WO2014064971A1

WO2014064971A1 - 標的粒子の検出方法

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Abstract

本発明は、走査分子計数法を利用し、溶液中の非発光性の標的粒子を、発光標識せずに検出する方法を提供する。本発明は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて非発光性の粒子を検出する方法であって、非発光性の観測用粒子、及び固相担体を、検出対象である標的粒子を介して溶液中又は溶液の界面にて結合させる工程と、（ｂ）前記工程（ａ）の後、遊離状態の観測用粒子を除去する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記観測用粒子を前記複合体から分離させる工程と、（ｄ）前記工程（ｃ）の後、分離された観測用粒子を分散させた測定試料溶液を調製する工程と、（ｅ）前記工程（ｄ）において調製された測定試料溶液中の観測用粒子を、反転型走査分子計数法により検出する工程とを有する標的粒子の検出方法。

Description

標的粒子の検出方法

　本発明は、共焦点顕微鏡や多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、標的粒子を検出する方法に関する。

　近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。特に、蛍光相関分光分析（Fluorescence Correlation Spectroscopy：ＦＣＳ）、蛍光強度分布分析（Fluorescence-Intensity Distribution Analysis：ＦＩＤＡ）等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域（顕微鏡のレーザ光が集光された焦点領域－コンフォーカル・ボリュームと称される）の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度且微量でよい。一回の測定で使用される量は、数十μＬ程度である。一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返されば済むので測定時間も大幅に短縮される。さらに、ＦＣＳの態様の一つとして、多量の発光物質が溶解された溶液中において分散された非発光性粒子がコンフォーカル・ボリューム内に進入した際に検出される光強度が低下する系において、蛍光強度の自己相関関数の値を算出し、非発光性粒子のコンフォーカル・ボリューム内における並進拡散時間及び滞留粒子数の平均値を算出する方法（inverted ＦＣＳ（ｉＦＣＳ））がある（例えば、特許文献１参照）。

　最近、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系等の溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、測定試料溶液内において光の検出領域である微小領域の位置を移動させながら、当該微小領域内を横切る発光粒子（蛍光、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子）を個別に検出する新規な方式の光分析技術（走査分子計数法）が提案されている（例えば、特許文献２～４参照）。走査分子計数法は、具体的には、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、測定試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域中の発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、測定試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや測定試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする技術である。

　走査分子計数法は、その光検出機構自体については、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合と同様に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域からの光を検出するよう構成されているため、ＦＩＤＡ等と同様に測定試料溶液の量は微量（例えば、数十μＬ程度）であってよく、また測定時間が短い。一方で、走査分子計数法においては、蛍光強度のゆらぎを算出する等の統計的処理を要するＦＩＤＡ等と異なり、このような統計的処理が実行されない。このため、走査分子計数法の光分析技術は、粒子の数密度又は濃度がＦＩＤＡ等の光分析技術に必要であったレベルよりも大幅に低い測定試料溶液に適用可能である。つまり、発光プローブによって標識された測定試料溶液中の標的粒子（観測対象粒子）を、走査分子計数法を利用して検出することにより、測定試料溶液中の標的粒子の濃度又は数密度が非常に低い場合であっても、標的粒子の状態又は特性を検出し解析することができる（例えば、特許文献５参照）。

国際公開第２０１０／１１９０９８号国際公開第２０１１／１０８３６９号国際公開第２０１１／１０８３７０号国際公開第２０１１／１０８３７１号国際公開第２０１２／０１４７７８号

　発光する単一粒子の光を個別に検出する走査分子計数法においては、単一粒子からの光は、微弱であるので、迷光や水のラマン散乱による影響を受けやすい。即ち、発光粒子から発せられる光を表す光強度値の増大を発光粒子の信号として識別する分析手法の場合、迷光や水のラマン散乱による光を誤って発光粒子の信号として識別してしまうことがある。また、単一粒子の光を検出する走査分子計数法の場合には、観測対象となる粒子（観測対象粒子）は、発光粒子に限られる。従って、非発光性粒子を観測したい場合には、観測対象となる粒子に発光標識（蛍光標識、りん光標識など）を付与する必要があるが、観測対象粒子に常に適当な発光標識が付与可能であるとは限らない。更に、発光標識の付与により、観測対象粒子が変性することもあり得る。

　本発明は、走査分子計数法を利用して、測定試料溶液中の非発光性の標的粒子（検出対象の粒子）を、迷光や水のラマン散乱による影響を抑制しつつ、かつ発光標識せずに検出する方法を提供することを目的としている。

　本発明者は上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた走査分子計数法において、前記光学系の光検出領域から実質的に一定の背景光を含む光を検出すると、光検出領域よりも充分に小さい粒子が通過した際には、検出される光強度はほとんど変化しないが、比較的大きな粒子が通過すると、当該粒子により光が遮蔽され、検出される光強度が低下することを見出し、この現象を利用して測定試料溶液中の非発光性分子を計数する反転型走査分子計数法を開発した。

　さらに、従来の反転型走査分子計数法のみでは、光検出領域に対して小さい分子を検出することは非常に困難であるが、一分子当たりの大きさが光検出領域に対して比較的大きな非発光性の粒子を観測用粒子として用い、当該観測用粒子と検出対象である標的粒子とを結合させた後、遊離の観測用粒子を測定系外へ除去した上で当該観測用粒子の数を計数すれば、従来の反転型走査分子計数法によっても観測用粒子の検出が可能であることを見出し、更には、固相担体を用いることにより、標的粒子と結合した観測用粒子から遊離の観測用粒子を容易に分離できることも見出し、本発明を完成させた。

　即ち、本発明に係る標的粒子の検出方法は下記（１）～（１４）である。
（１）　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、非発光性の粒子を検出する方法であって、
（ａ）非発光性の観測用粒子、及び固相担体を、検出対象である標的粒子を介して溶液中又は溶液の界面にて結合させ、複合体を形成させる工程；
（ｂ）前記工程（ａ）の後、遊離状態の観測用粒子を前記溶液から除去する工程；
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記観測用粒子を前記複合体から分離させる工程；
（ｄ）前記工程（ｃ）の後、分離された観測用粒子を分散させた測定試料溶液を調製する工程；及び
（ｅ）前記測定試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域から実質的に一定の背景光を含む光を検出して時系列の光強度データを生成し、前記時系列光強度データにおいて前記観測用粒子が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる光強度の低下を、前記観測用粒子の各々の存在を表す信号として個別に検出することにより、前記測定試料溶液中の観測用粒子検出する工程；
を有する、標的粒子の検出方法。
（２）　前記観測用粒子の平均外径が、前記光学系の光検出領域の直径の３５％以上である、前記（１）の標的粒子の検出方法。
（３）　前記標的粒子が核酸分子又は核酸類似物質であり、
　前記工程（ｃ）における前記観測用粒子の分離を、当該複合体中の標的粒子を変性させることにより行う、前記（１）又は（２）の標的粒子の検出方法。
（４）　前記工程（ｄ）が、
前記固相担体を前記観測用粒子より分離除去し、前記観測用粒子のみを分散させた前記測定試料溶液を調製することである、前記（１）～（３）のいずれかの標的粒子の検出方法。
（５）　前記固相担体が、平均外径が前記光学系の光検出領域の直径の３５％未満である粒子であり、
　前記工程（ｃ）及び（ｄ）に代えて、
（ｃ’）前記工程（ｂ）の後、前記観測用粒子、前記標的粒子、及び前記固相担体からなる複合体を分散させた測定試料溶液を調製する工程、
を行う、前記（１）又は（２）の標的粒子の検出方法。
（６）　前記背景光が、前記測定試料溶液内に分散された物質による蛍光、りん光、化学発光、生物発光又は散乱光である、前記（１）～（５）のいずれかの標的粒子の検出方法。
（７）　前記背景光が照明光である、前記（１）～（５）のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
（８）　前記光検出領域の位置の移動を、その移動速度が前記単一粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて行う、前記（１）～（７）のいずれかの標的粒子の検出方法。
（９）　前記光検出領域の位置の移動を、前記光学系の光路を変更することにより行う、前記（１）～（８）のいずれかの標的粒子の検出方法。
（１０）　前記観測用粒子の存在を表す信号の検出が、前記背景光の強度から計って所定の閾値より低い光強度を有する信号が検出されたときに１つの観測用粒子が前記光検出領域に入ったと判定することである、前記（１）～（９）のいずれかの標的粒子の検出方法。
（１１）　前記観測用粒子の存在を表す信号の検出が、前記時系列光強度データを平滑化し、前記平滑化した時系列光強度データにおいて前記背景光の強度から計って所定閾値を下回る強度を有する下に凸の釣鐘型のパルス状信号を検出することである、前記（１）～（１０）のいずれかの標的粒子の検出方法。
（１２）　前記工程（ｅ）において、更に、前記個別に検出された観測用粒子の存在を表す信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記観測用粒子の数を計数する、前記（１）～（１１）のいずれかの標的粒子の検出方法。
（１３）　前記工程（ｅ）において、更に、前記検出された観測用粒子の数に基づいて、前記測定試料溶液中の観測用粒子の数密度又は濃度を決定する、前記（１）～（１２）のいずれかの標的粒子の検出方法。
（１４）　前記工程（ｅ）における前記光検出領域の位置の移動、前記光検出領域からの光の検出、及び前記観測用粒子の存在を表す信号の検出を、前記観測用粒子の存在を表す信号の数が予め定められた数に達するまで、繰り返し、当該予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて前記測定試料溶液中の前記観測用粒子の濃度を決定する、前記（１）～（１２）のいずれかの標的粒子の検出方法。

　本発明に係る標的粒子の検出方法は、走査分子計数法の原理を利用しているため、測定試料溶液中の標的粒子の数密度又は濃度が非常に低い場合であっても、標的粒子を検出することができる。また、本発明に係る標的粒子の検出方法は、標的粒子を発光標識する必要がなく、このため、光標識を付与すると変性する粒子であっても、標的粒子として検出できる。さらに、或る程度の背景光の存在下で、背景光の低減を標的粒子の存在を表す信号として検出する態様によれば、迷光やラマン散乱光を標的粒子の信号として誤検出することを防止することができる。さらに、本発明に係る標的粒子の検出方法は、標的粒子を直接検出するのではなく、観測用粒子を検出することによって間接的に標的粒子を検出するため、標的粒子が光検出領域よりも比較的小さい分子であっても検出することができる。

反転型走査分子計数法のための光分析装置の内部構造の模式図である。コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の光検出領域）の模式図である。ミラー７の向きを変更して試料溶液内において光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。マイクロプレートの水平方向位置を移動して試料溶液内における光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。反転型走査分子計数法における非発光性の単一粒子の存在を検出する原理を説明する模式図である。図２Ａの原理により計測される光強度の時間変化の模式図である。非発光性の単一粒子が光検出領域に進入した際の検出光量の低下の原理を説明する図である。光検出領域と単一粒子との径の比と検出光量の低下の割合との関係を示す図である。反転型走査分子計数法の処理手順の一態様をフローチャートの形式で表した図である。単一粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合の粒子の運動の態様を表すモデル図である。単一粒子が、試料溶液内の光検出領域の位置を、その拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより粒子が光検出領域を横切る場合に粒子の運動の態様を表すモデル図である。反転型走査分子計数法に従って、計測された時系列光強度データ（フォトンカウントの時間変化）から単一粒子の存在を検出するための処理手順における検出信号の信号処理過程の例を説明する図である。図５は、反転型走査分子計数法の処理手順の別の一態様をフローチャートの形式で表した図である。反転型走査分子計数法の処理手順のさらに別の一態様をフローチャートの形式で表した図である。図６Ａに示される態様における、解析時間間隔ｔを粒子の検出状況に応じて修正する処理の内容をフローチャートの形式で表した図である。図７は、実施例１において、各測定試料溶液のピーク数の測定結果を示した図である。図８は、実施例２において、各測定試料溶液のピーク数の測定結果を示した図である。

　本発明に係る標的粒子の検出方法（以下、単に「本発明に係る検出方法」ということがある）は、非発光性の粒子の検出を、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、反転型走査分子計数法を利用することによって行うことを特徴とする。反転型走査分子計数法とは、前記光学系の光検出領域から実質的に一定の背景光を含む光を検出し、前記光検出領域から検出される光強度の低下を指標として、当該光検出領域を通過する粒子の存在を検出する走査分子計数法である。

　特許文献２～５に記載されている通常の走査分子計数法では、観測対象となる粒子は、発光粒子であり、非発光性粒子を検出することができない。従って、本来的には非発光性粒子を観測対象とする場合には、かかる粒子に蛍光標識等の発光標識を付与する必要がある。しかしながら、粒子によっては、発光標識の付与が困難であったり、発光標識の付与に起因して粒子の変性が起き得る。また、粒子の放出する光をその粒子の存在を表す信号として識別する形式の場合、迷光や散乱光或いは光検出器の電気的ノイズにより、光強度データ上の値の増大が生じたときに、その値の増大を誤って発光粒子の信号として識別してしまう場合が在り得る。

　一方で、一般に、顕微鏡の光学系により光計測を行う場合、背景光が高いときには、迷光や水のラマン散乱による影響を受けにくい。また、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の場合、通常の光学顕微鏡よりも光軸方向の分解能が高いため、非発光性粒子がコンフォーカル・ボリュームの内部を通過すると、コンフォーカル・ボリュームからの光強度の低下が観測される。つまり、充分な背景光の存在下で反転型走査分子計数法による計測を行うことにより、迷光や水のラマン散乱による影響が低減された環境下で、標的粒子を検出することができる。また、標的粒子を発光プローブ等で標識する必要もない。

　本発明及び本願明細書において、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡において光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する。なお、かかる領域は、共焦点顕微鏡においては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。

　本発明及び本願明細書において、「溶液中に分散しランダムに運動する粒子」とは、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの粒子（発光するもの又は発光しないもののいずれであってもよい）であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子を意味する。

　反転型走査分子計数法では、走査分子計数法と同様に、測定試料溶液内において光検出領域の位置を移動しながら、即ち、測定試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。かかる構成において、光検出領域からの光に実質的に一定の背景光が含まれている場合には、「光検出領域に対してある程度の大きさを有する非発光性粒子」が光検出領域に進入したときに或いは測定試料溶液内にて移動する光検出領域が前記非発光性粒子を包含したときに、当該粒子の存在によって光検出領域からの光検出部まで到達する背景光の光強度又は光量が低下することとなる。かくして、反転型走査分子計数法では、逐次的に検出された光において、かかる背景光の光強度又は光量の低下を前記非発光性粒子の信号として個別に検出して、これにより、粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。なお、本明細書において、「粒子の信号」という場合には、特に断らない限り、当該粒子の存在を表す信号を指すものとする。

　以下、まず反転型走査分子計数法について説明する。
＜反転型走査分子計数法のための光分析装置の構成＞
　反転型走査分子計数法は、基本的な構成において、図１Ａに模式的に例示されている如き、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置により実現可能である。同図を参照して、光分析装置１は、光学系２～１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこにおいて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端において固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１～数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。測定に供される試料溶液中には、背景光を生ずる任意の発光物質が分散又は溶解されていてもよい。この場合、非発光性粒子が励起領域に進入していないときには、発光物質が励起されて実質的に一定の光が放出されて、背景光となり、非発光性粒子が励起領域に進入すると、背景光が低減することとなる。

　かくして、励起領域から放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて単一粒子（一の粒子としての挙動を示す粒子）検出のための処理が為される。なお、当業者において知られている如く、上記の構成において、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１Ｂに模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１Ｂに例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１～１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置における光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス様分布となる。実効体積は、光強度が１／ｅ^２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、本発明では、数分子程度の蛍光色素分子からの微弱光からなる背景光における単一粒子の存在による光量の低下を検出するので、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。光の検出がフォトンカウンティングによる場合、光強度の測定は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮ　ＴＩＭＥ）に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。従って、この場合、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータである。また、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するべきウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。

　更に、上記の光分析装置の光学系においては、試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内において焦点領域、即ち、光検出領域の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１Ｃに模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい（光検出領域の絶対的な位置を移動する方式）。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。或いは、別の態様として、図１Ｄに例示されている如く、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動し、試料溶液内における光検出領域の相対的な位置を移動するべくステージ位置変更装置１７ａが作動されてもよい（試料溶液の絶対的な位置を移動する方式）。いずれの方式による場合も、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８におけるプログラムにおいて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。また、光検出領域の絶対的な位置を移動する方式と試料溶液の絶対的な位置を移動する方式とを組み合わせて、試料溶液の位置を動かしつつ、光検出領域の絶対的な位置の移動が実行されてよい。この場合、短時間のうちの光検出領域が同一の領域を通過することにより同一の単一粒子を繰り返し検出することが回避される。或いは、光検出領域の絶対的な位置を移動する方式により、意図的に光検出領域に同一の領域を繰り返し通過させ、同一の単一粒子を複数回に亘って周期的に検出し、信号の精度の向上が図られてもよい。この場合、光検出領域の絶対的な位置の移動を所定時間に亘って実行した後に、試料溶液の位置が間歇的に移動して、試料溶液内の別の場所にて、同一の単一粒子の繰り返し検出を実行し、検出される単一粒子の数の増大が図られてよい。なお、図示していないが、対物レンズ８又はステージを上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されて、光検出領域の位置の軌跡が、試料溶液内にて三次元的に展開されるようになっていてもよい。

　背景光を生成する発光物質が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、背景光を生成する発光物質が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２～５が省略されてよい。背景光を生成する発光物質がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、装置１においては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、発光物質の励起波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、背景光の波長に応じて別々に検出できるようになっていてよい。更にまた、背景光は、照明光により与えられてもよい。その場合、対物レンズの上方から透過照明（ケーラー照明であってよい。）により試料溶液が照明される。

＜反転型走査分子計数法の光分析技術の原理＞
　反転型走査分子計数法は、端的に述べれば、単一粒子の影を検出する形式の走査分子計数法にて、即ち、背景光の存在下で、試料溶液内にて光検出領域の位置を移動し、非発光性の単一粒子が光検出領域に包含された際の背景光の低下を単一粒子の信号として検出する態様にて、単一粒子の存在が個別に検出され、その計数、或いは、試料溶液中の濃度に関する情報が取得される。

　具体的には、通常の走査分子計数法と同様に、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、或いは、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動して、図２Ａにて模式的に描かれているように、試料溶液内において光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。既に触れたように、試料溶液中には発光物質が分散され、光検出領域ＣＶ内には、多数の発光物質が存在しているので、光検出領域ＣＶの移動中（図中、時間ｔｏ～ｔ２）、基本的には、それらの発光物質からの光が略一様に検出される。しかしながら、光検出領域ＣＶが移動する間において１つの非発光性粒子の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、発光物質の存在領域の体積が低減するので、発光物質の放出する光の総量が低減し、図２Ｂに描かれている如く、時系列の光強度データ上に、釣鐘型のパルス状の有意な光強度（Ｅｍ）の低下が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２Ｂに例示されている如きパルス状の有意な光強度の低下、即ち、単一粒子の存在を表す信号を一つずつ検出することによって、単一粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する単一粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。

　上記の光強度の低下の度合は、非発光性の単一粒子の径と光検出領域の径との関係から概算することが可能である。図２Ｃを参照して、典型的には、光検出領域内の光強度分布は、図中、実線にて示されている如く、中心にて最大強度Ｉｍａｘを有し、半径ｒ方向に向かって低減する釣鐘型のプロファイルｆ（ｒ）を有している。従って、ｆ（ｒ）が略０になる光検出領域の半径ａを用いて、光検出領域内に非発光性粒子が存在していないときの光検出領域内から放出される光の総量αは、
α＝４π∫ｒ^２ｆ（ｒ）ｄｒ［積分区間は、０～ａ］　…（１）
にて与えられる。一方、光検出領域内に、半径ｂの非発光性の単一粒子が進入し、図２Ｃの下段の如く光検出領域の中心に位置するとき、その領域の発光物質が排除されることとなるので、図２Ｃの上段の斜線領域に相当する光量が低減することとなる。その排除される発光物質に相当する光量、つまり低下量βは、
β＝４π∫ｒ^２ｆ（ｒ）ｄｒ［積分区間は、０～ｂ］　…（２）
にて与えられる。かくして、光強度の低下の割合は、β／αにより概算することが可能となる。

　ここで、ｆ（ｒ）がガウス関数であり、α＝１、ａ＝１となるとき、
ｆ（ｒ）＝０．６８４ｅｘｐ（－２ｒ^２）　 …（３）
となる。図２Ｄは、式（３）を用いて、半径比ｂ／ａに対する光強度の低下の割合β／αをプロットした図である。同図を参照して、典型的には、背景光の変動率が１％程度であり、単一粒子による光強度の低下の割合が１％以下であると、信号の検出が不可能となるので、光検出領域の半径に対する単一粒子半径の比ｂ／ａは、０．１５以上とすべきである。また、単一粒子による光強度の低下の割合を１０％以上とする場合には、光検出領域の半径に対する検出可能な単一粒子半径の比ｂ／ａは、０．３５となる。

　なお、観測されるべき単一粒子が消光剤や蛍光エネルギー移動のアクセプタである場合、単一粒子が周囲（例えば、１０ｎｍ）の光を吸収するので、検出可能な単一粒子半径は、上記に例示の半径よりも低減し得る。

＜反転型走査分子計数法の処理工程＞
　反転型走査分子計数法では、観測対象となる粒子を含む試料溶液の光強度が測定された後、分析される。図３に、反転型走査分子計数法における処理手順の一態様を、フローチャートの形式で表す。

（試料溶液の光強度の測定：図３のステップ１００）
　反転型走査分子計数法による光分析における光強度の測定は、測定中にミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａを駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行う他は、ＦＣＳ又はＦＩＤＡにおける光強度の測定過程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理において、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内において光検出領域の位置を移動する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域における励起光の照射及び光強度の計測が開始される。かかる計測中、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、ミラー７（ガルバノミラー）又は顕微鏡のステージ上のマイクロプレート９を駆動して、ウェル１０内において光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８では、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、典型的には、光検出器１６は、一光子の到来の有無を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出が、フォトンカウンティングによる場合、時系列光強度データは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。

　光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された単一粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となるので、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行される。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となるので、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。

　ところで、光検出領域の位置の移動速度に関して、計測された時系列の光強度データからの単一粒子の個別の検出、或いは、単一粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、かかる移動速度は、単一粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。反転型走査分子計数法の観測対象粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、ブラウン運動によって位置が時間と伴に移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図４Ａに模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度がランダムに変化し（既に触れた如く、光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の単一粒子に対応する有意な光強度の変化を特定することが困難となる。そこで、好適には、図４Ｂに描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データにおいて、図４Ｃの最上段に例示の如く、個々の単一粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略一様となり（単一粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布を反転したプロファイルと略同様となる。）、個々の粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。

　また、反転型走査分子計数法においては、光検出領域が単一粒子の存在位置を通過したときにその単一粒子の存在による背景光の低減を検出して単一粒子を個別に検出する。しかしながら、単一粒子が溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの単一粒子から複数回、その存在を信号が検出されてしまい、検出された信号と１つの単一粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を単一粒子の拡散移動速度よりも高く設定し、これにより、１つの単一粒子を一つの（単一粒子の存在を表す）信号に対応させることが可能となる。

　具体的には、拡散係数Ｄを有する粒子がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、平均二乗変位の関係式（２Ｗｏ）^２＝６Ｄ・Δｔ　　 …（４）
から、
Δｔ＝（２Ｗｏ）^２／６Ｄ　　　…（５）
となるので、粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、Ｖdif＝２Ｗｏ／Δｔ＝３Ｄ／Ｗｏ　　　…（６）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に速い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０^－１０ｍ^２／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０^－３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その略１０倍以上の１５ｍｍ／ｓなどと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。

（光強度の分析）
　上記の処理により時系列光強度データが得られると、コンピュータ１８において、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、単一粒子の信号の検出、単一粒子のカウンティング、濃度算出等の各種分析が実行される。

　１つの粒子が光検出領域に入ったか否かの判定は、上記の処理により時系列光強度データの形状に基づいて為されてよい。典型的には背景光の強度から計って所定の閾値より低い光強度を有する信号が検出されたときに１つの単一粒子が光検出領域に入ったと判定されてよい。より具体的には、通常、単一粒子の存在を表す信号は、光検出部の時系列の検出値、即ち、光強度データにおいて、或る程度の強度を下回る下に凸の釣鐘型のパルス状の信号として現れ、ノイズは、釣鐘型のパルス状ではないか、強度の高い信号として現れる。そこで、時系列光強度データ上において、背景光の強度から計って所定閾値を下回る下に凸の釣鐘型のパルス状の信号を単一粒子の存在を表す信号として検出するよう構成されていてよい。「所定閾値」は、実験的に適当な値に設定することが可能である。

　更に、反転型走査分子計数法に用いられる光分析装置により得られる光強度は、比較的微弱であり、細かい増減が生じ、かかる光強度の細かい増減は、単一粒子の存在を表す信号の検出精度を悪化させる。そこで、時系列の光強度データを平滑化し、光強度の細かい増減を無視できるようにデータを加工した後、平滑化された時系列光強度データにおいて背景光の強度から計って所定閾値を下回る強度を有する下に凸の釣鐘型のパルス状信号を単一粒子の存在を表す信号として検出してもよい。

　反転型走査分子計数法においては、信号の数を計数して光検出領域に包含された単一粒子の数を計数するようになっていてよい（粒子のカウンティング）。その場合、検出された単一粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の同定された単一粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。具体的には、例えば、複数の試料溶液の数密度若しくは濃度の比、或いは、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比が算出されるか、又は、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を用いて、絶対的な数密度値又は濃度値が決定されてよい。或いは、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、単一粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できることとなる。
　以下、より詳細に説明する。

（ｉ）単一粒子信号の個別検出
　時系列の光強度データにおいて、一つの粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図４Ｂに示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号における光強度の変化は、（光学系により決定される）光検出領域内の光強度分布を反映した下に凸の略釣鐘状のプロファイルを有する（図４Ｃ最上段参照）。従って、走査分子計数法では、基本的には、背景光から計った適宜設定される閾値を下回る光強度の低下が継続する時間幅が所定の範囲にあるとき、その光強度の低下のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、閾値を下回る光強度の低下が継続する時間幅が所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、背景光Ｉｂｇから下に凸のガウス分布：
Ｉ＝Ｉｂｇ－Ａ・ｅｘｐ（－２ｔ^２／ａ^２）　　…（７）
であると仮定できるときには、有意な光強度の低下のプロファイル（背景光のゆらぎではないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（７）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの粒子の検出が為されてよい。なお、強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等において無視されてよい。

　時系列光強度データからの単一粒子の一括的な検出を行う処理方法の一つの例としては、まず、時系列光強度データ（図４Ｃ、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（図３－ステップ１１０、図４Ｃ中上段「スムージング」）。発光物質の発する光は確率的に放出されるものであり、また、その光強度は、比較的微弱であるので、細かい増減が生じるところ、かかる光強度の細かい増減（ゆらぎ）は、単一粒子の存在を表す信号の検出精度を悪化させる。スムージング処理は、かかるデータ上の細かい増減を無視できるようにすることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法等により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法において一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ　ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。

　次いで、スムージング処理後の時系列光強度データにおいて、有意なパルス状の信号（以下、「パルス信号」と称する。）が存在する時間領域（パルス存在領域）を検出するために、スムージング処理後の時系列光強度データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。時系列光強度データの時間微分値は、図４Ｃ中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点における値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。

　しかる後、時系列光強度データ上において、逐次的に、有意なパルス信号を検出し、検出された信号が単一粒子に対応する信号であるか否かが判定される。具体的には、まず、時系列光強度データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域におけるスムージングされた時系列光強度データに対して、下に凸の釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図４Ｃ下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のパルスのピークの強度（背景光からの最大低下量）Ｉpeak、パルス幅（半値全幅）Ｗpeak、フィッティングにおける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの発光粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、パルスのピーク強度、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か、例えば、
下記の条件:
２０μ秒＜パルス幅＜４００μ秒
ピーク強度＞４．０［ｐｃ／１０μｓ］　　…（Ａ）
相関係数＞０．９５
を満たすか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの粒子に対応する信号において想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの粒子に対応する信号であると判定される。一方、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。

　上記のステップ１３０～１５０の処理におけるパルス信号の探索及び判定は、時系列光強度データの全域に渡って繰り返し実行されてよい（ステップ１６０）。なお、時系列光強度データから発光粒子の信号を個別に検出する処理は、上記の手順に限らず、任意の手法により実行されてよい。

（ii）粒子濃度の決定
　更に、検出された単一粒子の信号の数を計数して、粒子の数の決定が為されてもよい（粒子のカウンティング）。また、任意の手法にて、光検出領域の通過した領域の総体積が算定されれば、その体積値と粒子の数とから試料溶液中の粒子の数密度又は濃度が決定される（ステップ１７０）。

　光検出領域の通過した領域の総体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に基づいて理論的に算定されてもよいが、実験的に、例えば、粒子の濃度が既知の溶液（対照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出及びカウンティングを行うことにより検出された粒子の数と、対照溶液の粒子の濃度とから決定されるようになっていてよい。具体的には、例えば、粒子濃度Ｃの対照溶液について、対照溶液の単一粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、
Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ　　…（８）
により与えられる。また、対照溶液として、単一粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、単一粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の粒子濃度ｃは、
ｃ＝ｎ／Ｖｔ　　…（９）
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の装置においては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な粒子についての濃度Ｃと粒子の数Ｎとの関係（式（６））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が単一粒子の検出を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。

　かくして、光検出領域により試料溶液中にて走査して粒子を個別に検出する反転型走査分子計数法において、上記の処理手順により、試料溶液中の粒子のカウンティング、濃度の決定等が可能となる。

（４）一定の信号数を検出する単一粒子検出処理
　上記の単一粒子検出処理においては、或る設定した時間に亘って光測定を実行した後、得られた光強度データ上にて単一粒子の信号が検出される。つまり、任意に設定された測定時間中に得られた単一粒子の信号の数が計数される。その場合、試料溶液中の粒子濃度が未知であるとき、或る固定された測定時間に亘って光強度の測定を行う場合には、粒子の濃度が低い場合に備えて、測定時間は、十分に長く設定されることとなる。一方、試料溶液中の粒子の濃度が高い場合には、濃度等の特性を許容可能な又は満足する精度にて決定するのに必要な時間以上に光強度の測定が継続されることとなる。また、試料溶液中の粒子濃度が実験者の想定した濃度よりも低く、設定された測定時間が足りない場合には、結果の誤差が大きくなってしまう。このように、設定された測定時間の長さによって、検出される単一粒子の信号数の変動することとなり、特に、単一粒子濃度が低いときには、検出信号数から算定される単一粒子濃度値のばらつきが大きくなって精度が低下し得る。

　そこで、粒子のカウンティングの別の態様として、単一粒子の信号数が任意に設定された数に到達するまで測定が実行され、測定時間に基づいて単一粒子濃度値が算定されるようになっていてよい。即ち、単一粒子検出処理の別の態様として、光検出領域を移動しながらの光強度の測定と単一粒子の信号の検出とを信号の数が予め定められた数に達するまで繰り返し、信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間が計測され、かかる単一粒子の信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて、粒子濃度が決定されてよい。かかる構成によれば、試料溶液中の粒子濃度が高い場合には、光強度の測定に要する時間は短縮され、試料溶液中の粒子濃度が低い場合には、結果（即ち、粒子濃度）に要求される精度を達成する粒子数が得られるまで光強度の測定を継続させることが可能となる。つまり、単一粒子の濃度に応じて測定時間が最適化される。
　そして、単一粒子の信号の数が達するべき予め定められた数を結果に要求される精度を達成する粒子数に設定しておくことにより、単一粒子の信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間には、結果に要求される精度を達成する粒子数が反映されることとなるので、その時間に基づいて決定される粒子の濃度値は、許容可能な又は満足する精度を有していることが期待される。つまり、予め定められた数を結果に要求される精度を達成する数に設定しておけば、その予め定められた数の単一粒子の検出に要した時間又はそれから導出される任意の結果におけるばらつきは、小さく抑制され、結果の精度を満足するものとすることが可能となる。

（ｉ）基本原理
　粒子の濃度値と、信号数が予め定められた数に達するのに要した時間とは、以下の如く、関係づけられる。即ち、或る粒子濃度Ｃの試料溶液中において、時間τに亘って、光検出領域を走査速度ｕにて移動させた場合、光検出領域の断面積をＳとすると、検出される粒子信号の数Ｘは、
Ｘ＝ＣＳｕτＮ_Ａ　　…（１０）
となる。ここで、Ｎ_Ａは、アボガドロ数である。従って、信号数が予め定められた数ＸＥに達するのに時間Ｔを要したとすると、粒子濃度Ｃは、
Ｃ＝ＸＥ／（ＳＴｕＮ_Ａ）　　…（１１）
により、時間Ｔの関数として与えられる。なお、式（１１）において、単位時間当たりの粒子の検出速度Ｖは、信号数が予め定められた数ＸＥに達するのに要した時間Ｔと粒子検出数ＸＥとに基づいて
Ｖ＝ＸＥ／Ｔ　　 …（１２）
により与えられるので、粒子濃度Ｃは、
Ｃ＝Ｖ／（ＳｕＮ_Ａ）　　…（１３）
と表される。この式（１３）においては、粒子濃度Ｃが、検出速度Ｖに一次に比例し、粒子濃度Ｃと検出速度Ｖとの対応関係がわかり易いので、実際の実験においては、粒子濃度Ｃは、検出速度Ｖを用いて決定されてもよい。

（ii）処理操作手順
　一定の信号数を検出する単一粒子検出処理は、例えば、図５のフローチャートに示した処理手順により実行されてよい。同図の例においては、端的に述べれば、光検出領域の位置の移動、光検出領域からの光の検出、単一粒子の信号の検出及び検出された粒子信号の計数の一連の処理が、解析時間間隔ｔ（所定の時間間隔）毎に、検出された粒子数Ｘが終了粒子数ＸＥ（発光粒子数が到達すべき予め定められた数）に到達するまで反復して実行される。なお、以下に述べる一連の処理及び構成は、コンピュータ１８の処理作動により実現されることは理解されるべきである。

（ａ）初期設定
　図５を参照して、操作処理において、具体的には、まず、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、光強度の測定と粒子の検出・計数の処理の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、初期設定として、終了粒子数ＸＥの設定（ステップ１０）及び解析時間間隔ｔの設定（ステップ２０）を行う。終了粒子数ＸＥと解析時間間隔ｔとは、使用者により任意に設定されてよい。終了粒子数ＸＥは、粒子濃度の結果値に要求される精度を達成できるように粒子濃度が既知の溶液を用いた予備実験による結果を参考にして適宜決定可能である。解析時間間隔ｔとしては、処理の開始後から粒子数（Ｘ）が終了粒子数（ＸＥ）に到達するまでの時間よりも十分に短い任意の時間間隔が、装置１における処理速度等を考慮して適宜設定されてよい。また、終了粒子数ＸＥと解析時間間隔ｔとは、それぞれ、粒子濃度が既知の溶液を用いた予備実験による結果を参考にして予め決定された値が、装置１において記憶され、かかる記憶された値が自動的に又は使用者の選択により使用されるようになっていてもよい。

（ｂ）粒子数の検出
　上記の如く終了粒子数ＸＥと解析時間間隔ｔの設定が為されると、以下の如く、解析時間間隔ｔ毎に、解析時間間隔ｔに亘る走査分子計数法による光強度の測定処理及び測定された光強度データからの粒子信号の検出並びに粒子数ｘの検出（ステップ３０）と、ステップ３０にて検出された粒子数ｘを累積して粒子の総数Ｘ（ｔ_ｎ）を算定する処理（ステップ４０）とが粒子の総数Ｘ（ｔ_ｎ）が終了粒子数ＸＥに到達するまで（ステップ５０）、反復して実行される。なお、ステップ３０～５０の処理の反復実行に先だって、一連の処理の開始時間Ｔｓが記憶されてよい（ステップ２５）。

　ステップ３０における光検出・粒子数検出の処理は、図３に示した処理と同様であってよい。端的に述べれば、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行いながら、光強度の測定が解析時間間隔ｔに亘って為され、しかる後、得られた解析時間間隔ｔにおける時系列光強度データにおいて、コンピュータ１８において、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、単一粒子の存在を表す信号の検出及び検出数のカウンティングが実行される。

　かくして、解析時間間隔ｔに亘る時系列光強度データにおける粒子数ｘが検出されると、発光粒子の検出総数Ｘ（ｔ_ｎ）が
Ｘ（ｔ_ｎ）＝Ｘ（ｔ_ｎ－１）＋ｘ　　…（１４）
により算出される（図５－ステップ４０）。なお、Ｘ（ｔ_ｎ－１）は、前回の解析時間間隔ｔまでに検出された粒子の検出総数であり、その初期値は０である。そして、ステップ３０～４０は、発光粒子の検出総数Ｘ（ｔ_ｎ）が終了粒子数ＸＥに到達するまで、即ち、
Ｘ（ｔ_ｎ）≧ＸＥ　　…（１５）
が成立するまで（ステップ５０）、解析時間間隔ｔ毎に繰り返される。そして、ステップ３０～５０を反復しているうちに、式（１５）が成立すると、試料溶液の光強度の測定と粒子の検出・計数との処理が終了する。ステップ３０～５０の反復処理が終了すると、終了時間ＴＥが記憶されてよい（ステップ６０）。

（ｃ）粒子数と測定終了時間の表示
　ところで、解析時間間隔ｔ毎にステップ３０～５０の反復実行期間において（式（１５）が成立するまで）、コンピュータ１８のモニター上などの表示器に、粒子の検出総数Ｘ（ｔ_ｎ）及び／又は測定終了時間ＴＥ若しくは測定残り時間Ｔｒが表示されるようになっていてよい。かかる構成によれば、使用者は、それらの表示を見ることによって、実行中の測定がいつ頃終了するのかを予測することができる点で有利である。

　上記の如き表示を実行する場合には、図５のステップ５０の判定において、式（１５）が成立しなかった場合に、図中、点線にて示された各処理が実行される。具体的には、まず、ステップ４０において算定された最新の粒子の検出総数Ｘ（ｔ_ｎ）が表示器上に表示される（ステップ５２）。なお、既にステップ３０～５０の反復実行が為されている場合には、それまでの粒子の検出総数Ｘ（ｔ_ｎ）の値が更新される。次いで、測定終了時間ＴＥ若しくは測定残り時間Ｔｒを算出するために、ステップ３０～５０の処理の開始後からの粒子の検出速度ｖが算出される（ステップ５４）。現在までの粒子の検出速度ｖは、
ｖ＝Ｘ（ｔ_ｎ）／（Ｔ_ｐ－Ｔ_ｓ）　　…（１６）
により与えられてよい。ここで、Ｔ_ｐは、現在の時刻である。かくして、粒子の検出速度ｖを用いて、測定残り時間Ｔｒ（ステップ３０～５０の処理終了までの時間）が、
Ｔｒ＝（ＸＥ－Ｘ（ｔ_ｎ））／ｖ　　…（１７）
により推定され、また、測定終了時間ＴＥ（ステップ３０～５０の処理が終了する時間）が、
ＴＥ＝Ｔｐ＋Ｔｒ　　…（１８）
により推定される（ステップ５６）。そして、推定された測定終了時間ＴＥ若しくは測定残り時間Ｔｒが表示器上に表示される（ステップ５８）。なお、既にステップ３０～５０の反復実行が為されている場合には、既に表示されている値が更新される。また、Ｘ（ｔ_ｎ）＝０のときは、式（１７）又は（１８）は、演算されずに、Ｔｒ及びＴＥは、不明であると表示されてよい。

　上記の図５のステップ３０～５０の処理は、既に述べた如く、解析時間間隔ｔ毎に繰り返される。この点に関し、図３のステップ１００の光強度の測定は、測定の開始から終了まで、ステップ１００以外の信号処理ステップの実行中も連続的に実行されてよい。即ち、光検出・粒子数検出の処理においては、一つのサイクルの解析時間間隔ｔに亘る光強度の測定が完了されると、次のサイクルの解析時間間隔ｔに亘る光強度の測定がそのまま連続して実行されると同時に、コンピュータ１８において、完了したサイクルの解析時間間隔ｔに亘って取得された光強度データからの粒子の信号の検出・計数の処理が実行されることとなる。これにより、リアルタイムに粒子の検出・計数が達成されることとなる。

（ｄ）濃度算出等の分析
　かくして、粒子数が終了粒子数に到達すると、粒子数が終了粒子数に到達するまでの時間Ｔ（＝ＴＥ－Ｔ_ｓ）或いは検出された粒子の信号から得られるその他の情報を用いて、濃度算出等の分析が実行されてよい（ステップ７０）。粒子濃度は、既に述べた如く、式（１２）を用いて、終了粒子数に到達するまでの時間Ｔと終了粒子数ＸＥとから、粒子の検出速度Ｖを算出し、粒子の検出速度Ｖから、式（１３）の関係を用いて決定される。

　なお、式（１０）～（１３）中の光検出領域の通過領域の断面積Ｓは、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に基づいて理論的に算定されてもよいが、実験的に、例えば、粒子濃度が既知の溶液（対照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出・計数を行うことにより検出された粒子の数と、対照溶液の発光粒子の濃度とから決定されるようになっていてよい。具体的には、例えば、粒子の濃度Ｃの対照溶液について、移動速度ｕｏにて或る時間τｏに亘って実行された光強度の測定における粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過領域の断面積Ｓは、
Ｓ＝Ｎ／（Ｃ・ＮＡ・ｕｏ・τｏ）　　…（１９）
により与えられる。また、対照溶液として、粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＳの平均値が光検出領域の断面積Ｓとして採用されるようになっていてよい。

（ｅ）試料溶液の光強度の測定と粒子の検出・計数の処理の修正例
　上記の試料溶液の光強度の測定と発光粒子の検出・計数の処理において、別の態様として、解析時間間隔ｔは、固定値ではなく、発光粒子の検出状況に応じて修正されるようになっていてもよい。図６Ａは、解析時間間隔ｔを粒子の検出状況に応じて修正する処理（ステップ２０’）を含むよう構成された試料溶液の光強度の測定と粒子の検出・計数の処理をフローチャートの形式で表したものであり、図６Ｂは、ステップ２０’における解析時間間隔ｔの演算処理をフローチャートの形式で表したものである。なお、図６Ａにおいて、図５と同一の処理には、同一のステップ番号が付されている。

　同図を参照して、図６の処理では、解析時間間隔ｔに亘る光強度の測定が完了する毎に解析時間間隔ｔが修正される（ステップ２０’）。また、図示の例の処理は、特に、開始から粒子数が終了粒子数ＸＥに到達するまでの一回の測定において、予め定められた回数Ｎ（以下、「更新予定回数」と称する。）だけ、光強度の測定と粒子の検出・計数の処理サイクルが実行されるよう構成される。具体的には、まず、初期設定として、終了粒子数ＸＥの設定（ステップ１０）及び開始時間Ｔｓの記憶（ステップ２５）の後、最初に光強度の測定と粒子の検出・計数の処理を実行する際、即ち、光強度の測定と粒子の検出・計数の処理サイクルの実行回数ｋが０のとき、解析時間間隔ｔに、任意に設定されてよい初期値ｔｏが与えられる（図６Ｂステップ２００、２１０参照）。そして、処理サイクルの実行回数ｋが１増大され（ステップ２７０）、図５に記載の処理と同様に解析時間間隔ｔに亘る光強度の測定及び粒子の検出・計数の処理が実行される（ステップ３０～５０）。かくして、最初のサイクルの粒子数ｘ（＝Ｘ（ｔ_１））が得られると、粒子検出速度ｖ（ステップ５４）、測定残り時間Ｔｒ（ステップ５６）が順に算定される。なお、図５の場合と同様に、コンピュータ１８のモニター上などの表示器に、粒子の検出総数Ｘ（ｔ_ｎ）及び／又は測定終了時間ＴＥ若しくは測定残り時間Ｔｒが表示されるようになっていてよい（ステップ５２、５８）。また、最初の処理サイクルで粒子数が終了粒子数ＸＥに到達していたときには、そのまま、光強度の測定と粒子の検出・計数の処理が終了する（ステップ５０）。

　最初の処理サイクルの後、解析時間間隔ｔの修正と、図５の場合と同様の光強度の測定と粒子の検出・計数の処理サイクル（ステップ２０’、３０～５８）が、粒子数が終了粒子数ＸＥに到達するまで反復される。その際、解析時間間隔ｔの修正を行うステップ２０’においては、まず、そのときまでに検出されている粒子数Ｘ（ｔ_ｎ）が０であるか否かが判定される（ステップ２２０）。Ｘ（ｔ_ｎ）＝０のときは、直前のサイクルにおける解析時間間隔ｔがｍ倍されてよい（ｍは、１以上の正数）。Ｘ（ｔ_ｎ）＞０であるときには、測定残り時間Ｔｒと更新予定回数Ｎと処理サイクルの実行回数ｋとを用いて、解析時間間隔ｔが、
ｔ＝Ｔｒ／（Ｎ－ｋ）　　…（２０）
により算定される（ステップ２４０）。なお、算定される解析時間間隔ｔには、下限が設定されていてよく、解析時間間隔ｔが下限値ｔｍｉｎを下回るときには、解析時間間隔ｔは、下限値ｔｍｉｎに設定されてよい（ステップ２５０、２６０）。上記の如く、解析時間間隔ｔが修正される態様によれば、測定残り時間Ｔｒには、観測対象となっている試料溶液中の粒子の検出状況が反映されているので、解析時間間隔ｔがかかる粒子の検出状況に応じて最適化されることとなる。

　次に、反転型走査分子計数法を利用した、本発明の標的粒子の検出方法について説明する。
＜標的粒子の検出方法＞
　本発明に係る検出方法では、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、反転型走査分子計数法を利用して、非発光性の粒子を検出する。前述のように、反転型走査分子計数法は、分子が離散的な状況において、ｐＭオーダー以下の比較的低濃度の粒子に対しても測定が可能である。このため、本発明に係る検出方法により、試料溶液中の解析対象の標的粒子の濃度が非常に低い場合であっても、標的粒子を高感度に計数することができる。

　さらに、本発明に係る検出方法では、検出対象である標的粒子を直接計数するのではなく、反転型走査分子計数法により計数可能な大きさを持ち、かつ標的粒子と結合可能な観測用粒子を用い、測定試料溶液中の観測用粒子を検出することによって、間接的に標的粒子を検出する。このため、標的粒子が、一分子当たりの大きさが光学系の光検出領域の体積に対して小さい（即ち、前記光検出領域を当該粒子が通過する際に、当該光検出領域から検出される光強度がほとんど低下しない）場合であっても、反転型走査分子計数法を利用することができ、迷光や水のラマン散乱による影響を抑制しつつ、かつ発光標識せずに標的粒子を検出することができる。

　具体的には、本発明に係る検出方法は、下記工程（ａ）～（ｅ）を有し、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、非発光性の粒子を検出することを特徴とする。
（ａ）非発光性の観測用粒子、及び固相担体を、検出対象である標的粒子を介して、溶液中又は溶液の界面にて結合させ、複合体を形成させる工程；
（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記遊離状態の観測用粒子を前記溶液から除去する工程；
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記観測用粒子を前記複合体から分離させる工程；
（ｄ）前記工程（ｃ）の後、分離された観測用粒子を分散させた測定試料溶液を調製する工程；及び
（ｅ）前記測定試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域から実質的に一定の背景光を含む光を検出して時系列の光強度データを生成し、前記時系列光強度データにおいて前記観測用粒子が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる光強度の低下を、前記観測用粒子の各々の存在を表す信号として個別に検出することにより、前記測定試料溶液中の観測用粒子を検出する工程。

　本発明に係る検出方法の検出の対象である標的粒子は、非発光性の粒子である。非発光性とは、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等による光を発しない性質を意味する。なお、標的粒子は、背景光及び測定光（反転型走査分子計数法による測定の際に、背景光を検出するために測定試料溶液に照射される光）に対して非発光性であればよく、背景光及び測定光以外の波長の光を照射した場合に蛍光等を発する粒子であってもよい。

　標的粒子の大きさや比重は特に限定されるものではないが、観測用粒子を用いて間接的に標的粒子を計数するという本発明の効果をより発揮し得ることから、標的粒子は、溶液中に分散しランダムに運動する粒子であることが好ましく、測定に使用する共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の光検出領域を通過した際に、背景光の変動率が１０％以下となる粒子であることがより好ましく、背景光の変動率が１％以下となる粒子であることがさらに好ましい。背景光の変動率が１０％以下の小さな粒子は、反転型走査分子計数法によって直接検出することは非常に困難であるが、観測用粒子を用いることにより、検出可能となる。例えば、標的粒子の大きさとしては、平均外径が光学系の光検出領域の直径の３５％未満であることが好ましく、３０％未満であることがより好ましい。

　本発明に係る検出方法においては、標的粒子は、非発光性の粒子であれば、任意のものであってよく、特に限定されるものではない。例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、核酸類似物質、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウィルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物、又は非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイド等など）等が挙げられる。さらに、複数の異種又は同種の生体分子が結合したものであってもよい。核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ｃＤＮＡのように人工的に増幅させたものであってもよい。核酸類似物質としては、ＤＮＡやＲＮＡのような天然型ヌクレオチド（天然に存在するヌクレオチド）の側鎖等がアミノ基等の官能基により修飾されたものや、タンパク質や低分子化合物等で標識されたもの等が挙げられる。より具体的には、例えば、Ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ（ＢＮＡ）や、天然型ヌクレオチドの４’位酸素原子が硫黄原子に置換されているヌクレオチド、天然型リボヌクレオチドの２’位水酸基がメトキシ基に置換されているヌクレオチドやＨｅｘｉｔｏｌ　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ（ＨＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等が挙げられる。

　本発明に係る検出方法における標的粒子としては、核酸分子又は核酸類似物質であることが好ましい。核酸分子又は核酸類似物質としては、２本鎖核酸分子であってもよく、１本鎖核酸分子であってもよい。具体的には、例えば、動物や植物の染色体や、細菌やウィルスの遺伝子に存在する塩基配列を有する核酸分子、人工的に設計された塩基配列を有する核酸分子が挙げられる。中でも、標的粒子として、例えば、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＰＣＲ増幅等による合成ＤＮＡ、ＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成されたｃＤＮＡ等が好ましい。

　本発明に係る検出方法において用いられる観測用粒子及び固相担体は、いずれもその表面に標的粒子と特異的又は非特異的に結合又は吸着する部位（以下、「標的粒子結合部位」ということがある）を有する。また、観測用粒子及び固相担体は、標的粒子を介して結合する。つまり、両者が備える標的粒子結合部位は、一の標的粒子の異なる部位とそれぞれ独立して結合するものである。

　例えば、標的粒子が核酸分子又は核酸類似物質である場合には、標的粒子結合部位としては、標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、核酸結合性タンパク質（例えば、核酸結合性抗体等）、核酸に結合する非発光性の色素分子等が挙げられる。当該オリゴヌクレオチドとしては、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ｃＤＮＡのように、人工的に増幅させたものであってもよく、天然の核酸塩基と同様にヌクレオチド鎖や塩基対を形成することが可能な核酸類似物質を一部又は全部に含むものであってもよい。また、標的粒子がタンパク質である場合には、標的粒子結合部位としては、標的粒子に対する抗原若しくは抗体、標的粒子に対するリガンド若しくはレセプター等を用いることができる。

　本発明において用いられる観測用粒子及び固相担体が備える標的粒子結合部位は、標的粒子と非特異的に結合等するものであってもよいが、標的粒子の検出・定量の精度の点からは、特異的に結合等するものであることが好ましい。なお、標的粒子と特異的に結合する標的粒子結合部位としては、物理的又は化学的性質が標的粒子と類似した他の物質に対する結合よりも、標的粒子と優先的に結合するものであればよく、標的粒子以外の物質と全く結合しないものである必要はない。例えば、標的粒子が核酸分子である場合には、標的粒子結合部位として用いるオリゴヌクレオチドは、当該標的粒子の部分塩基配列と完全に相補的な塩基配列を有していてもよく、当該標的粒子の部分塩基配列と１～数塩基のミスマッチを有する塩基配列を有していてもよい。

　本発明に係る検出方法において用いられる観測用粒子及び固相担体は、例えば、標的粒子結合部位を有する物質（以下、「標的粒子と結合する物質」ということがある）を、粒子や固相担体の表面に固定化させることによって製造できる。観測用粒子及び固相担体の表面に標的粒子と結合する物質を固定化させる方法は特に限定されるものではなく、物理的に吸着させる方法でもよく、観測用粒子又は固相担体の表面の官能基に化学的に結合させる方法でもよい。化学的に結合させる場合には、各官能基に適した方法により結合させることができる。例えば、ＥＤＡＣ反応、ＥＤＣとＮＨＳとを予め混合してカルボン酸とアミノ基とを結合させる反応、双極性を有するリンカーを用いてアミノ基同士を架橋する反応、活性化したアルデヒド基やトシル基と、標的粒子と結合する物質中の官能基を結合する反応等が挙げられる。観測用粒子又は固相担体の表面に官能基を有さない場合には、それらの表面を予め官能基で被覆してもよい。

　本発明に係る検出方法において用いられる観測用粒子及び固相担体としては、標的粒子と結合する物質をその表面に直接有しているものに限られず、標的粒子と結合する物質がその表面に可逆的に結合しているものであってもよい。例えば、観測用粒子又は固相担体がその表面にアビジンを備えている場合には、標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをビオチンで標識し、得られたビオチン標識オリゴヌクレオチドを観測用粒子又は固相担体の表面のアビジンに結合させ、これらを標的粒子と結合させることによって、観測用粒子と固相担体と標的粒子とを含む複合体を形成してもよい。

　本発明に係る検出方法において用いられる観測用粒子は、測定試料溶液中にて分散しランダムに運動する非発光性の粒子である。当該観測用粒子としては、測定に使用する共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の光検出領域を通過した際に、背景光の変動率が１０％超となる粒子であることが好ましく、背景光の変動率が１５％以上となる粒子であることがより好ましい。例えば、観測用粒子の大きさとしては、平均外径が光学系の光検出領域の直径の３５％以上であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましい。平均外径が光学系の光検出領域の直径の３５％以上であれば、測定試料溶液中にて分散しランダムに運動する観測用粒子を、反転型走査分子計数法により精度よく検出することができる。

　当該観測用粒子の材質は、測定試料溶液中にて分散しランダムに運動可能な程度の比重のものであればよい。具体的には、例えば、ポリスチレン粒子、ラテックス粒子、ポリアクリルアミド樹脂粒子、ポリメチルメタクリエート粒子、ポリエチレン粒子、ポリ塩化ビニル粒子、ポリアミド粒子、ポリアクリレート粒子、ポリウレタン粒子等のプラスチック粒子；シリカ粒子、セラミックス粒子、ジルコニア粒子、シリカ－アルミナ粒子、ガラス粒子等の無機粒子；アガロースゲル粒子等が挙げられる。

　本発明に係る検出方法において用いられる固相担体は、溶液中に分散している観測用粒子と、固液分離処理によって分離可能なものであれば、その形状、材質等は特に限定されるものではない。例えば、比重や磁性の有無等によって観測用粒子と分離可能な粒子であってもよく、多孔質膜、容器、チップ基板等であってもよい。

　当該固相担体の材質は、水又は測定に用いられる溶媒に不溶性であり、その表面に標的粒子と結合する物質を固定化できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、天然ゴムやポリスチレン、ポリスチレン－ジビニルベンゼン共重合体、スチレン－ブタジエン共重合体、ポリアクリル酸エステル、及びポリメタクリル酸エステル等のプラスチック；カオリン、炭素、カーボン、活性炭、ガラス、シリカ、アルミナ、シリカ－アルミナ等の無機物；ゼラチン、リポソーム、及び血球等の天然有機高分子；磁性物質；等が挙げられる。

　本発明において用いられる固相担体としては、遊離の観測用粒子との分離が容易であることから、磁性粒子、シリカメンブレン、シリカフィルター、プラスチックプレート、プラスチック容器、ガラス容器、チップ基板が好ましく、磁性粒子がより好ましい。磁性粒子を固相担体として用いる場合には、観測用粒子は磁性粒子ではない。

　固相担体として用いられる磁性粒子としては、磁気誘導により容易に磁化され得るものであれば特に限定されるものではない。磁性粒子として、例えば、四三酸化鉄（Ｆｅ_３Ｏ_４）、三二酸化鉄（γ－Ｆｅ_２Ｏ_３）、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロム等の金属からなる粒子や、あるいはコバルト、ニッケル、マンガン等を含む合金からなる粒子等が挙げられる。また、該磁性粒子は、磁性体のみからなる粒子であってもよく、非磁性体粒子の内部に磁性体の微粒子を含有させた粒子であってもよく、非磁性体粒子の表面に磁性体の微粒子を固定化させた粒子であってもよい。このような非磁性体粒子として、例えば、疎水性重合体からなるラテックス粒子や、架橋した親水性重合体からなるラテックス粒子、ゼラチン、リポソーム等がある。

　該疎水性重合体として、例えば、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリカプラミド、ポリエチレンテレフタレート等がある。２～４種類程度のモノマーの共重合体からなるラテックス粒子であってもよい。
　また、該架橋した親水性重合体として、例えば、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（２－オキシエチルアクリレート）、ポリ（２－オキシエチルメタクリレート）、ポリ（２，３－ジオキシプロピルアクリレート）、ポリ（２，３－ジオキシプロピルメタクリレート）、ポリエチレングリコールメタクリレート、デキストラン等がある。

　以下、本発明に係る検出方法において、固相担体として用いられる粒子を、特に「分離用粒子」ということがある。本発明において用いられる分離用粒子の大きさは、反転型走査分子計数法によって検出できないほど充分に小さいこと、特に、分離用粒子が光学系の光検出領域を通過した際の背景光の変動率が１０％以下であることが好ましく、１％以下であることがより好ましい。分離用粒子が反転型走査分子計数法によって検出されない場合には、後の工程（ｅ）における反転型走査分子計数法による計測時に、測定試料溶液中に遊離の分離用粒子が分散している場合であっても、ノイズを低減させて観測用粒子を特異的に検出することができるためである。例えば、分離用粒子の大きさとしては、平均外径が光学系の光検出領域の直径の３５％未満であることが好ましく、３０％未満であることがより好ましい。

　具体的には、まず、工程（ａ）として、観測用粒子と固相担体とを、標的粒子を介して結合させ、これらからなる複合体を形成させる。観測用粒子と固相担体と標的粒子との結合反応は、適当な溶媒中で行うことができる。該溶媒は、標的粒子、標識用粒子及び固相担体を損なわない溶媒であれば、特に限定されるものではない。典型的には水溶液であるが、ホルムアミド等の有機溶媒その他の任意の液体であってもよい。具体的には、該溶媒は、当該技術分野において一般的に用いられているバッファーの中から、適宜選択して用いることができる。該バッファーとして、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファーやトリスバッファー等がある。

　観測用粒子と固相担体と標的粒子を同時に反応させてもよく、それぞれの結合反応を逐次的に行ってもよい。例えば、溶媒中に観測用粒子と標的粒子（通常は、標的粒子が含まれているか否かを調べる目的の被検試料であり、以下も同様である）を添加して両者を含む溶液を調製し、当該溶液中で観測用粒子と標的粒子を結合させた後、当該溶液を固相担体に接触させ（分離用粒子を用いる場合には、当該溶液に分離用粒子を添加し）、観測用粒子と結合している標的粒子に固相担体を結合させてもよい。また、溶媒に標的粒子を添加した溶液を固相担体に接触させ（分離用粒子を用いる場合には、当該溶液に分離用粒子を添加し）、固相担体と標的粒子を結合させた後、当該溶液に観測用粒子を添加し、固相担体と結合している標的粒子に観測用粒子を結合させてもよい。なお、「溶液を固相担体に接触させる」とは、例えば、固相担体が多孔質膜の場合には、当該多孔質膜に溶液を透過させればよく、固相担体が容器の場合には、溶液を当該容器に注入すればよく、固相担体がチップ基板の場合には、溶液を当該チップ基板の表面に滴下したり、当該チップ基板を溶液中に浸漬させたりすればよい。

　観測用粒子と標的粒子、固相担体と標的粒子が、いずれも同じ溶液中に共存させるだけで両者を結合させることができる場合には、観測用粒子と標的粒子を含む溶液を固相担体に接触させた（分離用粒子を用いる場合には、当該溶液に分離用粒子を添加した）後、必要に応じて所定時間当該溶液をインキュベートするだけで、当該溶液中で、観測用粒子と標的粒子と固相担体の複合体を形成することができる。

　一方で、標的粒子と、観測用粒子又は固相担体中の標的粒子結合部位が核酸分子又は核酸類似物質である場合には、溶液中の核酸分子等を変性させた後、両者を会合させることが好ましい。なお、「核酸分子又は核酸類似物質を変性させる」とは、塩基対を解離させることを意味する。例えば、２本鎖核酸分子を１本鎖核酸分子とすることを意味する。なお、観測用粒子又は固相担体中の標的粒子結合部位がＰＮＡ等の核酸類似物質を含むオリゴヌクレオチドである場合、標的粒子が２本鎖核酸分子であったとしても、特段の変性処理を行わずとも、当該標的粒子結合部位と標的粒子とを結合させることができる場合がある。

　変性処理としては、高温処理による変性（熱変性）又は低塩濃度処理による変性等が挙げられる。中でも、操作が簡便であるため、熱変性を行うことが好ましい。具体的には、熱変性は、当該溶液を高温処理することにより、当該溶液中の核酸分子等を変性することができる。一般的には、ＤＮＡで９０℃、ＲＮＡでは７０℃で数秒間から２分間程度、保温することによって変性させることができるが、標的粒子の塩基の長さ等により変性する温度は千差万別であり、変性することが可能であれば、この温度に限定するものではない。一方、低塩濃度処理による変性は、例えば、精製水等により希釈することによって、当該溶液の塩濃度が十分に低くなるように調整することによって行うことができる。

　必要に応じて変性させた後、前記溶液中の標的粒子と、観測用粒子又は固相担体中の標的粒子結合部位とを会合させて複合体を形成する。熱変性を行った場合には、高温処理後、当該溶液の温度を、標的粒子と標的粒子結合部位とが特異的にハイブリダイズできる温度（特異的会合条件）にまで低下させることにより、当該溶液中の両者を適宜会合させることができる。好ましくは、両者を含む溶液の温度を、標的粒子結合部位中の標的粒子と相補的な塩基配列を有する領域のＴｍ値±３℃の温度程度まで低下させる。また、低塩濃度処理による変性を行った場合には、塩溶液を添加する等により、当該溶液の塩濃度を、標的粒子と観測用粒子又は固相担体中の標的粒子結合部位とが特異的にハイブリダイズできる濃度にまで上昇させることによって、当該溶液中の両者を適宜会合させることができる。

　なお、２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる温度は、両者からなる会合体の融解曲線から求めることができる。融解曲線は、例えば、両者のみを含有する溶液の温度を、高温から低温へと変化させ、当該溶液の吸光度や蛍光強度を測定することにより求めることができる。得られた融解曲線から、変性した２本の１本鎖核酸分子が会合体を形成し始めた温度から、ほぼ全てが会合体となった温度までの範囲の温度を、両者が特異的にハイブリダイズできる温度とすることができる。温度に代えて、溶液中の塩濃度を低濃度から高濃度への変化させることによっても、同様にして融解曲線を決定し、２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる濃度を求めることができる。

　このように、特異的会合条件は、標的粒子や標的粒子結合部位の種類ごとに異なり、実験的に決定されるものであるが、一般にはＴｍ値（融解温度）で代用することができる。
　例えば、汎用されているプライマー／プローブ設計ソフトウェア等を用いることにより、標的粒子結合部位の塩基配列情報から、標的粒子とハイブリダイズする領域のＴｍ値（２本鎖ＤＮＡの５０％が１本鎖ＤＮＡに解離する温度）を算出することができる。温度がＴｍ値近傍の値である条件、例えばＴｍ値±３℃程度である条件を、特異的会合条件とすることができる。算出されたＴｍ値近傍において実験的に融解曲線を求めることにより、より詳細に特異的会合条件を決定することもできる。

　また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、複合体を形成させる際に、前記溶液の温度を比較的ゆっくりと低下させることが好ましい。例えば、前記溶液の温度を７０℃以上にして核酸分子を変性させた後、当該溶液の液温を、０．０５℃／秒以上の降温速度で低下させることができる。

　また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、予め前記溶液中に、界面活性剤、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、又は尿素等を添加しておくことも好ましい。これらの化合物は、１種のみを添加してもよく、２種類以上を組み合わせて添加してもよい。これらの化合物を添加しておくことにより、比較的低い温度環境下において、非特異的なハイブリダイゼーションを起こりにくくすることができる。

　次いで、工程（ｂ）として、遊離状態の観測用粒子を前記溶液から除去する。すなわち、前記標的粒子を介して前記固相担体と結合していない観測用粒子を、当該固相担体、前記標的粒子及び前記観測用粒子からなる複合体と分離除去する。固相担体が多孔質膜、容器、チップ基板等の場合には、工程（ａ）で調製した溶液から液体成分を除去することによって、遊離の観測用粒子を固相担体から分離除去することができる。また、固相担体が磁性粒子の場合には、例えば、工程（ａ）で調製した溶液が入れられている容器に磁石を接近させ、当該容器の当該磁石に最も近接する面に磁性粒子を収束させた後、上清を除去してもよい。固相担体が観測用粒子よりも重い粒子である場合には、工程（ａ）で調製した溶液を、固相担体は沈殿するが、遊離の観測用粒子は沈殿しない遠心力で遠心分離処理し、上清を除去してもよい。その他、固相担体が観測用粒子よりも充分に大きな粒子である場合には、工程（ａ）で調製した溶液を、孔の大きさが固相担体は透過できないが遊離の観測用粒子は透過できる多孔質膜を用いて濾過し、当該多孔質膜の表面に残留した固相担体を回収してもよい。

　次いで、工程（ｃ）として、前記複合体から、前記観測用粒子を分離させた後、工程（ｄ）として、分離された観測用粒子を分散させた測定試料溶液を調製する。反転型走査分子計数法によって粒子を検出するためには、当該粒子が測定試料溶液中でランダムに運動している必要があるが、固相担体が多孔質膜、容器、チップ基板等の場合には、観測用粒子を、固相担体を含む複合体から切り離すことによって、溶液中に観測用分子を分散させることができる。また、固相担体が分離用粒子の場合にも、観測用粒子を、固相担体を含む複合体から切り離すことにより、溶液中における観測用粒子の運動の自由度が固相担体と結合している状態よりも高くなり、反転型走査分子計数法によって精度よく観測用粒子を検出することができる。

　標的粒子が生体分子の場合には、標的粒子を分解することによって、観測用粒子を固相担体から分離させることが好ましい。例えば、標的粒子が核酸の場合には核酸分解酵素処理を行い、標的粒子がタンパク質の場合にはタンパク質分解酵素処理を行うことによって、標的粒子を分解することができる。具体的には、工程（ｂ）において遊離の観測用粒子を除去した後の固相担体に、核酸分解酵素やタンパク質分解酵素を含む溶液を接触させ、酵素反応を行う。これらの酵素を含む溶液の溶媒としては、工程（ａ）の説明で挙げられた溶媒と同様のものが挙げられる。

　標的粒子が核酸分子又は核酸類似物質であり、観測用粒子及び固相担体が備える標的粒子結合部位が標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである場合には、観測用粒子と標的粒子と固相担体とからなる複合体中の核酸分子を変性させることによって、観測用粒子を固相担体から分離することができる。例えば、工程（ｂ）において遊離の観測用粒子を除去した後の固相担体に溶媒を添加して当該固相担体を含む溶液を調製した後、当該溶液を、標的粒子がＤＮＡの場合には９０～１００℃、標的粒子がＲＮＡの場合には７０～１００℃に加熱することによって、当該固相担体と結合していた観測用粒子を分離させることができる。

　観測用粒子が分散した測定試料溶液は、観測用粒子を、固相担体を含む複合体から分離させることによって調製できるが、反転型走査分子計数法の測定におけるノイズをより低減し得るため、測定試料溶液中の光検出領域には、固相担体が存在していないことが好ましい。そこで、本発明においては、工程（ｄ）において調製される測定試料溶液は、固相担体を含む複合体が分離除去されたものであることが好ましい。固相担体を含む複合体を分離除去する方法としては、例えば、工程（ｂ）において、固相担体を含む複合体から、当該固相担体と結合していない観測用粒子を除去する際に使用可能な方法と同様の方法が挙げられる。なお、固相担体が容器の場合には、特段の分離処理を行わずとも、当該容器中の溶液を、固相担体を含む複合体の混入のない測定試料溶液とすることができる。

　固相担体として、反転型走査分子計数法によって検出できないほど充分に小さい分離用粒子を用いた場合には、観測用粒子と標的粒子と分離用粒子とからなる複合体（三者複合体）は、遊離の観測用粒子と同程度に、溶液中をランダムに運動し得る。このため、分離用粒子から分離せず、三者複合体をそのまま、反転型走査分子計数法による測定に供することができる。具体的には、工程（ｂ）において遊離の観測用粒子を除去した後の分離用粒子を溶媒中で分散させることによって、三者複合体を分散させた測定試料溶液を調製することができる。当該溶媒としては、工程（ａ）の説明で挙げられた溶媒と同様のものが挙げられる。

　その後、工程（ｅ）として、工程（ｄ）において調製された測定試料溶液中の観測用粒子を、反転型走査分子計数法により算出する。観測用粒子を検出することによって、間接的に標的粒子が検出される。

　具体的には、測定試料溶液を前記の反転型走査分子計数法のための光分析装置に設置し、前記の手法により、前記測定試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動させ、前記測定試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域から実質的に一定の背景光を含む光を検出して時系列の光強度データを生成し、前記時系列光強度データにおいて前記観測用粒子が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる光強度の低下を、前記観測用粒子の各々の存在を表す信号として個別に検出することにより、検出する。個別に検出された観測用粒子の存在を表す信号の数を計数して、前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記観測用粒子の数を計数することもできる。

　検出された観測用粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、測定試料溶液中の同定された観測用粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。具体的には、例えば、複数の測定試料溶液の数密度若しくは濃度の比、或いは、濃度若しくは数密度の基準となる標準測定試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比が算出されるか、又は、濃度若しくは数密度の基準となる標準測定試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を用いて、絶対的な数密度値又は濃度値が決定されてよい。
　或いは、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、観測用粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できることとなる。こうして得られた測定試料溶液中の観測用粒子の数密度又は濃度に関する情報に基づいて、被検試料中の標的粒子の数密度又は濃度を決定することもできる。

　反転型走査分子計数法による計測では、光検出領域からの光に含まれているべき実質的に一定の背景光としては、透過照明等による照明光であってもよく、測定試料溶液内に分散された物質による蛍光、りん光、化学発光、生物発光又は散乱光であってもよい。この場合、測定試料溶液として使用する溶液中に光を放出又は散乱する物質が分散していない場合には、かかる溶液中に積極的に光を放出又は散乱する物質が溶解又は分散されてよい。また、測定試料溶液として使用する溶液が自家蛍光を発する場合には、その自家蛍光が上記の背景光として利用されてよい。

　背景光のために測定試料溶液内に光を放出又は散乱する物質を溶解又は分散させる場合、当該物質は、反転型走査分子計数法による計測の前に測定試料溶液に添加されればよい。当該物質としては、典型的には蛍光物質であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する物質であってもよい。蛍光物質としては、特定の波長の光を放射することにより蛍光を放出する物質であれば特に限定されるものではなく、ＦＣＳやＦＩＤＡ等で使用されている蛍光色素の中から適宜選択して用いることができる。

　次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
　配列番号１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを標的粒子（標的ＤＮＡ）とし、アビジン化ポリスチレンビーズを観測用粒子とし、配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドにビオチンを結合させたビオチン化ＤＮＡプローブ１を、アビジン化ポリスチレンビーズ表面に結合させる「標的粒子と結合する物質」とし、アビジン化磁性ビーズを分離用粒子とし、配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドにビオチンを結合させたビオチン化ＤＮＡプローブ２をアビジン化磁性ビーズ表面に結合させる「標的粒子と結合する物質」として用い、本発明に係る検出方法を行った。

＜ビオチン化プローブを結合させたアビジン化ポリスチレンビーズの調製＞
　１６０ｆＭのアビジン化ポリスチレンビーズ（製品名：ｓｐｈｅｒｏ　ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　ＳＶＰ－４０－５、ｓｐｈｅｒｏ社製、直径（平均外径）：４μｍ）を含むＴＥＳバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１００ｍＭ　ＥＤＴＡ，１Ｍ　ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）と、２．７μＭの３’－ビオチン化ＤＮＡプローブ１を含むＴＥＳバッファーを、５：３で混合し、１時間室温で攪拌しながらインキュベートを行うことによって、アビジン化ポリスチレンビーズに３’－ビオチン化ＤＮＡプローブ１を結合させた。
得られたＤＮＡプローブ１修飾ポリスチレンビーズに対して、遠心分離処理による洗浄を５回行うことによって、未反応の３’－ビオチン化ＤＮＡプローブ１を除去した。

＜ビオチン化プローブを結合させたアビジン化磁性ビーズの調製＞
　１０ｐＭのアビジン化磁性ビーズ（製品名：Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　ｍｙｏｎｅ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、直径：１μｍ）を含むＴＥＳバッファーと１０μＭの５’－ビオチン化ＤＮＡプローブ２を含むＴＥＳバッファーを等量で混合し、１時間室温で攪拌しながらインキュベートを行うことによって、アビジン化磁性ビーズに３’－ビオチン化ＤＮＡプローブ２を結合させた。得られたＤＮＡプローブ２修飾磁性ビーズに対して、遠心分離処理による洗浄を５回行うことによって、未反応の３’－ビオチン化ＤＮＡプローブ２を除去した。

＜工程（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ’）＞
　ＤＮＡプローブ１修飾ポリスチレンビーズと、ＤＮＡプローブ２修飾磁性ビーズと、ＴＥＳバッファーと、各種濃度（０，０．５，１，５，１０，５０ｆＭ）の標的ＤＮＡを１：５：３：１で混合し、２４時間室温で攪拌しながらインキュベートした。この溶液を磁石に近づけることによって沈殿を生じさせ、上清を捨てた後、もとの容量と同じになるようにＴＥＳバッファーを加え、沈殿を懸濁させた。この溶液と６ｎＭのＡＴＴＯ（登録商標）４８８を含む２０容量％ポリエチレングリコール溶液を等量混合し、これらを測定試料溶液とした。

＜工程（ｅ）＞
　調製した測定試料溶液中のアビジン化ポリスチレンビーズを含む複合体を、反転型走査分子計数法により検出した。具体的には、計測においては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス社製）を用い、上記の各測定試料溶液について、時系列のフォトンカウントデータを取得した。励起光は、５０μＷの４８８ｎｍのレーザー光を用い、バンドパスフィルター５３５ＢＰを用いて、５１０～５６０ｎｍの波長帯域の光を測定し、時系列光強度データを生成した。測定試料溶液中における光検出領域は、その直径が４μｍに設計されており、９０００ｒｐｍ（６７．５ｍｍ／秒）の移動速度（走査速度）にて回転させ、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）から得られるシグナルをＢＩＮ　ＴＩＭＥを１０μ秒で検出し、プレート連続測定モードで６０秒間と測定した。各測定試料溶液について、ばらつきを評価するために３回ずつ測定を行った。測定によって得られた時系列データをＳａｖｉｎｚｋｙ－Ｇｏｌａｙのアルゴリズムでスムージングした後、微分によりピークの検出を行った。ピークとみなされた領域のうち、ガウス関数に近似できる領域をシグナルとして抽出し、ピーク数を算出した。

　各測定試料溶液について、測定の結果得られたピーク数を、図７に示す。標的ＤＮＡ濃度依存的にピーク数が増加することが観察された。ここで、本実施例では、平均外径が光検出領域の直径の１００％である観測用粒子と、平均外径が光検出領域の直径の２５％である観測用粒子とを用いている。よってこの結果から、平均外径が光検出領域の直径の１００％以上である観測用粒子と、平均外径が光検出領域の直径の２５％以下である観測用粒子とを用いた場合に、本発明に係る検出方法により、標的粒子の検出が可能であることが明らかである。さらに、標的ＤＮＡ濃度が５ｆＭにおいて、ピーク数の平均値±１ＳＤの範囲が、０Ｍの平均値±１ＳＤの範囲と重複していないことから、本実施例における検出方法は、検出限界５ｆＭで標的粒子の濃度を検出できることが明らかになった。

［実施例２］
　配列番号１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを標的粒子（標的ＤＮＡ）とし、配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（プローブＤＮＡ３）を表面に固定化したＤＮＡ修飾ポリスチレンビーズを観測用粒子とし、アビジン化磁性ビーズを分離用粒子とし、配３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドにビオチンを結合させたビオチン化Ｄ列番号ＮＡプローブ２をアビジン化磁性ビーズ表面に結合させる「標的粒子と結合する物質」として用い、本発明に係る検出方法を行った。

＜ＤＮＡ修飾ポリスチレンビーズの調製＞
　１００μＭのプローブＤＮＡ３溶液とそれに対応する相補鎖ＤＮＡの１００μＭの溶液を等量で混合し、サーマルサイクラーを用いて、得られた混合液の温度を９８℃まで上げた後、０．１℃／分で２０℃まで下げることによってＤＮＡをアニーリングした。次いで、アニーリングにより形成された２本鎖ＤＮＡを含む溶液を、超純水を用いて１／１０に希釈し、５０ｍｇ／ｍＬのエポキシ基修飾ポリスチレンビーズ（製品名：ｍｉｃｒｏｍｅｒ（登録商標）ｅｐｏｘｙ、ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製、直径：４μｍ）と等量で混合し、５０℃で２４時間振蕩することによって、プローブＤＮＡ３の突出したグアニンのアミノ基とポリスチレンビーズのエポキシ基を反応させ、結合させることによって２本鎖ＤＮＡ修飾ポリスチレンビーズを得た。この反応溶液を、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理し、２本鎖ＤＮＡ修飾ポリスチレンビーズを沈殿させ、上清を除いて回収した。回収したビーズは、２．５ＭのＫＣｌ中で１５０００ｒｐｍ、５分間遠心分離処理後、上清を除くことによって洗浄した。続いて、同様の洗浄操作を０．１５ＭのＮａＯＨ中、続いて超純水中で行うことにより、ポリスチレンビーズ表面の２本鎖ＤＮＡを一本鎖化した。最終的に、遠心分離処理によって沈殿として回収したビーズを、ＴＥＳバッファーに懸濁することにより、１．２ｐＭ相当の１本鎖のプローブＤＮＡ３が表面に修飾されたＤＮＡ修飾ポリスチレンビーズを得た。

＜工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）＞
　作製した１．２ｐＭのＤＮＡ修飾ポリスチレンビーズ、実施例１で用いた１００ｎＭのビオチン化ＤＮＡプローブ２、ＴＥＳバッファー、及び各種濃度（０，０．１，１，１０ｐＭ）の実施例１で用いた標的ＤＮＡを１：１：７：１で混合したものを、サーマルサイクラーを用いて９８℃まで温度を上げた後、０．１℃／分で２０℃まで下げることによってＤＮＡをアニーリングした。次いで、アニーリングにより形成された２本鎖ＤＮＡを含む溶液を、アビジン化磁性ビーズ（製品名：Ｂｉｏ－Ｅｓｔａｐｏｒ　Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ－ＢＥ－Ｍ０８／０，３，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）と等量で混合し、室温で１時間振蕩することにより、アビジン－ビオチン結合を介してＤＮＡ修飾ポリスチレンビーズとアビジン化磁性ビーズを架橋させた。この溶液を磁石に近づけることによって沈殿を生じさせ、上清を捨てた後、もとの容量と同じになるようにＴＥＳバッファーを加え、沈殿を懸濁させた。その後、この溶液を９５℃まで加熱し、磁石に近づけることによって沈殿を生じさせ、上清を回収することにより、アビジン化磁性ビーズから分離したＤＮＡ修飾ポリスチレンビーズを含む溶液を得た。この溶液と６ｎＭのＡＴＴＯ（登録商標）４８８を含む２０容量％ポリエチレングリコール溶液を等量混合したものを、測定試料溶液とした。

＜工程（ｅ）＞
　調製した測定試料溶液中のＤＮＡ修飾ポリスチレンビーズを、反転型走査分子計数法により検出した。具体的には、測定時間を、プレート連続測定モードで１００秒間とした以外は、実施例１と同様にして時系列データを得た。測定によって得られた時系列データをＳａｖｉｎｚｋｙ－Ｇｏｌａｙのアルゴリズムでスムージングした後、微分によりピークの検出を行った。ピークとみなされた領域のうち、オッズ比が５．６以上のピーク数を算出した。

　各測定試料溶液について、測定の結果得られたピーク数を、図８に示す。各測定試料溶液の算出されたピーク数の平均値±１ＳＤは、標的ＤＮＡ濃度が０Ｍで３７±８．３、１０ｆＭで４８±１２．０、１００ｆＭで７６±１４．２、１ｐＭで７９±２３．７であった。標的ＤＮＡ濃度依存的にピーク数が増加しており、１００ｐＭではピーク数は飽和していた。また、１００ｆＭ、１ｐＭにおいて、ピーク数の平均値±１ＳＤの範囲が０Ｍの平均値±１ＳＤと重複していないことから、本実施例における検出方法は、検出限界１００ｆＭで標的粒子の濃度を検出できることが明らかになった。

　本発明に係る検出方法により、被検試料中の非常に低濃度にしか存在していない標的粒子を、反転型走査分子計数法により検出することができるため、本発明に係る検出方法は、臨床検体等の解析対象物質の濃度が微量である試料の解析・検査等の分野で利用が可能である。

１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１４ａ…ダイクロイックミラー又は偏光ビームスプリッタ
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ

Claims

　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、非発光性の粒子を検出する方法であって、
（ａ）非発光性の観測用粒子、及び固相担体を、検出対象である標的粒子を介して溶液中又は溶液の界面にて結合させ、複合体を形成させる工程；
（ｂ）前記工程（ａ）の後、遊離状態の観測用粒子を前記溶液から除去する工程；
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記観測用粒子を前記複合体から分離させる工程；
（ｄ）前記工程（ｃ）の後、分離された観測用粒子を分散させた測定試料溶液を調製する工程；及び
（ｅ）前記測定試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域から実質的に一定の背景光を含む光を検出して時系列の光強度データを生成し、前記時系列光強度データにおいて前記観測用粒子が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる光強度の低下を、前記観測用粒子の各々の存在を表す信号として個別に検出することにより、前記測定試料溶液中の観測用粒子を検出する工程；
を有する、標的粒子の検出方法。
　前記観測用粒子の平均外径が、前記光学系の光検出領域の直径の３５％以上である、請求項１に記載の標的粒子の検出方法。
　前記標的粒子が核酸分子又は核酸類似物質であり、
　前記工程（ｃ）における前記観測用粒子の分離を、前記複合体中の標的粒子を変性させることにより行う、請求項１又は２に記載の標的粒子の検出方法。
　前記工程（ｄ）が、
前記固相担体を前記観測用粒子より分離除去し、当該観測用粒子を分散させた前記測定試料溶液を調製することである、請求項１～３のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
　前記固相担体が、平均外径が前記光学系の光検出領域の直径の３５％未満である粒子であり、
　前記工程（ｃ）及び（ｄ）に代えて、
（ｃ’）前記工程（ｂ）の後、前記観測用粒子、前記標的粒子、及び前記固相担体からなる複合体を分散させた測定試料溶液を調製する工程、
を行う、請求項１又は２に記載の標的粒子の検出方法。
　前記背景光が、前記測定試料溶液内に分散された物質による蛍光、りん光、化学発光、生物発光又は散乱光である、請求項１～５のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
　前記背景光が照明光である、請求項１～５のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
　前記光検出領域の位置の移動を、その移動速度が前記単一粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて行う、請求項１～７のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
　前記光検出領域の位置の移動を、前記光学系の光路を変更することにより行う、請求項１～８のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
　前記観測用粒子の存在を表す信号の検出が、
　前記背景光の強度から計って所定の閾値より低い光強度を有する信号が検出されたときに１つの観測用粒子が前記光検出領域に入ったと判定することである、
請求項１～９のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
　前記観測用粒子の存在を表す信号の検出が、
　　前記時系列光強度データを平滑化し、
　　前記平滑化した時系列光強度データにおいて前記背景光の強度から計って所定閾値を下回る強度を有する下に凸の釣鐘型のパルス状信号を検出する
ことである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
　前記工程（ｅ）において、更に、
　前記個別に検出された観測用粒子の存在を表す信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記観測用粒子の数を計数する、
請求項１～１１のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
　前記工程（ｅ）において、更に、
　前記検出された観測用粒子の数に基づいて、前記測定試料溶液中の観測用粒子の数密度又は濃度を決定する、
請求項１～１２のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
　前記工程（ｅ）における前記光検出領域の位置の移動、前記光検出領域からの光の検出を、及び前記観測用粒子の存在を表す信号の検出を、前記観測用粒子の存在を表す信号の数が予め定められた数に達するまで繰り返し、
　当該予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて、前記測定試料溶液中の前記観測用粒子の濃度を決定する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。