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WO2013110147A1 - Desenho computacional para novos inibidores de alfa-amilases - Google Patents

Desenho computacional para novos inibidores de alfa-amilases Download PDF

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WO2013110147A1
WO2013110147A1 PCT/BR2012/000539 BR2012000539W WO2013110147A1 WO 2013110147 A1 WO2013110147 A1 WO 2013110147A1 BR 2012000539 W BR2012000539 W BR 2012000539W WO 2013110147 A1 WO2013110147 A1 WO 2013110147A1
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WO
WIPO (PCT)
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alpha
structures
residues
protein
amylase
Prior art date
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PCT/BR2012/000539
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English (en)
French (fr)
Inventor
Goran Neshich
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria EMBRAPA
Original Assignee
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria EMBRAPA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria EMBRAPA filed Critical Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria EMBRAPA
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Ceased legal-status Critical Current

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    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G16B30/10—Sequence alignment; Homology search
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
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    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B15/00—ICT specially adapted for analysing two-dimensional or three-dimensional molecular structures, e.g. structural or functional relations or structure alignment
    • G—PHYSICS
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    • G16C—COMPUTATIONAL CHEMISTRY; CHEMOINFORMATICS; COMPUTATIONAL MATERIALS SCIENCE
    • G16C20/00—Chemoinformatics, i.e. ICT specially adapted for the handling of physicochemical or structural data of chemical particles, elements, compounds or mixtures
    • G16C20/50—Molecular design, e.g. of drugs
    • G—PHYSICS
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    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids

Definitions

  • Patent Descriptive Report "COMPUTER DESIGN FOR NEW ALF A-AM I LAS ES INHIBITORS”.
  • the present patent document relates to a method for the computational design of novel low molecular weight compounds with potential inhibitory function of alpha-amylase enzymes. Special focus is given to the design of novel insect-inhibiting alpha-amylase-inhibiting compounds that feed mainly on stocked agricultural products.
  • insects that cause such losses are rodents and a large variety of insects, the latter being more difficult to control because they are more resistant, reproduce faster and infiltrate the warehouses more easily.
  • Many grain-eating insects also do so in the field, infesting before harvest and because of this, there is some difficulty in separating the insects from the harvested produce for storage.
  • the most important stock pests can outgrow pest control strategies and multiply rapidly even under unfavorable conditions for most insects. For example, dry grain to less than 12% moisture inhibits the development of most pests, but still, insects can feed and reproduce at less than 4% humidity. The same happens with the low controlled oxygen content in the stocks aiming at the death and reduction of insect proliferation, because there are strains resistant to this method.
  • starch is the most important source of energy.
  • Starch is a polymer of sugar residues (polysaccharide) that has the function of energy reserve in vegetables. It is formed of linear glucose polymer (amylose) whose residues are bound in the alpha-, 4-conformation, and branched glucose polymer (amylopectin), whose alpha-1,4 linear glucose chains are interspersed by alpha-like bonds. 1, 6.
  • glucose is the molecule used as the energy source for ATP production, which is then used as an energy source in almost every process.
  • Biochemicals The enzymes responsible for converting starch to glucose residues are amylases, which can be classified as:
  • Endoamylases (EC 3.2.1.1): which cleave alpha-1, 4 bonds in amylose, amylopectin and related polysaccharides such as glycogen.
  • Hydrolysis products are oligosaccharides of various lengths and with an alpha configuration at C1 of the reducing unit. They act by liquefying starch (effect of rapid decrease in viscosity).
  • Exoamylases Cleave the alpha-1, 4 bonds of amylose, amylopectin and glycogen from non-reducing ends by removing maltose / glucose. Its products have beta configuration in C1 of the reduction unit. They act by saccharifying the starch, resulting in slow viscosity decrease.
  • pullulanase enzyme breaks these bonds; glycoamylase too, but more slowly than pullulanase.
  • Endoamylases are the most important type of glucose due to their rapid depolymerising activity (Muralikrishna, G., Nirmala, M., Cereal alpha-amylases - an overview, Carbohydrate polymers, 60, 163-173, 2005). They are called alpha-amylases because they break alpha-1-like bonds between sugar residues in starch components, glycogen and other related carbohydrates and are present in various organisms such as mammals, insects, bacteria and fungi. . They belong to clan GH-H (clan H of glycosidic hydrolases) and are classified into families according to similarity between their primary sequences.
  • the GH-H clan comprises about 100 enzyme families and alpha-amylases comprise families 13, 70 and 77; The set of these 3 families is also known as the alpha-amylase superfamily. All GH-H clan enzymes are believed to have the same three-dimensional barrel catalytic site (alpha / beta) 8, which consists of eight alternating beta-leaf and eight alpha-helix segments along of the polypeptide chain. This conformation has been observed on X-ray crystallographies of enzymes from families 13, 77, and 70. Each of these families may contain enzymes with different catalysis mechanisms: family 77 has glucanotransferases that cleave alpha-1,4 bonds between glucose residues.
  • family 70 has glucanosucrases which synthesize polyglucans from sucrose and may form new alpha-1, 2, alpha-, 3, alpha-1, 4, or alpha-1,6 linkages between glucose residues; and family 13 contains hydrolases, transferases and isomerases with more than twenty two known specificities.
  • All GH-H clan enzymes are believed to perform the catalytic reaction by a common mechanism involving an aspartate residue on beta-sheet 4 (D185, Tenebrio molitor framework numbering, UAE.pdb), a glutamate on beta sheet 5 (E222, UAE.pdb) and an aspartate on beta sheet 7 (D287, UAE.pdb) ( Figure 1).
  • Catalysis begins with donation of a proton of residue E222 to glycosidic oxygen inducing breakage of the bond. Then, the aglycone portion of the substrate leaves the active site of the enzyme. The remaining glucose residue at the enzyme site is stabilized by hydrogen interaction between its C2 and C3 hydroxyl with beta-leaf aspartate 7.
  • stabilization occurs by the covalent bond formation between glucose C1 and leaf nucleophilic aspartate. -beta 4.
  • the enzyme facilitates the approach of a second substrate with reversal of the previously explained interactions: covalent bonding breaks, beta-5 glutamate residue is reprotonated by removal of a proton from the second substrate, occurs inversion of the C1 configuration in the formed transient intermediate and a new reducing group is formed in the substrate C1; some enzymes transfer another residue of glucose, phosphate, fructose or their isomers (acGregor, EA, An overview of clan GH-H and distantly-related families, Bratislava Biology, 16: 5-12, 2005).
  • Alpha-amylase structures usually have three domains:
  • A Contains residues from the active site and those involved in binding to the substrate.
  • B is the least conserved domain among alpha-amylases. It binds to calcium with interface to domain A. It has residues involved in binding to the substrate.
  • C partially overlaps with the structure of domain A and has a second starch-binding site independent of the binding site comprising domains A and B.
  • domain A comprises residue ranges 1-97 and 160-379
  • domain B comprises range 98-159
  • domain C comprises 380-471 ( S-trobl, S., Maskos, K., Betz, M., Wiegand, G., Hubre, R., Gomis-Ruth, X., Glockshuber, R., Crystal structure of yellow mealy worm alpha-amylase at 1.64 Resolution, J. Mo. Bio, 278, 617-628, 1998).
  • alpha-amylases also have activity associated with seed maturation and germination participating in endosperm modification (Muralikrishna, G., Nirmala, M., Cereal alpha-amylases - an overview, Carbohydrate polymers, 60, 163-173, 2005).
  • endosperm modification Muralikrishna, G., Nirmala, M., Cereal alpha-amylases - an overview, Carbohydrate polymers, 60, 163-173, 2005.
  • these processes are not affected by the action of alpha-amylase inhibitors produced by the plants themselves.
  • the production of inhibitors is nothing but a defense mechanism against the action of insects, bacteria and fungi that also produce alpha-amylase and use it to break down starch stored in plant structures.
  • ⁇ -AH and ⁇ -AI2 There are two main types of plant-produced inhibitors: ⁇ -AH and ⁇ -AI2, with ⁇ -AI1 being the most common in seeds.
  • Inhibition of the plant's own enzymes by their inhibitors does not occur because the amino acid sequences near the catalytic and ligand sites are quite different from insect sequences, culminating in structural differences that do not allow the enzyme to bind to the inhibitor.
  • These inhibitors are not effective against all types of alpha-amylases produced by insects (Bompard-Gilles, C., Rousseau, P., Rougé, P., Payan, F., Substrate mimicry in the active Center of a mammaliam alpha-amylase: structural analysis of an enzyme inhibitor complex, Structure, 4, 1441-1452, 1996).
  • carbose used as an oral hypoglycemic agent in prophylactic treatment and in early cases of type 2 diabetes mellitus (DM2).
  • DM2 type 2 diabetes mellitus
  • Acarbose competitively and reversibly inhibits pancreatic and intestinal alpha-amylases by preventing glucose formation. It is currently marketed as Precose® in the US and Glucobay® in Europe by Bayer, which has patented a purification process. high purity (US Pat. 4904769) for the production of medicaments.
  • acarbose is obtained by fermentation of Gram positive bacteria of the genus Actinoplanes and purified by HPLC ("High-pressure liquid chromatograph") technique.
  • HPLC High-pressure liquid chromatograph
  • isoacarbose and acarviosine glucose inhibitors which in the biochemical study by Kim and colleagues (1999) have been shown to have greater inhibiting power than acarbose (Kim, MJ, Lee, SB, Lee, HS, Lee, SY, Baek, JS, Kim, D., Moon, TW, Rbyt, JF, Park, KH, Comparative study of the inhibition of alpha-glucosidase, alpha-amylase, and cyclomaltodextrin glucanosyltransferase by acarbose, isoacarbose, and acarviosine glucose, Arch Biochem Biophys, 15, 371 (2): 277-283, 1999).
  • TMA Tenebrio molitor larval alpha-amylase
  • molitor is a beetle that is among the most important pests and causes infestation of stored grain and farinaceous. Their larvae are highly resistant and live up to 80 days at -5 ° C.
  • TMA Trigger-activated melatin
  • Ligand- Based Drug Design (“Ligand- Based Drug Design "-LBDD) (Acharya, C, Coop, A., Polli, EJ, Mac-Kerrel, D., Alexander., Recent advances in ligand-based drug design: disclosure and utility of the conformationaly sampled pharmacophore approach, Current Computer - Aided Drug Design, 7, 1: 10-22, 2011), the linker being amylose. Important advances in drug production have already been achieved through computational approaches. CADD can predict experimental results with reasonable accuracy in short time compared to more classical methods. CADD methods are already widely used by the pharmaceutical industry to identify new compounds or refine existing compounds that have activity against a biological target.
  • WO 2001097098 describes a method for obtaining inhibitory potential molecules from databases containing the structures of chemical compounds (PubChem), potential effects of enzyme function whose activity should be altered (inhibition or potentiation) using docking.
  • Document RPI 2036 describes the development of herbicides against a specific enzyme by the docking technique followed by molecular modification of the selected binders with better scores, considering steric and electrostatic properties in the ligand-protein interaction. Finally, the docking results were corroborated by the experimental results.
  • US 2008/7383135 relates to the development of inhibitors that act in a particular conserved region among proteins of a family of kinases.
  • the work uses an isoform with a resolved three-dimensional structure as a template for resolving the three-dimensional structure of homologous proteins and for designing compounds with potential to bind to the isoform or homologues.
  • the invention relates to a method for the computational design of novel compounds with potential inhibitory function of alpha-amylase enzymes.
  • Alpha-amylases are enzymes present in the digestive tract of insects, animals and humans, and also produced by fungi and bacteria. They participate in the hydrolysis of alpha-1,4 bonds of amylose. Hydrolysis of amylose results in sugar residues that are used as a source of energy by organisms.
  • structures that bind to alpha-amylase with high theoretical affinity can be designed.
  • a particular but not limiting approach to the invention is the design of novel insect-inhibiting alpha-amylase-inhibiting compounds that feed mainly on stocked agricultural products.
  • the computational design is based on "ligand-based drug design” methodologies and the interactions and structures of the natural ligand (amylose) and natural inhibitors. Structure-Based Drug Design methodologies are also used, where interactions between the bound molecules and the target protein are evaluated by docking.
  • FIG. 1 View of the catalytic triad of Tenebrio molitor alpha-amylase (TMA, UAE.pdb) with Aspartate (D185 and D287) and Glutamate (E222) residues highlighted in black. Image generated by Molegro Virtual Docker.
  • FIG. 1 Alignment of primary alpha-amylase enzyme structures.
  • Plant alpha-amylase sequences were used to verify the conservation of the most important residues involved in catalysis and the existence of other residues that are insect-exclusive and spatially close to the catalytic / ligand site, which could indicate the existence of additional and preferred targets, as a compound that binds strongly to a specific insect residue is unlikely to cause effects on plant alpha-amialse binding.
  • the residues absent in plants, however, are not exclusive to insects, but are also present in mammalian enzymes, whose sequences have high similarity and identity with insect enzymes.
  • Residue G210 for example, although present in the TMA and TcA sequences, is not very conserved in insects and some mammals have residues with similar characteristics.
  • Alignments demonstrate high structural similarity with respect to the positions of the ligand site residues (W56, W57, Y60, Q61, H99, H189, R183, H286). This shows that even if the enzymes have been cocrystallized with inhibitors, the positions of the ligand site residues are preserved, as well as the entire remaining structure of the enzymes, which is consistent with the results shown in Table 3 (TM-Scores near 1 and low RMSDs). Alignments were made using TM-align, which was used to generate the images and to provide RMSD and TM-score data on alignment quality (Yang Zhang, J. Skolnick, TM-align: a protein structure alignment algorithm based on th TM-score, Nucleic Acid Research, 33 (7): 2302- 2309, 2005).
  • FIG. 4 Surface images of the ligand and catalytic sites made by the Molegro Virtual Docker program.
  • porcine alpha-amylase PPA, I HxO.pdb
  • TMA UE.pbd
  • FIG. 5 Overlapping acarviosin-glucose inhibitor structures at the PPA ligand site (I HXO.pdb) showing the cocrystallized inhibitor (light gray) and the docking position (dark gray). It has been verified by MVD's Ligand Energy Inspector and Sting DB's Java Protein Dossier that both docking and cocrystallization inhibitors interact with the same residues. In the visualization of the MVD, it is also noted that both occupy practically the same space with little conformation difference, which validates the technique employed for the dockings performed in this work. Image generated by MVD.
  • FIG. 6 Core structures for group bonding ("Rs") in the design of tripod series binders. These structures are similar to Tryptophan for stacking interaction with residues W56, W57 and Y60, belonging to the ligand site and close to the active site. As can be seen in B and C, the rings were retained and the main changes were: exchange of nitrogen for oxygen (B and C), forming the structure of benzofuran (B); and the displacement of the furan ring installation to the connection with R1 (C).
  • Rs group bonding
  • FIG. 7 Core structures for group bonding ("Rs") in the "T” series binder design. Like those in the "trip” series, they are derived from the structured Tryptophan and analogous to benzofuran.
  • Rs group bonding
  • A we have a benzofuran-derived structure without a furan ring and a benzene ring.
  • B a structure similar to that shown in A is shown, but without the oxygen atom that characterizes the furan ring.
  • C a structure similar to benzofuran is shown, but without an opening in the benzene ring and without the oxygen atom.
  • Figures 9.1 to 9.5 Structural representation of the ligands by series.
  • Figure 9.1 "A” series, acarbose-derived ligands.
  • Figure 9.2 "malt” series, maltose-derived ligands.
  • Figure 9.3 Trip series, liqueurs derived from the tryptophan structure with some maltose-derived groups.
  • Figure 9.4 "T” series, ligands derived from the tryptophan structure with acarbose and acarviosin glucose groups.
  • Figure 9.5 "T3" series, ligands derived from the "T” series, with acarbose and acarviosin-glucose derivative groups and larger nuclei for stacking interaction.
  • FIGS 10A and 10B T3B ligand "positions" positioned at the TMA target site (UAE.pdb), figure 10A, and positioned at the PPA target site (I HXO.pdb), figure 10B. Comparing the two figures, it is observed that in docking with TMA the ligand presented more similar poses than in docking with PPA. Since it was also observed during docking with known inhibitors, they presented several similar poses. This suggests that more similar poses may lead to more stable interaction. Considering that MolDock is an evolution-based algorithm and that the final poses were selected for performing more energetically stable interactions and better geometric complementarity, it is therefore important to also analyze the arrangement of the poses at the target site.
  • ligand poses interact with TMA cavities that are not present in PPA (as shown in Figure 4). Based on this, the greater similarity between docking pose positions with TMA suggests that ligand interaction is more favorable with this enzyme than with PPA.
  • the present invention relates to a method for the computational design of novel compounds with potential inhibitory function of alpha-amylase enzymes. Special focus is given to the design of novel insect-inhibiting alpha-amylase-inhibiting compounds that feed mainly on stocked agricultural products.
  • the proposed method consists of the following steps:
  • BLAST provides data on the characteristics of primary sequence alignment, such as: identities (percentage of identical amino acids at corresponding positions), positive (are identical amino acid numbers plus the number of non-identical amino acids between two sequences in a position, but have similar properties, considered as a "Positive” because it indicates substitutions in which the BLOSUM-62 matrix scores positively according to Altshul et al.
  • the gaps indicate the number of regions that represent gaps in alignment (either due to insertions and deletions in the evolutionary history of genes) and, lastly, the e-value column (Expect Value) represents a statistical parameter of the BLAST program that indicates the number of different alignments that would occur in a database by mere chance with Score. equivalent or better than that obtained for a given alignment. and, more significant is the score obtained in the alignment in question (S.F. Altschul, T.L. Madden, AA Schffer, Z. Zhang, W.
  • TM-score Align the enzyme of interest to the structures of other alpha-amylases deposited in the PDB for analysis of tertiary structure overlap and to analyze root-mean deviation (RMSD) and TM-score.
  • the RMSD gives in ⁇ the quadratic average of the distances between corresponding residue pairs after overlapping a structure. ra over the other.
  • the TM-score uses the Levitt-Gerstein factor, which considers the pairs of residuals at shorter distances as more relevant than those at longer distances and is also more sensitive to general topology than localized structural variations.
  • TM-score is normalized so as not to be dependent on protein size, its value can range from 0.0 to 1.0, with values greater than 0.17 indicative of high structural similarity (Yang Zhang, J. Skolnick, TM-align: a protein). structure alignment algorithm based on the TM-score, Nucleic Acid Research, 33 (7): 2302-2309, 2005). Tertiary structures are visualized through PyMol for analysis of overlapping tertiary structures. (WL Delano, The PyMol Molecular Graphics System Delano Scientific, San Carlos, CA, USA, http://www.pymol.com.org).
  • Stochastic and Systematic by Molecular Dynamics and Genetic / Evolutionary Algorithms.
  • the Stochastic and Systematic search method for ligands is widely used and varied.
  • the DOCK program for example, uses a method based on random conformations; FLEXX is based on the conformational space of the active site.
  • the Molecular Dynamics method used by AUTODOCK calculates the various conformations that the target protein can adopt during interaction with the ligand.
  • MVD uses the MolDcok algorithm which is based on Evolutionary Algorithm (a variety of Stochastic and Systematic Method) to simulate ligand-protein interactions.
  • Evolutionary algorithms can be defined as a group of computational approximations based on the concepts of Darwin's Theory of Evolution.
  • MolDock is an implementation of the evolutionary algorithm focused on molecular docking simulations, where computational approximations of an evolutionary process are applied to simulate the permanence of the most favorable characteristics (Thomsen R, Christensen, MH., MolDock: a new technique for high accuracy). J Med Chem, Jun 1.49 (11): 3315-21, 2006; WF De Azevedo Jr, MolDock applied to structure-based virtual screening, Current Drug Targets, 11 (3): 327-334, 2010 ). Studies comparing the most commonly used programs indicate that evolutionary algorithm-based programs such as GemDock and MolDock perform better overall than Flexx, GOLD, and Surflex (R.
  • Osiris Property Explorer Thomas Sander, Actelion Pharmaceuticals Ltd., http://www.orqanic-chemistry.org/proq) / pao /
  • the Osiris program provides toxicity risk data: mutagenicity, tumorogenicity, irritant and reproductive effect based on fragments of known molecules deposited in the RTECS database.
  • Example 1 Analysis of similarity and identity between alpha-amylases of different species.
  • BLAST and PSI-BLAST a new generation of protein database search programs. Naked- cleic Acid Res. 1997 Sep 1; 25 (17): 3389-402.) between dark molar alpha-amylase (TMA, UAE.pdb) and NCBI NR bank sequences (www.ncbi.nlm.nih) . ov), reporting the top three hits against insects, mammals, fungi and plants. Data are provided for the characteristics of the BLAST primary sequence alignment, such as: positive identities (percentage of identical amino acids at corresponding positions), positive (are identical amino acid number plus non-identical amino acid number between two sequences in a given sequence).
  • the gaps column indicates the number of regions that represent gaps in alignment ( due to insertions and deletions in the evolutionary history of genes) and, lastly, the e-value column (Expect Value) which represents a statistical parameter of the BLAST program that indicates the number of different alignments that would occur in a database. by chance with a score equal to or better than that obtained for a given alignment. The lower the e-value, the more significant is the score obtained in the alignment in question.
  • BLASTp against insect NR (Table 1), of the best three only one (Melampsora larici-populina) has agricultural importance. At Fungal enzymes will not be considered in this work due to the low identity and similarity with TMA.
  • BLASTp was also performed with plant enzymes (Table 1) whose alignments with the query TMA sequence (1 JAE_A) showed much lower similarity and identity values. No available structure was found in the plant alpha-amylase PDB; and the insect structures available in PDB presented very low identity and similarity (between 30 and 40%) in relation to TMA (data not shown), besides not being insects characterized as agricultural pests.
  • BLASTp against NCBI NR (Table 1) was performed for mammalian sequences, which presented higher identity and similarity than the vegetable ones.
  • BLASTp against PDB (Table 2) only resulted in mammalian enzyme hits.
  • Table 2 - BLASTp results against the PDB database using the query sequence as the TMA sequence (UAE.pdb). Shown are the top three hits hits. The description of the columns follows the pattern of table 1.
  • the target considered, the alpha-amylase enzyme is essential for the survival of grain-eating insects, is susceptible to inhibition (already practically demonstrated by studies with low molecular weight protein inhibitors) and, we suggest follow residues to be used as preferred targets as they are not present in plant enzyme structures whereas they are essential for insect enzymes to bind to the substrate.
  • these can be considered potential targets as rodents are also considered pests of grain stock.
  • such enzymes cannot be considered as targets.
  • the new binders are designed to have less theoretical affinity for mammalian enzymes and greater affinity for insect enzymes. For this, we considered the few structural differences surrounding the ligand and catalytic sites of mammalian and insect enzymes, explained below. It is also expected that in vitro and in vivo testing, designed ligands have greater affinity for insect enzymes than mammalian ones.
  • the structures of the protein inhibitor cocrystallized TMA (I CLV.pdb, ITMQ.pdb, IVIW.pdb), the inhibitor complexed PPA structures (I HXO.pdb, I KXQ.pdb, I DHK.pdb) Cocbearised HPA with acarbose (2QV4.pdb) deposited in the PDB were analyzed by visualization in the STING platform Java Protein Dossier program (Neshich G., Roccia W., Mancini A.
  • Example 3 Analysis of the binder and catalytic site nanoenvironment
  • structural overlaps were made between the various resolved alpha-amylase structures deposited in the PDB (Table 3).
  • the RMSD provides the quadratic average of the distances between matched pairs of residues after one structure overlaps with another.
  • TM-score (Yang Zhang, J. Skolnick, TM-align: a protein structure alignment algorithm based on th-score, Nucleic Acid Research, 33 (7): 2302-2309, 2005) uses the Levitt-Gerstein factor. which considers pairs of residues at shorter distances as more relevant than those at longer distances and is also more sensitive to general topology than localized structural variations.
  • TM-score is normalized so as not to be dependent on protein size, its value can range from 0.0 to 1.0, with values greater than 0.17 indicative of high structural similarity. As TM-score mainly takes into account topology, these results indicate that all enzymes have a high structural correlation with TMA (UAE.pdb), even when complex with inhibitors.
  • Alignment deviation values between the aligned tertiary structures were calculated using the TM-align program (Yang Zhang, J. Skolnick, TM-align: a protein structure alignment algorithm based on th-score, Nucleic Acid Research, 33 (7): 2302-2309, 2005).
  • the values provided by the TM-align are the RMSD and the TM-score, the former calculating the quadratic average of the distance between the corresponding residues considering only the distances between pairs of residues and being influenced by protein size, not taking into account your topology.
  • the TM-Score is calculated taking into account the topology of the overlapping structures, which is very important since most protein interactions are influenced by the topology.
  • Functional sites can be analyzed as a physicochemical nano-environment that accompanies a function rather than as a group of fixed residues.
  • ligands were based on the natural ligand fragment structure (maltose) and existing low molecular weight inhibitors (acarbose, acarviosin and isoacarbose). From them searches were made for compounds that had similarity in chemical structure above 90% in the PubChem database (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) through the "PubChem Structure Search” (Junguk Hur, David J Wild: PubChemSR: A Search and Retrieval Tool for PubChem, Chemistry Central Journal 2:11 doi: 10.1186 / 1752-153X-2-11, 2008) and in all, 1881 structures were obtained.
  • the strategy for the design of these ligands was based on observing the position of all amino acids in the ligand site and confirming the absence of plant enzyme sequences. through various alignments made using CLUSTALw between primary insect, plant and mammal structures. All the drawn structures were then submitted to docking simulations with the TMA structure, PDB code 1JAE. The docking was performed using the Molegro Virtual Docking (MVD) program (Thomsen R, Christensen MH .: MolDock: A New Technique for High-Precision Molecular Docking. J Med Chem. Jun 1; 49 (11): 3315-21, 2006 ), which is based on an evolutionary algorithm to simulate ligand-protein interactions.
  • MMD Molegro Virtual Docking
  • residues W56, W57 and Y60 were considered the main targets. Given the absence of exclusive insect residues relative to mammalian residues that participate in substrate binding and catalysis, it is expected, in both computer simulations and in vitro and in vivo tests, that interactions of ligands with the enzymes of mammals are worse than interactions with insect enzymes.
  • Drug candidate ligands were designed following the strategies:
  • T3 series molecules derived from the T3 ligand but with alterations in the tryptophan-derived nucleus ( Figure 8), with an increase in the number of rings.
  • Tables 4 and 5 show the docking results of the designed ligands, maltose and acarbose, isoacarbose and acarviosin inhibitors against the enzymes TMA (UAE.pdb) and PPA (I HXO.pdb). with the latter for comparison of insect enzyme and mammalian enzyme values (1 HX0 has 53% identity, 67% positives and 6% gaps in TMA, with e-value of 1e-145).
  • the energy sum values of the three specified residues are closer to compared to the values obtained when docking with TMA.
  • the greater variation in the sum values of the docking residues with TMA indicates a higher affinity variation with this enzyme, while the values obtained in the PPA docking (between -55 and - 66 kcal / mol) indicate very similar affinity between the protein and the various ligands in the simulation.
  • Some ligands designed (such as T3 and T3B) showed differences greater than 10 kcal / mol in the sum of the energies of the three mentioned residues, comparing the simulations with TMA and PPA, indicating greater affinity with the three residues of TMA. It was also observed during the docking that ligands presented less coherent poses, probably due to residues adjacent to the ligand site that may produce some impediment to access to the ligand site.
  • the designed structures present proposals for new drug candidates against the action of insects that attack grain stocks. They also provide an alternative to current alpha-amylase inhibitors that are obtained through microbial culture and then purified. Since chemical synthesis production is cheaper than biotechnology production, the present work offers products with potential alternative for cost reduction in the production of alpha-amylase inhibitors.
  • This tool allows to analyze cLogP, water solubility, molecular weight and toxicity risks; In addition, it provides two parameters: Druglikeness and Drug-score. Druglikeness is based on comparing the designed compound with compounds from commercialized compounds and compounds without pharmacological properties (Fluka). The drug score gives a general value that considers all the previous parameters. The results of the analysis are shown in Table 6. As it is not interesting for compounds to be absorbed by consumers' gastrointestinal tract, lower cLogP values are desirable. Osiris provides animal toxicity data such as risk of mutagenicity, tumorogenicity, reproductive effect and irritation based on molecular fragments with known toxicities stored in database (RTECS).
  • RTECS toxicities stored in database
  • the program also provides a LogS value (solubility), a parameter that describes both absorption and distribution, whose value must be greater than -4, based on the average LogS of the marketed drugs.
  • the program still provides the Drug Score which is a general value resulting from the combination of all the above parameters plus Druglikeness, which compares fragments of the designed compound with commercialized compound database and compound database. that do not serve as drugs (Fluka). It is desirable that both Druglikeness and Drug-score are positive.

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Description

Λ
Relatório Descritivo de Patente de Invenção: "DESENHO COMPUTACIONAL PARA NOVOS INIBIDORES DE ALF A-AM I LAS ES" .
CAMPO PA INVENÇÃO
O presente documento de patente refere-se a um método para o desenho computacional de novos compostos de baixo peso molecular com potencial função inibitória das enzimas alfa-amilases. Um enfoque especial é dado ao desenho de novos compostos inibidores das enzimas alfa-amilases produzidas por insetos que se alimentam principalmente de produtos agrícolas estocados.
ESTADO DA TÉCNICA
Para a maior parte das nações, os grãos estão entre os principais constituintes da base alimentar. No entanto, sua produção é sazonal e em muitos lugares as colheitas ocorrem apenas uma vez ao ano. Em consequência, tanto perdas em campo como em estoque são muito significati- vas.
Para que seja possível alimentar todas as pessoas do mundo é necessário que a maior parte da produção dos principais grãos (arroz, trigo, sorgo, milho, soja e painço) seja estocada por até mais que um ano. O mercado de grãos é caracterizado por demanda relativamente estável e abaste- cimento muito variável ao longo do ano. A variação no abastecimento é consequente a variação das colheitas, que depende das condições climáticas. Apesar de já existirem novas variedades de plantas que crescem mais rápido e são adaptáveis a diferentes regiões climáticas, ainda assim há variação do abastecimento. O armazenamento de grãos tem então o papel de diminu- ir essa variação do abastecimento, sendo feito nas épocas de colheita e liberando produto para o mercado nas épocas de baixa produção. Consequentemente, há também menos variação nos preços dos grãos durante o ano, o que contribui com a estabilidade económica (Proctor, D.L; Grain storage te- chniques: evolution and trends in developing countries, FAO agricultural ser- vices bulletin n° 109, Rome, 1994).
Para controle e minimização das perdas de grãos estocados, já existem várias estratégias como desinfestação térmica, baixa umidade, bai- xo teor de oxigénio, resfriamento e armazenamento hermético, por exemplo, que são delineadas segundo o clima da região, tipo de grão e tipo de inseto. Ainda assim, há grandes perdas de produtos estocados causadas por pragas, que perfazem cerca de 10% da produção total, e pelo menos 50% des- sa perda deve-se a insetos. Tomando o trigo como exemplo, cuja produção foi de 668 milhões de toneladas entre 2009 e 2010, das quais 186 milhões de toneladas foram estocadas e considerando que o preço da tonelada era de US$221 ,99 na época, perdas de 10% desse produto em estoque alcança um prejuízo em torno de US$4,13 bilhões, sendo metade disso devido a in- setos (Embrapa, Panorama mundial do trigo no fórum nacional, Embrapa notícias, 2010). Logo, se consideramos a crescente demanda anual de estoque de grãos em resposta à crescente produção agrícola e somarmos os prejuízos de todos os outros grãos, pode-se chegar a um valor exorbitante.
As pragas causadoras de tais perdas são roedores e uma gran- de variedade de insetos, sendo que estes últimos são mais difíceis de controlar por serem mais resistentes, se reproduzirem mais rápido e se infiltrarem com maior facilidade nos armazéns. Muitos dos insetos que se alimentam de grãos também o fazem no campo, infestando antes da colheita e devido a isso, há certa dificuldade em separar os insetos do produto colhido para ser armazenado. As pestes de estoque mais importantes conseguem sobrevier às estratégias de controle de pragas e multiplicam-se rapidamente mesmo em condições desfavoráveis para a maioria dos insetos. Por exemplo, grão seco para menos de 12% de umidade inibe o desenvolvimento da maioria das pestes, mas ainda assim, há insetos que conseguem se alimen- tar e reproduzir a menos de 4% de umidade. O mesmo ocorre com o baixo teor de oxigénio controlado nos estoques visando à morte e diminuição da proliferação de insetos, pois existem linhagens resistentes a esse método. A aplicação dessas estratégias também gera alto custo ao produtor e não é acessível à maioria dos produtores de países em desenvolvimento. Os inse- tos que conseguem sobreviver a essas estratégias têm cada vez maior importância económica, pois não há como criar ambiente que seja ao mesmo tempo desfavorável ao seu desenvolvimento, não prejudique a qualidade do produto e seja de baixo custo. Os pesticidas apresentam uma alternativa mais barata, mas também representam risco de produção de efeitos indesejáveis no consumidor e desenvolvimento de resistência dos insetos. Apesar disso, o desenvolvimento de pesticidas mais específicos e que ataquem es- trutura altamente conservada nos insetos pode trazer uma solução mais barata e segura para implementação do controle de pestes de estoque (Proc- tor, D.L; Grain storage techniques: evolution and trends in developing coun- tries, FAO agricultural services bulletin n° 109, Rome, 1994).
Para muitos insetos que se alimentam de grãos durante suas fa- ses larval e/ou adulta o amido representa a mais importante fonte energética. O amido é um polímero de resíduos de açúcar (polissacarídeo) que tem a função de reserva energética nos vegetais. É formado de polímero linear de glicose (amilose), cujos resíduos são ligados na conformação alfa- ,4, e de polímero ramificado de glicose (amilopectina), cujas cadeias lineares de glicose alfa-1 ,4 são intercaladas por ligações do tipo alfa-1 ,6. Para obtenção de energia a partir do amido, este deve ser processado ao longo do trato digestivo para produzir glicose, que é a molécula utilizada como fonte de energia para a produção de ATP, que é então usado como fonte de energia em quase todos os processos bioquímicos. As enzimas responsáveis pela conversão do amido a resíduos de glicose são as amilases, que podem ser classificadas:
• Endoamilases (EC 3.2.1.1): que clivam as ligações alfa-1 ,4 na amilose, amilopectina e polissacarídeos relacionados como o glicogênio. Os produtos de hidrólise são oligossacarídeos de vários comprimentos e com configuração alfa no C1 da unidade redutora. Agem liquefazendo o amido (efeito da rápida diminuição da viscosidade).
• Exoamilases (EC 3.2.1.2): clivam as ligações alfa-1 ,4 da amilose, amilopectina e glicogênio das extremidades não-redutoras através da remoção de maltose/glicose. Seus produtos têm a configuração beta no C1 da unidade redutora. Agem sacarificando o amido, resultando de lenta diminuição da viscosidade.
• Enzimas desramificadoras (3.2.1.3): as ligações alfa-1 ,6 são .
resistentes a ação das alfa e beta-amilases. A enzima pululanase quebra essas ligações; a glicoamilase também, porém mais lentamente que a pululanase.
As endoamilases são o tipo mais importante para obtenção de glicose devido a sua rápida atividade despolimerizadora (Muralikrishna, G., Nirmala, M., Cereal alpha-amylases - an overview, Carbohydrate polymers, 60, 163-173, 2005). São chamadas de alfa-amilases por quebrarem as ligações do tipo alfa-1 ,4 entre os resíduos de açúcar em componentes do amido, glicogênio e outros carboidratos relacionados e estão presentes em vá- rios organismos, tais como mamíferos, insetos, bactérias e fungos. Pertencem ao clã GH-H (clã H de hidrolases glicosídicas) e são classificadas em famílias segundo similaridade entre suas sequências primárias. O clã GH-H integra cerca de 100 famílias de enzimas e as alfa-amilases compreendem as famílias 13, 70 e 77; o conjunto dessas 3 famílias também é conhecido como superfamília de alfa-amilases. Acredita-se que todas as enzimas do clã GH-H possuem o sítio catalítico com a mesma forma tridimensional de barril (alfa/beta) 8, que consiste de oito segmentos de folhas-beta e oito de alfa-hélices que se alternam ao longo da cadeia polipeptídica. Essa conformação foi observada nas cristalografias de raios X de enzimas das famílias 13, 77 e 70. Cada uma dessas famílias pode conter enzimas com mecanismos diferentes de catálise: a família 77 possui glucanotransferases que clivam as ligações alfa-1 ,4 entre resíduos de glicose e transferem uma parte do substrato para um aceptor glucano, criando uma nova ligação alfa-1 ,4; a família 70 possui glucanosucrases que sintetizam poliglucanos a partir de sacarose podendo formar novas ligações alfa-1 ,2, alfa- ,3, alfa-1 ,4 ou alfa- 1 ,6 entre os resíduos de glicose; e a família 13 contém hidrolases, transfera- ses e isomerases com mais de vinte e duas especificidades conhecidas. A- credita-se que todas as enzimas do clã GH-H realizam a reação catalítica por um mecanismo comum que envolve um resíduo de aspartato na folha- beta 4 (D185, numeração da estrutura do Tenebrio molitor, UAE.pdb), um glutamato na folha-beta 5 (E222, UAE.pdb) e um aspartato na folha-beta 7 (D287, UAE.pdb) (Figura 1). A catálise se inicia com a doação de um próton do resíduo E222 ao oxigénio glicosídico induzindo a quebra da ligação. Então, a porção aglicona do substrato deixa o sítio ativo da enzima. O resíduo de glicose remanescente no sítio enzimático é estabilizado por interação de hidrogêonio entre seus C2 e hidroxila do C3 com o aspartato da folha-beta 7. Adicionalmente, ocorre estabilização pela formação de ligação covalente entre o C1 da glicose e o aspartato nucleófilo da folha-beta 4. Por mecanismo desconhecido, a enzima facilita a aproximação de um segundo substrato com reversão das interações anteriormente explicadas: a ligação covalente se quebra, o resíduo glutamato da folha-beta 5 é reprotonado por remoção de um próton do segundo substrato, ocorre inversão da configuração do C1 no intermediário transiente formado e um novo grupo redutor é formado no C1 do substrato; algumas enzimas transferem outro resíduo de glicose, fosfato, frutose ou seus isômeros ( acGregor, E.A., An overview of clan GH-H and distantly-related families, Biologia Bratislava, 16:5-12, 2005). Um meca- nismo diferente é proposto por Mazur e colaboradores, onde há a participação de molécula de água em ataque nucleofílico ao C1 da amilose e, após a clivagem, há formação de hemiacetal a partir da interação entre os grupos aldeído e hidroxila do resíduo glicosídico não ligado à enzima, sem formação de intermediários covalentes entre enzima e substrato (Mazur, A.K, Haser, R. & Payan, F., The catalytic mechanism of alfa-amylases based upon enzyme crystal structures and model building calculations, Biochem. Bio- phys. Res. Commun., 204, 297-302, 1994).
As estruturas das alfa-amilases geralmente tem três domínios:
1. A: contém os resíduos do sítio ativo e os envolvidos na liga- ção ao substrato.
2. B: é o domínio menos conservado entre as alfa-amilases. Li- ga-se ao cálcio com interface ao domínio A. Possui resíduos envolvidos na ligação ao substrato.
3. C: sobrepõe-se parcialmente sobre a estrutura do domínio A e possui um segundo sítio ligante ao amido independente do sítio ligante que compreende os domínios A e B.
Segundo numeração da enzima alfa-amilase do besouro Tene- _
brio molitor, a qual será referida como TMA daqui em diante, o domínio A compreende os intervalos de resíduos 1-97 e 160-379, o domínio B compreende o intervalo 98-159, e o domínio C compreende o intervalo 380-471 (S- trobl, S., Maskos, K., Betz, M., Wiegand, G., Hubre, R., Gomis-Ruth, X., Glockshuber, R., Crystal structure of yellow meai worm alpha-amylase at 1.64 A resolution, J. Mo. Bio, 278, 617-628, 1998).
Nas plantas, as alfa-amilases também possuem atividade associada à maturação e germinação de sementes participando na modificação do endosperma (Muralikrishna, G., Nirmala, M., Cereal alpha-amylases - an overview, Carbohydrate polymers, 60, 163-173, 2005). No entanto, esses processos não são afetados pela ação de inibidores de alfa-amilase produzidos pelas próprias plantas. A produção de inibidores nada mais é que um mecanismo de defesa contra a ação de insetos, bactérias e fungos que também produzem alfa-amilase e a utilizam para quebrar o amido armazenado nas estruturas vegetais. Há dois tipos principais de inibidores produzidos pelas plantas: α-AH e a-AI2, sendo o a-AI1 mais comum em sementes. A inibição das enzimas da própria planta por seus inibidores não ocorre, pois as sequências de aminoácidos próximos aos sítios catalítico e ligante são bastante diferentes da sequências de insetos, culminando em diferenças estruturais que não permitem a ligação da enzima ao inibidor. Esses inibidores, no entanto, não são efetivos contra todos os tipos de alfa-amilases produzidas pelos insetos (Bompard-Gilles, C, Rousseau, P., Rougé, P., Payan, F., Substrate mimicry in the active Center of a mammaliam alpha-amylase: structural analysis of na enzyme-inhibitor complex, Structure, 4, 1441-1452, 1996).
Além dos inibidores produzidos por plantas, há também inibidores de baixo peso molecular conhecidos. O inibidor mais conhecido é a a- carbose, utilizado como hipoglicemiante oral no tratamento profilático e em casos inicias de Diabetes Melitus tipo 2 (DM2). A acarbose inibe competitiva e reversivelmente as alfa-amilases pancreática e intestinal impedindo a formação de glicose. Atualmente é comercializada como Precose® nos EUA e Glucobay ® na Europa pela Bayer, que patenteou um processo de purifica- ção com alta pureza (US Pat. 4904769) para produção de medicamentos. Nesse processo, a acarbose é obtida por fermentação de bactérias Gram positivas do género Actinoplanes e purificada por técnica de HPLC ("High- pressure liquid chromatograph"). Há também os inibidores isoacarbose e acarviosine-glicose, que no estudo bioquímico de Kim e colaboradores (1999) mostraram ter maior poder de inibição do que a acarbose (Kim, M.J., Lee, S.B., Lee, H.S., Lee, S.Y., Baek, J.S., Kim, D., Moon, T.W., Rbyt, J.F., Park, K.H., Comparative study of the inhibition of alpha-glucosidase, alpha- amylase, and cyclomaltodextrin glucanosyltransferase by acarbose, isoacar- bose, and acarviosine-glucose, Arch Biochem Biophys, 15, 371 (2):277-283, 1999).
Até o momento, a alfa-amilase da larva do Tenebrio molitor (TMA) é a mais bem estudada dentre as alfa-amilases de insetos. Sua estrutura foi cristalizada por StrobI e colaboradores a 1 ,64 Á de resolução; código PDB (Protein Data Bank): 1JAE (StrobI, S., Maskos, K., Bete, M., Wiegand, G., Huber, R., Gomis-Ruth, F.X., Glockshuber, R., Crystal structure of yellow meai worm alpha-amylase at 1 ,64 A resolution, J Mol Biol, 278, 617-628, 1998). O T. molitor é um besouro que está entre as pestes mais importantes e é causador de infestação de grãos e farináceos estocados. Suas larvas são altamente resistentes e vivem até 80 dias a -5°C. Há também estudos de interação entre TMA e inibidores com informações importantes para o desenho racional de inibidores. No trabalho de Pereira e colaboradores foi feita a cristalografia da estrutura do TMA em complexo com inibidor protéico produzido pelas sementes de Amaranthus hypocondriacus, 2,00 A de reso- lução, sem grandes diferenças estruturais entre a forma livre e a complexada do TMA. Esse inibidor é específico contra alfa-amilases de insetos, sendo inativa para enzimas de mamíferos. Segundo o trabalho, isso se deve à menor interface de contato entre as proteínas, que faz com que haja menos interações de hidrofóbicas e de hidrogénio (Pereira, P.J.B., Lozanov, V., Pat- thy, A., Huber, R., Bode, W., Pongor, S., StrobI, S., Specifi inhibition of insect alpha-amylases: yellow meai worm alpha-amylase in complex with Amaranth alpha-amylase inhibitor at 2,0 A resolution, Structure, 7:1079- 088, 1999). Em outro estudo de Strobl e colaboradores a TMA foi cocristalizada com inibidor protéico produzido pelo cerai Eurecine coracana, a 2,5 Á de resolução, sem diferenças estruturais entre a TMA livre e em complexo com esse inibidor. Neste trabalho também fica evidente a relevância das interações hidro- fóbicas e de hidrogénio entre as proteínas (Strobl, S., Maskos, K., Wiegand, G., Huber, R., Gomis-Ruth, F.X., Glockshuber, R., A novel strategy for inhibi- tion of alpha-amylases: yellow meai worm alpha-amylase in complex with the Ragi bifunctional inhibitorat 2,5 A resolution, Structure, 6:91 1-921 , 1998).
Com o intuito de se combater perdas de produtos agrícolas em estoque causadas por insetos, através do desenvolvimento e produção de estruturas com potencial para inibição dessas enzimas, ao longo do trabalho foram utilizadas técnicas computacionais para desenho de compostos ("computer-aided drug design" - CADD) (W. Graham Richards, Computer Aided-Drug Design, Pure & Appl. Chem., 66,8: 1589-1596, 1994), através do desenho computacional de fármacos baseado na estrutura do ligante ("Li- gand-Based Drug Design"-LBDD) (Acharya, C, Coop, A., Polli, E. J., Mac- Kerrel, D., Alexander., Recent advances in ligand-based drug design: reve- lance and utility of the conformationaly sampled pharmacophore approach, Current Computer - Aided Drug Design, 7, 1 :10-22, 2011), sendo o ligante a amilose. Avanços importantes na produção de fármacos já foram obtidos por meio de abordagens computacionais. O CADD pode predizer resultados experimentais com razoável precisão em tempo reduzido se comparado com os métodos mais clássicos. Métodos de CADD já são amplamente utilizados pela indústria farmacêutica com a finalidade de identificar novos compostos ou aperfeiçoar compostos já existentes que apresentam atividade contra um alvo biológico. Através de simulações de docking, que propõem predizer as interações proteína-ligante de interesse, levando em consideração parâmetros físico-químicos que interferem na ligação (D.B. Kitchen, H. Decornez, J.R. Furr, J. Bajorath, Docking and scoring in virtual screening for drug dis- covery: methods and applications, Nature Reviews - Drug Discovery, 3, 935- 949, 2004), é possível identificar compostos que potencialmente servirão como ligantes na proteína alvo. O documento WO 2001097098 descreve um método para obtenção de moléculas com potencial inibitório a partir de bancos de dados contendo as estruturas dos compostos químicos (PubChem), potenciais efe- tores da função das enzimas cuja atividade deve ser alterada (inibição ou potencialização) utilizando docking para selecionar entre as moléculas encontradas no PubChem, baseando-se em scores fornecidos pelos programas, tais como GOLD (Verdonk, M.L., Cole, J.C., Harston, M.J., Murray, C.W., Taylor, R.D., Improved protein-ligand docking using GOLD, Proteins, Structure, Function and Genetics, 52: 609-623, 2003) que simulam o atra- camento do ligante em sitio de ligação - alvo escolhido.
O documento RPI 2036 descreve o desenvolvimento de herbicidas contra uma enzima específica através da técnica de docking seguido de modificação molecular dos ligantes selecionados com melhores scores, considerando propriedades estéricas e eletrostáticas na interação ligante- proteína. Por fim, os resultados de docking foram corroborados pelos resultados experimentais.
O documento US 2008/7383135 refere-se ao desenvolvimento de inibidores que agem em uma determinada região conservada entre as proteínas de uma família de quinases. O trabalho utiliza uma isoforma com estrutura tridimensional resolvida como molde para resolver a estrutura tridimensional de proteínas homólogas e para o desenho de compostos com potencial para se ligarem à isoforma ou aos homólogos.
Ressalta-se a importância económica dos organismos em questão e a dificuldade em se produzir vegetais totalmente resistentes a essas pestes é válido que se estabeleça um esforço no sentido de desenvolver compostos com o fim de preencher a necessidade de proteção eficaz contra as pestes. O desafio deste trabalho não reside apenas em produzir moléculas com potencial inibitório das alfa-amilases de insetos, mas também em produzir compostos de baixo risco para a população exposta e para o meio ambiente. Pensando nisso, propomos o desenho de novos compostos que atuariam como inibidores da enzima alfa-amilase, descrita como essencial para o correto desenvolvimento dos organismos que a contem. SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A invenção refere-se a um método para o desenho computacional de novos compostos com potencial função inibitória das enzimas alfa- amilases. As alfa-amilases são enzimas presentes no trato digestivo de inse- tos, animais e humanos, e também produzidas por fungos e bactérias. Participam da hidrólise das ligações alfa-1 ,4 da amilose. A hidrólise da amilose resulta em resíduos de açúcar que são utilizados como fonte de energia pelos organismos. Com o objetivo de diminuir as perdas agrícolas estocadas causadas pela ação de insetos, pode-se desenhar estruturas que se ligam à alfa-amilase com alta afinidade teórica. Um enfoque especial, mas não limi- tante da invenção, é dado ao desenho de novos compostos inibidores das enzimas alfa-amilases produzidas por insetos que se alimentam principalmente de produtos agrícolas estocados. Dessa forma, os insetos cujas alfa- amilases são inibidas, não conseguindo obter os resíduos de açúcar neces- sários para obtenção de energia e, em consequência, morrem de privação energética. O desenho computacional tem como base metodologias de "Li- gand-Based Drug Design" e as interações e estruturas do ligante natural (a- milose) e de inibidores naturais. Também são utilizadas metodologias de "Structure-Based Drug Design", onde as interações entre as moléculas de- senhadas e a proteína alvo são avaliadas por meio de docking.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1. Visão da tríade catalítica da alfa-amilase do Tenebrio molitor (TMA, UAE.pdb) com os resíduos de Aspartato (D185 e D287) e Glutamato (E222) destacados em preto. Imagem gerada pelo Molegro Virtual Docker.
Figura 2. Alinhamento das estruturas primárias de enzimas alfa- amilases. As sequências de insetos usadas neste alinhamento, com seus respectivos identificadores do NCBI GenPept e códigos, foram: Tenebrio molitor, 3891490, TMA; Tribolium castaneum, 167466 85, TcA. As sequên- cias de mamíferos: alfa-amilase salivar humana, 215261 156, HSA; alfa- amilase pancreática humana, 14719495, HPA; alfa-amilase pancreática suína, 21730556, PPA; alfa-amilase pancreática de camundongo, 11 1607467, MPA; alfa-amilase pancreática de ratazana, 149025954, RPA. E as sequências de plantas: Physcomitrella patens ssp patens, 168000555, PpA; Glycine max, 255638753, GmA. As sequências de alfa-amilases vegetais foram usadas com o intuito de verificar a conservação dos resíduos mais importantes envolvidos na catálise e a existência de outros resíduos que sejam exclusivos insetos e estejam espacialmente próximos ao sítio catalítico/ligante, o que poderia indicar a existência de alvos adicionais e preferenciais, pois um composto que se ligue fortemente a um resíduo específico insetos provavelmente não causará efeitos quanto à ligação à alfa-amialse de planta. Os resíduos ausentes em plantas, porém, não são exclusivos de insetos, estando presentes também em enzimas de mamíferos, cujas sequências possuem alta similaridade e identidade com as enzimas de insetos. Os resíduos mais importantes da tríade catalítica composta pelos Aspartatos 185 e 287, e pelo Glutamato 222 estão destacados por barras cinzas contornadas em preto. Os resíduos destacados por barras cinzas sem contorno (W56, W57, Q61 , V151 , I224, N331 e D332) são os resíduos que participam da ligação ao substrato e estão ausentes em vegetais. Em uma análise de homologia com 150 sequências, sendo 50 de insetos, 50 de mamíferos e 50 de plantas (dado não mostrado) não foram encontrados resíduos exclusivos de insetos que poderiam participar na interação com o substrato. Praticamente todos os resíduos importantes para ligação ao substrato existentes nas enzimas de insetos também estão presentes nas enzimas de mamíferos ou possuem um similar. Vale salientar que este alinhamento mostra de forma resumida a a- nálise que foi feita entre várias sequências para facilitar a visualização da análise. Devido a isso, alguns resíduos não destacados que nessa figura parecem ser exclusivos de insetos, em análise mais profunda não o são. O resíduo G210, por exemplo, apesar de estar presente nas sequências de TMA e TcA, não é muito conservado em insetos e alguns mamíferos apresentam resíduos com características similares.
Figuras 3A e 3B. Alinhamento da estrutura da TMA (UAE.pdb)
(em preto) com estruturas que foram cocristalizadas com inibidor (em cinza), obtidas do Protein Data Bank. Na figura 3A, a TMA larval (UAE.pdb) foi ali- nhada com outro cristal de TMA ( CLV.pdb) que possui inibidor protéico Amaranth complexado a sua estrutura. Na figura 3B, a TMA está alinhada com uma alfa-amilase pancreática suína (PPA, I HXO.pdb) que foi cocristali- zada com inibidor de baixo peso molecular acarviosina-glicose. Os inibidores foram removidos das estruturas para melhor visualização. Os alinhamentos demonstram alta similaridade estrutural no que diz respeito às posições dos resíduos do sítio ligante (W56, W57, Y60, Q61 , H99, H189, R183, H286). Isso demonstra que mesmo que as enzimas tenham sido cocristalizadas com inibidores, as posições dos resíduos do sítio ligante ficam preservadas, bem como toda a estrutura restante das enzimas, o que está de acordo com os resultados mostrados na Tabela 3 (TM-Scores próximos de 1 e baixos RMSDs). Os alinhamentos foram feitos com o TM-align, usado para gerar as imagens e para fornecer dados de RMSD e TM-score sobre a qualidade dos alinhamentos (Yang Zhang, J. Skolnick, TM-align: a protein structure align- ment algorithm based on th TM-score, Nucleic Acid Research, 33(7): 2302- 2309, 2005).
Figura 4. Imagens da superfície dos sítios ligante e catalítico feitas pelo programa Molegro Virtual Docker. Em 4A1 e 4A2, está visível a alfa- amilase suína (PPA, I HxO.pdb) e em 4B1 e 4B2, está visível a TMA (UAE.pbd). Comparando as duas enzimas (4A1 e 4B1), observa-se que o sítio ativo (círculo de linha mais espessa) tem poucas alterações. As regiões vizinhas ao sítio ativo e ligante (círculos pontilhados), no entanto, apresentam diferenças estruturais que podem estar envolvidas na especificidade de inibidores protéicos e também podem influenciar a afinidade com diferentes ligantes de baixo peso molecular. As duas regiões destacadas por círculos pontilhados em 4B1 , mostram as diferenças mais significativas entre essas enzimas: duas cavidades ao lado do sítio ligante que são inexistentes na PPA. Essas cavidades podem ser exploradas para o desenho de inibidores preferenciais às enzimas de insetos. Em 4A2 e 4B2, observa-se moléculas de inibidor acarviosina-glicose ligadas às enzimas. O inibidor da PPA foi co- cristalizada com a enzima, e o inibidor presente na TMA foi posicionado por docking. Nota-se que as diferenças estruturais entre as enzimas alteram a conformação do inibidor ligado à enzima.
Figura 5. Sobreposição das estruturas do inibidor acarviosina- glicose no sítio ligante da PPA (I HXO.pdb) mostrando o inibidor cocristaliza- do (em cinza claro) e o posicionado por docking (cinza escuro). Foi verifica- do pelo Ligand Energy Inspector do MVD e pelo Java Protein Dossier do Sting DB que tanto no docking quanto na cocristalização os inibidores interagem com os mesmos resíduos. Na visualização do MVD, nota-se também que ambos ocupam praticamente o mesmo espaço com pouca diferença de conformação, o que valida a técnica empregada para os dockings realizados neste trabalho. Imagem gerada pelo MVD.
Figura 6. Estruturas que serviram de núcleo para a ligação de grupos ("Rs") no desenho de ligantes da série "trip". Essas estruturas são semelhantes ao Triptofano visando interação do tipo stacking com os resíduos W56, W57 e Y60, pertencentes ao sítio ligante e próximos ao sítio ati- vo. Como pode ser visto em B e C, os anéis foram mantidos e as principais alterações foram: troca do Nitrogénio pelo Oxigénio (B e C), formando a estrutura do benzofurano (B); e o deslocamento da instauração do anel de fu- rano para a ligação com o R1 (C).
Figura 7. Estruturas que serviram de núcleo para a ligação de grupos ("Rs") no desenho de ligantes da série "T". Assim como as da série "trip", são derivadas da estruturado Triptofano e análogas ao benzofurano. Em A, temos uma estrutura derivada do benzofurano sem uma instauração no anel furano e sem uma instauração no anel benzeno. Em B, é apresentada uma estrutura semelhante à mostrada em A, mas sem o átomo de Oxigê- nio que caracteriza o anel furano. E em C, é mostrada uma estrutura semelhante ao benzofurano, mas sem uma instauração no anel benzeno e sem o átomo de Oxigénio.
Figura 8. Estrutura do núcleo para ligação de grupos ("Rs") no desenho dos ligantes da série "T3". É um mero aumento no número de anéis visando aumentar a abrangência de interações do tipo stacking na regiãos so sítio ligante.
Figuras 9.1 a 9.5. Representação estrutural dos ligantes dese- nhados, por série. Figura 9.1 : série "A", ligantes derivados da acarbose. Figura 9.2: série "malt", ligantes derivados da maltose. Figura 9.3: série "trip", licantes derivados da estrutura do triptofano com alguns grupos derivados da maltose. Figura 9.4: série "T", ligantes derivados da estrutura do triptofano com grupos derivados da acarbose e acarviosina-glicose. Figura 9.5: série "T3", ligantes derivados da série "T", com grupos derivados de acarbose e acarviosina-glicose e núcleos com maior extensão para realização de intera- ção do tipo stacking.
Figuras 10A e 10B. "Poses" do ligante T3B posicionadas no sítio alvo da TMA (UAE.pdb), figura 10A, e posicionado no sítio alvo da PPA (I HXO.pdb), figura 10B. Comparando as duas figuras, observa-se que no docking com a TMA o ligante apresentou mais "poses" semelhantes do que em docking com PPA. Visto que também foi observado durante docking com inibidores conhecidos, que estes apresentaram várias "poses" semelhantes. Isto sugere que "poses" mais parecidas podem implicar em interação mais estável. Considerando ainda que o MolDock é um algoritmo baseado em evolução e que as "poses" finais foram selecionadas por realizarem intera- ções energeticamente mais estáveis e melhor complementariedade geométrica, é então importante analisar também a disposição das "poses" no sítio alvo. Além disso, também observa-se que as "poses" do ligante interagem com cavidades na TMA que não estão presentes na PPA (conforme o mostrado na Figura 4). Baseado nisso, a maior semelhança entre as posições das poses no docking com a TMA sugere que a interação do ligante é mais favorável com essa enzima do que com a PPA.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a um método para o desenho computacional de novos compostos com potencial função inibitória das enzimas alfa-amilases. Um enfoque especial é dado ao desenho de novos compostos inibidores das enzimas alfa-amilases produzidas por insetos que se alimentam principalmente de produtos agrícolas estocados.
0 método proposto consiste das seguintes etapas:
1 - Obter arquivos de coordenadas referentes às estruturas tri- dimensionais (a partir do banco PDB) da estrutura da alfa-amilase da enzima de interessse.
2 - Fazer busca por sequências homólogas à estrutura primária da enzima do de interessse usando o BLASTp contra o banco de dados de sequências primárias do PDB e NR ("non-reduntant protein sequences") do NCBI. O BLAST fornece os dados referentes às características do alinhamento de sequência primária, como: identidades (porcentagem de aminoácidos idênticos em posições correspondentes), positivos (são os números de aminoácidos idênticos somado ao número de aminoácidos que não são i- dênticos entre duas sequências numa determinada posição, mas que possuem propriedades similares, considerado como um "Positivo" por indicar substituições nas quais a matriz BLOSUM-62 pontua positivamente segundo Altshul e colaboradores (1997). Os gaps indicam o número de regiões que representam lacunas no alinhamento (seja devido a inserções e deleções no histórico evolutivo dos genes) e, por último, a coluna e-value (Expect Value) representa um parâmetro estatístico do programa BLAST que indica o número de diferentes alinhamentos que ocorreriam em um banco de dados por mero acaso com Score equivalentes ou melhores que o obtido para um determinado alinhamento. Quanto menor o e-value, mais significante é o score obtido no alinhamento em questão (S.F. Altschul, T.L. Madden, A.A. Schãffer, Z. Zhang, W. Miller, D.J. Lipman, Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Acid Res, 25( 7):3389-3402, 997) para análise de homologia e com o programa Clus- talW (M.A Larkin, G. Blackshields, N.P. Brown, R. Chenna, P.A. McGettin- gan, H. McWillian, F. Valentin, I.M. Wallace, A. Wilm, R. Lopez, J.D. Thompson, T.J. Gibson, D.G. Higgins, Clustal W and Clustal X version 2.0, Bioin- formatics, 23, 2947-2948, 2007).
3 - Alinhar a enzima de interesse às estruturas de outras alfa- amilases depositadas no PDB para análise da sobreposição das estruturas terciárias e para analisar os desvios (RMSD - "root-mean-square deviation") e TM-score. O RMSD fornece em  a média quadrática das distâncias entre pares de resíduos correspondentes, depois da sobreposição de uma estrutu- ra sobre a outra. O TM-score utiliza o fator de Levitt-Gerstein que considera os pares de resíduos em menores distâncias como mais relevantes do que aqueles a maiores distâncias e também é mais sensível à topologia geral do que a variações estruturais localizadas. O TM-score é normalizado de forma a não ser dependente do tamanho da proteína, seu valor pode ir de 0.0 a 1.0, sendo valores maiores que 0.17 indicativos de similaridade estrutural elevada (Yang Zhang, J. Skolnick, TM-align: a protein structure alignment algorithm based on th TM-score, Nucleic Acid Research, 33(7): 2302-2309, 2005). As estruturas terciárias são visualizadas através do PyMol para análi- se da sobreposição das estruturas terciárias. (W.L Delano, The PyMol molecular graphics system Delano Scientific, San Carlos, CA, USA, http://www.pymol.com.org).
4 - Fazer alinhamentos entre a estrutura primária de proteínas homólogas à proteína de interesse através do programa ClustalW 2.0 (Lar- kin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, P. A., McWillian, H., Valentin, F., Wallace, I. M., Wilm, A., Lopez, R., Thompson, J., D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioin- formatics, 23, 2947-2948, 2007) e incluir proteínas de outros organismos, evidenciando as similaridades e diferenças entre estes dois conjuntos de proteínas e buscando as correspondências no alinhamento de estrutura primária dos resíduos importantes. Seguindo certos critérios como: presença exclusivamente nas sequencias de insetos, escolher os alvos terapêuticos preferenciais.
5 - Buscar estruturas de compostos no PubChem (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) por similaridade maior que 90% com o ligante natural (amilose) e proceder simulações de docking empregando o programa Molegro Virtual Docker (MVD). O docking consiste na predição da orientação de uma molécula em relação a uma segunda quando elas se ligam para formar um complexo ligante-proteína. Há vários programas que realizam docking molecular, tais como DOCK, AUTODOCK, GOLD, FLEXX, ZDOCK, M-ZDOCK, MS-DOCK, Surflex, MCDOCK, MolDock, GemDock, entre outros. Os métodos usados por cada programa diferem basicamente na busca pela conformação que melhor se liga à proteína. Há três principais tipos: Estocástico e Sistemático, por Dinâmica Molecular e Algoritmos Genéticos/Evolucionários. O método de busca Estocástica e Sistemática por ligan- tes é bastante empregado e variado. O programa DOCK, por exemplo, utiliza um método baseado em conformações randômicas; FLEXX é baseado no espaço conformacional do sítio ativo. O método por Dinâmica Molecular, utilizado pelo AUTODOCK, calcula as várias conformações que a proteína alvo pode adotar durante a interação com o ligante. O MVD utiliza o algoritmo MolDcok que é baseado em Algoritmo Evolucionário (uma variedade de Mé- todo Estocástico e Sistemático) para simular as interações ligante-proteína. Os algoritmos evolucionários podem ser definidos como um grupo de aproximações computacionais baseadas nos conceitos da Teoria da Evolução de Darwin. O MolDock é uma implementação do algoritmo evolucionário focado em simulações de docking molecular, onde aproximações computacionais de um processo evolutivo são aplicadas para simular a permanência das características mais favoráveis (Thomsen R, Christensen, MH., MolDock: a new technique for high-accuracy molecular docking. J Med Chem. Jun 1 , 49(11 ):3315-21 , 2006; W.F. De Azevedo Jr, MolDock applied to structure- based virtual screening, Current Drug Targets, 1 1 (3):327-334, 2010). Traba- lhos que comparam os programas mais utilizados indicam que programas baseados em algoritmo evolucionário tais como GemDock e MolDock apresentam melhor performance geral do que Flexx, GOLD e Surflex (R. Thomsen, M.H, Christensen, MolDock: a new technique for high-accuracy molecular docking, J Med Chem, 49, 3315-21 , 2006; J.M. Yang, C.C. Chen, Gem- Dock: a generic evolutionary method for molecular docking, Proteins, 55, 288-304, 2004). Neste trabalho, os dockings foram feitos entre os ligantes obtidos no PubChem e a TMA para seleção de estruturas com melhor afinidade com os resíduos do sítio alvo principalmente em relação aos aminoácidos conservados.
6 - Uma análise detalhada do nano-ambiente do sitio alvo é realizada usando-se o programa STING Java Protein Dossier (Neshich G., Roc- chia W., Mancini A.L., Yamagishi M.E., Kuser P.R., Fileto R., Baudet C, Pin- to I.P., Montagner A.J., Palandrani J.F., Krauchenco J.N., Torres R.C., Souza S., Togawa R.C., Higa R.H. 2004. JavaProtein Dossier: a novel web- based data visualization tool for comprehensive analysis of protein structure. Nucleic Acids Res. 1 ;32 (Web Server issue):W595-601 , 2004) e a ferramenta "select". Desta forma, são determinados conjuntos de parâmetros físico- químicos e estruturais que descrevem o nano-ambiente que é composto pelos resíduos que compõem o sítio-alvo, no qual se espera que os ligantes atraquem. Estes conjuntos são usados não apenas para identificação nas estruturas estudadas, como também para melhor compreender o ambiente para qual o inibidor seria construído, tendo a eficácia necessária para sua aplicação final. Portando estes parâmetros indicam as características físico- químicas do alvo terapêutico para o adequado desenho computacional e modificação dos novos compostos.
7 - As estruturas selecionadas no item "5" devem ser modifica- das racionalmente, de acordo com as características físico-químicas e estruturais encontradas no item "6" (por exemplo, se o potencial eletrostático local é alto, adicionam-se os átomos adequados para diminuir este potencial no composto incial), a fim de aumentar os valores de afinidade de ligação. As alterações nos compostos são feitas computacionalmente através do pro- grama ChemBioDraw, no qual também são feitas minimização de energia e dinâmica das estruturas de ligantes desenhadas (Zhenjiang Li, Honggui Wan, Yuhu Shi, Pingkai Ouyang, Personal experience with four kinds of chemical structure drawi-ng software: review on ChemDraw, ChemWindows, ISIS/Draw, and ChemSketch, J. Chem. Inf. Comput. Sei., 44, 1886-1890, 2004). Além da busca por ligantes baseados na estrutura de amilose no PubChem, também é feita busca por ligantes baseados na estrutura dos inibidores naturais. Os demais passos de docking e modificações estruturais também são aplicados a esses ligantes.
8 - Realizar predição de parâmetros moleculares que interferem na Absorção, Distribuição, Metabolismo, Excreção e Toxicidade utilizando a ferramenta online Osíris Property Explorer (Thomas Sander, Actelion Phar- maceuticals Ltd., http://www.orqanic-chemistry.org/proq/peo/) para orientar no desenho dos compostos. O programa Osíris fornece dados de risco de toxicidade: mutageninicade, tumorogenicidade, irritante e com efeito reprodutivo, baseados em fragmentos de moléculas conhecidas depositados no banco de dados RTECS. Também prediz valores de cLogP, solubilidade em água, peso molecular e fornece o Drug-score que é um valor geral resultante da combinação de todos os parâmetros anteriores mais o Druglikeness, que compara fragmentos do composto desenhado com base de dados de compostos comercializados e com base de dados de compostos que não servem como fármacos (Fluka).
EXEMPLOS
A invenção será agora descrita em maiores detalhes por meio dos exemplos a seguir, o qual não devem ser interpretados como limitativos do escopo da invenção.
Exemplo 1 - Análise de similaridade e identidade entre as alfa- amilases de diferentes espécies.
Foram obtidos os arquivos de coordenadas referentes às estruturas tridimensionais existentes do Tenebrio molitor através do Protein Data Bank (http://www.pdb.org). As alfa-amilases de insetos, cujas estruturas tridimensionais estão resolvidas e depositadas no PDB, são: enzima da larva do T. molitor (1JAE), T. molitor em complexo com inibidor Amaranth (1 CLV), T. molitor em complexo com inibidor Ragi (1TMQ) e T. molitor em complexo com inibidor do Phaseolus vulgaris (1VIW). Como o trabalho tem como alvo principal o estudo de alfa-amilase de insetos para o desenvolvimento de inibidores, foi executado o programa BLASTp usando como query a sequência da alfa-amilase de T. molitor (TMA) contra a database NR do NCBI filtrada para proteínas de outros insetos. Foram evidenciados altos valores de identidade e similaridade, ambos acima de 60% e 75%, respectivamente, para a maioria das sequências de insetos obtidas como "hits" no BLASTp (Tabela 1)·
Tabela 1 - Resultados obtidos com o BLASTp (SF Altschul, TL
Madden, AA Schâffer, Z Zhang, W Miller, DJ Lipman. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nu- cleic Acid Res. 1997 Sep 1 ;25(17):3389-402.) entre a alfa-amilase do Tene- brio molitor (TMA, UAE.pdb) e sequências do banco NR do NCBI (www.ncbi.nlm.nih. ov), sendo reportados os três melhores "hits" obtidos contra insetos, mamíferos, fungos e plantas. São fornecidos os dados refe- rentes às características do alinhamento de sequência primária realizado pelo BLAST, como: identidades (porcentagem de aminoácidos idênticos em posições correspondentes), positivos (são o número aminoácidos idênticos somado ao número de aminoácidos não idênticos entre duas sequências numa determinada posição, mas que possuem propriedades similares, con- siderado como um "Positivo" por indicar substituições nas quais a matriz BLOSUM-62 pontua positivamente segundo Altshul e colaboradores (1997), a coluna gaps indica o número de regiões que representam lacunas no alinhamento (seja devido a inserções e deleções no histórico evolutivo dos genes) e, por último, a coluna e-value (Expect Value) que representa um parâ- metro estatístico do programa BLAST que indica o número de diferentes alinhamentos que ocorreriam em um banco de dados por mero acaso com Score equivalentes ou melhores que o obtido para um determinado alinhamento. Quanto menor o e-value, mais significante é o score obtido no alinhamento em questão.
Figure imgf000021_0001
Nicotiana langsdoffii x N.. sanderae (tabaco) 25 37 17 4e-05
No BLASTp contra NR de insetos (Tabela 1), dos três melhores apenas um (Melampsora larici-populina) tem importância agrícola. As enzimas fúngicas não serão consideradas neste trabalho devido às baixas identidade e similaridade com a TMA. Foi também feito o BLASTp com enzimas de plantas (Tabela 1) cujos alinhamentos com a sequência query TMA (1 JAE_A) apresentaram valores de similaridade e identidade muito menores. Não foi encontrada nenhuma estrutura disponível no PDB de alfa-amilase vegetal; e as estruturas de insetos disponíveis em PDB apresentaram identidade e similaridade muito baixas (entre 30 e 40%) em relação à TMA (dado não mostrado), além de não serem de insetos caracterizados como pestes agrícolas. Em relação às enzimas de mamíferos, foi feito BLASTp contra NR do NCBI (Tabela 1 ) para sequências de mamíferos, que apresentou identidade e similaridade maiores do que as vegetais. No BLASTp contra PDB (Tabela 2) apenas resultaram "hits" de enzimas de mamíferos.
Tabela 2 - Resultados de BLASTp contra o banco PDB usando- se como sequência de busca ("query sequence") a sequência da TMA (UAE.pdb). São mostrados os três melhores resultados "hits" encontrados. A descrição das colunas segue o padrão da tabela 1.
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wmm m um SpilíplSS fti.denílda.deg pOSltlVOS ;..
porco / pancreático / 1 KXQ 53 67 5 1 e-141 humano / salivar / 3BLK 66 6 1 e-139 humano / pancreático / 2CPU 52 66 5 7e-13B
Exemplo 2 - Identificação dos resíduos-alvo
Sabendo-se da importância dos insetos no estoque de grãos e pensando-se no desenho de um fármaco capaz de interagir com mais de uma espécie de inseto, foi feito um alinhamento de sequência primária u- sando o programa ClustalW (Larkin, M. A., Blackshields, G, Brown, N. R, Chenna, R., McGettigan, P. A., McWillian, H., Valentin, E, Wallace, I. M., Wilm, A., Lopez, R., Thompson, J., D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23, 2947-2948, 2007), que é mostrado na Figura 2. Nesta figura também estão alinhadas duas sequências de alfa-amilases vegetais (de PpA - Physcomitrella patens ssp patens e GmA - Glycine max) com o intuito de compará-las com sequências alfa- amilases de insetos para buscar por aminoácidos que sejam específicos de insetos em relação às plantas, para não interferir na função enzimática vegetal, e que estejam envolvidos na ligação com o substrato. São exibidas apenas as duas sequências de enzimas vegetais que apresentaram melhores resultados no BLASTp, ou seja, são exibidas as duas sequências vegetais mais similares às sequências de insetos. Da mesma forma, são exibidas as quatro sequências de mamíferos que apresentaram melhores resultados no BLASTp (HSA - alfa-amilase salivar humana, HPA - alfa-amilase pancreática humana, PPA - alfa-amilase pancreática suína, MPA - alfa-amilase pancreática e camundongo, RPA - alfa-amilase pancreática de rato). Esse ali- nhamento mostra de forma resumida a análise que foi feita entre várias sequências (não mostrado) para facilitar a visualização da análise. Devido a isso, alguns resíduos não destacados que nessa figura parecem ser exclusivos de insetos, em análise mais aprofundada não o são. O resíduo G210, por exemplo, apesar de estar presente nas sequências de TMA e TcA, não é muito conservado em insetos e alguns mamíferos apresentam resíduos com características similares. Isso remete à discussão sobre como identificar um alvo terapêutico ideal para o desenho computacional de novos compostos. Anderson publicou uma descrição de como deve ser realizado o procedimento de desenho computacional de fármacos baseado em estruturas pro- téicas, desde os critérios que devem ser adotados para a escolha do alvo terapêutico para tal desenho até os processos de desenvolvimento, docking e virtual screening (AC Anderson. The process of structure-based drug design. Chem Biol. Sep;10(9):787~97, 2003). O trabalho discute que o desenho de drogas antimicrobianas deve se basear em alvos que sejam essenciais, principalmente encontrados nos organismos que se pretende atacar, tenham uma função única nesse organismo e que sejam passíveis de sofrerem inibição por pequenas moléculas. Pensando nisso, o alvo considerado, a enzima alfa-amilase, é essencial para a sobrevivência dos insetos que se alimentam de grãos, é passível de inibição (já demonstrada praticamente através de estudos com inibidores protéicos e de baixo peso molecular) e, sugerimos a seguir resíduos a serem usados como alvos preferenciais por não estarem presentes nas estruturas das enzimas vegetais ao passo que são essenciais para que as enzimas de insetos se liguem ao substrato. Considerando as enzimas de mamíferos, estas podem ser consideradas alvos potenciais já que roedores também são considerados pragas de estoque de grãos. Em relação às enzimas humanas, em outro trabalho, poderiam ser consideradas como alvos terapêuticos no tratamento da Diabetes Mellitus tipo 2. Porém, neste trabalho tais enzimas não podem ser consideradas alvos. Como os resíduos elencados como cruciais para ligação ao substrato estão presentes tanto em insetos como mamíferos, os novos ligantes foram desenhados para ter menor afinidade teórica com as enzimas de mamíferos e maior afinidade com enzimas de insetos. Para isso, foram consideradas as poucas diferenças estruturais que circundam os sítios ligantes e catalíticos das enzimas de mamíferos e insetos, explicadas mais adiante. Espera-se que também nos teste in vitro e in vivo, os ligantes desenhados tenham maior afinidade com as enzimas de insetos do que com as de mamíferos.
Analisando o alinhamento e características estruturais de resíduos próximos aos envolvidos na catálise e ligação ao substrato, pode-se perceber a existência de cinco aminoácidos importantes, presentes nas alfa- amilases de insetos e mamíferos e ausentes nas alfa-amilases vegetais: W56, W57, Q61 , V151 e N331. No alinhamento, o alto grau de identidade dos resíduos especificamente envolvidos na catálise e ligação do substrato e a alta similaridade nos leva a crer que os compostos aqui desenhados para a TMA seriam igualmente capazes de inibir as alfa-amilases do Tribolium castaneum e, possivelmente, de outros insetos e mamíferos. As estruturas da TMA cocristalizada com inibidores protéicos (I CLV.pdb, ITMQ.pdb, IVIW.pdb), as estruturas da PPA complexada com inibidores (I HXO.pdb, I KXQ.pdb, I DHK.pdb) e a estrutura da HPA cocristalizada com acarbose (2QV4.pdb) depositadas no PDB, foram analisadas através de visualização no programa Java Protein Dossier da plataforma STING (Neshich G., Roc- chia W., Mancini A. L, Yamagishi M.E., Kuser P.R., Fileto R., Baudet C, Pinto I.P., Montagner A.J., Palandrani J.F., Krauchenco J.N., Torres R.C., Souza S., Togawa R.C., Higa R.H. Java Protein Dossier: a novel eb-based data visua- lization tool for comprehensive analysis of protein structure. Nucleic Acids Res. 2004 Jul 1 ;32 (Web Server issue):W595-601 , 2004), de onde foi possível extrair informações de que aminoácidos estão interagindo por meio de contatos com os inibidores complexados às estruturas. Estes são os resíduos do sítio ativo D185, E222 e D287, e sítio ligante: W56, W57, Y60, Q61 , H99, R183, A186, H189 e H286, que são bastante conservados entre os in- setos, segundo o alinhamento feito.
Exemplo 3 - Análise do nanoambiente do sítio ligante e catalítico Para uma análise comparativa das posições estruturais dos aminoácidos relevantes ao presente estudo, foram efetuadas sobreposições estruturais entre as diversas estruturas resolvidas de alfa-amilases depositadas no PDB (Tabela 3).
Tabela 3 - Valores de RMSD e TM-Score resultantes de alinhamento estrutural entre a TMA (1 JAE.pdb) e as estruturas de alfa-amilases de insetos e mamíferos depositadas no banco PDB. O RMSD fornece a média quadrática das distâncias entre pares correspondentes de resíduos depois da sobreposição de uma estrutura sobre a outra. O TM-score (Yang Zhang, J. Skolnick, TM-align: a protein structure alignment algorithm based on th TM-score, Nucleic Acid Research, 33(7): 2302-2309, 2005) utiliza o fator de Levitt-Gerstein que considera os pares de resíduos em menores distâncias como mais relevantes do que aqueles a maiores distâncias e também é mais sensível à topologia geral do que a variações estruturais localizadas. O TM- score é normalizado de forma a não ser dependente do tamanho da proteína, seu valor pode ir de 0.0 a 1.0, sendo valores maiores que 0.17 indicativos de similaridade estrutural elevada. Como o TM-score leva em considera- ção principalmente a topologia, esses resultados indicam que todas as enzimas possuem alta correlação estrutural com a TMA (UAE.pdb), mesmo quando em complexo com inibidores.
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Foram calculados os valores de desvio no alinhamento entre as estruturas terciárias alinhadas através do programa TM-align (Yang Zhang, J. Skolnick, TM-align: a protein structure alignment algorithm based on th TM-score, Nucleic Acid Research, 33(7): 2302-2309, 2005). Os valores fornecidos pelo TM-align são o RMSD e o TM-score, sendo que o primeiro calcula a média quadrática da distância entre os resíduos correspondentes considerando apenas as distâncias entre pares de resíduos e sendo influenciado pelo tamanho da proteína, não levando em conta sua topologia. Já o TM-Score é calculado levando em conta a topologia das estruturas sobrepostas, o que é bastante importante uma vez que a maioria das interações entre proteínas são influenciadas pela topologia. A sobreposição das estrutu- ras gerada pelos alinhamentos estruturais entre a TMA (UAE.pdb) e a TMA complexada com inibidor Amaranth (I CLV.pdb), e entre a TMA (UAE.pdb) e a PPA complexada com acarviosina-glicose (I HXO.pdb) são mostradas nas figuras 3A e 3B* , respectivamente, com enfoque nos resíduos importantes do sítio ligante (W56, W57, Y60, Q61 , H99, R183, H189 e H286). Foi obser- vado, nestas sobreposições, que as posições dos aminoácidos nos sítios ligantes das proteínas são bastante conservadas estruturalmente, o que reforça a idéia de que um ligante possa funcionar como inibidor da alfa- amilase ligando-se a esses aminoácidos não somente da TMA como de enzimas de outros insetos ou até de mamíferos. Apesar de a posição desses aminoácidos serem bem conservadas tanto em insetos quanto em mamíferos, há diferenças no posicionamento de outros resíduos que circundam o sítio ligante de modo a direcionar a interação com os ligantes (Figuras 4A e 4B). A visualização e confecção de imagens foram feitas com o programa MVD (Thomsen R, Christensen MH.: MolDock: a new technique for high- accuracy molecular docking. J Med Chem. Jun 1 ;49(11):3315-21. 2006;W.F. De Azevedo Jr, MolDock applied to structure-based virtual screening, Cur- rent Drug Targets, 1 1 (3):327-334, 2010).
Um trabalho adicional foi realizado para a análise da conservân-
São apenas mostradas duas sobreposições, referentes às figuras 3A e 3B, embora tenham sido feitas sobreposições de todos os alinhamentos para análise da posição dos resíduos citados no texto. As demais sobreposições foram omitidas pois são praticamente idênticas às apresentadas. As sobreposições das figuras 3A e 3B foram escolhidas por apresentarem estruturas co-cristalizadas com inibidor a fim de verificar se a ligação com inibidor altera a forma da alfa-amilase no sítio ligante. cia de parâmetros físico-químicos e estruturais dentre os resíduos importantes entre as estruturas de alfa-amilases. Sabe-se que a função da proteína é mais conservada com relação à estrutura 3D do que em relação à sequência primária (Chothia C, Lesk AM. The relation between the divergence of se- quence and structure in proteins. EMBO J. Apr;5 (4):823-6, 1986), havendo várias proteínas com pouca ou nenhuma similaridade de sequência que, mesmo assim, têm similaridade estrutural. Conhecer a estrutura permite-nos explicar o mecanismo bioquímico pelo qual a proteína implementa sua funcionalidade. Os fatores que determinam a funcionalidade do sítio ativo de uma proteína são muito complexos e dependem da estrutura tridimensional, além das propriedades bioquímicas e biofísicas.
É possível analisar os sítios funcionais como um nano-ambiente físico-químico que acompanha uma função, ao invés de considerá-los como um grupo de resíduos fixos. Assim, buscamos uma caracterização mais ge- nérica do sítio ativo (e/ou conjunto dos aminoácidos que constroem o chamado sítio de ligação ao substrato), a partir de descritores estruturais, sem considerar necessariamente a conservação como o principal fator e sim a geometria específica, que sejam úteis para a previsão dos resíduos catalíticos das enzimas.
Aplicamos um método para seleção de descritores da estrutura contidos no STING_DB (Neshich, G., Togawa, R., Mancini, A. L, Kuser, P. R., Yamagishi, M. E. B., Pappas Jr., G., Torres, W. V., Campos, T. F., Ferreira, L. L, Luna, F. M., Oliveira, A. G., Miura, R. T., Inoue, M. K., Horita, L. G., de Souza, D. F., Dominiquini, F., Álvaro, A., Lima, C. S., Ogawa, F. O., Go- mes, B. G., Palandrani, J. C. F., dos Santos, G. F., de Freitas, E. M., Mattiuz, A. R., Costa, I. C, de Almeida, C. L, Souza, S., Baudet, C. and Higa, R. H. STING Millennium: a Web based suite of programs for comprehensive and simultaneous analysis of protein structure and sequence. Nucleic Acids Research, 31 :13, 3386-3392, 2003), projetado especificamente para previsão do sítio catalítico e do sítio de ligação ao substrato de enzimas. Apenas alguns resíduos da enzima participam da catálise, ao passo que a grande maioria dos resíduos são não reativos. Outros resíduos são caracterizados como aqueles que servem para o atracamento de ligante ou substrato e estes também tem suas características que podem ser usadas para sua sele- ção e consequentemente, para descrição do nano-ambiente criado por este conjunto de resíduos que compõem o sítio de ligação. Com a identificação de um conjunto dos descritores de nano ambiente, estamos habilitados para a construção de uma tabela de assinaturas (consulta sobre os descritores estruturais dos resíduos restringindo seus intervalos de valores) para os diversos membros de famílias enzimáticas. Estas assinaturas devem funcionar em todos os membros se identificadas com rigor. No caso da proteína alfa- amilase, identificamos apenas dois parâmetros que com sucesso foram capazes de selecionar em todas as estruturas existentes no PDB o conjunto de resíduos que compõem o sítio catalítico que, como já foi mencionado anteriormente, é constituído pelos três aminoácidos: Aspartato 185, Glutamato 222 e Aspartato 287, segundo numeração da TMA (1 JAE.pdb).
Foram examinadas 8 estruturas de alfa-amilases (em parêntesis a numeração dos aminoácidos da tríade catalítica correspondentes em cada estrutura) 1 JAE (D185, E222, D287), 1 CLV (D185, E222, D287), 1 DHK (D197, E233, D3000), 1 KXQ (D197, E233, D3000), 1TMQ (D185, E222, D287), 2VIW (D185, E222, D287), 2QV4 (D197, E233, D3000) e 3BLK (D197, E233, D3000). Usando a ferramenta Select do Java Protein Dossier. O conjunto de descritores e seus intervalos de valores que caracterizam unicamente estes resíduos foram: Valor do parâmetro Conservation HSSP Re- lative Entropy <= 2 e do parâmetro Electrostatic Potencial no último átomo pesado da cadeia lateral de aminoácido (LHA) num intervalo de [-218, -180 kT/e], o que indica a característica do potencial eletrostático medido em volta de último átomo pesado da cadeia lateral, sendo este negativo e os resíduos possuem alta conservação na evolução deste aminoácido no contexto da estrutura desta enzima (indicado pelo baixo valor de "Conservation HSSP Relative Entropy"). Em adição, foram identificados os aminoácidos constitu- intes de sítio de ligação ao substrato para estas estruturas, de acordo com as interações com inibidores cocristalizados indicadas pelo "Protein Java Dossier". O conjunto de descritores e seus respectivos valores, usados para identificar o nano ambiente criado na estrutura protéica por eles, são bem mais complexos e diversos. É constituído pelos seguintes parâmetros STING, com seus respectivos intervalos: Conservation HSSP Relative En- tropy <= 5; Reliability (x100) >= 83,7; Rotamers Percent <= 13; Unused Con- tacts Total >= 62; Unused Contacts Energy Total >= 127; Hydrophobic Scale Isolation < 1 ; Surface Accessibility Isolation < 33. Pode-se observar que estes aminoácidos, além de conservados altamente, possuem rotâmeros alternativos, também possuem baixo valor de intervalo de potencial eletrostático médio, -39.38 a 20.75 kT/e. Outra característica observada foi o alto numero de contatos não usados (indicando alto potencial em fazer contatos com molécula de substrato) e tendo hidrofobicidade baixa e acessibilidade dos resíduos ao solvente alta. Estes conjuntos foram usados não apenas para identificação nas estruturas estudadas, como também para melhor compreender o ambiente para qual o inibidor seria construído, tendo a eficácia necessária para sua aplicação final. Portanto, estes parâmetros indicam as características físico-químicas do alvo terapêutico para o desenho adequado dos novos compostos (Da Silva, M.C.M., Grossi da Sá, M.F., Chrispeels, M.J., Togawa, R.C., Neshich, G, Analysis of structural and physico-chemical parameters involved in the specificity of binding between alpha-amylases and their inhibi- tors, Protein engineering, 13, 3:167-177, 2000).
Exemplo 4 - Desenho computacional dos ligantes
Para o desenho computacional de ligantes partiu-se da estrutura de fragmento do ligante natural (maltose) e dos inibidores de baixo peso molecular já existentes (acarbose, acarviosina e isoacarbose). A partir deles foram feitas buscas por compostos que possuíam similaridade na estrutura química acima de 90% na base de dados PubChem (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) através do "PubChem Structure Search" (Junguk Hur, David J Wild: PubChemSR: A search and retrieval tool for PubChem, Chemistry Central Journal. 2:11 doi:10.1186/1752-153X-2-11 , 2008) e, ao todo, foram obtidas 1881 estruturas. A estratégia para o desenho desses ligantes partiu da observação da posição de todos os aminoácidos do sítio ligante e confirmação de ausência em sequência de enzimas vegetais através de vários alinhamentos feitos usando o CLUSTALw entre estruturas primárias de insetos, plantas e mamíferos. Todas as estruturas desenhadas foram então submetidas a simulações de docking com a estrutura da TMA, código PDB 1JAE. O docking foi realizado com o programa Molegro Virtual Docking (MVD) (Thomsen R, Christensen MH.: MolDock: a new technique for high-accuracy molecular docking. J Med Chem. Jun 1 ;49(11):3315-21 , 2006), que é baseado em algoritmo evolutivo para simular as interações li- gante-proteína.
As simulações de docking (com ligante flexível) usando-se o programa MVD, foram efetuadas centralizando-se nos resíduos do sítio ativo mencionado e com um raio de esfera de espaço de busca de 14Â centralizada no sítio catalítico. O algoritmo de cálculo de score usado foi o MolDock Score [GRID], usando uma resolução de Grid de 0,2Ã (avaliando-se o ligante por meio de Interações internas de pontes de hidrogénio, interações eletros- táticas e torções Sp2-Sp2). O algoritmo de busca e docking usado foi o MolDock Optimizer (que é uma implementação de uma variação do algoritmo evolutivo), com 20 rodadas, tamanho de população igual a 100 e com 3000 iterações. Após o docking, o MVD realizou Minimização de energia e otimi- zação de pontes de Hidrogénio das "poses" (sendo que uma pose é um mo- do de ligação candidato) obtidas.
Com o MVD é possível visualizar os resultados das simulações em modelos tridimensionais, o que torna possível eliminar facilmente as "poses" que adotaram posições visualmente erróneas, não tendo de levar apenas em consideração os valores numéricos fornecidos pelo programa para isso. Dada a importância dos resíduos preferenciais, ausentes nas plantas, W56, W57, Q61 , I224 N331 e D332, e os envolvidos na interação ligante- proteína Y60, H99, R183, K188, H 89 e H286, os compostos foram então selecionados de acordo com os valores de energia, em relação a esses resíduos, fornecidos pelo programa através do módulo "Ligand Energy Inspec- tor". Foi também considerado o MolDock score, que é a energia total da pose, como parâmetro secundário na seleçáo de ligantes.
A cada docking seguiu-se a seleção de ligantes e modificações estruturais nos mesmos a fim de melhorar a interação com os resíduos-alvo. As modificações foram feitas com o programa ChemBioDraw (http://www.cambridgesoft.com/software/ChemBioDraw/) e as estruturas foram energeticamente minimizadas com o mesmo.
No virtual screening, no docking com a maltose (produto da ami- lose), docking com a amilose, com a acarbose, com acarviosina e com isoa- carbose, os resíduos que apresentaram melhor energia de interação foram os que realizaram interações tipo stacking com anéis dos ligantes; esses resíduos foram o W56, W57 e Y60. Além desses resíduos, também se des- tacaram Valina 151 e Isoleucina 224, com interações hidrofóbicas. Os inibidores (isoacarbose e acarviosina-glicose) apresentaram energia de interação menor (menor energia significa interação mais estável) do que a maltose em relação aos resíduos W56, W57 e Y60, no docking com a TMA, sugerindo que esses resíduos fazem as principais interações de ligação ao substra- to. Já no docking com a PPA (alfa-amilase pancreática de porco) os resíduos com menor energia foram V163 (V151 , na TMA) e W59 (W57, na TMA). Pensando-se em um desenho de estruturas que se liguem preferencialmente às enzimas de insetos, os resíduos W56, W57 e Y60 foram considerados principais alvos. Dada à inexistência de resíduos exclusivos de insetos, em relação às de mamíferos, que participem na ligação e catálise do substrato, espera-se, tanto nas simulações computacionais como nos testes in vitro e in vivo, que as interações dos ligantes com as enzimas de mamíferos sejam piores do que as interações com enzimas de insetos.
O posicionamento dos ligantes no sítio catalítico e ligante foi va- lidado a partir de comparação com estrutura de enzima cocristalizada com acarviosina-glicose (PPA, I HXO.pdb). A Figura 5 mostra a sobreposição entre o docking feito com a PPA e o ligante cocristalizado da mesma enzima.
Os ligantes candidatos a fármacos foram desenhados seguindo as estratégias:
· Série "A": as estruturas dessa série foram desenhadas a partir da estrutura do inibidor acarbose, com mudanças esteroquímicas e adição de insaturações. • Série "malt": foram baseados na estrutura da maltose. Também foram modificados em relação à orientação dos grupos e insaturações.
• Série "trip": as estruturas foram desenhadas a partir da estrutura do resíduo de triptofano visando a realização de interação tipo stacking com os triptofanos e tirosinas da enzima. A estrutura do anel do triptofano foi mantida e o Nitrogénio foi trocado por Oxigénio (figura 6), pois o Nitrogénio nessa posição teria repulsão com o Nitrogénio do triptofano da enzima. Nesses ligantes foram colocados grupos ("Rs") derivados da maltose e outros grupos.
» Série "T": foram feitas moléculas a partir das estruturas derivadas do triptofano (Figura 7), com "Rs" derivados da acarbose e acarviosi- na-glicose, variando em número de "Rs" e em número de resíduos glicosídi- cos por "R".
• Série "T3": moléculas derivadas do ligante T3 mas com alte- rações no núcleo derivado de triptofano (Figura 8), com aumento do número de anéis.
Todos os ligantes desenhados são mostrados nas figuras 9.1 a
9.5.
Foram obtidas 4 estruturas derivadas daquelas que apresenta- ram melhores resultados nas rodadas de dockings anteriores e que sugere- se que podem apresentar atividade inibitória para a(s) enzima(s) alfa- amilases(s). Nas tabelas 4 e 5 são demonstrados os resultados de docking dos ligantes desenhados, de maltose e dos inibidores acarbose, isoacarbose e acarviosina, contra as enzimas TMA (UAE.pdb) e PPA (I HXO.pdb), sendo que foi feito também docking com esta última para comparação dos valores entre enzima de inseto e enzima de mamífero (a 1 HX0 possui 53% de identidade, 67% de positivos e 6% de gaps em relação à TMA, com e-value de 1e-145) .
Tabela 4 - Valores de energias de interação (em Kcal/mol) entre os ligantes e os resíduos conservados (W56, W57, Y60) entre as alfa- amilases de insetos e mamíferos, soma das energias de interações estabelecidas entre os ligantes e os três resíduos especificados e valores de Mol- dock score (energia total do ligante), Protein (total energia de interação do ligante com a proteína) e Hbond (energia decorrente de interações de Hidrogénio) fornecidos pelo Molegro Virtual Docker (Thomsen R, Christensen, MH., MolDock: a new technique for high-accuracy molecular docking. J Med Chem. 2006 Jun 1 ;49(1 1):3315-21), no módulo Ligand Energy Inspector. Estes resultados foram obtidos da simulação de docking dos ligantes desenhados com o espaço de busca centralizado no sítio catalítico da TMA. Para o desenho das novas moléculas foram especialmente consideradas as interações com os resíduos especificados. A soma das energias de interação entre os ligantes e esses resíduos foi o primeiro parâmetro de avaliação para exclusão e modificação das estruturas dos novos compostos. O segundo parâmetro utilizado foi o MolDock score. Também foram consideradas as energias de interação com proteína e de ligação de hidrogénio. Observa-se então os valores de energia total entre esses resíduos e os ligantes dese- nhados se comparados aos valores encontrados no docking dos inibidores, são menores ou iguais, o que sugere que a ligação dos ligantes desenhados a esses resíduos pode ser mais estável.
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Tabela 5- Valores fornecidos pelo docking dos ligantes desenhados com espaço de busca centralizado no sítio catalítico da alfa-amilase pancreática suína (PPA, 2HX0.pdb), conforme padrão da tabela 4. Foi feito um docking com essa enzima a fim de verificar se os ligantes desenhados também poderiam se ligar às enzimas de mamíferos. Nesse docking observa-se que os valores de MolDock score e Protein são menores do que os obtidos em docking com a TMA, no entanto, esses valores são decorrentes do formato mais fechado do sítio alvo da PPA, enquanto que na TMA o sítio alvo é mais aberto e, em alguns pontos do sítio, há maior distância entre os resíduos da proteína e os ligantes. Porém, os valores das somas de energias dos três resíduos especificados (W58, W59, Y62) são mais próximos en- tre si no docking com a PPA, se comparados aos valores obtidos no docking com a TMA. A maior variação dos valores de soma dos resíduos no docking com a TMA (entre -11 e -77 kcal/mol) indica maior variação de afinidade com essa enzima, enquanto que os valores obtidos no docking com a PPA (entre -55 e -66 kcal/mol) indicam afinidade muito parecida entre a proteína e os vários ligantes na simulação. Alguns ligantes desenhados (como o T3 e T3B) apresentaram diferenças maiores que 10 kcal/mol na soma das energias dos três resíduos citados, comparando-se as simulações com a TMA e a PPA, indicando maior afinidade com os três resíduos da TMA. Também foi obser- vado durante a realização do docking que os ligantes apresentaram "poses" com posição menos coerente, provavelmente devido aos resíduos vizinhos ao sítio ligante que podem produzir algum impedimento no acesso ao sítio ligante.
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Apesar dos valores maiores de "MolDock score" e "Protein" no docking com a PPA, a contribuição da soma de energias dos 3 resíduos considerados é proporcionalmente menor. Os cinco ligantes (A1 , malt002, trip005, T3, T3B) mostrados na tabela são aqueles com melhores resultados dentre os ligantes de mesma série. São também mostrados os ligantes com propriedades inibitórias conhecidas (acarbose, acarviosina-glicose e isoa- carbose) e a maltose, fragmento do substrato natural. Observa-se que no docking com a PPA todos os ligantes apresentaram valores mais aproximados na soma de energias dos resíduos especificados, do que no docking com a TMA, onde há uma maior diferença nos valores, indicando que alguns dos ligantes desenhados apresentam melhor afinidade teórica com esses resíduos. Não apenas os valores numéricos foram considerados para avaliação de cada ligante como também foi considerada a coerência das posições adotadas pelas "poses" no sítio ligante, pois muitas vezes um ligante possui várias "poses" cujas posições são muito divergentes, sugerindo pouca esta- bilidade da molécula no sítio. O ligante T3B, por exemplo, apesar dos valores de "MolDock score" e "Protein" serem melhores para a PPA, apresentou melhores "poses" no docking com a TMA (Figura 10A e 10B). Vale acrescentar, que o mesmo comportamento se repetiu nos docking com os outros li- gantes devido às diferenças nos arredores do sítio alvo das enzimas ilustradas na Figura 4. Este é um ponto importante a se avaliar no docking já que o MolDock é um algoritmo baseado na evolução dos ligantes que elimina a cada rodada os piores candidatos, ou seja, no final do docking restam apenas as "poses" com melhores energias de interação e melhor posicionamen- to no sítio indicado no programa. Nos dockings com inibidores conhecidos, observou-se que a maior parte das "poses" adotavam posição e conformação muito similares entre si no sítio ligante, por isso esse critério de avaliação foi adotado para a seleção de ligantes.
As estruturas desenhadas apresentam propostas de novos can- didatos a fármacos contra a ação de insetos que atacam estoques de grãos. Apresentam também uma alternativa aos atuais inibidores de alfa-amilases que são obtidos através do cultivo microbiano e então purificados. Sabendo- se que a produção por meio de síntese química é mais barata do que a aplicada por biotecnologia, o presente trabalho oferece produtos com potencial alternativa para diminuição de custos na produção de inibidores alfa- amilases.
Exemplo 5 - Análise de parâmetros de Absorção, Distribuição, Metabolismo, Excreção e Toxicidade (ADMET)
Considerando que os compostos serão para uso agrícola e seus resíduos poderão ser consumidos por humanos e animais, em sua aplicação deve-se evitar o contato com os alimentos já que possuem potencial atividade contra as enzimas de mamíferos. Isso pode ser feito com o uso de iscas de depósitos isolados do inseticida. Também é fundamental que o desenho de novos compostos seja analisado em relação ao potencial de risco de produção de efeitos indesejáveis. Pensando nisso, foi feita predição de parâmetros moleculares que influenciam na Absorção, Distribuição, Metabolismo, Excreção e Toxicidade (ADMET) utilizando-se o Osiris Property Explorer (Thomas Sander, Actelion Pharmaceuticals Ltd., http://www.organic-chernistry.org/prog/peo/). Essa ferramenta permite analisar cLogP, solubilidade em água, peso molecular e riscos de toxicidade; além disso, fornece dois parâmetros: Druglikeness e Drug-score. O Druglikeness baseia-se na comparação do composto dese- nhado com compostos de base de dados de compostos comercializados e de base de dados de compostos sem propriedades farmacológicas (Fluka). O Drug-score fornece um valor geral que considera todos os parâmetros anteriores. Os resultados da análise constam na Tabela 6. Como não é interessante que os compostos sejam absorvidos pelo trato gastrointestinal dos consumidores, valores menores de cLogP são desejáveis. O Osíris fornece dados de toxicidade animal tais como risco de mutagenicidade, tumorogeni- cidade, efeito reprodutivo e irritação baseado em fragmentos moleculares com toxicidades conhecidas armazenadas em base de dados (RTECS).
Tabela 6 - Resultados da análise de ADMET, feita pelo progra- ma Osiris Property Explorer (http://www.organic-chemistrv.org/prog/peo/) com os dados de risco de toxicidade tais como mutagenicidade, tumorgeni- cidade, irritabilidade e eventuais efeitos colaterais reprodutivos, baseados em fragmentos de moléculas conhecidas depositados no banco de dados RTECS. Este programa fornece um valor de LogP, o coeficiente de partição entre água e n-octanol, que mede a hidrofobicidade (quanto maior o valor, maior a solubilidade do composto em lipídeos). No caso das plantas e tra- tando-se de um composto de uso superficial (não precisa ser absorvido para agir), ter um LogP baixo pode ser algo positivo pois será menos absorvido e menos distribuído em tecidos animais. O programa também fornece um va- lor de LogS (solubilidade), parâmetro que descreve tanto absorção e distribuição, cujo valor deve ser maior que -4, baseado no LogS médio dos medicamentos comercializados. E, por fim, o programa ainda fornece o Drug- score que é um valor geral resultante da combinação de todos os parâmetros anteriores mais o Druglikeness, que compara fragmentos do composto desenhado com base de dados de compostos comercializados e com base de dados de compostos que não servem como fármacos (Fluka). É desejável que tanto Druglikeness quanto o Drug-score sejam positivos.
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Como pode ser observado na Tabela 6, nenhum dos 4 melhores ligantes desenhados apresentaram risco de efeito grave na análise do AD- MET. Isso provavelmente se deve às características dos grupos "Rs" empregados e núcleos desenhados, que se baseiam em estruturas conhecidamente inócuas ao organismo humano. O efeito irritante provavelmente deve-se ao grande número de átomos de Oxigénio presentes nas estruturas (hidroxi- las, principalmente). As estruturas que não apresentam efeito irritante são muito menores do que as outras e possuem, portanto, menos átomos de Oxigénio. No entanto, os átomos de Oxigénio em grande quantidade são necessários para realizar as várias interações de hidrogénio com os resíduos do sítio ligante e do sítio catalítico de forma a mimetizar as interações feitas pelo substrato natural e os inibidores existentes, que também possuem estrutura polissacarídica.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1 - Método para desenhar computacionalmente novos compostos com potencial função inibitória das enzimas alfa-amilases caracterizado pelas seguintes etapas: (i) obter arquivos de coordenadas referentes as es- truturas tridimensionais, a partir do banco PDB, da estrutura da alfa-amilase de interesse; (ii) fazer busca por sequências homólogas à estrutura primária da enzima de interesse usando o BLASTp contra o banco de dados de sequências primárias do PDB e NR ("non-reduntant protein sequences") do NCBI; (iii) alinhar a enzima de interesse às estruturas de outras alfa- amilases depositadas no PDB para análise da sobreposição das estruturas terciárias e para analisar os desvios (RMSD - "root-mean-square deviation") e TM-score; (iv) visualizar as estruturas terciárias através do PyMol para a- nálise da sobreposição das estruturas terciárias; (v) fazer alinhamentos entre a estrutura primária de proteínas homólogas à proteína de interesse através do programa ClustalW 2.0 e incluir proteínas de outros organismos, evidenciando as similaridades e diferenças entre estes dois conjuntos de proteínas e buscando as correspondências no alinhamento de estrutura primária dos resíduos importantes; (vi) buscar estruturas de compostos no PubChem por similaridade maior que 90% com o ligante natural (amilose) e proceder simu- lações de docking empregando o programa Molegro Virtual Docker (MVD), ou alternativamente outro programa com a mesma função, tais como: DOCK, AUTODOCK, GOLD, FLEXX, ZDOCK, M-ZDOCK, MS-DOCK, Sur- flex, MCDOCK, MolDock, GemDock, entre outros; (vii) analisar detalhadamente o nano-ambiente do sitio alvo usando-se o programa STING Java Protein Dossier e a ferramenta "select" determinando o conjuntos de parâmetros físico-químicos e estruturais que descrevem o nano-ambiente que é composto pelos resíduos que compõem o sítio-alvo, no qual se espera que os ligantes atraquem; (viii) modificar as estruturas selecionadas no item (vi) de acordo com as características físico-químicas e estruturais encontradas no item (vii) a fim de aumentar os valores de afinidade de ligação através de alterações computacionais nos compostos através do programa ChemBio- Draw no qual também são feitas minimização de energia e dinâmica das es- truturas de ligantes desenhadas; (ix) adicionalmente às busca por ligantes baseados na estrutura de amilose no PubChem, também deve ser feita busca por ligantes baseados na estrutura dos inibidores naturais aplicando-se os passos de docking e modificações estruturais a esses ligantes; e (x) reali- zar predição de parâmetros moleculares que interferem na Absorção, Distribuição, Metabolismo, Excreção e Toxicidade utilizando a ferramenta online Osíris Property Explorer.
2 - Método de inibição ou inativação da enzima alfa-amilase por meio de ligação parcial ou total de inibidor desenvolvido de acordo com a reivindicação 1 ;
3 - Método de prevenção ou tratamento contra organismos que utilizam as enzimas enzimas alfa-amilases para obter glicose utilizando-se compostos desenvolvidos de acordo com a reivindicação 2;
4 - Método de prevenção ou tratamento de acordo com a reivin- dicação 3, onde esses organismos sejam insetos;
5 - Método para desenhar computacionalmente novos compostos empregado no tratamento de Dibetes Melitus tipo 2, e/ou outras doenças glicêmicas, em mamíferos caracterizado pelas seguintes etapas: (i) obter arquivos de coordenadas referentes as estruturas tridimensionais, a partir do banco PDB, da estrutura da alfa-amilase de interesse; (ii) fazer busca por sequências homólogas à estrutura primária da enzima de interesse usando o BLASTp contra o banco de dados de sequências primárias do PDB e NR ("non-reduntant protein sequences") do NCBI; (iii) alinhar a enzima de interesse às estruturas de outras alfa-amilases depositadas no PDB para análise da sobreposição das estruturas terciárias e para analisar os desvios (RMSD - "root-mean-square deviation") e TM-score; (iv) visualizar as estruturas terciárias através do PyMol para análise da sobreposição das estruturas terciárias; (v) fazer alinhamentos entre a estrutura primária de proteínas homólogas à proteína de interesse através do programa ClustalW 2.0 e incluir prote- ínas de outros organismos, evidenciando as similaridades e diferenças entre estes dois conjuntos de proteínas e buscando as correspondências no alinhamento de estrutura primária dos resíduos importantes; (vi) buscar estru- turas de compostos no PubChem por similaridade maior que 90% com o li- gante natural (amilose) e proceder simulações de docking empregando o programa Molegro Virtual Docker (MVD), ou alternativamente outro programa com a mesma função, tais como: DOCK, AUTODOCK, GOLD, FLEXX, ZDOCK, M-ZDOCK, MS-DOCK, Surflex, MCDOCK, MolDock, GemDock, entre outros; (vii) analisar detalhadamente o nano-ambiente do sitio alvo u- sando-se o programa STING Java Protein Dossier e a ferramenta "select" determinando o conjuntos de parâmetros físico-químicos e estruturais que descrevem o nano-ambiente que é composto pelos resíduos que compõem o sítio-alvo, no qual se espera que os ligantes atraquem; (viii) modificar as estruturas selecionadas no item (vi) de acordo com as características físico- químicas e estruturais encontradas no item (vii) a fim de aumentar os valores de afinidade de ligação através de alterações computacionais nos compostos através do programa ChemBioDraw no qual também são feitas minimi- zação de energia e dinâmica das estruturas de ligantes desenhadas; (ix) a- dicionalmente às busca por ligantes baseados na estrutura de amilose no PubChem, também deve ser feita busca por ligantes baseados na estrutura dos inibidores naturais aplicando-se os passos de docking e modificações estruturais a esses ligantes; e (x) realizar predição de parâmetros molecula- res que interferem na Absorção, Distribuição, Metabolismo, Excreção e Toxicidade utilizando a ferramenta online Osiris Property Explorer.
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