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WO2013009143A9 - 당뇨망막병증 진단용 마커 및 이의 용도 - Google Patents

당뇨망막병증 진단용 마커 및 이의 용도 Download PDF

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WO2013009143A9
WO2013009143A9 PCT/KR2012/005622 KR2012005622W WO2013009143A9 WO 2013009143 A9 WO2013009143 A9 WO 2013009143A9 KR 2012005622 W KR2012005622 W KR 2012005622W WO 2013009143 A9 WO2013009143 A9 WO 2013009143A9
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
diabetic retinopathy
protein
expression level
gene
kit
Prior art date
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Ceased
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PCT/KR2012/005622
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English (en)
French (fr)
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WO2013009143A2 (ko
WO2013009143A3 (ko
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김영수
유형곤
김경곤
김상진
유지영
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SNU R&DB Foundation
Original Assignee
SNU R&DB Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Publication of WO2013009143A9 publication Critical patent/WO2013009143A9/ko
Publication of WO2013009143A3 publication Critical patent/WO2013009143A3/ko
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/16—Ophthalmology
    • G01N2800/164—Retinal disorders, e.g. retinopathy

Definitions

  • the present invention is a composition, kit for diagnosing diabetic retinopathy, comprising a preparation for measuring the level of gene or protein that can be used for diagnosis and diagnosis of diabetic retinopathy patients, method for providing information for diagnosing diabetic retinopathy using the same and diabetes It relates to a method for diagnosing retinopathy.
  • Diabetes is a serious disease with increased blood sugar due to abnormalities in the production or use of insulin and accompanying various acute and chronic complications.
  • 9.6% (over 20 million people) of the population 20 years of age or older have diabetes, and an estimated 50 million pre-diabetes patients at high risk are estimated (2005 national diabetes facts in the United States. sheet).
  • $ 132 billion was spent on direct and indirect medical expenses related to diabetes.
  • diabetes Since diabetes has a long morbidity, it is accompanied by various complications of the whole system. Representative examples include cardiovascular disease, diabetes mellitus, diabetes neuropathy, and diabetic retinopathy. Among them, diabetic retinopathy (DR) occurs in over 60% of diabetic patients within 10 years of diabetic diagnosis and over 90% of diabetic patients in 20 years.
  • DR diabetic retinopathy
  • Diabetic retinopathy is a microangiopathy of diabetes characterized by changes in permeability of retinal vessels, vascular obstruction, ischemia, neovascularization, and thus fibrovascular proliferation.
  • Diabetic retinopathy is the largest cause of acquired blindness in adults, and in the United States, 12,000 to 24,000 people die from diabetes every year. In the United States, the prevalence of diabetic retinopathy is estimated to be about 40% of diabetic patients and 8% is reported to be a serious condition that can lead to blindness.
  • Diabetic retinopathy is divided into early non-proliferative diabetic retinopathy (NPDR) and late proliferative diabetic retinopathy (PDR) according to the degree of progression (FIG. 1).
  • NPDR non-proliferative diabetic retinopathy
  • PDR late proliferative diabetic retinopathy
  • Non-proliferative diabetic retinopathy is characterized by retinal bleeding, microaneurysm, exudate, retinal edema, etc. due to obstruction of the retinal capillaries and changes in permeability. have.
  • macular edema DME, diabetic macular edema
  • DME diabetic macular edema
  • Proliferative diabetic retinopathy is a stage in which neovascularization proliferates due to an ischemia condition following extensive vessel occlusion of the retina. This proliferation progresses from the retina to the vitreous and fibrovascular proliferation causes complications such as vitreous hemorrhage, tractional retinal detachment, and neovascular glaucoma, in which the retina falls from its original attachment site. This is the stage of blindness.
  • diabetic retinopathy has been mainly focused on biochemical and molecular biological studies of individual proteins in the vitreous.
  • proteomics study of diabetic retinopathy is a profiling (discovery) step of the vitreous protein bodies that identify proteins in patient vitreous by 2-DE and mass spcectrometry. Very little verification and validation studies have been conducted to determine whether these vitreous proteins are expressed in the blood or can be used as clinical biomarkers.
  • the present inventors have made diligent efforts to develop markers useful for early diagnosis of diabetic retinopathy. As a result, we have discovered a diabetic retinopathy-specific protein and using the expression pattern of the specific protein that increases or decreases in diabetic retinopathy. It was confirmed that can be easily diagnosed to complete the present invention.
  • One object of the present invention is a new diabetic retinopathy marker for early diagnosis of diabetic retinopathy, APOC1 (Apolipoprotein C1), APOB100 (Apolipoprotein B100), APOC3 (Apolipoprotein C3), VTN (Vitronectin), PLG (Plasminogen)
  • APOC1 Apolipoprotein C1
  • APOB100 Apolipoprotein B100
  • APOC3 Polipoprotein C3
  • VTN Vitronectin
  • PLG Plasminogen
  • HRP Histidine-rich protein
  • AFM Afamin
  • CP ceruloplasmin
  • CFB Complement factor B
  • Still another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing diabetic retinopathy comprising an agent for measuring the level of mRNA or protein thereof of at least one gene selected from the above markers.
  • Another object of the present invention to provide a kit for diagnosing diabetic retinopathy comprising the composition.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for providing information necessary for diagnosing diabetic retinopathy by using the composition or kit for diagnosing diabetic retinopathy.
  • Another object of the present invention to provide a method for diagnosing diabetic retinopathy using the composition or kit for diagnosing diabetic retinopathy.
  • the present invention provides a marker for diagnosing diabetic retinopathy, and by measuring and comparing the expression level of a gene or a protein whose expression is increased or decreased in a diabetic retinopathy, the early diagnosis and the degree of disease of the diabetic retinopathy is significant. Can be predicted or identified.
  • the marker of the present invention enables a non-invasive diagnosis can be a simple and effective early diagnosis of diabetic retinopathy by blood, urine tests and the like.
  • 1 is an eye photograph of a patient with non-proliferative diabetic retinopathy and proliferative diabetic retinopathy.
  • FIG. 2 is a flow chart schematically showing the implementation process of the first to sixth embodiments.
  • FIG. 3 is a graph showing an ROC curve and an interactive plot of APOC1 according to Example 6.
  • FIG. 4 is a graph showing an ROC curve and an interactive plot of APOB100 according to Example 6.
  • FIG. 4 is a graph showing an ROC curve and an interactive plot of APOB100 according to Example 6.
  • FIG. 5 is a graph illustrating an ROC curve and an interactive plot of APOC3 according to Example 6.
  • FIG. 6 is a graph showing an ROC curve and an interactive plot of the VTN according to the sixth embodiment.
  • FIG. 7 is a graph illustrating an ROC curve and an interactive plot of PLG according to Example 6.
  • FIG. 8 is a graph illustrating an ROC curve and an interactive plot of HRP according to Example 6.
  • FIG 9 is a graph showing an ROC curve and an interactive plot of the AFM according to the sixth embodiment.
  • FIG. 10 is a graph showing an ROC curve and an interactive plot of CP according to Example 6.
  • FIG. 10 is a graph showing an ROC curve and an interactive plot of CP according to Example 6.
  • FIG. 11 is a graph illustrating an ROC curve and an interactive plot of CFB according to Example 6.
  • FIG. 12 is a graph illustrating an ROC curve and an interactive plot of AGP according to Example 6.
  • FIG. 12 is a graph illustrating an ROC curve and an interactive plot of AGP according to Example 6.
  • FIG. 13 is a graph illustrating an ROC curve and an interactive plot of PEDF according to Example 6.
  • the present invention is APOC1 (Apolipoprotein C1), APOB100 (Apolipoprotein B100), APOC3 (Apolipoprotein C3), VTN (Vitronectin), PLG (Plasminogen), HRP (Histidine-rich protein),
  • APOC1 Apolipoprotein C1
  • APOB100 Apolipoprotein B100
  • APOC3 Apolipoprotein C3
  • VTN Vitronectin
  • PLG Plasminogen
  • HRP Histidine-rich protein
  • AFM Afamin
  • Ceruloplasmin CP
  • CFB Complement factor B
  • the term "diagnostic" means identifying the presence or characteristic of a pathological condition.
  • the diagnosis is to determine whether diabetic retinopathy develops. Preferably it is to determine whether the early stage of diabetic retinopathy non-proliferative diabetic retinopathy.
  • diagnosis marker refers to significant levels of gene expression or protein expression levels in individuals with non-proliferative diabetic retinopathy compared to normal controls (non-diabetic retinopathy) or proliferative diabetic retinopathy.
  • Organic biomolecules such as polypeptides or nucleic acids (eg, mRNA, etc.), lipids, glycolipids, glycoproteins, sugars (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, etc.) and the like, which show increasing or decreasing aspects.
  • Markers for diagnosing diabetic retinopathy for the purposes of the present invention are APOC1 (Apolipoprotein C1), APOB100 (Apolipoprotein B100), APOC3 (Apolipoprotein C3), VTN (Vitronectin), PLG (Plasminogen), HRP (Histidine-rich protein), AFM (Afamin) ), One or more selected from ceruloplasmin (CP) and complement factor B (CFB).
  • at least one selected from nine markers at least two, at least three, at least four, at least five, at least six, at least seven, at least eight or at least nine may be used in combination.
  • the marker for diagnosing diabetic retinopathy may further include at least one selected from the group consisting of alpha-1 acid glycoprotein (AGP) or pigment epithelium-derived factor (PEDF).
  • AGP alpha-1 acid glycoprotein
  • PEDF pigment epithelium-derived factor
  • the marker may be AGP, PEDF alone, or a combination of AGP and PEDF.
  • one or more selected from the markers APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP and CFB, and AGP or PEDF or AGP and PEDF may be used as a diagnostic marker for diabetic retinopathy.
  • Diabetic retinopathy is divided into early stage of non-proliferative diabetic retinopathy (NPDR) and late stage proliferative diabetic retinopathy (PDR).
  • NPDR non-proliferative diabetic retinopathy
  • PDR proliferative diabetic retinopathy
  • Non-proliferative diabetic retinopathy is characterized by not developing blood vessels, and proliferative diabetic retinopathy is different in its mechanism, such as the development of blood vessels. Since non-proliferative diabetic retinopathy does not necessarily progress to proliferative diabetic retinopathy, a marker known as a diagnostic marker for proliferative diabetic retinopathy cannot necessarily be used as a diagnostic marker for non-proliferative diabetic retinopathy.
  • APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP, CFB, AGP and PEDF can be used as diagnostic markers for diabetic retinopathy.
  • biomarkers that overexpress or underexpress diabetic retinopathy by analyzing plasma samples from MH (macular hole), PDR (proliferative diabetic retinopathy), and NPDR (non-proliferative diabetic retinopathy) individuals Excavated.
  • samples of PDR and MH individuals were analyzed to identify PDR-specific candidate markers, and based on these, 11 NPDR-specific markers (APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP, CFB, AGP, and PEDF). ) was finally unearthed.
  • the plasma samples of the normal control group (non-diabetic retinopathy) and NPDR (non-proliferative diabetic retinopathy) subjects were analyzed to identify the 11 types of NPDR (non-proliferative diabetic retinopathy) identified above. The validity of the enemy marker was established.
  • the present invention is APOC1 (Apolipoprotein C1), APOB100 (Apolipoprotein B100), APOC3 (Apolipoprotein C3), VTN (Vitronectin), PLG (Plasminogen), HRP (Histidine-rich protein), AFM (Afamin), CP (Ceruloplasmin) and CFB (Complement factor B) provides a composition for diagnosing diabetic retinopathy comprising an agent for measuring the mRNA or protein level of one or more genes selected from.
  • APOC1 Polipoprotein C1
  • APOB100 Polipoprotein B100
  • APOC3 Polipoprotein C3
  • APOC1 GeneBank Accession No. AAD02506, Uniprot: P02654
  • APOB100 GeneBank Accession No. AAB04636, Uniprot: P04114
  • APOC3 GeneBank Accession No. AAS68230, Uniprot: P02656
  • no association between APOC1, APOB100 and APOC3 with diabetic retinopathy is known at all.
  • VTN Vitronectin
  • PLG Plasminogen
  • HRP Histidine-rich protein
  • AFM (Afamin) is a protein involved in transport according to the gene ontology classification, and the genetic information can be found in GeneBank Accession No. AAI09021, Uniprot: P43652. However, the association of AFM with diabetic retinopathy is unknown at all.
  • CP ceruloplasmin
  • CFB Complement factor B
  • the APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP and CFB are all reduced in gene expression level or expression level of the protein in diabetic retinopathy compared to normal control (individual not diabetic retinopathy).
  • the diabetic retinopathy subject is preferably a non-proliferative diabetic retinopathy subject.
  • the composition may further comprise alpha-1 acid glycoprotein (AGP) and PEDF (AGP) to measure the mRNA or protein level of one or more genes selected from APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP and CFB.
  • AGP alpha-1 acid glycoprotein
  • PEDF PEDF
  • Pigment epithelium-derived factor may be a composition for diagnosing diabetic retinopathy comprising an agent for measuring the mRNA or protein level of one or more genes selected from.
  • Alpha-1 acid glycoprotein is an acute plasma alpha-globulin glycoprotein that is regulated by two polymorphic genes and, according to the gene ontology classification, is a protein involved in immune response and fibrin lysis. Is AGP (GeneBank Accession No. AAB33887, Uniprot: P02763). However, the association of AGP with diabetic retinopathy is unknown at all. AGP is characterized by an increase in the gene expression level or the expression level of the protein in the diabetic retinopathy subject compared to the normal control (individual non-diabetic retinopathy). The diabetic retinopathy subject is preferably a non-proliferative diabetic retinopathy subject.
  • PEDF Porture epithelium-derived factor
  • the genetic information is PEDF (GeneBank Accession No. AAK92491, Uniprot: P36955). However, no association between PEDF and diabetic retinopathy is known at all. PEDF is characterized by an increase in the gene expression level or expression level of the protein in diabetic retinopathy individuals compared to normal controls (individuals not diabetic retinopathy).
  • the diabetic retinopathy subject is preferably a non-proliferative diabetic retinopathy subject.
  • mRNA expression level measurement refers to measuring the amount of mRNA in the process of confirming the presence and expression of mRNA of the genes for diagnosing diabetic retinopathy in a biological sample in order to diagnose diabetic retinopathy.
  • Analytical methods for this purpose include reverse transcriptase (RT-PCR), competitive reverse transcriptase (RT) PCR, real-time reverse transcriptase (Real-time RT-PCR), RNase protection assay (RPA). assays, Northern blotting, DNA chips, etc., but are not limited thereto. Since nucleic acid information of genes according to the present invention is known to GeneBank et al., Those skilled in the art can design primer pairs or probes that specifically amplify specific regions of these genes based on the sequences.
  • protein expression level measurement refers to a process of confirming the presence and degree of expression of a protein expressed from a gene for diagnosing diabetic retinopathy in a biological sample to diagnose diabetic retinopathy. Protein expression level measurement is to determine the amount of protein using an antibody that specifically binds to the protein of the gene, preferably refers to measuring the protein expression level itself without using an antibody.
  • the protein expression level measurement or comparative analysis method is protein chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF) analysis, Surface Enhanced Laser Desorption / SELDI-TOF Ionization Time of Flight Mass Spectrometry, radioimmunoassay, radioimmunoassay, oukteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, complement fixation assay, two-dimensional electrophoresis analysis, liquid phase chromatography-mass spectrometry liquid chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS), liquid chromatography-Mass Spectrometry / Mass Spectrometry (LC-MS / MS), Western blotting, and enzyme linked immunosorbentassay (ELISA), but are not limited thereto.
  • MALDI-TOF Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization Time of Flight Mass Spectrometry
  • diabetic retinopathy refers to a diabetic complication in which peripheral circulatory disorder occurs due to diabetes, which causes disorders in the microcirculation of the retina, resulting in decreased vision.
  • the diabetic retinopathy according to the invention is non-proliferative diabetic retinopathy.
  • the agent for measuring mRNA levels is specific for one or more genes selected from APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP and CFB and additionally one or more genes selected from AGP and PEDF.
  • primer pair includes primer pairs of all combinations of forward and reverse primers that recognize a target gene sequence, but preferably, a primer pair that provides an assay with specificity and sensitivity. to be. High specificity can be imparted when the nucleic acid sequence of the primer is a sequence that is inconsistent with the non-target sequence present in the sample so that only the target gene sequence containing the complementary primer binding site is amplified and does not cause nonspecific amplification. .
  • the term "probe” refers to a substance that can specifically bind to a target substance to be detected in a sample, and through the binding, a substance that can specifically confirm the presence of the target substance in the sample. it means.
  • the type of probe is a material commonly used in the art, but is not limited.
  • the probe may be a peptide nucleic acid (PNA), a locked nucleic acid (LNA), a peptide, a polypeptide, a protein, an RNA, or a DNA. It is PNA.
  • the probes include those derived from or similar to organisms or produced ex vivo as biomaterials, for example enzymes, proteins, antibodies, microorganisms, flora and fauna, organ cells, neurons, DNA, and RNA.
  • DNA may include cDNA, genomic DNA, oligonucleotides, RNA includes genomic RNA, mRNA, oligonucleotides, and examples of proteins may include antibodies, antigens, enzymes, peptides, and the like.
  • antisense refers to a nucleotide in which an antisense oligomer hybridizes with a target sequence in RNA by Watson-Crick base pairing, allowing formation of mRNA and RNA: oligomeric heterodimers typically within the target sequence.
  • the agent measuring the protein level is specific for at least one protein selected from APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP and CFB and at least one protein further selected from AGP and PEDF. It may include an antibody that binds to.
  • an antibody refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site.
  • an antibody means an antibody that specifically binds to at least one protein selected from APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP, CFB, AGP, and PEDF.
  • Antibodies of the invention include all polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and recombinant antibodies. Generating antibodies can be readily prepared using techniques well known in the art.
  • the antibodies of the present invention also include functional fragments of antibody molecules, as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains.
  • the functional fragment of an antibody molecule means the fragment which has at least antigen binding function, and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2, Fv, etc.
  • the present invention provides a kit for diagnosing diabetic retinopathy comprising the composition for diagnosing diabetic retinopathy.
  • the kit may be an RT-PCR kit, a DNA chip kit, an ELISA kit, a protein chip kit, a rapid kit, or a multiple reaction monitoring (MRM) kit.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • the diabetic retinopathy diagnostic kit may further include one or more other component compositions, solutions, or devices suitable for analytical methods.
  • the diagnostic kit may be a diagnostic kit comprising essential elements necessary to perform reverse transcriptase.
  • the reverse transcription polymerase kit contains each primer pair specific for the marker gene.
  • the primer is a nucleotide having a sequence specific to the nucleic acid sequence of each gene, and is about 7 bp to 50 bp in length, more preferably about 10 bp to 30 bp in length. It may also include primers specific for the nucleic acid sequence of the control gene.
  • reverse transcriptase kits include test tubes or other suitable containers, reaction buffers (pH and magnesium concentrations vary), enzymes such as deoxynucleotides (dNTPs), Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNAse, RNAse inhibitor DEPC - May include DEPC-water, sterile water, and the like.
  • reaction buffers pH and magnesium concentrations vary
  • enzymes such as deoxynucleotides (dNTPs), Taq-polymerase and reverse transcriptase
  • DNAse DNAse
  • RNAse inhibitor DEPC - May include DEPC-water, sterile water, and the like.
  • the diagnostic kit may be a diagnostic kit comprising an essential element necessary to perform a DNA chip.
  • the DNA chip kit may include a substrate on which a cDNA or oligonucleotide corresponding to a gene or a fragment thereof is attached, and a reagent, a preparation, an enzyme, or the like for preparing a fluorescent probe.
  • the substrate may also comprise cDNA or oligonucleotide corresponding to the control gene or fragment thereof.
  • the diagnostic kit may be a diagnostic kit comprising essential elements necessary for performing an ELISA.
  • ELISA kits include antibodies specific for the protein. Antibodies are antibodies that have high specificity and affinity for each marker protein and have little cross-reactivity to other proteins. They are monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, or recombinant antibodies.
  • the ELISA kit can also include antibodies specific for the control protein.
  • Other ELISA kits can bind reagents that can detect bound antibodies, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (eg conjugated with the antibody) and substrates or antibodies thereof. Other materials and the like.
  • the present invention provides a method for providing information for diagnosing diabetic retinopathy using the diabetic retinopathy diagnostic composition or the diabetic retinopathy diagnostic kit.
  • the information providing method is APOC1 (Apolipoprotein C1), APOB100 (Apolipoprotein B100), APOC3 (Apolipoprotein C3), VTN (Vitronectin), PLG (Plasminogen), HRP (Histidine) from biological samples isolated from patients with suspected diabetic retinopathy measuring the expression level or protein expression level of at least one gene selected from -rich protein, AFM (Afamin), ceruloplasmin (CP), and Complement factor B (CFB); And it may be a method of providing information for diagnosing diabetic retinopathy comprising comparing the expression level of the gene or the expression level of the protein with a normal control sample.
  • biological sample means a tissue, cell, whole blood, serum, plasma, saliva, cerebrospinal fluid or urine, or the like, in which the gene expression level or protein expression level is different due to the development of diabetic retinopathy. However, it is not limited thereto.
  • the APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP and CFB are characterized by a decrease in the expression level of the gene or protein expression compared to the normal control, diabetic retinopathy when the level is reduced Can diagnose and provide information.
  • the diabetic retinopathy is non-proliferative diabetic retinopathy.
  • the measuring and comparing step may further measure the expression level or protein expression level of one or more genes selected from the group consisting of Alpha-1 acid glycoprotein (AGP) and Pigment epithelium-derived factor (PEDF). And comparing.
  • AGP Alpha-1 acid glycoprotein
  • PEDF Pigment epithelium-derived factor
  • the AGP and PEDF has a characteristic that the expression level of the gene and the protein expression level is increased compared to the normal control, and when the level is increased can be diagnosed with diabetic retinopathy and provide information. At this time, the diabetic retinopathy is non-proliferative diabetic retinopathy.
  • the expression level of the gene of APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP and CFB or the expression level of the protein and the expression level of the gene of the individual sample of proliferative diabetic retinopathy or the expression level of the protein may further comprise determining that the reduction is non-proliferative diabetic retinopathy.
  • APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP, and CFB of the present invention reduce the gene or protein expression level in non-proliferative diabetic retinopathy, so it is a gene or protein of a proliferative diabetic retinopathy (PDR) individual.
  • PDR proliferative diabetic retinopathy
  • Reduction compared to the expression level can be determined as non-proliferative diabetic retinopathy (NPDR) during the progression of diabetic retinopathy.
  • NPDR non-proliferative diabetic retinopathy
  • At least one selected from the group consisting of AGP and PEDF as a complex marker increases the gene or protein expression level in non-proliferative diabetic retinopathy, and compares it with the gene or protein expression level of proliferative diabetic retinopathy (PDR) individuals. If increased, it can be determined as non-proliferative diabetic retinopathy (NPDR).
  • PDR proliferative diabetic retinopathy
  • the expression level of the gene of the present invention can measure or compare the mRNA expression level.
  • the mRNA expression level measurement or comparison may include, but is not limited to, reverse transcriptase polymerase reaction, competitive reverse transcriptase polymerase reaction, real time reverse transcriptase polymerase reaction, RNase protection assay, northern blotting or DNA chip.
  • the protein expression level of the present invention can be measured and compared using an antibody that specifically binds to the protein.
  • the antibody and the protein of interest in the biological sample form an antigen-antibody complex, and a method of detecting the antibody is used.
  • the term “antigen-antibody complex” means a combination of a protein antigen and an antibody that recognizes it to identify the presence or absence of the gene of interest in a biological sample.
  • the detection of the antigen-antibody complex can be detected using methods as known in the art, such as spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical, electrical, absorbing, chemical and other methods.
  • the protein expression level measurement and comparison in the present invention is characterized by measuring and comparing the protein expression level itself without using an antibody.
  • the protein expression level measurement or comparative analysis methods include protein chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF) analysis, SELDI-TOF (Sulface Enhanced Laser Desorption / Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, radioimmunoassay, radioimmunoassay, oukteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, complement fixation assay, two-dimensional electrophoresis analysis, liquid phase Liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), liquid chromatography-mass spectrometry / mass spectrometry (LC-MS / MS), western blot, and enzyme linked immunosorbentassay (ELISA). .
  • MALDI-TOF Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization Time of Flight Mass Spectrometry
  • SELDI-TOF Surface Enhanced
  • the LC-MRM method was used to measure and compare the protein expression levels of APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP, CFB, AGP or PEDF itself.
  • the protein in the biological sample was passed through the LC analysis column with a concentration gradient of 5% to 85% for 30 minutes with a solution of 5% distilled water, 95% acetonitrile, and 0.1% formic acid based on volume%. Since the resolution of a specific material may vary depending on the solution mixing ratio, a concentration gradient was performed, and the above range was selected for an optimal range for separating various proteins at the same time.
  • SIM Multiple reaction monitoring
  • MRM Multiple reaction monitoring
  • MRM Multiple reaction monitoring
  • MRM Multiple reaction monitoring
  • MRM Multiple reaction monitoring
  • MRM selects one ion from one broken ion one more time to source another MS in series. It is a method of using ions obtained from the collision after passing through it once more.
  • SIM there is a problem that the selected quantitative ion may interfere with the quantification when the selected quantitative ion is an ion that is also detected in plasma.
  • MRM even if ions with the same mass are broken once more, the molecular structure is different and tends to be differentiated. Can be obtained.
  • MRM mode in mass spectrometry, it was possible to simultaneously analyze the desired materials with better analytical sensitivity.
  • the present invention provides a combination of APOC1 (Apolipoprotein C1), APOB100 (Apolipoprotein B100), APOC3 (Apolipoprotein C3), VTN (Vitronectin), PLG (Plasminogen), HRP (Histidine-rich protein), and AFM Measuring the expression level of one or more genes selected from the group consisting of Afamin), ceruloplasmin (CP) and Complement factor B (CFB) or expression levels of proteins; And it provides a method for diagnosing diabetic retinopathy comprising comparing the expression level of the gene or the expression level of the protein with a normal control sample.
  • the measuring and comparing step may further measure and compare the expression level of one or more genes selected from the group consisting of alpha-1 acid glycoprotein (AGP) and pigment epithelium-derived factor (PEDF) or the expression level of the protein. It may include a step.
  • AGP alpha-1 acid glycoprotein
  • PEDF pigment epithelium-derived factor
  • the present invention provides Alpha-1 acid glycoprotein (AGP), Pigment epithelium-derived factor (PEDF), APOC1 (Apolipoprotein C1), APOB100 (Apolipoprotein B100), APOC3 (Apolipoprotein C3), VTN (Vitronectin), PLG (Plasminogen), Hisidine-rich protein (HRP), AFM (Afamin), Ceruloplasmin (CP), and Complement factor B (CFB) are provided for use as a marker for diagnosing diabetic retinopathy.
  • AGP Alpha-1 acid glycoprotein
  • PEDF Pigment epithelium-derived factor
  • APOC1 Apolipoprotein C1
  • APOB100 Polipoprotein B100
  • APOC3 Apolipoprotein C3
  • VTN Vitronectin
  • PLG Plasminogen
  • HRP Hisidine-rich protein
  • AFM Afamin
  • Ceruloplasmin CP
  • CFB Complement factor B
  • MRM analysis of vitreous proteins in patients with proliferative diabetic retinopathy (PDR) and macular hole (MH) revealed MDR-specific candidate markers, which differ in expression.
  • NPDR non-proliferative diabetic retinopathy
  • Table 1 SEQ ID NO: Protein name Expression Gene Accession number Uniprot One Alpha-1 acid glycoprotein (AGP) Increased expression AAB33887 P02763 2 Pigment epithelium-derived factor (PEDF) Increased expression AAK92491 P36955 3 APOC1 (Apolipoprotein C1) Reduced expression AAD02506 P02654 4 APOB100 (Apolipoprotein B100) Reduced expression AAB04636 P04114 5 Apolipoprotein C3 (APOC3) Reduced expression AAS68230 P02656 6 Vitronectin (VTN) Reduced expression AAH05046 P04004 7 PLG (Plasminogen) Reduced expression AAA60113 P00747 8 Histidine-rich protein (HRP) Reduced expression AAI50592 P04196 9 AFM (Afamin) Reduced expression AAI09021 P43652 10 Ceruloplasmin (CP) Reduced expression AAF02483 P00450 11 Complement factor B (CFB) Reduced
  • Plasma samples from 45 patients with non-proliferative diabetic retinopathy (NPDR) early in diabetic retinopathy (NPDR) were obtained for LC-MS / MS test samples.
  • Clinical characteristics of the 45 patients with non-proliferative diabetic retinopathy (NPDR) and control patients are shown in Table 2 below. The three stages were mild, moderate and severe according to the progression of non-proliferative diabetic retinopathy.
  • NoDR Diabetic but no diabetic retinopathy
  • MI NPDR Mild NPDR
  • MO NPDR Moderate NPDR
  • SV NPDR Severe NPDR
  • Plasma samples were quantified using Bradford, of which 200 ⁇ g of plasma was taken, denatured into urea, reduced and alkylated with DTT and iodoacetic acid.
  • trypsin was treated at a ratio of 50: 1 (protein: trypsin, w / w) to make denatured proteins into peptides, and the peptides were desalted using C18 ZipTip and lyophilized. This was dissolved in solution A (95% distilled water, 5% acetonitrile, 0.1% formic acid) and spiked with 100 fmol of beta-galactosidase peptide, an internal standard, and analyzed by MRM. .
  • MS / MS analysis was performed on the proteins selected in the excavation study. Based on this, a representative peptide for each protein was selected (Q1 transition), and the highest intensity ion (Q3) was selected among fragmentation ions generated by electrically breaking the peptide. Two peptides per protein were selected and two fragmentation ions per peptide were selected to determine Q1 / Q3 as four transitions for one protein. Transitions were selected using the MRM-Initiated Detection and Sequencing (MIDAS) workflow program (MRMPliot, version 2.0, Appliedbiosystems, USA) for some transitions that were difficult to select due to low peaks. For transitions not captured by the MIDAS workflow program, the peptides were selected by selecting peptides with high observed numbers using the Peptide Atlas database.
  • MIDAS MRM-Initiated Detection and Sequencing
  • LC used MDLC nanoflow TempoLC of MDS.
  • C18 resin with a diameter of 3 ⁇ m and a pore size of 200 mm was directly filled using a fused sillica capillary column of 15 cm in length and 100 ⁇ m in diameter.
  • Peptide samples were injected by direct injection method, 1.0 ⁇ l was injected directly into the analitical column without passing through the trap column, and the flow rate was used as 400nl / min.
  • Mass spectrometry was monitored in MRM mode for transitions to selected proteins using 4000 QTrap instrument, Applied Biosystems' hybrid triple quadrupole / linear ion trap. Ion voltage was used at 2000 Volt and resolution at Quadruple 1 (Q1) and Quadruple 3 (Q3) was set in units. The dwell time for the transition was set to 20 milliseconds so that the total cycle time would be 2.5 seconds. Neubulizing gas was used in 5 units and heater temperature was set at 150 °C.
  • beta-galactosidase peptide (beta-galactosidase peptide, Transition 542.3 / 636.3) spiked in each sample was also monitored at the same time.
  • MS run time was run for 60 minutes in time synchronization with LC.
  • MS and LC were run using Analyst 2.1.2.
  • beta-galatosidase peptide (Transition 542.3 / 636.3) was used to quantify MRM at 8 concentration points of blank, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0, 25.0, 50.0, and 100.0 fmol. Standard curve was determined.
  • the individual MRM results were generated by extracting ion ion chromatography (XIC) of the MRM transitions using MultiQuant (AppliedBiosystems, ver1.0), and the peak area of each transition was calculated and plotted again over time. . Normalize the area of each XIC peak to the XIC peak area of the beta-galatosidase peptide (Transition 542.3 / 636.3), an internal standard, and use this value to perform relative quantitative analysis for each protein.
  • ROC Receiveiver Operating Characteristic Curve and Interactive plot were prepared using MedCalc (MedCalc Software, Belgium, vesion 11.3.3) and ANOVA (Analysis of variance) statistical analysis was performed. Sigma Plot (Systat Software Inc, USA, version 10.1) was used for some plotting and t-test analysis.
  • FIGS. 3 to 11 are ROC curves and interactive plots of APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP, and CFB, respectively, and their expression is reduced compared to NoDR samples, resulting in non-proliferative diabetic retinopathy. It was confirmed that it can be used as a specific diagnostic marker.
  • 12 to 13 are ROC curves and interactive plots of AGP and PEDF, respectively, with increased expression compared to NoDR samples, respectively, with the addition of APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP and CFB. It was confirmed that it can be used as a diagnostic marker specific to non-proliferative diabetic retinopathy.

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Abstract

본 발명은 당뇨망막병증 환자의 진단 및 진행 정도 판단을 위해 사용될 수 있는 유전자 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 당뇨망막병증 진단용 조성물, 키트, 이를 사용한 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법 및 당뇨망막병증 진단방법에 관한 것이다.

Description

당뇨망막병증 진단용 마커 및 이의 용도
본 발명은 당뇨망막병증 환자의 진단 및 진행 정도 판단을 위해 사용될 수 있는 유전자 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 당뇨망막병증 진단용 조성물, 키트, 이를 사용한 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법 및 당뇨망막병증 진단방법에 관한 것이다.
당뇨병은 인슐린의 생성 혹은 이용 과정의 이상으로 혈당이 증가하고 그에 따른 다양한 급성, 만성 합병증을 동반하는 심각한 질환이다. 미국의 경우, 20세 이상 인구의 9.6% (2000만 명 이상)가 당뇨를 가지고 있고, 발병 위험이 높은 당뇨 전단계(pre-diabetes) 환자가 5000만 명 이상으로 추정 된다(2005년 미국 national diabetes fact sheet). 2002년에는 당뇨 질환과 관련하여 직접, 간접적인 의료비용으로 1320억 달러가 지출되었다.
한국의 경우, 2005년 질병관리본부에서 시행한 국민건강영양조사에 따르면 30세 이상 남자의 9.0%, 여자의 7.2%가 당뇨병 환자로 나타났다. 대한 당뇨병학회가 발간한 「2007년 한국인 당뇨병 연구보고서」에 따르면, 당뇨의 유병률은 약 8%이고 매년 10%의 새로운 환자가 발생하고 있다. 당뇨 관련 의료비는 건강보험 비용의 약 20% (약 3조원)를 차지한다. 현재 400-500만 명으로 추산되는 당뇨 환자 수의 최근의 빠른 증가 속도를 고려할 때 10-20년 후에는 당뇨 환자 수가 약 1000만 명에 이를 수 있다.
당뇨병은 이환 기간이 긴 특징이 있기 때문에, 전신의 다양한 합병증을 동반하게 되는데, 대표적인 예로서 심혈관계 질환, 당뇨신증, 당뇨신경병증, 당뇨망막병증이 있다. 이 중 당뇨망막병증(Diabetic Retinopathy, DR)은 당뇨 진단 10년 내에 60% 이상, 20년 내에 90% 이상의 당뇨 환자에게서 나타난다.
당뇨망막병증은 당뇨병의 미세혈관 합병증(microangiopathy)의 하나로 망막 혈관의 투과성 변화와 혈관 폐쇄, 허혈증(ischemia), 신생혈관 생성 (neovascularization), 그리고 이에 따른 섬유혈관 증식(fibrovascular proliferation)이 특징이다.
당뇨망막병증은 성인의 최대의 후천적 실명 원인으로, 미국의 경우 매년 12,000명에서 24,000명이 당뇨로 인해 실명에 이르고 있다. 미국의 연구에서, 당뇨망막병증의 유병률은 당뇨 환자의 40% 정도로 추산되며 8% 정도는 실명에 이를 수 있는 심각한 상태인 것으로 보고되고 있다.
당뇨망막병증은 진행 정도에 따라 초기의 비증식성 당뇨망병증(NPDR, non-proliferative diabetic retinopathy)과 후기의 증식성 당뇨망막병증(PDR, proliferative diabetic retinopathy)으로 구분한다(도 1).
비증식성 당뇨망막병증(NPDR)은 망막 모세혈관의 폐쇄 및 투과성 변화 등으로 망막출혈, 미세혈관류(microaneurysm), 삼출물(exudate), 망막 부종(edema) 등이 나타나면서 조금씩 시력이 떨어지게 되는 특징이 있다. 또한 황반부의 부종 (DME, 당뇨황반부종)을 동반하게 되면 비증식성 당뇨망막병증 단계에서도 심각한 시력 저하를 보일 수 있다.
증식성 당뇨망막병증(PDR)은 망막의 광범위한 혈관 폐쇄에 따르는 허혈 (ischemia) 상태로 인해 신생혈관(neovascularization)이 증식하는 단계이다. 이러한 증식은 망막에서 유리체로 진행되고 섬유혈관 증식이 일어나 견인막에 의해 유리체출혈(vitreous hemorrhage)이나 망막이 원래 부착 부위에서 떨어지는 견인망막박리(tractional retinal detachment), 신생혈관녹내장 등의 합병증이 발생해 실명이 진행되는 단계이다.
레이저 치료 혹은 수술 치료에도 불구하고 병증이 계속 진행되어 실명에 이르는 환자가 아직도 많아, 당뇨망막병증의 조기발견과 진행 억제, 고위험군에 대한 조기 치료에 대한 필요성이 증가하고 있다. 그러나, 당뇨망막병증의 병인은 아직 정확하게 밝혀지지는 않았고, 당뇨에 의한 망막증의 진행 정도를 판단하는 바이오마커도 매우 한정적이다.
현재까지 당뇨망막병증 연구는 유리체의 개별 단백질에 대한 생화학 및 분자생물학적 연구를 중심으로 주로 이루어지고 있다. 또한 당뇨망막병증의 단백질체 연구도 환자 유리체에서 단백질을 2-DE 및 Mass spcectrometry로 동정하는 유리체 단백질체의 Profiling(Discovery) 단계의 연구이다. 이들 유리체 단백질들이 혈액에서 발현이 되는지 혹은 이들을 임상적인 바이오마커로 이용할 수 있는 지에 대한 확인(verification) 및 검증(validation) 연구는 거의 이루어지지 않은 상태이다.
따라서, 임상적으로 특이성과 민감도가 높은 신규 진단 마커와 아울러 이를 검출할 수 있는 항체를 개발하여, 당뇨망막병증의 조기 진단 및 진행 정도를 손쉽게 미리 예측할 필요가 있다.
본 발명자들은 당뇨망막병증의 조기 진단에 유용한 마커를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 당뇨망막병증 특이 단백질을 발굴하고, 당뇨망막병증 개체에서 증가 또는 감소하는 상기 특이 단백질의 발현양상을 이용하여 당뇨망막병증을 손쉽게 진단할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 당뇨망막병증을 조기 진단할 수 있는 새로운 당뇨망막병증 진단용 마커인 APOC1(Apolipoprotein C1), APOB100(Apolipoprotein B100), APOC3(Apolipoprotein C3), VTN(Vitronectin), PLG(Plasminogen), HRP(Histidine-rich protein), AFM(Afamin), CP(ceruloplasmin) 및 CFB(Complement factor B) 중에서 1개 이상 선택되는 당뇨망막병증 진단용 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 마커 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 당뇨망막병증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 당뇨망막병증 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 당뇨망막병증 진단용 조성물 또는 키트를 이용하여 당뇨망막병증 진단에 필요한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 당뇨망막병증 진단용 조성물 또는 키트를 이용하여 당뇨망막병증 진단방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 당뇨망막병증을 진단할 수 있는 마커를 제공함으로서, 당뇨망막병증 환자에게서 발현이 증가 또는 감소한 유전자 또는 그 단백질의 발현 수준을 측정 및 비교함으로서 당뇨망막병증의 조기진단 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있다. 또한, 본 발명의 마커는 비침습성 진단을 가능하게 하여 혈액, 뇨 검사 등으로 간단하고 유효성 있는 당뇨망막병증의 초기 진단을 할 수 있다.
도 1은 비증식성 당뇨망막병증 및 증식성 당뇨망막병증 환자의 안구 사진이다.
도 2는 실시예 1 내지 6의 실시 과정을 개략적으로 나타낸 플로우 차트이다.
도 3은 실시예 6에 따른 APOC1의 ROC curve와 interactive plot을 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 6에 따른 APOB100의 ROC curve와 interactive plot을 나타낸 그래프이다.
도 5는 실시예 6에 따른 APOC3의 ROC curve와 interactive plot을 나타낸 그래프이다.
도 6은 실시예 6에 따른 VTN의 ROC curve와 interactive plot을 나타낸 그래프이다.
도 7은 실시예 6에 따른 PLG의 ROC curve와 interactive plot을 나타낸 그래프이다.
도 8은 실시예 6에 따른 HRP의 ROC curve와 interactive plot을 나타낸 그래프이다.
도 9는 실시예 6에 따른 AFM의 ROC curve와 interactive plot을 나타낸 그래프이다.
도 10는 실시예 6에 따른 CP의 ROC curve와 interactive plot을 나타낸 그래프이다.
도 11은 실시예 6에 따른 CFB의 ROC curve와 interactive plot을 나타낸 그래프이다.
도 12은 실시예 6에 따른 AGP의 ROC curve와 interactive plot을 나타낸 그래프이다.
도 13는 실시예 6에 따른 PEDF의 ROC curve와 interactive plot을 나타낸 그래프이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 APOC1(Apolipoprotein C1), APOB100(Apolipoprotein B100), APOC3(Apolipoprotein C3), VTN(Vitronectin), PLG(Plasminogen), HRP(Histidine-rich protein), AFM(Afamin), CP(Ceruloplasmin) 및 CFB(Complement factor B)중에서 선택되는 1개 이상의 당뇨망막병증 진단용 마커를 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 당뇨망막병증 발병 여부를 확인하는 것이다. 바람직하게는 당뇨망막병증 중 초기 단계인 비증식성 당뇨망막병증 발병 여부를 확인하는 것이다.
본 발명에서 사용된 용어, "진단용 마커"란 정상 대조군(당뇨망막병증이 아닌 개체) 또는 증식성 당뇨망막병증 개체에 비하여 비증식성 당뇨망막병증을 가진 개체에서 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준의 유의적인 증가 또는 감소하는 양상을 보이는, 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 의미한다.
본 발명의 목적상 당뇨망막병증 진단용 마커는 APOC1(Apolipoprotein C1), APOB100(Apolipoprotein B100), APOC3(Apolipoprotein C3), VTN(Vitronectin), PLG(Plasminogen), HRP(Histidine-rich protein), AFM(Afamin), CP(Ceruloplasmin) 및 CFB(Complement factor B)으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 바람직하게, 상기 마커 9개로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상 또는 9개를 조합하여 사용할 수 있으며, 예를 들어, APOC1; APOC1 및 VTN; AFM, CP 및 CFB; APOC1, APOC3, PLG 및 HRP; 등을 예시로 들 수 있으며 이에 제한되지 않는다.
보다 바람직하게는 상기 당뇨망막병증 진단용 마커는 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein) 또는 PEDF(Pigment epithelium-derived factor)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 마커는 AGP, PEDF 단독, 또는 AGP와 PEDF의 조합일 수 있다.
바람직하게, 상기 마커 APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP 및 CFB로부터 선택된 하나 이상과, AGP 또는 PEDF 또는 AGP와 PEDF를 조합하여 당뇨망막병증 진단용 마커로 사용할 수 있다.
당뇨망막병증은 진행 정도에 따라 초기의 비증식성 당뇨망막병증(NPDR)과 후기의 증식성 당뇨망막병증(PDR)로 구분한다. 비증식성 당뇨망막병증은 혈관이 발달하지 않는 특징이 있으며, 증식성 당뇨망막병증은 혈관이 발달하는 등 그 기전에 있어서 상이한 점이 있다. 비증식성 당뇨망막병증이 반드시 증식성 당뇨망막병증으로 진행되는 것이 아니어서, 증식성 당뇨망막병증의 진단용 마커로 알려진 마커라도 반드시 비증식성 당뇨망막병증의 진단용 마커로 사용될 수는 없다.
본 발명자들은 다음과 같은 입증을 통해 APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP, CFB, AGP 및 PEDF가 당뇨망막병증 진단용 마커로 이용될 수 있음을 규명하였다.
본 발명의 일 실시예에서, MH(황반원공), PDR(증식성 당뇨망막병증), 및 NPDR(비증식성 당뇨망막병증) 개체의 혈장 시료를 분석하여 당뇨망막병증에 과발현 또는 저발현하는 바이오마커를 발굴하였다. 구체적으로 PDR 및 MH 개체의 시료를 분석하여 PDR 특이적 후보 마커를 확인하고 이를 바탕으로 NPDR 특이적 마커 11종(APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP, CFB, AGP 및 PEDF)을 최종 발굴하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 정상 대조군(당뇨망막병증이 아닌 개체) 및 NPDR(비증식성 당뇨망막병증) 개체의 혈장 시료를 분석하여 상기 발굴한 11종의 NPDR(비증식성 당뇨망막병증) 특이적 마커의 유효성을 확립하였다.
하나의 양태로서, 본 발명은 APOC1(Apolipoprotein C1), APOB100(Apolipoprotein B100), APOC3(Apolipoprotein C3), VTN(Vitronectin), PLG(Plasminogen), HRP(Histidine-rich protein), AFM(Afamin), CP(Ceruloplasmin) 및 CFB(Complement factor B)중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 당뇨망막병증 진단용 조성물을 제공한다.
APOC1(Apolipoprotein C1), APOB100(Apolipoprotein B100), 및 APOC3(Apolipoprotein C3)는 유전자 존재론(Gene ontology) 분류에 따르면 모두 지질 대사에 관여하는 단백질로서, 그 유전자 정보는 각각 APOC1(GeneBank Accession No.AAD02506, Uniprot: P02654), APOB100(GeneBank Accession No.AAB04636, Uniprot: P04114), APOC3(GeneBank Accession No.AAS68230, Uniprot: P02656)이다. 그러나, APOC1, APOB100 및 APOC3의 당뇨망막병증과의 연관성은 어디에도 전혀 알려지지 않았다.
VTN(Vitronectin), PLG(Plasminogen), HRP(Histidine-rich protein)는 유전자 존재론(Gene ontology) 분류에 따르면 면역 반응 및 섬유소 용해에 관여하는 단백질로서, 그 유전자 정보는 각각 VTN(GeneBank Accession No.AAH05046, Uniprot: P04004), PLG(GeneBank Accession No. AAA60113, Uniprot: P00747), HRP(GeneBank Accession No.AAI50592, Uniprot: P04196)이다. 그러나, VTN, PLG 및 HRP의 당뇨망막병증과의 연관성은 어디에도 전혀 알려지지 않았다.
AFM(Afamin)은 유전자 존재론(Gene ontology) 분류에 따르면 수송(transport)에 관여하는 단백질로서, 그 유전자 정보는 AFM(GeneBank Accession No.AAI09021, Uniprot: P43652)으로 찾을 수 있다. 그러나, AFM의 당뇨망막병증과의 연관성은 어디에도 전혀 알려지지 않았다.
CP(ceruloplasmin)은 유전자 존재론(Gene ontology) 분류에 따르면 수송(transport)에 관여하는 단백질로서, 그 유전자 정보는 CP(GeneBank Accession No.AAF02483, Uniprot: P00450)이다. 그러나, AFM의 당뇨망막병증과의 연관성은 어디에도 전혀 알려지지 않았다.
CFB(Complement factor B)은 유전자 존재론(Gene ontology) 분류에 따르면 망막아세포종 및 전활성 B-림포사이트(preactivated B-lymphocytes)에 관여하는 단백질로서, 그 유전자 정보는 CFB(GeneBank Accession No.AAA16820, Uniprot: P00751)이다. 그러나 CFB의 당뇨망막병증과의 연관성은 어디에도 전혀 알려지지 않았다.
상기 APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP 및 CFB는 모두 정상 대조군(당뇨망막병증이 아닌 개체)과 비교하여 당뇨망막병증 개체에서 유전자 발현 수준 또는 해당 단백질의 발현 수준이 감소하는 특징을 가진다. 이때 상기 당뇨망막병증 개체는 바람직하게 비증식성 당뇨망막병증 개체이다.
상기 조성물은 APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP 및 CFB로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제에 추가로 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein) 및 PEDF(Pigment epithelium-derived factor) 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 당뇨망막병증 진단용 조성물일 수 있다.
AGP(Alpha-1 acid glycoprotein)는 급성기 혈장 알파-글로블린 글라이코프로테인으로 두 개의 다형 유전자에 의해 조절되며, 유전자 존재론(Gene ontology) 분류에 따르면 면역 반응 및 섬유소 용해에 관여하는 단백질로서, 그 유전자 정보는 AGP(GeneBank Accession No.AAB33887, Uniprot: P02763) 이다. 그러나, AGP의 당뇨망막병증과의 연관성은 어디에도 전혀 알려지지 않았다. AGP는 정상 대조군(당뇨망막병증이 아닌 개체)과 비교하여 당뇨망막병증 개체에서 유전자 발현 수준 또는 해당 단백질의 발현 수준이 증가하는 특징을 가진다. 이때 상기 당뇨망막병증 개체는 바람직하게 비증식성 당뇨망막병증 개체이다.
PEDF(Pigment epithelium-derived factor)는 안티-안지오제닉, 안티-튜머리제닉 및 뉴로트로픽 기능을 가지는 다기능 분비 단백질로서 유전자 존재론(Gene ontology) 분류에 따르면 망막아세포종 및 전활성 B-림포사이트(preactivated B-lymphocytes)에 관여하는 단백질이다. 그 유전자 정보는 PEDF(GeneBank Accession No.AAK92491, Uniprot: P36955)이다. 그러나, PEDF의 당뇨망막병증과의 연관성은 어디에도 전혀 알려지지 않았다. PEDF는 정상 대조군(당뇨망막병증이 아닌 개체)과 비교하여 당뇨망막병증 개체에서 유전자 발현 수준 또는 해당 단백질의 발현 수준이 증가하는 특징을 가진다. 이때 상기 당뇨망막병증 개체는 바람직하게 비증식성 당뇨망막병증 개체이다.
본 발명에 사용된 용어, "mRNA 발현수준 측정"이란 당뇨망막병증을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 당뇨망막병증 진단용 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정하는 것을 의미한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 유전자들의 핵산 정보는 GeneBank 등에 알려져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머쌍 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어, "단백질 발현수준 측정"이란 당뇨망막병증을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 당뇨망막병증 진단용 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정을 의미한다. 단백질 발현 수준 측정은 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있으며, 바람직하게는 항체를 이용하지 않고 단백질 발현 수준 자체를 측정하는 것을 말한다.
상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 용어, "당뇨망막병증"이란 당뇨병에 의해 말초 순환 장애가 발생하여, 망막의 미세순환에 장애가 생겨 시력 감소가 발생하는 당뇨 합병증을 의미한다. 바람직하게 본 발명에 따른 당뇨망막병증은 비증식성 당뇨망막병증이다.
바람직하게, 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP 및 CFB로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 및 추가적으로 AGP 및 PEDF 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어, "프라이머 쌍"은 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체외에서 제조된 것을 포함하는 것으로 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
바람직하게, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP 및 CFB로부터 선택되는 1개 이상의 단백질 및 추가적으로 AGP 및 PEDF 중에서 선택되는 1개 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어, "항체"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP, CFB, AGP 및 PEDF 중에서 선택되는 1 이상의 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 당뇨망막병증 진단용 조성물을 포함하는 당뇨망막병증 진단용 키트를 제공한다. 바람직하게, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다.
또한, 바람직하게, 상기 당뇨망막병증 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
바람직하게, 상기 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 각 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
바람직하게, 상기 진단용 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한 바람직하게는, 상기 진단용 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 당뇨망막병증 진단용 조성물 또는 상기 당뇨망막병증 진단용 키트를 이용한 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
바람직하게, 상기 정보 제공 방법은 당뇨망막병증 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 APOC1(Apolipoprotein C1), APOB100(Apolipoprotein B100), APOC3(Apolipoprotein C3), VTN(Vitronectin), PLG(Plasminogen), HRP(Histidine-rich protein), AFM(Afamin), CP(ceruloplasmin) 및 CFB(Complement factor B) 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "생물학적 시료"란 당뇨망막병증 발병에 의해 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준이 차이가 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 의미하나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP 및 CFB는 그 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준이 정상 대조군과 비교하여 감소하는 특징을 가지므로, 상기 수준이 감소하면 당뇨망막병증으로 진단하여 정보제공을 할 수 있다. 이때 바람직하게 상기 당뇨망막병증은 비증식성 당뇨망막병증이다.
바람직하게, 상기 측정하는 단계 및 비교하는 단계는 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein) 및 PEDF(Pigment epithelium-derived factor)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 추가로 측정 및 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 AGP 및 PEDF는 그 유전자의 발현 수준 및 단백질의 발현 수준이 정상 대조군과 비교하여 증가하는 특징을 가지므로, 상기 수준이 증가하면 당뇨망막병증으로 진단하여 정보제공 할 수 있다. 이때 상기 당뇨망막병증은 비증식성 당뇨망막병증이다.
또한, 바람직하게 APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP 및 CFB의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 증식성 당뇨망막병증 개체 시료의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준과 비교하여, 감소하면 비증식성 당뇨망막병증이라고 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP 및 CFB는 비증식성 당뇨망막병증에서 그 유전자 또는 단백질 발현 수준이 감소하므로 이를 증식성 당뇨망막병증(PDR) 개체의 유전자 또는 단백질 발현 수준과 비교하여 감소하면 당뇨망막병증 진행단계 중 비증식성 당뇨망막병증(NPDR) 이라고 판정할 수 있다.
또한, 복합 마커로서 AGP 및 PEDF로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상은 비증식성 당뇨망막병증에서 그 유전자 또는 단백질 발현 수준이 증가하므로 이를 증식성 당뇨망막병증(PDR) 개체의 유전자 또는 단백질 발현 수준과 비교하여 증가하면 비증식성 당뇨망막병증(NPDR)이라고 판정할 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 상기 유전자의 발현 수준은 mRNA 발현 수준을 측정하거나 비교할 수 있다. 상기 mRNA 발현 수준 측정 또는 비교는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 측정 방법들을 통하여 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 당뇨망막병증 환자의 mRNA 발현량을 확인할 수 있고, 이들 발현량 정도를 비교함으로써 당뇨망막병증 발병 여부를 진단 또는 예측할 수 있다.
바람직하게 본 발명의 상기 단백질 발현 수준은 해당 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 측정 및 비교할 수 있다. 상기 항체와 생물학적 시료 내의 해당 단백질이 항원-항체 복합체를 형성하도록 하고, 이를 검출하는 방법을 이용한다.
본 발명에서 사용된 용어, "항원-항체 복합체"는 생물학적 시료 중의 해당 유전자의 존재 또는 부존재를 확인하기 위한 단백질 항원과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 항원-항체 복합체의 검출은 당업계에 공지된 바와 같은 방법, 예를 들어 분광학적, 광화학적, 생물화학적, 면역화학적, 전기적, 흡광적, 화학적 및 기타 방법을 이용하여 검출할 수 있다.
보다 바람직하게, 본 발명에서 상기 단백질 발현 수준 측정 및 비교는 항체를 이용하지 않고 단백질 발현 수준 자체를 측정 및 비교하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 목적상, 상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP, CFB, AGP 또는 PEDF의 단백질 발현 수준 자체를 측정 및 비교하기 위해서, LC-MRM 방법을 사용하였다.
구체적으로 생물학적 시료 중의 단백질을 부피% 기준으로 5% 증류수, 95% 아세토니트릴, 0.1% 포름산의 용액으로 30분간 5%에서 85%까지 농도구배를 하면서 LC 분석 컬럼을 통과시켰다. 용액 혼합 비율에 따라 특정 물질에 대한 분해능이 달라질 수 있기 때문에 농도 구배를 실시하였고, 상기 범위는 다양한 단백질들을 동시에 분리하기 위한 최적 범위를 선정한 것이다.
질량 분석에서는 MS/MS 모드인 MRM(Multiple reaction monitoring)으로 정량을 실시하였다. SIM(Selected Ion Monitoring)이 질량분석기의 소스 부분에서 한 번 충돌하여 생긴 이온을 이용하는 방법인 반면, MRM은 한 번 깨진 이온 중에서 특정 이온을 한 번 더 선택하여 연속적으로 연결된 또 다른 MS의 소스를 한 번 더 통과시켜 충돌시킨 후 이 중에서 얻은 이온들을 이용하는 방법이다. SIM에서는 선택한 정량이온이 혈장에서도 검출되는 이온인 경우에 정량에 방해가 될 수 있다는 문제점이 있다. 반면, MRM을 이용하는 경우, 같은 질량을 가진 이온이라도 한 번 더 깨지면 분자구조가 달라지면서 차별화된 경향을 나타내므로, 이를 정량이온으로 사용하게 되면 백그라운드에서 방해되는 피크가 제거되어 한 층 더 깨끗한 베이스 라인을 얻을 수 있다. 따라서, 질량 분석시에 MRM 모드를 사용함으로써 보다 우수한 분석 감도에서 원하는 물질들을 동시에 분석할 수 있었다.
상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 단백질 발현 수준과 당뇨망막병증 개체에서의 단백질 발현 수준을 비교할 수 있고, 당뇨망막병증 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량 증감여부를 판단하여, 당뇨망막병증 발병 여부를 진단할 수 있다.
따라서, 또 다른 양태로서 본 발명은 생물학적 시료로부터 APOC1(Apolipoprotein C1), APOB100(Apolipoprotein B100), APOC3(Apolipoprotein C3), VTN(Vitronectin), PLG(Plasminogen), HRP(Histidine-rich protein), AFM(Afamin), CP(ceruloplasmin) 및 CFB(Complement factor B)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 당뇨망막병증 진단방법을 제공한다.
상기 측정하는 단계 및 비교하는 단계는 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein) 및 PEDF(Pigment epithelium-derived factor)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 추가로 측정 및 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein), PEDF(Pigment epithelium-derived factor), APOC1(Apolipoprotein C1), APOB100(Apolipoprotein B100), APOC3(Apolipoprotein C3), VTN(Vitronectin), PLG(Plasminogen), HRP(Histidine-rich protein), AFM(Afamin), CP(Ceruloplasmin) 및 CFB(Complement factor B) 중에서 선택되는 하나 이상의 당뇨망막병증 진단용 마커로서의 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 당뇨망막병증 과발현 또는 저발현 단백질의 발굴
1차로 증식성 당뇨망막병증(PDR) 환자와 황반원공(MH) 환자의 유리체 단백을 MRM 분석하여 발현 차이가 나는 단백질인 PDR 특이적 후보 마커를 발굴하였다.
상기 과정으로 얻어진 PDR 단백질 발현 정도를 기반으로 2차로 증식성 당뇨망막병증(PDR) 환자와 황반원공(MH) 환자 및 비증식성 당뇨망막병증(NPDR) 환자의 유리체 및 대응하는 혈장시료 중의 단백의 발현 양상을 MRM으로 비교 분석하였다. 그 결과, 황반원공(MH) 및 당뇨망막병증 환자(PDR)와 비교하여 발현 차이를 나타내는 단백질들을 발견할 수 있었다(표 1). 이중 과발현과 저발현이 각각 2개 및 9개로 비증식 당뇨망막병증(NPDR)에 특이적으로 발현되는 단백질들을 최종 선발할 수 있었다.
표 1
서열번호 단백질명 발현양상 Gene Accession number Uniprot
1 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein) 발현 증가 AAB33887 P02763
2 PEDF(Pigment epithelium-derived factor) 발현 증가 AAK92491 P36955
3 APOC1(Apolipoprotein C1) 발현 감소 AAD02506 P02654
4 APOB100(Apolipoprotein B100) 발현 감소 AAB04636 P04114
5 APOC3(Apolipoprotein C3) 발현 감소 AAS68230 P02656
6 VTN(Vitronectin) 발현 감소 AAH05046 P04004
7 PLG(Plasminogen) 발현 감소 AAA60113 P00747
8 HRP(Histidine-rich protein) 발현 감소 AAI50592 P04196
9 AFM(Afamin) 발현 감소 AAI09021 P43652
10 CP(Ceruloplasmin) 발현 감소 AAF02483 P00450
11 CFB(Complement factor B) 발현 감소 AAA16820 P00751
실시예 2: 환자 선정 및 혈장 채취
당뇨망막병증 초기인 비증식성 당뇨망막병증 환자(NPDR) 45명의 혈장시료 및 대조군 환자 혈장 시료(당뇨이지만 당뇨망막병증이 없는 환자군, NoDR)로부터 LC-MS/MS 시험용 샘플을 얻었다. 상기 비증식성 당뇨망막병증 환자(NPDR) 45명 및 대조군 환자의 임상적 특징은 하기 표 2와 같다. 비증식성 당뇨망막병증 진행 단계 별로 mild, moderate 및 severe한 세 군으로 나누어 실시하였다.
표 2
군 성별(여성/남성) 나이 DM경과기간(년) HbAlc(%) 혈장농도(㎍/㎕) 혈장 농도의 CV(%)
NoDR 7/8 63.8±9.5 7.9±5.4 7.5±1.6 63.8 9.1
MI NPDR 7/8 61.4±6.7 12.3±6.0 7.4±1.3 61.4 9.4
MO NPDR 8/7 60.6±9.9 15.9±7.7 7.4±1.1 60.6 7.9
SV NPDR 9/6 61.8±9.1 11.8±6.4 7.8±0.8 61.8 9.7
(NoDR: 당뇨이지만 당뇨망막병증이 없는 군, MI NPDR: Mild NPDR, MO NPDR: Moderate NPDR, SV NPDR: Severe NPDR)
실시예 3: 혈장 시료의 전처리
Plasma 시료를 Bradford를 이용하여 정량하여 이중 200㎍에 해당하는 혈장을 취해 요소(Urea)로 변성시키고 DTT 및 요오드아세트산(iodoacetic acid)를 사용하여 환원 및 알킬화시켰다. 여기에 트립신(Trypsin)을 50 : 1 (단백질 : 트립신, w/w)의 비율로 처리하여 변성된 단백질을 펩타이드로 만든 후 펩타이드를 C18 ZipTip을 사용하여 탈염을 하고 동결 건조하였다. 이를 용액 A (95% 증류수, 5% 아세토니트릴, 0.1% 포름산)로 녹이고 여기에 내부 표준(internal standard)인 베타-갈락토시다아제 펩타이드(beta-galactosidase peptide) 100 fmol을 spiking 시키고 이를 MRM 분석하였다.
실시예 4: Transition의 선정
상기 단백질들의 Transition을 선정하기 위해 발굴 연구에서 선정한 단백질들에 대해 각각 MS/MS 분석을 하였다. 이를 바탕으로 각 단백질에 대한 대표 펩타이드를 선정하고(Q1 transition), 이 펩타이드를 전기적으로 깨서 발생하는 fragmentation ion 중 가장 강도가 높은 이온을 (Q3) 선정하였다. 각 단백질 당 2개의 펩타이드를 선정하고 각 펩타이드 당 2개의 fragmentation ion을 선정하여 Q1/Q3를 하나의 단백질에 대한 4개의 Transition으로 결정하였다. 일부 피크가 낮게 나와서 실험적으로 선정하기 어려운 Transition에 대해서는 MIDAS (MRM-Initiated Detection and Sequencing) workflow program (MRMPliot, version 2.0, Appliedbiosystems, USA)을 사용하여 Transition을 선정하였다. 그리고 MIDAS workflow program로도 잡히지 않은 transition은 Peptide Atlas database를 활용하여 observed number가 높은 펩타이드를 선별하여 transition을 선정하였다.
실시예 5: LC 및 MRM
LC는 MDS사의 MDLC nanoflow TempoLC를 사용하였다. 펩타이드의 분리를 위해 직경 3㎛, pore size 200Å의 C18 resin을 길이 15cm, 내경 100㎛의 fused sillica capillary column을 사용하여 직접 충진하였다. 펩타이드 시료는 1.0㎕를 Trap column을 거치지 않고 analitical column으로 바로 주입되는 직접 주입 방법으로 주입하였으며 유속은 400nl/min 으로 사용하였다. 컬럼을 용액 A (95% 증류수, 5% 아세토니트릴, 0.1% 포름산)으로 10분간 평형화한 후 용액 B (5% 증류수, 95% 아세토니트릴, 0.1% 포름산)로 30분간 5%에서 85%까지, 5분간 85%의 농도구배를 통해 펩타이드를 용출하였다.
질량 분석법(Mass spectrometry)은 Applied Biosystems의 hybrid triple quadrupole/linear ion trap인 4000 QTrap 장비를 이용하여 선정 단백질들에 대한 Transition에 대해 MRM 모드로 모니터링을 하였다. Ion voltage는 2000Volt를 사용하였으며 Quadruple 1(Q1)과 Quadruple 3(Q3)에서의 resolution은 unit으로 설정하였다. Transition에 대한 Dwell time은 20 millisecond로 설정하여 total cycle time이 2.5초가 되도록 설정하였다. Neubulizing gas는 5 unit로 사용하였으며 히터 온도는 150℃로 설정하여 분석하였다. 배치(Batch) 간 variation을 증명하기 위해 각각의 샘플에 spiking된 50fmole 베타-갈락토시다아제 펩타이드(beta-galactosidase peptide, Transition 542.3/636.3)도 동시에 모니터링하였다. MS run time은 LC와 시간 동조로 60분 동안 진행하며 MS 및 LC는 Analyst 2.1.2를 사용하여 구동하였다.
실시예 6 : 데이터 분석
상대 정량을 위해 베타-갈락토시다아제 펩타이드(beta-galatosidase peptide, Transition 542.3/636.3)를 사용하여 blank, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0, 25.0, 50.0, 100.0fmol 총 8개의 농도 점에서 MRM 정량하여 Standard curve를 결정하였다. 각 개인별 MRM 결과는 MultiQuant (AppliedBiosystems, ver1.0)을 사용하여 해당 MRM transition의 이온 추출 크로마토그래피(XIC, Extract ion chromatography)를 생성하였으며 각 transition의 피크 면적을 계산하고 이를 다시 시간 경과에 따라 도식화하였다. 각 XIC한 피크의 면적을 내부 표준(Internal standard)인 베타-갈락토시다아제 펩타이드(beta-galatosidase peptide, Transition 542.3/636.3)의 XIC된 피크 면적으로 정상화하고 이 값으로 상대 정량 분석을 각 단백질별로 수행하였다. 통계 분석을 위해서 MedCalc (MedCalc Software, Belgium, vesion 11.3.3)을 이용하여 ROC (Receiver Operating Characteristic) Curve 및 Interactive plot 등을 작성하였으며 ANOVA (Analysis of variance) 통계 분석을 수행하였다. 일부 도표 작성과 t-test분석을 위해 Sigma Plot (Systat Software Inc, USA,version 10.1)을 사용하였다.
상기 분석의 결과 발현 차이가 나는 단백질 중 유의적으로 차이를 보이는 11개의 단백질을 발굴하였고 각 단백질의 ROC curve와 interactive plot은 도 3 내지 13에 나타내었다.
그 결과, 도 3 내지 도 11은 APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP 및 CFB 각각의 ROC curve와 interactive plot으로서 각각 NoDR 시료에 비해 발현이 감소하여, 비증식성 당뇨망막병증에 특이적인 진단용 마커로 이용할 수 있음을 확인하였다. 또한, 도 12 내지 도 13는 각각 AGP 및 PEDF의 ROC curve와 interactive plot로서 각각 NoDR 시료에 비해 발현이 증가하여, 상기 APOC1, APOB100, APOC3, VTN, PLG, HRP, AFM, CP 및 CFB와 함께 추가적인 비증식성 당뇨망막병증에 특이적인 진단용 마커로 이용할 수 있음을 확인하였다.

Claims (16)

  1. APOC1(Apolipoprotein C1), APOB100(Apolipoprotein B100), APOC3(Apolipoprotein C3), VTN(Vitronectin), PLG(Plasminogen), HRP(Histidine-rich protein), AFM(Afamin), CP(ceruloplasmin) 및 CFB(Complement factor B)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 당뇨망막병증 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, AGP(Alpha-1 acid glycoprotein) 및 PEDF(Pigment epithelium-derived factor)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 추가로 측정하는 제제를 포함하는 당뇨망막병증 진단용 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 당뇨망막병증은 비증식성 당뇨망막병증인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드인 당뇨망막병증 진단용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것인 당뇨망막병증 진단용 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 당뇨망막병증 진단용 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인 것을 특징으로 하는 당뇨망막병증 진단용 키트.
  8. 생물학적 시료로부터 APOC1(Apolipoprotein C1), APOB100(Apolipoprotein B100), APOC3(Apolipoprotein C3), VTN(Vitronectin), PLG(Plasminogen), HRP(Histidine-rich protein), AFM(Afamin), CP(ceruloplasmin) 및 CFB(Complement factor B)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 측정하는 단계 및 비교하는 단계는 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein) 및 PEDF(Pigment epithelium-derived factor)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 추가로 측정 및 비교하는 단계를 포함하는 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 증식성 당뇨망막병증 개체 시료의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준과 비교하여, 감소하면 비증식성 당뇨망막병증이라고 판정하는 단계를 추가로 포함하는 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준은 상기 유전자의 mRNA 발현 수준인 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 mRNA 수준 측정은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의한 것인 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법.
  13. 제8항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준 측정은 해당 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 것인 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법.
  14. 제8항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법.
  15. 생물학적 시료로부터 APOC1(Apolipoprotein C1), APOB100(Apolipoprotein B100), APOC3(Apolipoprotein C3), VTN(Vitronectin), PLG(Plasminogen), HRP(Histidine-rich protein), AFM(Afamin), CP(ceruloplasmin) 및 CFB(Complement factor B)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 당뇨망막병증 진단방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 측정하는 단계 및 비교하는 단계는 AGP(Alpha-1 acid glycoprotein) 및 PEDF(Pigment epithelium-derived factor)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 추가로 측정 및 비교하는 단계를 포함하는 당뇨망막병증 진단방법.
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