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WO2013121146A1 - Procédé de détermination de l'activité du récepteur lpa1 de l'acide lysophosphatidique (lpa) - Google Patents

Procédé de détermination de l'activité du récepteur lpa1 de l'acide lysophosphatidique (lpa) Download PDF

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Publication number
WO2013121146A1
WO2013121146A1 PCT/FR2013/050295 FR2013050295W WO2013121146A1 WO 2013121146 A1 WO2013121146 A1 WO 2013121146A1 FR 2013050295 W FR2013050295 W FR 2013050295W WO 2013121146 A1 WO2013121146 A1 WO 2013121146A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
expression
lpai
level
receptor
hbegf
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2013/050295
Other languages
English (en)
Inventor
Olivier PEYRUCHAUD
Marion David
Philippe Clezardin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hospices Civils de Lyon HCL
Universite Claude Bernard Lyon 1
Original Assignee
Hospices Civils de Lyon HCL
Universite Claude Bernard Lyon 1
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hospices Civils de Lyon HCL, Universite Claude Bernard Lyon 1 filed Critical Hospices Civils de Lyon HCL
Publication of WO2013121146A1 publication Critical patent/WO2013121146A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to the field of biology in general, and in particular to lysophosphatidic acid receptors.
  • the invention relates in particular to a method for determining in vitro the specific activity of the LPAi receptor by measuring the expression of one or more specific markers, in particular for determining in vitro in vitro modulating activity. or in vivo of a compound vis-à-vis specifically the LPAi receptor, particularly in the context of monitoring the effectiveness of a therapeutic compound specifically targeting the LPAi receptor.
  • Lysophosphatidic acid is a naturally occurring phospholipid that exhibits growth factor-like activity on a very wide variety of cells, regulating its proliferation, migration, and cellular invasion in vitro (Fukushima et al., 1998; Goetzl). ef a /., 1999). Platelets are the major but non-exclusive source of LPA in the body during platelet aggregation (Gerrard and Robinson 1989). The concentration of LPA passes from the order of ⁇ , ⁇ in the plasma to 5-25 ⁇ in the serum. Fibroblasts, preadipocytes and some tumor cells can themselves produce LPA,
  • LPA is involved in the control of many physiopathological functions (pulmonary fibrosis, renal fibrosis, obesity, rheumatoid arthritis, reproduction, urinary diseases, cancer).
  • the cellular action of LPA passes through the activation of a series of receptors on the surface of many cells including cancer cells (LPA, LPA2, LPA 3, LPA 4, LPA 5, LPA LPA 6 and 7).
  • LPA cancer cells
  • LPA 2, LPA 3, LPA 4, LPA 5, LPA LPA 6 and 7 These receptors are very homologous to each other. They have a structure with seven transmembrane passages coupled to binding proteins GTP (G proteins), however There are two subclasses of receptors based on their phylogenetic origin and their genomic organization (LPA LPA1-3 and 4 -7). It should be known that the messenger RNAs encoding these receptors are widely distributed at tissue (Contos et al., 2002) and that most cells express several types of receptors at the same time.
  • LPA receptors including the LPA1 or LPAi type 1 receptor.
  • the validation of the activation and inhibition of the LPAi receptor is carried out only in vitro, and this under very limited conditions from cells expressing naturally no LPA receptor and which after genetic manipulations express this receptor.
  • the tests consist in measuring either the intensity of the intracellular calcium flux by spectrophotometry in the presence of LPA, or the binding of gammaGTP * at the level of GTP-fixing proteins, present at the inner surface of the plasma membrane, by measuring the radioactivity associated with membranes following stimulation with LPA.
  • the present invention proposes to be able to detect in vitro the specific activation or inhibition of the LPAi receptor by virtue of the use of a particular biological signature.
  • the present invention therefore fills the current impossibility of confirming the activation or specific inhibition state of the LPAi receptor in vivo in the body, but also in vitro in complex cellular systems that express different LPA receptors.
  • the present invention relates to a method for determining in vitro the specific activity of the LPAi receptor comprising the steps of:
  • HBEGF Heparin-Binding EGF-like growth factor
  • CXCL3 Chemokine C-X-C Ligand 3 motif
  • HBEGF Heparin-Binding EGF-like growth factor
  • CXCL3 Cellular CXC motif Ligand 3
  • an increase in the expression of HBEGF and an increase in the expression of CXCL3 is associated with the activation of LPAi specifically
  • a decrease in the expression of HBEGF and a decrease in the expression of CXCL3 is associated with the inhibition of LPAi specifically.
  • the method of the invention allows the in vitro determination of the modulatory activity of a compound vis-à-vis the LPAi receptor, by measuring the expression of the two HBEGF markers. and CXCL3 as indicated above, and using as a reference value the level of expression of said markers before adding said compound whose modulator activity is at determine.
  • the method of the invention also makes it possible to monitor the effectiveness of a therapeutic compound for specifically targeting the LPAi receptor, by measuring the expression of the two markers HBEGF and CXCL3 as indicated. above, and using as a reference value the level of expression of said markers in an earlier sample.
  • the type 1 receptor of LPA or LPAi is also sometimes called LPAR1 for "lysophosphatidic acid receptor 1", or else EDG2 "Endothelial Differentiation Gene 2", VZG1 "ventricular zone gene 1", GPR26, "G protein-coupled receptor 26” , Mred.3 (named after Macrae et al., 1996), Kdt2 (based on the Genome Informatîx website) http://www.informatics.iax.org.name: Lparl, ID: MGI: 108429 ).
  • the LPAi receptor preferably corresponds to the receptor as described by An et al in 1997.
  • the word "specific” or “specifically” used in connection with the LPAi receptor. or its activity corresponds to an activity of the LPAi receptor, and not to the activity of other types of LPA receptors, and in particular LPA 2 to LPA 7 .
  • the HBEGF marker Heparin-Binding EGF-like growth factof
  • HEGFL HEGFL
  • DTR Diphtheria Toxin Receptor
  • the reference nucleic sequence is preferably the following: NM_001945.2
  • the reference protein sequence for the HBEGF marker according to the invention is preferably the following: EAW62069.1
  • the marker CXCL3 (Chemokine CXC motif Ligand S), also named GROG, GRO-gamma (Growth Regulated Oncogene Gamma), SCYB3 (Small Inducible Cytokine Subfamily B Member 3), MIP2B, MIP2beta (Macrophage Infiammatory Protein-2-beta), preferably corresponds to that described by Tekamp-Olson et al., In 1990.
  • the preferred reference nucleic sequence is the following: NM_002090.2.
  • the reference protein sequence for the CXCL3 marker according to the invention is preferably the following: AAH16308.1.
  • the method according to the invention makes it possible in particular to determine in vitro the specific activity of the LPAi receptor in vivo or in vitro, irrespective of the variant of the process according to the invention.
  • the subject of the present invention is also a method for determining, in vitro, the modulatory activity of a compound with respect to the LPAi receptor, characterized in that it comprises the steps of the determination method. in vitro the specific activity of the LPAi receptor as described above, and that the reference value corresponds to the level of expression of said markers before the addition of said compound whose modulator activity is to be determined.
  • the compound whose modulating activity is to be determined may correspond to a compound whose activity is to be determined as an LPAi receptor agonist or antagonist.
  • the compound whose modulating activity is to be determined is preferably a therapeutic molecule.
  • This method thus makes it possible to validate the efficacy of agonists or antagonists specifically directed against the LPAi receptor in complex cellular systems expressing multiple LPA receptors, and in particular in a therapeutic context.
  • the present invention also relates to a method for monitoring the efficacy of a therapeutic compound for specifically targeting the LPAi receptor, characterized in that it comprises the steps of the in vitro determination method of the specific activity of the LPAi receptor as described above, and that the reference value corresponds to the level of expression of said markers in an earlier sample.
  • the present invention thus makes it possible to validate the efficacy of therapeutic compounds specifically targeting the LPAi receptor and to monitor their effectiveness over time during the implementation of the treatment.
  • the previous sample corresponds to an earlier stage during treatment with the therapeutic compound whose efficacy is to be validated, and not at an earlier stage before the introduction of said treatment.
  • LPAi receptors have recently been shown to be involved in carcinogenesis and metastatic dissemination of breast cancer (Boucharaba et al., 2004 and 2006, Liu et al., 2009). More particularly, the LPAi receptor is a target in the case of the treatment of bone metastases of breast cancer (Boucharaba et al., 2006).
  • the method of the invention may further comprise a step of measuring the level of expression of one or more other marker (s), in particular chosen (s). ) among CSF2 / GMCSF (Colony Stimulating Factor 2), CXCL1 / Groa, (Chemokine CXC Motif Ligand 1), IL-6 (Interleukin 6) and IL-8 (Interleukin 8) as described by Boucharaba et al. in 2006.
  • This particular embodiment can be applied irrespective of the variant of implementation of the method, namely to determine in vitro the specific activity of the LPAi receptor, but also to determine in vitro the modulating activity of a compound vis-à-vis specifically the LPAi receptor, or for monitoring the effectiveness of a therapeutic compound to specifically target the LPAi receptor.
  • expression measurement means an in vitro or ex-vivo measurement of expression.
  • expression means designate both the measurement of expression at the nucleic and protein levels.
  • any measurement or quantification method well known to those skilled in the art can be used for the implementation of the invention.
  • RNA or cDNA when the measurement of the expression is carried out at the nucleic level, and in particular from RNA or cDNA, this can in particular be carried out by PCR analysis, in particular quantitative PCR or qPCR, by micro hybridization. -arrays (biochips) or Northern-blot.
  • the measurement of the expression of the markers is carried out at the nucleic level, and in particular by a PCR technique.
  • any act defined in relation to the term “in vitro” also covers the same act in relation to the terms “ex vivo” or “in cellulo” or with any equivalent term as long as it excludes application to the human or animal body.
  • “Significantly increased or decreased level of expression” means a statistically significant increase or decrease in the level of expression, preferably associated or correlated with a confidence index of at least 95% (p ⁇ 0.05).
  • the sample on which the process of the invention is implemented may be of biological origin, in particular animal or human, and preferably human. It may in particular correspond to a sample of biological fluid, for example serum, to a tissue sample or to isolated cells, in particular from such biological fluids or tissues. These samples may in particular be derived from a healthy or sick individual, in particular suffering from a disease that can be treated or improved by targeted therapy of LPAi receptor activity.
  • the sample on which the method of the invention is implemented is derived from an individual suffering from prostate or breast cancer, preferably breast cancer.
  • cancer and “tumor” are used interchangeably to designate a cancer, that is to say that here the term “tumor” means to designate a malignant tumor that is to say cancerous.
  • the present invention also relates to the use of the in vitro measurement of the level of expression of the markers HBEGF and CXCL3 as a signature of the LPAi specific receptor activity of LPA, that is to say to say an activation or an inhibition of this receiver.
  • the demonstration of an increase in the level of expression of HBEGF and of CXCL3 is a signature of the activation of the specific receptor LPA I whereas a decrease in the level of expression of HBEGF and CXCL3 is a signature of specific LPAi receptor inhibition.
  • the use according to the invention thus makes it possible to determine, in vitro, the specific activity of the LPAi receptor, but also to determine in vitro the modulatory activity of a compound vis-à-vis the LPAi receptor, or the follow-up of the effectiveness of a therapeutic compound to specifically target the LPAi receptor.
  • the measurement of the level of expression of HBEGF and of CXCL3 is used as a signature of the LPAi specific receptor activity of LPA for monitoring the in vivo efficacy of a therapeutic compound to specifically target the LPAi receptor.
  • the invention preferably relates to the use of measuring the level of expression of HBEGF and CXCL3 in a biological sample from a patient treated with said therapeutic compound.
  • the use according to the invention may also include level measurement.
  • the present invention also relates to the use of a kit comprising one or more specific reagents for measuring the level of expression of HBEGF and one or more specific reagents for measuring the level of expression.
  • a kit comprising one or more specific reagents for measuring the level of expression of HBEGF and one or more specific reagents for measuring the level of expression.
  • CXCL3 for the implementation of the process of the invention, according to any of its variants described above, namely to determine in vitro the specific activity of the LPAi receptor, for the in vitro determination of the modulatory activity of a compound vis-à-vis specifically the LPAi receptor, or for monitoring the effectiveness of a therapeutic compound to specifically target the LPAi receptor.
  • the kit used according to the invention contains specific oligonucleotides as specific reagents for measuring the level of expression of the marker (s) chosen (s), in particular by a PCR technique.
  • specific oligonucleotides may be:
  • HBEGF-F 5'-GG ACCCATGTCTTCGG AAAT-3 '(SEQ ID NO: 1); and or
  • HBEGF-R 5'-CCCATGACACCTCTCTCCAT-3 '(SEQ ID NO: 2); and / or CXCL3-F; 5 '- ATCCCCC ATGGTTCAGAAA-3' (SEQ ID NO: 3); and or
  • CXCL3-R 5 '- ACCCTGCAGG AAGTGTCAAT-3' (SEQ ID NO: 4).
  • the kit used according to the invention may also contain one or more specific reagents for measuring the expression level of LPAI, and in particular the following oligonucleotides:
  • LPA1-F 5'-TGGCATTAAAAATTTTAC AAAAAC A-3 '(SEQ ID NO: 5);
  • LPA1-R 5'-AATAGTTAACAACATGGGAATGG-3 '(SEQ ID NO: 6).
  • the kit used according to the invention further comprises one or more specific reagents making it possible to measure the level of expression of one or more other marker (s), preferably chosen from CSF2 / GMCSF, CXCL1 / Groa, IL-6 and IL-8.
  • one or more other marker preferably chosen from CSF2 / GMCSF, CXCL1 / Groa, IL-6 and IL-8.
  • the kit as defined above and in all its variants is used according to the invention for monitoring the effectiveness of a therapeutic compound to specifically target the LPAi receptor.
  • the use of the kit as defined above and in all its variants makes it possible to determine the LPAi specific receptor activity of LPA, and in particular the in vivo activity of this receptor.
  • the invention preferably covers the use of a kit comprising one or more specific reagents making it possible to measure the level of expression of HBEGF and one or more specific reagents making it possible to measure the level of expression of CXCL3, and optionally that of one or more other marker (s), preferably chosen from CSF2 / GMCSF, CXCL1 / Groa, IL-6 and IL-8, for the implementation of the method according to invention, and particularly preferably the use of such a kit for monitoring the effectiveness of a therapeutic compound to specifically target the LPAi receptor or to determine the in vivo activity of LPAi specific receptor of LPA.
  • a kit comprising one or more specific reagents making it possible to measure the level of expression of HBEGF and one or more specific reagents making it possible to measure the level of expression of CXCL3, and optionally that of one or more other marker (s), preferably chosen from CSF2 / GMCSF, CXCL1 / Groa, IL-6 and IL-8, for the implementation
  • FIG. 1 represents the effect of the antagonist VPC12249 on the expression of HBEGF and CXCL3 in PC3 cells
  • FIG. 2 represents the expression of LPAi, HBEGF and CXCL3 in MDA-B02, SK-BR-3 and MDA-B02 / LPAi, SK-BR-3 / LPAi cells,
  • FIG. 3 represents the expression of LPAi, HBEGF and CXCL3 in a RNA collection originating from primary breast tumors
  • FIG. 4 represents the expression correlation of LPAi as a function of the combined expression levels of CXCL3 and of HBEGF in an RNA collection originating from primary breast tumors
  • FIG. 5 represents the effect of the antagonist K16425 on the expression of HBEGF and CXCL3 in PC3 tumors induced in mice.
  • RNAs from six independent replicates of each cell line were extracted using the Nucleospin RNAII kit (Macherey-Nagel) and the RNAs were treated with RNAse-free DNAse to remove any trace of contamination from the cell line. Genomic DNA. Two replicates for each condition were analyzed on Affixetrix U133 Plus2.0 biochips (54677 probes). After hybridization, according to the conditions recommended by the supplier (Affimetrix UK Ltd, United Kingdom), the average intensity of the signal emitted by the probes corresponding to each duplicate was calculated for each of the conditions.
  • the three cell types were cultured in a medium containing no serum. Then they were put in the presence of LPA 1 ⁇ for 45 minutes. The cells were then harvested and their contents
  • RNA Total RNA was prepared. Each experimental condition was reproduced 6 times (6 replicates) independently. The microarray analysis is based on comparing the expression means of two replicates for each condition.
  • HBEGF and CXCL3 The expression of the two genes HBEGF and CXCL3 was analyzed in particular to study the potential link with the activity of the LPAi receptor.
  • PC-3 independent hormonal prostate carcinoma cells (ATCC CRL-135 TM) were cultured at 37 ° C in a humid atmosphere at 5% CO 2 in F-12K medium (Invitrogen) in the presence of fetal vera serum (10%) and the total RNAs were extracted using the Nucleospin RNAII kit (Macherey-Nagel) after 45 minutes or 16 hours after treatment of cells with a LPAi receptor (VPC12249, 5 or ⁇ , Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USA). The RNAs were treated with RNAse-free DNAse to remove any trace of contamination by genomic DNA.
  • VPC 12249 Since there is no specific antagonist for the commercially available LPAi receptor, a non-specific LPA1 / LPA3 receptor antagonist (VPC 12249) was used for this study.
  • HBEGF and CXCL3 as specific markers of LPAi receptor activation was investigated by quantitative RT-PCR (QPCR) from total RNAs of 3 replicates.
  • the cDNAs were synthesized from lpg RNA using the iScript cDNA Synthesis kit kit (Biorad).
  • the mRNAs were amplified using SYBR Green kit (Finnzymes) using specific primers (HBEGF-F: 5'-GGACCCATGTCTTCGGAAAT-3 '(SEQ ID NO: 1); HBEGF-R: 5'-CCCATGACACCTCTCTCCAT -3 '(SEQ ID NO: 2); CXCL3-F: 5'-ATCCCCC ATG GTTC AG AAA-3' (SEQ ID NO: 3); CXCL3-R: 5 '-ACCCTGC AG GAAGTGTC AAT-3' (SEQ ID NO: 2); ID NO: 4) thanks to the Reaiplex Eppendorf Mastercycler (Invitrogen)
  • the complementary DNAs were amplified by a 40 cycles PCR and the PCR products analyzed by electrophoresis in a 2% agarose gel labeled with ethidium bromide.
  • the CT (Threshold Cycle or Cycle Threshold) values obtained were normalized by the expression of L32 ribon ribosomal RNA by the Ct method (L32-F: 5 '-C AAGG AGCTGG AAGTGCTGC-3' (SEQ ID NO: 7)).
  • L32-R 5'-CAGCTCTTTCCACGATGGC-3 '(SEQ ID NO: 8).
  • results are grouped in FIG. 1 and show that the expression of the LPAi HBEGF and CXCL3 target genes is inhibited by an LPA1 / LPA3 receptor antagonist.
  • MDA-B02 human breast cancer cell lines From the MDA-B02 human breast cancer cell lines, a subclone of MDA-MB-231 cells (Peyruchaud et al., 2001) which express all the LPA receptors described to date (LPAi -5 ) and SK-BR-3 (ATCC HTB-30 TM) that do not express LPA receptors, MDA-B02 / LPAi cell lines that overexpress the LPAi receptor and SK-BR-3 / LPAi that de novo LPAi were constructed by transfection as described by Boucharaba et al., 2004 and Boucharaba et al., 2006.
  • LPAi LPAi
  • HBEGF human fetal vesicle serum
  • LPA1-F 5'-TGGOTTAAA TTTTACAAAAACA-3 '(SEQ ID NO: 5); LPA1-R: 5'-AATAGTTAACAACATGGGAATGG-3 '(SEQ ID NO: 6).
  • FCS fetal calf serum
  • PC3, LnCap prostate cancer
  • MDA-MB231, T47D MCF7
  • MCF7 breast cancer
  • MG63 KHOS
  • Mnng / HOS osteosarcoma
  • MDA-MB435S melanoma
  • RNA samples from primary tumors of breast cancer patients were analyzed by QPCR for expression levels of the gene encoding LPA1, CXCL3 and HBEGF.
  • the population was stratified into four sub-groups of 65 individuals each (quartiles) corresponding to (i) 1A of the population which has the level of LPA lowest (very low LPA +), (ii) 1 ⁇ 4 of population which has the level attaining the median LPAi expression level (LPAi low ++), (iii) in " 1 ⁇ 4 of the population with a higher than average median LPAi expression level (mean LPAi +++) , and (iv) au of the population with the highest LPAi level (LPAi high ++++) ( Figure 3).
  • LPAi LPAi high
  • p 0.0215
  • p 0.021
  • the median expression value of each marker has been defined as the threshold value.
  • the population was thus stratified into four subgroups corresponding to (i) the population with CXCL3 below the median and HBEGF below the median (3BHB, 79 patients), (ii) the population with CXCL3 less than the median and HBEGF greater than the median (3BHH, 51 patients), (iii) the population with CXCL3 greater than the median and HBEGF lower than the median (3HHB, 51 patients) and (iv) the population with CXCL3 greater than the median and HBEGF greater than the median (3HHH, 79 patients).
  • the expression level of LPAi was calculated ( Figure 4).
  • HBEGF and CXCL3 were analyzed by RT-QPCR from xenografts of PC3 cells generated by subcutaneous injection in Balb / c nude mice.
  • human hormone-independent PC-3 prostate carcinoma cells ATCC CRL-135 TM were cultured at 37 ° C in a humid atmosphere at 5% CO 2 in F-12K medium (Invitrogen) in the presence of fetal vision serum (10%).
  • the non-specific LPAi and LPA 3 receptor antagonist KI16425, Cayman

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Description

PROCEDE DE DETERMINATION DE L'ACTIVITE DU RECEPTEUR LPAi DE L'ACIDE LYSOPHOSPHATIDIQUE (LPA)
La présente invention concerne le domaine de la biologie en général, et en particulier les récepteurs de l'acide lysophosphatidique.
Plus précisément, l'invention concerne notamment un procédé de détermination in vitro de l'activité spécifique du récepteur LPAi par la mesure de l'expression d'un ou de plusieurs marqueurs spécifiques, en particulier pour déterminer in vitro l'activité modulatrice in vitro ou in vivo d'un composé vis-à-vis spécifiquement du récepteur LPAi, notamment dans le cadre du suivi de l'efficacité d'un composé thérapeutique ciblant spécifiquement le récepteur LPAi.
L'acide lysophosphatidique (LPA) est un phospholipide naturel qui présente une activité de type facteur de croissance sur une très large variété de cellules, régulant Sa prolifération, la migration et l'invasion cellulaire in vitro (Fukushima et al,, 1998 ; Goetzl ef a/.,1999). Les plaquettes sanguines constituent la source majeure, mais non-exclusive, de LPA dans l'organisme lors de l'agrégation plaquettaire (Gerrard et Robinson, 1989). La concentration de LPA passe de l'ordre de Ο,ΙμΜ dans le plasma à 5-25μ dans le sérum. Les fibroblastes, les préadipocytes et certaines cellules tumorales peuvent produire elle-même du LPA,
Le LPA est impliqué dans le contrôle de nombreuses fonctions physiopathologiques (fibrose pulmonaire, fibrose rénale, obésité, polyarthrite rhumatoïde, reproduction, maladies urinaires, cancer). L'action cellulaire du LPA passe par l'activation d'une série de récepteurs présents à la surface de nombreuses cellules dont les cellules cancéreuses (LPAi, LPA2, LPA3, LPA4, LPA5, LPA6 et LPA7). Ces récepteurs sont très homologues entre-eux. Ils ont une structure à sept passages transmembranaires couplés aux protéines fixatrices du GTP (protéines G), On distingue cependant deux sous-classes de récepteurs en fonction de leur origine phylogénétique et de leur organisation génomique (LPA1-3 et LPA4-7). Il faut savoir que les ARN messagers codant pour ces récepteurs sont largement distribués au niveau tissulaire (Contos et ai., 2002) et que la plupart des cellules expriment plusieurs types de récepteurs en même temps.
De nombreux laboratoires et sociétés développent actuellement des molécules à visée thérapeutique ciblant les récepteurs du LPA, notamment le récepteur de type 1 du LPA ou LPAi.
Or, il n'existe à l'heure actuelle aucun test permettant de valider l'activation ou l'inhibition spécifique du récepteur LPAi dans des d'échantillons biologiques prélevés in vivo, ni in vitro dans des systèmes cellulaires complexes exprimant de multiples récepteurs du LPA, ce qui est largement majoritaire.
A ce jour, il n'est donc pas possible de savoir si le récepteur LPAi spécifiquement est effectivement activé ou inactivé. En particulier dans l'organisme (homme, souris,..), aucun test ne permet de valider que ce récepteur LPAi est effectivement activé ou inactivé sous l'action de ces différentes molécules thérapeutiques, ni de suivre l'efficacité de thérapies ciblées mises en place.
Actuellement, la validation de l'activation et de l'inhibition du récepteur LPAi est réalisée uniquement in vitro, et ceci dans des conditions très limitées à partir de cellules n'exprimant naturellement aucun récepteur du LPA et qui après manipulations génétiques expriment ce récepteur. Les tests consistent à mesurer soit l'intensité du flux calcique intracellulaire par spectrophotométrie en présence de LPA, soit la fixation de gammaGTP* au niveau de protéines fixatrices du GTP, présentes au niveau de la face interne de la membrane plasmique, en mesurant la radioactivité associée aux membranes suite à la stimulation par le LPA.
C'est dans ce contexte que la présente invention propose de pouvoir détecter in vitro l'activation ou l'inhibition spécifique du récepteur LPAi grâce à l'utilisation d'une signature biologique particulière.
La présente invention comble donc l'impossibilité actuelle de confirmer l'état d'activation ou d'inhibition spécifique du récepteur LPAi in vivo dans l'organisme, mais également in vitro dans des systèmes cellulaires complexes qui expriment différents récepteurs du LPA. Ainsi, selon un premier aspect, ia présente invention a pour objet un procédé de détermination in vitro de l'activité spécifique du récepteur LPAi comprenant les étapes consistant à :
- mesurer le niveau d'expression des marqueurs HBEGF (Heparin- Binding EGF-like growth factor) et CXCL3 {Chemokine C-X-C motif Ligand 3) dans un échantillon,
- conclure respectivement à l'activation ou à l'inhibition du récepteur LPAi spécifiquement, lorsqu'une augmentation ou une diminution significative du niveau d'expression de ces deux marqueurs est mise en évidence par rapport à une valeur de référence.
Les inventeurs ont en effet trouvé, de manière surprenante, que l'étude combinée de l'expression du gène codant HBEGF (Heparin-Binding EGF-like growth factor) et du gène codant CXCL3 (Chemokine C-X-C motif Ligand 3) constitue une signature de l'activation ou de l'inhibition du récepteur LPAi spécifiquement. Ainsi, une augmentation de l'expression de HBEGF et une augmentation de l'expression de CXCL3 est associée à l'activation de LPAi spécifiquement, alors qu'une diminution de l'expression de HBEGF et une diminution de l'expression de CXCL3 est associée à l'inhibition de LPAi spécifiquement. Par conséquent, si l'expression respective des deux marqueurs HBEGF et CXCL3 est modifiée en sens contraire, c'est-à-dire que l'expression d'un de ces deux marqueurs est augmentée alors que l'expression de l'autre de ces deux marqueurs est diminuée, il ne sera pas possible de conclure à l'activation ou à l'inhibition du récepteur LPAi spécifiquement. Ainsi, on ne pourra pas conclure que la modification de l'expression de ces deux marqueurs est spécifique de la voie de signalisation du récepteur LPAi du LPA.
Selon une première variante de mise en oeuvre, le procédé de l'invention permet la détermination in vitro de l'activité modulatrice d'un composé vis-à-vis spécifiquement du récepteur LPAi, par la mesure de l'expression des deux marqueurs HBEGF et CXCL3 comme indiqué ci-dessus, et en utilisant comme valeur de référence le niveau d'expression desdits marqueurs avant l'ajout dudit composé dont l'activité modulatrice est à déterminer.
Selon une deuxième variante de mise en œuvre, le procédé de l'invention permet également le suivi de l'efficacité d'un composé thérapeutique pour cibler spécifiquement le récepteur LPAi, par la mesure de l'expression des deux marqueurs HBEGF et CXCL3 comme indiqué ci-dessus, et en utilisant comme valeur de référence le niveau d'expression desdits marqueurs dans un prélèvement antérieur.
Le récepteur de type 1 du LPA ou LPAi est également nommé parfois LPAR1 pour « lysophosphatidic acid receptor 1 », ou encore EDG2 « Endothelial Différenciation Gene 2 », VZG1 « ventricular zone gene 1 », GPR26, « G protein-coupled receptor 26 », Mred.3 (nomination d'après Macrae et al., 1996), Kdt2 (d'après le site internet ouse Génome Informatîx. http://www.informatics.iax.org. nom : Lparl, ID : MGI: 108429).
Dans le cadre de l'invention, le récepteur LPAi correspond de préférence au récepteur tel que décrit par An et al en 1997. Par ailleurs, selon l'invention, le mot « spécifique » ou « spécifiquement » utilisé en lien avec le récepteur LPAi ou son activité correspond à une activité du récepteur LPAi, et non à l'activité d'autres types de récepteurs du LPA, et notamment LPA2 à LPA7.
Dans le cadre de l'invention, le marqueur HBEGF (Heparin-Binding EGF- like growth factof), encore nommé HEGFL, DTR (Diphteria Toxin Receptor), correspond de préférence à celui décrit par Besner et ai en 1990.
En particulier, pour le marqueur HBEGF selon l'invention, la séquence nucléique de référence est de préférence la suivante : NM_001945.2
De même, la séquence protéique de référence pour le marqueur HBEGF selon l'invention est de préférence la suivante : EAW62069.1
Dans le cadre de l'invention, le marqueur CXCL3 {Chemokine C-X-C motif Ligand S), encore nommé GROG, GRO-gamma (Growth Regulated Oncogene Gamma), SCYB3 (Small Inducible Cytoktne Subfamily B Member 3), MIP2B, MIP2beta (Macrophage Infiammatory Protein-2-beta), correspond de préférence à celui décrit par Tekamp-Olson et ai., en 1990. En particulier, pour le marqueur CXCL3 selon l'invention, la séquence nucléique de référence de préférence est la suivante : NM_002090.2.
De même, la séquence protéique de référence pour le marqueur CXCL3 selon l'invention est de préférence la suivante : AAH16308.1.
Le procédé selon l'invention permet en particulier de déterminer in vitro l'activité spécifique du récepteur LPAi in vivo ou in vitro, et ce quelle que soit la variante du procédé selon l'invention.
Selon l'invention, Sa valeur de référence est choisie en fonction de la variante de mise en œuvre du procédé.
Selon un deuxième aspect, la présente invention a également pour objet un procédé de détermination in vitro de l'activité modulatrice d'un composé vis-à-vis spécifiquement du récepteur LPAi, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes du procédé de détermination in vitro de l'activité spécifique du récepteur LPAi tel que décrit ci-dessus, et que la valeur de référence correspond au niveau d'expression desdits marqueurs avant l'ajout dudit composé dont l'activité modulatrice est à déterminer.
Dans le cadre de ce procédé, le composé dont l'activité modulatrice est à déterminer peut correspondre à un composé dont on souhaite déterminer l'activité en tant qu'agoniste ou antagoniste du récepteur LPAi.
En particulier, le composé dont l'activité modulatrice est à déterminer est de préférence une molécule thérapeutique.
Ce procédé permet ainsi de valider l'efficacité d'agonistes ou d'antagonistes dirigés spécifiquement contre le récepteur LPAi dans des systèmes cellulaires complexes exprimant de multiples récepteurs du LPA, et en particulier dans un contexte thérapeutique.
Selon un troisième aspect, la présente invention a également pour objet un procédé de suivi de l'efficacité d'un composé thérapeutique pour cibler spécifiquement le récepteur LPAi, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes du procédé de détermination in vitro de l'activité spécifique du récepteur LPAi tel que décrit ci-dessus, et que la valeur de référence correspond au niveau d'expression desdits marqueurs dans un prélèvement antérieur. Dans cette variante particulièrement préférée, la présente invention permet ainsi de valider l'efficacité de composés thérapeutiques ayant spécifiquement pour cible le récepteur LPAi et de suivre leur efficacité dans le temps au cours de la mise en place du traitement. De manière préférée, le prélèvement antérieur correspond à un stade antérieur au cours du traitement avec le composé thérapeutique dont on souhaite valider l'efficacité, et non à un stade antérieur avant la mise en place dudit traitement.
Ce procédé de validation et de suivi de l'efficacité de composés thérapeutiques ciblant spécifiquement le récepteur LPAi trouve application dans de nombreuses pathologies, et notamment dans le traitement des cancers, de la polyarthrite rhumatoïde, de la fibrose rénale, et de la fibrose pulmonaire. En cancérologie par exemple, il a été récemment montré que les récepteurs du LPA sont impliqués dans la carcinogène et dans la dissémination métastatique des cancers du sein (Boucharaba et al., 2004 et 2006 ; Liu et ai, 2009). Plus particulièrement le récepteur LPAi est une cible dans le cas du traitement des métastases osseuses du cancer du sein (Boucharaba et ah, 2006).
En plus de l'expression de HBEGF et de CXCL3, le procédé de l'invention peut en outre comprendre une étape de mesure du niveau d'expression d'un ou de plusieurs autre(s) marqueur(s), notamment choisi(s) parmi CSF2/GMCSF {Colony Stimulating Factor 2), CXCLl/Groa, {Chemokine C-X-C Motif Ligand 1), IL-6 (Interleukine 6) et IL-8 (Interleukine 8) comme décrit par Boucharaba et al. en 2006. Ce mode de réalisation particulier peut s'appliquer quelle que soit la variante de mise en œuvre du procédé, à savoir pour déterminer in vitro l'activité spécifique du récepteur LPAi, rnais également pour déterminer in vitro l'activité modulatrice d'un composé vis-à- vis spécifiquement du récepteur LPAi, ou encore pour le suivi de l'efficacité d'un composé thérapeutique pour cibler spécifiquement le récepteur LPAi.
Au sens de la présente invention, les termes « mesure de l'expression » ou « mesurer l'expression » signifient une mesure in vitro ou ex-vivo de l'expression. Par ailleurs, dans ces termes, le mot « expression » entend désigner à la fois la mesure de l'expression au niveau nucléique ou au niveau protéique. A cet effet, toute méthode de mesure ou de quantification bien connue de l'homme du métier peut être utilisée pour la mise en œuvre de l'invention.
En particulier, lorsque la mesure de l'expression est réalisée au niveau nucléique, et en particulier à partir d'ARN ou d'ADNc, celle-ci peut notamment être réalisée par analyse PCR, en particulier PCR quantitative ou qPCR, par hybridation micro-arrays (biopuces) ou Northern-blot.
Lorsque la mesure de l'expression est réalisée au niveau protéique, les techniques standards telles que le Western-Blot, ELISA, RIA, IRMA, FIA, CLIA, ECL, cytométrie de flux ou immunocytologie peuvent être utilisées.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la mesure de l'expression des marqueurs est réalisée au niveau nucléique, et en particulier par une technique PCR.
Au sens de la présente invention, tout acte défini en relation avec le terme « in vitro » couvre également le même acte en relation avec les termes « ex vivo » ou « in cellulo » ou avec tout terme équivalent du moment qu'il exclut une application au corps humain ou animal.
Par « augmentation ou diminution significative du niveau d'expression », on entend une augmentation ou une diminution statistiquement significative du niveau d'expression, de préférence associée ou corrélée à un indice de confiance d'au moins 95 % (p<0,05)
L'échantillon sur lequel le procédé de l'invention est mis en œuvre peut être d'origine biologique, notamment animale ou humaine, et de préférence humaine. Il peut notamment correspondre à un prélèvement de fluide biologique par exemple le sérum, à un prélèvement tissulaire ou à des cellules isolées, notamment à partir de tels fluides biologiques ou tissus. Ces échantillons peuvent notamment être issus d'un individu sain ou malade, en particulier atteint d'une maladie susceptible d'être traitée ou améliorée par une thérapie ciblée de l'activité du récepteur LPAi. En particulier, l'échantillon sur lequel le procédé de l'invention est mis en œuvre est issu d'un individu atteint de cancer de la prostate ou du sein, de préférence de cancer du sein. Dans le cadre de la présente demande, les termes « cancer » et « tumeur » sont utilisés indifféremment pour désigner un cancer, c'est-à-dire qu'ici le terme « tumeur » s'entend désigner une tumeur maligne c'est-à-dire cancéreuse.
Selon un autre aspect, la présente invention a également pour objet l'utilisation de la mesure in vitro du niveau d'expression des marqueurs HBEGF et CXCL3 en tant que signature de l'activité du récepteur spécifique LPAi du LPA, c'est-à-dire d'une activation ou d'une inhibition de ce récepteur.
En effet, dans le cadre de cette utilisation, la mise en évidence d'une augmentation du niveau d'expression de HBEGF et de CXCL3 est une signature de l'activation du récepteur spécifique LPAl alors qu'une diminution du niveau d'expression de HBEGF et de CXCL3 est une signature de l'inhibition du récepteur spécifique LPAi.
L'utilisation selon l'invention permet ainsi de déterminer in vitro l'activité spécifique du récepteur LPAi, mais également de déterminer in vitro l'activité modulatrice d'un composé vis-à-vis spécifiquement du récepteur LPAi, ou encore le suivi de l'efficacité d'un composé thérapeutique pour cibler spécifiquement le récepteur LPAi.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, la mesure du niveau d'expression de HBEGF et de CXCL3 est utilisée en tant que signature de l'activité du récepteur spécifique LPAi du LPA pour le suivi de l'efficacité in vivo d'un composé thérapeutique pour cibler spécifiquement le récepteur LPAi.
Dans le cadre de cet aspect, l'invention concerne de préférence l'utilisation de la mesure du niveau d'expression de HBEGF et de CXCL3 dans un échantillon biologique issu d'un patient traité avec ledit composé thérapeutique.
Tous ies modes de réalisation préférés et leurs combinaisons qui sont mentionnés ci-dessus concernant le procédé constituent également des modes de réalisation préférés s'agissant de l'utilisation. En particulier, outre la mesure du niveau d'expression à la fois de HBEGF et de CXCL3, l'utilisation selon l'invention peut également comprendre la mesure du niveau d'expression d'un ou de plusieurs autre(s) marqueur(s), de préférence choisi(s) parmi CSF2/GMCSF, CXCLl/Groa, IL-6 et IL-8.
Selon encore un autre aspect, la présente invention a aussi pour objet l'utilisation d'un kit comprenant un ou plusieurs réactifs spécifiques permettant de mesurer le niveau d'expression de HBEGF et un ou plusieurs réactifs spécifiques permettant de mesurer le niveau d'expression de CXCL3, pour la mise en œuvre du procédé de l'invention, selon l'une quelconque de ses variantes énoncées ci-dessus, à savoir pour déterminer in vitro l'activité spécifique du récepteur LPAi, pour la déterminer in vitro de l'activité modulatrice d'un composé vis-à-vis spécifiquement du récepteur LPAi, ou pour le suivi de l'efficacité d'un composé thérapeutique pour cibler spécifiquement le récepteur LPAi.
Préférentiellement, le kit utilisé selon l'invention contient des oligonucléotides spécifiques en tant que réactifs spécifiques permettant de mesurer le niveau d'expression des marqueur(s) choisi(s), en particulier par une technique PCR. Par exemple, de tels oligonucléotides spécifiques peuvent être :
HBEGF-F : 5 '-GG ACCCATGTCTTCGG AAAT-3 ' (SEQ ID NO : 1); et/ou
HBEGF-R : 5'-CCCATGACACCTCTCTCCAT-3' (SEQ ID NO : 2); et/ou CXCL3-F ; 5 '- ATCCCCC ATGGTTCAGAAA-3 ' (SEQ ID NO : 3); et/ou
CXCL3-R : 5 '- ACCCTGCAGG AAGTGTCAAT-3' (SEQ ID NO : 4).
Le kit utilisé selon l'invention peut également contenir un ou plusieurs réactifs spécifiques permettant de mesurer le niveau d'expression de LPAI, et en particulier les oligonucléotiques suivants :
LPA1-F : 5 '-TGGCATTAAAAATTTTAC AAAAAC A-3 ' (SEQ ID NO : 5); et/ou
LPA1-R : 5'- AATAGTTAACAACATGGGAATGG-3 ' (SEQ ID NO ; 6).
De préférence, le kit utilisé selon l'invention comprend en outre un ou plusieurs réactifs spécifiques permettant de mesurer le niveau d'expression d'un ou de plusieurs autre(s) marqueur(s), de préférence choisi(s) parmi CSF2/GMCSF, CXCLl/Groa, IL-6 et IL-8.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, le kit tel que défini ci-dessus et selon toutes ses variantes est utilisé selon l'invention pour le suivi de l'efficacité d'un composé thérapeutique pour cibler spécifiquement le récepteur LPAi.
De manière particulièrement préférée, l'utilisation du kit tel que défini ci-dessus et selon toutes ses variantes permet de déterminer l'activité du récepteur spécifique LPAi du LPA, et en particulier l'activité in vivo de ce récepteur.
Tous les modes de réalisation préférés et leurs combinaisons qui sont mentionnés ci-dessus concernant le procédé et l'utilisation constituent également des modes de réalisation préférés s'agissant du kit utilisé selon l'invention.
En particulier, l'invention couvre de préférence l'utilisation d'un kit comprenant un ou plusieurs réactifs spécifiques permettant de mesurer le niveau d'expression de HBEGF et un ou plusieurs réactifs spécifiques permettant de mesurer le niveau d'expression de CXCL3, et éventuellement celui d'un ou de plusieurs autre(s) marqueur(s), de préférence choisi(s) parmi CSF2/GMCSF, CXCLl/Groa, IL-6 et IL-8, pour la mise en œuvre du procédé selon l'invention, et de manière particulièrement préférée l'utilisation d'un tel kit pour le suivi de l'efficacité d'un composé thérapeutique pour cibler spécifiquement le récepteur LPAi ou pour déterminer l'activité in vivo du récepteur spécifique LPAi du LPA.
Diverses autres caractéristiques ressortent de la description faite ci- dessous en référence aux figures annexées qui montrent, à titre d'exemples non limitatifs, des formes de réalisation de la présente invention, et dans lesquelles :
- la figure 1 représente l'effet de l'antagoniste VPC12249 sur l'expression de HBEGF et CXCL3 dans des cellules PC3,
- la figure 2 représente l'expression de LPAi, HBEGF et CXCL3 dans des cellules MDA-B02, SK-BR-3, et MDA-B02/ LPAi, SK-BR-3/ LPAi,
- la figure 3 représente l'expression de LPAi, HBEGF et CXCL3 dans une collection d'ARN provenant de tumeurs primaires du sein, - la figure 4 représente la corrélation d'expression de LPAi en fonction des niveaux d'expression combinés de CXCL3 et de HBEGF dans une collection d'ARN provenant de tumeurs primaires du sein,
- la figure 5 représente l'effet de l'antagoniste KÎ16425 sur l'expression de HBEGF et CXCL3 dans des tumeurs PC3 induites chez la souris.
L'invention n'est pas limitée aux exemples décrits et représentés car diverses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre. EXEMPLES
Méthodes
Les groupes de gènes dont l'expression est stimulée de façon précoce par l'activation spécifique du récepteurs LPAi en réponse à une stimulation par le LPA ont été identifiés de la manière suivante.
Une analyse croisée des données de transcriptomique de lignées cellulaires stimulées ou non par le LPA pendant un temps cours a été réalisée. Afin d'éliminer de l'analyse tous les gènes qui sont spécifiques à une seule lignée cellulaire une série de trois lignées cellulaires tumorales naturelles, non modifiées génétiquement, différentes tant au niveau de leur genre (mâle pour les PC3 et femelles pour les MDA-MB-231 et MCF-7) que de leur origine cancéreuse (cancer de la prostate hormono-indépendant pour les PC3, cancer du sein hormono-indépendant pour les MDA-MB-231 et cancer du sein hormono-dépendant pour les MCF-7) ont été utilisées.
Les cellules ont été cultivées en absence de sérum pendant 24h puis mises en présence ou non de LPA (1 μΜ) pendant 45 minutes. Les ARN totaux de six réplicats indépendants de chaque lignée cellulaire ont été extraits à l'aide du kit Nucleospin RNAII (Macherey-Nagel) et les ARNs ont été traités avec une DNAse RNAse-free afin d'enlever toute trace de contamination par l'ADN génomique. Deux réplicats pour chaque condition ont été analysés sur des biopuces Affimétrix U133 Plus2.0 (54677 sondes). Après hybridation, selon les conditions préconisées par le fournisseur (Affimetrix UK Ltd, Royaume Uni), la moyenne d'intensité du signal émis par les sondes correspondant à chaque duplicat a été calculée pour chaque des conditions. Les duplicats présentant une intensité moyenne d'expression inférieure à la valeur Médiane d'expression (va(eur=63) de i'ensemble des 54677 sondes de la biopuce ont été éliminés de l'analyse en raison d'un niveau d'expression trop faible et donc non fiable. Ont également été éliminés de l'analyse les sondes désignées comme « Absent », en présence de LPA, par le logiciel Affimétrix d'analyse de la biopuce.
En absence de stimulation par le LPA, l'analyse montre que chaque lignée cellulaire utilisée exprime un panel différent des récepteurs du LPA, comme indiqué dans le tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1
Edg2 Edg4 Edg7 GPR23 GPR92 P2Y5 GPRS7
LPAi LPA2 LPAj LPA LPAS LPA6 LPA7
P2Y9
PC3 ++++ ++ +++ 0 0 +++ ++
MCF-7 0 +++ 0 0 0 0 +++
MDA-MB-231 ++ ++ 0 0 0 0 0
En résumé, les récepteurs du LPA majoritaires chez les PC3 sont
LPAi,2,3,6,7, chez les MCF7 LPA2,y et chez les MDA-MB231 LPAij2.
Une analyse par biopuces a ensuite été effectuée sur la base de l'hypothèse suivante : les gènes régulés de façon similaire
(activation/inhibition) uniquement dans les cellules PC3 et MDA-MB-231 identifient l'activation spécifique de LPAi.
Pour cela, les trois types cellulaires ont été cultivés dans un milieu ne contenant pas de sérum. Puis elles ont été mises en présence de LPA 1 μΜ pendant 45 minutes. Les cellules ont ensuite été récoltées et leur contenu en
ARN total a été préparé. Chaque condition expérimentale a été reproduite 6 fois (6 replicats) de façon indépendante. L'analyse par biopuces est basée sur la comparaison des moyennes d'expression de deux réplicats pour chaque condition.
L'analyse a été effectuée en excluant l'ensemble des sondes de la biopuce correspondant à des EST et à des gènes codant pour des séquences identifiées « protéines hypothétiques ». Ainsi, un ensemble de 56 gènes, non activé par le LPA chez les MCF7 fold change =<1.0) et stimulé de façon précoce {fold change >= 1,3) par le LPA, a été identifié dans les cellules PC3 et MDA-MB-231 . Selon l'hypothèse formulée, cette liste de gènes correspond à la signature d'activation du récepteur LPAi.
L'expression des deux gènes HBEGF et CXCL3 a notamment été analysée pour étudier le lien potentiel avec l'activité du récepteur LPAi.
Exemple 1 : Analyse par RT-OPCR de l'expression de HBEGF et CXCL3 à partir de lignées cellulaires in vitro
a) Des cellules humaines de carcinome de prostate hormonaux- indépendantes PC-3 (ATCC CRL-135™) ont été cultivées à 37°C dans une atmosphère humide à 5% de C02 dans du milieu F-12K (Invitrogen) en présence de sérum de vœu fœtal (10 %) et les ARN totaux ont été extraits à l'aide du kit Nucleospin RNAII (Macherey-Nagel) au bout de 45 minutes ou 16 heures après traitement des cellules à l'aide d'un antagoniste du récepteur LPAi (VPC12249, 5 ou ΙΟμΜ, Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USA). Les ARNs ont été traités avec une DNAse RNAse-free afin d'enlever toute trace de contamination par l'ADN génomique.
N'existant pas d'antagoniste spécifique uniquement du récepteur LPAi disponible de façon commerciale, un antagoniste non spécifique des récepteurs LPA1/LPA3 (VPC 12249) a été utilisé pour cette étude.
L'expression de HBEGF et CXCL3 en tant que marqueurs spécifiques de l'activation du récepteur LPAi a été étudiée par RT-PCR quantitative (QPCR) à partir des ARN totaux de 3 réplicats. Les ADNc ont été synthétisés à partir de lpg d'ARN en utilisant le kit iScript cDNA Synthesis kit (Biorad). Les ARNm ont été amplifiés en utilisant le kit SYBR Green (Finnzymes) à l'aide d'amorces spécifiques (HBEGF-F : 5'-GGACCCATGTCTTCGGAAAT- 3' (SEQ ID NO : 1); HBEGF-R : 5'-CCCATGACACCTCTCTCCAT-3' (SEQ ID NO : 2); CXCL3-F : 5 '- ATCCCCC ATG GTTC AG AAA-3 ' (SEQ ID NO : 3); CXCL3- R : 5 '- ACCCTGC AG GAAGTGTC AAT-3 ' (SEQ ID NO : 4) grâce à l'Eppendorf Mastercycler ReaIPlex (Invitrogen). Les ADN complémentaires ont été amplifiés par une PCR de 40 cycles et les produits de PCR analysés par électrophorèse dans un gel 2% agarose marqués au bromure d'éthidium. Les valeurs de CT (cycle seuil ou Cycle Threshold obtenues ont été normalisées par l'expression de TARN m ribosomal L32 par la méthode des Ct (L32-F : 5 '-C AAGG AGCTGG AAGTGCTGC- 3 ' (SEQ ID NO : 7); L32-R : 5'- CAGCTCTTTCCACGATGGC-3 ' (SEQ ID NO : 8).
Les résultats sont regroupés sur la figure 1 et montrent que l'expression des gènes cibles de LPAi HBEGF et CXCL3 est inhibée par un antagoniste des récepteurs LPA1/LPA3.
b) A partir des lignées de cellules humaines de cancer du sein MDA- B02, un sous clone des cellules MDA-MB-231 (Peyruchaud et al., 2001) qui expriment l'ensemble des récepteurs du LPA décrits à ce jour (LPAi-5) et SK- BR-3 (ATCC HTB-30™) qui n'expriment pas ou peu les récepteurs du LPA, des lignées cellulaires MDA-B02/LPAi qui surexpriment le récepteur LPAi et SK-BR-3/LPAi qui expriment de novo LPAi ont été construites par transfection comme décrit par Boucharaba et al., 2004 et Boucharaba et al., 2006.
L'expression de LPAi, HBEGF et CXCL3 a été étudiée par RT-PCR quantitative (QPCR) à partir des ARN totaux extraits de ces différentes lignées cellulaires MDA-B02, SK-BR-3, MDA-B02/LPAi et SK-BR-3/ LPAi cultivées à 37°C dans du milieu DMEM (PAA) et McCoy's (Invitrogen) en présence de sérum de vœu fœtal (10 %), Pour la mesure de l'expression de LPAi, les ARNm ont été amplifiés à l'aide d'amorces spécifiques suivantes : LPA1-F : 5'-TGGOTTAAA TTTTACAAAAACA-3' (SEQ ID NO : 5); LPA1-R : 5'- AATAGTTAACAACATGGGAATGG-3 ' (SEQ ID NO : 6).
Les résultats sont regroupés sur la figure 2, et montrent que les niveaux d'expression de HBEGF et de CXCL3 sont directement corrélés à celui de LPAi dans les lignées cellulaires humaines de cancers du sein MDA- B02/LPAi et SK-BR-3/ LPAi .
c) Le niveau d'expression de LPAi, HBEGF et CXCL3 a également été mesuré dans une série de lignées cellulaires provenant de différents cancers et cultivées en présence de 10% SVF (sérum de veau fœtal), telles que PC3, LnCap (cancer de la prostate) ; MDA-MB231, T47D, MCF7 (cancer du sein) ; MG63, KHOS, Mnng/HOS (ostéosarcome) ; et MDA-MB435S (mélanome).
Les résultats montrent que les lignées cellulaires ayant le niveau le plus élevé de LPAi expriment le plus fortement HBEGF et CXCL3. Inversement, les lignées cellulaires ayant le niveau le plus bas de LPAi expriment le plus faiblement HBEGF et CXCL3. Ces résultats indiquent que la mesure de l'expression de HBEGF et de CXCL3 constitue une signature de l'activité du récepteur LPAi, que ce soit d'une activation ou d'une inhibition de ce récepteur.
Exemple 2 : Analyse par RT-OPCR de l'expression de HBEGF et CXCL3 à partir d'une série d'ARN de tumeurs primaires de cancers du sein
Une série de 260 échantillons d'ARN provenant de tumeurs primaires de patientes atteintes d'un cancer du sein a été analysé par QPCR pour les niveaux d'expression du gène codant LPAi, CXCL3 et HBEGF.
a) L'analyse des deux marqueurs HBEGF et CXCL3 pris individuellement a tout d'abord été effectuée. Les résultats sont regroupés sur la figure 3.
La population a été stratifiée en quatre sous-groupes de 65 personnes chacun (Quartiles) correspondant (i) au 1A de la population qui a le niveau de LPAi le plus faible (LPAi très bas +), (ii) au ¼ de la population qui a le niveau atteignant la valeur médiane d'expression de LPAi (LPAi bas ++), (iîi) au "¼ de la population qui a un niveau d'expression de LPAi supérieur à la médiane (LPAi moyen +++), et (iv) au ¾ de la population qui a le niveau de LPAi le plus fort (LPAi haut ++++) (figure 3).
L'analyse de différentes populations de tumeurs montre une corrélation directe entre le niveau d'expression de LPAi et de HBEGF. Ceci est observé par le test-t série non appariées pour les deux populations ayant un niveau d'expression de LPAi inférieur à la médiane (LPAi très bas et LPAi bas) par rapport à la population ayant le niveau d'expression le plus élevé de LPAi (LPAi haut), p=0,0215 et p=0,021 , respectivement (Tableaux 2 et 3 ci- dessous). Le lien direct entre LPAi et HBEGF a également été montré lorsque les 4 groupes sont comparés entre eux par le test Kruskal-Wallis, p-0.0027 (Tableaux 4 et 5 ci-dessous).
Tableau 2 : Test-t série non-appariées pour HBEGF :
Figure imgf000017_0001
Tableau 3 : Effectifs pour Test-t série non-appariées pour HBEGF :
Figure imgf000017_0002
Tableau 4 : Kruskal-Wallis pour HBEGF :
Figure imgf000017_0003
Tableau 5 : Effectifs pour Kruskal-Wallis pour HBEGF
nombre Somme des rangs Moy. Des rangs
LPAi très bas 65 7360,500 113,238
LPAi bas 65 7760,500 119,392
LPAi moyen 65 8478,000 130,431
LPAi haut 65 10331,000 158,938 De façon surprenant, aucune corrélation significative n'a été retrouvée pour les niveaux d'expression de LPAi et de CXCL3 pris individuellement (Tableaux 6 à 9 ci dessous). Tableau 6 : Test-t série non-appariées pour CXCL3 :
Figure imgf000018_0001
Tableau 7 : Effectifs pour Test-t série non-appariées pour CXCL3 :
Figure imgf000018_0002
Tableau 8 : Kruskal-Wallis pour CXCL3 :
DDL 3
# Groupes 4
# ex-aequo 34
H 3,568
Valeur de p 0,3121
H corrigé pour ex-aequo 3,568
p corrigé pour ex-aequo 0,3121 Tableau 9 : Effectifs pour Kruskal-Wallis pour CXCL3 :
Figure imgf000019_0001
b) Une deuxième analyse a ensuite été effectuée en combinant les deux marqueurs HBEGF et CXCL3. Les résultats sont regroupés sur la figure 4.
La valeur médiane d'expression de chaque marqueur a été définie comme valeur seuil. La population a ainsi pu être stratifiée en quatre sous- groupes correspondant (i) à la population ayant CXCL3 inférieur à la médiane et HBEGF inférieur à la médiane (3BHB, 79 patients), (ii) à la population ayant CXCL3 inférieur à ia médiane et HBEGF supérieur à la médiane (3BHH, 51 patients), (iii) à la population ayant CXCL3 supérieur à la médiane et HBEGF inférieur à la médiane (3HHB, 51 patients) et (iv) à la population ayant CXCL3 supérieur à la médiane et HBEGF supérieur à la médiane (3HHH, 79 patients). Pour chaque groupe, !e niveau d'expression de LPAi a été calculé (figure 4).
L'analyse par le test-t série non appariées montre que la combinaison du niveau d'expression de CXCL3 à celui de HBEGF présente une puissance statistique de corrélation beaucoup plus forte que HBEGF seul avec l'expression de LPAi : ρ=0,0070 (3HHB-3HHH) versus p=0,0215 (LPAi très bas-LPAi haut) (Tableaux 10 et 11 ci-dessous et Tableaux 2 et 3 ci- dessus). Cette analyse a été confirmée par l'analyse par le test Kruskal-Wallis en comparant l'ensemble des quatre populations (p=0,0144) (Tableaux 12 et 13 ci-dessous). Tableau 10 : Test-t série non-appariées pour LPAi :
Figure imgf000020_0001
Tableau 11 : Effectifs pour Test-t série non-appariées pour LPAi :
Figure imgf000020_0002
Tableau 12 : Kmskal-Wallis pour LPAi :
Figure imgf000020_0003
Tableau 13 : Effectifs pour Kmskal-Wallis pour LPAi :
nombre Somme des rangs Moy. Des rangs
3BHB 79 9200,200 116,456
3BHH 51 7164,500 140,480
3HHB 51 5831,500 114,343
3HHH 79 11734,000 148,532 Exemple 3 ; Effet d'un antagoniste de LPA1/LPA3 sur expression de HBEGF et CXCL3 dans des tumeurs induites chez la souris
L'expression de HBEGF et CXCL3 a été analysée par RT-QPCR à partir de xénogreffes de cellules PC3 générées par injection sous-cutanée chez la souris Balb/c nude. Pour ce faire, des cellules humaines de carcinome de prostate hormonaux-indépendantes PC-3 (ATCC CRL-135™) ont été cultivées à 37°C dans une atmosphère humide à 5% de CO2 dans du milieu F-12K (Invitrogen) en présence de sérum de v u fœtal (10 %).
Une injection avec 106 cellules PC3 a été réalisée par voie sous-cutanée chez les souris (n=16). Lorsque les tumeurs ont atteint 1mm3, certains des animaux (n=9) ont reçu un traitement avec l'antagoniste non spécifique des récepteurs LPAi et LPA3 (KÏ16425, Cayman) à raison d'une injection quotidienne (20mg/kg/jour) par injection sous-cutanée pendant 5 jours. Les tumeurs ont été récoltées au moment du sacrifice. Les ARN totaux ont été préparés et analysés pour les niveaux d'expression de HBEGF et CXCL3, comme décrit ci-dessus.
Les résultats sont regroupés sur la figure 5 et montrent que l'expression de HBEGF et de CXCL3 est significativement diminuée (p<0,05) après traitement avec l'antagoniste Ki 16425. Par conséquent, l'étude in vitro du niveau d'expression de HBEGF et/ou de CXCL3 permet de montrer l'inhibition in vivo de LPAi dans une condition thérapeutique.
L'ensemble de ces résultats indique donc que l'analyse in vitro du niveau d'expression de HBEGF et du niveau d'expression de CXCL3, permet de montrer l'activation ou l'inhibition in vivo de LPAi, en particulier dans un contexte thérapeutique. Références bibliographiques
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détermination in vitro de l'activité spécifique du récepteur LPAi comprenant les étapes consistant à :
- mesurer le niveau d'expression des marqueurs HBEGF {Heparin-Binding EGF-Iike growth factot et CXCL3 {Chemokine C-X-C motif Ligand
3) dans unéchantillon, et
- conclure respectivement à l'activation ou à l'inhibition du récepteur LPAi spécifiquement lorsqu'une augmentation ou une diminution significative du niveau d'expression de ces deux marqueurs est mise en évidence par rapport à une valeur de référence.
2. Procédé de détermination in vitro de l'activité modulatrice d'un composé vis-à-vis spécifiquement du récepteur LPAi, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes du procédé selon la revendication 1 et que la valeur de référence correspond au niveau d'expression desdits marqueurs avant l'ajout dudit composé dont l'activité modulatrice est à déterminer.
3. Procédé de suivi de l'efficacité d'un composé thérapeutique pour cibler spécifiquement le récepteur LPAi, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes du procédé selon la revendication 1 ou 2 et que la valeur de référence correspond au niveau d'expression desdits marqueurs dans un prélèvement antérieur.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que qu'il comprend en outre une étape de mesure du niveau d'expression d'un ou de plusieurs autre(s) marqueurs) choisi(s) parmi CSF2/GMCSF, CXCLl/Groa, IL-6 et IL-8.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la mesure du niveau d'expression des marqueurs est réalisée au niveau nucléique, et de préférence par une technique PCR.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'échantillon est d'origine biologique, et de préférence humaine.
7. Utilisation de la mesure in vitro du niveau d'expression des marqueurs HBEGF et CXCL3 en tant que signature de l'activité du récepteur spécifique LPAi du LPA, c'est-à-dire d'une activation ou d'une inhibition de ce récepteur.
8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'une augmentation du niveau d'expression de HBEGF et de CXCL3 est une signature de l'activation du récepteur spécifique LPAi, alors qu'une diminution du niveau d'expression de HBEGF et de CXCL3 est une signature de l'inhibition du récepteur spécifique LPAi,
9. Utilisation selon la revendication 7 ou la revendication 8 pour déterminer in vitro l'activité spécifique du récepteur LPAi, pour déterminer in vitro l'activité modulatrice d'un composé vis-à-vis spécifiquement du récepteur LPAi, ou pour le suivi de l'efficacité in vivo d'un composé thérapeutique pour cibler spécifiquement le récepteur LPAi.
10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 7 à 9 comprenant également la mesure du niveau d'expression d'un ou de plusieurs autre(s) marqueur(s), de préférence choisi(s) parmi CSF2/GMCSF, CXCLl/Groa, IL-6 et IL-8.
11. Utilisation d'un kit comprenant un ou plusieurs réactifs spécifiques permettant de mesurer le niveau d'expression de HBEGF et un ou plusieurs réactifs spécifiques permettant de mesurer le niveau d'expression de CXCL3, et éventuellement un ou plusieurs réactifs spécifiques permettant de mesurer le niveau d'expression d'un ou de plusieurs réactifs spécifiques permettant de mesurer le niveau d'expression d'un ou de plusieurs autre(s) marqueur(s), de préférence choisi(s) parmi CSF2/G CSF, CXCLl/Groa, IL-6 et IL-8, pour la mise en œuvre du procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 6.
12. Utilisation d'un kit selon la revendication 11, pour le suivi de l'efficacité d'un composé thérapeutique pour cibler spécifiquement le récepteur LPAi.
13. Utilisation du kit selon la revendication 11 ou 12, caractérisée en ce que ledit kit permet de déterminer l'activité du récepteur spécifique LPAi du LPA, en particulier de l'activité in vivo de ce récepteur.
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