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WO2014096024A1 - Verfahren zur herstellung einer lipid-reichen zusammensetzung aus mikroorganismen - Google Patents

Verfahren zur herstellung einer lipid-reichen zusammensetzung aus mikroorganismen Download PDF

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Publication number
WO2014096024A1
WO2014096024A1 PCT/EP2013/077125 EP2013077125W WO2014096024A1 WO 2014096024 A1 WO2014096024 A1 WO 2014096024A1 EP 2013077125 W EP2013077125 W EP 2013077125W WO 2014096024 A1 WO2014096024 A1 WO 2014096024A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
microorganisms
extraction
lipids
weight
water
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2013/077125
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Miguel CARAUCÁN DÁVILA
Kurt Gasser
David Ruppen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lonza AG
Original Assignee
Lonza AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lonza AG filed Critical Lonza AG
Publication of WO2014096024A1 publication Critical patent/WO2014096024A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B1/00—Production of fats or fatty oils from raw materials
    • C11B1/10—Production of fats or fatty oils from raw materials by extracting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
    • C11C1/00—Preparation of fatty acids from fats, fatty oils, or waxes; Refining the fatty acids
    • C11C1/007—Preparation of fatty acids from fats, fatty oils, or waxes; Refining the fatty acids using organic solvents

Definitions

  • the invention relates to a method for producing a lipid-containing composition, wherein lipids are selectively extracted in the presence of at least one polar organic solvent and water from microorganisms.
  • the invention also relates to lipid-rich compositions and uses.
  • Lipids are important components of human and animal nutrition.
  • fatty acids and triacylglycerides are important.
  • Polyunsaturated fatty acids (PUFA), in particular omega-3 fatty acids (n3 fatty acids) are essential components of the human diet. They can be isolated from natural sources or absorbed through food. However, in most industrialized nations, the supply of n3-fatty acids is deficient. In contrast, the total fat content in the diet and the intake of saturated fatty acids and N6 fatty acids are too high. This is due to a change in dietary composition, especially in the last 150 or so years, which is correlated with the onset of various chronic diseases, such as cardiovascular disease, the leading cause of death in industrialized nations.
  • n3 fatty acids such as eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA), for example, can reduce cardiovascular risk. Therefore, it is recommended by health organizations such as the WHO to increase the consumption of n3-fatty acids.
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • DHA docosahexaenoic acid
  • PUFAs and n3 fatty acids are mainly derived from marine coldwater fish.
  • microorganisms have increasingly been used as industrial sources. From suitable fermentation cultures, PUFAs can be isolated under controlled and inexpensive conditions.
  • Suitable microorganisms for obtaining PUFAs are, for example, microalgae, bacteria or dinoflagellates.
  • WO 03/039832 discloses a process for the purification of oils and fatty acids from microalgae.
  • dried microalgae are mixed with hexane and digested by grinding and centrifuged, whereby an oil-containing organic phase is obtained. After separation of the solvent, an oil fraction containing unsaturated fatty acids is obtained.
  • EP 9 515 460 B1 discloses a process for isolating an oil rich in unsaturated fatty acids from unicellulars, especially dinoflagellates.
  • the protozoa are cultivated under defined conditions, after which the cells are harvested and freeze-dried.
  • the extraction of the oil is then carried out with hexane with stirring at 50 ° C.
  • EP 0 935 667 B1 discloses a process for isolating lipids, in particular docosahexaenoic acid or docosapentaenoic acid, from microalgae of the genus Ulkenia.
  • the algae are cultivated, harvested and freeze-dried.
  • the extraction of the lipids is carried out with chloroform / methanol with simultaneous cell disruption by homogenization.
  • chloroform in industrial processes is disadvantageous for environmental reasons and generally in the field of food production.
  • a modified process for isolating fatty acids from microalgae is disclosed in EP 2 105 506 A1. In this case, a complexing agent or a flocculant is added to the fermentation medium.
  • the isolation of the oil takes place freeze-dried harvested cells digested by heat treatment in the presence of methanolic hydrochloric acid. In the process, the fatty acid profile is changed and the qualitative composition of the oil is improved, whereby overall a high overall yield is achieved.
  • DE 10 2006031 212 therefore proposes to carry out the extraction of ingredients in vivo in the presence of a solvent, wherein the cells are to be immobilized in porous layers of a silica gel / nanosol.
  • the described known methods are still in need of improvement, since they require numerous and sometimes cumbersome process steps and the yields are often not satisfactory.
  • the methods also consume a lot of energy, in particular during drying, lyophilization and mechanical disruption of the cells. Some methods also use solvents or chemicals which are harmful to health and therefore undesirable in the production of food.
  • the object of the invention is to provide compositions, processes and uses which overcome the disadvantages described above.
  • the object of the invention is to provide simple and efficient methods for selectively isolating lipids from microorganisms.
  • the isolation and purification of unsaturated fatty acids, such as DHA and DPA should be made possible in the highest possible yield and purity.
  • the process should have as few process steps and thereby be easily reproducible on an industrial scale and at the same time cost.
  • the resulting compositions should be safe for health and suitable for applications in cosmetics, pharmacy and food.
  • the invention relates to a method for producing a lipid-containing composition, wherein lipids are extracted in the presence of at least one polar organic solvent and water from microorganisms.
  • microorganisms such as eukaryotic unicellular organisms or bacteria.
  • the microorganisms are microalgae.
  • the microorganisms are preferably eukaryotic protozoa.
  • Microalgae are often eukaryotic unicellular organisms, but can also be eukaryotic multicellular organisms.
  • the microorganisms are in a preferred embodiment Stramenopilen ⁇ Stramenopiles, also Chromista or Heteroconta). These are eukaryotes, which possess at least in certain stages of growth two differently formed flagella. Most species are single-celled, with the brown algae but also include highly differentiated Mehrzeller.
  • Microorganisms which are suitable for obtaining PUFA are, for example, dinoflagellates (Dinophyta), in particular the genus Crypthecodinium, such as C. cohnii, or stramenopiles, such as the pinguiophyceae such as Glossomastix, Phaeomonas, Pinguiochrysis, Pinguiococcus and Polydochrysis.
  • Dioflagellates Diophyta
  • the genus Crypthecodinium such as C. cohnii, or stramenopiles
  • pinguiophyceae such as Glossomastix, Phaeomonas, Pinguiochrysis, Pinguiococcus and Polydochrysis.
  • microorganisms of the genera Japonochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium, Althornia, Labyrinthuloides, Aplanochytrium and Ulkenia are particularly suitable for the purification of PUFA.
  • Particularly preferred are those of the genus Ulkenia, Schizochytrium or Thraustochytrium.
  • Thraustochytrium aureum in particular ATCC 2821 1 or ATTC 34304
  • Thraustochytrium roseum ATCC 28210 Thraustochytrium sp. ATCC 20890, ATTC 20891, ATTC 20892 and ATTC 26185
  • Schizochytrium aggregatum ATTC 28209
  • Schizochytrium sp. ATCC 20888 and ATTC 20889
  • Schizochytrium SR21 Ulkenia spec. SAM 2179 and SAM 2180.
  • Suitable strains, their uses as bioreactors, and fermentation and culture conditions are well known in the art.
  • WO91 / 07498 discloses the production of PUFA with organisms of the genera Schizochytrium and Thraustochytrium
  • WO98 / 03671 discloses the production of PUFA with microorganisms of the genus Ulkenia.
  • the microorganisms may be wild-type strains or mutants. Suitable mutants are, in particular, those which contain elevated levels of lipids, such as storage lipids, or which contain increased levels of specific desired fatty acids, such as DHA. Mutants with particular properties are known in the art or can be obtained by conventional methods such as recombinant techniques or classical mutagenesis by means of chemicals or radiation.
  • the selection of the microorganism for the method according to the invention takes place with regard to the lipids to be extracted.
  • the microorganism is selected with regard to the fatty acid type and distribution.
  • the process conditions can be adjusted with an assay as described in the embodiments.
  • the microorganism is under the extraction conditions not lysed by the polar organic solvent.
  • the microorganisms may optionally be supplemented with additives such as flocculants or complexing agents.
  • the microorganism can be provided mixed with water, for example as cell paste or in aqueous solution, such as fermentation solution or buffer solution, or as dried biomass, for example as powder or granules.
  • the inventive method is used for the extraction of lipids.
  • the process gives a lipid-containing composition.
  • the lipid-containing composition may be the immediate product of the extraction, and thus an extract containing lipids and solvents.
  • the lipid-containing composition can also be obtained after the extract has been further purified and / or concentrated, for example by removal of the solvent.
  • the lipids are or include fatty acids and / or triacylglycerides.
  • the lipids are preferably at least partially as an oil.
  • the triacylglycerides can be fats, fatty oils and waxes.
  • the lipids are storage lipids or contain storage lipids.
  • Memory lipids are lipids from the cell interior that are not part of the cell membrane. They form accumulations in the cell interior, for example in the form of oil droplets (oleosomes). They can serve the cells as an energy reserve. These include, above all, neutral lipids (triglycerides). In a preferred embodiment, the lipids are therefore not phospholipids, which serve primarily for the formation of the cell membrane.
  • a composition is obtained which, after separation of the solvents (organic solvents and water), contains more than 10% by weight, in particular more than 50% by weight or more than 90% by weight, of fatty acids and triacylglycerides.
  • the proportion of membrane-forming lipids, in particular of phospholipids, is preferably less than 10% by weight, less than 5% by weight or less than 2% by weight.
  • the lipids are polyunsaturated fatty acids (PUFA). Polyunsaturated fatty acids have at least two double bonds along the carbon chain.
  • the fatty acids are omega-3 fatty acids.
  • the total proportion of all unsaturated fatty acids, in particular the proportion of omega-3 fatty acids, in the extracted lipids is preferably at least 10% by weight, preferably at least 50% by weight or at least 90% by weight, based on the total weight of the lipids extracted.
  • a composition is obtained which, after separation of the solvents (organic solvents and water), contains more than 10% by weight, in particular more than 50% by weight or more than 90% by weight, of unsaturated fatty acids.
  • the fatty acid is docosahexaenoic acid (DHA).
  • DHA docosahexaenoic acid
  • the fatty acid can also be docosapentaenoic acid (DPA). It is known that these fatty acids accumulate and isolate in large quantities in microorganisms such as microalgae.
  • Further omega-3 fatty acids which are suitable according to the invention are eicosatetraenoic acid, eicosatrienoic acid and alpha-linolenic acid.
  • the total amount of DHA in the extracted fatty acids is preferably at least 10% by weight or at least 50% by weight, preferably at least 80% by weight or at least 90% by weight, based on the total weight of the extracted fatty acids.
  • a composition is obtained which, after separation of the solvents (organic solvents and water), contains more than 10% by weight or more than 50% by weight, in particular more than 80% by weight or more than 90% by weight of DHA.
  • the microorganisms are preferably selected to contain a high concentration of the desired lipids.
  • the microorganisms contain at least 1% by weight or at least 5% by weight, preferably at least 10% by weight, at least 20% by weight. or at least 50% by weight of storage lipids, in each case based on the dry weight of the microorganisms (the dry weight here denotes the weight without water).
  • the proportion of memory lipids in the microorganisms 1 to 90 wt.%, In particular 5 to 85 wt.%, Particularly preferably 20 to 80 wt.%, Based on the dry weight.
  • the microorganisms contain, based on the dry weight of the microorganisms, at least 1% by weight or at least 5% by weight, preferably at least 10% by weight, at least 15% by weight or at least 25% by weight of unsaturated fatty acids. especially DHA.
  • the proportion of unsaturated fatty acids, in particular DHA, in the microorganisms, based on the dry weight 1 to 90 wt.%, In particular 5 to 85 wt.%, Particularly preferably 20 to 80 wt.%.
  • more than 10% by weight or more than 50% by weight, in particular more than 80% by weight, more than 85% by weight, more than 90% by weight or more than 95% by weight of the storage lipids are preferred , in particular the unsaturated fatty acids, in particular the DHA, extracted, based on the respective total content in the microorganisms.
  • the extraction according to the invention is carried out in the presence of water and at least one polar organic solvent.
  • the water also serves as a solvent.
  • the solvents contained form a mixture and / or a liquid / liquid two-phase system.
  • the invention is based on the unexpected finding that, in the presence of polar organic solvents and water, a particularly efficient and selective extraction of lipids, in particular of unsaturated fatty acids, from microorganisms takes place.
  • the process is so efficient that even without digestion of the microorganisms, a substantial proportion of the lipids can be extracted. It was surprising that the extraction can take place very selectively even without digestion of the cell wall of the microorganisms.
  • the extraction takes place in an extraction mixture which comprises or derives from the microorganisms, water and at least one polar organic solvent consists.
  • the extraction mixture has two liquid phases. These are a lower aqueous phase (which contains the microorganisms) and an upper organic phase.
  • the lipids are transferred to the organic phase during extraction.
  • the extraction mixture may alternatively comprise a single liquid phase containing a solvent mixture of the polar organic solvent and water. The lipids then go into the liquid phase during extraction.
  • the polar organic solvent may be partially or completely miscible with water.
  • Polar organic solvents are especially those containing oxygen as the heteroatom. Suitable examples are esters, ethers, alcohols and ketones.
  • the polar organic solvent is an ester.
  • the ester is preferably an alkylalkylate, such as ethyl acetate, methyl acetate, n-butyl acetate, isobutyl acetate, methyl propylate or ethyl methoxide. Particularly preferred is the use of ethyl acetate.
  • the organic solvent is liquid at room temperature (23 ° C). Preferably, the boiling point of the organic solvent is above 30 ° C or above 70 ° C.
  • the organic solvent is preferably between 2 and 15 C atoms, in particular between 3 and 10 C atoms.
  • the organic solvent does not lyse the microorganisms under the extraction conditions.
  • the water can be introduced into the extraction mixture with the microorganisms, for example as part of a cell paste, cell suspension, cell solution and / or the fermentation solution. Alternatively or additionally, water may be added separately from the microorganisms.
  • the polar organic solvent is completely or partially miscible with water. If the organic solvent is partially miscible with water, it is preferably saturated or supersaturated.
  • the extraction mixture may contain additional water, which then forms a second liquid phase (the aqueous phase).
  • the polar organic solvent is nearly saturated with water, that is it contains a water content, for example, less than 5% or less than 1% below the saturation limit. Alternatively, the water content may for example be at least 30% below the saturation limit.
  • the water content in the extraction is at least 2.5% by weight, at least 5% by weight, at least 7.5% by weight or at least 10% by weight, based in each case on the sum of all in the extraction mixture at room temperature (23 ° C) liquid solvent (including water).
  • the proportion of water may be, for example, up to 95% by weight, up to 80% by weight or up to 60% by weight.
  • the amount of water may be, for example, 2.5 to 95% by weight, in particular 5 to 80% by weight or 10 to 60% by weight.
  • the remaining portion is in each case polar organic solvent.
  • the water content also includes the water which is optionally contained in the microorganisms and / or bound thereto.
  • the proportion of water in the entire extraction mixture is at least 2.5% by weight, at least 5% by weight, at least 7.5% by weight or at least 10% by weight.
  • the proportion of water may be, for example, up to 90% by weight, up to 75% by weight or up to 50% by weight.
  • the proportion of water may be, for example, 2.5 to 90% by weight, in particular 5 to 75% by weight.
  • Saturated ethyl acetate contains about 3.4% by weight of water at room temperature.
  • the extraction is carried out in the presence of ethyl acetate and water, the ethyl acetate being at least saturated with water.
  • the proportion of water is preferably higher than 3.4% by weight, in each case based on the sum of all liquid solvents (including water). With a significantly higher water content, there are two liquid phases. It is according to the invention not necessary that non-polar organic solvent, such as hexane or chloroform, is included. If necessary, you can but small amounts may be included, for example, up to 10 wt.% Or up to 5 wt.%, Based on the sum of all solvents contained.
  • the proportion by weight of the microorganisms (dry weight) in the extraction mixture can be, for example, between 2.5 and 75% by weight, in particular between 5 and 50% by weight, or between 10 and 30% by weight.
  • the microorganisms Before carrying out the extraction, the microorganisms can be cultured in a fermentation batch (culture solution). After growth, propagation and formation of a desired amount of microorganisms, they can be used for extraction.
  • the microorganisms are separated from the culture solution prior to extraction, for example by filtration or centrifugation.
  • the isolated cells are optionally washed.
  • several washes are performed to remove contaminants and soluble components of the culture solution.
  • the washing steps can be carried out, for example, with water or buffer solution.
  • an aqueous biomass is obtained (cell paste).
  • further water can be removed by pressing and / or filtering.
  • the biomass is preferably used directly, ie without further processing steps, for extraction.
  • the organic solvent and optionally additional water are added and optionally mixed.
  • the separation of the microorganisms is not absolutely necessary since the extraction according to the invention can also be carried out after mixing the polar organic solvent with an aqueous fermentation mixture.
  • dried microorganisms are used for the extraction.
  • Dried microorganisms are available, for example, by spray drying, lyophilization or heat drying.
  • the use of dried microorganisms may be advantageous to the proportions and adjust the water content as evenly as possible.
  • the drying preferably takes place in such a way that the cells are not disrupted.
  • the microorganisms are not dried before extraction, in particular not lyophilized.
  • such a step is carried out to allow extraction in the absence of water.
  • the drying of the microorganisms is not required, since a high yield can be achieved even in the presence of water. Since drying and, in particular, freeze-drying require large amounts of energy, the method according to the invention can therefore be carried out not only simpler and more efficiently, but also more cost-effectively.
  • the microorganisms are not digested.
  • the microorganisms are not digested prior to extraction.
  • the extraction conditions are selected so gently that no cell disruption takes place.
  • cell disruption destroys the integrity of cell walls.
  • the cell interior such as: phospholipids, proteins - released and diffuses into the environment.
  • Continuous disruption results in cell debris and agglomerates.
  • the digestion can be followed microscopically or via suitable markers, optionally in conjunction with color reactions.
  • mechanical, chemical, enzymatic and / or physical methods are usually used in the prior art. Mechanical and physical methods include grinding the cells, for example in ball mills, Ultrasonic treatment and homogenization. Even vigorous stirring and shaking can lead to the destruction of cell membranes.
  • the microorganisms are preferably not treated before and during the extraction in a manner which causes the destruction of the cell membranes or substantially promotes.
  • no pretreatment of the cells for purposes of cell disruption takes place and no additives are added to the extraction mixture for this purpose.
  • a small proportion of the microorganisms can regularly be destroyed, for example because individual microorganisms have a low stability for reasons of age or can already be obtained dead from the fermentation medium. This proportion can be minimized by a gentle treatment, for example, only slight shaking.
  • less than 10%, 5% or 2% of the cells are preferably digested without targeted cell disruption.
  • a high yield can be achieved even without measures for cell disruption or for weakening the cell membrane.
  • at least 50% by weight, more than 70% by weight or more than 80% by weight of all storage lipids, especially of all unsaturated fatty acids, are extracted without cell disruption.
  • the microorganisms are digested before and / or during the extraction.
  • the yield may optionally be further increased by this cell disruption.
  • the cell disruption can be carried out using the methods already mentioned above.
  • the cell disruption can be effected mechanically and / or physically, for example by grinding, homogenizing or with ultrasound, and / or chemically or enzymatically, for example with lysozyme. It has been found that when the extraction according to the invention is combined, in particular with ethyl acetate, with cell disruption, a virtually quantitative separation of the lipids, in particular of the unsaturated fatty acids, can be achieved.
  • At least 80% by weight, preferably more than 90% by weight or more than 95% by weight, of all storage lipids, in particular all unsaturated fatty acids, are extracted.
  • means for cell disruption will be decided with regard to the desired product in the context of a cost / benefit analysis.
  • an even higher yield is achieved by an additional digestion of the cells, the process becomes more complex.
  • Another disadvantage is that when a cell disruption is carried out, the proportion of contaminants from the cell interior and the membrane in the product is generally higher. In addition to the storage lipids, a higher proportion of lipids is extracted from the cell membrane.
  • the invention thus provides opportunities to isolate a high proportion of lipids in a high purity in a fast process or to isolate an even higher proportion of lipids in a slightly more complex process.
  • the microorganisms are not fixed to a support material before and during the extraction. In particular, it is not necessary to immobilize the microorganisms on a solid support or in a gel.
  • the extraction can be carried out with conventional process extraction equipment and tools. Depending on the scale, the extraction can be carried out, for example, in the presence of membranes, with an extraction centrifuge, an extraction decanter, as a cross-extraction with diafiltration, in a Soxhiet apparatus or with a separating funnel. The extraction can be carried out continuously, semi-batch or as a batch extraction.
  • the extraction is carried out at least twice, in particular two, three, four or five times. It is known to the person skilled in the art that with the repetition of an extraction with in each case relatively small amounts of extraction agent this can be saved and at the same time the yield can be increased (according to the Nernst distribution set). The saving of solvents is desirable in industrial processes for environmental and cost considerations.
  • the extraction according to the invention can be carried out at customary temperatures, for example at 0 ° C. to 100 ° C.
  • the process is carried out at low temperature, for example at 0 ° C to 40 ° C, in particular approximately at room temperature (23 ° C).
  • the extraction is efficient even at such low temperatures.
  • the extraction at low temperatures has the advantage that the extraction is gentle and energy-saving.
  • the yield can be increased by multiple extraction.
  • the extraction is carried out at elevated temperature, for example at 40 ° C to 100 ° C, in particular between 50 ° C and 90 ° C.
  • the extraction at elevated temperature has the advantage that optionally the yield is increased.
  • One possible variant is a combination of extraction with solvent removal.
  • the extraction is carried out until a desired amount of lipids has passed into the organic phase.
  • extraction with ethyl acetate may be carried out for a period of 1 minute to 10 hours, preferably between 30 minutes and 5 hours. It has been found that after 2 hours at 4 ° C already over 80% of the lipids are taken up from the cell interior into the organic phase.
  • the mixing of the components may each be assisted by appropriate means, such as gentle shaking or gentle suspending. If the procedure is carried out without disruption of the cells, the person skilled in the art adjusts the conditions so that damage to the cell membranes is avoided as far as possible.
  • the method can be supplemented and optimized by known conventional means, for example, washing, centrifuging, filtering or other separation steps.
  • the extraction mixture is centrifuged to achieve phase separation.
  • the lipid-containing liquid phase is separated off.
  • the product obtained is a mixture containing polar organic solvent and lipids, optionally containing a proportion of water and common impurities.
  • the solvents ie the organic solvent and water, can be removed by known methods, for example by evaporation at elevated temperature, and / or vacuum, membrane filtration and / or precipitation of fatty acids.
  • a lipid-containing composition consisting essentially of lipids is obtained.
  • the lipids can be processed further by customary methods, for example by chemical modification or refining.
  • the polar organic solvent such as ethyl acetate
  • the polar organic solvent such as ethyl acetate
  • the process is one for preparing a DHA-containing composition which, after separation of the ethyl acetate, contains more than 10% by weight of DHA, the DHA being extracted with ethyl acetate from microorganisms of the genus Ulkenia.
  • the method comprises the steps:
  • step (b) preference is given to adding so much ethyl acetate that two aqueous phases form.
  • the digestion in step (e) followed by repetition (f) of the extraction process serves to increase the yield.
  • the process according to the invention is also a process for the isolation and / or purification of lipids, in particular of polyunsaturated fatty acids, from microorganisms.
  • the invention also provides the use of the method according to the invention for the isolation and / or purification of lipids, in particular of polyunsaturated fatty acids.
  • the invention also provides a lipid-containing composition obtainable or obtained by a process according to the invention.
  • the composition of the present invention differs from prior art lipid extracts in the low level of unwanted components from the cell interior and cell membrane. For example, only a small proportion of phospholipids is included. The proportion of peroxides and p-anisidine is low. In addition, no traces of problematic solvents are contained, such as hexane or chloroform.
  • the composition is therefore particularly suitable for the production of products in cosmetics, pharmacy and food.
  • the composition of the lipids depends on the microorganisms used.
  • the high lipid composition is a mixture of the solvents with the extracted lipids.
  • the composition is one from which the polar organic solvent has been completely or partially separated.
  • the proportion of the organic solvent is then preferably less than 10% by weight, less than 1% by weight, less than 0.5% by weight or less than 0.1% by weight.
  • the proportion of lipids is then preferably at least 90% by weight, at least 95% by weight or at least 98% by weight.
  • the lipid-containing composition is an oil.
  • the composition according to the invention preferably contains more than 50% by weight of unsaturated fatty acids, in particular more than 20% by weight or more than 50% by weight of DHA.
  • the proportion of non-lipids is preferably less than 5% by weight, less than 2% by weight or 1% by weight.
  • the inventive method and the composition of the invention solve the problem underlying the invention.
  • the method can be used to carry out an efficient and at the same time simple extraction of lipids from microorganisms. Unusually high yields are achieved even without prior digestion of the microorganisms.
  • the process can be carried out with dry or moist microorganisms. Due to the gentle extraction without disruption of the cells can be a highly pure Lipid composition containing low levels of unwanted cell components and components of the cell membrane. Combining the process with digestion can achieve near quantitative recovery of the lipids from the cells.
  • the process is overall energy and cost efficient.
  • Suitable solvents such as ethyl acetate, are available in large quantities and are harmless to health, so that the purified lipids can be further processed in foods, pharmaceuticals or cosmetics.
  • the solvent ethyl acetate can also be recycled after separation into the process without affecting the quality.
  • FIG. 1 shows light micrographs of samples of ulkenia taken during the extraction process according to Example 8. The samples were taken before the first digestion 0 and after 1, 2 and 3 digestions. For each sample a 4x, 10x and 40x magnification is shown.
  • FIG. 2 shows the p-anisidine content of the extracts after each extraction (determined photometrically) for the extraction experiment from Example 9. Two different batches of cell material were examined (squares and circles). The 50.0 line is an acceptable threshold for cosmetic and food applications.
  • Figure 3 shows for the extraction experiment of Example 9, the peroxide content of the extracts after each extraction in mEq / kg. Two different batches of cell material were examined (squares and circles). The line at 15.0 [mEq / kg] is an acceptable threshold for cosmetic and food applications.
  • Examples 1 to 7 preliminary experiments for extraction with ethyl acetate / water
  • DHA oil was extracted from microorganisms from various extraction mixtures without the cells having been previously disrupted.
  • the microorganism Ulkenia SAM2179 was used as microorganism and pure EtOAc as extractant.
  • extraction mixtures were prepared with different proportions of water, EtOAc and biomass as shown in Table 1.
  • the biomass was moist after centrifugation, so that the sample to Example 4 contained water.
  • the color of the organic phase with yellow DHA was assessed visually.
  • Table 1 Overview of sample preparations and results of Examples 1 to 7 (yellowing: ++ distinct, + light, - none).
  • Example 1 The samples of Examples 1 to 4 were each mixed and centrifuged.
  • the biomass was initially not susceptible to being suspended well in EtOAc. It was therefore initially not easy to handle mechanically, for example stirring or pumping. Within a few hours, however, the cell mass disintegrated and was then easily processable.
  • the intensity of yellowing indicated whether and how much DHA oil was incorporated into the EtOAc phase. While the EtOAc phase was markedly yellowish in Example 1, the intensity was low in Examples 2 and 3. In Example 4, the EtOAc phase was yellowish and heavily cloudy. In Example 7, the biomass was easily resuspended in water. In contrast, the biomass in EtOAc in Example 4 immediately settled on the ground. The mass was tough and chewing gum-like. The EtOAc initially turned a little yellowish.
  • Ulkenia was used as the starting material in the form of a moist press cake from the filter press with a water content of about 65% by weight.
  • the wet biomass was charged and treated with pure EtOAc in a ratio of 4 parts EtOAc to 1 part dry biomass.
  • the extraction thus resulted in a weight ratio of EtOAc / H 2 O / dry biomass of approximately 4/2/1.
  • Figure 3 shows the peroxide values of the products after each extraction (in mEq./kg, determined according to AOCS Official Method Cd 8-53).
  • the usual upper limit is 15.0.
  • the compositions of the invention have p-anisidine and peroxide values well below the usual thresholds and unusually low for unrefined crude oil. The products are therefore suitable for applications in the food or cosmetics sector.

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Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer lipidhaltigen Zusammensetzung, wobei Lipide in Gegenwart von mindestens einem polaren organischen Lösungsmittel und Wasser aus Mikroorganismen selektiv extrahiert werden. Die Erfindung betrifft auch lipidreiche Zusammensetzungen und Verwendungen.

Description

VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG EINER LIPID-REICHEN ZUSAMMENSETZUNG AUS MIKROORGANISMEN Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer lipidhaltigen Zusammensetzung, wobei Lipide in Gegenwart von mindestens einem polaren organischen Lösungsmittel und Wasser aus Mikroorganismen selektiv extrahiert werden. Die Erfindung betrifft auch lipidreiche Zusammensetzungen und Verwendungen.
Stand der Technik und Hintergrund der Erfindung Lipide sind wichtige Bestandteile der menschlichen und tierischen Ernährung. Für die menschliche Ernährung sind vor allem Fettsäuren und Triacylglyceride von Bedeutung. So sind mehrfach ungesättigte Fettsäuren (Polyunsaturated Fatty Acids, PUFA), insbesondere Omega-3-Fettsäuren (n3-Fettsäuren), essentielle Bestandteile der menschlichen Ernährung. Sie können aus natürlichen Quellen isoliert oder über die Nahrung aufgenommen werden. Allerdings ist in den meisten Industrienationen die Versorgung mit n3-Fettsäuren mangelhaft. Dagegen sind der Gesamtfettanteil in der Ernährung und die Zufuhr an gesättigten Fettsäuren und N6-Fettsäuren zu hoch. Dies beruht auf einer Veränderung der Nahrungszusammensetzung, die vor allem in den letzten ca. 150 Jahren stattgefunden hat und die mit dem Auftreten verschiedener chronischer Krankheiten, wie beispielsweise Herzkreislauferkrankungen - der Haupttodesursache in Industrienationen - korreliert wird. Durch die gezielte Zufuhr von n3-Fettsäuren, wie Eicosapentaensäure (EPA) und Docosahexaensäure (DHA), kann beispielsweise das Herzkreislaufrisiko reduziert werden. Daher wird von Gesundheitsorganisationen wie der WHO empfohlen, den Konsum von n3-Fettsäuren zu erhöhen. PUFAs und n3-Fettsäuren werden vornehmlich aus marinen Kaltwasserfischen gewonnen. In den letzten Jahren wurden zunehmend Mikroorganismen als industrielle Quellen genutzt. Aus geeigneten Fermentationskulturen können PUFAs unter kontrollierten und kostengünstigen Bedingungen isoliert werden. Geeignete Mikroorganismen zur Gewinnung von PUFAs sind beispielsweise Mikroalgen, Bakterien oder Dinoflagellaten. In den letzten Jahren wurde versucht, durch verbesserte Fermentationsbedingungen Aufreinigungsverfahren Fettsäuren und sonstige Lipide in höheren Ausbeuten zu isolieren. Die WO 03/039832 offenbart ein Verfahren zur Reinigung von Ölen und Fettsäuren aus Mikroalgen. Dabei werden getrocknete Mikroalgen mit Hexan versetzt und durch Mahlen aufgeschlossen und zentrifugiert, wobei eine ölhaltige organische Phase erhalten wird. Nach Abtrennung des Lösungsmittels wird eine Ölfraktion erhalten, die ungesättigte Fettsäuren enthält.
Die EP 9 515 460 B1 offenbart ein Verfahren zur Isolierung eines Öls, das reich an ungesättigten Fettsäuren ist, aus Einzellern, insbesondere Dinoflagellaten. Dabei werden die Einzeller unter definierten Bedingungen kultiviert, wonach die Zellen geerntet und gefriergetrocknet werden. Die Extraktion des Öls erfolgt anschließend mit Hexan unter Rühren bei 50°C.
Die EP 0 935 667 B1 offenbart ein Verfahren zur Isolierung von Lipiden, insbesondere Docosahexaensäure oder Docosapentaensäure, aus Mikroalgen der Gattung Ulkenia. Dabei werden die Algen kultiviert, geerntet und gefriergetrocknet. Die Extraktion der Lipide erfolgt mit Chloroform/Methanol bei gleichzeitigem Zellaufschluss durch Homogenisieren. Die Verwendung von Chloroform bei großtechnischen Verfahren ist jedoch aus Umweltschutzgründen und generell im Gebiet der Nahrungsmittelherstellung nachteilig. Ein modifiziertes Verfahren zur Isolierung von Fettsäuren aus Mikroalgen wird in EP 2 105 506 A1 offenbart. Dabei wird dem Fermentationsmedium ein Komplexbildner oder ein Flockungsmittel zugegeben. Die Isolierung des Öls erfolgt aus gefriergetrockneten geernteten Zellen, die durch eine Hitzebehandlung in Gegenwart von methanolischer Salzsäure aufgeschlossen werden. Bei dem Verfahren wird das Fettsäureprofil verändert und die qualitative Zusammensetzung des Öls verbessert, wobei insgesamt eine hohe Gesamtausbeute erzielt wird.
Bei den beschriebenen Verfahren ist es erforderlich, die Mikroorganismen aufzuschließen und damit zu zerstören. Dies ist nachteilig, wenn die Zellen in Fermentationslösungen nur langsam wachsen. Die DE 10 2006031 212 schlägt daher vor, die Extraktion von Inhaltsstoffen in vivo in Gegenwart eines Lösungsmittels durchzuführen, wobei die Zellen in porösen Schichten eines Silica- Gels/Nanosols immobilisiert werden sollen.
Die beschriebenen bekannten Verfahren sind noch verbesserungsbedürftig, da sie zahlreiche und zum Teil umständliche Verfahrensschritte erfordern und die Ausbeuten oft nicht befriedigend sind. Die Verfahren verbrauchen insbesondere beim Trocknen, Lyophilisieren und mechanischem Aufschließen der Zellen auch viel Energie. Bei einigen Verfahren kommen auch Lösungsmittel oder Chemikalien zum Einsatz, die gesundheitsschädlich und daher bei der Produktion von Nahrungsmitteln nicht wünschenswert sind.
Aufgabe der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, Zusammensetzungen, Verfahren und Verwendungen bereitzustellen, welche die oben beschriebenen Nachteile überwinden.
Der Erfindung liegt insbesondere die Aufgabe zugrunde, einfache und effiziente Verfahren bereitzustellen, um Lipide aus Mikroorganismen selektiv zu isolieren. Insbesondere soll die Isolierung und Aufreinigung von ungesättigten Fettsäuren, wie DHA und DPA in möglichst hoher Ausbeute und Reinheit ermöglicht werden. Das Verfahren soll möglichst wenige Verfahrensschritte aufweisen und dadurch im industriellen Maßstab einfach reproduzierbar und gleichzeitig kostengünstig sein. Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, eine lipidhaltige Zusammensetzung bereitzustellen, die aus Mikroorganismen extrahierbar ist und die eine vorteilhafte Verteilung von ungesättigten Fettsäuren und gleichzeitig einen geringen Anteil von unerwünschten Nebenprodukten aufweist. Die erhaltenen Zusammensetzungen sollen gesundheitlich unbedenklich und für Anwendungen in der Kosmetik, Pharmazie und im Nahrungsmittelbereich geeignet sein.
Offenbarung der Erfindung
Überraschenderweise wird das der Erfindung zugrunde liegende Problem gelöst durch Verfahren, Zusammensetzungen und Verwendungen gemäß den Patentansprüchen. Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer lipidhaltigen Zusammensetzung, wobei Lipide in Gegenwart von mindestens einem polaren organischen Lösungsmittel und Wasser aus Mikroorganismen extrahiert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit verschiedenen Mikroorganismen durchgeführt werden, wie eukaryotischen Einzellern oder Bakterien. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Mikroorganismen Mikroalgen. Bevorzugt sind die Mikroorganismen eukaryotische Einzeller. Mikroalgen sind oft eukaryotische Einzeller, können aber auch eukaryotische Mehrzeller sein. Die Mikroorganismen sind in einer bevorzugten Ausführungsform Stramenopilen {Stramenopiles, auch Chromista oder Heterokonta). Diese sind Eukaryoten, die mindestens in bestimmten Wachstumsstadien zwei unterschiedlich ausgebildete Geißeln besitzen. Die meisten Arten sind Einzeller, mit den Braunalgen zählen jedoch auch stark differenzierte Mehrzeller dazu.
Mikroorganismen, die sich zur Gewinnung von PUFA eignen, sind beispielsweise Dinoflagellaten (Dinophyta), insbesondere die Gattung Crypthecodinium, wie C. cohnii, oder Stramenopiles, wie die Pinguiophyceae wie z.B. Glossomastix, Phaeomonas, Pinguiochrysis, Pinguiococcus und Polydochrysis.
Bevorzugt sind Mikroorganismen der Gattungen Japonochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium, Althornia, Labyrinthuloides, Aplanochytrium und Ulkenia. Diese Mikroorganismen eigenen sich insbesondere zur Reinigung von PUFA. Besonders bevorzugt sind solche der Gattung Ulkenia, Schizochytrium oder Thraustochytrium.
Speziell geeignet sind die Stämme Thraustochytrium aureum (insbesondere ATCC 2821 1 bzw. ATTC 34304), Thraustochytrium roseum ATCC 28210 Thraustochytrium sp. ATCC 20890, ATTC 20891 , ATTC 20892 und ATTC 26185, Schizochytrium aggregatum ATTC 28209, Schizochytrium sp. ATCC 20888 und ATTC 20889, Schizochytrium SR21 , sowie Ulkenia spec. SAM 2179 und SAM 2180. Geeignete Stämme, ihre Verwendungen als Bioreaktoren und Fermentations- und Kultivierungsbedingungen sind im Stand der Technik grundsätzlich bekannt. Die WO91/07498 offenbart die Herstellung von PUFA mit Organismen der Gattungen Schizochytrium und Thraustochytrium, während die WO98/03671 die Herstellung von PUFA mit Mikroorganismen der Gattung Ulkenia offenbart. Die Mikroorganismen können Wildtyp-Stämme oder Mutanten sein. Geeignete Mutanten sind insbesondere solche, die erhöhte Anteile an Lipiden, wie Speicherlipiden, enthalten oder die erhöhte Anteile an speziellen gewünschten Fettsäuren, wie DHA, enthalten. Mutanten mit besonderen Eigenschaften sind im Stand der Technik bekannt oder können durch übliche Methoden, wie rekombinante Techniken, oder klassische Mutagenese mittels Chemikalien oder Bestrahlung erhalten werden.
Die Auswahl des Mikroorganismus für das erfindungsgemäße Verfahren erfolgt im Hinblick auf die zu extrahierenden Lipide. Der Mikroorganismus wird dabei im Hinblick auf die Fettsäureart und -Verteilung ausgewählt. Die Verfahrensbedingungen können mit einem Assay wie in den Ausführungsbeispielen beschrieben eingestellt werden. Bevorzugt wird der Mikroorganismus unter den Extraktionsbedingungen nicht durch das polare organische Lösungsmittel lysiert. Die Mikroorganismen können optional mit Zusätzen versetzt werden, wie Flockungsmittel oder Komplexbildner. Der Mikroorganismus kann gemischt mit Wasser, zum Beispiel als Zellpaste oder in wässriger Lösung, wie Fermentationslösung oder Pufferlösung, oder als getrocknete Biomasse, beispielsweise als Pulver oder Granulat, bereitgestellt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur Extraktion von Lipiden. Mit dem Verfahren wird eine lipidhaltige Zusammensetzung erhalten. Dabei kann die lipidhaltige Zusammensetzung das unmittelbare Produkt der Extraktion sein, und somit ein Extrakt, der Lipide und Lösungsmittel enthält. Die lipidhaltige Zusammensetzung kann jedoch auch erhalten werden, nachdem der Extrakt weiter gereinigt und/oder konzentriert wurde, beispielsweise durch Entfernung des Lösungsmittels.
Bevorzugt sind oder umfassen die Lipide Fettsäuren und/oder Triacylglyceride. Die Lipide liegen bevorzugt mindestens teilweise als Öl vor. Die Triacylglyceride können Fette, fette Öle und Wachse sein. Dabei ist es bevorzugt, dass die Lipide Speicheriipide sind bzw. Speicheriipide enthalten. Speicheriipide sind Lipide aus dem Zellinneren, die nicht Bestandteil der Zellmembran sind. Sie bilden Ansammlungen im Zellinneren, beispielsweise in Form von Öltropfen (Oleosomen). Sie können den Zellen als Energiereserve dienen. Zu ihnen zählen vor allem neutrale Lipide (Triglyceride). In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Lipide daher keine Phospholipide, die vornehmlich zur Bildung der Zellmembran dienen.
Bevorzugt wird erfindungsgemäß eine Zusammensetzung erhalten, die nach Abtrennung der Lösungsmittel (organische Lösungsmittel und Wasser) zu mehr als 10 Gew.%, insbesondere mehr als 50 Gew.% oder mehr als 90 Gew.% Fettsäuren und Triacylglyceride enthält. Bevorzugt ist der Anteil an membranbildenden Lipiden, insbesondere an Phospholipiden, kleiner 10 Gew.%, kleiner 5 Gew.% oder kleiner 2 Gew.%. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Lipide mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFA). Mehrfach ungesättigte Fettsäuren weisen entlang der Kohlenstoff kette mindestens zwei Doppelbindungen auf. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Fettsäuren Omega-3- Fettsäuren. Damit werden Verbindungen bezeichnet, bei denen die erste Doppelbindung vom Kettenende (Omega-Ende) aus an der C-3-Position lokalisiert ist. Bevorzugt ist der Gesamtanteil aller ungesättigter Fettsäuren, insbesondere der Anteil der Omega-3-Fettsäuren, an den extrahierten Lipiden mindestens 10 Gew.%, bevorzugt mindestens 50 Gew.% oder mindestens 90 Gew.%, bezogen auf das Gesamtgewicht der extrahierten Lipide. Bevorzugt wird erfindungsgemäß eine Zusammensetzung erhalten, die nach Abtrennung der Lösungsmittel (organische Lösungsmittel und Wasser) mehr als 10 Gew.%, insbesondere mehr als 50 Gew.% oder mehr als 90 Gew.% ungesättigte Fettsäuren enthält.
Es ist besonders bevorzugt, dass die Fettsäure Docosahexaensäure (DHA) ist. Die Fettsäure kann auch Docosapentaensäure (DPA) sein. Es ist bekannt, dass sich diese Fettsäuren sich in großen Mengen in Mikroorganismen, wie Mikroalgen, ansammeln und isolieren lassen. Weitere erfindungsgemäß geeignete Omega-3- Fettsäuren sind Eicosatetraensäure, Eicosatriensäure und alpha-Linolensäure. Bevorzugt ist der Gesamtanteil von DHA an den extrahierten Fettsäuren mindestens 10 Gew.% oder mindestens 50 Gew.%, bevorzugt mindestens 80 Gew.% oder mindestens 90 Gew.%, bezogen auf das Gesamtgewicht der extrahierten Fettsäuren. Bevorzugt wird erfindungsgemäß eine Zusammensetzung erhalten, die nach Abtrennung der Lösungsmittel (organische Lösungsmittel und Wasser) zu mehr als 10 Gew.% oder mehr als 50 Gew.%, insbesondere mehr als 80 Gew.% oder mehr als 90 Gew.% DHA enthält.
Die Mikroorganismen werden bevorzugt so ausgewählt, dass eine hohe Konzentration der gewünschten Lipide enthalten ist. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthalten die Mikroorganismen mindestens 1 Gew.% oder mindestens 5 Gew.%, bevorzugt mindestens 10 Gew.%, mindestens 20 Gew.% oder mindestens 50 Gew.% Speicheriipide, jeweils bezogen auf das Trockengewicht der Mikroorganismen (das Trockengewicht bezeichnet hier das Gewicht ohne Wasser). Bevorzugt ist der Anteil an Speicherlipiden in den Mikroorganismen 1 bis 90 Gew.%, insbesondere 5 bis 85 Gew.%, besonders bevorzugt 20 bis 80 Gew.%, bezogen auf das Trockengewicht. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthalten die Mikroorganismen, bezogen auf das Trockengewicht der Mikroorganismen, mindestens 1 Gew.% oder mindestens 5 Gew.%, bevorzugt mindestens 10 Gew.%, mindestens 15 Gew.% oder mindestens 25 Gew.% ungesättigte Fettsäuren, insbesondere DHA. Bevorzugt ist der Anteil an ungesättigten Fettsäuren, insbesondere DHA, in den Mikroorganismen, bezogen auf das Trockengewicht, 1 bis 90 Gew.%, insbesondere 5 bis 85 Gew.%, besonders bevorzugt 20 bis 80 Gew.%.
Bevorzugt werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren mehr als 10 Gew.% oder mehr als 50 Gew.%, insbesondere mehr als 80 Gew.%, mehr als 85 Gew.%, mehr als 90 Gew.% oder mehr als 95 Gew.% der Speicheriipide, insbesondere der ungesättigten Fettsäuren, insbesondere der DHA, extrahiert, bezogen auf den jeweiligen Gesamtgehalt in den Mikroorganismen. Die erfindungsgemäße Extraktion erfolgt in Gegenwart von Wasser und mindestens einem polaren organischen Lösungsmittel. Das Wasser dient ebenfalls als Lösungsmittel. Die enthaltenen Lösungsmittel bilden ein Gemisch und/oder ein flüssig/flüssig-Zweiphasensystem. Die Erfindung beruht auf dem unerwarteten Befund, dass in Gegenwart von polaren organischen Lösungsmitteln und Wasser eine besonders effiziente und selektive Extraktion von Lipiden, insbesondere von ungesättigten Fettsäuren, aus Mikroorganismen erfolgt. Das Verfahren ist so effizient, dass sogar ohne Aufschluss der Mikroorganismen ein wesentlicher Anteil der Lipide extrahiert werden kann. Es war überraschend, dass die Extraktion auch ohne Aufschluss der Zellwand der Mikroorganismen sehr selektiv stattfinden kann.
Die Extraktion erfolgt in einem Extraktionsgemisch, das die Mikroorganismen, Wasser und mindestens ein polares organisches Lösungsmittel aufweist bzw. daraus besteht. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist das Extraktionsgemisch zwei flüssige Phasen auf. Diese sind eine untere wässrige Phase (welche die Mikroorganismen enthält) und eine obere organische Phase. Die Lipide gehen bei der Extraktion in die organische Phase über. Das Extraktionsgemisch kann alternativ eine einzige flüssige Phase aufweisen, die ein Lösungsmittelgemisch aus dem polaren organischen Lösungsmittel und Wasser enthält. Die Lipide gehen dann bei der Extraktion in die flüssige Phase über. Dabei kann das polare organische Lösungsmittel teilweise oder vollständig mit Wasser mischbar sein. Polare organische Lösungsmittel sind insbesondere solche, die Sauerstoff als Heteroatom enthalten. Geeignet sind beispielsweise Ester, Ether, Alkohole und Ketone. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das polare organische Lösungsmittel ein Ester. Der Ester ist bevorzugt ein Alkylalkylat, wie Ethylacetat, Methylacetat, n-Butylacetat, Isobutylacetat, Methylpropylat oder Ethylmethylat. Besonders bevorzugt ist der Einsatz von Ethylacetat. Das organische Lösungsmittel ist bei Raumtemperatur (23°C) flüssig. Bevorzugt liegt der Siedepunkt des organischen Lösungsmittels oberhalb 30°C oder oberhalb 70°C. Das organische Lösungsmittel weit bevorzugt zwischen 2 und 15 C-Atome auf, insbesondere zwischen 3 und 10 C-Atome. Bevorzugt lysiert das organische Lösungsmittel unter den Extraktionsbedingungen nicht die Mikroorganismen.
Das Wasser kann mit den Mikroorganismen in das Extraktionsgemisch eingebracht werden, beispielsweise als Bestandteil einer Zellpaste, Zellsuspension, Zelllösung und/ oder der Fermentationslösung. Alternativ oder zusätzlich kann Wasser getrennt von den Mikroorganismen zugegeben werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das polare organische Lösungsmittel vollständig oder teilweise mit Wasser mischbar. Sofern das organische Lösungsmittel teilweise mit Wasser mischbar ist, ist es bevorzugt gesättigt oder übersättigt. Das Extraktionsgemisch kann zusätzliches Wasser enthalten, das dann eine zweite flüssige Phase (die wässrige Phase) bildet. In einer weiteren Ausführungsform ist das polare organische Lösungsmittel nahezu mit Wasser gesättigt, das heißt es enthält einen Wasseranteil, der beispielsweise weniger als 5% oder weniger als 1 % unterhalb der Sättigungsgrenze liegt. Der Wasseranteil kann alternativ auch beispielsweise mindestens 30% unterhalb der Sättigungsgrenze liegen. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Wasseranteil bei der Extraktion mindestens 2,5 Gew.%, mindestens 5 Gew.%, mindestens 7,5 Gew.% oder mindestens 10 Gew.%, jeweils bezogen auf die Summe aller im Extraktionsgemisch enthaltenen bei Raumtemperatur (23°C) flüssigen Lösungsmittel (einschließlich Wasser). Der Wasseranteil kann beispielsweise bis zu 95 Gew.%, bis zu 80 Gew.% oder bis zu 60 Gew.% betragen. Dabei kann der Wasseranteil beispielsweise 2,5 bis 95 Gew.%, insbesondere 5 bis 80 Gew.% oder 10 bis 60 Gew.% betragen. Der verbleibende Anteil ist jeweils polares organisches Lösungsmittel. Der Wasseranteil schließt auch das Wasser ein, das gegebenenfalls in den Mikroorganismen enthalten und/oder daran gebunden ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Wasseranteil am gesamten Extraktionsgemisch, also inklusive Zellmasse und Lösungsmittel, mindestens 2,5 Gew.%, mindestens 5 Gew.%, mindestens 7,5 Gew.% oder mindestens 10 Gew.%. Der Wasseranteil kann dabei beispielsweise bis zu 90 Gew.%, bis zu 75 Gew.% oder bis zu 50 Gew.% betragen. Dabei kann der Wasseranteil beispielsweise 2,5 bis 90 Gew.%, insbesondere 5 bis 75 Gew.% betragen.
Gesättigtes Ethylacetat enthält bei Raumtemperatur etwa 3,4 Gew.% Wasser. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Extraktion in Gegenwart von Ethylacetat und Wasser, wobei das Ethylacetat mindestens mit Wasser gesättigt ist. Der Wasseranteil ist bevorzugt insgesamt höher als 3,4 Gew.%, jeweils bezogen auf die Summe aller flüssigen Lösungsmittel (einschließlich Wasser). Bei einem deutlich höheren Wasseranteil liegen zwei flüssige Phasen vor. Es ist erfindungsgemäß nicht erforderlich, dass unpolares organisches Lösungsmittel, wie Hexan oder Chloroform, enthalten ist. Gegebenenfalls können aber geringe Mengen enthalten sein, beispielsweise bis zu 10 Gew.% oder bis zu 5 Gew.%, bezogen auf die Summe aller enthaltenen Lösungsmittel.
Der Gewichtsanteil der Mikroorganismen (Trockengewicht) an dem Extraktionsgemisch kann beispielsweise zwischen 2,5 und 75 Gew%, insbesondere zwischen 5 und 50 Gew.% oder zwischen 10 und 30 Gew.% betragen.
Vor Durchführung der Extraktion können die Mikroorganismen in einem Fermentationsansatz (Kulturlösung) kultiviert werden. Nach Wachstum, Vermehrung und Bildung einer gewünschten Menge Mikroorganismen können diese für die Extraktion eingesetzt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Mikroorganismen vor der Extraktion aus der Kulturlösung abgetrennt, beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugation. Die isolierten Zellen werden gegebenenfalls gewaschen. Gegebenenfalls werden mehrere Waschschritte durchgeführt, um Verunreinigungen und lösliche Komponenten der Kulturlösung zu entfernen. Die Waschschritte können beispielweise mit Wasser oder Pufferlösung durchgeführt werden. Bei der Abtrennung der Mikroorganismen wird eine wässrige Biomasse erhalten (Zellpaste). Dabei kann weiteres Wasser durch Verpressen und/oder Filtrieren entfernt werden. Die Biomasse wird bevorzugt unmittelbar, also ohne weitere Verarbeitungsschritte, zur Extraktion eingesetzt. Dabei werden das organische Lösungsmittel und gegebenenfalls zusätzliches Wasser hinzugefügt und gegebenenfalls vermischt. Die Abtrennung der Mikroorganismen ist jedoch nicht unbedingt erforderlich, da die erfindungsgemäße Extraktion auch nach Vermischen des polaren organischen Lösungsmittels mit wässrigem Fermentationsansatz erfolgen kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden getrocknete Mikroorganismen für die Extraktion eingesetzt. Getrocknete Mikroorganismen sind beispielsweise durch Sprühtrocknen, Lyophilisieren oder Wärmetrocknen erhältlich. Der Einsatz von getrockneten Mikroorganismen kann vorteilhaft sein, um die Mengenverhältnisse und den Wassergehalt möglichst gleichmäßig einzustellen. Das Trocknen erfolgt bevorzugt in einer Weise, dass die Zellen nicht aufgeschlossen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Mikroorganismen vor der Extraktion nicht getrocknet, insbesondere nicht lyophilisiert. Bei bekannten Verfahren wird ein solcher Schritt durchgeführt, um in Abwesenheit von Wasser die Extraktion zu ermöglichen. Erfindungsgemäß wurde dagegen gefunden, dass das Trocknen der Mikroorganismen nicht erforderlich ist, da eine hohe Ausbeute auch in Gegenwart von Wasser erzielt werden kann. Da das Trocknen und insbesondere Gefriertrocknen große Energiemengen beanspruchen, kann das erfindungsgemäße Verfahren daher nicht nur einfacher und effizienter, sondern auch kostengünstiger durchgeführt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Mikroorganismen nicht aufgeschlossen. Bevorzugt werden die Mikroorganismen vor der Extraktion nicht aufgeschlossen. Bevorzugt werden die Mikroorganismen auch im weiteren Verfahren, insbesondere bei der Extraktion und/oder durch die Extraktion, nicht oder nicht wesentlich aufgeschlossen. Dabei werden die Extraktionsbedingungen so schonend ausgewählt, dass kein Zellaufschluss erfolgt.
Üblicherweise erfolgt im Stand der Technik eine Extraktion von Inhaltsstoffen in Kombination mit einer Zellzerstörung (Zellaufschluss). Bei einem Zellaufschluss wird die Integrität der Zellwände zerstört. Dadurch wird das Zellinnere - wie z.B.: Phospholipide, Proteine, - freigesetzt und diffundiert in die Umgebung. Bei fortlaufender Disruption bilden sich Zelltrümmer und Agglomerate. Der Aufschluss kann mikroskopisch oder über geeignete Marker, gegebenenfalls in Verbindung mit Farbreaktionen, verfolgt werden. Zum Aufschluss von Mikroorganismen werden im Stand der Technik üblicherweise mechanische, chemische, enzymatische und/oder physikalische Methoden eingesetzt. Mechanische und physikalische Methoden umfassen das Zermahlen der Zellen, beispielsweise in Kugelmühlen, Ultraschallbehandlung und Homogenisieren. Auch heftiges Rühren und Schütteln kann zur Zerstörung von Zellmembranen führen.
Erfindungsgemäß werden die Mikroorganismen dabei bevorzugt vor und während der Extraktion nicht in einer Weise behandelt werden, welche die Zerstörung der Zellmembranen bewirkt oder wesentlich fördert. Erfindungsgemäß ist es auch nicht erforderlich, dass ein chemischer oder enzymatischer Aufschluss erfolgt, beispielsweise mit Lysozym. Bevorzugt findet keine Vorbehandlung der Zellen zu Zwecken des Zellaufschlusses statt und dem Extraktionsgemisch werden keine Zusätze zu diesem Zweck hinzugefügt. Allerdings kann auch bei einer Extraktion regelmäßig ein kleiner Anteil der Mikroorganismen zerstört werden, beispielsweise weil einzelne Mikroorganismen aus Altersgründen eine geringe Stabilität aufweisen oder bereits tot aus dem Fermentationsmedium erhalten sein können. Dieser Anteil kann durch eine schonende Behandlung, beispielsweise nur leichtes Schütteln, minimiert werden. Bevorzugt werden daher ohne gezielten Zellaufschluss weniger als 10%, 5% oder 2% der Zellen aufgeschlossen. Erfindungsgemäß kann auch ohne Maßnahmen zum Zellaufschluss oder zur Schwächung der Zellmembran eine hohe Ausbeute erzielt werden. Bevorzugt werden erfindungsgemäß ohne Zellaufschluss mindestens 50 Gew.%, mehr als 70 Gew.% oder mehr als 80 Gew.% aller Speicheriipide, insbesondere aller ungesättigter Fettsäuren, extrahiert.
Erfindungsgemäß wurde gefunden, dass die Extraktion ohne Zellaufschluss besonders schonend und selektiv verläuft und dass auf diese Weise eine besonders reine lipidhaltige Zusammensetzung erhalten wird. Dies war unerwartet, da übliche Extraktionsverfahren im Stand der Technik einen Aufschluss der Zellen erfordern. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, ist die hohe Reinheit eine Folge davon, dass die Lipide selektiv durch die Zellmembran in die organische Phase übergehen, während das übrige Zellinnere im Wesentlichen in den Zellen verbleibt. Außerdem scheinen die Lipide der Zellmembranen nicht oder zumindest weniger in die organische Phase überzugehen, wenn die Membranen/Zellwandstrukturen nicht aufgebrochen werden. Daher ist der Anteil unerwünschter Nebenprodukte (Proteine, Phospholipide aus den Membranen) im Extrakt und in der lipidreichen Zusammensetzung gering. Im Gebiet der Nahrungsmittelherstellung ist dies besonders vorteilhaft, da der Anteil potenziell unverträglicher Komponenten reduziert ist. Bei unbekannten Komponenten besteht grundsätzlich die Gefahr, dass diese Abwehrreaktionen, wie Allergien, auslösen.
In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung werden die Mikroorganismen vor und/oder während der Extraktion aufgeschlossen. Die Ausbeute kann gegebenenfalls durch diesen Zellaufschluss noch weiter erhöht werden. Der Zellaufschluss kann dabei mit den oben bereits genannten Methoden durchgeführt werden. Der Zellaufschluss kann mechanisch und/oder physikalisch, beispielsweise durch Mahlen, Homogenisieren oder mit Ultraschall, und/oder chemisch oder enzymatisch, beispielsweise mit Lysozym, erfolgen. Es wurde gefunden, dass bei Kombination der erfindungsgemäßen Extraktion, insbesondere mit Ethylacetat, mit einem Zellaufschluss eine nahezu quantitative Abtrennung der Lipide, insbesondere der ungesättigten Fettsäuren, erzielt werden kann. Bevorzugt werden in einem Verfahren mit Zellaufschluss mindestens 80 Gew.%, bevorzugt mehr als 90 Gew.% oder mehr als 95 Gew.% aller Speicheriipide, insbesondere aller ungesättigten Fettsäuren, extrahiert. Ob das erfindungsgemäße Verfahren mit Mitteln zum Zellaufschluss kombiniert wird, wird im Hinblick auf das gewünschte Produkt im Rahmen einer Kosten/Nutzen- Analyse entschieden werden. Durch einen zusätzlichen Aufschluss der Zellen wird zwar eine noch höhere Ausbeute erzielt, das Verfahren wird jedoch aufwändiger. Nachteilig ist auch, dass bei Durchführung eines Zellaufschlusses der Anteil von Verunreinigungen aus dem Zellinneren und der Membran im Produkt im allgemeinen höher ist. Neben den Speicherlipiden wird auch ein höherer Anteil von Lipiden aus der Zellmembran extrahiert. Die Erfindung stellt somit Möglichkeiten zur Verfügung, in einem schnellen Verfahren einen hohen Anteil von Lipiden in besonderer Reinheit zu isolieren oder in einem etwas komplexeren Verfahren einen noch höheren Anteil von Lipiden zu isolieren. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Mikroorganismen vor und während der Extraktion nicht an ein Trägermaterial fixiert. Insbesondere ist es nicht erforderlich, die Mikroorganismen an einen festen Träger oder in einem Gel zu immobilisieren.
Die Extraktion kann mit üblichen verfahrenstechnischen Extraktionsvorrichtungen und Hilfsmitteln durchgeführt werden. Je nach Maßstab kann die Extraktion beispielsweise in Gegenwart von Membranen, mit einer Extraktionszentrifuge, einem Extraktionsdekanter, als Kreuz-Extraktion mit Diafiltration, in einer Soxhiet-Apparatur oder mit einem Scheidetrichter durchgeführt werden. Die Extraktion kann kontinuierlich, Semi-Batch oder als Batch-Extraktion durchgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Extraktion mindestens zweifach durchgeführt, insbesondere zwei-, drei-, vier- oder fünffach. Dem Fachmann ist bekannt, dass bei der Wiederholung einer Extraktion mit jeweils relativ kleinen Mengen Extraktionsmittel dieses eingespart werden und gleichzeitig die Ausbeute erhöht werden kann (gemäß dem Nernstschen Verteilungssatz). Die Einsparung von Lösungsmitteln ist bei industriellen Prozessen aus Umwelt- und Kostenerwägungen wünschenswert.
Die erfindungsgemäße Extraktion kann bei üblichen Temperaturen durchgeführt werden, beispielsweise bei 0°C bis 100°C. In einer Ausführungsform der Erfindung wird das Verfahren bei niedriger Temperatur durchgeführt, beispielsweise bei 0°C bis 40°C, insbesondere ungefähr bei Raumtemperatur (23°C). Die Extraktion ist auch bei solchen niedrigen Temperaturen effizient. Die Extraktion bei niedrigen Temperaturen hat den Vorteil, dass die Extraktion schonend und energiesparend verläuft. Die Ausbeute kann dabei durch mehrfache Extraktion erhöht werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Extraktion bei erhöhter Temperatur durchgeführt, beispielsweise bei 40°C bis 100°C, insbesondere zwischen 50°C und 90°C. Die Extraktion bei erhöhter Temperatur hat den Vorteil, dass gegebenenfalls die Ausbeute erhöht wird. Eine mögliche Variante ist dabei eine Kombination der Extraktion mit einer Lösungsmittelentfernung.
Die Extraktion wird so lange durchgeführt, bis eine gewünschte Menge Lipide in die organische Phase übergegangen ist. Beispielsweise kann die Extraktion mit Ethylacetat über einen Zeitraum von 1 min bis 10 h, bevorzugt zwischen 30 min und 5 h durchgeführt werden. Es wurde gefunden, dass nach 2 Stunden bei 4°C bereits über 80% der Lipide aus dem Zellinneren in die organische Phase aufgenommen werden.
Die Vermischung der Komponenten kann jeweils durch geeignete Maßnahmen, wie sanftes Schütteln oder vorsichtiges Suspendieren, unterstützt werden. Sofern das Verfahren ohne Aufschluss der Zellen durchgeführt wird, stellt der Fachmann die Bedingungen so ein, dass eine Beschädigung der Zellmembranen so weit wie möglich vermieden wird. Das Verfahren kann durch bekannte übliche Maßnahmen ergänzt und optimiert werden, beispielweise Waschen, Zentrifugieren, Filtrieren oder sonstige Trennschritte.
Bevorzugt wird das Extraktionsgemisch zentrifugiert, um eine Phasentrennung zu erreichen. Die lipidhaltige flüssige Phase wird abgetrennt. Als Produkt wird ein Gemisch erhalten, das polares organischen Lösungsmittel und Lipide enthält, wobei gegebenenfalls ein Wasseranteil und übliche Verunreinigungen enthalten sind. Die Lösungsmittel, also das organische Lösungsmittel und Wasser, können nach bekannten Methoden entfernt werden, beispielsweise durch Verdampfen bei erhöhter Temperatur, und/oder Vakuum, Membranfiltration und/oder Ausfällen von Fettsäuren. Im Ergebnis wird eine lipidhaltige Zusammensetzung erhalten, die im Wesentlichen aus Lipiden besteht. Die Lipide können nach üblichen Methoden weiter verarbeitet werden, beispielsweise durch chemische Modifikation oder Raffination. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das polare organische Lösungsmittel, wie Ethylacetat, nach der Extraktion von dem Produkt abgetrennt, insbesondere durch Destillieren, und in dem Verfahren wieder verwendet. Erfindungsgemäß wurde gefunden, dass ein Recycling der Lösungsmittel ohne Beeinträchtigung der Qualität möglich ist. Auf diese Weise können Material und Kosten eingespart werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Verfahren ein solches zur Herstellung einer DHA-haltigen Zusammensetzung, die nach Abtrennung des Ethylacetat mehr als 10 Gew.% DHA enthält, wobei die DHA mit Ethylacetat aus Mikroorganismen der Gattung Ulkenia extrahiert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren die Schritte:
(a) Bereitstellen von Mikroorganismen,
(b) Zugeben von Ethylacetat und Suspendieren der Mikroorganismen in Gegenwart von Wasser,
(c) Extrahieren von Lipiden insbesondere von mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFA), durch das Ethylacetat,
(d) Abtrennen einer flüssigen Phase mit darin gelösten Lipiden, wobei die flüssige Phase bevorzugt eine organische Phase ist,
(e) gegebenenfalls Aufschließen der Mikroorganismen,
(f) gegebenenfalls Wiederholen der Schritte c) bis e), und
(g) Abtrennen der Lösungsmittel von der flüssigen, bevorzugt organischen, Phase.
In Schritt (b) wird bevorzugt so viel Ethylacetat zugesetzt, dass sich zwei wässrige Phasen ausbilden. Der Aufschluss in Schritt (e) mit anschließender Wiederholung (f) des Extraktionsverfahrens dient zur Erhöhung der Ausbeute.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch ein Verfahren zur Isolierung und/oder Aufreinigung von Lipiden, insbesondere von mehrfach ungesättigten Fettsäuren, aus Mikroorganismen. Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Isolierung und/oder Aufreinigung von Lipiden, insbesondere von mehrfach ungesättigten Fettsäuren. Gegenstand der Erfindung ist auch eine lipidhaltige Zusammensetzung, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhältlich oder erhalten ist. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung unterscheidet sich von Lipid-Extrakten aus dem Stand der Technik durch den geringen Anteil von unerwünschten Komponenten aus dem Zellinneren und der Zellmembran. Beispielsweise ist nur ein geringer Anteil an Phospholipiden enthalten. Auch der Anteil von Peroxiden und p-Anisidin ist niedrig. Zudem sind keine Spuren von gesundheitlich problematischen Lösungsmitteln enthalten, wie Hexan oder Chloroform. Die Zusammensetzung ist daher besonders geeignet zur Herstellung von Produkten in der Kosmetik, Pharmazie und im Nahrungsmittelbereich.
Die Zusammensetzung der Lipide hängt von den verwendeten Mikroorganismen ab. In einer Ausführungsform ist die lipidreiche Zusammensetzung ein Gemisch der Lösungsmittel mit den extrahierten Lipiden. In einer weiteren Ausführungsform ist die Zusammensetzung eine solche, von der das polare organische Lösungsmittel ganz oder teilweise abgetrennt wurde. Der Anteil des organischen Lösungsmittels ist dann bevorzugt kleiner 10 Gew.%, kleiner 1 Gew.%, kleiner 0,5 Gew.% oder kleiner 0, 1 Gew.%. Der Anteil an Lipiden ist dann bevorzugt mindestens 90 Gew.%, mindestens 95 Gew.% oder mindestens 98 Gew.%. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die lipidhaltige Zusammensetzung ein Öl. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung enthält bevorzugt mehr als 50 Gew.% ungesättigte Fettsäuren, insbesondere mehr als 20 Gew.% oder mehr als 50 Gew.% DHA. Der Anteil an nicht-Lipiden ist bevorzugt kleiner als 5 Gew.%, kleiner als 2 Gew.% oder als 1 Gew.%.
Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Zusammensetzung lösen die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe. Überraschenderweise kann mit dem Verfahren eine effiziente und zugleich einfache Extraktion von Lipiden aus Mikroorganismen durchgeführt werden. Ungewöhnlich hohe Ausbeuten werden sogar ohne vorherigen Aufschluss der Mikroorganismen erzielt. Das Verfahren kann mit trockenen oder feuchten Mikroorganismen durchgeführt werden. Durch die schonende Extraktion ohne Disruption der Zellen kann eine hochreine Lipidzusammensetzung erhalten werden, die geringe Anteile an unerwünschten Zellinhaltsstoffen und Komponenten der Zellmembran enthält. Bei Kombination des Verfahrens mit einem Aufschluss kann eine nahezu quantitative Gewinnung der Lipide aus den Zellen erreicht werden. Das Verfahren ist insgesamt energie- und kosteneffizient. Geeignete Lösungsmittel, wie Ethylacetat, sind in großen Mengen verfügbar und gesundheitlich unbedenklich, so dass die gereinigten Lipide in Lebensmitteln, Pharmazeutika oder Kosmetika weiterverarbeitet werden können. Das Lösungsmittel Ethylacetat kann zudem nach der Abtrennung in das Verfahren zurückgeführt werden, ohne dass die Qualität beeinträchtigt wird.
Figuren:
Figur 1 zeigt lichtmikroskopische Aufnahmen von Proben von Ulkenia, die während des Extraktionsverfahrens gemäß Beispiel 8 entnommen wurden. Die Proben wurden vor dem ersten Aufschluss 0 und nach 1 , 2 und 3 Aufschlüssen entnommen. Für jede Probe ist eine 4fache, 10fache und 40fache Vergrößerung gezeigt.
Figur 2 zeigt für den Extraktionsversuch aus Beispiel 9 den p-Anisidingehalt der Extrakte nach jeder Extraktion (photometrisch bestimmt). Es wurden zwei verschiedene Batches von Zellmaterial untersucht (Quadrate und Kreise). Die Linie bei 50,0 entspricht einem akzeptablen Schwellenwert für Anwendungen im kosmetischen und Lebensmittelbereich.
Figur 3 zeigt für den Extraktionsversuch aus Beispiel 9 den Peroxidgehalt der Extrakte nach jeder Extraktion in mEq/kg. Es wurden zwei verschiedene Batches von Zellmaterial untersucht (Quadrate und Kreise). Die Linie bei 15,0 [mEq/kg] entspricht einem akzeptablen Schwellenwert für Anwendungen im kosmetischen und Lebensmittelbereich.
Beispiele: Beispiele 1 bis 7: Vorversuche zur Extraktion mit Ethylacetat/Wasser In einer Versuchsreihe wurde aus verschiedenen Extraktionsgemischen DHA-ÖI aus Mikroorganismen extrahiert, ohne das die Zellen vorher aufgeschlossen wurden. Als Mikroorganismus wurde die Mikroalge Ulkenia SAM2179 und als Extraktionsmittel reines EtOAc verwendet. Dabei wurden Extraktionsgemische mit unterschiedlichen Anteilen von Wasser, EtOAc und Biomasse wie in Tabelle 1 gezeigt hergestellt. Die Biomasse war nach der Zentrifugation feucht, so dass auch die Probe zu Beispiel 4 Wasser enthielt. Die Einfärbung der organischen Phase mit gelber DHA wurde jeweils visuell beurteilt. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1 : Übersicht der Probenzubereitungen und Ergebnisse der Beispiele 1 bis 7 (Gelbfärbung: ++ deutlich, + leicht, - keine).
Figure imgf000022_0001
Die Proben der Beispiele 1 bis 4 wurden jeweils gemischt und zentrifugiert. Die Biomasse war anfänglich nicht gut in EtOAc suspendierbar. Sie ließ sich daher anfänglich nicht auf einfache Weise mechanisch handhaben, beispielsweise rühren oder pumpen. Innerhalb von wenigen Stunden zerfiel die Zellmasse jedoch und war dann gut verarbeitbar. Die Intensität der Gelbfärbung zeigte an, ob und wie viel DHA- ÖI in die EtOAc-Phase aufgenommen wurde. Während die EtOAc-Phase bei Beispiel 1 deutlich gelblich eingefärbt war, war die Intensität bei den Beispielen 2 und 3 gering. Bei Beispiel 4 war die EtOAc-Phase gelblich und stark eingetrübt. In Beispiel 7 ließ sich die Biomasse in Wasser leicht wieder suspendieren. Dagegen setzte sich die Biomasse in EtOAc in Beispiel 4 sofort am Boden ab. Die Masse war dabei zäh und kaugummiartig. Das EtOAc färbte sich anfangs ein wenig gelblich. Die Biofeuchtmasse mit dem Ethylacetat wurde über zwei Stunden im Kühlschrank belassen. Mit zunehmender Zeit verlor die Biomasse an Konsistenz und bildete kleine Flocken. Das Ethylacetat färbte sich während 2 Stunden deutlich gelb ein. Unter dem Lichtmikroskop war zu erkennen, dass die Zellen aus Beispiel 4 weiterhin intakt waren. Daher erfolgte die Extraktion durch die Zellmembran hindurch. Die Ergebnisse zeigen, das DHA-ÖI überraschenderweise mit einer ausreichenden Menge EtOAc ohne Aufschluss der Zellen in Gegenwart von Wasser aus einer Fermentationslösung selektiv extrahiert werden kann. Um zu zeigen, dass die Gelbfärbung tatsächlich quantitativ mit dem gewonnen DHA- ÖI korreliert ist, wurden die EtOAc-Phase und die Biofeuchtmasse aus Beispiel 4 nach zwei Stunden durch Zentrifugieren voneinander getrennt, einrotiert und jeweils hinsichtlich Fettsäuren analysiert. Das Ergebnis zeigte, dass 81 % der gesamten DHAs in der EtOAc-Phase enthalten sind. Nur gut 18% wurden nicht extrahiert und verblieben in der Biomasse. Da die Fermentationsbrühe nicht aufgeschlossen wurde, war der hohe Anteil der extrahierten DHA unerwartet.
Die Versuche 1 bis 7 wurden mit aufgeschlossener Biomasse wiederholt. Dabei konnten keine deutlichen Veränderungen festgestellt werden (nicht gezeigt). Die Färbung des EtOAc schien bei visueller Betrachtung etwas dunkler zu sein. Insgesamt zeigen die Versuche, dass eine Extraktion von DHA-ÖI mit EtOAc in Gegenwart von Wasser durchführbar ist, wobei selbst ohne vorherigen Zellaufschluss sehr hohe Ausbeuten erzielbar sind. Beispiel 8: Extraktion mit Ethylacetat/Wasser
Zunächst wurden 2,18 kg Fermentationsbrühe von Ulkenia SAM2179 bei 8000 rpm für 20 min zentrifugiert, der Überstand (rund 1800 ml) abgenommen und verworfen. Die Biofeuchtmasse (etwa 380 g) wurde auf zwei 1 L Flaschen gleich aufgeteilt und mit je 900 ml (810 g) EtOAc aufgefüllt. Nach zwei Stunden Lagerung unter Kühlung wurde ein Zellaufschluss durchgeführt. Dafür wurde der Inhalt einer Flasche kräftig gerührt und so oft wie nötig durch eine Kugelmühle (RKM) geführt, bis der Aufschluss der Zellen bei nahezu 100% liegt.
Unmittelbar vor dem ersten Aufschluss und nach jedem Aufschluss wurden Proben entnommen, um jeweils den DHA-Gehalt in der EtOAc-Phase und in der Biomasse zu bestimmen. Die Biomasse wurde dabei anschließend mittels Filtration von dem EtOAc getrennt, einrotiert und auf Fettsäuren analysiert. Die Biomasse musste anschließend noch lyophilisiert werden, da sie trotz starken Unterdrucks Feuchtigkeit aufwies. Als Ergebnis wurde gefunden, das bereits vor dem ersten Aufschluss 88% der DHA in der Ethylacetatphase enthalten waren, während nur 12% in der Biomasse verblieben waren. Nach Durchführung des gesamten Aufschlusses waren 97% der DHA in der Ethylacetatphase enthalten, während noch 3% in der Biomasse verblieben. Die Ergebnisse zeigen, dass eine sehr hohe Ausbeute bereits ohne Zellaufschluss erzielt werden kann. Die Ausbeute kann durch den Zellaufschluss noch weiter erhöht werden, wobei die DHA fast vollständig extrahiert wird.
Unmittelbar vor dem ersten Aufschluss und nach jedem Aufschluss wurde Biomasse entnommen und unter dem Lichtmikroskop untersucht. Die Ergebnisse sind in Figur 1 gezeigt. Bei der mit„0" gekennzeichneten Probe (untere Zeile), also vor dem ersten Aufschluss, sind nach 2 Stunden die einzelnen intakten Zellen gut zu erkennen. Die Zellen verbinden sich dabei zu losen Agglomeraten. Nach Aufschluss der Zellen wird dagegen eine Zusammenballung der Biomasse beobachtet und einzelne Zellen sind nicht mehr zu unterscheiden. Nach dem zweiten Aufschluss liegt kaum noch intakte Zellmasse vor. Allerdings befand sich noch ein großer Anteil der Zellmasse in der Kugelmühle. Deshalb wurde der EtOAc-Überstand noch einmal durch die Mühle gefahren. Nach dem dritten Durchlauf reduzierte sich die feste Biomasse um insgesamt etwa 300 g. Auf keinem der Bilder sind Öltropfen zu erkennen.
Die EtOAc-Phasen vor und nach dem Aufschluss wurden chromatographisch untersucht. Der Vergleich zeigte, dass die Anzahl der Nebenprodukte nach dem Zellaufschluss erhöht ist. Dies deutet ebenfalls darauf hin, dass das Zellinnere erst durch den Aufschluss freigesetzt wurde oder dass Membranbestandteile in den Extrakt übergehen. Um eine möglichst reine DHA-Präparation mit wenig unbekannten Nebenprodukten zu erhalten, kann es daher vorteilhaft sein, das Verfahren schonend ohne Aufschluss der Zellen durchzuführen. Dies könnte beispielsweise im Nahrungsmittelbereich von Vorteil sein, um das Risiko von Unverträglichkeiten und Allergien zu reduzieren.
Beispiel 9: Untersuchung der Reinheit des Produkts
Als Ausgangsmaterial wurde Ulkenia in Form eines feuchten Presskuchens aus der Filterpresse mit einem Wassergehalt von ca. 65 Gew.% eingesetzt. Die feuchte Biomasse wurde vorgelegt und mit reinem EtOAc in einem Verhältnis 4 Teile EtOAc zu 1 Teil trockene Biomasse versetzt. Bei der Extraktion ergab sich somit ein Gewichtsverhältnis von EtOAc/H2O/trockene Biomasse von ungefähr 4/2/1 . Die Batch-Extraktion erfolgte unter Rührung und bei T = 20°C. Nach 2 h Extraktionszeit wurde die Rührung abgestellt. Nach 5 Minuten Absetzzeit (Sedimentation der Suspension) wurde die organische Phase mittels eines Tauchrohrs und Aufpressen mit Stickstoff aus dem System entfernt. In der organischen Phase reicherte sich die DHA an. Mit der verbleibenden Biomasse wurden weitere Batch-Extraktionen mit der gleichen Menge an EtOAc (diesmal gesättigt mit H2O) durchgeführt. Es wurden insgesamt 5 Extraktionen durchgeführt. Nach jeder Extraktion wurden in der organischen Phase der Gehalt an DHA-ÖI, an p-Anisidin und der Peroxid-Wert bestimmt. Die organischen Phasen wurden vereint. Schließlich wurde das EtOAc in eine Rotovapor abdestilliert. Die Ergebnisse sind in den Figuren 2 und 3 dargestellt. Der Gehalt an p-Anisidin und Peroxiden dient als Qualitätsmarker für die Reinheit. Für p-Anisidin zeigt Figur 2 die photometrisch ermittelte Menge des Produktes nach jeder Extraktion (gemäß AOCS Official Method Cd 18-90). Die übliche und für spätere Anwendungen im Lebensmittel- und Kosmetikbereich akzeptable Obergrenze beträgt 50,0. Figur 3 zeigt die Peroxidwerte der Produkte nach jeder Extraktion (in mEq./kg, bestimmt gemäß AOCS Official Method Cd 8-53). Die übliche Obergrenze beträgt 15,0. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen weisen p- Anisidin und Peroxid-Werte auf, die deutlich unterhalb der üblichen Schwellenwerte liegen und die für nicht raffiniertes Rohöl ungewöhnlich niedrig sind. Die Produkte sind daher für Anwendungen im Lebensmittel- oder Kosmetikbereich geeignet.
Beispiele 10 bis 16: Untersuchung der Bedeutung des Wasseranteils
Um den Einfluss des Wasseranteils auf die Extraktion zu bestimmen, wurde eine Versuchsreihe mit verschiedenen Wassergehalten durchgeführt. Dabei wurde Ulkenia in Form von trockener Biomasse (Restwassergehalt 1 bis 4 Gew.%) und reines EtOAc in den Beispielen 10 bis 15 sowie gesättigtes EtOAc in Beispiel 16 (Wasseranteil ca. 3,4 Gew.%) eingesetzt. Die Zusammensetzungen der Extraktionsgemische und die Ergebnisse werden unten in Tabelle 2 zusammengefasst. In den Beispielen 10 bis 15 wurden Wasseranteile in den angegebenen Mengen zugegeben. Bei Beispiel 16 wurden kein zusätzliches Wasser hinzugefügt. In Tabelle 2 ist jeweils der ermittelte DHA-Gehalt der organischen Phase angegeben. Der Vergleich zeigt, dass in Gegenwart von Wasser oberhalb der Sättigungsgrenze von EtOAc eine deutlich höhere Ausbeute erzielt wird.
Tabelle 2: Zusammensetzungen und Ergebnisse der Beispiele 10 bis 16
Figure imgf000026_0001
(*) Extraktion mit H20-gesättigtem EtOAc (3.4% H20)
Wdh. = Wiederholung

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1 . Verfahren zur Herstellung einer lipidhaltigen Zusammensetzung, wobei Lipide in Gegenwart von mindestens einem polaren organischen Lösungsmittel und Wasser aus Mikroorganismen extrahiert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die Mikroorganismen Mikroalgen sind,
3. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Mikroorganismen solche der Gattung Ulkenia, Schizochytrium oder Thraustochytrium sind.
4. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Lipide mehrfach ungesättigte Fettsäuren enthalten.
5. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Lipide Docosahexaensäure enthalten, wobei der Anteil der Docosahexaensäure an den Lipiden bevorzugt mindestens 10 Gew.% ist.
6. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Mikroorganismen, bezogen auf das Trockengewicht, mindestens 2 Gew.% Speicheriipide enthalten.
7. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Extraktionsgemisch eine wässrige flüssige Phase und eine organische flüssige Phase aufweist.
8. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das polare organische Lösungsmittel teilweise mit Wasser mischbar und mit Wasser gesättigt ist, oder wobei das polare organische Lösungsmittel vollständig mit Wasser mischbar ist.
9. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das polare organische Lösungsmittel ein Ester ist, insbesondere Ethylacetat.
10. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Mikroorganismen vor der Extraktion nicht aufgeschlossen werden.
1 1 . Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Extraktionsgemisch mindestens 2,5 Gew.% Wasser enthält.
12. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das organische Lösungsmittel nach der Extraktion von der lipidhaltigen Zusammensetzung abgetrennt wird.
13. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen von Mikroorganismen,
(b) Zugeben von Ethylacetat und Suspendieren der Mikroorganismen in Gegenwart von Wasser,
(c) Extrahieren von Lipiden, insbesondere von mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFA), durch das Ethylacetat,
(d) Abtrennen einer flüssigen Phase mit darin gelösten Lipiden, wobei die flüssige Phase bevorzugt eine organische Phase ist,
(e) gegebenenfalls Aufschließen der Mikroorganismen,
(f) gegebenenfalls Wiederholen der Schritte c) bis e), und
(g) Abtrennen der Lösungsmittel von der flüssigen, bevorzugt organischen, Phase.
14. Verwendung eines Verfahrens gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche zur Isolierung und/oder Aufreinigung von Lipiden, insbesondere von mehrfach ungesättigten Fettsäuren.
15. Lipidhaltige Zusammensetzung, erhältlich durch ein Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche.
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