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WO2013114845A1 - 細胞培養用キット、及び細胞培養用キットの使用方法 - Google Patents

細胞培養用キット、及び細胞培養用キットの使用方法 Download PDF

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WO2013114845A1
WO2013114845A1 PCT/JP2013/000410 JP2013000410W WO2013114845A1 WO 2013114845 A1 WO2013114845 A1 WO 2013114845A1 JP 2013000410 W JP2013000410 W JP 2013000410W WO 2013114845 A1 WO2013114845 A1 WO 2013114845A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
container
culture
cell
medium
medium storage
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2013/000410
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
郷史 田中
貴彦 戸谷
庸一 石▲崎▼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toyo Seikan Group Holdings Ltd
Original Assignee
Toyo Seikan Group Holdings Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toyo Seikan Group Holdings Ltd filed Critical Toyo Seikan Group Holdings Ltd
Priority to EP13743029.4A priority Critical patent/EP2811011B1/en
Priority to CN201380007337.9A priority patent/CN104093827B/zh
Priority to KR1020147021478A priority patent/KR101909000B1/ko
Priority to JP2013556254A priority patent/JP6326817B2/ja
Publication of WO2013114845A1 publication Critical patent/WO2013114845A1/ja
Priority to US14/444,479 priority patent/US9909090B2/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/34—Internal compartments or partitions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/14—Bags
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/24—Gas permeable parts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/26—Constructional details, e.g. recesses, hinges flexible
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/40—Manifolds; Distribution pieces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/26—Conditioning fluids entering or exiting the reaction vessel

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture kit for use in an automatic cell culture apparatus that performs cell culture using a culture vessel and a method for using the same.
  • an automatic cell culture apparatus that automatically performs cell culture using a culture vessel can be suitably used.
  • an automatic cell culture device it is important to use a closed system in order to reduce the risk of contamination.
  • there has been no simple cell culture kit that can perform automatic culture from cell injection to medium addition, sampling, and collection while maintaining a closed system.
  • the culture medium storage container in the cell culture kit may be refrigerated.
  • the refrigerated medium when the refrigerated medium is directly fed from the medium storage container to the culture container, there is a problem that the temperature of the medium in the culture container is lowered and cell growth is deteriorated.
  • the refrigerated medium has high gas solubility, and a large amount of carbon dioxide and oxygen are dissolved therein. When this was transferred to a culture vessel and heated, the solubility of the gas decreased as the liquid temperature increased, and there was a problem that bubbles were generated in the culture vessel. Bubbles generated in the culture vessel are finely bubbled when stirring in the vessel, and adversely affect the cells.
  • the present invention has been considered in view of the above circumstances, and in cell culture using a culture vessel, from cell injection to medium addition, sampling, and collection are automatically performed while maintaining a closed system in the kit.
  • An object of the present invention is to provide a cell culture kit for making it possible. Moreover, it aims at provision of the kit for cell culture provided with the temperature control container for adjusting the temperature of a culture medium, and its usage method.
  • the cell culture kit of the present invention is a closed cell culture kit for culturing cells, and stores a culture container for culturing cells, a medium, and the like.
  • the culture vessel, the culture medium storage vessel, the cell injection vessel, and the cell collection vessel are connected by a conduit.
  • the cell culture kit of the present invention may have a configuration in which at least one sampling container capable of partially sampling a culture medium being cultured is provided, and the sampling container is connected to the culture container by a conduit. preferable.
  • the cell culture kit of the present invention preferably has a configuration in which a temperature adjustment container for adjusting the temperature of the medium or the like is provided by branching from a conduit connecting the culture container and the medium storage container. It is also preferable that a part or all of the medium or the like refrigerated in the storage container is transferred to the temperature adjustment container and heated to a predetermined temperature, and then transferred to the culture container.
  • the method for using the cell culture kit of the present invention includes a culture container for culturing cells, a medium storage container for storing a medium and the like, and a cell for injecting the cells into the cell culture kit.
  • At least one or more cell injection containers, a cell recovery container for recovering the cell suspension after the culture, and a temperature adjustment container for adjusting the temperature of the medium or the like are provided.
  • the culture container, medium storage container, cell injection container, cell recovery container, and temperature control container are connected by a conduit, and the medium is refrigerated in the medium storage container.
  • Some or all of the culture medium is transferred from the culture medium storage container to the temperature adjustment container.
  • the culture medium is heated to a predetermined temperature, and the temperature-controlled culture medium is transferred to the culture container. There as a way to be.
  • the medium refrigerated in the medium storage container can be transferred to the temperature adjustment container and adjusted to the temperature, it can be transferred to the culture container, thus preventing a decrease in the medium temperature in the culture container and inhibiting cell growth. It becomes possible to prevent.
  • FIG. 1 is a diagram showing the configuration of the cell culture kit of the present embodiment.
  • the cell culture kit of this embodiment includes a culture container 10, a medium storage container 20, a cell injection container 30, and a cell collection container 40. Moreover, it is preferable to provide the sampling container 50.
  • the culture container 10 is a container formed in a bag shape (back shape) using a flexible material as a material.
  • the culture container 10 is filled with a medium (culture solution) and seeded with cells to be cultured to culture a large amount of cells. It is a container for.
  • the culture vessel 10 needs to have gas permeability necessary for cell culture. Specifically, it preferably has an oxygen permeability of 5000 ml / m 2 ⁇ day ⁇ atm (37 ° C.-80% RH) or more. Moreover, it is preferable that all or a part of the culture vessel 10 has transparency so that the contents can be confirmed. In FIG. 1, an observation frame 11 is shown on the culture vessel 10 that is unlikely to be wrinkled and makes it easy to observe the inside. Furthermore, the culture vessel 10 preferably has low cytotoxicity, low elution property, and suitability for radiation sterilization in order to achieve high cell growth efficiency.
  • a polyethylene resin As a material for the culture vessel 10 satisfying such conditions, a polyethylene resin is preferable.
  • the polyethylene resin include polyethylene, a copolymer of ethylene and ⁇ -olefin, a copolymer of ethylene and vinyl acetate, an ionomer using ethylene and acrylic acid or a methacrylic acid copolymer and a metal ion.
  • polyolefin, styrene elastomer, polyester thermoplastic elastomer, silicone thermoplastic elastomer, silicone resin and the like can also be used.
  • the culture vessel 10 is provided with a port for injecting and collecting a medium and cells.
  • the number of ports is not particularly limited, but those having 1 to 3 ports are preferably used as will be described later.
  • the medium storage container 20 is a container for storing a medium for culturing cells that is transferred to the culture container 10.
  • the medium storage container 20 preferably has gas barrier properties so that the pH of the medium stored therein does not change significantly during the culture period.
  • the carbon dioxide permeability is preferably 1000 ml / m 2 ⁇ day ⁇ atm (23 ° C.-80% RH) or less. This is because the high-concentration carbon dioxide contained in the culture medium escapes into the air, and the carbon dioxide concentration in the culture medium decreases, resulting in an increase in pH. This is because it is desirable to minimize the leakage of carbon dioxide from the outside.
  • the medium storage container 20 preferably includes at least two ports. One of the ports is connected to a conduit (tube) connected to the culture container 10, and fresh medium is sent from the medium storage container 20 to the culture container 10 little by little in accordance with the growth of cultured cells. .
  • the medium storage container 20 in which the medium is enclosed is preferably stored in a refrigerator.
  • the other port of the medium storage container 20 is a medium filling port 21 for supplying the medium to the medium storage container 20 from the outside of the cell culture kit of the present embodiment. The medium is filled from the medium filling port 21.
  • the medium storage container 20 having only one port is used to fill the medium storage container 20 with the medium, and then the medium is transferred from the port to the culture container 10. It can also be transported.
  • the culture medium storage container 20 can be used as a waste liquid container after completion of the culture. That is, prior to recovering cells from the culture container 10 to the cell recovery container 40, the supernatant of the culture medium is transferred to the culture medium storage container 20 as a waste liquid container so that the concentrated cell suspension can be transferred from the culture container 10 thereafter. It can be sent to the cell collection container 40.
  • the second embodiment that does not use a dedicated waste liquid container.
  • the cell culture kit of this embodiment can include two or more medium storage containers 20. Thereby, the same medium can be stored twice, and different culture media can be stored to supply the culture vessel 10 with various variations.
  • the cell injection container 30 is a container containing cells and a medium necessary for starting culture. The contents of this container are transferred to the culture container 10 and culture is started. It is preferable that the total amount of cells and culture medium placed in the cell injection container 30 is about 250 ml, but is not limited thereto.
  • the cell injection container 30 is a container for storing cells and a medium, it is preferable that the cell injection container 30 has gas permeability like the culture container 10. It is also preferable to have low cytotoxicity, low elution property and the like. For this reason, it is preferable to use the same material as the culture vessel 10 as the material of the cell injection vessel 30.
  • the cell injection container 30 is provided with at least one port. And the cell and culture medium at the time of a culture
  • the cell collection container 40 is a container for collecting the cultured cells and a part of the medium from the culture container 10 after completion of the culture. For this reason, it is preferable that the cell collection container 40 also has the same characteristics as the culture container 10, and it is preferable to use the same material as the culture container 10 as the material.
  • the cell collection container 40 is provided with at least one port, and cells and a part of the medium are sent from the culture container 10 to the cell collection container 40 through this port.
  • the sampling container 50 is a container for performing sampling by transferring a part of the cell suspension in the culture container 10 during or after the culturing of the cells. Although it is preferable to set it as the quantity of about 10 ml as a sample transferred to this sampling container 50, it is not limited to this.
  • the sampling container 50 is provided with two ports, and one of these ports is connected to a conduit (tube) connected to the culture container 10, and the cell suspension is sent from the culture container 10 to the sampling container 50. .
  • the other port is used for taking out a part of the cell suspension in the sampling container 50 in order to perform various analyses. It should be noted that a single port that performs both of these can be provided, or a configuration in which three or more ports are provided and sorting can be performed a plurality of times can be employed.
  • silicone resin soft vinyl chloride resin, polybutadiene resin, ethylene-vinyl acetate copolymer, polyurethane-based thermoplastic elastomer, polyester-based thermoplastic elastomer, silicone-based thermoplastic elastomer, styrene-based elastomer such as SBS (styrene-butadiene) Styrene, SIS (styrene / isoprene / styrene), SEBS (styrene / ethylene / butylene / styrene), SEPS (styrene / ethylene / propylene / styrene), polyolefin resin, fluororesin, and the like can be used.
  • SBS styrene-butadiene
  • SIS styrene / isoprene / styrene
  • SEBS styrene / ethylene / butylene
  • a medium supply tube for connecting the culture container 10 and the medium storage container 20 and a medium transfer tube for connecting a combination of other containers As a medium supply tube for connecting the culture container 10 and the medium storage container 20, it is particularly preferable to use a tube made of polyolefin or silicone resin. Since the medium supply tube is for transferring the medium little by little to the culture vessel 10 throughout the culture period, it is desirable that the medium supply tube has particularly excellent low cytotoxicity, low elution property, and the like. On the other hand, the medium supply tube does not need to be melted during the culture process. In view of these, it is preferable to use a material made of the above materials. In FIG. 1, it is assumed that the culture medium storage container connection tube 22 is composed of such a medium supply tube. For example, a silicon tube having an inner diameter of 3.5 mm and an outer diameter of 6.0 mm is preferably used. it can.
  • the culture medium transfer tube connecting between other combinations of containers does not transfer the culture medium for a long time, it does not need to have a high function with respect to low cytotoxicity, low elution, and the like.
  • the cell injection container, the cell collection container (waste liquid container), and the sampling container can be detached from the cell culture kit of the present embodiment while maintaining the closed system by fusing the conduit. Therefore, it is preferable to use a medium transfer tube connected to these containers at least at one place made of a thermoplastic resin.
  • the whole culture medium transfer tube can be formed of a thermoplastic resin.
  • thermoplastic resin although a soft vinyl chloride resin can be used, for example, it is not limited to this.
  • FIG. 1 it is assumed that the cell injection container connection tube 31, the cell collection container connection tube 41, and the sampling container connection tube 51 are configured by such a medium transfer tube.
  • a polyvinyl chloride tube having a diameter of 5.0 mm can be suitably used.
  • a tube made of a thermoplastic resin is preferably connected to the port forming the medium filling port 21 for supplying the medium to the medium storage container 20 from the outside of the cell culture kit of the present embodiment. It is preferable to connect a tube made of vinyl chloride resin. This is because the medium storage container 20 is filled with a medium from the medium filling port 21 via an aseptic joining apparatus, and currently, soft vinyl chloride resin is mainly used for connection to the aseptic joining apparatus. Because. Regarding the tube tip treatment, members such as a luer connector, a needleless connector, and a septum can be applied in addition to the two-stage seal of the present embodiment.
  • the cell culture kit of the present embodiment has a one-port specification in which only one port is provided in the culture container 10. That is, in the cell culture kit of this embodiment, the culture container 10 is provided with the first port 12, and the medium storage container 20 is connected to the first port 12 via the medium storage container connection tube 22. The medium storage container connection tube 22 is connected to other containers.
  • the cell injection container 30 is connected to the medium storage container connection tube 22 via the cell injection container connection tube 31.
  • the cell collection container 40 is connected to the culture medium storage container connection tube 22 via the cell collection container connection tube 41.
  • the sampling container 50 is connected to the culture medium storage container connection tube 22 via the sampling container connection tube 51.
  • a tube pump is provided only in the culture medium storage container connection tube 22.
  • the cell injection container 30 is preferably connected to the culture container 10 in the culture medium storage container connection tube 22. If it does in this way, when inject
  • the medium is sent from the medium storage container 20 to the cell injection container 30, and the inside of the conduit connecting the medium storage container 20 and the cell injection container 30 is filled with the medium. At this time, the air existing inside the conduit moves into the cell injection container 30.
  • the air in the cell injection container 30 is moved upward, and only the cells and medium can be sent from the cell injection container 30 to the culture container 10. it can.
  • the air that enters the culture vessel 10 is only present from the medium storage vessel connection tube 22 to which the cell injection vessel 30 is connected to the culture vessel 10. Therefore, by connecting the cell injection container 30 to the position as close as possible to the culture container 10 in the culture medium storage container connection tube 22, the air sent to the culture container 10 is minimized to the extent that it does not interfere with the observation and photographing of the cells. Can be suppressed.
  • the medium storage container 20 and the cell injection container 30 are configured to be removable in the cell culture kit. This is because the medium storage container 20 is filled with a medium before use, and the cell injection container 30 is filled with cells and a medium, and these are used by being connected to a cell culture kit at the time of use. It is preferable that the culture container 10, cell collection container 40, sampling container 50, and tubes attached thereto are integrally configured before use (during manufacture). In addition, the waste liquid container 60 mentioned later can also be comprised integrally before use.
  • each tube with a clip, or to control the transfer of the medium and the like in each tube with an electromagnetic valve or the like.
  • a luer connector with a cap or a cover can be used for the connecting portion in the medium storage container connection tube 22.
  • a silicon tube is used for the medium storage container connection tube 22 and a polyvinyl chloride tube is used for the other, and a joint tube (for example, inner diameter 5.3 mm, outer diameter 7.
  • a joint tube for example, inner diameter 5.3 mm, outer diameter 7.
  • the present invention is not limited to these specific configurations.
  • the cell culture kit of this embodiment can be used, for example, by the following method. First, in the cell culture kit shown in FIG. 1, the connector in the medium storage container connection tube 22 of the medium storage container 20 filled with the medium is connected and the cell injection container connection tube of the cell injection container 30 filled with cells and the medium. 31 is connected by a connector.
  • the medium is transferred from the medium storage container 20 to the cell injection container 30 via the medium storage container connection tube 22 and the cell injection container connection tube 31.
  • the air that has entered the tube in the portion where the culture medium has been transferred enters the cell injection container 30.
  • the cells and the medium are transferred from the cell injection container 30 to the culture container 10. At this time, only the cells and the medium are cultured without sending air to the culture container 10 by, for example, collecting the air contained in the cell injection container 30 in the vertical direction with the port of the cell injection container 30 facing down. It can be transferred to the container 10.
  • the culture medium is transferred from the culture medium storage container 20 to the culture container 10 via the culture medium storage container connection tube 22.
  • the timing which transfers a cell and a culture medium from the cell injection container 30 to the culture container 10 is not limited above, For example, it carries out at the timing which transferred one part or all the culture medium from the culture medium storage container 20 to the culture container 10. You can also Then, when the culture container 10 is filled with a predetermined amount of medium and cells, the cells are cultured for a certain period of time with appropriate shaking and stirring. During cell culture, the sample can be appropriately transferred from the culture vessel 10 to the sampling vessel 50 and used for investigation and analysis.
  • the culture medium storage container 20 is used as a waste liquid container. That is, first, the culture vessel 10 is stopped and the cells are allowed to settle down, and then the supernatant of the cell suspension is transferred from the culture vessel 10 to the medium storage vessel 20. As a result, the cell suspension in the culture vessel 10 can be concentrated, and the amount of liquid transferred to the cell collection vessel 40 can be reduced. Next, the concentrated cell suspension is recovered from the culture container 10 to the cell recovery container 40.
  • cell culture can be performed in a closed system by using the cell culture kit of this embodiment.
  • the process from cell injection to medium addition, sampling, and collection is automatically performed while maintaining a closed system in the kit. Is possible.
  • the cell culture kit of this embodiment has a one-port specification, only one tube pump for liquid feeding is required, and the apparatus can be simplified.
  • FIG. 1 is a diagram showing the configuration of the cell culture kit of the present embodiment.
  • the cell culture kit of the present embodiment is different from the first embodiment in that it has a two-port specification, and has the same configuration as the cell culture kit of the first embodiment in other points. That is, the cell culture kit according to the present embodiment includes the culture container 110, the medium storage container 20, the cell injection container 30, the cell recovery container 40, and preferably includes the sampling container 50.
  • the culture vessel 110 in the cell culture kit of the present embodiment includes a first port 112 and a second port 113 as shown in FIG.
  • the medium storage container 20 is connected to the first port 112 via the medium storage container connection tube 22.
  • a cell collection container 40 is connected to the second port 113 via a cell collection container connection tube 41.
  • Tube pumps are used for the medium storage container connection tube 22 and the cell collection container connection tube 41, respectively, and the medium and the cell suspension are transferred.
  • the cell injection container 30 is connected to the medium storage container connection tube 22 via the cell injection container connection tube 31, and the sampling container 50 is connected to the medium storage container connection tube 22 via the sampling container connection tube 51.
  • the method for using the cell culture kit of this embodiment can be the same as that of the first embodiment until the completion of cell culture.
  • the cell suspension is collected in the cell collection container 40 by the tube pump via the second port 113 and the cell collection container connection tube 41 without going through the medium storage container connection tube 22. It is possible to do.
  • the cell suspension is removed from the culture container 110 from the culture container 110 by the dedicated tube pump without passing through the medium storage container connection tube 22 when collecting the cells. 40 can be recovered. For this reason, it becomes possible to collect cells more efficiently.
  • This embodiment is an example of a two-port specification, and it is possible to connect the sampling container 50 via the second port 113 and the sampling container connection tube 51 instead of the cell collection container 40.
  • FIG. 1 is a diagram showing the configuration of the cell culture kit of the present embodiment.
  • the cell culture kit of this embodiment is different from that of the first embodiment in that it has a three-port specification, and has the same configuration as that of the cell culture kit of the first embodiment in other points.
  • the cell culture kit of this embodiment includes a culture container 210, a medium storage container 20, a cell injection container 30, a cell recovery container 40, a waste liquid container 60, and preferably a sampling container 50. Further, two medium storage containers 20a and 20b are provided as the medium storage container 20.
  • the culture vessel 210 in the cell culture kit of this embodiment includes a first port 212, a second port 213, and a third port 214, as shown in FIG.
  • a sampling container 50 and a waste liquid container 60 are connected to the first port via a sampling container connection tube 51 and a waste liquid container connection tube 61, respectively.
  • a tube pump is used in the tube portion where these tubes merge, and the cell suspension is transferred to the sampling container 50 and the supernatant liquid is transferred to the waste liquid container 60, respectively.
  • medium storage containers 20a and 20b are connected to the second port 213 via medium storage container connection tubes 22 (22a and 22b).
  • the medium storage container connection tube 22 uses a tube pump to transfer the medium to the culture container 210.
  • the cell collection container 40 is connected to the third port 214 via the cell collection container connection tube 41, and the cell suspension is transferred from the culture container 210 to the cell collection container 40 by a tube pump.
  • the method for using the cell culture kit of this embodiment can be the same as that of the first embodiment until cell culture is first started.
  • the cell injection container connection tube 31 is connected to the middle of the medium storage container connection tube 22 due to the limitation of the description space, but actually prevents air from entering the culture container 210. Therefore, it is preferable to connect at the time of the second port.
  • the sample can be used for investigation and analysis by appropriately transferring the sample from the culture vessel 210 to the sampling vessel 50.
  • the supernatant of the cell suspension can be transferred from the culture vessel 210 to the waste solution container 60 via the waste solution container connection tube 61 to concentrate the cell suspension in the culture vessel 210.
  • the concentrated cell suspension is recovered from the culture container 210 to the cell recovery container 40.
  • a plurality of operations can be performed simultaneously. In particular, even when the culture medium still remains in the culture medium storage container 20 or the culture medium storage container connection tube 22, the sampling into the sampling container 50 can be performed, and the supply of the culture medium and the timing of sampling can be adjusted flexibly. It becomes.
  • FIGS. are diagrams showing the configuration of the cell culture kit of the present embodiment.
  • the cell culture kit of this embodiment is characterized in that, in addition to the configurations of the first to third embodiments, a temperature adjustment container 70 and a temperature adjustment container connection tube 71 for adjusting the temperature of the medium are provided. is there.
  • Other configurations can be the same as those in the first to third embodiments.
  • a cell culture kit according to this embodiment in which a temperature adjustment container 70 and a temperature adjustment container connection tube 71 are added to the cell culture kit according to the first embodiment will be described with reference to FIG.
  • the temperature adjustment container 70 and the temperature adjustment container connection tube 71 are the same as those in FIG.
  • the temperature adjustment container 70 is a container for temporarily storing the medium to be transferred and adjusting the temperature of the medium when the medium is transferred from the medium storage container 20 to the culture container 10.
  • the amount of the medium to be transferred is not particularly limited, and can be a part or all of the medium in the medium storage container 20.
  • a part of the medium storage containers 20 is not a medium but a physiology for adding to the medium being cultured in the culture container 10.
  • the temperature can be raised by the temperature adjustment container 70.
  • the container of the temperature adjustment container 70 preferably has the same gas barrier properties as the medium storage container 20.
  • the temperature adjustment container 70 is provided with at least one port, and the temperature adjustment container connection tube 71 is connected to the port.
  • the temperature adjustment container connection tube 71 is connected to the medium storage container for connecting the medium storage container 20 and the culture container 10. Connected to the tube 22. That is, the temperature adjustment container 70 is branched from the tube connecting the medium storage container 20 and the culture container 10 and is provided in the cell culture kit in a form that maintains a closed system.
  • the temperature adjustment container connection tube 71 and the culture medium storage container connection tube 22 may be integrally formed.
  • the temperature adjustment container 70 is preferably made of a soft packaging material, and preferably has a structure with air vent.
  • the gas dissolved in the culture medium is released.
  • the port of the temperature adjustment container 70 downward the gas can be collected on the upper part of the temperature adjustment container 70, and only the culture medium can be fed to the culture container 10. For this reason, it becomes possible to transfer the culture medium without mixing extra bubbles in the culture vessel 10.
  • the temperature adjustment container 70 is preferably disposed inside the incubator in which the culture container 10 is disposed.
  • the medium in the temperature adjustment container 70 can be adjusted to the same temperature as the medium in the culture container 10.
  • the temperature can be 37 ° C., for example. It is also preferable to arrange the temperature adjustment container 70 outside the incubator and heat the temperature adjustment container 70 with, for example, a separate heating device to adjust the medium temperature in the temperature adjustment container 70. In this case, the temperature can be adjusted to a temperature range of 30 to 37 ° C., for example.
  • the temperature of the medium in the temperature adjustment container 70 can be returned to room temperature (room temperature) by placing the temperature adjustment container 70 outside the incubator and allowing it to stand without any special heating device. It is.
  • two or more temperature control containers 70 can be provided. Thereby, it becomes possible to adjust the temperature of the medium and other substances more than twice the amount at the same time.
  • the temperature control container connection tube 71 is for transferring the medium to the culture container 10 little by little throughout the culture period, it is desirable to have particularly excellent low cytotoxicity, low elution property, etc. There is no need to blow. For this reason, it is preferable that the temperature control container connection tube 71 is the same as the culture medium storage container connection tube 22 that connects the culture container 10 and the culture medium storage container 20.
  • an amount of a medium necessary for transfer to the culture container can be put in the temperature adjustment container and the temperature can be raised, and then fed to the culture container. For this reason, the temperature of the medium in the culture vessel does not decrease, and cell growth inhibition can be prevented.
  • the temperature of the medium can be raised by the temperature adjustment container in this way, the medium in the medium storage container can be refrigerated as before, and the culture efficiency of the cells decreases when the heating time of the medium becomes long. Can be prevented.
  • the gas dissolved in the culture medium is released due to the temperature rise, only the culture medium can be transferred from the temperature adjustment container to the culture container, and it is possible to prevent bubbles from entering the culture container.
  • the present invention is not limited to the above embodiment, and that various modifications can be made within the scope of the present invention.
  • the embodiment shows an example using a tube of a specific size, and a specific connector is used, but other components that can achieve the same function are used within the scope of the present invention. It is possible to change appropriately. It is also possible to attach a container filled with physiologically active substances, cytokines and other various substances to be added to the culture medium being added to the kit of the embodiment.
  • the present invention can be suitably used in the fields of biopharmaceuticals, regenerative medicine, immunotherapy and the like that require culturing a large amount of cells.

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Description

細胞培養用キット、及び細胞培養用キットの使用方法
　本発明は、培養容器を用いて細胞培養を行う自動細胞培養装置に用いるための細胞培養用キット及びその使用方法に関する。
　近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
　このような細胞の大量培養では、培養容器を用いて自動的に細胞培養を行う自動細胞培養装置を好適に用いることができる。
　自動細胞培養装置を使用するにあたっては、コンタミネーションのリスクを低減すべく、閉鎖系で行うことが重要である。しかしながら、細胞注入から培地追加、サンプリング、回収までを、閉鎖系を維持しながら自動培養可能な簡便な細胞培養用キットは、これまで存在していなかった。
国際公開２００７／０５２７１６号パンフレット
　すなわち、これまでに自動細胞培養装置は幾つか提案されており、またその装置に使う容器キットも提案されているが、臨床応用に当たって必要となる細胞注入から培地追加、サンプリング、回収までを閉鎖系を維持したまま、簡便に達成できる細胞培養用キットは存在していなかった。
　具体的には、培養容器を用いて自動的に細胞培養を行う自動細胞培養装置として、例えば特許文献１に記載の細胞培養装置を挙げることができる。この装置では、培地貯留手段、機能発現用培養容器、及び増殖用培養容器が閉鎖系で構成されている（請求項７参照）。しかし、この細胞培養装置では、廃液バックから細胞回収バックに交換する際については閉鎖系を維持できる構成は見られず、開放系で行われていると考えられる。また、その他にも、細胞注入から回収までを閉鎖系を維持したまま実現可能にするための細胞培養用キットは見当たらなかった。
　また、自動細胞培養装置を使用するにあたり、細胞培養用キットにおける培地貯蔵容器は冷蔵されることがある。しかしながら、冷蔵された培地を培地貯蔵容器から培養容器に直接送液すると、培養容器内の培地温度が低下して、細胞の増殖が悪くなるという問題があった。
　さらに、冷蔵された培地は気体の溶解度が高く、多量の炭酸ガスや酸素が溶け込んでいる。これを培養容器に移して加温すると、気体の溶解度は液温が高くなるにつれて低くなるため、培養容器内で気泡が発生するという問題があった。培養容器内で発生した気泡は、容器内を攪拌する際に細かく泡立ち、細胞に対して悪影響を与える。また、容器内部を観察する際に気泡が邪魔になり、観察しにくくなるという問題があった。
　このような問題の対策として、培地貯蔵容器自体を加温しておくことが考えられるが、培地は加温時間が長くなると細胞の培養効率が低下してしまう。このため、なるべく培養する直前までは、培地を冷蔵保存することが望ましい。
　本発明は、上記の事情にかんがみなされたものであり、培養容器を用いた細胞培養において、細胞注入から培地追加、サンプリング、回収までをキット内で閉鎖系を維持しながら自動的に行うことを可能にするための細胞培養用キットの提供を目的とする。
　また、培地の温度を調整するための温度調整容器を備えた細胞培養用キット及びその使用方法の提供を目的とする。
　上記目的を達成するため、本発明の細胞培養用キットは、細胞を培養するための閉鎖系細胞培養用キットであって、細胞を培養するための培養容器と、培地等を貯蔵しておくための培地貯蔵容器と、細胞を注入するための細胞注入容器と、培養後の細胞懸濁液を回収する細胞回収容器と、をそれぞれ少なくとも１つ以上有し、培地貯蔵容器が、培養後の培地を回収する廃液容器としても用いられ、培養容器、培地貯蔵容器、細胞注入容器、及び細胞回収容器が導管によって連結された構成としてある。
　また、本発明の細胞培養用キットを、培養中の培地を一部サンプリングすることが可能なサンプリング容器を少なくとも１つ以上有し、サンプリング容器が導管によって培養容器に連結された構成とすることも好ましい。
　さらに、本発明の細胞培養用キットを、培地等の温度を調整するための温度調整容器が、培養容器と培地貯蔵容器を連結する導管から分岐して設けられた構成とすることが好ましく、培地貯蔵容器において冷蔵された培地等の一部又は全部が、温度調整容器に移送されて所定の温度に昇温された後、培養容器に移送される構成とすることも好ましい。
　また、本発明の細胞培養用キットの使用方法は、細胞培養用キットに、細胞を培養するための培養容器と、培地等を貯蔵しておくための培地貯蔵容器と、細胞を注入するための細胞注入容器と、培養後の細胞懸濁液を回収する細胞回収容器と、培地等の温度を調整するための温度調整容器と、がそれぞれ少なくとも１つ以上備えられ、培地貯蔵容器が、培養後の培地を回収する廃液容器としても用いられ、培養容器、培地貯蔵容器、細胞注入容器、細胞回収容器、及び温度調整容器が導管によって連結され、培地貯蔵容器において培地等が冷蔵され、この冷蔵された培地等の一部又は全部が、培地貯蔵容器から温度調整容器へ移送され、温度調整容器において、培地等が所定の温度に昇温され、温度が調節された培地等が、培養容器に移送される方法としてある。
　培養容器を用いた細胞培養において、細胞注入から培地追加、サンプリング、回収までをキット内で閉鎖系を維持しながら行うことが可能となる。また、培地貯蔵容器において冷蔵された培地を温度調整容器へ移送し、温度を調整してから培養容器に移送することができるため、培養容器内の培地温度の低下を防ぎ、細胞の増殖阻害を防止することが可能となる。
本発明の第一実施形態の細胞培養用キット（１ポート仕様）の構成を示す図である。 本発明の第二実施形態の細胞培養用キット（２ポート仕様）の構成を示す図である。 本発明の第三実施形態の細胞培養用キット（３ポート仕様）の構成を示す図である。 本発明の第四実施形態の細胞培養用キット（１ポート仕様）の構成を示す図である。 本発明の第四実施形態の細胞培養用キット（２ポート仕様）の構成を示す図である。 本発明の第四実施形態の細胞培養用キット（３ポート仕様）の構成を示す図である。
　以下、本発明の細胞培養用キットの好ましい実施形態について、図面を参照しつつ説明する。
［第一実施形態］
　まず、図１を参照して、本発明の第一実施形態について説明する。同図は、本実施形態の細胞培養用キットの構成を示す図である。
　本実施形態の細胞培養用キットは、培養容器１０、培地貯蔵容器２０、細胞注入容器３０、細胞回収容器４０を備えている。また、サンプリング容器５０を備えることが好ましい。
　培養容器１０は、可撓性素材を材料として、袋状（バック型）に形成した容器であり、培地（培養液）を入れると共に、培養対象の細胞を播種して、細胞を大量に培養するための容器である。
　培養容器１０は、細胞の培養に必要なガス透過性を有していることが必要である。具体的には、5000ml／m2・day・atm（37℃－80％RH）以上の酸素透過率を有することが好ましい。
　また、内容物を確認できるように、培養容器１０の全部又は一部は、透明性を有していることが好ましい。図１において、培養容器１０上には、シワが生じ難く、内部の観察をし易くすることができる観察枠１１が示されている。
　さらに、培養容器１０は、高い細胞増殖効率を実現するために、低細胞毒性、低溶出性、及び放射線滅菌適性を有することが好ましい。
　このような条件を満たす培養容器１０の材料としては、ポリエチレン系樹脂が好ましい。ポリエチレン系樹脂とはポリエチレン、エチレンとα－オレフィンの共重合体、エチレンと酢酸ビニルの共重合体、エチレンとアクリル酸やメタクリル酸共重合体と金属イオンを用いたアイオノマー等が挙げられる。また、ポリオレフィン、スチレン系エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、シリコーン樹脂等を用いることもできる。
　また、培養容器１０は、培地や細胞の注入、回収などを行うためのポートを備える。このポートの数は特に限定されないが、後述するように１～３ポートのものが好適に用いられる。
　培地貯蔵容器２０は、培養容器１０へ移送する、細胞を培養するための培地を格納する容器である。培地貯蔵容器２０は、格納している培地のｐＨが培養期間中に大きく変化しないように、ガスバリア性を有することが好ましい。具体的には1000ml／m2・day・atm（23℃－80％RH）以下の二酸化炭素透過率を有することが好ましい。これは、培地中に含まれている高濃度の炭酸ガスが空気中に抜け、培地中の炭酸ガス濃度が低下し、結果としてｐＨが上昇することを回避するために、培地貯蔵容器２０の内部から二酸化炭素が外部に漏れ出るのをできるだけ少なくすることが望ましいからである。
　また、培地貯蔵容器２０には、少なくとも２つのポートを備えることが好ましい。このうち１つのポートには、培養容器１０と連結する導管（チューブ）が接続され、この培地貯蔵容器２０から新鮮な培地が、培養細胞の増殖等に合わせて、少しずつ培養容器１０へ送られる。培地が封入された培地貯蔵容器２０は、冷蔵庫で保存されることが望ましい。また、培地貯蔵容器２０の他の１つのポートは、本実施形態の細胞培養用キットの外部から、培地を培地貯蔵容器２０に供給するための培地充填口２１であり、無菌接合装置等を介してこの培地充填口２１から培地が充填される。
　なお、本実施形態の細胞培養用キットにおいて、１つのポートのみを備えた培地貯蔵容器２０を用いて、このポートから培地を培地貯蔵容器２０に充填した後に、同ポートから培地を培養容器１０へ移送することもできる。
　さらに、培地貯蔵容器２０は、培養完了後、廃液容器として用いることができる。すなわち、培養容器１０から細胞回収容器４０に細胞を回収するのに先立って培地の上澄みを廃液容器としての培地貯蔵容器２０へ移送することで、その後濃縮された細胞懸濁液を培養容器１０から細胞回収容器４０へ送ることが可能となる。これは、専用の廃液容器を用いない第二実施形態においても同様である。
　また、本実施形態の細胞培養用キットにおいて、培地貯蔵容器２０を２以上備えることもできる。これにより、同一の培地を２倍量貯蔵できる他、それぞれ異なる培地を貯蔵することで、培養容器１０に様々なバリエーションで培地を供給することも可能となる。
　細胞注入容器３０は、培養開始時に必要となる細胞と培地が入った容器である。この容器の内容物を培養容器１０へ移して、培養が開始される。細胞注入容器３０に入れられる細胞と培地は、総量約２５０ｍｌ程度とすることが好ましいが、これに限定されるものではない。
　また、細胞注入容器３０は、細胞と培地を入れる容器であるため、培養容器１０と同様にガス透過性を有していることが好ましい。また、低細胞毒性、低溶出性などを有することも好ましい。このため、細胞注入容器３０の材料としては、培養容器１０と同様のものを用いることが好ましい。
　この細胞注入容器３０には、少なくとも１つのポートが備えられる。そして、このポートを介して、細胞注入容器３０から培養容器１０へ培養開始時の細胞と培地が送られる。
　細胞回収容器４０は、培養終了後に、培養された細胞と培地の一部を培養容器１０から回収するための容器である。このため、細胞回収容器４０も培養容器１０と同様の特性を備えていることが好ましく、その材料として培養容器１０と同様のものを用いることが好ましい。
　細胞回収容器４０には、少なくとも１つのポートが備えられ、このポートを介して、培養容器１０から細胞回収容器４０へ細胞と培地の一部が送られる。
　サンプリング容器５０は、細胞の培養中や培養終了後に、培養容器１０における細胞懸濁液の一部を移送してサンプリングを行うための容器である。このサンプリング容器５０へ移送するサンプルとしての例えば１０ｍｌ程度の量とすることが好ましいが、これに限定されるものではない。
　サンプリング容器５０には、２つのポートが備えられ、このうち一方のポートには、培養容器１０と連結する導管（チューブ）が接続され、培養容器１０から細胞懸濁液がサンプリング容器５０へ送られる。また、もう一方のポートは、各種分析を行うためにサンプリング容器５０内の細胞懸濁液の一部取り出すために用いられる。なお、これらを共に行う１つのポートを備えたものとすることや、３つ以上のポートを備え、複数回の分取を可能とする構成にすることもできる。
　次に、本実施形態の細胞培養用キットにおける各容器を接続する導管について、説明する。
　これらの導管の材料は、使用目的に応じて適切なものを適宜選択することが望ましい。例えば、シリコーン樹脂、軟質塩化ビニル樹脂、ポリブタジエン樹脂、エチレン－酢酸ビニル共重合体、ポリウレタン系熱可塑性エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、スチレン系エラストマー、例えば、ＳＢＳ（スチレン・ブタジエン・スチレン）、ＳＩＳ（スチレン・イソプレン・スチレン）、ＳＥＢＳ（スチレン・エチレン・ブチレン・スチレン）、ＳＥＰＳ（スチレン・エチレン・プロピレン・スチレン）、ポリオレフィン樹脂、フッ素系樹脂等を用いることができる。
　また、本実施形態の細胞培養用キットにおいて、導管には、大きく分けて２種類の異なるものが用いられる。
　すなわち、培養容器１０と培地貯蔵容器２０を接続するための培地供給用チューブと、その他の容器の組み合わせの間を接続する培地移送用チューブである。
　培養容器１０と培地貯蔵容器２０を接続するための培地供給用チューブとしては、特にポリオレフィンまたはシリコーン樹脂からなるものを用いることが好ましい。培地供給用チューブは、培養期間を通じて、培地を少しずつ培養容器１０へ移送するものであるため、特に優れた低細胞毒性、低溶出性等を有することが望ましい。一方、この培地供給用チューブは、培養工程において、特に溶断する必要性はない。そこで、これらを考慮して、上記材料からなるものを用いることが好ましいとしている。
　図１において、培地貯蔵容器接続チューブ２２は、このような培地供給用チューブで構成することを想定しており、例えば内径３．５ｍｍ、外径６．０ｍｍのシリコンチューブなどを好適に用いることができる。
　その他の容器の組み合わせの間を接続する培地移送用チューブは、長時間にわたって培地を移送するものではないため、低細胞毒性、低溶出性等について高い機能を備えたものにする必要はない。また、導管を溶断することにより、細胞注入容器や、細胞回収容器（廃液容器）、サンプリング容器を、閉鎖系を維持したまま本実施形態の細胞培養用キットから取り外して使用できることが望ましい。
　そこで、これらの容器に接続される培地移送用チューブとして、少なくとも一箇所が、熱可塑性樹脂で形成されたものを用いることが好ましい。また、培地移送用チューブの全体を熱可塑性樹脂で形成することもできる。
　また、熱可塑性樹脂としては、例えば軟質塩化ビニル樹脂を用いることができるが、これに限定されない。
　図１において、細胞注入容器接続チューブ３１、細胞回収容器接続チューブ４１、及びサンプリング容器接続チューブ５１は、このような培地移送用チューブで構成することを想定しており、例えば内径３．３ｍｍ、外径５．０ｍｍの塩ビチューブなどを好適に用いることができる。
　なお、本実施形態の細胞培養用キットの外部から培地を培地貯蔵容器２０に供給するための培地充填口２１を形成するポートには、熱可塑性樹脂からなるチューブを接続することが好ましく、特に軟質塩化ビニル樹脂からなるチューブを接続することが好ましい。これは、培地貯蔵容器２０には、無菌接合装置を介してこの培地充填口２１から培地が充填されるが、現在この無菌接合装置への接続には主に軟質塩化ビニル樹脂が用いられているためである。また、チューブの先端処理に関しては、本実施形態の二段シール以外にもルアーコネクター、ニードルレスコネクター、セプタム等の部材を適用することもできる。
　本実施形態の細胞培養用キットは、図１に示すように、培養容器１０にポートが１つのみ備えられている１ポート仕様である。
　すなわち、本実施形態の細胞培養用キットでは、培養容器１０に第一ポート１２が備えられ、この第一ポート１２に培地貯蔵容器接続チューブ２２を介して培地貯蔵容器２０が接続される。そして、この培地貯蔵容器接続チューブ２２に、その他の容器が接続される構成となっている。
　すなわち、細胞注入容器３０は、細胞注入容器接続チューブ３１を介して、培地貯蔵容器接続チューブ２２に接続される。また、細胞回収容器４０は、細胞回収容器接続チューブ４１を介して、培地貯蔵容器接続チューブ２２に接続される。また、サンプリング容器５０は、サンプリング容器接続チューブ５１を介して、培地貯蔵容器接続チューブ２２に接続される。そして、チューブポンプが、培地貯蔵容器接続チューブ２２のみに備えられている。
　ここで、細胞注入容器３０は、培地貯蔵容器接続チューブ２２における培養容器１０の際（きわ）に接続することが好ましい。このようにすれば、培養開始時に、培地貯蔵容器２０から培養容器１０へ培地を注入するにあたり、培地貯蔵容器接続チューブ２２内の空気が培養容器１０へ入るのを最小限に抑制することができるためである。
　具体的には、まず培地貯蔵容器２０から細胞注入容器３０へ培地が送られて、培地貯蔵容器２０と細胞注入容器３０間を接続する導管の内部には培地が満たされる。このとき、その導管の内部に存在していた空気は細胞注入容器３０の内部に移動する。次に、細胞注入容器３０から培養容器１０へ細胞と培地を送るときに、細胞注入容器３０内の空気を上部に移動させ、細胞と培地のみを細胞注入容器３０から培養容器１０へ送り出すことができる。
　このため、培養容器１０へ入る空気は、細胞注入容器３０が接続されている培地貯蔵容器接続チューブ２２の際から培養容器１０までに存在するもののみとなる。したがって、細胞注入容器３０を培地貯蔵容器接続チューブ２２において、培養容器１０にできるだけ近い位置に接続することで、培養容器１０に送られる空気を、細胞の観察や撮影の邪魔にならない程度に最小限に抑制することが可能となる。
　また、少なくとも培地貯蔵容器２０と細胞注入容器３０については、細胞培養用キットにおいて取り外し可能に構成することが好ましい。これは、使用前に培地貯蔵容器２０には培地が充填され、細胞注入容器３０には細胞と培地とが充填されて、使用時にこれらを細胞培養用キットに接続して用いるためである。これら以外の培養容器１０、細胞回収容器４０、サンプリング容器５０とこれらに付属するチューブ類は、使用前（製造時）に一体として構成することが好ましい。なお、後述する廃液容器６０も使用前に一体として構成することができる。
　さらに、各チューブにクリップを備えたり、電磁弁などで各チューブにおける培地等の移送を制御したりすることが好ましい。
　また、培地貯蔵容器接続チューブ２２における連結部分には、キャップ付き又はカバー付きのルアーコネクター（ニードレスコネクター）などを用いることができる。
　さらに、本実施形態の細胞培養用キットでは、培地貯蔵容器接続チューブ２２にはシリコンチューブを、それ以外には塩ビチューブを用い、必要に応じてジョイント管（例えば内径５．３ｍｍ、外径７．０ｍｍ）を使用しているが、本発明はこれらのような具体的構成に限定されるものではない。
　本実施形態の細胞培養用キットは、例えば以下のような方法で使用することができる。
　まず、図１に示す細胞培養用キットにおいて、培地を充填した培地貯蔵容器２０の培地貯蔵容器接続チューブ２２におけるコネクターを連結すると共に、細胞と培地を充填した細胞注入容器３０の細胞注入容器接続チューブ３１をコネクターによって接続する。
　次に、培地貯蔵容器２０から培地貯蔵容器接続チューブ２２と細胞注入容器接続チューブ３１を介して細胞注入容器３０まで培地を移送する。このとき、培地が移送された部分のチューブに入っていた空気は細胞注入容器３０に入る。
　次に、細胞注入容器３０から培養容器１０へ細胞と培地を移送する。このとき、細胞注入容器３０のポートを下側にして縦にし、細胞注入容器３０に入っている空気を上部に集めることなどにより、空気を培養容器１０へ送ることなく、細胞と培地のみを培養容器１０へ移送することができる。
　次に、培地貯蔵容器２０から培地貯蔵容器接続チューブ２２を介して、培地を培養容器１０へ移送する。なお、細胞注入容器３０から細胞と培地を培養容器１０へ移送させるタイミングは上記に限定されるものではなく、例えば培地貯蔵容器２０から培養容器１０へ一部又は全部の培地を移送したタイミングで行うこともできる。
　そして、培養容器１０に所定量の培地と細胞が充填されると、適宜振とうやかく拌が行われて、一定期間細胞の培養が行われる。細胞培養中には、サンプルを培養容器１０からサンプリング容器５０へ適宜移送することにより、調査や分析に用いることができる。
　一定期間の細胞培養が完了すると、細胞の回収が行われる。このとき、培地貯蔵容器２０は、廃液容器として用いられる。
　すなわち、まず培養容器１０を静止させて細胞を下部に沈降させた後に、細胞懸濁液の上澄みを培養容器１０から培地貯蔵容器２０へ移送させる。これによって、培養容器１０における細胞懸濁液を濃縮することができ、細胞回収容器４０へ移送する液量を低減することができる。次いで、この濃縮された細胞懸濁液を培養容器１０から細胞回収容器４０に回収する。
　このように、本実施形態の細胞培養用キットを用いることで、閉鎖系で細胞培養を行うことができる。
　以上の通り、本実施形態の細胞培養用キットによれば、培養容器を用いた細胞培養において、細胞注入から培地追加、サンプリング、回収までをキット内で閉鎖系を維持しながら自動的に行うことが可能である。また、本実施形態の細胞培養用キットは、１ポート仕様であるため、送液用チューブポンプが１個で済み、装置をシンプルにすることが可能となっている。
［第二実施形態］
　次に、図２を参照して、本発明の第二実施形態について説明する。同図は、本実施形態の細胞培養用キットの構成を示す図である。
　本実施形態の細胞培養用キットは、２ポート仕様となっている点で第一実施形態と異なり、その他の点では、第一実施形態の細胞培養用キットと同様の構成となっている。すなわち、本実施形態の細胞培養用キットは、培養容器１１０、培地貯蔵容器２０、細胞注入容器３０、細胞回収容器４０を備え、またサンプリング容器５０を備えることが好ましい。
　本実施形態の細胞培養用キットにおける培養容器１１０は、図２に示されるように、第一ポート１１２と、第二ポート１１３を備えている。
　第一ポート１１２には、第一実施形態と同様に、培地貯蔵容器２０が培地貯蔵容器接続チューブ２２を介して接続されている。第二ポート１１３には、細胞回収容器４０が細胞回収容器接続チューブ４１を介して接続されている。培地貯蔵容器接続チューブ２２及び細胞回収容器接続チューブ４１には、それぞれチューブポンプが用いられ、それぞれ培地、細胞懸濁液の移送が行われる。
　また、細胞注入容器３０は細胞注入容器接続チューブ３１を介して培地貯蔵容器接続チューブ２２に接続され、サンプリング容器５０はサンプリング容器接続チューブ５１を介して培地貯蔵容器接続チューブ２２に接続されている。
　本実施形態の細胞培養用キットの使用方法は、細胞の培養完了までは、第一実施形態と同様の方法とすることができる。そして、細胞の回収時は、培地貯蔵容器接続チューブ２２を経由することなく、第二ポート１１３と細胞回収容器接続チューブ４１を経由して、チューブポンプにより細胞懸濁液を細胞回収容器４０に回収することが可能となっている。
　本実施形態の細胞培養用キットによれば、上記の通り、細胞の回収時に、培地貯蔵容器接続チューブ２２を経由することなく、専用のチューブポンプにより細胞懸濁液を培養容器１１０から細胞回収容器４０に回収することができる。このため、細胞の回収をより効率的に行うことが可能となる。本実施形態は２ポート仕様の一例であり、細胞回収容器４０の代わりに、第二ポート１１３とサンプリング容器接続チューブ５１を介してサンプリング容器５０を接続することも可能である。
［第三実施形態］
　次に、図３を参照して、本発明の第三実施形態について説明する。同図は、本実施形態の細胞培養用キットの構成を示す図である。
　本実施形態の細胞培養用キットは、３ポート仕様となっている点で第一実施形態と異なっており、その他の点では、第一実施形態の細胞培養用キットと同様の構成となっている。すなわち、本実施形態の細胞培養用キットは、培養容器２１０、培地貯蔵容器２０、細胞注入容器３０、細胞回収容器４０、廃液容器６０を備え、またサンプリング容器５０を備えることが好ましい。また、培地貯蔵容器２０として、培地貯蔵容器２０ａと２０ｂの２つが備えられている。
　本実施形態の細胞培養用キットにおける培養容器２１０は、図３に示されるように、第一ポート２１２、第二ポート２１３、及び第三ポート２１４を備えている。
　本実施形態では、第一ポートには、サンプリング容器５０と廃液容器６０がそれぞれサンプリング容器接続チューブ５１、廃液容器接続チューブ６１を介して接続されている。また、これらのチューブが合流したチューブ部分には、チューブポンプが用いられ、サンプリング容器５０への細胞懸濁液の移送、及び廃液容器６０への上澄み液の移送がそれぞれ行われる。
　また、第二ポート２１３には、培地貯蔵容器接続チューブ２２（２２ａ，２２ｂ）を介して、培地貯蔵容器２０ａ，２０ｂが接続されている。このように培地貯蔵容器を複数用いることで、異なる組成の培地を組み合わせて、培養容器１０へ移送することができ、供給する培地の組成やタイミングなどにバリエーションを持たせることが可能となっている。また、培地貯蔵容器接続チューブ２２にはチューブポンプが用いられて、培養容器２１０への培地の移送が行われる。
　また、第三ポート２１４には、細胞回収容器４０が細胞回収容器接続チューブ４１を介して接続されており、チューブポンプにより、細胞懸濁液が培養容器２１０から細胞回収容器４０へ移送される。
　本実施形態の細胞培養用キットの使用方法は、まず細胞の培養を開始するまでは、第一実施形態と同様の方法とすることができる。なお、図３では、記載スペースの制約から、細胞注入容器接続チューブ３１が、培地貯蔵容器接続チューブ２２の中程に接続されているが、実際には培養容器２１０に空気が入ることを抑止するため、第二ポートの際に接続することが好ましい。
　また、細胞培養中には、サンプルを培養容器２１０からサンプリング容器５０へ適宜移送することにより、調査や分析に用いることができる。
　さらに、細胞培養完了後には、細胞懸濁液の上澄みを培養容器２１０から廃液容器６０へ廃液容器接続チューブ６１を介して移送させて、培養容器２１０における細胞懸濁液を濃縮することができる。最後に、この濃縮された細胞懸濁液を培養容器２１０から細胞回収容器４０に回収する。
　本実施形態の細胞培養用キットによれば、複数の動作を同時に行うことが可能となる。特に培地貯蔵容器２０や培地貯蔵容器接続チューブ２２にまだ培地が残存している場合でも、サンプリング容器５０へのサンプリングを行うことができ、培地の供給とサンプリングのタイミングを柔軟に調整することが可能となる。
［第四実施形態］
　次に、図４～図６を参照して、本発明の第四実施形態について説明する。これらの図は、本実施形態の細胞培養用キットの構成を示す図である。
　本実施形態の細胞培養用キットは、第一実施形態～第三実施形態の構成に加えて、培地の温度を調整するための温度調整容器７０及び温度調整容器接続チューブ７１を備える点に特徴がある。その他の構成については、第一実施形態～第三実施形態におけるものと同様のものとすることができる。
　以下、第一実施形態の細胞培養用キットに温度調整容器７０及び温度調整容器接続チューブ７１を追加した本実施形態の細胞培養用キットを示す図４を用いて説明するが、図５，６における温度調整容器７０及び温度調整容器接続チューブ７１についても図４と同様である。
　温度調整容器７０は、培地貯蔵容器２０から培養容器１０へ培地を移送するに際して、移送させる培地を一旦貯留して、培地の温度を調整するための容器である。移送する培地の量は、特に限定されず、培地貯蔵容器２０内における培地の一部又は全部とすることができる。また、細胞培養用キットに複数の培地貯蔵容器２０が備えられている場合であって、その一部の培地貯蔵容器２０に培地ではなく、培養容器１０における培養中の培地に追加するための生理活性物質やサイトカインその他様々な物質が貯蔵されている場合には、温度調整容器７０によりこれらを昇温させることも可能である。温度調整容器７０の容器は、培地貯蔵容器２０と同様のガスバリア性を有することが好ましい。
　温度調整容器７０には、少なくとも１つのポートが備えられ、ポートに温度調整容器接続チューブ７１が接続され、温度調整容器接続チューブ７１は、培地貯蔵容器２０と培養容器１０を接続する培地貯蔵容器接続チューブ２２に接続されている。すなわち、温度調整容器７０は、培地貯蔵容器２０と培養容器１０を接続するチューブから分岐され、閉鎖系を維持した形で細胞培養用キットに備えられる。温度調整容器接続チューブ７１と培地貯蔵容器接続チューブ２２は一体に形成されたものであっても良い。
　また、温度調整容器７０は、軟包材からなるものとすることが好ましく、空気抜きを有する構成とすることも好ましい。温度調整容器７０において培地が昇温されると、培地中に溶解していたガスが抜ける。このとき、温度調整容器７０のポートを下側にしておくことで、ガスを温度調整容器７０の上部に集めることができ、培地のみを培養容器１０へ送液することができる。このため、培養容器１０内に余計な気泡を混入させることなく、培地を移送することが可能となる。
　温度調整容器７０は、培養容器１０が配置されるインキュベータの内部に配置することが好ましい。この場合、温度調整容器７０内の培地は、培養容器１０内の培地と同じ温度に調節することが可能となる。その温度としては、例えば３７℃とすることができる。
　また、温度調整容器７０をインキュベータの外部に配置して、例えば別個の加温装置によって温度調整容器７０を加温し、温度調整容器７０内の培地温度を調整することも好ましい。この場合は、例えば３０～３７℃などの温度範囲に調整することができる。
　さらに、温度調整容器７０をインキュベータの外部に配置して、特別な加温装置を設けることなく静置させておくことで、温度調整容器７０内の培地温度を常温（室温）に戻すことも可能である。
　また、本実施形態の細胞培養用キットにおいて、温度調整容器７０を２以上備えることもできる。これにより、同時に２倍量以上の培地やその他の物質の温度を調節することが可能となる。
　温度調整容器接続チューブ７１は、培養期間を通じて、培地を少しずつ培養容器１０へ移送するものであるため、特に優れた低細胞毒性、低溶出性等を有することが望ましく、また培養工程において、特に溶断する必要性はない。このため、温度調整容器接続チューブ７１は、培養容器１０と培地貯蔵容器２０を接続する培地貯蔵容器接続チューブ２２と同様のものとすることが好ましい。
　以上の通り、本実施形態の細胞培養用キットによれば、培養容器に移送するために必要な量の培地を温度調整容器に入れて昇温した後に、培養容器へ送液することができる。
このため、培養容器内の培地温度が低下せず、細胞の増殖阻害を阻止することが可能となる。
　また、このように温度調整容器によって培地を昇温できるため、培地貯蔵容器内の培地はこれまで通り冷蔵保存可能であり、培地の加熱時間が長くなる場合に細胞の培養効率が低下するという問題の発生を防止することが可能となる。
　さらに、昇温により培地に溶解していたガスが抜けるため、温度調整容器から培養容器に培地のみを移送することができ、培養容器内に気泡が混入するのを防止することが可能となる。
　本発明は、以上の実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
　例えば、実施形態では特定サイズのチューブを用いる例が示されており、また特定のコネクターが使用されているが、本発明の技術的範囲の範囲内において、同じ機能が得られる他の部品を用いるなど適宜変更することが可能である。また、培養中の培地に追加するための生理活性物質やサイトカインその他様々な物質を充填済みの容器を実施形態のキットに付加して取り付けておくことも可能である。
　本発明は、大量の細胞を培養する必要のあるバイオ医薬や再生医療、免疫療法等の分野において、好適に利用することが可能である。

Claims (14)

  1. 　細胞を培養するための閉鎖系細胞培養用キットであって、
    　細胞を培養するための培養容器と、
    　培地等を貯蔵しておくための培地貯蔵容器と、
    　細胞を注入するための細胞注入容器と、
    　培養後の細胞懸濁液を回収する細胞回収容器と、をそれぞれ少なくとも１つ以上有し、
    　前記培地貯蔵容器が、培養後の培地を回収する廃液容器としても用いられ、
    　前記培養容器、前記培地貯蔵容器、前記細胞注入容器、及び前記細胞回収容器が導管によって連結された
    　ことを特徴とする細胞培養用キット。
  2. 　培養中の細胞懸濁液の一部をサンプリングすることが可能なサンプリング容器を少なくとも１つ以上有し、
    　前記サンプリング容器が、導管によって前記培養容器に連結された
    　ことを特徴とする請求項１記載の細胞培養用キット。
  3. 　前記培地貯蔵容器とは別個に、培養中又は培養後の培地を回収する廃液容器を少なくとも１つ以上有し、
    　前記廃液容器が、導管によって前記培養容器に連結された
    　ことを特徴とする請求項１又は２記載の細胞培養用キット。
  4. 　前記培地貯蔵容器を２つ有し、それぞれに同一の又は異なる培地が充填されることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の細胞培養用キット。
  5. 　培地等の温度を調整するための温度調整容器が、前記培養容器と前記培地貯蔵容器を連結する導管から分岐して設けられたことを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載の細胞培養用キット。
  6. 　前記培地貯蔵容器において冷蔵された培地等の一部又は全部が、前記温度調整容器に移送されて所定の温度に昇温された後、前記培養容器に移送されることを特徴とする請求項５記載の細胞培養用キット。
  7. 　前記各容器が、可撓性素材で袋状に形成されていることを特徴とする請求項１～６のいずれかに記載の細胞培養用キット。
  8. 　前記培地貯蔵容器が1000ml／m2・day・atm（23℃－80％RH）以下の二酸化炭素透過率を有し、前記培養容器が5000ml／m2・day・atm（37℃－80％RH）以上の酸素透過率を有することを特徴とする請求項１～７のいずれかに記載の細胞培養用キット。
  9. 　前記培地貯蔵容器に少なくとも２つの導管があり、前記培養容器と連結されていない導管が、軟質塩化ビニル樹脂で形成されることを特徴とする請求項１～８のいずれかに記載の細胞培養用キット。
  10. 　前記細胞注入容器、前記細胞回収容器、前記サンプリング容器、及び前記廃液容器への導管の少なくとも一箇所が、熱可塑性樹脂で形成されることを特徴とする請求項２～９のいずれかに記載の細胞培養用キット。
  11. 　前記培地貯蔵容器、及び前記細胞注入容器の少なくともいずれかが、請求項１～１０のいずれかに記載の細胞培養用キットから、取り外し可能であることを特徴とする細胞培養用キット。
  12. 　前記培地貯蔵容器と前記培養容器間の導管が、ポリオレフィンまたはシリコーン樹脂であることを特徴とする請求項１～１１のいずれかに記載の細胞培養用キット。
  13. 　前記細胞注入容器が、前記培地貯蔵容器と前記培養容器を連結する導管における、前記培養容器の際から分岐することを特徴とする請求項１～１２のいずれかに記載の細胞培養用キット。
  14. 　細胞を培養するための閉鎖系細胞培養用キットの使用方法であって、
    　前記細胞培養用キットに、細胞を培養するための培養容器と、培地等を貯蔵しておくための培地貯蔵容器と、細胞を注入するための細胞注入容器と、培養後の細胞懸濁液を回収する細胞回収容器と、培地等の温度を調整するための温度調整容器と、がそれぞれ少なくとも１つ以上備えられ、前記培地貯蔵容器が、培養後の培地を回収する廃液容器としても用いられ、前記培養容器、前記培地貯蔵容器、前記細胞注入容器、前記細胞回収容器、及び前記温度調整容器が導管によって連結され、
    　前記培地貯蔵容器において培地等が冷蔵され、
    　この冷蔵された培地等の一部又は全部が、前記培地貯蔵容器から前記温度調整容器へ移送され、
    　前記温度調整容器において、培地等が所定の温度に昇温され、
    　温度が調節された培地等が、前記培養容器に移送される
    　ことを特徴とする細胞培養用キットの使用方法。
     
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