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WO2014072934A1 - Utilisation de lumiere bleue pour la stimulation du metabolisme de microorganismes non phototrophes - Google Patents

Utilisation de lumiere bleue pour la stimulation du metabolisme de microorganismes non phototrophes Download PDF

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Publication number
WO2014072934A1
WO2014072934A1 PCT/IB2013/059979 IB2013059979W WO2014072934A1 WO 2014072934 A1 WO2014072934 A1 WO 2014072934A1 IB 2013059979 W IB2013059979 W IB 2013059979W WO 2014072934 A1 WO2014072934 A1 WO 2014072934A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
blue light
microorganisms
illumination
wastewater
metabolism
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/IB2013/059979
Other languages
English (en)
Inventor
Olivier GIRINSKY
Nicolas GIRARDIN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to EP13815156.8A priority Critical patent/EP2938719A1/fr
Publication of WO2014072934A1 publication Critical patent/WO2014072934A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F3/34—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F1/00—Treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F1/30—Treatment of water, waste water, or sewage by irradiation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02W—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES RELATED TO WASTEWATER TREATMENT OR WASTE MANAGEMENT
    • Y02W10/00—Technologies for wastewater treatment
    • Y02W10/30—Wastewater or sewage treatment systems using renewable energies
    • Y02W10/37—Wastewater or sewage treatment systems using renewable energies using solar energy

Definitions

  • Microorganisms are used nowadays in many processes that it is for the degradation of undesirable molecules, the synthesis of molecules of interest or the production of biomass. There is a constant need for new methods for increasing the yields of biological processes involving microorganisms without increasing the energy cost of implementing the process.
  • non-phototrophic microorganisms are not able to generate energy from light, the existence of proteins capable of detecting the presence of blue light has been discovered.
  • YcgF YcgE proteins are known blue light sensors in E. coli and are strongly induced at low temperature by exposure to blue light.
  • One of the objectives of this invention is to propose a method for stimulating the metabolism, and therefore the growth, of non-phototrophic microorganisms. This method can be applied to many biological processes involving the presence of non-phototrophic microorganisms and can increase yields compared to methods not using the method disclosed in this invention. Another object of this invention is to provide devices for applying this method.
  • the invention relates to a biological method involving the use of non-phototrophic microorganisms characterized in that it comprises a blue light illumination step of non-phototrophic microorganisms to stimulate their metabolism.
  • this biological process is a biological treatment process for wastewater and more particularly urban wastewater.
  • this biological process is a process for the bioproduction of molecules by non-phototrophic microorganisms and more particularly a biological process for producing enzymes, fuels, alcoholic beverages, antibiotics, vitamins, proteins, recombinant proteins, polymers, organic acids or amino acids.
  • the biological methods of the invention can be performed under anaerobic or aerobic conditions.
  • the invention also relates to a device for implementing the biological method described above, characterized in that it comprises (1) a vessel containing a culture medium or wastewater, (2) at least one illumination source in blue light illuminating the tank and / or its contents.
  • the blue light used in the methods or devices described above at a wavelength of between 430 and 495 nm.
  • the blue light illumination source (s) used in the methods or devices described have an intensity of less than 1000 lumens.
  • the blue-light illumination used in the methods or devices described previously emits continuously or periodically.
  • Figure 1 shows the growth enhancement and biomass increase of E. coli K12 in blue light illumination.
  • Figure 2 shows the growth enhancement and biomass increase of Sporosarcina pasteurii following blue light illumination.
  • Figure 3 shows the improvement in acid production by a consortium of lactic acid bacteria following blue light illumination.
  • Figure 4 shows the growth improvement of a consortium of lactic acid bacteria following blue light (L L) illumination compared to Darkness.
  • Figure 5 shows the solid growth acceleration of E. coli K12 during blue light illumination compared to a dark culture.
  • the present invention relates to the use of blue light illumination for stimulating the metabolism of non-phototrophic microorganisms in biological methods involving the presence of non-phototrophic microorganisms.
  • the present invention also relates to devices for the cultivation of non-phototrophic microorganisms comprising a means of illumination in blue light. More particularly, the devices intended for the cultivation of non-phototrophic microorganisms are used in the treatment of wastewater.
  • the invention will thus relate to the use of a blue light illumination for stimulating the metabolism of non-phototrophic microorganisms in a purification plant aeration basin.
  • the present invention is based on the discovery by the inventors of the ability of blue light to stimulate the metabolism of non-phototrophic microorganisms. More particularly, the light waves between 430 and 495 nm surprisingly have the capacity to stimulate the metabolism of microorganisms and this without this action being dependent on the expression of photosynthetic pigments such as bacteriophylls, xanthorhodopsins, proteorhodopsins or bacteriorhodopsins, or other pigments such as carotenoids.
  • photosynthetic pigments such as bacteriophylls, xanthorhodopsins, proteorhodopsins or bacteriorhodopsins, or other pigments such as carotenoids.
  • the illumination in blue light of non-phototrophic microorganisms leads to an improvement of the biological processes intended for the treatment of wastewater or the bioproduction of molecules of interest.
  • the bioproduction systems of molecules stimulated by the present invention do not include pigment production
  • Blue light is used as a cellular stimulus, rather than an energy contributing to chemical reactions.
  • the present invention is based on the discovery of the ability of this signal to increase the metabolism of non-phototrophic microorganisms independently of their ability to produce energy from light sources but through a cascade of regulatory reactions.
  • the inventors have discovered that the efficacy of stimulation of blue light depends on the physiological status of the microorganism during illumination.
  • the illumination according to the invention will stimulate the metabolism and induce improved growth and increased protein production.
  • the microorganism when the microorganism is in conditions that are not conducive to an acceleration of its metabolism or its growth (low temperature, non-optimum environment such as a medium that is poor in organic matter), the blue light will induce a decrease in growth. .
  • the invention relates to biological methods involving the use of non-phototrophic microorganisms maintained under favorable growing conditions such as optimum growth temperatures or high concentrations of organic matter.
  • the temperature is generally not controlled in the water treatment systems, but growth conditions (concentration of organic matter, aeration, etc.) are favorable for the microorganisms involved in the biodegradation.
  • the temperature is generally maintained at about 37 ° C and the culture media are rich in organic matter.
  • Phototrophic microorganisms are micro-organisms that use light in photosynthetic processes to acquire energy. "Non-phototrophic" microorganisms are not able to use light to acquire energy. Many reference works in microbiology make it possible to differentiate between these two types of microorganisms.
  • Non-phototrophic microorganisms are micro-organisms that use the energy of chemical compounds as the main source of energy. They are distinguished from “phototrophic” microorganisms, for which this main source of energy is light. Non-phototrophic microorganisms are present in many industrial processes. They are particularly present in wastewater, of which they constitute the main population and proceed to the transformation of organic matter present in these waters into energy and waste in easily separable forms of water. These microorganisms can also be found in many processes for the biosynthesis of molecules for therapeutic, industrial or food purposes.
  • the non-phototrophic microorganisms concerned by the invention may be of natural origin or genetically modified organisms.
  • the "metabolism” for a microorganism is the set of molecular and energetic transformations that take place uninterruptedly in the living microorganism.
  • stimulation of metabolism means increasing the metabolism of microorganisms and thus promoting the rate of multiplication of microorganisms and thus accelerate the degradation of organic matter, increase the production of molecules and / or increase the maximum biomass achieved. According to a preferred interpretation, the present invention makes it possible to increase the rate of multiplication of the microorganisms.
  • a "photo stimulable” or “photostimulation” microorganism for one of its properties or functions, is a microorganism whose property or function can be controlled or activated by a variation of surrounding light energy, a light signal, or light stimulation.
  • industrial wastewater which includes all wastewater from premises used for commercial or industrial purposes other than domestic sewage and runoff;
  • a biological treatment comprises at least one step of bringing microorganisms into contact with wastewater and a step of degradation of pollutants by said microorganisms to cause a depollution of these waters.
  • a bioproduction process comprises at least one step of contacting microorganisms with a culture medium and a step of producing molecules of interest by said microorganisms.
  • a “biological treatment device” is a device by which the wastewater is depolluted for the purpose of sanitizing it. It can take many forms since its main function is to contact, under favorable conditions, the microorganisms with the substrate to be transformed. Thus, many well-known devices can serve, within the meaning of the invention, biological treatment basin.
  • such a device can be: a bioreactor, membrane bioreactor, fixed bed bioreactor, fluidized bed bioreactor, column bioreactor, upflow sludge bed bioreactor, biofilm bioreactor (s) , stirred continuous bioreactor, stirred batch bioreactor, tubular bioreactor, fermenter, aeration tank, septic tank, digester, phase separation digester, activated sludge, biofilters or a combination of several such devices.
  • a bioreactor membrane bioreactor, fixed bed bioreactor, fluidized bed bioreactor, column bioreactor, upflow sludge bed bioreactor, biofilm bioreactor (s) , stirred continuous bioreactor, stirred batch bioreactor, tubular bioreactor, fermenter, aeration tank, septic tank, digester, phase separation digester, activated sludge, biofilters or a combination of several such devices.
  • a device for the cultivation of non-phototrophic microorganisms may be chosen for example from the following list: bioreactor, membrane bioreactor, fixed bed bioreactor, fluidized bed bioreactor, column bioreactor, biofilm bioreactor , stirred continuous bioreactor, stirred discontinuous bioreactor, tubular bioreactor, fermentor.
  • bioreactor membrane bioreactor, fixed bed bioreactor, fluidized bed bioreactor, column bioreactor, biofilm bioreactor , stirred continuous bioreactor, stirred discontinuous bioreactor, tubular bioreactor, fermentor.
  • the inventors have discovered that the spectrum of illumination used has an influence on the efficiency of the stimulation. Indeed, illuminations by natural light or light generated by an incandescent bulb do not induce the desired effect. While illuminations by a white or blue light-emitting diode (LED) induce such stimulation.
  • LED white or blue light-emitting diode
  • blue-light illumination refers to illumination having a wavelength exclusively between 430 nm and 500 nm; preferentially, the illumination in blue light refers to a lighting whose intensity is increased for wavelengths between 430 nm and 500 nm.
  • blue light illumination includes illumination having a higher relative intensity between 430 nm and 500 nm wavelengths relative to sunlight.
  • a blue light illumination corresponds to a lighting having a ratio between i) the intensity of the wavelengths corresponding to the blue light, and ii) the intensity of the total wavelengths which is greater than that of the sunlight.
  • the stimulus is not intended to have a direct action on the organic molecules of wastewater. It acts through the stimulation of non-phototrophic microorganisms present in wastewater. Also, since blue light illumination constitutes this signal, the intensity of illumination is lower than that used for white light illumination used in processes including phototrophic microorganisms.
  • the invention may relate to aerobic or anaerobic methods. Likewise, it can be applied to culture devices intended to function aerobically or anaerobically.
  • a major part of the metabolism of chemotropic microorganisms is the transformation of organic matter from the environment into biomass, energy for said micro-organisms, or new organic substances.
  • This family includes but is not limited to: aerobic purification, anaerobic purification, denitrification, nitrification, biodegradation of organic molecules, biosorption, dephosphatation, iron removal.
  • This family includes, but is not limited to, applications for the production of: dairy products, alcoholic beverages, amino acids, vitamins, flavors, enzymes, recombinant proteins, fuels, pigments, insecticides and biological pesticides.
  • This family includes, but is not limited to, the production of biomass, yeast extract.
  • the invention relates to a biological method involving the action of non-phototrophic microorganisms characterized in that it comprises a blue light illumination step non-phototrophic microorganisms to stimulate their metabolism.
  • the invention is particularly applicable to the treatment of industrial effluents or urban biologically and more particularly to urban wastewater treatment processes for their purification aerobic biological means including activated sludge, or to processes comprising such a step.
  • non-phototrophic microorganisms are responsible for the purification of this wastewater, which makes the invention applicable in the purification plant industry or to another biological treatment device.
  • illumination in blue light could reduce the lag phase and improve the growth of strains belonging to the genera Pseudomonas, Alcaligenes, Aeromonas and Acinetobacter. In an urban wastewater treatment process, this may lead to accelerating the ramp-up of activated sludge
  • the invention therefore relates to a biological treatment process for wastewater characterized in that it comprises a step of illuminating said wastewater, in blue light, to obtain a stimulation of the metabolism of non-phototrophic microorganisms contained in the waters waste. More particularly, the biological wastewater treatment process is a treatment of urban wastewater.
  • the invention also relates to a biological wastewater treatment device characterized in that it comprises means for illuminating said wastewater, in blue light, to obtain a stimulation of the metabolism of non-photo trophic microorganisms contained in Wastewater.
  • the biological wastewater treatment device is an aeration tank.
  • the invention relates to a wastewater treatment method comprising a step of nitrification of wastewater characterized in that it comprises a step of illuminating said wastewater, in blue light, to obtain stimulation.
  • metabolism of non-phototrophic microorganisms in wastewater may be advantageously selected from the genera nitrosomonas, nitrobacter or nitrospira.
  • the invention relates to a wastewater treatment method comprising a wastewater denitrification step characterized in that it comprises a step of illuminating said wastewater, in blue light, to obtain a stimulation. metabolism of non-phototrophic microorganisms in wastewater.
  • the stimulated non-phototrophic microorganisms may be advantageously selected from the genera Alcaligenes, Paracoccus, Pseudomonas or Thiobacillus.
  • the invention relates to a wastewater treatment method comprising a step of dephosphating wastewater characterized in that it comprises a step of illuminating said wastewater, in blue light, to obtain a stimulation metabolism of non-phototrophic microorganisms in wastewater.
  • the stimulated non-phototrophic microorganisms may be advantageously selected from the genera Rhodocyclus, Acinetobacter, Tetrasphaera or Dechloromonas.
  • the invention relates to a method for treating industrial wastewater characterized in that it comprises a step of illuminating said wastewater, in blue light, to obtain a stimulation of the metabolism of the non-phototrophic microorganisms contained in wastewater.
  • the industrial wastewater may come from any industry generating wastewater requiring treatment before release into the environment, for example from the paper industry, livestock, textile or food industry. oil industry.
  • the invention relates to a method for treating industrial wastewater intended to degrade dyes, characterized in that it comprises a step of illuminating said wastewater, in blue light, to obtain a stimulation of the metabolism of the microorganisms. non-phototrophic organisms in wastewater.
  • the stimulated non-phototrophic microorganisms may be advantageously selected from Penicillium or Trametes genera.
  • the invention in another embodiment, relates to an anaerobic wastewater treatment process characterized in that it comprises a step of illuminating said wastewater, in blue light, to obtain a stimulation of the metabolism of microorganisms. non-phototrophic organisms in wastewater.
  • the use of the invention does not require the presence of bacteria of the genus Methanothermobacter or microbial strains expressing methyl-CoM reductase.
  • the invention can operate in biological wastewater treatment processes containing no or few so-called hydrogenotrophic strains such as Methanothermobacter (preferably less than 10% and even more preferably less than 5% by most likely number).
  • hydrogenotrophic strains such as Methanothermobacter (preferably less than 10% and even more preferably less than 5% by most likely number).
  • the methanogenic strains that consume acetate (acetotrophs) are responsible for nearly 70% of the methane production in the digesters and their methane production can be stimulated by blue light illumination as described in this paper. invention.
  • the invention relates to an anaerobic wastewater treatment method comprising a methanization step characterized in that it comprises a step of illuminating said wastewater, in blue light, to obtain stimulation of the metabolism of non-phototrophic microorganisms contained in wastewater.
  • the stimulated non-phototrophic microorganisms may belong to the groups of acetotrophic methanogenic microorganisms such as the genera Methanosarcina, Methanothix, or Methanobacteriales.
  • the stimulated microorganisms may be advantageously chosen from the genera Bifidobacterium, Flavobacterium, Acetobacterium or Lactobacillus.
  • the invention relates to an anaerobic wastewater treatment process comprising an anaerobic oxidation step of ammonium (anamox) characterized in that it comprises a step of illumination of said waste water, in blue light, to stimulate the metabolism of non-phototrophic microorganisms in the wastewater.
  • the stimulated non-phototrophic microorganisms may be advantageously chosen from the genera Planctomyces, Brocadia, Kuenenia, Anammoxoglobus, Jettenia, Scalindua or Pirellula.
  • Non-phototrophic microorganisms stimulated by blue light illumination accelerated colonization of the device harboring the anaerobic oxidation reaction of ammonium and better denitrification yields.
  • the invention is also particularly applicable to bioproduction processes using non-photo trophic microorganisms.
  • illumination in blue light can stimulate the metabolism of non-phototrophic microorganisms involved in the production of molecules of interest.
  • illumination in blue light can make it possible to increase the production of urease from strains belonging to the genus Sporosarcina, the production of PHA (polyhydroxyalkanoates) or lactic acid by strains belonging to the Bacillus genus, ethanol production by Saccharomyces cerevisiae or L glutamate by Corynebacterium glutamicum
  • the invention relates to a method for producing biological molecules with non-phototrophic microorganisms, characterized in that it comprises a stage of illumination in blue light of the non-phototrophic microorganisms, to obtain a stimulation of the metabolism of non-phototrophic microorganisms.
  • the process for producing biological molecules can be intended for production:
  • enzymes such as amidases, xylose isomerase, nitrile hydratase, protease, lactase, lipase, cellulase, amylase, glucoamylase, pectinase, beta-galactosidases, lysozymes chitinase.
  • biomaterials such as PHA or PHB (poly-P-hydroxybutyrate) organic acids such as citric acid, lactic acid, acetic acid amino acids such as L-lysine, DL-methionine, L-lysine threonine, L-tryptophan, L-glutamate.
  • PHA or PHB poly-P-hydroxybutyrate organic acids
  • citric acid lactic acid
  • acetic acid amino acids such as L-lysine, DL-methionine, L-lysine threonine, L-tryptophan, L-glutamate.
  • the invention relates to a process for producing recombinant enzymes or proteins by non-phototrophic microorganisms, characterized in that it comprises a stage of illumination in blue light of said non-phototrophic microorganisms, in order to obtain a stimulation of the metabolism of non-phototrophic microorganisms.
  • the stimulated non-phototrophic microorganisms may be advantageously chosen from the genera Aspergillus, Actynomicetes, Bacillus, Brevibacterium, Candida, Cellulomonas, Clostridium, Escherichia, Kluyveromyces, Lactobacillus, Mucor, Penicillium, Pseudomonas, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Streptococcus, Streptomyces, Sporosarcina or Trichoderma and this stimulation leads to an increase in the production yield of enzymes or proteins.
  • the recombinant proteins produced are not under the control of a promoter bound to a gene known to be a blue light sensor such as ytvA lov, bluf, ycg-
  • the invention relates to a process for the production of fuel by non-phototrophic microorganisms, characterized in that it comprises a stage of illumination in blue light of said non-phototrophic microorganisms, to obtain a stimulation of the micro metabolism. non-phototrophic organisms.
  • the stimulated non-phototrophic microorganisms may be advantageously chosen from the genera Aeromonas, Bacillus, Candida, Clostridium, Enterobacter, Lactococcus, Pachysolen, Pichia stipitis, Pseudomonas, Saccharomyces, Streptococcus, Thermoanaerobacter, or Thermoanaerobacterium and this stimulation results in a increased production efficiency of fuels.
  • the invention relates to a method for producing an alcoholic beverage by non-phototrophic microorganisms belonging to the genus Saccharomyces, characterized in that it comprises a step of illumination in blue light of said non-phototrophic microorganisms, to obtain stimulation of the metabolism of non-phototrophic microorganisms.
  • the invention relates to a process for the production of antibiotics, vitamins or protein molecules by non-phototrophic microorganisms, characterized in that it comprises a step of illumination in blue light of said non-phototrophic microorganisms, to achieve stimulation of the metabolism of non-phototrophic microorganisms.
  • the stimulated non-phototrophic microorganisms may be advantageously chosen from the genera Actinoplanes, Amycolatopsis, Bacillus subtilis, Cephalosporium, Gluconobacter, Ketogulonicigenium, Micromonosprora, Streptomyces or Escherichia and this stimulation leads to an increase in the production yield of the molecules produced.
  • the invention relates to a probiotic production process characterized in that it comprises a blue light illumination step of said probiotics, to obtain an increase in the growth of said probiotics.
  • the stimulated non-phototrophic microorganisms may be advantageously selected from the genera Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Streptococcus spp. And Lactococcus spp. and this stimulation leads to an increase in the yield of biomass produced.
  • the present invention also makes it possible to accelerate the growth of microorganisms on a solid medium. The present invention can therefore be used for the enumeration and identification of pathogenic microorganisms such as E.
  • the invention relates to a method for cultivating non-phototrophic microorganisms on a solid medium, characterized in that it comprises a step of illuminating blue light of said non-phototrophic microorganisms to accelerate the growth of said non-microorganisms. phototrophic.
  • the invention relates to a method for culturing pathogenic non-phototrophic microorganisms on solid medium, characterized in that it comprises a step of illuminating blue light of said microorganisms to accelerate the growth of said microorganisms.
  • Pathogenic non-phototrophic microorganisms may be selected from microorganisms belonging to coliforms, enterobacteria, staphylococci, anaerobes, sulphite-reducing agents, lactic acid bacteria, yeasts or molds; and more particularly from the group consisting of Listeria mono cyto genes, Salmonella, Legionella pneumophila, Escherichia coli O157, Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Cronobacter spp. and Campylobactero.
  • the present invention relates to an oven for the culture of non-phototrophic microorganisms characterized in that it comprises a means of illumination blue light to accelerate the growth of said non-phototrophic microorganisms.
  • the means of illumination in blue light will be implemented by means of convenient light sources such as lamps, diodes, light-emitting diodes, light ribbons, lasers, the light of day passing through a filter passing preferentially the wavelengths corresponding to the blue light, or else by reflection of the light on a mirror with a filter absorbing wavelengths other than that comprising blue light.
  • the light source may also be made of blue neons emitting in the range of wavelengths or any fluorescent tubes provided with blue filters, for example interference filters for the transmission of the blue color.
  • the spectrum of the white light-emitting diodes has a high proportion of blue light (blue peak in the spectrum) which can make these diodes effective in the blue light illumination described in the present invention.
  • the means of illumination in blue light is a light source whose emission spectrum comprises wavelengths between 440 and 500 nm, preferably between 430 nanometers and 495 nanometers, more preferably between 450 and 490 nm, and even more preferably between 460 and 480 nm. Spectrum The emission of a light source is usually provided by the manufacturer and can easily be verified by known methods using spectroscopes.
  • the illumination in blue light comes from one or more sources of illumination in blue light.
  • the means of illumination in blue light is a light source whose intensity is less than 10 ⁇ s " m " . It is preferably less than 6.7 ⁇
  • the means of illumination in blue light is a light source whose intensity is preferably less than 1000 lumen, preferably less than 500 lumen, more preferably less than 200 lumen and even more preferentially lower at 100 lumen or even less than 50 lumen.
  • the emission intensity of a light source is usually provided by the manufacturer and can easily be verified by known methods using photometers. Any measure representative of the effectiveness of the stimulation during the treatment or production process is useful for adjusting blue light illumination levels, in real time by taking samples and measuring on samples. From this point of view, the effect of the invention can be demonstrated by any means of the prior art for measuring the variation in energy consumption or more generally the metabolism of non-phototrophic microorganisms subjected to illumination in blue light. This variation thus constitutes the criterion or the first technical effect of the invention, whose illumination in blue light constitutes the means.
  • the COD, DB05, N-NH4, N-NO3, N-NO2, P and PO4 measurements are suitable for verifying the practical implementation of the invention in the vast majority of industrial biological treatment basins of waste.
  • While measuring optical density or metabolic product concentrations are suitable methods for monitoring stimulation of non-phototrophic microorganisms in biomanufacturing processes. There are many manuals outlining the appropriate methods of measuring the stimulation of the metabolism of microorganisms under such conditions, which will allow by simple routine tests to determine the optimal conditions for the implementation of these processes.
  • the invention also relates to devices for implementing the methods described in this document.
  • the methods may be carried out in devices usually used for the cultivation of non-phototrophic microorganisms characterized in that they will comprise a source of illumination in blue light.
  • Devices within the meaning of the invention are distinguished from devices for culturing phototrophic microorganisms in that the illumination is an illumination in blue light and that the intensity is preferentially less than the intensity usually used for the cultivation of phototrophic microorganisms.
  • Devices within the meaning of the invention also have the objective of providing and / or allowing illumination in blue light to stimulate the metabolism of non-phototrophic microorganisms.
  • the invention may relate to known devices for the cultivation of phototrophic microorganisms used in the context of the invention to stimulate the metabolism of non-phototrophic microorganisms by means of blue light illumination as described in the invention.
  • the means of illumination in blue light must take into account the conditions of light diffusion in the system, specific to each industrial process involving the presence of non-phototrophic microorganisms.
  • biological treatment basins are subject to a proliferation of various microorganisms, varying according to the organic input materials. Particularly in the aeration basins, this expansion gives rise unexpectedly to the appearance of light-opaque, non-dispersible foams on the surface of the wastewater.
  • the light source may be in the open air, above or at the edge of the device, above the level of water filling in the device, which is the altitude of the surface of the liquid in contact with the device. atmosphere surrounding the device or in contact with the foam if foam overcomes the wastewater.
  • the source is in contact with the liquid, for example by being in contact for its emitting surface with the surface of the liquid, a floating device with a transparent bottom may be used for this purpose.
  • the source is in contact with the liquid and has a submerged portion immersed under the surface of the liquid between the filling level and the bottom of the device.
  • the source is completely immersed in the liquid, with electrical connections and a sealed envelope for the electric sources.
  • the device has a transparent window located between the altitude of the filling level and the altitude of the bottom of the device, this porthole being a filter for the blue, a reflecting mirror for directing the light. to the liquid through the transparent porthole and non-phototrophic microorganisms.
  • a plane mirror can easily redirect the sunlight in the device by the sides.
  • the positioning variants proposed by the inventor are:
  • said illumination means is disposed outside said wastewater or the culture medium, said illumination means is disposed in contact with said wastewater or the culture medium, or
  • said illumination means in contact with said wastewater or the culture medium, comprises a part immersed in the wastewater or the culture medium, said immersed part extending in these wastewater or this culture medium, between said filling level and said bottom of the device.
  • the device is equipped with a blue light source that can be lit:
  • the illumination period can be determined according to the efficiency analyzes performed
  • the lighting is very low and therefore low energy consumption, light being considered as a signal and not as a source of energy, which is a significant advantage.
  • the necessary illumination is much lower than the light energy of a domestic lighting.
  • the illumination in blue light can be carried out for a device not receiving external light (for example a fermenter with opaque walls or a digester) or for a device receiving the light of day (aeration basin for example).
  • a device not receiving external light for example a fermenter with opaque walls or a digester
  • a device receiving the light of day for example.
  • the illumination in blue light can be carried out preferably at night but it can also be performed during the day in order to increase the ratio of blue light to white light and thus to stimulate the metabolism of light-insensitive microorganisms.
  • the illumination source is adjustable in terms of positioning, light intensity and wavelength to maximize the energy consumption and thus the metabolism of non-phototrophic microorganisms. It is also possible for a person skilled in the art to carry out an illumination ramp and to determine the maximum increase in efficiency and the necessary lighting.
  • the invention also relates to the use of blue light illumination to stimulate the metabolism of non-phototrophic microorganisms.
  • the invention relates to the use of an illumination in blue light in a biological process described above to stimulate the metabolism of non-phototrophic microorganisms.
  • the illumination in blue light is of low intensity, for example lower than the photosynthesis optimums and that the illuminated microorganisms are in favorable growth conditions as for example in a culture medium or at a temperature adapted to high growth.
  • the invention may relate to all non-phototrophic microorganisms, including bacteria or yeasts. Nevertheless, as shown below, the most interesting results are obtained for the bacteria.
  • the culture device used in the context of the invention can take different forms. Any container suitable for microbial culture can be used (the beaker, Erlenmeyer flask, bioreactor, fermenter, etc.). In the examples which follow, the container is an Erlenmeyer flask based on a thermostatically controlled magnetic stirrer making it possible to maintain a constant temperature in the culture medium of between 20 ° C. and 37 ° C.
  • the culture device is prepared in such a way that the microbial cultures are protected from the external light and kept in the dark or illuminated via a blue LED strip (LED Xanlite Strip, LSA-K1.5B) or white LED strip (Xanlite LED Strip, LSA-K1.5) or Arcadia Eco Aqua Led Spot 30w Marine Blue. Except for the light sources, the culture device is operated according to the practices commonly used in microbiology.
  • the experiment is carried out with bacterial strains belonging to the species Acinetobacter calcoaceticus, Alcaligenes xylosoxidans, Aeromonas veronii and Pseudomonas putida
  • the strains are cultured on Luria-Bertani agar medium (LB).
  • the LB agar medium is prepared from liquid LB medium (Trytone: 10 g / L, NaCl: 10 g / L, yeast extract: 5 g / L) supplemented, before autoclaving, with agar at 15 g / ml. L. Inoculation of the LB agar medium is carried out from stocks of the pure strains maintained at -80 ° C. and then the agar is placed at 30 ° C. for 24 hours.
  • a preculture is performed by inoculating 50 ml of LB medium from a sample taken on the agar medium. The culture is stirred (250 rpm) in the dark and at about 30 ° C and the OD is monitored hourly. 50 ml of preculture of strains in the exponential phase of growth (OD 0.5 mm between 0.4 and 0.8) are removed and centrifuged at 6000 g for 30 min at room temperature. The bacterial pellet is resuspended in 10 ml of saline buffer sterile to 9 g / L NaCl and the OD of this suspension is adjusted to 1 with sterile saline buffer.
  • the experiments are carried out in synthetic wastewater having the following composition: 220-250 mg / L acetate, 10 mg / L CaCl2, 200 mg / L SO4 7H20, 57 mg / L NH4C1, 56.2 mg / L K2HP04 , 0.06 mg / L CuSO 4 5H 2 O, 3 mg / L FeCl 3 6H 2 O, 0.24 ZnSO 4 7H 2 O, 0.06 mg / L KI, 0.3 mg / L H 3 BO 3, 0.24 mg / L MnCl 2 4H 2 O, 0, 12 mg / L Na2MoO4 " 2H20, 0.3 mg / L CaCl2 " 6H20, 5 mg / L Yeast extract.
  • the cultures are stirred at 250 rpm at 22 ° C for 24 hours.
  • the measurement of OD 600 nm is carried out on a sample of 1 mL of culture using a spectrophotometer.
  • LCK914 total nitrogen (Simplified TKN (s-TKN)), nitrates (NitraVer 5 Reagent, 10 mL, HR, MR), total phosphorus (Phosphorus, Reactive and Total, LR) are made according to supplier's indications (Hach).
  • Lighting in blue light causes an increase in growth kinetics and bacterial density reached after 24 hours of culture. These crops, illuminated in blue light, also have a higher nutrient consumption compared to cultures grown in the dark or in white light.
  • the experiment is carried out with bacterial strains belonging to the genera Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Streptococcus spp. And Lactococcus spp.
  • the strains are cultured on MRS agar medium. Inoculation of the MRS agar medium is carried out from stocks of the pure strains maintained at -80 ° C. and then the agar is placed at 37 ° C. for 24 hours.
  • the composition of the liquid MRS medium is as follows: Meat peptone 10 gL-1; Meal extract 10 ⁇ L-1; Yeast extract 5 ⁇ L-1; Sodium acetate 5 ⁇ L-1; Bipotassium phosphate 2 gL-1; Ammonium citrate 2 ⁇ L-1; Magnesium sulphate 0.1 gL-1; Manganese sulphate 0.05 gL-1; Tween 80 (or teepol) 1 ml; a source of carbon, namely glucose at 20g. Ll or lactose to 10 ⁇ L-1.
  • the solution without the carbon source is autoclaved then the carbon source is diluted in water, filtered through 0.2 ⁇ filter and sterile add.
  • the culture is carried out at 37 ° C., stirring for 24 h in an oven from a solution of MRS liquid medium inoculated from the agar media.
  • the growth of the bacterial culture is monitored by measuring the optical density at 600 nm.
  • the experiment is carried out with a strain of Sporosarcina pasteurii.
  • the strains are cultured in a culture medium containing 20 g / l of yeast extract and 20 g / l of urea
  • the culture is made at 22 ° C. with stirring for 24 hours. Growth of the bacterial culture is monitored by measuring optical density at 600 nm and enzyme production by measuring urease enzyme activity (EA).
  • EA urease enzyme activity
  • the measurement of cellular OD is carried out on a test sample of 300 ⁇ l of bacterial suspension which is diluted in 2.7 ml of distilled water directly in a cuvette for spectrophotometer.
  • the absorbance measurement at 600 nm is accomplished using a Biomate 3 spectrophotometer from Thermo Electron Corporation.
  • the enzymatic activity (EA) is measured on 3 ml of the bacterial suspension diluted in 27 ml of a 1.1 M urea solution, ie 66 g / l.
  • the measurement of the activity is carried out by measuring the conductivity thanks to the multi-parameter Multi 340i (brand WTW), and a dual conductivity and temperature probe TetraCon 325 from WTW and this under dynamic conditions, at 20 ° C.
  • a measurement of the conductivity of the mixture is carried out every minute for a period of 6 minutes.
  • the steepness coefficient of the conductivity curve as a function of time makes it possible to calculate the enzymatic activity of the suspension tested under these standard conditions.
  • the enzymatic activity is given in ⁇ / ⁇ / ⁇ . This is Total Enzyme Activity (TEA).
  • the experiment is carried out with bacterial strains belonging to the genera
  • the strains are cultured on MRS agar medium. Seeding of the MRS agar medium is carried out from stocks of the pure strains maintained at -80 ° C. and then the agar is placed at 37 ° C. for 24 hours. Colonies are collected to make liquid inocula. The latter are cultured at 37 ° C. for 24 h in MRS broth in a semi-anaerobic condition (4% CO 2).
  • the experiment is carried out with an Escherichia coli strain K12, generally used in recombinant protein bioproduction systems.
  • a culture medium called inoculum or pre culture, is used to seed the media used for expression. This preculture was carried out at room temperature at protected from light. When the latter reaches the beginning of the exponential phase (0.450 unit OD 600 nm.), It is stopped and to allow to seed (10% (V / V)) the culture media (semi-synthetic LB) for the expression.
  • the culture is made at 37 ° C with stirring.
  • the growth of the bacterial culture is monitored by measuring the optical density at 600 nm.
  • the experiment is carried out with bacterial strains belonging to the species Escherichia coli.
  • a culture medium called inoculum or pre culture, is used to seed the solid media used for expression. This preculture was carried out at room temperature in the dark. When the latter reaches the stationary phase (4 units OD 600 nm.), It is stopped and diluted (100 times in sterile physiological saline (9 g / L NaCl)) to allow to inoculate (100 ⁇ ) solid culture (LB agar). Culture condition
  • the culture is made at 37 ° C for 18h in a study informed or not by blue light
  • the growth of the colonies is monitored after 24h and evaluated by measuring the diameter of the colonies.

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Abstract

L'invention dévoile une méthode de stimulation du métabolisme de microorganismes non phototrophes impliqués dans des procédés biologiques comprenant l'illumination en lumière bleue des dits microorganismes. L'invention dévoile également les dispositifs permettant une telle illumination. Plus particulièrement, l'illumination en 10 lumière bleue présente une longueur d'onde comprise entre 430 nm et 495 nm et une intensité inférieure à 1000 lumen. Cette découverte peut être utile pour améliorer les rendements de procédés biologiques et plus particulièrement pour améliorer les rendements de procédés de traitement d'eaux usées par voie biologique.

Description

UTI LISATION DE LUM IERE BLEU E POUR LA STI M ULATION DU M ETABOLISM E DE
M ICROORGAN ISM ES NON PHOTOTROPH ES
Ces dernières années, l'augmentation de la production des déchets, les exigences de plus en plus élevées quant à la qualité des eaux rejetées dans l'environnement et la meilleure compréhension des processus de dégradation biologique ont conduit à une utilisation accrue des procédés de traitement biologique pour la dépollution d'effluents divers. Ainsi, il est courant d'utiliser des microorganismes non phototrophes, aérobies ou anaérobies, dans des procédés de traitement des eaux usées (eaux résiduaires industrielles, urbaines ou domestiques), cela dans le but de permettre leur rejet dans le milieu naturel sans atteinte à la qualité des eaux et de l'environnement. Par ailleurs, de nombreux microorganismes non phototrophes aérobies ou anaérobies sont également utilisés dans des procédés de production de molécules d'intérêt (acides aminés, éthanol, enzymes...).
Les microorganismes sont utilisés de nos jours dans de nombreux procédés que cela soit pour la dégradation de molécules indésirables, la synthèse de molécules d'intérêt ou encore la production de biomasse. Il existe un besoin constant de nouvelles méthodes permettant d'augmenter les rendements des procédés biologiques impliquant des microorganismes sans augmenter le coût énergétique de mise en œuvre du procédé. Bien que les microorganismes non phototrophes ne soient pas capables de générer de l'énergie à partir de la lumière, il a été découvert l'existence de protéines capables de détecter la présence de lumière bleue. Ainsi, les protéines YcgF YcgE sont des senseurs connus de la lumière bleue chez E. coli et sont fortement induits à basse température par une exposition à la lumière bleue. Il a été montré récemment, par la construction de mutants ycgF: :lacZ, ycgE: :lacZ et ycgZ: :lacZ qu'à basse température, la production de beta-galactosidase peut être améliorée grâce à l'illumination en lumière bleue (N. Tschowri et al. Genes&Development, 23(4) 522-534, 2009). Néanmoins, ces résultats reposent sur l'induction de l'expression des gènes ycg par la lumière bleue et ne pourraient être considérés pertinent pour mettre en place des procédés de bioproduction à haut rendement. En effet, dans cet article, les auteurs ont également montré que l'augmentation de l'expression s' accompagné d'une diminution de la croissance et que cet effet est présent seulement à 16°C et non à 25°C- 37°C températures habituelles de systèmes de bioproduction.
De même, il est connu de la littérature des microorganismes capables de synthétiser plus de pigments lorsqu'ils sont illuminés par de la lumière, dont de la lumière bleue (H. Takano et al. Journal of Bacteriology, 187(5) 1825-1832, 2005). Néanmoins, la connaissance de tels phénomènes ne permettent pas de développer de nouveaux procédés de bioproduction de protéines car ils conduiraient à utiliser la lumière bleue pour augmenter la production de pigments.
Un des objectifs de cette invention est de proposer une méthode permettant de stimuler le métabolisme, et donc la croissance, des microorganismes non phototrophes. Cette méthode peut être appliquée à de nombreux procédés biologiques impliquant la présence de microorganismes non phototrophes et permet d'augmenter les rendements par rapport aux procédés n'utilisant pas la méthode dévoilée dans cette invention. Un autre objectif de cette invention est de proposer des dispositifs permettant d'appliquer cette méthode.
Ainsi, l'invention concerne un procédé biologique impliquant l'utilisation de microorganismes non phototrophes caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'illumination en lumière bleue des microorganismes non phototrophes afin de stimuler leur métabolisme.
Selon un mode particulier de l'invention, ce procédé biologique est un procédé de traitement biologique d'eaux usées et plus particulièrement des eaux usées urbaines. Selon un autre mode particulier de l'invention, ce procédé biologique est un procédé de bioproduction de molécules par des microorganismes non phototrophes et plus particulièrement un procédé biologique de production d'enzymes, des carburants, des boissons alcoolisées, des antibiotiques, des vitamines, des protéines, des protéines recombinantes, des polymères, des acides organiques ou des acides aminés.
Les procédés biologiques de l'invention peuvent se dérouler en conditions anaérobie ou aérobie.
L'invention concerne également un dispositif pour la mise en œuvre du procédé biologique décrit précédemment, caractérisé en ce qu'il comprend (1) une cuve contenant un milieu de culture ou des eaux usée, (2) au moins une source d'illumination en lumière bleue éclairant la cuve et/ou son contenu.
Selon un mode particulier de l'invention, la lumière bleue utilisée dans les procédés ou les dispositifs décrit précédemment à une longueur d'onde comprise entre 430 et 495 nm.
Selon un autre mode particulier de l'invention, la ou les sources d'illumination en lumière bleue utilisée(s) dans les procédés ou les dispositifs décrit ont une intensité inférieure à 1000 lumen
Selon un autre mode particulier de l'invention, l'illumination en lumière bleue utilisée dans les procédés ou les dispositifs décrit précédemment émet en continu ou de façon périodique.
Les dessins annexés illustrent l'invention :
La figure 1 présente l'amélioration de la croissance et l'augmentation de biomasse de E. coli K12 lors d'une illumination en lumière bleue.
La figure 2 présente l'amélioration de la croissance et l'augmentation de biomasse de Sporosarcina pasteurii suite à une illumination en lumière bleue.
La figure 3 présente l'amélioration de la production d'acide par un consortium de bactéries lactiques suite à une illumination en lumière bleue.
La figure 4 présente l'amélioration de la croissance d'un consortium de bactéries lactiques suite à une illumination en lumière bleue (L Bleue) par rapport à l'Obscurité. La figure 5 présente l'accélération de croissance sur milieu solide de E. coli K12 lors d'une illumination en lumière bleue comparée à une culture à l'obscurité. La présente invention concerne l'utilisation d'une illumination en lumière bleue pour la stimulation du métabolisme de micro-organismes non phototrophes dans des procédés biologiques impliquant la présence de microorganismes non phototrophes. La présente invention concerne également des dispositifs destinés à la culture de microorganismes non phototrophes comprenant un moyen d'illumination en lumière bleue. Plus particulièrement, les dispositifs destinés à la culture de microorganismes non phototrophes sont utilisés dans le traitement d'eaux usées. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concernera ainsi l'utilisation d'une illumination en lumière bleue pour la stimulation du métabolisme de micro-organismes non phototrophes dans un bassin d'aération de station d'épuration.
La présente invention repose sur la découverte par les inventeurs de la capacité de la lumière bleue stimuler le métabolisme des microorganismes non phototrophes. Plus particulièrement, les ondes lumineuses comprises entre 430 et 495 nm possèdent étonnamment la capacité à stimuler le métabolisme des microorganismes et cela sans que cette action ne soit dépendante de l'expression de pigments permettant la photosynthèse tels que les bactériophylles, xanthorhodopsines, proteorhodopsines ou les bacteriorhodopsines, ou d'autres pigments tels que les caroténoïdes. Ainsi, l'illumination en lumière bleue de microorganismes non phototrophes entraine une amélioration des procédés biologiques destinés au traitement des eaux usées ou à la bioproduction de molécules d'intérêt. Les systèmes de bioproduction de molécules stimulés par la présente invention n'incluent pas les systèmes de production de pigments.
La lumière bleue est utilisée au titre de stimulus cellulaire, plutôt qu'une énergie contribuant aux réactions chimiques. La présente invention repose sur la découverte de la capacité de ce signal à augmenter le métabolisme des microorganismes non phototrophes indépendamment de leur capacité à produire de l'énergie à partir de sources lumineuses mais au travers d'une cascade de réactions de régulation.
Par ailleurs, les inventeurs ont découvert que l'efficacité de stimulation de la lumière bleue dépend du statut physiologique du microorganisme lors de l'illumination. Ainsi, lorsque le microorganisme illuminé en lumière bleue est dans des conditions propices à une accélération de son métabolisme et à une phase exponentielle de croissance (optimum de température, milieu de culture optimum), l'illumination selon l'invention va stimuler le métabolisme et induire une croissance améliorée et une production de protéine augmentée. Au contraire, lorsque le microorganisme se trouve dans des conditions peu propices à une accélération de son métabolisme ou de sa croissance (température basse, milieu non optimum comme par exemple un milieu pauvre en matière organique) la lumière bleue va induire une diminution de la croissance.
Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne des procédés biologiques impliquant l'utilisation de microorganismes non phototrophes maintenus dans des conditions de croissances favorables comme par exemple des températures optimales de croissance ou des concentrations fortes en matière organique. La température n'est généralement pas contrôlée dans les systèmes de traitement des eaux mais les conditions de croissances (concentration en matière organique, aération...) y sont favorables pour les microorganismes impliquées dans la biodégradation. Pour les systèmes de bioproduction, la température est généralement maintenue à environ 37 °C et les milieux de culture y sont riches en matières organiques.
Définitions au sens de la présente demande :
Des micro-organismes « phototrophes » sont des micro-organismes qui utilisent la lumière dans des processus de photosynthèse afin d'acquérir de l'énergie. Les microorganismes « non phototrophes » ne sont pas capables d'utiliser la lumière pour acquérir de l'énergie. De nombreux ouvrages de références en microbiologie permettent de différencier ces deux types de microorganismes.
Des micro-organismes « non phototrophes » sont des micro-organismes qui utilisent l'énergie de composés chimiques comme source principale d'énergie. On les distingue des microorganismes « phototrophes », pour lesquels cette source d'énergie principale est la lumière. Les micro-organismes non phototrophes sont présents dans de très nombreux procédés industriels. Ils sont notamment présents dans les eaux usées, dont ils constituent la population principale et y procèdent à la transformation des matières organiques présentes dans ces eaux en énergie et en déchets sous des formes facilement séparables de l'eau. Ces microorganismes peuvent également être retrouvés dans de nombreux procédés pour la biosynthèse de molécules à visée thérapeutique, industrielles ou alimentaires. Les microorganismes non phototrophes concernés par l'invention peuvent être d'origine naturelle ou bien des organismes génétiquement modifiés.
Le « métabolisme » pour un micro-organisme est l'ensemble des transformations moléculaires et énergétiques qui se déroulent de manière ininterrompue dans le microorganisme vivant.
Au sens de l'invention, le terme « stimulation du métabolisme » signifie augmenter le métabolisme des microorganismes et donc favoriser la vitesse de multiplication des micro-organismes et ainsi accélérer la dégradation de la matière organique, augmenter la production de molécules et/ou augmenter les maximums de biomasse atteints. Selon une interprétation préférée, la présente invention permet d'augmenter la vitesse de multiplication des microorganismes.
Un micro-organisme « photo stimulable » ou présentant une « photostimulation », pour une de ses propriétés ou fonctions, est un micro-organisme dont la propriété ou fonction peut être commandée ou activée par une variation de l'énergie lumineuse environnante, d'un signal lumineux, ou stimulation lumineuse.
Dans le contexte de cette invention le terme « eaux usées » regroupe :
les eaux résiduaires urbaines, qui proviennent des établissements et services résidentiels et sont produites essentiellement par le métabolisme humain et les activités ménagères ;
les eaux résiduaires industrielles, qui regroupent toutes les eaux usées provenant de locaux utilisés à des fins commerciales ou industrielles autres que les eaux ménagères usées et les eaux de ruissellement;
- les eaux pluviales ou eaux de ruissellement, les eaux issues d'activités humaines
(lavage des automobiles, arrosage des pelouses...) et l'eau provenant de la fonte de la neige qui s'infiltrent dans le sol ou qui ruissellent à sa surface avant de terminer leur course dans les cours d'eau avoisinants ou des dispositifs de récupération.
Dans le contexte de l'invention, un traitement biologique comprend au moins une étape de mise en contact de microorganismes avec des eaux usées et une étape de dégradation des polluants par les dits microorganismes cela afin d'entraîner une dépollution de ces eaux.
Dans le contexte de l'invention, un procédé de bioproduction comprend au moins une étape de mise en contact de microorganismes avec un milieu de culture et une étape de production de molécules d'intérêt par les dits microorganismes.
Dans le contexte de l'invention, un « dispositif de traitement biologique » est un dispositif par lequel les eaux usées sont dépolluées en vue de les assainir. Il peut prendre de nombreuses formes étant donné que sa fonction principale est de mettre en contact, dans des conditions propices, les microorganismes avec le substrat à transformer. Ainsi de nombreux dispositifs bien connus peuvent faire office, au sens de l'invention, de bassin de traitement biologique. Sans se limiter à ceux-ci, un tel dispositif peut être : un bioréacteur, bioréacteur à membrane, bioréacteur à lit fixé, bioréacteur à lit fluidisé, bioréacteur à colonne, bioréacteur à lit de boues à flux ascendant, bioréacteur à biofilm(s), bioréacteur continu agité, bioréacteur discontinu agité, bioréacteur tubulaire, fermenteur, bassin d'aération, fosse septique, digesteur, digesteur à séparation de phase, boues activées, des biofiltres ou un ensemble constitué de plusieurs de ces dispositifs.
Dans le contexte de l'invention, un dispositif pour la culture de microorganismes non phototrophe peut être choisi par exemple parmi la liste suivante : bioréacteur, bioréacteur à membrane, bioréacteur à lit fixé, bioréacteur à lit fluidisé, bioréacteur à colonne, bioréacteur à biofilm, bioréacteur continu agité, bioréacteur discontinue agité, bioréacteur tubulaire, fermenteur. Les inventeurs ont découvert que le spectre de l'illumination utilisée avait une influence sur l'efficacité de la stimulation. En effet, des illuminations par une lumière naturelle ou une lumière générée par une ampoule à incandescence n'induisent pas l'effet recherché. Alors que des illuminations par une diode électroluminescente (DEL) blanche ou bleue induisent une telle stimulation. Cette différence provient du fait que le spectre lumineux des DEL présente une intensité relative plus forte entre 430 et 500 nm par rapport aux spectres de la lumière du soleil ou des ampoules à incandescence. Ainsi, dans le contexte de l'invention, l'illumination en lumière bleue se réfère à un éclairage ayant une longueur d'onde exclusivement comprise entre 430 nm et 500 nm ; préférentiellement, l'illumination en lumière bleue fait référence à un éclairage dont l'intensité est augmentée pour les longueurs d'onde comprise entre 430 nm et 500 nm. Ainsi, une illumination en lumière bleue comprend un éclairage ayant une intensité relative plus forte entre les longueurs d'ondes 430 nm et 500 nm par rapport à la lumière du soleil. Ainsi, une illumination en lumière bleue correspond à un éclairage présentant un rapport entre i) l'intensité des longueurs d'onde correspondant à la lumière bleue, sur ii) l'intensité des longueurs d'onde totales qui est supérieur à celui de la lumière du soleil.
De nombreux procédés de traitement ou de production utilisent des microorganismes phototrophes éclairés en lumière blanche, cela n'est pas l'objet de l'invention. Les inventeurs ont découvert que l'illumination en lumière bleue à certaines longueurs d'ondes et intensités pouvait stimuler le métabolisme des microorganismes non phototrophes et ainsi avoir de nombreuses applications dans les procédés de production ou de traitement utilisant des microorganismes non phototrophes. De façon plus particulière et comme cela est détaillé dans les exemples, la présente invention permet d'améliorer les rendements de dégradation de procédés de traitement de l'eau ou les rendements de production des procédés de bioproduction. Cette amélioration reposant sur l'utilisation de lumière bleue en tant que signal, elle ne nécessite pas l'utilisation de photocatalyseur pour être efficace. De même, elle ne nécessite pas l'ajout ni la présence d'organismes photosynthétiques. Par ailleurs, comme cela a été dit précédemment le stimulus n'est pas destiné à avoir une action directe sur les molécules organiques des eaux usées. Il agit par l'intermédiaire de la stimulation des microorganismes non phototrophes présents dans les eaux usées. Aussi, étant donné que l'illumination en lumière bleue constitue ce signal, l'intensité de l'illumination est plus faible que celle utilisée pour l'illumination en lumière blanche utilisée dans des procédés comprenant des microorganismes phototrophes.
L'invention peut concerner des procédés aérobies ou anaérobies. De même, elle peut être appliquée à des dispositifs de culture destinés à fonctionner en aérobie ou en anaérobie. Une partie importante du métabolisme des micro-organismes chimiotrophes est la transformation des matières organiques de l'environnement en biomasse, en énergie pour lesdits micro-organismes, ou en nouvelles substances organiques. Ainsi, cette découverte permet d'envisager l'utilisation de la lumière bleue dans trois grandes familles d'applications pouvant tirer profit d'une stimulation du métabolisme des microorganismes:
les applications utilisant les microorganismes pour dégrader des composés organiques. Cette famille comporte sans s'y limiter : l'épuration aérobie, l'épuration anaérobie, la dénitrification, la nitrification, la biodégradation de molécules organiques, la biosorption, la déphosphatation, la déferrisation.
les applications utilisant les microorganismes pour produire des composés organiques d'intérêt. Cette famille comporte, sans s'y limiter, les applications destinées à la production de : produits laitiers, boissons alcoolisées, acides aminés, vitamines, arômes, enzymes, protéines recombinantes, carburants, pigments, insecticides et pesticides biologiques.
les applications cultivant les microorganismes pour des applications ultérieures. Cette famille comporte, sans s'y limiter : la production de biomasse, d'extrait de levure.
En conséquence, l'invention concerne un procédé biologique impliquant l'action de microorganismes non phototrophes caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'illumination en lumière bleue des microorganismes non phototrophes afin de stimuler leur métabolisme.
L'invention s'applique particulièrement bien au traitement d'effluents industriels ou urbains par voie biologique et plus particulièrement aux procédés de traitement des eaux usées urbaines en vue de leur épuration par voie biologique aérobie notamment par l'intermédiaire des boues activées, ou aux procédés comprenant une telle étape. En effet, dans les eaux usées, les microorganismes non phototrophes sont responsables de l'épuration de ces eaux usées, ce qui rend l'invention applicable dans l'industrie des stations d'épuration ou à un autre dispositif de traitement biologique. Ainsi, comme montré dans les exemples, l'illumination en lumière bleue pourrait permettre de réduire la phase de latence et améliorer la croissance de souches appartenant aux genres Pseudomonas, Alcaligenes, Aeromonas et Acinetobacter. Dans un procédé de traitement des eaux usées urbaines, cela peut conduire à accélérer la montée en puissance des boues activées
L'invention concerne donc un procédé de traitement biologique des eaux usées caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'illumination des dites eaux usées, en lumière bleue, pour obtenir une stimulation du métabolisme de micro-organismes non phototrophes contenus dans les eaux usées. Plus particulièrement, le procédé de traitement biologique des eaux usées est un traitement des eaux usées urbaines.
L'invention concerne également un dispositif de traitement biologique d'eaux usées caractérisé en ce qu'il comprend un moyen d'illumination des dites eaux usées, en lumière bleue, pour obtenir une stimulation du métabolisme de micro-organismes non photo trophes contenus dans les eaux usées.
Dans un mode particulier de réalisation, le dispositif de traitement biologique des eaux usées est un bassin d'aération.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de traitement des eaux usées comprenant une étape de nitrification des eaux usées caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'illumination des dites eaux usées, en lumière bleue, pour obtenir une stimulation du métabolisme des micro-organismes non phototrophes contenus dans les eaux usées. Dans ce mode de réalisation, les microorganismes non phototrophes stimulés peuvent être avantageusement choisis parmi les genres nitrosomonas, nitrobacter ou nitrospira.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de traitement des eaux usées comprenant une étape de dénitrification des eaux usées caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'illumination des dites eaux usées, en lumière bleue, pour obtenir une stimulation du métabolisme des micro-organismes non phototrophes contenus dans les eaux usées. Dans ce mode de réalisation, les microorganismes non phototrophes stimulés peuvent être avantageusement choisis parmi les genres Alcaligenes, Paracoccus, Pseudomonas ou Thiobacillus.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de traitement des eaux usées comprenant une étape de déphosphatation des eaux usées caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'illumination des dites eaux usées, en lumière bleue, pour obtenir une stimulation du métabolisme des micro-organismes non phototrophes contenus dans les eaux usées. Dans ce mode de réalisation, les microorganismes non phototrophes stimulés peuvent être avantageusement choisis parmi les genres Rhodocyclus, Acinetobacter, Tetrasphaera ou Dechloromonas.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de traitement des eaux usées industrielles caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'illumination des dites eaux usées, en lumière bleue, pour obtenir une stimulation du métabolisme des microorganismes non phototrophes contenus dans les eaux usées. Dans ce mode de réalisation, les eaux usées industrielles peuvent provenir de toute industrie générant des eaux usées nécessitant un traitement avant leur libération dans l'environnement par exemple provenir de l'industrie du papier, de l'élevage, du textile ou de l'industrie pétrolière. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé de traitement des eaux usées industrielles destiné à dégrader des colorants caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'illumination des dites eaux usées, en lumière bleue, pour obtenir une stimulation du métabolisme des micro-organismes non phototrophes contenus dans les eaux usées. Dans ce mode de réalisation, les microorganismes non phototrophes stimulés peuvent être avantageusement choisis parmi les genres Pénicillium ou Trametes.
Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de traitement des eaux usées en anaérobie caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'illumination des dites eaux usées, en lumière bleue, pour obtenir une stimulation du métabolisme de micro-organismes non phototrophes contenus dans les eaux usées.
L'utilisation de l'invention ne nécessite pas la présence de bactéries du genre Methanothermobacter ni de souches microbiennes exprimant la methyl-CoM réductase. Ainsi l'invention peut fonctionner dans des procédés de traitement biologique d'eaux usées ne contenant pas ou peu de souches dites hydrogénotrophes comme Methanothermobacter (préférablement moins de 10% et encore plus préférablement moins de 5 % en nombre le plus probable). En effet, les souches méthanogènes qui consomment l'acétate (acétotrophes) sont responsables de près de 70 % de la production de méthane dans les digesteurs et leur production de méthane peut être stimulée par l'illumination en lumière bleue telle que décrite dans la présente invention.
Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé de traitement des eaux usées en anaérobie comprenant une étape de méthanisation caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'illumination des dites eaux usées, en lumière bleue, pour obtenir une stimulation du métabolisme de micro-organismes non phototrophes contenus dans les eaux usées. Dans ce mode de réalisation, les microorganismes non phototrophes stimulés peuvent appartenir aux groupes des microorganismes méthanogène acétotrophes tels que les genres Methanosarcina, Methanothix, ou Methanobacteriales . Les microorganismes stimulés peuvent être avantageusement choisis parmi les genres Bifidobacterium, Flavobacterium, Acetobacterium ou Lactobacillus.
Ainsi, dans un autre mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé de traitement des eaux usées en anaérobie comprenant une étape de oxydation anaérobie de l'ammonium (anamox) caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'illumination des dites eaux usées, en lumière bleue, pour obtenir une stimulation du métabolisme des micro-organismes non phototrophes contenus dans les eaux usées. Dans ce mode de réalisation, les microorganismes non phototrophes stimulés peuvent être avantageusement choisis parmi les genres Planctomyces, Brocadia, Kuenenia, Anammoxoglobus, Jettenia, Scalindua ou Pirellula. Les microorganismes non phototrophes ainsi stimulés par une illumination en lumière bleue présente une colonisation accélérée du dispositif abritant la réaction d'oxydation anaérobie de l'ammonium et de meilleurs rendements de dénitrification.
L'invention s'applique également particulièrement bien aux procédés de bioproduction mettant en œuvre des microorganismes non photo trophes.
En effet, comme montré dans les exemples, l'illumination en lumière bleue permet de stimuler le métabolisme de microorganismes non phototrophes impliqué dans la production de molécules d'intérêt. Ainsi, comme montré dans les exemples, l'illumination en lumière bleue peut permettre d'augmenter la production d'uréase à partir de souches appartenant au genre Sporosarcina, la production de PHA (polyhydroxyalkanoates) ou d'acide lactique par des souches appartenant au genre Bacillus, la production d'éthanol par Saccharomyces cerevisiae ou de L glutamate par Corynebacterium glutamicum
L'invention concerne un procédé de production de molécules biologiques par des microorganismes non phototrophes caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'illumination en lumière bleue des microorganismes non phototrophes, pour obtenir une stimulation du métabolisme des micro-organismes non phototrophes.
Plus particulièrement, le procédé de production de molécules biologiques peut être destiné à la production :
d'antibiotiques,
- de protéines recombinantes comme l'insuline,
de carburants comme l'éthanol, le butanol, le 2-3 butanediol, le méthane, l'hydrogène,
de boissons alcoolisées contenant de l'éthanol,
d'enzymes comme des amidases, xylose isomerase, nitrile hydratase, protéase, lactase, lipase, cellulase, amylase, glucoamylase, pectinase, beta-galactosidases, lysozymes chitinase.
des biomatériaux comme le PHA ou le PHB (poly-P-hydroxybutyrate) des acides organiques comme l'acide citrique, l'acide lactique, l'acide acétique des acides aminés comme la L-lysine, la DL-méthionine, la L-threonine, le L- tryptophane, le L-glutamate.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'enzymes ou de protéines recombinantes par des microorganismes non phototrophes caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'illumination en lumière bleue des dits microorganismes non phototrophes, pour obtenir une stimulation du métabolisme de micro-organismes non phototrophes. Dans ce mode de réalisation, les microorganismes non phototrophes stimulés peuvent être avantageusement choisis parmi les genres Aspergillus, Actynomicetes, Bacillus, Brevibacterium, Candida, Cellulomonas, Clostridium, Escherichia, Kluyveromyces, Lactobacillus, Mucor, Pénicillium, Pseudomonas, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Streptococcus, Streptomyces, Sporosarcina ou Trichoderma et cette stimulation entraine une augmentation du rendement de production des enzymes ou des protéines. Dans un mode de réalisation préféré, les protéines recombinantes produites ne sont pas sous le contrôle d'un promoteur lié à un gène connu pour être un senseur de la lumière bleue comme par exemple ytvA lov, bluf, ycg-
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production de carburant par des microorganismes non phototrophes caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'illumination en lumière bleue des dits microorganismes non phototrophes, pour obtenir une stimulation du métabolisme de micro-organismes non phototrophes. Dans ce mode de réalisation, les microorganismes non phototrophes stimulés peuvent être avantageusement choisis parmi les genres Aeromonas, Bacillus, Candida, Clostridium, Enterobacter, Lactococcus, Pachysolen, Pichia stipitis, Pseudomonas, Saccharomyces, Streptococcus, Thermoanaerobacter, ou Thermoanaerobacterium et cette stimulation entraine une augmentation du rendement de production des carburants.
Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé de production de boisson alcoolisée par des microorganismes non phototrophes appartenant au genre Saccharomyces caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'illumination en lumière bleue des dits microorganismes non phototrophes, pour obtenir une stimulation du métabolisme des micro-organismes non phototrophes.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'antibiotiques, de vitamines ou de molécules protéiques par des microorganismes non phototrophes caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'illumination en lumière bleue des dits microorganismes non phototrophes, pour obtenir une stimulation du métabolisme des micro-organismes non phototrophes. Dans ce mode de réalisation, les microorganismes non phototrophes stimulés peuvent être avantageusement choisis parmi les genres Actinoplanes, Amycolatopsis, Bacillus subtilis, Cephalosporium, Gluconobacter, Ketogulonicigenium, Micromonosprora, Streptomyces ou Escherichia et cette stimulation entraine une augmentation du rendement de production des molécules produites.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production de probiotique caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'illumination en lumière bleue des dits probiotiques, pour obtenir une augmentation de la croissance des dits probiotiques. Dans ce mode de réalisation, les microorganismes non phototrophes stimulés peuvent être avantageusement choisis parmi les genres Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp., Streptococcus spp et Lactococcus spp. et cette stimulation entraine une augmentation du rendement de biomasse produite. Les inventeurs ont également découverts que par certains aspects, la présente invention permet également d'accélérer la croissance des microorganismes sur milieu solide. La présente invention peut donc être utilisée pour le dénombrement et l'identification de microorganismes pathogènes comme E. coli comme cela est montré dans les exemples. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un procédé de culture des microorganismes non phototrophes sur milieu solide caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'illumination en lumière bleue desdits microorganismes non phototrophes pour accélérer la croissance desdits microorganismes non phototrophes. Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé de culture des microorganismes non phototrophes pathogènes sur milieu solide caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'illumination en lumière bleue desdits microorganismes pour accélérer la croissance desdits microorganismes. Les microorganismes non phototrophes pathogènes peuvent être sélectionnés parmi des microorganismes appartenant aux colif ormes, entérobactéries, staphylocoques, anaérobies sulfito- réducteurs, bactéries lactiques, levures ou moisissures ; et plus particulièrement parmi le groupe constitué de Listeria mono cyto gènes, Salmonella, Legionella pneumophila, Escherichia coli 0157, Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Cronobacter spp. et Campylobactero.
Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne une étuve destinée à la culture des microorganismes non phototrophes caractérisée en ce qu'elle comporte un moyen d'illumination en lumière bleue pour accélérer la croissance desdits microorganismes non phototrophes.
Le moyen d'illumination en lumière bleue sera mis en œuvre par l'intermédiaire de sources lumineuses commodes telles que les lampes, les diodes, les diodes électroluminescentes, les rubans lumineux, les lasers, la lumière du jour traversant un filtre laissant passer préférentiellement les longueurs d'onde correspondants à la lumière bleue , ou encore via une réflexion de la lumière sur un miroir avec un filtre absorbant les longueurs d'onde autres que celle composant la lumière bleue. La source lumineuse peut être également constituée de néons bleus émettant dans la gamme de longueurs d'ondes ou de tubes fluorescents quelconques munis de filtres bleus, par exemple des filtres interférentiels pour la transmission de la couleur bleue. Il faut noter que le spectre des diodes électroluminescentes blanches présente une forte proportion de lumière bleue (pic bleu dans le spectre) ce qui peut rendre ces diodes efficaces dans le cadre de l'illumination en lumière bleue décrite dans la présente invention.
Le moyen d'illumination en lumière bleue est une source lumineuse dont le spectre d'émission comprend des longueurs d'onde comprises entre 440 et 500 nm, préférentiellement entre 430 nanomètres et 495 nanomètres, plus préférentiellement entre 450 et 490 nm, et encore plus préférentiellement entre 460 et 480 nm. Le spectre d'émission d'une source lumineuse est habituellement fourni par le constructeur et peut être aisément vérifié par des méthodes connues utilisant des spectroscopes.
L'illumination en lumière bleue provient d'une ou plusieurs sources d'illumination en lumière bleue. Le moyen d'illumination en lumière bleue est une source lumineuse dont l'intensité est inférieure à 10 μιηοΐ s" m" . Elle est préférablement inférieure à 6.7 μιηοΐ
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s" m" , préférentiellement inférieure à 3.36 μιηοΐ s" m" , plus préférentiellement inférieure à 1.34 μιηοΐ s -"1 m-"2 , encore plus préférentiellement inférieure à 0.67 μιηοΐ s -"1 m -"2 , voire inférieure à 0.33. μιηοΐ s -"1 m -"2. Le moyen d'illumination en lumière bleue est une source lumineuse dont l'intensité est préférablement inférieure à 1000 lumen, préférentiellement inférieure à 500 lumen, plus préférentiellement inférieure à 200 lumen et encore plus préférentiellement inférieure à 100 lumen voire inférieure à 50 lumen.
L'intensité d'émission d'une source lumineuse est habituellement fournie par le constructeur et peut être aisément vérifiée par des méthodes connues utilisant des photomètres. Toute mesure représentative de l'efficacité de la stimulation au cours du procédé de traitement ou de production est utile pour ajuster les niveaux d'éclairage en lumière bleue, en temps réel par des prélèvements et des mesures sur des échantillons. De ce point de vue, l'effet de l'invention peut être mis en évidence par tout moyen de l'art antérieur permettant de mesurer la variation de la consommation énergétique ou plus généralement du métabolisme de micro-organismes non phototrophe soumis à l'illumination en lumière bleue. Cette variation constitue ainsi le critère ou l'effet technique premier de l'invention, dont l'illumination en lumière bleue constitue le moyen. Par exemple, les mesures DCO, DB05, N-NH4, N-N03,N-N02, P et P04 sont adaptées à la vérification de la mise en œuvre pratique de l'invention dans la grande majorité des bassins industriels de traitement biologique des eaux usées. Tandis que la mesure de la densité optique ou des concentrations en produits du métabolisme sont des méthodes adaptées au suivi de la stimulation des microorganismes non phototrophes dans des procédés de bioproduction. Il existe de nombreux manuels explicitant les méthodes mesures adéquates pour suivre la stimulation du métabolisme des microorganismes dans de telles conditions, qui permettront par de simples essais de routine de déterminer les conditions optimales de mise en œuvre de ces procédés
L'invention concerne également les dispositifs permettant la mise en œuvre des procédés décrits dans ce document. Ainsi, les procédés pourront être menés dans des dispositifs habituellement utilisés pour la culture de microorganismes non phototrophes caractérisés en ce qu'ils devront comprendre une source d'illumination en lumière bleue.
Les dispositifs au sens de l'invention se distinguent des dispositifs de culture des microorganismes phototrophes en ce que l'éclairage est une l'illumination en lumière bleue et que l'intensité est préférentiellement inférieure à l'intensité habituellement utilisée pour la culture des microorganismes phototrophes. Les dispositifs au sens de l'invention ont également pour objectif de fournir et/ou de permettre une illumination en lumière bleue afin de stimuler le métabolisme de microorganismes non phototrophes. Ainsi, l'invention peut concerner des dispositifs connus pour la culture de microorganismes phototrophes utilisés dans le cadre de l'invention pour stimuler le métabolisme de microorganismes non phototrophes grâce à une illumination en lumière bleue telle que décrite dans l'invention.
Le moyen d'illumination en lumière bleue doit prendre en compte les conditions de diffusion de la lumière dans le système, propres à chaque procédé industriel impliquant la présence de microorganismes non phototrophes. Par exemple, les bassins de traitement biologique sont soumis à un foisonnement de micro-organismes divers, variables en fonction des matières organiques d'entrée. Dans les bassins d'aération notamment, ce foisonnement donne lieu de façon imprévisible à l'apparition de mousses opaques à la lumière et non dispersables par agitation, à la surface des eaux usées. Ainsi, il faut adapter les conditions de diffusion de lumière dans le système aux dispositifs classiquement employés pour exploiter le métabolisme des microorganismes.
Ainsi, la source lumineuse pourra être à l'air libre, au-dessus ou au bord du dispositif, au-dessus du niveau de remplissage des eaux dans le dispositif, niveau qui est l'altitude de la surface du liquide en contact avec l'atmosphère environnant le dispositif ou en contact avec la mousse si de la mousse surmonte les eaux usées.
Avantageusement, la source est en contact avec le liquide par exemple en étant en contact pour sa surface émissive avec la surface du liquide, un dispositif flottant à fond transparent pourra être utilisé à cette fin.
Avantageusement encore, la source est en contact avec le liquide et possède une partie immergée plongeant sous la surface du liquide entre le niveau de remplissage et le fond du dispositif. Avantageusement, la source est entièrement plongée dans le liquide, avec des connexions électriques et une enveloppe étanche pour les sources électriques.
Dans un mode particulier de l'invention, le dispositif possède un hublot transparent situé entre l'altitude du niveau de remplissage et l'altitude du fond du dispositif, ce hublot étant filtrant pour le bleu, un miroir de renvoi permettant de diriger la lumière vers le liquide à travers le hublot transparent et sur les micro-organismes non phototrophes. Ainsi pour un dispositif muni d'un hublot entre son bord et son fond, un miroir plan peut facilement rediriger la lumière solaire dans le dispositif par les côtés.
Les variantes de positionnement proposé par l'inventeur sont :
- ledit moyen d'illumination est disposé en dehors desdites eaux usées ou du milieu de culture, - ledit moyen d'illumination est disposé en contact avec lesdites eaux usées ou le milieu de culture, ou
- ledit moyen d'illumination, en contact avec lesdites eaux usées ou le milieu de culture, comprend une partie immergée dans les eaux usées ou le milieu de culture, ladite partie immergée s 'étendant dans ces eaux usées ou ce milieu de culture, entre ledit niveau de remplissage et ledit fond du dispositif.
Le dispositif est muni d'une source lumineuse bleue qui peut être allumée :
soit de façon continue,
soit de façon périodique, la période d'illumination pouvant être déterminée en fonction des analyses d'efficacité réalisées,
soit en réponse à des prélèvements et des mesures de façon temporaire, soit de façon temporaire en réponse à l'ajout d'eaux usées ou de milieu de culture dans le système.
Il est à noter que l'éclairage est très faible et donc peu consommateur d'énergie, la lumière étant considérée comme un signal et non comme source d'énergie, ce qui est un avantage non négligeable. L'illumination nécessaire est très inférieure à l'énergie lumineuse d'un éclairage domestique.
L'illumination en lumière bleue peut être réalisée pour un dispositif ne recevant pas de lumière extérieure (par exemple un fermenteur aux parois opaques ou un digesteur) ou bien pour un dispositif recevant la lumière du jour (bassin d'aération par exemple).
L'illumination en lumière bleue peut être réalisée de préférence de nuit mais elle peut aussi être réalisée le jour afin d'augmenter le rapport lumière bleue sur lumière blanche et donc stimuler le métabolisme des microorganismes non photo trophes éclairés. La source d'illumination est réglable en terme de positionnement, d'intensité lumineuse et de longueur d'onde afin de maximiser la consommation énergétique et donc le métabolisme des microorganismes non phototrophes. Il est aussi possible à un homme du métier d'effectuer une rampe d'éclairement et de déterminer le maximum d'augmentation de rendement et l'éclairage nécessaire.
L'invention concerne également l'utilisation d'une illumination en lumière bleue pour stimuler le métabolisme des microorganismes non phototrophes. De façon préférée, l'invention concerne l'utilisation d'une illumination en lumière bleue dans un procédé biologique décrit précédemment pour stimuler le métabolisme des microorganismes non phototrophes.
Il est important pour l'invention que l'illumination en lumière bleue soit de faible intensité, par exemple inférieure aux optimums de la photosynthèse et que les microorganismes illuminés soient dans des conditions de croissance favorables comme par exemple dans un milieu de culture ou à une température adaptée à une forte croissance.
Pour l'ensemble des modes de réalisation présentés ci-dessus, l'invention peut concerner l'ensemble des microorganismes non phototrophes, dont les bactéries ou les levures. Néanmoins, comme cela est montré ci-après, les résultats les plus intéressants sont obtenus pour les bactéries.
Dispositif de culture et d'éclairage
Le dispositif de culture utilisé dans le contexte de l'invention peut prendre différentes formes. Tout contenant adapté à la culture microbienne peut être utilisé (Le. bêcher, Erlenmeyer, bioréacteur, fermenteur...). Dans les exemples qui suivront, le contenant est un Erlenmeyer reposant sur un agitateur magnétique thermostaté permettant de maintenir une température constante dans le milieu de culture comprise entre 20°C et 37°C.
Le dispositif de culture est préparé de sorte à ce que les cultures microbiennes soient protégées de la lumière extérieure et soient maintenues à l'obscurité ou bien éclairées via un ruban LED bleu (Strip LED Xanlite, LSA-K1.5B) ou ruban LED blanc (Strip LED Xanlite, LSA-K1.5) ou un spot Arcadia Eco Aqua Led 30w Marine Blue. Excepté les sources lumineuses, le dispositif de culture est opéré suivant les pratiques couramment mises en œuvre en microbiologie.
Traitement des déchets
Traitement d'eaux usées en aérobie
Souches
L'expérience est réalisée avec des souches bactériennes appartenant aux espèces Acinetobacter calcoaceticus, Alcaligenes xylosoxidans, Aeromonas veronii et Pseudomonas putida
Inoculum
Les souches sont cultivées sur milieu gélosé Luria-Bertani (LB). Le milieu gélosé LB est préparé à partir de milieu LB liquide (Trytone : 10 g/L, NaCl : 10 g/L, extrait de levure : 5 g/L) supplémenté, avant autoclavage, avec de l'agar à 15 g/L. L'ensemencement du milieu gélosé LB est réalisé à partir de stock des souches pures maintenus à -80°C puis la gélose est placée à 30°C pendant 24h.
Pour chacune des souches, une préculture est réalisée en ensemencent 50 mL de milieu LB à partir d'un prélèvement fait sur le milieu gélosé. La culture est maintenue sous agitation (250 rpm), à l'obscurité et à environ 30°C et la DO est suivi toutes les heures. 50 mL de préculture des souches en phase exponentielle de croissance (DOôoonm comprise entre 0,4 et 0,8) sont prélevées et centrifugées à 6 000 g pendant 30 min à température ambiante. Le culot bactérien est resuspendu dans 10 mL de tampon salin stérile à 9 g/L de NaCl puis la DO de cette suspension est ajustée à 1 avec du tampon salin stérile.
Condition de culture
Les expériences sont menées dans de l'eau usée synthétique présentant la composition suivante : 220-250 mg/L acétate, 10 mg/L CaC12, 200 mg/L S04 7H20, 57 mg/L NH4C1, 56,2 mg/L K2HP04, 0,06 mg/L CuS04 5H20, 3 mg/L FeC13 6H20, 0,24 ZnS04 7H20, 0,06 mg/L Kl, 0,3 mg/L H3B03, 0,24 mg/L MnC12 4H20, 0,12 mg/L Na2Mo04«2H20, 0,3 mg/L CaC12«6H20, 5 mg/L Yeast extract.
Dans des erlenmeyer de 500 mL, 100 mL d'eau usée synthétique à pH 7, stérilisé par autoclavage, sont ensemencés avec 1 mL de d'inoculum de P. putida ou A. calcoaceticus.
Les cultures sont maintenues sous agitation à 250 rpm à 22 °C pendant 24 heures.
Suivi des paramètres
Des mesures physico-chimiques sont réalisées à partir de l'ensemencement des cultures (T=0) puis aux temps (T+lh, T+2h T+4h, T+6h, T+24h). La mesure de la DOÔOO nm est réalisée sur un prélèvement de 1 mL de culture grâce à un spectrophotomètre.
Les analyses suivantes sont menées sur les surnageants d'échantillons préalablement centrifugés (6000 g / 10 min, 25°C). Les dosages de la demande chimique en oxygène
(LCK914), de l'azote total (Simplified TKN (s-TKN)), des nitrates (NitraVer 5 Reagent, 10 mL, HR, MR), du phosphore total (Phosphorus, Reactive and Total, LR) sont réalisés suivant les indications du fournisseur (Hach).
Résultats
L'éclairage en lumière bleue entraine une augmentation de la cinétique de croissance et de la densité bactérienne atteinte après 24h de culture. Ces cultures, éclairées en lumière bleue, présentent également une consommation plus importante en nutriments par rapport aux cultures réalisées à l'obscurité ou à la lumière blanche.
Production de molécules
Production de probiotiques
Souches
L'expérience est réalisée avec des souches bactériennes appartenant aux genres Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp., Streptococcus spp et Lactococcus spp.
Inoculum
Les souches sont cultivées sur milieu MRS agar. L'ensemencement du milieu gélosé MRS est réalisé à partir de stock des souches pures maintenus à -80°C puis la gélose est placée à 37°C pendant 24h.
La composition du milieu MRS liquide (de De Man, Rogosa et Sharpe) est la suivante : Peptone de viande 10 g.L-1 ; Extrait de viande 10 g.L-1 ; Extrait de levure 5 g.L-1 ; Acétate de sodium 5 g.L-1 ; Phosphate bipotassique 2 g.L-1 ; Citrate d'ammonium 2 g.L-1 ; Sulfate de magnésium 0,1 g.L-1 ; Sulfate de manganèse 0,05 g.L-1 ; Tween 80 (ou teepol ) 1 ml ; une source de carbone à savoir du glucose à 20g. L-l ou du lactose à 10 g.L-1. La solution sans la source de carbone est autoclavée puis la source de carbone est diluée dans de l'eau, filtrée sur filtre 0,2 μηι puis ajouter de façon stérile.
Condition de culture
La culture est faite à 37°C en agitation pendant 24 h dans une étuve à partir d'une solution de milieu liquide MRS inoculée à partir des milieux gélosés. La croissance de la culture bactérienne est suivie via la mesure de la densité optique à 600 nm.
Résultats
Les résultats présentés dans la figure 1 montrent un temps de latence réduit en moyenne de 20 %, un gain moyen de production de biomasse en fin de croissance entre 11 et 19 %. Ainsi, l'éclairage en lumière bleue entraine une stimulation du métabolisme, une augmentation de la cinétique de croissance et de la densité bactérienne atteinte après 24h de culture pour Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp., Streptococcus spp et Lactococcus spp.
Production d'enzymes
Souches
L'expérience est réalisée avec une souche de Sporosarcina pasteurii.
Inoculum
Les souches sont cultivées dans un milieu de culture contenant 20 g/L d'extrait de levure et 20g/L d'urée
Condition de culture
La culture est faite à 22°C sous agitation pendant 24 h. La croissance de la culture bactérienne est suivie via la mesure de la densité optique à 600 nm et la production d'enzyme via la mesure de l'activité enzymatique uréasique (A.E.). La mesure de la D.O. cellulaire se réalise sur une prise d'essai de 300 μΐ de suspension bactérienne qui est diluée dans 2.7 ml d'eau distillée directement dans une cuvette pour spectrophotomètre. La mesure d'absorbance à 600 nm s'accomplit grâce à un spectrophotomètre Biomate 3, de chez Thermo Electron corporation. La mesure de l'activité enzymatique (A.E.) s'effectue sur 3 ml de la suspension bactérienne diluée dans 27 ml d'une solution d'urée à 1,1 M soit 66 g/1. La mesure de l'activité, réalisée dans les conditions de Michaelis-Menten, s'opère par mesure de la conductivité grâce au multi paramètre Multi 340i (marque WTW), et d'une double sonde de conductivité et de température TetraCon 325 de chez WTW et cela dans les conditions dynamiques, à 20 °C. Une mesure de la conductivité du mélange est effectuée toutes les minutes pendant une durée de 6 min. Le coefficient directeur de la pente de la courbe de conductivité en fonction du temps, permet de calculer l'activité enzymatique de la suspension testée dans ces conditions standard. L'activité enzymatique est donnée en μΞ/οηι/ηώι. Il s'agit là de l'activité enzymatique totale (A.E. T.). Au cours de cette recherche, il a été mis en évidence que l'enzyme ayant tendance à sortir de la cellule, une mesure de l'activité est donc faite sur une fraction filtrée sur des filtres de 0.2 μιη de porosité qui retiennent les cellules. L'activité alors mesurée correspond à l'activité enzymatique extracellulaire ou libre (A.E.L). Elle est peu intéressante pour le procédé car l'enzyme libre ne s'adsorbe que très peu sur les grains de sable et dans tous les cas, moins bien que les bactéries. L'activité enzymatique spécifique (A.E.S) est déduite grâce au rapport A.E./D.O., son unité est donc le
Figure imgf000021_0001
Résultats
Cette expérience menée avec Spowsarcina pasteurii a montré une réponse en consommation en dioxygène de 5 à 10 mn après l'illumination en lumière bleue. Il a été observé au mieux avec ledit micro-organisme Spowsarcina pasteurii , sous illumination du bassin constitué par des cultures en tri réplica en fermenteur, une augmentation de plus de 20 % en densité optique à 600 nm sur 24h sous illumination en lumière bleue (Figure 2) et une amélioration de l'activité enzymatique de type uréase pouvant atteindre 50 % sous illumination, pour la mesure de l'activité enzymatique de l'uréase sur 24h. La photostimulaton d'un micro-organisme chimiotrophe et non phototrophe comme Spowsarcina pasteurii, a donc été obtenue expérimentalement. Production d'acides organiques
Souches
L'expérience est réalisée avec des souches bactériennes appartenant aux genres
Lactobacillus spp,
Inoculum
Les souches sont cultivées sur milieu MRS agar. L'ensemencement du milieu gélosé MRS est réalisé à partir de stock des souches pures maintenues à -80°C puis la gélose est placée à 37°C pendant 24h. Les colonies sont collectées pour réaliser des inocula liquides. Ces derniers sont cultivés à 37 ° C, pendant 24 h dans MRS bouillon en condition semi-anaérobie (4% de C02).
Condition de culture
Tous les échantillons ont été inoculés à partir d'une préculture de 24 h (1%, v / v) et ont été incubées à 37 ° C sous des conditions semi-anaérobie (4%, C02). Après 18 h, la croissance bactérienne est mesurée via la DO600nm et l'acidité est mesurée par titrage sous agitation par une solution d'hydroxyde de sodium 0,1 M jusqu'à pH 8,3.
Résultats
L'éclairage en lumière bleue entraine une augmentation de la cinétique de croissance et de la densité bactérienne atteinte après 24h de culture pour Lactobacillus spp, et entraine également une production d'acides augmentée de 10 à 15 % (figure 3).
Production de protéines recombinantes
Souches
L'expérience est réalisée avec une souche Escherichia coli K12, généralement utilisée dans les systèmes de bioproduction de protéines recombinantes.
Inoculum
Un milieu de culture (LB) appelé inoculum ou pré culture, sert à ensemencer les milieux utilisés pour l'expression. Cette pré-culture a été réalisée à température ambiante à l'abri de la lumière. Lorsque cette dernière atteint le début de la phase exponentielle (0.450 unité D.O 600 nm.), elle est arrêtée et pour permettre d'ensemencer (10 % (V/V)) les milieux de culture (LB semi-synthétique) pour l'expression.
Condition de culture
La culture est faite à 37°C sous agitation. La croissance de la culture bactérienne est suivie via la mesure de la densité optique à 600 nm.
Résultats
Les résultats présentés dans la figure 4 montrent une réduction du temps de latence en moyenne de 25 % et un gain moyen de production de biomasse entre 13 et 42 %. Ainsi, dans des conditions de croissance favorables, l'illumination en lumière bleue permet une stimulation du métabolisme et une augmentation de la croissance d'E. coli et donc une augmentation de la production de protéine recombinante.
Accélération de la croissance sur milieu gélosé
Souches
L'expérience est réalisée avec des souches bactériennes appartenant à l'espèce Escherichia coli.
Inoculum
Un milieu de culture (LB) appelé inoculum ou pré culture, sert à ensemencer les milieux solides utilisés pour l'expression. Cette pré-culture a été réalisée à température ambiante à l'abri de la lumière. Lorsque cette dernière atteint la phase stationnaire (4 unité D.O 600 nm.), elle est arrêtée et diluée (100 fois dans de l'eau physiologique stérile (9g/L NaCl)) pour permettre d'ensemencer (100 μΐ) des milieux de culture solides (LB agar). Condition de culture
La culture est faite à 37 °C pendant 18h dans une étude éclairée ou non par de la lumière bleue La croissance des colonies est suivie après 24h et évaluée par mesure du diamètre des colonies.
Résultats
Les résultats présentés dans la figure 5 montrent clairement que, après 18 heures d'incubation à la lumière bleue, les colonies microbiennes sont bien plus visibles et développées que celles incubées à l'obscurité. Ainsi, la présente invention permet d'accélérer la croissance également sur milieu solide.

Claims

Revendications
1. Procédé biologique impliquant l'utilisation de microorganismes non phototrophes caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'illumination en lumière bleue des microorganismes non phototrophes afin de stimuler leur métabolisme.
2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le procédé biologique est un procédé de traitement biologique d'eaux usées.
3. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le procédé biologique est un procédé de bioproduction de molécules par des microorganismes non phototrophes.
4. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que les eaux usées sont des eaux usées urbaines.
5. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que les molécules produites sont sélectionnées parmi des enzymes, des carburants, des boissons alcoolisées, des antibiotiques, des vitamines, des protéines, des protéines recombinantes, des polymères, des acides organiques ou des acides aminés.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il s'effectue en conditions anaérobie ou aérobie.
7. Dispositif pour la mise en œuvre du procédé biologique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend (1) une cuve contenant un milieu de culture ou des eaux usée, (2) au moins une source d'illumination en lumière bleue éclairant la cuve et/ou son contenu.
8. Procédé ou dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la lumière bleue utilisée a une longueur d'onde comprise entre 430 et 495 nm.
9. Procédé ou dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'intensité de la source d'illumination en lumière bleue est inférieure à 1000 lumen.
10. Procédé ou dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la source de lumière bleue utilisée émet en continu ou de façon périodique.
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