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WO2013053859A1 - Hochauflösende lumineszenzmikroskopie - Google Patents

Hochauflösende lumineszenzmikroskopie Download PDF

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WO2013053859A1
WO2013053859A1 PCT/EP2012/070215 EP2012070215W WO2013053859A1 WO 2013053859 A1 WO2013053859 A1 WO 2013053859A1 EP 2012070215 W EP2012070215 W EP 2012070215W WO 2013053859 A1 WO2013053859 A1 WO 2013053859A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sample
illumination
structured
image
different
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/EP2012/070215
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English (en)
French (fr)
Inventor
Ingo Kleppe
Yauheni Novikau
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Carl Zeiss Microscopy GmbH
Original Assignee
Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Carl Zeiss Microscopy GmbH filed Critical Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority to US14/350,919 priority Critical patent/US9726877B2/en
Publication of WO2013053859A1 publication Critical patent/WO2013053859A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements
    • G02B21/365—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes
    • G02B21/367—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes providing an output produced by processing a plurality of individual source images, e.g. image tiling, montage, composite images, depth sectioning, image comparison
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
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    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
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    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence
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    • G—PHYSICS
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    • G06F3/01—Input arrangements or combined input and output arrangements for interaction between user and computer
    • G06F3/03—Arrangements for converting the position or the displacement of a member into a coded form
    • G06F3/041—Digitisers, e.g. for touch screens or touch pads, characterised by the transducing means
    • G06F3/0412—Digitisers structurally integrated in a display

Definitions

  • the invention relates to a microscopy method or a microscope for generating a high-resolution image of a luminescent sample.
  • microscopy The examination of samples by microscopy is a wide technical field, for which there are many technical solutions.
  • various microscopy techniques have developed.
  • a classical field of application of light microscopy for the investigation of biological preparations is luminescence microscopy.
  • certain dyes so-called phosphors or fluorophores
  • the sample is illuminated with excitation radiation and the luminescence light stimulated thereby is detected with suitable detectors.
  • a dichroic beam splitter in combination with block filters is provided for this purpose in the light microscope, which split off the fluorescence radiation from the excitation radiation and enable separate observation.
  • Luminescence is understood here, as is common practice, as a generic term for phosphorescence and fluorescence, so it covers both processes.
  • LSM laser scanning microscopy
  • a confocal detection arrangement one speaks of a confocal LSM
  • a nonlinear sample interaction so-called multiphoton microscopy
  • An optical section is obtained, and the recording of several optical sections at different depths of the sample then makes it possible, with the aid of a suitable data processing device, to generate a three-dimensional image of the sample, which is composed of the various optical sections.
  • Laser scanning microscopy is thus suitable for the examination of thick specimens.
  • microscopy methods For resolutions beyond the diffraction limit given by the laws of physics, various approaches have recently been developed. These microscopy methods are characterized in that they provide the user with a higher lateral and / or axial optical resolution compared to the conventional microscope. In this specification, such microscopy methods are referred to as high-resolution microscopy methods, since they achieve a resolution beyond the optical diffraction limit. Diffraction-limited microscopes, on the other hand, are called classical microscopes. They realize known optical far field microscopy or laser scanning microscopy.
  • a high-resolution microscopy method is mentioned in EP 1 157 297 B1.
  • nonlinear processes are exploited by means of structured illumination.
  • the non-linearity is the saturation of the fluorescence.
  • Structured illumination results in a displacement of the object space spectrum relative to the transfer function of the optical system.
  • the shift of the spectrum means that object space frequencies V0 are transmitted at a spatial frequency V0-Vm, where Vm is the frequency of the structured illumination.
  • Vm is the frequency of the structured illumination.
  • This approach requires Fourier filtering as a reconstruction algorithm for image generation and exploitation of multiple images for an image.
  • the EP 1 157 297 B1 which is also fully incorporated with regard to the corresponding description of the resolving microscopy method, thus uses a structured far-field illumination of the sample, for example by means of an amplitude / phase grating. Fluorescence in the sample is also detected far field.
  • the grid is now used in at least three different rotational positions, z. B. 0 °, 120 ° and 240 °, and in each rotational position, the grid is moved in three or more different positions. For the three shifts of the three rotational positions (a total of at least 9 illumination states), the sample is detected far field.
  • the grating has frequencies as close as possible to the cut-off frequency, to the transmission of which the optical arrangement used is capable.
  • This microscopy method is also called a SIM method.
  • An increase of the resolution is obtained with this principle, if the structuring (eg by a grid) is so intense that the fluorescence of the sample reaches saturation in the bright area. Then the structured illumination of the sample on the sample no longer has a sinusoidal distribution, but because of the saturation effects even higher harmonic beyond the optical cutoff frequency.
  • This development of the SIM method is also referred to as saturated pattern excitation microscopy (SPEM).
  • SIM method can also be achieved with a linear illumination which is perpendicular to the grid direction. You then have a line lighting, along the line, the grid structure is found again. The lines of the lighting is thus in turn structured by the grid.
  • the linear illumination allows a confocal slit detection and thus an increase in resolution. This procedure is also abbreviated SLIM.
  • DE 102008054317 A1 describes the combination of various high-resolution microscopy methods, with the aim of being able to use the optimum method for individual sample areas in each case from the viewpoints of resolution and measuring speed.
  • the invention has for its object to provide a microscopy method or a microscope, which achieves an increased resolution.
  • a microscopy method for producing a high-resolution image of a sample wherein a) the sample is provided with a marker which emits statistically flashing luminescent radiation after excitation, or a sample is used which has molecules which, after stimulation, flashes statistically Emit luminescence radiation, b) the sample is excited by structured illumination to luminescence so that the markers / molecules with a blink rate flashing emit luminescent, wherein the illumination is structured so that the Blink rate varies locally and the sample repeatedly in different illumination states of the structured illumination is illuminated, so that for each illumination state, a different local distribution of the blink rate is obtained, c) the luminescent sample is repeatedly imaged onto a detector in each of the different illumination states, so that for each of the different Be a series of images is obtained, d) from each image sequence a raw image of the sample is generated, which reflects the local distribution of the flash rate, e) from the obtained raw images by a computation comprising a Fourier filtering computational
  • the object is likewise achieved with a microscope for producing a high-resolution image of a sample, the sample being provided with a marker which emits statistically flashing luminescent radiation after excitation, or a sample comprising the molecules which emit statistically flashing luminescent radiation after excitation, a detection beam path and an illumination beam path, wherein the detection beam path images the sample onto a detector and the illumination beam path illuminates the sample with structured illumination to excite luminescence, the illumination beam path having means for realizing different illumination states, a computing and control device comprising the Microscope controls so that the sample is excited by structured illumination to luminescence so that the markers / molecules with a blink rate flashing luminescence the illumination is structured so that the blinking rate varies locally and the sample is repeatedly illuminated in different illumination states of the structured illumination, so that for each illumination state a different local distribution of the blink rate is obtained, the computing and control device reads out the detector, that an image sequence of the luminescent sample is obtained in each of the different illumination states, the arithmetic and control device
  • the invention uses structured illumination such that a local blink rate modulation occurs in the sample.
  • This flash rate modulation then serves to generate a higher resolution image utilizing the principles known from the SIM concept.
  • SIM principle therefore, not multiple illumination states are used, which differ with respect to the fluorescence intensity modulation, but illumination states are used which differ with regard to the blink rate modulation.
  • the inventive concept can therefore be provided with the abbreviation SBIM.
  • the sample is illuminated in different lighting conditions.
  • the lighting conditions differ with regard to the flash rate modulation generated thereby.
  • an image sequence is taken so that the images each show different flashing states at one and the same blink rate modulation state.
  • the blink rate modulation state is determined by suitable evaluation of the image sequence. This represents a raw image. From each blink rate modulation state, a raw image is generated in this way. The multiple raw images are then converted into a high resolution image according to the concepts known for SIM.
  • Blink rate modulation i.e., a lighting condition
  • the image sequences for all flash rate modulations i.e., all illumination states
  • the modulation of the blink rate is known in the art. It usually depends linearly on the excitation intensity, as, for example, in the publication by S. van de Linde et al., "Photoinduced formation of reversible dye radicals and their impact on super-resulution imaging", Photochem., Photobiol , 10, 499.
  • the reading of the blink rate in a spatially resolved manner is possible by various methods, for example autocorrelation, frequency analysis (eg evaluation of a maximum in a previously determined frequency band used for Blink rates of the dye is characteristic).
  • the location information which is in the raw images, ie the location dependence of the blink rate, can be determined for example by means of a frequency analysis. It is determined z. B. the average flash rate and / or amplitude. Gray values, which are assigned to the blink rate or alternatively to the blink amplitude, can then be present in the raw image, for example.
  • a two-stage excitation can be used. Then fluorescence is first excited and then the blink rate is modulated at a different wavelength.
  • the generation of the raw image can also be effected by means of the procedure known from the SOFI concept, ie. H. by using a so-called cumulant function.
  • the structured illumination for the modulation of the blink rate can be structured with regard to the radiation intensity.
  • there is also a color structuring So structuring with regard to the wavelength distribution or structuring with respect to the polarization distribution possible.
  • the sample is provided with a marker which emits statistically flashing luminescent radiation after suitable excitation.
  • markers thereby usual label or other substances are provided, which attach themselves to represented structures of the sample.
  • an already suitably luminescent sample can be used.
  • a sample is microscopically imaged which has structures that emit statistically flashing luminescent radiation.
  • Statistically flashing means that the individual markers or sample molecules each independently change between two luminescence radiation states independently of adjacent markers or molecules If a state in which luminescence radiation is emitted and a state in which no luminescence radiation is emitted is also possible, it is also possible to change between the emission of two different types of luminescence radiation, for example a wavelength change, polarization change, etc.
  • the image acquisition rate and the blink rate of the molecules used are suitably adapted to one another. This can be achieved by selecting suitable marker or sample molecules. Of course it is also possible to adjust the blink rate of the molecules by appropriate influence. Depending on the molecule, various physical influencing factors come into question here, in particular Temperature, wavelength of the acting as excitation radiation illumination radiation, intensity of acting as excitation radiation illumination radiation, etc. Also, chemical influences are possible, such. From Geissbuehler et al. explained. Further, for a given flash rate, one can adjust the image pickup time accordingly to achieve the above-mentioned condition.
  • Fig. 2 is a schematic representation to illustrate the generation of a high-resolution
  • Image from several raw images of a sample which are different from image sequences
  • Fig. 3 is a schematic diagram illustrating the generation of the image sequences of
  • Fig. 4 is a further schematic representation of a method for generating a higher-resolution image
  • Fig. 5 is a flow chart of the generation of a higher resolution image.
  • a microscope 1 is shown, the classical microscopy method, d. H .
  • Microscopy method whose resolution diffraction-limited, can perform simultaneously with high-resolution microscopy method, d. H. with microscopy method whose resolution is increased beyond the diffraction limit.
  • the microscope 1 is constructed on the basis of a conventional laser scanning microscope and detects a sample 2. For this purpose, it has an objective 3, through which the radiation runs for all microscopy methods.
  • the objective 3 forms, via a beam splitter 4, the specimen together with a tube lens 5 on a CCD detector 6, which in the example is a generally possible area detector.
  • the microscope 1 has a conventional light microscope module 7 and the beam path from the sample 2 through the lens 3 and the tube lens 5 to the CCD detector 6 corresponds to a conventional wide-field detection beam path 8.
  • a laser scanning module 9 is further connected, whose LSM illumination and detection beam path via a switching mirror 1 1, which also has beam splitter functions, is coupled into the beam path to the lens 3.
  • the beam path from the switching mirror 1 1 to the lens 3 through the beam splitter 4 is thus a beam path, are combined in the illumination beam path and detection beam path.
  • illumination radiation is coupled into the switching mirror 11, which together with the wide field detection beam path 8, d. H. realized the CCD detector 6 microscopy.
  • the switching mirror 1 1 and the beam splitter 4 are combined to form a beam splitter module 12, which makes it possible to change the switching mirror 1 1 and the beam splitter 4 depending on the application. This is also illustrated by double arrows.
  • an emission filter 13 is provided, which is located in the wide-field detection beam path 8 and the spectral components, which can propagate through the wide-field detection beam 8, appropriately filters.
  • the emission filter 13 in the beam splitter module 12 is interchangeable.
  • the laser scanning module 9 receives laser radiation required for operation via an optical fiber 14 from a laser module 15.
  • a collection illumination beam path 16 is coupled in at the beam splitter module 12, more precisely at the switching mirror 14, through which illumination radiation for different microscopy methods runs.
  • this collective illumination beam path 16 different illumination beam paths of individual lighting modules are coupled.
  • a wide-field illumination module 17 couples via a switching mirror 18 wide-field illumination radiation in the collection illumination beam path 16, so that the tube 2 is far-field illuminated via a tube lens 27 and the lens 3.
  • the wide-field illumination module can have, for example, an HBO flap.
  • a TI RF illumination module 19 is provided, which realizes a TIRF illumination with a suitable position of the switching mirror 18.
  • the TI RF illumination module 19 receives radiation from the laser module 15 via an optical fiber 20.
  • the TI RF illumination module 19 has a mirror 21 which is longitudinally displaceable. As a result of the longitudinal displacement, the illumination beam emitted by the TI RF illumination module 19 is displaced perpendicular to the main propagation direction of the emitted illumination beam, as a result of which the TI RF illumination is incident on the objective 3 at an adjustable angle to the optical axis of the objective. In this way, simply the necessary angle of total reflection on the cover glass can be ensured. Of course, other means are suitable for effecting this angular adjustment.
  • the illuminating beam path of a manipulator module 22 is coupled to the collecting illumination beam path, which likewise receives radiation from the laser module 15 via an unspecified optical fiber and leads a point or line-shaped beam distribution over the sample 2 in a scanning manner.
  • the manipulator module 22 thus corresponds essentially to the illumination module of a laser scanning microscope, and consequently the manipulator module 22 can also be operated in combination with the detector of the laser scanning module 9 or the wide-field detection of the CCD detector 6.
  • a grid 23 is further provided, the lattice constant is below the cutoff frequency, which can be transmitted with the microscope 1 in the sample 2.
  • the grating 23 is displaceable transversely to the optical axis of the collective illumination beam path 16.
  • a corresponding displacement drive 24 is provided downstream of the grating in the illumination direction.
  • an image field rotator 25 which is rotated by a rotator drive 26, is located in the collective illumination beam path 16.
  • the field rotator may be, for example, an Abbe-König prism.
  • the modules and drives and detectors of the microscope 1 are all connected via unspecified lines to a control device 28. This connection can be made for example via a data and control bus.
  • the control device 28 controls the microscope 1 in different operating modes.
  • the control unit 28 thus makes it possible to perform classical microscopy on the microscope 1, ie wide field microscopy (WF), laser scanning microscopy (LSM) and also fluorescence microscopy with total internal reflection (TIRF).
  • the microscope of FIG. 1 essentially has two modules suitable for laser scanner illumination, namely the laser scanning module 9 and the manipulator module 22. Of course, other combinations are also possible. These modules are coupled via tube lenses with the objective 3 to the sample 2.
  • the manipulator module 22 only contains the excitation part of a laser scanning module, without detection. As a result, the sample can be spot-illuminated and the illumination spot scanned over the sample 2.
  • a switching lens or cylindrical lens with which a switch between a punctiform and a line-shaped illumination.
  • This line-shaped illumination is particularly advantageous when the grating 23, which is located in an intermediate image of the collection illumination beam path 16, is pivoted in and lies perpendicular to the line of the line-shaped illumination.
  • a variably adjustable strip modulator or a DMD for producing a structured illumination in the sample 2 can also be used. Then, of course, the displacement drive 24 and the on / Ausschwenkles the grid 23 is no longer required.
  • the field rotator 25 allows the structured illumination generated by the grating 23 (or elements replacing it) to rotate about the optical axis of the collection illumination beam path 16 so that the structured illumination is at different angles in the sample 2 ,
  • the switching mirrors 18 and 11 and the beam splitter 4 are set appropriately.
  • folding or Einschenkspiegel can be used in the realization, so that a switch between the modes can be sequential.
  • dichroic mirrors are also possible which allow simultaneous operation of the various modules.
  • the beam splitter 4 is preferably designed as a dichroic beam splitter, wherein the spectral properties are adjustable so that spectral components of fluorescence emission of marking molecules to be detected by the CCD detector 6, get into the wide field detection beam path 8 and the remaining spectral components are transmitted as possible ,
  • a plurality of different beam splitters 4 and emission filters 13 are interchangeably arranged in the beam splitter module 12, e.g. B. on a filter wheel.
  • control unit 28 is suitably designed, for example by a suitable programming.
  • FIGS. 4 and 5 essential features and principles will first be explained with reference to FIGS. 2 and 3, which are components of the microscopy methods to be described.
  • FIG. 2 exemplifies the concept used to produce a higher-resolution image.
  • the sample microscopically microscoped in the microscope 1 of FIG. 1 is repeatedly field-imaged, whereby different illumination states are set.
  • FIG. 2 shows a set 30 of individual raw images 40 which differ in terms of a structuring 41 which is applied to the sample by suitable illumination by means of the illumination beam path 8.
  • the structuring 41 in the different raw images 40 is different.
  • the structuring relates to a blink rate of the fluorescent sample.
  • the different structurings are designated in the representation of FIG. 2 by an appendix ". 01" to ". O9" to the reference numeral 40 of the respective raw image.
  • the structuring concerns a flash rate modulation.
  • the individual raw images 40.x thus differ with regard to different flash rate structuring. For example, in the areas marked in black, there may be a blink rate which lies above the white areas of a raw image 40.x.
  • the plan view of the individual raw images 40.x shows that the nine orientations of the structuring differ with regard to a displacement position and a rotational position.
  • higher numbers of different structuring are possible, as is known from the publications listed in the general part of the description of the SIM principle.
  • the generation of the individual raw images 40.x in the set 39 is illustrated in FIG.
  • an image sequence 44 is taken which is formed from individual images 45.t1 to 45.tn.
  • the individual images 45.x are recorded in each case over a period of time, which is preferably short against the reciprocal of an average flash rate of the sample molecules or markers used.
  • Each image 45.x thus represents a momentary blinking state.
  • the image sequence 44 is recorded.
  • a flash rate analysis 46 a raw image 40 is determined from the image sequence 44, which indicates the spatial distribution of the flash rates (so-called flash rate modulation structure).
  • the raw image 40 can be present, for example, as a gray image whose gray values encode the blink rate.
  • Each of the individual raw images 40.o1 to 40.o9 is generated in this way from an image sequence 44.
  • the structuring 41 is constant during the acquisition of an image sequence 44.
  • the blink rate analysis 46 can be, for example, a frequency analysis, which determines the corresponding blink rate from the image sequence 44 and / or blink amplitude for each pixel.
  • an autocorrelation can also be used, as is known from the SOFI principle.
  • a cumulant function is a possible variant for the use of an autocorrelation evaluation. From the entire sentence 39, then e.g. by means of a Fourier transformation 42 generates a high-resolution image 43.
  • Fig. 2 illustrates features of the SBIM principle.
  • the structuring 41 shown is to be understood purely by way of example. In particular, it does not have to be a line structure. The schematically drawn lines along the line can also be further structured.
  • a scanned confocal point illumination with confocal detection instead of the linear structuring used in the aforementioned SIM publications, as described in the publication C. Müller and J. Enderlein, "Image scanning microscopy", Physical Review Letters, 104, 198101 (2010) This principle is referred to as ISM
  • ISM image scanning microscopy
  • a step SO the method is started, which in particular includes sample preparation, the provision of a sample with suitable marker molecules, the preselection of suitable marker molecules, etc . may include.
  • step S1 the sample is then illuminated in a first illumination state, which results in a first blink rate modulation structuring 41.
  • a first image sequence 44 is recorded in a step S2.
  • the blink rate modulation state .01 is the frame 44. o2 of FIG. 4. It consists of a time series of frames 45. t1 to 45. tn.
  • step S3 the blink rate analysis 45 is carried out in order to generate from the image sequence 44.o1 a corresponding raw image 40.o1 which reproduces the first blink rate structure .01.
  • step S45 it is queried whether all the blink rate modulation structures already provided for the further method have already been processed.
  • step S5 is entered, in which a change in the illumination state is set on the microscope 1, which results in a different type of blink rate modulation structure.
  • step S2 which is then run through again, the image sequence 44.sub.o2 of FIG. 4 consisting of individual images 44. t1 to 44.tn is then recorded.
  • step S3 by an analysis 46 for generating a raw image 40, in this case the raw image 40.
  • steps S2, S3, S4 and S5 is run through until the predetermined different structurings 41 have been obtained. There is then a corresponding number of raw images 40 before, for example, nine pieces that are in terms of lighting condition, d. H. differentiate the spatial position of a flashing rate modulation structure.
  • any structure that is known and suitable for the SIM or ISM principle can be used for the flash rate modulation structure.
  • the high-resolution image 43 is generated by suitable mathematical combination of the individual images 40.x, for example by means of a Fourier analysis 42.
  • the method is then ended.

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Abstract

Mikroskopieverfahren zum Erzeugen eines hochaufgelösten Bildes (55) einer Probe (2), wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist: a) die Probe (2) mit einem Marker versehen wird, der nach Anregung statistisch blinkend Lumineszenzstrahlung abgibt, oder eine Probe (2) verwendet wird, die Moleküle aufweist, welche nach Anregung statistisch blinkend Lumineszenzstrahlung abgeben, b) die Probe (2) durch strukturierte Beleuchtung so zur Lumineszenz angeregt wird, daß die Marker/Moleküle mit einer Blinkrate blinkend Lumineszenzstrahlung abgeben, wobei - die Beleuchtung so strukturiert wird, daß die Blinkrate lokal variiert und - die Probe (2) wiederholt in verschiedenen Beleuchtungszuständen (.o1-.o9) der strukturierten Beleuchtung beleuchtet wird, so daß für jeden Beleuchtungszustand eine andere lokale Verteilung der Blinkrate erhalten wird, c) die lumineszierende Probe (2) in jedem der unterschiedlichen Beleuchtungszustände wiederholt auf einen Detektor (6) abgebildet wird, so daß für jeden der verschiedenen Beleuchtungszustände (.o1-.9) eine Bildfolge (44) erhalten wird, d) aus jeder Bildfolge (44) ein Rohbild (40) erzeugt wird, das die lokale Verteilung der Blinkrate in der Probe (2) wiedergibt, e) aus den erhaltenen Rohbildern (40.o1-40.o9) durch eine eine Fourierfilterung umfassende rechnerische Bearbeitung (42) das hochaufgelöste Bild (43), das eine gegenüber der Abbildung auf den Detektor (6) gesteigerte Ortsauflösung aufweist, erzeugt wird.

Description

Hochauflösende Lumineszenzmikroskopie
Die Erfindung bezieht sich auf ein Mikroskopieverfahren bzw. ein Mikroskop zum Erzeugen eines hochaufgelösten Bildes einer lumineszierenden Probe.
Die Untersuchung von Proben mittels Mikroskopie ist ein weites technisches Gebiet, für das es vielfältige technische Lösungen gibt. Ausgehend von der klassischen Lichtmikroskopie haben sich verschiedenste Mikroskopieverfahren entwickelt. Ein klassisches Anwendungsgebiet der Lichtmikroskopie zur Untersuchung von biologischen Präparaten ist die Lumineszenzmikroskopie. Hierbei werden bestimmte Farbstoffe (sogenannte Phosphore oder Fluorophore) zur spezifischen Markierung von Proben, z.B. von Zellteilen, verwendet. Die Probe wird, wie erwähnt, mit Anregungsstrahlung beleuchtet und das dadurch angeregte Lumineszenzlicht mit geeigneten Detektoren erfaßt. Üblicherweise ist dazu im Lichtmikroskop ein dichroitischer Strahlteiler in Kombination mit Blockfiltern vorgesehen, die die Fluoreszenzstrahlung von der Anregungsstrahlung abspalten und eine getrennte Beobachtung ermöglichen. Durch dieses Vorgehen ist die Darstellung einzelner, verschieden gefärbter Zellteile im Lichtmikroskop möglich. Natürlich können auch mehrere Teile eines Präparates gleichzeitig mit verschiedenen, sich spezifisch an unterschiedliche Strukturen des Präparates anlagernden Farbstoffen eingefärbt werden. Dieses Verfahren bezeichnet man als Mehrfachlumineszenz. Auch kann man Proben vermessen, die per se, also ohne Markierungsstoffzugabe lumineszieren.
Lumineszenz wird hier, wie allgemein üblich, als Oberbegriff für Phosphoreszenz und Fluoreszenz verstanden, erfaßt also beide Prozesse.
Weiter ist es zur Probenuntersuchung bekannt, Laser-Scanning-Mikroskopie (auch LSM abgekürzt) zu verwenden, die aus einem dreidimensional ausgeleuchteten Bild mittels einer konfokalen Detektionsanordnung (dann spricht man von einem konfokalen LSM) oder einer nichtlinearen Probenwechselwirkung (sogenannte Multiphotonenmikroskopie) nur diejenige Ebene wiedergibt, die sich in der Fokusebene des Objektives befindet. Es wird ein optischer Schnitt gewonnen, und die Aufzeichnung mehrerer optischer Schnitte in verschiedenen Tiefen der Probe erlaubt es anschließend, mit Hilfe einer geeigneten Datenverarbeitungseinrichtung ein dreidimensionales Bild der Probe zu generieren, das aus den verschiedenen optischen Schnitten zusammengesetzt ist. Die Laser-Scanning-Mikroskopie ist somit zur Untersuchung von dicken Präparaten geeignet.
Für Auflösungen jenseits der Beugungsgrenze, die durch die physikalischen Gesetze gegeben ist, wurden in der letzen Zeit verschiedene Ansätze entwickelt. Diese Mikroskopieverfahren zeichnen sich dadurch aus, daß sie im Vergleich zum klassischen Mikroskop dem Anwender eine höhere laterale und/oder axiale optische Auflösung zur Verfügung stellen. In dieser Beschreibung werden solche Mikroskopieverfahren als hochauflösende Mikroskopieverfahren bezeichnet, da sie eine Auflösung jenseits der optischen Beugungsgrenze erreichen. Beugungsbegrenzte Mikroskope werden hingegen als klassische Mikroskope bezeichnet. Sie realisieren bekannte optische Weitfeldmikroskopie oder Laser-Scanning-Mikroskopie.
Ein hochauflösendes Mikroskopieverfahren ist in der EP 1 157297 B1 angesprochen. Dabei werden mittels strukturierter Beleuchtung nichtlineare Prozesse ausgenützt. Als Nichtlinearität dient die Sättigung der Fluoreszenz. Durch eine strukturierte Beleuchtung erfolgt eine Verschiebung des Objektraumspektrums relativ zur Übertragungsfunktion des optischen Systems. Konkret bedeutet die Verschiebung des Spektrums, daß Objektraumfrequenzen V0 bei einer Raumfrequenz V0 - Vm, wobei Vm die Frequenz der strukturierten Beleuchtung ist, übertragen werden. Bei gegebener, durch das System maximal übertragbarer Raumfrequenz ermöglicht dies den Transfer von um die Verschiebefrequenz Vm über der maximalen Frequenz der Übertragungsfunktion liegender Raumfrequenzen des Objektes. Dieser Ansatz erfordert eine Fourierfilterung als Rekonstruktionsalgorithmus zur Bilderzeugung und die Verwertung mehrerer Aufnahmen für ein Bild. Die bezüglich der entsprechenden Beschreibung des auflösenden Mikroskopieverfahrens ebenfalls voll einbezogene EP 1 157297 B1 verwendet also eine strukturierte Weitfeldbeleuchtung der Probe, beispielsweise durch ein Amplituden/Phasen- Gitter. Fluoreszenz in der Probe wird ebenfalls weitfelddetektiert. Das Gitter wird nun in mindestens drei verschiedene Drehlagen gebraucht, z. B. 0°, 120° und 240 °, und in jeder Drehlage wird das Gitter in drei oder mehr verschiedene Positionen verschoben. Für die jeweils drei Verschiebungen der drei Drehlagen (insgesamt also mindestens 9 Beleuchtungszustände) wird die Probe weitfelddetektiert. Weiter hat das Gitter Frequenzen möglichst nahe der Grenzfrequenz, zu deren Übertragung die verwendete optische Anordnung in der Lage ist. Unter Verwendung der Fourierfilterung erfolgt dann die erwähnte Verschiebung, wobei insbesondere die 0. und +/- 1 . Beugungsordnung in den Bildern ausgewertet wird. Dieses Mikroskopieverfahren wird auch als SIM-Verfahren bezeichnet. Eine Steigerung der Auflösung erhält man bei diesem Prinzip, wenn die Strukturierung (z.B. durch ein Gitter) so intensiv ist, daß die Fluoreszenz der Probe in den hellen Bereich eine Sättigung erreicht. Dann hat die strukturierte Beleuchtung der Probe auf der Probe keine Sinusverteilung mehr, sondern aufgrund der Sättigungseffekte noch höhere harmonische jenseits der optischen Grenzfrequenz. Diese Weiterbildung des SIM-Verfahrens wird auch als saturated pattern excitation microscopy (SPEM) bezeichnet.
Eine Weiterbildung des SIM-Verfahrens kann auch mit einer linienförmigen Beleuchtung erreicht werden, die senkrecht zur Gitterrichtung liegt. Man hat dann eine Linienbeleuchtung, wobei längs der Linie sich die Gitterstruktur wiederfindet. Die Linien der Beleuchtung ist also ihrerseits durch das Gitter strukturiert. Die linienförmige Beleuchtung erlaubt eine konfokale Schlitzdetektion und damit nochmals eine Auflösungssteigerung. Dieses Verfahren wird auch als SLIM abgekürzt.
Die Veröffentlichung C. Müller und J. Enderlein,„Image scanning microscopy", Physical Review Letters, 104, 198101 (201 0) greift das SIM-Prinzip auf, verwendet allerdings ein Abscannen der Probe mit einer konfokalen Beleuchtung und Detektion mit nachfolgender Fourierfilterung. Dieses Prinzip wird als ISM bezeichnet. Bei ihm liegen nicht neun Orientierungen einer strukturierten Beleuchtung vor, sondern jede Scan-Lage, d. h. jeder Rasterzustand beim Abrastern des Bildes, entspricht einem Beleuchtungszustand, und die strukturierte Beleuchtung ist eine Spotbeleuchtung des Probe.
Aus der Veröffentlichung T. Dertinger, et al.,„Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI)", PNAS (2009), S. 22287-22292 sowie „Achieving increased resolution and more pixels with Superresolution Optical Fluctuation Imaging (SOFI)", Opt. Express, 30.08.2010, 18(18) : 18875-85, doi : 10.1364/1 E.18.018875 und S. Geissbuehler et al. , „Comparison between SOFI and STORM", Biomed. Opt. Express 2, 408-420 (201 1 ) ist ein weiteres hochauflösendes Verfahren der Lumineszenzmikroskopie bekannt. Dieses Verfahren nutzt die Blinkeigenschaften eines Fluorophors. Blinken die Fluorophore einer Probe statistisch unabhängig voneinander, kann eine Abbildung der Probe durch geeignete Filterung mit einer sogenannten Kumulantenfunktion eine erhebliche Auflösungserhöhung über die physikalisch vorgegebene optische Auflösungsgrenze hinaus erreicht werden. Ein Beispiel für eine solche Kumulantenfunktion ist beispielsweise die Autokorrelationsfunktion zweiter Ordnung. Zur Erzeugung eines hochaufgelösten Bildes wird dabei eine Folge von Einzelbildern aufgenommen und dann mit der Kumulantenfunktion zu einem Einzelbild vereinigt, das dann die höhere Auflösung hat. Dieses Verfahren wird in Abkürzung des Begriffes „Super-Resolution Optical Fluctuation Imaging" als SOFI-Verfahren bezeichnet. Im Stand der Technik ist es weiter bekannt, mehrere hochauflösende Mikroskopieverfahren zu kombinieren. So beschreibt beispielsweise die DE 102008054317 A1 die Kombination diverser hochauflösender Mikroskopieverfahren, mit dem Ziel für einzelne Probenbereiche jeweils das unter den Gesichtspunkten Auflösung und Meßgeschwindigkeit optimale Verfahren einsetzen zu können.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mikroskopieverfahren bzw. ein Mikroskop zu schaffen, das eine gesteigerte Auflösung erreicht.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst mit einem Mikroskopieverfahren zum Erzeugen eines hochaufgelösten Bildes einer Probe, wobei a) die Probe mit einem Marker versehen wird, der nach Anregung statistisch blinkend Lumineszenzstrahlung abgibt, oder eine Probe verwendet wird, die Moleküle aufweist, welche nach Anregung statistisch blinkend Lumineszenzstrahlung abgeben, b) die Probe durch strukturierte Beleuchtung so zur Lumineszenz angeregt wird, daß die Marker/Moleküle mit einer Blinkrate blinkend Lumineszenzstrahlung abgeben, wobei die Beleuchtung so strukturiert wird, daß die Blinkrate lokal variiert und die Probe wiederholt in verschiedenen Beleuchtungszuständen der strukturierten Beleuchtung beleuchtet wird, so daß für jeden Beleuchtungszustand eine andere lokale Verteilung der Blinkrate erhalten wird, c) die lumineszierende Probe in jedem der unterschiedlichen Beleuchtungszustände wiederholt auf einen Detektor abgebildet wird, so daß für jeden der verschiedenen Beleuchtungszustände eine Bildfolge erhalten wird, d) aus jeder Bildfolge ein Rohbild der Probe erzeugt wird, das die lokale Verteilung der Blinkrate wiedergibt, e) aus den erhaltenen Rohbildern durch eine eine Fourierfilterung umfassende rechnerische Bearbeitung das hochaufgelöste Bild, das eine gegenüber der Abbildung auf den Detektor gesteigerte Ortsauflösung aufweist, erzeugt wird.
Die Aufgabe wird ebenfalls gelöst mit einem Mikroskop zum Erzeugen eines hochaufgelösten Bildes einer Probe, wobei die Probe mit einem Marker versehen ist, der nach Anregung statistisch blinkend Lumineszenzstrahlung abgibt, oder einer Probe, die die Moleküle aufweist, welche nach Anregung statistisch blinkend Lumineszenzstrahlung abgeben, einen Detektionsstrahlengang und einen Beleuchtungsstrahlengang, wobei der Detektionsstrahlengang die Probe auf einen Detektor abbildet und der Beleuchtungsstrahlengang die Probe mit durch strukturierte Beleuchtung zur Anregung von Lumineszenz beleuchtet, wobei der Beleuchtungsstrahlengang eine Einrichtung zu Realisierung von verschiedenen Beleuchtungszuständen aufweist, eine Rechen- und Steuereinrichtung, die das Mikroskop so steuert, daß die Probe durch strukturierte Beleuchtung so zur Lumineszenz angeregt ist, daß die Marker/Moleküle mit einer Blinkrate blinkend Lumineszenzstrahlung abgeben, die Beleuchtung so strukturiert ist, daß die Blinkrate lokal variiert und die Probe wiederholt in verschiedenen Beleuchtungszustanden der strukturierten Beleuchtung beleuchtet ist, so daß für jeden Beleuchtungszustand eine andere lokale Verteilung der Blinkrate erhalten wird, die Rechen- und Steuereinrichtung den Detektor so ausliest, daß eine Bildfolge der lumineszierende Probe in jedem der unterschiedlichen Beleuchtungszustände erhalten ist, die Rechen- und Steuereinrichtung aus jeder Bildfolge ein Rohbild erzeugt, das die lokale Verteilung der Blinkrate wiedergibt, die Rechen- und Steuereinrichtung aus den erhaltenden Rohbildern durch eine eine Fourierfilterung umfassende rechnerische Bearbeitung das hochaufgelöste Bild, das eine gegenüber der Abbildung auf den Detektor gesteigerte Ortsauf lösung aufweist, erzeugt.
Die Erfindung verwendet eine strukturierte Beleuchtung derart, daß in der Probe eine örtliche Blinkratenmodulation erfolgt. Diese Blinkratenmodulation dient dann dazu, um unter Ausnützung der aus dem SIM-Konzept bekannten Prinzipien ein höher aufgelöstes Bild zu erzeugen. Im Unterschied zum bekannten SIM-Prinzip werden also nicht mehrere Beleuchtungszustände verwendet, die sich hinsichtlich der Fluoreszenzintensitätsmodulation unterscheiden, sondern es werden Beleuchtungszustände verwendet, die sich hinsichtlich der Blinkratenmodulation unterscheiden. Das erfindungsgemäße Konzept kann deshalb mit der Abkürzung SBIM versehen werden.
Die Probe wird in verschiedenen Beleuchtungszuständen beleuchtet. Die Beleuchtungszustände unterscheiden sich hinsichtlich der damit erzeugten Blinkratenmodulation. Um für einen gegebenen Beleuchtungszustand die Blinkratenmodulation zu ermitteln, wird eine Bildfolge aufgenommen, so daß die Bilder jeweils unterschiedliche Blinkzustände bei ein und demselben Blinkratenmodulationszustand zeigen. Durch geeignete Auswertung der Bildfolge wird der Blinkratenmodulationszustand ermittelt. Dies stellt ein Rohbild dar. Aus jedem Blinkratenmodulationszustand wird auf diese Weise ein Rohbild erzeugt. Die mehreren Rohbilder werden dann gemäß den für SIM bekannten Konzepten in ein hochaufgelöstes Bild umgesetzt.
Eine Blinkratenmodulation (d. h. ein Beleuchtungszustand) kann beibehalten werden, bis die Bildfolge aufgenommen ist. Alternativ können die Bildfolgen für alle Blinkratenmodulationen (d. h. alle Beleuchtungszustände) simultan aufgebaut werden, indem die Zustände zyklisch durchgewechselt werden.
Gegenüber dem bekannten SIM-Prinzip erhält man den Vorteil einer besseren Auflösungssteigerung, da die meisten Fluorophore in ihren Blinkeigenschaften mit deutlich kürzeren Wellenlängen beeinflu ßbar sind. Auch bewirkt die nichtlineare Verrechnung der Fluoreszenzintensitäten eine Rauschunterdrückung bei der Erzeugung der Rohbilder.
Die Modulation der Blinkrate ist im Stand der Technik bekannt. Sie hängt in aller Regel linear von der Anregungsintensität ab, wie beispielsweise der Veröffentlichung S. van de Linde et al., „Photoinduced formation of reversible dye radicals and their impact on super-resoulition imaging", Photochem. Photobiol. Sei. , 201 1 , 10, 499, zu entnehmen ist. Das Auslesen der Blinkrate ortsaufgelöst (z. B. pro Pixel des Detektors) ist über verschiedene Verfahren möglich, beispielsweise Autokorrelation, Frequenzanalyse (z. B. Auswertung eines Maximums in einem vorher bestimmten Frequenzband, das für Blinkraten des Farbstoffes charakteristisch ist).
Die Ortsinformation, die in den Rohbildern steckt, also die Ortsabhängigkeit der Blinkrate, kann beispielsweise mittels einer Frequenzanalyse ermittelt werden. Dabei bestimmt man z. B. die mittlere Blinkrate und/oder Amplitude. Im Rohbild können dann beispielsweise Grauwerte vorliegen, die der Blinkrate oder alternativ der Blinkamplitude zugeordnet sind.
Für die Verrechnung der Rohbilder sind, wie für das SIM-Prinzip bekannt, verschiedene Beleuchtungszustände, beispielsweise verschiedene Drehlagen und Längsverschiebungen einer Blinkratenmodulationsstruktur erforderlich. Alternativ kann auch gemäß dem ISM-Prinzip mit einem Punktscanner gearbeitet werden.
Je nach Marker bzw. Moleküle in den Proben , kann eine zweistufige Anregung verwendet werden. Dann wird zuerst die Fluoreszenz angeregt und dann bei einer anderen Wellenlänge die Blinkrate moduliert.
Verwendet man Marker bzw. Probenmoleküle, die statistisch unabhängig voneinander blinken, bei denen also das Blinken eines Moleküls nicht das Blinken des benachbarten Moleküls beeinflu ßt, läßt sich die Erzeugung des Rohbildes auch mittels der aus dem SOFI-Konzept bekannten Vorgehensweise, d. h. durch Verwendung einer sogenannten Kumulantenfunktion, erhalten.
Um eine Bildfolge möglichst kurz wählen zu können, ist es zu bevorzugen, die Aufnahme jedes einzelnen Bildes so zu wählen, daß sie nicht größer ist als der Kehrwert einer mittleren Blinkrate, vorzugsweise nicht großer als 1 /10 des Kehrwertes.
Die strukturierte Beleuchtung zur Modulation der Blinkrate kann hinsichtlich der Strahlungsintensität strukturiert sein. Je nach Molekül ist aber auch eine Farbstrukturierung, also eine Strukturierung hinsichtlich der Wellenlängenverteilung bzw. eine Strukturierung hinsichtlich der Polarisationsverteilung möglich.
Soweit die Erfindung Merkmale des SIM-Prinzipes verwendet, seien folgende Druckschriften, die sich mit Details des SIM-Prinzipes befassen, vollumfänglich in ihrer Offenbarung hier eingebunden: EP 1 157297 B1 , DE 19908883 A1 , M. Gustafsson, „Nonlinear structured- illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution", Proc Natl Acad Sei USA, 13.09.2005, 102(37): 13081 -6, Epub 2.09.2005; R. Heintzmann und C. Cremer, (1998), Proc. SPIE Int. Soc. Opt. Eng. 3568, S. 185-195. Analoges gilt für die ISM- Publikation Veröffentlichung C. Müller und J. Enderlein,„Image scanning microscopy", Physical Review Letters, 104, 198101 (2010).
Soweit die Erfindung Merkmale des SOFI-Prinzipes verwendet, seien folgende, für dieses Prinzip relevante Veröffentlichungen ebenfalls voll eingebunden: T. Dertinger et al., „Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluetuation imaging (SOFI)", PNAS (2009), S. 22287-22292 samt zugehöriger „Supporting Information"; „Achieving increased resolution and more pixels with Superresolution Optical Fluetuation Imaging (SOFI)", Opt. Express, 30.08.2010, 18(18): 18875-85, doi: 10.1364/IE.18.018875 und S. Geissbuehler et al., „Comparison between SOFI and STORM", Biomed. Opt. Express 2, S. 408-420 (201 1 ).
Erfindungsgemäß wird die Probe mit einem Marker versehen, der nach geeigneter Anregung statistisch blinkend Lumineszenzstrahlung abgibt. Unter Marker werden dabei übliche Label oder sonstige Substanzen versehen, die sich an darzustellenden Strukturen der Probe anlagern. Alternativ kann eine bereits entsprechend lumineszierende Probe verwendet werden. Letztlich wird also eine Probe mikroskopisch abgebildet, die Strukturen aufweist, welche statistisch blinkend Lumineszenzstrahlung abgeben.„Statistisch blinkend" heißt dabei, daß die einzelnen Marker oder Probenmoleküle jeweils für sich unabhängig von benachbarten Markern oder Molekülen ständig zwischen zwei Lumineszenzstrahlungszuständen wechseln. Dies können im einfachsten Fall ein Zustand, in dem Lumineszenzstrahlung abgegeben wird, und ein Zustand sein, in dem keine Lumineszenzstrahlung abgegeben wird. Es ist aber auch der Wechsel zwischen der Abgabe zweier sich unterscheidender Arten von Lumineszenzstrahlung möglich, beispielsweise ein Wellenlängenwechsel, Polarisationswechsel etc.
Es ist in einer Weiterbildung der Erfindung bevorzugt, daß die Bildaufnahmegeschwindigkeit und die Blinkrate der verwendeten Moleküle geeignet aneinander angepaßt werden. Dies kann zum einen durch Auswahl geeigneter Marker- oder Probenmoleküle erreicht werden. Natürlich ist es auch möglich, durch geeignete Beeinflussung die Blinkrate der Moleküle anzupassen. Je nach Molekül kommen hier verschiedene physikalische Einflußgrößen in Frage, insbesondere Temperatur, Wellenlänge der als Anregungsstrahlung wirkenden Beleuchtungsstrahlung, Intensität der als Anregungsstrahlung wirkenden Beleuchtungsstrahlung, etc. Auch sind chemische Beeinflussungen möglich, wie z. B. von Geissbuehler et al. erläutert. Weiter kann man für eine gegebene Blinkrate die Bildaufnahmedauer entsprechend anpassen, um den oben erwähnten Zustand zu erreichen.
Soweit die Erfindung vorstehend oder nachfolgend unter Bezugnahme auf Verfahrensmerkmale beschrieben ist, soll dies gleichermaßen auch für die Beschreibung eines entsprechenden Mikroskops aus den oben erwähnten Merkmalen gelten. Wesentlich für das Mikroskop ist, daß seine Rechen- und Steuereinrichtung einen entsprechenden Betrieb des Mikroskops zur Realisierung der geschilderten Verfahrensmerkmale gewährleistet. Die Rechen- und Steuereinrichtung ist dazu geeignet ausgebildet, beispielsweise durch eine passende Programmierung. Umgekehrtes gilt natürlich für den Fall, daß einzelne Merkmale lediglich anhand des Mikroskops beschrieben sein sollten. Diese Merkmale gelten dann analog für die beschriebenen Mikroskopieverfahren.
Für das SIM-Konzept ist eine Rotation der strukturierten Beleuchtung erforderlich, wie bereits geschildert wurde. Diese läßt sich besonders einfach realisieren, wenn dem Gitter, welches zur Realisierung dieser Mikroskopieverfahren im gemeinsamen Abschnitt von zweiten und dritten Beleuchtungsstrahlengang liegt ein Bildfeldrotator nachgeordnet ist. Dieser kann beispielsweise durch ein Abbe-König-Prisma realisiert sein.
Es versteht sich , daß die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen , die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen :
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung eines Kombinationsmikroskops,
Fig. 2 eine Schemadarstellung zur Verdeutlichung der Erzeugung eines hochaufgelösten
Bildes aus mehreren Rohbildern einer Probe, die aus Bildfolgen unterschiedlicher
Beleuchtungszustände erhalten wurden,
Fig. 3 eine Schemadarstellung zur Veranschaulichung der Erzeugung der Bildfolgen der
Fig. 2,
Fig. 4 eine weitere Schemadarstellung eines Verfahrens zur Erzeugung eines höher aufgelösten Bildes und Fig. 5 ein Ablaufdiagramm der Erzeugung eines höher aufgelösten Bildes.
In Fig. 1 ist ein Mikroskop 1 dargestellt, das klassische Mikroskopieverfahren, d. h . Mikroskopieverfahren deren Auflösung beugungsbegrenzt ist, mit hochauflösenden Mikroskopieverfahren simultan ausführen kann, d. h. mit Mikroskopieverfahren deren Auflösung über die Beugungsgrenze hinaus gesteigert ist.
Das Mikroskop 1 ist auf Basis eines herkömmlichen Laser-Scanning-Mikroskops aufgebaut und erfaßt eine Probe 2. Dazu weist es ein Objektiv 3 auf, durch das die Strahlung für alle Mikroskopieverfahren läuft.
Das Objektiv 3 bildet über einen Strahlteiler 4 die Probe zusammen mit einer Tubuslinse 5 auf einen CCD-Detektor 6 ab, der im Beispiel ein allgemein möglichen Flächendetektor ist. Insofern verfügt das Mikroskop 1 über ein herkömmliches Lichtmikroskopmodul 7 und der Strahlengang von der Probe 2 durch das Objektiv 3 und die Tubuslinse 5 zum CCD-Detektor 6 entspricht einem herkömmlichen Weitfeld-Detektionsstrahlengang 8. Der Strahlteiler 4 ist, wie durch den Doppelpfeil in Fig. 1 angedeutet, austauschbar, um zwischen Strahlteilern mit verschiedenen dichroitischen Eigenschaften bzw. achromatischen Strahlteilern gemäß US 2008/0088920 wechseln zu können.
In den Strahlengang zum Objektiv 3 ist weiter ein Laser-Scanning-Modul 9 angebunden, dessen LSM-Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang über einen Schaltspiegel 1 1 , der ebenfalls Strahlteilerfunktionen hat, in den Strahlengang zum Objektiv 3 eingekoppelt ist. Der Strahlengang vom Schaltspiegel 1 1 zum Objektiv 3 durch den Strahlteiler 4 ist also ein Strahlengang, in dem Beleuchtungsstrahlengang und Detektionsstrahlengang vereint sind. Dies gilt sowohl hinsichtlich des Laser-Scanning-Moduls 9 also auch hinsichtlich des Weitfeld- Detektionsstrahlengangs 8, da, wie noch zu erläutern sein wird, am Schaltspiegel 1 1 auch Beleuchtungsstrahlung eingekoppelt wird, die zusammen mit dem Weitfeld- Detektionsstrahlengang 8, d. h. dem CCD-Detektor 6 Mikroskopieverfahren realisiert.
Der Schaltspiegel 1 1 und der Strahlteiler 4 sind zu einem Strahlteilermodul 12 zusammengefaßt, wodurch die Möglichkeit besteht, den Schaltspiegel 1 1 und den Strahlteiler 4 anwendungsabhängig zu wechseln. Dies ist auch durch Doppelpfeile veranschaulicht. Weiter im Strahlteilermodul 12 ist ein Emissionsfilter 13 vorgesehen, das im Weitfeld- Detektionsstrahlengang 8 liegt und die spektralen Anteile, welche durch den Weitfeld- Detektionsstrahlengang 8 propagieren können, geeignet filtert. Natürlich ist auch das Emissionsfilter 13 im Strahlteilermodul 12 austauschbar. Das Laser-Scanning-Modul 9 erhält für den Betrieb erforderliche Laserstrahlung über eine Lichtleitfaser 14 von einem Lasermodul 15.
In der in Fig. 1 dargestellten Bauweise wird am Strahlteilermodul 12, genauer am Schaltspiegel 14 ein Sammel-Beleuchtungsstrahlengang 16 eingekoppelt, durch den Beleuchtungsstrahlung für verschiedene Mikroskopieverfahren läuft. In diesen Sammel-Beleuchtungsstrahlengang 16 sind verschiedene Beleuchtungsstrahlengänge einzelner Beleuchtungsmodule eingekoppelt. Beispielsweise koppelt ein Weitfeldbeleuchtungsmodul 17 über einen Schaltspiegel 18 Weitfeldbeleuchtungsstrahlung in den Sammel-Beleuchtungsstrahlengang 16, so daß über eine Tubuslinse 27 und das Objektiv 3 die Probe 2 weitfeldbeleuchtet wird. Das Weitfeldbeleuchtungsmodul kann beispielsweise eine HBO-Lappe aufweisen. Als weiteres Beleuchtungsmodul ist ein TI RF-Beleuchtungsmodul 19 vorgesehen, das bei geeigneter Stellung des Schaltspiegels 18 eine TIRF-Beleuchtung realisiert. Das TI RF-Beleuchtungsmodul 19 erhält dazu Strahlung von Lasermodul 15 über eine Lichtleitfaser 20. Das TI RF- Beleuchtungsmodul 19 weist einen Spiegel 21 auf, der längsverschieblich ist. Durch die Längsverschiebung wird der Beleuchtungsstrahl, der vom TI RF-Beleuchtungsmodul 19 abgegeben wird, senkrecht zur Hauptausbreitungsrichtung des abgegebenen Beleuchtungsstrahls verschoben, wodurch im Ergebnis am Objektiv 3 die TI RF-Beleuchtung unter einem einstellbaren Winkel zur optischen Achse des Objektivs einfällt. Auf diese Weise kann einfach der nötige Winkel der Totalreflexion am Deckglas sichergestellt werden. Natürlich sind auch andere Mittel geeignet, um diese Winkelverstellung zu bewirken.
Weiter ist an dem Sammel-Beleuchtungsstrahlengang der Beleuchtungsstrahlengang eines Manipulatormoduls 22 angekoppelt, das ebenfalls über eine nicht näher bezeichnete Lichtleitfaser Strahlung vom Lasermodul 15 erhält und eine punkt- oder linienförmige Strahlverteilung scannend über die Probe 2 führt. Das Manipulatormodul 22 entsprechend also im wesentlichen dem Beleuchtungsmodul eines Laserscanningmikroskops, und demzufolge kann das Manipulatormodul 22 auch mit dem Detektor des Laser-Scanning-Moduls 9 oder der Weitfeld-Detektion des CCD-Detektors 6 kombiniert betrieben werden.
Im Sammel-Beleuchtungsstrahlengang 16 ist weiter ein Gitter 23 vorgesehen, dessen Gitterkonstante unterhalb der Grenzfrequenz liegt, die mit dem Mikroskop 1 in die Probe 2 übertragen werden kann. Das Gitter 23 ist quer zur optischen Achse des Sammel- Beleuchtungsstrahlengangs 16 verschieblich. Hierzu ist ein entsprechender Verschiebeantrieb 24 vorgesehen . In Beleuchtungsrichtung dem Gitter nachgeordnet sitzt im Sammel-Beleuchtungsstrahlengang 16 weiter ein Bildfeldrotator 25, der von einem Rotatorantrieb 26 gedreht wird. Bei dem Bildfeldrotator kann es sich beispielsweise um ein Abbe-König-Prisma handeln. Die Module und Antriebe sowie Detektoren des Mikroskops 1 sind alle über nicht näher bezeichnete Leitungen mit einer Steuereinrichtung 28 verbunden. Diese Verbindung kann beispielsweise über einen Daten- und Steuerbus erfolgen. Die Steuereinrichtung 28 steuert das Mikroskop 1 in verschiedene Betriebsmodi. Das Steuergerät 28 erlaubt es somit am Mikroskop 1 klassische Mikroskopie, d. h. Weitfeldmikroskopie (WF), Laserscanningmikroskopie (LSM) und auch Fluoreszenzmikroskopie mit totaler interner Reflexion (TIRF) auszuführen. Das Mikroskop der Fig. 1 weist im wesentlichen zwei zum Laserscannerbeleuchten geeignete Module auf, nämlich das Laserscanningmodul 9 sowie das Manipulatormodul 22. Natürlich sind auch andere Kombinationen möglich. Diese Module sind über Tubuslinsen mit dem Objektiv 3 auf die Probe 2 gekoppelt. Das Manipulatormodul 22 beinhaltet lediglich den Anregungsteil eines Laserscanningmoduls, ohne Detektion . Dadurch kann die Probe punktförmig beleuchtet und der Beleuchtungsspot über die Probe 2 gerastert werden. Vorzugsweise befindet sich im Manipulatormodul 2 auch eine Umschalteinheit, z. B. eine Umschaltlinse oder Zylinderlinse, mit welcher eine Umschaltung zwischen einer punktförmigen und einer linienformigen Beleuchtung erfolgt. Diese linienförmige Beleuchtung ist besonders dann vorteilhaft, wenn das Gitter 23, welches sich in einem Zwischenbild des Sammel-Beleuchtungsstrahlengangs 16 befindet, eingeschwenkt ist und senkrecht zur Linie der linienformigen Beleuchtung liegt. Alternativ zum Gitter 23 kann auch ein variabel einstellbarer Streifenmodulator oder ein DMD zur Erzeugung einer strukturierten Beleuchtung in der Probe 2 eingesetzt werden. Dann ist natürlich der Verschiebeantrieb 24 sowie die Ein-/Ausschwenkbarkeit des Gitters 23 nicht mehr erforderlich. Der Bildfeldrotator 25 erlaubt es, die strukturierte Beleuchtung, die durch das Gitter 23 (oder die dieses ersetzende Elemente) erzeugt werden, um die optische Achse des Sammel- Beleuchtungsstrahlenganges 16 zu drehen, so daß die strukturierte Beleuchtung in verschiedenen Winkeln in der Probe 2 liegt. Zur Umschaltung zwischen einzelnen Betriebsarten werden die Schaltspiegel 18 und 1 1 sowie der Strahlteiler 4 geeignet eingestellt. Hierzu können in der Realisierung Klapp- oder Einschenkspiegel verwendet werden, so daß eine Umschaltung zwischen den Betriebsarten sequentiell erfolgen kann. Alternativ sind auch dichroitische Spiegel möglich, welche einen gleichzeitigen Betrieb der verschiedenen Module ermöglichen.
Der Strahlteiler 4 ist vorzugsweise als dichroitischer Strahlteiler ausgeführt, wobei die Spektraleigenschaften so einstellbar sind, daß Spektralanteile von Fluoreszenzemission von Markierungsmolekülen, die mit Hilfe des CCD-Detektors 6 detektiert werden sollen, in den Weitfeld-Detektionsstrahlengang 8 gelangen und die übrigen Spektralkomponenten möglichst transmittiert werden. Zur Erhöhung der Flexibilität bezüglich der Verwendbarkeit von Markierungsmolekülen mit verschiedenen Emissionscharakteristiken sind im Strahlteilermodul 12 mehrere verschiedene Strahlteiler 4 und Emissionsfilter 13 austauschbar angeordnet, z. B. auf einem Filterrad.
Das oben beschriebene Mikroskop dient nun dazu, ein hochaufgelöstes Mikroskopbild zu erzeugen. Dazu ist das Steuergerät 28 geeignet ausgebildet, beispielsweise durch eine geeignete Programmierung. Bevor mögliche Verfahrensabläufe anhand der Fig. 4 und 5 erläutert werden, seien zunächst anhand der Fig. 2 und 3 wesentliche Merkmale und Prinzipien erläutert, die Bestandteile der zu beschreibenden Mikroskopieverfahren sind.
Fig. 2 verdeutlicht exemplarisch das verwendete Konzept zur Erzeugung eines höher aufgelösten Bildes. Die im Mikroskop 1 der Fig. 1 mikroskopierte Probe wird wiederholt weitfeld- abgebildet, wobei unterschiedliche Beleuchtungszustände eingestellt werden.
Fig. 2 zeigt einen Satz 30 von einzelnen Rohbildern 40, die sich hinsichtlich einer Strukturierung 41 unterscheiden, die durch eine geeignete Beleuchtung mittels des Beleuchtungsstrahlenganges 8 auf die Probe aufgebracht wird. Wie zu sehen ist, ist die Strukturierung 41 in den verschiedenen Rohbildern 40 unterschiedlich. Die Strukturierung betrifft eine Blinkrate der fluoreszierenden Probe. Insgesamt liegen exemplarisch neun einzelnen Rohbilder 40 vor. Es gibt also neun unterschiedliche Orientierungen der Strukturierung 41 . Die unterschiedlichen Strukturierungen sind in der Darstellung der Fig. 2 durch eine Anfügung ,,.o1 " bis ,,.o9" an das Bezugszeichen 40 des jeweiligen Rohbildes bezeichnet.
Die Strukturierung betrifft eine Blinkratenmodulation. Die einzelnen Rohbilder 40.x unterscheiden sich also hinsichtlich unterschiedlicher Blinkratenstrukturierungen. Beispielsweise kann in den schwarz markierten Bereichen eine Blinkrate vorliegen, die über den wei ßen Bereichen eines Rohbildes 40.x liegt. Die Draufsicht auf die einzelnen Rohbilder 40.x zeigt, daß sich die neun Orientierungen der Strukturierung hinsichtlich einer Verschiebelage und einer Drehlage unterscheiden. Es sind natürlich auch höhere Anzahlen unterschiedlicher Strukturierungen möglich, wie dies aus den im allgemeinen Teil der Beschreibung aufgelisteten Publikationen zum Prinzip SIM bekannt ist.
Die Erzeugung der einzelnen Rohbilder 40.x im Satz 39 ist in Fig. 3 veranschaulicht. Für eine Orientierung der Strukturierung 41 wird eine Bildfolge 44 aufgenommen, die aus Einzelbildern 45. t1 bis 45.tn entsteht. Die Einzelbilder 45.x werden dabei jeweils über eine Zeitdauer aufgenommen, die vorzugsweise kurz gegen den Kehrwert einer mittleren Blinkrate der Probenmoleküle bzw. verwendeter Marker ist. Jedes Bild 45.x stellt somit einen momentanen Blinkzustand dar. Um die örtliche Verteilung der Blinkrate zu ermitteln, wird die Bildfolge 44 aufgenommen. Mittels einer Blinkratenanalyse 46 wird aus der Bildfolge 44 ein Rohbild 40 ermittelt, das die örtliche Verteilung der Blinkraten (sogenannte Blinkratenmodulationsstruktur) angibt. Das Rohbild 40 kann beispielsweise als Graubild vorliegen, dessen Grauwerte die Blinkrate codieren . Jedes der einzelnen Rohbilder 40.o1 bis 40.o9 wird auf diese Weise aus einer Bildfolge 44 erzeugt. Die Strukturierung 41 ist während der Aufnahme einer Bildfolge 44 konstant.
Die Blinkratenanalyse 46 kann beispielsweise eine Frequenzanalyse sein, welche für jedes Pixel die entsprechende Blinkrate aus der Bildfolge 44 und/oder Blinkamplitude ermittelt. Alternativ kann auch eine Autokorrelation verwendet werden, wie aus dem SOFI-Prinzip bekannt ist. Eine Kumulantenfunktion ist eine mögliche Variante für den Einsatz einer Autokorrelationsauswertung. Aus dem gesamten Satz 39 wird dann z.B. mittels einer Fourier-Transformation 42 ein hochaufgelöstes Bild 43 erzeugt.
Fig. 2 veranschaulicht also Merkmale des SBIM-Prinzipes. Die gezeigte Strukturierung 41 ist jedoch rein exemplarisch zu verstehen. Insbesondere mu ß sie keine Linienstrukturierung sein. Auch können die schematisch eingezeichneten Linien längs der Linie noch weiter strukturiert sein. Gleichermaßen ist es möglich, anstelle der in den eingangs genannten SIM-Publikationen verwendeten linienartigen Strukturierung auch eine gescannten konfokale Punkt-Beleuchtung mit konfokaler Detektion einzusetzen, wie dies aus der Veröffentlichung C. Müller und J. Enderlein,„Image scanning microscopy", Physical Review Letters, 104, 198101 (2010) bekannt ist. Dieses Prinzip wird als ISM bezeichnet. Natürlich liegen dann nicht neun Orientierungen einer strukturierten Beleuchtung vor, sondern eine geeignete Vielzahl an Einzelbildern, die aus dem Abscannen einer Probe gewonnen wurden. Jedes Bild 40 entspricht dann einer bestimmten Scan-Lage, d. h. einem bestimmten Rasterzustand beim Abrastern des Bildes. Fig. 4 zeigt in Zusammenschau die Abfolge der Erzeugung des hochaufgelösten Bildes 43. Das entsprechende Ablaufdiagramm zeigt Fig. 5. In einem Schritt SO wird das Verfahren gestartet, was insbesondere die Probenpräparation, das Versehen einer Probe mit geeigneten Markierungsmolekülen, die Vorauswahl geeigneter Markierungsmoleküle etc. umfassen kann.
Anschließend wird dann im Schritt S1 die Probe in einem ersten Beleuchtungszustand beleuchtet, der eine erste Blinkratenmodulations-Strukturierung 41 zur Folge hat. Anschließend wird in einem Schritt S2 eine erste Bildfolge 44 aufgenommen. Aufgrund des Blinkratenmodulationszustandes .01 handelt es sich um die Bildfolge 44. o2 der Fig. 4. Sie besteht aus einer Zeitreihe von Einzelbildern 45. t1 bis 45. tn . Anschließend wird in einem Schritt S3 die Blinkratenanalyse 45 ausgeführt, um aus der Bildfolge 44.o1 ein entsprechendes Rohbild 40.o1 zu erzeugen, das die erste Blinkratenstruktur .01 wiedergibt. Anschlie ßend wird in einem Schritt S45 abgefragt, ob bereits alle Blinkratenmodulationsstrukturen, die für das weitere Verfahren vorgesehen sind, abgearbeitet wurden. Ist dies nicht der Fall, wird zum Schritt S5 gesprungen, in dem am Mikroskop 1 eine Änderung des Beleuchtungszustandes eingestellt wird, der eine andersartige Blinkratenmodulationsstruktur zur Folge hat. In Schritt S2, der dann erneut durchlaufen wird, wird dann die Bildfolge 44. o2 der Fig. 4 bestehend aus Einzelbildern 44. t1 bis 44. tn aufgenommen. Es schließt sich wieder in Schritt S3 eine Analyse 46 zur Erzeugung eines Rohbildes 40, in diesem Fall des Rohbildes 40. o2 an.
Die Schleife aus den Schritten S2, S3, S4 und S5 wird solange durchlaufen, bis die vorbestimmten verschiedenen Strukturierungen 41 erhalten wurden. Es liegt dann eine entsprechende Anzahl an Rohbildern 40 vor, beispielsweise neun Stück, die sich hinsichtlich des Beleuchtungszustandes, d. h. räumliche Lage einer Blinkratenmodulationsstruktur unterscheiden. Natürlich kommt für die Blinkratenmodulationsstruktur, wie bereits erwähnt, jede Struktur in Frage, die für das SIM- oder ISM-Prinzip bekannt und geeignet ist.
Anschließend wird in einem Schritt S6 durch geeignete rechnerische Zusammenfassung der Einzelbilder 40.x, beispielsweise mittels einer Fourier-Analyse 42, das hochaufgelöste Bild 43 erzeugt. In einem Schritt S7 ist das Verfahren dann beendet.

Claims

Patentansprüche
1 . Mikroskopieverfahren zum Erzeugen eines hochaufgelösten Bildes (55) einer Probe (2), wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:
a) die Probe (2) mit einem Marker versehen wird, der nach Anregung statistisch blinkend Lumineszenzstrahlung abgibt, oder eine Probe (2) verwendet wird, die Moleküle aufweist, welche nach Anregung statistisch blinkend Lumineszenzstrahlung abgeben,
b) die Probe (2) durch strukturierte Beleuchtung so zur Lumineszenz angeregt wird, daß die Marker/Moleküle mit einer Blinkrate blinkend Lumineszenzstrahlung abgeben, wobei
- die Beleuchtung so strukturiert wird, daß die Blinkrate lokal variiert und
die Probe (2) wiederholt in verschiedenen Beleuchtungszuständen (.o1 -.o9) der strukturierten Beleuchtung beleuchtet wird, so daß für jeden Beleuchtungszustand eine andere lokale Verteilung der Blinkrate erhalten wird,
c) die lumineszierende Probe (2) in jedem der unterschiedlichen Beleuchtungszustände wiederholt auf einen Detektor (6) abgebildet wird, so daß für jeden der verschiedenen
Beleuchtungszustände (.01 -.9) eine Bildfolge (44) erhalten wird,
d) aus jeder Bildfolge (44) ein Rohbild (40) erzeugt wird, das die lokale Verteilung der Blinkrate in der Probe (2) wiedergibt,
e) aus den erhaltenen Rohbildern (40.o1 -40.o9) durch eine eine Fourierfilterung umfassende rechnerische Bearbeitung (42) das hochaufgelöste Bild (43), das eine gegenüber der Abbildung auf den Detektor (6) gesteigerte Ortsauflösung aufweist, erzeugt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei in Schritt d) eine mittlere Blinkrate und/oder Blinkamplitude örtlich aufgelöst ermittelt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei in Schritt d) zur Erzeugung des Rohbildes eine Kumulantenfunktion verwendet wird, welche durch das Blinken verursachte Intensitätsfluktuationen jedes Pixels in der Bildfolge (44) auswertet.
4. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, wobei in Schritt c) die Aufnahmedauer jedes Bildes (45.t1 -45.tn) so gewählt wird, daß sie nicht größer ist als ein Kehrwert einer mittleren Blinkrate, vorzugsweise nicht größer als 1 /10 des Kehrwertes.
5. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, wobei die verschiedenen Beleuchtungszustände drei Drehlagen und pro Drehlage mindestens drei Verschiebelagen der strukturierten Beleuchtung aufweisen und die Probe auf einen Pixel aufweisenden Flächendetektor (6) abgebildet wird.
6. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, wobei die strukturierte Beleuchtung hinsichtlich der Strahlungsintensität strukturiert wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 -5, wobei die strukturierte Beleuchtung hinsichtlich der Wellenlänge strukturiert wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 -5, wobei die strukturierte Beleuchtung hinsichtlich der Polarisation strukturiert wird.
9. Mikroskop zum Erzeugen eines hochaufgelösten Bildes (43) einer Probe (2), wobei die Probe (2) mit einem Marker versehen ist, der nach Anregung statistisch blinkend
Lumineszenzstrahlung abgibt, oder einer Probe, die die Moleküle aufweist, welche nach Anregung statistisch blinkend Lumineszenzstrahlung abgeben,
einen Detektionsstrahlengang (8) und einen Beleuchtungsstrahlengang (16), wobei der Detektionsstrahlengang (8) die Probe (2) auf einen Detektor (6) abbildet und der Beleuchtungsstrahlengang (16) die Probe (2) mit durch strukturierte Beleuchtung zur Anregung von Lumineszenz beleuchtet, wobei der Beleuchtungsstrahlengang (16) eine Einrichtung zu Realisierung von verschiedenen Beleuchtungszuständen (.o1 -.o9) aufweist,
eine Rechen- und Steuereinrichtung (28), die das Mikroskop (1 ) so steuert, daß
die Probe (2) durch strukturierte Beleuchtung so zur Lumineszenz angeregt ist, daß die Marker/Moleküle mit einer Blinkrate blinkend Lumineszenzstrahlung abgeben, die Beleuchtung so strukturiert ist, daß die Blinkrate lokal variiert und die Probe wiederholt in verschiedenen Beleuchtungszuständen (.o1 -.o9) der strukturierten Beleuchtung beleuchtet ist, so daß für jeden Beleuchtungszustand eine andere lokale Verteilung der Blinkrate erhalten wird,
- die Rechen- und Steuereinrichtung (28) den Detektor (6) so ausliest, daß eine Bildfolge (44) der lumineszierende Probe (2) in jedem der unterschiedlichen Beleuchtungszustände erhalten ist, die Rechen- und Steuereinrichtung (28) aus jeder Bildfolge (44) ein Rohbild (40) erzeugt, das die lokale Verteilung der Blinkrate wiedergibt,
die Rechen- und Steuereinrichtung (28) aus den erhaltenden Rohbildern (40.o1 -40.o9) durch eine eine Fourierfilterung umfassende rechnerische Bearbeitung (42) das hochaufgelöste Bild (43), das eine gegenüber der Abbildung auf den Detektor (6) gesteigerte Ortsauflösung aufweist, erzeugt.
10. Mikroskop nach Anspruch 9, wobei die strukturierte Beleuchtung hinsichtlich der Strahlungsintensität strukturiert ist.
1 1 . Mikroskop nach Anspruch 9, wobei die strukturierte Beleuchtung hinsichtlich der Wellenlänge strukturiert ist.
12. Mikroskop nach Anspruch 9, wobei die strukturierte Beleuchtung hinsichtlich der Polarisation strukturiert ist.
13. Mikroskop nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei die Probe (2) oder deren einen Marker blinkend Lumineszenzstrahlung mit einer mittleren Blinkrate abgibt, und die Aufnahmedauer jedes Bildes so festgelegt ist, daß die Zeitdauer zur Erzeugung eines Satzes (44) nicht größer ist als der Kehrwert der mittleren Blinkrate, vorzugsweise nicht größer als 1/10 des Kehrwertes.
14. Mikroskop nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei die verschiedenen Beleuchtungszustände drei Drehlagen und pro Drehlage mindestens drei Verschiebelagen der strukturierten Beleuchtung aufweisen und der Detektionsstrahlengang (16) die Probe (2) auf einen Pixel aufweisenden Flächendetektor (6) abbildet.
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