[go: up one dir, main page]

WO2014067299A1 - 对水稻褐飞虱高毒力的Bt毒素 Cry1Ab-loop2-P2S和工程菌 - Google Patents

对水稻褐飞虱高毒力的Bt毒素 Cry1Ab-loop2-P2S和工程菌 Download PDF

Info

Publication number
WO2014067299A1
WO2014067299A1 PCT/CN2013/080290 CN2013080290W WO2014067299A1 WO 2014067299 A1 WO2014067299 A1 WO 2014067299A1 CN 2013080290 W CN2013080290 W CN 2013080290W WO 2014067299 A1 WO2014067299 A1 WO 2014067299A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
crylab
gene
toxin
loop2
lungens
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/CN2013/080290
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
关雄
邵恩斯
张灵玲
刘斯军
庄浩瀚
许碧虹
林莉
林立金
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujian Agriculture and Forestry University
Original Assignee
Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fujian Agriculture and Forestry University filed Critical Fujian Agriculture and Forestry University
Publication of WO2014067299A1 publication Critical patent/WO2014067299A1/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the invention relates to a toxin and an engineering bacterium which are toxic to plant pests, and particularly relates to a Bt toxin CrylAb-loop2-P2S and an engineering bacterium which are highly virulent to Hemiptera fuliginea, and belongs to the technical field of biological control.
  • BACKGROUND OF THE INVENTION Rice is the most important food crop in China. However, rice has a large number of pests and diseases, which seriously affects the production of rice in China. The cultivation of anti-Lepidopteran and Coleoptera pest rice such as Bt gene is expected to effectively prevent the harm of such pests (Tang e/2006; Wang e/ /, 2010).
  • Bacillus thuringie is Bt) is the most widely used microbial insecticide in the world. Its Cry series of toxins ( ⁇ -Endotoxins) is one of the most important toxin proteins produced by Bt and has been widely used in the control of Lepidoptera, Coleoptera, Diptera pests and phytopathogenic nematodes ( Arenas e / , 2010).
  • ⁇ Gene is also the most widely used insecticidal gene for genetically modified crops.
  • the genetic crops such as corn, cotton, soybeans, potatoes, tobacco, tomatoes, rapeseed, rice, etc.
  • the genetic crops have been planted in large areas, effectively controlling the harm of lepidopteran and coleopteran pests, and becoming an important pest management.
  • Means Rie, 2000; Shelton i?/ /, 2002; Wang ⁇ ?/ ⁇ , 2010).
  • Bt and its insect toxins have no obvious toxicity to sucking mouthparts such as Hemiptera and Homoptera. So far, Bt strains which have significant toxicity to such pests have not been found.
  • the short peptide P2S which can bind to the midgut of rice brown planthopper was screened by phage short peptide library display technology; further, it will be short
  • the peptide sequence replaces the 1 ⁇ 2 sequence of the Cry molecule Domain II by a molecular fragment replacement method to construct a toxin gene, which is linked to the universal expression vector pGEX-KG (purchased from GE Healthcare).
  • the 1 ⁇ 2 sequence is a loop region in the Cry molecule that determines receptor recognition, and the amino acid sequence thereof is: RRPFNIGINNQ; the Escherichia coli BL21-DE3 strain is commercially available.
  • the phage display technology is a technique for combining gene expression with affinity selection. The basic principle is that a DNA fragment encoding a bait protein is inserted into a phage genome and fused to a phage coat protein encoding gene. After the recombinant phage infects the host bacteria, it replicates to form a large number of phage particles with a hybrid coat protein, which is directly used to capture the protein in the target protein library that interacts with the bait protein.
  • the technical solution of the present invention the operation steps are as follows:
  • a short peptide P2S capable of forming a surface loo structure.
  • the short peptide P2S is capable of binding to the intestinal lining of the rice brown planthopper, and the gene of the short peptide P2S has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the short peptide P2S has the amino acid sequence shown as SEQ ID NO: 2.
  • the PBS buffer is Na 2 HP0 4 ⁇ 12H 2 0 3.473 g NaH 2 P0 4 ⁇ 12H 2 0 0.226 g, NaCl 0.9 g is dissolved in 1 L of trihydrated water;
  • the elution buffer is 0.2 M Glycine-HCl pH 2.2 , lmg / ml BSA;
  • the E. coli ER2738 host strain M13 phage is included in the Ph.D.-C7C TM phage display peptide library kit;
  • the body display peptide library kit is commercially available.
  • the biopanning refers to the binding and elution process of the phage short peptide library, as described in the Ph.D.-C7CTM phage display peptide library kit.
  • crylAb-F and crylAb-R were designed, and a full-length fragment of a 3,473 bp crylAb was obtained by cloning the crylAb gene (Fig. 1).
  • the crylAb gene was cloned into the 7/3 ⁇ 4H l and / 1 sites of the universal expression vector pGEX-KG (Fig. 2) and subjected to double enzyme digestion verification (Fig. 3).
  • crylAb-F 5 ' -GGATCCATGGATAACAATCCGAACAT-3 'crylAb-R: 5'-GTCGACTTACTATTCCTCCATAAGGAGTAATTC-3 '.
  • NCBI National Center for Biote clmology Information
  • primers up-F, up-R were designed to amplify the 1 ⁇ 2 upstream fragment sequence (Fig. 7).
  • Primers are: up-F: 5 ' -CCCGGGACTAGTTGATATAATATGGGGAATTT-3 '
  • a pair of primers down-F, down-R were designed to amplify the 1 ⁇ 2 downstream fragment sequence (Fig. 7).
  • the primers were: down-F: 5 down-R: 5 '-GGGCCCCAATTGATGTATGGAATTGTAAA-3 '
  • the 1 ⁇ 2 upstream and downstream fragment DNA was used as a template to obtain a short peptide P2S replacement 1 ⁇ 2 Fragment gene domainll-loop2-p2s ( Figures 8, 9).
  • the fragment to be engineered in the /w/ //-/ ⁇ y gene sequence has the nucleotide sequence shown as SEQ ID NO: 12.
  • the CrylAb-loop2-p2s toxin is toxic to rice brown planthopper, and the toxin gene has a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 3;
  • the CrylAb-loop2-p2s toxin protein is toxic to rice brown planthopper, and the CrylAb-loop2-p2s toxin protein has an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 4.
  • the LB medium is 10 g of tryptone, 5 g of yeast extract, 10 g of sodium chloride is dissolved in 1 L of distilled water, and is sterilized after packaging; IPTG is isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (Isopropyl ⁇ -D- 1 -Thiogalactopyranoside )
  • test insects were: Lepidopteran pest Plutella xylostella; Hemiptera pest, Nilaparvata lugens All chemical reagents used in the present invention were of analytical grade.
  • the invention has the following advantages:
  • the present invention uses a phage short peptide library display technology to screen a short peptide P2S capable of binding to the intestinal lining of rice brown planthopper by membrane feeding method; the Bt gene is directionally transformed by the short peptide P2S screened by the present invention, and the expression vector is subjected to expression vector Construction was carried out to obtain an engineered strain lAb-P2S (CGMCC NO: 6427) capable of expressing the toxin CrylAb-loop2-P2S.
  • CGMCC NO: 6427 engineered strain lAb-P2S
  • the Toxicity of the Toxin Protein CrylAb-loop2-P2S Expressed by the Engineering Bacteria to Rice Brown Planthopper and the CrylAb Toxin Protein before Transformation Compared to the increase of nearly 20 times.
  • CrylAb-l 00 p2-P2S expressed by the engineered bacteria can effectively control rice brown planthopper, and the method of screening short peptides and structuring Bt Cry toxin by phage short peptide library can effectively extend the insecticidal spectrum of Bt toxin.
  • Figure 1 is a clone of the ⁇ gene.
  • Lane 1 is the crylAb gene; M is a 250 bp Marker.
  • Figure 2 is a schematic diagram showing the construction of subclones.
  • Figure 3 is a double restriction enzyme verification of the crylAb-linked expression vector pGEX-KG.
  • Lane 450 is a 250 bp Marker, and Lane 2 is a crylAb-PK ⁇ I and / 1 double digestion assay.
  • Figure 4 shows the alignment of the crylAb gene sequence at NCBI.
  • Figure 5 is a cloning of the fragment to be modified.
  • Lane 1 is the cryalAb gene to be engineered; Lane 2 is crylAb subcloning plasmid DNA; Lane M is 250 bp Marker.
  • Figure 6 is a double enzyme digestion verification of the fragment of the cryLAb to be engineered to the pMD-18T cloning vector. Lane 1 was verified by I and Mun I double digestion; Lane M was 250 bp Marker.
  • Figure 7 is a cloning of the upstream and downstream fragments of CrylAb 1 ⁇ 2. Lane 1 is the 1 ⁇ 2 upstream fragment; Lane 2 is the 1 ⁇ 2 downstream fragment; M is the 250bp Marker.
  • Figure 8 is a schematic representation of the modification of the short peptide P2S replacing CrylAb 1 ⁇ 2, the fragment shown in the figure is the 1448 bp fragment to be engineered in the ⁇ gene.
  • Figure 9 is a domainli-hop2-p2s fragment after the short peptide P2S replaces the crylAb gene 1 ⁇ 2.
  • Lane 1 is a domain li-hop2-p2s fragment;
  • lane M is a 250 bp Marker.
  • Figure 10 is a schematic diagram showing the construction of the subclones of the ⁇ - expression after the transformation.
  • Figure 11 shows the transformation of ⁇ Z ⁇ - expression subcloning after digestion.
  • Lane 1 is the 3 ⁇ 4y expression subcloning plasmid ⁇ I and double enzyme digestion; Lane 2 is the crylAb subcloning plasmid ⁇ I and / I double enzyme digestion verification.
  • Figure 12 shows the results of purification of CrylAb-loop2-P2S using GST-tagged protein. Lane 1 is CrylAb-loop2-P2S purified protein; Lane M is SDSPAGE protein Marker.
  • Figure 13 shows the lethal concentration of the toxin protein CrylAb-loop2-P2S expressed by the engineered strain lAb-P2S (CGMCC NO: 6427) against the susceptible strain Plutella xylostella (LC 5Q ) in g/ml.
  • Figure 14 shows the lethal concentration (LC 5Q ) of the toxin protein CrylAb-loop2-P2S expressed by the engineered strain lAb-P2S (CGMCC NO: 6427) on rice brown planthopper, in units of g/ml.
  • LC 5Q lethal concentration
  • CGMCC NO: 6427 engineered strain lAb-P2S
  • a phage containing a short peptide library was obtained by a membrane-feeding method (Ph.D.-C7CTM phage display peptide library kit, New England Biolabs) Company) Nutrient solution (containing 25% sucrose in PBS buffer). After the nymphs were fed with the phage-mixed nutrient solution for 16 hours, the midgut of the nymphal nymph was dissected, washed, washed three times with PBS buffer, eluted with an elution buffer, and the phage bound to the intima of the midgut was recovered.
  • the plasmid containing the c/jZ ⁇ gene was used as a template to design a pair of primers, crylAb-F and crylAb-R, and cloned the crylAb gene to obtain a 3783 bp full-length fragment of crylAb (Fig. 1).
  • the crylAb gene was cloned into the BamY I and /1 sites of the universal expression vector pGEX-KG (Fig. 2) and subjected to double enzyme digestion (Fig. 3). This gene was confirmed to be the ⁇ 7 gene by NCBI alignment (Fig. 4).
  • Primers are: cry 1 Ab-F: 5 ' -GGATCCATGGATAACAATCCGAACAT-3 'crylAb-R: 5'-GTCGACTTACTATTCCTCCATAAGGAGTAATTC-3 '.
  • Example 3 Modification of the crylAb gene using the short peptide P2S Using the crylAb plasmid DNA obtained in Example 2 as a template, a pair of primers md-F and md-R were designed, and the 1448 bp fragment to be modified in the crylAb gene sequence was expanded. Increase, obtain the ⁇ ⁇ gene sequence in the gene to be modified ( Figures 5, 6).
  • the primers were: md-F: 5 '-CCCGGGACTAGTTGATATAATATGGGGAATTT-3 ' md-R: 5'-GGGCCCCAATTGATGTATGGAATTGTAAACCCGGG-3 ' Further, a pair of primers up-F, up-R, and a 1 ⁇ 2 upstream fragment sequence were designed (Fig. 7). Primers are: up-F: 5 ' -CCCGGGACTAGTTGATATAATATGGGGAATTT-3 '
  • Example 4 Construction of a gene expression vector containing a ⁇ Z ⁇ - 3 ⁇ 4 ⁇ 4 ⁇ -y toxin
  • the fragment obtained in Example 3 was used together with the c Z ⁇ gene subcloning plasmid obtained in Example 2 with a restriction endonuclease Spe I
  • the gene was digested with Mun I and the engineered fragment was ligated into the crylAb granule gene using T4 ligase to obtain the c/7Z ⁇ - 3 ⁇ 43 ⁇ 4 ⁇ -y plasmid gene (Fig. 10).
  • the plasmid was transformed into E. coli BL21-DE3 to form a CrylAb-loop2-P2S toxin engineering strain lAb-P2S capable of expressing high virulence to rice brown planthopper.
  • the engineered plasmid DNA was extracted and verified by double enzyme digestion (Fig. 11) and sequenced to obtain a ⁇ Z ⁇ -3 ⁇ 43 ⁇ 4 ⁇ y toxin gene sequence having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • Example 5 Expression and purification of toxin protein in engineered strain lAb-P2S (CGMCC NO: 6427)
  • the engineered strain lAb-P2S (CGMCC NO: 6427) was cultured in LB at 37 °C until the logarithmic phase (OD 6 QQ) -0.5), IPTG was added to a final concentration of 0.8 mM overnight to induce protein expression, and the purification method was as described in Example 3.
  • the purified CrylAb-loop2-P2S protein was obtained (Fig. 12).
  • Example 6 Insecticide activity assay The test insects were: Lepidoptera pest Plutella xylostella; Nilaparvata lugens Insecticidal bioassay: Plutella xylostella: After the cabbage leaf was weighed and then immersed in the leaf method, 48 hours of investigation results; Rice planthopper: using the membrane-vibration method, 24-hour investigation results.
  • the CrylAb-loop2-P2S toxin expressed by the engineering strain lAb-P2S has a significant effect on the toxicity of rice brown planthopper.
  • the final lethal concentration of engineered bacteria on rice brown planthopper (Fig. 14).

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明提供了一种对水稻褐飞虱高毒力的Bt毒素Cry1Ab-loop2-P2S和工程菌。本发明以Bt Cry毒素作用模型Bravo模型为理论基础，利用噬菌体短肽文库展示技术筛选出可以和水稻褐飞虱中肠结合的短肽P2S；进一步，将短肽序列利用分子片段替换的方法替换Cry分子Domain II的lοορ2序列，构建出cry1Ab-loop2-p2s毒素基因，将该基因与通用表达载体pGEX-KG连接并转化入大肠杆菌（Escherichia coli）BL21-DE3中，经过稳定性测定、结合活性测定及毒力测定，获得了能够表达对水稻褐飞虱有高毒性作用Cry1Ab-loop2-P2S毒素的工程菌1Ab-P2S（CGMCCNO：6427）。

Description

对水稻褐飞虱高毒力的 Bt毒素 Cr lAb-loop2-P2S和工程菌 技术领域
本发明涉及一种对植物害虫具有毒力的毒素和工程菌，具体涉及一种对半翅目水稻褐飞 虱高毒力的 Bt毒素 CrylAb-loop2-P2S和工程菌； 属生物防治技术领域。 背景技术 水稻是我国最主要的粮食作物， 然而水稻的病虫害繁多， 严重影响我国水稻的生产。转 Bt基因等抗鳞翅目和鞘翅目害虫水稻的种植，预期可有效地防治这类害虫的危害（Tang e/ 2006; Wang e/ /， 2010)。 同时， 也不可避免地带来加重非 Bt杀虫蛋白靶标昆虫刺吸性口器 害虫如飞虱、 叶蝉等危害的可能性 （Chen e/ ， 2011 )。 因此， 创制发展针对稻飞虱等刺吸 性害虫的新型昆虫毒素迫在眉睫。 苏云金杆菌 Bacillus thuringie is Bt) 是世界上应用最广的微生物杀虫剂。 其产 生的 Cry系列毒素蛋白 （δ-Endotoxins) 是 Bt产生的最重要的毒素蛋白之一， 已经被广泛应 用于对鳞翅目、 鞘翅目、 双翅目害虫及植物病原线虫的防治 （ Arenas e/ ， 2010)。 ^基因 也是应用最广的用于转基因作物的杀虫基因。 转^基因农作物 （如玉米、 棉花、 大豆、 马 铃薯、 烟草、 番茄、 油菜、 水稻等） 已被大面积种植， 有效地控制了鳞翅目与鞘翅目害虫的 危害， 成为害虫管理的一种重要手段 （Rie， 2000; Shelton i?/ /, 2002; Wang ί?/ Ζ， 2010)。 然而， Bt及其所含昆虫毒素对半翅目及同翅目等刺吸性口器害虫无明显毒性，迄今还未 发现对这类害虫有显著毒效的 Bt株系。 鉴于飞虱、 叶蝉、 蚜虫等刺吸性害虫对农业生产的 重大危害及转基因抗虫品种的种植带来的加重刺吸性害虫爆发性危害的现实可能性，迫切需 要研发针对此类害虫的新型抗性基因。 以^基因为基础， 通过改造 Cry毒素分子， 开发能 够产生针对刺吸性害虫的新型 Cry毒素工程菌， 是一项具有重大理论和应用价值的研究。 发明内容 本发明的目的是提供对半翅目害虫水稻褐飞虱具有高毒力的 Bt毒素 CrylAb-l00p2-P2S 和工程菌。 以 Bt Cry毒素作用模型 Bravo模型 （Knowles, B. H. & J. A. Dow., 1993 ) 为理论基础， 利用噬菌体短肽文库展示技术筛选出可以和水稻褐飞虱中肠结合的短肽 P2S; 进一步， 将短 肽序列利用分子片段替换的方法替换 Cry分子 Domain II的 1οορ2序列， 构建出 毒素基因， 将该基因与通用表达载体 pGEX-KG (购自 GE Healthcare )连接
Figure imgf000004_0001
BL21-DE3中， 经过稳定性测定、结合活性测定及毒力测 定， 获得了能够表达对水稻褐飞虱有高毒性作用 CrylAb-loop2-P2S毒素的工程菌 lAb-P2S, 该菌株为人工构建质粒的工程菌， 宿主为肠埃希氏菌、 Escherichia Co//) BL21 ( DE3 ) , 于 2012年 8月 13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 北京市朝阳区北 辰西路 1号院 3号， 菌株保藏号为： CGMCC NO : 6427。 所述 1οορ2序列为 Cry分子中决定受体识别的环区， 其氨基酸序列为： RRPFNIGINNQ; 所述大肠杆菌 BL21-DE3菌株由市场购得。 所述噬菌体展示技术 （phage display) 是将基因 表达与亲和选择相结合的技术， 其基本原理是将编码诱饵蛋白的 DNA片段插入噬菌体基因 组， 并使之与噬菌体外壳蛋白编码基因进行融合表达， 该重组噬菌体侵染宿主细菌后， 复制 形成大量带有杂合外壳蛋白的噬菌体颗粒，直接用于捕获靶标蛋白库中与诱饵蛋白相互作用 的蛋白质。 本发明的技术方案， 操作步骤如下：
1. 与水稻褐飞虱中肠内膜结合短肽的筛选 利用膜伺喂法让水稻褐飞虱若虫获取含短肽文库的噬菌体 （Ph.D.-C7C™噬菌体展示肽 库试剂盒， New England Biolabs公司） 营养液 （含 25%蔗糖 PBS缓冲液）。 让若虫取食混有 噬菌体的营养液 16h后， 用洗脱缓冲液洗脱并回收结合在中肠内膜表面的噬菌体。将获得的 噬菌体感染大肠杆菌 ER2738扩增后， 重复上述"生物淘洗" （Bio-panning ) 过程。 经 3轮淘 洗后， 将最后一轮筛选出的噬菌体感染细菌， 铺板培养， 从单个噬菌斑得到的噬菌体经培养 扩增后， 提取单链噬菌体 DNA进行测序， 获得具有抗原 （Epitope) 性及能形成表面环状 ( Surface loo ) 结构的短肽 P2S。 短肽 P2S能够与水稻褐飞虱中肠内膜结合， 短肽 P2S的基因具有如 SEQ ID ΝΟ: 1所示 的核苷酸序列。 短肽 P2S具有如 SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。 所述 PBS缓冲液为 Na2HP04 · 12H20 3.473g NaH2P04 · 12H20 0.226g、 NaCl 0.9g溶于 1L三蒸水； 洗脱缓冲液为 0.2M Glycine-HCl pH2.2, lmg/ml BSA; 所述大肠杆菌 ER2738为 M13噬菌体宿主菌， 包含于 Ph.D.-C7CTM噬菌体展示肽库试剂盒中； 所述 Ph.D.-C7CTM噬菌 体展示肽库试剂盒由市场购得。 所述生物淘洗指噬菌体短肽文库结合与洗脱过程， 详见 Ph.D.-C7C™噬菌体展示肽库试剂盒说明书。
2. c/jZ^基因的克隆 以含 c/jZ^基因质粒 DNA为模板， 设计一对 引物 crylAb-F、 crylAb-R, 克隆 crylAb基因获得一个 3483bp的 crylAb全长片段 （图 1 )， 再将 crylAb基因克隆到通用表达 载体 pGEX-KG 的 7/¾H l及 / 1位点上 （图 2)， 并进行双酶切验证 （图 3 )。 引物为： crylAb-F： 5 ' -GGATCCATGGATAACAATCCGAACAT-3 ' crylAb-R: 5'-GTCGACTTACTATTCCTCCATAAGGAGTAATTC-3 '。 所述 c/j/ 基因已公布于美国国立生物技术信息中心网站 ( National Center For Biote clmology Information, NCBI)。 所述 3483bp c^Z^基因全长片段参照 NCBI数据库， 基因 编号 AY395148.1。
3. 利用短肽 P2S对 crylAb基因的改造 以步骤 2获得的 crylAb质粒 DNA为模板， 设计一对引物 md-F、 md-R, 将 crylAb基因 序列中待改造的 1448bp片段进行扩增， 获得^ ^ 基因序列中待改造片段 (图 5、 6)。 引 物为： md-F： 5 ' -CCCGGGACTAGTTGATATAATATGGGGAATTT-3 ' md-R: 5'-GGGCCCCAATTGATGTATGGAATTGTAAACCCGGG-3 '。 所述 基因序列中待改造片段， 具有如 SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列。 进一步， 设计一对引物 up-F、 up-R, 扩增 1οορ2上游片段序列 （图 7)。 引物为： up-F： 5 ' -CCCGGGACTAGTTGATATAATATGGGGAATTT-3 '
更进一步， 设计一对引物 down-F、 down-R, 扩增 1οορ2下游片段序列 （图 7)。 引物为： down-F: 5 down-R: 5 '-GGGCCCCAATTGATGTATGGAATTGTAAA-3 ' 最后， 利用 md-F与 md-R引物， 以 1οορ2上下游片段 DNA为模板进行扩增， 获得短肽 P2S替换 1οορ2的片段基因 domainll-loop2-p2s (图 8、 9)。 所述 /w/ //-/^^ y基因序列中待改造片段，具有如 SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序列。
4. 含^ ^^- 毒素基因表达载体的构建 将步骤 3获得的片段基因 domainll - op2-p2s与 2中获得的 yZ ^基因亚克隆质粒 共同用限制性内切酶 Spe I和 Mim I双酶切， 利用 T4连接酶将改造后的片段连回 crylAb i 粒基因中，获得 毒素基因（图 10、 11 )。将该质粒转化入大肠杆菌 BL21-DE3 内，获得能够表达对水稻褐飞虱有高毒力的 CrylAb_loop2-P2S毒素工程菌 lAb-P2S (CGMCC NO: 6427)
CrylAb-loop2-p2s毒素对水稻褐飞虱具有毒性， ^的毒素基因具有如 SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
5. 毒素蛋白在工程菌 lAb-P2S (CGMCC NO: 6427)中的表达及纯化 将步骤 4获得的工程菌 lAb-P2S (CGMCC NO: 6427)接入 LB培养基中， 37°C培养至对数 前期 （OD6(X 0.4)， 加入 IPTGC终浓度 0.8mM)， 16°C诱导 24h。 经过细胞收集、 细胞破碎后， 利用谷胱甘肽巯基转移酶（Glutathione s-transferase, GST )标签纯化获得 CrylAb-loop2-P2S 毒素蛋白 （图 12) 。
CrylAb-loop2-p2s毒素蛋白对水稻褐飞虱具有毒性， CrylAb-loop2-p2s毒素蛋白具有如 SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。 所述 LB培养基为胰蛋白胨 10g， 酵母提取物 5g， 氯化钠 10g溶于 1L蒸馏水， 分装后 灭菌； IPTG为异丙基 -β-D-硫代吡喃半乳糖苷 （Isopropyl β-D- 1 -Thiogalactopyranoside )
6. 杀虫生物活性测定 测试昆虫为： 鳞翅目害虫一小菜蛾 （ plutella xylostella)； 半翅目害虫一褐飞虱 （ Nilaparvata lugens) 本发明使用的所有化学试剂均为分析纯。 本发明具有以下优点：
本发明使用噬菌体短肽文库展示技术，通过膜伺喂法筛选出能够与水稻褐飞虱中肠内膜 结合的短肽 P2S; 利用本发明筛选到的短肽 P2S对 Bt 基因进行定向改造， 经过表达载体 构建， 获得能够表达毒素 CrylAb-loop2-P2S的工程菌 lAb-P2S (CGMCC NO: 6427)。 该工程 菌表达的毒素蛋白 CrylAb-loop2-P2S对水稻褐飞虱的毒性作用与改造前的 CrylAb毒素蛋白 相比提高了近 20倍。 说明该工程菌所表达的 CrylAb-l00p2-P2S能够有效防治水稻褐飞虱， 且利用噬菌体短肽文库筛选短肽并定向改造 Bt Cry毒素的方法能够有效的扩展 Bt毒素杀虫 谱。
附图说明： 图 1为^^ 基因的克隆。 其中泳道 1为 crylAb基因； M为 250bp Marker。 图 2为 ^^ 表达亚克隆构建示意图。 图 3为 crylAb连接表达载体 pGEX-KG的双酶切验证。 其中泳道 M为 250bp Marker, 泳道 2为 crylAb-PK ΒαητΆ I及 / 1双酶切验证。 图 4为 crylAb基因序列在 NCBI的比对结果。 图 5为 ^^ 基因待改造片段的克隆。 其中泳道 1为 crylAb基因待改造片段； 泳道 2为 crylAb亚克隆质粒 DNA; 泳道 M为 250bp Marker。 图 6为 crylAb待改造片段连接 pMD-18T克隆载体的双酶切验证。 其中泳道 1为 I及 Mun I双酶切验证； 泳道 M为 250bp Marker。 图 7为 CrylAb 1οορ2上下游片段的克隆。 其中泳道 1为 1οορ2上游片段； 泳道 2为 1οορ2下游片段； M为 250bp Marker。 图 8为短肽 P2S替换 CrylAb 1οορ2的改造示意图， 图中所示片段为 ^^ 基因中待改 造的 1448bp片段。 图 9为短肽 P2S替换 crylAb基因 1οορ2后的 domainli-hop2-p2s片段。 其中泳道 1为 domain li-hop2-p2s片段； 泳道 M为 250bp Marker。 图 10为改造后 ^^^- 表达亚克隆构建示意图。 图 11改造后 ^Z^- 表达亚克隆双酶切验证。 其中泳道 1为 ¾y表达亚克隆质粒 ΒωηΆ I及 双酶切验证； 泳道 2 为 crylAb亚克隆质粒 ΒωηΆ I及 / I双酶切验证。 图 12为 CrylAb-loop2-P2S利用 GST标签蛋白纯化结果。 其中泳道 1为 CrylAb-loop2-P2S纯化蛋白； 泳道 M为 SDSPAGE蛋白 Marker。 图 13为工程菌 lAb-P2S (CGMCC NO: 6427)表达的毒素蛋白 CrylAb-loop2-P2S对敏感 品系小菜蛾致死终浓度 （LC5Q)， 单位为 g/ml。 图 14为工程菌 lAb-P2S (CGMCC NO : 6427)表达的毒素蛋白 CrylAb-loop2-P2S对水稻 褐飞虱致死终浓度 （LC5Q)， 单位为 g/ml。 具体实施方式 以下叙述本发明的实施例。 应该说明的是， 本发明的实施例对于本发明只有说明作用， 而没有限制作用。 实施例 1、 与水稻褐飞虱中肠内膜结合短肽的筛选 利用膜伺喂法让水稻褐飞虱若虫获取含短肽文库的噬菌体 （Ph.D.-C7C™噬菌体展示肽 库试剂盒， New England Biolabs公司） 营养液 （含 25%蔗糖 PBS缓冲液）。 让若虫取食混有 噬菌体的营养液 16h后， 解剖褐飞虱若虫中肠， 研磨后经 PBS缓冲液清洗 3次， 用洗脱缓 冲液洗脱并回收结合在中肠内膜表面的噬菌体。将获得的噬菌体感染细菌扩增后， 重复上述 "生物淘洗" （Biopatming) 过程。 经 3轮淘洗后， 将最后一轮筛选出的噬菌体感染细菌， 铺 板培养， 从单个噬菌斑得到的噬菌体经培养扩增后， 提取单链噬菌体 DNA进行测序， 获得 具有抗原 （Epitope) 性及能形成表面环状 （Surface loop) 结构的短肽 P2S。 实施例 2、 /jZ^基因的克隆 以含 c/jZ^基因质粒 DNA为模板， 设计一对 引物 crylAb-F、 crylAb-R, 克隆 crylAb基因获得一个 3483bp的 crylAb全长片段 （图 1 )， 再将 crylAb基因克隆到通用表达 载体 pGEX-KG 的 BamY I及 / 1位点上 （图 2)， 并进行双酶切验证 （图 3 )。 经 NCBI比 对证明该基因为^ 7 基因 （图 4)。 引物为： cry 1 Ab-F： 5 ' -GGATCCATGGATAACAATCCGAACAT-3 ' crylAb-R: 5'-GTCGACTTACTATTCCTCCATAAGGAGTAATTC-3 '。 实施例 3、 利用短肽 P2S对 crylAb基因的改造 以实施例 2中获得的 crylAb质粒 DNA为模板， 设计一对引物 md-F、 md-R, 将 crylAb 基因序列中待改造的 1448bp片段进行扩增， 获得^ ^ 基因序列中待改造片段 (图 5、 6)。 引物为： md-F： 5 ' -CCCGGGACTAGTTGATATAATATGGGGAATTT-3 ' md-R: 5'-GGGCCCCAATTGATGTATGGAATTGTAAACCCGGG-3 ' 进一步， 设计一对引物 up-F、 up-R, 扩增 1οορ2上游片段序列 （图 7)。 引物为： up-F: 5 ' -CCCGGGACTAGTTGATATAATATGGGGAATTT-3 '
更进一步， 设计一对引物 down-F、 down-R, 扩增 1οορ2下游片段序列 （图 7)。 引物为：
down-R: 5 '-GGGCCCCAATTGATGTATGGAATTGTAAA-3 ' 最后， 以 md-F及 md-R为引物以 1οορ2上下游片段 DNA为模板进行扩增， 获得短肽 P2S替换 1οορ2的片段基因 domainll- op2-p2s (图 8、 9)。 实施例 4、 含 ^Z^- ¾¾^- y毒素基因表达载体的构建 将实施例 3中获得的 片段与实施例 2中获得的 c Z^基因亚克隆质粒 共同用限制性内切酶 Spe I和 Mun I双酶切， 利用 T4连接酶将改造后的片段连回 crylAb 粒基因中， 获得 c/7Z^- ¾¾^- y质粒基因 （图 10 )。 将该质粒转化入大肠杆菌 BL21-DE3 内，形成能够表达对水稻褐飞虱高毒力的 CrylAb-loop2-P2S毒素工程菌 lAb-P2S。提取该工 程菌质粒 DNA经双酶切验证 （图 11 ) 及序列测定， 获得^ Z^- ¾¾^^ y毒素基因序列， 该基因具有如 SEQ ID NO:2所示核苷酸序列。 实施例 5、 毒素蛋白在工程菌 lAb-P2S (CGMCC NO: 6427)中的表达及纯化 将工程菌 lAb-P2S (CGMCC NO: 6427)在 LB中 37 °C培养至对数前期 （OD6QQ-0.5 )， 加入 IPTG至终浓度 0.8mM过夜诱导蛋白表达， 纯化方法参照实施例 3。 获得的纯化 CrylAb-loop2-P2S蛋白 （图 12)。 实施例 6、 杀虫生物活性测定 测试昆虫为： 鳞翅目害虫一小菜蛾 （ plutella xylostella)； 半翅目害虫一褐飞虱 （ Nilaparvata lugens) 杀虫生物测定方法： 小菜蛾： 采用甘蓝叶片称重后浸叶法， 48小时调查结果; 稻飞虱： 采用膜伺毒法， 24小时调查结果。
( 1 ) 工程菌 lAb-P2S (CGMCC NO: 6427)表达蛋白对小菜蛾毒性结果： 如表 1所示， CrylAb工程菌表达的未改造 CrylAb蛋白对小菜蛾的毒性很高， 致死终 浓度达到 0.88 g/ml， 由于识别受体环区的替换工程菌 lAb-P2S表达的 CrylAb-loop2-P2S蛋 白对小菜的毒性较之 CrylAb工程菌有所下降， 致死终浓度为 32.5 g/ml。 工程菌 lAb-P2S (CGMCC NO: 6427)表达的蛋白对敏感品系小菜蛾致死终浓度 （图 13 )。
( 2 ) 工程菌 lAb-P2S (CGMCC NO: 6427)表达蛋白对水稻褐飞虱毒性结果： 如表 2所示， CrylAb工程菌表达的未改造 CrylAb蛋白对水稻褐飞虱的毒性较弱， 致 死终浓度为 233 g/ml，而利用能够与水稻褐飞虱中肠内膜结合的短肽 P2S替换 CrylAb 1οορ2 后制备的工程菌 lAb-P2S所表达的毒素蛋白 CrylAb-loop2-P2S对水稻褐飞虱的毒性上升近 20倍， 致死终浓度为 18.75 g/ml。 据此结果证明， 工程菌 lAb-P2S (CGMCC NO: 6427)所表达 的 CrylAb-loop2-P2S毒素对水稻褐飞虱毒性效果作用显著。 工程菌对水稻褐飞虱的致死终 浓度 （图 14)。 ∞
表 1 工程菌 lAb-P2S (CGMCC NO: 6427)对敏感品系小菜蛾毒性效果 （48小时） 样品 蛋白浓度 （pg/ml) 重复 总虫数 48小时死虫数 48小时校正死亡率
0.4 3 60 21 32.71%
0.7 3 60 28 44.85%
CrylAb 1.0 3 60 36 58.63%
1.5 3 60 42
2.4 3 60 52 86.21%
0.3 3 60 8 10.38%
1.2 3 60 10 13.82%
Cr lAb-loop2 2.4 3 60 13 18.99%
-P2S 10 3 60 24 37.95%
20.0 3 60 30 48.29%
55.0 3 60 44 72.42% 表 2 工程菌 lAb-P2S (CGMCC NO: 6427)对水稻褐飞虱毒性效果 （24小时） 样品 蛋白浓度 （pg ml) 重复 总虫数 24小时死虫数 24小时校正死亡率
25 3 60 9 5.56%
50 3 60 13 12.96%
CrylAb 100 3 60 17 20.37%
200 3 60 37 57.41%
1 3 60 23 35.09%
5 3 60 27 42.11%
CrylAb-loop2 10 3 60 32 50.88%
-P2S 25 3 60 37 59.65%
50 3 60 42 68.42%
100 3 60 50 82.46%

Claims

权利要求书
1、 一种短肽 P2S基因， 其特征在于具有如 SEQ ID NO: l所示的核苷酸序列； 所述短肽 P2S, 能够与水稻褐飞虱中肠内膜结合。
2、 一种短肽 P2S， 其特征在于具有如 SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
3、 一种毒素 ^Ζ^-Λ¾¾^- ί6 的基因， 其特征在于具有如 SEQ ID NO:3所示的核苷 酸序列， 且对水稻褐飞虱具有毒性。
4、 一种毒素 CrylAb- op2-p2s的蛋白， 其特征在于具有如 SEQ ID NO:4所示的氨基酸 序列， 且对水稻褐飞虱具有毒性。
5、 与克隆 yZ^基因相关的 1对引物为 crylAb-F和 crylAb-R: crylAb-F： 5 ' -GGATCCATGGATAACAATCCGAACAT-3 ' crylAb-R: 5'-GTCGACTTACTATTCCTCCATAAGGAGTAATTC-3 '。
6、 与利用短肽 P2S改造 yZ^基因相关的 3对引物分别为 md-F和 md-R、up-F和 up-R、 down-F禾口 down-R:
( 1 ) md-F： 5 ' -CCCGGGACTAGTTGATATAATATGGGGAATTT-3 ' md-R: 5'-GGGCCCCAATTGATGTATGGAATTGTAAACCCGGG-3 '；
(2) up-F: 5 '-CCCGGGACTAGTTGATATAATATGGGGAATTT-3 ' up-R ：
down-R: 5 '-GGGCCCCAATTGATGTATGGAATTGTAAA-3 ' 。
7、 一种工程菌 lAb-P2S， 其特征在于该菌株为人工构建质粒的工程菌， 宿主为肠埃希 氏菌， CGMCC NO: 6427 ο
8、 根据权利要求 7所述的工程菌 lAb-P2S， 其特征在于含有^ ^^- ¾¾^^ y毒素。
9、根据权利要求 7或 8所述的工程菌 lAb-P2S， 其特征在于由工程菌 lAb-P2S发酵液 纯化获得的 CrylAb-lo0p2-P2S毒素蛋白， 对于水稻褐飞虱具有毒杀作用。
PCT/CN2013/080290 2012-11-05 2013-07-29 对水稻褐飞虱高毒力的Bt毒素 Cry1Ab-loop2-P2S和工程菌 Ceased WO2014067299A1 (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210433476.5A CN103060342B (zh) 2012-11-05 2012-11-05 对水稻褐飞虱高毒力的Bt毒素 Cry1Ab-loop2-P2S和工程菌
CN201210433476.5 2012-11-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014067299A1 true WO2014067299A1 (zh) 2014-05-08

Family

ID=48103238

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2013/080290 Ceased WO2014067299A1 (zh) 2012-11-05 2013-07-29 对水稻褐飞虱高毒力的Bt毒素 Cry1Ab-loop2-P2S和工程菌

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN103060342B (zh)
WO (1) WO2014067299A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116444632A (zh) * 2023-04-24 2023-07-18 中国农业科学院植物保护研究所 一种对飞虱有活性的杀虫蛋白、编码其的核酸及应用
CN116554286A (zh) * 2023-04-24 2023-08-08 中国农业科学院植物保护研究所 一种杀虫蛋白、编码其的核酸及应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104845914B (zh) * 2015-05-26 2018-04-06 中国农业科学院植物保护研究所 苏云金芽胞杆菌菌株，表达蛋白及其应用
CN104845913B (zh) * 2015-05-26 2018-04-06 中国农业科学院植物保护研究所 苏云金芽胞杆菌菌株，组合蛋白及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011084629A1 (en) * 2009-12-16 2011-07-14 Dow Agrosciences Llc Use of cry1da in combination with cry1ca for management of resistant insects
CN102753694A (zh) * 2009-12-16 2012-10-24 陶氏益农公司 组合使用Cry1Fa和Cry1Ab蛋白用于控制Cry抗性蔗螟和用于甘蔗中的昆虫抗性管理

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006131515A (ja) * 2004-11-04 2006-05-25 Nippon Nohyaku Co Ltd 農園芸有害生物防除剤組成物及びその使用方法
EP2380439A1 (en) * 2008-12-19 2011-10-26 Meiji Seika Pharma Co., Ltd. Composition to control harmful organisms that contains 16-keto aspergillimide

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011084629A1 (en) * 2009-12-16 2011-07-14 Dow Agrosciences Llc Use of cry1da in combination with cry1ca for management of resistant insects
CN102753694A (zh) * 2009-12-16 2012-10-24 陶氏益农公司 组合使用Cry1Fa和Cry1Ab蛋白用于控制Cry抗性蔗螟和用于甘蔗中的昆虫抗性管理

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHANG, JIE ET AL.: "Cloning and Expression of cry3Aa7 Gene from Bacillus thuringiensis Strain Toxic to Coleopteran Pests", SCIENTIA AGRICULTURA SINICA, vol. 35, no. 6, 2002, pages 650 - 653 *
ZHANG, LILI ET AL.: "Approaches for Enhancing the Insecticidal Activity of Bacillus thuringiensis Cry Toxins: Application of Synergistic Factors and Genetic Improvement of Crystal Protein", JOURNAL OF ENVIRONMENTAL ENTOMOLOGY, vol. 32, no. 3, June 2010 (2010-06-01), pages 525 - 531 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116444632A (zh) * 2023-04-24 2023-07-18 中国农业科学院植物保护研究所 一种对飞虱有活性的杀虫蛋白、编码其的核酸及应用
CN116554286A (zh) * 2023-04-24 2023-08-08 中国农业科学院植物保护研究所 一种杀虫蛋白、编码其的核酸及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN103060342B (zh) 2014-05-21
CN103060342A (zh) 2013-04-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Cohen et al. High-resolution crystal structure of activated Cyt2Ba monomer from Bacillus thuringiensis subsp. israelensis
Yu et al. Profiling of antimicrobial metabolites synthesized by the endophytic and genetically amenable biocontrol strain Bacillus velezensis DMW1
WO2014067299A1 (zh) 对水稻褐飞虱高毒力的Bt毒素 Cry1Ab-loop2-P2S和工程菌
CN103467584B (zh) 一种原核基因工程杂合阳离子抗菌肽cc的获得及其发酵方法
CN102559554A (zh) 苏云金芽胞杆菌cry1Ca基因，表达蛋白及其应用
BR112016014689B1 (pt) Gene inseticida derivado de ser humano e peptídeo inseticida codificado pelo mesmo e aplicação dos mesmos
Jin et al. Heterologous expression and purification of Bt CspB, a novel cold-shock protein-like bacteriocin from Bacillus thuringiensis BRC-ZYR2
Ordon et al. Conserved immunomodulation and variation in host association by Xanthomonadales commensals in Arabidopsis root microbiota
CN104845913B (zh) 苏云金芽胞杆菌菌株，组合蛋白及其应用
CN115725559A (zh) 一种细胞壁合成相关蛋白ugma及其编码基因与应用
CN104673706B (zh) 苏云金芽胞杆菌fh21、杀虫基因，表达蛋白及其应用
CN104844703B (zh) 对Bt毒素具有杀虫增效作用的小菜蛾钙粘蛋白基因蛋白片段PxCAD1及应用
CN108314718A (zh) 一种家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体、其编码基因及其表达和应用
CN101831441A (zh) 一种表达重组Cry1C基因的大肠杆菌工程菌
CN114907458B (zh) 一种活性提高的Vip3A突变蛋白及其应用
CN112094848A (zh) 一种小菜蛾丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7基因及其应用
US9545107B2 (en) Allium fistulosum leaf agglutinin recombinant protein, its encoding polynucleotide, primer and process for preparation thereof
CN102898511A (zh) 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组基因工程疫苗候选抗原i12c制备中的纯化方法
Li et al. Expression and activity of a probable toxin from Photorhabdus luminescens
CN111825749B (zh) 一种抗肿瘤多肽及其制备方法与用途
Upadhyay et al. Purification and characterization of a lectin with high hemagglutination property isolated from Allium altaicum
Visitsattapongse et al. Single-reversal charge in the β10-β11 receptor-binding loop of Bacillus thuringiensis Cry4Aa and Cry4Ba toxins reflects their different toxicity against Culex spp. larvae
CN107365372A (zh) 一种凡纳滨对虾l型凝集素及其编码基因和应用
CN103626853B (zh) 黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白、截短片段及其重组表达载体和应用
CN119823241B (zh) 一种苏云金芽胞杆菌来源的抗褐飞虱杀虫蛋白及其编码基因与应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13850540

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 13850540

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1