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WO2013133012A1 - 試料観察方法および試料前処理方法 - Google Patents

試料観察方法および試料前処理方法 Download PDF

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WO2013133012A1
WO2013133012A1 PCT/JP2013/054067 JP2013054067W WO2013133012A1 WO 2013133012 A1 WO2013133012 A1 WO 2013133012A1 JP 2013054067 W JP2013054067 W JP 2013054067W WO 2013133012 A1 WO2013133012 A1 WO 2013133012A1
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WO
WIPO (PCT)
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ionic liquid
sample
observation
solution containing
drying
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2013/054067
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English (en)
French (fr)
Inventor
正道 塩野
雅子 西村
麻美 許斐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hitachi High Tech Corp
Original Assignee
Hitachi High Technologies Corp
Hitachi High Tech Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to JP2014503748A priority patent/JP5792886B2/ja
Priority to DE112013000467.4T priority patent/DE112013000467B4/de
Priority to CN201380007954.9A priority patent/CN104094096B/zh
Publication of WO2013133012A1 publication Critical patent/WO2013133012A1/ja
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    • H01J2237/26—Electron or ion microscopes
    • H01J2237/2602—Details
    • H01J2237/2605—Details operating at elevated pressures, e.g. atmosphere
    • H01J2237/2608—Details operating at elevated pressures, e.g. atmosphere with environmental specimen chamber
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    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J2237/00—Discharge tubes exposing object to beam, e.g. for analysis treatment, etching, imaging
    • H01J2237/26—Electron or ion microscopes
    • H01J2237/28—Scanning microscopes

Definitions

  • the present invention relates to a method of replacing an observation target with an aqueous solution containing an ionic liquid and observing with a charged particle beam apparatus such as a scanning electron microscope, and a method of operating an observation target using a probe installed in the charged particle beam apparatus It is about.
  • Small crustaceans such as copepods, daphnids, daphnids, leaf prawns, krill, ami, coomas, horseshoe shrimp, large crustaceans nauplius, cypris, zoea, mince larvae, zooplanktons such as rotifers and amoeba, cyanobacteria, green algae
  • microaquatic organisms such as phytoplankton such as thin flagellate algae
  • morphological observation under a microscope is essential.
  • observation of the form of fine legs called appendages is regarded as important.
  • crustacean appendages are intricately intertwined, it is necessary to separate and dissect individual appendages for detailed observation.
  • separation and dissection of crustacean appendages have been performed under an optical microscope, but it has been difficult to operate dissecting instruments under the optical microscope, and skillful techniques have been required for dissection.
  • the electron microscope has a deep depth of focus and is suitable for observing the three-dimensional shape of living organisms, and there are probes that can be operated in the sample chamber of the electron microscope.
  • microaquatic organisms are taken out of water and exposed to the atmosphere, they will dry and shrink to such an extent that their original shape is not retained.
  • larvae of microcrustaceans and large crustaceans are deformed by drying and shrinkage even when they are fixed using ethanol, glutaraldehyde, formalin, or the like.
  • Non-Patent Document 1 has succeeded in low-temperature observation of morning glory leaf primordia using the above method.
  • Patent Document 1 describes that a biological sample can be observed under an electron microscope in its original form by utilizing the characteristics of an ionic liquid that does not evaporate even in a vacuum.
  • a method of immersing a sample containing moisture in an ionic liquid and then removing the moisture under vacuum and a method of applying an ionic liquid diluted with a solvent such as alcohol to the sample and then removing the solvent under vacuum are described. ing.
  • Non-Patent Document 2 an ionic liquid was dropped onto a mycobacterial colony cultured on an agar medium that had been vapor-fixed with osmic acid, and an image believed to be the original structure of the mycobacterial colony was obtained. Has been reported.
  • Patent Document 2 discloses that a specific ionic liquid is used to increase the permeability of an ionic liquid into a biological sample.
  • a specific ionic liquid is used to increase the permeability of an ionic liquid into a biological sample.
  • observation examples of wakame, spinach stem, cotton cloth, hair, mouse bone, red blood cells, and mutans bacteria are shown.
  • a method is described in which the ionic liquid is dissolved in a polar solvent such as water to form a liquid medium, and the liquid medium is impregnated, applied, and sprayed.
  • Patent Document 1 it is shown that an ionic liquid does not evaporate even in a vacuum, and that a biological sample can be observed under an electron microscope in its original form.
  • the ionic liquid is directly applied to an aquatic organism that is vulnerable to changes in osmotic pressure.
  • the aquatic organisms are applied to the ionic liquid, the water in the aquatic organisms is lost due to the osmotic pressure difference, and the aquatic organisms are dried up even in the ionic liquid.
  • an ionic liquid diluted with a solvent such as alcohol is applied to a sample and the solvent is removed under vacuum, so that the solvent may bump in vacuum. . If bumping occurs inside the shell of an aquatic organism (in the organism), the internal pressure of the shell suddenly increases, which may destroy the shell and cause shell fragments to scatter. Accordingly, not only the sample destruction occurs but also the SEM sample chamber may be contaminated.
  • Patent Document 2 describes a method in which an ionic liquid is dissolved in a polar solvent such as water to form a liquid medium, and this liquid medium is impregnated, applied, and sprayed. However, a method for removing the solvent is not disclosed at all. .
  • the present invention provides a sample observation method for observing with a charged particle beam observation apparatus such as an electron microscope while suppressing morphological changes and damage of aquatic organisms that are vulnerable to changes in osmotic pressure using an ionic liquid aqueous solution. Objective.
  • the observation object is immersed in a solution containing the ionic liquid, and the solution containing the ionic liquid is dried in a state where the osmotic pressure of the solution containing the ionic liquid and the osmotic pressure inside the observation object are antagonized.
  • the concentration of the ionic liquid in the solution is increased, and the observation object impregnated with the ionic liquid is irradiated with a charged particle beam to acquire an image of the observation object.
  • an ionic liquid aqueous solution can be used to change the form of aquatic organisms that are vulnerable to changes in osmotic pressure, suppress damage, and observe with a charged particle beam observation apparatus such as an electron microscope.
  • FIG. 3 is a side view of a sample chamber of the electron microscope of Example 1.
  • FIG. FIG. 3 is an explanatory diagram showing a procedure of a sample observation method of Example 1.
  • Example 1 it is explanatory drawing of the state which dripped the ionic liquid aqueous solution to the horizontal shrimp substituted with water.
  • Example 1 it is explanatory drawing of the state by which the ionic liquid was impregnated in the inside of a side shrimp. It is explanatory drawing which showed the method of removing the ionic liquid aqueous solution adhering to fine parts, such as the circumference
  • 2 is an electron microscopic image of a leaf shrimp in Example 1.
  • Example 2 It is an electron microscopic image of the horizontal shrimp seen from the back surface in Example 1.
  • 2 is an electron microscope image of a horizontal shrimp imaged by tilting a sample stage for an electron microscope in Example 1 by 45 °. It is the electron microscope image which showed the example which observed the side shrimp without using the method of Example 1.
  • FIG. It is an electron microscopic image of copepod in Example 2. It is the electron microscope image which showed the example which observed the copepod without using the method of Example 2.
  • FIG. It is explanatory drawing which showed dissecting the aquatic organism impregnated with ionic liquid aqueous solution under an electron microscope observation using the probe installed in the sample chamber of the electron microscope.
  • Non-Patent Document 1 which is a conventional technique using room temperature vacuum drying after freezing, there is a problem that the flexibility of the joints is lost and it becomes difficult to move the legs and other movable parts. For this reason, when attempting to dissect aquatic organisms with a probe or the like installed in the sample chamber of an electron microscope, the dried aquatic organisms may be damaged.
  • Patent Document 1 it is shown that an ionic liquid does not evaporate even in a vacuum, and that a biological sample can be observed under an electron microscope in its original form.
  • the ionic liquid is directly applied to an aquatic organism that is vulnerable to changes in osmotic pressure.
  • the aquatic organisms are applied to the ionic liquid, the water in the aquatic organisms is lost due to the osmotic pressure difference, and the aquatic organisms are dried up even in the ionic liquid.
  • a method of applying an ionic liquid diluted with a solvent such as alcohol to a sample is described, the solvent may be bumped in vacuum because the solvent is removed under vacuum.
  • Non-Patent Document 2 after vapor fixation with osmic acid, an ionic liquid was dropped onto a mycobacteria colony cultured on an agar medium, and good results were obtained.
  • aquatic organisms such as microcrustaceans are much larger than microorganisms such as acid-fast bacteria, there is a problem that the effect of dehydration and destruction due to osmotic pressure difference between the ionic liquid and the organism cannot be ignored.
  • Osmic acid vapor is highly toxic and has safety issues. Even in chemical fixation with glutaraldehyde other than the vapor fixation method of osmic acid, it is difficult to obtain mechanical strength that can resist the breaking strength due to osmotic pressure difference.
  • Patent Document 2 shows an observation example of seaweed, spinach stem, cotton cloth, hair, mouse bone, red blood cells, and mutans bacteria, but does not show an aquatic organism observation example.
  • a living tissue as shown in Patent Document 2 is porous, and the solvent quickly penetrates into the sample.
  • shells exoskeletons
  • ionic liquid must permeate the entire solid through the non-destructive exoskeleton.
  • Patent Document 2 describes a method in which an ionic liquid is dissolved in a polar solvent such as water to form a liquid medium, and the liquid medium is impregnated, applied, and sprayed. However, a method for removing the solvent is disclosed. Not.
  • an aquatic organism is first introduced into a low-concentration ionic liquid (2 to 10%), and the concentration of the ionic liquid is continuously increased to maintain the shape of the aquatic organism when living.
  • the water inside is replaced with a concentrated ionic liquid aqueous solution.
  • by utilizing the slow increase in the concentration of the ionic liquid aqueous solution due to natural drying it is possible to reduce the osmotic pressure difference inside and outside the aquatic organism and to gradually increase the ionic liquid concentration inside the aquatic organism.
  • SEM scanning electron microscope
  • STEM scanning transmission electron microscope
  • ion microscope ion microscope
  • sample observation apparatus using other charged particle beams and the like.
  • an aquatic organism is taken as an example as a sample or observation target, but the present invention is not limited to this.
  • the present invention is particularly effective for an observation object that is vulnerable to changes in osmotic pressure and drying.
  • Observation targets include, for example, minute crustaceans such as copepods, barnacles, daphnids, leaf prawns, krill, trout, coomas, horseshoe shrimp, large crustaceans nauplius, cypris, zoea, mince larvae, others, rotifers and amoeba Zooplankton, cyanobacteria, green algae, phytoplankton and other phytoplankton, water-absorbent resin, agar, gelatin, konjac, etc., observation subjects that are vulnerable to changes in osmotic pressure, nematodes, earthworms, gypsum, etc.
  • an observation object that is deformed by drying under normal pressure environment such as an insect
  • FIG. 1 shows a side view of the sample chamber of the electron microscope of this example.
  • the electron microscope of the present embodiment is a scanning electron microscope and includes an electron gun that generates an electron beam, a lens system that focuses the electron beam, and a deflector that deflects the electron beam to scan over the sample, although not shown.
  • An operation unit such as a mouse to be operated and a console, and a vacuum pump for evacuating a column having an electron source and an electron optical system inside are included.
  • the sample chamber may be evacuated to a low or high vacuum by this vacuum pump, or the sample chamber may be evacuated by another vacuum pump, but the sample chamber of an electron microscope is usually kept in a vacuum state. So the sample is observed under vacuum conditions.
  • the control unit and the image generation unit may be configured as hardware by a dedicated circuit board, or may be configured by a program executed by a computer connected to an electron microscope.
  • the inside of the sample chamber is an electron microscope objective lens 1, an electron beam 3 irradiated from the electron microscope objective lens 1 to the sample 2 impregnated with the ionic liquid aqueous solution, and a reflected electron signal 4 from the sample 2 impregnated with the ionic liquid aqueous solution.
  • a secondary electron detector 7 for detecting a secondary electron signal 6 from the sample 2 impregnated with the aqueous ionic liquid solution.
  • Secondary electrons, reflected electrons, and the like which are signals obtained by irradiating the sample with an electron beam, may be collectively referred to as secondary particles.
  • a sample 2 impregnated with an ionic liquid aqueous solution is placed on a sample stage 8 for an electron microscope.
  • the material of the sample stage is generally aluminum, but in order to obtain the effect of removing excess ionic liquid on the sample stage, it is possible to use a water-absorbing material, for example, a carbon sample stage.
  • a method for observing aquatic organisms impregnated with an ionic liquid aqueous solution as a sample to be observed will be described using a horizontal shrimp that is a major aquatic organism in the ocean as a sample.
  • the form of the example here is not limited to the shrimp, but can be applied to arthropods, plankton, aquatic organisms such as cultured cells, and other samples that are vulnerable to changes in osmotic pressure.
  • the shrimp used in this example has a body length of 3 mm or less and has been stored in an ethanol solution having a concentration of 90% or more for 1 to 4 months, but a sample immediately after collection may be used.
  • FIG. 2 is an explanatory diagram showing a procedure for obtaining an electron microscope image of a horizontal shrimp according to an embodiment of the present invention.
  • the shrimp initially stored in the ethanol solution is put into water and the ethanol is replaced with water.
  • the body color of the shrimp that was translucent in the ethanol solution changes to opaque and white after being replaced with water.
  • the time for soaking the shrimp in water was 80 minutes, but a shorter time may be used if a change in body color is confirmed.
  • pick up the shrimp from the water place it on a sample stage for an electron microscope, and suck excess water with filter paper. The above steps can be omitted when water is contained in the sample in advance, such as when using the shrimp immediately after collection.
  • FIG. 3 is an explanatory view showing this state.
  • the horizontal shrimp 10 whose inside is replaced with the drawing is placed on the sample stage 8.
  • the ionic liquid aqueous solution 9 is dropped from above with a pipette 11.
  • the inside of the side shrimp 10 is impregnated with water, so that the body color of the side shrimp remains opaque or white.
  • the optimum concentration of the ionic liquid aqueous solution was 2 to 5%, but this concentration varies depending on the kind of organism or the difference in material, composition and osmotic pressure.
  • the concentration of the ionic liquid in the ionic liquid aqueous solution is desirably 10% or less from the viewpoint of suppressing the destruction or shrinkage of the sample due to the change in the osmotic pressure.
  • 20 ml of the ionic liquid aqueous solution is used, but it may be more or less if the aquatic organism is immersed in the ionic liquid aqueous solution. It is desirable that the ionic liquid has hydrophilic properties.
  • an ionic liquid having a chemical formula of C 8 H 15 N 2 BF 4 was used.
  • another solvent may be sufficient.
  • formalin containing ethanol, methanol, acetone, hexane, ether and formaldehyde can be considered.
  • air drying refers to a method of naturally evaporating a solvent (natural drying) by allowing it to stand for a certain period of time under atmospheric pressure. Further, the drying may be accelerated by intentionally blowing air, or it may be left in a desiccator with adjusted humidity, or the drying may be accelerated by overheating.
  • the air drying and natural drying described below include a state in which temperature or humidity is controlled. Controlling the temperature and humidity can control the rate at which the solvent dries.
  • any solvent removal method may be used that increases the concentration of the ionic liquid in the solution by drying the ionic liquid aqueous solution in a state in which the osmotic pressure of the ionic liquid aqueous solution is antagonized with the osmotic pressure inside the observation target.
  • the concentration of the ionic liquid in the solution increases continuously and gently.
  • the solvent is evaporated at the same time as immersing the sample in the ionic liquid aqueous solution, so that the state in which the osmotic pressure of the ionic liquid aqueous solution and the osmotic pressure inside the observation target are antagonized can be maintained.
  • the concentration is gently increased to prevent sample destruction due to osmotic pressure differences and to prevent dry destruction even in vacuum.
  • the concentration can be increased to the concentration.
  • a plurality of ionic liquid solutions having different concentrations may be prepared and replaced by increasing the concentration of the solution in which the sample is immersed, but it is much easier to use natural drying.
  • FIG. 4 is an explanatory diagram illustrating a state in which four hours have elapsed from the state of FIG.
  • the amount of the ionic liquid aqueous solution is gradually decreased by air drying, and a part of the leaf shrimp may be finally exposed.
  • the inside of the horizontal shrimp 13 is in a higher concentration state.
  • the ionic liquid aqueous solution penetrates into the body of the shrimp, the body color of the shrimp changes from white to transparent. Thus, it can be determined that the ionic liquid is impregnated into the body of the shrimp.
  • the determination of whether the observation target is impregnated with the ionic liquid is not limited to this, and may be determined based on the weight of the observation target, for example.
  • the amount of the ionic liquid aqueous solution continues to decrease for about 2 to 3 hours after the ionic liquid aqueous solution is dripped and the air drying is started, but thereafter, the amount of the ionic liquid aqueous solution does not change and the air drying is completed. .
  • the air drying time depends on climatic conditions and the amount of ionic liquid aqueous solution dropped. At this time, since the osmotic pressure inside the ionic liquid aqueous solution and the horizontal shrimp is equal, the sample is not destroyed and the form is maintained even if it is left for a day or more.
  • ionic liquid aqueous solution is sucked with a paper such as filter paper or a wiping member 14 such as gauze.
  • a paper such as filter paper or a wiping member 14 such as gauze.
  • FIG. 5 it is possible to remove the ionic liquid aqueous solution adhering to a fine part such as the periphery of the leg by bringing the wiping member 14 having a thin tip into contact with the side shrimp.
  • water or a hydrophilic solution is pre-soaked in paper such as filter paper or paper waste (Kimwipe (registered trademark)) or gauze, etc., so that it can be placed between the legs. It is possible to adsorb the attached ionic liquid aqueous solution.
  • the ionic liquid aqueous solution whose viscosity has increased by drying on the sample surface comes into contact with paper such as filter paper or paper waste, or water or hydrophilic solution contained in gauze, etc. This is because it is easily absorbed by paper such as waste or gauze.
  • the ionic liquid aqueous solution it can be washed with a low concentration ionic liquid aqueous solution or water.
  • the shrimp is transferred to a water-absorbing material, for example, a carbon sample table, the effect of removing excess ionic liquid aqueous solution is further enhanced.
  • FIG. 6 is an image 15 obtained by photographing the shrimp with an electron microscope using the method of this embodiment. This shows that the shape of the lobster, which is vulnerable to changes in osmotic pressure, can be photographed with an electron microscope without changing or damaging it.
  • SEM scanning electron microscope
  • FIG. 7 is an image 17 of the side shrimp observed in the reverse direction after the first observation with the electron microscope in this manner and again with the electron microscope.
  • FIG. 7 shows the same specimen as FIG. 6 and the opposite side observed in FIG. However, with respect to the leg 18 in FIG. 7, the direction of the leg is changed because the joint of the leg is moved from the state of FIG.
  • FIG. 7 is an electron microscope image 19 obtained by observing the shrimp that was actually tilted by 45 ° and replaced with the aqueous ionic liquid solution.
  • FIG. 9 shows an example in which horizontal shrimp is observed without using the method of this embodiment.
  • the left figure is an electron microscope image 20 obtained by observing a side shrimp without using an ionic liquid
  • the right figure is an electron microscopic image 21 in which the legs in the central four-frame frame of the left figure are enlarged.
  • the example shown in FIG. 9 is observed under the same conditions as in this example except that an ionic liquid is used. Observing normal temperature shrimp with an electron microscope without using this example clearly shows that the sample dries out and has dried up. In particular, as can be seen from the image indicated by reference numeral 21, the legs are significantly deformed and broken by drying.
  • the sample preparation method described above may be performed automatically by a sample preparation apparatus or by a user instruction / operation.
  • a sample preparation apparatus is sometimes called a pretreatment apparatus.
  • the apparatus includes at least immersion means for immersing the observation object in the solution containing the ionic liquid, the osmotic pressure of the solution containing the ionic liquid, and the inside of the observation object. Drying means for increasing the concentration of the ionic liquid in the solution by drying the solution containing the ionic liquid in a state of antagonizing the osmotic pressure.
  • the dipping means may collect a small amount of a solution containing an ionic liquid, such as a micropipette, and drop it on the observation target.
  • the drying means may be a sample chamber in which an observation object is placed under atmospheric pressure, or a desiccator that can control temperature and humidity.
  • the drying time may be managed by a timer provided in the sample preparation device.
  • the sample preparation apparatus includes an optical microscope that can observe the observation object being dried by the drying means, the degree of reduction of the ionic liquid due to drying, and the observation object is not contracted or deformed by the ionic liquid. Can be confirmed. Further, as described above, it is effective when it is determined that the ionic liquid is impregnated from the change in the color of the observation target.
  • the solution containing the ionic liquid remaining after drying is sucked by the paper 14 such as filter paper or the wiping member 14 such as gauze.
  • the wiping member 14 such as gauze.
  • a similar wiping member is attached to the sample preparation device, and drying means is provided. It can be used as a means for removing the solution containing the ionic liquid remaining after the drying.
  • the sample preparation device with means for detecting the progress of drying of the solution containing the ionic liquid from the change in the weight of the observation target, it can be used to determine whether the observation target is impregnated with the ionic liquid.
  • the optimum concentration of the ionic liquid aqueous solution was 10%, but this concentration differs depending on the type of organism or the difference in material, composition and osmotic pressure.
  • 20 ml of the ionic liquid aqueous solution is used, but it may be more or less if the aquatic organism is immersed in the ionic liquid aqueous solution.
  • the ionic liquid has hydrophilic properties.
  • an ionic liquid having a chemical formula of C 8 H 15 N 2 BF 4 was used.
  • the air drying means that the concentration of the ionic liquid in the solution is continuously dried by drying the ionic liquid aqueous solution in a state in which the osmotic pressure of the ionic liquid aqueous solution is antagonized with the osmotic pressure inside the observation target. It is intended to broadly mean a solvent removal method that raises.
  • the amount of the ionic liquid aqueous solution is gradually decreased by air drying, and eventually a part of the copepod may be exposed. As the ionic liquid aqueous solution penetrates into the body of a copepod, the body color of the copepod changes from white to transparent.
  • the ionic liquid is impregnated in the body of the shrimp.
  • the time for impregnation of the ionic liquid in the standard sample is measured in advance by the method based on the body color change described above, and whether or not the sample actually used for observation is impregnated is determined by the immersion time. Also good.
  • the amount of the ionic liquid aqueous solution continues to decrease for about 2 to 3 hours after the ionic liquid aqueous solution is dripped and the air drying is started, but thereafter, the amount of the ionic liquid aqueous solution does not change and the air drying is completed. .
  • the air drying time depends on climatic conditions and the amount of ionic liquid aqueous solution dropped. At this time, since the osmotic pressure inside the ionic liquid aqueous solution and the copepod is equal, the sample is not destroyed, and the form is maintained even if left for a day or more.
  • the excess ionic liquid aqueous solution is sucked with paper such as filter paper or paper waste, or with a wiping member such as gauze.
  • the method is the same as in FIG.
  • water or a hydrophilic solution is soaked in filter paper or paper, such as Kimwipe, or gauze in advance, so that the ionic liquid aqueous solution adhering to fine places such as between the legs can be adsorbed. Is possible. This is because the ionic liquid aqueous solution, whose viscosity has increased due to the drying of the sample surface, comes into contact with water such as filter paper or paper waste or water or hydrophilic solution contained in gauze, etc.
  • FIG. 10 is an image obtained by photographing a copepod with an electron microscope using the method of the present embodiment, and shows that the form of a copepod that is weak against changes in osmotic pressure can be photographed with an electron microscope without being changed or damaged.
  • the electron microscope image 22 in FIG. 10 was taken with the sample stage tilted by 45 °, and it is clear from this explanatory view that tilt observation is possible.
  • FIG. 11 shows an example in which copepods are observed without using the method of this embodiment.
  • the example shown in FIG. 11 is observed under the same conditions as in this example except that an ionic liquid is used. From the electron microscope image 23 in FIG. 11, it can be seen that copepods are extremely dry and notably deformed at room temperature and normal pressure. Without using this example, it is impossible to observe copepods dried at room temperature.
  • copepods are observed under an optical microscope.
  • the sample is adsorbed to the sample table by a very small amount of the ionic liquid aqueous solution, so the sample needs to be fixed to the sample table with an adhesive such as carbon tape or carbon paste. There is no. Therefore, after observation and dissection of the electron microscope, it is possible to remove the sample from the dedicated sample stage for the electron microscope and enclose the aquatic organism as the sample with water or other encapsulant to prepare a preparation for the optical microscope. It is possible to observe under an optical microscope by observing copepods with an electron microscope and then sealing the copepods replaced with an aqueous ionic liquid solution after observation with an electron microscope with an encapsulant such as water or Canadian balsam.
  • the copepod processed by the conventional freeze-drying method has a problem that a cavity is generated inside the copepod, and it is difficult for water and Canadian balsam to enter the cavity and bubbles are generated. If the inside of the aquatic organism is filled with the ionic liquid aqueous solution as in the method of this embodiment, no cavity is generated inside the copepod. There is little possibility of air bubbles.
  • sample preparation method in the present embodiment may also be executed by the sample preparation apparatus described in the first embodiment.
  • sample preparation device may be provided with an optical microscope sample preparation means for preparing an optical microscope preparation as described above by dropping an encapsulant onto an observation target impregnated with an ionic liquid.
  • FIG. 12 is an explanatory diagram showing dissection of an aquatic organism obtained by impregnation with an aqueous ionic liquid solution under observation with an electron microscope using a probe installed in a sample chamber of an electron microscope.
  • the aquatic organism 24 obtained by impregnating an aqueous ionic liquid solution is a sample that has been subjected to the treatment shown in Example 1 or Example 2. It is desirable that the probe 25 installed in the sample chamber of the electron microscope can be operated while performing electron microscope observation.
  • a sample moving image can be obtained by manipulating the sample during image acquisition using an electron beam, and the dynamic state of the sample can be visually recognized.
  • the aquatic organism 24 is rotated using the probe 25 so as to roll.
  • the state when the aquatic organism is rolled is the same as in FIG. In the explanatory view of FIG. 12, the sample stage 8 for the electron microscope can be tilted as necessary.
  • the probe 25 After adjusting the direction of the aquatic organism 24, the probe 25 is used to move the joints of the appendages or to dissect the appendages. At this time, if two or more probes are installed in the electron microscope sample chamber, this operation becomes easy. Therefore, the number of probes in the electron microscope sample chamber is desirably two or more.
  • the aquatic leg 26 dissected by the probe installed in the sample chamber of the electron microscope is cut off by the probe 25.
  • the method of observing with an electron microscope by replacing water or other solutions in aquatic organisms with an ionic liquid aqueous solution loses flexibility such as joints even in a high vacuum environment within the electron microscope. It has the effect of moving the legs and other movable parts. For this reason, it becomes possible to observe while moving the legs of aquatic organisms and other movable parts using a probe or the like installed in the electron microscope sample chamber after or during electron microscope observation. effective. Furthermore, dissection of aquatic organisms as samples becomes possible.
  • the dissected aquatic leg is replaced with an ionic liquid aqueous solution, so it has conductivity. Therefore, it is possible to reduce the scattering of the fragments accompanying the charge-up phenomenon and the contamination in the electron microscope chamber due to the scattering of the fragments. Moreover, since the aquatic organism substituted with the ionic liquid aqueous solution retains flexibility, operations such as bending the appendage can be performed without destroying the sample.
  • the dissected sample is observed with an electron microscope as it is, but may be re-observed with another analytical instrument such as an optical microscope as necessary.
  • a preparation for an optical microscope may be prepared with an encapsulant as in the method described in Example 2.
  • a biological microscope it is also possible to perform the above treatment on a slide glass for an optical microscope or a cover glass.
  • glass is an insulator, and a charge-up phenomenon occurs.
  • this invention is not limited to the above-mentioned Example, Various modifications are included.
  • the above-described embodiments have been described in detail for easy understanding of the present invention, and are not necessarily limited to those having all the configurations described.
  • a part of the configuration of one embodiment can be replaced with the configuration of another embodiment, and the configuration of another embodiment can be added to the configuration of one embodiment.

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Abstract

　水生生物内外の浸透圧差を軽減し、生物試料内部からの脱水を防止することで、イオン液体水溶液中に浸した水生生物の自然な形態を壊さずに、かつ外骨格および関節部の柔軟性を保持することを実現する。最初に濃度の低いイオン液体に水生生物を投入し、イオン液体の濃度を連続的に高めることで、水生生物の生体時の形状を保持したまま、水生生物内の水分を濃度の濃いイオン液体水溶液に置換する。自然乾燥による緩慢としたイオン液体水溶液の濃度上昇を利用することで、水生生物内外の浸透圧差を軽減し、水生生物内部のイオン液体濃度を連続的に高めることを実現する。

Description

試料観察方法および試料前処理方法
　本発明は、観察対象をイオン液体を含む水溶液で置換し、走査電子顕微鏡等の荷電粒子線装置で観察する方法、および荷電粒子線装置内に設置したプローブを用いて観察対象の操作を行う方法に関するものである。
　カイアシ、ケンミジンコ、ミジンコ、ヨコエビ、オキアミ、アミ、クーマ、カブトエビなどの微小甲殻類や、大型甲殻類のノープリウス、キプリス、ゾエア、ミンス幼生、その他、ワムシやアメーバなどの動物プランクトン、藍藻、緑藻、薄鞭毛藻類などの植物プランクトンなどの微小水生生物を調査・研究するためには、顕微鏡下での形態観察が必須である。特に、微小甲殻類や、大型甲殻類の幼生の分類法においては、付属肢と呼ばれる微細な脚の形態観察が重要視されている。甲殻類の付属肢は複雑に絡み合っているため、詳細な観察を行うためには、個々の付属肢を分離・解剖する必要がある。従来、甲殻類の付属肢の分離・解剖は光学顕微鏡下で実施されてきたが、光学顕微鏡下では解剖器具の操作が難しく、解剖には熟練した技術が必要であった。
　電子顕微鏡は焦点深度が深く、生物の立体的な形状の観察に適しており、電子顕微鏡の試料室内で操作可能なプローブも存在している。しかしながら、微小水生生物を水中から取り出し、大気中に暴露すると原形を留めないほどに、乾燥、収縮してしまう。特に、微小甲殻類や大型甲殻類の幼生は、エタノール、グルタールアルデヒド、ホルマリンなどを用いて固定した場合であっても乾燥、収縮による変形が生じる。電子顕微鏡で水生生物の観察を行う場合には、水や封入剤中から水生生物を取り出し、さらには真空環境下に持ち込む必要があるため、試料前処理なしで電子顕微鏡観察を行うことは困難であった。
　この問題を解決するために、電子顕微鏡用の試料前処理方法の開発が行われてきた。代表的な例が、低真空雰囲気中（１.３～２７０Pa）でマイナス数十度から室温付近まで試料温度の制御が可能な低真空クライオステージを使用して、生体軟組織の形態破壊を防止する手法である。例えば、非特許文献１では、上記手法を用いて、アサガオ葉原基の低温観察に成功している。
　一方、電子顕微鏡下で液体中の微細試料を観察および制御する手法として、イオン液体を用いる手法が開発されている。特許文献１では、真空中でも蒸発しないイオン液体の特性を利用し、生体試料を原形のまま電子顕微鏡下で観察できることが記載されている。特に、イオン液体で水分を含む試料を浸漬しその後真空下で水分を除去する方法、およびアルコール等の溶媒で希釈されたイオン液体を試料に塗布しその後真空下で溶媒を除去する方法が記載されている。
　この発明以後、イオン液体を用いた生物試料の観察方法が進められてきた。例えば、非特許文献２ではオスミウム酸による蒸気固定を行った寒天培地で培養した抗酸菌のコロニーにイオン液体を滴下し、抗酸菌のコロニーの本来の構造と思われる像が得られたことが報告されている。
　特許文献２では、特定のイオン液体を用いてイオン液体の生体試料への浸透性への浸透性を高める点が開示されている。実施例としてワカメ、ほうれん草の茎、綿布、毛髪、マウスの骨、赤血球、ミュータンス菌の観察例が示されている。また、このイオン液体を水などの極性溶媒に溶かし液状媒体とし、この液状媒体を試料に含浸、塗布、噴霧する方法が記載されている。
国際公開第２００７／０８３７５６号（ＵＳ２００９／０１７３８８２） 特開２０１１－１３７８０７号公報
植田和弘、山田満彦、後藤真知夫、松島久、久保木健三、低真空ＳＥＭによる低温観察の試み、日本電子顕微鏡学会第４９回学術講演会予稿集、社団法人日本電子顕微鏡学会、Ｐ２７４、１９９３ 横山満、小川みどり、市原剛志、イオン液体による抗酸菌のＳＥＭ観察、医学生物学電子顕微鏡技術学会第２７回学術講演会および総会プログラム・予稿集、医学生物学電子顕微鏡技術学会、Ｐ２９、２０１１
　特許文献１では、イオン液体が真空中でも蒸発しないことを利用し、生体試料を原形のまま電子顕微鏡下で観察できることが示されているが、浸透圧の変化に弱い水生生物に直接的にイオン液体を塗布、またはイオン液体中に水生生物を投入すると、浸透圧差により水生生物内の水分が失われ、イオン液体中であっても、水生生物が干からびてしまう問題があった。
　また、特許文献１に記載されている方法ではアルコール等の溶媒で希釈されたイオン液体を試料に塗布して溶媒を真空下で除去しているため、真空中で溶媒が突沸する可能性がある。水生生物が持つ殻の内部（生物体内）で突沸が生じた場合、殻の内圧が急激に高まり、殻を破壊し、殻の破片が飛散する恐れがある。したがって、試料破壊が生じるだけでなくＳＥＭ試料室内を汚染する恐れがある。
　特許文献２では、イオン液体を水などの極性溶媒に溶かし液状媒体とし、この液状媒体を試料に含浸、塗布、噴霧する方法が記載されているが、溶媒の除去方法については全く開示されていない。
　本発明は、イオン液体水溶液を用いて、浸透圧の変化に弱い水生生物の形態の変化、損傷を抑制して電子顕微鏡等の荷電粒子線観察装置で観察を行う試料観察方法を提供することを目的とする。
　本発明の試料観察方法は、イオン液体を含む溶液に前記観察対象を浸し、イオン液体を含む溶液の浸透圧と観察対象の内部の浸透圧と拮抗させた状態で、イオン液体を含む溶液を乾燥させることで、溶液中のイオン液体の濃度を上昇させ、イオン液体を内部が含浸した観察対象に荷電粒子線を照射して観察対象の画像を取得することを特徴とする。
　本発明によれば、イオン液体水溶液を用いて、浸透圧の変化に弱い水生生物の形態を変化、損傷を抑制して、電子顕微鏡等の荷電粒子線観察装置で観察を行うことができる。
実施例１の電子顕微鏡の試料室側面図である。 実施例１の試料観察方法の手順を示した説明図である。 実施例１における、水で置換したヨコエビにイオン液体水溶液を滴下した状態の説明図である。 実施例１において、ヨコエビの内部にイオン液体が含浸された状態の説明図である。 先端部を細くした紙をヨコエビに接触させることで、脚の周囲などの細かな部位に付着したイオン液体水溶液を除去する手法を示した説明図である。 実施例１における、ヨコエビの電子顕微鏡画像である。 実施例１における、裏面から見たヨコエビの電子顕微鏡画像である。 実施例１における、電子顕微鏡用の試料台を４５°傾斜させて撮像したヨコエビの電子顕微鏡画像である。 実施例１の手法を用いずに、ヨコエビを観察した例を示した電子顕微鏡画像である。 実施例２における、カイアシの電子顕微鏡画像である。 実施例２の手法を用いずに、カイアシを観察した例を示した電子顕微鏡画像である。 イオン液体水溶液を含浸させた水生生物を、電子顕微鏡の試料室内に設置したプローブを用いて、電子顕微鏡観察下で解剖することを示した説明図である。
　まず、従来技術における課題をより詳細に説明する。
　凍結後の常温真空乾燥を利用する従来の手法である非特許文献１では、関節などの柔軟性が失われ、脚や、その他の可動部を動かすことが困難になってしまう問題があった。このため、電子顕微鏡の試料室内に設置したプローブなどで水生生物の解剖を試みた場合、乾燥した水生生物が破損する恐れがあった。
　特許文献１では、イオン液体が真空中でも蒸発しないことを利用し、生体試料を原形のまま電子顕微鏡下で観察できることが示されているが、浸透圧の変化に弱い水生生物に直接的にイオン液体を塗布、またはイオン液体中に水生生物を投入すると、浸透圧差により水生生物内の水分が失われ、イオン液体中であっても、水生生物が干からびてしまう問題があった。また、アルコール等の溶媒で希釈されたイオン液体を試料に塗布する方法についても記載されているが、溶媒を真空下で除去しているため、真空中で溶媒が突沸する可能性がある。
　非特許文献２ではオスミウム酸による蒸気固定後に、寒天培地で培養した抗酸菌のコロニーにイオン液体を滴下し、良好な結果を得ている。しかしながら、微小甲殻類などの水生生物は、抗酸菌などの微生物よりも、はるかに大型であるため、イオン液体と生物体内の浸透圧差による脱水・破壊効果が無視できないほど大きくなる問題がある。また、オスミウム酸の蒸気は毒性が高く、安全性の問題もある。オスミウム酸の蒸気固定法以外のグルタールアルデヒドによる化学固定においても、浸透圧差による破壊強度に対抗できるほどの機械的強度を得ることは難しい。
　特許文献２では、ワカメ、ほうれん草の茎、綿布、毛髪、マウスの骨、赤血球、ミュータンス菌の観察例を示したが、水生生物の観察例は示していない。特許文献２に示されているような生体組織は多孔質であり、溶媒は速やかに試料内部に浸透する。一方で、微小甲殻類等の殻（外骨格）をもつ水生生物の形状を非破壊で観察するためには、当然のことながら非破壊の外骨格を通してイオン液体を固体全体に浸透させる必要があり、生体組織と比較すると、浸漬や乾燥に時間がかかる。また、水生生物の外骨格がイオン液体をはじく場合もあるので、微小甲殻類等の水生生物を強制的にイオン液体の中に沈めなければならない場合がある。このため、水生生物をイオン液体水溶液を用いて観察する手法は、解剖済の生物組織や遊離細胞にイオン液体を浸透させる手法とは、根本的に異なる手段を発明する必要がある。
　また、特許文献２には、イオン液体を水などの極性溶媒に溶かし液状媒体とし、この液状媒体を試料に含浸、塗布、噴霧する方法が記載されているが、溶媒の除去方法については開示されていない。
　本発明では、最初に濃度の低いイオン液体（２～１０％）に水生生物を投入し、イオン液体の濃度を連続的に高めることで、水生生物の生体時の形状を保持したまま、水生生物内の水分を濃度の濃いイオン液体水溶液に置換する。これによって、水生生物内外の浸透圧差を軽減し、生物試料内部からの脱水を防止でき、イオン液体水溶液中に浸した水生生物の自然な形態を壊さずに、かつ外骨格および関節部の柔軟性を保持することを実現することができる。特に、自然乾燥による緩慢としたイオン液体水溶液の濃度上昇を利用することで、水生生物内外の浸透圧差を軽減し、水生生物内部のイオン液体濃度を緩やかに高めることを実現する。
　以下、図面を用いて本願発明の各実施例について説明する。
　なお、以下の実施例では走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を例にあげて説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は走査透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）やイオン顕微鏡、その他の荷電粒子線を用いた試料観察装置等による観察に適用可能である。
　また、以下では、試料または観察対象として、水生生物を例に挙げて説明しているが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、特に、浸透圧の変化や乾燥に弱い観察対象に対して有効である。観察対象としては、例えば、カイアシ、ケンミジンコ、ミジンコ、ヨコエビ、オキアミ、アミ、クーマ、カブトエビなどの微小甲殻類や、大型甲殻類のノープリウス、キプリス、ゾエア、ミンス幼生、その他、ワムシやアメーバなどの動物プランクトン、藍藻、緑藻、薄鞭毛藻類などの植物プランクトンなどの微小水生生物、吸水性樹脂、寒天、ゼラチン、コンニャクなどの浸透圧の変化に弱い観察対象、線虫、ミミズ、ギョウチュウなどのように常圧環境でも乾燥により変形が生じる観察対象、昆虫、ダニ、クモなどのように常圧下では乾燥に抵抗があるものの、真空環境下では変形が生じる観察対象が考えられる。
　図１には、本実施例の電子顕微鏡の試料室側面図を示す。本実施例の電子顕微鏡は走査電子顕微鏡であり、図示しないが、電子線を発生する電子銃、電子線を集束するレンズ系と電子線が試料上を走査するように偏向する偏向器とを含む電子光学系、電子光学系を制御する制御部、検出器からの信号に基づいて資料の画像を生成する画像生成部、撮像した画像を表示するディスプレイ等の表示部、走査電子顕微鏡の各機能を操作するマウスや操作卓等の操作部、電子源や電子光学系を内部に有するカラムを真空排気する真空ポンプを含むものとする。この真空ポンプによって試料室を低真空または高真空に排気しても良いし、別の真空ポンプによって試料室を排気しても良いが、通常、電子顕微鏡の試料室は真空状態に保たれているので、試料は真空状態の下で観察される。なお、上記の制御部、画像生成部は、専用の回路基板によってハードとして構成されていてもよいし、電子顕微鏡に接続されたコンピュータで実行されるプログラムによって構成されてもよい。
　試料室内部は電子顕微鏡の対物レンズ１、電子顕微鏡の対物レンズ１からイオン液体水溶液を含浸させた試料２に照射される電子ビーム３、イオン液体水溶液を含浸させた試料２からの反射電子信号４を検出する反射電子検出器５、イオン液体水溶液を含浸させた試料２からの二次電子信号６を検出する二次電子検出器７から構成される。試料に電子ビームを照射することで得られる信号である二次電子、反射電子等を総称して二次粒子ということもある。イオン液体水溶液を含浸させた試料２は、電子顕微鏡用の試料台８の上に乗せてある。試料台の材質はアルミニウムが一般的であるが、試料台上の余分なイオン液体を除去する効果を得るために、吸水性の材質、例えばカーボン製試料台を使用することも可能である。
　本実施例では、海洋の主要な水生生物であるヨコエビを試料として、イオン液体水溶液を含浸させた水生生物を観察対象の試料として観察する手法を説明する。ここでの実施例の形態はヨコエビに限定されず、節足動物、プランクトン、培養細胞を代表とする水生生物の観察、浸透圧の変化に弱いその他の試料に適応可能である。本実施例で使用するヨコエビは体長３mm以下であり、濃度９０％以上のエタノール溶液中に１～４ヶ月間保存していたものであるが、採取直後の試料を用いてもかまわない。
　図２は、本発明の実施形態により、ヨコエビの電子顕微鏡画像を得る手順を示した説明図である。最初にエタノール溶液中に保存していたヨコエビを、水中に入れ、エタノールを水で置換する。このとき、エタノール溶液中では半透明であったヨコエビの体色が、水で置換されたのちには不透明、白色に変化する。本実施例ではヨコエビを水に浸した時間は８０分であったが、体色の変化が確認されれば、もっと短い時間でも良い。次に水中からヨコエビを引き上げ、電子顕微鏡用の試料台に乗せ、余分な水分を濾紙などで吸引する。以上のステップは採取直後のヨコエビを使う場合など、試料の内部に予め水が含まれている場合には省略可能である。
　余分な水分を吸い取った後、試料が乾燥する前に手早く少量のイオン液体水溶液をピペット等で滴下する。図３はこの状態を示した説明図である。図３では、内部を済み図で置換されたヨコエビ１０が試料台８に載せられている。その上からピペット１１によってイオン液体水溶液９を滴下する。滴下直後には、ヨコエビ１０の内部は水で含浸されているのでヨコエビの体色は不透明または白のままである。
　ヨコエビの場合、最適なイオン液体水溶液の濃度は２～５％であったが、この濃度は生物の種類の違い、または素材、組成、浸透圧の違いによって異なる。ただし、浸透圧の変化による試料の破壊または収縮を抑制するという観点から、イオン液体水溶液におけるイオン液体の濃度は１０％以下であること望ましい。本実施例では２０mlのイオン液体水溶液を用いたが、水生生物がイオン液体水溶液中に浸されれば、これより多くても、少なくてもよい。イオン液体は親水性の性質を有するものが望ましく、本実施例ではＣ8Ｈ15Ｎ2ＢＦ4の化学式を有するイオン液体を使用した。また、イオン液体溶液の溶媒として水を用いる例を示したが、その他の溶媒でも良い。溶媒としては、水のほか、例えばエタノール、メタノール、アセトン、ヘキサン、エーテル、ホルムアルデヒドを含むホルマリンが考えられる。
　ヨコエビにイオン液体水溶液を滴下した後に２時間以上、風乾を実施する。なお、以下でいう風乾とは、大気圧下で一定時間放置することで自然に溶媒を蒸発させる（自然乾燥）方法をいう。また、意図的に風をあてて乾燥を速めてもよいし、湿度を調整したデシケーター内に放置したり、過熱を行って乾燥を速めてもよい。このように以下でいう風乾および自然乾燥とは、温度または湿度を制御した状態も含むものとする。温度や湿度を制御すると溶媒が乾燥する速度を制御することができる。
　すなわち、イオン液体水溶液の浸透圧と観察対象の内部の浸透圧と拮抗させた状態でイオン液体水溶液を乾燥させることで、溶液中のイオン液体の濃度を上昇させるような溶媒除去方法であればよい。本実施例の乾燥方法によれば、溶液中のイオン液体の濃度は連続的にかつ緩やかに上昇することとなる。また、本実施例の方法では、イオン液体水溶液に試料を浸漬させながら同時に溶媒を蒸発させるので、イオン液体水溶液の浸透圧と観察対象の内部の浸透圧と拮抗させた状態を保つことができる。
　初期溶液である低濃度（約２～１０％）のイオン液体から自然乾燥を利用して、ゆるやかに濃度を上昇させることにより、浸透圧差による試料破壊を防ぎつつ、かつ真空中でも乾燥破壊が生じない濃度まで濃度を高めることができる。
　また、濃度の異なる複数のイオン液体溶液を用意して、順に試料を漬け込む溶液の濃度を高くして置換してもよいが、自然乾燥を利用するほうがはるかに簡便である。
　図４は、図３の状態から４時間経過した状態を図示した説明図である。イオン液体水溶液は、風乾によって徐々に量が減少し、最終的にヨコエビの一部が露出することもある。風乾によって濃縮されたイオン液体水溶液１２の浸透圧と平衡状態を保つように、ヨコエビ１３の内部はさらに濃度の高い状態となる。イオン液体水溶液がヨコエビの体内に浸透にするにつれて、ヨコエビの体色は白色から透明に変化する。これによってヨコエビの体内にイオン液体が含浸したことを判断できる。また、上述の体色変化による方法で予め標準的な試料の内部にイオン液体が含浸する時間を測定しておいて、実際に観察に用いる試料に含浸されたか否かは浸漬時間によって判断しても良い。なお、イオン液体が観察対象に含浸したかの判断はこれに限られることなく、例えば観察対象の重量から判断しても良い。
　イオン液体水溶液を滴下し、風乾を開始してから、概ね２～３時間の間はイオン液体水溶液の量が減少を続けるが、それ以後はイオン液体水溶液の量の変化がなくなり、風乾が完了する。ただし、風乾時間は気候条件および、イオン液体水溶液の滴下量によって左右される。このとき、イオン液体水溶液と、ヨコエビ内部の浸透圧が等しくなっているため、試料の破壊は起こらず、一昼夜以上放置しても形態は維持される。
　風乾が完了した後に、余分なイオン液体水溶液を、濾紙などの紙、あるいはガーゼ等のふき取り部材１４で吸引する。図５に示すように、先端部を細くしたふき取り部材１４をヨコエビに接触させることで、脚の周囲などの細かな部位に付着したイオン液体水溶液を除去することが可能である。このとき濾紙やペーパーウエス（キムワイプ（登録商標）など）などの紙、あるいはガーゼ等に、水や親水性の溶液を、予め染み込ませておくことで、脚と脚の間などの細かな場所に付着したイオン液体水溶液を吸着することが可能である。これは試料表面に乾燥により粘性が増したイオン液体水溶液が、濾紙やペーパーウエスなどの紙、あるいはガーゼ等に含ませた水や親水性の溶液に接触することで、粘性が下がり、紙やペーパーウエスなどの紙、あるいはガーゼ等に吸収されやすくなるためである。イオン液体水溶液を除去しにくい場合には、濃度の低いイオン液体水溶液や水で洗浄することも可能である。また、吸水性の材質、例えばカーボン製試料台にヨコエビを移し替えれば、余分なイオン液体水溶液を除去する効果が、さらに高くなる。
　余分なイオン液体を除去した後に電子顕微鏡で観察を実施する。観察に用いる電子顕微鏡は走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）であることが望ましい。図６は、本実施例の手法を用いて、ヨコエビを電子顕微鏡で撮影した画像１５である。浸透圧の変化に弱いヨコエビの形態を変化、損傷させることなく電子顕微鏡で撮影できることを示している。
　ヨコエビ表面のイオン液体水溶液も除去できているため、図６では、触覚の毛１６などの細かな構造も、イオン液体水溶液に覆われることなく観察できている。イオン液体水溶液に置換したヨコエビは、真空環境下に置かれた後においても柔軟性を保っていることから、一回目の電子顕微鏡観察後に、ヨコエビを裏返しにして、裏面の観察を行うことや、さらには脚などの関節を動かした後に、再度、電子顕微鏡で観察することが可能である。図７は、このようにして、１回目の電子顕微鏡観察後、裏返しにして、再度、電子顕微鏡で観察したヨコエビの画像１７である。図６と同一検体であり、図６で観察されている反対側が図７である。ただし、図７中の脚１８については、図６の状態から脚の関節を動かしたため、脚の向きが変化している。
　図７に示したように、イオン液体水溶液で置換したヨコエビは電子顕微鏡用の試料台から簡単に取り外すことが可能であるが、極少量のイオン液体水溶液によって、試料台に吸着しているため、電子顕微鏡用の試料台を傾斜させても滑り落ちることなく、安定して観察可能である。図８は実際に試料台を４５°傾斜させて、イオン液体水溶液で置換したヨコエビを観察した電子顕微鏡画像１９である。
　参考として図９に本実施例の方法を用いないで、ヨコエビを観察した例を示す。左図はイオン液体を用いずにヨコエビを観察した電子顕微鏡画像２０であり、右図は左図の中央四画枠内の脚を拡大した電子顕微画像２１である。図９に示した例は、イオン液体を用いる点以外は本実施例と同じ条件で観察したものである。本実施例を用いずに、電子顕微鏡で常温のヨコエビを観察すると、試料が乾燥してしまい、干からびてしまっていることが明らかに分かる。特に、符号２１で示された画像から分かるように脚に関しては乾燥による変形、破壊が著しい。
　なお、以上に説明した試料作製方法は、試料作製装置によって、自動的に、またはユーザの指示・操作により行われてもよい。このような試料作製装置は前処理装置と呼ばれることもある。試料作製装置により、本実施例の方法を行う場合には、当該装置は少なくとも、観察対象をイオン液体を含む溶液に浸漬させる浸漬手段と、イオン液体を含む溶液の浸透圧と観察対象の内部の浸透圧と拮抗させた状態で、イオン液体を含む溶液を乾燥させることで、溶液中のイオン液体の濃度を上昇させる乾燥手段とを備える。ここで浸漬手段は、例えばマイクロピペットのようにイオン液体を含む溶液を少量採取し、観察対象に滴下するものであってもよい。また、乾燥手段は、大気圧下で観察対象を入れておく試料室であってもよいし、温度や湿度を制御できるデシケーター等であってもよい。また、予め乾燥に要する時間が決まっている場合には、試料作製装置に備えられたタイマーによって乾燥時間が管理されてもよい。
　さらに、試料作製装置が乾燥手段で乾燥中の前記観察対象を観察可能な光学顕微鏡を備えることにより、乾燥によるイオン液体の減少程度や、イオン液体によって観察対象が収縮したり変形したりしていないかを確認することができる。また、上述のように、観察対象の色の変化からイオン液体が含浸したことを判断する場合に有効である。
　さらに、上述の実施例では、乾燥後に残ったイオン液体を含む溶液を、濾紙などの紙、あるいはガーゼ等のふき取り部材１４で吸引したが、試料作製装置に、同様のふき取り部材を取り付け、乾燥手段での乾燥後に残ったイオン液体を含む溶液を除去する手段とすることができる。
　また、試料作製装置に、観察対象の重量変化から前記イオン液体を含む溶液の乾燥の進行具合を検知する手段を備えることで、イオン液体が観察対象に含浸したかの判断に利用することができる。
　本実施例では、海洋の主要な水生生物であるカイアシ（ケンミジンコ類）を試料として、イオン液体水溶液を含浸させた水生生物を観察する手法、およびイオン液体水溶液を含浸させた水生生物を用いて光学顕微鏡用プレパラートを作成する手法について説明する。なお、以下において、実施例１と同様の部分については説明を省略する。本実施例で使用するカイアシは体長２mm以下であり、濃度９０％以上のエタノール溶液中に１ヶ月間保存していたものであるが、採取直後の試料を用いてもかまわない。
　最初にエタノール溶液中に保存していたカイアシを、水中に入れ、エタノールを水で置換する。このとき、エタノール溶液中では半透明であったカイアシの体色が、水で置換されたのちには不透明、白色に変化する。本実施例ではカイアシを水に浸した時間は８０分であったが、体色の変化が確認されれば、もっと短い時間でも良い。次に水中からカイアシを引き上げ、電子顕微鏡用の試料台に乗せ、余分な水分を濾紙などで吸引する。以上のステップは採取直後のヨコエビを使う場合など、試料の内部に予め水が含まれている場合には省略可能である。
　余分な水分を吸い取った後、試料が乾燥する前に手早く少量のイオン液体水溶液をピペット等で滴下するが、その手法は図３と同じである。カイアシの場合、最適なイオン液体水溶液の濃度は１０％であったが、この濃度は生物の種類の違い、または素材、組成、浸透圧の違いによって異なる。本実施例では２０mlのイオン液体水溶液を用いたが、水生生物がイオン液体水溶液中に浸されれば、これより多くても、少なくてもよい。イオン液体は親水性の性質を有するものが望ましく、本実施例ではＣ8Ｈ15Ｎ2ＢＦ4の化学式を有するイオン液体を使用した。また、イオン液体溶液の溶媒として水を用いる例を示したが、その他の溶媒でも良い。溶媒としては、水のほか、例えばエタノール、メタノール、アセトン、ヘキサン、エーテル、ホルムアルデヒドを含むホルマリンが考えられる。
　カイアシにイオン液体水溶液を滴下した後に２時間以上、風乾を実施する。風乾とは、実施例１と同様、イオン液体水溶液の浸透圧と観察対象の内部の浸透圧と拮抗させた状態でイオン液体水溶液を乾燥させることで、連続的に前記溶液中のイオン液体の濃度を上昇させるような溶媒除去方法を広く意味するものとする。イオン液体水溶液は、風乾によって徐々に量が減少し、最終的にカイアシの一部が露出することもある。イオン液体水溶液がカイアシの体内に浸透にするにつれて、カイアシの体色は白色から透明に変化する。これによってヨコエビの体内にイオン液体が含浸したことを判断できる。また、上述の体色変化による方法で予め標準的な試料の内部にイオン液体が含浸する時間を測定しておいて、実際に観察に用いる試料に含浸されたか否かは浸漬時間によって判断しても良い。イオン液体水溶液を滴下し、風乾を開始してから、概ね２～３時間の間はイオン液体水溶液の量が減少を続けるが、それ以後はイオン液体水溶液の量の変化がなくなり、風乾が完了する。ただし、風乾時間は気候条件および、イオン液体水溶液の滴下量によって左右される。このとき、イオン液体水溶液と、カイアシ内部の浸透圧が等しくなっているため、試料の破壊は起こらず、一昼夜以上放置しても形態は維持される。
　風乾が完了した後に、余分なイオン液体水溶液を、濾紙やペーパーウエスなどの紙、あるいはガーゼ等のふき取り部材で吸引する。その手法は図５と同じである。このとき濾紙やキムワイプなどの紙、あるいはガーゼ等に、水や親水性の溶液を、予め染み込ませておくことで、脚と脚の間などの細かな場所に付着したイオン液体水溶液を吸着することが可能である。これは試料表面の乾燥により粘性が増したイオン液体水溶液が、濾紙やペーパーウエスなどの紙、あるいはガーゼ等に含ませた水や親水性の溶液に接触することで、粘性が下がり、紙やペーパーウエスなどの紙、あるいはガーゼ等に吸収されやすくなるためである。イオン液体水溶液を除去しにくい場合には、濃度の低いイオン液体水溶液や水で洗浄することも可能である。また、吸水性の材質、例えばカーボン製試料台にカイアシを移し替えれば、余分なイオン液体水溶液を除去する効果が、さらに高くなる。
　余分なイオン液体を除去した後に電子顕微鏡で観察を実施する。観察に用いる電子顕微鏡は走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）であることが望ましい。ＳＥＭの基本構成は実施例１で説明したとおりである。図１０は、本実施例の手法を用いて、カイアシを電子顕微鏡で撮影した画像であり、浸透圧の変化に弱いカイアシの形態を変化、損傷させることなく電子顕微鏡で撮影できることを示している。図１０の電子顕微鏡画像２２は、試料台を４５°傾斜させて撮影したものであり、傾斜観察が可能であることも、この説明図より明らかである。
　参考として図１１に本実施例の方法を用いないで、カイアシを観察した例を示す。図１１に示した例は、イオン液体を用いる点以外は本実施例と同じ条件で観察したものである。図１１の電子顕微鏡画像２３から、カイアシは極めて乾燥に弱く、常温、常圧において著しく変形していることがわかる。本実施例を用いずに、常温で乾燥させたカイアシを観察することは不可能である。
　一般的に、カイアシの観察は光学顕微鏡下で行われている。本実施例のような観察試料作成方法によれば、極少量のイオン液体水溶液によって、試料台に吸着しているため、試料をカーボンテープや、カーボンペーストなどの接着剤で試料台に固着する必要がない。したがって、電子顕微鏡観察および解剖後に、電子顕微鏡用の専用試料台から試料を取り外し、試料となる水生生物を水やその他の封入剤で封入し、光学顕微鏡用プレパラートを作成することが可能である。電子顕微鏡でカイアシを観察したのちに、電子顕微鏡観察後のイオン液体水溶液で置換したカイアシを水やカナダバルサムなどの封入剤で封じることによって、光学顕微鏡下で観察することが可能である。
　従来の凍結乾燥法などで処理を行ったカイアシは、カイアシ内部に空洞が生じており、この空洞まで水やカナダバルサムを侵入させることは難しく、気泡が生じてしまう問題があった。本実施例の手法のように、水生生物の内部がイオン液体水溶液に満たされている状態であれば、カイアシ内部に空洞が生じないために、光学顕微鏡用プレパラートを作成しても水生生物内部に気泡が生じる恐れが少ない。
　なお、本実施例での試料作製方法も、実施例１で記載した試料作製装置によって実行されてもよい。さらに、試料作製装置に、イオン液体を含浸した観察対象に対して封入剤を滴下して、上述のように光学顕微鏡用プレパラートを作製する光学顕微鏡用試料作成手段を備えても良い。
　微小甲殻類や、大型甲殻類の幼生の分類法においては、付属肢と呼ばれる微細な脚の形態観察が重要視されている。甲殻類の付属肢は複雑に絡み合っているため、詳細な観察を行うためには、個々の付属肢を分離・解剖する必要がある。従来、甲殻類の付属肢の分離・解剖は光学顕微鏡下で実施されてきたが、光学顕微鏡下では解剖器具の操作が難しく、解剖には熟練した技術が必要であった。本実施例では、この問題点を解決するために、電子顕微鏡下で甲殻類を解剖する方法を説明する。なお、以下において、実施例１と同様の部分については説明を省略する。
　図１２は、イオン液体水溶液を含浸させることで柔軟性を得た水生生物を、電子顕微鏡の試料室内に設置したプローブを用いて、電子顕微鏡観察下で解剖することを示した説明図である。図１２において、イオン液体水溶液を含浸させることで、柔軟性を得た水生生物２４は、実施例１あるいは実施例２で示した処理を行った試料である。電子顕微鏡の試料室内に設置したプローブ２５は、電子顕微鏡観察を行いながら操作できることが望ましい。電子線による画像取得中に試料の操作を行うことで試料の動画像が得られ、試料の動的な状態を視覚的に認識することができる。
　水生生物２４の向きが、解剖の実施に適していない場合、プローブ２５を用いて水生生物２４を転がすように回転させる。水生生物を転がしたときの状態は、図７と同様である。図１２の説明図中、電子顕微鏡用の試料台８は、必要に応じて傾斜することが可能である。
　水生生物２４の向きを整えたのち、プローブ２５を用いて付属肢の関節を動かす、あるいは付属肢の切り離しなどの解剖を行う。このとき電子顕微鏡試料室内にプローブが２本以上設置されていれば、この操作が容易になる。したがって、電子顕微鏡試料室内のプローブの本数は２本以上であることが望ましい。電子顕微鏡の試料室内に設置したプローブにより解剖された水生生物の脚２６はプローブ２５によって切り離されたものである。
　本実施例のように、水生生物中の水または他の溶液を、イオン液体水溶液に置換して電子顕微鏡で観察する手法は、電子顕微鏡内の高真空環境においても、関節などの柔軟性を失わず、脚や、その他の可動部を動かすことができる効果がある。このため、電子顕微鏡観察後、あるいは電子顕微鏡観察中に、電子顕微鏡試料室内に設置したプローブなどを使用して、水生生物の脚や、その他の可動部を動かしつつ、観察することが可能となる効果がある。さらに、試料となる水生生物の解剖も可能になる。
　解剖された水生生物の脚はイオン液体水溶液で置換されているので、導電性を有する。したがって、チャージアップ現象に伴う破片の飛散、および破片の飛散による電子顕微鏡室内の汚染を軽減することが可能である。また、イオン液体水溶液で置換された水生生物は柔軟性を保持しているため、試料を破壊することなく、付属肢を曲げるなどの操作が可能である。
　解剖した試料は、そのまま電子顕微鏡で観察を行うが、必要に応じて、その他の分析機器、例えば光学顕微鏡で再観察してもよい。この場合は実施例２で説明した方法のように封入剤で光学顕微鏡用プレパラートを作成しても良い。生物顕微鏡で観察を行う場合、光学顕微鏡用のスライドガラス、あるいはカバーガラス上で上記の処理を行うことも可能である。一般にガラスは絶縁物であり、チャージアップ現象が生じるが、ガラス表面にイオン液体を薄く塗布することで導電性を付加することも可能である。
　なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
１　対物レンズ
２　試料
３　電子ビーム
４　反射電子信号
５　反射電子検出器
６　二次電子信号
７　二次電子検出器
８　試料台
９　イオン液体水溶液
１０　水で置換したヨコエビ
１１　ピペット
１２　濃縮されたイオン液体水溶液
１３　ヨコエビ
１４　ふき取り部材
１５　イオン液体水溶液で置換されたヨコエビの電子顕微鏡画像
１６　ヨコエビの触覚の毛
１７　１回目の電子顕微鏡観察後に、裏返しにして、再度、電子顕微鏡で観察したヨコエビの電子顕微鏡画像
１８　１回目の電子顕微鏡観察後に関節を動かした脚
１９　電子顕微鏡試料台を４５°傾斜させて観察した、イオン液体水溶液で置換したヨコエビの電子顕微鏡画像
２０　イオン液体を用いずにヨコエビを観察した電子顕微鏡画像
２１　乾燥によって変形したヨコエビの脚を拡大した電子顕微鏡画像
２２　イオン液体水溶液で置換されたカイアシの電子顕微鏡画像
２３　イオン液体を用いずにカイアシを観察した電子顕微鏡画像
２４　水生生物
２５　プローブ
２６　水生生物の脚

Claims (13)

  1. 　観察対象に荷電粒子線を照射することで得られる信号を検出して前記観察対象の画像を取得する試料観察方法であって、
    　イオン液体を含む溶液に前記観察対象を浸す浸漬ステップと、
    　前記イオン液体を含む溶液の浸透圧と前記観察対象の内部の浸透圧と拮抗させた状態で、前記イオン液体を含む溶液を乾燥させることで、前記溶液中のイオン液体の濃度を上昇させる乾燥ステップと、
    　前記イオン液体を含む溶液が内部に含浸した観察対象に前記荷電粒子線を照射して前記観察対象の画像を取得する観察ステップとを含むことを特徴とする試料観察方法。
  2. 　請求項１に記載の試料観察方法であって、
    　前記浸漬ステップの前に前記観察対象に水を含浸させるステップを有し、
    　前記観察対象の色の変化から前記乾燥ステップの終了を判断することを特徴とする試料観察方法。
  3. 　請求項１に記載の試料観察方法であって、
    　前記イオン液体は、親水性であることを特徴とする試料観察方法。
  4. 　請求項３に記載の試料観察方法であって、
    　前記乾燥ステップの後に、水または親水性の溶液が染み込んだ部材を用いて前記イオン液体を含む溶液を除去するステップを含むことを特徴とする試料観察方法。
  5. 　請求項１に記載の試料観察方法であって、
    　前記浸漬ステップで用いる前記イオン液体を含む溶液は、イオン液体の濃度が１０％以下であることを特徴とする試料観察方法。
  6. 　請求項１に記載の試料観察方法であって、
    　前記イオン液体を含む溶液が含浸した観察対象を封入剤で封じることで光学顕微鏡用のプレパラートを作成するステップと、
    　前記光学顕微鏡用のプレパラートを光学顕微鏡で観察するステップとを含むことを特徴とする試料観察方法。
  7. 　請求項１に記載の試料観察方法であって、
    　前記イオン液体を含む溶液が含浸した観察対象を、プローブを用いて解体または解剖するステップを有することを特徴とする試料観察方法。
  8. 　試料に荷電粒子線を照射することで得られる信号を検出して前記試料の画像を取得する装置で観察を行う試料前処理方法であって、
    　イオン液体を含む溶液に前記試料を浸す浸漬ステップと、
    　前記イオン液体を含む溶液の浸透圧と前記試料の内部の浸透圧と拮抗させた状態で、前記イオン液体を含む溶液を乾燥させることで、前記溶液中のイオン液体の濃度を上昇させる乾燥ステップと、を含むことを特徴とする試料前処理方法。
  9. 　観察対象に荷電粒子線を照射することで得られる信号を検出して前記観察対象の画像を取得する試料観察装置での観察に適した状態に前記観察対象を前処理する試料作製装置において、
    　前記観察対象をイオン液体を含む溶液に浸漬させる浸漬手段と、
    　前記イオン液体を含む溶液の浸透圧と前記観察対象の内部の浸透圧と拮抗させた状態で、前記イオン液体を含む溶液を乾燥させることで、前記溶液中のイオン液体の濃度を上昇させる乾燥手段とを備えることを特徴とする試料作製装置。
  10. 　請求項９に記載の試料作製装置において、
    　前記乾燥手段で乾燥中の前記観察対象を観察可能な光学顕微鏡を備えた試料作製装置。
  11. 　請求項９に記載の試料作製装置において、
    　前記乾燥手段での乾燥後に残ったイオン液体を含む溶液を除去する手段を備えた試料作製装置。
  12. 　請求項９に記載の試料作製装置において、
    　前記観察対象の重量変化から前記イオン液体を含む溶液の乾燥の進行具合を検知する手段を備えた試料作製装置。
  13. 　請求項９に記載の試料作製装置において、
    　前記浸漬手段は、前記観察対象に対して前記イオン液体を含む溶液を滴下するマイクロピペットであることを特徴とする試料作製装置。
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