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WO2014046183A1 - 定量方法、定量装置及び定量用キット - Google Patents

定量方法、定量装置及び定量用キット Download PDF

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WO2014046183A1
WO2014046183A1 PCT/JP2013/075304 JP2013075304W WO2014046183A1 WO 2014046183 A1 WO2014046183 A1 WO 2014046183A1 JP 2013075304 W JP2013075304 W JP 2013075304W WO 2014046183 A1 WO2014046183 A1 WO 2014046183A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sample
measured
amount
calibration curve
measurement
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2013/075304
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English (en)
French (fr)
Inventor
悟史 八幡
宏光 八谷
章夫 黒田
野田　健一
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hiroshima University NUC
DKK TOA Corp
Original Assignee
Hiroshima University NUC
DKK TOA Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hiroshima University NUC, DKK TOA Corp filed Critical Hiroshima University NUC
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Priority to CN201380048822.0A priority patent/CN104781673A/zh
Priority to US14/429,784 priority patent/US20150225768A1/en
Priority to IN2992DEN2015 priority patent/IN2015DN02992A/en
Publication of WO2014046183A1 publication Critical patent/WO2014046183A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/008—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions for determining co-enzymes or co-factors, e.g. NAD, ATP
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/579—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving limulus lysate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • G01N2400/12—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar
    • G01N2400/24—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar beta-D-Glucans, i.e. having beta 1,n (n=3,4,6) linkages between saccharide units, e.g. xanthan
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • G01N2400/50—Lipopolysaccharides; LPS

Definitions

  • the present invention provides a reaction for activating a Limulus reagent and / or a biochemiluminescence reaction by ATP, luciferin or a luciferin derivative (hereinafter simply referred to as “luciferin”) and a luciferase or a luciferase mutant (hereinafter simply referred to as “luciferase”).
  • luciferin a luciferin derivative
  • luciferase or a luciferase mutant hereinafter simply referred to as “luciferase”.
  • the present invention relates to a quantification method, a quantification device, and a quantification kit for measuring the amount of a measurement target component in a sample to be measured.
  • ATP adenosine triphosphate
  • Patent Document 1 As a method for measuring the amount of ATP, there is a biochemiluminescence method that uses a biochemiluminescence reaction with ATP, luciferin, and luciferase (Patent Document 1).
  • luciferase and luciferin are allowed to act as the luminescence reagent, and luminescence by biochemiluminescence reaction is performed.
  • the amount is measured with a luminescence detector.
  • the amount of ATP is measured using the correlation between the amount of luminescence and the amount of ATP, and viable bacteria and the like are quantified from the amount of ATP.
  • the amount of ATP is measured by a biochemiluminescence method.
  • the measurement of the endotoxin amount by the gelation overturning method and the turbidimetric method determines or measures the endotoxin amount by utilizing a reaction in which the sample gels by activating the Limulus reagent by the endotoxin.
  • the endotoxin level is measured by a colorimetric method using a chromogenic substrate that liberates a chromophore by the activation of the Limulus reagent by endotoxin, and the amount of liberated chromophore is determined colorimetrically by measuring the absorbance or amount of transmitted light. .
  • the amount of endotoxin is measured by utilizing the fact that the amount of the liberated chromophore is correlated with the amount of endotoxin.
  • Measurement of endotoxin by biochemiluminescence method uses a luminescent synthetic substrate that liberates luciferin by activation of the Limulus reagent by endotoxin, and the released luciferin is measured according to the above-mentioned principle of measuring ATP by biochemiluminescence reaction. Use and measure. That is, ATP and luciferase are allowed to act on luciferin liberated by the Limulus reaction system to measure the amount of luminescence by biochemiluminescence reaction. And the amount of endotoxins is measured using the fact that the amount of luminescence correlates with the amount of endotoxins.
  • ⁇ -glucan has been conventionally measured in fields such as medicine, pharmaceuticals, clinical examinations, and the food industry. For example, it is important to measure the amount of ⁇ -glucan in order to select a treatment method for a patient suspected of deep mycosis or to determine a therapeutic effect.
  • a method for measuring the amount of ⁇ -glucan there is a Limulus test using a gelation overturning method, a turbidimetric method, a colorimetric method, and a biochemiluminescence method as in the case of measuring the endotoxin amount (Patent Document 3). Each method is different from the measurement of endotoxin amount in that the Limulus reaction system uses a process activated by ⁇ -glucan, but each measurement principle is almost the same as the measurement of endotoxin amount. It is.
  • the various methods described above have been widely used in the past, but the measurement accuracy may be reduced due to interference components in the sample.
  • the sample is a dialysate or blood
  • the amount of ATP, endotoxin or ⁇ -glucan is measured by the various methods described above
  • the reaction necessary for the measurement is inhibited by sodium ions which are interfering components in the sample.
  • the measurement target component in the sample is quantified using a calibration curve prepared using a standard solution prepared by adding a known amount (concentration) of the measurement target component (ATP, endotoxin or ⁇ -glucan) to pure water.
  • the measurement result is lower than the actual measurement (FIG. 7).
  • the biochemiluminescence reaction by ATP, luciferin and luciferase is inhibited by sodium ions. Therefore, measurement of ATP amount, endotoxin amount, and ⁇ -glucan amount using biochemiluminescence reaction is hindered by sodium ions.
  • the sample may be sufficiently diluted to suppress the influence of interference components, but there is a problem that the sensitivity is lowered due to dilution of the sample.
  • an object of the present invention is to provide a quantification method and a quantification apparatus capable of performing highly sensitive and highly accurate measurement on samples containing sodium ions, such as biological samples, pharmaceuticals, and foods.
  • Another object of the present invention is to use the same single calibration curve for both a sample containing sodium ions and a sample containing substantially no sodium ions such as water or a lower content. It is to provide a quantitative device capable of performing highly sensitive and highly accurate measurement, and a quantitative kit that can be used in the above quantitative method and quantitative device.
  • a standard solution to which sodium ions are added so that the sodium ion content is equivalent to the sodium ion content of a sample to be measured is used as a reaction for activating the Limulus reagent and / or
  • the second aspect of the present invention provides a standard solution to which sodium ions are added so that the sodium ion content is equivalent to the sodium ion content of the sample to be measured, a reaction for activating the Limulus reagent and / or ATP, luciferin and luciferase. Same as the method used in the calibration curve creation step, and the calibration curve creation step for creating a calibration curve representing the relationship between the measured value and the amount of the component to be measured.
  • the third aspect of the present invention is a method for quantifying the amount of a measurement target component in a sample to be measured by a method using a reaction for activating a Limulus reagent and / or a biochemiluminescence reaction by ATP, luciferin and luciferase, or Quantitative kit for preparing a calibration curve for use in quantification, comprising a sodium ion source for supplying a predetermined amount of sodium ions to the sample to be measured or the standard solution for preparing the calibration curve It is.
  • highly sensitive and highly accurate measurement can be performed on samples containing sodium ions, such as biological samples, pharmaceuticals, and foods.
  • samples containing sodium ions such as biological samples, pharmaceuticals, and foods.
  • both the sample containing sodium ions and the sample containing substantially no sodium ions such as water or a lower content can be obtained with the same sensitivity using the same calibration curve. Highly accurate measurement can be performed.
  • Quantitation method includes the following steps.
  • A a standard solution to which sodium ions are added so that the sodium ion content is equivalent to the sodium ion content of the sample to be measured, a reaction that activates the Limulus reagent and / or biochemistry by ATP, luciferin, and luciferase
  • a calibration curve creation step of creating a calibration curve measured by a method using a luminescence reaction and representing the relationship between the measured value and the amount of the measurement target component.
  • B A sample measurement step for measuring the sample to be measured by the same method as used in the calibration curve creation step.
  • C A quantification step for obtaining the amount of the measurement target component in the sample to be measured from the measurement value in the sample measurement step using a calibration curve.
  • the component to be measured differs depending on the method used in the calibration curve preparation step (a) and the sample measurement step (b).
  • a method using a reaction that activates the Limulus reagent endotoxin or ⁇ -glucan is used.
  • ATP can be mentioned when measuring by the method using the biochemiluminescence reaction by ATP, luciferin, and luciferase.
  • luciferin and luciferase endotoxin or ⁇ -glucan can be mentioned.
  • ATP when used as a measurement target component, it may include a case where ATP is extracted from live bacteria and measured for the final purpose of quantifying live bacteria in the sample to be measured.
  • the number of viable cells after measuring the amount of ATP by the above process, can be determined from a calibration curve representing the relationship between the final number of viable cells for quantitative purposes and the amount of ATP.
  • the calibration curve obtained in (a) and the calibration curve representing the relationship between the viable cell count and the ATP content the relational expression between the luminescence amount and the viable cell count is created, and the viable cell count is obtained. You can also.
  • ATP in cells such as viable bacteria can be extracted using an ATP extraction reagent.
  • Measurement of endotoxin amount by a method using a reaction that activates Limulus reagent (hereinafter also referred to as “measurement of endotoxin amount by Limulus reagent”).
  • Limulus Amebocyte Lysate (LAL) contained in the Limulus reagent, there is a Factor C Limulus reaction system that is a chain reaction system initiated by endotoxin.
  • Endotoxin activates factor C.
  • the activated factor C activates factor B in the Limulus reaction system.
  • the activated factor B activates the clotting enzyme precursor of the Limulus reaction system to generate a clotting enzyme. Gelation occurs due to the action of the generated clotting enzyme.
  • Measurement of endotoxin amount using Limulus reagent is based on the above-described process, and can be performed by measuring the state of a gelled sample (gelation overturning method) or measuring turbidity (turbidimetric method). .
  • the amount of endotoxin can be measured by adding a chromogenic synthetic substrate to the reaction system to liberate the chromogenic group and measuring the amount by absorbance or transmitted light amount (colorimetric method).
  • Measurement of ⁇ -glucan amount by a method using a reaction that activates Limulus reagent (hereinafter also referred to as “measurement of ⁇ -glucan amount by Limulus reagent”)
  • a reaction that activates Limulus reagent hereinafter also referred to as “measurement of ⁇ -glucan amount by Limulus reagent”
  • ⁇ -glucan activates factor G.
  • the activated factor G activates the clotting enzyme precursor of the Limulus reaction system to generate a clotting enzyme. Gelation occurs due to the action of the generated clotting enzyme.
  • ⁇ -glucan is measured by the gelation overturning method, turbidimetric method, or colorimetric method. be able to.
  • Measurement of ATP content by a method using a biochemiluminescence reaction with ATP, luciferin and luciferase (hereinafter also referred to as “measurement of ATP content by biochemiluminescence method”).
  • ATP reacts with luciferin by the action of luciferase in the presence of Mg 2+ (divalent metal ion) to produce AMP, oxyluciferin and pyrophosphate. Since the light emission amount generated at that time correlates with the ATP amount, the ATP amount can be measured using this.
  • Measurement of endotoxin amount by a method using a reaction that activates the Limulus reagent and a biochemiluminescence reaction of ATP, luciferin, and luciferase (hereinafter also referred to as “measurement of endotoxin amount by biochemiluminescence method”).
  • the measurement of the amount of endotoxin by the biochemiluminescence method applies the measurement of the ATP amount by the biochemiluminescence method described in (3) to the same Limulus reaction system process as described in (1).
  • a luminescent synthetic substrate containing luciferin which is a luminescent substrate, is added to the Limulus reaction system, and luciferin is released by activating the Limulus reaction system with endotoxin.
  • ATP and luciferase are allowed to act on the liberated luciferin to measure the amount of light emitted by the biochemiluminescence reaction.
  • the amount of luminescence correlates with the amount of luciferin released (the degree of activation of the Limulus reaction system), and as a result, the amount of endotoxin can be measured.
  • Measurement of ⁇ -glucan amount by a method using a reaction that activates the Limulus reagent and a biochemiluminescence reaction between ATP, luciferin, and luciferase (hereinafter also referred to as “measurement of ⁇ -glucan amount by biochemiluminescence method”).
  • the measurement of the amount of ⁇ -glucan by the biochemiluminescence method applies the measurement of the amount of ATP by the biochemiluminescence method to the process of the Limulus reaction system, as in (4).
  • a luminescence synthetic substrate containing luciferin is added to the Limulus reaction system, luciferin is released by activation of the Limulus reaction system with ⁇ -glucan, and the amount of ⁇ -glucan is measured by measuring the amount of luminescence by biochemiluminescence reaction.
  • the quantification method measures a standard solution to which sodium ions are added so that the sodium ion content is equivalent to the sodium ion content of the sample to be measured in the calibration curve creation step of (a).
  • a calibration curve is created based on the measured values.
  • the standard solution has a desired content (concentration) step size so that a desired measurement accuracy can be obtained according to the amount of the measurement target component in the sample to be measured. Prepare over the desired content (concentration) range.
  • the measurement in the calibration curve preparation step (a) is substantially the same as the measurement in the sample measurement step (b) (content (concentration) of each component of the reaction system excluding the measurement target component), Reaction temperature, reaction time, etc.) are preferable. By aligning the conditions, higher sensitivity and higher accuracy can be measured.
  • Samples to be measured include drugs used in the medical field such as injections, infusions or dialysis solutions, drugs for external use such as eye drops, various internal medicines, water (normal water, RO water, purified water, sterilized purified water, sterilized) Water, water for injection (distilled water for injection), pure water, ultrapure water, reverse osmosis water, etc.), collected from medical devices and equipment, collected from clean room, blood (whole blood, serum, plasma) or Biological samples (clinical samples) such as urine.
  • Various samples in food processing, food hygiene, and environmental fields can also be used as samples to be measured.
  • the sodium ion content of the sample to be measured is an amount equivalent to a level at which the influence of sodium ions on the measurement result can be suppressed according to the desired measurement accuracy.
  • the sodium content of the standard solution with respect to the sample to be measured is in the range of ⁇ 50% to + 75%, the influence of sodium ions on the measurement result is suppressed. can do.
  • it is within the range of ⁇ 15% to + 25%, more preferably ⁇ 5% to + 10%.
  • the samples containing sodium ions such as dialysate and blood have the same sodium ion content.
  • the significance of the equivalent sodium ion content is the same as described above.
  • the sodium ion content is the same, such as dialysate and blood, high-sensitivity and high-accuracy measurement can be performed with the same calibration curve even for different types of samples.
  • sodium ions are preferably added to the standard solution or sample to be measured by adding sodium chloride (NaCl).
  • adding sodium ions to a standard solution or a sample to be measured is not limited to charging or injecting a sodium ion source such as NaCl as a dry drug or solution into the standard solution or sample.
  • a standard solution or a sample to be measured may be injected into a container in which a sodium ion source such as NaCl is stored as a dry drug or solution.
  • reagents for example, buffer solution, luciferin, luciferase, ATP, divalent metal ion, luminescent synthetic substrate, or color development
  • a sodium ion source such as NaCl
  • sodium ions are added to the standard solution or sample to be measured so that a predetermined amount of sodium ions is obtained by introducing or injecting the reagent.
  • the method may be used.
  • FIG. 1 shows a schematic functional block of one embodiment of a quantitative device according to the present invention.
  • the quantitative device 100 includes a measurement unit 101 that performs measurement, a control unit 102 that controls measurement operation, a storage unit 103 that stores information, and an input unit that inputs information to the control unit 102. 104, and an output unit 105 that outputs information from the control unit 102.
  • the measurement unit 101 is configured according to the method used in the calibration curve creation step (a) and the sample measurement step (b) described above.
  • the measuring unit 101 includes a reaction vessel, a luminescence detector, and a test liquid (sample to be measured, standard solution) supply means. , Reagent supply means and the like.
  • the measuring unit 101 includes a reaction container, an absorptiometer (transmitted light measuring device), It can be composed of a test solution supply means, a reagent supply means and the like.
  • the control unit 102 may control the operation of the quantitative device 100 in an integrated manner, and in accordance with the instruction information from the input unit 104, the control unit 102 controls the measurement unit 101 according to the program stored in the storage unit 103 and various setting information. It can be configured by a microcomputer or the like so as to perform sequence control, process measurement results by the measurement unit 101, and output measurement result information to the output unit 105.
  • the storage unit 103 can be configured by an electronic memory or the like so as to store various information such as a control program used by the control unit 102, various setting information, and measurement result information obtained by the control unit 102.
  • the input unit 104 is configured by an operation unit having input keys and the like provided in the quantitative device 100 for inputting various types of information such as various setting information and measurement start / stop instruction information to the control unit 102. Can do.
  • the input unit 104 may be an interface unit that receives information similar to the above from an external device of the quantitative device 100 and transmits it to the control unit 102.
  • the output unit 105 can be configured by a display unit such as a liquid crystal display that displays various setting information and measurement result information, or a printer unit that prints out similar information.
  • the output unit 105 may be an interface unit that receives the same information from the control unit 102 and transmits the same information to an external device of the quantitative device 100.
  • a calibration curve is prepared in the following manner prior to quantification of endotoxin (component to be measured) in dialysate and RO water (sample to be measured).
  • Sodium ions are added to each of two or more standard solutions having different endotoxin amounts so that the sodium ion content of the standard solution is equivalent to the sodium ion content of the dialysate. Specifically, since the sodium ion contained in the dialysate is about 140 mmol / L, sodium ions are added so that the sodium ion concentration of each standard solution is 140 mmol / L.
  • each standard solution is measured by measuring the endotoxin amount using the aforementioned Limulus reagent or by measuring the endotoxin amount using a biochemiluminescence method, and a calibration curve is created.
  • control unit 102 causes the measurement unit 101 to perform the measurement for the standard solution according to the control program and various setting information stored in the storage unit 103, creates a calibration curve from the acquired measurement result, and stores the storage unit 103.
  • This calibration curve is used for quantifying the measurement target component in the sample to be measured.
  • sample measurement process The measurement method and conditions are the same as those in the calibration curve creation step described above, and the dialysate and RO water are measured.
  • control unit 102 causes the measurement to be performed on the sample to be measured according to the control program and various setting information stored in the storage unit 103.
  • Information of the measurement result acquired by the measurement unit 101 is stored in the storage unit 103 and used for quantification of the measurement target component in the sample to be measured.
  • information on whether or not the sample to be measured should be measured after adding sodium ions can be given to the apparatus by operator input.
  • the introduction sequence of a plurality of samples to be measured and the presence / absence of sodium ion addition can be set in advance as an operation sequence.
  • a sodium ion measuring means for example, an ion electrode or a conductivity meter
  • the necessity of adding sodium ions and the amount of sodium ions to be added are automatically determined according to the measured values. It is also possible to make a determination automatically according to a signal from the outside (for example, a signal from an ion concentration meter or a conductivity meter provided separately from the quantitative device).
  • the sample to be measured is not limited to two types, and three or more samples can be measured by controlling the addition of sodium ions.
  • the intermediate product sodium Create a calibration curve for the calibration curve creation process based on the ion content, and measure the finished product and raw materials by adding sodium ions so that they are equivalent to the sodium ion content of the intermediate product. Good. Also, create a calibration curve for the calibration curve creation process based on the sodium ion content of the finished product, and measure the finished product and intermediate products without adding sodium ions. Can be measured by adding sodium ions so as to be equivalent to the sodium ion content of the finished product.
  • the sample to be measured may be a plurality of samples having different sodium ion contents.
  • a calibration curve can be created by measuring a standard solution to which sodium ions are added so as to be equivalent to the sodium ion content of an arbitrary sample among a plurality of samples.
  • the sample measurement step the sample is measured without adding sodium ions to the arbitrary sample and a sample having a sodium ion content equal to or higher than the arbitrary sample.
  • sodium ions are added to a sample having a sodium ion content less than that of the above arbitrary sample so as to be equivalent to the sodium ion content of the above arbitrary sample, and then the sample is measured.
  • Quantification kit The quantification kit according to the present invention will be described.
  • the quantitative kit according to the present invention can be suitably used for the above-described quantitative method or quantitative device. That is, when quantifying the amount of a measurement target component in a sample to be measured by a method using a reaction that activates the Limulus reagent and / or a biochemiluminescence reaction between ATP, luciferin, and luciferase, or a calibration used for the determination When creating a line, it has a sodium ion source that supplies a predetermined amount of sodium ions to a sample to be measured or a standard solution for creating a calibration curve.
  • the quantification kit uses the same calibration curve for the dialysate and the RO water.
  • a sodium ion source for supplying sodium ions to the standard solution and RO water so that the sodium ion content is equivalent to the sodium ion content of the dialysate so that it can be measured using It is set as the structure which has.
  • the sodium ion concentration of the dialysate is about 140 mmol / L, and the standard solution and RO water hardly contain sodium ions. Therefore, if the amount of the standard solution or RO water used for the measurement using the quantification kit is always constant, the predetermined amount of sodium ions to be supplied by the quantification kit may always be constant. The amount can be easily calculated. That is, the sodium ion supply amount of the quantification kit can be appropriately determined according to the sodium ion concentration of the sample to be measured and the amount of liquid used for the measurement using the quantification kit.
  • the kit for quantification according to the present invention can be used particularly suitably when the sample to be measured is a biological sample such as blood, or when it is an injection, infusion solution, dialysate, eye drops, physiological saline or the like. This is because these sodium ion concentrations are almost constant, and a quantitative kit capable of supplying the amount of sodium ions determined from the concentration can be mass-produced and used.
  • the sodium ion source of the quantification kit has a sodium ion concentration of 135 to 155 m in a sample to be measured or a standard solution for preparing a calibration curve. It is preferable to supply sodium ions so as to be mol / L.
  • the determination kit 10 may have a first container 1 in which NaCl is stored as a dry ion or solution as a sodium ion source.
  • the first container 1 may further contain a pH buffering agent as a dry drug or a solution (buffer).
  • the first container 1 can be filled with a standard solution or a sample such as water that does not contain sodium ions or has a lower content.
  • the determination kit 10 may further include a second container 2 that does not contain a sodium ion source.
  • the second container 2 may further contain a pH buffering agent as a dry drug or a solution (buffer).
  • a sample such as dialysate containing sodium ions can be injected into the second container 2.
  • the sodium ion concentration of the contents of the first container 1 and the second container 2 into which the sample or standard solution has been injected is set to be equal. And it measures using the sample and standard solution in this 1st container 1 and the 2nd container 2.
  • ATP-containing liquids containing ATP diluted to different concentrations were prepared using water, dialysate, and NaCl aqueous solution as solvents, respectively, and for each ATP-containing liquid, the ATP concentration and the amount of luminescence by biochemiluminescence reaction were determined. Sought the relationship.
  • ATP standard solution is roughly a solution of 1 ⁇ 10 ⁇ 7 M ATP dissolved in 0.025 M HEPES buffer.
  • water for injection Otsuka Pharmaceutical Otsuka distilled water
  • luciferin and luciferase mutant a luminescence reagent containing these (luciferase FM + manufactured by Bio-Enex) was used.
  • kindly 3D (manufactured by Fuso Pharmaceutical Co., Ltd.) was used as the dialysis agent.
  • Kindally 3D is composed of an A-1 agent in which the A agent of the dialysate is an electrolyte component and an A-2 that is a glucose (non-electrolyte) component.
  • the dialysis solution was prepared by dissolving the A and B agents of kinda 3D using water for injection according to the prescription.
  • the sodium ion concentration of this kindery 3D is 140 mmol / L (140 mEq / L).
  • the NaCl aqueous solution was prepared by dissolving NaCl in water for injection to a concentration of 140 mmol / L (140 mEq / L). That is, the sodium ion concentration of this NaCl aqueous solution is equal to the sodium ion concentration of the dialysate.
  • the ATP-containing solution is prepared by diluting the above ATP standard solution with water for injection, dialysate, or aqueous NaCl solution to obtain 1 ⁇ 10 ⁇ 14 , 1 ⁇ 10 ⁇ 13 , 1 ⁇ 10 ⁇ 12 , 1 ⁇ 10 ⁇ 11 , 1 ⁇
  • the concentration was adjusted to 10 ⁇ 10 , 1 ⁇ 10 ⁇ 9 and 1 ⁇ 10 ⁇ 8 .
  • each ATP-containing solution is transferred to a reaction container, and 100 ⁇ L of a luminescent reagent is added to each reaction container and mixed. Thereafter, the amount of luminescence of the reaction solution was measured using a luminescence detector (a weak luminescence counter manufactured by Hamamatsu Photonics).
  • a luminescence detector a weak luminescence counter manufactured by Hamamatsu Photonics.
  • the results are shown in FIG.
  • the horizontal axis in FIG. 3 is the ATP concentration (mol / L) of the ATP-containing liquid, and the vertical axis is the light emission amount (emission intensity: RLU).
  • the relationship between the ATP concentration and the amount of luminescence is greatly different from that when dialysate is used as the solvent.
  • the amount of luminescence at each ATP concentration is lower when the dialysate is used than when water is used as the solvent. Therefore, if the amount of ATP in the dialysate is quantified using a calibration curve prepared using a standard solution prepared by simply adding ATP at a known concentration to water, a measurement result having a concentration lower than the actual concentration is obtained.
  • ATP can be measured with high sensitivity and high accuracy using the same calibration curve as in the case of dialysate.
  • endotoxin-containing solutions containing endotoxins diluted to different contents are prepared using water, dialysate, and NaCl aqueous solution as solvents, respectively, and the endotoxin amount and the amount of luminescence by biochemiluminescence reaction for each endotoxin-containing solution. Sought a relationship with.
  • Carbostar P is a dialysis fluid that is made into one agent.
  • the dialysate was prepared by dissolving each of Kindery 3D and Carbon Star P using water for injection according to the prescription.
  • the sodium ion concentration of the solution of this kindery 3D and carbonster P is 140 mmol / L (140 mEq / L), respectively.
  • the NaCl aqueous solution was prepared by dissolving NaCl in water for injection to a concentration of 140 mmol / L (140 mEq / L). That is, the sodium ion concentration of this NaCl aqueous solution is equal to the sodium ion concentration of the dialysate.
  • An endotoxin-containing solution is prepared by dissolving an endotoxin standard substance in water for injection and preparing a content of 1000 EU / mL, and diluting this stock solution with water for injection, dialysate, and aqueous NaCl solution to obtain 0.001 , 0.01, 0.1, and 1 EU / mL.
  • the Limulus reagent was prepared using 200 ⁇ L of water for injection.
  • the results are shown in FIG.
  • the horizontal axis of FIG. 4 is the endotoxin amount (EU / mL) of the endotoxin-containing solution, and the vertical axis is the luminescence amount (luminescence intensity: RLU).
  • the relationship between the amount of endotoxin and the amount of luminescence is greatly different from that when dialysate is used as the solvent.
  • the amount of luminescence at each endotoxin amount is lower when the dialysate is used than when water is used as the solvent. Therefore, when the endotoxin amount in the dialysate is quantified using a calibration curve prepared using a standard solution prepared by simply adding a known amount of endotoxin to water, a measurement result lower than the actual result is obtained.
  • the sample is, for example, water not containing sodium ions
  • NaCl is added so as to contain sodium ions at a concentration equal to that of the standard solution (that is, equal to the dialysate). It can also be seen that endotoxin can be measured with high sensitivity and high accuracy using the same calibration curve as in the case of dialysate.
  • endotoxin-containing solutions containing endotoxins diluted to different contents were prepared using water, dialysate, and NaCl aqueous solution as solvents, respectively, and for each endotoxin-containing solution, the endotoxin amount and the reaction time by the turbidimetric method were determined. The relationship with the measured value was obtained.
  • Example 2 The same thing as Example 2 was used as a Limulus reagent (LAL) and an endotoxin standard substance. Further, the same water as in Example 2 was used. Further, as the dialysis agent, the same kindery 3D as in Example 1 was used.
  • LAL Limulus reagent
  • An endotoxin-containing solution is prepared by dissolving an endotoxin standard substance in water for injection and preparing a content of 1000 EU / mL, and diluting this stock solution with water for injection, dialysate, and aqueous NaCl solution to obtain 0.00125. , 0.0025, 0.005, and 0.01 EU / mL.
  • each endotoxin-containing solution is transferred to a reaction vessel containing a Limulus reagent, and the amount of transmitted light with respect to the reaction solution is measured using a measuring device (ET-6000 manufactured by Wako Pure Chemical Industries). The reaction time until the decrease was measured.
  • a measuring device E-6000 manufactured by Wako Pure Chemical Industries
  • the results are shown in FIG.
  • the horizontal axis in FIG. 5 is the endotoxin amount (log (EU / mL)) of the endotoxin-containing solution, and the vertical axis is the reaction time (log (min)).
  • the relationship between the amount of endotoxin and the reaction time is significantly different from that when dialysate is used as the solvent.
  • the reaction time for each endotoxin amount is longer when the dialysate is used than when water is used as the solvent. Therefore, when the endotoxin amount in the dialysate is quantified using a calibration curve prepared using a standard solution prepared by simply adding a known amount of endotoxin to water, a measurement result lower than the actual result is obtained.
  • the relationship between the endotoxin amount and the reaction time approaches that when a dialysate is used as a solvent. Therefore, by using a calibration curve prepared using a standard solution prepared by adding a known amount of endotoxin to a NaCl aqueous solution containing sodium ions at a concentration equal to that of the dialysate, the endotoxin amount in the dialysate can be more accurately determined. It can be seen that it can be measured. It can also be seen that the sample can be measured with high sensitivity because it is not necessary to dilute the sample to suppress the influence of sodium ions.
  • the sample is, for example, water not containing sodium ions
  • NaCl is added so as to contain sodium ions at a concentration equal to that of the standard solution (that is, equal to the dialysate). It can also be seen that endotoxin can be measured with high sensitivity and high accuracy using the same calibration curve as in the case of dialysate.
  • Table 1 shows the relationship when water was used as the solvent shown in FIG. 5 as a calibration curve (water calibration curve) for the sample in which a known amount of endotoxin was added to the dialysate, the reaction time by the turbidimetric method was measured according to the above procedure ) Shows the result of calculating the recovery rate when using the relationship (NaCl) when an aqueous NaCl solution is used as the solvent.
  • the recovery rate was -20% to -30%, indicating that sodium ions inhibited the activation of the Limulus reaction system.
  • the recovery rate is in the range of ⁇ 10%, indicating that high-precision measurement is possible.
  • a calibration curve used for measuring the amount of endotoxin by the biochemiluminescence method was prepared using a NaCl aqueous solution having a sodium ion concentration of 140 mmol / L, and was measured by the biochemiluminescence method.
  • an endotoxin-containing solution of 0.01 EU / mL was prepared using a NaCl aqueous solution in which the sodium ion concentration was changed in the range of ⁇ 75% to + 100% with reference to 140 mmol / L.
  • Each of the 0.01 EU / mL endotoxin-containing solutions having different sodium ion concentrations was measured by the biochemiluminescence method, and the endotoxin content was calculated using the calibration curve.
  • FIG. FIG. 6 shows the deviation (%) from the reference value of the sodium ion concentration of the standard solution when the calibration curve used for the calculation is plotted on the horizontal axis, and the endotoxin content calculated using each calibration curve on the vertical axis. .
  • any sample containing sodium ions such as dialysate
  • water such as pharmaceutical raw material water

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Description

定量方法、定量装置及び定量用キット
　本発明は、リムルス試薬を活性化する反応及び／又はＡＴＰとルシフェリン若しくはルシフェリン誘導体（以下単に「ルシフェリン」という。）とルシフェラーゼ若しくはルシフェラーゼ変異体（以下単に「ルシフェラーゼ」という。）とによる生物化学発光反応を用いて被測定試料中の測定対象成分の量を測定する定量方法、定量装置及び定量キットに関するものである。
　従来、食品衛生、医療、医薬品、臨床検査、環境など幅広い分野において、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）量を測定することが行われている。ＡＴＰはすべての生物の細胞内に含まれ、ＡＴＰ量は細胞数と相関があるため、ＡＴＰ量を測定することで細胞数や生菌等の定量を行うことができる。
　ＡＴＰ量を測定する方法としては、ＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応を用いて測定する生物化学発光法がある（特許文献１）。
　この生物化学発光法により生菌等を定量するためには、その細胞中のＡＴＰをＡＴＰ抽出試薬を用いて抽出した後、発光試薬としてルシフェラーゼとルシフェリンとを作用させて、生物化学発光反応による発光量を発光検出器により測定する。そして、この発光量がＡＴＰ量と相関することを利用してＡＴＰ量を測定し、そのＡＴＰ量から生菌等を定量する。生化学研究の分野などにおいて、試料中のＡＴＰ量自体を測定の目的とする場合にも、生物化学発光法によるＡＴＰ量の測定が行われる。
　また、従来、医療、医薬品、臨床検査などの分野において、生体試料（血液、尿、体液、組織、付着物その他の生体から採取した試料）、或いは医薬品（本明細書では医薬部外品を含む概念とする。）又はその原材料（本明細書では原材料そのものの他、溶媒、中間生成物等を含む概念とする。）に含まれるエンドトキシン量を測定することや医療用具（注射器、透析膜等）の製造においてエンドトキシンが混入していないことを確認することなどが行われている。エンドトキシンが体内に入ると、発熱、ショック、多臓器不全などを引き起こしたりする。そのため、生体試料中のエンドトキシン量を測定してこれらの診断をすること、又は上記医薬品やその原材料などに含まれるエンドトキシン量、或いはそれらの製造工程や医療用具の製造工程におけるエンドトキシン量を測定して、エンドトキシンが体内に注入されることを未然に防ぐことは重要である。
　エンドトキシン量を測定する方法としては、カブトガニの血球抽出液（以下、「リムルス試薬」という。）の成分であるリムルス反応系がエンドトキシンにより活性化されるプロセスを利用したリムルステストがある（特許文献２）。そして、このリムルステストには、判定又は測定方法の違いから、ゲル化転倒法、比濁法、比色法、生物化学発光法がある。
　ゲル化転倒法及び比濁法によるエンドトキシン量の測定は、エンドトキシンによりリムルス試薬が活性化されることで試料がゲル化する反応を利用することによりエンドトキシン量を判定又は測定する。
　比色法によるエンドトキシン量の測定は、エンドトキシンによりリムルス試薬が活性化されることで発色基を遊離する発色合成基質を用い、遊離した発色基の量を吸光度又は透過光量の測定によって比色定量する。そして、この遊離した発色基の量がエンドトキシン量と相関することを利用して、エンドトキシン量を測定する。
　生物化学発光法によるエンドトキシン量の測定は、エンドトキシンによりリムルス試薬が活性化されることでルシフェリンを遊離する発光合成基質を用い、遊離したルシフェリンを、前述の生物化学発光反応によるＡＴＰ量の測定原理を利用して測定する。即ち、リムルス反応系により遊離させたルシフェリンに、ＡＴＰとルシフェラーゼを作用させて生物化学発光反応による発光量を測定する。そして、この発光量がエンドトキシン量と相関することを利用して、エンドトキシン量を測定する。
　また、従来、医療、医薬品、臨床検査、食品産業などの分野において、βグルカンを測定することが行われている。例えば、深在性真菌症が疑われる患者に対する治療方法の選択や治療効果の判定などのために、βグルカン量を測定することは重要である。βグルカン量を測定する方法としては、上記エンドトキシン量の測定と同様、ゲル化転倒法、比濁法、比色法、生物化学発光法によるリムルステストがある（特許文献３）。それぞれの方法は、リムルス反応系がβグルカンにより活性化されるプロセスを利用している点が上記エンドトキシン量の測定の場合と異なるが、それぞれの測定原理は上記エンドトキシン量の測定の場合と概略同様である。
特開平７－１１０３０１号公報 国際公開第２００９／０６３８４０号 特開２０１０－１８７６３４号公報
　上述の各種方法は、従来から広く用いられているが、試料中の妨害成分により測定精度が低下することがある。例えば、試料が透析液や血液である場合、上述の各種方法によりＡＴＰ、エンドトキシン又はβグルカンの量を測定すると、試料中の妨害成分であるナトリウムイオンによって測定に必要な反応が阻害される。このため、純水に既知量（濃度）の測定対象成分（ＡＴＰ、エンドトキシン又はβグルカン）を添加して調製した標準液を用いて作成した検量線により、試料中の測定対象成分の定量を行うと、実際よりも低い測定結果となる（図７）。
　本発明者の検討によると、ＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応がナトリウムイオンによって阻害される。従って、生物化学発光反応を用いたＡＴＰ量、エンドトキシン量、βグルカン量の測定は、ナトリウムイオンにより妨害される。
　また、エンドトキシン、βグルカンによるリムルス試薬の活性化がナトリウムイオンによって阻害される。従って、これによっても生物化学発光反応を用いたエンドトキシン量、βグルカン量の測定は妨害され、更にゲル化転倒法、比濁法、比色法によるリムルステストを用いたエンドトキシン量、βグルカン量の測定も妨害される。
　この問題に対して、試料を十分に希釈して妨害成分の影響を抑制することが行われることがあるが、試料の希釈により感度が低下するという問題がある。
　従って、本発明の目的は、生体試料や医薬品或いは食品などのナトリウムイオンを含有する試料について高感度、高精度の測定を行うことができる定量方法及び定量装置を提供することである。
　また、本発明の他の目的は、ナトリウムイオンを含有する試料と水などのナトリウムイオンを実質的に含有しないか又は含有量がより少ない試料のいずれについても、同じ１つの検量線を用いて、高感度、高精度の測定を行うことのできる定量装置及び上記定量方法や定量装置に使用できる定量用キットを提供することである。
　上記目的は本発明に係る定量方法、定量装置及び定量用キットにて達成される。要約すれば、第１の本発明は、ナトリウムイオン含有量が被測定試料のナトリウムイオン含有量と同等となるようにナトリウムイオンを添加した標準液を、リムルス試薬を活性化する反応及び／又はＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応を用いた方法により測定し、その測定値と測定対象成分の量との関係を表す検量線を作成する検量線作成工程と、前記検量線作成工程で用いた方法と同一の方法により前記被測定試料を測定する試料測定工程と、前記検量線を用いて前記試料測定工程における測定値から前記被測定試料中の前記測定対象成分の量を求める定量工程と、を含む定量方法である。
　第２の本発明は、ナトリウムイオン含有量が被測定試料のナトリウムイオン含有量と同等となるようにナトリウムイオンを添加した標準液を、リムルス試薬を活性化する反応及び／又はＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応を用いた方法により測定し、その測定値と測定対象成分の量との関係を表す検量線を作成する検量線作成工程と、前記検量線作成工程で用いた方法と同一の方法により前記被測定試料を測定する試料測定工程と、前記検量線を用いて前記試料測定工程における測定値から前記被測定試料中の前記測定対象成分の量を求める定量工程と、を含む定量装置である。
　第３の本発明は、リムルス試薬を活性化する反応及び／又はＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応を用いた方法により、被測定試料中の測定対象成分の量を定量するため、又は、該定量に用いる検量線を作成するための定量用キットであって、所定量のナトリウムイオンを前記被測定試料又は前記検量線作成のための標準液に供給するナトリウムイオン源を有する定量用キットである。
　本発明によれば、生体試料や医薬品或いは食品などのナトリウムイオンを含有する試料について高感度、高精度の測定を行うことができる。また、本発明によれば、ナトリウムイオンを含有する試料と水などのナトリウムイオンを実質的に含有しないか又は含有量がより少ない試料のいずれについても、同じ１つの検量線を用いて、高感度、高精度の測定を行うことができる。
本発明の一実施形態に係る定量装置の概略機能ブロック図である。 本発明に係る定量用キットの一例を説明するための模式図である。 生物化学発光法によるＡＴＰ量の測定におけるナトリウムイオンの影響及びその影響を抑制する効果を表すグラフを示す図である。 生物化学発光法によるエンドトキシン量の測定におけるナトリウムイオンの影響及びその影響を抑制する効果を表すグラフを示す図である。 比濁法によるリムルステストを用いたエンドトキシン量の測定におけるナトリウムイオンの影響及びその影響を抑制する効果を表すグラフを示す図である。 標準溶液のＮａＣｌ濃度のずれとエンドトキシン量の測定結果との関係を表すグラフを示す図である。 従来の課題を説明するための説明図である。
　以下、本発明に係る定量方法、定量装置及び定量キットを図面に則して更に詳しく説明する。
　１．定量方法
　本発明に係る定量方法は、次の各工程を含むものである。
（ａ）ナトリウムイオン含有量が被測定試料のナトリウムイオン含有量と同等となるようにナトリウムイオンを添加した標準液を、リムルス試薬を活性化する反応及び／又はＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応を用いた方法により測定し、その測定値と測定対象成分の量との関係を表す検量線を作成する検量線作成工程。
（ｂ）検量線作成工程で用いた方法と同一の方法により被測定試料を測定する試料測定工程。
（ｃ）検量線を用いて試料測定工程における測定値から被測定試料中の測定対象成分の量を求める定量工程。
　測定対象成分は、上記（ａ）の検量線作成工程及び（ｂ）の試料測定工程において用いる方法により異なり、リムルス試薬を活性化する反応を用いた方法により測定する場合は、エンドトキシン又はβグルカンを挙げることができる。また、ＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応を用いた方法により測定する場合は、ＡＴＰを挙げることができる。更に、リムルス試薬を活性化する反応及びＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応を用いた方法により測定する場合は、エンドトキシン又はβグルカンを挙げることができる。
　また、ＡＴＰを測定対象成分とする場合には、被測定試料中の生菌等の定量を最終的な目的として、生菌等からＡＴＰを抽出して測定する場合を含むものとすることができる。
この場合、上記工程によりＡＴＰ量を測定した後、最終的な定量目的の生菌数とＡＴＰ量との関係を表す検量線から、当該生菌数を求めることができる。或いは、（ａ）で求めた検量線、及び生菌数とＡＴＰ量との関係を表す検量線から、発光量と生菌数との関係式を作成するなどして、生菌数を求めることもできる。なお、生菌等の細胞中のＡＴＰは、ＡＴＰ抽出試薬を用いて抽出することができる。
　これらの測定は以下の原理に基づくものであるが、周知の測定方法であるため詳細な説明は省略する。
　（１）リムルス試薬を活性化する反応を用いた方法によるエンドトキシン量の測定（以下「リムルス試薬によるエンドトキシン量の測定」ともいう。）
　リムルス試薬に含まれるカブトガニの血球抽出液（ＬＡＬ：Limulus Amebocyte Lysate）には、エンドトキシンによって開始される連鎖反応系であるＣ因子リムルス反応系が存在する。エンドトキシンはＣ因子を活性化する。活性化されたＣ因子は、リムルス反応系のＢ因子を活性化する。活性化されたＢ因子は、リムルス反応系の凝固酵素前駆体を活性化し、凝固酵素を生成させる。この生成した凝固酵素の作用によりゲル化が生じる。
　リムルス試薬によるエンドトキシン量の測定は、上述のようなプロセスを利用したものであり、ゲル化した試料の状態の測定（ゲル化転倒法）又は濁度の測定（比濁法）により行うことができる。或いは、発色合成基質を上記反応系に加えて発色基を遊離させ、その量を吸光度又は透過光量により測定すること（比色法）によりエンドトキシン量を測定することもできる。
　（２）リムルス試薬を活性化する反応を用いた方法によるβグルカン量の測定（以下「リムルス試薬によるβグルカン量の測定」ともいう。）
　リムルス試薬に含まれるカブトガニの血球抽出液には、βグルカンによって開始される連鎖反応系であるＧ因子リムルス反応系が存在する。βグルカンはＧ因子を活性化する。
活性化されたＧ因子は、リムルス反応系の凝固酵素前駆体を活性化し、凝固酵素を生成させる。この生成した凝固酵素の作用によりゲル化が生じる。
　リムルス試薬によるβグルカン量の測定は、上述のようなプロセスを利用したものであり、エンドトキシン量の測定と同様に、ゲル化転倒法又は比濁法、或いは比色法によりβグルカン量を測定することができる。
　（３）ＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応を用いた方法によるＡＴＰ量の測定（以下「生物化学発光法によるＡＴＰ量の測定」ともいう。）
　ＡＴＰは、Ｍｇ2+（２価金属イオン）の存在下で、ルシフェラーゼの作用でルシフェリンと反応して、ＡＭＰとオキシルシフェリンとピロリン酸を生成する。その際に発生する光の発光量がＡＴＰ量と相関するので、これを利用してＡＴＰ量を測定することができる。
　（４）リムルス試薬を活性化する反応及びＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応を用いた方法によるエンドトキシン量の測定（以下「生物化学発光法によるエンドトキシン量の測定」ともいう。）
　生物化学発光法によるエンドトキシン量の測定は、（１）で説明したのと同じリムルス反応系のプロセスに、（３）で説明した生物化学発光法によるＡＴＰ量の測定を応用したものである。即ち、発光基質であるルシフェリンを含有する発光合成基質をリムルス反応系に加え、エンドトキシンによるリムルス反応系の活性化によりルシフェリンを遊離させる。この遊離したルシフェリンにＡＴＰとルシフェラーゼを作用させて生物化学発光反応による発光量を測定する。発光量は遊離されたルシフェリン量（リムルス反応系の活性化の程度）と相関するので、結果としてエンドトキシン量を測定することができる。
　（５）リムルス試薬を活性化する反応及びＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応を用いた方法によるβグルカン量の測定（以下「生物化学発光法によるβグルカン量の測定」ともいう。）
　生物化学発光法によるβグルカン量の測定は、（４）と同様に、リムルス反応系のプロセスに、生物化学発光法によるＡＴＰ量の測定を応用したものである。即ち、ルシフェリンを含有する発光合成基質をリムルス反応系に加え、βグルカンによるリムルス反応系の活性化によりルシフェリンを遊離させ、生物化学発光反応による発光量を測定することによりβグルカン量を測定する。
　前述のように、ＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼによる生物化学発光反応は、ナトリウムイオンによって阻害される。従って、生物化学発光法によるＡＴＰ量、エンドトキシン量、βグルカン量の測定は、ナトリウムイオンにより妨害される。
　また、エンドトキシン、βグルカンによるリムルス反応系の活性化は、ナトリウムイオンによって阻害される。従って、リムルス試薬によるエンドトキシン量、βグルカン量の測定及び生物化学発光法によるエンドトキシン量、βグルカン量の測定は妨害される。
　例えば、透析液や血液などの比較的高濃度でナトリウムイオンを含む試料について、生物化学発光法によるＡＴＰ量、エンドトキシン量又はβグルカン量の測定を行う場合、ナトリウムイオンを含まない純水等の溶媒に既知量（濃度）の測定対象成分（ＡＴＰ、エンドトキシン又はβグルカン）を添加して調製した標準液を用いて作成した検量線から、試料中の測定対象成分の量を定量すると、実際よりも低い測定結果となる（図７）。
　そこで、本発明に係る定量方法は、（ａ）の検量線作成工程において、ナトリウムイオン含有量が被測定試料のナトリウムイオン含有量と同等となるようにナトリウムイオンを添加した標準液の測定を行い、その測定値をもとに検量線を作成する。つまり、透析液や血液など妨害成分（ナトリウムイオン）を多く含む試料の定量に先立って、被測定試料に含まれる妨害成分の量と同等になるように妨害成分を添加した標準液を測定した結果に基づき検量線を作成し、この検量線を用いて試料中の測定対象成分の定量を行うことにより、妨害成分の影響をキャンセルしようとするものである。
　上記（ａ）の検量線作成工程において、標準液は、被測定試料中の測定対象成分の量に応じて、所望の測定精度が得られるように、所望の含有量（濃度）刻み幅で、所望の含有量（濃度）範囲にわたり用意する。そして、上記（ａ）の検量線作成工程における測定は、上記（ｂ）の試料測定工程における測定と実質的に同一の条件（測定対象成分を除く反応系の各成分の含有量（濃度）、反応温度、反応時間など）で行うことが好ましい。条件を揃えることによって、より高感度、高精度な測定を行うことができる。　被測定試料は、注射剤、輸液又は透析液など医療現場で使用される薬剤、目薬等の外用薬、各種の内服薬等の医薬品、水（常水、ＲＯ水、精製水、滅菌精製水、滅菌水、注射用水（注射用蒸留水）、純水、超純水、逆浸透水等）、医療用具や医療機器からの採取物、クリーンルームからの採取物、血液（全血、血清、血漿）又は尿などの生体試料（臨床試料）などである。また、食品加工や食品衛生、環境分野での各種試料を被測定試料とすることもできる。
　また、被測定試料のナトリウムイオン含有量と同等であるとは、所望の測定精度に応じて、ナトリウムイオンが測定結果に与える影響を抑制し得る程度に等しい量である。詳しくは後述するように、本発明者の検討によれば、被測定試料に対する標準液のナトリウム含有量が－５０％～＋７５％の範囲内にあれば、ナトリウムイオンが測定結果に与える影響を抑制することができる。好ましくは－１５％～＋２５％、より好ましくは－５％～＋１０％の範囲内とする。
　なお、同じ検量線で高感度、高精度な測定を行うためには、透析液や血液などのナトリウムイオンを含有する試料のそれぞれは、ナトリウムイオン含有量が同等であることが必要である。この場合も、ナトリウムイオン含有量が同等であることの意義は、上述と同様である。ただし、例えば、透析液と血液など、ナトリウムイオン含有量が同等であれば、種類の異なる試料であっても、同じ検量線で高感度、高精度な測定を行うことができる。
　また、上記（ａ）の検量線作成工程において、ナトリウムイオンは、好ましくは塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を添加することによって標準液又は被測定試料に添加する。また、標準液又は被測定試料にナトリウムイオンを添加するとは、標準液又は試料にＮａＣｌなどのナトリウムイオン源を乾燥薬剤又は溶液として投入又は注入することに限定されない。例えば、ＮａＣｌなどのナトリウムイオン源が乾燥薬剤又は溶液として収容された容器に標準液又は被測定試料を注入する方法でもよい。また、標準液又は被測定試料自体（又はこれらが希釈された希釈液）に投入又は注入される他の試薬（例えば、緩衝液、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、ＡＴＰ、２価金属イオン、発光合成基質又は発色合成基質など）にＮａＣｌなどのナトリウムイオン源が含有されており、当該試薬が投入又は注入されることで実質的に標準液又は被測定試料に所定のナトリウムイオン量となるようにナトリウムイオンが添加される方法でもよい。
　２．定量装置
　本発明に係る定量装置は、前述の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の工程を含む。図１は、本発明に係る定量装置の一実施形態の概略機能ブロックを示す。
　図１に示すように、定量装置１００は、測定を実行する測定部１０１、測定動作の制御を行う制御部１０２、情報を記憶する記憶部１０３、制御部１０２に情報を入力するための入力部１０４、制御部１０２からの情報を出力する出力部１０５などを有する。
　測定部１０１は、前述の（ａ）の検量線作成工程及び（ｂ）の試料測定工程において用いる方法に応じて構成される。例えば、生物化学発光法によるＡＴＰ量、エンドトキシン量又はβグルカン量の測定方法を用いる場合には、測定部１０１は、反応容器、発光検出器、被検液（被測定試料、標準液）供給手段、試薬供給手段などで構成することができる。また、リムルス試薬によるエンドトキシン量又はβグルカン量の測定方法を用いる場合、例えば比濁法又は比色法を採用するときには、測定部１０１は、反応容器、吸光光度計（透過光測定器）、被検液供給手段、試薬供給手段などで構成することができる。
　制御部１０２は、定量装置１００の動作を統括的に制御するものであってよく、入力部１０４からの指示情報に応じて、記憶部１０３に記憶されたプログラムや各種設定情報に従って測定部１０１をシーケンス制御すると共に、測定部１０１による測定結果の処理を行い、出力部１０５に測定結果情報を出力するように、マイクロコンピュータなどで構成することができる。
　記憶部１０３は、制御部１０２が用いる制御プログラムや各種設定情報、制御部１０２が求めた測定結果情報などの各種情報を記憶するように、電子的なメモリなどで構成することができる。
　入力部１０４は、制御部１０２に各種設定情報や測定の開始・停止の指示情報などの各種情報を入力するための、定量装置１００に設けられた入力キーなどを有する操作部などで構成することができる。或いは、入力部１０４は、定量装置１００の外部の機器からの上記同様の情報を受信して制御部１０２に送信するインターフェース部であってもよい。
　出力部１０５は、各種設定情報や測定結果情報を表示する液晶ディスプレイなどの表示部、又は同様の情報をプリントアウトするプリンター部などで構成することができる。或いは、出力部１０５は、制御部１０２からの上記同様の情報を受信して定量装置１００の外部の機器に送信するインターフェース部であってもよい。
　次に、本発明の一実施形態に係る定量装置を用いて、透析液及び透析液を調製するための溶液（原液希釈用のＲＯ水）に含まれるエンドトキシン量を定量する場合について説明する。
　（検量線作成工程）
　この定量装置では、透析液及びＲＯ水（被測定試料）中のエンドトキシン（測定対象成分）の定量に先立ち、以下の要領で検量線の作成を行う。
　エンドトキシン量が異なる２以上の標準液のそれぞれに、標準液のナトリウムイオン含有量が、透析液のナトリウムイオン含有量と同等となるようにナトリウムイオンを添加する。具体的には、透析液に含まれるナトリウムイオンは約１４０ｍｍｏｌ／Ｌであるため、それぞれの標準液のナトリウムイオン濃度が１４０ｍｍｏｌ／Ｌとなるようにナトリウムイオンを添加する。
　次に、前述のリムルス試薬によるエンドトキシン量の測定又は生物化学発光法によるエンドトキシン量の測定により、それぞれの標準液を測定して、検量線を作成する。
　この際、制御部１０２は、記憶部１０３に記憶された制御プログラムや各種設定情報に従って、標準液について上記測定を測定部１０１に実行させ、取得した測定結果から検量線を作成して記憶部１０３に記憶させる。この検量線は、被測定試料中の測定対象成分の定量に用いられる。
　（試料測定工程）
　測定方法及び条件を前述の検量線作成工程と同一として、透析液及びＲＯ水をそれぞれ測定する。
　ここで、検量線作成工程において標準液のナトリウムイオン含有量の基準とした透析液を測定するときは、ナトリウムイオンを添加しない。一方、ナトリウムイオン含有量が透析液のナトリウムイオン含有量よりも少ないＲＯ水を測定するときには、検量線作成工程と同様に、ナトリウムイオン濃度が１４０ｍｍｏｌ／Ｌとなるようにナトリウムイオンを添加してから測定を行う。
　この際、制御部１０２は、記憶部１０３に記憶された制御プログラムや各種設定情報に従って、被測定試料について上記測定を実行させる。測定部１０１によって取得された測定結果の情報は、記憶部１０３に記憶され、被測定試料中の測定対象成分の定量に用いられる。
　（定量工程）
　試料測定工程で測定した透析液の測定値及びＲＯ水の測定値は、いずれも、前述の検量線作成工程で作成した１つの検量線を用いてエンドトキシン量に換算される。
　このような工程によって定量を行うことにより、透析液については妨害成分であるナトリウムイオンの影響を受けることなく高感度、高精度な測定を行うことができる。また、同じ１つの検量線を用いて、ナトリウムイオンをほとんど含まないＲＯ水についても、正確な測定を行うことができる。
　例えば、オペレーターの入力によって、ナトリウムイオンを添加してから被測定試料を測定すべきか否かの情報を装置に与えることができる。また、あらかじめ、複数の被測定試料の導入順序とナトリウムイオン添加の有無とを、動作シーケンスとして設定しておくようにすることもできる。さらには、定量装置内にナトリウムイオン測定手段（例えば、イオン電極や導電率計）を備え、その測定値に応じて、ナトリウムイオンの添加の必要性や添加するナトリウムイオン量を自動的に判断させるようにすることや、外部からの信号（例えば、定量装置とは別に設けたイオン濃度計や導電率計からの信号）に応じて自動的に判断させるようにすることもできる。
　また、被測定試料は２種類に限られず、３以上の試料について、ナトリウムイオンの添加をコントロールして測定することができる。例えば、医薬品製造工程において、完成品、中間生成物、原材料の３種を被測定試料とする場合に、ナトリウムイオン含有量が、中間生成物＞完成品＞原材料であれば、中間生成物のナトリウムイオン含有量を基準として検量線作成工程の検量線を作成し、完成品及び原材料の測定の際には中間生成物のナトリウムイオン含有量と同等となるようにナトリウムイオンを添加して測定すればよい。また、完成品のナトリウムイオン含有量を基準として検量線作成工程の検量線を作成し、完成品及び中間生成物の測定の際にはナトリウムイオンを添加せずに測定し、原材料の測定の際には完成品のナトリウムイオン含有量と同等となるようにナトリウムイオンを添加して測定することもできる。
　このように、被測定試料は、ナトリウムイオン含有量の異なる複数の試料であってよい。この場合、検量線作成工程では、複数の試料のうち任意の試料のナトリウムイオン含有量と同等となるようにナトリウムイオンを添加した標準液を測定して検量線を作成することができる。そして、試料測定工程では、上記任意の試料及びナトリウムイオン含有量が上記任意の試料と同等以上の試料にはナトリウムイオンを添加せずに該試料を測定する。一方、ナトリウムイオン含有量が上記任意の試料と同等未満の試料には上記任意の試料のナトリウムイオン含有量と同等となるようにナトリウムイオンを添加してから該試料を測定する。
　３．定量用キット
　本発明に係る定量用キットについて説明する。
　本発明に係る定量用キットは、上述の定量方法又は定量装置に好適に使用することができる。即ち、リムルス試薬を活性化する反応及び／又はＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応を用いた方法により被測定試料中の測定対象成分の量を定量する際、又は、その定量に用いる検量線を作成する際に、所定量のナトリウムイオンを被測定試料又は検量線作成のための標準液に供給するナトリウムイオン源を有する。
　例えば、前述のように透析液中のエンドトキシン量を測定することに加えて、原液希釈用のＲＯ水中のエンドトキシン量を測定する場合、定量用キットは、透析液とＲＯ水について同じ１つの検量線を用いて測定することができるように、標準液とＲＯ水とに、これらのナトリウムイオン含有量が透析液のナトリウムイオン含有量と同等となるようにナトリウムイオンを供給するための、ナトリウムイオン源を有する構成とする。
　透析液のナトリウムイオン濃度は、約１４０ｍｍｏｌ／Ｌであり、標準液やＲＯ水はナトリウムイオンをほとんど含まない。したがって、定量用キットを用いた測定に供する標準液やＲＯ水の量を常に一定量とすることにすれば、定量用キットが供給すべき所定量のナトリウムイオン量も常に一定量でよいこととなり、その量は簡単に算出することができる。つまり、被測定試料のナトリウムイオン濃度と定量用キットを用いた測定に供する液体量に応じて、定量用キットのナトリウムイオン供給量を適宜決定することができる。
　本発明に係る定量用キットは、被測定試料を、血液などの生体試料とする場合や、注射剤、輸液、透析液、目薬、生理食塩水等とする場合に特に好適に用いることができる。これらのナトリウムイオン濃度はほぼ一定であり、その濃度から求めたナトリウムイオン量を供給することができる定量用キットを量産して使用することができるからである。
　具体的には、血液のナトリウムイオン濃度は約１３５～１４５ｍｍｏｌ／Ｌであり、透析液のナトリウムイオン濃度は約１４０ｍｍｏｌ／Ｌであり、生理食塩水のナトリウムイオン濃度は約１５５ｍｍｏｌ／Ｌであることから、これらを基準として算出したナトリウムイオン量を供給することができる定量用キットとすることができる。そのため、定量用キットのナトリウムイオン源は、被測定試料又は検量線作成のための標準液のナトリウムイオン濃度が１３５～１５５ｍ
ｍｏｌ／Ｌとなるようにナトリウムイオンを供給することが好ましい。
　更に説明すると、例えば、図２に示すように、定量用キット１０は、ナトリウムイオン源としてＮａＣｌが乾燥薬剤又は溶液として収容された第１の容器１を有していてよい。第１の容器１には更に、ｐＨ緩衝作用物が乾燥薬剤又は溶液（緩衝液）として収容されていてよい。そして、この第１の容器１に、標準液、或いはナトリウムイオンを含有しないか又は含有量がより少ない水などの試料が注入されるようにすることができる。
　また、定量用キット１０は更に、ナトリウムイオン源が収容されていない第２の容器２を有していてよい。第２の容器２には更に、ｐＨ緩衝作用物が乾燥薬剤又は溶液（緩衝液）として収容されていてよい。そして、この第２の容器２に、ナトリウムイオンを含有する透析液などの試料が注入されるようにすることができる。
　試料や標準液が注入された第１の容器１と第２の容器２の内容物のナトリウムイオン濃度は同等となるように設定される。そして、この第１の容器１、第２の容器２内の試料や標準液を用いて測定する。
　次に、本発明をより具体的な実施例に則して更に説明する。
　生物化学発光法によるＡＴＰ量の測定におけるナトリウムイオンの影響及びその影響を抑制する効果について確認した。
　本実施例では、異なる濃度に希釈したＡＴＰを含むＡＴＰ含有液を、溶媒として水、透析液、ＮａＣｌ水溶液を用いてそれぞれ調製し、各ＡＴＰ含有液についてＡＴＰ濃度と生物化学発光反応による発光量との関係を求めた。
　・試薬
　ＡＴＰ標準液として、東亜ディーケーケー社製ＡＦ－２Ａ１を用いた。このＡＴＰ標準液は、概略、０．０２５ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に１×１０-7ＭのＡＴＰが溶解されたものである。また、水として、注射用水（大塚製薬社製大塚蒸留水）を用いた。ルシフェリン、ルシフェラーゼ変異体として、これらを含有する発光試薬（バイオエネックス社製のルシフェラーゼＦＭ＋）を用いた。透析用剤として、キンダリー３Ｄ（扶桑薬品工業社製）を用いた。キンダリー３Ｄは、透析液のＡ剤が電解質分であるＡ－１剤と、グルコース（非電解質）分であるＡ－２とで構成されるものである。
　・方法
　透析液は、キンダリー３ＤのＡ剤とＢ剤とを、処方に従って注射用水を用いて溶解して調製した。このキンダリー３Ｄのナトリウムイオン濃度は、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ（１４０ｍＥｑ／Ｌ）である。
　ＮａＣｌ水溶液は、ＮａＣｌを注射用水で溶解して、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ（１４０ｍＥｑ／Ｌ）の濃度に調製した。即ち、このＮａＣｌ水溶液のナトリウムイオン濃度は、上記透析液のナトリウムイオン濃度と等しい。
　ＡＴＰ含有液は、上記ＡＴＰ標準液を注射用水、透析液、ＮａＣｌ水溶液で希釈することにより、１×１０-14、１×１０-13、１×１０-12、１×１０-11、１×１０-10、１×１０-9、１×１０-8の濃度に調製した。
　次に、各ＡＴＰ含有液の１００μＬを反応容器に移し、各反応容器に１００μＬの発光試薬を添加し、混合する。その後、その反応液について、発光検出器（浜松ホトニクス社製微弱発光計数装置）を用いて発光量を測定した。
　・結果
　結果を図３に示す。図３の横軸はＡＴＰ含有液のＡＴＰ濃度（ｍｏｌ／Ｌ）、縦軸は発光量（発光強度：ＲＬＵ）である。
　溶媒として水を用いた場合、ＡＴＰ濃度と発光量との関係は、溶媒として透析液を用いた場合とは大きく異なる。特に、図３に示すように、各ＡＴＰ濃度における発光量は、溶媒として水を用いた場合よりも透析液を用いた場合の方が低い。従って、単に水に既知濃度のＡＴＰを添加して調製した標準液を用いて作成した検量線を用いて、透析液中のＡＴＰ量を定量すると、実際よりも低濃度の測定結果となる。
　これに対して、溶媒としてＮａＣｌ水溶液を用いた場合、ＡＴＰ濃度と発光量との関係は、溶媒として透析液を用いた場合とほぼ一致する。従って、透析液と等しい濃度でナトリウムイオンを含有するＮａＣｌ水溶液に既知濃度のＡＴＰを添加して調製した標準液を用いて作成した検量線を用いることで、透析液中のＡＴＰ量を高精度に測定し得ることがわかる。また、ナトリウムイオンの影響を抑制するために試料を希釈しなくてよいため、高感度に測定し得ることがわかる。また、試料が例えばナトリウムイオンを含有しない水などである場合には、標準液と等しい（即ち、透析液と等しい）濃度でナトリウムイオンを含有するようにＮａＣｌを添加することで、その試料中のＡＴＰについても、透析液の場合と同じ検量線を用いて高感度、高精度に測定し得ることがわかる。
　生物化学発光法によるエンドトキシン量の測定におけるナトリウムイオンの影響及びその影響を抑制する効果について確認した。
　本実施例では、異なる含有量に希釈したエンドトキシンを含むエンドトキシン含有液を、溶媒として水、透析液、ＮａＣｌ水溶液を用いてそれぞれ調製し、各エンドトキシン含有液についてエンドトキシン量と生物化学発光反応による発光量との関係を求めた。
　・試薬
　リムルス試薬（ＬＡＬ）として、エンドトキシン測定試薬である和光純薬社製リムルスＥＳ－IIを用いた。また、エンドトキシン標準物質として、和光純薬社製コントロールスタンダードエンドトキシン（ＣＳＥ）を用いた。また、水として、注射用水（大塚製薬社製注射用水）を用いた。また、発光合成基質として、ベンゾイル－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ルシフェリンを用いた。ルシフェラーゼとしては、変異型ルシフェラーゼ（バイオエネックス社製ルシフェラーゼＦＭ）を用いた。透析用剤として、キンダリー３Ｄ（扶桑薬品工業社製）と、カーボスターＰ（味の素製薬社製）とを用いた。カーボスターＰは、透析液のＡ剤が１剤化されたものである。
　・方法
　透析液は、キンダリー３Ｄ、カーボスターＰのそれぞれを、処方に従って注射用水を用いて溶解して調製した。このキンダリー３Ｄ、カーボスターＰの溶液のナトリウムイオン濃度は、それぞれ１４０ｍｍｏｌ／Ｌ（１４０ｍＥｑ／Ｌ）である。
　ＮａＣｌ水溶液は、ＮａＣｌを注射用水で溶解して、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ（１４０ｍＥｑ／Ｌ）の濃度に調製した。即ち、このＮａＣｌ水溶液のナトリウムイオン濃度は、上記透析液のナトリウムイオン濃度と等しい。
　エンドトキシン含有液は、エンドトキシン標準物質を注射用水で溶解して、１０００ＥＵ／ｍＬの含有量に調製したものを原液として、この原液を注射用水、透析液、ＮａＣｌ水溶液で希釈することにより、０．００１、０．０１、０．１、１ＥＵ／ｍＬの含有量に調製した。
　リムルス試薬は、２００μＬの注射用水を用いて調製した。
　次に、各エンドトキシン含有液の５０μＬを反応容器に移し、各反応容器に２５μＬのリムルス試薬を添加し、混合した後、３７℃で２０分間加温した。
　次に、各反応容器に、０．００１Ｍ酢酸マグネシウムと５％トレハロースを含む０．０４Ｍトリシン緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解した６．７×１０-5Ｍの発光合成基質を５０μＬ添加し、３７℃で５分間加温した。
　次に、各反応容器に、０．０２５ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）に溶解した１０-6ＭのＡＴＰを５０μＬ、０．００１Ｍの酢酸マグネシウムと０．１５Ｍトレハロースを含む０．０４Ｍトリシン緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解したルシフェラーゼ（ＦＭ１ｇを４ｍＬに溶解）を５０μＬ添加し、その反応液について、発光検出器（東亜ディーケーケー社製ＡＦ－１００）を用いて発光量を測定した。
　・結果
　結果を図４に示す。図４の横軸はエンドトキシン含有液のエンドトキシン量（ＥＵ／ｍＬ）、縦軸は発光量（発光強度：ＲＬＵ）である。
　溶媒として水を用いた場合、エンドトキシン量と発光量との関係は、溶媒として透析液を用いた場合とは大きく異なる。特に、図４に示すように、各エンドトキシン量における発光量は、溶媒として水を用いた場合よりも透析液を用いた場合の方が低い。従って、単に水に既知量のエンドトキシンを添加して調製した標準液を用いて作成した検量線を用いて、透析液中のエンドトキシン量を定量すると、実際よりも低い測定結果となる。
　これに対して、溶媒としてＮａＣｌ水溶液を用いた場合、エンドトキシン濃度と発光量との関係は、溶媒として透析液を用いた場合とほぼ一致する。従って、透析液と等しい濃度でナトリウムイオンを含有するＮａＣｌ水溶液に既知量のエンドトキシンを添加して調製した標準液を用いて作成した検量線を用いることで、透析液中のエンドトキシン量を高精度に測定し得ることがわかる。また、ナトリウムイオンの影響を抑制するために試料を希釈しなくてよいため、高感度に測定し得ることがわかる。また、試料が例えばナトリウムイオンを含有しない水などである場合には、標準液と等しい（即ち、透析液と等しい）濃度でナトリウムイオンを含有するようにＮａＣｌを添加することで、その試料中のエンドトキシンについても、透析液の場合と同じ検量線を用いて高感度、高精度に測定し得ることがわかる。
　比濁法によるリムルステストを用いたエンドトキシン量の測定におけるナトリウムイオンの影響及びその影響を抑制する効果について確認した。
　本実施例では、異なる含有量に希釈したエンドトキシンを含むエンドトキシン含有液を、溶媒として水、透析液、ＮａＣｌ水溶液を用いてそれぞれ調製し、各エンドトキシン含有液についてエンドトキシン量と比濁法による反応時間の測定値との関係を求めた。
　・試薬
　リムルス試薬（ＬＡＬ）、エンドトキシン標準物質としては、実施例２と同じものを用いた。また、水としては実施例２と同じものを用いた。また、透析用剤としては、実施例１と同じキンダリー３Ｄを用いた。
　・方法
　透析液、ＮａＣｌ水溶液は、実施例１、２と同様にして調製した。
　エンドトキシン含有液は、エンドトキシン標準物質を注射用水で溶解して、１０００ＥＵ／ｍＬの含有量に調製したものを原液として、この原液を注射用水、透析液、ＮａＣｌ水溶液で希釈することにより、０．００１２５、０．００２５、０．００５、０．０１ＥＵ／ｍＬの含有量に調製した。
　次に、各エンドトキシン含有液の２００μＬをリムルス試薬を含む反応容器に移し、その反応液について、測定装置（和光純薬社製ＥＴ－６０００）を用いて透過光量が所定の閾値（約９０％）に減少するまでの反応時間を測定した。
　・結果
　結果を図５に示す。図５の横軸はエンドトキシン含有液のエンドトキシン量（ｌｏｇ（ＥＵ／ｍＬ））、縦軸は反応時間（ｌｏｇ（分））である。
　溶媒として水を用いた場合、エンドトキシン量と反応時間との関係は、溶媒として透析液を用いた場合とは大きく異なる。特に、図５に示すように、各エンドトキシン量における反応時間は、溶媒として水を用いた場合よりも透析液を用いた場合の方が長い。従って、単に水に既知量のエンドトキシンを添加して調製した標準液を用いて作成した検量線を用いて、透析液中のエンドトキシン量を定量すると、実際よりも低い測定結果となる。
　これに対して、溶媒としてＮａＣｌ水溶液を用いた場合、エンドトキシン量と反応時間との関係は、溶媒として透析液を用いた場合に近づく。従って、透析液と等しい濃度でナトリウムイオンを含有するＮａＣｌ水溶液に既知量のエンドトキシンを添加して調製した標準液を用いて作成した検量線を用いることで、透析液中のエンドトキシン量をより高精度に測定し得ることがわかる。また、ナトリウムイオンの影響を抑制するために試料を希釈しなくてよいため、高感度に測定し得ることがわかる。また、試料が例えばナトリウムイオンを含有しない水などである場合には、標準液と等しい（即ち、透析液と等しい）濃度でナトリウムイオンを含有するようにＮａＣｌを添加することで、その試料中のエンドトキシンについても、透析液の場合と同じ検量線を用いて高感度、高精度に測定し得ることがわかる。
　表１は、透析液に既知量のエンドトキシンを添加した試料について、上記手順に従って比濁法による反応時間を測定し、検量線として図５に示す溶媒として水を用いた場合の関係（水検量線）、溶媒としてＮａＣｌ水溶液を用いた場合の関係（ＮａＣｌ）を用いた場合の回収率を算出した結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　水検量線からエンドトキシン量を算出した場合、－２０％～－３０％の回収率となり、ナトリウムイオンがリムルス反応系の活性化を阻害していることがわかる。一方、ＮａＣｌ検量線から算出すると、回収率は±１０％の範囲となり、高精度な測定が可能であることがわかる。
　標準液のナトリウム含有量と被測定試料のナトリウムイオン含有量とのずれの影響を確認した。
　ここでは、生物化学発光法によるエンドトキシン量の測定に用いる検量線を、ナトリウムイオン濃度が１４０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ水溶液を用いて調製し、生物化学発光法により測定して作成した。
　次に、ナトリウムイオン濃度を１４０ｍｍｏｌ／Ｌを基準として、－７５％～＋１００％の範囲で変化させたＮａＣｌ水溶液を用いて、０．０１ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン含有液を調製した。そして、これらナトリウムイオン濃度の異なる０．０１ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン含有液のそれぞれを生物化学発光法により測定して、上記検量線を用いて、エンドトキシン含有量を計算した。図６に結果を示す。図６は、横軸に計算に使用した検量線を作成する際の、標準液のナトリウムイオン濃度の基準値に対するずれ（％）、縦軸に各検量線を用いて計算したエンドトキシン含有量を示す。
　図６の結果から、ＮａＣｌ水溶液のナトリウムイオン濃度が－１５％～＋２５％の範囲内であれば、±３０％の回収率を達成でき、－５％～＋１０％の範囲内であれば、±１５％の回収率を達成できることがわかった。
　以上説明したように、本発明によれば、生体試料（血液など）や医薬品（透析液など）或いは食品などのナトリウムイオンを含有する試料について高感度、高精度の測定を行うことができる。また、本発明によれば、ナトリウムを含有する試料（透析液など）と水（医薬品の原料水など）などのナトリウムイオンを実質的に含有しないか又は含有量がより少ない試料のいずれについても、同じ１つの検量線を用いて、高感度、高精度の測定を行うことができる。
　１　　　第１の容器
　２　　　第２の容器
　１０　　定量用キット
　１００　定量装置

Claims (8)

  1. 　ナトリウムイオン含有量が被測定試料のナトリウムイオン含有量と同等となるようにナトリウムイオンを添加した標準液を、リムルス試薬を活性化する反応及び／又はＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応を用いた方法により測定し、その測定値と測定対象成分の量との関係を表す検量線を作成する検量線作成工程と、
    　前記検量線作成工程で用いた方法と同一の方法により前記被測定試料を測定する試料測定工程と、
    　前記検量線を用いて前記試料測定工程における測定値から前記被測定試料中の前記測定対象成分の量を求める定量工程と、
    を含む定量方法。
  2. 　前記測定対象成分が、エンドトキシン、βグルカン又はＡＴＰである請求項１に記載の定量方法。
  3. 　ナトリウムイオン含有量が被測定試料のナトリウムイオン含有量と同等となるようにナトリウムイオンを添加した標準液を、リムルス試薬を活性化する反応及び／又はＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応を用いた方法により測定し、その測定値と測定対象成分の量との関係を表す検量線を作成する検量線作成工程と、
    　前記検量線作成工程で用いた方法と同一の方法により前記被測定試料を測定する試料測定工程と、
    　前記検量線を用いて前記試料測定工程における測定値から前記被測定試料中の前記測定対象成分の量を求める定量工程と、
    を含む定量装置。
  4. 　前記被測定試料は、ナトリウムイオン含有量の異なる複数の試料であり、
    　前記検量線作成工程は、前記複数の試料のうち任意の試料のナトリウムイオン含有量と同等となるようにナトリウムイオンを添加した前記標準液を測定して前記検量線を作成し、
    　前記試料測定工程は、前記任意の試料及びナトリウムイオン含有量が前記任意の試料と同等以上の試料にはナトリウムイオンを添加せずに該試料を測定し、ナトリウムイオン含有量が前記任意の試料と同等未満の試料には前記任意の試料のナトリウムイオン含有量と同等となるようにナトリウムイオンを添加してから該試料を測定する請求項３に記載の定量装置。
  5. 　前記複数の試料が、医薬品及び該医薬品を調製するための溶液である請求項４に記載の定量装置。
  6. 　前記測定対象成分が、エンドトキシン、βグルカン又はＡＴＰである請求項３～５のいずれかの項に記載の定量装置。
  7. 　リムルス試薬を活性化する反応及び／又はＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応を用いた方法により、被測定試料中の測定対象成分の量を定量するため、又は、該定量に用いる検量線を作成するための定量用キットであって、　所定量のナトリウムイオンを前記被測定試料又は前記検量線作成のための標準液に供給するナトリウムイオン源を有する定量用キット。
  8. 　前記ナトリウムイオン源が、前記被測定試料又は前記検量線作成のための標準液のナトリウムイオン濃度が１３５～１５５ｍ
    ｍｏｌ／Ｌとなるようにナトリウムイオンを供給する請求項７に記載の定量用キット。
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