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WO2013131162A1 - Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira com hidrólise enzimática e uso do mesmo - Google Patents

Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira com hidrólise enzimática e uso do mesmo Download PDF

Info

Publication number
WO2013131162A1
WO2013131162A1 PCT/BR2013/000069 BR2013000069W WO2013131162A1 WO 2013131162 A1 WO2013131162 A1 WO 2013131162A1 BR 2013000069 W BR2013000069 W BR 2013000069W WO 2013131162 A1 WO2013131162 A1 WO 2013131162A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
production
bioethanol
banana
sodium hydroxide
banana pseudostem
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/BR2013/000069
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Mauro César Marghetti LARANJEIRA
Cristiane PILISSÃO
Mariane MARTINI
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mater Pesquisa E Desenvolvimento Tecnologico Ltda
Paulista De Forca E Luz - Cpfl Cia
Original Assignee
Mater Pesquisa E Desenvolvimento Tecnologico Ltda
Paulista De Forca E Luz - Cpfl Cia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mater Pesquisa E Desenvolvimento Tecnologico Ltda, Paulista De Forca E Luz - Cpfl Cia filed Critical Mater Pesquisa E Desenvolvimento Tecnologico Ltda
Publication of WO2013131162A1 publication Critical patent/WO2013131162A1/pt
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P2201/00—Pretreatment of cellulosic or lignocellulosic material for subsequent enzymatic treatment or hydrolysis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a process for the production of bioethanol from fermentable sugars formed by enzymatic hydrolysis of chemically pretreated banana pseudostem biomass. More specifically, the present invention relates to enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material present in banana pseudostem for the production of fermentable sugars for further bioethanol formation.
  • Ethanol can be produced from a range of renewable energies.
  • Lignocellulosic wastes from agribusiness contain cellulose in combination with lignin.
  • Cellulose is the predominant polymer in lignocellulosic biomass, with hemicellulose and lignin found in smaller quantities.
  • the cellulose component in these materials can be converted to ethanol in a two step process, where the cellulose is first converted to sugars (glucose) by hydrolysis; The resulting sugars in turn can be converted to ethanol by fermentation.
  • sugars sugars
  • a pretreatment of these available carbohydrates is required to facilitate enzymatic hydrolysis and fermentation, as revealed by El-Zawawy, WK and colleagues in the study. work entitled "Acid and enzyme hydrolysis to convert pretreated lignocellulosic materials into glucose for ethanol production" published in Carbohydrate Polymers in 2011, V. 84, pgs. 865-871.
  • pretreatment processes have been developed for lignocellulosic materials in the state of the art. These are performed in part by solubilization of hemicelluloses and in part by lignin degradation. Pretreatments are: grinding and grinding, pyrolysis, high energy radiation, high vapor pressure, alkali or acid, gas treatment (chlorine dioxide, nitrogen and ozone), hydrogen peroxide, organic solvent treatment, hydrothermal treatment. , steam explosion, wet oxidation and biological treatment.
  • Plant waste has aroused great interest in bioethanol production.
  • the most studied route for its conversion to fermentable sugars has been acid hydrolysis, both in isolation, as Del Campo and colleagues describe, in their paper entitled “Diluted acid hydrolysis pretreatment for agri-food wastes for biotethanol production", published in Industrial. Crops and Products in 2006, V.24, pages. 214-221, as combined with enzymatic hydrolysis, according to the article by Cara et al., Entitled “Conversion of olive tree into fermentable sugars by dilute acid pretreatment and enzymatic saccharification” published in Bioresource Technology in 2008, V. 99, pags .1869-1876.
  • the banana tree is one of the main fruit in exploitation in Brazil; However, the amount of bananas produced annually in the country is only surpassed by oranges. Banana is grown without exception in all states of the Federation.
  • the state of Santa Catarina the second largest national banana producer, produced 668,000 tons of the fruit, mainly the species Musa sapientu and Musa cavendischii, popularly known in the region as white banana and banana nanica, respectively (CEPA, 2006).
  • Data from EMBRAPA (2006) show that of every 100 kg of fruits harvested in 2006, 46 kg were not used. In addition to this waste, the banana crop generates other residues. in the countryside from its industrialization.
  • this treatment modifies the lignocellulosic structure so that it can be quickly solubilized by cellulase, even using high solids contents (10 to 30%), without affecting enzymatic activity.
  • Commercial enzymes such as Spezyme CP (Genecor international Co) and Novo 188 (Novozyrr.es) were used.
  • each lignocellulosic material behaves differently with the pretreatments due to its lignin, cellulose and hemicellulose content. Therefore, in the present invention different pretreatments were performed with a single substance or in combinations, for example: sodium hydroxide (5%) under reflux of 2 hours; sulfuric acid (5%) at reflux for 2 hours; combination of sodium hydroxide and sulfuric acid; combination of sodium hydroxide with sodium hypochlorite and hydrogen peroxide; combination of sodium hydroxide with vinegar or acetic acid and hydrogen peroxide. This may include 3% sodium hydroxide and pure steam explosion or in combination with sodium hydroxide.
  • the yield of glucose with NaOH (3%) at 2 hours of reflux and with 0.03mL of the enzymes NS 2207 (cellulosic complex ⁇ -glucosidase, xylanase) and NS 50012 (cellulosic complex arabinase, hemicellulase, cellulase, pectinase and xylanase) for each 0.2 g of pretreated material was 85% within 48 hours of shaker reaction at 50 ° C.
  • the process of the invention provides a process comprising the steps of: (a) pre-treating the lignocellulosic plant biomass with an alkaline hydrogen peroxide solution; and b) Enzymatic hydrolysis of the pretreated biomass using mixtures comprising cellulases, glycosidases, hemicellulases, or combinations thereof.
  • said process further comprises a fermentation step of the carbohydrates produced in the previous steps, providing the production of ethanol and / or other alcohols.
  • the present invention uses only sodium hydroxide (3%) in 2h reaction whereas Brazilian patent application PI 0802559-2 uses 7.35% hydrogen peroxide plus the base amount to reach pH 11.5. , the concentration required to carry out this process was not cited in said document PI 0802559-2.
  • the glucose yield obtained by the present invention was 85% within 48 hours of reaction with only 0.03 ml of the NS 22074 and NS 50012 enzyme mix for each 0.2 grams of substrate.
  • Brazilian patent application PI 0802559-2 obtained 84% glucose yield.
  • the present invention employs a banana pseudostem lignocellulosic material, while Brazilian patent application PI 0802559-2 employs sugarcane bagasse and / or straw.
  • the present invention utilizes sodium hydroxide (3%) in 2h reaction after steam explosion reaction, which assists in the removal of any interferent that forms during steam explosion which is undesirable for fermentation and afterwards. obtaining ethanol.
  • the pretreatments disclosed in the present invention resulted in increased glucose yield from 51% to 71.5% with only 0.03 ml of enzyme, and enzymes NS 22074 (cellulosic complex-p-glucosidase) were used.
  • NS 22074 cellulosic complex-p-glucosidase
  • NS 50012 cellulosic complex arabinase, ⁇ - glucanase, hemicellulase, cellulase, pectinase and xylanase.
  • the present invention will provide significant advantages over bioethanol production processes using chemical pretreatment of banana pseudostem followed by enzymatic hydrolysis with commercial enzymes, enabling an increased performance and cost effectiveness. / most favorable benefit.
  • the process of the present invention is based on the chemical treatment of banana pseudostem followed by enzymatic hydrolysis using commercial enzymes such as NS 22074 and NS 50012 to obtain fermentable sugars for further bioethanol formation.
  • each lignocellulosic material behaves differently with the pretreatments, since the composition of biomass varies according to its plant origin (lignin content, cellulose and hemicellulose) and the way they are associated.
  • the process of the present invention is quite versatile as it provides the selection of the best pretreatment to be applied to banana pseudostem.
  • the processes employed in the present invention have shown by HPLC analysis that the main fermentable sugar formed is sucrose and there is no generation of compounds that are inhibitory in the later stages.
  • the present invention describes a method of improving the degradation of lignocellulosic material using chemical pretreatment, as well as increasing the yield of fermentable sugars in enzymatic hydrolysis with the mixing of commercial cellulases NS 22074 and NS 50012 for further ethanol production.
  • the present invention relates to the evaluation of the percentage conversion to fermentable sugars and the amount of biomass required to produce fermentable sugars for ethanol production.
  • Another advantage of the present invention is that it employs the main enzyme for use in the hydrolysis of lignocelluloses to NS 22074 (cellulosic complex ⁇ -glucosidase, xylanase) and the effect of this enzyme is enhanced by the addition of the enzyme NS 50012. (cellulosic complex - arabinase, hemicellulase, cellulase, pectinase and xylanase).
  • the present invention has several advantages over the state of the art, such as practicality, high enzymatic hydrolysis of banana pseudostem, providing good yields of reducing sugars and thus enabling good yields in the production of. ethanol.
  • the process disclosed by the present invention utilizes a highly sustainable substrate because it is a tailings, which enables the production of ethanol from this lignocellulosic material.
  • the present invention discloses different pretreatments to evaluate, which one is most suitable for banana pseudostem biomass, where the treatment with refluxing sodium hydroxide (3%) is better than those described in the state of the art, even better than Sodium hypochlorite.
  • Another aspect of the present invention is that the reaction condition described in the process of the present invention has not been reported in the prior art. None of the pretreatment methods described in the prior art utilize the same combinations of reagents and equipment as the ultrasonic bath used in the process of the present invention. Considering that, in the state of the art, the studied biomass is sugarcane bagasse or straw, the present invention has relevance when using banana pseudostem as an alternative lignocellulosic biomass, abundantly generated in the agricultural sector, for the production of second generation bioethanol. .
  • the present invention has obtained 85% yield in fermentable sugars with a minimal amount of enzyme, much lower than that described in the prior art, and another important aspect is that the biomass of the present invention is free of interfering affecting fermentation due to the sodium hydroxide treatment that was used, in addition to the absence of xylose and the presence of sucrose as the main sugar reducer formed.
  • the enzymes used in the process of the present invention are different from those described in the prior art, although: they are cellulase, ⁇ -glycosidase hemicellulase, their origin is distinct
  • banana caturra (fresh) pseudostem was washed with running water about 3 times to remove the dirt and the resin, then placed in an oven at 60 ° C for drying. After drying the banana pseudostem was ground in a Willye model MA680 mill with a 30 mesh sieve and stored in plastic bags for later chemical treatments and enzymatic hydrolysis (this washed material is called from this biomass step ), described in Brazilian patent application PI 1102362-7 and incorporated herein by reference in its entirety.
  • Pretreatment with sodium hydroxide was performed by adding 10g of the banana pseudostem biomass in a round bottom flask and 200 mL of a (5% w / v) or (3% w / v) sodium hydroxide solution, this mixture was refluxed for 2 hours. At the end of this period the solution was filtered and the remaining solid was washed with distilled water. The collected solid was placed in the steam oven until its drying at a temperature of approximately 60 ° C. After drying the material was ground and enzymatic hydrolysis was performed.
  • Treatment with sodium hydroxide followed by the mixture of acetic acid and hydrogen peroxide was performed by adding 10g of the banana pseudostem biomass in an erlenmeyer and 100 ml of a sodium hydroxide solution (0.1M), this mixture was stirred on a shaker. magnetic for 1 hour at 70 ° C or in a cold bath. ultrasound at a fixed temperature of 60 ° C.
  • reaction mixture was filtered and washed with distilled water until the pH was adjusted to 4-5. After the collected solid was placed in the steam oven until its drying at a temperature of approximately 60 ° C. Subsequently, the dried material was ground and stored for later enzymatic hydrolysis.
  • Sulfuric acid treatment was performed by adding 10 g of biomass in a round bottom flask and 200 mL of a 5% (v / v) sulfuric acid solution, the reaction mixture was kept for 2 hours under reflux. At the end of this. The reaction mixture was then filtered and the solid was washed with distilled water, the collected solid material was placed in a steam oven until drying at approximately 60 ° C. Subsequently, the dried material was ground and stored in flasks for further enzymatic hydrolysis.
  • Table 1 shows the percentage of reducing sugars released from the 0.1 lb suspensions of banana pseudostem with different chemical pretreatments with the mixture of NS 22074 (0.015mL) and NS 50012 (0.015mL) cellulas directly assisted in the ultra bath. only at a fixed temperature of 60 ° C for 4 hours and the amount of biomass required to produce 1 kg of reducing sugars.
  • acetic acid / H 2 0 2 Banana pseudostem treated with sodium hydroxide for 1 hour at 70 ° C, followed by treatment with the mixture acetic acid and hydrogen peroxide for 6h at 70 ° C.
  • NaOH / vinegar / H 2 0 2 banana pseudostem treated with sodium hydroxide for 1 hour at 70 ° C, followed by treatment with mixing vinegar and hydrogen peroxide for 6h at 70 ° C.
  • NaOH / sodium hypochlorite / H 2 0 2 Banana pseudostem treated with sodium hydroxide for 1 hour at 70 ° C, followed by treatment with the mixture of sodium hypochlorite and hydrogen peroxide for 6h at 70 ° C .
  • H2SO4 Banana pseudostem treated with sulfuric acid (5%) for 2 hours under reflux.
  • the present invention shows that when using pretreatment with sodium hydroxide (5%), the conversion to fermentable sugars was 51%, this result was better than using pre-treated biomass. treated with sodium hydroxide followed by peracetic acid (this pretreatment was developed in patent application PI 1102362-7 and incorporated herein by reference in its entirety), however, to compare pretreatments, it performed enzymatic hydrolysis on the same reaction conditions as described in this invention.
  • the best result obtained was using sodium hydroxide pretreated biomass (5%) and performing assisted enzymatic hydrolysis in an ultrasound bath.
  • Table 2 shows the percentage of reducing sugars released from suspensions of 0.1 g of sodium hydroxide pretreated banana pseudostem (5%) under reflux for 2 hours or pre-treated biomass.
  • sodium hydroxide followed by pretreatment with peracetic acid with the mixture of cellulase NS 22074 (0.015mL) and NS 50012 (0.015mL) in the shaker bath at 50 ° C and rpm 150 for 4 and 24 hours and the amount of biomass needed to produce 1 kg of reducing sugars
  • Table 2 also shows that sodium hydroxide pretreatment is better than sodium hydroxide treatment followed by peracetic acid, since the conversion to fermentable sugars was about 40% higher when using the sodium hydroxide pretreated biomass. sodium.
  • the present invention shows that depending on the chemical pretreatment, the enzyme and the reaction conditions used the enzymatic hydrolysis may be more efficient with one method or another.
  • Table 3 The results of the percentage of fermentable sugars and the amount of biomass required to produce 1 kg of fermentable sugars are presented in Table 3.
  • Table 3 shows the percentage of reducing sugars released from 0.2g suspensions of sodium hydroxide pretreated banana pseudostem (5%) under reflux for 2 hours or pretreatment with sodium hydroxide followed by peracetic acid with mix the NS 22074 (0.015mL) and NS 50012 (0.015mL) cellulases in the shaker bath, the temperature of 50 ° C and rpm of 150 for 4, 24 and 48 hours and the amount of biomass required to produce IKg of reducing sugars. . .
  • the results of the percentage of fermentable sugars and the amount of biomass required to produce 1 kg of fermentable sugars are presented in Table 4.
  • Table 4 shows the percentage of reducing sugars released from 0.2g suspensions of sodium hydroxide pretreated banana pseudostem (3%) under reflux for 2 hours or steam blast pretreatment followed by sodium hydroxide (3%) for 2 hours under reflux with the mixture of NS 22074 (0.015mL) and NS 50012 (0.015mL) cellulases in the shaker bath at a temperature of 50 ° C and rpm of 150 by 4, 24 and 48 hours and the amount of biomass needed to produce 1 kg of reducing sugars.
  • Table 5 HPLC chromatography analyzes of the sodium hydroxide-treated banana pseudostem (3%) samples at 2 hours of reflux.
  • Table 6 shows that for steam blast treated samples followed by pretreatment with 2 hours reflux sodium hydroxide (3%), the main reducing sugar is sucrose, the second is. glucose and xylose is absent. In this treatment, the presence of very small amount of hydroxymethylfurfural in the samples is confirmed.
  • Table 6 HPLC chromatography analyzes of steam-blown banana pseudostem samples followed by pre-treatment with sodium hydroxide (3%) with 2 hours of reflux.
  • An important aspect of the present invention is that enzymatic hydrolysis using the mixture of sodium hydroxide-treated banana pseudostem enzymes NS 22074 and NS 50012 (3%) with 2 hours reflux and treated with steam explosion followed by pretreatment with sodium hydroxide resulted in the formation of sucrose as the main fermentable sugar which can be easily and efficiently converted to ethanol by the microorganism Saccharomyces cereviseae under industrial conditions.
  • the influence of the mixture of the enzymes NS 22074 and NS 50012 in comparison with the pure cellulase NS 22074 is emphasized.
  • the use of the enzyme NS 50012 enhances the enzymatic hydrolysis and thereby reduces the enzymatic cost.

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Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção para: "PROCESSO. PARA A PRODUÇÃO DE BIOETANOL A PARTIR DO PSEUDOCAULE DE BANANEIRA COM HIDRÓLISE ENZIMÁTICA E USO DO MESMO".
Campo da Invenção
A presente invenção se refere a um processo para a produção de bioetanol a partir de açúcares fermentáveis formados através da hidrólise enzimática da biomassa do pseudocaule de bananeira pré-tratada quimicamente. Mais especificamente, a presente invenção se refere à hidrólise enzimática do material lignocelulósico presente no pseudocaule de bananeira visando à produção de açúcares fermentáveis para posterior formação de bioetanol.
Antecedentes da Invenção
As perspectivas de esgotamento das reservas de petróleo e os compromissos mais sólidos com a questão ambiental, desde a assinatura do Protocolo de Quioto, fizeram renascer a atenção nas fontes alternativas de energia. Existem diversas fontes alternativas de energia que, embora não possam substituir o petróleo em sua totalidade, pelo menos podem contribuir para diminuir o seu consumo. Entre elas, uma de particular interesse, em função da sua abundância e do seu caráter renovável, é a biomassa vegetal, principalmente aquela formada por resíduos florestais e agrícolas.
No entanto, a matéria-prima para produção de bioetanol deve ser proveniente de partes não comestíveis dos alimentos, a fim de evitar a concorrência direta entre o bioetanol e a produção de alimentos (Sakai et al. , 2007). O etanol pode ser produzido a partir de uma série de energias renováveis.
Resíduos lignocelulósicos da agroindústria contêm celulose, em combinação com a lignina. A celulose é o polímero predominante na biomassa lignócelulósica, com hemicelulose e lignina encontrados em quantidades menores. 0 componente de celulose nestes materiais pode ser convertido em etanol em um processo de duas etapas, onde a celulose é primeiro convertido em açúcares (glicose) por hidrólise; os açúcares resultantes por sua vez podem ser convertidos em etanol por fermentação. No entanto, devido à estreita associação da celulose e hemicelulose com a lignina na parede celular das plantas, é necessário fazer um pré-tratamento desses carboidratos disponíveis para facilitar a hidrólise enzimática e a fermentação, conforme revelado por El-Zawawy, W.K. e colaboradores no trabalho intitulado "Acid and enzyme hydrolysis to convert pretreated lignocellulosic materiais into glucose for ethanol production" publicado na Carbohydrate Polymers em 2011, V. 84, pgs. 865-871.
Endo e colaboradores descreveram no trabalho intitulado "Genome-wide screening of the genes required for tolerance to vanillin , which is a potential inhibitor of bioethanol fermentation in Saccharomyces cerevisiae", publicado na Biotechnology for Biofuels em 2008, 1, 3, que por razões económicas, pré-tratamentos termoquímicos vem sendo realizados, tais como hidrólise ácida diluída e a explosão a vapor, que solubiliza o componente hemicelulose e aumenta a acessibilidade de celulose.
Entretanto, nem todo o tipo de biomassa lignócelulósica pode ser pré-tratado da mesma forma. Enquanto a explosão a vapor tem sido experimentado e testado para agros resíduos, como palha de milho e palha de arroz, uma hidrólise ácida é necessária para produção de açúcar a partir de madeira macia. Assim, é necessário realizar uma investigação para determinar a .melhor estratégia do pré-tratamento que. pode ser a mais económica, e ao mesmo tempo, pode satisfazer todas as características de um bom pré-tratamento conforme descrito em diversos trabalhos no estado da técnica.
Vários processos de pré-tratamento foram desenvolvidos para materiais lignocelulósicos no estado da técnica. Estes são realizados em parte pela solubilização das hemiceluloses e, em parte, pela degradação da lignina. Os pré-tratamentos são: moagem e trituração, pirólise, radiação de alta energia, alta pressão de vapor, alcalinos ou ácidos, tratamento de gás (dióxido de cloro, nitrogénio e ozônio) , peróxido de hidrogénio, tratamento com solvente orgânico, tratamento hidrotérmico, explosão a vapor, oxidação úmida e tratamento biológico.
Os resíduos vegetais têm despertado grande interesse na produção de bioetanol. A rota mais estudada para a sua conversão em açúcares fermentáveis tem sido a hidrólise ácida, tanto de forma isolada, conforme descreve Del Campo e colaboradores , no trabalho intitulado "Diluted acid hydrolysis pretreatment of agri-food wastes for biotethanol production" , publicado na Industrial Crops and Products em 2006, V.24, pags . 214-221, tal como combinada com a hidrólise enzimática, conforme o artigo de Cara e colaboradores , intitulado "Conversion of olive tree biomass into fermentable sugars by dilute acid pretreatment and enzymatic saccharification" publicado na Bioresource Technology em 2008, V. 99, pags .1869-1876.
Entre os resíduos gerados na agricultura encontra-se a biomassa da bananicultura . As condições de produção, industrialização e comercialização da banana resultam em grande quantidade de matéria vegetal, tanto em termos de resíduos acumulados quanto de frutos rejeitados.
Souza e colaboradores descreveram no trabalho intitulado "Biodegradação de resíduos lignocelulósicos gerados na bananicultura e sua valorização para a produção de biogás" publicado na Revista Brasileira de Engenharia Agrícola e Ambiental em .2010, V. 4, pags . 438-443, que a produção de bioetanol a partir da biomassa da bananicultura torna-se um processo bastante atraente. Além de permitir a criação de uma fonte alternativa e renovável de energia e de contribuir com a redução de resíduos no meio ambiente, a geração de energia pode agregar valor à matriz produtiva da fruta reduzindo assim o risco de perdas provocadas pelas oscilações do seu preço no mercado.
A bananeira é uma das principais frutíferas em exploração no Brasil; entretanto, a quantidade de bananas produzidas anualmente no País só é superada pela de laranjas. A bananeira é cultivada, sem exceção, em todos os estados da Federação. Em 2005, o estado catarinense, segundo maior produtor nacional de bananas, produziu 668 mil toneladas da fruta, principalmente as das espécies Musa sapientu e Musa cavendischii , popularmente conhecidas na região como banana branca e banana nanica, respectivamente (CEPA, 2006). Dados da EMBRAPA (2006) mostram que, de cada 100 kg de frutas colhidas em 2006, 46 kg não foram aproveitados. Além desse rejeito, a cultura da banana gera outros resíduos . no campo provenientes da sua industrialização. De acordo com dados levantados em uma empresa de alimentos do município de Garuva, um dos maiores produtores de banana nanica na região nordeste do estado de Santa Catarina, para . cada tonelada de banana industrializada aproximadamente 3. toneladas de pseudocaule, .160 kg de engaços, 480 kg de folhas e 440 kg. de . cascas são gerados.
Conforme Yoswathana. e colaboradores escreveram em seu trabalho intitulado "Bioethanol Production . from Rice Straw" , publicado na Energy Research Journal, 1; 26-31 em .2010, a palha do arroz tem sido tratada com diferentes produtos químicos (ácidos ou álcalis) e métodos físicos (água subcrítica, ultra-som) para converter o material lignocelulósico em açúcar. 0 tratamento com ácido sulfúrico (1-9%) a 121°C durante 15 minutos é um método de pré- tratamento eficaz para conversão de lignocelulose para o açúcar, sendo que foi medido 21% de conversão em açúcares após o tratamento com o ácido. Um bom resultado foi obtido ao utilizar a combinação do pré-tratamento químico e enzimático, sendo que aumentou o rendimento de açúcares, para 37 e 28% para as amostras pré- tratadas com ácido e alcalis, respectivamente. Melhor resultado foi obtido ao utilizar a combinação do pré-tratamento ácido com ultra-som antes do tratamento enzimático, sendo que a conversão em açúcar aumentou para 44%.
El-Zawawya e colaboradores escreveram em seu trabalho intitulado: "Acid and enzyme hydrolysis to convert pretreated lignocellulosic materiais into glucose for ethanol production" , publicado na Carbohydrate Polymers, 84 865-871 em 2011, a hidrólise ácida e enzimática para a produção de glicose a partir de palha de arroz, resíduos de bananeira e sabugo de milho pré-tratados , como materiais lignocelulósicos . A hidrólise enzimática da celulose em glicose é realizada por enzima celulase. A hidrólise foi realizada em condições brandas (por exemplo, pH 4,5-5,0 e temperatura 40-50 °C) . Neste caso não teve grandes problemas' de corrosão, apresentou baixo consumo de energia e baixa toxicidade dos hidrolisados como as principais vantagens deste processo em comparação com a hidrólise ácida realizada com ácido diluído em temperatura mais elevada. Ao realizar a hidrólise enzimática com o resíduo de bananeira, o melhor resultado obtido foi ao utilizar a biomassa pré- tratada com explosão a vapor, sendo que em 24 horas de reação foram formados 9 g/L de glicose.
O pedido de patente internacional WO 2008/095098, depositado em 31 de janeiro de 2008 em nome de Board of Supervisors of Louisiana State University & Agricultural & Mechanical College descreve um processo para obtenção de açúcares a partir de biomassa lignocelulósica, no qual se faz um pré-tratamento alcalino a quente do material com uma mistura de hidróxido de cálcio e água a temperatura de 80°C a 140°C durante cerca de 30 min a 3 horas. Após o tratamento, o bagaço é prensado; o líquido contém principalmente componentes solúveis de lignina, além de cal (que pode ser recuperada) e o material sólido fibroso é submetido à hidrólise por enzimas celulásicas .. Segundo os autores, este tratamento modifica a estrutura lignocelulósica de modo que possa ser rapidamente solubilizada pela celulase, mesmo usando altos teores de sólidos (10 a 30%), sem que a atividade enzimática seja afetada. Foram utilizadas enzimas comerciais, como por exemplo, Spezyme CP (Genecor international Co) e Novo 188 (Novozyrr.es ) .
O pedido de patente brasileiro PI 0700481-8, depositado em 02 de março de 2007 e intitulado "Pré- tratamento de bagaço de cana-de-açúcar para produção de etanol" em nome de Fundação Universidade de Caxias do Sul descreve processos de pré-tratamento alcalinos para o bagaço de cana-de-açúcar e posterior hidrólise com a enzima de Penicillíum echinulatum para a obtenção de açúcares fermentáveis. Esta invenção empregou quantidades de enzima de 10 a 15 FPU por grama de biomassa seca a temperatura de 40-60°C durante 24-48 horas. Os rendimentos em. açúcares fermentáveis foram de 50-90%.
O pedido de patente internacional WO 2006/110901 depositado em 12 de abril de 2006 em nome de E . I. Du Pont de Nemours and Company e intitulado " Treatment of biomass to obtain fermentable sugars" , relata o pré-tratamento da biomassa usando baixas concentrações de amónia aquosa a grandes concentrações de biomassa. A biomassa pré-tratada é hidrolisada com enzimas.
O pedido de patente internacional WO 2006/026863, · depositado em 09 de setembro de 2005 em nome de Iogen Energy Corporation e intitulado " Process for producing a pretreated feedstock" revela um método para tratar biomassa lignocelulósica - grama, palhas de cereais e sabugo ou combinações destes materiais. Por este método, os resíduos são triturados e o pré-tratamento é realizado com a adição de ácido diluído aos resíduos. Esta mistura é mantida em temperatura de 160°C a 280°C.
O pedido de patente internacional WO 2005/078140, depositado em 08 de fevereiro de 2005 em nome de JGC Corporation e intitulado "Process for producing monosaccharide from biomass and monosaccharide production apparatus" revela um processo que compreende uma primeira etapa, onde a biomassa é tratada com ácido sulfúrico na concentração de 65 a 85%, a temperaturas de 30 a 70°C e, na segunda etapa, ocorre a sacarificação do produto obtido na primeira, etapa. Esta sacarificação é realizada com ácido sulfúrico na concentração de 20 a 60% a temperaturas de 40 a 100°C.
Reyes e colaboradores descreveram no trabalho, intilulado Hidrólise enzimática de casca de arroz utilizando-se celulases . Os efeitos de tratamentos químicos e fotoquímicos" , publicado na Quim. Nova em 1998, 21,2, a hidrólise enzimática da . casca de arroz utilizando um preparado de celulase comercial. Os resultados mostraram que o pré-tratamento com clorito de sódio e luz inibe -o processo de hidrólise enzimática, enquanto que com o peróxido de hidrogénio e o ozônio favoreceu a produção enzimática de açúcares redutores, sendo de 5,9 e 54,9%, respectivamente .
0 pedido de patente brasileiro PI 9200100-9 depositado em 15 de janeiro de 1992 em nome de U.S. Department of Energy e intitulado "Processo para sacarificação e fermentação simultâneas" descreve um processo para produzir etanol a partir da biomassa em que o substrato inclui um hidrolisado de celulose, hemicelulose e amido, visando produzir açúcares fermentáveis de seis carbonos. Para a fermentação é utilizada uma cepa de levedura geneticamente modificada (Brettanomyces custersii CBS 5512) que produz a enzima B-glucosidade, o que torna esta levedura com habilidade de fermentar tanto glicose quanto celobiose.
O pedido de patente brasileiro PI 0408165-0, depositado em 08 de março de 2004 em nome de Athenix Corporation e intitulado "Processos para melhorar a atividade das enzimas de degradação de lignocelulose" descreve um método para hidrolisar materiais lignocelulósicos para a obtenção de açúcares, além disso, utiliza um pré-tratamento :. químico com condições de temperatura (10-90°C) e pressão (2 atm) . Nesta invenção o pré-tratamento é realizado com peróxido de hidrogénio, hipoclorito de cálcio dá biomassa de palha de milho. Ao utilizar a biomassa pré-tratada com peróxido de hidrogénio e com a celulase T. longíbrachiatum (25mg) durante 24h a 65°C, o rendimento foi de 47%. No referido documento PI 0408165-0, ao utilizar a enzima Spezyme (0,3mL para 0,2g de biomassa) o rendimento obtido foi de 71,9% em 24 horas de reação, e sem prévio pré-tratamento o rendimento foi de 32,8%. Além disso, os autores descrevem que a partir do material hidrolisado eles podem produzir de uma forma geral um combustível, , um fármaco, um ácido orgânico, um ácido lático, uma enzima industrial e um aminoácido. Na presente invenção podem-se obter todos estes produtos, no entanto foi enfatizada a formação de combustível etanol. Além disso, na presente invenção foram realizados diferentes pré-tratamentos químicos.
No estado da técnica já é bem descrito diversos pré- tratamentos químicos ou físicos, mas cada material lignocelulósico se comporta de forma distinta com os pré- tratamentos devido ao seu teor de lignina, celulose e hemicelulose . Portanto, na presente invenção foram realizados diferentes pré-tratamentos com uma única substância ou em combinações, por exemplo: hidróxido de sódio (5%) sob refluxo de 2 horas; ácido sulfúrico (5%) sob refluxo de 2 horas; combinação de hidróxido de sódio e ácido sulfúrico; combinação do hidróxido de sódio com o hipoclororito de sódio e peróxido de hidrogénio; combinação do hidróxido de sódio com vinagre ou ácido acético e peróxido de hidrogénio. Aqui se pode incluir o hidróxido de sódio 3% e a explosão a vapor pura ou em combinação com hidróxido de sódio.
É importante ressaltar que na presente invenção o rendimento em glicose com NaOH (3%) em 2 horas de refluxo e com 0,03mL das enzimas NS 2207 (complexo celulósico-β- glucosidase, xilanase) e NS 50012 ( complexo celulósico - arabinase, hemicelulase, celulase, pectinase e xilanase) para cada 0,2 g de material pré-tratado foi de 85% em 48 horas de reação em shaker a 50°C. Ao realizar a hidrólise da amostra com explosão a vapor o rendimento foi de 51%, e quando foi realizado a combinação com hidróxido de sódio e explosão a vapor o rendimento foi de 71,5%, enquanto que na invenção presente no documento PI 0408165-0 . foram necessários 0,3 mL da enzima Spezyme para obter 71,9% de rendimento em glicose. Já é descrito também no estado da técnica que para hidrolisar o material lignocelulósico é necessário utilizar celulase. Portanto nota-se que .a presente invenção é diferente da descrito no pedido de patente brasileiro PI 0408165-0 que utiliza as seguintes enzimas Spezyme (0,3mL) e T. Longibhachiatum (25mg) . Além de serem enzimas diferentes a quantidade usada no pedido de patente brasileiro PI 0408165-0 foi superior a quantidade utilizada na presente invenção. Ademais, o pré-tratamento com hidróxido de sódio demonstrou ser melhor que o do hipoclorito de sódio, e no caso da presente invenção não foi necessário utilizar pressão e temperaturas elevadas ao realizar a reação com hipoclorito de sódio, foram menores que na condição ótima obtida no pedido de patente brasileiro PI 0408165-0 e, finalmente, salienta-se que o substrato pseudocaule de bananeira da presente invenção é - diferente dos. materiais lignoeelulósicos empregados no documento. do pedido de patente brasileiro PI 0408165-0.
.0 pedido de patente brasileiro PI 0802559-2, depositado em 07. de. julho de 2008 em nome Universidade Estadual de Campinas - Unicamp e intitulado "Processo de pré-tratamento e hidrólise . de biomassa vegetal lignocelulósica , e produto para a produção industrial, de álcoois" descreve processos de pré-tratamento e hidrólise de biomassa vegetal. O produto obtido pelo referido processo é substancialmente útil como insumo na produção industrial de etanol e/ou outros álcoois. Em um aspecto preferencial, o processo da invenção proporciona um processo compreendendo as etapas de: a) Pré-tratamento da biomassa vegetal lignocelulósica com uma solução de peróxido de hidrogénio alcalino; e b) Hidrólise enzimática da biomassa pré-tratada utilizando misturas compreendendo celulases, glicosidases , hemicelulases , ou combinações das mesmas. Opcionalmente, o referido processo adicionalmente compreende uma etapa de fermentação dos carboidratos produzidos nas etapas anteriores, proporcionando a produção de etanol e/ou outros álcoois.
A presente invenção usa somente o hidróxido de sódio (3%) em 2h de reação enquanto que o pedido de patente brasileiro PI 0802559-2 utiliza 7,35% de peróxido de hidrogénio e mais a quantidade de base para atingir o pH 11,5, não foi citado no referido documento PI 0802559-2 a concentração necessária para realizar este processo. O rendimento em glicose obtido pela presente invenção foi de 85% em 48 horas de reação com apenas 0,03 mL da mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012 para Cada 0,2 gramas de substrato. Enquanto o pedido de patente brasileiro PI 0802559-2 obteve 84% de rendimento em glicose. Além disso, a presente, invenção emprega um material lignocelulósico pseudocaule de bananeira, enquanto que o pedido de patente brasileiro PI 0802559-2 emprega bagaço e/ou palha de cana. As enzimas utilizadas no pedido de patente brasileiro PI 0802559-2 não foram definidas e muito menos quais foram utilizadas e sim que são uma celulase, β-glicosidase , hemicelulase ou combinação destas e a quantidade é muito maior em relação ao que foi utilizada na presente invenção.
O pedido de patente brasileiro PI 0608369-2, depositado em 14 de março de 2006 em nome de Novozymes North America, INC e intitulado "Processo para a produção de um produto de fermentação a partir de material lignocelulósico" fornece um processo de produção de um produto de fermentação que compreende as etapas de i) pré- tratar o material lignocelulósico para a liberação ou separação de celulose, hemicelulose e/ou lignina, ii) submeter o material pré-tratado a uma celulase, iii) fermentar na presença de um organismo de fermentação, em que a xilose isomerase é adicionada na etapa ii) e/ou etapa iii). A presente invenção utiliza hidróxido de sódio (3%) em 2h de reação posterior a reação de explosão a vapor, o que auxilia na remoção de algum interferente que se forma durante a explosão a vapor, o qual não é desejável para a fermentação e posteriormente obtenção de etanol. Além disso, os pré-tratamentos revelados na presente invenção resultaram no aumento do rendimento de glicose de 51% para 71,5 % com apenas 0,03 mL de enzima, sendo que se utilizou as enzimas NS 22074 (complexo celulósico-p-glucosidase, xilanase) e NS 50012 (complexo celulósico- arabinase, β- glucanase, hemicelulase, celulase, pectinase e xilanase) . Enquanto, o pedido de patente brasileiro PI 0608369-2 utiliza as enzimas Novozym 188. e celullast 1.5L ou viscozyme e utiliza aproximadamente 0,5 mL de enzima. Ademais, o uso de ácido já está bem descrito que forma interferentes tais como o HMF que dificultará a etapa de fermentação caindo assim o rendimento.
Como já vem sendo descrito no estado da técnica, um grande grupo de pesquisadores vem estudando formas de produzir etanol a partir de materiais lignocelulósicos . Assim, para que este processo se torne possível, é necessário que o pré-tratamento físico' ou químico seja economicamente viável, bem como a enzima a ser utilizada como catalisador. Atualmente, vem sendo estudada diferentes enzimas (celulases, hemicelulases ) e a busca de novos catalisadores que proporcionem a hidrólise do material lignocelulósico com maiores rendimentos e um custo menor.
Como pode ser observado nenhum documento do estado da técnica descreve ou sugere um processo de hidrólise enzimática . do pseudocaule de bananeira com a mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012 e diferentes pré-tratamentos para a produção de bioetanol.
Sumário da Invenção
Para solucionar os problemas acima mencionados, a presente invenção propiciará vantagens significativas em relação aos processos para a produção de bioetanol utilizando pré-tratamento químico do pseudocaule de bananeira seguido da hidrólise enzimática com enzimas comerciais, possibilitando um aumento do seu desempenho e apresentando uma relação custo/benefício mais favorável.
O processo da presente invenção baseia-se no pré- tratamento químico do pseudocaule de bananeira, seguido da hidrólise enzimática utilizando enzimas comerciais, tais como a NS 22074 e NS 50012 para a obtenção de açúcares fermentáveis para posteriormente formação do bioetanol.
No estado da técnica já é bem descrito diversos pré- tratamentos químicos ou físicos, mas cada material lignocelulósico se comporta de forma distinta com os pré- tratamentos, visto que a composição da biomassa varia de acordo com sua origem vegetal (teor de lignina, celulose e hemicelulose ) e a forma que estes estão associados.
Apesar dos documentos citados no estado da técnica revelarem pré-tratamentos de biomassa lignocelulósico e a produção de etanol a partir de material lignocelulósico e/ou diferentes meios de cultura, o método ou processo utilizado na presente invenção é inovador, pois nenhum dos processos citados no estado da técnica, descreve a tecnologia de pré-tratamento do pseudocaule de bananeira, empregando hidróxido de sódio (5%) sob refluxo de 2 horas ou hidróxido de sódio (3%) sob refluxo de 2 horas; ácido sulfúrico (5%) sob refluxo de 2 horas; combinação de hidróxido de sódio e ácido sulfúrico; combinação do hidróxido de sódio com o hipoclororito de sódio e peróxido de hidrogénio; combinação do hidróxido de sódio com vinagre ou ácido acético e peróxido de hidrogénio e explosão a vapor durante 8 minutos a 200 °C seguido de hidróxido de sódio 3% durante 2 horas de refluxo.
O processo da presente invenção é bastante versátil, pois proporciona a seleção do melhor pré-tratamento a ser aplicado para pseudocaule de bananeira. Além disso, os processos empregados na presente invenção mostraram através de análises de HPLC que o principal açúcar fermentável formado é a sacarose e que não há geração de compostos que são inibitórios nas etapas posteriores.
Descrição Detalhada da Invenção
Embora a presente invenção possa ser suscetivel a diferentes modalidades, é mostrada nas tabelas e na seguinte discussão detalhada, uma modalidade preferida com o entendimento de que a presente modalidade deve ser considerada uma exemplificação dos princípios da invenção e não pretende limitar a presente invenção ao que foi ilustrado e descrito aqui.
A presente invenção descreve um método de melhorar a degradação do material lignocelulósico utilizando o pré- tratamento químico, bem como aumentar o rendimento de açúcares fermentáveis na hidrólise enzimática com a mistura das celulases comerciais NS 22074 e NS 50012 para posterior produção de etanol.
A presente invenção se refere à avaliação da percentagem de conversão em açúcares fermentáveis e a quantidade de biomassa necessária para produzir açúcares fermentáveis visando à produção de etanol.
Outro diferencial da presente ivenção é que emprega a principal enzima para uso na hidrólise de lignocelulósicos a NS 22074 (complexo celulósico^-glucosidase, xilanase) e o efeito desta enzima é potencializado com a adição da enzima NS 50012. (complexo celulósico - arabinase, hemicelulase, celulase, pectinase e xilanase) .
A presente invenção apresenta diversas vantagens em relação ao estado da técnica, tais como praticidade, elevada hidrólise enzimática do pseudocaule de bananeira, proporcionando bons rendimentos de açúcares redutores e assim, possibilitando bons rendimentos na produção de etanol .
.0 processo revelado pela presente invenção utiliza um substrato altamente sustentável, por se tratar de um rejeito, o que viabiliza a produção de etanol a partir deste material lignocelulósico .
A presente invenção revela diferentes pré-tratamentos para avaliar, qual o mais adequado para a biomassa de pseudocaule de bananeira, onde o tratamento com hidróxido de sódio (3%) em refluxo é melhor que aos descritos no estado da técnica, inclusive melhor que o hipoclorito de sódio.
Outro aspecto da presente invenção é que a condição reacional descrita no processo da presente invenção não foi relatada no estado da técnica. Nenhum dos métodos de pré- tratamento, descrito, no estado da técnica utilizam as mesmas combinações de reagentes e equipamentos, tais como o banho de ultrassom utilizado no processo da presente invenção. Visto que, no estado da técnica a biomassa estudada é o bagaço de cana ou palha de trigo, a presente invenção tem relevância ao utilizar o pseudocaule de bananeira como uma biomassa lignocelulósica alternativa, abundantemente gerada no setor agrícola, para produção de bioetanol de segunda geração.
Além disso, a presente invenção obteve 85% de rendimento em açúcares fermentáveis com uma quantidade mínima de enzima, muito inferior ao que vem sendo descrito no estado da técnica e, outro aspecto importante é que a biomassa da presente invenção está isenta de interferentes que afetam a fermentação, devido ao tratamento com hidróxido de sódio que foi utilizado, além da ausência de xilose e a presença de sacarose como o principal açúcar redutor formado.
As enzimas usadas no processo da presente invenção são diferentes das descritas no estado da técnica, apesar: de serem celulase, hemicelulase β -glicosidase, a origem delas são distintas
Inicialmente, o pseudocaule de bananeira caturra (in natura) foi lavado com água corrente cerca de 3 vezes para remover as sujeiras e a resina, posteriormente foi colocado em estufa com temperatura de 60°C para a secagem. Após a secagem o pseudocaule de bananeira foi moído em moinho do tipo Willye, modelo MA680, com peneira de 30 mesh e armazenados em sacos plásticos para posteriormente realizar os tratamentos químicos e a hidrólise enzimática (este material lavado é chamado a partir desta etapa de biomassa) , descrito no pedido de patente brasileiro PI 1102362-7 e incorporado aqui por referência em sua totalidade.
Posteriormente foram realizados diferentes tratamentos químicos, tais como: com o hidróxido de sódio puro ou em combinação com o hipoclorito de sódio e o peróxido de hidrogénio, com o hidróxido de sódio em combinação com o ácido acético ou o vinagre e peróxido de hidrogénio; e a combinação de hidróxido de sódio e ácido sulfúrico.
Além desses pré-tratamentos foi realizada a explosão a vapor em combinação com o hidróxido de sódio; os resultados desta presente invenção foram comparados com os resultados obtidos com a combinação de hidróxido de sódio e ácido peracético, pré-tratamento descrito no pedido de patente brasileiro PI 1102362-7 e incorporado aqui por referência em sua totalidade.
0 pré-tratamento com hidróxido de sódio foi realizado adicionando 10g da biomassa de pseudocaule de bananeira em um balão de fundo redondo e 200 mL de uma solução de hidróxido de sódio (5% m/v) ou (3% m/v), está mistura foi mantida em refluxo por 2 horas. Ao término deste período filtrou-se a solução e o sólido remanescente foi lavado com água destilada. O sólido coletado foi colocado na estufa a vapor até a sua secagem a temperatura de aproximadamente 60°C. Após a sua secagem o material foi moído, e realizado a hidrólise enzimática.
O tratamento com hidróxido de sódio seguido da mistura ácido acético e peróxido de hidrogénio foi realizado adicionando lOg da biomassa de pseudocaule de bananeira em um erlenmeyer e 100 mL de uma solução de hidróxido de sódio (0,1M), está mistura foi agitada em agitador magnético por 1 hora a temperatura de 70°C ou em banho de. ultra-som a temperatura fixa de 60 °C.
Após este período adicionou-se na mistura reacional uma solução de ácido acético e peróxido de hidrogénio (30%, sendo 40% de ácido acético (12mL) em peróxido de hidrogénio (18 mL) ) (lOOmL) o restante do volume foi completado com água destilada. Está mistura reacional foi agitada por 6 horas a temperatura de 70°C ou em outro experimento no banho de ultra-som a temperatura fixa de 60°C. Ao término deste período filtrou-se a mistura reacional e regulou o pH para 4-5, lavando com água destilada, o material sólido coletado foi colocado na estufa a vapor até a sua secagem. Posteriormente, o material seco foi macerado é armazenado em frascos para posterior hidrólise enzimática.
O tratamento com hidróxido de sódio seguido da mistura vinagre e peróxido de hidrogénio foi realizado adicionando lOg da biomassa pseudocaule de bananeira em um erlenmeyer e 100 mL de uma solução de NaOH (0,1M), a mistura reacional foi agitada por lhora em agitador magnético a - temperatura de 70°C. Após este. período adicionou-se na mistura reacional uma solução de vinagre de maçã (marca Rosina) e peróxido de hidrogénio (30%, sendo 40% de vinagre (12mL) em peróxido de hidrogénio (18 mL) ) (lOOmL) o restante do volume foi completado com água destilada. Está mistura reacional foi agitada em agitador magnético por 7 horas a temperatura de 70°C. Ao término deste período filtrou-se a mistura reacional e, lavou com água destilada, até regular o pH entre 4-5. Após o sólido coletado foi colocado na estufa a vapor até a sua secagem a temperatura de aproximadamente 60°C. Posteriormente, o material seco foi triturado e armazenado para posterior hidrólise enzimática.
O tratamento com o ácido sulfúrico foi realizado adicionando lOg de biomassa em um balão de fundo redondo e 200 mL de uma solução de ácido sulfúrico (5%) (v/v), a mistura reacional foi mantida por 2 horas sob refluxo. Ao término deste . período filtrou-se a mistura reacional e, lavou o sólido com água destilada, o material sólido coletado foi colocado na estufa a vapor até a sua secagem a temperatura de aproximadamente 60°C. Posteriormente, o material seco foi triturado e armazenado em frascos para posterior hidrólise enzimática.
O tratamento com explosão a vapor foi realizado a temperatura de 200°C .por 8 minutos, posteriormente foi pesado lOg da biomassa pré-tratada por explosão a vapor em um balão de fundo redondo e 200 mL de uma solução de hidróxido de sódio (3%) (v/v), a mistura reacional foi mantida por 2 horas sob refluxo. Ao término deste período filtrou-se a mistura reacional e, o sólido foi lavado com água destilada, o material sólido coletado foi colocado na estufa a vapor até a sua secagem a temperatura de aproximadamente 60 °C. Posteriormente, o material seco foi triturado e armazenado em frascos para posterior hidrólise enzimática.
Para realizar a hidrólise, enzimática foi utilizado 0,lg de biomassa pré-tratada, 0,03 mL da mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012, 5 mL de tampão acetato de sódio pH = 4,8. A mistura foi deixada em banho de ultra-som em temperatura fixa de 60°C durante 4 horas. Os resultados de percentagem de açúcares fermentáveis e a quantidade de biomassa . necessária para produzir 1 kg de açúcares fermentáveis estão apresentados na Tabela 1.
A Tabela 1 mostra a percentagem de açúcares redutores liberada de suspensões de 0,lg de pseudocaule de bananeira com diferentes pré-tratamentos químicos com a mistura das celulases NS 22074 (0,015mL) e NS 50012 (0,015mL) diretamente assistida no banho de ultra-som com a temperatura fixa de 60°C durante 4 horas e a quantidade de biomassa necessária para produzir lKg de açúcares redutores .
Tabela 1 - Hidrólise enzimática assistida no banho de ultra-som do pseudocaule de bananeira pré-tratado quimicamente com a mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012. Tratamento químico Rendimento (%) Biomassa necessária para produzir 1 Kg de açúcares redutores
Sem tratamento 19 5.3 kg
NaOH/ác, peracético "47 2.1 kg
NaOH/ác. acético/H202 ~45 2.2 Kg NaOH/ác. 33 3.0 kg
Acético/H202/US
NaOH/vinagre/H202 47 2.2 Kg
NaOH/hipoclorito de 45 2.2 kg
sódio/H202
NaOH 51 2.0 kg
H2S04 35 3.0 Kg
NaOH/H2S04 47 2.1 Kg
Condições reacionais : biomassa (3.3 gramas de biomassa por mL da mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012, 1:50 biomassa/volume de tampão acetato de sódio pH = 4.8), banho de ultra-som durante 4 horas de 1 reação a temperatura de
60°C.
onde :
NaOH/AC. perácetico: Pseudocaule de bananeira tratada com solução de NaOH (0,1M) por 1 hora a temperatura de 70°C seguida do tratamento com ácido peracético (30%) realizado a temperatura de 70°C durante 7 horas.
NaOH/ác . acético/H202 : Pseudocaule de bananeira tratada com hidróxido de sódio durante 1 hora a temperatura de 70°C, seguido do tratamento com a mistura ácido acético e peróxido de hidrogénio durante 6h a 70°C.
NaOH/ác . acético/H202/US : Pseudocaule de bananeira tratada com hidróxido de sódio durante 1 hora a temperatura de 60°C no banho de ultrâ-som, seguido do tratamento com a mistura ácido acético e peróxido de hidrogénio durante 6h a 60°C no banho de ultra-som
NaOH/vinagre/H202 : Pseudocaule de bananeira tratada com hidróxido de sódio durante 1 hora a temperatura de 70°C, seguido do tratamento com a mistura vinagre e peróxido de hidrogénio durante 6h a 70°C. NaOH/hipoclorito de sódio/H202: Pseudocaule de bananeira tratada com hidróxido de sódio durante 1 hora a temperatura de 70°C, seguido, do tratamento com a mistura de hipoclorito de sódio e peróxido de hidrogénio durante 6h a 70°C.
> NaOH: Pseudocaule de bananeira tratada com hidróxido de sódio (5%) durante 2 horas sob refluxo.
H2SO4: Pseudocaule de bananeira tratada com ácido sulfúrico (5%) durante 2 horas sob refluxo.
aOH/H2S04: Pseudocaule de bananeira tratada com hidróxido de sódio (5%) durante 2 horas sob refluxo seguido do tratamento com ácido sulfúrico (5%) durante 2 horas sob refluxo .
A partir dos resultados obtidos na Tabela 1, a presente invenção mostra que ao utilizar o pré-tratamento com hidróxido de sódio (5%), a conversão em açúcares fermentáveis foi de 51%, este resultado foi melhor que ao utilizar a biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio seguido do ácido peracético (sendo que este pré-tratamento foi desenvolvido no pedido de patente PI 1102362-7 e incorporado aqui por referência em sua totalidade) , no entanto para comparar os pré-tratamentos , realizou a hidrólise enzimática nas mesmas condições reacionais, descrita nesta invenção.
Neste caso ao utilizar o pré-tratamento com hidróxido de sódio as quantidades de enzima e de biomassa necessárias para produzir 1 kg de açúcares fermentáveis foram menores em relação ao utilizar a biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio seguido do ácido peracético.
Além disso, o custo do pré-tratamento químico com hidróxido de sódio é menor em comparação ao utilizar a mistura hidróxido de sódio e ácido peracético, mostrando que o pré-tratamento com hidróxido de sódio é melhor e economicamente mais viável e eficiente.
Deve se destacar na presente invenção que o pré- tratamento com hidróxido de sódio seguido da mistura de vinagre e peróxido de hidrogénio e com a mistura hidróxido de sódio e ácido sulfúrico,, a conversão em açúcares fermentáveis foram de aproximadamente 47%, a mesma porcentagem obtida ao realizar a hidrólise . enzimática com a biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio seguido de ácido peracético nas mesmas condições reacionais. No entanto estes pré-tratamentos apresentam a vantagem de ser economicamente mais viável que ao utilizar o ácido peracético.
Os resultados mostrados até o presente momento indicam que a conversão em açúcares fermentáveis foi 60% maior em comparação a amostra não pré-tratada ao utilizar a amostra pré-tratada com hidróxido de sódio, dessa forma, este processo torna-se viável para a produção de açúcares fermentáveis.
Como descrito na presente invenção, o melhor resultado obtido foi ao utilizar a biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio (5%) e realizar a hidrólise enzimática assistida em banho de ultra-som.
Outro aspecto da presente invenção é realizar a hidrólise enzimática utilizando a biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio (5%) (0,lg) ou com hidróxido de sódio seguido do ácido peracético com pré-tratamento descrito no pedido de patente brasileiro PI 1102362-7 e incorporado aqui por referência em sua totalidade, com a mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012 (0,03mL), 5 mL de tampão acetato de sódio pH = 4.8, agitar esta mistura em agitador do tipo shaker horizontal a temperatura de 50°C, rpm de 150,. durante 4 e 24 horas.
Nesta presente invenção também avaliou a. hidrólise enzimática em banho do tipo shaker com a biomassa de pseudocaule de bananeira pré-tratada com hidróxido de sódio (5%) e estes resultados foram comparados com os obtidos com a biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio seguido de ácido peracético. Estes resultados estão apresentados na Tabela 2.
A Tabela 2 mostra a percentagem de açúcares redutores liberada de suspensões de 0,lg de pseudocaule de bananeira pré-tratado com hidróxido de sódio (5%) sob refluxo durante 2 horas ou a biomassa pré-tratada com. hidróxido de sódio seguido do pré-tratamento com ácido peracético com a mistura das celulases NS 22074 (0,015mL) e NS 50012 (0,015mL) no banho tipo shaker, a temperatura de 50°C e rpm de 150 por 4 e 24 horas e a quantidade de biomassa necessária para produzir lKg de açúcares redutores
Tabela 2 - Hidrólise enzimática da biomassa pré-tratada com o hidróxido de sódio (5%) ou com hidróxido de sódio seguido de ácido peracético com a mistura das enzimas NS 22074 e NS
50012 em shaker horizontal.
NaOH NaOH/ác. Peracético
Tempo Rendimento Biomassa Rendimento Biomassa
(h) (%) necessária (%) necessária
para para produzir produzir lKg lKg de de açúcares açúcares redutores redutores 4 72 1.5 kg 43 2.3 kg
24 96 : 1.1 kg 98 1.0 kg
Condições reacionais: biomassa pré-tratada quimicamente 3.3g/mL de enzima), 1:50 biomassa/volume de tampão acetato de sódio pH = 4.8) banho do tipo shaker temperatura de 50°C, 150 rpm.- A partir dos resultados obtidos na Tabela 2, observa- se que ao realizar a hidrólise enzimática em shaker do tipo horizontal com a biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio a conversão em açúcares fermentáveis foi de 72% em apenas 4 horas, ou seja, apresentou um rendimento maior em comparação ao utilizar a hidrólise assistida em banho de ultra-som (descrito na Tabela 1). Além disso, esta percentagem é superior ao descrito na literatura com diferentes substratos lignocelulosicos e em tempo menor.
A tabela 2 também mostra que o pré-tratamento com hidróxido de sódio é melhor que o tratamento com hidróxido de sódio seguido do ácido peracético, pois a conversão em açúcares fermentáveis foi cerca de 40% maior ao utilizar a biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio.
Cabe. salientar aqui, que ao utilizar a biomassa pré- tratada com hidróxido de sódio seguido de ácido peracético, os resultados de conversão foram melhores quando a reação foi realizada no banho de ultra-som em cerca de 10% em comparação ao ser realizada em shaker, o que comprova os resultados obtidos no pedido de patente PI 1102362-7 e incorporados aqui por referência em sua totalidade.
Portanto, a presente invenção mostra que dependendo do pré-tratamento químico, da enzima e das condições reacionais usadas a hidrólise enzimática pode ser mais eficiente com um método ou outro. O terceiro aspecto da presente invenção é realizar a ; hidrólise enzimática utilizando a biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio (5%) (0,2g) e comparar os resultados com a biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio seguido de ácido peracético (0,2g) (pré-tratamento descrito no pedido de patente PI 1102362-7 e incorporado aqui por referência em sua totalidade) , com a mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012 (0,03mL), 10 mL de tampão . acetato de sódio pH = 4.8, agitar esta mistura em agitador do tipo shaker horizontal a temperatura de 50°C, rpm de 150, durante 4, 24 e 48 horas. Os resultados da percentagem de açúcares fermentáveis e a quantidade de biomassa necessária para produzir 1 kg de açúcares fermentáveis estão apresentados na Tabela 3
Nesta presente invenção também deve ressaltar que ao dobrar a quantidade de biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio utilizando a mesma quantidade de enzima. Os resultados foram significativos, pois observou uma redução da enzima necessária para a produção de etanol, estes dados foram comparados com os resultados obtidos com a biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio seguido do peróxido de hidrogénio e estão apresentados na Tabela 3.
A Tabela 3 mostra a percentagem de açúcares redutores liberada de suspensões de 0,2g de pseudocaule de bananeira pré-tratado com hidróxido de sódio (5%) sob refluxo durante 2 horas ou pré-tratamento com hidróxido de sódio seguido do ácido peracético com a mistura das celulases NS 22074 (0,015mL) e NS 50012 (0,015mL) no banho tipo shaker, a temperatura de 50°C e rpm de 150 por 4, 24 e 48 horas e a quantidade de biomassa necessária para produzir IKg de açúcares redutores..
Tabela 3 - Hidrólise enzimática da biomassa pré-tratada quimicamente com o hidróxido de sódio (5%) ou com hidróxido de sódio seguido de ácido peracético com a mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012 em shaker horizontal.
Figure imgf000028_0001
Condições reacionais: biomassa pré-tratada (6.7g/mL
5 enzima); 1:50 biomassa/volume de tampão acetato de sódio pH = 4.8) banho do tipo shaker temperatura de 50°C, 150 rpm.
A partir dos resultados obtidos na Tabela 3, observa- se que ao realizar a hidrólise enzimática com uma massa maior e a mesma quantidade de enzima, formou uma quantidade 10 maior de açúcares fermentáveis, ou seja, o custo do processo tornou-se economicamente mais viável, pois é necessário uma quantidade inferior de enzima.
Além disso, os resultados de conversão obtidos ao utilizar a biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio são L5 melhores em comparação ao obtidos com a biomassa pré- tratada com hidróxido de sódio seguida do ácido peracético.
O quarto aspecto da presente invenção é realizar a hidrólise enzimática utilizando a biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio (3%) (0,2g) e comparar os resultados com ?0 a biomassa pré-tratada com explosão a vapor seguida do pré- tratamento com hidróxido de sódio (3%) (0,2g) com a mistura das enzimas NS 22074 e NS .50012 (0,03mL), 10 mL de tampão acetato de sódio pH = 4.8, agitar esta mistura em agitador do tipo shaker horizontal a temperatura de 50°C, rpm de 150, durante 4, 24 e 48 horas. Os resultados da percentagem de açúcares fermentáveis e a quantidade de biomassa necessária para produzir 1 kg de açúcares fermentáveis estão apresentados na Tabela 4.
Para diminuir ainda mais o custo do processo, foi realizado na presente invenção a hidrólise enzimática da biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio (3%) em refluxo durante 2 horas e a biomassa pré-tratada com explosão a vapor seguida do pré-tratamento com hidróxido de sódio (3%).
A Tabela 4 mostra a percentagem de açúcares redutores liberados de suspensões de 0,2g de pseudocaule de bananeira pré-tratado com hidróxido de sódio (3%) sob refluxo durante 2 horas ou pré-tratamento com explosão a vapor seguido do pré-tratamento com hidróxido de sódio (3%) durante 2 horas sob refluxo com a mistura das celulases NS 22074 (0,015mL) e NS 50012 (0,015mL) no banho tipo shaker, a temperatura de 50°C e rpm de 150 por 4, 24 e 48 horas e a quantidade de biomassa necessária para produzir lKg de açúcares redutores .
Tabela 4 - Hidrólise enzimática da biomassa pré-tratada quimicamente com o hidróxido de sódio (3%) ou com explosão a vapor seguido do hidróxido de sódio (3%) com a mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012 em shaker horizontal.
NaOH Explosão a vapor
/NaOH Tempo Rendimento Biomassa Rendimento Biomassa
(h) , . (%)■ necessária (%) necessária para produzir para
1 Kg de produzir 1 açúcares Kg de redutores açúcares redutores
4 25 4.0 kg 21.5 4.7 kg
24 62.5 1.6 kg 37.5 2.7 kg
48 85 1,2 kg 71.5 1.4 kg
Condições reacionais: biomassa pré-tratada (6.7g/mL de enzima); 1:50 biomassa/volume de tampão acetato de sódio pH = 4.8) banho do tipo shaker temperatura de 50°C, 150 rpm.
A partir dos resultados obtidos na Tabela 4, observa- se que ao realizar a hidrólise enzimática da biomassa pré- tratada com hidróxido de sódio (3%) ou com a biomassa pré- tratada por explosão a vapor seguida do tratamento com hidróxido de sódio (3%), foi formada uma quantidade maior de açúcares fermentáveis, ou seja, o custo do processo tornou-se economicamente mais viável, pois é necessária uma quantidade inferior de enzima.
Portanto, o melhor resultado obtido é realizar a hidrólise enzimática em shaker durante 48 horas de reação da biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio (3%), pois para produzir lkg de açúcares fermentáveis são necessários somente l,2Kg de biomassa pré-tratada e apenas 180mL da mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012, mostrando ser economicamente viável. Além disso, outra vantagem de utilizar o pré- tratamento com hidróxido de sódio nestas condições reacionais, é que este tratamento não forma inibidores, mostrando desta forma mais uma grande vantagem. Os resultados das análises de cromatografia HPLC das amostras de pseudocaule de bananeira tratadas com hidróxido de sódio (3%) com 2 horas de refluxo e tratadas com explosão a vapor seguido do pré-tratamento com hidróxido de sódio estão apresentados nas Tabelas 5 e 6, respectivamente. A Tabela 5 mostra a ausência de glicose e xilose e a presença de sacarose como o principal açúcar redutor ao contrário do que se esperava. Além disso, a Tabela 5 mostra apenas quantidades muito pequenas de ácidos orgânicos, e a ausência do principal interferente do processo de fermentação, o hidroximetilfurfural .
Tabela 5 - Análises de cromatografia HPLC das amostras de pseudocaule de bananeira tratadas com hidróxido de sódio (3%) com 2 horas de refluxo.
Pseudocaule de bananeira pré-tratado com NaoH (3%) com 2 horas de refluxo
PARÂMETRO UNIDADE RESULTADO
Glicose g/100 mL ND
Frutose g/100 mL ND
Xilose g/100 mL ND
Sacarose g/100 mL 1, 53
Galactose g/100 mL 0, 14
Manose g/100 mL ND
Ribose g/100 mL ND
Manitol g/100 mL 0, 38
Sorbitol g/100 mL 0, 04
Arabinose g/100 mL 0, 04
Maltose g/100 mL ND
Maltotriose g/100 mL 0,01
Ácido acético mg/L 124,6
Ácido lático mg/L 5, 95 Ácido propiônico mg/L 16,4
Ácido cítrico mg/L 4,79
HMF mg/L ND
(hidroximetilfurfurai )
ND - Não dectado
A Tabela 6 mostra que para as amostras tratada com explosão a vapor seguida do pré-tratamento com hidróxido de sódio (3%) com 2 horas de refluxo, o principal açúcar redutor é a sacarose, o segundo é . a glicose e que a xilose está ausente. Neste tratamento, é confirmada a presença de quantidade muito pequena de hidroximetilfurfural nas amostras.
Tabela 6 - Análises de cromatografia HPLC das amostras de pseudocaule de bananeira tratadas com explosão a vapor seguida do pré-tratamento com hidróxido de sódio (3%) com 2 horas de refluxo.
Pseudocaule de bananeira pré-tratado com NaoH (3%) com 2 horas dé refluxo
PARÂMETRO UNIDADE RESULTADO
Glicose g/100 mL 0, 81
Frutose g/100 mL ND
Xilose g/100 mL ND
Sacarose g/100 mL 1, 96
Galactose g/100 mL 0, 07
Manose g/100 mL ND
Ribose g/100 mL ND
Manitol g/100 mL 0, 24
Sorbitol g/100 mL ND
Arabinose g/100 mL 0,06
Maltose g/100 mL ND
Maltotriose g/100 mL 0, 02 Ácido acético mg/L 151, 4
Ácido lático mg/L 8, 05
Ácido propiônico mg/L ND
Ácido cítrico mg/L ND
HMF mg/L 53, 1
(hidroximetilfurfurai)
ND - Não dectado
As condições reacionais do tratamento químico e posterior hidrólise enzimática descritas na Tabela 4 além de resultar na melhor conversão de açúcares redutores, apresenta uma condição muito favorável para a fermentação destes açúcares para a produção de bioetanol. Isto se justifica frente ao desafio que se impõe à obtenção do etanol a partir da celulose, que é o da fermentação de pentoses. As hemíceluloses são ricas em pentoses como xiloses e arabinoses. O Saccharomyces cereviseae, microorganismo usualmente empregado na produção de álcool a partir da sacarose, é muito pouco eficiente na conversão de pentoses. A presença de pentoses de fato inibe a fermentação das hexoses. O rendimento do etanol celulósico será elevado se praticamente todos os tipos de açúcares na celulose e na hemicelulose forem convertidos para etanol. Um aspecto importante da presente invenção é que a hidrólise enzimática usando a mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012 de pseudocaule de bananeira tratadas com hidróxido de sódio (3%) com 2 horas de refluxo e tratadas com explosão a vapor seguido do pré-tratamento com hidróxido de sódio, resultou na formação de sacarose como o principal açúcar fermentável, o qual pode ser facilmente e eficientemente convertido em etanol pelo microorganismo Saccharomyces cereviseae em condições industriais. Nesta presente invenção destaca-se a influência da mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012 em comparação com a celulase pura NS 22074, o uso da enzima NS 50012 potencializa a hidrólise enzimática e com isso reduz o custo enzimático, para mostrar este efeito realizou-se a hidrólise enzimática com a biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio (5%) (0,lg) com a enzima NS 22074 (0,03 mL) e a mistura das enzimas NS 22074 (0, 015 mL) e 50.012 (0,015 mL) , 5 mL de tampão acetato de sódio pH = 4.8, agitador do tipo shaker horizontal a temperatura de 50°C, 150 rpm, durante 4 e 24 horas. Os resultados obtidos estão apresentados na Tabela 7.
Tabela 7 - Hidrólise enzimática da biomassa pré-tratada quimicamente com o hidróxido de sódio (5%) com a mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012 ou com a enzima NS 22074 em shaker horizontal.
Figure imgf000034_0001
Condições reacionais: biomassa pré-tratada quimicamente 3.3g/mL de enzima), 1:50 biomassa/volume de tampão acetato de sódio pH = 4.8) banho do tipo shaker temperatura de 50°C, 150 rpm.
A partir dos resultados obtidos na Tabela 7, observa- se que ao realizar a hidrólise enzimática com a mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012 os resultados de conversão foram muito melhores em comparação ao utilizar a enzima NS 22074, ou seja, a conversão em açúcares fermentáveis foi aproximadamente 80% maior em comparação ao utilizar somente a enzima NS 22074 em apenas .4 horas de reação. Portanto está é mais uma vantagem desta patente o uso de mistura de enzimas, o que faz com que o custo enzimático se reduza significativamente e torna o processo economicamente viável.
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Claims

REI VIDICAÇÕES
1. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira com hidrólise enzimática caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas :
a) lavar o pseudocaule de bananeira com água corrente cerca de 3 vezes para remover as sujeiras e a resina, posteriormente colocar em estufa com temperatura de 60°C para a secagem.
b) moer o pseudocaule de bananeira e armazenar para posteriormente realizar os tratamentos químicos e a hidrólise enzimática.
c) fazer um pré-tratamento com hidróxido de sódio seguido da mistura de ácido acético e peróxido de hidrogénio .
2. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) de compreende as seguintes etapas:
a) tratar o pseudocaule de bananeira com hidróxido de sódio, durante 1 hora a 70°C (1:10 m/v), em agitador magnético,
b) adição da mistura de ácido acético e peróxido de hidrogénio (30%), e completar o volume com água destilada) (1:10 m/v) durante 6 horas a temperatura de 70°C em agitador magnético ou em ultra-som com temperatura fixa de 60°C.
c) filtrar a amostra e lavar com água destilada até pH: 4-5, e
d) colocar para secar e moer.
3. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a mistura de ácido acético e peróxido de hidrogénio compreende 40% de ácido acético e 60% de peróxido de hidrogénio.
4. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:
a) lavar o pseudocaule de bananeira com água. corrente cerca de 3 vezes para remover as sujeiras e a resina, posteriormente colocar em estufa com temperatura de 60°C para a secagem.
b) moer o pseudocaule de bananeira e armazenar para posteriormente realizar os tratamentos químicos e a hidrólise enzimática.
c) fazer um pré-tratamento com hidróxido de sódio seguido da mistura de vinagre e peróxido de hidrogénio.
5. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) de compreende as seguintes etapas:
a) tratar o pseudocaule de bananeira com hidróxido de sódio, durante 1 hora a 70°C (1:10 m/v), em agitador magnético,
b) adição da mistura de vinagre e peróxido de hidrogénio (30%) , o restante completar com água destilada) (1:10 m/v) durante β horas a temperatura de 70°C;
c) filtrar a amostra e lavar com água destilada até pH: 4-5, e
d) colocar para secar e moer.
6. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a mistura de vinagre e peróxido de hidrogénio compreende 40% de vinagre e 60% de peróxido de hidrogénio.
7. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:
a) lavar com água corrente cerca de 3 vezes para remover as sujeiras e a resina, posteriormente colocar em estufa com temperatura de 60°C para a secagem.
b) moer o pseudocaule de bananeira e armazenar para posteriormente realizar os tratamentos químicos e a hidrólise enzimática.
c) fazer um pré-tratamento com hidróxido de sódio seguido da mistura de hipoclorito de sódio e peróxido de hidrogénio.
8. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) de compreende as seguintes etapas:
a) tratar o pseudocaule de bananeira com hidróxido de sódio, durante 1 hora a 70°C (1:10 m/v), em agitador magnético,
b) adição da mistura de hipoclorito de sódio e peróxido de hidrogénio (5:1) (1:10 v/v durante 6 horas a temperatura de 70°C;
c) filtrar a amostra e lavar com água destilada até pH: 4-5,
d) colocar para secar e moer.
9. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:
) lavar com água corrente cerca de 3 .vezes para remover as sujeiras e a resina, posteriormente colocar em estufa com temperatura de 60°C para a secagem.
) moer o pseudocaule de bananeira e armazenar para posteriormente realizar os tratamentos químicos e a hidrólise enzimática. ) fazer um pré-tratamento com hidróxido de sódio.
10. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) de compreende as seguintes etapas:
a) tratar o pseudocaule de bananeira com hidróxido de sódio. (3%) ou (5%) (1:20 m/v) durante 2 horas sob refluxo,
b) filtrar a amostra e lavar com água destilada, c) colocar para. secar e moer.
11. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:
a) lavar com água corrente cerca de 3 vezes para remover as sujeiras e a resina, posteriormente colocar em estufa com temperatura de 60°C para a secagem.
b) moer o pseudocaule de bananeira e armazenar para posteriormente realizar os tratamentos químicos e a hidrólise enzimática.
c) fazer um pré-tratamento com ácido sulfúrico.
12. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) de compreende as seguintes etapas:
a) tratar o pseudocaule de bananeira com ácido sulfúrico (5%) (1:20 m/v) durante 2 horas sob refluxo,
b) filtrar a amostra e lavar com água destilada, c) colocar para secar e moer.
13. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:
a) lavar com água corrente cerca de 3 vezes para remover as sujeiras e a resina, posteriormente colocar em estufa com temperatura de 60°C para a secagem, b) moer o pseudocaule de . ,bananeira e armazenar para posteriormente realizar os. .tratamentos químicos e a hidrólise enzimática.
c) fazer um pré-tratamento com hidróxido de sódio- . combinado com ácido sulfúrico.
14. Processo . para a produção de bioetanol a partir do. pseudocaule de bananeira, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) de compreende as seguintes etapas:
a) tratar o pseudocaule de bananeira com hidróxido de sódio (5%) (1:20 m/v) durante 2 horas sob refluxo, b) adicionar ácido sulfúrico (5%) (1:10 m/v) durante 2 horas sob refluxo,
c) filtrar a amostra e lavar com água destilada,
d) colocar para secar e moer.
15. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:
a) lavar com água corrente cerca de 3 vezes para remover as sujeiras e a resina, posteriormente colocar em estufa com temperatura de 60°C para a secagem.
b) moer o pseudocaule de bananeira e armazenar para posteriormente realizar os tratamentos químicos e a hidrólise enzimática.
c) fazer um pré-tratamento com explosão a vapor seguido do pré-tratamento com hidróxido de sódio.
16. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) de compreende as seguintes etapas:
a) tratar o pseudocaule de bananeira com explosão a vapor durante 8 minutos a 200°C seguido do pré-tratamento com hidróxido se sódio (3%) (1:20 m/v) durante 2 horas sob refluxo,
b) filtrar a amostra e lavar com água destilada, c) colocar para secar e moer.
17. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira, de acordo com as reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato da referida hidrólise enzimática ser realizada conforme as seguintes etapas:
a) adição de 0,lg de biomassa pré-tratada, 0,03 mL da mistura das enzimas NS 22074 e NS 50012, 5 mL de tampão acetato de sódio pH = 4 , 8 ; e
b) a mistura foi deixada em banho de ultra-som em temperatura fixa de 60aC durante 4 horas.
18.. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:
a) Hidrolisar a biomassa pré-tratada conforme definida pelas reivindicações 1-12 (3.3g/mL de enzima) diretamente no banho de ultra-som com a mistura das enzimas celulases NS 22074 e NS 50012 durante 4 horas;
b) Utilizar 1:50 de biomassa/volume de tampão acetato de sódio pH = 4.8.
19. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:
a) Hidrolisar a biomassa pré-tratada com hidróxido de sódio e hidróxido de sódio seguido de ácido peracético em shaker tipo horizontal (3.3g/mL de enzimas) com a mistura das enzimas celulases NS 22074 e NS 50012 ou somente com a enzima NS 22074 durante 4 e 24 horas;
b) Utilizar 1:50 de biomassa/volume de tampão acetato de sódio pH = 4.8 ;
c) Utilizar temperatura de 50°C e rpm de 150.
20. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira caracterizado pelo fato de que
. compreende ás seguintes etapas:
a). Hidrolisar a biomassa pré-tratada com hidróxido 5 de sódio ou hidróxido de sódio seguido de ácido peracético em shaker tipo horizontal (6,7g./mL de enzimas) com a mistura das enzimas celulases NS 22074 e NS 50012 durante 4, 24 e 48 horas.
b) Utilizar 1:50 de -biomassa/volume de tampão 10 acetato de sódio pH = 4.8 ; e
c) Utilizar temperatura de 50°C e rpm de 150.
21. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira, de acordo com as reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a enzima celulase NS
15 22074 é um complexo celulósico- -glucosidase e xilanase.
22. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira, de acordo com as reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a enzima NS 50012 é um complexo celulósico - arabinase,
20 hemicelulase, celulase, pectinase e xilanase.
23. Processo para a produção de bioetanol a partir do pseudocaule de bananeira, de acordo com as reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a bananeira é preferencialmente do tipo que produz banana caturra.
25 24. Processo para a produção de bioetanol, de acordo com a reivindicação 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a conversão de açúcares redutores por hidrólise foi de 33 a 51%.
25. Processo para a produção de bioetanol, de acordo i0 com a reivindicação. 19, caracterizado pelo fato de que a conversão de açúcares redutores por hidrólise foi de 31- 96%.
26. Processo para a produção de bioetanol, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a conversão de açúcares redutores por hidrólise, foi de 10 a 70%.
27. Processo para a produção de bioetanol, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a conversão de açúcares redutores por hidrólise com hidróxido de sódio (3%) foi de 25-85%.
28. Processo para a produção de bioetanol., de acordo com as reivindicações 15 e 16, caracterizado pelo fato de que a conversão de açúcares redutores por hidrólise foi de 21,5 até 71,5%.
29. Processo para a produção de bioetanol, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o hidrolisado enzimático obtido para produzir etanol compreende uma mistura de açúcares fermentáveis tendo a sacarose como açúcar principal, a ausência de glicose e xilose e a ausência de hidroximetilfurfural .
30. Processo para a produção de bioetanol, de acordo com as reivindicações 15 e 16, caracterizado pelo fato de que o hidrolisado enzimático obtido para produzir etanol compreende uma mistura de açúcares fermentáveis tendo a sacarose como açúcar principal, a glicose como açúcar secundário, a ausência de xilose e a presença de hidroximetilfurfural em quantidade muito pequena.
31. Uso do processo conforme definido pelas reivindicações 1 a 30 caracterizado pelo fato de obter açúcares redutores para produzir etanol.
32. Uso, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o processo de produção de etanol é realizado por fermentação com leveduras de açúcares fermentáveis.
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