[go: up one dir, main page]

WO2013008881A1 - 虚血性疾患治療薬 - Google Patents

虚血性疾患治療薬 Download PDF

Info

Publication number
WO2013008881A1
WO2013008881A1 PCT/JP2012/067797 JP2012067797W WO2013008881A1 WO 2013008881 A1 WO2013008881 A1 WO 2013008881A1 JP 2012067797 W JP2012067797 W JP 2012067797W WO 2013008881 A1 WO2013008881 A1 WO 2013008881A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
bifidobacterium
transport carrier
gene
ischemic disease
ischemic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2012/067797
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2013008881A9 (ja
Inventor
有子 和田
裕子 嶋谷
瞳 清水
貴之 佐々木
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Anaeropharma Science Inc
Original Assignee
Anaeropharma Science Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Anaeropharma Science Inc filed Critical Anaeropharma Science Inc
Priority to KR1020147003731A priority Critical patent/KR20140046463A/ko
Priority to CN201280034792.3A priority patent/CN103958680A/zh
Priority to CA2841451A priority patent/CA2841451A1/en
Priority to EP12811514.4A priority patent/EP2733207A4/en
Publication of WO2013008881A1 publication Critical patent/WO2013008881A1/ja
Publication of WO2013008881A9 publication Critical patent/WO2013008881A9/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/745—Bifidobacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]

Definitions

  • the present invention relates to a gene transport carrier capable of specifically treating an ischemic disease site, a pharmaceutical composition, and a method for treating ischemic disease using them.
  • Bifidobacteria which is a non-pathogenic intestinal bacterium that exists in the human intestine and forms flora and is known to be an extremely safe obligate anaerobic bacterium, has attracted attention.
  • -Bifidobacteria transformed to express cytosine deaminase, an enzyme that converts the fluoroduracil prodrug 5-fluorocytosine to 5-FU have been developed. (See Patent Documents 4 and 5)
  • this transformed bifidobacteria When this transformed bifidobacteria is administered intravenously to a solid tumor animal model of anaerobic disease, it is engrafted and propagated specifically in an anaerobic disease tissue under hypoxia, and in a normal tissue that is not in an anaerobic environment. It has the feature of disappearing quickly (see Non-Patent Documents 1 and 2).
  • angiogenesis therapy has been attempted to restore blood flow by developing neovascularization and collateral circulation.
  • angiogenesis therapy has three types of angiogenesis therapy, cell transplantation, protein administration, and gene therapy.
  • gene therapy has attracted attention from the viewpoint of minimally invasiveness.
  • genes encoding hepatocyte growth factor (HGF) or vascular endothelial growth factor (VEGF) are injected into the vicinity of the affected area by intramuscular injection or intraarterial injection. The blood flow is restored by promoting angiogenesis in the vicinity of the affected area (see, for example, Non-Patent Documents 3 and 4).
  • angiogenic therapies have attracted attention as one of the options for patients who cannot revascularize due to arteriolar level impairment or who are unable to perform surgery due to invasive problems.
  • many clinical trials have been conducted in recent years, particularly with respect to angiogenesis therapy by gene therapy.
  • the present invention relates to a gene transport carrier comprising an anaerobic bacterium capable of growing specifically in a site of ischemic disease and expressing at least one protein useful for diagnosis or treatment of ischemic disease, the gene It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition containing a transport carrier and a method for treating ischemic diseases using the same.
  • angiogenesis therapy using gene therapy is useful for treatment of ischemic diseases, but angiogenesis therapy using current gene therapy still has some problems.
  • the currently used gene transport carriers have no lesion site specificity and are systemically disseminated when administered systemically, so intramuscular injection or intraarterial injection is mainly used for transgene administration.
  • intramuscular injection or intraarterial injection is mainly used for transgene administration.
  • these methods are used, it cannot be said that the administration is specific to the ischemic disease site and is uniformly administered to the disease site, and ischemic sites and non-ischemic sites are mixed. If this is the case, a large amount of transgene is delivered to the non-ischemic site, and angiogenesis is promoted at the non-ischemic site. There is concern that the phenomenon will occur.
  • angiogenesis therapy is considered to have a significant advantage over other therapies in the elderly and diabetics because of its low invasiveness.
  • malignant tumors in the elderly may have complications that can be exacerbated by angiogenesis, so current angiogenesis therapy with low disease site specificity is limited to its indication There is.
  • a gene transport carrier comprising an anaerobic bacterium capable of growing in an ischemic disease site-specific manner and expressing at least one protein useful for diagnosis or treatment of ischemic disease.
  • Bifidobacteria are Bifidobacterium addressensetis, Bifidobacterium angratam, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium asteroides, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium boum , Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenuratam, Bifidobacterium coelinum, Bifidobacterium coryneforme, Bifidobacterium kunicli, Bifidobacterium denticorens, Bifidobacterium Dentium, Bifidobacterium gallcum, Bifidobacterium gallinarum, Bifidobacterium globosum, Bifidobacterium indicum, Bifidobacterium infantis, Bif Bacterium Inopinatum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium lactent
  • Proteins useful for the treatment of ischemic disease are fibroblast growth factor (FGF), endothelial growth factor (ECGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), hepatocyte growth factor (HGF) vascular growth factor (AGF), platelet-derived growth factor (PDGF), transforming growth factor ⁇ (TGF ⁇ ), angiopoietin, proteins having pro-angiogenic activity such as ephrin, factors related to vasodilation such as prostaglandins, granules Colony stimulating factors such as sphere colony stimulating factor (G-CSF), granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), neurotrophic factor
  • the gene transport carrier according to (2) to (9), wherein the transformation plasmid is a non-shuttle plasmid.
  • the gene transport carrier according to (2) to (10), wherein the transformation plasmid further comprises a gene sequence encoding a secretory signal peptide.
  • the gene transport carrier according to (2) to (11), wherein the plasmid for transformation contains a pTB6 rep unit.
  • the gene transport carrier according to (2) to (12), wherein the transformation plasmid has an expression cassette containing a gene encoding p37 promoter, HU terminator, and FGF2.
  • the gene transport carrier according to (2) to (13), wherein the transformed plasmid comprises a DNA sequence encoding a polypeptide having the sequence set forth in SEQ ID NO: 40.
  • the gene transport carrier according to (2) to (14), wherein the transformed plasmid is pFGF12a (SEQ ID NO: 38).
  • a pharmaceutical composition for ischemic disease comprising the gene transport carrier of (1) to (15).
  • An ischemic disease comprising administering an anaerobic bacterium capable of growing specifically in an ischemic disease site and expressing at least one protein useful for diagnosis or treatment of the ischemic disease. How to diagnose or treat. (19) The method according to (18), wherein the administration is systemic administration.
  • the gene delivery carrier of the present invention is an anaerobic bacterium, it is engrafted and proliferated specifically to an ischemic disease site in an anaerobic environment, and a protein having therapeutic activity for ischemic disease is produced in the diseased tissue. It can be secreted, is extremely useful as a therapeutic agent for ischemic diseases, and can be expected as a high-quality gene transport carrier.
  • it since it is engrafted specifically in the ischemic disease site, even if it is systemic administration such as intravenous injection, it is accumulated specifically in the ischemic disease site and exhibits an effect. Therefore, large doses and multiple doses are not required, and the burden on the administration subject can be reduced.
  • ischemia continues, it grows for a long time because the anaerobic environment of the ischemic disease site is maintained, but once the ischemia is ameliorated, it is no longer an anaerobic environment, so it cannot grow and quickly Disappear.
  • the gene delivery carrier of the present invention itself can express a protein useful for treatment, it is necessary to consider the efficiency of gene transfer into cells at or near ischemic sites as in the past. And can always exhibit high protein expression efficiency. Furthermore, since it is a carrier that is specifically delivered to an ischemic site, there is less risk of complications. Therefore, it is possible to perform angiogenesis treatment with higher safety and less invasiveness with fewer side effects and higher safety. Furthermore, by simultaneously expressing a marker on the gene delivery carrier of the present invention, it can also be used for ischemic site diagnosis and treatment monitoring. Furthermore, the gene carrier of the present invention can simultaneously deliver a plurality of genes, and it is considered that a more efficient and noninvasive treatment can be achieved by incorporating and administering a plurality of effective growth factors.
  • FIG. 1 is a graph showing a) a measurement image of a lower limb ischemic model mouse (ischemic b model) by a laser Doppler blood flow meter and b) a change in blood flow ratio (affected limb / healthy limb).
  • FIG. 2 is a graph comparing changes in the blood flow rate ratio between the group administered with the B. longum bacterium of the present invention and the group not administered with the ischemic model. There was no significant difference in changes in blood flow between the administration group and the non-administration group.
  • FIG. 3 is a photograph in which B. longum bacteria of the present invention present in samples collected from affected limbs and healthy limbs of the ischemic model local administration group were detected.
  • FIG. 4 is a graph showing the number of bacteria in the affected limb and healthy limb at the time point of 168 hours after administration of the ischemic model local administration group.
  • FIG. 5 is a graph showing changes in the number of B. longum bacteria in a healthy limb in the systemic administration group of ischemic model at a certain time point. In the systemic administration group, bacteria were hardly observed at 48 hours, and were not observed at 72 hours.
  • FIG. 6 is a graph showing the change in blood flow ratio and the change in the number of bacteria with respect to elapsed time in the affected limb of the ischemic model model systemic administration group. It is observed that the number of bacteria increases with the passage of time after administration, and the number of bacteria decreases with the recovery of blood flow to the ischemic site.
  • FIG. 7 is a Gram-stained image of muscle tissue at 4 days after administration in the ischemic model systemic administration group.
  • FIG. 8 is a graph showing changes over time in the affected limb / health limb blood flow ratio of the lower limb ischemic model mouse (ischemic model) and the lower limb necrosis model mouse (necrotic model). It can be seen that the necrotic model has a longer ischemic duration and less recovery.
  • FIG. 9 is a graph showing the change in blood flow ratio and the change in the number of bacteria with respect to the elapsed time in the affected limb of the necrotic model systemic administration group.
  • the number of bacteria increased with the passage of time after administration, and B. longum bacteria were engrafted and proliferated while the ischemic state persisted, and it was observed that the number of bacteria decreased with the recovery of blood flow to the ischemic site Is done.
  • FIG. 10 is a graph plotting the B. longum bacteria count against the affected limb / healthy limb blood flow ratio in the affected limb of the necrotic model systemic administration group. A state in which the number of bacteria decreases as the blood flow ratio increases is shown.
  • FIG. 10 is a graph plotting the B. longum bacteria count against the affected limb / healthy limb blood flow ratio in the affected limb of the necrotic model systemic administration group. A state in which the number of bacteria decreases as the blood flow ratio increases is shown.
  • FIG. 11 is a photograph showing the results of a test for detecting B. longum bacteria in affected limbs, lungs, kidneys, liver, spleen and heart in the systemic administration group of ischemic model.
  • the upper left is the ischemic limb
  • the upper middle is the lung
  • the upper right is the kidney
  • the lower left is the liver
  • the lower middle is the spleen
  • the lower left is the heart detection result.
  • FIG. 12 is a graph showing the number of B. longum bacteria per elapsed time in the affected limb, blood, kidney, liver, spleen, and heart of the necrotic model systemic administration group. Immediately after administration, some bacteria are observed, but then disappear quickly. No bacteria were detected in the blood.
  • FIG. 13 is a schematic diagram showing a ligation site and a bacterial administration site in a myocardial infarction model.
  • FIG. 14 is a diagram showing a stained image of the heart of a myocardial infarction model minipig. a) is a TTC-stained image, indicating that the infarcted part (the part indicated by the arrow in the figure) is not stained and is an infarcted part. b) and c) respectively represent an MT stained image and an HE stained image at a normal myocardial site and an infarcted site. In both stained images, cardiomyocyte shedding and fibrosis progression were observed at the infarct site.
  • FIG. 15 is a graph showing the number of B.
  • FIG. 16 is a diagram showing a scheme for constructing pFGF12a, which is one embodiment of a transformation plasmid for transforming the gene delivery carrier of the present invention.
  • FIG. 17 shows the results of Western blotting using the culture supernatant of Bifidobacterium longum 105A transformed with pFGF12a. Bifidobacterium longum105A transformed with pBEshuttle was used as a negative control, and hFGF2 was used as a positive control. A band is confirmed around 20 kDa, which is considered to be hFGF2.
  • FIG. 18 shows the results of Western blotting using the culture supernatant of Bifidobacterium breve JCM1192 transformed with pFGF12a.
  • Bifidobacterium breve JCM1192 transformed with pBEshuttle was used as a negative control, and hFGF2 was used as a positive control.
  • a band is also confirmed around 20 kDa, which is considered to be hFGF2.
  • FIG. 19 is a graph in which a pharmaceutical composition containing Bifidobacterium longum A105A / pFGF12a, which is a gene delivery carrier of the present invention, was intravenously injected into a mouse of a lower limb ischemia model and changes in blood flow at the lower limb ischemia site were observed. Although a slight difference in blood flow recovery has already occurred on the third day, the blood flow was significantly recovered in the group administered with the gene delivery carrier of the present invention after the sixth day.
  • FIG. 19 is a graph in which a pharmaceutical composition containing Bifidobacterium longum A105A / pFGF12a, which is a gene delivery carrier of the present invention, was intravenously injected into a mouse of a lower limb ischemia model and changes in blood flow at the lower limb ischemia site were observed. Although a slight difference in blood flow recovery has already occurred on the third day, the blood flow was significantly recovered in the group administered with the gene delivery carrier of the present invention after the sixth day.
  • FIG. 20 is a graph in which a pharmaceutical composition containing Bifidobacterium breve JCM1192 / pFGF12a, which is a gene delivery carrier of the present invention, was intravenously injected into a mouse of a lower limb ischemia model and changes in blood flow at the lower limb ischemia site were observed. Although a slight difference in blood flow recovery has already occurred on the 4th day, the blood flow was significantly recovered in the group administered with the gene delivery carrier of the present invention after the 8th day.
  • the present invention relates to a gene transport carrier comprising anaerobic bacteria capable of growing specifically in the site of ischemic disease and expressing at least one protein useful for diagnosis or treatment of ischemic disease.
  • ischemia means a state of oxygen / nutrient deficiency in the tissue due to a decrease in the amount of arterial blood supplied to the tissue due to stenosis or occlusion of the blood vessel. Cause degeneration, necrosis, etc.
  • the gene delivery carrier of the present invention is mainly used in a treatment method for ameliorating an undesirable condition caused by ischemia, such as angiogenesis therapy and organ protection. Therefore, in the present specification, “ischemic disease” refers to a state in which tissue ischemia continues due to arterial stenosis or occlusion, regardless of the presence or absence of subjective symptoms, or an unfavorable state caused by such ischemia. Say.
  • ischemic disease examples include, but are not limited to, ischemic heart disease such as angina pectoris and myocardial infarction, cerebral ischemia such as cerebral infarction, chronic cerebral ischemia such as moyamoya disease, spinal cord ischemia, Ischemic colitis, ischemic bowel diseases such as mesenteric artery occlusion, lower limb ischemia such as obstructive arteriosclerosis, retinal ischemia such as diabetic retinopathy, and the like.
  • ischemic heart disease such as angina pectoris and myocardial infarction
  • cerebral ischemia such as cerebral infarction
  • chronic cerebral ischemia such as moyamoya disease
  • spinal cord ischemia spinal cord ischemia
  • Ischemic colitis ischemic bowel diseases such as mesenteric artery occlusion
  • lower limb ischemia such as obstructive arteriosclerosis
  • retinal ischemia such as diabetic retinopathy, and the like.
  • ischemic site means a site where arterial blood volume, nutrition and oxygen are reduced due to ischemia, and is interchangeably used with “ischemic disease site” or “ischemic disease tissue”.
  • ischemic disease tissue used.
  • the “anaerobic bacterium” means a bacterium having an anaerobic property
  • the “anaerobic property” means a property capable of growing under conditions with little or no oxygen.
  • anaerobic bacteria can be classified into facultative anaerobes that can grow even in the presence of oxygen and obligate anaerobic bacteria that cannot grow in the presence of oxygen. Is preferred.
  • the anaerobic property of the anaerobic bacterium of the present invention may be a property inherent to bacteria or may be obtained by transformation.
  • the gene transport carrier of the present invention is composed of anaerobic bacteria, it can be specifically engrafted and proliferated at an ischemic disease site under anaerobic conditions. And since the gene transport carrier itself has gene transcription and translation functions, it is possible to express a protein useful for diagnosis or treatment at the time of engraftment in an ischemic disease tissue and supply it to the disease tissue. It is. Therefore, the gene transport carrier of the present invention contains a DNA sequence encoding a protein useful for diagnosis or treatment of ischemic disease.
  • the gene transport carrier is transformed with a transformation plasmid.
  • Any plasmid can be used as the plasmid for transformation as long as it functions in the fungus of the gene transport carrier and does not impair the anaerobic properties of the fungus.
  • the anaerobic property possessed by the anaerobic bacterium that is the gene transport carrier of the present invention may be obtained by transformation. Therefore, in one embodiment of the present invention, the anaerobic bacterium is obligatory. It has been transformed to become an anaerobic bacterium.
  • the gene transport carrier is transformed with a plasmid having a DNA sequence encoding a protein useful for diagnosis or treatment of ischemic disease.
  • an ischemic disease includes an acute ischemic disease in which tissue is damaged by a rapid decrease in oxygen concentration due to ischemia, and a tissue is degenerated or necrotic due to a continuous decrease in oxygen concentration over a long period of time.
  • Chronic ischemic disease that causes The gene delivery carrier of the present invention is preferably used for improving a chronic ischemic condition because it is selectively delivered to a disease site after administration, engrafts, and remains at the delivery site to develop an effect. It is done.
  • chronic ischemic condition is used interchangeably with “chronic ischemic disease”, but is not limited thereto, for example, ischemic heart diseases such as angina pectoris, myocardial infarction, Examples include chronic cerebral ischemia such as moyamoya disease and lower limb ischemia such as obstructive arteriosclerosis. Examples of treatment for improving chronic ischemic disease include, but are not limited to, angiogenesis therapy.
  • the gene transport carrier of the present invention Since the gene transport carrier of the present invention is premised on administration into the body, the anaerobic bacteria used need not be toxic or have low toxicity. Therefore, in one embodiment of the present invention, the gene transport carrier may be a pathogenic bacterium that has been mutated to low toxicity. However, a bacterium that has been mutated to low toxicity may be reversely mutated to return to the original pathogenic bacterium, and may exhibit harmful effects. Therefore, it is preferably a naturally non-pathogenic bacterium. Therefore, in a preferred embodiment of the present invention, the anaerobic bacteria use non-pathogenic enteric bacteria.
  • Bifidobacterium Bifidobacteria
  • Bifidobacteria Bifidobacterium addressentis, Bifidobacterium angratum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium asteroides, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium Um Boum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenuratam, Bifidobacterium coelinum, Bifidobacterium coryneforme, Bifidobacterium kunichli, Bifidobacterium denticorens, Bifido Bacterium Dentium, Bifidobacterium galcumum, Bifidobacterium galinarum, Bifidobacterium globosum, Bifidobacterium in
  • Bifidobacterium longum ATCC-15707 Bifidobacterium bifidum ATCC-11863, Bifidobacterium infantis ATCC-15697, etc. are easily available from ATCC (The American American Type Culture Collection). Can do.
  • the strain of each bacterium is not particularly limited.
  • Bifidobacterium longum strain Bifidobacterium longum 105-A strain
  • Bifidobacterium longum aE-194b strain examples include the Fidobacterium longum bs-601 strain and the Bifidobacterium longum M101-2 strain, with the Bifidobacterium longum 105-A strain being preferred.
  • Bifidobacterium breve strains examples include Bifidobacterium breve standard strain (JCM1192), Bifidobacterium breve aS-1 strain, and Bifidobacterium breve I-53-8W strain. Among them, the Bifidobacterium breve standard strain and the Bifidobacterium breve aS-1 strain are preferable.
  • Bifidobacterium infantis strains include Bifidobacterium infantis standard strain (JCM1222) and Bifidobacterium infantis I-10-5 strain. Bifidobacterium infantis standard strain and Bifidobacterium infantis I-10-5 strain are preferable.
  • Bifidobacterium lactentis strains include Bifidobacterium lactentis standard strain (JCM1220).
  • the gene transport carrier of the present invention is engrafted specifically in the ischemic disease site, it is possible to diagnose the ischemic disease site by detecting the presence of the gene transport carrier.
  • the detection of the gene transport carrier can be easily performed by labeling the gene transport carrier, for example. From the viewpoint of use in diagnosis of a disease, detection is preferably less invasive and preferably has less adverse effect on the delivery target due to the label. Therefore, in a preferred embodiment of the present invention, the gene transport carrier expresses a fluorescent protein as a protein useful for diagnosis. Examples of fluorescent proteins include various green fluorescent proteins (GFP) and red fluorescent proteins (RFP). As another preferred embodiment,
  • the gene transport carrier of the present invention engrafts specifically on the ischemic disease site, the protein expressed at the engraftment site is necessarily delivered specifically on the ischemic disease site. Therefore, an ischemic disease can be effectively treated by expressing the protein used for the treatment of ischemic disease in the gene transport carrier of the present invention. Accordingly, in a preferred embodiment of the present invention, the gene transport carrier expresses a protein useful for the treatment of ischemic disease.
  • proteins useful for the treatment of ischemic diseases include, but are not limited to, proteins having angiogenesis-promoting activity, proteins involved in vasodilation, and the like.
  • proteins having angiogenesis-promoting activity include, but are not limited to, fibroblast growth factor (FGF), endothelial growth factor (ECGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), hepatocyte growth factor (HGF), vascular growth factor (AGF), platelet-derived growth factor (PDGF), transforming growth factor ⁇ (TGF ⁇ ), angiopoietin, ephrin and the like.
  • FGF fibroblast growth factor
  • ECGF endothelial growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • AGF vascular growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • TGF ⁇ transforming growth factor ⁇
  • angiopoietin ephrin
  • Prostaglandins are involved in vas
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony stimulating factor
  • NGF nerve growth factor
  • BDNF brain-derived neurotrophic Factors
  • neurotrophins such as neurotrophin 3, insulin-like growth factor (IGF), and the like.
  • the plasmid that can be used for transformation of the gene transport carrier of the present invention may be any plasmid as long as it functions in the fungus of the gene transport carrier and does not impair the anaerobic properties of the fungus.
  • the plasmid used for transformation in the delivery target body is horizontally transmitted to another bacterium in the body, for example, E. coli, and in this case, the plasmid is replicated in another horizontally transmitted bacterium.
  • the risk of expressing the protein encoded by the plasmid at an unintended site cannot be denied.
  • the transforming plasmid is a non-shuttle plasmid.
  • shuttle plasmid means a plasmid that can replicate in two or more different hosts, and is used interchangeably with “shuttle vector plasmid”.
  • non-shuttle plasmid means a plasmid that can replicate in only one host.
  • the gene transport carrier of the present invention produces a protein encoded by a transformation plasmid in the microbial cell, but since such protein has a therapeutic effect only after being released outside the microbial cell, In order to exert a therapeutic effect using a protein that is not secreted, it is necessary to kill bacteria.
  • the transformation plasmid further comprises a gene sequence encoding a secretory signal peptide.
  • secretory signal peptide means a peptide sequence present at the end of a protein having a function of secreting a protein produced in the microbial cell to the outside of the microbial cell.
  • secretory signal peptides include, but are not limited to, amyB of Bifidobacterium adrescentis and Sec1, Sec2, and Sec3 of Bifidobacterium breve, SEQ ID NOS: 1-22. And a peptide encoded by the DNA sequence.
  • the gene transport carrier of the present invention can be prepared, for example, as follows.
  • at least one kind of desired ischemic disease diagnosis or treatment is performed on a shuttle plasmid having a replication origin that functions in transformed bacteria and non-transformed bacteria, for example, bifidobacteria and E. coli, respectively.
  • a shuttle plasmid can be prepared by inserting a gene encoding a protein useful for.
  • a non-shuttle plasmid can be prepared by removing the replication origin of bacteria other than transformed bacteria from this shuttle plasmid. Further, if desired, the promoter gene is replaced with a secretion signal that functions at least in bifidobacteria and its promoter gene, and the terminator gene is replaced with the terminator gene of the secretory signal peptide that functions in the bifidobacteria. A plasmid containing the gene sequence encoding the peptide can be generated.
  • operation in each said process can be performed according to the well-known method of the field of genetic engineering.
  • any anaerobic bacterium to be transformed can be produced by transforming according to a known method in the field of genetic engineering using the transformation plasmid.
  • the present invention further relates to a pharmaceutical composition for ischemic disease comprising the gene transport carrier.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as it contains the gene transport carrier of the present invention.
  • the gene transport carrier of the present invention may be contained in at least one kind, and may be contained in two or more kinds.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used in combination with a pharmaceutical composition or a therapeutic agent for ischemic disease containing a compound having an effect of treating ischemic disease other than the gene transport carrier of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain any component in addition to the gene transport carrier of the present invention as long as the effects of the present invention are not hindered.
  • optional components include pharmacologically acceptable carriers, excipients, diluents and the like.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a liquid or solid preparation containing the gene transport carrier of the present invention.
  • the solution is prepared by purifying the anaerobic bacteria culture medium of the gene carrier of the present invention, and adding an appropriate physiological saline solution or a replacement solution or a pharmaceutical additive to the ampule or a vial as necessary. Can be manufactured.
  • an appropriate protective agent is added to the liquid and filled into ampoules or vials, and then lyophilized or L-dried, or an appropriate protective agent is added to the liquid and lyophilized or L-dried. This can be manufactured by filling ampules or vials.
  • parenteral administration is preferred, and for example, intravenous injection, subcutaneous injection, local injection, intraventricular administration, etc. can be performed, Most preferred is intravenous injection, ie systemic administration.
  • the dosage of the gene transport carrier of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as it can grow at a disease site and is sufficient to express an effective therapeutic amount of an active protein. From the viewpoint of avoiding side effects as much as possible, it is preferable that the amount is as small as possible within a range in which a necessary therapeutic effect can be obtained.
  • the dosage of the gene transport carrier in the pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately selected according to the degree of disease, the patient's weight, age, and sex, and can be increased or decreased as appropriate according to the degree of improvement.
  • the disease treatment activity exhibited by the anaerobic bacteria used, the type of protein having disease treatment activity produced by the anaerobic bacteria used, and the anaerobic bacteria used sets suitably according to the production amount of the said active protein, etc.
  • the anaerobic bacterium of the present invention is divided into 10 6 to 10 12 cfu per 1 kg of body weight 1 to several times a day, one to several days continuously or at appropriate intervals. And administer. More specifically, a preparation containing 10 4 to 10 10 cfu / mL of the bifidobacteria cells of the present invention is diluted 1 to 1000 mL per adult directly or with an appropriate supplemental solution, 1 day per day. Divide into several times and administer continuously for 1 to several days.
  • the bifidobacteria of the present invention may be administered at 10 6 to 10 12 cfu per kg of body weight 1 to several times a day, one or more days as necessary, continuously or at appropriate intervals. And administer.
  • a preparation containing 10 4 to 10 10 cfu / mL of the bifidobacteria of the present invention is directly applied 1 to 1000 mL per adult several times a day, if necessary, for 1 to several days continuously. To administer.
  • “combined with X and Y” includes any of X and Y in different forms, and X and Y in the same form (for example, a form containing X and Y). Including cases. In the case where X and Y are in different forms, the case where both X and Y further contain other components is also included.
  • the gene delivery carrier of the present invention engrafts and proliferates specifically to the ischemic disease site, and does not proliferate in normal tissues that are not in an anaerobic environment. Therefore, a gene is delivered in a disease site-specific manner without local administration aiming at the ischemic disease site. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention is preferably administered systemically from the viewpoints of ease of administration and low invasiveness.
  • One aspect of the present invention includes a method for diagnosing or treating an ischemic disease using a gene transport carrier comprising the above anaerobic bacteria.
  • the gene transport carrier of the present invention is administered to a subject having an ischemic disease.
  • an administration method both oral administration and parenteral administration are possible, but parenteral administration is preferable.
  • intravenous injection, subcutaneous injection, local injection, intraventricular administration, etc. can be performed. Most preferred.
  • the gene transport carrier of the present invention is administered systemically. Since the gene transport carrier of the present invention can deliver a gene in an ischemic disease site-specific manner, even if it is administered systemically such as intravenous injection without using a catheter or intramuscular injection, it is ischemic. Engraft and proliferate in the diseased area and exert its effect. Therefore, treatment that is very less invasive than conventional treatment methods is possible.
  • Example 1 Mouse lower limb ischemia model experiment
  • a mouse model of lower limb ischemia was prepared and the gene delivery carrier of the present invention was administered. And examined.
  • the popliteal artery from the common femoral artery was ligated with 7-0 polypropylene thread, and the femoral artery was excised. After the wound was washed with physiological saline, the wound was sutured with 5-0 nylon thread.
  • B. longum bacteria transformed with the pBLES100 plasmid to become spectinomycin-resistant bacteria were subcultured twice in MRS medium (obtained from Kanto Chemical Co., Inc.). The culture solution that had been subcultured twice was subjected to centrifugal washing with physiological saline and suspended in physiological saline for use.
  • MRS medium obtained from Kanto Chemical Co., Inc.
  • the culture solution that had been subcultured twice was subjected to centrifugal washing with physiological saline and suspended in physiological saline for use.
  • the B. Longum bacterium was administered to the ischemic limb and the healthy limb by intramuscular injection at 1 ⁇ 10 9 cfu / ml ⁇ 0.1 ml ⁇ 2 sites.
  • Example 2 Mouse lower limb necrosis model experiment (1) Model preparation In Example 1, it was suggested that the number of B. longum engraftment decreased with the recovery of blood flow. To confirm this, more A necrotic model mouse, a model of severe ischemia, was prepared. The experimental animals used were 6-7 weeks old male BALB / c mice (available from Charles River, Japan). For anesthesia, 0.3 ml of 3.6% chloral hydrate (Nacalai Tesque) was injected intraperitoneally. After removing the hair from the abdomen and the lower leg, the femoral artery was ligated with 7-0 polypropylene thread from the common femoral artery to the superficial femoral artery. After the wound was washed with physiological saline, the wound was sutured with 5-0 nylon thread.
  • Example 2 Blood flow measurement with a laser Doppler blood flow meter As in Example 1, blood flow was measured. The results are shown in FIG. The necrotic model has a slower blood flow recovery timing than the ischemic model, and the final blood flow is about 30% compared to the healthy limb, compared to the ischemic model where the blood flow recovers to about 60%. Even so, it was found that the degree of recovery was as low as about half.
  • B. longum was systemically administered in the same manner as in Example 1, and the healthy limbs and affected limb muscle tissues were examined. The results are shown in FIGS. In the necrotic model, it was found that B. longum bacteria were present in the affected limb over a longer period of time compared to the ischemic model. As with the ischemic model, the number of bacteria decreased with the recovery of blood flow, and when the blood flow recovered to some extent, the bacteria were not observed. From the above results, B.
  • longum bacteria are engrafted and proliferated in the affected limb during the ischemic state for any period of time, and blood flow recovery (ie, ischemic state) It was found that the number of bacteria began to decrease with the recovery from Therefore, B. longum is specifically delivered to tissues in ischemic state, expresses the introduced gene, and has the property of disappearing with the recovery of ischemic state, and is excellent in the diagnosis and treatment of ischemic diseases Expect to be effective.
  • Example 4 Representative ischemic diseases by mini-pig myocardial infarction model test include ischemic heart diseases such as myocardial infarction. Recently, angiogenesis treatment, especially angiogenesis by gene transfer, ischemic heart diseases. Treatment is being attempted. However, problems similar to those in other ischemic diseases can be mentioned in the treatment of ischemic heart diseases. Especially in ischemic heart disease, local administration requires very highly invasive methods such as arterial injection using a coronary catheter, local injection using a coronary catheter, and intrathoracic intramyocardial injection. Although the therapy may be particularly beneficial for subjects to whom other therapies such as percutaneous coronary angioplasty (PCI), coronary artery bypass grafting (CABG) cannot be applied, other therapies are currently available The combination with is mainly.
  • PCI percutaneous coronary angioplasty
  • CABG coronary artery bypass grafting
  • the model experimental animal used was a male Göttingen minipig (15 kg) (obtained from Chugai Medical Research Institute). Ketalar (obtained from Sankyo Co., Ltd.) 15 mg / kg and atropine sulfate (obtained from Tanabe Seiyaku Co., Ltd.) (25 mg) were injected intramuscularly, followed by inhalation anesthesia Frocene (obtained from Takeda Pharmaceutical Company Limited) (2% -5 %) Maintained anesthesia. After thoracotomy, the left anterior descending coronary artery was ligated with 3-0 silk thread.
  • 2% xylocaine obtained from AstraZeneca (1 ml to 2 ml) was administered.
  • the inside of the pericardium was washed with 100 ml of Lactec (obtained from Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.).
  • TTC staining was performed by slicing a heart removed 7 days after the preparation of myocardial infarction model to a thickness of 5 mm and incubating at 37 ° C. for 5 minutes in 1% TTC solution (obtained from SIGMA). Thereafter, it was visually observed.
  • Hematoxylin and eosin (HE) staining was deparaffinized, stained with hematoxylin for 30 seconds to 1 minute, washed with running water for 10 minutes, and then stained with 0.5% eosin solution for 30 seconds. After staining, dehydration, clearing and sealing were carried out, and observed with an optical microscope.
  • Masson / Trichrome (MT) staining was performed by rinsing with running water for 10 minutes after fixing each section with Buan. After washing with water, it was immersed in a mixed solution of 10% potassium dichromate and 10% trichloracetic acid in an equal amount for 10 minutes, then immersed in iron hematoxylin staining solution for 5 minutes, and washed with running water for 5 minutes. After washing with water, it was immersed in a ponsoic acid fuchsin azofuroxin solution for 1 minute and then immersed in a 2.5% phosphotungstic acid solution for 10 minutes.
  • the sections were immersed in 2% orange G solution for 5 minutes, washed with 1% aqueous acetic acid, stained with light green liquid for 3 minutes, and washed with 1% aqueous acetic acid. Dehydration, penetration, and encapsulation were performed in the same process as HE staining.
  • TTC staining revealed a transmural infarcted area from the anterior wall of the left ventricle and the ventricular septum.
  • MT and HE staining confirmed that the myocardial infarction had been completed by confirming the loss of cardiomyocytes at the same site and the increase of collagen fibers.
  • Example 5 Construction of non-shuttle hFGF2 expression plasmid for Bifidobacterium (1) Construction of expression plasmid vector p37 Using the plasmid pCDshuttle (International Application No. 2009/128272) as a template, CDvecF3 primer (SEQ ID NO: 23) and pUCoriR5 primer (SEQ ID NO: 24) The PCR product was used as a vector. A PCR product amplified with the Pins37F primer (SEQ ID NO: 25) and Pins37R primer (SEQ ID NO: 26) using Bifidobacterium 1ongum 105A genomic DNA as a template was used as an insert. PCR was performed by a conventional method.
  • the above vector and insert are connected using In-Fusion HD Cloning Kit and Cloning Enhancer (Takara Bio Inc.) (hereinafter referred to as in-fusion reaction), and a portion of the reaction solution is used to produce E. coli TOP10 chemically competent cell (Life Technologies Japan Co., Ltd.) was transformed. Details followed the product instructions.
  • the transformed Escherichia coli was applied to LB (75 ⁇ g / mL spectinomycin-containing) agar medium and statically cultured at 37 ° C. overnight. The well-separated colonies on the plate were picked up and cultured overnight at 37 ° C. in LB (75 ⁇ g / mL spectinomycin-containing) liquid medium.
  • PCR was performed using the FGF1 primer (SEQ ID NO: 27) and FGF7 primer (SEQ ID NO: 28), and the P37 promoter (SEQ ID NO: 29), Hu terminator, pTB6 replicon (plasmid in Bifidobacteria)
  • a DNA of about 3.8 kbp consisting of a replicon), an AAD9 cassette (spectrinomycin resistance gene expression unit), and a pUCori portion (plasmid replication origin in E. coli) was amplified and used as a vector.
  • Primers were designed so that the end 15 bp of the vector had the same sequence as the insert end 15 bp shown below.
  • PrimeSTAR HS Premix
  • PCR conditions were in accordance with the product instructions for the enzyme.
  • the insert was prepared as follows. That is, based on the amino acid sequence of hFGF2 (a protein of about 18 kDa which started translation from AUG of GenBank Accession No. # NM_002006), DNA whose codon was optimized for Bifidobacteria was artificially synthesized (requested by GenScript). At that time, DNA was designed such that a histidine tag was fused to the C-terminus of the hFGF2-encoding protein (SEQ ID NO: 30).
  • PCR amplification was performed in the same manner as described above using the FGF3 primer (SEQ ID NO: 31) and FGF4 primer (SEQ ID NO: 32), and a DNA amplification product of about 0.5 kbp was used as an insert.
  • the above vector and insert were connected by In-fusion reaction. For details, follow the product instructions.
  • the In-fusion reaction solution was appropriately diluted with 0.1 ⁇ TE, and 2 ⁇ L of the solution was used to transform E. coli TOP10 chemically competent cell (Life Technologies Japan). Details followed the product instructions.
  • the transformed Escherichia coli was applied to LB (75 ⁇ g / mL spectinomycin-containing) agar medium and statically cultured at 37 ° C. overnight.
  • the well-separated colonies on the plate were picked up and cultured overnight at 37 ° C. in an LB (75 ⁇ g / mL spectinomycin-containing) liquid medium, and then QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen Co., Ltd.) was used. Plasmid DNA was extracted. A part of the plasmid DNA was used to confirm the DNA sequence of the hFGF2 expression unit. For the sequencing reaction, BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Life Technologies Japan Co., Ltd.) was used, and details were in accordance with the product manual. Electrophoresis of the sequencing reaction solution was requested from the Shinshu University Human Environmental Science Support Center, Instrument Analysis Department. GenetyxGVer.10 was used for data analysis. The completed plasmid was named pFGF-P37 (SEQ ID NO: 33).
  • FIG. 16 shows an outline of construction of human FGF2 expression (secretory) plasmid pFGF12a. PCR was performed using the above plasmid pFGF-P37 as a template and FGF35 primer (SEQ ID NO: 34) and FGF26 primer (SEQ ID NO: 35), and a DNA amplification product of about 4.2 kbp was used as a vector.
  • PCR was performed using the genomic DNA of the Bifidobacterium longum 105A strain as a template with the FGF45 primer (SEQ ID NO: 36) and FGF17 primer (SEQ ID NO: 37), and a DNA amplification product of about 0.2 kbp was used as an insert.
  • the insert contains a secretion signal and the N-terminal sequence of Sec2 of B. breve UCC2003 (see Shkoporov AN et. Al., Biotechnol Lett (2008) 30: 1983-1988) is well conserved.
  • PrimeSTAR HS Premix
  • the vector and the insert were ligated by an in-fusion reaction, E. coli TOP10 was transformed, and the DNA sequence of the hFGF2 expression unit portion of the plasmid was confirmed.
  • the name of the completed plasmid was designated as pFGF12a (SEQ ID NO: 38).
  • the structure of the hFGF2 expression unit portion is as follows.
  • P37 promoter base numbers 14 to 275 of SEQ ID NO: 38
  • FGF2 coding region structure base numbers 276 to 902 of SEQ ID NO: 38
  • Signal sequence base numbers 276 to 419 of SEQ ID NO: 38
  • FGF2 sequence base numbers 420 to 881 of SEQ ID NO: 38
  • Histidine tag sequence base numbers 882 to 899 of SEQ ID NO: 38
  • Stop codon base numbers 900 to 902 of SEQ ID NO: 38
  • Hu terminator base numbers 903 to 1016 of SEQ ID NO: 38
  • FGF2 coding region structure amino acid numbers 1 to 208 of SEQ ID NO: 40
  • Signal sequence amino acid numbers 1 to 48 of SEQ ID NO: 40 (of which amino acid numbers 1 to 37 are putative signal peptide regions, amino acid numbers 38 to 48 are putative spacer regions, and between amino acid numbers 37 and 38 are Estimated cutting location)
  • FGF2 sequence amino acid numbers 49 to 202 of SEQ ID NO: 40
  • Histidine tag sequence amino acid numbers 203 to 208 of SEQ ID NO: 40
  • Electroporation was performed. Electroporation was performed using a 0.2 cm gap cuvette under the conditions of 2 kV, 25 ⁇ F, and 200 ⁇ . The transformed bifidobacteria were applied to an IMR (75 ⁇ g / mL spectinomycin-containing) agar medium and anaerobically cultured at 37 ° C. for 2 days. A well-separated colony formed on the agar medium was fished to obtain recombinant bifidobacteria.
  • IMR 75 ⁇ g / mL spectinomycin-containing
  • Bifidobacterium breve JCM1192 / pFGF12a and Bifidobacterium breve JCM1192 / pBEshuttle were also cultured.
  • RCM medium was used instead of MRS medium.
  • No vitamin C / cysteine solution was added.
  • the recombinant bifidobacteria culture supernatant was trichloroacetic acid (TCA) precipitated according to a conventional method and redissolved in 1 ⁇ SDS sample buffer. This was heat-treated at 95 ° C. for 3 minutes and subjected to Western analysis.
  • TCA trichloroacetic acid
  • the sample was electrophoresed with 1 ⁇ SDS buffer using a mini-PROTEAN TGX gel (4-20%, Bio-Rad).
  • Mini PROTEAN Tetra System Bio-Rad
  • the gel after electrophoresis was transferred to iBlot Transfer Stacks using iBlot Gel Transfer Device. After the transfer, the membrane was washed 3 times with TTBS for about 5 minutes and then blocked with a 2% blocking solution (Block Ace).
  • Anti-FGF-2-human rabbit poly H-131, Santa Cruz Biotechnology Inc. was added as a primary antibody and shaken overnight at 4 ° C.
  • the membrane was washed with TTBS for about 5 minutes about 6 times, and the secondary antibody Goat anti-rabbit IgG HRP (Santa Cruz Biotechnology) Inc.) was added and shaken at room temperature for 3.5 hours.
  • This membrane was washed with TTBS for about 5 minutes 6 times, and then light was emitted with a luminescent reagent in ECL Advance Western Blotting Detection Kit (manufactured by GE Healthcare). This was detected with an imaging analyzer (Fluor-S MAX, Bio-Rad) (FIGS. 17 and 18).
  • the culture supernatant was prepared by the same method as described above before the TCA precipitation step, and the amount of hFGF2 was quantified using a human FGF2 ELISA kit (Quantikine® ELISA Human FGF basic Immunoassay, R & D systems, catalog number: DFB50).
  • the amount of hFGF2 in the culture supernatant was 33,058 pg / mL with B. longum 105A / pFGF12a, and 0 pg / mL with B. longum 105A / pBEshuttle as the negative control.
  • Example 6 Verification of therapeutic effect in vivo by mouse lower limb ischemia model
  • a mouse model of lower limb ischemia was prepared and human FGF2 secretion was observed.
  • Bifidobacteria were administered and examined.
  • the common femoral artery, deep femoral artery, and superficial femoral artery were ligated with 8-0 polypropylene thread, and the superficial femoral artery was partially excised. After the wound was washed with physiological saline, the wound was sutured with 5-0 nylon thread.
  • FIGS. FIG. 19 shows the blood flow improvement effect of human FGF2-secreting B. longum
  • FIG. 20 shows the effect of human FGF2-secreting B. breve.
  • Human FGF2-secreting B. longum bacteria showed a significant improvement in blood flow compared to the PBS group after the 6th day.
  • Longum FGF12a vs. PBS 0.41 ⁇ 0.11 vs. 0.14 ⁇ 0.02 on day 6; 0.55 ⁇ 0.11 vs. 0.32 ⁇ 0.08 on day 8
  • FGF2-secreting B. breve bacteria showed a significant blood flow improvement effect on the 8th day.
  • Breve FGF12a vs. breve control 0.67 ⁇ 0.11 vs. 0.38 ⁇ 0.02
  • the gene delivery carrier of the present invention can provide a gene delivery carrier that specifically engrafts and proliferates at an ischemic disease site and disappears with improvement of the disease state. Therefore, it becomes possible to perform angiogenesis therapy in a less invasive and simple manner as compared with conventional methods.
  • the gene delivery carrier itself is made of bacteria, the efficiency of gene introduction into the target site is not a problem, and it is possible to perform a very high-efficiency treatment as compared with the prior art. This makes it possible to effectively treat subjects such as elderly people who could not be treated due to high invasiveness or systemic side effects, although angiogenesis therapy should be effective.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

　全身投与によっても病変部位のみに特異的に集積し、高いタンパク質発現率を有し、治癒とともに病変部位から消失する遺伝子輸送担体およびそれを用いた虚血性疾患の治療方法を提供することを目的とする。　虚血性疾患部位特異的に生育でき、かつ、少なくとも１種の、虚血性疾患の診断もしくは治療に有用なタンパク質を発現することができる、嫌気性菌からなる遺伝子輸送担体、該遺伝子輸送担体を含む医薬組成物、およびこれらを利用した虚血性疾患の治療方法を提供することにより、上記課題が解決された。

Description

虚血性疾患治療薬
　本発明は、虚血性疾患部位を特異的に治療することができる遺伝子輸送担体、医薬組成物およびそれらを用いる虚血性疾患の治療方法に関する。
　近年、悪性腫瘍の治療方法において、形質転換嫌気性菌を遺伝子輸送担体として用いる方法が注目され、例えば、形質転換したクロストリジウムを用いて、抗腫瘍物質のプロドラッグを抗腫瘍物質に変換する酵素のニトロリダクターゼの発現遺伝子を腫瘍部位へ輸送する方法などが提案されている（特許文献１～３参照）。
　ところが、従来これらの目的で用いられている微生物はいずれも病原性の菌を低毒性に変異化したものであり、逆変異化して元の病原性菌に戻り、有害性を発揮する可能性が否定できず、さらに、運動性、侵襲性のため、疾患組織のみでなく正常組織においても作用を発現して全身性の副作用症状を生じるおそれがあるなど、安全性において問題性が懸念される。
　そこで、ヒトの腸内に存在してフローラを形成する非病原性の腸内細菌で、極めて安全な偏性嫌気性細菌であることが知られているビフィズス菌が注目され、抗腫瘍物質の５－フルオロウラシルのプロドラッグの５－フルオロシトシンを５－ＦＵに変換する酵素のシトシン・デアミナーゼを発現するように形質転換したビフィズス菌が開発された。（特許文献４、５参照）
　この形質転換ビフィズス菌は、これを嫌気的疾患の固形腫瘍動物モデルに静脈内投与した場合、低酸素状態の嫌気的疾患組織特異的に生着、増殖し、嫌気的環境下にない正常組織では速やかに消失するという特長を有している（非特許文献１、２参照）。
　一方、虚血性疾患の治療、特に重症虚血の治療において、血管の新生や側副血行を発達させることで血流を回復しようという血管新生療法が試みられている。血管新生療法は、大別すると細胞移植、タンパク投与および遺伝子治療の３種の治療法があるが、低侵襲性の観点から、近年特に遺伝子治療が注目されている。遺伝子治療による血管新生においては、例えば肝細胞増殖因子（hepatocyte growth factor：ＨＧＦ）や血管内皮増殖因子（vascular endothelial growth factor：ＶＥＧＦ）などをコードする遺伝子を、患部付近に筋肉内注射や動脈内注入によって導入し、患部付近の血管新生を促すことにより血流を回復させる（例えば非特許文献３、４参照）。
　これらの血管新生療法は、細動脈レベルの障害により血行再建ができないかまたは効果が不十分である患者や、侵襲性の問題により外科的治療が行えない患者などに対する選択肢の一つとして注目されてきており、特に遺伝子治療による血管新生療法に関しては、近年多くの臨床試験が行われている。
米国特許第６４１６７５４号明細書 米国特許第６６５２８４９号明細書 米国特許出願公開２００３／０１０３９５２号明細書 特開２００２－９７１４４号公報 国際公開第２００７－１３６１０７号
Yazawa et al., Cancer Gene Therapy, Vol. 7, No. 2, 2000: pp 269-274 Yazawa et al., Breast Cancer Research and Treatment, Vol. 66, 2001: pp 165-170 Gupta et al., Circ. Res. 2009;105:724-736 Morishita et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2011;31:713-720
　本発明は、虚血性疾患部位特異的に生育でき、かつ、少なくとも１種の、虚血性疾患の診断もしくは治療に有用なタンパク質を発現することができる、嫌気性菌からなる遺伝子輸送担体、該遺伝子輸送担体を含む医薬組成物、およびこれらを利用した虚血性疾患の治療方法を提供することを目的とする。
　上述のとおり、遺伝子治療を利用した血管新生療法は、虚血性疾患の治療に有用ではあるが、現在の遺伝子治療を利用した血管新生療法は依然としていくつかの問題点を有している。第一に、現在用いられている遺伝子輸送担体には病変部位特異性がなく、全身投与した場合には全身播種されてしまうため、導入遺伝子の投与には筋肉内注射または動脈内注入が主に用いられているが、これらの投与方法では、虚血疾患部位特異的、且つ、疾患部位に均一に投与されているとはいえず、さらには虚血部位と非虚血部位とが混在している場合、非虚血部位に導入遺伝子が多く送達されてしまい、非虚血部位での血管新生が促進されてしまうことにより、結果として虚血部位においてさらに血行が悪化するという、スティール現象と呼ばれる現象が起こってしまうことが懸念される。
　第二に、ベクターによる遺伝子導入によって目的タンパク質を疾患部位において発現させることを前提とした治療方法であるため、遺伝子導入効率や導入遺伝子の発現期間のコントロールが困難であることが挙げられる。したがって投与しても十分に導入されず効果を発揮しない、疾患の寛解前に導入遺伝子の発現がなくなる、寛解後も導入遺伝子が発現し続けるといった問題がある。
　第三に、血管新生療法はその低侵襲性から高齢者や糖尿病罹患者などにおいて他の治療法よりも大きな優位性を有すると考えられるが、これらの患者においては、例えば糖尿病罹患者であれば糖尿病性網膜症、高齢者であれば悪性腫瘍など、血管新生によって症状が悪化し得る合併症を有していることがあるため、疾患部位特異性の低い現状の血管新生療法ではその適応に制限がある。
　本発明者らは、全身投与によっても病変部位のみに特異的に集積し、高いタンパク質発現率を有し、治癒とともに病変部位から消失するベクターによってこれらの問題が全て解決されることに想到し、鋭意研究を重ねた結果本発明を完成させるに至った。
　すなわち本発明は、以下に関する。
（１）虚血性疾患部位特異的に生育でき、かつ、少なくとも１種の、虚血性疾患の診断もしくは治療に有用なタンパク質を発現することができる嫌気性菌からなる遺伝子輸送担体。
（２）嫌気性菌が、形質転換用プラスミドで形質転換されたものであり、該プラスミドが虚血性疾患の診断もしくは治療に有用なタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む、（１）の遺伝子輸送担体。
（３）虚血性疾患が、慢性虚血性疾患である、（１）または（２）の遺伝子輸送担体。
（４）嫌気性菌が、非病原性の腸内細菌である、（１）～（３）の遺伝子輸送担体。
（５）嫌気性菌が、ビフィズス菌である、（１）～（４）の遺伝子輸送担体。
（６）ビフィズス菌が、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・アングラタム、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ビフィドバクテリウム・アステロイデス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ボウム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・カテヌラタム、ビフィドバクテリウム・コエリナム、ビフィドバクテリウム・コリネフォルメ、ビフィドバクテリウム・クニクリ、ビフィドバクテリウム・デンティコレンス、ビフィドバクテリウム・デンティウム、ビフィドバクテリウム・ガリクム、ビフィドバクテリウム・ガリナラム、ビフィドバクテリウム・グロボサム、ビフィドバクテリウム・インディクム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・イノピナタム、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・ラクテンティス、ビフィドバクテリウム・リベロラム、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・マグナム、ビフィドバクテリウム・メリシクム、ビフィドバクテリウム・ミニマム、ビフィドバクテリウム・モンゴリエンス、ビフィドバクテリウム・パルブロラム、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラタム、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム、ビフィドバクテリウム・サイクラエロフィラム、ビフィドバクテリウム・プロラム、ビフィドバクテリウム・ルミナレ、ビフィドバクテリウム・ルミナンチウム、ビフィドバクテリウム・サエクラレ、ビフィドバクテリウム・スカルドヴィ、ビフィドバクテリウム・サブタイル、ビフィドバクテリウム・スイス、ビフィドバクテリウム・テルマシドフィラム、およびビフィドバクテリウム・サーモフィラムからなる群より選ばれる１種である、（５）の遺伝子輸送担体。
（７）ビフィズス菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガムである、（６）の遺伝子輸送担体。
（８）虚血性疾患の診断に有用なタンパク質が、蛍光タンパク質である、（１）～（７）の遺伝子輸送担体。
（９）虚血性疾患の治療に有用なタンパク質が、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）血管増殖因子（ＡＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、アンギオポイエチン、エフリンなどの血管新生促進活性を有するタンパク質、プロスタグランジン類などの血管拡張に関与する因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３などのニューロトロフィン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）からなる群から選ばれる一種である、（１）～（７）の遺伝子輸送担体。
（１０）形質転換用プラスミドが、非シャトルプラスミドである、（２）～（９）の遺伝子輸送担体。
（１１）形質転換用プラスミドが、さらに分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子配列を含む、（２）～（１０）の遺伝子輸送担体。
（１２）形質転換用プラスミドが、ｐＴＢ６　ｒｅｐユニットを含む、（２）～（１１）の遺伝子輸送担体。
（１３）形質転換プラスミドが、ｐ３７プロモーター、ＨＵターミネーター、およびＦＧＦ２をコードする遺伝子を含む発現カセットを有する、（２）～（１２）の遺伝子輸送担体。
（１４）形質転換プラスミドが、配列番号４０に記載の配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む、（２）～（１３）の遺伝子輸送担体。
（１５）形質転換プラスミドが、pFGF12a（配列番号３８）である、（２）～（１４）の遺伝子輸送担体。
（１６）（１）～（１５）の遺伝子輸送担体を含む、虚血性疾患用医薬組成物。
（１７）全身投与により投与される、（１６）の医薬組成物。
（１８）虚血性疾患部位特異的に生育でき、かつ、少なくとも１種の、虚血性疾患の診断または治療に有用なタンパク質を発現することができる嫌気性菌を投与することを含む、虚血性疾患を診断または処置する方法。
（１９）投与が、全身投与である、（１８）の方法。
　本発明の遺伝子送達担体は嫌気性菌であるため、嫌気的環境下にある虚血性疾患部位特異的に生着、増殖し、当該疾患組織において、虚血性疾患の治療活性を有するタンパク質を産生、分泌させることができ、虚血性疾患治療剤として極めて有用で、高品質の遺伝子輸送担体として期待できる。また、虚血性疾患部位特異的に生着するため、静脈注射などの全身投与であっても虚血性疾患部位に特異的に集積して効果を発揮するものである。したがって、大量投与や複数回の投与が必要なく、投与対象の負担を軽減できる。さらに、虚血が持続する間は虚血性疾患部位の嫌気的環境が維持されるため長期的に生育するが、いったん虚血が寛解すればもはや嫌気的環境ではなくなるため、生育できなくなって速やかに消失する。
　さらに本発明の遺伝子送達担体は、遺伝子送達担体そのものが治療に有用なタンパク質を発現することが可能であるため、従来のように虚血性部位またはその近傍の細胞への遺伝子導入効率を考える必要がなく、常に高いタンパク質発現効率を発揮することができる。さらに、虚血性部位に特異的に送達される担体であるため、合併症の危険性も少ない。したがって、従来よりもさらに低侵襲性で副作用も少なく、安全性の高い血管新生治療を施すことが可能となる。さらに、本発明の遺伝子送達担体にマーカーを同時に発現させることにより、虚血性部位の診断や処置のモニターに用いることも可能である。さらに、本発明の遺伝子担体は複数の遺伝子を同時に送達することが可能であり、複数の有効な増殖因子を組み込み投与することによって、より効率的かつ非侵襲的な治療が可能となると考えられる。
図１は、ａ）下肢虚血モデルマウス（ischemic model）のレーザードップラー血流計による測定イメージおよびｂ）血流量比（患肢／健肢）の変化を表したグラフである。 図２は、ischemic modelにおいて、本発明のB.longum菌を投与した群と投与しなかった群とで、血流量比の変化を比較したグラフである。投与群と非投与群では、血流量の変化に有意差は見られなかった。 図３はischemic model局所投与群の患肢と健肢から採取したサンプル中に存在する本発明のB.longum菌を検出した写真である。患肢においては投与後１６８時間経過時点でも多くの菌が観察されたのに対し、健肢ではほとんど観察されなかった。 図４は、ischemic model局所投与群の投与後１６８時間経過時点における患肢と健肢での菌数をそれぞれグラフに表したものである。
図５は、ischemic model全身投与群の健肢における一定の時間経過時点のB.longum菌の菌数変化をグラフにしたものである。全身投与群においても、４８時間経過時点では菌はほとんど観察されず、７２時間経過時点では観察されなかった。 図６は、ischemic model全身投与群の患肢における、経過時間に対する血流比の変化および菌数の変化をグラフにしたものである。投与後時間の経過とともに菌数が増大し、虚血部位への血流の回復とともに菌数が減少していく様子が観察される。 図７は、ischemic model全身投与群における、投与後４日経過時点での筋組織のグラム染色像である。健肢にはグラム染色された菌は観察されなかったのに対し、患肢では多くのグラム染色菌が観察された。 図８は、下肢虚血モデルマウス（ischemic model）と下肢壊死モデルマウス（necrotic model）の患肢／健肢血流比の時間変化を表すグラフである。necrotic modelの方が、虚血状態継続時間が長く、回復の程度も低いことがわかる。
図９は、necrotic model全身投与群の患肢における、経過時間に対する血流比の変化および菌数の変化をグラフにしたものである。投与後時間の経過とともに菌数が増大し、虚血状態が持続する間B.longum菌が生着・増殖し、虚血部位への血流の回復とともに菌数が減少していく様子が観察される。 図１０は、necrotic model全身投与群の患肢における、患肢／健肢血流比に対するB.longum菌数をプロットした図である。血流比の増加とともに菌数が減少している様子が表れている。 図１１は、ischemic model全身投与群の患肢、肺、腎臓、肝臓、脾臓および心臓中のB.longum菌検出試験の結果を表す写真である。上段左上が虚血肢、上段真ん中が肺、上段右が腎臓、下段左が肝臓、下段真ん中が脾臓、下段左が心臓の検出結果である。全身投与によっても、虚血性疾患部位である患肢以外の臓器では、投与したB.longum菌は観察されなかった。 図１２は、necrotic model全身投与群の患肢、血液、腎臓、肝臓、脾臓および心臓中の、経過時間ごとのB.longum菌数を表すグラフである。投与直後は菌が多少観察されるものの、その後速やかに消失することがわかる。血液からは菌が検出されなかった。
図１３は、心筋梗塞モデルの結紮部位および菌の投与箇所を表す模式図である。 図１４は、心筋梗塞モデルミニブタの心臓の染色像を表す図である。ａ）はＴＴＣ染色像であり、梗塞部位（図中矢印で示した部分）が染色されておらず、梗塞部位であることを示している。ｂ）、ｃ）はそれぞれ、正常心筋部位および梗塞部位におけるＭＴ染色像、ＨＥ染色像を表す。どちらの染色像でも、梗塞部位において心筋細胞の脱落および線維化の進行が観察された。 図１５は、心筋梗塞モデルにおけるB.longum菌投与後４日および７日経過時点の、梗塞部位および健常部位でのB.longum菌数を表すグラフである。４日経過時点では健常部位においてもわずかに菌が観察されたものの、７日経過時点においては梗塞部位においてのみ菌が観察された。
図１６は、本発明の遺伝子送達担体を形質転換する形質転換プラスミドの一態様であるpFGF12a構築のスキームを表した図である。 図１７は、pFGF12aで形質転換したBifidobacterium longum 105Aの培養上清を用いたウェスタンブロッティングの結果を表す。ネガティブコントロールとしてpBEshuttleで形質転換したBifidobacterium longum105Aを用い、ポジティブコントロールとしてｈＦＧＦ２を用いた。２０ｋＤａ近辺にバンドが確認され、これはｈＦＧＦ２であると考えられる。 図１８は、pFGF12aで形質転換したBifidobacterium breve JCM1192の培養上清を用いたウェスタンブロッティングの結果を表す。ネガティブコントロールとしてpBEshuttleで形質転換したBifidobacterium breve JCM1192を用い、ポジティブコントロールとしてｈＦＧＦ２を用いた。やはり２０ｋＤａ近辺にバンドが確認され、これはｈＦＧＦ２であると考えられる。
図１９は、本発明の遺伝子送達担体であるBifidobacterium longum 105A/pFGF12aを含む医薬組成物を下肢虚血モデルのマウスに静脈注射し、下肢虚血部位における血流の変化を観察したグラフである。３日目においてすでにわずかに血流回復に差が生じているが、６日目以降には、本発明の遺伝子送達担体を投与した群において有意に血流が回復していた。 図２０は、本発明の遺伝子送達担体であるBifidobacterium breve JCM1192/pFGF12aを含む医薬組成物を下肢虚血モデルのマウスに静脈注射し、下肢虚血部位における血流の変化を観察したグラフである。４日目においてすでにわずかに血流回復に差が生じているが、８日目以降には、本発明の遺伝子送達担体を投与した群において有意に血流が回復していた。
　本発明は、虚血性疾患部位特異的に生育でき、かつ、少なくとも１種の、虚血性疾患の診断もしくは治療に有用なタンパク質を発現することができる嫌気性菌からなる遺伝子輸送担体に関する。
　本発明において、「虚血」とは、血管の狭窄や閉塞により、組織に供給される動脈血量が減少することによる組織の酸素・栄養欠乏状態を意味し、持続的な虚血は組織の萎縮や変性、壊死などを生じる。
　本発明の遺伝子送達担体は、主に血管新生治療、臓器の保護など、虚血によって引き起こされる好ましくない状態を改善する処置法において用いられるものである。したがって本明細書において「虚血性疾患」とは、自覚症状の有無に拘わらず、動脈の狭窄や閉塞により、組織の虚血が持続している状態、またはかかる虚血により引き起こされる好ましくない状態をいう。虚血性疾患としては、これに限定するものではないが例えば、狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患、脳梗塞などの脳虚血、もやもや病などの慢性脳虚血、脊髄虚血、虚血性大腸炎、腸間膜動脈閉塞症などの虚血性腸疾患、閉塞性動脈硬化症などの下肢虚血、糖尿病網膜症などの網膜虚血などが挙げられる。
　本明細書において「虚血性部位」とは、虚血によって動脈血量、栄養および酸素が減少している状態の部位を意味し、「虚血性疾患部位」または「虚血性疾患組織」と互換的に用いられる。
　本明細書において、「嫌気性菌」とは、嫌気的性質を有する細菌を意味し、「嫌気的性質」とは、酸素が少ないまたはない条件下で生育可能な性質を意味する。一般的に嫌気性菌は、酸素の存在下でも生育可能な通性嫌気性菌と、酸素の存在下では生育できない偏性嫌気性菌とに分類できるが、本発明においては偏性嫌気性菌が好ましい。本発明の嫌気性菌が有する嫌気的性質は、細菌が生来有する性質であっても、形質転換によって得られたものであってもよい。
　本発明の遺伝子輸送担体は、嫌気性菌からなるものであるため、嫌気的条件下にある虚血性疾患部位で特異的に生着、増殖することが可能である。そして、遺伝子輸送担体そのものが遺伝子の転写、翻訳機能を有しているため、虚血性疾患組織に生着した時点で診断もしくは治療に有用なタンパク質を発現し、当該疾患組織に供給することが可能である。したがって、本発明の遺伝子輸送担体は、虚血性疾患の診断もしくは治療に有用なタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んでいる。
　本発明の一態様において、遺伝子輸送担体は形質転換用プラスミドで形質転換されている。形質転換用プラスミドとしては、遺伝子輸送担体の菌中で機能し、該菌の嫌気的性質を損なうものでなければ、いかなるプラスミドも用い得る。
　上述の通り、本発明の遺伝子輸送担体である嫌気性菌が有する嫌気的性質は、形質転換によって得られたものであってもよく、したがって本発明の一態様において、嫌気性菌は、偏性嫌気性菌となるように形質転換されたものである。
　本発明の好ましい態様において、遺伝子輸送担体は、虚血性疾患の診断もしくは治療に有用なタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドによって形質転換されている。虚血性疾患の診断もしくは治療に有用なタンパク質を発現する能力を形質転換によって与えることにより、プラスミドの設計次第で任意のタンパク質を発現させることが可能となる。
　本発明において、虚血性疾患には、虚血による急激な酸素濃度の低下によって組織にダメージが与えられる急性虚血性疾患と、長時間にわたる持続的な酸素濃度の低下により、組織が変性、壊死などを引き起こす慢性虚血性疾患とが包含される。本発明の遺伝子送達担体は、投与の後、疾患部位に選択的に送達され、生着し、送達部位に留まって効果を発現するため、好ましくは慢性的な虚血状態を改善するために用いられる。本明細書において、「慢性的な虚血状態」は「慢性虚血性疾患」と互換的に用いられ、これに限定するものではないが例えば、狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患、もやもや病などの慢性脳虚血、閉塞性動脈硬化症などの下肢虚血などが挙げられる。慢性虚血性疾患の改善処置としては、これに限定するものではないが、例えば血管新生療法などが挙げられる。
　本発明の遺伝子輸送担体は、体内に投与することを前提とするものであるから、用いられる嫌気性菌は毒性を有さないかまたは毒性が低いものである必要がある。したがって、本発明の一態様において、遺伝子輸送担体は、病原性の菌を低毒性に変異化したものであり得る。しかしながら、低毒性に変異化した細菌は、逆変異化して元の病原性菌に戻り、有害性を発揮する可能性があるため、生来的に非病原性の細菌であることが好ましい。したがって、本発明の好ましい態様において、嫌気性菌は非病原性の腸内細菌を用いる。
　本発明に用い得る非病原性腸内細菌としては、好ましくはビフィドバクテリウム属菌（ビフィズス菌）が挙げられる。ビフィドバクテリウム属細菌としては、例えばビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・アングラタム、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ビフィドバクテリウム・アステロイデス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ボウム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・カテヌラタム、ビフィドバクテリウム・コエリナム、ビフィドバクテリウム・コリネフォルメ、ビフィドバクテリウム・クニクリ、ビフィドバクテリウム・デンティコレンス、ビフィドバクテリウム・デンティウム、ビフィドバクテリウム・ガリクム、ビフィドバクテリウム・ガリナラム、ビフィドバクテリウム・グロボサム、ビフィドバクテリウム・インディクム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・イノピナタム、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・ラクテンティス、ビフィドバクテリウム・リベロラム、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・マグナム、ビフィドバクテリウム・メリシクム、ビフィドバクテリウム・ミニマム、ビフィドバクテリウム・モンゴリエンス、ビフィドバクテリウム・パルブロラム、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラタム、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム、ビフィドバクテリウム・サイクラエロフィラム、ビフィドバクテリウム・プロラム、ビフィドバクテリウム・ルミナレ、ビフィドバクテリウム・ルミナンチウム、ビフィドバクテリウム・サエクラレ、ビフィドバクテリウム・スカルドヴィ、ビフィドバクテリウム・サブタイル、ビフィドバクテリウム・スイス、ビフィドバクテリウム・テルマシドフィラム、ビフィドバクテリウム・サーモフィラムなどが挙げられ、ビフィドバクテリウム・ロンガムが最も好ましい。
　これらの菌は、いずれも市販されているか、または寄託機関から容易に入手することができる。例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ－１５７０７、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＡＴＣＣ－１１８６３、ビフィドバクテリウム・インファンティスＡＴＣＣ－１５６９７等は、ＡＴＣＣ（The American Type Culture Collection ）から容易に入手することができる。
　また、それぞれの菌の株についても特に限定されず、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムの株については、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５－Ａ株、ビフィドバクテリウム・ロンガムａＥ－１９４ｂ株、ビフィドバクテリウム・ロンガムｂｓ－６０１株、ビフィドバクテリウム・ロンガムＭ１０１－２株を挙げることができ、中でもビフィドバクテリウム・ロンガム１０５－Ａ株が好ましい。
　ビフィドバクテリウム・ブレーベの株については、例えば、ビフィドバクテリウム・ブレーベ標準株（ＪＣＭ１１９２）、ビフィドバクテリウム・ブレーベａＳ－１株、ビフィドバクテリウム・ブレーベＩ－５３－８Ｗ株を挙げることができ、中でも、ビフィドバクテリウム・ブレーベ標準株、ビフィドバクテリウム・ブレーベａＳ－１株が好ましい。
　ビフィドバクテリウム・インファンティスの株については、例えば、ビフィドバクテリウム・インファンティス標準株（ＪＣＭ１２２２）、ビフィドバクテリウム・インファンティスＩ－１０－５株を挙げることができ、中でも、ビフィドバクテリウム・インファンティス標準株、ビフィドバクテリウム・インファンティスＩ－１０－５株が好ましい。
　また、ビフィドバクテリウム・ラクテンティスの株については、例えば、ビフィドバクテリウム・ラクテンティス標準株（ＪＣＭ１２２０）を挙げることができる。
　本発明の遺伝子輸送担体は、虚血性疾患部位特異的に生着するため、該遺伝子輸送担体の存在を検出することで、虚血性疾患部位を診断することが可能となる。遺伝子輸送担体の検出は、例えば遺伝子輸送担体を標識することにより簡便に行うことができる。疾患の診断に用いるという観点から、検出は侵襲性が少ないことが好ましく、標識による送達対象への悪影響が少ないことが好ましい。したがって、本発明の好ましい態様において、遺伝子輸送担体は、診断に有用なタンパク質として蛍光タンパク質を発現する。蛍光タンパク質としては、各種の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）などを挙げることができる。別の好ましい態様としては、
　本発明の遺伝子輸送担体は、虚血性疾患部位特異的に生着するため、生着部位で発現したタンパク質は必然的に虚血性疾患部位特異的に送達されることとなる。したがって、本発明の遺伝子輸送担体に、虚血性疾患の治療に用いるタンパク質を発現させることにより、効果的に虚血性疾患を処置することができる。したがって本発明の好ましい態様において、遺伝子輸送担体は、虚血性疾患の治療に有用なタンパク質を発現する。
　虚血性疾患の治療に有用なタンパク質としては、これに限定するものではないが、例えば血管新生促進活性を有するタンパク質、血管拡張に関与するタンパク質などが挙げられる。血管新生促進活性を有するタンパク質としては、これに限定するものではないが、例えば線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管増殖因子（ＡＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、アンギオポイエチン、エフリンなどが挙げられ、血管拡張に関与する因子としては、プロスタグランジン類などが挙げられる。他の治療に有用なタンパク質としては、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３などのニューロトロフィン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）などが挙げられる。
　本発明の遺伝子輸送担体の形質転換に用い得るプラスミドは、上述の通り、遺伝子輸送担体の菌中で機能し、該菌の嫌気的性質を損なうものでなければ、いかなるプラスミドであってもよい。しかしながら、送達対象の体内において、形質転換に用いたプラスミドが、例えば大腸菌など、体内の別の細菌に水平伝達される可能性があり、その場合、水平伝達された別の細菌でプラスミドが複製され、その結果意図しない部位でプラスミドがコードするタンパク質が発現する危険性が否定できない。したがって、好ましい態様において、形質転換プラスミドは非シャトルプラスミドである。
　本明細書において、「シャトルプラスミド」とは、２種以上の異なる宿主において複製可能なプラスミドを意味し、「シャトルベクタープラスミド」と互換的に用いられる。したがって、「非シャトルプラスミド」とは、１種の宿主のみにおいて複製可能なプラスミドを意味する。
　本発明の遺伝子輸送担体は、形質転換プラスミドによってコードされるタンパク質を菌体中で産生するが、かかるタンパク質は菌体外に放出されて初めて治療効果を奏するものであるため、通常菌体外に分泌されないタンパク質を用いて治療効果を発揮させるためには、菌を殺破壊する必要がある。この問題を解消するため、好ましい態様において、形質転換用プラスミドは、さらに分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子配列を含む。
　本明細書において、「分泌シグナルペプチド」とは、菌体内で産生されたタンパク質を菌体外に分泌させる機能を有する、タンパク質の末端に存在するペプチド配列を意味する。用い得る分泌シグナルペプチドとしては、これに限定するものではないが、例えば、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスのａｍｙＢやビフィドバクテリウム・ブレーベのＳｅｃ１、Ｓｅｃ２、Ｓｅｃ３、配列番号１～２２に記載のＤＮＡ配列によってコードされるペプチドなどが挙げられる。
　本発明の遺伝子輸送担体は、例えば、以下のようにして作製することができる。
　例えば、通常の手法に従って、形質転換菌と形質転換菌以外の菌、例えばビフィズス菌と大腸菌でそれぞれ機能する複製開始点を有するシャトルプラスミドに、少なくとも１種の、所望の虚血性疾患の診断または治療に有用な蛋白質をコードする遺伝子を挿入する事により、シャトルプラスミドを作製することができる。
　そして、所望に応じて、このシャトルプラスミドから形質転換菌以外の菌の複製開始点を除去することにより、非シャトルプラスミドを作製することができる。
　さらに、所望に応じて、プロモーター遺伝子を、少なくともビフィズス菌で機能する分泌シグナルおよびそのプロモーター遺伝子に代え、ターミネーター遺伝子を、前記ビフィズス菌で機能する分泌シグナルペプチドのターミネーター遺伝子に代えることにより、さらに分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子配列を含むプラスミドを作製することができる。
　なお、上記各工程における操作は、遺伝子工学分野の公知の方法に準じて行うことができる。
　そして、形質転換する任意の嫌気性菌を、上記形質転換用プラスミドを用いて、遺伝子工学分野の公知の方法にしたがって形質転換する事により作製することができる。
　本発明はさらに、上記遺伝子輸送担体を含む、虚血性疾患用医薬組成物に関する。
　本発明の医薬組成物は、本発明の遺伝子輸送担体を含有している限り特に制限はされない。本発明の遺伝子輸送担体は、少なくとも１種含まれていればよく、２種以上含まれていてもよい。さらに、本発明の医薬組成物は、本発明の遺伝子輸送担体以外の虚血性疾患治療効果を示す化合物を含有する医薬組成物や虚血性疾患治療剤と組み合わせて用いることができる。
　また、本発明の医薬組成物は、本発明の効果を妨げない限り、本発明の遺伝子輸送担体のほかに任意の成分を含有していてもよい。そのような任意成分として、例えば、薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤等が挙げられる。
　本発明の医薬組成物の剤型は特に制限されないが、例えば、本発明の遺伝子輸送担体を含有する液剤あるいは固形製剤を挙げることができる。液剤は、本発明の遺伝子輸送担体の嫌気性菌の培養液を精製し、これに必要に応じて適当な生理食塩液もしくは補液または医薬添加物を加えてアンプルまたはバイアル瓶などに充填することにより製造することができる。また、固形製剤は、液剤に適当な保護剤を添加してアンプルまたはバイアル瓶などに充填した後凍結乾燥またはＬ乾燥するか、液剤に適当な保護剤を添加して凍結乾燥またはＬ乾燥した後これをアンプルまたはバイアル瓶などに充填することにより製造することができる。
　本発明の医薬組成物の投与方法としては、経口投与、非経口投与共に可能であるが、非経口投与が好ましく、例えば静脈注射、皮下注射、局所注入、脳室内投与等を行うことができ、静脈注射、すなわち全身投与が最も好ましい。
　本発明の医薬組成物の遺伝子輸送担体の投与量は、疾患部位において生育でき、且つ、有効治療量の活性タンパク質を発現するのに十分な量である限り特に制限はされないが、経済上の観点および副作用を可能な限り回避する観点から、必要な治療効果が得られる範囲においてできる限り少ない方が好ましい。
　本発明の医薬組成物における遺伝子輸送担体の投与量は、疾患の程度、患者の体重、年齢、性別に応じて適宜選択し、改善の度合いに応じて適宜増減することができる。
　例えば、本発明の医薬組成物を用いる際には、用いる嫌気性菌の菌自体が示す疾患治療活性、用いる嫌気性菌が産生する疾患治療活性を有するタンパク質等の種類、および用いる嫌気性菌の当該活性タンパク質の産生量などによって、適宜設定する。
　具体的には、例えば静脈内投与の場合には、特に、菌塊による塞栓等のリスクを低減することが求められるため、できるだけ低濃度の注射用製剤を複数回に分けて分注するか、または適当な補液で希釈して持続注入することが好ましい。例えば、成人の場合、本発明の嫌気性菌の菌体を、体重１ｋｇ当たり１０６～１０１２ｃｆｕを１日１～複数回に分け、１～複数日間、連続してまたは適宜、間隔をおいて投与する。より具体的には、本発明のビフィズス菌の菌体を１０４～１０１０ｃｆｕ／ｍＬ含有する製剤を、成人１人あたり１～１０００ｍＬを直接、または適当な補液で希釈して、１日１～数回に分け、１～数日連続して投与する。
　また、疾患組織へ直接投与する局所投与の場合は、できるだけ疾患組織全体へ菌が生着、増殖することが求められるため、高濃度の注射剤を、疾患組織の複数個所に投与することが望ましい。例えば、成人の場合、本発明のビフィズス菌の菌体を、体重１ｋｇ当たり１０６～１０１２ｃｆｕを１日１～複数回、必要に応じ１～複数日間、連続してまたは適宜、間隔をおいて投与する。より具体的には、本発明のビフィズス菌の菌体を１０４～１０１０ｃｆｕ／ｍＬ含有する製剤を、成人１人あたり１～１０００ｍＬを直接、１日数回、必要に応じ１～数日連続して投与する。
　治療期間中に疾患組織中の菌が消失していることが確認された場合は、一旦治療を中断し、上記と同様にして菌を投与する。
　なお、本発明における「ＸとＹと組み合わせてなる」には、ＸとＹを別の形態としたもの、ＸとＹを同一の形態（例えばＸとＹを含有する形態）としたもののいずれの場合も含む。また、ＸとＹを別の形態としたものの場合、Ｘ、Ｙのいずれも他の成分をさらに含有している場合も含まれる。
　本発明の遺伝子送達担体は、虚血性疾患部位特異的に生着、増殖するものであり、嫌気的環境下にない正常組織においては増殖することがない。したがって、虚血性疾患部位を狙った局所投与でなくても、疾患部位特異的に遺伝子が送達される。したがって、投与の簡便さ、侵襲性の低さなどの観点から、好ましくは、本発明の医薬組成物は全身投与される。
　本発明の一側面には、上記の嫌気性菌からなる遺伝子輸送担体を用いて虚血性疾患を診断または処置する方法が含まれる。本発明の遺伝子輸送担体を用いることにより、高効率で安全性の高い診断または治療が可能となる。
　本発明の方法において、本発明の遺伝子輸送担体を、虚血性疾患を有する対象に投与する。投与方法としては、経口投与、非経口投与共に可能であるが、非経口投与が好ましく、例えば静脈注射、皮下注射、局所注入、脳室内投与等を行うことができ、静脈注射、すなわち全身投与が最も好ましい。
　したがって、本発明の方法の好ましい一態様において、本発明の遺伝子輸送担体を全身投与する。本発明の遺伝子輸送担体は、遺伝子を虚血性疾患部位特異的に送達することができるため、カテーテルや筋肉内注射などを用いずに、静脈注射などの全身投与した場合であっても、虚血性疾患部位に生着、増殖して効果を発揮することができる。したがって、従来の治療法と比較しても非常に侵襲性が低い治療が可能となる。
　以下、参考例および実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
例１：マウス下肢虚血モデル実験
　本発明の遺伝子送達担体の、虚血性疾患部位への特異的送達性を検証するため、下肢虚血のマウスモデルを作製し、本発明の遺伝子送達担体を投与して検討した。
（１）モデル作製
　実験動物は８－９週齢、オスのＣ５７ＢＬ／６マウス（日本チャールズリバー社より入手）を使用し、以下の手順で下肢虚血モデル（ischemic model）マウスを作製した。麻酔は３．６％抱水クロラール（ナカライテスク株式会社より入手）を腹腔内に０．３ｍｌ注射した。腹部から下腿の除毛を行ったのち総大腿動脈から膝窩動脈を７－０ポリプロピレン糸にて結紮し、大腿動脈を切除した。創内を生理食塩水で洗浄後、創を５－０ナイロン糸にて縫合した。
（２）レーザードップラー血流計による血流測定
　マウスを麻酔後、レーザードップラー血流計（Moor Instruments社製）を用いて、（３）の下肢筋肉摘出前に血流測定を行った。下腿部から指先までの血流を両側について定量し、患側／健側比にて表した。血流測定はモデル作製直前、直後、１、２、３、４、５、７、１０、１４、２１、２８日後に行った。
　結果を図１および２に示す。かかる下肢虚血モデルにおいては、術後健肢に対する患肢の血流量が２割以下となるが、術後１週間で４割程度まで回復し、術後４週間では６割程度まで回復した（図１）。（３）でB.longum菌を投与した群と投与していない群とで、血流の変化を比較した。投与群と非投与群では、術後の血流変化の挙動に有意な差は観察されず（図２）、B.longum菌の存在は虚血状態に影響を与えないことがわかった。
（３）B.longum菌の投与および検出
　pBLES100プラスミドで形質転換し、スペクチノマイシン耐性菌としたB.longum菌をＭＲＳ培地（関東化学株式会社より入手）で２回継代した。２回継代した培養液を、生理食塩水を用いて遠心洗浄を行い、生理食塩水で懸濁して使用した。局所投与モデルとして、下肢虚血モデル作製直後に虚血肢および健肢にそれぞれ上記B. Longum菌を１×１０９ｃｆｕ／ｍｌ×０．１ｍｌ×２ヶ所筋肉内注射投与した。全身投与モデルとして、尾静脈にB.longum菌を１×１０９ｃｆｕ／ｍｌの濃度で０．２ｍｌ投与した。菌を投与してから１、２、３、４、５、７、１０、１４日後に、各投与モデルの、左右それぞれの下肢筋肉を摘出した（各ｎ＝５）。各組織をホモジナイズした後、ＢＬプレートに塗布して３７℃、嫌気的条件下で３日間培養した。培養後に各プレートのコロニー数を測定し、虚血肢および健肢の菌数を求めた。
　結果を図３～図６に示す。局所投与の場合、術後２４時間経過の時点で、健肢に比べ患肢でより多数の菌の集積を認めた。健肢ではその後時間経過に伴って菌数の減少がみられ、術後１６８時間経過の時点では菌はほとんど観察されなかった。それに対し患肢では術後１６８時間経過時点でも多くの菌が観察された。術後１６８時間経過時点での筋肉組織１ｇあたりの菌数は、健肢が４．８×１０２個であったのに対し、患肢では４．１×１０６個と、有意に差が見られた（ｐ＝０．０３９、ｎ＝３）（図３および４）。
　同様の結果が全身投与の場合においても観察された。すなわち、健肢においては術後２４時間経過時点では約０．６×１０３個の菌が観察されたものの、術後４８時間経過時点では約０．１×１０３個となり、術後７２時間経過時点では観察されなかった。それに対し患肢では、術後２４時間には約３．５×１０５個もの菌が観察され、時間経過とともにその数が増大し、術後４日経過の時点で最大で約２．７×１０６個ほどの菌が観察された。その後血流の回復とともに菌数は減少し、術後１０日の時点では観察されなかった（図５および６）。局所投与の場合と比較して全身投与は、菌の生着に多少時間がかかるものの、静脈への投与であっても虚血性疾患部位に特異的に生着することがわかった。血流比が最低となる４日目で菌数が最高値を示し、その後血流比の改善に伴い菌数が低下することから、B.longum菌は虚血の程度にしたがって生育する可能性が示唆された。
（４）組織学的解析
　（３）と同様にマウスへB.longum菌を投与した後、９６時間後に下肢筋肉を摘出した。下肢筋肉を２０％中性緩衝ホルマリンに４８時間浸し組織を固定した。その後パラフィン包埋しパラフィンブロックとした。パラフィンブロックを３μｍの厚さにカットし、スライドガラスにのせて２４時間４４℃で風乾し、パラフィン組織切片スライドとした。脱パラフィン後グラム染色を行った。グラム染色はグラム染色液neo-B＆Mワコー（和光純薬工業株式会社）を用いた。染色後、光学顕微鏡で観察した。
　結果を図６に示す。健肢においてはグラム染色された菌は検出されなかったが、患肢においてはグラム染色された細菌が観察され、投与したB.longum菌が生着していることが確認された。
例２：マウス下肢壊死モデル実験
（１）モデル作製
　例１において、血流の回復とともにB.longum菌の生着数が減少していることが示唆されたが、このことを確認するため、より重度の虚血状態のモデルである下肢壊死モデル（necrotic model）マウスを作製した。実験動物は６－７週齢、オスのＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールズリバー社より入手）を使用した。麻酔は３．６％抱水クロラール（ナカライテスク株式会社）を腹腔内に０．３ｍｌ注射した。腹部から下腿の除毛を行ったのち総大腿動脈から浅大腿動脈までを７－０ポリプロピレン糸にて結紮し、大腿動脈を切除した。創内を生理食塩水で洗浄後、創を５－０ナイロン糸にて縫合した。
（２）レーザードップラー血流計による血流測定
　例１と同様に、血流を測定した。結果を図８に示す。necrotic modelはischemic modelと比較して血流回復のタイミングが遅く、最終的な血流量も健肢と比較して約３０％程度であり、約６０％程度まで血流が回復するischemic modelと比較しても、回復の程度が半分程度と低いことがわかった。
（３）B.longum菌の投与および検出
　例１と同様にB.longum菌を全身投与し、健肢および患肢筋肉組織を検査した。結果を図９および１０に示す。necrotic modelでは、ischemic modelと比較して長期間にわたってB.longum菌が患肢に存在することがわかった。そしてischemic modelと同様、血流の回復とともに菌数が減少し、ある程度血流が回復した時点で菌が観察されなくなった。以上の結果から、B.longum菌は、どの程度の期間であっても、虚血状態が持続している間は患肢において生着、増殖しており、血流の回復（すなわち虚血状態からの回復）とともに菌数が減少を始めることがわかった。したがって、B.longum菌は虚血状態にある組織に特異的に送達され、導入した遺伝子を発現し、虚血状態の回復とともに消失する性質を有し、虚血性疾患の診断および治療において優れた効果を発揮することが期待できる。
例３：安全性試験
　上述の下肢虚血モデル（ischemic model）マウスおよび下肢壊死モデル（necrotic model）マウス両者について安全性試験を行った。菌を投与してから２，３，４，６，７日後に、各投与モデルの、腎臓、肝臓、脾臓、心臓を摘出した（各ｎ＝３）。またこれらの臓器に加え、ischemic modelでは肺を、necrotic modelでは血液をさらに摘出した。各組織をホモジナイズした後、ＢＬプレートに塗布して３７℃、嫌気的条件下で３日間培養した。培養後に各プレートのコロニー数を測定し、各組織の菌数を求めた。
　結果を図１１および１２に示す。ischemic modelにおいては全身投与１６８時間後には、患肢以外のいずれの臓器においてもB.longum菌は観察されなかった。necrotic modelにおいても、全身投与３日後までは全身の各臓器でB.longum菌が観察されたものの、６日後には脾臓以外の臓器では観察されなくなった。また、投与群と非投与群を比較しても、下肢潰瘍形成率および膿瘍形成率に有意な差は認められず、膿瘍からB.longum菌が優位に分離されることもなかった。以上の結果から、B.longum菌は、健常な臓器からは速やかに消失し、また虚血状態そのものや併発症の悪化など、疾患に対して悪影響を及ぼすものでもないことがわかった。
例４：ミニブタ心筋梗塞モデル試験
　別の代表的な虚血性疾患としては心筋梗塞などの虚血性心疾患が挙げられるが、近年虚血性心疾患に対しても血管新生治療、特に遺伝子導入による血管新生治療が試みられている。しかしながら他の虚血性疾患における問題点と同様の問題点が虚血性心疾患の治療においても挙げられる。特に虚血性心疾患においては、局所投与法としては冠動脈カテーテルを用いた動脈注射、冠動脈カテーテルを用いた局所注射、開胸下心筋内注射など、非常に高侵襲な方法が必要であり、血管新生療法は経皮的冠動脈形成術（ＰＣＩ）、冠動脈バイパス術（ＣＡＢＧ）などの他の治療法の適用ができない対象に対して特に恩恵があると考えられるにもかかわらず、現時点では他の治療法との併用が主となっている。
　そこで、心筋梗塞においても本発明の遺伝子送達担体が有効に機能することを確認するため、以下の通り実験を行った。
（１）モデル作製
実験動物は、オスのゲッチンゲン系ミニブタ（１５ｋｇ）（中外医科学研究所より入手）を使用した。ケタラール（三共株式会社より入手）１５ｍｇ／ｋｇと硫酸アトロピン（田辺製薬株式会社より入手）（２５ｍｇ）を筋肉注射したのち、吸入麻酔であるフローセン（武田薬品工業株式会社より入手）（２％～５％）により麻酔状態を維持した。開胸後、左冠状動脈前下行枝を３－０シルク糸で結紮した。術中に２％キシロカイン（アストラゼネカ株式会社より入手）（１ｍｌ～２ｍｌ）を投与した。閉胸前にラクテック（大塚製薬株式会社より入手）１００ｍｌで心嚢内を洗浄した。
（２）組織学的解析
　心筋梗塞確認のために塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）染色、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色およびマッソン・トリクローム（ＭＴ）染色を行った。ＴＴＣ染色は心筋梗塞モデル作製７日後に摘出した心臓を５ｍｍの厚さにスライスし、１％ＴＴＣ液（ＳＩＧＭＡより入手）中、３７℃で５分インキュベーションした。その後、肉眼的に観察した。
　ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色は脱パラフィン後、ヘマトキシリンで３０秒から１分間染色し、流水にて１０分間洗浄した後、０．５％エオジン溶液で３０秒染色した。染色後、脱水、透徹および封入し、光学顕微鏡で観察した。
　マッソン・トリクローム（ＭＴ）染色は各切片をブアン固定したあと流水水洗を１０分間行った。水洗後、１０％重クロム酸カリウム１０％トリクロール酢酸等量混合液に１０分浸した後、鉄ヘマトキシリン染色液に５分間浸し、流水水洗を５分間行った。水洗後、ポンソー酸フクシンアゾフロキシン液に１分間浸した後２．５％リンタングステン酸溶液に１０分間浸した。２％オレンジＧ液に５分間切片を浸した後、１％酢酸水で洗浄し、ライトグリーン液にて３分間染色した後、１％酢酸水で洗浄した。脱水、透徹、封入はＨＥ染色と同様の過程で行った。
　結果を図１４に示す。ＴＴＣ染色では左室前壁および心室中隔の前壁よりに貫壁性の梗塞部位を認めた。また、ＭＴおよびＨＥ染色にて同部位の心筋細胞の脱落と膠原線維の増生を認め、心筋梗塞が完成されていることが確認された。
（３）B.longum菌の投与および検出
　B.longum菌を例１と同様に調製し、心筋梗塞モデル作製直後にB.longum菌を１×１０９ｃｆｕ／ｍｌの濃度で、０．１ｍｌを１ｃｍおきに等間隔で健常部位と梗塞部位に心筋内投与した（図１３参照）。菌を投与してから４日および７日後（各ｎ＝２）に心臓を摘出して梗塞部位と健常部位に分け、ホモジナイズした後、ＢＬプレートに塗布して３７℃、嫌気的条件下で３日間培養した。培養後に各プレートのコロニー数を測定し、梗塞部位および健常部位の菌数を求めた。
　結果を図１５に示す。投与４日後においては、健常部位でわずかに菌が検出されたものの、梗塞部位において有意に菌が観察された。投与７日後には、健常部位からは菌は検出されなくなり、梗塞部位のみにおいて菌が観察された。このことから、心筋梗塞においてもB.longum菌は梗塞部位特異的に生着、増殖することがわかった。
例５：Bifidobacterium用非シャトルｈＦＧＦ２発現プラスミドの構築
（１）発現プラスミドベクターp37の構築
　プラスミドpCDshuttle（国際出願第２００９／１２８２７２号）を鋳型として、CDvecF3プライマー（配列番号２３）およびpUCoriR5プライマー（配列番号２４）を用いたＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物をベクターとした。Bifidobacterium 1ongum 105AのゲノムＤＮＡを鋳型としてPins37Fプライマー（配列番号２５）およびPins37Rプライマー（配列番号２６）にて増幅したＰＣＲ産物をインサートとした。ＰＣＲは常法にて実施した。
　上記ベクターおよびインサートを、In-Fusion HD Cloning KitおよびCloning Enhancer（タカラバイオ株式会社）を用いて繋げ（以下in-fusion反応と記載）、反応液の一部を用いて大腸菌TOP10 chemically competent cell（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を形質転換した。詳細は製品説明書に従った。形質転換大腸菌は、ＬＢ（７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシン含有）寒天培地に塗布し、３７℃にて一晩静置培養した。
　上記プレート上のよく分離したコロニーを拾い、ＬＢ（７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシン含有）液体培地にて３７℃で一晩振とう培養後、これより、QIAprep Spin Miniprep Kit（株式会社キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドＤＮＡの全長についてシーケンス解析を行い、配列を確認した。完成したプラスミド名をp37（配列番号３９）とした。
（２）ｈＦＧＦ２発現プラスミド（非分泌型）の構築
　ヒトＦＧＦ２発現（非分泌型）プラスミドpFGF-P37の構築概要を図１６に示した。ベクターを以下のように、調製した。即ち、プラスミドP37を鋳型として、FGF1プライマー（配列番号２７）およびFGF7プライマー(配列番号２８)を用いてＰＣＲを行い、P37プロモーター（配列番号２９）、Huターミネーター、pTB6レプリコン（ビフィズス菌中でのプラスミドレプリコン）、AAD9カセット（スペクチノマイシン耐性遺伝子発現ユニット）、pUCori部分（大腸菌中でのプラスミド複製起点）からなる約３．８ｋｂｐのＤＮＡを増幅し、これをベクターとした。ベクターの末端１５ｂｐが、以下に示すインサート末端１５ｂｐと同配列になるようプライマーを設計した。ＤＮＡの増幅には、PrimeSTAR HS（Premix）（タカラバイオ株式会社）を使用し、ＰＣＲ条件は同酵素の製品説明書に従った。
　インサートを以下のように調製した。即ち、hFGF2（GenBank Accession No. #NM_002006のＡＵＧより翻訳開始の約１８ｋＤａのタンパク質）のアミノ酸配列に基づき、コドンをビフィズス菌用に最適化したＤＮＡを人工合成した（GenScript社に依頼）。その際に、ｈＦＧＦ２コードタンパク質のＣ末端にヒスチジンタグが融合するようＤＮＡをデザインした（配列番号３０）。この合成ＤＮＡを鋳型として、FGF3プライマー（配列番号３１）およびFGF4プライマー（配列番号３２）にて上記と同様にＰＣＲ増幅を行い、約０．５ｋｂｐのＤＮＡ増幅産物をインサートとした。
　上記ベクターおよびインサートを、In-fusion反応により繋げた。詳細は、製品説明書に従った。In-fusion反応液を、０．１×ＴＥにて適宜希釈し、このうち２μＬを用いて、大腸菌TOP10 chemically competent cell（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を形質転換した。詳細は製品説明書に従った。形質転換大腸菌は、ＬＢ（７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシン含有）寒天培地に塗布し、３７℃にて一晩静置培養した。
　上記プレート上のよく分離したコロニーを拾い、ＬＢ（７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシン含有）液体培地にて３７℃で一晩振とう培養後、これより、QIAprep Spin Miniprep Kit（株式会社キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。プラスミドＤＮＡの一部を用いてｈＦＧＦ２発現ユニットのＤＮＡ配列を確認した。シーケンス反応は、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を使用し、詳細は製品説明書に従った。シーケンス反応液の電気泳動は、信州大学ヒト環境科学研究支援センター機器分析部門に依頼した。データ解析には、Genetyx Ver.10を使用した。完成したプラスミド名をpFGF-P37（配列番号３３）とした。
（３）分泌型ｈＦＧＦ２発現プラスミドの構築
　ヒトＦＧＦ２発現（分泌型）プラスミドpFGF12aの構築概要を図１６に示した。上記プラスミドpFGF-P37を鋳型として、FGF35プライマー（配列番号３４）およびFGF26プライマー（配列番号３５）を用いてＰＣＲを行い、約４．２ｋｂｐのＤＮＡ増幅産物をベクターとした。
　別に、Bifidobacterium longum 105A株のゲノムＤＮＡを鋳型として、FGF45プライマー（配列番号３６）およびFGF17プライマー（配列番号３７）にてＰＣＲを行い、約０．２ｋｂｐのＤＮＡ増幅産物をインサートとした。インサートは、分泌シグナルを含んでおり、B. breve UCC2003のＳｅｃ２（Shkoporov AN et. al., Biotechnol Lett (2008) 30: 1983-1988参照）のＮ末端配列がよく保存されている。ベクターおよびインサートの増幅には、PrimeSTAR HS（Premix）（タカラバイオ株式会社）を使用し、ＰＣＲ条件は同酵素の製品説明書に従った。
　上記ベクターおよびインサートを、上記、ＦＧＦ発現プラスミド（非分泌型）の構築時と同様に、In-fusion反応にて連結し、大腸菌TOP10を形質転換、プラスミドのｈＦＧＦ２発現ユニット部分のＤＮＡ配列を確認し、完成したプラスミド名をpFGF12a（配列番号３８）とした。ｈＦＧＦ２発現ユニット部分の構成は以下の通りである。
・Ｐ３７プロモーター：配列番号３８の塩基番号１４から２７５、
・ＦＧＦ２コード領域の構成：配列番号３８の塩基番号２７６から９０２
・シグナル配列：配列番号３８の塩基番号２７６から４１９
・ＦＧＦ２配列：配列番号３８の塩基番号４２０から８８１
・ヒスチジンタグ配列：配列番号３８の塩基番号８８２から８９９
・終始コドン：配列番号３８の塩基番号９００から９０２
・Ｈｕターミネーター：配列番号３８の塩基番号９０３から１０１６
　また、同ユニットがコードするアミノ酸配列を配列番号４０に、更にその構成を以下に示す。
・ＦＧＦ２コード領域の構成：配列番号４０のアミノ酸番号１から２０８
・シグナル配列：配列番号４０のアミノ酸番号１から４８（うち、アミノ酸番号１～３７が推定シグナルペプチド領域であり、アミノ酸番号３８～４８が推定スペーサー領域であり、アミノ酸番号３７と３８との間が推定切断箇所）
・ＦＧＦ２配列：配列番号４０のアミノ酸番号４９から２０２
・ヒスチジンタグ配列：配列番号４０のアミノ酸番号２０３から２０８
（４）組換えビフィズス菌の作製
　Bifidobacterium longum 105A株およびBifidobacterium breve JCM1192株のコンピテントセルを、Rossi et al., Letters in Applied Microbiology (1997) 24: 33-36に記載の方法に準じて作製した。即ち、ＩＭＲ培地にて対数増殖期初期まで培養した上記ビフィズス菌をＰＢＳバッファーにて洗浄後、ＫＭＲバッファーにて懸濁し、液体窒素にて急速凍結したものをコンピテントセルとした。コンピテントセルを氷上にて融解後、上記プラスミドpFGF12aあるいはpBEshuttle（国際公開第２０１１／０９３４６５号に記載のｍｏｃｋベクター、ＦＧＦ発現なし）を混合し、Gene Pulser II（バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社）を用いてエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションは、０．２ｃｍギャップのキュベットを用いて、２ｋＶ、２５μＦ、２００Ωの条件で行った。形質転換後のビフィズス菌を、ＩＭＲ（７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシン含有）寒天培地に塗布し、３７℃にて２日間嫌気培養を行なった。寒天培地上に形成したよく分離したコロニーを釣菌し、組換えビフィズス菌を取得した。
（５）タンパク質発現解析（ウェスタンブロッティング）
　ビフィズス菌培養用培地として、ＭＲＳ培地（ｏｘｉｄｅ）１０ｍＬに、３５０ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸および２０ｍｇ／ｍＬのＬ－システインを含むビタミンＣ／システイン溶液２００μＬおよび７５ｍｇ／ｍＬスペクチノマイシン溶液１０μＬを添加した。この調整培地に、上記組換えビフィズス菌B. longum 105A/pFGF12aおよびB. longum 105A/pBEshuttleを植菌し、３７℃にて２４時間嫌気培養した（活性化培養液）。活性化培養液を、上記調整培地にさらにリン酸ナトリウムバッファーを１６６ｍＭになるよう添加した培地に植菌し、３７℃にて１８時間嫌気培養した。
　上記と同様に、Bifidobacterium breve JCM1192/pFGF12aおよびBifidobacterium breve JCM1192/pBEshuttleの培養も実施した。ただし、ＭＲＳ培地ではなくＲＣＭ培地を使用した。ビタミンＣ／システイン溶液は添加しなかった。
　上記組換えビフィズス菌培養液上清を常法に従いトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿し、１×ＳＤＳサンプルバッファーにて再溶解した。これを、９５℃にて３分間加熱処理し、ウェスタン解析に供した。
　上記試料を、ミニプロティアンTGXゲル（４～２０％、バイオ・ラッド）を用いて１×ＳＤＳバッファーにて電気泳動した。電気泳動装置は、Mini PROTEAN Tetra System（バイオ・ラッド）を用いた。電気泳動後のゲルを、iBlot Gel Transfer Deviceを用いてiBlot Transfer Stacks に転写した。転写後のメンブランをＴＴＢＳにて約５分、３回の洗浄を行った後、２％ブロッキング溶液（ブロックエース）にてブロッキングした。一次抗体として、Anti FGF-2 human rabbit poly（H-131、 Santa Cruz Biotechnology Inc.）を加え、４℃にて一晩振とうした。一次抗体反応後、メンブランをＴＴＢＳにて約５分の洗浄を６回繰り返し、二次抗体Goat anti-rabbit IgG HRP（Santa Cruz Biotechnology Inc.）を加え、室温にて３．５時間振とうした。このメンブランをＴＴＢＳにて約５分の洗浄を６回繰り返した後、ECL Advance Western Blotting Detection Kit（GEヘルスケア社製）内の発光試薬にて発光させた。これを、イメージングアナライザー（Fluor-S MAX、バイオ・ラッド）にて検出した（図１７および図１８）。
（６）タンパク質発現解析（ＥＬＩＳＡ）
　培養上清を、ＴＣＡ沈殿工程前まで上記と同様の方法にて調製し、human FGF2　ELISAキット（Quantikine（Ｒ） ELISAHuman FGF basic Immunoassay、R&D systems、カタログ番号：DFB50）にてｈＦＧＦ２量を定量した。
　培養上清中のｈＦＧＦ２量は、B. longum 105A/pFGF12aにて３３，０５８ｐｇ／ｍＬ、陰性コントロールのB. longum 105A/pBEshuttleでは０ｐｇ／ｍＬであった。Bifidobacterium breve JCM1192/pFGF12aにて１１，４２９ｐｇ／ｍＬ、陰性コントロールのBifidobacterium breve JCM1192/pBEshuttleでは０ｐｇ／ｍＬであった。
例６：マウス下肢虚血モデルによるin vivoでの治療効果検証
　本発明の遺伝子送達担体の、虚血性疾患部位での治療効果を検証するため、下肢虚血のマウスモデルを作製し、ヒトＦＧＦ２分泌ビフィズス菌を投与して検討した。
（１）モデル作製
　実験動物は６－８週齢、メスのＢａｌｂ／ｃマウス（日本チャールズリバー社より入手）を使用し、以下の手順で下肢虚血モデル（ischemic model）マウスを作製した。麻酔は３．６％抱水クロラール（ナカライテスク株式会社より入手）を腹腔内に０．３ｍｌ注射した。腹部から下腿の除毛を行ったのち総大腿動脈、深大腿動脈、浅大腿動脈を８－０ポリプロピレン糸にて結紮し、浅大腿動脈を部分切除した。創内を生理食塩水で洗浄後、創を５－０ナイロン糸にて縫合した。
（２）レーザードップラー血流計による血流測定
　マウスを麻酔後、レーザードップラー血流計（Moor Instruments社製）を用いて、血流測定を行った。下腿部から指先までの血流を両側について定量し、患側／健側比にて表した。血流測定はモデル作製直後、３～４、６および８日後に行った。
（３）遺伝子組み換えB.longum菌の投与
　ヒトＦＧＦ２分泌ビフィズス菌およびコントロールとして非分泌ビフィズス菌をＭＲＳ培地（関東化学株式会社より入手）で２回継代した。２回継代した培養液を、生理食塩水を用いて遠心洗浄を行い、生理食塩水で懸濁して使用した。モデル作製翌日、眼窩静脈叢に菌を１×１０９ｃｆｕ／ｍｌの濃度で０．２ｍｌ投与し、上述（２）の如く下肢血流を測定した。
　結果を図１９および２０に示す。図１９はヒトＦＧＦ２分泌B.longum菌の、図２０はヒトＦＧＦ２分泌B. breve菌の、血流改善効果を示したものである。ヒトＦＧＦ２分泌B.longum菌においては６日目以降にＰＢＳ群に比べ有意な血流改善効果を示した。（longumＦＧＦ１２ａ対ＰＢＳ；６日目において、０．４１±０．１１対０．１４±０．０２；８日目において、０．５５±０．１１対０．３２±０．０８）また、ヒトＦＧＦ２分泌B. breve菌においては８日目に有意な血流改善効果を示した。（breveＦＧＦ１２ａ対breveコントロール、０．６７±０．１１対０．３８±０．０２）なおいずれの群においてもＦＧＦ非分泌菌投与群（コントロール）とＰＢＳ投与群の間には有意な差は認めなかった。
　本発明の遺伝子送達担体により、虚血性疾患部位に特異的に生着、増殖し、疾患状態の改善とともに消失する遺伝子送達担体を提供することが可能となる。したがって、従来の方法と比較して血管新生療法を低侵襲で簡便に行うことが可能となる。また、遺伝子送達担体そのものが細菌からなるため、目的部位への遺伝子の導入効率などが問題にならず、従来と比較して非常に高効率な処置を行うことが可能となる。これにより、高齢者など、本来血管新生療法が効果的であるはずなのに侵襲性の高さや全身性の副作用が障害となって処置できなかった対象などに対しても有効に処置が可能となる。

Claims (19)

  1. 　虚血性疾患部位特異的に生育でき、かつ、少なくとも１種の、虚血性疾患の診断もしくは治療に有用なタンパク質を発現することができる嫌気性菌からなる遺伝子輸送担体。
  2. 　嫌気性菌が、形質転換用プラスミドで形質転換されたものであり、該プラスミドが虚血性疾患の診断もしくは治療に有用なタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む、請求項１に記載の遺伝子輸送担体。
  3. 　虚血性疾患が、慢性虚血性疾患である、請求項１または２に記載の遺伝子輸送担体。
  4. 　嫌気性菌が、非病原性の腸内細菌である、請求項１～３のいずれか一項に記載の遺伝子輸送担体。
  5. 　嫌気性菌が、ビフィズス菌である、請求項１～４のいずれか一項に記載の遺伝子輸送担体。
  6. 　ビフィズス菌が、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・アングラタム、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ビフィドバクテリウム・アステロイデス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ボウム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・カテヌラタム、ビフィドバクテリウム・コエリナム、ビフィドバクテリウム・コリネフォルメ、ビフィドバクテリウム・クニクリ、ビフィドバクテリウム・デンティコレンス、ビフィドバクテリウム・デンティウム、ビフィドバクテリウム・ガリクム、ビフィドバクテリウム・ガリナラム、ビフィドバクテリウム・グロボサム、ビフィドバクテリウム・インディクム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・イノピナタム、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・ラクテンティス、ビフィドバクテリウム・リベロラム、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・マグナム、ビフィドバクテリウム・メリシクム、ビフィドバクテリウム・ミニマム、ビフィドバクテリウム・モンゴリエンス、ビフィドバクテリウム・パルブロラム、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラタム、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム、ビフィドバクテリウム・サイクラエロフィラム、ビフィドバクテリウム・プロラム、ビフィドバクテリウム・ルミナレ、ビフィドバクテリウム・ルミナンチウム、ビフィドバクテリウム・サエクラレ、ビフィドバクテリウム・スカルドヴィ、ビフィドバクテリウム・サブタイル、ビフィドバクテリウム・スイス、ビフィドバクテリウム・テルマシドフィラム、およびビフィドバクテリウム・サーモフィラムからなる群より選ばれる１種である、請求項５に記載の遺伝子輸送担体。
  7. 　ビフィズス菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガムである、請求項６に記載の遺伝子輸送担体。
  8. 　虚血性疾患の診断に有用なタンパク質が、蛍光タンパク質である、請求項１～７のいずれか一項に記載の遺伝子輸送担体。
  9. 　虚血性疾患の治療に有用なタンパク質が、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）血管増殖因子（ＡＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、アンギオポイエチン、エフリンなどの血管新生促進活性を有するタンパク質、プロスタグランジン類などの血管拡張に関与する因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３などのニューロトロフィン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）からなる群から選ばれる一種である、請求項１～７のいずれか一項に記載の遺伝子輸送担体。
  10. 　形質転換用プラスミドが、非シャトルプラスミドである、請求項２～９のいずれか一項に記載の遺伝子輸送担体。
  11. 　形質転換用プラスミドが、さらに分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子配列を含む、請求項２～１０のいずれか一項に記載の遺伝子輸送担体。
  12. 　形質転換用プラスミドが、ｐＴＢ６　ｒｅｐユニットを含む、請求項２～１１のいずれか一項に記載の遺伝子輸送担体。
  13. 　形質転換プラスミドが、ｐ３７プロモーター、ＨＵターミネーター、およびＦＧＦ２をコードする遺伝子を含む発現カセットを有する、請求項２～１２のいずれか一項に記載の遺伝子輸送担体。
  14. 　形質転換プラスミドが、配列番号４０に記載の配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む、請求項２～１３のいずれか一項に記載の遺伝子輸送担体。
  15. 　形質転換プラスミドが、pFGF12a（配列番号３８）である、請求項２～１４のいずれか一項に記載の遺伝子輸送担体。
  16. 　請求項１～１５のいずれか一項に記載の遺伝子輸送担体を含む、虚血性疾患用医薬組成物。
  17. 　全身投与により投与される、請求項１６に記載の医薬組成物。
  18. 　虚血性疾患部位特異的に生育でき、かつ、少なくとも１種の、虚血性疾患の診断または治療に有用なタンパク質を発現することができる嫌気性菌を投与することを含む、虚血性疾患を診断または処置する方法。
  19. 　投与が、全身投与である、請求項１８に記載の方法。
PCT/JP2012/067797 2011-07-13 2012-07-12 虚血性疾患治療薬 Ceased WO2013008881A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020147003731A KR20140046463A (ko) 2011-07-13 2012-07-12 허혈성질환 치료제
CN201280034792.3A CN103958680A (zh) 2011-07-13 2012-07-12 缺血性疾病治疗药
CA2841451A CA2841451A1 (en) 2011-07-13 2012-07-12 Ischemic disease therapeutic agent
EP12811514.4A EP2733207A4 (en) 2011-07-13 2012-07-12 THERAPEUTIC AGENT FOR ISCHEMIC DISEASE

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161507590P 2011-07-13 2011-07-13
US61/507,590 2011-07-13

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2013008881A1 true WO2013008881A1 (ja) 2013-01-17
WO2013008881A9 WO2013008881A9 (ja) 2013-06-06

Family

ID=47506160

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2012/067797 Ceased WO2013008881A1 (ja) 2011-07-13 2012-07-12 虚血性疾患治療薬

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP2733207A4 (ja)
JP (1) JPWO2013008881A1 (ja)
KR (1) KR20140046463A (ja)
CN (1) CN103958680A (ja)
CA (1) CA2841451A1 (ja)
WO (1) WO2013008881A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2016117508A1 (ja) * 2015-01-19 2017-12-07 国立大学法人信州大学 虚血性疾患治療薬

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115400154A (zh) * 2022-08-10 2022-11-29 深圳未知君生物科技有限公司 长双歧杆菌在制备治疗自闭症谱系障碍的药物中的应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002097144A (ja) 2000-09-21 2002-04-02 Jun Amano 嫌気性菌を用いた遺伝子治療用医薬
US6416754B1 (en) 1994-03-03 2002-07-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Anaerobe targeted enzyme-mediated prodrug therapy
US20030103952A1 (en) 1994-03-03 2003-06-05 Brown John M. Anaerobe targeted enzyme-mediated prodrug therapy
WO2007136107A1 (ja) 2006-05-24 2007-11-29 Anaeropharma Science Inc. 遺伝子輸送担体作製方法
WO2009128272A1 (en) 2008-04-17 2009-10-22 Anaeropharma Science, Inc. Expression vector
WO2011093465A1 (ja) 2010-01-29 2011-08-04 株式会社アネロファーマ・サイエンス 形質転換用プラスミド

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1227152A1 (en) * 2001-01-30 2002-07-31 Société des Produits Nestlé S.A. Bacterial strain and genome of bifidobacterium

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6416754B1 (en) 1994-03-03 2002-07-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Anaerobe targeted enzyme-mediated prodrug therapy
US20030103952A1 (en) 1994-03-03 2003-06-05 Brown John M. Anaerobe targeted enzyme-mediated prodrug therapy
US6652849B2 (en) 1994-03-03 2003-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Standford Junior University Anaerobe targeted enzyme mediated prodrug therapy
JP2002097144A (ja) 2000-09-21 2002-04-02 Jun Amano 嫌気性菌を用いた遺伝子治療用医薬
WO2007136107A1 (ja) 2006-05-24 2007-11-29 Anaeropharma Science Inc. 遺伝子輸送担体作製方法
WO2009128272A1 (en) 2008-04-17 2009-10-22 Anaeropharma Science, Inc. Expression vector
JP2011517929A (ja) * 2008-04-17 2011-06-23 株式会社アネロファーマ・サイエンス 発現ベクター
WO2011093465A1 (ja) 2010-01-29 2011-08-04 株式会社アネロファーマ・サイエンス 形質転換用プラスミド

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GUPTA ET AL., CIRC. RES., vol. 105, 2009, pages 724 - 736
MORISHITA ET AL., ARTERIOSCLER THROMB VASC BIOL., vol. 31, 2011, pages 713 - 720
ROSSI ET AL., LETTERS IN APPLIED MICROBIOLOGY, vol. 24, 1997, pages 33 - 36
See also references of EP2733207A4 *
SHKOPOROV AN, BIOTECHNOL LETT, vol. 30, 2008, pages 1983 - 1988
SHKOPOROV, A. N. ET AL.: "Production of human basic fibroblast growth factor (FGF-2) in Bifidobacterium breve using a series of novel expression/secretion vectors", BIOTECHNOL. LETT., vol. 30, no. 11, 2008, pages 1983 - 1988, XP019639457 *
YAZAWA ET AL., BREAST CANCER RESEARCH AND TREATMENT, vol. 66, 2001, pages 165 - 170
YAZAWA ET AL., CANCER GENE THERAPY, vol. 7, no. 2, 2000, pages 269 - 274
YUKO WADA ET AL.: "anaerobic bacterial vector in ischemic cardiovascular disease", REGENERATIVE MEDICINE, vol. 11, 1 June 2012 (2012-06-01), pages 282, F-3-57, XP008172503 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2016117508A1 (ja) * 2015-01-19 2017-12-07 国立大学法人信州大学 虚血性疾患治療薬

Also Published As

Publication number Publication date
CN103958680A (zh) 2014-07-30
JPWO2013008881A1 (ja) 2015-02-23
EP2733207A1 (en) 2014-05-21
WO2013008881A9 (ja) 2013-06-06
EP2733207A4 (en) 2014-12-10
KR20140046463A (ko) 2014-04-18
CA2841451A1 (en) 2013-01-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6726419B2 (ja) 組換え型プロバイオティクス細菌
US12042517B2 (en) Nucleic acid systems that enable bacteria to specifically target solid tumors via glucose-dependent viability
US9730968B2 (en) Therapeutic agent for ischemic diseases
WO2013008881A1 (ja) 虚血性疾患治療薬
US10993972B2 (en) Therapeutic agent for ischemic diseases
US20130095072A1 (en) Therapeutic agent for ischemic diseases
WO2008012693A2 (en) Recombinant mycobacterium strain expressing a mycobacterial fap protein under the control of a promoter active under hypoxia and its application for cancer therapy
KR20250124794A (ko) mvIIA의 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된 약독화 살모넬라 균주
US12491236B2 (en) Genetically engineered live bacteria and methods of constructing the same
CN115364125A (zh) 一种携带内皮抑素蛋白的重组长双歧杆菌在制备治疗小鼠结肠炎和结直肠癌的药物中的应用
CN118703546A (zh) 一种表达铜绿假单胞菌外膜蛋白i的重组乳酸乳球菌、质粒和疫苗及其应用
KR20250154996A (ko) 스트랩-태그를 발현하는 재조합 균주 및 이를 함유하는 종양 영상화 어쥬번트
BR112017016772B1 (pt) Bactérias probióticas recombinantes
HK1240848B (en) Recombinant probiotic bacteria
HK1240848A1 (en) Recombinant probiotic bacteria

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12811514

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2841451

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2013523979

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2012811514

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012811514

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20147003731

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A