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WO2014060270A2 - Optikanordnung und lichtmikroskop - Google Patents

Optikanordnung und lichtmikroskop Download PDF

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WO2014060270A2
WO2014060270A2 PCT/EP2013/071076 EP2013071076W WO2014060270A2 WO 2014060270 A2 WO2014060270 A2 WO 2014060270A2 EP 2013071076 W EP2013071076 W EP 2013071076W WO 2014060270 A2 WO2014060270 A2 WO 2014060270A2
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WO
WIPO (PCT)
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light
optical
paths
arrangement according
pupil plane
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2013/071076
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English (en)
French (fr)
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WO2014060270A3 (de
Inventor
Daniel Schwedt
Tiemo Anhut
Ralf Netz
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Carl Zeiss Microscopy GmbH
Original Assignee
Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Carl Zeiss Microscopy GmbH filed Critical Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority to US14/436,641 priority Critical patent/US10663749B2/en
Publication of WO2014060270A2 publication Critical patent/WO2014060270A2/de
Publication of WO2014060270A3 publication Critical patent/WO2014060270A3/de
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Ceased legal-status Critical Current

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Definitions

  • the present invention relates in a first aspect to an optical arrangement for positioning in a beam path of a light microscope according to the preamble of claim 1.
  • the invention relates to a light microscope according to the preamble of claim 20.
  • a generic optical arrangement has means for providing structured illumination light in a sample plane of the light microscope, wherein structured illumination light can be generated in different orientations.
  • a generic light microscope in whose beam path such Optikan- order can be positioned, has at least one light source for emitting a light beam.
  • the light beam can be directed in the direction of a sample plane in which a sample to be examined can be positioned. Due to the optical arrangement of this light beam can be routed as structured illumination on the sample.
  • Structured Illumination Microscopy is an established method for examining a sample with high resolution. Under structured illumination light can be understood in principle any light with a spatially variable intensity distribution over the beam cross-section. In particular, light with a periodic intensity distribution over the cross section can be used.
  • Conventional means for providing structured illumination light comprise at least one grating which is positioned in an intermediate image plane, that is to say in a plane conjugate to the sample plane. This will cause the grid to enter the sample level shown.
  • the structured illumination is thus formed according to the grid structure by a line pattern with illuminated and non-illuminated lines.
  • the structured illumination should be able to be generated in different orientations, ie different angles of rotation about an optical axis.
  • several phases of the structured illumination should be adjustable for each orientation.
  • the structured illumination can be moved in the sample plane in a direction transverse to the lines of the line pattern. For the different orientations and phases, a sample image is taken in each case, from which finally a sample image with increased resolution is calculated.
  • an optical beam splitting to produce the interfering beams can be implemented, which is complicated in terms of apparatus but can be problematic in terms of stability.
  • structured illumination can be generated by a pattern of light points in the pillar plane.
  • a dot pattern leads to a stripe pattern in the sample plane via the Fourier transformation. This is done with a Order achieved, which is described in DE 10 2007 047 466 A1. Between different light spot patterns can be switched by selectively blocking light.
  • known optical arrangements have a high dead time when switching between different orientations of the structured illumination light and / or have high mechanical requirements, for example with regard to a high positioning accuracy of movable optical components.
  • undesirable intensity losses of the illumination light can occur.
  • An optical arrangement of the abovementioned type is inventively characterized in that adjustable deflection means are provided for selectable deflecting an incident light beam to one of a plurality of beam paths that in the beam paths beam splitting means are provided for splitting the light beam. bundle of the respective beam path in spatially separated partial light bundles, that for each of the partial light beam beam guiding means are present, which lead the associated partial light bundle to a pupil plane, and that the beam guiding means are arranged so that the partial light bundles belonging to the same beam path, in the pupil plane Form light pattern and that the Lichtfieckmuster different beam paths in the pupil plane are different from each other.
  • an optical arrangement according to the invention is present and can be arranged so that the light beam of the light source can be conducted to the adjustable deflection means. This light bundle can also be performed on other components of the optical assembly on the deflection. From the optics arrangement, outgoing light is passed on to a sample plane where it hits a sample as structured illumination,
  • a change of the selected, ie illuminated, beam path takes place.
  • a movement of the adjustable deflection is required.
  • no further components need to be mechanically adjusted.
  • a movement of the deflection can be done much faster than, for example, the extension and retraction of grids in the beam path, as is the case with many conventional optical arrangements.
  • Structured illumination light of different orientations can be generated successively in the sample plane by the successive deflection means of the invention sequentially selecting the different ray paths.
  • the invention requires as a means for providing structured illumination light, no gratings or other structured objects positioned in a plane conjugate to the sample plane become. Rather, different light spot patterns can be generated in a pupil plane.
  • the pupil plane should be such a plane in which the light intensity distribution is related by a Fourier transformation to the light intensity distribution in the sample plane.
  • Fasteners are preferably provided for positioning the optical arrangement in a beam path of a light microscope so that the light distribution in the pupil plane is determined by a Fourier transformation of the light distribution is determined in the sample level.
  • a light spot pattern in the pupil plane therefore results in a line pattern or other periodic pattern in the sample plane.
  • the same patterns can be generated in the sample plane, such as with a grid in an intermediate image plane.
  • a light spot pattern can include a central illuminated area corresponding to a zeroth diffraction order from a grid.
  • the light spot pattern can have two outer illuminated areas the +1. and the -1. Diffraction order of a grid correspond.
  • the means for providing structured illumination light in the optical arrangement according to the invention therefore comprise the beam splitting means and the beam guiding means, by which a light beam from one of the beam paths is divided into a plurality of partial light beams and forms a light spot pattern in the pupil plane.
  • beam dividing means are present in each of the selectable beam paths. This makes it possible to select a large number of spatially separated partial light bundles, without an equal number of beam paths, which can be selected via the deflection means, being present. As a result, the adjustable deflecting means can select one of the light spot patterns in a particularly short time.
  • the division into partial light bundles also takes place separately from the selection via the deflection means. As a result, the division into partial light bundles can advantageously take place without movements or switching operations, which results in better stability.
  • a spot pattern may be any pattern having spaced-apart illuminated areas. These areas are preferably circular, but may also have any other shape.
  • the beam splitting center! may include any means by which a light beam incident to be split simultaneously into two or more spatially separated partial light bundles.
  • the partial light bundles can then by Strahl Operationssmitte! be directed to the pupil plane.
  • the cross section of the partial light bundles forms a light spot pattern there.
  • a bundle of light is the radiated light or the light beam of a light source. This light should be optically coherent.
  • each light spot pattern from the partial light bundles of a single light bundle, it can be achieved that the partial light bundles of the same light spot pattern are optically coherent with one another. As a result, the partial light bundles in the sample plane can interfere with one another and lead to the desired structured illumination light.
  • a merging of the previously separate beam paths is achieved in that the partial light bundles of all beam paths are guided side by side in the pupil plane.
  • This combination of the beam paths advantageously leads to no or only low light losses.
  • the combination does not require any moving components, is comparatively insensitive to external influences and can be carried out inexpensively.
  • a changeover time between the different orientations of the structured illumination can be determined solely by a switching time of the adjustable deflection means.
  • These preferably have a deflection mirror, which is rotatable and / or displaceable.
  • the selection of a specific beam path in this embodiment requires only a slight rotation or displacement of the deflection mirror. Compared to extending and retracting an entire optical component, such as a grating, the required movement is small and can be fast.
  • a deflection mirror may have smaller dimensions and a lower weight than a grating for producing structured illumination light. As a result, an adjustment of the deflection mirror can already be within a few milliseconds.
  • a rotatable and / or displaceable prism can also be used.
  • a secure beam guidance on the different beam paths can be achieved if there is a first group of optical fibers for guiding light bundles from the deflection means to the beam division means.
  • This first group preferably has an optical fiber for the different beam paths.
  • the beam guidance from the deflection means to the beam splitting means takes place without mirrors or prisms, whereby the stability increases and demands on the positioning accuracy of the existing components are to be fulfilled more easily.
  • the beam splitting means can in principle be formed by a plurality of partially transparent mirrors. However, it can be achieved a particularly compact design with high stability against external influences when the beam splitting means have a waveguide chip.
  • This has a substrate or carrier substrate and Lichtleitpfade for guiding the light beams and partial light fringes! on.
  • the optical paths are formed by a transparent material in or on the substrate. The production of the optical guide paths can be carried out, for example, lithographically or by ion exchange.
  • the waveguide chip may have a solid structure, that is, be free of mutually movable components.
  • the stability of the beam guidance is thereby higher.
  • a beam splitting can be achieved by dividing the different optical paths into two or more optical paths, for example in the form of a Y.
  • the optical paths of the waveguide chip may also be formed by optical fibers.
  • a division of the light guide paths can be achieved in particular by thin film filters (TFF). This may be referred to as a fiber multiplexer.
  • the waveguide chip has a plurality of inputs for coupling light bundles, that each of the beam paths that can be selected via the deflection means leads to another of the inputs, that in the waveguide chip at the inputs in each case a light guide path is formed in the waveguide chip at the Lichtleitpfaden a first division point is formed in each case, which divides the associated Lichtleitpfad in two or more Lichtleitpfade that the Waveguide chip has a plurality of outputs for coupling out partial light bundles and that each of the Lichtleitpfade leads to one of the outputs, so that over such outputs, which are illuminated via the same input, coherently coupled partial light beams can be output, each of the optical fiber of the first group can with one of the inputs
  • the translucent material forming the optical guide paths and the surrounding material are selected so that light can propagate along the optical guide paths alone. Due to the positionally stable formation of the optical waveguide paths, the waveguide chip is insensitive to impacts or other external influences.
  • a second division point is formed in the waveguide chip at least for some of the optical paths, at which the corresponding optical paths are divided into two Lichtleitpfade.
  • a light guide path is split at two division points one behind the other, resulting in three Lichtleitpfade.
  • a light beam is thus split into three partial light bundles.
  • a light bundle at one of the division points can be divided into the corresponding paths of light in any ratio.
  • a light guide path is split equally over two light paths. These may be due to their position in the pupil plane of the +1. and the -1. Diffraction order of a grid correspond.
  • a Lichtleitpfad be divided in the beam splitter in three Lichtieitpfade, the light output is lower in one of these paths than in the other two ,
  • a light distribution is selected so that two outputs of the same light output are provided for each of the inputs and an output of lower light power at which a light output is less than that at the two outputs of the same light output ,
  • a light spot pattern in the pupil plane can also be generated by only two light paths or by more than three light guide paths.
  • a large number of optical paths increase the demand on the pole positioning accuracy with respect to the partial light bundles of a light spot pattern.
  • each light spot pattern is formed by exactly three Lichtleitpfade This allows a high image quality can be achieved with a relatively small apparatus design.
  • the first division points are designed so that a light beam is divided into different proportions on the associated two Lichtleitpfade. These proportions may be in a ratio of 90:10 or 95: 5, for example. Those Lichtieitpfade on which the smaller portions of the light beam are passed, can lead directly to the outputs of lower light output. The Lichtieitpfade, on which the larger portions of the light beam are passed, however, can lead to the second division points. These are preferably each designed so that light is divided in equal proportions on the associated two Lichtieitpfade. In turn, these light paths can lead directly to the outputs of the same light output, that is, without encountering further dividing points.
  • the two light paths that of the +1. and the -1. Diffraction order of a grid correspond, lead the same light output.
  • this can advantageously be achieved independently of the exact division ratio at the first division points.
  • a 50:50 split can be used at the second split points, which can be accomplished technically easier and with a higher precision than unequal split shares.
  • the partial light bundles, which leaves the beam splitting means on the optical paths of the selected beam path, should be directed to the pupil plane.
  • the beam guiding means for guiding partial light beams from the beam splitting means to the pupil plane comprise a second group of optical fibers.
  • This second group preferably has an optical fiber for each of the partial light bundles.
  • an optical fiber of the second group is connected to each output of the waveguide chip.
  • a particularly high positional stability can be achieved by optical fibers.
  • optical fibers allow a relatively simple variation of the positions of the exiting light in the pupil plane.
  • This can be a common Fiber holder for the optical fibers of the Lichtleitpfade belonging to the same beam path may be present.
  • a fiber holder may be present for all optical fibers of the second group.
  • an orientation of the structured illumination can be varied.
  • fiber mounts belonging to different beam paths are rotatable relative to each other. In this case, a measurement break time can be reduced by moving one fiber holder while producing structured illumination over the optical fibers of another fiber holder.
  • the ends of the optical fibers are arranged in the pupil plane so as to define the respective desired light spot pattern.
  • one or more mirrors may also be arranged in the pupil plane, to which the light from the optical fibers of the second group strikes.
  • each of the optical fibers of the second group can also be replaced by one or more mirrors, the light pattern in the pupil plane being generated by the mirror arrangement.
  • the beam guiding means are formed by Lichtleitpfade within the waveguide chip.
  • the outputs of the waveguide chip may be arranged in the pupil plane corresponding to the desired light spot patterns.
  • a light spot pattern is therefore formed in this embodiment by a partial light bundle in the central region of the pupil plane and two partial light bundles in outer regions of the pupil plane. These three partial light bundles correspond by their position in the pupil plane, preferably the -1., 0. and +1. Diffraction order of a grating arranged in a plane which is related to the pupil plane by a Fourier transformation.
  • the partial light bundles of different light spot patterns, which are arranged in the central area can be positioned next to each other there be.
  • the ends of the corresponding optical fibers of the second group can be arranged adjacent to one another, preferably directly next to each other, in the central region of the pupil plane.
  • the two beam guiding means which are connected to one of the outputs of the same power and are illuminated via the same beam path, are preferably arranged so that partial beam bundles emerging from these beam guiding centers oppose each other in the pupil plane with respect to the central region. Accordingly, the three partial light bundles which form a light spot pattern lie approximately on a straight line. This takes into account the fact that the -1. and the +1, diffraction order of a grating are symmetrical to each other with respect to the 0th diffraction order. Slight deviations from this symmetry, which can result from the arrangement of different optical fibers next to one another in the central area, have only a small influence on the pattern of the structured illumination in the sample plane.
  • a reference image can be taken in each case with the different light spot patterns.
  • the intensity distributions in these reference images can be used to evaluate later recorded sample images.
  • the image quality depends on the polarization direction of the light generated. If the structured illumination light in the sample plane is formed by a line pattern, then the polarization direction of the light should be parallel to the line direction of the line pattern. This can be achieved if the optical fibers of the first and the second group and the optical waveguides of the waveguide chip are polarization-preserving.
  • a polarization direction of partial light bundles emerging from the optical fibers of the second group is transverse, in particular perpendicular, to a connecting straight line which connects two partial light bundles of the same beam path in the pupil plane.
  • a phase shift of the structured illumination should also be possible. This can be done by a Change of the phase relationship between the partial light bundles, which together form one of the light spot pattern can be achieved.
  • thermo-phase shifters are provided for phase shifting of a structured illumination that can be generated by one of the light spot patterns.
  • a thermo-phase shifter shows middle! for influencing the temperature of the optical fibers of the second group and / or the optical waveguide paths of the waveguide chip, wherein the optical fibers of the second group and / or the optical waveguides of the waveguide chip have temperature-dependent refractive indices.
  • the phase relationship between the partial light beams of the same beam path can also be controlled by electrical influencing.
  • the optical fibers of the second group and / or the optical waveguides of the waveguide chip have manipulation areas in which a refractive index is voltage-dependent.
  • electrooptical modulators are present adjacent to the manipulation regions, which predefine the refractive index in the adjacent region by an adjustable voltage, and in that electronic control means are provided and adapted to vary the refractive indices in the manipulation regions via the electrooptical modulators for phase shifting a structured illumination, is generated by one of the light spot patterns.
  • the manipulation areas can be formed for example by a suitable material doping. Control of the phase relationship via electro-optical modulators can also be done very quickly.
  • the electronic control means may be adapted to perform a phase shift for the partial light beams from one of the beam paths, while another of the beam paths is selected via the deflection means.
  • the measurement interruption time between the recordings of two sample images can hereby be reduced, in particular, if it is possible to switch the deflection means in a shorter time than a phase shift.
  • at least one phase plate can also be provided for phase shifting the structured illumination. This is expediently arranged between the beam-dividing center and the sample plane and can, for example, comprise a translucent wedge, which is displaced or tilted for a phase shift. Alternatively, the phase plate may have a translucent plate with plane-parallel surfaces which is tilted for phase shifting.
  • the sample images which are taken using different light spot pattern, are to be charged to a higher resolution image.
  • different light spot patterns have the same light output.
  • these light outputs may be different from one another, in particular due to input and output losses on the optical fibers. Therefore, it is desirable to be able to variably adjust the light output of various dot patterns.
  • an acousto-optical device is present in front of the adjustable deflection means for this purpose.
  • Electronic control means are provided and adapted to vary with the acousto-optic device a power of a light beam depending on which of the beam paths the light beam is directed.
  • the electronic control means may be arranged to control the acousto-optic device such that in the pupil plane the light spot patterns of different beam paths have the same light output.
  • the results of reference measurements can be used, in which the brightness or light power in the sample plane is measured for the different dot patterns, without influencing the light output variably via the acousto-optical device.
  • an image field rotator can additionally be used.
  • an image field rotator is provided in the beam path behind the beam guidance means.
  • an adjusting device for rotating the image field rotator is present.
  • a zoom optics is preferably present for a variable adaptation between a light conductance of a lens and a light conductance of the light spot pattern in the Puptllenebene.
  • the luminance value of the light spot patterns in the pupil plane is determined by the distance between the outer partial light bundles and by the numerical aperture of the partial light bundles, that is to say by their extent and the opening angle with which the partial light bundles expand from the pupil plane.
  • the zoom optics ensure that the light spot patterns are guided completely over the lens into a sample plane. This is advantageously ensured by the zoom optics for lenses with different numerical aperture
  • the objective can expediently be part of the light microscope according to the invention. It is used to direct light emitted by the optics assembly.
  • the described pupil plane of the optical arrangement is optically conjugate to a pupil plane of the objective,
  • Fig. 1 is a schematic representation of an embodiment of a light microscope according to the invention with an optical arrangement according to the invention
  • Fig. 2 is an enlarged view of components of the optical arrangement of FIG. 1
  • Fig. 3 is a schematic representation of light spot patterns, which are generated in a pupil plane by an optical arrangement according to the invention.
  • FIG. 1 schematically shows an exemplary embodiment of a light microscope 110 according to the invention and an optical arrangement 100 according to the invention, which is positioned in a beam path of the light microscope 110.
  • the optical arrangement 100 generates structured illumination light 18 in a sample plane 90 of the light microscope 110.
  • unstructured light 15 is first generated by a light source 10 of the light microscope 110.
  • Such a light beam 15 is directed to the optical assembly 100.
  • This has means for providing structured illumination light 16 from the light bundle! 15 on.
  • these means do not require a grating, such is usually arranged in an intermediate image plane, so that in the sample plane an image of the grating is produced as structured illumination.
  • a light spot pattern in a pupil plane is generated by the optical arrangement 100 according to the invention.
  • a pupil plane is thus to be understood as a plane in which the light distribution via a Fourier transformation is related to the light distribution in the sample plane.
  • a structured illumination in the sample plane 90 can be achieved which resembles or resembles the structured illumination by a grid.
  • the means for providing structured illumination light in the optical arrangement 100 comprise in particular adjustable deflection means 20, beam splitting means 50 and beam guiding means 70.
  • the light source 10 comprises a plurality of laser modules, via which light 15 of the wavelengths 488 nm, 561 nm and 640 nm can be emitted.
  • the light is transmitted from the laser modules via optical fibers 11 to 13 led to a mirror staircase 14, which unites by partially transmissive mirror the light 15 different laser modules on a common beam path.
  • this particular light of a desired wavelength can be selected and passed on to the adjustable deflection means 20.
  • the deflection means 20 comprise a rotatable Umienkspiegel. This can be quickly rotated via a galvanometer scanner or another motor.
  • the deflection mirror 20 can also comprise one or more juxtaposed mirror surfaces, which can each be adjusted in their orientation by a microelectromechanical system (MEMS).
  • MEMS microelectromechanical system
  • the light beam 15 can be selectively directed to one of a plurality of spatially separated beam paths 21 to 23. Structured illumination light is generated in different orientations via the different beam paths 21 to 23, as described below.
  • the beam paths 21 to 23 are guided via a first group of optical fibers 30 to the beam splitting means 50.
  • FIG. 2 shows the optical fibers 30, the beam splitting means 50 and the subsequent beam guiding means 70 enlarged.
  • the beam splitting means 50 are here formed with a waveguide chip 50. This has a plurality of inputs 51 to 53 for coupling in light bundles 15.
  • the first group of optical fibers 30 comprises a plurality of optical fibers 31 to 33, each of which guides one of the beam paths 21 to 23 to one of the inputs 51 to 53.
  • the optical fibers 31 to 33 have end caps, which are connected to connection means at the inputs 51 to 53 so that no air gap arises between them.
  • the waveguide chip 50 has a substrate on which light-conducting paths 41 to 49 are formed with a light-transmitting material. In principle, these can also be formed by optical fibers which are held on one or more chips.
  • the waveguide chip 50 can thereby also be referred to as a fiber multiplexer.
  • Each of the inputs 51 to 53 is connected to a Lichtleitpfad, which leads in each case to a first division point 54 to 56.
  • the associated Lichtleitpfad is divided into two spatially separate Lichtleitpfade 41 and 43, 44 and 46, 47 and 49.
  • thin film filters TMF
  • a light beam is thus split at one of the first dividing points 54 to 58 into two partial light bundles.
  • light is divided into unequal proportions on the two light guide paths 41 »43, 44, 48, 47, 49.
  • the Lichtleitpfade 43, 46, 49, to which the respective smaller proportion of light passes leads directly to each output 63, 66, 69 of the waveguide chip 50.
  • On these Lichtleitpfade 43, 46, 49 is preferably less than 20% of the light on the corresponding first division point 54 to 56, passed, for example, 5% or 10%, the outputs 63, 66, 69 may also be referred to as outputs of lower light output.
  • a light beam is thus divided into three partial light beams, which are capable of interfering with each other.
  • the beam guiding means 70 comprise a second group of optical fibers 71 to 79 which are respectively connected to one of the outputs 61 to 69.
  • the partial light bundles are guided via the optical fibers 71 to 79 to a pupil plane 80, which is shown in FIG. 1 and enlarged in FIG. 3.
  • FIG. 3 schematically shows light spots, that is to say cross sections of the partial light bundles 81 to 89, in the pupil plane 80.
  • the arrangement of the partial light bundles 81 to 89 is predetermined by the arrangement of the optical fibers 71 to 79.
  • the optical fibers 71 to 79 may terminate in the pupil plane 80 so that their arrangement coincides with the arrangement of the partial light beams 81 to 89 shown in FIG. 3.
  • the partial light bundles 81 to 83 which belong to the beam path 21, form a light spot pattern in the pupil plane 80 of three illuminated, spaced-apart areas.
  • the three partial light beams 84 to 86 and the partial light beams 87 to 89 generate a second and a third light spot pattern.
  • the different light spot patterns only one is generated at any one time via the umtenkmiltel. Since the different light spot patterns do not overlap or at least do not completely overlap, the structured illumination produced in each case in the sample plane differs.
  • Each light spot pattern comprises a light spot in a central region of the pillar plane 80, that is to say in the area around an optical axis, which runs centrally through a field of view.
  • These light spots are generated by the partial light bundles 83, 86, 89, which were guided by the lower-power outputs 63, 66, 69 from the waveguide chip 50 to the pupil plane 80.
  • the partial light bundles 83, 86, 89 in the central region correspond spatially to the 0th order of diffraction of a grating which is located in an intermediate image plane.
  • the two outer partial beams or beams 81, 82, 84, 85, 87, 88 spatially correspond to the -1, and the +1. Diffraction order of a grating in an intermediate image plane. Therefore, two partial light beams of the same beam path, for example, the partial light beams 81 and 82, are opposed to each other with respect to the central area. In particular, they may be in respect to the optical axis opposite to each other or in relation to the associated Teiilichtbündel 83 "is arranged in the central region.
  • the partial light bundles 83, 86, 89 which belong to different beam paths and are respectively guided into the central area, should lie one above the other.
  • two or more of the partial light bundles 83, 86, 89 can first be brought together into a common optical fiber and then guided into the central region (not shown).
  • two or more of the partial light bundles 83, 86, 89 are combined in the waveguide chip.
  • the associated light guide paths 43, 46, 49 may be three-dimensional, that is, they do not lie in one plane.
  • the outputs 81 to 89 on the waveguide chip 50 are offset from each other in a direction which points from the inputs 51 to 53 to the outputs 61 to 69. Then the Uchtleitpfade 43, 46, 49 behind the outputs of remaining Lichtleitpfade 41, 42, 44, 45, 47, 48 are brought together without it comes to a crossing of different Lichtleitpfade.
  • the different light spot patterns may differ by rotational alignment about the optical axis.
  • the partial light beams 81 to 83 can be converted by a rotation of 120 ° about the optical axis into the partial light beams 84 to 86. Since the light spot patterns differ only in their orientation, the structured illuminations in the sample plane differ only in their orientation.
  • phase shifting of the structured illumination the positions and arrangements of the light spot patterns remain unchanged. Rather, the phase relationship between the partial light beams of the same light spot pattern is varied from each other. This influences the position of the regions in the sample plane in which the three partial light bundles of a light spot pattern constructively interfere with one another. Consequently, the phase of the structured illumination is changed.
  • a variation of the refractive index in a material can be carried out, through which the respective partial light bundle moves.
  • means for changing the refractive indices of the optical fibers 71 to 79 and / or the optical fiber paths 41 to 49 may be provided in the waveguide chip 50.
  • these means may comprise an electro-optic modulator for changing a refractive index over an applied voltage.
  • thermal phase shifters can be used which influence the refractive index via a temperature change.
  • the quality of a sample image also depends on the polarization of the structured illumination light.
  • the optical fibers 31 to 39 and 71 to 79 and the light guide paths 41 to 49 are polarization-preserving.
  • the optical fibers are positioned in their rotational orientation so that the polarization direction of two partial light bundles of the same beam path is perpendicular to a connecting line between these Teiüichtbündeln in the pupil plane 80. Accordingly, a polarization direction is perpendicular to a connecting straight line for the partial light bundle 81, which connects the partial light bundle 81 with the partial light bundle 82 and / or with the partial light bundle 83 in the pupil plane 80.
  • FIG. 1 schematically shows that the partial light bundles, which are generated by splitting an unstructured light bundle 15, interfere with one another in an intermediate image plane and thus produce structured illumination light 16.
  • This is coupled with optical imaging means 91, 93 via an optical interface of the Lichtmik- roskops 110 in this and meets there on a color splitter 94.
  • the color splitter 94 has a cut-off wavelength between transmission and reflection. The cut-off wavelength is chosen such that structured illumination light 16 coming from the optical arrangement 100 is directed in the direction of a lens 95 and on to the sample plane 90.
  • the numerical aperture of the objective 95 determines whether the structured illumination light 18 can be guided completely or only partially into the sample plane 90.
  • the optical imaging means 91 preferably comprise a zoom lens.
  • a sample 92 which is located in the sample plane 90 emits detection light 17.
  • This may in particular be fluorescent or phosphorescent light.
  • the detection light 17 passes through the lens 95 and the color splitter 94 to a detector device 96, which is expediently a spatially resolving camera.
  • a detector device 96 which is expediently a spatially resolving camera.
  • the beam paths 21 to 23 that can be selected by the deflecting gib 20 are combined with only slight light losses in the pupil plane 80.
  • the funds required for this are relatively low cost and stable to external influences such as vibrations. Compared to conventional optical arrangements and light microscopes can Therefore, sample images of high quality can be recorded in a shorter time with the invention.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Optikanordnung zum Positionieren in einem Strahlengang eines Lichtmikroskops mit Mitteln zum Bereitstellen von strukturiertem Beleuchtungslicht in einer Probenebene des Lichtmikroskops, wobei strukturiertes Beleuchtungslicht in unterschiedlichen Orientierungen erzeugbar ist. Die Optikanordnung ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, dass verstellbare Umlenkmittel vorhanden sind zum auswählbaren Umlenken eines auftreffenden Lichtbündels auf einen von mehreren Strahlengängen, dass in den Strahlengängen Strahlteilungsmittel vorhanden sind zum Aufteilen des Lichtbündels des jeweiligen Strahlengangs in räumlich voneinander getrennte Teillichtbündel, dass für jedes der Teillichtbündel Strahlführungsmittel vorhanden sind, welche die Teillichtbündel zu einer Pupillenebene führen, und dass die Strahlführungsmittel so angeordnet sind, dass die Teillichtbündel, die zu demselben Strahlengang gehören, in der Pupillenebene ein Lichtfleckmuster bilden und dass die Lichtfleckmuster verschiedener Strahlengänge in der Pupillenebene voneinander verschieden sind. Zudem betrifft die Erfindung ein Lichtmikroskop mit einer erfindungsgemäßen Optikanordnung.

Description

Optikanordnung und Lichtmikroskop
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem ersten Gesichtspunkt eine Optikanordnung zum Positionieren in einem Strahlengang eines Lichtmikroskops nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1. In einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Lichtmikroskop nach dem Oberbegriff des Anspruchs 20.
Eine gattungsgemäße Optikanordnung weist Mittel zum Bereitstellen von strukturiertem Beleuchtungslicht in einer Probenebene des Lichtmikroskops auf, wobei strukturiertes Beleuchtungslicht in unterschiedlichen Orientierungen erzeugbar ist.
Ein gattungsgemäßes Lichtmikroskop, in dessen Strahlengang eine solche Optikan- Ordnung positionierbar ist, weist mindestens eine Lichtquelle zum Aussenden eines Lichtbündels auf. Das Lichtbündel kann in Richtung einer Probenebene geleitet werden, in welcher eine zu untersuchende Probe positionierbar ist. Durch die Optikanordnung kann dieses Lichtbündel als strukturierte Beleuchtung auf die Probe geleitet werden. Die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung (structured Illumination microscopy, SIM) ist ein etabliertes Verfahren zum Untersuchen einer Probe mit hoher Auflösung. Unter strukturiertem Beieuchtungslicht kann prinzipiell beliebiges Licht mit einer räumlich variablen Intensitätsverteilung über den Strahlquerschnitt verstanden werden. Insbesondere kann Licht mit einer periodischen Intensitätsverteilung über den Querschnitt eingesetzt werden.
Herkömmliche Mittel zum Bereitstellen von strukturiertem Beleuchtungslicht umfassen mindestens ein Gitter, das in einer Zwischenbildebene positioniert wird, also in einer zur Probenebene konjugierten Ebene. Dadurch wird das Gitter in die Proben- ebene abgebildet. Die strukturierte Beleuchtung wird folglich entsprechend der Gitterstruktur durch ein Linienmuster mit beleuchteten und nicht beleuchteten Linien gebildet.
In der Probenebene soll die strukturierte Beleuchtung in verschiedenen Orientierun- gen, das heißt unterschiedlichen Drehwinkeln um eine optische Achse, erzeugt werden können. Zudem sollen für jede Orientierung mehrere Phasen der strukturierten Beleuchtung einstellbar sein. Hierzu kann die strukturierte Beleuchtung in der Probenebene in einer Richtung quer zu den Linien des Linienmusters verschoben werden. Für die verschiedenen Orientierungen und Phasen wird jeweils ein Probenbild aufgenommen, woraus schließlich ein Probenbild mit erhöhter Auflösung berechnet wird.
Diese erhöhte Auflösung stellt einen erheblichen Vorteil gegenüber der herkömmlichen Aufnahme von Weitfeldbildern ohne strukturierte Beleuchtung dar. Der Zeitaufwand zur Bilderzeugung ist bei der Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung jedoch höher. Ein grundlegendes Ziel kann deshalb darin gesehen werden, die benötigte Zeit zur Aufnahme der verschiedenen Probenbilder gering zu halten. Der apparative Aufbau soll dabei einfach und kostengünstig sein.
Diese Anforderungen werden von herkömmlichen Optikanordnungen nicht erfüllt.
So ist es bekannt, zum Abbilden verschiedener Gitterorientierungen ein einziges Git- ter einzusetzen und dieses in verschiedene Orientierungen zu drehen. Auch kann hinter dem Gitter ein optischer Bildfelddreher eingesetzt werden, beispielsweise ein Abbe-König-Prisma, Dadurch kann eine Bildfelddrehung und somit eine Drehung der Gitterabbildung in der Probenebene erzeugt werden. Die Drehung eines Gitters oder eines Bildfelddrehers ist aber verhältnismäßig Zeitaufwand ig. Zudem können stören- de Reflexe von Beugungslicht auftreten.
Alternativ kann eine optische Strahlteilung zur Erzeugung der interferierenden Strahlen umgesetzt werden, was apparativ jedoch kompliziert ist und im Hinblick auf die Stabilität problematisch sein kann.
Zudem kann strukturierte Beleuchtung durch ein Muster aus Lichtpunkten in der Pu- pillenebene erzeugt werden. Ein solches Punktmuster führt über die Fourier- Transformation zu einem Streifenmuster in der Probenebene. Dies wird mit einer An- Ordnung erreicht, die in DE 10 2007 047 466 A1 beschrieben ist. Zwischen verschiedenen Lichtpunktmustern kann durch selektives Blockieren von Licht geschaltet werden.
Weiterhin ist es bekannt, superponierte unterschiedlich ausgerichtete Gitter auf ei- nem Substrat vorzusehen. Licht einer gewünschten Beugungsordnung wird zur Probe geleitet, während andere Beugungsordnungen ausgeblendet werden. Der Intensitätsverlust ist dadurch jedoch hoch.
Auch können mehrere unterschiedlich ausgerichtete Gitter nacheinander durch motorische Gitterwechsler ausgewählt werden. Der Zeitaufwand zum Wechseln zwischen den Gittern ist hier jedoch ebenfalls hoch.
Im Gesamten weisen daher bekannte Optikanordnungen eine hohe Totzeit beim Wechseln zwischen verschiedenen Orientierungen des strukturierten Beleuchtungslichts auf und/oder stellen hohe mechanische Anforderungen, beispielsweise hinsichtlich einer hohen Positioniergenauigkeit von beweglichen optischen Komponen- ten. Zudem kann es zu unterwünschten Intensitätsverluste des Beleuchtungslichts kommen.
Ais eine A u f g a b e der Erfindung kann angesehen werden, eine Optikanordnung und ein Lichtmikroskop bereitzustellen, mit denen ein schneller Wechsel zwischen strukturiertem Beleuchtungslicht verschiedener Orientierungen bei einem möglichst einfachen Aufbau ermöglicht wird.
Diese Aufgabe wird durch die Optikanordnung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und das Lichtmikroskop mit den Merkmalen des Anspruchs 20 gelöst.
Bevorzugte Ausführungsvarianten der erfindungsgemäßen Optikanordnung und des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche und werden in der folgenden Beschreibung erläutert, insbesondere im Zusammenhang mit den Figuren.
Eine Optikanordnung der oben genannten Art ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, dass verstellbare Umlenkmittel vorhanden sind zum auswählbaren Umlenken eines auftreffenden Lichtbündels auf einen von mehreren Strahlengängen, dass in den Strahlengängen Strahlteilungsmittel vorhanden sind zum Aufteilen des Licht- bündels des jeweiligen Strahlengangs in räumlich voneinander getrennte Teillichtbündel, dass für jedes der Teillichtbündel Strahlführungsmittel vorhanden sind, welche das zugehörige Teillichtbündel zu einer Pupillenebene führen, und dass die Strahlführungsmittel so angeordnet sind, dass die Teillichtbündel, die zu demselben Strahlengang gehören, in der Pupillenebene ein Lichtfieckmuster bilden und dass die Lichtfieckmuster unterschiedlicher Strahlengänge in der Pupillenebene voneinander verschieden sind.
Bei einem Lichtmikroskop der oben genannten Art ist gemäß der Erfindung eine erfindungsgemäße Optikanordnung vorhanden und so anordenbar, dass- LicWbündel der Lichtquelle zu den verstellbaren Umlenkmitteln leitbar sind. Hierbei können Lichtbündel auch über weitere Komponenten der Optikanordnung auf die Umlenkmittel geführt werden. Von der Optikanordnung wird ausgehendes Licht weiter zu einer Probenebene geführt, wo es als strukturierte Beleuchtung auf eine Probe trifft,
Als ein erster grundlegender Gedanke der Erfindung kann erachtet werden, dass zum Wechseln zwischen verschiedenen Orientierungen des strukturierten Beleuchtungslichts eine Änderung des ausgewählten, das heißt beleuchteten, Strahlengangs erfolgt. Hierzu ist allein eine Bewegung der verstellbaren Umlenkmittel erforderlich. Bevorzugt müssen keine weiteren Komponenten mechanisch verstellt werden. Eine Bewegung der Umlenkmittel kann wesentlich schneller erfolgen als beispielsweise das Ein- und Ausfahren von Gittern in den Strahlengang, wie es bei zahlreichen herkömmlichen Optikanordnungen der Fall ist. Strukturiertes Beleuchtungslicht verschiedener Orientierungen kann nacheinander in der Probenebene erzeugt werden, indem die verstellbaren Umlenkmittel der Erfindung nacheinander die unterschiedlichen Strahlengänge auswählen. Ein kostengünstiger Aufbau bei gleichzeitig sehr geringen Lichtverlusten wird durch die besondere Erzeugung des strukturierten Beleuchtungslichts sowie durch die Weise erreicht, in der die verschiedenen Strahlengänge, über die strukturiertes Beleuchtungslicht verschiedener Orientierungen bereitgestellt wird, zusammengeführt werden, Im Gegensatz zu herkömmlichen Optikanordnungen benötigt die Erfindung als Mittel zum Bereitstellen von strukturiertem Beleuchtungslicht keine Gitter oder anderen strukturierten Objekte, die in einer zur Probenebene konjugierten Ebene positioniert werden. Vielmehr können unterschiedliche Lichtfleckmuster in einer Pupillenebene erzeugt werden. Die Pupillenebene soll eine solche Ebene sein, in welcher die Lichtintensitätsverteilung durch eine Fouriertransformation mit der Lichtintensitätsverteilung in der Probenebene zusammenhängt Bevorzugt sind Befestigungsmittel vor- handen zum Positionieren der Optikanordnung in einem Strahlengang eines Lichtmikroskops, so dass die Lichtverteilung in der Pupillenebene durch eine Fouriertransformation der Lichtverteilung in der Probenebene bestimmt ist.
Ein Lichtfleckmuster in der Pupillenebene führt daher zu einem Linienmuster oder einem anderen periodischen Muster in der Probenebene. Dadurch können die glei- chen Muster in der Probenebene erzeugt werden, wie mit einem Gitter in einer Zwischenbildebene, Ein Lichtfleckmuster kann beispielsweise einen zentralen beleuchteten Bereich umfassen, welcher einer nullten Beugungsordnung von einem Gitter entspricht Zudem kann das Lichtfleckmuster zwei äußere beleuchtete Bereiche aufweisen, welche der +1. und der -1. Beugungsordnung eines Gitters entsprechen. Die Mittel zum Bereitstellen von strukturiertem Beleuchtungslicht umfassen bei der erfindungsgemäßen Optikanordnung daher die Strahlteilungsmittel und die Strahlführungsmittel, durch welche ein Lichtbündel von einem der Strahlengänge in mehrere Teillichtbündel geteilt wird und ein Lichtfleckmuster in der Pupillenebene bildet.
Eine weitere wesentliche Idee kann darin gesehen werden, dass in jedem der auswählbaren Strahlengänge Strahlteilungsmittel vorhanden sind. Hiermit ist eine große Anzahl räumlich getrennter Teillichtbündel auswählbar, ohne dass eine gleich große Anzahl an Strahlengängen, die über die Umlenkmittel auswählbar sind, vorhanden ist. Dadurch können die verstellbaren Umlenkmittel in besonders kurzer Zeit eines der Lichtfleckmuster auswählen. Im Gegensatz zu bekannten Faserschalteinheiten, bei denen Licht schaltbar zu mehreren Lichtleitfasern gekoppelt wird, erfolgt zudem die Aufteilung in Teillichtbündel separat von der Auswahl über die Umlenkmittei. Dadurch kann die Aufteilung in Teillichtbündel vorteilhafterweise ohne Bewegungen oder Schaltvorgänge erfolgen, womit eine bessere Stabilität einhergeht.
Die Lichtbündel verschiedener Strahlengänge werden als unterschiedliche Licht- fleckmuster in die Pupillenebene geführt. Das heißt, die Lichtfleckmuster überlappen sich in der Pupillenebene nicht oder zumindest nicht vollständig. Unter einem Lichtfleckmuster kann ein beliebiges Muster mit räumlich voneinander beabstandeten beleuchteten Bereichen verstanden werden. Diese Bereiche sind bevorzugt kreisförmig, können aber auch jede andere Form aufweisen.
Die Strahlteilungsmitte! können beliebige Mittel umfassen, durch weiche ein auftref- fendes Lichtbündel gleichzeitig in zwei oder mehr räumlich voneinander getrennte Teillichtbündel aufgeteilt wird. Die Teillichtbündel können sodann durch Strahlführungsmitte! in die Pupillenebene geleitet werden. Der Querschnitt der Teillichtbündel bildet dort ein Lichtfleckmuster.
Unter einem Lichtbündel ist das abgestrahlte Licht oder der Lichtstrahl einer Lichtquelle zu verstehen. Dieses Licht soll optisch kohärent sein. Indem jedes Lichtfleckmuster aus den Teillichtbündeln eines einzelnen Lichtbündels gebildet wird, kann erreicht werden, dass die Teillichtbündel desselben Lichtfleckmusters optisch kohärent zueinander sind. Dadurch können die Teillichtbündel in der Probenebene miteinander interferieren und zu dem gewünschten strukturierten Beleuchtungslicht führen.
Eine Zusammenführung der zuvor getrennten Strahlengänge wird dadurch erreicht, dass die Teillichtbündel aller Strahlengänge nebeneinander in die Pupillenebene geführt werden. Diese Zusammenführung der Strahlengänge führt vorteilhafterweise zu keinen oder nur geringen Lichtverlusten. Zudem erfordert die Zusammenführung kei- ne beweglichen Komponenten, ist vergleichsweise unempfindlich gegen äußere Einflüsse und kann kostengünstig ausgeführt werden.
Eine Wechselzeit zwischen den verschiedenen Orientierungen der strukturierten Beleuchtung kann allein durch eine Schaltzeit der verstellbaren Umlenkmittel bestimmt sein. Diese weisen bevorzugt einen Umlenkspiegel auf, der drehbar und/oder verschiebbar ist. Die Auswahl eines bestimmten Strahlengangs erfordert bei dieser Ausführung bloß eine geringe Drehung oder Verschiebung des Umlenkspiegels. Im Vergleich zu dem Ein- und Ausfahren einer gesamten optischen Komponente, beispielsweise eines Gitters, ist die erforderliche Bewegung klein und kann schnell erfolgen. Zudem kann ein Umlenkspiegel kleinere Abmessungen und ein geringeres Gewicht als ein Gitter zum Erzeugen von strukturiertem Beleuchtungslicht aufweisen. Dadurch kann ein Verstellen des Umlenkspiegels bereits in- nerhalb weniger Millisekunden erfolgen. Prinzipiell kann an Stelle eines Umlenkspiegels auch ein drehbares und/oder verschiebbares Prisma eingesetzt werden.
Eine sichere Strahlführung auf den verschiedenen Strahlengängen kann erreicht werden, wenn zum Leiten von Lichtbündeln von den Umlenkmittel zu den Strahltei- lungsmitteln eine erste Gruppe von optischen Fasern vorhanden ist. Diese erste Gruppe weist bevorzugt für die verschiedenen Strahlengänge jeweils eine optische Faser auf. Vorzugsweise erfolgt die Strahlführung von den Umlenkmitteln zu den Strahlteilungsmitteln ohne Spiegel oder Prismen, wodurch die Stabilität steigt und Anforderungen an die Positioniergenauigkeit der vorhandenen Komponenten leich- ter zu erfüllen sind.
Die Strahlteilungsmittel können prinzipiell durch mehrere teildurchlässige Spiegel gebildet sein. Es kann jedoch eine besonders kompakte Bauform bei gleichzeitig hoher Stabilität gegenüber äußeren Einwirkungen erreicht werden, wenn die Strahlteilungsmittel einen Wellenleiterchip aufweisen. Dieser weist ein Substrat oder Tragersubstrat und Lichtleitpfade zum Leiten der Lichtbündel und Teillichtbünde! auf. Die Lichtleitpfade sind durch ein lichtdurchlässiges Material in oder an dem Substrat gebildet. Die Herstellung der Lichtleitpfade kann beispielsweise lithographisch oder auch durch lonenaustausch erfolgen. Der Wellenleiterchip kann eine in sich feste Struktur haben, das heißt frei von zueinander beweglichen Komponenten sein. Vor- teilhafterweise ist hierdurch die Stabilität der Strahlführung höher. Eine Strahlteilung kann erreicht werden, indem die verschiedenen Lichtleitpfade sich jeweils in zwei oder mehr Lichtleitpfade aufteilen, beispielsweise in Form eines Y.
Die Lichtleitpfade des Wellenleiterchips können auch durch optische Fasern gebildet sein. Eine Aufteilung der Lichtleitpfade kann insbesondere durch Dünnschichtfilter (englisch: thin film filters, TFF) erreicht werden. Dies kann als ein Fasermultiplexer bezeichnet werden.
Es ist bevorzugt, dass der Wellenleiterchip mehrere Eingänge zum Einkoppeln von Lichtbündeln aufweist, dass jeder der Strahlengänge, die über die Umlenkmittel auswählbar sind, zu einem anderen der Eingänge führt, dass in dem Wellenleiter- chip an den Eingängen jeweils ein Lichtleitpfad gebildet ist, dass in dem Wellenleiterchip an den Lichtleitpfaden jeweils ein erster Teilungspunkt gebildet ist, der den zugehörigen Lichtleitpfad in zwei oder mehr Lichtleitpfade aufteilt, dass der Wellenleiterchip mehrere Ausgänge zum Auskoppeln von Teillichtbündeln aufweist und dass jeder der Lichtleitpfade zu einem der Ausgänge führt, so dass über solche Ausginge, die über denselben Eingang beleuchtet werden, kohärent gekoppelte Teillichtbündel ausgebbar sind, Jede der optischen Faser der ersten Gruppe kann mit einem der Eingänge des Wellenleiterchips verbunden sein, Das lichtdurchlässige Material, das die Lichtleitpfade bildet, und das umgebende Material sind so gewählt, dass sich Licht allein entlang der Lichtleitpfade ausbreiten kann. Durch die positionsfeste Bildung der Lichtleitpfade ist der Wellenleiterchip unempfindlich gegenüber Stößen oder anderen äußeren Ein- Wirkungen. Die Lichtleitpfade des Wellenleiterchips können auch abschnittsweise oder vollständig durch optische Fasern gebildet sein.
Vorzugsweise ist in dem Wellenleiterchip zumindest für einige der Lichtleitpfade jeweils ein zweiter Teilungspunkt gebildet, an welchem die entsprechenden Lichtleitpfade in je zwei Lichtleitpfade aufgeteilt werden. Es wird also ein Lichtleitpfad an zwei Teilungspunkten hintereinander aufgespalten, wodurch drei Lichtleitpfade entstehen. Ein Lichtbündel wird folglich in drei Teillichtbündel gespalten.
Prinzipiell kann ein Lichtbündel an einem der Teilungspunkte auf die entsprechenden Lichtieitpfade in einem beliebigen Verhältnis aufgeteilt werden. Bevorzugt wird ein Lichtleitpfad aber zu gleichen Teilen auf zwei Lichtieitpfade aufgeteilt. Diese können durch ihre Position in der Pupillenebene der +1. und der -1. Beugungsordnung eines Gitters entsprechen. Für das Licht, das der 0. Beugungsordnung entspricht, ist bereits eine geringe Lichtleistung für eine hohe Bildqualität ausreichend, Hierfür kann ein Lichtleitpfad in den Strahlteilungsmitteln in insgesamt drei Lichtieitpfade geteilt werden, wobei die Lichtleistung in einem dieser Pfade geringer ist als in den beiden anderen.
Demnach kann vorgesehen sein, dass an den ersten und den zweiten Teilungspunkten eine Lichtaufteilung so gewählt ist, dass für jeden der Eingänge zwei Ausgänge gleicher Lichtleistung bereitgestellt werden und ein Ausgang geringerer Lichtleistung, an welchem eine Lichtleistung geringer ist als die an den zwei Ausgängen gleicher Lichtleistung. Grundsätzlich kann ein Lichtfleckmuster in der Pupillenebene auch durch bloß zwei Lichtieitpfade oder durch mehr als drei Lichtleitpfade erzeugt werden. Eine große Anzahl an Lichtleitpfaden erhöht jedoch die Anforderung an die Po- sitioniergenauigkeit hinsichtlich der Teillichtbündel eines Lichtfleckmusters. Vorzugsweise wird daher jedes Lichtfleckmuster durch genau drei Lichtleitpfade gebildet Hierdurch kann eine hohe Bildqualität bei einem verhältnismäßig geringen apparativen Aufbau erreicht werden. Bevorzugt sind die ersten Teilungspunkte so gestaltet, dass ein Lichtbündel zu unterschiedlichen Anteilen auf die zugehörigen zwei Lichtleitpfade aufgeteilt wird. Diese Anteile können beispielsweise in einem Verhältnis von 90:10 oder 95:5 zueinander stehen. Diejenigen Lichtieitpfade, auf welche die kleineren Anteile des Lichtbündels geleitet werden, können direkt zu den Ausgängen geringerer Lichtleistung führen. Die Lichtieitpfade, auf weiche die größeren Anteile des Lichtbündels geleitet werden, können hingegen zu den zweiten Teilungspunkten führen. Diese sind bevorzugt jeweils so gestaltet, dass Licht zu gleichen Anteilen auf die zugehörigen zwei Lichtieitpfade aufgeteilt wird. Diese Lichtieitpfade können wiederum direkt, das heißt ohne auf weitere Teilungspunkte zu treffen, zu den Ausgängen gleicher Licht- leistung führen. Für eine hohe Strahlqualität des strukturierten Beleuchtungslichts in der Probenebene sollten die beiden Lichtieitpfade, die der +1. und der -1. Beugungsordnung eines Gitters entsprechen, dieselbe Lichtleistung führen. Durch die beschriebenen Teilungspunkte kann dies vorteilhafterweise unabhängig von dem genauen Teilungsverhältnis an den ersten Teilungspunkten erreicht werden. Zudem kann an den zweiten Teilungspunkten eine 50:50-Aufteilung genutzt werden, was technisch einfacher und mit einer höheren Präzision erreicht werden kann, als ungleiche Teilungsanteile.
Die Teillichtbündel, welche die Strahlteilungsmittel auf den Lichtleitpfaden des ausgewählten Strahlengangs verlässt, sollen zu der Pupillenebene geleitet werden. Be- vorzugt weisen die Strahlführungsmittel zum Leiten von Teillichtbündeln von den Strahlteilungsmitteln zu der Pupillenebene eine zweite Gruppe von optischen Fasern auf. Diese zweite Gruppe weist vorzugsweise für jedes der Teillichtbündel jeweils eine optische Faser auf. Somit ist an jedem Ausgang des Wellenleiterchips eine optische Faser der zweiten Gruppe angeschlossen. Durch optische Fasern kann vorteil- hafterweise eine besonders hohe Positionsstabilität erreicht werden.
Zudem ermöglichen optische Fasern ein verhältnismäßig einfaches Variieren der Positionen des austretenden Lichts in der Pupillenebene. Dazu kann eine gemeinsame Faserhalterung für die optischen Fasern der Lichtleitpfade, die zu demselben Strahlengang gehören, vorhanden sein. Alternativ kann eine Faserhalterung für alle optischen Fasern der zweiten Gruppe vorhanden sein. Durch ein Drehen oder Bewegen einer Faserhalterung kann eine Orientierung der strukturierten Beleuchtung variiert werden. Bevorzugt sind Faserhalterungen, die zu verschiedenen Strahlengängen gehören, relativ zueinander drehbar. In diesem Fall kann eine Messunterbrechungs- zeit reduziert werden, indem eine Faserhalterung bewegt wird, während eine strukturierte Beleuchtung über die optischen Fasern einer anderen Faserhalterung erzeugt wird. Bevorzugt sind die Enden der optischen Fasern so in der Pupillenebene angeordnet, dass sie das jeweils gewünschte Lichtfleckmuster definieren. Alternativ können in der Pupillenebene aber auch ein oder mehrere Spiegel angeordnet sein, auf die das Licht aus den optischen Fasern der zweiten Gruppe trifft. Prinzipiell kann auch jede der optischen Fasern der zweiten Gruppe durch jeweils einen oder mehrere Spiegel ersetzt sein, wobei durch die Spiegelanordnung die Lichtfleckmuster in der Pupillenebene erzeugt werden. Mit optischen Fasern ist jedoch der apparative Aufwand geringer und die Positionsstabilität höher.
Bei einer weiteren Alternative sind die Strahlführungsmittel durch Lichtleitpfade innerhalb des Wellenleiterchips gebildet. In diesem Fall können die Ausgänge des Wellenleiterchips in der Pupillenebene entsprechend den gewünschten Lichtfleckmustern angeordnet sein.
Es ist bevorzugt, dass solche Strahlführungsmittel, die mit einem Ausgang geringerer Lichtleistung verbunden sind, zu einem zentralen Bereich in der Pupillenebene führen, und dass solche Strahlführungsmittel, die mit einem der Ausgänge gleicher Lichtleistung verbunden sind, zu äußeren Bereichen in der Pupillenebene führen. Ein Lichtfleckmuster wird bei dieser Ausführung also durch ein Teillichtbündel im zentralen Bereich der Pupillenebene und zwei Teillichtbündel in äußeren Bereichen der Pupillenebene gebildet. Diese drei Teillichtbündel entsprechen durch ihre Position in der Pupillenebene vorzugsweise der -1., 0. und +1. Beugungsordnung eines Gitters, das in einer Ebene angeordnet ist, welche durch eine Fourier-Transformation mit der Pupillenebene zusammenhängt. Die Teillichtbündel verschiedener Lichtfleckmuster, die im zentralen Bereich angeordnet sind, können dort nebeneinander positioniert sein. Hierfür können die Enden der entsprechenden optischen Fasern der zweiten Gruppe benachbart zueinander, bevorzugt direkt nebeneinander, im zentralen Bereich der Pupillenebene angeordnet sein.
Bevorzugt sind jeweils die beiden Strahlführungsmittel, die mit einem der Ausgänge gleicher üchtleistung verbunden sind und über denselben Strahlengang beleuchtet werden, so angeordnet, dass aus diesen Strahlführungsmittein austretende Teillichtbündel in der Pupillenebene bezüglich des zentralen Bereichs einander gegenüberliegen. Die drei Teillichtbündel, die ein Lichtfleckmuster bilden, liegen demnach in etwa auf einer Geraden. Hierdurch wird dem Umstand Rechnung getragen, dass die -1. und die +1 , Beugungsordnung eines Gitters symmetrisch zueinander in Bezug auf die 0. Beugungsordnung liegen. Geringfügige Abweichungen von dieser Symmetrie, die durch die Anordnung verschiedener optischer Fasern nebeneinander im zentralen Bereich resultieren können, haben nur einen geringen Einfluss auf das Muster der strukturierten Beleuchtung in der Probenebene. Dennoch kann ein Kompensieren dieser Auswirkungen auf die strukturierte Beleuchtung vorgesehen sein. Dazu kann mit den verschiedenen Lichtfleckmustern jeweils ein Referenzbild aufgenommen werden. Die Intensitätsverteilungen in diesen Referenzbildern können zum Auswerten von später aufgenommenen Probenbildern genutzt werden. Bei der Verwendung von strukturiertem Beleuchtungslicht ist die Bildqualität abhängig von der Polarisationsrichtung des erzeugten Lichts. Wird das strukturierte Beleuchtungslicht in der Probenebene durch ein Linienmuster gebildet, so sollte die Polarisationsrichtung des Lichts parallel zu der Linienrichtung des Linienmusters stehen. Dies kann erreicht werden, wenn die optischen Fasern der ersten und der zwei- ten Gruppe sowie die Lichtleitpfade des Wellenleiterchips polarisationserhaltend sind. Zudem sind sie bevorzugt so angeordnet, dass eine Polarisationsrichtung von Teillichtbündeln, die aus den optischen Fasern der zweiten Gruppe austreten, quer, insbesondere senkrecht, zu einer Verbindungsgeraden steht, welche in der Pupillen- ebene zwei Teillichtbündel desselben Strahlengangs verbindet. Zusätzlich zu den verschiedenen Orientierungen der strukturierten Beleuchtung, welche über die unterschiedlichen Lichtfleckmuster auswählbar sind, soll auch eine Phasenschiebung der strukturierten Beleuchtung möglich sein. Dies kann durch eine Änderung der Phasenbeziehung zwischen den Teillichtbündeln, die gemeinsam eines der Lichtfleckmuster bilden, erreicht werden.
Bei einer bevorzugten Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Optikanordnung sind zum Phasenschieben einer strukturierten Beleuchtung, die durch eines der Licht- fleckmuster erzeugbar ist, Thermo-Phasenschieber vorhanden. Ein Thermo-Phasenschieber weist Mitte! zur Temperaturbeeinflussung der optischen Fasern der zweiten Gruppe und/oder der Lichtleitpfade des Wellenleiterchips auf, wobei die optischen Fasern der zweiten Gruppe und/oder die Lichtleitpfade des Wellenleiterchips temperaturabhängige Brechzahlen aufweisen. Indem die verschiedenen optischen Fasern oder Lichtleitpfade unterschiedlich erhitzt werden, kann ein Phasenschieben in sehr kurzer Zeit erfolgen, beispielsweise innerhalb weniger Millisekunden. Zudem sind keine mechanischen Bewegungen erforderlich.
Alternativ oder zusätzlich kann die Phasenbeziehung zwischen den Teillichtstrahlen desselben Strahlengangs auch über eine elektrische Beeinflussung gesteuert wer- den, Hierzu ist bevorzugt vorgesehen, dass die optischen Fasern der zweiten Gruppe und/oder die Lichtleitpfade des Wellenleiterchips Manipulationsbereiche aufweisen, in denen eine Brechzahl spannungsabhängig ist, dass benachbart zu den Manipulationsbereichen elektrooptische Modulatoren vorhanden sind, welche die Brechzahl im benachbarten Bereich durch eine einstellbare Spannung vorgeben, und dass elektronische Steuerungsmittel vorhanden und dazu eingerichtet sind, die Brechzahlen in den Manipulationsbereichen über die elektrooptischen Modulatoren zu variieren zum Phasenschieben einer strukturierten Beleuchtung, die durch eines der Lichtfleckmuster erzeugt wird. Die Manipulationsbereiche können beispielsweise durch eine geeignete Materialdotierung gebildet sein. Eine Steuerung der Phasenbezie- hung über elektrooptische Modulatoren kann ebenfalls sehr schnell erfolgen.
Zur Reduzierung einer Messunterbrechungszeit können die elektronischen Steuerungsmittel dazu eingerichtet sein, ein Phasenschieben für die Teillichtbündel von einem der Strahlengänge durchzuführen, während ein anderer der Strahlengänge über die Umlenkmittel ausgewählt ist. Die Messunterbrechungszeit zwischen den Aufnahmen zweier Probenbilder kann hierdurch insbesondere dann reduziert werden, wenn ein Umschalten der Umlenkmittel in kürzerer Zeit erfolgen kann als ein Phasenschieben. Für eine kostengünstige Ausführung kann zum Phasenschieben der strukturierten Beleuchtung auch mindestens eine Phasenplatte vorgesehen sein. Diese ist zweckmäßigerweise zwischen den Strahlteilungsmittein und der Probenebene angeordnet und kann beispielsweise einen lichtdurchlässigen Keil umfassen, der für eine Pha- senschiebung verschoben oder gekippt wird. Alternativ kann die Phasenplatte eine lichtdurchlässige Platte mit planparallelen Oberflächen aufweisen, die zum Phasenschieben gekippt wird.
Die Probenbilder, die unter Nutzung verschiedener Lichtfleckmuster aufgenommen werden, sollen zu einem höher auflösenden Bild verrechnet werden. Hierfür ist es vorteilhaft, wenn verschiedene Lichtfleckmuster die gleiche Lichtleistung aufweisen. Insbesondere aufgrund von Ein- und Auskopplungsverlusten an den optischen Fasern können diese Lichtteistungen jedoch voneinander verschieden sein. Deshalb ist es erwünscht, die Lichtleistung verschiedener Punktmuster variabel einstellen zu können. Bevorzugt ist hierfür eine akustooptische Vorrichtung vor den verstellbaren Umlenkmitteln vorhanden. Elektronische Steuerungsmittel sind vorhanden und dazu eingerichtet, mit der akustooptischen Vorrichtung eine Leistung eines Lichtbündels abhängig davon zu variieren, auf welchen der Strahlengänge das Lichtbündel geleitet wird. Die elektronischen Steuerungsmittel können dazu eingerichtet sein, die akustooptische Vorrichtung so anzusteuern, dass in der Pupillenebene die Lichtfleckmuster verschiedener Strahlengänge eine gleiche Lichtleistung aufweisen. Hierfür können die Ergebnisse von Referenzmessungen genutzt werden, in welchen die Helligkeit oder Lichtleistung in der Probenebene für die verschiedenen Punktmuster gemessen wird, ohne über die akustooptische Vorrichtung die Lichtleistung variabel zu beeinflussen. Zum Erhöhen der Anzahl verschiedener Orientierungen der strukturierten Beleuchtung kann zusätzlich ein Bildfelddreher eingesetzt werden. Hierbei ist zum Ändern einer Orientierung der strukturierten Beleuchtung, die mit einem der Lichtfleckmuster bereitgestellt wird, im Strahlengang hinter den Strahlführungsmitteln ein Bildfelddreher vorhanden. Zudem ist eine Stelleinrichtung zum Drehen des Bildfelddre- hers vorhanden. Zwar ist eine Änderung der Orientierung der strukturierten Beleuchtung durch ein Umschalten der Umlenkmittel in der Regel schneller als ein Drehen des Bildfelddrehers. Durch diesen kann jedoch eine prinzipiell beliebige Anzahl verschiedener Orientierungen der strukturierten Beleuchtung ermöglicht werden.
Im Strahlengang hinter den Strahlführungsmitteln ist bevorzugt eine Zoomoptik vorhanden für eine variable Anpassung zwischen einem Lichtleitwert eines Objektivs und einem Lichtleitwert der Lichtfleckmuster in der Puptllenebene. Der Lichileitwert der Lichtfleckmuster in der Pupiilenebene wird bestimmt durch den Abstand zwischen den äußeren Teillichtbündeln und durch die numerische Apertur der Teillichtbündel, das heißt durch ihre Ausdehnung und den Öffnungswinkel, mit dem sich die Teillichtbündel von der Pupillenebene aus aufweiten. Durch die Zoomoptik wird er- reicht, dass die Lichtfleckmuster vollständig über das Objektiv in eine Probenebene geführt werden. Dies wird durch die Zoomoptik vorteilhafterweise für Objektive mit unterschiedlicher numerischer Apertur gewährleistet
Das Objektiv kann zweckmäßigerweise Bestandteil des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops sein. Es dient dem Leiten von Licht, das von der Optikanordnung ausge- geben wird. Die beschriebene Pupillenebene der Optikanordnung ist optisch konjugiert zu einer Pupiilenebene des Objektivs,
Dadurch kann mit dem Objektiv Licht, das von der Optikanordnung kommt, so in die Probenebene geführt werden, dass eine Lichtintensitätsverteilung in der Probenebene durch eine Fouriertransformation mit der Lichtintensitätsverteilung in der Pupillen- ebene der Optikanordnung zusammenhängt. In der Probenebene, in welcher eine zu untersuchende Probe positionierbar ist, interferiert das von der Optikanordnung kommende Licht daher zu einer strukturierten Beleuchtung, Mit dem Objektiv kann zudem Detektionslicht, das von der Probe kommt, in Richtung einer Detektoreinrichtung leitbar sein. Weitere Eigenschatten und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden mit Bezug auf die beigefügten schematischen Zeichnungen beschrieben. Hierin zeigen;
Fig. 1 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops mit einer erfindungsgemäßen Optikanordnung; Fig. 2 eine vergrößerte Darstellung von Komponenten der Optikanordnung aus Fig. 1 und Fig. 3 eine schematische Darstellung von Lichtfleckmustern, die in einer Pupillenebene durch eine erfindungsgemäße Optikanordnung erzeugt werden.
Gleiche und gleich wirkende Komponenten sind in den Figuren in der Regel mit denselben Bezugszeichen versehen.
Fig. 1 zeigt schematisch ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops 110 und einer erfindungsgemäßen Optikanordnung 100, die in einem Strahlengang des, Lichtmikroskops 110 positioniert ist Durch die Optikanordnung 100 wird strukturiertes Beleuchtungslicht 18 in einer Probenebene 90 des Lichtmikroskops 110 erzeugt. Hierzu wird zunächst von einer Lichtquelle 10 des Lichtmikroskops 110 unstrukturiertes Licht 15 erzeugt. Ein solches Lichtbündel 15 wird zu der Optikanordnung 100 geleitet. Diese weist Mittel zum Bereitstellen von strukturiertem Beleuchtungslicht 16 aus dem Lichtbünde! 15 auf. Im Gegensatz zu herkömmlichen Optikanordnungen erfordern diese Mittel kein Gitter, Ein solches wird gewöhnlicherweise in einer Zwischenbildebene angeordnet, so dass in der Probenebene ein Bild des Gitters als strukturierte Beleuchtung erzeugt wird. Durch die erfindungsgemäße Optikanordnung 100 wird hingegen ein Lichtfleckmuster in einer Pupillenebene erzeugt. Unter einer Pupillenebene soll so eine Ebene verstanden werden, in der die Lichtverteilung über eine Fourier- Transformation mit der Lichtverteilung in der Probenebene zusammenhängt. Dadurch kann durch ein Lichtfleckmuster eine strukturierte Beleuchtung in der Probenebene 90 erreicht werden, die der strukturierten Beleuchtung durch ein Gitter gleicht oder ähnelt Die Mittel zum Bereitstellen von strukturiertem Beleuchtungslicht umfassen bei der Optikanordnung 100 insbesondere verstellbare Umlenkmittel 20, Strahlteilungsmittel 50 und Strahlführungsmittel 70.
Zunächst wird von der Lichtquelle 10 kohärentes, also interferenzfähiges Licht 15 ausgesendet. Im dargestellten Beispiel umfasst die Lichtquelle 10 mehrere Lasermo- dule, über welche Licht 15 der Wellenlängen 488 nm, 561 nm und 640 nm ausgesendet werden kann. Das Licht wird von den Lasermodulen über optische Fasern 11 bis 13 zu einer Spiegeltreppe 14 geführt, welche durch teildurchlässige Spiegel das Licht 15 verschiedener Lasermodule auf einen gemeinsamen Strahlengang vereint.
Sodann trifft das Licht oder Lichtbünde! 15 auf eine akustooptische Vorrichtung 18. Mit dieser kann insbesondere Licht einer gewünschten Wellenlänge ausgewählt und weiter zu den verstellbaren Umlenkmitteln 20 geleitet werden.
Die Umlenkmittel 20 umfassen einen drehbaren Umienkspiegel. Dieser kann über einen Galvanometer-Scanner oder einen anderen Motor schnell drehbar sein. Der Umlenkspiegel 20 kann auch, eine oder mehrere nebeneinander angeordnete Spiegelflächen umfassen, welche jeweils durch ein mikroelektromechanisches System (MEMS) in ihrer Ausrichtung verstellt werden können. Hierdurch kann das Lichtbündel 15 auswählbar auf einen von mehreren räumlich getrennten Strahlengängen 21 bis 23 geleitet werden. Ober die verschiedenen Strahlengänge 21 bis 23 wird strukturiertes Beleuchtungslicht in unterschiedlichen Orientierungen erzeugt, wie im Folgenden beschrieben.
Die Strahlengänge 21 bis 23 werden über eine erste Gruppe von optischen Fasern 30 zu den Strahlteilungsmitteln 50 geführt. Hierzu wird auf Fig. 2 Bezug genommen, welche die optischen Fasern 30, die Strahlteilungsmittel 50 und die darauf folgenden Strahlführungsmittel 70 vergrößert zeigt.
Die Strahlteilungsmittel 50 sind hier mit einem Wellenleiterchip 50 gebildet. Dieser weist mehrere Eingänge 51 bis 53 zum Einkoppeln von Lichtbündeln 15 auf. Die erste Gruppe von optischen Fasern 30 umfasst mehrere optische Fasern 31 bis 33, von denen jede einen der Strahlengänge 21 bis 23 zu einem der Eingänge 51 bis 53 führt. Die optischen Fasern 31 bis 33 weisen Endkappen auf, die mit Anschlussmitteln an den Eingängen 51 bis 53 so verbunden werden, dass kein Luftspalt zwischen diesen entsteht.
Der Wellenleiterchip 50 weist ein Substrat auf, auf dem mit einem lichtdurchlässigen Material Lichtleitpfade 41 bis 49 gebildet sind. Prinzipiell können diese auch durch optische Fasern gebildet sein, die an einem oder mehreren Chips gehalten sind. Der Wellenleiterchip 50 kann dadurch auch als Fasermultiplexer bezeichnet werden. Jeder der Eingänge 51 bis 53 ist mit einem Lichtleitpfad verbunden, welcher jeweils zu einem ersten Teilungspunkt 54 bis 56 führt. An jedem dieser ersten Teilungspunk- te 54 bis 56 wird der zugehörige Lichtleitpfad in zwei räumlich voneinander getrennte Lichtleitpfade 41 und 43, 44 und 46, 47 und 49 aufgeteilt. Hierfür können auch Dünnschichtfilter (Thin Film Filters, TFF) genutzt werden. Ein Lichtbündel wird an einem der ersten Teiiungspunkte 54 bis 58 somit in zwei Teillichtbündel aufgeteilt. An den ersten Teilungspunkten 54 bis 56 wird Licht zu ungleichen Anteilen auf die beiden Lichtleitpfade 41 » 43, 44, 48, 47, 49 aufgeteilt. Die Lichtleitpfade 43, 46, 49, auf die der jeweils kleinere Lichtanteil gelangt, führt direkt zu jeweils einem Ausgang 63, 66, 69 des Wellenleiterchips 50. Auf diese Lichtleitpfade 43, 46, 49 wird bevorzugt weniger als 20% des Lichts, das auf den entsprechenden ersten Teilungspunkt 54 bis 56 trifft, geleitet, beispielsweise 5% oder 10%, Die Ausgänge 63, 66, 69 können auch als Ausgänge geringerer Lichtleistung bezeichnet werden.
Das übrige Licht gelangt auf den Lichtleitpfaden 41 , 44, 47 jeweils zu einem zweiten Teilungspunkt 57, 58, 59. An diesen erfolgt jeweils eine weitere Teilung in zwei Lichtleitpfade 41 und 42, 44 und 45, 47 und 48. Dabei erfolgt an den zweiten Teilungs- punkten 57 bis 59 eine Aufteilung des Lichts bevorzugt zu gleichen Anteilen auf die zugehörigen zwei Lichtleitpfade. Diese Lichtleitpfade führen schließlich ebenfalls zu Ausgängen 61 , 62, 64, 65, 67 und 68 des Wellenleiterchips 50. Diese Ausgänge können auch Ausgänge gleicher Lichtleistung genannt werden.
Für jeden der Strahlengänge 21 bis 23 wird ein Lichtbündel somit in drei Teillichtbün- dei aufgeteilt, die miteinander interferenzfähig sind.
Die Strahlführungsmittel 70 umfassen eine zweite Gruppe von optischen Fasern 71 bis 79, die jeweils mit einem der Ausgänge 61 bis 69 verbunden sind. Über die optischen Fasern 71 bis 79 werden die Teillichtbündel zu einer Pupillenebene 80 geführt, welche in Fig. 1 eingezeichnet und in Fig. 3 vergrößert dargestellt ist. Fig. 3 zeigt schematisch Lichtflecken, das heißt Querschnitte der Teillichtbündel 81 bis 89, in der Pupillenebene 80. Die Anordnung der Teillichtbündel 81 bis 89 wird durch die Anordnung der optischen Fasern 71 bis 79 vorgegeben. Insbesondere können die optischen Fasern 71 bis 79 in der Pupillenebene 80 enden, so dass deren Anordnung mit der Anordnung der Teillichtbündel 81 bis 89, die in Fig. 3 gezeigt ist, übereinstimmt. Die Teillichtbündel 81 bis 83, die zu dem Strahlengang 21 gehören, bilden in der Pupillenebene 80 ein Lichtfleckmuster aus drei beleuchteten, voneinander beabstande- ten Bereichen. In entsprechender Weise erzeugen die drei Teiilichtbündel 84 bis 86 und die Teiilichtbündel 87 bis 89 ein zweites und ein drittes Lichtfleckmuster. Von den verschiedenen Lichtfleckmustern wird zu jeder Zeit über die Umtenkmiltel nur eines erzeugt. Indem die verschiedenen Lichtfleckmuster nicht oder zumindest nicht vollständig überlappen, unterscheidet sich die in der Probenebene jeweils erzeugte strukturierte Beleuchtung.
Jedes Lichtfleckmuster umfasst einen Lichtfleck in einem zentralen Bereich der Pu- pillenebene 80, das heißt im Bereich um eine optische Achse, welche zentral durch ein Sehfeld verläuft. Diese Lichtflecken werden durch die Teiilichtbündel 83, 86, 89 erzeugt, welche über die Ausgänge geringerer Leistung 63, 66, 69 von dem Wellen- ieiterchip 50 zu der Pupillenebene 80 geführt wurden.
Die Teiilichtbündel 83, 86, 89 im zentralen Bereich entsprechen räumlich der 0. Beu- gungsordnung eines Gitters, das sich in einer Zwischenbildebene befindet. Die beiden äußeren Teiilichtbündel oder -strahlen 81 , 82, 84, 85, 87, 88 entsprechen räumlich der -1, und der +1. Beugungsordnung eines Gitters in einer Zwischenbildebene. Daher liegen zwei Teillichtstrahlen desselben Strahlengangs, beispielsweise die Teillichtstrahlen 81 und 82, einander gegenüberliegend in Bezug auf den zentralen Be- reich. Insbesondere können sie in Bezug auf die optische Achse einander gegenüberliegen oder in Bezug auf das zugehörige Teiilichtbündel 83» das im zentralen Bereich angeordnet ist.
Idealerweise sollten die Teiilichtbündel 83, 86, 89, welche zu verschiedenen Strahlengängen gehören und jeweils in den zentralen Bereich geführt werden, übereinan- der liegen. Hierfür können zwei oder mehr der Teiilichtbündel 83, 86, 89 zunächst in eine gemeinsame optische Faser zusammengeführt werden und sodann in den zentralen Bereich geleitet werden (nicht dargestellt). Bevorzugt werden zwei oder mehr der Teillichtbündel 83, 86, 89 im Wellenleiterchip vereint. Bei einer Vereinigung von zwei der Teillichtbündel 83, 86, 89 im Wellenlefterchip 50 können alle Lichtleitpfade 41 bis 49 in einer Ebene verlaufen.
Wenn drei Teiilichtbündel 83, 86, 89 im Wellenleiterchip 50 vereint werden, können die zugehörigen Lichtleitpfade 43, 46, 49 dreidimensional verlaufen, das heißt, sie liegen nicht in einer Ebene. Sollen alternativ alle Uchtleitpfade in einer Ebene verlaufen, muss ein Durchkreuzen verschiedener Lichtleitpfade vermieden werden. Dies kann erreicht werden, wenn die Ausgänge 81 bis 89 am Wellenleiterchip 50 zueinander in einer Richtung versetzt sind, die von den Eingängen 51 bis 53 zu den Ausgän- gen 61 bis 69 zeigt Dann können die Uchtleitpfade 43, 46, 49 hinter den Ausgängen der übrigen Lichtleitpfade 41 , 42, 44, 45, 47, 48 zusammengeführt werden, ohne dass es zu einem Durchkreuzen verschiedener Lichtleitpfade kommt.
Die verschiedenen Lichtfleckmuster können sich durch eine Rotationsausrichtung um die optische Achse unterscheiden. So können im dargestellten Beispiel die Teillicht- strahlen 81 bis 83 durch eine Drehung von 120° um die optische Achse in die Teillichtstrahlen 84 bis 86 überführt werden. Indem sich die Lichtfleckmuster allein in ihrer Orientierung unterscheiden, unterscheiden sich auch die strukturierten Beleuchtungen in der Probenebene allein in der Orientierung.
Für ein Phasenschieben der strukturierten Beleuchtung bleiben die Positionen und Anordnungen der Lichtfleckmuster unverändert. Vielmehr wird die Phasenbeziehung zwischen den Teillichtbündeln desselben Lichtfleckmusters zueinander variiert. Dies beeinflusst die Lage der Bereiche in der Probenebene, in welcher die drei Teillichtbündel eines Lichtfleckmusters miteinander konstruktiv interferieren. Folglich wird die Phase der strukturierten Beleuchtung geändert. Zur Phasenänderung der Teillichtbündel kann eine Variation der Brechzahl in einem Material durchgeführt werden, durch welches sich das jeweilige Teillichtbündel fortbewegt. So können Mittel zum Ändern der Brechzahlen der optischen Fasern 71 bis 79 und/oder der Lichtleitpfade 41 bis 49 im Wellenleiterchip 50 vorhanden sein. Diese Mittel können beispielsweise einen elektrooptischen Modulator zum Ändern einer Brechzahl über eine angelegte Spannung umfassen. Alternativ können Thermo- Phasenschieber eingesetzt werden, welche die Brechzahl über eine Temperaturänderung beeinflussen.
Die Qualität einer Probenbildaufnahme hängt auch von der Polarisierung des strukturierten Beleuchtungslichts ab. Um eine Polarisationsrichtung der Teillichtbündel 81 bis 89 vorgeben zu können, sind die optischen Fasern 31 bis 39 und 71 bis 79 sowie die Lichtleitpfade 41 bis 49 polarisationserhaltend. Die optischen Fasern sind in ihrer Rotationsausrichtung so positioniert, dass die Polarisationsrichtung von zwei Teil- lichtbündeln desselben Strahlengangs senkrecht zu einer Verbindungsgeraden zwischen diesen Teiüichtbündeln in der Pupillenebene 80 steht. Für das Teillichtbündel 81 steht demnach eine Polarisationsrichtung senkrecht zu einer Verbindungsgeraden, die in der Pupillenebene 80 das Teillichtbündel 81 mit dem Teillichtbündel 82 und/oder mit dem Teillichtbündel 83 verbindet.
In Fig. 1 ist schematisch gezeigt, dass die Teillichtbündei, die durch Aufteilung eines unstrukturierten Lichtbündels 15 erzeugt werden, in einer Zwischenbildebene miteinander interferieren und so strukturiertes Beleuchtungslicht 16 erzeugen. Dieses wird mit optischen Abbildungsmitteln 91, 93 über eine optische Schnittstelle des Lichtmik- roskops 110 in dieses eingekoppelt und trifft dort auf einen Farbteiler 94. Der Farbteiler 94 weist eine Grenzwellenlänge zwischen Transmission und Reflexion auf. Die Grenzwellenlänge ist so gewählt, dass von der Optikanordnung 100 kommendes strukturiertes Beleuchtungslicht 16 in Richtung eines Objektivs 95 und weiter zur Probenebene 90 geleitet wird. Die numerische Apertur des Objektivs 95 bestimmt, ob das strukturierte Beleuchtungslicht 18 vollständig oder nur teilweise in die Probenebene 90 geleitet werden kann. Um sicherzustellen, dass die Teillichtstrahlen eines Lichtfleckmusters vollständig von dem Objektiv 95 weitergeleitet werden, umfassen die optischen Abbildungsmittel 91 bevorzugt eine Zoomoptik. Durch die Bestrahlung mit strukturiertem Beleuchtungslicht 16 sendet eine Probe 92, die sich in der Probenebene 90 befindet, Detektionslicht 17 aus. Bei diesem kann es sich insbesondere um Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzlicht handeln. Das Detektionslicht 17 gelangt über das Objektiv 95 und den Farbteiler 94 zu einer Detektoreinrichtung 96, die zweckmäßigerweise eine räumlich auflösende Kamera ist. Um die Orientierung der strukturierten Beleuchtung zu ändern, ist vorteilhafterweise allein eine Bewegung des Umlenkspiegels 20 erforderlich. Dies kann bereits innerhalb weniger Millisekunden erfolgen. Die durch den Umlenkspeigel 20 auswählbaren Strahlengänge 21 bis 23 werden mit nur geringen Lichtverlusten in der Pupillenebene 80 zusammengeführt. Die dafür erforderlichen Mittel sind verhältnismäßig koste n- günstig und stabil gegenüber äußeren Einflüssen wie beispielsweise Erschütterungen. Gegenüber herkömmlichen Optikanordnungen und Lichtmikroskopen können daher mit der Erfindung Probenbilder hoher Qualität in kürzerer Zeit aufgenommen werden.
Bezugszeichenliste
10 Lichtquelle
11 bis 13 optische Fasern zum Leiten von Licht der Lichtquelle
14 Spiegeltreppe
15 Lichtbündel
16 strukturiertes Beieuchtungslicht
17 Detektionslicht
18 akustooptische Vorrichtung
20 verstellbare Umlenkmittel, Umlenkspiegel
21 bis 23 Strahlengänge, die über die Umlenkmittel auswählbar sind
30 erste Gruppe von optischen Fasern
31 bis 33 optische Fasern der ersten Gruppe 30
41 bis 49 Lichtleitpfade
50 Strahlteilungsmittel, Wellenleiterchip
51 bis 53 Eingänge des Wellenleiterchips
54 bis 56 erste Teilungspunkte des Wellenleiterchips
57 bis 59 zweite Teilungspunkte des Wellenleiterchips
61 bis 69 Ausgänge des Wellenleiterchips
70 Strahlführungsmittel, zweite Gruppe von optischen Fasern
71 bis 79 optische Fasern der zweiten Gruppe 70
80 Pupillenebene
81 bis 89 Teillichtbündel
90 Probenebene
91 optische Abbildungsmittel
92 Probe
93 optische Abbildungsmittel
94 Farbteiler
95 Objektiv
96 Detektoreinrichtung 100 Optikanordnung 110 Lichtmikroskop

Claims

PATENTANSPRÜCHE 1. Optikanordnung zum Positionieren in einem Strahlengang eines Lichtmikroskops
mit Mitteln zum Bereitstellen von strukturiertem Beleuchtungsiicht (16) in einer Probenebene (90) des Lichtmikroskops, wobei strukturiertes Beleuchtungsiicht (16) in unterschiedlichen Orientierungen erzeugbar ist,
dadurch g e k e n n z e i c h n e t,
dass verstellbare Umlenkmittel (20) vorhanden sind zum auswählbaren Umlenken eines auftreffenden Lichtbündels (15) auf einen von mehreren Strahlengängen (21 - 23),
dass in den Strahlengängen (21 - 23) Strahlteilungsmittel (50) vorhanden sind zum Aufteilen des Lichtbündels (15) des jeweiligen Strahlengangs (21 - 23) in räumlich voneinander getrennte Teillichtbündel (81 - 89),
dass für jedes der Teilfichtbündel (81 - 89) Strahlführungsmittel (70, 71 - 79) vorhanden sind, welche das zugehörige Teillichtbündel (81 - 89) zu einer Pupillenebene (80) führen, und
dass die Strahlführungsmittel (70, 71 - 79) so angeordnet sind, dass die Teillichtbündel (81 - 83, 84 - 86, 87 - 89), die zu demselben Strahlengang (21 , 22, 23) gehören, in der Pupillenebene (80) ein Lichtfleckmuster bilden und dass die Lichtfleckmuster unterschiedlicher Strahlengänge (21 - 23) in der Pupillenebene (80) voneinander verschieden sind.
2. Optikanordnung nach Anspruch 1 ,
dadurch g e k e n n z e i c h n e t,
dass die Umlenkmittel (20) einen Umlenkspiegel (20) aufweisen, der drehbar und/oder verschiebbar ist.
3. Optikanordnung nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
dass zum Leiten von Lichtbündein (15) von den Umlenkmitteln (20) zu den Strahlteilungsmitteln (50) eine erste Gruppe von optischen Fasern (30) vorhanden ist und
dass die erste Gruppe von optischen Fasern (30) für die verschiedenen Strahlengänge (21 - 23) jeweils eine optische Faser (31 - 33) aufweist.
4. Optikanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Strahlteilungsmittel (50) einen Welienleiterchip (50) aufweisen, welcher ein Substrat und Uchtleitpfade (41 - 49) zum Leiten der Lichtbündel und Teillichtbündel (81 - 89) aufweist, wobei die Lichtleitpfade (41 -49) durch ein lichtdurchlässiges Material in oder an dem Substrat gebildet sind.
5. Optikanordnung nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet,
dass der Wellenleiterchip (50) mehrere Eingänge (51 - 53) zum Einkoppeln von Lichtbündeln (15) aufweist,
dass jeder der Strahlengänge (21 - 23), die über die Umlenkmittel (20) auswählbar sind, zu einem anderen der Eingänge (51 - 53) führt,
dass in dem Welienleiterchip (50) an den Eingängen (51 - 53) jeweils ein Lichtleitpfad gebildet ist,
dass in dem Wellenleiterchip (50) an den Lichtleitpfaden jeweils ein erster Teilungspunkt (54 - 56) gebildet ist, der den zugehörigen Lichtleitpfad in zwei Uchtleitpfade (41, 43, 44, 46, 47, 49) aufteilt,
dass der Wellenleiterchip (50) mehrere Ausgänge (61 - 69) zum Auskoppeln von Teillichtbündeln (81 - 89) aufweist und
dass jeder der Lichtleitpfade (41 , 43, 44, 46, 47, 49) zu einem der Ausgänge (61 - 69) führt, so dass über solche Ausgänge (61 - 69), die über denselben Eingang (51 - 53) beleuchtet werden, kohärent gekoppelte Teillichtbündel (81 - 89) ausgebbar sind.
6. Optikanordnung nach Anspruch 4 oder 5,
dadurch gekennzeichnet,
dass in dem Wellenieiterchip (50) zumindest für einige der Lichtleitpfade (41,
44, 47) jeweils ein zweiter Teilungspunkt (57 - 59) gebildet ist, an welchen die entsprechenden Lichtleitpfade (41, 44, 47) in je zwei Lichtleitpfade (41, 42, 44,
45, 47, 48) aufgeteilt werden.
7. Optikanordnung nach Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet,
dass an den ersten und den zweiten Teilungspunkten (54 - 59) eine Lichtaufteilung so gewählt ist, dass für jeden der Eingänge (51 - 53) zwei Ausgänge gleicher Lichtleistung (61, 62, 64, 65, 67, 68} bereitgestellt werden und ein Ausgang geringerer Lichtleistung (63, 66, 69), an welchem eine Lichtleistung geringer ist als die an den zwei Ausgängen gleicher Lichtleistung (61, 62, 64, 65, 67, 68).
8. Optikanordnung nach Anspruch 6 oder 7,
dadurch gekennzeichnet,
dass die ersten Teilungspunkte (54 - 56) so gestaltet sind, dass ein Lichtbündel (15) zu unterschiedlichen Anteilen auf die zugehörigen zwei Lichtleitpfade (41 , 43, 44, 46, 47, 49) aufgeteilt wird,
dass diejenigen Lichtleitpfade, auf welche die kleineren Anteile des Lichtbündels (15) geleitet werden, direkt zu den Ausgängen geringerer Lichtleistung (83, 66, 69) führen,
dass die Lichtleitpfade, auf welche die größeren Anteile des Lichtbündels (15) geleitet werden, zu den zweiten Teilungspunkten (57 - 59) führen,
dass die zweiten Teilungspunkte (57 - 59) jeweils so gestaltet sind, dass ein Teillichtbündel zu gleichen Anteilen auf die zugehörigen zwei Lichtleitpfade (41, 42, 44, 45, 47, 48) aufgeteilt wird und diese Lichtleitpfade direkt zu den Ausgängen gleicher Lichtleistung (61, 62, 64, 65, 67, 68) führen.
9. Optikanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Strahlführungsmittel (70, 71 - 79) zum Leiten von Teillichtbündeln (81
- 89) von den Strahlteilungsmittel (50) zu der Pupillenebene (80) eine zweite Gruppe von optischen Fasern (70, 71 - 79) aufweisen und
dass die zweite Gruppe von optischen Fasern (70, 71 - 79) für jeden der Teillichtbündel (81 - 89) jeweils eine optische Faser (71 - 79) aufweist,
10. Optikanordnung nach Anspruch 8 oder 9,
dadurch gekennzeichnet,
dass solche Strahlführungsmittel (73, 76, 79), die mit einem Ausgang geringerer Lichtleistung (63, 66, 69) verbunden sind, zu einem zentralen Bereich in der Pupillenebene (80) führen, und
dass solche Strahlführungsmittel (71, 72, 74, 75, 77, 78), die mit einem der Ausgänge gleicher Lichtleistung (61, 62, 64, 65, 67, 68) verbunden sind, zu äußeren Bereichen in der Pupillenebene (80) führen.
11. Optikanordnung nach einem der Ansprüche 8 bis 10,
dadurch gekennzeichnet,
dass jeweils die beiden Strahlführungsmittel (71, 72, 74, 75, 77, 78), die mit einem der Ausgänge gleicher Lichtleistung (61, 62, 64, 65, 67, 68) verbunden sind und über denselben Strahlengang (21 , 22, 23) beleuchtet werden, so angeordnet sind, dass aus diesen Strahlführungsmitteln (71, 72, 74, 75, 77, 78) austretende Teillichtbündel (81 - 89) in der Pupillenebene (80) bezüglich des zentralen Bereichs einander gegenüberliegen.
12. Optikanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 11,
dadurch gekennzeichnet,
dass die optischen Fasern der ersten und der zweiten Gruppe (30, 31 - 33, 70, 71 - 79) polarisationserhaltend sind und so angeordnet sind, dass eine
Polarisationsrichtung von Teillichtbündeln (81 - 89), die aus den optischen Fasern der zweiten Gruppe (70, 71 - 79) austreten, senkrecht zu einer Verbindungsgeraden steht, welche in der Pupillenebene (80) zwei Teillichtbündel (81
- 89) desselben Strahlengangs (21 - 23) verbindet.
13. Optikanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 12,
dadurch gekennzeichnet,
dass Thermo-Phasenschieber zum Phasenschieben einer strukturierten Beleuchtung, die durch eines der Lichtfleckmuster erzeugbar ist, vorhanden sind, dass ein Thermo-Phasenschieber Mitte! zur Temperaturbeeinflussung der optischen Fasern der zweiten Gruppe (70, 71 - 79) und/oder der Lichtleitpfade (41 -49) des Wellenleiterchips (50) aufweist, wobei die optischen Fasern der zweiten Gruppe (70, 71 - 79) und/oder die Lichtleitpfade (41 - 49) des Wellenleiterchips (50) temperaturabhängige Brechzahlen aufweisen.
14. Optikanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 13,
dadurch gekennzeichnet,
dass die optischen Fasern der zweiten Gruppe (70, 71 - 79) und/oder die Lichtleitpfade (41 -49) des Wellenleiterchips (50) Manipulationsbereiche aufweisen, in denen eine Brechzahl spannungsabhängig ist,
dass benachbart zu den Manipulationsbereichen elektrooptische Modulatoren vorhanden sind, weiche die Brechzahl im benachbarten Bereich durch eine einstellbare Spannung vorgeben, und
dass elektronische Steuerungsmittel vorhanden und dazu eingerichtet sind, die Brechzahlen in den Manipulationsbereichen über die elektrooptischen Modulatoren zu variieren zum Phasenschieben einer strukturierten Beleuchtung, die durch eines der Lichtfleckmuster erzeugt wird.
15. Optikanordnung nach Anspruch 13 oder 14,
dadurch gekennzeichnet,
dass die elektronischen Steuerungsmittel dazu eingerichtet sind, zur Reduzierung einer Messunterbrechungszeit ein Phasenschieben für die Teillichtbündel (81 - 89) von einem der Strahlengänge (21, 22) durchzuführen, während ein anderer der Strahlengänge (23) über die Umlenkmittel (20) ausgewählt ist.
16. Optikanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 15,
dadurch gekennzeichnet,
dass eine akustooptische Vorrichtung (18) vor den verstellbaren Umlenkmitteln (20) vorhanden ist und
dass elektronische Steuerungsmittel vorhanden und dazu eingerichtet sind, mit der akustooptischen Vorrichtung (18) eine Leistung eines Lichtbündels (15) abhängig davon zu variieren, auf welchen der Strahlengänge (21 - 23) das Lichtbündel (15) geleitet wird.
17. Optikanordnung nach Anspruch 16,
dadurch gekennzeichnet,
dass die elektronischen Steuerungsmittel dazu eingerichtet sind, die akustooptische Vorrichtung (18) so anzusteuern, dass in der Pupillenebene (80) die Lichtfleckmuster verschiedener Strahlengänge (21 - 23) eine gleiche Lichtleis- tung aufweisen.
18. Optikanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 17,
dadurch gekennzeichnet,
dass zum Ändern einer Orientierung der strukturierten Beleuchtung, die mit einem der Lichtfleckmuster bereitgestellt wird, im Strahlengang hinter den Strahlführungsmitteln (70, 71 - 79) ein Bildfelddreher vorhanden ist und dass eine Stelleinrichtung zum Drehen des Bildfelddrehers vorhanden ist.
19. Optikanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 18,
dadurch gekennzeichnet,
dass im Strahlengang hinter den Strahlführungsmitteln (70, 71 - 79) eine Zoomoptik (91) vorhanden ist für eine variable Anpassung zwischen einem Lichtleitwert eines Objektivs (65) und einem Lichtleitwert der Lichtfleckmuster in der Pupillenebene (80).
20. Lichtmikroskop
mit mindestens einer Lichtquelle (10) zum Aussenden eines Lichtbündels (15), dadurch gekennzeichnet,
dass eine Optikanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 19 vorhanden und so anordenbar ist, dass Lichtbündel (15) der Lichtquelle (10) zu den verstellbaren Umlenkmitteln (20) leitbar sind.
21. Lichtmikroskop nach Anspruch 20,
dadurch gekennzeichnet,
dass ein Objektiv (95) vorhanden ist zum Leiten von Licht (16), das von der Optikanordnung ausgegeben wird, und
dass die Pupillenebene (80) der Optikanordnung optisch konjugiert zu einer Pupillenebene des Objektivs (95) ist.
22. Lichtmikroskop nach Anspruch 20 oder 21 ,
dadurch gekennzeichnet,
dass eine Probenebene (90) vorhanden ist, in welcher eine zu untersuchende Probe (92) positionierbar ist,
dass mit dem Objektiv (95) Detektionslicht (17), das von der Probe (92) kommt, in Richtung einer Detektoreinrichtung (96) leitbar ist,
dass mit dem Objektiv (95) Licht (16), das von der Optikanordnung kommt, so in die Probenebene (90) führbar ist, dass eine Lichtintensitätsverteilung in der Probenebene (90) durch eine Fouriertransformation mit der Lichtintensitätsverteilung in der Pupillenebene (80) der Optikanordnung zusammenhängt.
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