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WO2013105612A1 - 血中の目的細胞の定量方法および該細胞を定量するシステムの評価方法 - Google Patents

血中の目的細胞の定量方法および該細胞を定量するシステムの評価方法 Download PDF

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WO2013105612A1
WO2013105612A1 PCT/JP2013/050329 JP2013050329W WO2013105612A1 WO 2013105612 A1 WO2013105612 A1 WO 2013105612A1 JP 2013050329 W JP2013050329 W JP 2013050329W WO 2013105612 A1 WO2013105612 A1 WO 2013105612A1
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WO
WIPO (PCT)
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cells
resin particles
specific gravity
red blood
blood
Prior art date
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Ceased
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PCT/JP2013/050329
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English (en)
French (fr)
Inventor
淳吾 荒木
恒子 千代田
幸司 宮崎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Konica Minolta Inc
Original Assignee
Konica Minolta Inc
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Publication date
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Application filed by Konica Minolta Inc filed Critical Konica Minolta Inc
Priority to JP2013524294A priority patent/JP5348357B1/ja
Priority to EP13736058.2A priority patent/EP2803998B1/en
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N33/56966—Animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • G01N15/042—Investigating sedimentation of particle suspensions by centrifuging and investigating centrifugates
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    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N2015/1486—Counting the particles

Definitions

  • the present invention relates to a method for quantifying target cells such as circulating cancer cells [CTC] in the blood that may be contained in a blood-derived specimen, a method for evaluating the authenticity of a system for quantifying the target cells, and these quantifications.
  • the present invention relates to a kit used for each of the method and the evaluation method.
  • Circulating cancer cells in the blood [CTC], circulating stem cells, circulating endothelial cells, etc. are cells that are very rarely present in whole blood depending on the pathological condition. Although it is obvious that the detection of these rare cells is clinically useful, it is still difficult to detect all the rare cells from a whole blood sample.
  • the separation medium containing Ficoll or the like varies in density depending on the surrounding environment (for example, temperature), and may not be separated as expected and impair the reliability of the detection result. Further, in processes other than separation, there is a risk that reliability may be lowered due to an error in measurement of the number of rare cells due to overestimation of the number of rare cells due to loss and oversight of adjustment due to deterioration of the detection device over time.
  • the stabilized cells described in Patent Document 1 as an internal control in a method for isolating and identifying rare cells.
  • these stabilized cells can be produced, for example, by fixing the breast cancer cell line SKBR-3 with paraformaldehyde after fluorescent labeling.
  • the stabilized cells for internal control may be unable to be separated as expected due to a large deviation from the specific gravity distribution of the rare cells because the living cells are specially treated.
  • target cells such as circulating blood cancer cells [CTC] that may be contained in a blood-derived specimen are separated from the blood-derived specimen and quantified, the period between immediately after blood collection and until separation. Enables accurate quantification without quantifying the number of cells because the target cell was lost in the process, or because the adjustment of the device that detects the target cell is not accurate.
  • Another object of the present invention is to provide a method for quantifying a target cell and a method for evaluating a quantifying system.
  • the present inventors separate target cells (for example, CTC) that may be contained from blood-derived specimens by density gradient centrifugation using a separation liquid having a specific gravity (for example, Ficoll having a specific gravity of 1.077).
  • a separation liquid having a specific gravity for example, Ficoll having a specific gravity of 1.077.
  • the quantification method of the present invention is a method for quantifying a target cell having a specific gravity greater than the specific gravity of plasma but smaller than the specific gravity of erythrocytes, which may be contained in a blood-derived specimen. It includes the steps (C) to (C).
  • a blood-derived specimen containing a known number (P 0) of resin particles P having a specific gravity greater than that of plasma but less than that of red blood cells is analyzed by density gradient centrifugation and a layer containing a large amount of red blood cells and red blood cells Separating at least two layers with a layer rich in cells other than (B) extracting a layer containing many cells other than erythrocytes and measuring the number of the target cells and the number of the resin particles (P1) contained in the layer; and (C) the number of the target cells. Calibrating the number of target cells by multiplying by P0 / P1.
  • the resin particles P are preferably formed from a water-insoluble resin and labeled with an optically detectable dye Da.
  • the resin particles P preferably have a specific gravity of 1.040 to 1.085, more preferably 1.040 to 1.077.
  • the target cell is preferably at least one rare cell selected from the group consisting of circulating tumor cells [CTC], circulating stem cells, and circulating endothelial cells.
  • CTC circulating tumor cells
  • stem cells circulating stem cells
  • endothelial cells circulating endothelial cells
  • the evaluation method of the present invention is a method for evaluating the credibility of a system for quantifying target cells having a specific gravity greater than that of plasma but less than that of red blood cells, which may be contained in a blood-derived specimen.
  • the method includes the following steps (a) to (d).
  • (a) Contains a known number (P0) of resin particles P having a specific gravity greater than that of plasma but less than that of red blood cells, and a known number (N0) of resin particles N having a specific gravity of 1.090 to 1.120. Separating the blood-derived specimen into at least two layers of a layer containing a large amount of red blood cells and a layer containing a large amount of cells other than red blood cells by density gradient centrifugation; (b) extracting a layer containing many cells other than erythrocytes and measuring the number of resin particles P (P1) and the number of resin particles N (N1) contained in the layer; (c) calculating (P1 / P0) ⁇ 100 and comparing with a predetermined reference value to evaluate how well the entire system functions; and (d) calculating N1 / P1; A step of comparing with a predetermined reference value and evaluating how much the layers are separated by the density gradient centrifugation.
  • the resin particles P and the target cells can be the same as the resin particles P and the target cells in the quantification method of the present invention.
  • the resin particles N are preferably formed of a water-insoluble resin and labeled with an optically detectable dye Db having a different emission wavelength from the optically detectable dye Da.
  • the evaluation method of the present invention is (e) Preferably, the method further includes a step of measuring a light emission signal derived from the P1 resin particles P or N1 resin particles N and calibrating the light emission signal detection device.
  • kits of the present invention A known number of the resin particles P, a kit for use in the quantification method of the present invention, and It has a known number of each of the resin particles P and the resin particles N, and includes a kit for use in the evaluation method of the present invention.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a blood-derived specimen before and after applying a density gradient centrifugation method.
  • the quantification method of the present invention is a method for quantifying a target cell having a specific gravity greater than that of plasma but less than that of erythrocytes, which may be contained in a blood-derived specimen, and comprises the following (A) to (A): C) is included.
  • a blood-derived specimen containing a known number (P 0) of resin particles P having a specific gravity greater than that of plasma but less than that of red blood cells is analyzed by density gradient centrifugation and a layer containing a large amount of red blood cells and red blood cells Separating at least two layers with a layer rich in cells other than (B) extracting a layer containing many cells other than erythrocytes and measuring the number of the target cells and the number of the resin particles (P1) contained in the layer; and (C) the number of the target cells. Calibrating the number of target cells by multiplying by P0 / P1.
  • the “target cell” refers to a cell to be quantified by the quantification method according to the present invention.
  • step (A) a blood-derived specimen containing a known number (P 0) of resin particles P having a specific gravity larger than that of plasma but smaller than that of red blood cells contains a large amount of red blood cells by density gradient centrifugation.
  • P 0 a known number of resin particles P having a specific gravity larger than that of plasma but smaller than that of red blood cells.
  • the resin particle P functions as an internal standard of the target cell, as will be described later in the section “Resin Particle P”.
  • a blood-derived specimen (2) containing P0 resin particles P (3) having a specific gravity larger than that of plasma but smaller than that of red blood cells.
  • P0 for example, 10 in FIG. 1
  • resin particles P (3) having a specific gravity larger than that of plasma but smaller than that of red blood cells when density gradient centrifugation is carried out using the specific gravity solution (1), the layer containing a large amount of red blood cells, one of the cells with the highest specific gravity (4) ) And a layer (5) containing many cells other than red blood cells.
  • examples of “cells other than red blood cells” include target cells such as platelets, white blood cells, and CTCs.
  • the density gradient centrifugation method used in the present invention those described in the section of “Density Gradient Centrifugation” can be used, and as the specific gravity liquid (1), “Density Gradient Centrifugation” described below.
  • the separation liquid or the separation medium described in the section can be used.
  • Step (A) is performed by placing a blood-derived specimen (2) containing a known number (P0) of resin particles P (3) having a specific gravity smaller than that of erythrocytes and performing centrifugation on this. It can be performed.
  • the contents of the centrifuge tube are divided into a layer (4) containing a large amount of red blood cells, a specific gravity liquid (1), red blood cells, depending on the density gradient, as shown in the right half of FIG. It is separated into a layer (5) containing many cells other than.
  • Step (B) is a step of extracting a layer containing many cells other than red blood cells and measuring the number of target cells and the number of resin particles P (P1) contained in this layer.
  • the number of resin particles P (P1) as well as the number of target cells is measured by the resin particles P added to the blood-derived specimen. Based on the ratio of the number of resin particles P (P1) confirmed in the “layer containing many cells other than red blood cells” to the number (P1), it may be contained in the blood-derived specimen This is to estimate the number of target cells having sex.
  • step (B) “target layer (5) containing many cells other than erythrocytes” is extracted from the target cells that may be contained in the blood-derived specimen (2).
  • the layer (5) contains P1 resin particles P (3) (for example, 8 particles in FIG. 1).
  • Step (C) is a step of calibrating the number of target cells by multiplying the number of target cells measured in step (B) by P0 / P1.
  • the target cell is contained in the “layer (5) containing many cells other than red blood cells” obtained by applying density gradient centrifugation to a blood-derived specimen containing T0 target cells plus P0 resin particles P.
  • the ratio of T1 to T0 and the ratio of P1 to P0 are equal to each other.
  • T1 / T0 P1 / P0 It can be considered that the relationship is satisfied.
  • the number of target cells contained in the blood-derived specimen (2) can be quantified more accurately by calibrating the number of target cells contained in the layer (5).
  • the specific gravity of the resin particles P is preferably close to the specific gravity of the target cell, and more preferably equal to the specific gravity of the target cell, based on the principle of using density gradient centrifugation.
  • each component in the blood-derived specimen is separated according to its specific gravity. Therefore, in the present invention, the closer the specific gravity of the resin particles P is to the specific gravity of the target cell, the closer to the target cell. It becomes possible to carry out quantitative determination of this more accurately.
  • the specific gravity of the specific gravity liquid is preferably larger than the specific gravity of the resin particles P and the target cells and smaller than the specific gravity of the red blood cells so that the resin particles P and the target cells can be sufficiently separated from the red blood cells.
  • blood-derived specimens used in the present invention include blood itself and other body fluids or those diluted with an appropriate buffer solution (that is, body fluid or diluted body fluid), tissue-derived cells, cultured cells, and the like. Examples include turbid liquids.
  • preferable “blood-derived specimens” include blood and those diluted with an appropriate diluent commonly used in the field of the present invention, such as a buffer solution, that is, blood and diluted blood.
  • Target cells that may be contained in blood-derived specimens to be quantified in the present invention are larger than the specific gravity of plasma (1.025 to 1.029) but smaller than the specific gravity of red blood cells (1.090 to 1.120).
  • a “target cell” is preferably at least one kind of rare cell selected from the group consisting of circulating tumor cells [CTC], circulating stem cells and circulating endothelial cells, and particularly preferably CTC. .
  • the resin particles P used in the present invention are used as an internal control for target cells, and have a specific gravity greater than that of plasma but less than that of red blood cells, preferably 1.040 or more and 1.085 or less, more preferably 1.040 or more and 1.077 or less. Has a specific gravity. Alternatively, it preferably has a specific gravity of 1.040 or more and a specific gravity of a separation medium used in density gradient centrifugation.
  • the resin particles P have a substantially spherical shape that is not less than a size that can maintain a suspended state in a blood-derived specimen and is not more than about 100 ⁇ m, and specifically has an average particle size of about 0.2 to 20 ⁇ m. It is preferable.
  • the resin particles P are preferably formed from a water-insoluble resin and have a property of not forming an aggregate.
  • a resin examples include polystyrene, polymethyl methacrylate, polyvinyl toluene, and polyacrylate, but the present invention is not limited to these.
  • the resin particles P are preferably labeled with an optically detectable dye Da so that the number can be easily measured in the step (B) and the following step (b) in the evaluation method described later.
  • the dye Da used sometimes is more preferably a fluorescent dye.
  • the labeling with the dye Da may be carried out in a mode in which it is bound or adhered to the particle surface, or may be carried out in a mode in which it is kneaded inside the particle.
  • the number of the resin particles P may be detected by autofluorescence of the resin itself without labeling with the dye Da. In such a case, the dye Da need not be introduced.
  • fluorescent dye Da examples include various fluorescent dyes described in JP 2010-169519 A, such as fluorescein fluorescent dyes, rhodamine fluorescent dyes, cyanine fluorescent dyes, quinoxaline fluorescent dyes, other synthetic fluorescent dyes,
  • porphyrin pigments and phycobilin pigments which are pigments derived from living bodies are also included.
  • phycoerythrin (PE) is mentioned as an example of a phycobilin pigment.
  • the resin particles P using a water-insoluble resin or a resin emitting autofluorescence can be manufactured using various known methods.
  • resin particles P commercially available products such as polystyrene particles (specific gravity 1.050; average particle diameter 20 ⁇ m) manufactured by Spherotech can be used, and if the specific gravity can be adjusted, JP-A-4-252957
  • the fluorescent microparticles described in 1) can also be used.
  • a conventional density gradient centrifugation method of the present invention can be used as appropriate.
  • the separation liquid or the separation medium used in the density gradient centrifugation include commercially available Ficoll, Percoll (both are registered trademarks of GE Healthcare Japan Co., Ltd.) or sucrose solution.
  • the separation liquid or the separation medium has a specific gravity capable of separating the red blood cells contained in the cell and other cells and can be adjusted to an osmotic pressure and pH without destroying the cells, the present invention is limited to these. Not.
  • two or more kinds of separation liquids or separation media having different specific gravities can be used in combination.
  • suitable dyes that can be used for labeling target cells include various fluorescent dyes in the above-mentioned section “Resin Particle P”.
  • the excitation wavelength may be the same as long as the emission wavelength of the dye used for labeling the resin particle P or the fluorescence of the resin particle P itself and the dye used for labeling the target cell are different from each other, Or they may be different from each other.
  • Suitable methods include labeling using an antigen-antibody reaction with an antibody labeled with an appropriate dye. A method is mentioned.
  • a dye having a reactive functional group capable of binding to the functional group is used as the dye.
  • the dye may be introduced into the target cell through various chemical bonds such as a covalent bond and a hydrogen bond.
  • the target cell number can be measured based on the fluorescence of the target cell itself without labeling the target cell with a dye. Good.
  • a method for measuring the number of target cells various conventionally known methods can be used.
  • a preferred example of such a method is a method in which a liquid containing a target cell or the like is spread on a plane, the plane is scanned two-dimensionally to detect and count fluorescence derived from the target cell.
  • Such a method may be a method of counting under a fluorescence microscope.
  • a liquid containing target cells is spread on an appropriate plane such as a dish for cell culture, and this plane is scanned two-dimensionally.
  • the fluorescence derived from the target cell can be counted.
  • the measurement of the number of target cells is not limited to that performed by a method of counting under a fluorescence microscope.
  • an appropriate photoelectric conversion element such as a photomultiplier tube is scanned two-dimensionally on the plane irradiated with appropriate excitation light, and the location of the target cell is evaluated based on the intensity and position of fluorescence.
  • the number of target cells may be measured based on the above.
  • a fluorescent image is obtained by photographing the plane irradiated with appropriate excitation light through a conventionally known image sensor in which a plurality of image sensors are arranged in a row or two-dimensionally.
  • the number of target cells may be measured by counting the number of distributed fluorescence.
  • the number of target cells can be measured by the method.
  • the emission wavelength of the dye used for labeling the resin particle P or the fluorescence of the resin particle P itself, the dye used for labeling the resin particle N or the resin particle N itself, and the dye used for labeling the target cell are the same.
  • the excitation wavelengths may be the same or different from each other.
  • the measurement of the number of target cells, the measurement of the number of resin particles P, and the measurement of the number of resin particles N may be performed simultaneously or separately.
  • the means for performing these measurements may be the same or may be different from each other.
  • these measurements may all be performed using excitation light having the same wavelength.
  • excitation light having different wavelengths may be used.
  • the evaluation method of the present invention is a method for evaluating the credibility of a system for quantifying target cells having a specific gravity greater than that of plasma but less than that of red blood cells, which may be contained in a blood-derived specimen.
  • the method includes the following steps (a) to (d).
  • (a) Contains a known number (P0) of resin particles P having a specific gravity greater than that of plasma but less than that of red blood cells, and a known number (N0) of resin particles N having a specific gravity of 1.090 to 1.120. Separating the blood-derived specimen into at least two layers of a layer containing a large amount of red blood cells and a layer containing a large amount of cells other than red blood cells by density gradient centrifugation; (b) extracting a layer containing many cells other than erythrocytes and measuring the number of resin particles P (P1) and the number of resin particles N (N1) contained in the layer; (c) calculating (P1 / P0) ⁇ 100 and comparing with a predetermined reference value to evaluate how well the entire system functions; and (d) calculating N1 / P1; A step of comparing with a predetermined reference value and evaluating how much the layers are separated by the density gradient centrifugation.
  • the evaluation method of the present invention is: (e) It is preferable to further include a step of measuring a light emission signal derived from P1 resin particles P or N1 resin particles N and calibrating the light emission signal detection device.
  • the “target cell” refers to a cell to be quantified by the “quantitative system” to be evaluated by the evaluation method of the present invention.
  • the resin particles N used in the present invention are used as an internal control of red blood cells, and have a specific gravity similar to that of red blood cells, that is, a specific gravity of 1.090 or more and 1.120 or less.
  • the resin particle N is preferably an optically detectable dye Db having a different emission wavelength from the optically detectable dye Da, and more preferably an optical having a different emission wavelength from the optically detectable dye Da. It is labeled with a fluorescent dye Db that can be detected.
  • the mode of labeling is the same as that of the resin particle P described above.
  • Examples of the fluorescent dye that can be used as the fluorescent dye Db include the same fluorescent dyes as those described above as the fluorescent dye Da.
  • the resin particles N are not less than a size that can maintain a suspended state in a blood-derived specimen and not more than about 100 ⁇ m, and specifically, an average particle diameter is preferably about 0.2 to 20 ⁇ m.
  • resin particles N commercially available products such as cross-linked polybutyl methacrylate true spherical fine particles (BM30X-5; specific gravity 1.100; average particle size 5 ⁇ m) manufactured by Sekisui Plastics Co., Ltd. can be used. If the specific gravity can be set to 1.090 or more and 1.120 or less, fluorescent fine particles described in JP-A-4-252957 can also be used.
  • BM30X-5 cross-linked polybutyl methacrylate true spherical fine particles
  • specific gravity can be set to 1.090 or more and 1.120 or less
  • fluorescent fine particles described in JP-A-4-252957 can also be used.
  • Step (a) In the step (a), a known number of resin particles P having a specific gravity greater than the specific gravity of plasma but smaller than the specific gravity of red blood cells (P0) and a known number of resin particles N having a specific gravity of 1.090 to 1.120 (N0).
  • This is a step of separating the contained blood-derived specimen into at least two layers of a layer containing a large amount of red blood cells and a layer containing a lot of cells other than red blood cells by density gradient centrifugation.
  • this step (a) a blood-derived specimen to which density gradient centrifugation is applied is added to a known number (P0) of resin particles P having a specific gravity greater than that of plasma but less than that of red blood cells. Further, it can be carried out by the same method as in the step (A) except that a known number (N0) of resin particles N having a specific gravity of 1.090 or more and 1.120 or less are added.
  • Step (b) is a step of extracting a layer containing many cells other than erythrocytes and measuring the number of resin particles P (P1) and the number of resin particles N (N1) contained in the layer. It is.
  • the measurement of the number of resin particles P and the number of resin particles N in this step (b) is the same as that described in the above section “Method for measuring the number of target cells or resin particles”. It can be done by a method.
  • step (b) measurement of the number of target cells may also be performed, and the measurement of the number of target cells at this time is also performed according to the above-mentioned method for measuring the number of target cells or the number of resin particles. It can carry out by the method similar to what was described in the term.
  • the “predetermined reference value” in step (c) can be appropriately set according to the system and is not particularly limited, but can be set as follows, for example.
  • Step (d) is a step of calculating N1 / P1 and comparing it with a predetermined reference value to evaluate how much the layers are separated by density gradient centrifugation.
  • the step (e) that can be optionally performed in the present invention is a step of measuring a luminescence signal derived from P1 resin particles P or N1 resin particles N and calibrating the luminescence signal detector.
  • the number of resin particles P or N (P1 or N1) can be measured by a flow cytometry method.
  • the measurement of the number of resin particles P or N in the step (e) is not limited to the flow cytometry method as long as the amount of luminescence can be measured. You may carry out by the said two-dimensional method as described in the term of the method of measuring the number or the number of resin particles.
  • the evaluation method of the present invention preferably further includes this step (e).
  • a kit for use in the quantification method of the present invention has a known number of the resin particles P, and a kit for use in the evaluation method of the present invention comprises the resin particles P and the resin particles N. Each of them has a known number.
  • kits include, in addition to the resin particles P or the resin particles P and the resin particles N, for example, a diluent, a buffer solution, and a density for diluting blood used in the quantification method and the evaluation method of the present invention.
  • a diluent for example, a diluent, a buffer solution, and a density for diluting blood used in the quantification method and the evaluation method of the present invention.
  • Separation media used in gradient centrifugation antibodies bound with fluorescent dyes for fluorescent labeling of target cells, as well as instruction manuals, flow cytometers and fluorescence microscopes, for processing numerical values obtained using these instruments Computers can also be included.
  • predetermined reference value In the following examples, the “predetermined reference value” is defined as follows.
  • step (c) 90-100%: The system is functioning well.
  • step (d) Less than 0.005: Isolation by density gradient centrifugation has no major problems.
  • FICP-80-2 manufactured by Spherotech specific gravity: 1.050
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • PE-labeled antibody Anti EpCAM (Becton Dickinson) was added, and only the cultured cells were stained with PE.
  • the fluorescence signal is measured by suspending the suspension in a 35 mm cell culture dish, allowing it to stand for several minutes, and then fluorescing the entire dish using a fluorescence inverted microscope (carl zeiss Observer D1). This was done by taking an image and determining the number of beads.
  • Extract about 1.2 mL of supernatant containing cultured cells, further centrifuge at 400 ⁇ g for 40 minutes, reduce the volume to 1 mL, collect 1/10 volume ( 100 ⁇ L) of the cell culture dish Developed on a plane.
  • Comparative Example 1 In Comparative Example 1, CTC was quantified using stabilized cells as an internal reference instead of the resin particles P.
  • Example 1 100 mL of cultured cells similar to Example 1 as a CTC model and 100 mL of cultured cells similar to Example 1 subjected to special treatment (paraformaldehyde treatment and FITC staining) as internal control particles 2 mL of whole blood After adding and mixing, density gradient centrifugation was carried out in the same manner as in Example 1.
  • special treatment paraformaldehyde treatment and FITC staining
  • the supernatant containing cultured cells was extracted, spread on a flat surface, and a fluorescent dye (Alexa Fluor 647) was added to stain only the cultured cells.
  • 20 FITC labels ie, density gradient

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Description

血中の目的細胞の定量方法および該細胞を定量するシステムの評価方法
　本発明は、血液由来検体に含有されている可能性のある血中循環癌細胞〔ＣＴＣ〕等の目的細胞を定量する方法および該目的細胞を定量するシステムの信憑性を評価する方法ならびにこれら定量方法と評価方法のそれぞれに用いるキットに関する。
　血中循環癌細胞〔ＣＴＣ〕，循環幹細胞，循環内皮細胞など（まとめて以下「希少細胞」ともいう。）は、病態に応じて全血中に極めて稀に存在する細胞である。これら希少細胞の検出は臨床的に有用であることは自明であるが、全血サンプルからすべての希少細胞を検出することは未だに困難である。
　近年、様々な細胞分離手法を応用して希少細胞の検出が試みられ、製品化されているが、いずれにおいても対象の希少性が故、検出結果の有効性（希少細胞のロスや不要細胞の混入の有無）や保証手段が重要であると考えられている。
　一方、光学検出機器の検出速度向上に伴い、希少細胞を白血球とともに、密度勾配遠心法などのような比重分離法により分離後、すべての細胞を検出する手法が提案されている（図2）。これは、フィコール（ＧＥヘルスケア・ジャパン(株)の登録商標）等特定の比重を有する重合体の溶液（すなわち分離媒体）を使用し、分離媒体を境にして赤血球群を下層に、希少細胞と白血球群とを上層に分離し、抽出された希少細胞と白血球とを光学検出機器によりスキャンすることによって、その中に含まれている希少細胞を同定する手法である。
　しかしながら、フィコールなどを含む分離媒体は周囲の環境（例えば温度）に依存して密度にばらつきを生じ、期待通りの分離がなされず検出結果の信頼性を損なう場合がある。また、分離以外の工程において、ロスに起因する希少細胞数の過小評価や、検出機器の経時劣化による調整のズレ等を見落とし、希少細胞数測定の誤差によって信頼性が低下する虞がある。
　そこで、特許文献1に記載の安定化細胞を、希少細胞を単離および同定する方法における内部対照として用いることが考えられている。この安定化細胞は、希少細胞をＣＴＣとする場合、安定化細胞は、例えば乳癌細胞系ＳＫＢＲ-3を蛍光標識後パラホルムアルデヒド等により固定化することによって製造することができる。
　しかしながら、内部対照用の安定化細胞は、生細胞に特殊な処理を施すことから、希少細胞の比重分布とのズレが大きくなり、想定したとおりに分離することができない場合がある。
特表２００４－５３４２１０号公報
　本発明は、血液由来検体に含有されている可能性のある血中循環癌細胞〔ＣＴＣ〕等の目的細胞を血液由来検体から分離し定量する際に、採血した直後から分離するまでの間の工程で目的細胞をロスしたため細胞数を少なく定量したり、あるいは、目的細胞を検出する機器の調整が正確でないため細胞数を誤って定量したりすることなく、正確に定量することを可能とする、目的細胞の定量方法および定量するシステムの評価方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、特定の比重を有する分離液（例えば比重1.077のフィコール）を用いた密度勾配遠心法により、血液由来検体から、含有されている可能性のある目的細胞（例えばＣＴＣ）を分離する際に、例えば比重1.050のポリスチレン製ビーズなどの樹脂粒子の既知数を血液由来検体に予め含有させておくと、該樹脂粒子がＣＴＣ数を定量する内部対照としてほぼ正確に作用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明の定量方法は、血液由来検体に含有されている可能性のある、血漿の比重より大きいが赤血球の比重より小さい比重を有する目的細胞を定量する方法であって、下記(Ａ)～(Ｃ)の工程を含むことを特徴とする。
　(Ａ) 血漿の比重より大きいが赤血球の比重より小さい比重を有する樹脂粒子Ｐを既知数個（Ｐ0個）含有させた血液由来検体を、密度勾配遠心法により、赤血球が多く含まれる層と赤血球以外の細胞が多く含まれる層との少なくとも二層に分離する工程；
　(Ｂ) 赤血球以外の細胞が多く含まれる層を抽出し、該層に含まれる該目的細胞の数および該樹脂粒子の数（Ｐ1個）を計測する工程；ならびに
　(Ｃ) 該目的細胞の数にＰ0／Ｐ1を乗じることによって、該目的細胞の数を校正する工程。
　上記樹脂粒子Ｐは、水不溶性の樹脂から形成され、且つ、光学的に検出可能な色素Ｄaによって標識されていることが好ましい。また上記樹脂粒子Ｐは、好ましくは1.040以上1.085以下、より好ましくは1.040以上1.077以下の比重を有する。
　上記目的細胞は、血中循環腫瘍細胞〔ＣＴＣ〕，循環幹細胞および循環内皮細胞からなる群から選択される少なくとも一種の希少細胞であることが好ましい。
　また、本発明の評価方法は、血液由来検体に含有されている可能性のある、血漿の比重より大きいが赤血球の比重より小さい比重を有する目的細胞を定量するシステムの信憑性を評価する方法であって、下記(a)～(d)の工程を含むことを特徴とする。
　(a) 血漿の比重より大きいが赤血球の比重より小さい比重を有する樹脂粒子Ｐを既知数個（Ｐ0個）とともに、1.090以上1.120以下の比重を有する樹脂粒子Ｎを既知数個（Ｎ0個）含有させた血液由来検体を、密度勾配遠心法により、赤血球が多く含まれる層と赤血球以外の細胞が多く含まれる層との少なくとも二層に分離する工程；
　(b) 赤血球以外の細胞が多く含まれる層を抽出し、該層に含まれる該樹脂粒子Ｐの数（Ｐ1個）と該樹脂粒子Ｎの数（Ｎ1個）とを計測する工程；
　(c) (Ｐ1／Ｐ0)×100を算出して、所定の基準値と比較し、該システム全体がどの程度機能しているかを評価する工程；ならびに
　(d) Ｎ1／Ｐ1を算出して、所定の基準値と比較し、該密度勾配遠心法によりどの程度層が分離しているかを評価する工程。
　このような本発明の評価方法において、上記樹脂粒子Ｐおよび上記目的細胞は、上記本発明の定量方法における樹脂粒子Ｐおよび目的細胞とそれぞれ同じものを用いることができる。
　上記樹脂粒子Ｎは、水不溶性の樹脂から形成され、且つ、光学的に検出可能な色素Ｄaとは発光波長の異なる光学的に検出可能な色素Ｄbによって標識されていることが好ましい。
　また、本発明の評価方法は、
　(e) Ｐ1個の該樹脂粒子ＰまたはＮ1個の該樹脂粒子Ｎに由来する発光シグナルを測定し、発光シグナル検出機器を校正する工程
をさらに含んでいることが好ましい。
　また、本発明のキットとして、
　上記樹脂粒子Ｐを既知数個有することを特徴とし、本発明の定量方法に用いるためのキット、および、
　上記樹脂粒子Ｐと上記樹脂粒子Ｎとをそれぞれ既知数個ずつ有することを特徴とし、本発明の評価方法に用いるためのキット
が挙げられる。
　本発明によれば、臨床検査等における各工程（特に密度勾配遠心分離工程）のエラーを検知することができ、目的細胞のロスを校正することができる。
図1は、密度勾配遠心法を適用する前後における血液由来検体の模式図を示す。
　以下、本発明の定量方法，評価方法およびキットについて具体的に説明する。
　　　　　　　　　　　　　　　　＜定量方法＞
　本発明の定量方法は、血液由来検体に含有されている可能性のある、血漿の比重より大きいが赤血球の比重より小さい比重を有する目的細胞を定量する方法であって、下記(Ａ)～(Ｃ)の工程を含むことを特徴とする。
　(Ａ) 血漿の比重より大きいが赤血球の比重より小さい比重を有する樹脂粒子Ｐを既知数個（Ｐ0個）含有させた血液由来検体を、密度勾配遠心法により、赤血球が多く含まれる層と赤血球以外の細胞が多く含まれる層との少なくとも二層に分離する工程；
　(Ｂ) 赤血球以外の細胞が多く含まれる層を抽出し、該層に含まれる該目的細胞の数および該樹脂粒子の数（Ｐ1個）を計測する工程；ならびに
　(Ｃ) 該目的細胞の数にＰ0／Ｐ1を乗じることによって、該目的細胞の数を校正する工程。
　ここで、本発明に係る定量方法において「目的細胞」とは、本発明に係る定量方法によって定量されるべき対象となる細胞を指す。
　図1を用いて、本発明の定量方法をさらに詳細に説明する。
　〔工程（Ａ）〕
　工程（Ａ）は、血漿の比重より大きいが赤血球の比重より小さい比重を有する樹脂粒子Ｐを既知数個（Ｐ0個）含有させた血液由来検体を、密度勾配遠心法により、赤血球が多く含まれる層と赤血球以外の細胞が多く含まれる層との少なくとも二層に分離する工程である。ここで、本発明において、樹脂粒子Ｐは、後記「樹脂粒子Ｐ」の項で後述するように、目的細胞の内部標準として機能する。
　図1を用いて説明すると、血漿の比重より大きいが赤血球の比重より小さい比重を有する樹脂粒子Ｐ(3)をＰ0個（例えば、図1中では10個）含有させた血液由来検体(2)に対して、比重液(1)を用いて密度勾配遠心法を実施すると、比重液(1)の層を境にして、最も比重の大きい細胞の一つである赤血球が多く含まれる層(4)と、赤血球以外の細胞が多く含まれる層(5)とに分離される。ここで、「赤血球以外の細胞」として、例えば、血小板や白血球、ＣＴＣ等の目的細胞が挙げられる。
　また、本発明で用いられる密度勾配遠心法として、後記「密度勾配遠心法」の項に記載したようなものを用いることができ、また、比重液(1)として、後記「密度勾配遠心法」の項に記載の分離液または分離媒体を用いることができる。
　具体的な手順としては、例えば、図1の左半分に示すように、遠心管に既知の比重を有する比重液(1)をいれ、この比重液(1)の上に、血漿の比重より大きいが赤血球の比重より小さい比重を有する樹脂粒子Ｐ(3)を既知数個（Ｐ0個）含有させた血液由来検体(2)を配置し、これに対して遠心分離を行うことにより工程（Ａ）を行うことができる。このような遠心分離により、遠心管の内容物は、図1の右半分に示したように、密度勾配に応じて、赤血球が多く含まれる層(4)と、比重液(1)と、赤血球以外の細胞が多く含まれる層(5)とに分離することになる。
　〔工程（Ｂ）〕
　工程（Ｂ）は、赤血球以外の細胞が多く含まれる層を抽出し、この層に含まれる目的細胞の数および樹脂粒子Ｐの数（Ｐ1個）を計測する工程である。
　ここで、「赤血球以外の細胞が多く含まれる層」について、目的細胞の数のみならず樹脂粒子Ｐの数（Ｐ1個）をも計測するのは、血液由来検体に加えられた樹脂粒子Ｐの数（Ｐ1個）の数に対する「赤血球以外の細胞が多く含まれる層」に確認された樹脂粒子Ｐの数（Ｐ1個）の数の比率をもとに、血液由来検体に含有されている可能性のある目的細胞の数を推測するためである。
　図1を用いて説明すると、工程（Ｂ）では、血液由来検体(2)に含有されている可能性のある目的細胞のうち「赤血球以外の細胞が多く含まれる層(5)」に抽出することができた細胞の数、および「赤血球以外の細胞が多く含まれる層(5)」に抽出することができた樹脂粒子Ｐ(3)の数を、従来公知の何らかの手段で計測することによって得ることができ、これにより、該層(5)には該樹脂粒子Ｐ(3)がＰ1個（例えば、図1中では8個）含有されていることがわかる。
　ここで、目的細胞の数および樹脂粒子Ｐの数（Ｐ1個）を計測する具体的な方法は、後記「目的細胞数または樹脂粒子数の計測方法」の項に記載してある。
　〔工程（Ｃ）〕
　工程（Ｃ）は、工程（Ｂ）によって計測された目的細胞の数にＰ0／Ｐ1を乗じることによって、該目的細胞の数を校正する工程である。
　例えば、目的細胞をＴ0個含む血液由来検体に樹脂粒子ＰをＰ0個加えたものに密度勾配遠心法を適用して得られた「赤血球以外の細胞が多く含まれる層(5)」に目的細胞がＴ1個および樹脂粒子ＰがＰ1個それぞれ含まれていることが確認できた場合、本発明によれば、Ｔ0に対するＴ1の割合と、Ｐ0に対するＰ1の割合とが等しい、すなわち、
　　Ｔ1／Ｔ0＝Ｐ1／Ｐ0
の関係を満たすと見なすことができる。そうすると、血液由来検体に含有されていた目的細胞の数Ｔ0を、
　　Ｔ0＝Ｔ1×（Ｐ0／Ｐ1）
と算出することができる。
　図1を用いて説明すると、該層(5)に含有される目的細胞の数（例えば8個とする。）に、Ｐ0／Ｐ1（例えば、図1では10／8となる。）を乗じると8個×10／8＝10個となる（工程(Ｃ)）。この結果から、元の血液由来検体(2)に含有されていた目的細胞の数を10個であると定量でき、この密度勾配遠心法によってロスした目的細胞の数は2個であると予想される。
　すなわち、本発明は、該層(5)に含有される目的細胞数を校正することによって、血液由来検体(2)に含有されていた目的細胞数をより正確に定量することができる。
　ここで、本発明においては、密度勾配遠心法を用いるという原理上、樹脂粒子Ｐの比重が、目的細胞の比重に近いことが好ましく、目的細胞の比重に等しいことがより好ましい。密度勾配遠心法によれば、血液由来検体中の各成分はその比重に応じて分離されることから、本発明においては、樹脂粒子Ｐの比重が目的細胞の比重に近ければ近いほど、目的細胞の定量をより正確に行うことが可能となる。また、樹脂粒子Ｐおよび目的細胞と、赤血球との分離を充分に行うことができるよう、比重液の比重は、樹脂粒子Ｐおよび目的細胞の比重より大きく、赤血球の比重より小さいことが好ましい。血液由来検体中の各成分および樹脂粒子Ｐの比重の大きさとして、特に好ましくは、血漿＜血小板＜白血球および目的細胞＝樹脂粒子Ｐ＜比重液＜赤血球、という関係になっている。
　〔血液由来検体〕
　本発明で用いる血液由来検体としては、例えば、血液そのものやその他の体液もしくはこれらを適切な緩衝液等で希釈したもの（すなわち、体液もしくは希釈体液）、または組織由来の細胞や培養細胞等が懸濁した液などが挙げられる。これらのうち、好ましい「血液由来検体」として、血液、および本発明の分野において常用される適当な希釈液、例えば緩衝液など、によって血液を希釈したもの、すなわち、血液および希釈血液が挙げられる。
　本発明において定量されるべき対象となる、血液由来検体に含有されている可能性のある「目的細胞」は、血漿の比重（1.025～1.029）より大きいが赤血球の比重（1.090～1.120）より小さい比重を有する細胞であり、このような「目的細胞」として、血中循環腫瘍細胞〔ＣＴＣ〕，循環幹細胞および循環内皮細胞からなる群から選択される少なくとも一種の希少細胞が好ましく、特にＣＴＣが好ましい。
　〔樹脂粒子Ｐ〕
　本発明で用いる樹脂粒子Ｐは、目的細胞の内部対照として用いるものであり、血漿の比重より大きいが赤血球の比重より小さい比重、好ましくは1.040以上1.085以下の比重、より好ましくは1.040以上1.077以下の比重を有する。または、望ましくは比重1.040以上、密度勾配遠心法で用いる分離媒体の比重以下を有する。
　樹脂粒子Ｐは、血液由来検体中で懸濁状態を保持できる程度の大きさ以上、100μｍ程度の大きさ以下の略球形を有し、具体的には、平均粒子径として約0.2～20μｍであることが好ましい。
　樹脂粒子Ｐは、水不溶性の樹脂から形成され、凝集塊を形成しない性質を有することが好ましい。このような樹脂としては、例えば、ポリスチレンやポリメチルメタクリレート，ポリビニルトルエン，ポリアクリレートなどが挙げられるが、本発明はこれらに限定されない。
　さらに、上記工程（Ｂ）および後述する評価方法における下記行程(b)において容易に個数を計測できるよう、樹脂粒子Ｐは、光学的に検出可能な色素Ｄaによって標識されていることが好ましく、このとき用いられる色素Ｄaは、蛍光色素であることがより好ましい。ここで色素Ｄaによる標識は、粒子表面に結合もしくは付着している態様で行われていてもよく、あるいは、粒子内部に練り込まれている態様で行われていてもよい。
　また、樹脂粒子Ｐとして用いる樹脂の種類によっては、色素Ｄaによる標識化を行うまでもなく、樹脂自身の自家蛍光によって樹脂粒子Ｐの個数を検出可能な場合がある。このような場合には、色素Ｄaの導入を行わなくてもよい。
　蛍光色素Ｄaとしては、例えば、フルオレセイン系蛍光色素、ローダミン系蛍光色素、シアニン系蛍光色素など特開2010-169519号公報に記載されている各種蛍光色素、キノキサリン系蛍光色素、その他の合成蛍光色素、並びに、生体由来の色素であるポルフィリン系色素やフィコビリン系色素なども挙げられる。ここで、フィコビリン系色素の例として、フィコエリスリン（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ：ＰＥ）が挙げられる。
　水不溶性の樹脂または自家蛍光を発する樹脂を用いた樹脂粒子Ｐの製造は、公知の種々の方法を用いて製造することができる。
　このような樹脂粒子Ｐとして、Spherotech社製のポリスチレン粒子（比重1.050；平均粒子径20μｍ）などの市販品も使用することができ、また比重を調整することができれば、特開平4-252957号公報に記載の蛍光微小粒子も使用することができる。
　〔密度勾配遠心法〕
　本発明の密度勾配遠心法は、従来のものを適宜利用することができる。密度勾配遠心法に用いられる分離液または分離媒体としては、例えば、市販のフィコールやパーコール（いずれもＧＥヘルスケア・ジャパン(株)の登録商標）またはショ糖溶液などが挙げられるが、血液由来検体に含有される赤血球と他の細胞とを分離することができる比重を有し、細胞を破壊することのない浸透圧およびｐＨに調節できる分離液または分離媒体であれば、本発明はこれらに限定されない。
　また、分離液または分離媒体は、比重の異なる二種以上（例えば、比重1.077と1.119）を併用することができる。このように比重の異なる二種以上の分離液または分離媒体を用いると、「赤血球以外の細胞が多く含まれる層」をさらに分離することができ、目的細胞以外の細胞をさらに排除できるため好ましい。
　〔目的細胞数または樹脂粒子数の計測方法〕
　上記(Ｂ)工程において目的細胞数を計測するには、例えば、樹脂粒子Ｐに標識した光学的に検出可能な色素と異なる発光波長を有する該色素により目的細胞のみを標識し、蛍光顕微鏡下でカウントする方法などが挙げられる。
　目的細胞を標識するために用いうる好適な色素として、上記「樹脂粒子Ｐ」の項で各種蛍光色素が挙げられる。本発明においては、樹脂粒子Ｐの標識に用いる色素または樹脂粒子Ｐ自体の蛍光と、目的細胞の標識に用いる色素とでは、発光波長が互いに異なっている限り、励起波長については同じでもよいし、あるいは互いに異なっていてもよい。
　目的細胞を標識する方法としては、従来公知の種々の手法を用いることができ、好適な方法の例として、適当な色素によって標識化された抗体との抗原－抗体反応を利用して標識化する方法が挙げられる。また、別の方法として、目的細胞が、他の細胞にはない特有の官能基を有している場合には、上記色素として、その官能基と結合可能な反応性官能基を有する色素を用い、共有結合や水素結合等の各種化学結合を通じて目的細胞への色素の導入を行ってもよい。
　一方、もし、目的細胞とする細胞がそれ自体で蛍光を発光する場合には、目的細胞に色素による標識を行うことなく、目的細胞それ自体の蛍光に基づいて目的細胞数の計測を行ってもよい。
　目的細胞数の計測方法として、従来公知の種々の方法を用いることができる。そのような方法として、目的細胞などを含む液を平面に広げ、この平面を二次元的にスキャンして目的細胞由来の蛍光を検出し、カウントする方法が好適に挙げられる。このような方法は、蛍光顕微鏡下でカウントする方法などであってもよく、例えば、細胞培養用ディッシュなどの適当な平面に、目的細胞を含む液を広げ、この平面を二次元的にスキャンして、目的細胞由来の蛍光をカウントすることができる。ただ、本発明では、目的細胞数の計測は、蛍光顕微鏡下でカウントする方法によっておこなうものに限られない。例えば、適当な励起光を照射した上記平面に、光電子増倍管などの適当な光電変換素子を二次元的に走査させて、蛍光の強度及び位置に基づいて目的細胞の所在を評価し、これに基づいて目的細胞数の計測を行ってもよい。あるいは、適当な励起光を照射した上記平面を、撮像素子を複数、一列にあるいは二次元的に配列してなる従来公知のイメージセンサを介して撮影して蛍光画像を取得し、この蛍光画像に分布する蛍光の数をカウントすることによって、目的細胞数の計測を行ってもよい。
　なお、後述する本発明の評価方法において、下記(b)の工程で、樹脂粒子Ｐおよび樹脂粒子Ｎの数のほかに、目的細胞数も計測する場合においても、以上に記載したものと同様の方法により目的細胞数の計測を行うことができる。この場合、樹脂粒子Ｐの標識に用いる色素または樹脂粒子Ｐ自体の蛍光と、樹脂粒子Ｎの標識に用いる色素または樹脂粒子Ｎ自体の蛍光と、目的細胞の標識に用いる色素とでは、発光波長が互いに異なっている限り、励起波長については同じでもよいし、あるいは互いに異なっていてもよい。
　一方、上記(Ｂ)工程において樹脂粒子Ｐの数を計測する方法、及び、下記(b)の工程において樹脂粒子Ｐおよび樹脂粒子Ｎの数をそれぞれ計測する方法として、上記のような二次元的な手法により目的細胞数を計測する方法の他に、例えばフローサイトメトリー法なども挙げられる。
　ここで、目的細胞数の計測、樹脂粒子Ｐの数の計測、および樹脂粒子Ｎの数の計測は、同時に行ってもよく、あるいは、別々に行ってもよい。また、これらの計測を行う手段は、全て同一でもよく、あるいは、互いに異なっていてもよい。さらには、目的細胞数の計測、樹脂粒子Ｐの数の計測、および樹脂粒子Ｎの数の計測を蛍光に基づいて行う場合、これらの計測を全て同一波長の励起光を用いて行ってもよく、あるいは、互いに異なる波長の励起光を用いて行ってもよい。また、必要により、適当なフィルターを用いて蛍光の波長を分離してもよい。
　　　　　　　　　　　　　　　　＜評価方法＞
　本発明の評価方法は、血液由来検体に含有されている可能性のある、血漿の比重より大きいが赤血球の比重より小さい比重を有する目的細胞を定量するシステムの信憑性を評価する方法であって、下記(a)～(d)の工程を含むことを特徴とする。
　(a) 血漿の比重より大きいが赤血球の比重より小さい比重を有する樹脂粒子Ｐを既知数個（Ｐ0個）とともに、1.090以上1.120以下の比重を有する樹脂粒子Ｎを既知数個（Ｎ0個）含有させた血液由来検体を、密度勾配遠心法により、赤血球が多く含まれる層と赤血球以外の細胞が多く含まれる層との少なくとも二層に分離する工程；
　(b) 赤血球以外の細胞が多く含まれる層を抽出し、該層に含まれる該樹脂粒子Ｐの数（Ｐ1個）と該樹脂粒子Ｎの数（Ｎ1個）とを計測する工程；
　(c) (Ｐ1／Ｐ0)×100を算出して、所定の基準値と比較し、該システム全体がどの程度機能しているかを評価する工程；ならびに
　(d) Ｎ1／Ｐ1を算出して、所定の基準値と比較し、該密度勾配遠心法によりどの程度層が分離しているかを評価する工程。
　ここで、本発明の評価方法は、
　(e) Ｐ1個の該樹脂粒子ＰまたはＮ1個の該樹脂粒子Ｎに由来する発光シグナルを測定し、発光シグナル検出機器を校正する工程
をさらに含むことが好ましい。
　なお、本発明に係る評価方法において「目的細胞」とは、本発明の評価方法によって評価されるべき「定量するシステム」によって、定量されるべき対象となる細胞を指す。
　〔樹脂粒子Ｎ〕
　本発明で用いる樹脂粒子Ｎは、赤血球の内部対照として用いるものであり、赤血球と同程度の比重、すなわち1.090以上1.120以下の比重を有する。
　樹脂粒子Ｎは、好ましくは、光学的に検出可能な色素Ｄaとは発光波長の異なる光学的に検出可能な色素Ｄb、より好ましくは、光学的に検出可能な色素Ｄaとは発光波長の異なる光学的に検出可能な蛍光色素Ｄbによって標識されている。標識化の態様は上述した樹脂粒子Ｐと同じである。蛍光色素Ｄbとして用いうる蛍光色素として、蛍光色素Ｄaとして上記したものと同様の蛍光色素を例示できる。
　樹脂粒子Ｎは、血液由来検体中で懸濁状態を保持できる程度の大きさ以上、100μｍ程度の大きさ以下であり、具体的には、平均粒子径として約0.2～20μｍであることが好ましい。
　なお、樹脂粒子Ｎを形成する樹脂の種類および樹脂粒子の製造方法として、上記「樹脂粒子Ｐ」の項で上述したものと同様のものが挙げられる。
　このような樹脂粒子Ｎは、積水化成品工業(株)製の架橋ポリメタクリル酸ブチルの真球状微粒子（ＢＭ30Ｘ-5；比重1.100；平均粒子径5μｍ）などの市販品も使用することができ、また比重を1.090以上1.120以下とすることができれば、特開平4-252957号公報に記載の蛍光微小粒子も使用することができる。
　〔工程(a)〕
　工程(a)は、血漿の比重より大きいが赤血球の比重より小さい比重を有する樹脂粒子Ｐを既知数個（Ｐ0個）とともに、1.090以上1.120以下の比重を有する樹脂粒子Ｎを既知数個（Ｎ0個）含有させた血液由来検体を、密度勾配遠心法により、赤血球が多く含まれる層と赤血球以外の細胞が多く含まれる層との少なくとも二層に分離する工程である。
　本発明において、この工程(a)は、密度勾配遠心法を適用する血液由来検体に、血漿の比重より大きいが赤血球の比重より小さい比重を有する樹脂粒子Ｐを既知数個（Ｐ0個）に加えて、さらに、1.090以上1.120以下の比重を有する樹脂粒子Ｎを既知数個（Ｎ0個）加えることを除いては、上記工程(Ａ)と同様の手法により行うことができる。
　〔工程(b)〕
　工程(b)は、赤血球以外の細胞が多く含まれる層を抽出し、該層に含まれる該樹脂粒子Ｐの数（Ｐ1個）と該樹脂粒子Ｎの数（Ｎ1個）とを計測する工程である。
　本発明において、この工程(b)における樹脂粒子Ｐの数および樹脂粒子Ｎの数の計測は、いずれも、上記「目的細胞数または樹脂粒子数の計測方法」の項に記載したものと同様の方法により行うことができる。
　ここで、工程(b)においては、目的細胞の数の計測も併せて行ってもよく、このときの目的細胞の数の計測もまた、上記「目的細胞数または樹脂粒子数の計測方法」の項に記載したものと同様の方法により行うことができる。
　〔工程(c)〕
　工程(c)は、(Ｐ1／Ｐ0)×100を算出して、所定の基準値と比較し、上記システム全体がどの程度機能しているかを評価する工程である。すなわち、工程(c)は、評価対象とするシステムが、血液由来検体に含まれる目的細胞のうち、どれだけ多くの目的細胞を定量のために抽出することができるかを評価する工程であると見ることもできる。例えば、(Ｐ1／Ｐ0)×100が100％である場合、すなわち、Ｐ1＝Ｐ0の場合、当該システムによって得られる定量結果は、血液由来検体に含まれる目的細胞の量を完全に反映していると判断することができる。
　工程(c)における「所定の基準値」は、システムに応じて適宜設定することができ特に限定されるものではないが、例えば次のように設定することができる。(Ｐ1／Ｐ0)×100＝90～100％である場合、上記システムは充分に機能していると判断し、(Ｐ1／Ｐ0)×100＝80％以上90％未満である場合、上記システムはほぼ問題なく機能していると判断し、(Ｐ1／Ｐ0)×100＝70％以上80％未満である場合、上記システムは何かしらの不備を有すると判断し、(Ｐ1／Ｐ0)×100＝70％未満である場合、上記システムは満足に機能していないと判断する。工程(c)で実際に算出された(Ｐ1／Ｐ0)が上記のどの範囲にあるかによって、それぞれに記載したように判断することができる。
　〔工程(d)〕
　工程(d)は、Ｎ1／Ｐ1を算出して、所定の基準値と比較し、密度勾配遠心法によりどの程度層が分離しているかを評価する工程である。
　工程(d)における「所定の基準値」は、システムに応じて適宜設定することができ特に限定されるものではないが、例えば次のように設定することができる。Ｎ1／Ｐ1＝0.005未満である場合、密度勾配遠心法による単離は大きな問題がないと判断し、Ｎ1／Ｐ1＝0.005以上である場合、密度勾配遠心法による単離は何かしらの問題があると判断する。工程(d)で実際に算出されたＮ1／Ｐ1が上記のどの範囲にあるかによって、それぞれに記載したように判断することができる。
　〔工程(e)〕
　本発明において任意に行うことができる工程(e)は、Ｐ1個の樹脂粒子ＰまたはＮ1個の樹脂粒子Ｎに由来する発光シグナルを測定し、発光シグナル検出機器を校正する工程である。
　この工程(e)において、樹脂粒子ＰまたはＮの数（Ｐ1個またはＮ1個）はフローサイトメトリー法により計測することができる。ここで、工程(e)における樹脂粒子ＰまたはＮの数の計測は、発光量をも計測可能である限りフローサイトメトリー法に限定されることはなく、可能な場合には、上記「目的細胞数または樹脂粒子数の計測方法」の項に記載したような上記二次元的な手法によって行ってもよい。
　樹脂粒子ＰまたはＮ1個に標識されている色素に由来する発光量を予め計測し、この1個当りの発光量と対応する樹脂粒子の数とを乗じた数値と、実際に発光シグナル検出機器が計測した数値とを比較することによって、発光シグナル検出機器を校正する（それらの数値が一致するようにする）ことができる。したがって、本発明の評価方法は、この工程(e)をさらに含むことが好ましい。
　　　　　　　　　　　　　　　　＜キット＞
　本発明の定量方法に用いるためのキットは、上記樹脂粒子Ｐを既知数個有することを特徴とし、また本発明の評価方法に用いるためのキットは、上記樹脂粒子Ｐと上記樹脂粒子Ｎとをそれぞれ既知数個ずつ有することを特徴とする。
　これらのキットは、上記の樹脂粒子Ｐ、または上記樹脂粒子Ｐおよび上記樹脂粒子Ｎ以外に、例えば、本発明の定量方法および評価方法で用いる血液等を希釈するための希釈剤や緩衝液，密度勾配遠心法で用いる分離媒体，目的細胞を蛍光標識するための蛍光色素が結合した抗体、さらには取扱説明書やフローサイトメータおよび蛍光顕微鏡，これら機器を用いて得られた数値を処理するためのコンピュータなども含めることができる。
　次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
　［所定の基準値］
　以下の実施例において、「所定の基準値」を以下のように規定した。
　＊工程(c)における(Ｐ1／Ｐ0)×100：
　　90～100％：システムは充分に機能している。
　　80％以上90％未満：システムはほぼ問題なく機能している。
　　70％以上80％未満：システムは何かしらの不備を有する。
　　70％未満：システムは満足に機能していない。
　＊工程(d)における(Ｎ1／Ｐ1)：
　　0.005未満：密度勾配遠心法による単離は大きな問題がない。
　　0.005以上：密度勾配遠心法による単離は何かしらの問題がある。
　［実施例１］
　ＣＴＣのモデルとして培養細胞であるＭＣＦ7を100個と、フルオレセインイソチオシアネート〔ＦＩＴＣ〕により標識された樹脂粒子Ｐ（Spherotech社製のＦＩＣＰ-80-2）（比重：1.050）を100個（すなわちＰ0＝100）とを全血2ｍＬ中に添加し混合した後、密度勾配遠心法を実施した。具体的には、分離液としてフィコール（比重：1.077）3ｍＬに、当該全血2ｍＬを重層し、400×ｇで40分間遠心した。
　培養細胞を含む上清約1.2ｍＬを抽出し、細胞培養ディッシュの平面上に展開し、ＰＥ標識済み抗体（Ａｎｔｉ ＥｐＣＡＭ（ベクトンディッキンソン社製））を添加し、培養細胞のみをＰＥで染色した。
　検出機器によりＰＥおよびＦＩＴＣの蛍光シグナルをそれぞれスキャンした結果、ＰＥ標識が68個（すなわち、密度勾配遠心分離後の培養細胞数＝68）、ＦＩＴＣ標識が70個（すなわち、Ｐ1＝70）検出された。ここで、蛍光シグナルの測定は、具体的には、35mm細胞培養用ディッシュに懸濁液を垂らし、数分静置後蛍光倒立顕微鏡（carl zeiss社 Observer D1）を用いてディッシュ全面に対して蛍光画像撮影を行ないビーズの数を判定することによって行った。
　Ｐ0／Ｐ1である100／70を、密度勾配遠心分離後の培養細胞数に乗ずると、68×100／70＝97と算出された。これは、密度勾配遠心分離する前の全血2ｍＬに含まれる培養細胞の推定数を表し、実際に全血に含まれていた培養細胞数100とほぼ一致するものであった。
　［実施例２］
　ＣＴＣのモデルとして実施例1と同様の培養細胞を100個と、ＦＩＴＣ標識された樹脂粒子Ｐを10,000個（すなわちＰ0＝10,000）とを全血2ｍＬ中に添加し混合した後、実施例1と同様にして密度勾配遠心法を実施した。
　培養細胞を含む上清約1.2ｍＬを抽出し、さらに400×ｇで40分間の遠心分離を実施し、1ｍＬまでボリュームダウンし、その1/10量（＝100μＬ）を採取し、細胞培養ディッシュの平面上に展開した。
　実施例１と同様の手法で、検出機器によりＦＩＴＣの蛍光をスキャンした結果、ＦＩＴＣ標識が990個（すなわち、Ｐ1×1/10＝990）検出された。
　システム全体がどの程度機能しているかを示す指標である(Ｐ1／Ｐ0)×100は、[(990×10)／10,000]×100＝99％と算出された。これは所定の基準値と比較しても有意に高い数値であることから、このシステムは充分に機能していると判断できた。
　［実施例３］
　ＣＴＣのモデルとして実施例1と同様の培養細胞を100個と、ＦＩＴＣ標識された樹脂粒子Ｐを10,000個（すなわちＰ0＝10,000）と、赤血球のモデルとしてＤＭＥＱ-ヒドラジド標識樹脂粒子Ｎ（積水化成品工業(株)製のカルボキシル基が付与されたＢＭ30Ｘ-5とＤＭＥＱ-ヒドラジド（和光純薬工業(株)）とを反応させて作製）（比重：1.10）を10,000個（すなわちＮ0＝10,000）とを全血2ｍＬ中に添加し混合した後、実施例1と同様にして密度勾配遠心法を実施した。
　培養細胞を含む上清約1.2ｍLを抽出し、さらに遠心分離を実施し、1ｍＬまでボリュームダウンし、その1/10量（＝100μＬ）を採取し、細胞培養ディッシュ平面上に展開した。
　実施例１と同様の手法で、検出機器によりＦＩＴＣとＤＭＥＱ-ヒドラジドの蛍光をスキャンした結果、それぞれＦＩＴＣ標識が990個（すなわち、Ｐ1×1/10＝990）、ＤＭＥＱが2個（すなわち、Ｎ1×1/10＝2）検出された。
　密度勾配遠心法によりどの程度層が分離しているかを示す指標であるＮ1／Ｐ1は、(2×10)／(990×10)＝0.002と算出された。これは所定の基準値の範囲内であることから、この密度勾配遠心法による単離は大きな問題がないと判断することができた。
　なお、本実施例における(Ｐ1／Ｐ0)×100は、[(990×10)／10,000]×100＝99％と算出できる。
　［比較例１］
　比較例１では、樹脂粒子Ｐに代えて安定化細胞を内部参照として用いてＣＴＣの定量をおこなった。
　ＣＴＣのモデルとして実施例1と同様の培養細胞100個と、内部対照用粒子として特殊な処理（パラホルムアルデヒド処理およびＦＩＴＣ染色）を施した実施例1と同様の培養細胞100個とを全血2ｍＬ中に添加し混合した後、実施例1と同様にして密度勾配遠心法を実施した。
　培養細胞を含む上清を抽出し、平面に展開し、培養細胞のみを染色する蛍光色素（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 647）を添加した。
　検出機器によりＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 647およびＦＩＴＣの蛍光シグナルをそれぞれスキャンした結果、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 647標識が69個（すなわち、密度勾配遠心分離後の培養細胞数＝69）、ＦＩＴＣ標識が20個（すなわち、密度勾配遠心分離後の内部対照用粒子数＝20）検出された。
　(密度勾配遠心分離前の内部対照用粒子数)／(密度勾配遠心分離後の内部対照用粒子数)である100／20を、実施例1と同様にして密度勾配遠心分離後の培養細胞数に乗じると、69×100／20＝345と算出された。これは、密度勾配遠心分離する前の全血2ｍＬに含まれる培養細胞の推定数を表し、実際に全血に含まれていた培養細胞数100とは大きく異なるものであった。
　１・・・比重液
　２・・・血液由来検体
　３・・・血漿の比重より大きいが赤血球の比重より小さい比重を有する樹脂粒子Ｐ
　４・・・赤血球が多く含まれる層
　５・・・赤血球以外の細胞が多く含まれる層

Claims (14)

  1. 　血液由来検体に含有されている可能性のある、血漿の比重より大きいが赤血球の比重より小さい比重を有する目的細胞を定量する方法であって、下記(Ａ)～(Ｃ)の工程を含むことを特徴とする定量方法：
    　(Ａ) 血漿の比重より大きいが赤血球の比重より小さい比重を有する樹脂粒子Ｐを既知数個（Ｐ0個）含有させた血液由来検体を、密度勾配遠心法により、赤血球が多く含まれる層と赤血球以外の細胞が多く含まれる層との少なくとも二層に分離する工程；
    　(Ｂ) 赤血球以外の細胞が多く含まれる層を抽出し、該層に含まれる該目的細胞の数および該樹脂粒子の数（Ｐ1個）を計測する工程；ならびに
    　(Ｃ) 該目的細胞の数にＰ0／Ｐ1を乗じることによって、該目的細胞の数を校正する工程。
  2. 　上記樹脂粒子Ｐが、水不溶性の樹脂から形成され、且つ、光学的に検出可能な色素Ｄaによって標識されている、請求項1に記載の定量方法。
  3. 　上記樹脂粒子Ｐが、1.040以上1.085以下の比重を有する、請求項1または2に記載の定量方法。
  4. 　上記樹脂粒子Ｐが、1.040以上1.077以下の比重を有する、請求項1または2に記載の定量方法。
  5. 　上記目的細胞が、血中循環腫瘍細胞〔ＣＴＣ〕，循環幹細胞および循環内皮細胞からなる群から選択される少なくとも一種の希少細胞である、請求項1～4のいずれか一項に記載の定量方法。
  6. 　血液由来検体に含有されている可能性のある、血漿の比重より大きいが赤血球の比重より小さい比重を有する目的細胞を定量するシステムの信憑性を評価する方法であって、下記(a)～(d)の工程を含むことを特徴とする評価方法：
    　(a) 血漿の比重より大きいが赤血球の比重より小さい比重を有する樹脂粒子Ｐを既知数個（Ｐ0個）とともに、1.090以上1.120以下の比重を有する樹脂粒子Ｎを既知数個（Ｎ0個）含有させた血液由来検体を、密度勾配遠心法により、赤血球が多く含まれる層と赤血球以外の細胞が多く含まれる層との少なくとも二層に分離する工程；
    　(b) 赤血球以外の細胞が多く含まれる層を抽出し、該層に含まれる該樹脂粒子Ｐの数（Ｐ1個）と該樹脂粒子Ｎの数（Ｎ1個）とを計測する工程；
    　(c) (Ｐ1／Ｐ0)×100を算出して、所定の基準値と比較し、該システム全体がどの程度機能しているかを評価する工程；ならびに、
    　(d) Ｎ1／Ｐ1を算出して、所定の基準値と比較し、該密度勾配遠心法によりどの程度層が分離しているかを評価する工程。
  7. 　上記樹脂粒子Ｐが、水不溶性の樹脂から形成され、光学的に検出可能な色素Ｄaによって標識されている、請求項6に記載の評価方法。
  8. 　上記樹脂粒子Ｐが、1.040以上1.085以下の比重を有する、請求項6または7に記載の評価方法。
  9. 　上記樹脂粒子Ｐが、1.040以上1.077以下の比重を有する、請求項6または7に記載の評価方法。
  10. 　該樹脂粒子Ｎが、水不溶性の樹脂から形成され、且つ、光学的に検出可能な色素Ｄaとは発光波長の異なる光学的に検出可能な色素Ｄbによって標識されている、請求項6～9のいずれか一項に記載の評価方法。
  11. 　上記目的細胞が、血中循環腫瘍細胞〔ＣＴＣ〕，循環幹細胞および循環内皮細胞からなる群から選択される少なくとも一種の希少細胞である、請求項6～10のいずれか一項に記載の評価方法。
  12. 　下記(e) の工程をさらに含むことを特徴とする請求項6～11のいずれか一項に記載の評価方法：
    　(e) Ｐ1個の該樹脂粒子ＰまたはＮ1個の該樹脂粒子Ｎに由来する発光シグナルを測定し、発光シグナル検出機器を校正する工程。
  13. 　上記樹脂粒子Ｐを既知数個有することを特徴とする、請求項1～5のいずれか一項に記載の定量方法に用いるためのキット。
  14. 　上記樹脂粒子Ｐと上記樹脂粒子Ｎとをそれぞれ既知数個ずつ有することを特徴とする、請求項6～12のいずれか一項に記載の評価方法に用いるためのキット。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015046557A1 (ja) * 2013-09-30 2015-04-02 積水メディカル株式会社 循環腫瘍細胞濃縮分離デバイス及び循環腫瘍細胞の濃縮分離方法
WO2016028011A1 (ko) * 2014-08-22 2016-02-25 삼성전자 주식회사 표적물질 분리장치 및 표적물질 분리방법
JP2021006774A (ja) * 2019-06-28 2021-01-21 東ソー株式会社 試料中に含まれる目的細胞の定量方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4374156A1 (en) * 2021-07-22 2024-05-29 Sartorius BioAnalytical Instruments, Inc Method and system for monitoring cell settling

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04252957A (ja) 1990-08-07 1992-09-08 Becton Dickinson & Co 絶対カウントのための一段試験
JP2000502892A (ja) * 1995-12-11 2000-03-14 デンドレオン コーポレイション 細胞分離の組成物、キット、および方法
JP2004534210A (ja) 2001-03-07 2004-11-11 イムニベスト・コーポレイション 希少細胞検出アッセイにおける内部機能対照として用いる標識細胞
JP2009288254A (ja) * 2002-10-03 2009-12-10 Battelle Memorial Inst 抗凝固処理全血試料中の循環目標細胞を検出するための方法
JP2010169519A (ja) 2009-01-22 2010-08-05 Konica Minolta Holdings Inc プラズモン励起センサおよびそれを用いたアッセイ法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4774965A (en) * 1987-07-01 1988-10-04 Becton Dickinson And Co., Inc. Material layer volume determination with correction band
US5840502A (en) * 1994-08-31 1998-11-24 Activated Cell Therapy, Inc. Methods for enriching specific cell-types by density gradient centrifugation
WO1997038313A1 (en) * 1996-04-05 1997-10-16 The Johns Hopkins University A method of enriching rare cells
US7205157B2 (en) * 2001-01-08 2007-04-17 Becton, Dickinson And Company Method of separating cells from a sample
EP3620465B1 (en) * 2007-07-03 2025-02-19 Dako Denmark A/S Improved methods for generation, labeling and use of mhc multimers
US20120142089A1 (en) * 2010-12-01 2012-06-07 Samsung Electronics Co., Ltd. Method of separating target cell in biological sample

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04252957A (ja) 1990-08-07 1992-09-08 Becton Dickinson & Co 絶対カウントのための一段試験
JP2000502892A (ja) * 1995-12-11 2000-03-14 デンドレオン コーポレイション 細胞分離の組成物、キット、および方法
JP2004534210A (ja) 2001-03-07 2004-11-11 イムニベスト・コーポレイション 希少細胞検出アッセイにおける内部機能対照として用いる標識細胞
JP2009288254A (ja) * 2002-10-03 2009-12-10 Battelle Memorial Inst 抗凝固処理全血試料中の循環目標細胞を検出するための方法
JP2010169519A (ja) 2009-01-22 2010-08-05 Konica Minolta Holdings Inc プラズモン励起センサおよびそれを用いたアッセイ法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP2803998A4

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015046557A1 (ja) * 2013-09-30 2015-04-02 積水メディカル株式会社 循環腫瘍細胞濃縮分離デバイス及び循環腫瘍細胞の濃縮分離方法
CN105683353A (zh) * 2013-09-30 2016-06-15 积水医疗株式会社 循环肿瘤细胞浓缩分离设备及循环肿瘤细胞的浓缩分离方法
US11221325B2 (en) 2013-09-30 2022-01-11 Sekisui Medical Co., Ltd. Device for concentration and separation of circulating tumor cells, and method for concentration and separation of circulating tumor cells
WO2016028011A1 (ko) * 2014-08-22 2016-02-25 삼성전자 주식회사 표적물질 분리장치 및 표적물질 분리방법
US10203332B2 (en) 2014-08-22 2019-02-12 Samsung Electronics Co., Ltd. Apparatus for and method of separating target matter
JP2021006774A (ja) * 2019-06-28 2021-01-21 東ソー株式会社 試料中に含まれる目的細胞の定量方法
JP7279542B2 (ja) 2019-06-28 2023-05-23 東ソー株式会社 試料中に含まれる目的細胞の定量方法

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