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WO2013011184A2 - Molécula quimerica util en inmunoterapia frente a la leishmaniosis, que comprende un fragmento de la proteina pfr1 de leishmania infantum con epitopes especificos inmunodominantes - Google Patents

Molécula quimerica util en inmunoterapia frente a la leishmaniosis, que comprende un fragmento de la proteina pfr1 de leishmania infantum con epitopes especificos inmunodominantes Download PDF

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WO2013011184A2
WO2013011184A2 PCT/ES2012/070541 ES2012070541W WO2013011184A2 WO 2013011184 A2 WO2013011184 A2 WO 2013011184A2 ES 2012070541 W ES2012070541 W ES 2012070541W WO 2013011184 A2 WO2013011184 A2 WO 2013011184A2
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WO
WIPO (PCT)
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nucleotide sequence
seq
pfr1
protein
animal
Prior art date
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PCT/ES2012/070541
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English (en)
French (fr)
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WO2013011184A3 (es
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Maria del Carmen THOMAS CARAZO
Manuel Carlos LÓPEZ LÓPEZ
Darién LEDESMA ARROYO
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Original Assignee
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
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Priority to US14/234,075 priority patent/US9926349B2/en
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention is within the chemical, pharmaceutical, and in the areas of medicine, molecular biology, immunology, veterinary medicine and parasitology, and refers to an immunological tool for the fight against leishmaniasis, disease caused by different species belonging to the genus Leish mania.
  • leishmaniasis The species of the genus Leishmania, protozoa intracellular parasites, belong to the order Kinetoplastida family Trypanosomatidae, are distributed by tropical and subtropical regions of the old and new world, causing a wide spectrum of clinical manifestations called leishmaniasis. Depending on the causative species, leishmaniasis can be classified as cutaneous, mucocutaneous or visceral (in reference to its tissue tropism and the clinical manifestations they cause).
  • leishmaniasis The incidence of leishmaniasis has increased enormously in recent years, so that it is currently endemic in 88 countries spread across all continents and there are considered to be 350 million people at risk of contracting the disease (WHO report, http: / /who.int/ctd/html/leisdis.html). It is estimated that there are about 12 million people affected by leishmaniasis in the world, including those who do not have the disease in an apparent way. Of the total 2 million annual cases, 500,000 are from visceral leishmaniasis (LV). This disease is caused by L. infantum and L. donovani and the symptoms of the disease include intermittent fever, anemia, splenomegaly, hepatomegaly and lymphadenopathy.
  • LV visceral leishmaniasis
  • the outcome of the LV is usually death, usually caused by a concomitant infection, given the patient's weak immune status.
  • Le ⁇ shman ⁇ aN ⁇ coinfection has been revealed in recent years as a major health problem for the countries of the Mediterranean area. In these countries, the main The host is the dog, acting as a reservoir of the disease in humans (Alvar et al. 2004. Adv Parasitol. 57: 1-88).
  • Vaccination is the most efficient medical treatment to prevent mortality and morbidity due to infectious agents. Despite this, there are currently very few pathogenic microorganisms against which an effective vaccine is available. Across the different species of Leishmania, in recent years, the use of vaccines made with antigens or fragments thereof, both in purified and recombinant form, with mixed results has been tested (Kedzierski et al. 2010. J Glob Infect Dis 2 (2): 177-85; Kedzierski et al. 2006. Parasitology, 133: 87-112; Requena et al. 2004. Expert Opin Biol Ther. 4 (9): 1505-17). However, none of the attempts to obtain a vaccine in humans has been satisfactory and has culminated successfully.
  • the dog is the main reservoir of the disease, then numerous attempts have also been made from the immunological point of view in the fight against this health problem, but also a veterinarian.
  • leishmaniasis constitutes a serious parasitic disease in dogs.
  • the most common clinical symptomatology is hair loss, especially around the eyes, ears and nose.
  • the dog loses weight but not the appetite and the presence of wounds in the skin, especially in the head and legs, as well as symptoms related to renal failure are common. This disease is endemic in large areas of Spain, as well as in most of the countries of the Mediterranean region.
  • PFR or paraflagelar proteins represent a family of relevant specific trypanosomatid antigens that are located in the paraphlagelar region of these parasites ⁇ Fouts et al., 1998 J Biol Chem, 273 (34): 21846-21855; Clark et al., 2005. Parasitol Res. 96 (5): 312-320).
  • Some members of this family of antigens, PFR1 -3 proteins stand out for their high immunogenic capacity (Michailowsky et al., Infect Immun 71 (6): 3165-3171). Immunization of mice with purified PFR1 and PFR2 proteins from T. cruzi induces a Th1 immune response capable of reducing, in experimental infection tests, the levels of T.
  • cruzi or fused to the Hsp70 of said pathogen induces high levels of anti-PFR lgG2a, however, only immunization with the chimeric vaccine stimulates the production of IL-12 and IFN- ⁇ and causes the decrease of IL-4 producing cells, allowing a protective response against T. cruzi (Morell et. al. 2006. Vaccine 24 : 7046-7055).
  • Hsp70 protein belongs to the family of heat shock proteins (Hsp). These form a broad family of heterogeneous-sized proteins, which are highly conserved among different species (eukaryotes and prokaryotes). They are fundamental in the maintenance of cell homeostasis because of its role as chaperones (Smith, Whitesell et al. 1998. Pharmacological Reviews 50 (4): 493-513). As for their immune role, they are very interesting for their ability to activate the immune system, highlighting the Hsp70 family for their immunological versatility.
  • Hsp heat shock proteins
  • Hsp70 from tumor cells or virus-infected cells has the ability to activate CD8 + CTL response in vivo and in vitro against different antigens expressed in cells from which the immunogenic protein has been purified (Srivastava. 2002. Nat Rev Immunol 2 : 185-194; Wu et al., 2005. Cancer Res. 65 (11): 4947-4954).
  • extracellular Hsp70 can complex with antigenic peptides and simultaneously activate APCs.
  • This interaction triggers a cascade of events, which would include cross-presentation processes of peptides to MHC I restricted to CD8 + and MHC II restricted to CD4 + T cells, proinflammatory cytokine secretion and phenotypic and functional dendritic cell maturation (DCs) (Asea et al. 2000. Nat Med 6: 435-442; Basu et al. 2001. Immunity 14: 303-313; Harmala et al. 2002. J Immunol 169: 5622-5629; Tobian et al. 2004. J Immunol 173: 5130-5137).
  • DCs dendritic cell maturation
  • Hsp70 protein of Trypanosoma cruzi tests in our laboratory have shown in vitro that it has per se a unique stimulatory effect on spleen and ganglion cells of naive mice (Mara ⁇ ón et al., 2000. Int. Immunol. 12 (12 ): 1685-1693), which results in a rapid and intense stimulation of T cells.
  • this same protein is capable of inducing a mixed immunological response (lgG1 and lgG2a) in vivo and in vitro, against the associated hapten. which, interestingly, turns out to be independent of the TLR2 and TLR4 receptors ⁇ Qazi et al. 2007.
  • Vaccine 25 (6): 1096-1103 This T.
  • cruzi Hsp70 has also proved to be able to generate a specific response against protein KMP1 1 when immunization is carried out with a vaccine vector that carries the sequences of both proteins, activating the production of specific lgG2a against KMP1 1 (Thomas, Garc ⁇ a-Pérez et al. 2000. DNA and Cell Biology 19 (1): 47-57; Thomas, Olivares et al. 2000. Acta Tropic 75 (2): 203-210).
  • mice immunized with the KMP1 1 -HSP70 fusion protein but not those immunized with the isolated KMP1 1 protein, induce a cytotoxic lymphocyte response against Jurkat-A2 / Kb cells expressing the KMP1 1 protein as well as against said cells loaded with different KMP1 1 peptides of proven binding to the A2 molecule.
  • Milestones of this type have also been achieved with the genus Leishmania itself, administering Hsp70 together with the gp63 metalloprotease characteristic of Leishmania donovani (Kaur et al. 2011. Parasite Immunol. 33 (2): 95-103).
  • the present invention represents a useful tool in the fight against human and animal leishmaniasis. It involves the use of nucleotide sequences encoding the PFR1 protein of Leishmania infantum and / or fragments thereof containing a series of peptides, alone or in conjunction with the Hsp70 protein of Trypanosoma cruzi, as well as plasmids containing their coding genetic sequences . Said peptides contained in the L. infantum PFR1 protein correspond to immunodominant epitopes, specifically recognized by CD8 + T lymphocytes with cytotoxic capacity, induced by said protein used as an immunogen. In a preferred case, the identified epitopes are presented by the human HLA molecule HLA-A * 0201.
  • the present invention achieves an immune, cellular and humoral response in the host against the parasitic protozoan, with the ability to control, in a significant way, Leishmania infection and / or prevent it.
  • These molecules The subject of the present invention are relevant for their role in immunotherapy against leishmaniasis, both used as a preventive vaccine, as a therapeutic vaccine (isolated or in combination with different chemotherapeutic agents).
  • the present invention protects an isolated nucleotide sequence characterized by encoding the Leishmania infantum PFR1 protein or a fragment thereof.
  • Said PFR1 protein or a fragment thereof comprises at least one immunodominant epitope selected from the following group: SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No : 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7 and SEQ ID No: 8, where said immunodominant epitope is capable of inducing an antigen-specific cytotoxic T immune response in an animal, against the kinetoplastids that cause disease Leishmaniasis
  • Such immunodominant epitopes are activators of cytotoxic T lymphocytes and have high binding affinity for the MHC class I molecule of type A2.
  • a peptide fragment capable of being recognized by lymphocyte receptors and generating an epitope-specific cellular immune response is considered "immunodominant epitope.” It usually depends, to a large extent, on the repertoire of MHC molecules of the individual since, the presentation of antigens to T lymphocytes depends largely on them.
  • nucleotide sequence refers to any nucleotide sequence that includes DNA, preferably genomic DNA, synthetic DNA, RNA, RNA transcribed in vitro, messenger RNA, said sequences may be sense or antisense sequences. Therefore, the present invention makes reference to these sequences regardless of their conditions of preparation, whereby sequences extracted both from a biological sample and by cloning or synthesis by chemical or enzymatic processes are included.
  • nucleotide sequence encoding a protein or a fragment thereof refers to a nucleotide sequence that is capable, under adequate expression control by its corresponding regulatory elements (promoters, enhancers, transcription sites, etc.), of transcribing and translating an amino acid sequence of the protein of interest or a fragment thereof.
  • the protein of interest as well as the fragments thereof referred to in the present invention are characterized by the sequence of amino acids they comprise but, in addition, they can also be characterized by the cell where it is expressed, its maturation process and by the existing environmental conditions .
  • amino acid sequence refers to a sequence of an oligopeptide, peptide, protein, or fragments thereof, which occur naturally or are generated synthetically.
  • the term is not limited to the complete amino acid sequences, or to the native amino acid sequences associated with said protein molecule, but also is also referring to the variations that said native amino acid sequence may suffer.
  • the present invention protects the nucleotide sequence defined above, characterized in that said sequence encodes amino acids 1-595 of the PFR1 protein of Leishmania infantum, determined by SEQ ID No: 12. Said fragment encodes the complete protein .
  • the present invention protects the nucleotide sequence defined above, characterized in that said sequence encodes the fragment corresponding to amino acids 160-595 of the PFR1 protein of Leishmania infantum determined by SEQ ID No: 9.
  • the present invention protects the nucleotide sequence defined above, characterized in that said sequence encodes the fragment corresponding to amino acids 160-548 of the PFR1 protein of Leishmania infantum determined by SEQ ID No: 10.
  • the present invention protects the nucleotide sequence defined above, characterized in that said sequence encodes the fragment corresponding to amino acids 160-385 of the PFR1 protein of Leishmania infantum determined by SEQ ID No: 1 1.
  • the present invention also protects a chimeric molecule characterized by comprising: a) a nucleotide sequence defined above, which is preferably fused to
  • chimeric molecule b) a nucleotide sequence encoding the Trypanosoma cruzi Hsp70 protein, or fragments thereof; wherein said chimeric molecule is capable of inducing an antigen-specific cytotoxic T immune response in an animal against the kinetoplastids that cause leishmaniosis disease.
  • chimeric molecule refers to a DNA molecule containing nucleotide sequences from two different species, preferably said species are Leishmania infantum and Trypanosoma cruzi.
  • the present invention protects the chimeric molecule defined above, characterized in that it carries the nucleotide sequence encoding the Trypanosoma cruzi Hsp70 protein, determined by SEQ ID No: 13, or HSP70 fragments with carrier activity.
  • the present invention protects the chimeric molecule defined above, characterized in that it incorporates at the 3 'end of the gene fragment encoding the fragment of the PFR1 protein corresponding to amino acids 160 to 595, characterized by SEQ ID No: 9, and the nucleotide sequence encoding the Trypanosoma cruzi Hsp70 protein, determined by SEQ ID No: 13 or HSP70 fragments with carrier activity.
  • the present invention protects the chimeric molecule defined above, characterized in that it incorporates at the 3 'end of the gene fragment encoding the fragment of the PFR1 protein corresponding to amino acids 160 to 548, characterized by SEQ ID No: 10, and the nucleotide sequence encoding the Trypanosoma cruzi Hsp70 protein, determined by SEQ ID No: 13 or HSP70 fragments with carrier activity.
  • the present invention protects the chimeric molecule defined above, characterized in that it incorporates at the 3 'end of the gene fragment encoding the fragment of the PFR1 protein corresponding to amino acids 160 to 365 characterized by SEQ ID No: 1 1, and the nucleotide sequence encoding the Trypanosoma cruzi Hsp70 protein, determined by SEQ ID No: 13, or HSP70 fragments with carrier activity.
  • the present invention protects the chimeric molecule defined above, characterized in that it incorporates at the 3 'end of the gene fragment encoding the PFR1 protein, the nucleotide sequence encoding the Trypanosoma cruzi Hsp70 protein, which is SEQ ID No: 13 or fragments of HSP70 with carrier activity.
  • the present invention also protects an expression or recombinant vector characterized by comprising:
  • the present invention also protects a recombinant plasmid characterized by comprising the vector defined above.
  • Another aspect protected by the present invention concerns a composition, preferably pharmaceutical or immunogenic, characterized by comprising: a) a nucleotide sequence defined above, or
  • Another aspect protected by the present invention concerns the use of the pharmaceutical or immunogenic composition defined above, for the treatment and / or prevention of an infection of the kinetoplastids that cause leishmaniosis disease in an animal.
  • Another aspect protected by the present invention concerns the method for manufacturing therapeutic or preventive vaccines for the treatment and / or prevention of an infection of the kinetoplastids that cause leishmaniosis disease, by using the pharmaceutical or immunogenic composition defined above.
  • Said use or method is characterized by comprising the following steps: a) identifying the coding sequences of interest, preferably identifying at least one nucleotide sequence defined above,
  • d) purify at least one of the proteins obtained in c), also called recombinant proteins (chimeras or not), by affinity chromatography, and e) produce at least one endotoxin-free DNA vector for safe inoculation as a therapeutic or preventive vaccine for the treatment and / or prevention of an infection of the kinetoplastids that cause leishmaniosis disease.
  • Another aspect protected by the present invention concerns the use of a nucleotide sequence, a chimeric molecule, a recombinant vector, a recombinant plasmid, or a pharmaceutical or immunogenic composition, defined above, as markers in methods of controlling the degree of infection of kinetoplastids. that cause leishmaniasis disease in an animal.
  • the present invention refers to the use of a nucleotide sequence, a chimeric molecule, a recombinant vector, a recombinant plasmid, or a pharmaceutical or immunogenic composition, defined above, to generate protective immunological memory against infection of the kinetoplastids that cause Leishmaniasis disease in an uninfected animal.
  • the present invention relates to the use of a nucleotide sequence, a chimeric molecule, a recombinant vector, a recombinant plasmid, or a pharmaceutical or immunogenic composition, defined above, to clarify or generate partial or total clearance of the kinetoplastids that They cause the disease of tissue leishmaniasis in an infected animal.
  • the invention mainly has two clear options for immunotherapeutic application, preventive vaccination and use in immune therapies against Leishmania infection. It also presents the possibility that the molecules / products object of the invention can be used in the form of recombinant proteins, such as DNA plasmids (genetic vaccine), or in combination.
  • a first application of the products to be patented would be the use of these molecules to generate protective immunological memory against infection by the aforementioned parasitic protozoan, either in humans or in dogs, getting control of the disease in endemic areas (vaccination ).
  • Another application is the use of these molecules as immunotherapy in already infected individuals, in order to enhance the host's immune response against the parasite and control it.
  • This treatment can be isolated or in combination with other existing chemotherapeutic agents, especially by pursuing the total clearance of the parasite that is so difficult today with the available means.
  • FIGURE 1 10% SDS-PAGE acrylamide gel electrophoresis corresponding to the purification of the Leishmania infantum PFR1 recombinant protein expressed in an in vitro prokaryotic expression system and purified by affinity chromatography. MW: Molecular weight marker.
  • FIGURE 2. Production of NO in rat alveolar macrophages stimulated with the PFR1 protein, LPS (stimulation control) and different inhibitors.
  • FIGURE 3 Western blots of extracts from COS-7 cells transfected with the different test plasmids.
  • Membrane A Western using serum against PAR-2 of T. cruzi.
  • Membrane B Western using the serum against the Hsp70 of T. cruzi.
  • Membrane C Western blot using anti-Th70 antibody.
  • Well 1 Total extract of COS-7 cells.
  • Well 2 Total extract of COS-7 cells transformed with plasmid pCMV4.
  • Well 3 Total extract of COS-7 cells transformed with plasmid pCMV4-PFR1.
  • Well 4 Total extract of COS-7 cells transformed with the plasmid pCMV4-PFR1-Hsp70.
  • FIGURE 4 Humoral response against PFR1 protein and at different post-immunization times (14 and 40 days) of C57BL / 6 mice immunized with the different plasmids tested (pCMV4-PFR1; pCMV4-PFR1-Hsp70) and negative control ( Saline solution). The values obtained from IgG (upper panel A) and from the lgG1 and lgG2a isotypes (lower panel B) are represented.
  • FIGURE 5 Humoral response against PFR1 protein and soluble Leishmania antigen (SLA) of the different C57BL / 6 mice immunized with the different plasmids and challenged with Leishmania infantum (SS. Saline solution; pCMV4; PFR1. PCMV4 PFR1; 70c. pCMV4 PFR1 -Hsp70 complete; 70t. pCMV4 PFR1 -Hsp70 truncated)
  • B lgG 2a / anti-SLA
  • C Igd / anti-SLA
  • D lgG / ant ⁇ -PFR1.
  • FIGURE 6 Stimulation index against PFR1 protein in splenocyte lymphoproliferation assays of C57BL / 6 mice immunized with the different plasmids under study (SS. Saline solution; pCMV4; PFR1. PCMV4 PFR1; 70c. PCMV4 PFR1 -Hsp70; 70t. PCMV4 PFR1 -Hsp70 truncated)
  • FIGURE 7 Production of NO by the macrophages of the peritoneum of C57BL / 6 mice after challenge with Leishmania infantum (SS. Saline solution; pCMV4; PFR1. pCMV4 PFR1; 70c pCMV4 PFR1 -Hsp70 complete; 70t. pCMV4 PFR1 -Hsp70 truncated).
  • FIGURE 8 Parasitic load on the different organs after infection with Leishmania infantum of C57BL / 6 mice immunized with the different molecules under study and control mice (SS. Saline solution; pCMV4; PFR1. PCMV4 PFR1; 70c. PCMV4 PFR1 -Hsp70 complete; 70t. pCMV4 PFR1 -Hsp70 truncated).
  • FIGURE 9 Percentage of T2 cell binding of the different peptides of the L. infantum PFR1 protein corresponding to the immunodominate epitopes identified. Values referred to the control peptide (HB-ENV 3 34.342).
  • FIGURE 10 Determination of the number of cells expressing Granzima B in control mice (S. salina) and mice immunized with plasmids pCMV4-PFR1 and pCMV4 PFR1-Hsp70), measured by ELISPOT assay, the figures shown are obtained by subtracting from the number of cells determined for each problem well and saline control (stimulated with the peptide in question), the value obtained in the negative control (background). Any figure higher than double the negative control plus two standard deviations and whose result has a minimum value of 150 cells per million is considered positive. In the negative wells the corresponding value is not represented. A representative value of at least three different tests is shown.
  • FIGURE 11 Determination of the number of cells expressing Granzima B in control mice (S. salina) and mice immunized with plasmids pCMV4-PFR1 and pCMV4 PFR1-Hsp70), measured by ELISPOT assay, the
  • FIGURE 13 Tables 1 and 2. Theoretical predictions of HLA-A * 0201 binding of potential CD8 + T epitopes. The amino acids involved in binding to the HLA-A * 0201 molecule are indicated in bold and underlined. In parentheses the name of the peptides that were synthesized is indicated.
  • FIGURE 14 Humoral response against 436aaPFR1 protein and at different post-immunization times (14 and 40 days) of C57BL / 6 mice immunized with the different plasmids tested (pCMV4-436aaPFR1; pCMV4-436aaPFR1 - Hsp70) and negative control (Solution saline).
  • the values obtained from IgG (upper panel A) and from the lgG1 and lgG2a isotypes (lower panel B) are represented.
  • FIGURE 15 PFR1 protein stimulation index in splenocyte lymphoproliferation assays of C57BL / 6 mice immunized with plasmids pCMV4-436aaPFR1, pCMV4-436aaPFR1 -HSP70 and Saline solution (SS).
  • FIGURE 16 Determination of the number of cells expressing Granzima B in control mice (S. salina) and mice immunized with plasmids pCMV4- 436aaPFR1 and pCMV4-436aaPFR1-Hsp70), measured by ELISPOT assay, the figures shown are obtained by subtracting from the number of cells determined for each problem well and saline control (stimulated with the peptide in question), the value obtained in the negative control (background). Is considered positive all that figure greater than double the negative control plus two standard deviations and whose result has a minimum value of 150 cells per million. In the negative wells the corresponding value is not represented. A representative value of at least three different tests is shown.
  • PFR1 protein induces nitric oxide expression.
  • the PFR1 protein of Leishmania infantum is included in the family of paraflagelar proteins characteristic of kinetoplastids.
  • Figure 1 we show the recombinant protein PFR1 of L. infantum expressed in a prokaryotic expression system and purified by affinity chromatography.
  • this protein we have shown that, per se, it has the ability to activate the production of nitric oxide (NO), one of the main mechanisms that macrophages have to eliminate the pathogens that have phagocytized in alveolar macrophages of naive rat, that is, without any previous treatment or infection.
  • NO nitric oxide
  • LNMMA L-nitromonomethylaginine
  • Figure 3 shows, respectively, the presence of recognition bands with sizes of 70 kDa (corresponding to the PFR1 protein, in the cell lane with the pCMV4 PFR1), of 140 kDa in the cell lane.
  • COS-7 transfected with plasmid pCMV4 PFR1 -Hsp70 and 96 kDa in the cell lane with plasmid pCMV4 PFR1 -Hsp70T; no recognition was detected in the lane of the cells carrying the empty pCMV4.
  • mice of strain C57BL / 6 were immunized 4 times with a time between each immunization of two weeks.
  • six mice from each group were challenged with 10 5 infective promastigotes of strain JPCM5 (MCAN / ES / 98 / LLM-724) of L. infantum intravenously.
  • the levels of IgG determined in sera from mice immunized with the PFR1 gene fused to the HSP70 gene were higher than those detected in mice immunized with the PFR1 gene isolated, with a maximum of antibodies being observed at two weeks post-fourth immunization. In all cases the level of anti-PFR1 antibodies slightly decreases at six weeks post-fourth immunization.
  • the isotype analysis reflects that the antibodies generated show a clear polarization of the response to the lgG2a isotype (Th1 type immune response). Results similar to those referred for the pPFR1-HSP70 molecule are obtained with the pPFR1-H70T molecule.
  • Lymphoproliferation assays were performed three weeks after the fourth inoculation.
  • the spleens were extracted in sterility and the splenocytes obtained were cultured in vitro, with increasing concentrations of the rPFR1 protein (0.4, 2 and 10 pg / ml).
  • a mitogen (ConA) and, as a negative control, unstimulated splenocytes were included as a positive control.
  • IE 13 and with saline
  • the parasitic load was analyzed by limiting dilution (Buffet et. Al., 1995, Antimicrob. Agents Chemother. 39 (9): 2167-2168), in the liver, spleen and bone marrow (target tissues of said parasite), on days 14 and 28 post-infection, showing in figure 8 a summary of the results obtained.
  • all groups of mice presented parasites in the liver, however, in the control groups (ss and pCMV4) the parasite load is significantly greater than that detected in the groups immunized with the different molecules at test, showing higher values in at least one order of magnitude.
  • mice vaccinated with the test molecules do not show an increase in hepatic parasitic load at 28 days post-infection.
  • mice immunized with the PFR1 gene fused to the complete HSP70 gene were able to clarify the said organ of parasites.
  • the analysis of the spleen parasite rate shows a behavior similar to the one described above.
  • ss and pCMV4 we observed a significant higher rate of parasites (at least an order of magnitude) in the splenic tissue of control mice (ss and pCMV4) relative to that shown by mice immunized with the molecules under test.
  • mice immunized with the PFR1 gene fused to the HSP70T gene show no spleen parasites at two weeks post-infection.
  • the control groups ss and pCMV4 present parasites, these being detected at 28 days post-infection.
  • none of the mice immunized with the problem molecules have parasites in said tissue.
  • Splenocyte cytokine expression pattern analysis of immunized mice and control mice shows the existence of levels of TNF- ⁇ e IFN- ⁇ older and with statistical significance in mice immunized with the chimeric constructs PFR1-HSP70 and PFR1-H70T, stimulated or not stimulated with rPFR1 and / or SLA, versus the control groups (P ⁇ 0.01). However, no statistically significant variation is observed between the groups to be evaluated in the levels of IL-2 or IL-4.
  • the first two programs give each peptide a score based on its theoretical affinity to this HLA molecule.
  • the BIMAS program scores the binding stability, indicating the theoretical binding time of each of the peptides to the HLA molecule.
  • eight theoretical high affinity epitopes binding to the HLA class I molecule were selected and the corresponding peptides were synthesized: SEQ ID No: 1-1864 (FMDIIGVKKV), SEQ ID No: 2-1865 (QLDATQLAQV) , SEQ ID No: 3 - 1866 (KLLELTVYNC), SEQ ID No: 4 - 1868 (KMMEDIMNA), SEQ ID No: 5 - 1869 (AMHDGETQV), SEQ ID No: 6 - 1871 (QLQERLIEL), SEQ ID No: 7 - 1872 (MLYLTLGSL) and SEQ ID No: 8-1873 (KMVEYKSHL).
  • tables 1 and 2 the scores obtained by the different peptides in the aforementioned computer
  • T2 cell binding assays deficient in the expression of antigen transporter molecules (TAP).
  • TAP antigen transporter molecules
  • mice that were injected with saline (Sigma) were used.
  • mice transgenic C57BL / 6-A2 / K b transgenic mice infected with 10 6 infectious promastigotes of L. infantum (strain JPCM5). At 170 days after infection, the mice were sacrificed and their splenocytes or their non-parenchymal liver cells were exposed to the different peptides in the context of an ELISPOT assay with a Granzima B detection antibody.
  • mice immunized with the test molecules tested and subsequently infected do not show parasites in bone marrow, while those control mice inoculated with the empty plasmid pCMV4 or with saline solution have a high rate of parasites in said tissue at 28 days post-infection.
  • the spleen and liver parasite rate of mice immunized with said problem molecules are between two to four orders of magnitude lower than those detected in control mice inoculated with the empty plasmid (pCMV4) or saline solution.
  • Mice immunized with the pPFR1-H70T molecule and infected with Leishmania do not show spleen parasites at 14 days post-infection.
  • EXAMPLE 2 1. 1 Antigen-specific humoral response induced by the test molecules.
  • the plasmids used contained the sequence corresponding to the fragment of the PFR1 protein of Leishmania infantum of 436 amino acids in length between amino acids 160 and 595 thereof. Each mouse was immunized 4 times with a time between each immunization of two weeks.
  • the levels of IgG determined in sera from mice immunized with the 436aaPFR1 gene fused to the HSP70 gene were higher than those detected in mice immunized with the 436aaPFR1 gene isolated, with a maximum of antibodies being observed at two weeks post-fourth immunization. In all cases, the level of anti-PFR1 antibodies slightly drops after six weeks post-fourth immunization.
  • the isotype analysis (B) shows in the generated antibodies a clear polarization of the response towards the lgG2a isotype (Th1 type immune response). 1.4 Antigen-specific cellular response induced by the test molecules.
  • Lymphoproliferation assays were performed three weeks after the fourth inoculation.
  • the spleens were removed in sterility and splenocytes obtained were grown in vitro, with increasing concentrations of the rPFR1 protein (0.4, 2 and 10 Mg / ml).
  • a mitogen (ConA) and, as a negative control, unstimulated splenocytes were included as a positive control. From the results obtained, shown in Figure 15, it can be affirmed that there is a significant cell proliferation index against the recombinant protein PFR1 and, in addition, this stimulation is splenocyte-dependent dose of the mice immunized with the recombinant molecules under study.
  • mice that were injected with saline (Sigma) were used.

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Abstract

La presente invención se refiere a una secuencia nucleotídica aislada caracterizada por codificar para la proteína PFR1 de Leishmania infantum o un fragmento de la misma, dicha proteína PFR1 o un fragmento de la misma comprende al menos un epítope inmunodominante seleccionado entre el siguiente grupo: SEQ ID No: 1, SEQID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7 y SEQ ID No: 8, donde dicho epítope inmunodominante es capaz de inducir una respuesta inmunológica T citotóxica específica de antígeno en un animal, frente a los kinetoplástidos que causan la enfermedad de la leishmaniosis. Dichos epítopes inmunodominantes son activadores de linfocitos T citotóxicos y presentan alta afinidad de unión por la molécula MHC de clase I de tipo A2.

Description

MOLECULA QUIMERICA UTIL EN INMUNOTERAPIA FRENTE A LA LEISHMANIOSIS, QUE COMPRENDE UN FRAGMENTO DE LA PROTEINA PFR1 DE LEISHMANIA INFANTUM CON EPITOPES ESPECIFICOS INMUNODOMINANTES.
La presente invención se encuentra dentro del sector químico, farmacéutico, y en las áreas de la medicina, la biología molecular, la inmunología, la veterinaria y la parasitología, y se refiere a una herramienta inmunológica para la lucha contra la leishmaniosis, enfermedad provocada por diferentes especies pertenecientes al género Leish manía.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR Las especies del género Leishmania, protozoos parásitos intracelulares, pertenecen al orden Kinetoplastida familia Trypanosomatidae, se distribuyen por regiones tropicales y subtropicales del viejo y nuevo mundo, causando un amplio espectro de manifestaciones clínicas denominadas leishmaniosis. Según la especie causante, la leishmaniosis puede ser clasificada como cutánea, mucocutánea o visceral (en referencia a su tropismo tisular y a las manifestaciones clínicas que provocan). La incidencia de la leishmaniosis ha aumentado enormemente en los últimos años, de tal forma que actualmente es endémica en 88 países repartidos por todos los continentes y se considera que hay 350 millones de personas en riesgo de contraer la enfermedad (WHO report, http://who.int/ctd/html/leisdis.html). Se estima que hay en el mundo unos 12 millones de personas afectadas de leishmaniosis, incluyendo aquellos que no presentan la enfermedad de forma aparente. Del total de 2 millones anuales de nuevos casos, 500.000 son de leishmaniosis visceral (LV). Esta enfermedad es causada por L. infantum y L. donovani y los síntomas de la enfermedad incluyen fiebre intermitente, anemia, esplenomegalia, hepatomegalia y linfoadenopatía. El desenlace de la LV suele ser la muerte, generalmente causada por una infección concomitante, dado el débil estado inmunológico del paciente. La coinfección Le¡shman¡aN\ se ha revelado en los últimos años como un importante problema de salud para los países del área mediterránea. En estos países, el principal hospedador es el perro, actuando como reservorio de la enfermedad en humanos (Alvar et al. 2004. Adv Parasitol. 57: 1-88).
La vacunación es el tratamiento médico más eficiente para prevenir la mortalidad y morbilidad debida a agentes infecciosos. Pese a ello, actualmente son muy pocos los microorganismos patógenos contra los que se dispone de una vacuna eficaz. Frente a las diferentes especies de Leishmania, en los últimos años, se ha probado la utilización de vacunas elaboradas con antígenos o fragmentos de los mismos, tanto en forma purificada como recombinante, con resultados dispares (Kedzierski et al. 2010. J Glob Infect Dis. 2(2): 177-85; Kedzierski et al. 2006. Parasitology, 133: 87-112; Requena et al. 2004. Expert Opin Biol Ther. 4(9): 1505- 17). No obstante, ninguno de los intentos para la obtención de una vacuna en humanos ha sido satisfactorio y ha culminado con éxito.
Otra opción interesante en la lucha contra la enfermedad es la inmunoterapia terapéutica o, en su defecto, la inmunoquimioterapia. Se han realizado intentos con parásitos completos pasteurizados con un adyuvante (Convit et al. 2003. Med Hyg, 97: 469-72), así como con una mezcla de antígenos propios del parásito {Badaro et al. 2006. J Infect Dis, 194: 1151-9), pero, al igual que ocurre con la vacunación, no se ha logrado ningún éxito definitivo (El-On J. 2009. Isr Med Assoc J, 11(10): 623-8).
Como antes se introdujo, el perro constituye el principal reservorio de la enfermedad, luego también se han realizado numerosos intentos desde el punto de vista inmunológico en la lucha frente a este problema sanitario, pero también veterinario. De hecho, la leishmaniosis constituye una enfermedad parasitaria grave en el perro. La sintomatología clínica más habitual es la pérdida de pelo, sobre todo alrededor de los ojos, orejas y la nariz. En una fase más avanzada de la enfermedad el perro pierde peso aunque no el apetito y son habituales la presencia de heridas en la piel, especialmente en la cabeza y las patas, así como síntomas relacionados con insuficiencia renal. Esta enfermedad es endémica en amplias zonas de España, así como en la mayoría de los países de la región mediterránea.
Al igual que ocurre con la enfermedad humana, se han realizado numerosos intentos desde diferentes perspectivas, tanto en vacunas como en inmunoterapia, sin que, hasta el momento, se disponga de moléculas que muestren una adecuada eficacia (Alvar et al. 2004. Adv Parasitol. 57: 1-88; Reís et al. 2010. Trends Parasitol. 26(7): 341-9).
En cualquier caso, ya se hable de leishmaniosis canina o humana, se apunta a la posibilidad de que una de las más prometedoras vías de control de la leishmaniosis es la utilización de vacunas DNA que portan múltiples genes codificantes de específicos antígenos de Leishmania o proteínas recombinantes quiméricas que contengan diferentes antígenos propios del parásito (de Oliveira et al. 2009. Parasitol Int. 58(4): 319-24; Palatnik-de-Sousa, 2008. Vaccine 26: 1709- 1724). Las proteínas PFR o paraflagelares representan una familia de relevantes antígenos específicos de tripanosomátidos que se localizan en la región paraflagelar de estos parásitos {Fouts et al., 1998 J Biol Chem, 273(34): 21846- 21855; Clark et al., 2005. Parasitol Res. 96(5): 312-320). Algunos miembros de esta familia de antígenos, proteínas PFR1 -3, destacan por su alta capacidad inmunogénica (Michailowsky et al., Infect Immun 71(6): 3165-3171). La inmunización de ratones con las proteínas PFR1 y PFR2 purificadas de T. cruzi induce una respuesta inmunológica Th1 capaz de reducir, en ensayos experimentales de infección, los niveles de T. cruzi en el tejido cardiaco de los ratones inmunizados e infectados con el parásito T. cruzi (Morell et al. 2006. Vaccine, 24: 7046-7055). Estos resultados, permiten postular que las proteínas PFR pueden ser adecuadas candidatas para ser utilizadas como vacunas. De acuerdo con estos resultados, se ha encontrado que linfocitos CD4+ aislados de ratones inmunizados con PFR son capaces de activar macrófagos parasitados provocando la muerte del parásito mediante la producción de NO (Wrightsman et. al. 2000. Vaccine 18 (14): 1419-27, Miller et. al. 1997. J Immunol 158 (11): 5330- 7), y ser capaces de reducir el nivel de parásitos en sangre, en ensayos experimentales de infección, en ausencia de células B, pero no en ausencia de linfocitos T CD4+ y CD8+ funcionales. Desde el punto de vista de la inmunización génica, diferentes proteínas paraflagelares de diversos kinetoplástidos han sido estudiadas. Se ha demostrado la capacidad inmunogénica y protectora de la proteína PFR2 de L. mexicana tras su inoculación tanto como DNA o proteína recombinante (Saravia et. al. 2005. Vaccine 23: 984-995). La inmunización de ratones con vectores DNA conteniendo el gen que codifica la PFR2 de T. cruzi o fusionada a la Hsp70 de dicho patógeno induce altos niveles de lgG2a anti-PFR, sin embargo sólo la inmunización con la vacuna quimérica estimula la producción de IL-12 e IFN-γ y provoca la disminución de células productoras de IL-4, permitiendo una respuesta protectora contra T. cruzi (Morell et. al. 2006. Vaccine 24: 7046-7055).
Con respecto a la proteína Hsp70, pertenece a la familia de las proteínas de choque térmico (heat shock proteins, Hsp). Éstas forman una amplia familia de proteínas de tamaño heterogéneo, las cuales están altamente conservadas entre las diferentes especies (eucariotas y procariotas). Las mismas son fundamentales en el mantenimiento de la homeostasis celular por su papel de chaperonas (Smith, Whitesell et al. 1998. Pharmacological Reviews 50(4): 493-513). En cuanto a su papel inmunológico, resultan muy interesantes por su capacidad de activación del sistema inmunitario, destacando la familia Hsp70 por su versatilidad inmunológica. La Hsp70 procedente de células tumorales o de células infectadas por virus tiene la capacidad de activar respuesta CTL CD8+ in vivo e in vitro contra distintos antígenos expresados en las células de las cuales se ha purificado la proteína inmunogénica (Srivastava. 2002. Nat Rev Immunol 2: 185- 194; Wu et al., 2005. Cáncer Res. 65(11): 4947-4954). Así, la Hsp70 extracelular puede formar complejos con péptidos antigénicos y simultáneamente activar APCs. Esta interacción desencadena una cascada de eventos, en los que se incluirían procesos de cross-presentación de péptidos a MHC I restringida a CD8+ y MHC II restringido a células T CD4+, secreción de citocinas proinflamatorias y maduración fenotípica y funcional de células dendríticas (DCs) (Asea et al. 2000. Nat Med 6: 435-442; Basu et al. 2001. Immunity 14: 303-313; Harmala et al. 2002. J Immunol 169: 5622-5629; Tobian et al. 2004. J Immunol 173: 5130-5137).
En cuanto a la proteína Hsp70 de Trypanosoma cruzi, ensayos de nuestro laboratorio han mostrado in vitro que tiene per se un singular efecto estimulador sobre células de bazo y ganglio de ratones naive (Marañón et al., 2000. Int. Immunol. 12(12): 1685-1693), el cual da lugar a una rápida e intensa estimulación de células T. Además, esta misma proteína es capaz de inducir in vivo e in vitro, frente al hapteno asociado, una respuesta inmunológica mixta (lgG1 e lgG2a) la cual, interesantemente, resulta ser independiente de los receptores TLR2 y TLR4 {Qazi et al. 2007. Vaccine 25(6): 1096-1103). Esta Hsp70 de T. cruzi también ha resultado ser capaz de generar una respuesta específica frente a la proteína KMP1 1 cuando se realiza una inmunización con un vector vacuna que porta las secuencias de ambas proteínas, activando la producción de lgG2a específicas frente a la KMP1 1 (Thomas, García-Pérez et al. 2000. DNA and Cell Biology 19(1): 47-57; Thomas, Olivares et al. 2000. Acta Trópica 75(2): 203-210). Además, los ratones inmunizados con la proteína de fusión KMP1 1 -HSP70, pero no los inmunizados con la proteína KMP1 1 aislada, inducen una respuesta de linfocitos citotóxicos frente a células Jurkat-A2/Kb expresando la proteína KMP1 1 así como frente a dichas células cargadas con distintos péptidos de KMP1 1 de probada unión a la molécula A2. También se han conseguido hitos de este tipo con el propio género Leishmania, administrando Hsp70 junto a la metaloproteasa gp63 propia de Leishmania donovani (Kaur et al. 2011. Parasite Immunol. 33(2): 95-103).
Frente a las diferentes especies de Leishmania, en los últimos años, se ha probado la utilización de vacunas elaboradas con parásitos completos inactivados y/o modificados, antígenos o fragmentos de los mismos, tanto en forma purificada como recombinante, con resultados dispares. Así, según nuestros datos, ninguno de los intentos para la obtención de una vacuna para humanos y/o perros ha sido satisfactorio ni se ha culminado con éxito. La quimioterapia actualmente en uso, aunque muestra cierta efectividad en numerosos casos es incapaz de generar un aclaramiento del parásito, aspecto necesario para su completo control.
En el 2009, propusimos como proyecto la identificación de epítopes T y de unión a la molécula A*0201 de la proteína PFR1 , así como la obtención de unas moléculas quiméricas (vacunas DNA) formadas por la secuencia codificante de proteínas antigénicas identificadas de L infantum PFR1 , utilizadas de forma aislada y asociadas a la proteína HSP70 y/o fragmentos de la misma, como molécula carrier. También propusimos la determinación de la respuesta inmunológica antígeno específica inducida frente a dichas proteínas antigénicas de L infantum PFR1 tras la inmunización de ratones con las moléculas quiméricas construidas a tal efecto.
Existen estudios en contra del empleo de péptidos aislados de las proteínas PFR de T. cruzi para la inducción de una respuesta CTL. En concreto, Wrightsman R.A. et al. , publicaron un artículo en 2002 donde analizan distintos péptidos aislados de las proteínas PFR de T. cruzi y evalúan si estos péptidos son eficientemente procesados y presentados, en el contexto del MHC-clase I, en el curso de una infección experimental con dicho parásito y si son reconocidos por los linfocitos T citotóxicos (CTLs) en los animales inmunizados (Wrightsman et al. 2002. Parasite Immunol. 24(8): 401-12). En dicho estudio, se identifican en PFR1 epítopes con capacidad de unión a las moléculas HLA de clase I murinas H-2Kb y H-2Db, pero se concluye que la inmunización de ratones con las proteínas PFR1 o PFR3 no generan CTLs frente a las mismas, ni frente a los péptidos en cuestión.
Por tanto, a la vista de la información del estado de la técnica, actualmente existe la necesidad de demostrar la eficiencia de moléculas quiméricas (vacunas DNA y lo recombinantes) formadas por la secuencia codificante de proteínas antigénicas de L. infantum PFR1 comprendiendo epítopes específicos capaces de inducir una respuesta CTL, utilizadas de forma aislada y asociadas a la proteína HSP70 y/o fragmentos de la misma, como molécula carrier. Así como su uso como moléculas eficaces como vacuna preventiva y terapéutica frente a la infección por Leishmania, tanto en humanos como en perros.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención representa una útil herramienta en la lucha contra la leishmaniosis humana y animal. Se trata de la utilización de secuencias nucleotídicas codificantes para la proteína PFR1 de Leishmania infantum y/o fragmentos de la misma conteniendo una serie de péptidos , solos o en conjunción con la proteína Hsp70 de Trypanosoma cruzi, así como de plásmidos conteniendo sus secuencias genéticas codificantes. Dichos péptidos contenidos en la proteína PFR1 de L. infantum se corresponden con epítopes inmunodominantes, reconocidos de forma específica por linfocitos T CD8+ con capacidad citotóxica, inducidos por la citada proteína usada como inmunógeno. En un caso preferente, los epítopes identificados son presentados por la molécula HLA humana HLA-A*0201 . Con estas moléculas genéticas y proteicas la presente invención consigue una respuesta inmunitaria, celular y humoral, en el hospedador frente al protozoo parásito, con capacidad para controlar, de forma significativa, la infección por Leishmania y/o prevenir la misma. Dichas moléculas objeto de la presente invención son relevantes por su papel en inmunoterapia frente a la leishmaniosis tanto usadas como vacuna preventiva, como terapéutica (aisladas o en combinación con diferentes quimioterápicos). Así, representan una seria ventaja, sobre todo, si tenemos en cuenta la inexistencia de vacunas preventivas eficaces frente a esta enfermedad parasitaria y las dificultades e inconvenientes que presentan los tratamientos farmacológicos tradicionalmente utilizados que, aunque de cierta efectividad en la mayoría de los casos, en muchos otros (especialmente en perros) no producen el aclaramiento del parásito para el completo control de la enfermedad y que, además, son bastante costosos y suelen presentar bastantes efectos adversos, amén de la aparición cada vez más frecuente de casos de resistencia.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención protege una secuencia nucleotídica aislada caracterizada por codificar para la proteína PFR1 de Leishmania infantum o un fragmento de la misma. Dicha proteína PFR1 o un fragmento de la misma comprende, al menos, un epítope inmunodominante seleccionado entre el siguiente grupo: SEQ ID No: 1 , SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7 y SEQ ID No: 8, donde dicho epítope inmunodominante es capaz de inducir una respuesta inmunológica T citotóxica específica de antígeno en un animal, frente a los kinetoplástidos que causan la enfermedad de la leishmaniosis. Dichos epítopes inmunodominantes son activadores de linfocitos T citotóxicos y presentan alta afinidad de unión por la molécula MHC de clase I de tipo A2.
En la presente invención se considera "epítope inmunodominante" a un fragmento peptídico capaz de ser reconocido por los receptores linfocitarios y de generar una respuesta inmunitaria celular específica de epítope. Suele depender, en gran medida, del repertorio de moléculas MHC del individuo puesto que, de ellas depende en gran parte la presentación de los antígenos a los linfocitos T.
La expresión "animal" referida en la presente invención, hace referencia a un humano o un animal de compañía, y más preferentemente a un perro. En la presente invención el término "secuencia nucleotídica" se refiere a cualquier secuencia nucleotídica que incluye ADN, preferentemente ADN genómico, ADN sintético, ARN, ARN transcrito in vitro, ARN mensajero, dichas secuencias pueden ser secuencias sentido o antisentido. Por tanto, la presente invención hace referencia a estas secuencias independientemente de sus condiciones de obtención, por lo que se incluyen secuencias tanto extraídas de una muestra biológica como por clonación o síntesis mediante procesos químicos o enzimáticos. En la presente invención el término "secuencia nucleotídica que codifica para una proteína o un fragmento de la misma" se refiere a una secuencia nucleotídica que es capaz, bajo un control adecuado de expresión por parte de sus correspondientes elementos de regulación (promotores, enhancers, sitios de transcripción, etc.), de transcribir y traducir una secuencia aminoacídica de la proteína de interés o un fragmento de la misma. La proteína de interés así como los fragmentos de la misma referidos en la presente invención se caracterizan por la secuencia de aminoácidos que comprenden pero, además, se pueden caracterizar también por la célula donde se expresa, su proceso de maduración y por las condiciones medioambientales existentes.
En la presente invención el término "secuencia de aminoácidos" se refiere a una secuencia de un oligopéptido, péptido, proteína, o sus fragmentos, que se producen de manera natural o bien se generan de forma sintética. Cuando en la presente invención se hace referencia a una secuencia codificada por una secuencia nucleotídica, el término no se limita a las secuencias de aminoácidos completas, o a las secuencias de aminoácidos nativas asociadas con la citada molécula proteica, sino que además también se está refiriendo a las variaciones que puede sufrir dicha secuencia de aminoácidos nativa. En una realización particular, la presente invención protege la secuencia nucleotídica definida anteriormente, caracterizada porque dicha secuencia codifica para los aminoácidos 1 -595 de la proteína PFR1 de Leishmania infantum, determinada por la SEQ ID No: 12. Dicho fragmento codifica para la proteína completa. En otra realización particular, la presente invención protege la secuencia nucleotídica definida anteriormente, caracterizada porque dicha secuencia codifica para el fragmento correspondiente a los aminoácidos 160-595 de la proteína PFR1 de Leishmania infantum determinada por la SEQ ID No: 9.
En una realización particular, la presente invención protege la secuencia nucleotídica definida anteriormente, caracterizada porque dicha secuencia codifica para el fragmento correspondiente a los aminoácidos 160-548 de la proteína PFR1 de Leishmania infantum determinada por la SEQ ID No: 10.
En otra realización particular, la presente invención protege la secuencia nucleotídica definida anteriormente, caracterizada porque dicha secuencia codifica para el fragmento correspondiente a los aminoácidos 160-385 de la proteína PFR1 de Leishmania infantum determinada por la SEQ ID No: 1 1 .
La presente invención protege también una molécula quimérica caracterizada por comprender: a) una secuencia nucleotídica definida anteriormente, que preferentemente se encuentra fusionada a
b) una secuencia nucleotídica que codifica para la proteína Hsp70 de Trypanosoma cruzi, o fragmentos de la misma; donde dicha molécula quimérica es capaz de inducir una respuesta inmunológica T citotóxica específica de antígeno en un animal frente a los kinetoplástidos que causan la enfermedad de la leishmaniosis.
En la presente invención el término "molécula quimérica" se refiere a una molécula de ADN que contiene secuencias nucleotídicas procedentes de dos especies diferentes, preferentemente dichas especies son Leishmania infantum y Trypanosoma cruzi. En una realización particular, la presente invención protege la molécula quimérica definida anteriormente, caracterizada porque porta la secuencia nucleotídica que codifica para la proteína Hsp70 de Trypanosoma cruzi, determinada por SEQ ID No: 13, o fragmentos de la HSP70 con actividad carrier.
En otra realización particular, la presente invención protege la molécula quimérica definida anteriormente, caracterizada porque incorpora en el extremo 3' del fragmento génico codificante para el fragmento de la proteína PFR1 correspondiente a los aminoácidos 160 a 595, caracterizado por SEQ ID No: 9, y la secuencia nucleotídica que codifica para la proteína Hsp70 de Trypanosoma cruzi, determinada por la SEQ ID No: 13 o fragmentos de la HSP70 con actividad carrier.
En otra realización particular, la presente invención protege la molécula quimérica definida anteriormente, caracterizada porque incorpora en el extremo 3' del fragmento génico codificante para el fragmento de la proteína PFR1 correspondiente a los aminoácidos 160 a 548, caracterizado por SEQ ID No: 10, y la secuencia nucleotídica que codifica para la proteína Hsp70 de Trypanosoma cruzi, determinada por la SEQ ID No: 13 o fragmentos de la HSP70 con actividad carrier.
En otra realización particular, la presente invención protege la molécula quimérica definida anteriormente, caracterizada porque incorpora en el extremo 3' del fragmento génico codificante para el fragmento de la proteína PFR1 correspondiente a los aminoácidos 160 a 365 caracterizado por SEQ ID No: 1 1 , y la secuencia nucleotídica que codifica para la proteína Hsp70 de Trypanosoma cruzi, determinada por la SEQ ID No: 13, o fragmentos de la HSP70 con actividad carrier. En una realización particular, la presente invención protege la molécula quimérica definida anteriormente, caracterizada porque incorpora en el extremo 3' del fragmento génico codificante para la proteína PFR1 , la secuencia nucleotídica que codifica para la proteína Hsp70 de Trypanosoma cruzi, la cual es SEQ ID No: 13 o fragmentos de la HSP70 con actividad carrier . La presente invención protege también un vector de expresión o recombinante caracterizado por comprender:
a) una secuencia nucleotídica definida anteriormente, o
b) una molécula quimérica definida anteriormente.
La presente invención protege también un plásmido recombinante caracterizado por comprender el vector definido anteriormente. Otro aspecto protegido por la presente invención concierne a una composición, preferentemente farmacéutica o inmunogénica, caracterizada por comprender: a) una secuencia nucleotídica definida anteriormente, o
b) una molécula quimérica definida anteriormente. Otro aspecto protegido por la presente invención concierne al uso de la composición farmacéutica o inmunogénica definida anteriormente, para el tratamiento y/o prevención de una infección de los kinetoplástidos que causan la enfermedad de la leishmaniosis en un animal. Otro aspecto protegido por la presente invención concierne al método para la fabricación de vacunas terapéuticas o preventivas para el tratamiento y/o prevención de una infección de los kinetoplástidos que causan la enfermedad de la leishmaniosis, mediante el uso de la composición farmacéutica o inmunogénica definida anteriormente. Dicho uso o método se caracteriza por comprender las siguientes etapas: a) identificar las secuencias codificantes de interés, preferentemente identificar al menos una secuencia nucleotídica definida anteriormente,
b) amplificar al menos una secuencia nucleotídica identificada en a) mediante PCR empleando DNA genómico del kinetoplástido que causa la enfermedad de la leishmaniosis y oligonucleótidos que contienen dianas de enzimas de restricción que permitirán el clonaje dirigido del amplicón tras la digestión del mismo con dichas enzimas en vectores de expresión procariota y eucariota, c) clonar en fase al menos una secuencia nucleotídica amplificada en b) para la producción de la proteína codificada por dicha secuencia nucleotídica,
d) purificar al menos una de las proteínas obtenidas en c), también denominadas proteínas recombinantes (quimeras o no), mediante cromatografía de afinidad, y e) producir al menos un vector de DNA libre de endotoxinas para la inoculación segura como vacuna terapéutica o preventiva para el tratamiento y/o prevención de una infección de los kinetoplástidos que causan la enfermedad de la leishmaniosis. Otro aspecto protegido por la presente invención concierne al uso de una secuencia nucleotídica, una molécula quimérica, un vector recombinante, un plásmido recombinante, o una composición farmacéutica o inmunogénica, definidos anteriormente, como marcadores en métodos de control del grado de infección de los kinetoplástidos que causan la enfermedad de la leishmaniosis en un animal.
Preferentemente, la presente invención hace referencia al uso de una secuencia nucleotídica, una molécula quimérica, un vector recombinante, un plásmido recombinante, o una composición farmacéutica o inmunogénica, definidos anteriormente, para generar memoria inmunológica protectora frente a la infección de los kinetoplástidos que causan la enfermedad de la leishmaniosis en un animal no infectado.
Más preferentemente, la presente invención hace referencia al uso de una secuencia nucleotídica, una molécula quimérica, un vector recombinante, un plásmido recombinante, o una composición farmacéutica o inmunogénica, definidos anteriormente, para aclarar o generar el aclaramiento parcial o total de los kinetoplástidos que causan la enfermedad de la leishmaniosis de los tejidos en un animal infectado.
La invención tiene principalmente dos claras opciones de aplicación inmuno- terapéutica, la vacunación preventiva y la utilización en terapias inmunes frente a la infección por Leishmania. Así mismo, presenta la posibilidad de que las moléculas/productos objeto de la invención puedan ser utilizadas en forma de proteínas recombinantes, como plásmidos DNA (vacuna genética), o en forma combinada.
Así, una primera aplicación de los productos a patentar sería la utilización de estas moléculas para generar memoria inmunológica protectiva frente a la infección por el mencionado protozoo parásito, ya sea en humanos o en perros, consiguiendo el control de la enfermedad en zonas endémicas (vacunación). Otra aplicación es el uso de estas moléculas como inmunoterapia en individuos ya infectados, con objeto de potenciar la respuesta inmunitaria del hospedador frente al parásito y controlar el mismo. Este tratamiento puede ser aislado o en combinación con otros quimioterápicos ya existentes, sobre todo, persiguiendo el aclaramiento total del parásito que tan difícil resulta en la actualidad con los medios disponibles. Así, activando y modulando la respuesta inmunitaria del hospedador frente al parásito y especialmente induciendo una respuesta T citotóxica antígeno-específica podemos conseguir que el sistema inmunológico acabe con los parásitos acantonados en tejidos, como médula ósea o bazo, que la mayoría de tratamientos quimioterápicos no consiguen aclarar.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS FIGURA 1. Electroforesis en gel de acrilamida al 10% SDS-PAGE correspondiente a la purificación de la proteína recombinante PFR1 de Leishmania infantum expresada en un sistema de expresión procariota in vitro y purificada por cromatografía de afinidad. MW: Marcador de peso molecular. FIGURA 2. Producción de NO en macrófagos alveolares de rata estimulados con la proteína PFR1 , LPS (control de estimulación) y diferentes inhibidores.
FIGURA 3. Western blots de extractos de las células COS-7 transfectadas con los diferentes plásmidos ensayo. Membrana A: Western empleando el suero frente a la PAR-2 de T. cruzi. Membrana B: Western empleando el suero frente a la Hsp70 de T. cruzi. Membrana C: Western blot empleando anticuerpo anti-Th70. Pocilio 1 : Extracto total de células COS-7. Pocilio 2: Extracto total de células COS-7 transformadas con el plásmido pCMV4. Pocilio 3: Extracto total de células COS-7 transformadas con el plásmido pCMV4-PFR1 . Pocilio 4: Extracto total de células COS-7 transformadas con el plásmido pCMV4-PFR1 -Hsp70. Pocilio 5: Extracto total de células COS-7 transformadas con el plásmido pCMV4-PFR1 -T70. Pocilio 6: Marcador de peso molecular. FIGURA 4. Respuesta humoral frente a la proteína PFR1 y a diferentes tiempos post-inmunización (14 y 40 días) de los ratones C57BL/6 inmunizados con los distintos plásmidos a ensayo (pCMV4-PFR1 ; pCMV4-PFR1 -Hsp70) y control negativo (Solución salina). Se representan los valores obtenidos de IgG (panel superior A) y de los isotipos lgG1 e lgG2a (panel inferior B).
FIGURA 5. Respuesta humoral frente a la proteína PFR1 y antígeno soluble de Leishmania (SLA) de los diferentes ratones C57BL/6 inmunizados con los distintos plásmidos y retados con Leishmania infantum (SS. Solución salina; pCMV4; PFR1 . pCMV4 PFR1 ; 70c. pCMV4 PFR1 -Hsp70 completa; 70t. pCMV4 PFR1 -Hsp70 truncada) A: IgG/anti-SLA, B: lgG2a/anti-SLA, C: Igd/anti-SLA, y D: lgG/ant¡-PFR1 .
FIGURA 6. índice de estimulación frente a la proteína PFR1 en ensayos de linfoproliferación con esplenocitos de ratones C57BL/6 inmunizados con los distintos plásmidos a estudio (SS. Solución salina; pCMV4; PFR1 . pCMV4 PFR1 ; 70c. pCMV4 PFR1 -Hsp70 completa; 70t. pCMV4 PFR1 -Hsp70 truncada)
FIGURA 7. Producción de NO por parte de los macrófagos del peritoneo de ratones C57BL/6 tras el reto con Leishmania infantum (SS. Solución salina; pCMV4; PFR1 . pCMV4 PFR1 ; 70c. pCMV4 PFR1 -Hsp70 completa; 70t. pCMV4 PFR1 -Hsp70 truncada).
FIGURA 8. Carga parasitaria en los diferentes órganos tras la infección con Leishmania infantum de los ratones C57BL/6 inmunizados con los distintas moléculas a estudio y ratones control (SS. Solución salina; pCMV4; PFR1 . pCMV4 PFR1 ; 70c. pCMV4 PFR1 -Hsp70 completa; 70t. pCMV4 PFR1 -Hsp70 truncada). FIGURA 9. Porcentaje de unión a células T2 de los diferentes péptidos de la proteína PFR1 de L. infantum correspondientes a los epítopes inmunodominates identificados. Valores referidos al péptido control (HB-ENV334.342).
FIGURA 10. Determinación del número de células expresando Granzima B en ratones control (S. salina) y ratones inmunizados con los plásmidos pCMV4-PFR1 y pCMV4 PFR1-Hsp70), medida mediante ensayo de ELISPOT, Las cifras mostradas se obtienen restando del numero de células determinado para cada pocilio problema y control salino (estimulados con el péptido en cuestión), el valor obtenido en el control negativo (fondo). Se considera positivo toda aquella cifra superior al doble del control negativo más dos desviaciones standards y cuyo resultado tenga un valor mínimo de 150 células por millón. En los pocilios negativos no se representa el valor correspondiente. Se muestra un valor representativo de al menos tres diferentes ensayos. FIGURA 11. Determinación del número de células expresando Granzima B medida mediante ensayo de ELISPOT en esplenocitos de ratones infectados y controles no infectados. Las cifras mostradas se obtienen restando del número de células determinado para cada pocilio problema (ratón infectado) y control no infectado, el valor obtenido en el control negativo (esplenocitos sin presencia de antígeno). Se considera positivo toda aquella cifra superior al doble del control negativo más dos desviaciones standards y cuyo resultado tenga un valor mínimo de 250 células por millón. En los pocilios negativos no se representa el valor correspondiente. Se muestra un valor representativo de al menos tres diferentes ensayos. FIGURA 12. Determinación del número de células expresando Granzima B medida mediante ensayo de ELISPOT en células no parenquimales del hígado de ratones infectados y controles no infectados. Las cifras mostradas se obtienen restando del número de células determinado para cada pocilio problema (ratón infectado) y control no infectado, el valor obtenido en el control negativo (esplenocitos sin presencia de antígeno). Se considera positivo toda aquella cifra superior al doble del control negativo más dos desviaciones standards y cuyo resultado tenga un valor mínimo de 750 células por millón. En los pocilios negativos no se representa el valor correspondiente. Se muestra un valor representativo de al menos tres diferentes ensayos.
FIGURA 13 Tablas 1 y 2. Predicciones teóricas de unión al HLA-A*0201 de potenciales epítopes T CD8+. En negrita y subrayados se señalan los aminoácidos implicados en la unión a la molécula HLA-A*0201 . Entre paréntesis se indica la denominación de los péptidos que se sintetizaron.
FIGURA 14 Respuesta humoral frente a la proteína 436aaPFR1 y a diferentes tiempos post-inmunización (14 y 40 días) de los ratones C57BL/6 inmunizados con los distintos plásmidos a ensayo (pCMV4-436aaPFR1 ; pCMV4-436aaPFR1 - Hsp70) y control negativo (Solución salina). Se representan los valores obtenidos de IgG (panel superior A) y de los isotipos lgG1 e lgG2a (panel inferior B).
FIGURA 15 índice de estimulación frente a la proteína PFR1 en ensayos de linfoproliferación con esplenocitos de ratones C57BL/6 inmunizados con los plásmidos pCMV4-436aaPFR1 , pCMV4-436aaPFR1 -HSP70 y Solución salina (SS).
FIGURA 16 Determinación del número de células expresando Granzima B en ratones control (S. salina) y ratones inmunizados con los plasmidos pCMV4- 436aaPFR1 y pCMV4-436aaPFR1-Hsp70), medida mediante ensayo de ELISPOT, Las cifras mostradas se obtienen restando del numero de células determinado para cada pocilio problema y control salino (estimulados con el péptido en cuestión), el valor obtenido en el control negativo (fondo). Se considera positivo toda aquella cifra superior al doble del control negativo más dos desviaciones standards y cuyo resultado tenga un valor mínimo de 150 células por millón. En los pocilios negativos no se representa el valor correspondiente. Se muestra un valor representativo de al menos tres diferentes ensayos.
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EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ¡lustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ¡lustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma. EJEMPLO 1
1. 1 La proteína PFR1 induce la expresión de óxido nítrico.
La proteína PFR1 de Leishmania infantum se engloba dentro de la familia de las proteínas paraflagelares característica de kinetoplástidos. En la figura 1 , mostramos la proteína recombinante PFR1 de L. infantum expresada en un sistema de expresión procariota y purificada mediante cromatografía de afinidad. Para esta proteína hemos demostrado que, per se, tiene la capacidad de activar la producción de óxido nítrico (NO), uno de los principales mecanismos que tienen los macrofagos para eliminar los patógenos que han fagocitado en macrofagos alveolares de rata naive, es decir, sin ningún tipo de tratamiento o infección previa. Esta activación de la producción de óxido nítrico confiere a la mencionada proteína una característica inmunológica relevante pues el NO favorece el aclaramiento de los amastigotes de Leishmania que se multiplican en los macrófagos del hospedador. En la figura 2, se recogen los valores de producción de NO por estos macrófagos alveolares al estimularlos con LPS (control) y la proteína PFR1 . Interesantemente, la activación observada para LPS, y no aquella detectada para la proteína PFR1 , queda inhibida por la presencia de polimixina B (inhibidor de la actividad inducida por LPS), lo cual descarta cualquier contaminación con LPS de la proteína recombinante PFR1 . Por otra parte, la adición de L-nitromonometilarginina (LNMMA), inhibidor de la enzima óxido nítrico sintasa sí inhibe la activación de NO inducida por la proteína PFR1 , indicando el mecanismo de acción de esta proteína. Similares resultados son obtenidos por la proteína de fusión PFR1 -HSP70.
1.2 Expresión de la proteína PFR1 en células eucariotas. La determinación de la correcta expresión de las proteínas a estudio en células eucariotas se determina mediante el análisis de células COS-7 transfectadas con los genes codificantes para la proteína PFR1 , y proteínas quiméricas de fusión PFR1 -HSP70 y PFR1 -H70T clonados en el plásmido pCMV4. La visualización de las distintas proteínas se realiza mediante ensayos de Western blots sobre extractos de las células transfectadas con los respectivos plásmidos anteriormente mencionados y anticuerpos policlonales generados frente a la proteína PFR1 . Así, en la figura 3 se observa, respectivamente, la presencia de bandas de reconocimiento con tamaños de 70 kDa (correspondiente a la proteína PFR1 , en el carril de las células con el pCMV4 PFR1 ), de 140 kDa en el carril de las células COS-7 transfectadas con el plásmido pCMV4 PFR1 -Hsp70 y de 96 kDa en el carril de las células con el plásmido pCMV4 PFR1 -Hsp70T; no detectándose reconocimiento en el carril de las células portadoras del pCMV4 vacío. 1.3 Respuesta humoral antígeno-específica inducida por las moléculas a ensayo.
A modo de ejemplo mostramos los resultados obtenidos tras la inmunización por vía intramuscular de grupos de 12 ratones de la cepa C57BL/6, con 100 g de los diferentes plásmidos a ensayo, así como con los controles negativos (plásmido vacío y solución salina). Cada ratón fue inmunizado 4 veces con un tiempo entre cada inmunización de dos semanas. Seis semanas tras la cuarta inmunización, seis ratones de cada grupo fueron retados con 105 promastigotes infectivos de la cepa JPCM5 (MCAN/ES/98/LLM-724) de L. infantum por vía intravenosa.
Para analizar la respuesta humoral generada en los diferentes grupos de ratones, se realizaron sangrías dos semanas después de cada inmunización y se midieron los niveles de anticuerpos en suero. Los resultados obtenidos indican que la presencia de anticuerpos IgG anti-PFR1 aparece 15 días post-segunda inmunización en el grupo inmunizado con el gen PFR1 aislado y dos semanas tras la tercera inmunización en aquellos que portan los genes fusionados PFR1 - HSP70 ó PFR1 -HSP70T. En la figura 4 mostramos los resultados obtenidos para cada molécula a ensayo 14 y 40 días post-cuarta inmunización. Los niveles de IgG determinados en sueros procedentes de los ratones inmunizados con el gen PFR1 fusionado al gen HSP70 fueron superiores a aquellos detectados en los ratones inmunizados con el gen PFR1 aislado, observándose un máximo de anticuerpos a las dos semanas post-cuarta inmunización. En todos los casos el nivel de anticuerpos anti-PFR1 levemente desciende a las seis semanas postcuarta inmunización. El análisis de isotipos refleja que los anticuerpos generados muestran una clara polarización de la respuesta hacia el isotipo lgG2a (respuesta inmunológica de tipo Th1 ). Resultados similares a los referidos para la molécula pPFR1 -HSP70 son obtenidos con la molécula pPFR1 -H70T.
Los resultados obtenidos en los ensayos de respuesta humoral frente a la proteína PFR1 y antígenos totales de Leishmania (SLA) existente en los ratones inmunizados con las referidas moléculas a ensayo y retados con L. infantum quedan mostrados en la figura 5. El análisis de dichos resultados indica que la infección con Leishmania no induce variación significativa en los niveles de IgG frente a PFR1 y se mantiene la tendencia hacia el isotipo lgG2a observado previo a la infección.
1.4 Respuesta celular antigeno-especifica inducida por las moléculas a ensayo. Ensayos de linfoproliferación se realizaron tres semanas después de la cuarta inoculación. Los bazos fueron extraídos en esterilidad y los esplenocitos obtenidos se cultivaron in vitro, con concentraciones crecientes de la proteína rPFR1 (0.4, 2 y 10 pg/ml). Además, en este ensayo se incluyó como control positivo un mitógeno (ConA) y, como control negativo, los esplenocitos sin estimular. De los resultados obtenidos, mostrados en la figura 6, se puede afirmar que existe un índice de proliferación celular significativo frente a la proteína recombinante PFR1 y, además, esta estimulación es dosis dependiente en esplenocitos de los ratones inmunizados con las moléculas recombinantes a estudio. Interesantemente, dicho índice fue significativamente mayor en los grupos que recibieron el gen PFR1 fusionado a la HSP70 y HSP70T. Los índices de proliferación (IE) para el caso de los esplenocitos procedentes de los ratones inoculados con estas moléculas de fusión, son aproximadamente de 25, mientras que los esplenocitos obtenidos de los ratones inmunizados con el plásmido conteniendo el gen PFR1 aislado se sitúan en torno a 20. En ambos casos, por encima de los controles; ratones inoculados con el plásmido vacío, IE=13 y con solución salina, IE=4. Estos índices de proliferación de las células esplénicas de los ratones inmunizados con las moléculas a ensayo se mantienen con similares valores ocho semanas post-cuarta inmunización. Además, la capacidad de estimulación se mantiene tras el reto, observando un máximo índice de proliferación (respuesta celular) en los ratones inmunizados con el gen PFR1 aislado y tras estimular con 2 pg/ml de la proteína recombinante PFR1 .
1.5 Expresión de óxido nítrico en ratones inmunizados e infectados con L. infantum.
Como queda reflejado en la Figura 7, se observa una significativa mayor capacidad de producir óxido nítrico (NO) en los macrófagos perifonéales de los ratones inmunizados con las moléculas problema, especialmente con las construcciones fusionadas (PFR1 -HSP70 o PFR1 -HSP70T) relativa a los ratones control, tanto estimulados como sin estimular. Además, esta capacidad de los macrófagos perifonéales de los mencionados grupos de ratones a estudio de producir oxido nítrico (NO) aumenta significativamente tras la estimulación con la proteína recombinante PFR1 . Por otra parte, mostramos que dicha producción fue significativamente mayor en los ratones infectados versus aquella detectada en los no retados.
1.6 Determinación de la capacidad de inducir protección frente a la infección por L. infantum de las moléculas a ensayo.
La carga parasitaria fue analizada mediante dilución límite (Buffet et. al., 1995, Antimicrob. Agents Chemother. 39(9): 2167-2168), en el hígado, bazo y médula ósea (tejidos diana de dicho parásito), los días 14 y 28 post-infección, mostrando en la figura 8 un resumen de los resultados obtenidos. Así, a los 14 días postinfección, todos los grupos de ratones presentaban parásitos en el hígado, sin embargo, en los grupos control (ss y pCMV4) la carga de parásitos es significativamente mayor que la detectada en los grupos inmunizados con las diferentes moléculas a ensayo, mostrando valores superiores en al menos un orden de magnitud. Además, a diferencia de lo que ocurre en los grupos control, los ratones vacunados con las moléculas a ensayo no muestran un incremento de la carga parasitaria hepática a los 28 días post-infección. De hecho, los ratones inmunizados con el gen PFR1 fusionado al gen HSP70 completo (pPFR1 -HSP70), lograron aclarar el mencionado órgano de parásitos. El análisis de la tasa de parásitos en bazo, muestra un comportamiento similar al antenormente descrito. Así, a los 14 días post-infección observamos una significativa mayor tasa de parásitos (al menos un orden de magnitud) en el tejido esplénico de los ratones controles (ss y pCMV4) relativo al mostrado por los ratones inmunizados con las moléculas a ensayo. De hecho, los ratones inmunizados con el gen PFR1 fusionado al gen HSP70T (pPFR1 -H70T) no muestran parásitos en bazo a las dos semanas post-infección. A nivel de médula ósea, únicamente los grupos control (ss y pCMV4) presentan parásitos, detectándose éstos a los 28 días postinfección. Interesantemente, ninguno de los ratones inmunizados con las moléculas problema presenta parásitos en dicho tejido. En resumen, todos los grupos inmunizados con el gen PFR1 aislado o fusionado a la molécula carrier Hsp70 ó H70T, presentan a lo largo del periodo de infección y tejidos analizados, una carga parasitaria significativamente menor que la hallada en los grupos control (disminución entre dos a cuatro órdenes de magnitud), indicando que estas moléculas inducían un elevado nivel de protección frente a la infección por L. infantum, inoculado por vía intravenosa.
El análisis del patrón de expresión de citocinas de esplenocitos de los ratones inmunizados y ratones control (medidas por citometría en el sobrenadante de cultivo celular empleando el kit Mouse Th1/Th2 Cytokine CBA -BD Biosciences) muestra la existencia de niveles de TNF-α e IFN-γ mayores y con significancia estadística en los ratones inmunizados con las construcciones quiméricas PFR1 - HSP70 y PFR1 -H70T, estimulados o sin estimular con rPFR1 y/o SLA, versus los grupos control (P<0.01 ). Sin embargo, no se observa variación estadísticamente significativa entre los grupos a evaluar en los niveles de IL-2 ó IL-4. Así mismo, el análisis tras el reto con Leishmania del nivel de activación de los macrófagos esplénicos de ratones de los distintos grupos problema y control es medido por el patrón de expresión de las moléculas de superficie CD80, CD86 y CD40. Los resultados obtenidos mostraban que a los 21 días post-infección la expresión de CD86 y CD40 era significativamente mayor en el grupo de ratones inmunizados con las construcciones quiméricas PFR1 -HSP70 y PFR1 -H70T relativo a los grupos control (P<0.01 ). 1.7 Identificación de epítopes T CD8+ en la proteína PFR1 de L. infantum.
La identificación de epítopes contenidos en la secuencia de la proteína PFR1 de L. infantum capaces de ser reconocidos por linfocitos T CD8+ y, consecuentemente de activar en el hospedador una respuesta antígeno- específica citotóxica, se llevó a cabo mediante la búsqueda de epítopes con capacidad de unión al HLA de clase I. Para ello, se seleccionaron in silico diferentes péptidos susceptibles de unirse a HLA-A*0201 (el más frecuente, expresado por la mitad de la población humana), utilizando tres programas: SYFPEITHI, RANKPEP y BIMAS. Para ello, se introdujo la secuencia deducida de la proteína PFR1 de Leishmania infantum {gene number. AY702344) en cada uno de los programas y se seleccionó el algoritmo de unión a HLA-A*0201 . Los dos primeros programas dan una puntuación a cada uno de los péptidos en base a su afinidad teórica a esta molécula HLA. El programa BIMAS puntúa la estabilidad de unión, indicando el tiempo de unión teórico de cada uno de los péptidos a la molécula HLA. Combinando los resultados obtenidos, se seleccionaron ocho teóricos epítopes de alta afinidad de unión a la molécula HLA de clase I y se sintetizaron los péptidos correspondientes: SEQ ID No: 1 - 1864 (FMDIIGVKKV), SEQ ID No: 2 - 1865 (QLDATQLAQV), SEQ ID No: 3 - 1866 (KLLELTVYNC), SEQ ID No: 4 - 1868 (KMMEDIMNA), SEQ ID No: 5 - 1869 (AMHDGETQV), SEQ ID No: 6 - 1871 (QLQERLIEL), SEQ ID No: 7 - 1872 (MLYLTLGSL) y SEQ ID No: 8 - 1873 (KMVEYKSHL). En las figura 13, tablas 1 y 2, se recogen las puntuaciones obtenidas por los diferentes péptidos en los citados programas informáticos.
Para determinar la capacidad de unión de los mencionados péptidos a la molécula HLA-A*0201 llevamos a cabo ensayos de unión a células T2, deficientes en la expresión de moléculas transportadoras de antígenos (TAP). Los resultados obtenidos, mostrados en la figura 9 indican que todos los péptidos a ensayo presentan buena o muy buena afinidad de unión a la citada molécula HLA- A*0201 , siendo la afinidad en algunos casos superior al péptido HB-ENV334.242 usado como control, para el que se refiere un porcentaje de unión del 100%.
El análisis de la capacidad de presentación efectiva de estos epítopes en el contexto de una inmunización experimental con las moléculas a ensayo, se llevó a cabo en ratones transgénicos C57BL/6-A2/Kb (expresan el producto del gen quimérico HLA-A2.1 /Kb, donde los dominios alfal y alfa2 son ¡guales a los de la molécula HLA-A*0201 humana y los dominios alfa3, transmembrana y citoplasmático correspondientes a la molécula murina H-2Kb) inmunizados por vía intramuscular con las moléculas pPFR1 y pPFR1 -HSP70. Como control negativo, se utilizaron ratones a los que se inyectó solución salina (Sigma). Seis semanas tras la cuarta inmunización los esplenocitos de los ratones pertenecientes a los distintos grupos son estimulados con los diferentes péptidos en el contexto de un ensayo ELISPOT usando como sonda un anticuerpo anti-granzima B. Los resultados obtenidos (figura 10) muestran que cinco de los péptidos ensayados dieron una respuesta positiva de granzima B (activación de CTLs antígeno específicos) en los ratones inmunizados con la molécula quimérica pPFR1 -HSP70 y uno en aquellos inmunizados con la molécula conteniendo el gen PFR1 aislado. Estos resultados demuestran que las mencionadas moléculas a ensayo son eficientemente procesadas y presentadas en el contexto del MHC-clase I. Además indican que en concreto esos epítopes para los que se obtienen valores positivos son reconocidos por los linfocitos T citotóxicos (CTLs) de los ratones inmunizados.
El análisis de la capacidad de generar respuesta citotóxica de estos mismos péptidos en el curso de una infección experimental con L. infantum se evaluó en ratones transgénicos C57BL/6-A2/Kb infectados por vía i.v. con 106 promastigotes infectivos de L. infantum (cepa JPCM5). A los 170 días tras la infección, los ratones fueron sacrificados y sus esplenocitos o sus células no parenquimales del hígado se expusieron a los diferentes péptidos en el contexto de un ensayo ELISPOT con un anticuerpo detector de Granzima B. Los resultados obtenidos muestran (figuras 11 y 12) que cuatro de los péptidos ensayados dieron una respuesta positiva de Granzima B en esplenocitos de bazo y tres de ellos también en células no parenquimales de hígado. Por lo tanto, estos péptidos son presentados a los CTLs en el curso de la infección experimental por el parásito. Interesantemente, sólo uno de estos cuatro péptidos también dio positivo en el ensayo con los ratones inmunizados, lo que evidencia que la presentación antigénica difiere entre la inmunización con los plásmidos y el curso de la infección experimental.
Conclusión EJEMPLO 1 : Los resultados obtenidos muestran que los ratones inmunizados con las moléculas problema a ensayo y posteriormente infectados, no muestran tener parásitos en medula ósea, mientras que aquellos ratones control inoculados con el plásmido vacío pCMV4 o con solución salina presentan una alta tasa de parásitos en dicho tejido a los 28 días post-infección. Además, la tasa de parásitos en bazo e hígado de los ratones inmunizados con las mencionadas moléculas problema son entre dos a cuatro órdenes de magnitud inferiores a las detectadas en los ratones control inoculados con el plásmido vacío (pCMV4) o solución salina. Los ratones inmunizados con la molécula pPFR1 - H70T e infectados con Leishmania, no muestran tener parásitos en bazo a los 14 días post-infección.
EJEMPLO 2 2. 1 Respuesta humoral antígeno-específica inducida por las moléculas a ensayo. A modo de ejemplo mostramos los resultados obtenidos tras la inmunización por vía intramuscular de grupos de 12 ratones de la cepa C57BL/6, con 100 g de los diferentes plásmidos a ensayo, así como con los controles negativos (solución salina). En este caso, los plásmidos utilizados contenían la secuencia correspondiente al fragmento de la proteína PFR1 de Leishmania infantum de 436 aminoácidos de longitud comprendido entre los aminoácidos 160 y 595 de la misma. Cada ratón fue inmunizado 4 veces con un tiempo entre cada inmunización de dos semanas.
Para analizar la respuesta humoral generada en los diferentes grupos de ratones, se realizaron sangrías dos semanas después de cada inmunización y se midieron los niveles de anticuerpos en suero. Los resultados obtenidos indican que la presencia de anticuerpos IgG anti-PFR1 aparece 15 días post-segunda inmunización en el grupo inmunizado con el gen 436aaPFR1 aislado y dos semanas tras la tercera inmunización en aquellos que portan los genes fusionados 436aaPFR1 -HSP70. En la figura 14 (A) mostramos los resultados obtenidos para cada molécula a ensayo 14 y 40 días post-cuarta inmunización. Los niveles de IgG determinados en sueros procedentes de los ratones inmunizados con el gen 436aaPFR1 fusionado al gen HSP70 fueron superiores a aquellos detectados en los ratones inmunizados con el gen 436aaPFR1 aislado, observándose un máximo de anticuerpos a las dos semanas post-cuarta inmunización. En todos los casos, el nivel de anticuerpos anti-PFR1 levemente desciende a las seis semanas post-cuarta inmunización. El análisis de isotipos (B) muestra en los anticuerpos generados una clara polarización de la respuesta hacia el isotipo lgG2a (respuesta inmunológica de tipo Th1 ). 1.4 Respuesta celular antígeno-específica inducida por las moléculas a ensayo.
Ensayos de linfoproliferación se realizaron tres semanas después de la cuarta inoculación. Los bazos fueron extraídos en esterilidad y los esplenocitos obtenidos se cultivaron in vitro, con concentraciones crecientes de la proteína rPFR1 (0.4, 2 y 10 Mg/ml). Además, en este ensayo se incluyó como control positivo un mitógeno (ConA) y, como control negativo, los esplenocitos sin estimular. De los resultados obtenidos, mostrados en la figura 15, se puede afirmar que existe un índice de proliferación celular significativo frente a la proteína recombinante PFR1 y, además, esta estimulación es dosis dependiente en esplenocitos de los ratones inmunizados con las moléculas recombinantes a estudio. Interesantemente, dicho índice fue significativamente mayor en los grupos que recibieron el gen 436aaPFR1 fusionado a la HSP70. Los índices de proliferación (IE) para el caso de los esplenocitos procedentes de los ratones inoculados con esta molécula de fusión, son aproximadamente de 22, mientras que los esplenocitos obtenidos de los ratones inmunizados con el plásmido conteniendo el gen 436aaPFR1 aislado se sitúan en torno a 18. En ambos casos, por encima de los controles; con solución salina, IE=4. Estos índices de proliferación de las células esplénicas de los ratones inmunizados con las moléculas a ensayo se mantienen con similares valores ocho semanas postcuarta inmunización.
El análisis de la capacidad de presentación efectiva de estos epítopes en el contexto de una inmunización experimental con las moléculas a ensayo, se llevó a cabo en ratones transgénicos C57BL/6-A2/Kb (expresan el producto del gen quimérico HLA-A2.1/Kb, donde los dominios alfal y alfa2 son ¡guales a los de la molécula HLA-A*0201 humana y los dominios alfa3, transmembrana y citoplasmático correspondientes a la molécula murina H-2Kb) inmunizados por vía intramuscular con las moléculas 436aaPFR1 y 436aaPFR1 -HSP70. Como control negativo, se utilizaron ratones a los que se inyectó solución salina (Sigma). Seis semanas tras la cuarta inmunización los esplenocitos de los ratones pertenecientes a los distintos grupos son estimulados con los diferentes péptidos en el contexto de un ensayo ELISPOT usando como sonda un anticuerpo anti- granzima B. Los resultados obtenidos (figura 16) muestran que cinco de los péptidos ensayados dieron una respuesta positiva de granzima B (activación de CTLs antígeno específicos) en los ratones inmunizados con la molécula quimérica 436aaPFR1 -HSP70 y uno en aquellos inmunizados con la molécula conteniendo el gen 436aaPFR1 aislado. Estos resultados demuestran que las mencionadas moléculas a ensayo son eficientemente procesadas y presentadas en el contexto del MHC-clase I. Además, indican que en concreto esos epítopes para los que se obtienen valores positivos son reconocidos por los linfocitos T citotóxicos (CTLs) de los ratones inmunizados.
Conclusión EJEMPLO 2: Los resultados obtenidos muestran que el fragmento de la proteína PFR1 de 436 aminoácidos se comporta de forma muy similar a la proteína completa, consiguiendo unos datos de respuesta inmunológica (humoral, celular y citotóxica) similares. Por tanto, dado que estos parámetros son los implicados en la protección frente al parásito, podemos concluir que este fragmento se comporta en todos los términos a estudio como la proteína completa.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Una secuencia nucleotídica caracterizada por codificar para la proteína PFR1 de Leishmania infantum o un fragmento de la misma que comprende al menos un epítope inmunodominante seleccionado entre el siguiente grupo: SEQ ID No: 1 , SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7 y SEQ ID No: 8, donde dicho epítope inmunodominante es capaz de inducir una respuesta inmunológica T citotóxica específica de antígeno en un animal frente a los kinetoplástidos que causan la enfermedad de la leishmaniosis.
2. La secuencia nucleotídica según la reivindicación 1 caracterizada porque codifica para los aminoácidos 1 -595 de la proteína PFR1 de Leishmania infantum determinada por la SEQ ID No: 12.
3. La secuencia nucleotídica según la reivindicación 1 caracterizada porque codifica para los aminoácidos 160-595 de la proteína PFR1 de Leishmania infantum determinada por la SEQ ID No: 9.
4. La secuencia nucleotídica según la reivindicación 1 caracterizada porque codifica los aminoácidos 160-548 de la proteína PFR1 de Leishmania infantum determinada por la SEQ ID No: 10.
5. La secuencia nucleotídica según la reivindicación 1 caracterizada porque codifica los aminoácidos 160-385 de la proteína PFR1 de Leishmania infantum determinada por la SEQ ID No: 1 1 .
6. Una molécula quimérica caracterizada por comprender:
a) una secuencia nucleotídica definida en las reivindicaciones 1 -5, fusionada a b) una secuencia nucleotídica que codifica para la proteína Hsp70 de Trypanosoma cruzi, o fragmentos de la misma;
donde dicha molécula quimérica es capaz de inducir una respuesta inmunológica T citotóxica específica de antígeno en un animal frente a los kinetoplástidos que causan la enfermedad de la leishmaniosis.
7. La molécula quimérica según la reivindicación 6, caracterizada porque porta la secuencia nucleotídica que codifica para la proteína Hsp70 de Trypanosoma cruzi determinada por la SEQ ID No: 13 o fragmentos de la misma.
5 8. Un vector recombinante caracterizado por comprender:
a) una secuencia nucleotídica definida en las reivindicaciones 1 -5, o
b) una molécula quimérica definida en las reivindicaciones 6-7.
9. Un plásmido recombinante caracterizado por comprender el vector definido 10 en la reivindicación 8.
10. Una composición farmacéutica caracterizada por comprender:
a) una secuencia nucleotídica definida en las reivindicaciones 1 -5, o
b) una molécula quimérica definida en las reivindicaciones 6-7.
15
1 1 . Uso de una secuencia nucleotídica definida en las reivindicaciones 1 -5, para el tratamiento y/o prevención de una infección de los kinetoplástidos que causan la enfermedad de la leishmaniosis en un animal.
20 12. Uso de una secuencia nucleotídica definida en las reivindicaciones 1 -5, caracterizada porque el animal es un humano o un perro.
13. Uso de una secuencia nucleotídica definida en las reivindicaciones 1 -5, para la fabricación de vacunas terapéuticas o preventivas.
25
14. Uso de una secuencia nucleotídica según la reivindicación 13, caracterizada porque comprende las siguientes etapas:
a) identificar al menos una secuencia nucleotídica definida en las reivindicaciones 1 -5,
30 b) amplificar al menos una secuencia nucleotídica identificada en a) mediante PCR empleando DNA genómico del kinetoplástido que causa la enfermedad de la leishmaniosis y oligonucleótidos que contienen dianas de enzimas de restricción que permitirán el clonaje dirigido del amplicón tras la digestión del mismo con dichas enzimas en vectores de expresión procariota y eucariota,
c) clonar en fase al menos una secuencia nucleotídica amplificada en b) para la producción de la proteína codificada por dicha secuencia
5 nucleotídica,
d) purificar al menos una de las proteínas obtenidas en c) mediante cromatografía de afinidad, y
e) producir, al menos, un vector de DNA libre de endotoxinas para la inoculación segura.
10
15. Uso de una secuencia nucleotídica definida en las reivindicaciones 1 -5, como marcadores en métodos de control del grado de infección de los kinetoplástidos que causan la enfermedad de la leishmaniosis en un animal.
15 16. Uso de una secuencia nucleotídica, según la reivindicación 15, caracterizada porque el animal es un humano o un perro.
17. Uso de una secuencia nucleotídica definida en las reivindicaciones 1 -5, para generar memoria inmunológica protectora frente a la infección de los
20 kinetoplástidos que causan la enfermedad de la leishmaniosis en un animal no infectado.
18. Uso de una secuencia nucleotídica, según la reivindicación 17, caracterizada porque el animal es un humano o un perro.
25
19. Uso de una secuencia nucleotídica definida en las reivindicaciones 1 -5, para aclarar parcial o totalmente los kinetoplástidos que causan la enfermedad de la leishmaniosis de los tejidos en un animal infectado.
30 20. Uso de una secuencia nucleotídica, según la reivindicación 19,
caracterizada porque el animal es un humano o un perro.
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