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WO2013150623A1 - 抗ｃｄｈ３（ｐ－カドヘリン）抗体の薬剤コンジュゲート - Google Patents

抗ｃｄｈ３（ｐ－カドヘリン）抗体の薬剤コンジュゲート Download PDF

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WO2013150623A1
WO2013150623A1 PCT/JP2012/059236 JP2012059236W WO2013150623A1 WO 2013150623 A1 WO2013150623 A1 WO 2013150623A1 JP 2012059236 W JP2012059236 W JP 2012059236W WO 2013150623 A1 WO2013150623 A1 WO 2013150623A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
cdh3
immune complex
chain
seq
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2012/059236
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English (en)
French (fr)
Inventor
石井　敬介
克之 見供
克志 甲田
富美子 野村
容子 粥川
正 松浦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Perseus Proteomics Inc
Original Assignee
Perseus Proteomics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to EP24201291.2A priority patent/EP4458859A3/en
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Priority to EP12873679.0A priority patent/EP2848686B1/en
Priority to CA2869704A priority patent/CA2869704A1/en
Priority to AU2012376421A priority patent/AU2012376421A1/en
Priority to US14/390,734 priority patent/US9764041B2/en
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    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
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    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]

Definitions

  • the present invention relates to a drug conjugate of an anti-CDH3 antibody.
  • the present invention further relates to methods of using anti-CDH3 antibody drug conjugates.
  • Cancer is an important disease that occupies the top causes of death, but its therapeutic needs have not yet been met.
  • cancer treatment with molecular targeted drugs that design and treat drugs targeting specific molecules specifically expressed in cancer cells Has been actively studied.
  • CDH3 which is a cell surface antigen
  • CDH3 is a membrane protein that was discovered as a molecule involved in homophilic cell adhesion in a calcium-dependent manner (Yoshida and Takeichi, Cell 28: 217-224, 1982).
  • a protein having a cadherin repeat consisting of about 110 amino acid residues having high homology to each other is called a cadherin superfamily, and CDH3 belongs to its main member.
  • ADCC antibody-dependent cytotoxicity
  • ADC antibody drug conjugates
  • the drug components used in ADC include bacterial protein toxins such as diphtheria toxin, plant protein toxins such as ricin, low molecular weight toxins such as auristatin, maytansinoid, calikiamycin and derivatives thereof.
  • the drug bound to the antibody circulates in the blood and accumulates in the target tumor, and then has a medicinal effect. Release of the drug outside the tumor site (withdrawal from the antibody) is not always preferable because there is a risk of causing side effects. That is, it is preferable that the drug bound to the antibody is designed to be released from the antibody after being taken into the cell.
  • Genentech has developed a drug (T-DM1) in which a toxin is bound to trastuzumab via a non-cleavable linker (SMCC) from this point of view.
  • SMCC non-cleavable linker
  • Antibody drug conjugates linked to drug components via cleavable linkers are also developed.
  • ImmunoGen develops an antibody drug conjugate in which a drug and a HuN901 antibody are bound via a disulfide linker (SPP) for cancers that express the NCAM antigen.
  • SPP disulfide linker
  • An object of the present invention is to provide an anti-CDH3 antibody drug conjugate that efficiently kills cancer cells expressing CDH3.
  • an immune complex formed by linking an antibody against CDH3 and a chemotherapeutic agent has a strong cytotoxic activity against a cancer cell line expressing CDH3.
  • the present invention has been completed.
  • an immune complex comprising an antibody against CDH3 or a fragment thereof capable of binding CDH3 and a chemotherapeutic agent.
  • an antibody against CDH3 or a fragment thereof capable of binding CDH3 exhibits cytotoxicity against cells expressing CDH3.
  • the antibody against CDH3 is an antibody produced by an antibody-producing cell obtained from an immune cell administered with CDH3 or a cell expressing CDH3 as an immunogen.
  • the antibody is a monoclonal antibody.
  • the antibody is chimerized.
  • the antibody is humanized.
  • the antibody is a human antibody.
  • the antibody comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 48, 56 and 65 on the H chain, and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 75, 82 and 86 on the L chain.
  • the antibody comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 52, 60 and 70 in the H chain and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 75, 82 and 91 in the L chain.
  • the antibody comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 54, 62 and 72 in the H chain and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 74, 81 and 93 in the L chain.
  • the antibody comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 55, 63 and 73 in the H chain and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 80, 85 and 94 in the L chain.
  • the antibody comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 49, 64 and 66 on the H chain and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 76, 84 and 89 on the L chain.
  • the antibody comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 49, 58 and 68 on the H chain and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 79, 82 and 90 on the L chain.
  • the antibody comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 53, 61 and 71 on the H chain, and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 75, 82 and 92 on the L chain.
  • the antibody comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 51, 57 and 67 on the H chain, and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 78, 83 and 88 on the L chain.
  • the antibody comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 50, 59 and 69 on the H chain, and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 77, 83 and 87 on the L chain.
  • the antibody has an H chain consisting of an amino acid sequence having at least 90% sequence identity with the amino acid sequence of the H chain of the antibody of the present invention described above.
  • CDH3 is mammalian CDH3.
  • CDH3 is selected from primate CDH3.
  • CDH3 is selected from human CDH3.
  • CDH3 is CDH3 expressed on the surface of a cell.
  • the antibody fragment having CDH3 binding ability is Fab, F (ab ′) 2 or scFv.
  • the chemotherapeutic agent is a cytotoxic substance.
  • the cytotoxic substance is selected from maytansinoids and derivatives thereof.
  • the cytotoxic substance is selected from auristatin and its derivatives.
  • the maytansinoid and its derivatives are selected from DM1, DM3, DM4.
  • the auristatin and its derivatives are selected from MMAE or MMAF.
  • the cytotoxic agent is DM1.
  • 1 to 10 DM1s are bound per molecule of an antibody against CDH3 or a fragment thereof having CDH3 binding ability.
  • 3 to 8 DM1s are bound per molecule of an antibody against CDH3 or a fragment thereof having CDH3 binding ability.
  • an antibody against CDH3 or a fragment thereof capable of binding CDH3 and the chemotherapeutic agent are bound via a linker.
  • the binding of the antibody against CDH3 or a fragment thereof capable of binding CDH3 and the chemotherapeutic agent is via an intramolecular disulfide bond in the Fc region of the antibody.
  • the antibody against CDH3 or a fragment thereof having CDH3 binding ability and the chemotherapeutic agent are those obtained by genetically modifying the Fc region of the antibody.
  • the linker that binds the antibody against CDH3 or a fragment thereof having CDH3 binding ability and the chemotherapeutic agent is a bivalent reactive crosslinking reagent.
  • the linker is N-succinimidyl 4- (maleimidomethyl) cyclohexanecarboxylate (SMCC), N-succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) -cyclohexane-1-carboxy- (6-amidocaproate) LC-SMCC), ⁇ -maleimidoundecanoic acid N-succinimidyl ester (KMUA), ⁇ -maleimidobutyric acid N-succinimidyl ester (GMBS), ⁇ -maleimidocaproic acid N-hydroxysuccinimide ester (EMCS), m- Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS), N- ( ⁇ -maleimidoacetoxy) -succinimide ester (AMAS), succinimidyl-6- ( ⁇ -maleimidopropionamido) hexanoate (SMPH), N- Succinimidy
  • the linker is cleaved by a protease.
  • the linker comprises val-cit.
  • the linker comprises PABA.
  • the pharmaceutical composition of the present invention has an anticancer effect.
  • the cancer is colorectal cancer, non-small cell lung cancer, breast cancer, head and neck cancer, ovarian cancer, lung cancer, invasive bladder cancer, pancreatic cancer, brain metastatic cancer, thyroid cancer, head and neck squamous cell carcinoma, Esophageal squamous cell carcinoma, lung squamous cell carcinoma, cutaneous squamous cell carcinoma, melanoma, breast cancer, lung adenocarcinoma, cervical squamous cell carcinoma, pancreatic squamous cell carcinoma, colon squamous cell carcinoma or gastric squamous cell carcinoma, prostate cancer, bone Selected from sarcoma or soft tissue sarcoma.
  • the immunocomplex comprising an anti-CDH3 antibody and a chemotherapeutic agent provided by the present invention is more potent in cytotoxicity against a cancer cell line expressing CDH3 than an antibody that does not bind a chemotherapeutic agent. Shows activity. Therefore, when the immune complex of the present invention is administered to a patient having a cancer cell that expresses CDH3, a high anticancer effect can be expected. That is, the immune complex of the present invention is useful as an anticancer agent.
  • FIG. 1 shows the results of flow cytometry in which a human CDH3 forced expression cell line was reacted with a commercially available anti-human CDH3 antibody.
  • FIG. 2 shows typical flow cytometry results for 3 acquired antibodies and each cell line.
  • B CHO cells
  • C Lung cancer-derived cell line NCI-H358.
  • FIG. 3 shows the expression results of CDH3 mRNA in various tumor tissues.
  • FIG. 4 shows the expression results of CDH3 in various human tumor tissues.
  • FIG. 5 shows the results of flow cytometry in which each CDH3 chimeric antibody was reacted.
  • FIG. 6 shows the structure of DM1SMe.
  • FIG. 7 shows the cytotoxicity test results of the CDH3 antibody drug conjugate.
  • ADC CDH3 antibody drug conjugate, Naked: drug-unbound CDH3 antibody.
  • FIG. 8 shows animal test results using CDH3 antibody drug conjugates.
  • ADC CDH3 antibody drug conjugate, Naked: drug-unbound CDH3 antibody.
  • the immune complex of the present invention is provided as an anti-CDH3 antibody drug conjugate that efficiently kills cancer cells.
  • CDH3 or a partial peptide thereof can be used as an antigen for producing the antibody of the present invention.
  • soluble CDH3 protein or the like can be used, but is not limited thereto.
  • the antibody used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the antibody of the present invention can be produced by any of various methods. Antibody production methods are well known in the art [see, eg, Sambrook, J et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press (1989)].
  • CDH3 or a partial peptide thereof is used as an antigen and administered to a mammal such as a rat, mouse, rabbit or the like.
  • the dose of the antigen per animal is 0.1 to 100 mg when no adjuvant is used, and 1 to 100 ⁇ g when an adjuvant is used.
  • adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant. Immunization is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, or the like.
  • the immunization interval is not particularly limited, and immunization is performed 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times at intervals of several days to several weeks, preferably 2 to 5 weeks. Then, 6 to 60 days after the final immunization, the antibody titer is measured by enzyme immunoassay (ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) or EIA (enzyme immunoassay)), radioimmunoassay (RIA; radio immunoassay), etc. On the day when the maximum antibody titer is shown, blood is collected to obtain antiserum.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radio immunoassay
  • CDH3 or a partial peptide thereof is used as an antigen to a mammal such as a rat, mouse, rabbit or the like.
  • the dose of the antigen per animal is 0.1 to 100 mg when no adjuvant is used, and 1 to 100 ⁇ g when an adjuvant is used.
  • adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant. Immunization is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously or intraperitoneally.
  • the immunization interval is not particularly limited, and immunization is performed 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times at intervals of several days to several weeks, preferably 2 to 5 weeks. Then, antibody-producing cells are collected 1 to 60 days, preferably 1 to 14 days after the final immunization day.
  • antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, peripheral blood cells, etc., but spleen cells or local lymph node cells are preferred.
  • cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells is performed.
  • myeloma cells to be fused with antibody-producing cells generally available cell lines of animals such as mice can be used.
  • the cell line used has drug selectivity and cannot survive in a HAT selection medium (including hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) in an unfused state, but can survive only in a state fused with antibody-producing cells.
  • HAT selection medium including hypoxanthine, aminopterin, and thymidine
  • myeloma cells include P3X63-Ag. 8).
  • Examples include mouse myeloma cell lines such as U1 (P3U1) and NS-1.
  • the myeloma cell and the antibody-producing cell are fused.
  • Cell fusion is performed by using 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 7 antibody-producing cells and 2 ⁇ 10 5 to 2 ⁇ 10 6 in animal cell culture media such as serum-free DMEM and RPMI-1640 medium.
  • 1 / ml myeloma cells are mixed (a cell ratio of antibody-producing cells to myeloma cells is preferably 5: 1), and a fusion reaction is performed in the presence of a cell fusion promoter.
  • the cell fusion promoter polyethylene glycol having an average molecular weight of 1000 to 6000 daltons can be used.
  • antibody-producing cells and myeloma cells can be fused using a commercially available cell fusion device utilizing electrical stimulation (for example, electroporation).
  • the target hybridoma is selected from the cells after cell fusion treatment.
  • the cell suspension is appropriately diluted with, for example, fetal bovine serum-containing RPMI-1640 medium, then plated on a microtiter plate at about 3 ⁇ 10 5 cells / well, a selective medium is added to each well, and thereafter The culture is carried out with the selective medium changed.
  • the selective medium changed.
  • Hybridoma screening is not particularly limited, and may be performed according to ordinary methods. For example, a part of the culture supernatant contained in a well grown as a hybridoma can be collected, and a hybridoma producing an antibody that binds to CDH3 can be screened by enzyme immunoassay, radioimmunoassay or the like. Cloning of the fused cells is performed by limiting dilution or the like, and finally, a hybridoma that is a monoclonal antibody-producing cell can be established.
  • a normal cell culture method or ascites collection method can be employed.
  • the hybridoma is cultured in an animal cell culture medium such as RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum, MEM medium, or serum-free medium under normal culture conditions (eg, 37 ° C., 5% CO 2 concentration). Culturing for 7 to 14 days, and antibodies are obtained from the culture supernatant.
  • an animal cell culture medium such as RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum, MEM medium, or serum-free medium under normal culture conditions (eg, 37 ° C., 5% CO 2 concentration). Culturing for 7 to 14 days, and antibodies are obtained from the culture supernatant.
  • hybridomas In the case of the ascites collection method, about 1 ⁇ 10 7 hybridomas are administered into the abdominal cavity of a myeloma cell-derived mammal and a homologous animal, and the hybridomas are proliferated in large quantities. Ascites are collected after 1-2 weeks.
  • known methods such as ammonium sulfate salting-out method, ion exchange chromatography, gel filtration, affinity chromatography are appropriately selected, or a combination thereof is used. Can be purified.
  • the type of the antibody of the present invention is not particularly limited, and it is artificial for the purpose of reducing the foreign antigenicity against humans such as mouse antibody, human antibody, rat antibody, rabbit antibody, sheep antibody, camel antibody, avian antibody, etc. Any of a recombinant antibody modified into, for example, a chimeric antibody or a humanized antibody may be used.
  • the recombinant antibody can be produced using a known method.
  • a chimeric antibody is an antibody comprising a non-human mammal, for example, a mouse antibody heavy chain and light chain variable region and a human antibody heavy chain and light chain constant region, and a DNA encoding the murine antibody variable region.
  • a humanized antibody is obtained by transplanting the complementarity determining region (CDR) of a mammal other than a human, for example, a mouse antibody, to the complementarity determining region of a human antibody, and its general gene recombination technique is also known. . Specifically, several oligonucleotides were prepared so that the DNA sequence designed to link the CDR of the mouse antibody and the framework region (FR) of the human antibody had an overlapping portion at the end. It is synthesized from nucleotides by PCR. It is obtained by ligating the obtained DNA with DNA encoding a human antibody constant region, then incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it (EP239400, International Publication WO96 / 02576, etc.) .
  • CDR complementarity determining region
  • Many host cell systems used for protein expression are of mammalian origin in antibody production systems.
  • the producer can preferentially determine the particular host cell system that is most suitable for the gene product he wishes to express.
  • Common host cell lines include CHO-derived cell lines (Chinese hamster ovary cell line), CV1 (monkey kidney line), COS (derivative of CV1 that carries SV40T antigen), SP2 / 0 (mouse myeloma), P3x63-Ag3 .653 (mouse myeloma), and 293 (human kidney), 293T (a derivative of 293 that carries the SV40T antigen), but is not limited thereto.
  • Host cell lines can be obtained from commercial facilities, the American Tissue Culture Collection (ATCC), or from published publication agencies.
  • ATCC American Tissue Culture Collection
  • the host cell system is preferably either a CHO-derived cell line deficient in expression of the dgfr gene or SP2 / 0 (Urland, G. et al., Effect of gammarays at the dihydrofolate reductases locus: deletionsandsands. Cell.Mol.Genet.Vol.12, 1986, p5555-566, and Schulman, M. et al., A letter cell line for forming hybrids, specific antibiotics, 27, 27, respectively. . Most preferably, the host cell line is DHFR deficient CHO.
  • Transfection of the plasmid into the host cell can be accomplished using any technique. Specific methods include transfection (including calcium phosphate method, DEAE method, lipofection, and electroporation), a method of introducing DNA using an envelope such as Sendai virus, microinjection, retrovirus virus, adeno Examples include, but are not limited to, infection using virus vectors such as viruses (refer to Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 9 Introduction of DNA into Mammalian Cells, John Wily and Inc.). Most preferred is the introduction of the plasmid into the host by electroporation.
  • a method for obtaining a human antibody is also known.
  • human lymphocytes are sensitized in vitro with a desired antigen or cells expressing the desired antigen, and the sensitized lymphocytes are fused with human myeloma cells, such as U266, to form a desired human antibody having binding activity to the antigen.
  • a desired human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having all repertoires of human antibody genes with a desired antigen (WO93 / 12227, WO92 / 03918, WO94 / 02602, WO94 / 25585).
  • WO96 / 34096, WO96 / 33735 ).
  • variable region of a human antibody is expressed as a single chain antibody (scFv) on the surface of the phage by the phage display method, and a phage that binds to the antigen can be selected.
  • scFv single chain antibody
  • the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined. If the DNA sequence of scFv that binds to the antigen is clarified, an appropriate expression vector can be prepared from the sequence to obtain a human antibody.
  • antibodies may be monovalent antibodies, bivalent antibodies, and multivalent antibodies as long as they recognize CDH3, and may be low molecular weight antibodies such as antibody fragments (fragments) or modified antibodies. Good.
  • an Fc part may be fused to an antibody fragment or a low molecular weight antibody, for example, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , Fv, ScFv (single chain Fv), Diabody, and the like.
  • a gene encoding these antibodies may be constructed, introduced into an expression vector, and then expressed in an appropriate host cell.
  • These antibodies can also be used by binding various molecules such as polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • Such a modified antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody.
  • Antibody modification methods are known to those skilled in the art.
  • a chemotherapeutic agent can be further bound to the above-described antibody and used as a cytotoxic agent.
  • the immune complex of the present invention can injure cancer cells, for example, by contacting with a cancer cell expressing CDH3.
  • a so-called ADC in which a cytotoxic substance such as a drug is bound to an antibody can be mentioned.
  • chemotherapeutic agents used in the present invention include, for example, duocarmycin, duocarmycin analogs and derivatives, CC-1065, duocarmycin analogs based on CBI, and duocarmycins based on MCBI.
  • the ADC in the present invention can be prepared by a known method by binding the chemotherapeutic agent and the antibody.
  • the antibody and the chemotherapeutic agent may be directly bonded via a linking group or the like possessed by themselves, or may be indirectly bonded via a linker or other substance.
  • linking group in the case where the chemotherapeutic agent is directly bonded examples include a disulfide bond using SH group and a bond via maleimide.
  • the intramolecular disulfide bond in the Fc region of the antibody and the disulfide bond of the drug are reduced, and both are bonded by a disulfide bond.
  • maleimide There is also a method via maleimide. Another method is to introduce cysteine into the antibody by genetic engineering.
  • the linker preferably has one or more functional groups that react with the antibody or the chemotherapeutic agent or both.
  • functional groups include amino groups, carboxyl groups, mercapto groups, maleimide groups, pyridinyl groups, and the like.
  • linkers include N-succinimidyl 4- (maleimidomethyl) cyclohexanecarboxylate (SMCC), N-succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) -cyclohexane-1-carboxy- (6-amidocaproate) (LC -SMCC), ⁇ -maleimidoundecanoic acid N-succinimidyl ester (KMUA), ⁇ -maleimidobutyric acid N-succinimidyl ester (GMBS), ⁇ -maleimidocaproic acid N-hydroxysuccinimide ester (EMCS), m-maleimide Benzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS), N- ( ⁇ -maleimidoacetoxy) -succinimide ester (AMAS), succinimidyl-6- ( ⁇ -maleimidopropionamido) hexanoate (SMPH), N-succi N-imid
  • a so-called immunotoxin in which a toxin (toxin) is chemically or genetically bound to an antibody can be mentioned.
  • toxin used in the present invention examples include diphtheria toxin A chain, Pseudomonas endotoxin, lysine chain; sugar-free ricin A chain Gelonin saporin and the like.
  • the immune complex of the present invention exhibits high cytotoxic activity, it can be used as a cytotoxic agent. Furthermore, the antibody of the present invention can be used as a therapeutic agent for diseases with high CDH3 expression.
  • the cytotoxic agent and therapeutic agent for a disease that highly expresses CDH3 of the present invention can injure cancer cells, for example, by contacting with cancer cells expressing cadherin.
  • Human CDH3 high expression diseases include colorectal cancer, non-small cell lung cancer, breast cancer, head and neck cancer, ovarian cancer, lung cancer, invasive bladder cancer, pancreatic cancer, brain metastatic cancer, thyroid cancer, head and neck squamous cell carcinoma Esophageal squamous cell carcinoma, lung squamous cell carcinoma, skin squamous cell carcinoma, melanoma, breast cancer, lung adenocarcinoma, cervical squamous cell carcinoma, pancreatic squamous cell carcinoma, colon squamous cell carcinoma, or gastric squamous cell carcinoma, prostate cancer, Examples include osteosarcoma or soft tissue sarcoma.
  • the immune complex of the present invention can be used as a pharmaceutical composition by appropriately combining pharmaceutically acceptable carriers, excipients, diluents and the like as necessary.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated, for example, as an injection.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention depends on the patient's symptom level, age and body weight, administration method and the like, and the weight of the antibody as the active ingredient is usually in the range of about 10 ng to about 100 mg / kg body weight. It is.
  • Example 1 Establishment of a CDH3-expressing CHO cell line
  • a CHO cell expressing full-length CDH3 was established.
  • (1) Preparation of CDH3 gene expression vector In order to insert the full-length human CDH3 DNA shown in SEQ ID NO: 1 into the mammalian expression vector pEF4 / myc-HisB (Invitrogen), two types of restriction enzymes KpnI (Takara Bio) and XbaI (Takara Bio) Biotechnology) at 37 ° C.
  • CDH3 full-length expression CHO clones were selected by Western blotting using an anti-c-Myc monoclonal antibody (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY). As a result, the CDH3 full-length expression CHO cell line with high expression and good growth ( EXZ1501) was obtained.
  • FIG. 1 shows the measurement results of this cell line and a commercially available anti-CDH3 antibody (R & D SYSTEMS) using a flow cytometer.
  • Soluble CDH3 (sCDH3) protein lacking the C-terminal transmembrane region was prepared for use as an immunogen for producing anti-CDH3 antibody.
  • soluble CDH3 antigen expression vector Forward designed to amplify a portion corresponding to the CDH3 extracellular region (corresponding to 1-654 of SEQ ID NO: 2, hereinafter referred to as sCDH3 cDNA) using CDH3 full-length cDNA as a template
  • a PCR reaction was carried out using a primer (SEQ ID NO: 3: CGCGGGTACCATGGGGCTCCCTCGT) and a reverse primer (SEQ ID NO: 4: CCGTCTAGATAAACCCCCTTCCAGGGTCC).
  • the reaction was performed using KOD-Plus (Toyobo Co., Ltd.) under the reaction conditions of 94 ° C. for 15 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, 68 ° C. for 90 seconds, and 30 cycles.
  • this sCDH3 cDNA was treated with two types of restriction enzymes KpnI and XbaI and then treated with KpnI and XbaI using p4 / myc-HisB using T4 DNA ligase.
  • the insertion was performed according to the method to obtain the expression vector pEF4-sCDH3-myc-His.
  • Soluble CDH3-expressing CHO cells were selected by Western blotting using an anti-c-Myc monoclonal antibody (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY). As a result of selecting a cell line with a large amount of secretion into the culture supernatant and good growth, a soluble CDH3-expressing CHO cell line (EXZ1702) was obtained.
  • the selected soluble CDH3-expressing CHO cell line (EXZ1702) uses 3 roller bottles with a culture area of 1,500 cm 2 , and 333 mL of serum-free medium CHO-S-SFM-II (Invitrogen) per roller bottle. The culture supernatant was collected for 72 hours.
  • the obtained culture supernatant is soluble by affinity chromatography using a HisTrap (registered trademark) HP column (GE Healthcare Bioscience) and gel filtration chromatography using a Superdex (registered trademark) 200 pg column (GE Healthcare Bioscience).
  • Type CDH3 protein was obtained.
  • Example 3 Preparation of anti-CDH3 monoclonal antibody (1) Preparation of monoclonal antibody using soluble CDH3 protein as immunogen 50 ⁇ g of soluble CDH3 protein dissolved in physiological saline and Titer-MAX Gold (registered trademark) (Titer Max) was mixed in an equal amount, and MRL / lpr mice (Japan SLC Co., Ltd.) were injected intraperitoneally and subcutaneously to perform initial immunization. The second and subsequent immunizations were carried out by mixing the similarly prepared soluble CDH3 protein equivalent to the amount of 25 ⁇ g protein and Titer-MAX Gold and injecting them intraperitoneally and subcutaneously.
  • Titer-MAX Gold registered trademark
  • mice Three days after the final immunization, spleen cells were aseptically prepared from mice, and cell fusion with mouse myeloma cells SP2 / O-Ag14 or P3-X63-Ag8.653 was carried out by the polyethylene glycol method according to a conventional method.
  • Anti-CDH3 antibody was selected by flow cytometry using a CHO cell line (EXZ1501) that expresses full-length CDH3.
  • a CHO cell line (EXZ1501) expressing full-length CDH3 was treated with 2 mM EDTA-PBS, detached from the culture plate, and then suspended in a FACS solution so as to be 1 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • This cell suspension was seeded in a 96-well plate at 50 ⁇ L / well, the hybridoma culture supernatant was added, reacted at 4 ° C. for 60 minutes, washed twice with FACS solution (200 ⁇ L / well), and then AlexaFluor 488. Labeled anti-mouse IgG • goat F (ab ′) 2 (Invitrogen) was added and reacted at 4 ° C. for 30 minutes. Thereafter, the cells were washed twice with a FACS solution, followed by flow cytometry, and hybridomas that were found to react with CDH3-expressing CHO cells were selected.
  • Typical antibodies obtained from the hybridoma and CDH3-expressing CHO cells (EXZ1501), the parental CHO cells, and the human bronchioloalveolar carcinoma cell line NCI-H358 that has been confirmed to be highly expressed
  • the reaction results are shown in FIG. It was confirmed that all the selected hybridomas reacted with CDH3-expressing CHO cells (EXZ1501) and NCI-H358 but not with CHO cells.
  • RNA was prepared from normal human tissue and various cancer tissues from a sample collected by laser microdissection (Laser Capture Microdetection) using ISOGEN (Nippon Gene) according to a standard method. did. Gene expression of each RNA of 10 ng was analyzed using GeneChip U-133B (Affymetrix) according to Expression Analysis Technical Manual (Affymetrix). When an average expression score of all genes was set to 100 and a gene whose expression is enhanced in cancer cells was searched for, CDH3 expression was limited in normal human tissues, and expression was high in lung cancer, colon cancer and pancreatic cancer (Fig. 3A, B). Further, when the expression of CDH3 mRNA in pancreatic cancer tissues having different degrees of differentiation was examined, tissues with high expression were recognized regardless of the degree of differentiation (FIG. 3C).
  • Example 5 Expression of CDH3 protein in cancer tissue by immunohistochemical staining
  • immunostaining was performed on a cancer specimen tissue array.
  • the cancer cell tissue array is manufactured by Shanghai Outdo Biotech Co., Ltd., pancreatic cancer (adenocarcinoma), lung cancer (adenocarcinoma), lung cancer (squamous cell carcinoma) and colon cancer (glandular gland). Cancer).
  • Each tissue array slide was deparaffinized and activated with 10 mM Tris 1 mM EDTA (pH 9.0) at 95 ° C. for 40 minutes. After inactivation of endogenous peroxidase with a blocking reagent attached to ENVISION + Kit (Dako), anti-CDH3 antibody 610227 (BD BIOSICSENCE), and anti-HBs antibody Hyb-3423 as a negative control at a concentration of 5 ⁇ g / mL The reaction was allowed to proceed overnight at 4 ° C. After washing off the antibody solution, it was reacted with the polymer secondary antibody reagent attached to ENVISION + Kit for 30 minutes at room temperature.
  • RNA present in the cytoplasm was isolated from Gough, Rapid and quantitative preparation of cytoplasmic RNA from small numbers of cells, Analytical Biochemisty, 173, p93-95 (1988). ) (But instead of the lysis buffer described in this article, another TNE buffer 25 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1% NP-40; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA) , pH 8.0 was used). As a specific operation method, 5 ⁇ 10e6 hybridoma cells were suspended in 0.2 mL of TNE buffer to dissolve the cell membrane, and then cell nuclei were removed by centrifugation.
  • RNA precipitate was then dissolved by adding 10-50 microliters of sterile distilled water so that the cytoplasmic RNA concentration was 0.5-2 microgram / microliter.
  • Example 7 Preparation of cDNA library from RNA prepared from hybridoma
  • cytoplasmic RNA prepared as described above was added to 50 mM Tris-HCl, pH 8.3.
  • Tris-HCl pH 8.3.
  • the cDNA library thus synthesized was directly used as a template for the polymerase chain reaction (PCR) method.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Example 8 Amplification of Gene Encoding Anti-CDH3 Antibody Variable Region by PCR Method All primers used in the experiment were synthesized by Hokkaido System Science Co., Ltd.
  • the mouse immunoglobulin light chain variable region DNA was isolated from the cDNA by polymerase chain reaction using the primer set.
  • the primer sequences were as follows:
  • Mouse L chain variable region cloning 4 set sense primer “Page Display-A Laboratory Manual-, Barbars Burton Scott Silverman” Sense Primer 17 species with Reverse Prime 9.5 referring to PROTOCOL 9.5, Reverse Primer System .
  • VK sense (FR1 portion) A mixture of the following 17 primers was used as a VK sense primer.
  • 5′-GAYATCCAGCTGACTCAGCC-3 ′ (degeneracy 2): SEQ ID NO: 5 5′-GAYATTGTTCTCWCCCAGTC-3 ′ (degeneracy 4): SEQ ID NO: 6 5′-GAYATTGTGMTMACTCAGTC-3 ′ (degree of degeneracy 8): SEQ ID NO: 7 5′-GAYATTTGTGYTRACACAGTC-3 ′ (degeneracy 8): SEQ ID NO: 8 5′-GAYATTGTRATGACMCAGTC-3 ′ (degree of degeneracy 8): SEQ ID NO: 9 5′-GAYATTTMAGATRAMCCAGTC-3 ′ (degree of degeneracy 16): SEQ ID NO: 10 5′-GAYATTCAGATGAYDCAGTC-3 ′ (degeneracy 12): SEQ ID NO: 11 5′-GAYATYCAGATGACA
  • J antisense (4 sets primer) J1 / J2 antisense primer (1) 5′-GGSACCAARCTGGAAATMAA-3 ′ (degeneracy: 8): SEQ ID NO: 22 J4 antisense primer (2) 5′-GGGACAAAGTTGGGAAATAAA-3 ′: SEQ ID NO: 23 J5 antisense primer (3) 5′-GGGACCAAGCTGGAGCTGAAA-3 ′: SEQ ID NO: 24 J1 / J2, J4, J5 antisense primer mixture (4)
  • C set sense primer 5′-ATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGGT-3 ′: SEQ ID NO: 27
  • D Set Sense Primer (Use a mixture of the following two types of primers) 5′-ATGAGRGCCCCTGCTCCAGWTTTYTTGIGITCTT-3 ′: SEQ ID NO: 28 5′-ATGGGCWTCAAGATGRAGTCACAKWYYCWGG-3 ′: SEQ ID NO: 29
  • E Set Sense Primer (Use a mixture of the following 3 types of primers) 5′-ATGAGTTGCYCYCACTCAGGTCCTGGSGTT-3 ′: SEQ ID NO: 30 5′-ATGTGGGGGAYCGKTTTYAMMCTTTCAATTG-3 ′: SEQ
  • 5′-ATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT-3 ′ (degeneracy: 32): SEQ ID NO: 42 5′-ATGRACTTCGGGGYTGAGCTKGGTTTTT-3 ′ (degeneracy: 8): SEQ ID NO: 43 5′-ATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTTCT-3 ′: SEQ ID NO: 44 5′-ATGGRCACGRCCTTACWTYY-3 ′ (degeneracy: 32): SEQ ID NO: 45
  • VH sense (FR1 part) This primer is based on Tan et al., “Superhumanized” Antibodies: Reduction of Immunogenic Potential by Complementarity-Determining Region Grafting with Human Germline Sequences: Application to an Anti-CD281, Journal of Immunology 169 (2002) p1119-1125 Modified and designed.
  • 5′-SAGGTSMARKTCSAGAGSAGTCWGG-3 ′ (Degeneracy: 256): SEQ ID NO: 46
  • VH antisense (antisense primer common to 3 and 4)
  • the nucleotide sequence was designed to be degenerate so that it could be annealed with all mouse IgG isoforms.
  • 5′-CASCCCCCATCDGTCTATCC-3 ′ (degeneracy: 6): SEQ ID NO: 47
  • Example 9 Production of Transient Expression Vector of Chimeric Anti-CDH3 Immunoglobulin Production of Expression Plasmid: Anti-CDH3 mouse monoclonal antibody L chain, H by PCR using DNA Engineer (Peltier Thermal Cycler, MJ Research, Bio-Rad) The variable region of each strand was amplified using the primers shown in Example 8. The amplified DNA fragment was incorporated into a subcloning vector pGEM (Promega), and the nucleotide sequence was determined using T7 and SP6 universal primers of this vector.
  • pGEM Promega
  • Table 1 shows the sequences obtained by converting the portion corresponding to the CDR of the base sequence determined at that time into amino acids.
  • the genes encoding the V regions of the L chain and H chain of the cloned anti-CDH3 antibody are the genes encoding the human Ck region for the chimeric L chain expression vector and human Cg1 for the chimeric H chain expression vector. Genes connecting the genes encoding the regions were designed, and these L-chain and H-chain chimeric antibody genes were artificially synthesized in full length by GenScript.
  • mouse IGKV k chain variable region gene signal peptide
  • anti-CDH3 antibody L chain V region human KC (k chain constant region) in this order
  • both ends A restriction enzyme site (NheI on the 5'-side and EcoRI on the 3'-side) was added.
  • a chimeric H chain was prepared in the same manner.
  • These artificially synthesized genes were cleaved with NheI and EcoRI and incorporated into the NheI and EcoRI sites of the expression vector pCAGGS to obtain an anti-CDH3 chimeric antibody L chain expression vector pCAGGS-IGK and a heavy chain expression vector pCAGGS-IGH.
  • Example 10 Production of Stable Expression Vector of Chimeric Anti-CDH3 Immunoglobulin Dihydrofolate with poly A signal linked to CMV promoter sequence for high-level expression of engineered antibody gene using CHO cells
  • An expression vector incorporating the reductase (dhfr) gene was prepared.
  • a pCAGGS expression vector incorporating the dhfr gene was prepared.
  • a dhfr gene having a CMV promoter and a poly A signal is incorporated into the transient expression vectors pCAGGS-IGH and pCAGGS-IGK.
  • a CMV promoter, a mouse dhfr gene having a Kozak sequence, and an SV40 polyA signal are each amplified by the PCR method, a mixture of these genes is connected by the PCR method, and HindIII sites are added to both ends to form a HindIII-CMV promoter-Kozak
  • a gene fragment called -dhfr-polyA-HindIII was obtained. This fragment was incorporated into the HindIII site of pCAGGS-IGH or pCAGGS-IGK to obtain pCAGGS-IGH-CMVp-dhfr-A and pCAGGS-IGK-CMVp-dhfr-A.
  • These expression vectors were able to express the chimeric antibody with the CAG promoter and the dhfr gene with the CMV promoter, and could efficiently produce the chimeric antibody using gene amplification.
  • Example 11 Establishment of chimeric anti-CDH3 producing CHO cell line CHO dhfr (-) cells (G. Urlaub et al., Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, p4216-4220 , 1980), pCAGGS-IGK-CMV- for expressing a chimeric anti-CDH3 light chain, that is, the plasmid was cut from PvuI in the ampicillin resistance gene into a linear plasmid from the circular plasmid.
  • the electroporated cells were added to Iscove's Modified Dulbecco medium (IMDM) containing 10% dialyzed FBS and not containing HT (H, hypoxanthine: T, thymidine).
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco medium
  • HT hypoxanthine: T, thymidine
  • neo + transformed cells were selected with 1 mg / mL G418, and a chimeric antibody-producing positive cell line clone Got.
  • gene amplification was performed using clones selected with G418. After amplification in 2 rounds of 0.25 mM, 1 mM methotrexate (MTX), a cell line producing about 50-100 mg of chimeric CDH3 antibody per liter could be established.
  • MTX methotrexate
  • Example 12 Quantification of Chimeric Antibody by Enzyme Immunoassay (ELISA)
  • the culture supernatant of a gene-introduced CHO cell was measured by ELISA to confirm that a chimeric antibody was produced.
  • the plates were coated with goat anti-human IgG (H + L) (absorbed against mouse, rabbit, bovine, mouse IgG) (Cosmo Bio: AQI, Cat A-110UD). After blocking, the culture supernatant from anti-CDH3 chimeric antibody-producing CHO cells was serially diluted and added to each well.
  • Example 13 Binding activity of chimeric antibody Antibodies having the CDR sequences of the combinations shown in Table 2 were prepared by the methods shown in Examples 10 and 11, and the binding activity was evaluated by flow cytometry.
  • Each cell line to be reacted (CHO cell, CDH3 forced expression CHO cell and NCI-H358 cell line in which high expression of CDH3 has been confirmed) is treated with 2 mM EDTA-PBS, and then detached from the culture plate. It suspended in the FACS solution so that it might become 10 ⁇ 6 > piece / mL. This cell suspension was seeded in a 96-well plate at 50 ⁇ L / well, the purified chimeric antibody was added at 10 ug / mL, and reacted at 4 ° C. for 60 minutes.
  • CDR-H1, H2 and H3 represent the respective antibody H chains
  • CDR-L1, L2 and L3 represent the CDR sequences constituting the respective antibody L chains.
  • Example 14 Drug Synthesis DM1SMe ( Figure 6) was prepared as previously described in US Patent Nos. 5,208,020 and 6,333,410B1.
  • Example 15 Preparation of drug-bound antibody Reduction treatment of binding agent 0.78 mg of DM1SMe dissolved in 300 uL of EtOH, 180 uL of 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5), 20 uL of TCEP Solution (Bond Breaker, Thermo Fisher Scientific) were mixed, and under a nitrogen atmosphere, The drug was reduced by reacting at room temperature for 30 minutes or more.
  • the reducing agent was purified using HPLC, and then the solvent was distilled off and dissolved in dimethylacetamide so as to be 10 mg / mL.
  • Example 16 Quantification of antibody drug binding amount The number of drug bonds per antibody was determined by measuring absorbance at 252 nm and 280 nm. The determination method is described in non-patent literature (Widdison, WC, Wilhelm, SD, Cavanagh, EE, et al. (2006) Semisynthetic maytansine analogues for the targeted treatment of cancer. J. Med. Chem., 49, 4392-4408).
  • the extinction coefficients ⁇ Ab 280 223,000 M ⁇ 1 cm ⁇ 1
  • ⁇ Ab 252 82,510 M ⁇ 1 cm ⁇ 1
  • ⁇ DM1 280 5,180 M ⁇ 1 cm ⁇ 1
  • Example 17 Cytotoxicity Test The cytotoxicity and specificity of drug-bound antibodies were evaluated using a cell proliferation assay reagent (Dojindo Laboratories, Cell counting assay kit-8) using WST-8 as a chromogenic substrate. That is, human breast cancer cell line HCC1954 confirmed to have high expression of CDH3 and drug-bound antibody (ADC) or antibody not bound (Naked) in an arbitrary amount coexisted at 37 degrees for 3 days, Incubated in a 5% CO 2 environment. Thereafter, the absorbance of A450 / 620 was measured after adding the cell proliferation measurement reagent and allowed to stand, and the relative value when the absorbance value obtained from the well in which only the cancer cell line was not added with the antibody was taken as 100% was used as the cell viability.
  • ADC drug-bound antibody
  • Example 18 Cytotoxicity test (comparison for each antibody) The cytotoxicity of the drug-bound antibody was evaluated using the obtained plurality of anti-CDH3 antibodies. The measurement was in accordance with the method described in Example 17. That is, human breast cancer cell line HCC1954 and drug-binding antibody (ADC) were allowed to coexist and incubated at 37 ° C. for 3 days in a 5% CO 2 environment. The ADC concentration at that time was 0.01 ug / mL. Thereafter, the absorbance of A450 / 620 was measured after adding the cell proliferation measurement reagent and allowed to stand, and the relative value when the absorbance value obtained from the well in which only the cancer cell line was not added with the antibody was taken as 100% was used as the cell viability. Expressed as a rate. The number of drugs per molecule of each antibody antibody was estimated by the method described in Example 16 (Table 3). As the negative control antibody, an antibody that was confirmed not to react with HCC1954 was used.
  • Administration was performed by dissolving anti-asialo GM1 antibody (WAKO 014-09801) in 1 mL of Otsuka distilled water, adding 4 mL of Otsuka saline to a total volume of 5 mL, and then intraperitoneally administering this solution per mouse.
  • HCC1954 was cultured using 10% FBS-containing RPMI1640 medium, and transplanted to 5 ⁇ 10 6 mice / mouse subcutaneously on the right flank of SCID mice (female, CLEA Japan).
  • the in vivo test was 5 animals in each group, and 15 mg / kg was administered from the tail vein. Administration was started when the average tumor diameter reached 100-150 mm3, and one week later, the same amount was further administered twice in total.
  • antibody numbers 067-12C, 067-23C and 067-27C were used, and for ADC, the number of drugs introduced per antibody was calculated by the method described in Example 16. It was estimated that 3-4 drugs were introduced per molecule.
  • the change in tumor size is shown in FIG.

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Description

抗ＣＤＨ３（Ｐ－カドヘリン）抗体の薬剤コンジュゲート
　本発明は、抗ＣＤＨ３抗体の薬剤コンジュゲートに関する。本発明はさらに抗ＣＤＨ３抗体の薬剤コンジュゲートの使用方法に関する。
　癌は、死亡原因の上位を占める重要な疾患であるが、その治療ニーズはいまだ満たされていない。近年、従来の化学療法の正常細胞にもダメージを与えるという問題点を解決するために、癌細胞に特異的に発現する特定の分子を標的として薬剤を設計し治療を行う分子標的薬による癌治療が盛んに研究されている。
　その標的のひとつとして細胞表面抗原であるＣＤＨ３が同定される。ＣＤＨ３はカルシウム依存的に同種親和性の細胞接着に関与する分子として発見された膜タンパク質である（Ｙｏｓｈｉｄａ　ａｎｄ　Ｔａｋｅｉｃｈｉ,  Ｃｅｌｌ　２８：２１７ー２２４,１９８２）。相互にホモロジーが高い約１１０アミノ酸残基からなるカドヘリンリピートを持つタンパク質はカドヘリンスーパーファミリーと呼ばれ、ＣＤＨ３はその主要メンバーに属する。
　ある種の癌細胞においてはＣＤＨ３の発現上昇例が報告されており、正常組織と比較して癌組織でのＣＤＨ３の発現が高い癌細胞に対して抗体を用いた癌治療が検討されている（ＷＯ２００２／０９７３９５号公報、ＷＯ２００７／１０２５２５号公報）。
　分子標的薬としては、すでに多くの抗体医薬が実際に上市され、その多くは抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を主な作用機序としている。しかしながら、その薬効は必ずしも十分なものではなく、より強力な抗腫瘍効果を目指した技術開発も同時に進められている。
　抗体の抗腫瘍能を増強する有効な手段の一つとして抗体と強力な毒性を有する薬剤（毒素）との連結があげられる。毒素はそれ単独で患者に投与すると、正常組織にも障害を及ぼし、有効な治療手段とはなり得ない。しかしながら、腫瘍細胞特異的な抗原と結合する抗体と連結することにより、正常な組織に悪影響を及ぼさず、腫瘍細胞のみ殺傷しえる能力を持つに至る。こうした薬剤は抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）と呼ばれる。即ち、毒素は抗体と結合している状態では何ら毒性を示さない。しかし、ある種の抗体は標的とする抗原に結合すると細胞内に取り込まれ、リソソームにて分解される。したがって、毒素を結合したその種の抗体が細胞内に取り込まれ、細胞内で分解される事で毒素が放出され、特定の細胞内部においてのみ毒性が発現し、その効果により細胞は殺傷される。
ＡＤＣに用いられる薬剤成分には、ジフテリア毒素などの細菌性タンパク質毒素、リシンなどの植物タンパク質毒素、アウリスタチン、メイタンシノイド、カリキアマイシンなどの低分子毒素及びその誘導体が含まれる。
　ＡＤＣにおいて、抗体に結合している薬剤は血液中を循環し、標的とする腫瘍に集積した後に薬効をしめす。腫瘍部位以外での薬剤の放出（抗体からの離脱）は、副作用を生じる危険性があるため必ずしも好ましくはない。つまり、抗体に結合している薬剤は細胞内に取り込まれた後に抗体から離脱する設計が好ましい。近年ジェネンテック社は、このような観点からトラスツズマブに非開裂型リンカー（ＳＭＣＣ）を介して毒素を結合した薬剤（Ｔ－ＤＭ１）を開発、臨床試験がすすめられ、非常に高い臨床効果を示している。また、開裂性リンカーを介して薬剤成分と連結した抗体薬剤コンジュゲートも開発される。例えば、ＮＣＡＭ抗原を発現する癌を対象に、ジスルフィドリンカー（ＳＰＰ）を介して薬剤とＨｕＮ９０１抗体を結合させた抗体薬剤コンジュゲートの開発がＩｍｍｕｎｏＧｅｎ社により進められている。
　上記の通り、ＡＤＣにより癌を治療するというコンセプトは公知である。当分野では、肺がん、大腸がんといった様々な癌を治療するための更なる薬剤に対する需要がある。この目的のために特に有用な薬剤に、有意に毒性が低いが有益な治療的有効性がある抗ＣＤＨ３抗体薬剤コンジュゲートが含まれる。これら及び他の制限ないし過去の問題点は本発明によって解決されうる。
ＷＯ２００２／０９７３９５号公報 ＷＯ２００７／１０２５２５号公報
Ｙｏｓｈｉｄａ　ａｎｄ　Ｔａｋｅｉｃｈｉ,  Ｃｅｌｌ　２８：２１７ー２２４,１９８２
　本発明は、ＣＤＨ３を発現する癌細胞を効率的に殺傷する抗ＣＤＨ３抗体薬剤コンジュゲートを提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＣＤＨ３に対する抗体と化学療法剤とを連結して成る免疫複合体が、ＣＤＨ３を発現する癌細胞株に対して強力な細胞傷害活性を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明によれば、ＣＤＨ３に対する抗体又はＣＤＨ３結合能を有するその断片と化学療法剤とを連結して成る免疫複合体が提供される。
　好ましくは、本発明の免疫複合体は、ＣＤＨ３に対する抗体又はＣＤＨ３結合能を有するその断片が、ＣＤＨ３を発現している細胞に対して細胞傷害能を示す。
　好ましくは、ＣＤＨ３に対する抗体は、ＣＤＨ３またはＣＤＨ３を発現している細胞を免疫原として投与した免疫細胞から取得した抗体産生細胞が産生する抗体である。
　好ましくは、前記抗体はモノクローナル抗体である。
　好ましくは、前記抗体はキメラ化されている。
　好ましくは、前記抗体はヒト化されている。
　好ましくは、前記抗体はヒト抗体である。
　好ましくは、前記抗体は、Ｈ鎖に配列番号４８、５６及び６５に記載されたアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖に配列番号７５、８２及び８６に記載されたアミノ酸配列を含む。
　好ましくは、前記抗体は、Ｈ鎖に配列番号５２、６０及び７０に記載されたアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖に配列番号７５、８２及び９１に記載されたアミノ酸配列を含む。
　好ましくは、前記抗体は、Ｈ鎖に配列番号５４、６２及び７２に記載されたアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖に配列番号７４、８１及び９３に記載されたアミノ酸配列を含む。
　好ましくは、前記抗体は、Ｈ鎖に配列番号５５、６３及び７３に記載されたアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖に配列番号８０、８５及び９４に記載されたアミノ酸配列を含む。
　好ましくは、前記抗体は、Ｈ鎖に配列番号４９、６４及び６６に記載されたアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖に配列番号７６、８４及び８９に記載されたアミノ酸配列を含む。
　好ましくは、前記抗体は、Ｈ鎖に配列番号４９、５８及び６８に記載されたアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖に配列番号７９、８２及び９０に記載されたアミノ酸配列を含む。
　好ましくは、前記抗体は、Ｈ鎖に配列番号５３、６１及び７１に記載されたアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖に配列番号７５、８２及び９２に記載されたアミノ酸配列を含む。
　好ましくは、前記抗体は、Ｈ鎖に配列番号５１、５７及び６７に記載されたアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖に配列番号７８、８３及び８８に記載されたアミノ酸配列を含む。
　好ましくは、前記抗体は、Ｈ鎖に配列番号５０、５９及び６９に記載されたアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖に配列番号７７、８３及び８７に記載されたアミノ酸配列を含む。
　好ましくは、前記抗体は、上記した本発明の抗体のＨ鎖のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＨ鎖を有する。
　好ましくは、ＣＤＨ３は哺乳類のＣＤＨ３である。
　好ましくは、ＣＤＨ３は霊長類のＣＤＨ３から選択される。
　好ましくは、ＣＤＨ３はヒトのＣＤＨ３から選択される。
　好ましくは、ＣＤＨ３は、細胞の表面に発現されるＣＤＨ３である。
　好ましくは、前記ＣＤＨ３結合能を有する抗体断片は、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）2、又はｓｃＦｖである。
　好ましくは、前記化学療法剤は、細胞障害性物質である。
　好ましくは、前記細胞傷害性物質は、メイタンシノイド及びその誘導体から選択される。
　好ましくは、前記細胞傷害性物質は、アウリスタチン及びその誘導体から選択される。
　好ましくは、前記メイタンシノイド及びその誘導体は、ＤＭ１、ＤＭ３、ＤＭ４から選択される。
　好ましくは、前記アウリスタチン及びその誘導体は、ＭＭＡＥあるいはＭＭＡＦから選択される。
　好ましくは、前記細胞性障害剤は、ＤＭ１である。
　好ましくは、ＣＤＨ３に対する抗体又はＣＤＨ３結合能を有するその断片１分子あたり１～10個のＤＭ１が結合している。
　好ましくは、ＣＤＨ３に対する抗体又はＣＤＨ３結合能を有するその断片１分子あたり3～8個のＤＭ１が結合している。
　好ましくは、ＣＤＨ３に対する抗体又はＣＤＨ３結合能を有するその断片と化学療法剤との結合はリンカーを介してなる。
　好ましくは、ＣＤＨ３に対する抗体又はＣＤＨ３結合能を有するその断片と化学療法剤との結合は、抗体のＦｃ領域の分子内ジスルフィド結合を介してなる。
　好ましくは、ＣＤＨ３に対する抗体又はＣＤＨ３結合能を有するその断片と化学療法剤との結合は、抗体のＦｃ領域を遺伝子工学的に改変して結合したものである。
　好ましくは、ＣＤＨ３に対する抗体又はＣＤＨ３結合能を有するその断片と化学療法剤とを結合させるリンカーは、２価反応性架橋試薬である。
　好ましくは、前記リンカーは、Ｎ－スクシンイミジル４－(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ－スクシンイミジル－４－(Ｎ－マレイミドメチル)－シクロヘキサン－１－カルボキシ－(６－アミドカプロエート) （ＬＣ－ＳＭＣＣ）、κ－マレイミドウンデカン酸Ｎ－スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ－マレイミド酪酸Ｎ－スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε－マレイミドカプロン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ－(α－マレイミドアセトキシ)－スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル－６－(β－マレイミドプロピオンアミド)ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ－スクシンイミジル４－(ｐ－マレイミドフェニル)－ブチレート（ＳＭＰＢ）、およびＮ－(ｐ－マレイミドフェニル)イソシアネート（ＰＭＰＩ）、６-マレイミドカプロイル(ＭＣ)、マレイミドプロパノイル(ＭＰ)、ｐ-アミノベンジルオキシカルボンイル(ＰＡＢ)、Ｎ-スクシンイミジル４(２-ピリジルチオ)ペンタノエート(ＳＰＰ) 及びＮ-スクシンイミジル(４-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(ＳＩＡＢ)、Ｎ-スクシンイミジル（4- (2-ピリジルチオ)ブタノエート（ＳＰＤＢ）から成る群より選択される。
　好ましくは、前記リンカーは、プロテアーゼによって切断される。
　好ましくは、前記リンカーはval-citを含む。
　好ましくは、前記リンカーはＰＡＢＡを含む。
　さらに本発明によれば、ＣＤＨ３の過剰発現によって特徴づけられる癌を治療するための、本発明の免疫複合体を含む医薬組成物が提供される。
　好ましくは、本発明の医薬組成物は、抗がん作用を有する。
　好ましくは、前記癌は、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、乳癌、頭頚部癌、卵巣癌、肺癌、浸潤性膀胱癌、膵臓癌、脳の転移性癌、甲状腺癌、頭頚部扁平上皮癌、食道扁平上皮癌、肺扁平上皮癌、皮膚扁平上皮癌、メラノーマ、乳腺癌、肺腺癌、子宮頚部扁平上皮癌、膵臓扁平上皮癌、結腸扁平上皮癌、又は胃扁平上皮癌、前立腺癌、骨肉腫又は軟組織肉腫から選択される。
　本発明で提供される抗ＣＤＨ３抗体と化学療法剤とを連結して成る免疫複合体は、化学療法剤を結合しない抗体と比較して、ＣＤＨ３を発現する癌細胞株に、より強力な細胞傷害活性を示す。従って、本発明の免疫複合体は、ＣＤＨ３を発現する癌細胞を有する患者に投与することにより、高い抗癌作用の発揮が期待できる。即ち、本発明の免疫複合体は、抗癌剤として有用である。
図１は、ヒトＣＤＨ３強制発現細胞株と市販抗ヒトＣＤＨ３抗体を反応させたフローサイトメトリの結果を示す。Ａ：ＣＨＯ細胞、Ｂ：ＣＤＨ３強制発現ＣＨＯ細胞。ａ：抗ＣＤＨ３抗体０.０１ｍｇ／ｍＬ、ｂ：抗ＣＤＨ３抗体０．１ｍｇ／ｍＬ、ｃ：抗ＣＤＨ３抗体１ｍｇ／ｍＬ 図２は、取得抗体３例と各細胞株との典型的なフローサイトメトリ結果を示す。Ａ：ＣＤＨ３強制発現ＣＨＯ細胞、Ｂ：ＣＨＯ細胞、Ｃ：肺がん由来細胞株ＮＣＩ－Ｈ３５８。ａ：抗ＣＤＨ３抗体０．０１ｍｇ／ｍＬ、ｂ：抗ＣＤＨ３抗体０．１ｍｇ／ｍＬ、ｃ：抗ＣＤＨ３抗体１ｍｇ／ｍＬ。 図３は、各種腫瘍組織のＣＤＨ３のｍＲＮＡの発現結果を示す。Ａ：正常組織、Ｂ：各種癌組織、Ｃ：膵臓癌分化度 図４は、各種ヒト腫瘍組織でのＣＤＨ３の発現結果を示す。 図５は、各ＣＤＨ３キメラ抗体を反応させたフローサイトメトリの結果を示す。Ａ：ＣＨＯ細胞、Ｂ：ＣＤＨ３強制発現ＣＨＯ細胞、Ｃ：肺がん由来細胞株ＮＣＩ－Ｈ３５８ 図６は、ＤＭ１ＳＭｅの構造を示す。 図７は、ＣＤＨ３抗体薬剤コンジュゲートの細胞傷害性試験結果を示す。ＡＤＣ：ＣＤＨ３抗体薬剤コンジュゲート、Ｎａｋｅｄ：薬剤未結合ＣＤＨ３抗体。 図８は、ＣＤＨ３抗体薬剤コンジュゲートを用いた動物試験結果を示す。ＡＤＣ：ＣＤＨ３抗体薬剤コンジュゲート、Ｎａｋｅｄ：薬剤未結合ＣＤＨ３抗体。
　以下、本発明について更に詳細に説明する。
　本発明の免疫複合体は、癌細胞を効率的に殺傷する抗ＣＤＨ３抗体薬剤コンジュゲートとして提供される。
　本発明の抗体を作成するための抗原としては、ＣＤＨ３又はその部分ペプチドを用いることができる。一例としては、可溶型ＣＤＨ３タンパク質などを用いることができるが、これに限定されるものではない。
　本発明で使用される抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。本発明の抗体は、種々の方法のいずれかによって製造することができる。抗体の製造法は当該分野で周知である[例えばＳａｍｂｒｏｏｋ,  Ｊ　ｅｔ　ａｌ.,　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ,  Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照]。
（ａ）ポリクローナル抗体の作製
　ポリクローナル抗体を作製するためには、ＣＤＨ３又はその部分ペプチドを抗原として、これを哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは０．１～１００ｍｇであり、アジュバントを用いるときは１～１００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２～５週間間隔で、１～１０回、好ましくは２～５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から６～６０日後に、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ）又はＥＩＡ（ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ））、放射性免疫測定法（ＲＩＡ；ｒａｄｉｏ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
（ｂ）モノクローナル抗体の作製
　モノクローナル抗体を作製するためには、先ず、ＣＤＨ３又はその部分ペプチドを抗原として、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは０．１～１００ｍｇであり、アジュバントを用いるときは１～１００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２～５週間間隔で、１～１０回、好ましくは２～５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から１～６０日後、好ましくは１～１４日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
　細胞融合ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えば　Ｐ３Ｘ６３－Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＮＳ－１などのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
　次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、１×１０6～１×１０7個／ｍｌの抗体産生細胞と２×１０5～２×１０6個／ｍｌのミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比５：１が好ましい）、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１０００～６０００ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
　細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ－１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に３×１０5個／ｗｅｌｌ程度まき、各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、１４日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
　次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によって、ＣＤＨ３と結合する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立することができる。
　樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水採取法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ－１６４０培地、ＭＥＭ培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％ＣＯ2濃度）で７～１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。
　腹水採取法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１×１０7個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１～２週間後に腹水を採集する。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
　本発明の抗体の種類は特に制限されず、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体、トリ抗体等や、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体等の何れでもよい。遺伝子組換え型抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ　Ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（ＥＰ２３９４００号公報、国際公開ＷＯ９６／０２５７６号公報など）。
　タンパク質発現に使用する宿主細胞系は、抗体生産系では哺乳動物起源のものが多い。該生産者は発現したい遺伝子産物に最も適する特定の宿主細胞系を優先的に決定できる。一般的な宿主細胞系としては、ＣＨＯ由来細胞株（チャイニーズハムスター卵巣細胞系）、ＣＶ１（サル腎臓系）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原をするＣＶ１の誘導体）、ＳＰ２／０（マウスミエローマ）、Ｐ３ｘ６３－Ａｇ３．６５３（マウスミエローマ）、および２９３（ヒト腎臓）、２９３Ｔ（ＳＶ４０Ｔ抗原をする２９３の誘導体）が挙げられるがそれらに限定されない。宿主細胞系は商業施設やｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から、または発表された文献の発表機関から入手することができる。
　宿主細胞系として、好ましくはｄｇｆｒ遺伝子の発現欠損であるＣＨＯ由来細胞株かＳＰ２／０のいずれかである（Ｕｒｌａｎｄ，　Ｇ．　ら、Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｇａｍｍａ　ｒａｙｓ　ａｔ　ｔｈｅ　ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　ｌｏｃｕｓ：　ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｉｎｖｅｒｓｉｏｎｓ，　Ｓｏｍａｔ．　Ｃｅｌｌ．　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎｅｔ．　Ｖｏｌ．　１２，　１９８６，　ｐ５５５５-５６６、および、Ｓｃｈｕｌｍａｎ，　Ｍ．　ら、Ａ　ｂｅｔｔｅｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ｆｏｒ　ｍａｋｉｎｇ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ　ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，　Ｎａｔｕｒｅ　Ｖｏｌ．　２７６，　１９７８，　ｐ２６９-２７０　をそれぞれ参照のこと）。最も好ましくは、宿主細胞系はＤＨＦＲ欠失ＣＨＯである。
　宿主細胞中へのプラスミドのトランスフェクションは、任意の技術を使って達成できる。具体的な方法としては、トランスフェクション（リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ法、リポフェクション、およびエレクトロポレーションを含む）、センダイウイルス等のエンベロープを利用してＤＮＡを導入する方法、マイクロインジェクション、およびレトロウイルスウイルスやアデノウイルス等のウイルスベクターを用いた感染が挙げられるが、それらに限定されない（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｃｈａｐｔｅｒ　９　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｉｎｔｏ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅｌｌｓ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．を参照のこと）。最も好ましいのは、エレクトロポレーションによる宿主中へのプラスミド導入である。
　また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ　ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１－５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９３／１２２２７,ＷＯ９２／０３９１８，ＷＯ９４／０２６０２,ＷＯ９４／２５５８５，ＷＯ９６／３４０９６,ＷＯ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列から適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、ＷＯ９２／０１０４７,ＷＯ９２／２０７９１, ＷＯ９３／０６２１３,ＷＯ９３／１１２３６,ＷＯ９３／１９１７２,ＷＯ９５／０１４３８,ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。
　また、これらの抗体は、ＣＤＨ３を認識する限り、一価抗体、二価抗体、多価抗体のいずれでもよく、抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体や抗体の修飾物などであってもよい。また、抗体断片や低分子化抗体、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ＳｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ）、ＤｉａｂｏｄｙなどにＦｃ部分を融合したものでもよい。このような抗体を得るには、これら抗体をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい。
　これらの抗体に、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子を結合して使用することもできる。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法は当業者に公知である。
　本発明の免疫複合体においては、上記の抗体に、更に化学療法剤を結合して、細胞傷害剤として使用することができる。本発明の免疫複合体は、例えばＣＤＨ３を発現している癌細胞と接触させることにより癌細胞を傷害することができる。
　本発明の免疫複合体の好ましい態様としては、抗体に薬剤等の細胞傷害性物質を結合したいわゆるＡＤＣをあげることができる。
　本発明で用いられる化学療法剤の例としては例えばデュオカルマイシン、デュオカルマイシンのアナログ及び誘導剤、ＣＣ－１０６５、ＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ＭＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ＣＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ドキソルビシン、ドキソルビシンコンジュゲート、モルフォリノ－ドキソルビシン、シアノモルフォリノ－ドキソルビシン、ドラスタチン、ドレスタチン－１０、コンブレタスタチン、カリケアマイシン(calicheamicin)、メイタンシン、メイタンシンアナログ、ＤＭ１，ＤＭ２，ＤＭ３，ＤＭ４、ＤＭＩ、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、アウリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、５－ベンゾイルバレリン酸ＡＥエステル（ＡＥＶＢ）、チューブリシン、ジソラゾール、エポシロン、パクリタキセル、ドセタキセル、ＳＮ－３８、トポテカン、リゾキシン、エキノマイシン、コルヒチン、ビンブラスチン、ビンデシン、エストラムスチン、セマドチン、エリューテロビン、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、５－フルオロウラシル、６－メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、リューロシン、リューロシダイン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ダウノルビシンコンジュゲート、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシン、ポドフィロトキシン誘導体、エトポシド、エトポシドリン酸塩、ビンクリスチン、タキソール、タキソテールレチノイン酸、酪酸、Ｎ8－アセチルスペルミジン並びにカンプトセシン等をあげることができるが、これだけに限定されるわけではない。
　本発明におけるＡＤＣは、前記の化学療法剤と抗体とを結合し、公知の方法により作製できる。抗体と化学療法剤は、それら自身が有する連結基などを介して直接結合されてもよいし、また、リンカーや他の物質を介して間接的に結合されてもよい。
　化学療法剤が直接結合される場合の連結基は、例えばＳＨ基を用いたジスルフィド結合やマレイミドを介する結合が挙げられる。例えば、抗体のＦｃ領域の分子内ジスルフィド結合と、薬剤のジスルフィド結合を還元して、両者をジスルフィド結合にて結合する。また、マレイミドを介する方法もある。また別の方法として、抗体内にシステインを遺伝子工学的に導入する方法もある。
　抗体と化学療法剤を、他の物質（リンカー）を介して間接的に結合することも可能である。リンカーには、抗体または化学療法剤または両方と反応する官能基を１または２種類以上有することが望ましい。官能基の例としてはアミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、,マレイミド基、ピリジニル基等をあげることができる。
　リンカーの例としては、Ｎ－スクシンイミジル４－(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ－スクシンイミジル－４－(Ｎ－マレイミドメチル)－シクロヘキサン－１－カルボキシ－(６－アミドカプロエート) （ＬＣ－ＳＭＣＣ）、κ－マレイミドウンデカン酸Ｎ－スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ－マレイミド酪酸Ｎ－スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε－マレイミドカプロン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ－(α－マレイミドアセトキシ)－スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル－６－(β－マレイミドプロピオンアミド)ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ－スクシンイミジル４－(ｐ－マレイミドフェニル)－ブチレート（ＳＭＰＢ）、およびＮ－(ｐ－マレイミドフェニル)イソシアネート（ＰＭＰＩ）、６-マレイミドカプロイル(ＭＣ)、マレイミドプロパノイル(ＭＰ)、ｐ-アミノベンジルオキシカルボンイル(ＰＡＢ)、Ｎ-スクシンイミジル４(２-ピリジルチオ)ペンタノエート(ＳＰＰ) 及びＮ-スクシンイミジル(４-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(ＳＩＡＢ)、Ｎ-スクシンイミジル（4- (2-ピリジルチオ)ブタノエート（ＳＰＤＢ）等があげられるが、これらに限定されるものではない。また、このリンカーは例えば、バリン-シトルリン（Ｖａｌ-Ｃｉｔ）、アラニン－フェニルアラニン(ａｌａ－ｐｈｅ)のようなペプチドリンカーであってもよいし、上記にあげたリンカーをそれぞれ適時組み合わせて使用しても良い。
　化学療法剤と抗体との結合方法に関しては、例えば、Cancer Research ;68 (22) 9280（2008）、Nature Biotechnology;26(8) 925（2008）、Bio Conjugate Chemistry;19、1673 (2008)、Cancer Research ;68 (15) 6300（2008）、又は特表2008-516896号公報などに記載の方法に準じて行うことができる。
　本発明の別の実施形態としては、抗体に毒素（トキシン）を化学的または遺伝子工学的に結合した、いわゆるイムノトキシンをあげることができる。
　本発明で用いられるトキシンとしては、例えば、ジフテリアトキシンＡ鎖、シュードモナスエンドトキシン、リシン鎖；無糖鎖リシンＡ鎖ゲロニン（Ｇｅｌｏｎｉｎ）サポリン（Ｓａｐｏｒｉｎ）等をあげることができる。
　本発明の免疫複合体は、高い細胞傷害活性を示すことから、細胞傷害剤として使用することができる。さらに、本発明の抗体は、ＣＤＨ３高発現疾患の治療薬として使用することができる。本発明の細胞傷害剤及びＣＤＨ３高発現疾患の治療薬は、例えばカドヘリンを発現している癌細胞と接触させることにより癌細胞を傷害することができる。ヒトＣＤＨ３高発現疾患としては、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、乳癌、頭頚部癌、卵巣癌、肺癌、浸潤性膀胱癌、膵臓癌、脳の転移性癌、甲状腺癌、頭頚部扁平上皮癌、食道扁平上皮癌、肺扁平上皮癌、皮膚扁平上皮癌、メラノーマ、乳腺癌、肺腺癌、子宮頚部扁平上皮癌、膵臓扁平上皮癌、結腸扁平上皮癌、又は胃扁平上皮癌、前立腺癌、骨肉腫又は軟組織肉腫などがあげられる。
　本発明の免疫複合体は、必要に応じて薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤などを適宜組み合わせることによって、医薬組成物として使用することができる。本発明の医薬組成物としては、例えば注射剤として製剤することができる。本発明の医薬組成物の投与量は、患者の症状の程度、年令及び体重、投与方法などに依存し、有効成分である抗体の重量としては通常、約１０ｎｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例１　ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞株の樹立
　抗ＣＤＨ３抗体スクリーニング用細胞株を得るため、全長ＣＤＨ３を発現するＣＨＯ細胞の樹立を行った。
（１）ＣＤＨ３遺伝子発現ベクターの作製
配列番号１に示す全長ヒトＣＤＨ３ＤＮＡを哺乳類発現ベクターｐＥＦ４／ｍｙｃ－ＨｉｓＢ（インビトロジェン社）へ挿入するため、２種類の制限酵素ＫｐｎＩ（タカラバイオ社）及びＸｂａＩ（タカラバイオ社）で３７℃、１時間処理した後、同じくＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理したｐＥＦ４／ｍｙｃ－ＨｉｓＢへＴ４ ＤＮＡリガーゼ（プロメガ社）により常法に従って挿入し、発現ベクターｐＥＦ４―ＣＤＨ３―ｍｙｃ－Ｈｉｓを得た。
（２）ＣＤＨ３安定発現株の取得
  ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６トランスフェクション試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社）のプロトコールに準じ、トランスフェクション前日に径１０ｃｍディッシュに８×１０5細胞のＣＨＯ細胞を播種し一晩培養後、８μｇの発現ベクターｐＥＦ４―ＣＤＨ３―ｍｙｃ－Ｈｉｓと１６μＬのＦｕＧＥＮＥ６試薬を４００μＬの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社）に混合し１５分間室温放置後、細胞培養液に加えトランスフェクションを行った。トランスフェクション翌々日に選択試薬（Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標））を用いて限界希釈法にてクローニングを行った。
　ＣＤＨ３全長発現ＣＨＯのクローン選抜は、抗ｃ－Ｍｙｃモノクローナル抗体（ＳＡＮＴＡ　ＣＲＵＺ　ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社）を用いたウェスタンブロット法により行い、その結果、発現量が高く、かつ増殖が良好なＣＤＨ３全長発現ＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１５０１）を得た。この細胞株と市販抗ＣＤＨ３抗体（Ｒ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳ社）のフローサイトメーターによる測定結果を図１に示す。
実施例２ 可溶型ＣＤＨ３抗原の作製
   抗ＣＤＨ３抗体作製の免疫原とするため、Ｃ末端膜貫通領域以降を欠損させた可溶型ＣＤＨ３（ｓＣＤＨ３）タンパク質を作製した。
（１）可溶型ＣＤＨ３抗原発現ベクターの作製
　ＣＤＨ３全長ｃＤＮＡをテンプレートとして、ＣＤＨ３細胞外領域に相当する部分（配列番号２の１－６５４に相当、以下ｓＣＤＨ３ｃＤＮＡ）を増幅するように設計されたフォワードプライマー （配列番号３：ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＧＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴ）とリバースプライマー （配列番号４：ＣＣＧＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＣ）を用いてＰＣＲ反応を行った。反応にはＫＯＤ－Ｐｌｕｓ（東洋紡社）を用い、９４℃－１５秒、５５℃－３０秒、６８℃－９０秒、３０サイクルの反応条件で行った。
 その後、アガロースゲル電気泳動で目的サイズである約２．０ｋｂｐのバンドを含むゲル断片を切り出し、ＱＩＡ（登録商標）クイックゲル抽出キット（キアゲン社）を用いて、目的のｓＣＤＨ３ｃＤＮＡを得た。
 このｓＣＤＨ３ｃＤＮＡを発現用ベクターｐＥＦ４／ｍｙｃ－ＨｉｓＢへ挿入するために、２種類の制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理した後、同じくＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理したｐＥＦ４／ｍｙｃ－ＨｉｓＢにＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて常法に従い挿入し、発現ベクターｐＥＦ４－ｓＣＤＨ３－ｍｙｃ－Ｈｉｓを得た。
（２）可溶型ＣＤＨ３タンパク質の発現
　ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬のプロトコールに準じ、トランスフェクション前日に径１０ｃｍディッシュに８×１０5個のＣＨＯ細胞を播種し一晩培養後、８μｇの発現ベクターｐＥＦ４－ｓＣＤＨ３－ｍｙｃ－Ｈｉｓと１６μＬのＦｕＧＥＮＥ６試薬を４００μＬの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地に混合、１５分間室温放置後、細胞培養液に加えトランスフェクションを行った。トランスフェクション翌々日に選択試薬（Ｚｅｏｃｉｎ）を用いて限界希釈法にてクローニングを行った。
　可溶型ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞の選抜は、抗ｃ－Ｍｙｃモノクローナル抗体（ＳＡＮＴＡ　ＣＲＵＺ　ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社）を用いたウェスタンブロット法で行った。培養上清中への分泌量が多く増殖が良好な細胞株を選択した結果、可溶型ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１７０２）が得られた。選択された可溶型ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１７０２）は、培養面積１，５００ｃｍ2のローラーボトル３本を用い、ローラーボトル１本あたり無血清培地ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭ－ＩＩ（インビトロジェン社）３３３ｍＬにて７２時間培養を行い、培養上清を回収した。得られた培養上清からＨｉｓＴｒａｐ（登録商標）ＨＰカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）によるアフィニティークロマトグラフィーとＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００ｐｇカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）によるゲル濾過クロマトグラフィーにより可溶型ＣＤＨ３タンパク質を得た。
実施例３　抗ＣＤＨ３モノクローナル抗体の作製
（１）可溶型ＣＤＨ３タンパク質を免疫原としたモノクローナル抗体の作製
生理食塩水に溶解した５０μｇの可溶型ＣＤＨ３タンパク質とＴｉｔｅｒ－ＭＡＸ　Ｇｏｌｄ（登録商標）（タイターマックス社）を等量混合し、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス（日本エスエルシー株式会社）の腹腔内および皮下に注射する事により初回免疫を行った。２回目以降の免疫は同様に調製した２５μｇタンパク質量相当の可溶型ＣＤＨ３タンパク質とＴｉｔｅｒ－ＭＡＸ　Ｇｏｌｄを混合して腹腔内および皮下に注射することにより実施した。最終免疫から３日後にマウスから脾臓細胞を無菌的に調製し、常法に従って、ポリエチレングリコール法によりマウスミエローマ細胞ＳＰ２／Ｏ－Ａｇ１４あるいはＰ３－Ｘ６３－Ａｇ８．６５３との細胞融合を行った。
（２）抗ＣＤＨ３抗体産生ハイブリドーマの選抜
　抗ＣＤＨ３抗体の選抜は、全長ＣＤＨ３を発現するＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１５０１）を用いたフローサイトメトリで行った。
　すなわち、全長ＣＤＨ３を発現するＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１５０１）を２ｍＭ　ＥＤＴＡ－ＰＢＳで処理することで培養プレートから剥離後、１×１０6個／ｍＬとなるようにＦＡＣＳ溶液に懸濁した。この細胞懸濁液を５０μＬ／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種し、ハイブリドーマ培養上清を加えて４℃で６０分間反応させ、ＦＡＣＳ溶液（２００μＬ／ウェル）で２回洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗マウスＩｇＧ・ヤギＦ（ａｂ‘）2（インビトロジェン社）を加えて、４℃で３０分間反応させた。その後ＦＡＣＳ溶液で２回洗浄した後、フローサイトメトリを実施し、ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞との反応が認められるハイブリドーマを選抜した。
　当該ハイブリドーマより得られた抗体と、ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞（ＥＸＺ１５０１）、親株であるＣＨＯ細胞及びＣＤＨ３が高発現であると確認されているヒト細気管支肺胞上皮癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ３５８との典型的な反応結果を図２に示す。選抜したハイブリドーマ全てが、ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞（ＥＸＺ１５０１）およびＮＣＩ－Ｈ３５８と反応し、ＣＨＯ細胞とは反応しないことを確認した。
実施例４　正常組織および癌組織でのＣＤＨ３ｍＲＮＡの発現
　正常ヒト組織および各種癌組織より、レーザーマイクロダイセクション法（Ｌａｓｅｒ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）で回収したサンプルよりＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用い定法に従って全ＲＮＡを調製した。ＲＮＡ各１０ｎｇをＧｅｎｅＣｈｉｐＵ－１３３Ｂ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用い、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｍａｎｕａｌ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）に準じて遺伝子発現を解析した。全遺伝子の発現スコアの平均値を１００とし、癌細胞において発現が亢進する遺伝子を探索したところ、ＣＤＨ３は正常ヒト組織では発現が限られ、肺癌、大腸癌、膵臓癌で発現が高かった（図３Ａ、Ｂ）。また、分化度の異なる膵臓癌組織におけるＣＤＨ３ｍＲＮＡの発現を検討したところ、分化度に関わらず発現が高い組織が認められた（図３Ｃ）。
実施例５　免疫組織化学染色による癌組織でのＣＤＨ３タンパク質の発現
　癌臨床検体でのＣＤＨ３タンパク質の発現を確認するため、癌検体組織アレイで免疫染色を行った。
　癌細胞組織アレイは、上海芯超生物科技有限公司社（Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｏｕｔｄｏ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｃｏ．,Ｌｔｄ．）製の、膵癌（腺癌）、肺癌（腺癌）、肺癌（扁平上皮癌）および大腸癌（腺癌）を使用した。
　各組織アレイスライドを脱パラフィン処理し、１０ｍＭＴｒｉｓ １ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐH９．０）で９５℃４０分賦活化を行った。ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋Ｋｉｔ（Ｄａｋｏ社）付属のブロッキング試薬にて内在性ペルオキシダーゼの不活性化を行った後、抗ＣＤＨ３抗体６１０２２７（ＢＤ　ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ社）、およびネガティブコントロールとして抗ＨＢｓ抗体Ｈｙｂ－３４２３と５μｇ／ｍLの濃度で４℃一晩反応させた。抗体溶液を洗い流した後に、ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋Ｋｉｔ付属のポリマー二次抗体試薬と室温３０分間反応させた。ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋Ｋｉｔ付属の発色試薬にて発色を行い、ヘマトキシリンエオジン溶液にて核染色を行った。
　図４に結果を示す。癌細胞は抗ＣＤＨ３抗体で染色され正常細胞は染色されなかった。
実施例６　ハイブリドーマからのＲＮＡの精製
　ＣＤＨ３抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞から、細胞質に存在するＲＮＡをGough, Rapid and quantitative preparation of cytoplasmic RNA from small numbers of cells, Analytical Biochemisty, 173, p93-95 (1988)により記載されている方法（ただし、この論文に記されている溶解緩衝液のかわりに別のＴＮＥ緩衝液 25 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1% NP-40; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA, pH 8.0を用いた）に従って単離した。具体的な操作方法としては、５ｘ１０ｅ６個のハイブリドーマ細胞を０．２ｍＬのＴＮＥ緩衝液に懸濁して細胞膜を溶解後、遠心により細胞核を除去した。得られた約０．２ｍＬ細胞質上清に０．２ｍＬの抽出緩衝液(10 mM Tris-HCl, pH7.5; 0.35 M NaCl; 1%(w/v) SDS; 10 mM EDTA, pH 8.0; 7 M 尿素)を加えた。この混合物をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、得られたＲＮＡ溶液にキャリアとしてグリコーゲン（ロッシュ、Ｃａｔ Ｎｏ． ９０１３９３）を加えてから、エタノールで沈澱させた。次にＲＮＡ沈殿物を、細胞質ＲＮＡ濃度が０．５～２マイクログラム／マイクロリットルになるように１０～５０マイクロリットルの滅菌蒸留水を加えて溶解した。
実施例７　ハイブリドーマから調製したＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの作製
　一本鎖ｃＤＮＡを合成するため、前記のように調製した細胞質ＲＮＡの０．５～３マイクログラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ， ｐＨ ８．３（室温）； ７５ｍＭ ＫＣｌ； ３ｍＭ ＭｇＣｌ2； １０ｍＭ ＤＴＴ、１００ナノグラムのランダムプライマー、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ、２００ユニットのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（逆転写酵素、インビトロジェン社）を含む２０マイクロリットル反応混合液を調製し、４２°Ｃで５０分間インキュベートした。このように合成したｃＤＮＡライブラリーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の鋳型として直接使用した。
実施例８　抗ＣＤＨ３抗体可変領域をコードする遺伝子のＰＣＲ法による増幅
　実験に用いたプライマーはすべて北海道システム・サイエンス株式会社で合成した。
Ａ．マウス軽鎖の可変領域をコードする遺伝子をＰＣＲ法で増幅するために使用するプライマー
５'末端においてＦＲ１部分と相同性を有するＤＮＡプライマーと３'末端においてマウスＬ鎖内のＪ鎖遺伝子と相同性を有する４セットプライマー（１）、あるいは、５'  末端においてＬ鎖シグナル部分（７セットプライマー）と３'末端においてＫＣ部分（ＫＶＬアンチセンスプライマー）と相同性を有するプライマーセット（２）の２種類のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応により、該ｃＤＮＡからマウス免疫グロブリンＬ鎖可変域ＤＮＡを単離した。プライマー配列は次のとおりであった。
（１）　マウスＬ鎖可変域クローニング４セットセンスプライマー
「Ｐｈａｇｅ　Ｄｉｓｐｌａｙ　－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ-  ，　Ｂａｒｂａｓ　Ｂｕｒｔｏｎ　Ｓｃｏｔｔ　Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ」　ＰＲＯＴＯＣＯＬ　９．５を参考にＳｅｎｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　１７種、Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　３種を北海道システムサイエンスで合成した。
　ＶＫセンス（ＦＲ１部分）下記１７のプライマーの混合物をＶＫセンスプライマーとして使用した。
５'-ＧＡＹＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣ-３'（縮重度２）：配列番号５
５'-ＧＡＹＡＴＴＧＴＴＣＴＣＷＣＣＣＡＧＴＣ-３'（縮重度４）：配列番号６
５'-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＭＴＭＡＣＴＣＡＧＴＣ-３'（縮重度８）：配列番号７
５'-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＹＴＲＡＣＡＣＡＧＴＣ-３'（縮重度８）：配列番号８
５'-ＧＡＹＡＴＴＧＴＲＡＴＧＡＣＭＣＡＧＴＣ-３'（縮重度８）：配列番号９
５'-ＧＡＹＡＴＴＭＡＧＡＴＲＡＭＣＣＡＧＴＣ-３'（縮重度１６）：配列番号１０
５'-ＧＡＹＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＹＤＣＡＧＴＣ-３'（縮重度１２）：配列番号１１
５'-ＧＡＹＡＴＹＣＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＡＣ-３'（縮重度４）：配列番号１２
５'-ＧＡＹＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＷＣＣＡＧＴＣ-３'（縮重度４）：配列番号１３
５'-ＧＡＹＡＴＴＧＷＧＣＴＳＡＣＣＣＡＡＴＣ-３'（縮重度８）：配列番号１４
５'-ＧＡＹＡＴＴＳＴＲＡＴＧＡＣＣＣＡＲＴＣ-３'（縮重度１６）：配列番号１５
５'-ＧＡＹＲＴＴＫＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＲＡＣ-３'（縮重度１６）：配列番号１６
５'-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＢＣＡＧＫＣ-３'（縮重度１２）：配列番号１７
５'-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＡＡＣＹＣＡＧＧＡ-３'（縮重度４）：配列番号１８
５'-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＷＴ-３'（縮重度４）：配列番号１９
５'-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＡＣＡＡＣＣ-３'（縮重度２）：配列番号２０
５'-ＧＡＹＡＴＴＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣ-３'（縮重度２）：配列番号２１
　Ｊアンチセンス（４セットプライマー）
Ｊ１　／　Ｊ２アンチセンスプライマー　（１）
５'-ＧＧＳＡＣＣＡＡＲＣＴＧＧＡＡＡＴＭＡＡＡ-３'（縮重度：８）：配列番号２２
Ｊ４アンチセンスプライマー　（２）
５'-ＧＧＧＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡ-３'：配列番号２３
Ｊ５アンチセンスプライマー（３）
５'-ＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡ-３' ：配列番号２４
Ｊ１　／　Ｊ２，　Ｊ４，　Ｊ５アンチセンスプライマー混合物　（４）
（２）　マウスＬ鎖可変域クローニング７セットプライマー
　ＶＫセンス（シグナルペプチド部分）
このプライマーはノバジェン社のマウスＩｇ-プライマーセット（Ｎｏｖａｇｅｎ；　Ｍｅｒｃｋ，Ｃａｔ．Ｎｏ．６９８３１-３）を元に制限酵素部位を除去するように塩基配列を改変した。
Ａセットセンスプライマー
５'-ＡＴＧＲＡＧＷＣＡＣＡＫＷＣＹＣＡＧＧＴＣＴＴＴ-３' ：配列番号２５
Ｂセットセンスプライマー
５'-ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴ-３' ：配列番号２６
Ｃセットセンスプライマー
５'-ＡＴＧＧＡＧＷＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＳＣＴＧＹＴＡＴＧＧＧＴ-３' ：配列番号２７
Ｄセットセンスプライマー（下記２種類のプライマーの混合物を使用）
５'-ＡＴＧＡＧＧＲＣＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＷＴＴＹＴＴＧＧＩＷＴＣＴＴ-３' ：配列番号２８
５'-ＡＴＧＧＧＣＷＴＣＡＡＧＡＴＧＲＡＧＴＣＡＣＡＫＷＹＹＣＷＧＧ-３' ：配列番号２９
Ｅセットセンスプライマー（下記３種類のプライマーの混合物を使用）
５'-ＡＴＧＡＧＴＧＴＧＣＹＣＡＣＴＣＡＧＧＴＣＣＴＧＧＳＧＴＴ-３'：配列番号３０
５'-ＡＴＧＴＧＧＧＧＡＹＣＧＫＴＴＴＹＡＭＭＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＧ-３'：配列番号３１
５'-　ＡＴＧＧＡＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＴＴＣＴＣＴＴＣＣ　-３'：配列番号３２
Ｆセットセンスプライマー（下記４種類のプライマーの混合物を使用）
５'-ＡＴＧＡＧＩＭＭＫＴＣＩＭＴＴＣＡＩＴＴＣＹＴＧＧＧ-３'：配列番号３３
５'-ＡＴＧＡＫＧＴＨＣＹＣＩＧＣＴＣＡＧＹＴＹＣＴＩＲＧ-３'：配列番号３４
５'-ＡＴＧＧＴＲＴＣＣＷＣＡＳＣＴＣＡＧＴＴＣＣＴＴＧ-３'：配列番号３５
５'-ＡＴＧＴＡＴＡＴＡＴＧＴＴＴＧＴＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＴ-３'：配列番号３６
Ｇセットセンスプライマー（下記４種類のプライマーの混合物を使用）
５'-ＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＧＴＴＡＧＧＣＴＧＴＴＧＧＴＧＣＴ-３'：配列番号３７
５'-ＡＴＧＧＡＴＴＴＷＣＡＲＧＴＧＣＡＧＡＴＴＷＴＣＡＧＣＴＴ-３'：配列番号３８
５'-ＡＴＧＧＴＹＣＴＹＡＴＶＴＣＣＴＴＧＣＴＧＴＴＣＴＧＧ-３'：配列番号３９
５'-ＡＴＧＧＴＹＣＴＹＡＴＶＴＴＲＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＧ-３'：配列番号４０
ＫＶＬアンチセンスプライマー
５'-ＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡ-３'：配列番号４１
Ｂ．マウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子をＰＣＲ法で増幅するために使用するプライマー
５'  末端においてマウスＨ鎖シグナル部分（４セットプライマー）と相同性を有するプライマーと３'末端においてＫＣ部分と相同性を有するプライマー、あるいは５'末端においてＦＲ１部分と相同性を有する１セットのプライマーと３'  末端においてマウスＨ鎖の定常領域（ＩＧＨＣ）と相同性を有する２種類のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応により、該ｃＤＮＡからマウス免疫グロブリンＨ鎖可変域ＤＮＡを単離した。プライマー配列は次のとおりであった。
（３）　マウスＨ鎖可変域クローニングプライマー
　ＶＨセンス（シグナル部分：４セットプライマー）
このプライマーはＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．），　Ｕｎｉｔ　２．１２　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，　ａｎｄ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｖ　ＲｅｇｉｏｎｓのＴａｂｌｅ　２．１２．２を参考にした。
５'-ＡＴＧＧＲＡＴＧＳＡＧＣＴＧＫＧＴＭＡＴＳＣＴＣＴＴ-３'（縮重度：３２）：配列番号４２
５'-ＡＴＧＲＡＣＴＴＣＧＧＧＹＴＧＡＧＣＴＫＧＧＴＴＴＴ-３'（縮重度：８）：配列番号４３
５'-ＡＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴ-３'：配列番号４４
５'-ＡＴＧＧＲＣＡＧＲＣＴＴＡＣＷＴＹＹ-３'（縮重度：３２）：配列番号４５
（４）　マウスＨ鎖可変域クローニングプライマー
　ＶＨセンス（ＦＲ１部分）
このプライマーはＴａｎら、“Superhumanized" Antibodies: Reduction of Immunogenic Potential by Complementarity-Determining Region Grafting with Human Germline Sequences: Application to an Anti-CD281, Journal of Immunology 169 (2002) p1119-1125のセンスプライマーの塩基配列を改変してデザインした。
５'-ＳＡＧＧＴＳＭＡＲＣＴＫＳＡＧＳＡＧＴＣＷＧＧ-３'（縮重度：２５６）：配列番号４６
　ＶＨアンチセンス（３，　４に共通のアンチセンスプライマー）
マウスＩｇＧすべてのアイソフォームとアニーリングできるように塩基配列を縮重してデザインした。
５'-ＣＡＳＣＣＣＣＡＴＣＤＧＴＣＴＡＴＣＣ-３'（縮重度：６）：配列番号４７
実施例９　キメラ抗ＣＤＨ３免疫グロブリンの一過性発現ベクターの作製
　発現プラスミドの作製：　ＤＮＡ　Ｅｎｇｉｎｅ（Ｐｅｌｔｉｅｒ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ，　ＭＪ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　Ｂｉｏ-Ｒａｄ）　を用いたＰＣＲ法により抗ＣＤＨ３マウスモノクローナル抗体Ｌ鎖、Ｈ鎖それぞれの可変領域を実施例８に示したプライマーを用いて増幅した。増幅したＤＮＡフラグメントはサブクローニングベクターｐＧＥＭ（プロメガ社）に組み込んで、このベクターのＴ７，ＳＰ６ユニバーサルプライマーで塩基配列を決定した。
　その際に決定された塩基配列のうち、ＣＤＲに相当する部分をアミノ酸に変換した配列を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　キメラ抗ＣＤＨ３抗体のＬ鎖、および、Ｈ鎖の可変域塩基配列はＩＭＧＴ／Ｖ-ＱＵＥＳＴ　Ｓｅａｒｃｈ　ｐａｇｅ　（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｖｑｕｅｓｔ？ｌｉｖｒｅｔ＝０＆Ｏｐｔｉｏｎ＝ｍｏｕｓｅＩｇ）　で検索して、確かに抗体遺伝子がクローニングできていることを確認した。次に、クローン化された抗ＣＤＨ３抗体のＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域をコードする遺伝子は、キメラＬ鎖発現ベクターにはヒトＣｋ領域をコードする遺伝子を、キメラＨ鎖発現ベクターにはヒトＣｇ１領域をコードする遺伝子をそれぞれ接続した遺伝子をデザインして、これらＬ鎖、Ｈ鎖キメラ抗体遺伝子をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社によって全長人工合成した。その際、ＣＨＯ生産細胞での遺伝子発現が有利なようにコドン使用頻度の最適化　（Ｋｉｍら、Ｃｏｄｏｎ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｈｉｇｈ-ｌｅｖｅｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ　（ＥＰＯ）　ｉｎ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ，　Ｇｅｎｅ，　１９９，　１９９７，　ｐ２９３-３０１の方法に従った）　をおこなった。具体的には、Ｌ鎖の場合、効率的な翻訳のために必須のＤＮＡ配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．，　Ａｔ　ｌｅａｓｔ　ｓｉｘ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ｐｒｅｃｅｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ＡＵＧ　ｉｎｉｔｉａｔｏｒ　ｃｏｄｏｎ　ｅｎｈａｎｃｅ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ．　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　１９６，　ｐ９４７-９５０，　１９８７）、マウスＩＧＫＶ（k鎖可変領域）遺伝子のシグナルペプチド、抗ＣＤＨ３抗体のＬ鎖のＶ領域、ヒトＫＣ（k鎖定常域）の順に遺伝子を並列し、その両端には制限酵素部位（５'  側にＮｈｅＩ，　３'  側にＥｃｏＲＩ）を付加した。キメラＨ鎖も同様に作製した。これら人工合成遺伝子をＮｈｅＩとＥｃｏＲＩで切断し、発現ベクターｐＣＡＧＧＳのＮｈｅＩとＥｃｏＲＩ部位に組み込み、抗ＣＤＨ３キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＫ，　Ｈ鎖発現ベクターｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＨを得た。
実施例１０　キメラ抗ＣＤＨ３免疫グロブリンの安定発現ベクターの作製
　遺伝子操作された抗体遺伝子をＣＨＯ細胞を用いて高レベルで発現させるために、ＣＭＶプロモーター配列に連結し、ポリＡシグナルを有したジヒドロフォレートレダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子を組み込んだ発現ベクターを作製した。
　キメラ抗体の安定発現生産細胞株をつくるために、ｄｈｆｒ遺伝子を組み込んだｐＣＡＧＧＳ発現ベクターを作製した。具体的には、一過性の発現ベクターであるｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＨ、および、ｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＫに、ＣＭＶプロモーターとポリＡシグナルを有したｄｈｆｒ遺伝子を組み込むことである。ＣＭＶプロモーター、Ｋｏｚａｋ配列をもつマウスｄｈｆｒ遺伝子、ＳＶ４０ポリＡシグナルをそれぞれＰＣＲ法によって増幅し、これらの遺伝子の混合物をＰＣＲ法で接続するとともに両端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を付加して、ＨｉｎｄＩＩＩ-ＣＭＶプロモーター-Ｋｏｚａｋ-ｄｈｆｒ-ポリＡ-ＨｉｎｄＩＩＩという遺伝子フラグメントを得た。このフラグメントをｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＨ、あるいは、ｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＫのＨｉｎｄＩＩＩ部位に組み込んでｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＨ-ＣＭＶｐ-ｄｈｆｒ-Ａ、および、ｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＫ-ＣＭＶｐ-ｄｈｆｒ-Ａを得た。これらの発現ベクターはキメラ抗体をＣＡＧプロモーターで、ｄｈｆｒ遺伝子をＣＭＶプロモーターで発現させることができ、効率的に遺伝子増幅を利用してキメラ抗体を生産することができた。
実施例１１　キメラ抗ＣＤＨ３生産ＣＨＯ細胞株の樹立
　ＣＨＯ ｄｈｆｒ（-）細胞(G. Urlaubら、Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, p4216-4220, 1980)を用いて、２種類のプラスミド（アンピシリン耐性遺伝子内のＰｖｕＩでプラスミドを切断して環状プラスミドから線状プラスミドにした）すなわち、キメラ抗ＣＤＨ３Ｌ鎖を発現するためのｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＫ-ＣＭＶ-ｄｈｆｒ-Ａベクター、および、キメラ抗ＣＤＨ３Ｈ鎖を発現するためのｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＨ-ＣＭＶ-ｄｈｆｒ-Ａベクターにより同時形質転換した。エレクトロポレーションはロンザ社製のＡｍａｘａでおこなった。ＤＮＡ（Ｌ鎖、Ｈ鎖各プラスミドにつき０．００２ｍｇ／試料）を３ｘ１０ｅ３ 細胞の０．１ｍＬのＡｍａｘａエレクトロポレーションＣＨＯ用緩衝液に加えてパルスを与えた。
　エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％の透析済みＦＢＳを含有し、ＨＴ（Ｈ，　ヒポキサンチン　：　Ｔ，　チミジン）を含まないＩｓｃｏｖｅ'ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）に加えた。遺伝子導入から３日後、１０％透析ＦＢＳ、２ ｍＭ Ｌ-グルタミン、ＨＴを含まないＩＭＤＭに培地を交換して１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８でｎｅｏ＋形質転換細胞の選択をおこない、キメラ抗体産生陽性細胞株クローンを得た。次に、Ｇ４１８で選択されたクローンを用いて遺伝子増幅をおこなった。０．２５ｍＭ、１ｍＭの２ラウンドのメソトレキセート（ＭＴＸ）中での増幅の後、１リットルあたり約５０～１００ｍｇのキメラＣＤＨ３抗体を生産する細胞株を樹立できた。
実施例１２　酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によるキメラ抗体の定量
　遺伝子導入したＣＨＯ細胞の培養上清をＥＬＩＳＡにより測定して、キメラ抗体が生産されていることを確認した。キメラ抗体を検出するため、プレートをヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（マウス、ウサギ、ウシ、マウスＩｇＧに対して吸収済み）（コスモバイオ：ＡＱＩ，　Ｃａｔ　Ａ-１１０ＵＤ）でコートした。ブロックした後、抗ＣＤＨ３キメラ抗体産生ＣＨＯ細胞からの培養上清を段階希釈し、各ウエルに加えた。プレートをインキュベーション、および洗浄後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（マウス、ウサギ、ウシ、マウスＩｇＧに対して吸収済み）-ＨＲＰ（コスモバイオ：ＡＱＩ，Ｃａｔ．Ａ-１１０ＰＤ）を加えた。インキュベーション及び洗浄の後、基質緩衝液を加えた。さらにインキュベーションした後、反応を停止しそして４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。標準として精製ヒトＩｇＧを用いた。
実施例１３　キメラ抗体の結合活性
　実施例１０、１１に示した方法で表２に示した組み合わせのＣＤＲ配列を持つ抗体を作製し、その結合活性をフローサイトメトリで評価した。
　反応対象となる各細胞株（ＣＨＯ細胞、ＣＤＨ３強制発現ＣＨＯ細胞及びＣＤＨ３の高発現が確認されているＮＣＩ－Ｈ３５８細胞株）を２ｍＭ　ＥＤＴＡ－ＰＢＳで処理することにより培養プレートから剥離後、１×１０6個／ｍＬとなるようにＦＡＣＳ溶液に懸濁した。この細胞懸濁液を５０μＬ／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種し、精製したキメラ抗体を１０ｕｇ／ｍＬになるように添加し、４℃で６０分間反応させた。ＦＡＣＳ溶液（１５０μＬ／ウェル）で２回洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ヒトＩｇＧ・ヤギＦ（ａｂ‘）2（インビトロジェン社）４μｇ/ｍｌを加えて、４℃で３０分間反応させた。その後ＦＡＣＳ溶液で２回洗浄した後、フローサイトメトリを実施した。その結果、キメラ抗体はＣＤＨ３発現細胞株への強い反応性が認められた（図５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ＣＤＲ－Ｈ1、Ｈ２及びＨ３はそれぞれ各抗体Ｈ鎖を、ＣＤＲ－Ｌ1、Ｌ２及びＬ３はそれぞれ各抗体Ｌ鎖を構成するＣＤＲ配列を示す。
実施例１４　薬剤の合成
　ＤＭ１ＳＭｅ（図６）は、米国特許第５，２０８，０２０号および６，３３３，４１０Ｂ１号に以前に記載されたように調製した。
実施例１５　薬剤結合抗体の調製
１．結合薬剤の還元処理
　ＥｔＯＨ３００ｕＬで溶解した０．７８ｍｇのＤＭ１ＳＭｅと５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５)１８０ｕＬ、ＴＣＥＰ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｏｎｄ　Ｂｒｅａｋｅｒ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）２０ｕＬを混合し、窒素雰囲気下、室温で３０分以上反応させ、薬剤を還元した。
　還元薬剤はＨＰＬＣを使用して精製した後に溶媒留去後、１０ｍｇ／ｍＬになるようにジメチルアセトアミドに溶解した。
２．マレイミド化抗体の調製
　１ｍｇ／ｍＬ抗ＣＤＨ３キメラ抗体にモル比３０倍過剰となる量のsulfo-SMCC(PIERCE社)を加え、３０℃、１時間反応させた。
　過剰な架橋剤を除くため、50mMリン酸カリウム、50mM NaCl、2mM EDTA(pH6.5)で平衡化した脱塩カラムで脱塩処理（ＺｅｂａＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ、 サーモフィッシャーサイエンティフィック社)した。
３．薬剤による抗体の修飾
　１ｍｇ／ｍＬのマレイミド化した抗ＣＤＨ３キメラ抗体と、結合したマレイミド基数の１．７倍に相当する還元薬剤とを５０ｍＭリン酸カリウム、50mM NaCl、2mM EDTA(pH6.5)中で、室温にて一晩反応させた。その後、過剰な薬剤をゲルろ過操作により除いた。
実施例１６　抗体薬剤結合量の定量
　抗体当たりの薬剤結合数は、252nm及び280nmの吸光度を測定する事で決定した。決定方法は非特許文献（Widdison,W.C.,Wilhelm,S.D.,Cavanagh,E.E.,et al. (2006) Semisynthetic maytansine analogues for the targeted treatment of cancer. J.Med.Chem.,49,4392-4408）に記載の吸光係数εAb280=223,000M-1cm-1, εAb252=82,510M-1cm-1, εDM1280=5,180M-1cm-1, εDM1252=26,160M-1cm-1を利用した。
実施例１７　細胞障害試験
　薬剤結合抗体の細胞傷害性と特異性はWST-8を発色基質とした細胞増殖測定試薬(同仁化学研究所社,Cell counting assay kit-8)を使用して評価した。
　即ち、ＣＤＨ３が高発現であると確認されているヒト乳がん細胞株ＨＣＣ１９５４と薬剤結合抗体（ＡＤＣ）あるいは薬剤を結合していない抗体（Ｎａｋｅｄ）を任意の量共存させ、３７度で３日間、、５%CO2環境下でインキュベートした。その後、細胞増殖測定試薬を添加放置後Ａ４５０／６２０の吸光度を測定し、癌細胞株のみで抗体を加えないウェルより得られた吸光度の値を１００％としたときの相対的な値を細胞生存率として表記した（図７）。なお、図中に用いられた抗体は、抗体番号０６７－１７Ｃを使用し、ＡＤＣについては、実施例１６に記載した方法で抗体あたりの薬剤導入数を計算したところ、抗体１分子辺り４．０５個の薬剤が導入されていると見積もられた。
実施例１８　細胞障害試験（抗体毎の比較）
　取得した複数の抗ＣＤＨ３抗体を用いて薬剤結合抗体の細胞傷害性を評価した。
　測定は、実施例１７に記載した方法に準じた。即ち、ヒト乳がん細胞株ＨＣＣ１９５４と薬剤結合抗体（ＡＤＣ）を共存させ、３７度で３日間、５%CO2環境下でインキュベートした。その際のＡＤＣ濃度は、０．０１ｕｇ／ｍＬとした。その後、細胞増殖測定試薬を添加放置後Ａ４５０／６２０の吸光度を測定し、癌細胞株のみで抗体を加えないウェルより得られた吸光度の値を１００％としたときの相対的な値を細胞生存率として表記した。各抗体抗体１分子辺りの薬剤数は、実施例１６に記載した方法で見積もった（表３）。
　陰性対照抗体は、ＨＣＣ１９５４と反応しないことが確認されている抗体が使用された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例１９　動物試験
　薬剤結合抗体のインビボでの腫瘍縮小効果を、乳がん細胞株ＨＣＣ１９５４を移植したゼノグラフトモデルにて確認した。投与は、抗アシアロGM1抗体（WAKO 014-09801）を、大塚蒸留水1ｍＬで溶解後、大塚生理食塩水4mLを加えて全量５ｍＬとした後、この溶液を、マウス1匹あたり１００ｕＬ腹腔内投与。ＨＣＣ１９５４は１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて培養し、ＳＣＩＤマウス（メス、日本クレア）の右腹側部皮下に５ｘ１０6個/マウスになるように移植した。
　インビボ試験は各群５匹とし、15mg/ｋｇを尾静脈より投与した。投与は平均腫瘍径が100-150mm3となった時点で開始し、１週間後に更に同量、計２回行なった。
　図中に用いられた抗体は、抗体番号０６７－１２Ｃ、０６７－２３Ｃ及び０６７－２７Ｃを使用し、ＡＤＣについては、実施例１６に記載した方法で抗体あたりの薬剤導入数を計算したところ、抗体１分子辺り３～４個の薬剤が導入されていると見積もられた。
　腫瘍サイズの推移を図８に示す。

Claims (41)

  1. ＣＤＨ３に対する抗体又はＣＤＨ３結合能を有するその断片と化学療法剤とを連結して成る免疫複合体。
  2. ＣＤＨ３に対する抗体又はＣＤＨ３結合能を有するその断片が、ＣＤＨ３を発現している細胞に対して細胞傷害能を示す、請求項１記載の免疫複合体。
  3. ＣＤＨ３に対する抗体が、ＣＤＨ３またはＣＤＨ３を発現している細胞を免疫原として投与した免疫細胞から取得した抗体産生細胞が産生する抗体である、請求項１又は２記載の免疫複合体。
  4. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１から３の何れか１項に記載の免疫複合体。
  5. 前記抗体がキメラ化されている請求項１から４の何れか１項に記載の免疫複合体。
  6. 前記抗体がヒト化されている請求項１から４の何れか１項に記載の免疫複合体。
  7. 前記抗体がヒト抗体である請求項１から４の何れか１項に記載の免疫複合体。
  8. 前記抗体が、Ｈ鎖に配列番号４８、５６及び６５に記載されたアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖に配列番号７５、８２及び８６に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の免疫複合体。
  9. 前記抗体が、Ｈ鎖に配列番号５２、６０及び７０に記載されたアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖に配列番号７５、８２及び９１に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の免疫複合体。
  10. 前記抗体が、Ｈ鎖に配列番号５４、６２及び７２に記載されたアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖に配列番号７４、８１及び９３に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の免疫複合体。
  11. 前記抗体が、Ｈ鎖に配列番号５５、６３及び７３に記載されたアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖に配列番号８０、８５及び９４に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の免疫複合体。
  12. 前記抗体が、Ｈ鎖に配列番号４９、６４及び６６に記載されたアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖に配列番号７６、８４及び８９に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の免疫複合体。
  13. 前記抗体が、Ｈ鎖に配列番号４９、５８及び６８に記載されたアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖に配列番号７９、８２及び９０に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の免疫複合体。
  14. 前記抗体が、Ｈ鎖に配列番号５３、６１及び７１に記載されたアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖に配列番号７５、８２及び９２に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の免疫複合体。
  15. 前記抗体が、Ｈ鎖に配列番号５１、５７及び６７に記載されたアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖に配列番号７８、８３及び８８に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の免疫複合体。
  16. 前記抗体が、Ｈ鎖に配列番号５０、５９及び６９に記載されたアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖に配列番号７７、８３及び８７に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の免疫複合体。
  17. 前記抗体が、請求項８から１６の何れか１項に記載の抗体のＨ鎖のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＨ鎖を有する、請求項１ないし２に記載の免疫複合体。
  18. ＣＤＨ３が哺乳類のＣＤＨ３である、請求項１～３の何れか１項に記載の免疫複合体。
  19. ＣＤＨ３が霊長類のＣＤＨ３から選択される、請求項１～３の何れか１項に記載の免疫複合体。
  20. ＣＤＨ３がヒトのＣＤＨ３から選択される、請求項１～３に何れか１項記載の免疫複合体。
  21. ＣＤＨ３が、細胞の表面に発現されるＣＤＨ３である、請求項１～３の何れか１項に記載の免疫複合体。
  22. 前記ＣＤＨ３結合能を有する抗体断片が、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）2、又はｓｃＦｖである、請求項１～２１の何れか１項に記載の免疫複合体。
  23. 前記化学療法剤が、細胞障害性物質である、請求項１～２２のいずれか１項に記載の免疫複合体。
  24. 前記細胞傷害性物質が、メイタンシノイド及びその誘導体から選択される、請求項２３に記載の免疫複合体。
  25. 前記細胞傷害性物質が、アウリスタチン及びその誘導体から選択される、請求項２３に記載の免疫複合体。
  26. 前記メイタンシノイド及びその誘導体が、ＤＭ１、ＤＭ３、ＤＭ４から選択される請求項２４に記載の免疫複合体。
  27. 前記アウリスタチン及びその誘導体が、ＭＭＡＥあるいはＭＭＡＦから選択される、請求項２５に記載の免疫複合体。
  28. 前記細胞性障害剤が、ＤＭ１である、請求項２３に記載の免疫複合体。
  29. ＣＤＨ３に対する抗体又はＣＤＨ３結合能を有するその断片１分子あたり１～10個のＤＭ１が結合している、請求項２８に記載の免疫複合体。
  30. ＣＤＨ３に対する抗体又はＣＤＨ３結合能を有するその断片１分子あたり3～8個のＤＭ１が結合している、請求項２８に記載の免疫複合体。
  31. ＣＤＨ３に対する抗体又はＣＤＨ３結合能を有するその断片と化学療法剤との結合がリンカーを介してなる、請求項１～３０の何れか１項に記載の免疫複合体。
  32. ＣＤＨ３に対する抗体又はＣＤＨ３結合能を有するその断片と化学療法剤との結合が、抗体のＦｃ領域の分子内ジスルフィド結合を介してなる、請求項１～３０の何れか１項に記載の免疫複合体。
  33. ＣＤＨ３に対する抗体又はＣＤＨ３結合能を有するその断片と化学療法剤との結合が、抗体のＦｃ領域を遺伝子工学的に改変して結合したものである、請求項１～３０の何れか１項に記載の免疫複合体。
  34. ＣＤＨ３に対する抗体又はＣＤＨ３結合能を有するその断片と化学療法剤とを結合させるリンカーが、２価反応性架橋試薬である、請求項３１に記載の免疫複合体。
  35. 前記リンカーが、Ｎ－スクシンイミジル４－(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ－スクシンイミジル－４－(Ｎ－マレイミドメチル)－シクロヘキサン－１－カルボキシ－(６－アミドカプロエート) （ＬＣ－ＳＭＣＣ）、κ－マレイミドウンデカン酸Ｎ－スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ－マレイミド酪酸Ｎ－スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε－マレイミドカプロン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ－(α－マレイミドアセトキシ)－スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル－６－(β－マレイミドプロピオンアミド)ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ－スクシンイミジル４－(ｐ－マレイミドフェニル)－ブチレート（ＳＭＰＢ）、およびＮ－(ｐ－マレイミドフェニル)イソシアネート（ＰＭＰＩ）、６-マレイミドカプロイル(ＭＣ)、マレイミドプロパノイル(ＭＰ)、ｐ-アミノベンジルオキシカルボンイル(ＰＡＢ)、Ｎ-スクシンイミジル４(２-ピリジルチオ)ペンタノエート(ＳＰＰ) 及びＮ-スクシンイミジル(４-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(ＳＩＡＢ)、Ｎ-スクシンイミジル（4- (2-ピリジルチオ)ブタノエート（ＳＰＤＢ）から成る群より選択される、請求項３１に記載の免疫複合体。
  36. 前記リンカーが、プロテアーゼによって切断される請求項３１に記載の免疫複合体。
  37. 前記リンカーがval-citを含む、請求項３１に記載の免疫複合体。
  38. 前記リンカーがＰＡＢＡを含む、請求項３１に記載の免疫複合体。
  39. ＣＤＨ３の過剰発現によって特徴づけられる癌を治療するための請求項１から３８の何れか１項に記載の免疫複合体を含む、医薬組成物。
  40. 抗がん作用を有する、請求項３９に記載の医薬組成物。
  41. 前記癌が、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、乳癌、頭頚部癌、卵巣癌、肺癌、浸潤性膀胱癌、膵臓癌、脳の転移性癌、甲状腺癌、頭頚部扁平上皮癌、食道扁平上皮癌、肺扁平上皮癌、皮膚扁平上皮癌、メラノーマ、乳腺癌、肺腺癌、子宮頚部扁平上皮癌、膵臓扁平上皮癌、結腸扁平上皮癌、又は胃扁平上皮癌、前立腺癌、骨肉腫又は軟組織肉腫から選択される、請求項３９又は４０に記載の医薬組成物。
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