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WO2012121409A1 - 温度応答性クロマトグラフィー担体による生理活性物質の精製方法 - Google Patents

温度応答性クロマトグラフィー担体による生理活性物質の精製方法 Download PDF

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WO2012121409A1
WO2012121409A1 PCT/JP2012/056319 JP2012056319W WO2012121409A1 WO 2012121409 A1 WO2012121409 A1 WO 2012121409A1 JP 2012056319 W JP2012056319 W JP 2012056319W WO 2012121409 A1 WO2012121409 A1 WO 2012121409A1
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WO
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temperature
active substance
physiologically active
responsive
chromatography carrier
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PCT/JP2012/056319
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English (en)
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Inventor
一郎 小熊
和雄 奥山
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Asahi Kasei Medical Co Ltd
Original Assignee
Asahi Kasei Medical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Asahi Kasei Medical Co Ltd filed Critical Asahi Kasei Medical Co Ltd
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    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
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    • G01N30/38—Flow patterns
    • G01N30/46—Flow patterns using more than one column
    • G01N30/461—Flow patterns using more than one column with serial coupling of separation columns

Definitions

  • the present invention relates to a method for purifying a physiologically active substance using a temperature-responsive ion exchange chromatography carrier that shows a change in the binding property to the physiologically active substance with a change in temperature.
  • Immunoglobulin is a physiologically active substance that controls the immune reaction.
  • the antibody is obtained from blood of the immunized animal or a cell culture solution of cells possessing antibody-producing ability or an ascites culture solution of the animal.
  • blood and culture fluids containing these antibodies include proteins other than antibodies, or complex contaminants derived from the raw material used for cell culture, and in order to separate and purify antibodies from those impurity components A complicated and time-consuming operation is usually necessary.
  • Liquid chromatography is important for antibody separation and purification.
  • Chromatographic techniques for separating antibodies include gel filtration chromatography, affinity chromatography, ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, and the like, and antibodies are separated and purified by combining these techniques.
  • Patent Document 1 discloses a filler containing a copolymer having a charge capable of changing the effective charge density on the surface of the stationary phase by temperature change, a method for producing the filler, and temperature responsiveness using the filler.
  • a chromatographic method is disclosed.
  • Patent Document 2 discloses a temperature-responsive chromatographic carrier in which a polymer whose hydration power changes within a temperature range of 0 to 80 ° C. is immobilized at a high density on the surface of a substrate by an atom transfer radical polymerization method. Yes.
  • Patent Document 3 discloses a temperature-responsive chromatographic support for growing and reacting a polymer having a charge and changing hydration power within a temperature range of 0 to 80 ° C. by an atom transfer radical method using isopropyl alcohol as a solvent. A manufacturing method is disclosed.
  • Patent Document 4 discloses that a high molecular weight physiologically active substance useful in the fields of biology, medicine, pharmacy and the like can be separated under a specific condition including an aqueous mobile phase within a temperature range of 0 to 80 ° C.
  • a method for producing a liquid chromatography carrier in which a solid surface is coated with a charged polymer that varies in sum is disclosed.
  • Non-Patent Document 1 discloses a temperature-responsive chromatography carrier having a carboxyl group prepared by an atom transfer radical polymerization method and a method for producing the same. Also disclosed is a monomer composition optimized for lysozyme separation in the monomer composition used in the atom transfer radical polymerization method.
  • Patent Document 5 discloses a separation method using mutant protein A (temperature-responsive protein A) whose binding property to an antibody changes due to a change in a three-dimensional structure accompanying a temperature change.
  • the conditions do not cause problems such as damage to biological components to be purified, loss of function, or generation of unintended functions. ), A physiologically active substance is purified.
  • the temperature-responsive ion exchange chromatography carrier has a characteristic that it can bind to an antibody at a high temperature and can elute the antibody at a temperature lower than the temperature at the time of binding.
  • the antibody solution is previously heated to a temperature equivalent to the temperature at which the temperature-responsive ion exchange chromatography carrier has binding properties to the antibody.
  • antibody purification is carried out on an industrial scale, in order to quickly raise the antibody solution to a desired temperature, it is necessary to heat-exchange the antibody solution with a heat medium that is as hot as possible.
  • an object of the present invention is to provide a method capable of efficiently purifying an antibody by temperature-responsive ion exchange chromatography without denaturing the antibody.
  • the present inventors have studied and developed from various angles.
  • the antibody before purifying the antibody with the temperature-responsive ion exchange chromatography carrier, the antibody is bound to the temperature-responsive affinity chromatography carrier in the low temperature region, and the temperature-responsive affinity chromatography carrier binds to the antibody.
  • the antibody is eluted from the temperature-responsive affinity chromatography carrier with a buffer solution in a high-temperature region where the temperature-responsive ion exchange chromatography carrier is a temperature region in which the temperature-responsive ion exchange chromatography carrier is binding to the antibody.
  • the present inventors have found that the antibody can be efficiently purified by suppressing the denaturation of the antibody by purifying the antibody with a cationic ion exchange chromatography carrier.
  • the technology shown in the present invention was completely unpredictable from the prior art, and is expected to develop into a novel antibody separation system that was never found in the prior art.
  • the present invention has been completed based on such findings.
  • the production method described in the present invention makes it possible to suppress antibody denaturation and efficiently purify the antibody using a temperature-responsive ion exchange chromatography carrier.
  • useful physiologically active substances such as antibodies can be separated and purified on an industrial scale by temperature change.
  • the present embodiment exemplify apparatuses and methods for embodying the technical idea of the present invention, and the technical idea of the present invention specifies the arrangement of components and the like as follows. Not what you want.
  • the technical idea of the present invention can be variously modified within the scope of the claims.
  • the method for purifying a physiologically active substance uses at least first and second temperature-responsive chromatography carriers.
  • the first temperature-responsive chromatography carrier has a property of adsorbing a physiologically active substance in a low temperature region and desorbing the physiologically active substance in a high temperature region.
  • a temperature-responsive affinity chromatography carrier can be used, and preferably a temperature-responsive protein A carrier can be used.
  • the second temperature-responsive chromatography carrier has the property of adsorbing the physiologically active substance in the high temperature region and desorbing the physiologically active substance in the low temperature region.
  • a temperature-responsive ion exchange chromatography carrier can be used as the second temperature-responsive chromatography carrier.
  • the low temperature region in the first temperature-responsive chromatography carrier is a temperature region in which the carrier has adsorptivity with a specific physiologically active substance, and is a physiologically active substance that can bind to a certain amount of carrier. This is a temperature region where the binding amount of the physiologically active substance is 50% or more with respect to the maximum binding amount.
  • the high temperature region in the first temperature-responsive chromatography carrier is a region where the carrier does not have an adsorptivity with a specific physiologically active substance, and is a physiologically active substance that can bind to a certain amount of the carrier. This is a region where the binding amount of the physiologically active substance is less than 50% with respect to the maximum binding amount.
  • a specific method for specifying the low temperature region and the high temperature region in the first temperature-responsive chromatography carrier is performed by the following procedure. 1.
  • the physiologically active substance is bound to the first temperature-responsive chromatographic carrier at less than 5 ° C., 10 ° C., respectively, and thereafter at temperatures set at intervals of 10 ° C. to just below the temperature at which the physiologically active substance is denatured.
  • the temperature is raised to just below the temperature at which the specific physiologically active substance is denatured, the bound physiologically active substance is eluted, and the physiologically active substance is quantified. 3.
  • the elution amount of the physiologically active substance is plotted against the temperature at which the protein is adsorbed, and 50% of the maximum value of the binding amount (elution amount) of the physiologically active substance and the intersection of the lines connecting the plots (hereinafter referred to as “50”).
  • the temperature region having a binding amount of 50% or more of the physiologically active substance at the boundary is referred to as a low temperature region in the first temperature-responsive chromatography carrier, and the binding amount of the physiologically active substance of less than 50%.
  • a temperature region having a temperature is defined as a high temperature region in the first temperature-responsive chromatography carrier.
  • the high temperature region in the second temperature-responsive chromatography carrier is a temperature region in which the carrier has adsorptivity with a specific physiologically active substance, and is a physiologically active substance that can bind to a certain amount of carrier. This is a temperature region where the binding amount of the physiologically active substance is 50% or more with respect to the maximum binding amount.
  • the low temperature region in the second temperature-responsive chromatography carrier is a region where the carrier does not have an adsorptivity to a specific physiologically active substance, and is a physiologically active substance that can bind to a certain amount of carrier. This is a region where the binding amount of the physiologically active substance is less than 50% with respect to the maximum binding amount.
  • a specific method for specifying the high temperature region and the low temperature region in the second temperature-responsive chromatography carrier is performed by the following procedure. 1.
  • the physiologically active substance is bound to the second temperature-responsive chromatographic carrier at each temperature set at intervals of 10 ° C. from just below the temperature at which the physiologically active substance is denatured to less than 5 ° C.
  • the temperature is lowered to less than 2.5 ° C., the bound physiologically active substance is eluted, and the physiologically active substance is quantified.
  • the elution amount of the physiologically active substance is plotted against the temperature at which the protein is adsorbed, and 50% of the maximum value of the binding amount (elution amount) of the physiologically active substance and the intersection of the lines connecting the plots (hereinafter referred to as “50”).
  • the temperature region having a binding amount of 50% or more of the physiologically active substance at the boundary is referred to as the high temperature region in the second temperature-responsive chromatography carrier, and the binding of the physiologically active substance of less than 50%.
  • the temperature region having the quantity is defined as the low temperature region in the second temperature-responsive chromatography carrier.
  • the low temperature region where the first temperature-responsive chromatography carrier adsorbs the physiologically active substance is, for example, 0 ° C. or higher and lower than 20 ° C., preferably 1 ° C. or higher and lower than 15 ° C., and most preferably 2 ° C. or higher and lower than 13 ° C.
  • the high temperature region where the first temperature-responsive chromatography carrier desorbs the physiologically active substance is, for example, 20 ° C. or higher and lower than 60 ° C., preferably 25 ° C. or higher and lower than 50 ° C., and most preferably 30 ° C. or higher and lower than 45 ° C. .
  • the high temperature region where the second temperature-responsive chromatography carrier adsorbs the physiologically active substance is, for example, 20 ° C. or more and less than 60 ° C., preferably 25 ° C. or more and less than 50 ° C., and most preferably 30 ° C. or more and less than 45 ° C.
  • the low temperature region where the second temperature-responsive chromatography carrier desorbs the physiologically active substance is, for example, 0 ° C. or higher and lower than 20 ° C., preferably 1 ° C. or higher and lower than 15 ° C., most preferably 2 ° C. or higher and lower than 13 ° C. .
  • the method for purifying a physiologically active substance includes at least A-1) a step of adsorbing the physiologically active substance to the first temperature-responsive chromatography carrier in a low temperature region, and A-2) adsorbing the physiologically active substance.
  • the temperature at which the physiologically active substance is adsorbed on the first temperature-responsive chromatography carrier is equal to or higher than the temperature at which the solution containing the physiologically active substance is frozen. It is preferably within ⁇ 30 ° C. from the 50% binding temperature of the chromatography carrier, more preferably within ⁇ 25 ° C., and most preferably within ⁇ 20 ° C. If the temperature when adsorbing the physiologically active substance to the first temperature-responsive chromatography carrier is low, the adsorptivity of the physiologically active substance can be increased, but the pressure in the column tends to increase. It is preferably within ⁇ 30 ° C. from the 50% binding temperature of the temperature-responsive chromatography carrier.
  • the temperature at which the physiologically active substance is desorbed from the first temperature-responsive chromatography carrier is within + 30 ° C. from the 50% binding temperature of the first temperature-responsive chromatography carrier. More preferably, it is within + 25 ° C, most preferably within + 20 ° C. If the temperature at which the physiologically active substance is desorbed from the first temperature-responsive chromatography carrier is high, the desorbability of the physiologically active substance is increased and the recovery rate can be increased, but the physiologically active substance is decomposed by heat. There is also a tendency to deactivate.
  • the temperature at which the physiologically active substance is adsorbed on the second temperature-responsive chromatography carrier is within + 30 ° C. from the 50% binding temperature of the second temperature-responsive chromatography carrier. Is more preferable, more preferably within + 25 ° C, and most preferably within + 20 ° C.
  • the higher the temperature at which the physiologically active substance is adsorbed to the second temperature-responsive chromatography carrier the higher the detachability of the physiologically active substance and the recovery rate, but the physiologically active substance is decomposed and lost by heat. There is also a tendency to live.
  • the temperature at which the physiologically active substance is adsorbed on the second temperature-responsive chromatography carrier is the same as that when the physiologically active substance is desorbed from the first temperature-responsive chromatography carrier.
  • the temperature is preferably below the temperature, and most preferably within the range of 0 to -5 ° C.
  • the temperature at which the physiologically active substance is desorbed from the second temperature-responsive chromatography carrier is equal to or higher than the temperature at which the solution containing the physiologically active substance is frozen. It is preferably within ⁇ 40 ° C., more preferably within ⁇ 35 ° C., and most preferably within ⁇ 30 ° C. from the 50% binding temperature of the hydrophilic chromatography carrier. If the temperature at which the physiologically active substance is adsorbed to the second temperature-responsive chromatography carrier is low, the detachability of the physiologically active substance can be increased and the recovery rate can be increased, but the pressure in the column tends to increase. Therefore, it is preferably within ⁇ 40 ° C. from the 50% binding temperature of the second temperature-responsive chromatography carrier.
  • the 50% binding temperature of the second temperature-responsive chromatography carrier is + 20 ° C. or less from the 50% binding temperature of the first temperature-responsive chromatography carrier. If the 50% binding temperature of the second temperature-responsive chromatography carrier is higher than the 50% binding temperature of the first temperature-responsive chromatography carrier by more than 20 ° C., the physiological response from the first temperature-responsive chromatography carrier Since the temperature at which the active substance is desorbed must be set high, the physiologically active substance tends to decompose and deactivate due to heat.
  • the pH condition of the solution containing the physiologically active substance is from 4 to 8 and the fluctuation range is within 1 until the steps A-1) to B-3).
  • the pH of a solution containing a physiologically active substance becomes acidic or alkaline, the physiologically active substance tends to be deactivated or aggregated.
  • the bioactive substance purification kit includes at least the first and second temperature-responsive chromatography carriers described above.
  • the temperature Th1 of the high temperature region where the first temperature-responsive chromatography carrier desorbs the physiologically active substance, and the temperature of the high temperature region where the second temperature-responsive chromatography carrier has the property of adsorbing the physiologically active substance Th2 Th1 -10 (° C) ⁇ Th2 ⁇ Th1 + 10 (° C) Have the relationship.
  • the temperature Th2 of the high temperature region in which the second temperature-responsive chromatography carrier adsorbs the physiologically active substance is the temperature Th2 of the high temperature region in which the first temperature-responsive chromatography carrier has the property of desorbing the physiologically active substance.
  • virus inactivation methods include a low pH method, a UV irradiation method, a surfactant treatment (SD treatment), a heat treatment, and a high pressure treatment.
  • the virus inactivation step can be inserted before step A-1), after step A-3), before step B-1) and after step B-3).
  • the low pH method is preferably used because it is easy to operate, but it is preferably carried out under conditions that do not cause inactivation or aggregation of the physiologically active substance.
  • the pH can be 3 to 5 and the treatment time can be 1 to 240 minutes.
  • the temperature-responsive ion exchange chromatography carrier a temperature-responsive ion exchanger in which a copolymer containing N-isopropylacrylamide or the like is fixed to the substrate surface can be used.
  • the copolymer has at least an ion exchange group.
  • the temperature-responsive ion exchanger according to this embodiment includes a monomer mixture composed of a monomer having an ion exchange group and / or an ion exchange group introduction precursor monomer and an N-isopropylacrylamide monomer by a surface graft polymerization method. It is formed by polymerization on the surface.
  • the shape of the substrate used in the temperature-responsive ion exchange chromatography carrier according to this embodiment is not particularly limited, and examples thereof include beads, flat plates, and tubes.
  • beads beads having various particle diameters are available and are not particularly limited, but the particle diameter is, for example, 1 to 300 ⁇ m, preferably 10 to 200 ⁇ m, more preferably 20 to 150 ⁇ m. is there. If the particle size is 1 ⁇ m or less, consolidation of beads tends to occur in the column, and thus processing at a high flow rate tends to be difficult. On the other hand, when the particle size is 300 ⁇ m or more, the gap between the beads becomes large, and the solution tends to leak when the biopolymer is adsorbed.
  • the base material used in this embodiment has a plurality of pores, for example.
  • the pore diameter is not particularly limited, but is, for example, 5 to 1000 nm, preferably 10 to 700 nm, and more preferably 20 to 500 nm.
  • the pore diameter is 5 nm or less, the molecular weight of the biopolymer that can be separated tends to be low.
  • the pore diameter is 1000 nm or more, the surface area of the substrate is reduced, and the antibody binding capacity tends to be reduced.
  • the material of the substrate is not particularly limited, but when it is in the form of beads, glass, silica, polystyrene resin, methacrylic resin, crosslinked agarose, crosslinked dextran, crosslinked polyvinyl alcohol, crosslinked cellulose, and the like can be used.
  • a temperature-responsive polymer having an ion exchange group is immobilized on the base material.
  • an atom transfer radical polymerization initiator is immobilized on the surface of the substrate, and a temperature responsive polymer is grown from the initiator in the presence of a catalyst. Is generated, and a “radiation graft polymerization method” in which a temperature-responsive polymer is allowed to grow using the generated radical as a starting point is not particularly limited.
  • an immobilization method there is an “atom transfer radical polymerization method” which is a surface living radical polymerization method.
  • the “atom transfer radical polymerization method” can be suitably used because the polymer can be fixed at a high density on the substrate surface.
  • the initiator used at that time is not particularly limited, but the substrate has a hydroxyl group as in this embodiment.
  • 2-mer chains are grown from this initiator.
  • the catalyst at that time is not particularly limited, and examples of the copper halide (CuIX) include CuICl and CuIBr.
  • the ligand complex for the copper halide is not particularly limited, but tris (2- (dimethylamino) ethyl) amine (Me6TREN), N, N, N ′′, N ′′ -pentamethyldiethylenetriamine (PMDETA), 1,1,4,7,10,10-hexamethyltriethylenetetraamine (HMTETA), 1,4,8,11-tetramethyl 1,4,8,11-azacyclotetradecane (Me4Cyclam), And bipyridine.
  • any means can be adopted to generate radicals on the substrate, but ionization is required to generate uniform radicals on the entire substrate. Irradiation with actinic radiation is preferred.
  • types of ionizing radiation ⁇ rays, electron beams, ⁇ rays, neutron rays and the like can be used. However, electron beams or ⁇ rays are preferable for implementation on an industrial scale.
  • the ionizing radiation is obtained from radioactive isotopes such as cobalt 60, strontium 90, and cesium 137, or by an X-ray imaging apparatus, an electron beam accelerator, an ultraviolet irradiation apparatus, or the like.
  • the irradiation dose of ionizing radiation is, for example, 1 kGy or more and 1000 kGy or less, preferably 2 kGy or more and 500 kGy or less, and more preferably 5 kGy or more and 200 kGy or less. If the irradiation dose is less than 1 kGy, radicals tend not to be generated uniformly. Further, when the irradiation dose exceeds 1000 kGy, the physical strength of the substrate tends to be lowered.
  • the graft polymerization method by irradiation with ionizing radiation generally involves generating a radical on the substrate and then bringing it into contact with the reactive compound, followed by a pre-irradiation method, and contacting the film with the reactive compound on the substrate. It is roughly divided into a simultaneous irradiation method for generating radicals. In this embodiment, any method can be applied, but a pre-irradiation method with less oligomer formation is preferred.
  • the solvent used at the time of polymerization is not particularly limited as long as it can uniformly dissolve the reactive compound.
  • solvents include alcohols such as ethanol, isopropanol, and t-butyl alcohol, ethers such as diethyl ether and tetrahydrofuran, ketones such as acetone and 2-butanone, water, and mixtures thereof.
  • the polymer coated on the substrate surface has a temperature-responsive monomer such as N-isopropylacrylamide.
  • Poly (N-isopropylacrylamide) is known to have a lower critical temperature at 32 degrees. Since the carrier introduced on the polymer surface greatly changes the hydrophilic / hydrophobic surface properties at the critical temperature, when used by grafting or coating on the surface of the base material (filler) of the chromatography carrier, The holding force for the sample can be obtained by the temperature. As a result, the retention behavior can be controlled by temperature without changing the composition of the eluate.
  • hydrophilic comonomers such as acrylamide, methacrylic acid, acrylic acid, dimethylacrylamide, and vinylpyrrolidone, which are more hydrophilic monomers than isopropylacrylamide, are combined with N-isopropylacrylamide. It can be prepared by polymerizing.
  • the lower critical temperature is desired to be 32 ° C. or lower, it can be prepared by copolymerization with a hydrophobic comonomer such as styrene, alkyl methacrylate, alkyl acrylate or the like which is a hydrophobic monomer.
  • Ion exchange groups can be broadly classified into strong anion exchange groups, weak anion exchange groups, strong cation exchange groups, and weak cation exchange groups.
  • the most appropriate ion exchange group is selected according to the type of physiologically active substance to be purified. There is a need to. Generally, when adsorbing basic proteins such as immunoglobulin, lysozyme, hemoglobin ⁇ chain, catalase, annexin, and ezrin, it is preferable to select a cation exchange group, and when adsorbing acidic proteins such as albumin It is preferable to select an anion exchange group. In the present embodiment, a case where a strong cation exchange group is selected as the ion exchange group and the antibody is adsorbed will be described in detail, but the present embodiment is not limited to this.
  • a polymer having a strong cation exchange group such as a sulfonic acid group will be described below as a polymer coated on the substrate surface.
  • a method for providing a strong cation exchange group is not particularly limited, but as a first method, when synthesizing a temperature-responsive polymer chain to be coated on the surface of a carrier, a method including copolymerization including a monomer having a strong cation exchange group is provided.
  • the monomer having a sulfonic acid group include (meth) acrylamide alkyl sulfonic acid, which is a structural unit of a polymer having sulfonic acid.
  • the “strong cation exchange group-introduced precursor” may include “a strong cation exchange group precursor”.
  • the “precursor of a strong cation exchange group” is, for example, a strong cation exchange group with a protective group. Examples of the monomer having a sulfonic acid group precursor include phenyl vinyl sulfonate, but the present embodiment is not limited thereto.
  • a strong cation exchange group can be given after copolymerization including a monomer having a functional group that can give a strong cation exchange group.
  • the method of converting a functional group into a sulfonic acid group is mentioned.
  • the monomer having a functional group capable of imparting a strong cation exchange group include glycidyl methacrylate.
  • a monomer composition in which the ratio of the monomer having a strong cation exchange group and / or the strong cation exchange group-introduced precursor monomer to N-isopropylacrylamide is 0.01 to 5 mol% is used as the surface graft weight. Polymerize by law. The ratio is preferably 0.1 to 4 mol%, more preferably 0.2 to 3 mol%, still more preferably 0.3 to 2 mol%, and most preferably 0.5 to 1.5 mol%. If the ratio exceeds 5 mol%, the amount of strong cation exchange groups relative to N-isopropylacrylamide in the copolymer will be excessive.
  • the amount of immunoglobulin adsorbed on the temperature-responsive adsorbent increases, it tends to be difficult to elute the adsorbed immunoglobulin due to temperature change.
  • the ratio is less than 0.01 mol%, the amount of strong cation exchange groups introduced is too small, and the amount of immunoglobulin adsorbed tends to decrease.
  • the polymer coated on the surface of the substrate causes hydration and dehydration by changing the temperature.
  • the temperature range is 0 ° C. or more and less than 80 ° C., preferably 5 ° C. or more and less than 50 ° C. More preferably, it is 10 ° C or higher and lower than 45 ° C. If the temperature exceeds 80 ° C., the mobile phase is water, and thus evaporation occurs and the workability tends to deteriorate. On the other hand, if it is lower than 0 ° C., the mobile phase tends to freeze.
  • the temperature-responsive ion exchange chromatography carrier obtained by this embodiment is attached to a normal liquid chromatography apparatus and used as a liquid chromatography system.
  • the method of loading the temperature-responsive ion exchange chromatography carrier with temperature is not particularly limited.
  • an aluminum block, water bath, air layer, jacket or the like having a predetermined temperature is attached to the temperature-responsive ion exchange chromatography carrier.
  • it may be attached.
  • the separation method using the temperature-responsive adsorbent of the present embodiment is not particularly limited, but as an example, the target biopolymer is once adsorbed on the obtained temperature-responsive liquid chromatography carrier, Thereafter, a method of utilizing the catch-and-release method, in which the adsorbed biopolymer is released by changing the temperature of the carrier surface by changing the temperature, can be mentioned.
  • the mass to be adsorbed may or may not exceed the amount that can be adsorbed on the carrier.
  • this is a purification method in which the adsorbed solute is released by once adsorbing and then changing the temperature and changing the characteristics of the support surface.
  • the temperature range in which the temperature-responsive ion exchange chromatography carrier, which is the second temperature-responsive chromatography carrier, adsorbs the physiologically active substance is, for example, 20 ° C. or more and less than 60 ° C., preferably 25 ° C. or more and 50 ° C. Less, most preferably in a high temperature region of 30 ° C. or higher and lower than 45 ° C.
  • the temperature range where the temperature-responsive ion exchange chromatography carrier desorbs the physiologically active substance is, for example, a low temperature range of 0 ° C. or higher and lower than 20 ° C., preferably 1 ° C. or higher and lower than 15 ° C., most preferably 2 ° C. or higher and lower than 13 ° C. is there.
  • the chromatography shown in the present embodiment may use a buffer solution as a mobile phase and does not require an organic solvent.
  • the buffer solution is an aqueous solution containing inorganic salts, and specifically includes a phosphate buffer solution, a Tris buffer solution, an acetate buffer solution, and the like. It is not limited.
  • the concentration of the inorganic salt is, for example, 1 to 50 mmol / L, preferably 3 to 40 mmol / L, and more preferably 5 to 30 mmol / L. If the concentration of the inorganic salt in the mobile phase is lower than 1 mmol / L, the activity of the physiologically active substance as a solute tends to be impaired.
  • the degree of dissociation of ion-exchange groups on the surface of the temperature-responsive adsorbent increases, and the solute is strongly adsorbed on the surface of the temperature-responsive adsorbent, making it difficult to remove the solute from the surface of the carrier in subsequent operations. There is a tendency.
  • the concentration of inorganic salts is higher than 50 mmol / L, the degree of dissociation of ion exchange groups on the surface of the temperature-responsive adsorbent becomes low, making it difficult to maintain the solute on the surface of the carrier, and finally separating the solute. Tend to be difficult.
  • the neutral buffer used in the present embodiment has, for example, a pH of 4.0 to 7.5, preferably 4.5 to 7.0, more preferably 5.0 to 6.5. is there.
  • the pH of the buffer solution is higher than 7.5, the immunoglobulin (isoelectric point 7.5 to 10) is negatively charged. Therefore, charge repulsion occurs with the strong cation exchange group of the temperature-responsive adsorbent of this embodiment. , The adsorption capacity tends to decrease extremely.
  • the pH is lower than 4.0, the immunoglobulin is denatured and tends to cause a decrease in activity and quality such as formation of aggregates.
  • the protein to be purified is not particularly limited, but a basic protein is preferable when a carrier surface having a strong cation exchange group is used.
  • basic proteins include immunoglobulins, lysozyme, hemoglobin ⁇ chain, catalase, annexin, and ezrin.
  • a carrier having a strong cation exchange group can be particularly suitably used for purification of immunoglobulin.
  • the shape of the support used in the temperature-responsive affinity chromatography carrier according to the present embodiment is not particularly limited, and may be, for example, a flat membrane shape, a hollow fiber shape, or a bead shape.
  • a hollow fiber-like support can be suitably used because it can be easily molded into a module and has a large membrane area that can be filled per module container.
  • a bead-shaped material generally has a larger surface area per volume than a film-shaped material and can adsorb a large amount of antibody, so that it can be suitably used.
  • the material of the support is not particularly limited, but when the carrier is in the form of a film, a polymer material capable of forming a porous film can be suitably used.
  • a polymer material capable of forming a porous film
  • olefin resins such as polyethylene and polypropylene
  • polyester resins such as polyethylene terephthalate and polyethylene terephthalate
  • polyamide resins such as nylon 6 and nylon 66
  • fluorine-containing resins such as polyvinylidene fluoride and polychlorotrifluoroethylene
  • polystyrene polysulfone
  • Noncrystalline resins such as polyethersulfone and polycarbonate
  • the support material may be glass, silica, polystyrene resin, methacrylic resin, crosslinked agarose, crosslinked dextran, crosslinked polyvinyl alcohol, crosslinked cellulose, and the like.
  • Crosslinked polyvinyl alcohol and crosslinked cellulose are highly hydrophilic and can be suitably used because they can suppress the adsorption of impurity components.
  • the support used in this embodiment has, for example, a plurality of pores.
  • the pore diameter is not particularly limited, but is, for example, 5 to 1000 nm, preferably 10 to 700 nm, and more preferably 20 to 500 nm. If the pore diameter is 5 nm or less, the molecular weight of the separable antibody tends to be low. Further, when the pore diameter is 1000 nm or more, the surface area of the substrate is reduced, and the antibody binding capacity tends to be reduced.
  • any coupling group may be introduced into the support.
  • the coupling group include a carboxyl group, carboxyl group, cyanogen bromide activation group, hydroxyl group, epoxy group, aldehyde group, and thiol group activated with N-hydroxysuccinimide (NHS).
  • NHS activity that can be coupled with a primary amino group Preferred are a carboxyl group, a carboxyl group, a cyanogen bromide active group, an epoxy group, and a formyl group.
  • a carboxyl group activated with NHS is preferably used because no other chemicals are required during the coupling reaction, and the reaction is rapid and forms a strong bond.
  • any method may be used for introducing the coupling group into the support, but a spacer is generally introduced between the support and the coupling group.
  • Methods for introducing coupling groups are disclosed in various literatures.
  • a graft polymer chain having a coupling group at the terminal and / or side chain may be introduced into the support.
  • a graft polymer chain having a coupling group By introducing a graft polymer chain having a coupling group into the support, it is possible to control the density of the coupling group as desired.
  • a polymer chain having a coupling group is grafted to the support, or a polymer chain having a precursor functional group that can be converted into a coupling group is grafted to the support, and then the grafted precursor functional group is cupped. It may be converted to a ring group.
  • the graft polymer chain can be introduced by any method.
  • a polymer chain may be prepared in advance and coupled to a support. Further, the graft chain may be polymerized directly on the support by the “living radical polymerization method” or the “radiation graft polymerization method”.
  • the “radiation grafting method” can be suitably used because there is no need to introduce a reaction initiator into the support in advance, and there are a variety of applicable supports.
  • any means can be adopted for generating radicals on the support, but in order to generate uniform radicals on the entire support, ionizing radiation can be used. Irradiation is preferred. As types of ionizing radiation, ⁇ rays, electron beams, ⁇ rays, neutron rays and the like can be used. However, electron beams or ⁇ rays are preferable for implementation on an industrial scale.
  • the ionizing radiation is obtained from radioactive isotopes such as cobalt 60, strontium 90, and cesium 137, or from an X-ray imaging apparatus, an electron beam accelerator, an ultraviolet irradiation apparatus, or the like.
  • the irradiation dose of ionizing radiation is, for example, preferably 1 kGy or more and 1000 kGy or less, more preferably 2 kGy or more and 500 kGy or less, and further preferably 5 kGy or more and 200 kGy or less. If the irradiation dose is less than 1 kGy, radicals tend not to be generated uniformly. Further, when the irradiation dose exceeds 1000 kGy, the physical strength of the support tends to be lowered.
  • a pre-irradiation method in which the radical is then contacted with a reactive compound, and the support in a state where the support is in contact with the reactive compound.
  • a simultaneous irradiation method for generating radicals in this embodiment, any method can be applied, but a pre-irradiation method with less oligomer formation is preferred.
  • the solvent used in the graft polymerization is not particularly limited as long as the reactive compound can be uniformly dissolved.
  • a solvent include alcohols such as ethanol, isopropanol and t-butyl alcohol; ethers such as diethyl ether and tetrahydrofuran; ketones such as acetone and 2-butanone; water, or a mixture thereof.
  • examples of the monomer having a coupling group used for graft polymerization include monomers such as acrylic acid and methacrylic acid when a carboxyl group is used as the coupling group.
  • a primary amino group is used as a coupling group, allylamine and the like can be mentioned.
  • an epoxy group is mentioned.
  • a monomer having a precursor functional group that can be converted into a coupling group may be grafted to a support, and then the grafted precursor functional group may be converted into a coupling group.
  • Glycidyl methacrylate (GMA) having an epoxy group can be converted into various functional groups using ring-opening reactions of various epoxy groups, and thus can be suitably used industrially.
  • the epoxy group of GMA is hydrolyzed into a diol, and a cyclic acid anhydride is subjected to a ring-opening half esterification reaction with a hydroxyl group derived from the diol. It is possible to form a carboxyl group derived from a cyclic acid anhydride (ring-opening half esterification reaction).
  • the cyclic acid anhydride is preferably succinic anhydride or glutaric anhydride, but is not limited thereto.
  • the catalyst used in the ring-opening half esterification reaction is not particularly limited as long as it promotes this reaction, and specific examples include triethylamine, isobutylethylamine, pyridine, 4-dimethylaminopyridine, and the like. 4-Dimethylaminopyridine is preferred, and 4-dimethylaminopyridine is most preferred in view of reaction rate and yield.
  • the ring-opening half esterification reaction is preferably performed in an inert organic solvent such as toluene to which the above catalyst is added.
  • the NHS activation reaction is a step of converting a carboxyl group formed by the ring-opening half esterification reaction into an active ester. Since the active ester is more reactive than the carboxyl group, the active esterification step is preferably performed when it is desired to quickly immobilize the temperature-responsive protein A on the carrier.
  • the active ester serves to bind the hydrophilic compound and the substance to be immobilized by a covalent bond.
  • the active ester means a chemical structure of R—C ( ⁇ O) —X.
  • X is a leaving group such as, but not limited to, halogen, N-hydroxysuccinimide group or derivative thereof, 1-hydroxybenzotriazole group or derivative thereof, pentafluorophenyl group, and paranitrophenyl group.
  • N-hydroxysuccinimide ester is desirable in terms of reactivity, safety and production cost. Conversion of the carboxyl group to an N-hydroxysuccinimide ester is achieved by reacting the carboxyl group with N-hydroxysuccinimide and carbodiimide simultaneously.
  • carbodiimide means an organic compound having a chemical structure of —N ⁇ C ⁇ N—, such as dicyclohexylcarbodiimide, diisopropylcarbodiimide, and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride.
  • concentration of N-hydroxysuccinimide and carbodiimide is 1 to 100 mmol / L
  • the reaction temperature is 0 ° C. or more and less than 100 ° C.
  • the reaction time is 2 minutes to 16 hours.
  • N, N'-dimethylformamide (DMF), toluene, or the like can be used as the reaction solvent.
  • the temperature-responsive affinity chromatography carrier comprises temperature-responsive protein A, which is protein A mutated so that the binding property to the antibody changes depending on temperature
  • the temperature-responsive protein A is: It can be prepared with reference to a patent document (WO2008 / 143199 pamphlet).
  • the coupling reaction between the NHS activated carboxyl group and the temperature-responsive protein A is performed as follows, for example. First, citrate buffer (pH 3.0 to 6.2), acetate buffer (pH 3.6 to 5.6), phosphate buffered saline (PBS, pH 5.8 to 8.5), or carbonate buffer A 0.1-100 mg / mL temperature-responsive protein A solution is prepared using a buffer solution that does not contain an amino group component such as a solution (pH 9.2 to 10.6). When this aqueous solution is brought into contact with the active ester surface, a functional group such as an amino group contained in the temperature-responsive protein A reacts with the active ester to form an amide bond.
  • citrate buffer pH 3.0 to 6.2
  • acetate buffer pH 3.6 to 5.6
  • phosphate buffered saline PBS, pH 5.8 to 8.5
  • carbonate buffer A 0.1-100 mg / mL temperature-responsive protein A solution is prepared using a buffer solution that does not contain an amino
  • temperature-responsive protein A is immobilized on the surface by covalent bonds.
  • the contact time may be set in the range of 2 minutes to 16 hours.
  • the washing solution is preferably a buffer solution containing about 0.5 mol / L of salt (NaCl) and about 0.1% of nonionic surfactant. This is because the temperature-responsive protein A that is physically adsorbed without being covalently bonded can be removed.
  • the unreacted carboxyl group or active ester is converted into a low molecular compound having an amino group and It is preferable to convert the carboxyl group or the active ester into a functional group having a lower reactivity by bonding. As a result, it is possible to prevent molecules such as impurities that are not subject to purification from being unintentionally immobilized on the surface of the carrier.
  • the functional group at the end of the temperature-responsive protein A fixing carrier is an active ester, this operation is preferably performed.
  • the operation of reacting a low molecular weight compound having an amino group with an active ester group may be particularly described as “blocking”.
  • the surface of the carrier after reacting the carboxyl group or the active ester with the low molecular weight compound is hydrophilic. This is because a hydrophilic surface generally has an effect of suppressing nonspecific adsorption of a biological substance.
  • Non-limiting examples of such low molecular weight compounds include ethanolamine, trishydroxymethylaminomethane, and diglycolamine (IUPAC name: 2- (2-aminoethoxy) ethanol).
  • reaction temperature may be set in the range of 4 to 37 ° C. and the reaction time in the range of 2 minutes to 16 hours.
  • the temperature-responsive protein A-immobilized carrier is stored at a low temperature of about 2-10 ° C. with a neutral solution in the pH range of 4-8 as a storage solution.
  • a neutral solution in the pH range of 4-8 as a storage solution.
  • 20% ethanol is preferable in consideration of antibacterial properties.
  • Temperature-responsive protein A has a characteristic that it can bind an antibody at a low temperature and can elute the antibody at a temperature higher than the temperature at the time of binding. It is preferable that the temperature at which the characteristics of the temperature-responsive protein A change in advance is confirmed, and the antibody is adsorbed and desorbed by changing the temperature so as to sandwich the temperature.
  • the temperature range in which the antibody is adsorbed to the temperature-responsive protein A is, for example, a low temperature range of 0 ° C. or higher and lower than 20 ° C., preferably 1 ° C. or higher and lower than 15 ° C., most preferably 2 ° C. or higher and lower than 13 ° C.
  • the temperature at which the antibody is desorbed from the temperature-responsive protein A is, for example, a high temperature region of 20 ° C. or higher and lower than 60 ° C., preferably 25 ° C. or higher and lower than 50 ° C., most preferably 30 ° C. or higher and lower than 45 ° C.
  • the antibody-containing mixture is transformed with a hybridoma that produces the antibody, a myeloma cell such as NSO, and a gene encoding the antibody.
  • Culture cells such as animal cells and yeast that can be expressed and produced are included.
  • these culture supernatants are clarified when purification by the method of this embodiment is performed. The clarification may be performed, for example, by filtration with a 0.2 ⁇ m membrane filter.
  • the antibody to be purified in this embodiment is not limited, and examples thereof include human antibodies, non-human animal antibodies such as mice, cows, goats, sheep and other ungulates, chimeric antibodies between humans and non-human animals, and non-human animals.
  • examples include humanized antibodies obtained by humanizing antibodies, and preferably human antibodies. More preferred is a human monoclonal antibody.
  • the class and subclass of the antibody are not limited, and antibodies of any class and subclass can be purified in the present embodiment, but IgG is preferable, and IgG1, IgG2, and IgG4 among them are preferable.
  • the antibody in the amino acid sequence of the heavy chain constant region of the antibody, at least one amino acid of the naturally occurring heavy chain constant region is deleted, or at least one of the naturally occurring heavy chain constant region amino acids. It may be an antibody in which one amino acid is substituted with another amino acid or at least one amino acid is added to a naturally occurring heavy chain constant region. Furthermore, the antibody may be covalently or coordinated with another compound.
  • the temperature-responsive chromatography carrier When the temperature-responsive chromatography carrier is fixed to a bead-like carrier, it may be packed into a commercially available empty column or an empty column prepared from a glass tube.
  • a commercially available empty column with a jacket (trade name: XK column, GE Healthcare Japan) can be suitably used because the temperature of the column itself can be arbitrarily controlled by controlling the temperature of the jacket circulating water. I can do it.
  • the temperature-responsive chromatography carrier When the temperature-responsive chromatography carrier is in the form of a membrane, it may be fixed to a commercially available membrane holder or processed into an arbitrary module shape according to each shape.
  • the column 20 provided with a temperature-responsive cation exchange chromatography carrier as a chromatography carrier is connected in series via a pipe 104.
  • the length of the pipe 104 between the columns is preferably as short as possible and further kept warm in order to minimize the temperature change due to heat radiation.
  • a three-way valve for switching the flow path may be installed in the pipe 104 between the columns, and the drain valve 60 may be disposed.
  • the drain valve 60 is a waste liquid containing contaminants flowing out from the temperature-responsive affinity chromatography carrier column 10 when supplying the antibody-containing mixture to the temperature-responsive affinity chromatography carrier column 10 including the temperature-responsive protein A. Is used to prevent the waste liquid containing impurities from being supplied to the temperature-responsive cation exchange chromatography support column 20.
  • the mixture solution containing the antibody is cooled to a temperature that is adsorbed to temperature-responsive protein A, and then temperature-responsive protein A.
  • a temperature-responsive affinity chromatography carrier column 10. it is necessary to confirm in advance the temperature at which the temperature-responsive protein A is binding to the antibody, and to adjust the temperature of the mixture solution containing the antibody to that temperature.
  • the temperature at which the antibody is adsorbed to the temperature-responsive protein A is 0 ° C. or higher and lower than 20 ° C., preferably 1 ° C. or higher and lower than 15 ° C., most preferably 2 ° C. or higher and lower than 13 ° C.
  • the mixture solution containing the antibody may contain impurities such as protease and may be stored at a low temperature.
  • the storage temperature of the mixture containing the antibody is within the temperature range where the temperature-responsive protein A has a binding property to the antibody, the antibody may be directly adsorbed to the temperature-responsive protein A.
  • a heat exchanger is disposed immediately upstream of the temperature-responsive protein A column, and the temperature of the mixture solution containing the antibody is continuously changed while loading the antibody-containing mixture solution onto the temperature-responsive protein A column. It is also possible to adjust. It is also possible to adjust the temperature of the mixture solution containing the antibody by immersing the temperature-responsive protein A column in a constant temperature water bath adjusted to a predetermined temperature.
  • the antibody-containing mixture is further immersed by immersing the temperature-responsive protein A column in a constant temperature water bath adjusted to a predetermined temperature. It is also possible to adjust the temperature of the solution.
  • the antibody-containing mixture solution is supplied to the temperature-responsive affinity chromatography carrier column 10 to bind the antibody to the temperature-responsive protein A, and then the phosphate buffer and the Tris-HCl buffer.
  • the carrier column 10 may be washed with a buffer solution such as By washing with the buffer solution, the impurities remaining on the carrier column 10 can be washed to improve the purity of the recovered antibody.
  • the buffer used for washing is used after the temperature-responsive protein A has been adjusted to a temperature range in which it binds to the antibody.
  • the antibody bound to temperature-responsive protein A can be eluted with a high-temperature buffer.
  • the temperature of the buffer solution when eluting the antibody is in a temperature range where the temperature-responsive protein A loses its binding property to the antibody, and the temperature-responsive cation exchange chromatography carrier has a temperature range in which the antibody is binding.
  • the temperature of the buffer solution when eluting the antibody varies depending on the temperature-responsive cation exchange chromatography carrier to be used, but it is 20 ° C. or more and less than 60 ° C., preferably 25 ° C. or more and less than 50 ° C., most preferably 30 ° C. or more and less than 45 ° C. It is.
  • the antibody eluted from temperature-responsive protein A is supplied to the temperature-responsive cation exchange chromatography carrier column 20 while maintaining the temperature as it is. Bound to a temperature-responsive cation exchange chromatography support.
  • the antibody solution eluted from the temperature-responsive protein A can be temporarily stored in a tank or the like, but not to the extent that the temperature-responsive cation exchange chromatography carrier does not deviate from the temperature range in which the antibody-binding ability is bound. It is preferable to keep warm.
  • the antibody eluted from temperature-responsive protein A is subjected to chromatography steps such as gel filtration, anion exchange, chromatofocusing, affinity, group-specific affinity, hydrophobic interaction, reverse phase, etc.
  • the responsive cation exchange chromatography support column 20 may be supplied. If a temperature-responsive protein A column and a temperature-responsive cation exchange chromatography carrier column are not directly connected to the temperature-sensitive protein A column without a tank or other purification step, The eluted antibody is preferable because it is easy to keep the temperature so that the temperature-responsive cation exchange chromatography carrier does not deviate from the temperature range in which the temperature-responsive cation exchange chromatography carrier binds to the antibody.
  • the antibody bound to the temperature-responsive cation exchange chromatography carrier can be eluted with a low-temperature buffer.
  • the temperature of the buffer solution during elution is a temperature region in which the temperature-responsive cation exchange chromatography carrier loses its binding property to the antibody.
  • the temperature of the buffer varies depending on the temperature-responsive cation exchange chromatography carrier used, but is 0 ° C. or higher and lower than 20 ° C., preferably 1 ° C. or higher and lower than 15 ° C., and most preferably 2 ° C. or higher and lower than 13 ° C.
  • a heat exchanger immediately upstream of the temperature-responsive cation exchange column and continuously pass a buffer solution at a predetermined temperature. It is also possible to elute the antibody by immersing the temperature-responsive cation exchange column in a constant temperature water bath adjusted to a predetermined temperature. In addition to using a heat exchanger arranged immediately upstream of the temperature-responsive cation exchange column, the antibody is eluted by immersing the temperature-responsive cation exchange column in a constant temperature water bath adjusted to a predetermined temperature. Is also possible.
  • NHS activation reaction liquid (NHS 0.07 g, dehydrated isopropyl alcohol 45 mL, diisopropylcarbodiimide 0.09 mL) was permeated at a flow rate of 0.4 mL / min for 30 minutes.
  • the carboxyl group was NHS activated.
  • the column was washed by passing dehydrated isopropyl alcohol through the column at a flow rate of 0.4 mL / min for 30 minutes. The washed column was stored at 4 ° C. with dehydrated isopropyl alcohol enclosed.
  • temperature-responsive protein A was prepared with reference to the examples in the patent document (WO2008 / 143199 pamphlet). Further, 2 mL of ice-cooled 1 mmol / L hydrochloric acid was passed through a column in which the carboxyl group had been NHS activated to replace dehydrated isopropyl alcohol as a stock solution. Next, 30 mg of temperature-responsive protein A was dissolved in 1 mL of coupling buffer (0.2 mol / L phosphate buffer, 0.5 mol / L NaCl, pH 8.3), and the module was flown at a flow rate of 0.4 mL / min. For 4 hours. After a predetermined time, the coupling buffer was permeated through the column to wash and collect the temperature-responsive protein A that did not undergo a coupling reaction with the NHS active group.
  • coupling buffer 0.2 mol / L phosphate buffer, 0.5 mol / L NaCl, pH 8.3
  • Blocking 10 mL of blocking reaction solution (0.5 mol / L ethanolamine, 0.5 mol / L NaCl, pH 8.0) permeates through a column coupled with temperature-responsive protein A, and left at room temperature for 30 minutes. Residual NHS was blocked with ethanolamine. After the reaction, the column was washed with pure water and then stored at 4 ° C. in a state sealed in the column with 20% ethanol.
  • the 50% bonding temperature was calculated according to the procedure described above. As a result, a certain amount of temperature-responsive protein A can bind to 14.5 mg / ml of antibody when the environmental temperature (antibody binding temperature) is 2 ° C., and at 2 ° C., the maximum binding amount is increased. Indicated.
  • the 50% adsorption temperature was 15.0 ° C. In this case, the temperature of 15.0 ° C. or lower is the low temperature region described above, and the temperature higher than 15.0 ° C. is the high temperature region.
  • thermo-responsive cation exchange chromatography carrier Preparation of temperature-responsive cation exchange chromatography carrier
  • a bead-like temperature-responsive adsorbent having a sulfonic acid group was prepared by an atom transfer radical polymerization method. Details are as follows.
  • N-isopropylacrylamide (IPAAm, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 18.40 g, GMA 0.231 g, butyl methacrylate (BMA, manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) 1.217 g, copper chloride I ( 0.085 g of CuCl, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 0.012 g of copper chloride II (CuCl2, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were dissolved in 42.8 mL of a 90% by volume isopropanol (IPA) aqueous solution. Nitrogen bubbling was performed for 30 minutes.
  • IPA isopropanol
  • the 50% bonding temperature was calculated according to the procedure described above. As a result, a certain amount of temperature-responsive cation exchange chromatography carrier can bind to 30.1 mg / ml antibody when the environmental temperature (antibody binding temperature) is 40 ° C. The amount of binding is shown.
  • the 50% adsorption temperature was 31.0 ° C. In this case, the temperature lower than 31.0 ° C. is the low temperature region described above, and the temperature higher than 31.0 ° C. is the high temperature region.
  • Antibody purification test 1) Adsorption and elution of antibody (blood donation Venoglobuly-IH, manufactured by Benesis Co., Ltd.) due to temperature change using a step chromatography system with temperature-responsive protein A (AKTA FPLC, manufactured by GE Healthcare Japan Co., Ltd.) A test was conducted. First, as shown in FIG. 1, a column 10 packed with a temperature-responsive protein A carrier and a temperature-responsive cation exchange chromatography carrier column 20 are composed of a container 30 containing a buffer solution, a container 40 containing an antibody solution, a pump 50, And pipes 101, 102, 103, 104.
  • AKTA FPLC temperature-responsive protein A
  • the temperature change operation of the column 10 is performed by temporarily stopping the pump 50 of the chromatography system, and the pipe 103 upstream of the column 10 (manufactured by GE Healthcare Japan, PEEK tubing, od. 1/16, id. 0). (5 mm, orange) 1 m was wound in a loop shape, the pipe 103 was immersed in a constant temperature water bath at a predetermined temperature together with the column 10, and then incubated for 10 minutes or more, and then the pump 50 of the chromatography system was started again. .
  • the adsorption and elution of the antibody by the column 10 packed with the temperature-responsive protein A carrier were performed under the following conditions.
  • Adsorption step ⁇ Antibody concentration: 2.5 mg / mL Adsorption buffer: 15 mmol / L phosphate buffer (pH 6.0) ⁇ Equilibration: 10 bead volume (using adsorption buffer) ⁇ Antibody load: 20 mL ⁇ Flow rate: 0.4mL / min ⁇ Bead volume: 0.59 mL ⁇ Adsorption temperature: 2 °C 1-2) Washing step ⁇ Washing buffer: Same as adsorption buffer ⁇ Flow rate: 0.4 mL / min ⁇ Washing temperature: 2 °C 1-3) Temperature elution step ⁇ Temperature elution buffer: Same as adsorption buffer ⁇ Flow rate: 0.4 mL / min ⁇ Permeate volume: 20 mL ⁇ Elution temperature: 40 °C
  • Adsorption step • Antibody solution load: 20 mL ⁇ Flow rate: 0.4mL / min -Column volume: 0.54 mL ⁇ Adsorption temperature: 40 °C 2-2) Washing step • Washing buffer: 15 mmol / L phosphate buffer (pH 6.0) ⁇ Flow rate: 0.4mL / min ⁇ Washing temperature: 40 °C 2-3) Temperature elution step ⁇ Temperature elution buffer: 15 mmol / L phosphate buffer (pH 6.0) ⁇ Flow rate: 0.4mL / min ⁇ Flow rate: 20mL ⁇ Elution temperature: 2 °C
  • the UV absorption (280 nm) of the fraction obtained from the temperature elution step of the temperature-responsive cation exchange chromatography support column 20 was measured, the antibody concentration was calculated from the following formula, and the temperature elution amount of immunoglobulin was calculated.
  • Antibody concentration (mg / mL) Absorbance at 280 nm / 14 ⁇ 10
  • Temperature elution amount (mg / mL) Immunoglobulin concentration of the temperature elution fraction x liquid volume of the temperature elution fraction / column volume
  • the aggregate ratio (monomer and fraction) of the fraction obtained from the temperature elution step of the temperature-responsive cation exchange chromatography carrier column 20 The weight ratio of the multimer).
  • the weight ratio between the monomer of the antibody and the multimer was measured by high performance liquid chromatography (LC-20A system manufactured by Shimadzu Corporation, column G3000SWXL manufactured by Tosoh Corporation), and the absorption peak area at a wavelength of 280 nm. It was calculated from the ratio.
  • Aggregate ratio (%) (Area ratio of multimers / Area ratio of monomers) ⁇ 100
  • the antibody contained in the temperature elution step of the temperature-responsive cation exchange chromatography carrier column 20 was 8 mg, and the aggregate ratio was 5.8% (the antibody before purification by the column 10 packed with the temperature-responsive protein A carrier). The aggregate ratio was 5.6%). From these results, it was possible to purify the antibody without increasing the aggregate ratio by using the temperature-responsive protein A carrier column 10 and the temperature-responsive cation exchange chromatography carrier column 20.
  • the antibody purified in Example 1 (temperature elution fraction of the temperature-responsive cation exchange chromatography support column 20) is directly permeated through the anion exchange chromatography support membrane 200, thereby anion exchange. Impurities were bound to the chromatography support to remove impurities from the solution.
  • the anion exchange chromatography carrier membrane 200 a hollow fiber membrane prepared according to Reference Example 1 of JP2010-241761 was used. The flow-through step by the anion exchange chromatography support membrane 200 was performed under the following conditions. Equilibration buffer: 15 mmol / L phosphate buffer (pH 6.0) ⁇ Equilibration: 10 beads volume ⁇ Flow rate: 0.4 mL / min Effective membrane volume: 0.53 mL ⁇ Adsorption temperature: Room temperature
  • the amount of antibody contained in the flow-through fraction of the anion exchange chromatography carrier membrane 200 was 8 mg, and the aggregate ratio was 5.8%. From this result, in addition to the temperature-responsive protein A carrier column 10 and the temperature-responsive cation exchange chromatography carrier column 20, the three-step purification using the anion exchange chromatography carrier membrane 200 does not increase the ratio of aggregates. The antibody could be purified.
  • the elution fraction was collected in a polypropylene centrifuge tube (capacity 50 mL) and placed in a refrigerator (4 ° C.). I saved it all day and night. Thereafter, as shown in FIG. 4, the temperature of the elution fraction was raised to the adsorption temperature of the temperature-responsive cation exchange chromatography carrier 20 and then the elution fraction was bound to the temperature-responsive cation exchange chromatography carrier 20. Purified the antibody according to Example 1.
  • the pipe 103 upstream of the column 20 (GE Healthcare Japan, PEEK tubing, od 1/16, id 0.5 mm, orange) 1 m is wound in a loop. It was carried out by immersing in a constant temperature water bath at 70 ° C.
  • the antibody contained in the temperature elution step of the temperature-responsive cation exchange chromatography carrier column 20 shown in FIG. 4 is 7 mg, and the aggregate ratio is 7.2% (before purification by the column 10 packed with the temperature-responsive protein A carrier).
  • the antibody aggregate ratio was 5.6%).
  • the antibody is thermally denatured in the process of raising the temperature with a heating medium of 70 ° C. in the looped pipe 103 shown in FIG. The aggregate ratio was increased.
  • the eluate obtained from the temperature-responsive protein A column 10 is supplied to the temperature-responsive cation exchange chromatography carrier column 20 while maintaining the temperature as it is. It was shown that the antibody can be purified efficiently.
  • the antibody purification method according to the present embodiment makes it possible to purify a useful physiologically active substance such as an antibody on an industrial scale while suppressing denaturation using a temperature-responsive chromatography carrier.

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Abstract

　低温領域で生理活性物質を吸着し、高温領域で生理活性物質を脱離する第１のクロマトグラフィー担体、及び高温領域で生理活性物質を吸着し、低温領域で生理活性物質を脱離する第２のクロマトグラフィー担体を使用する生理活性物質の精製方法であって、低温領域で第１のクロマトグラフィー担体に生理活性物質を吸着し、生理活性物質を吸着した第１のクロマトグラフィー担体を昇温し、高温領域で第１のクロマトグラフィー担体から生理活性物質を脱離し、高温領域で第２のクロマトグラフィー担体に生理活性物質を吸着し、生理活性物質を吸着した第２のクロマトグラフィー担体を降温し、低温領域で第２のクロマトグラフィー担体から生理活性物質を脱離すること、を含む生理活性物質の精製方法を提供する。

Description

温度応答性クロマトグラフィー担体による生理活性物質の精製方法
　本発明は、温度変化に伴い生理活性物質との結合性に変化を示す温度応答性イオン交換クロマトグラフィー担体を利用した、生理活性物質の精製方法に関する。
　免疫グロブリン（抗体）は、免疫反応を司る生理活性物質である。近年、医薬品、診断薬或いは対応する抗原タンパク質の分離精製材料等の用途において、抗体の利用価値が高まっている。抗体は免疫した動物の血液あるいは抗体産生能を保有する細胞の細胞培養液又は動物の腹水培養液から取得される。但し、それらの抗体を含有する血液や培養液は、抗体以外のタンパク質、又は細胞培養に用いた原料液に由来する複雑な夾雑成分を包含し、それらの不純物成分から抗体を分離精製するには、煩雑で長時間を要する操作が通常必要である。
　液体クロマトグラフィーは、抗体の分離精製に重要である。抗体を分離するためのクロマトグラフィー手法として、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び逆相クロマトグラフィー等があり、これらの手法を組み合わせることで抗体が分離精製される。
　従来使用されているクロマトグラフィーは、分離対象物質と、担体表面と、の相互作用を、移動相の組成を変えることによって変化させている。その際、移動相として、高塩濃度の緩衝液、低ｐＨ溶液、あるいは有機溶媒等を用いるために、分離対象になる生体成分の活性を損なう問題がある。
　上記問題を解決するために、分離対象物質と、担体表面と、の相互作用を、温度変化によって変化させることが可能な、温度応答性クロマトグラフィーが提案されている。
　特許文献１には、固定相表面の有効荷電密度を温度変化によって変化させることが可能である、荷電を有する共重合体を含む充填剤、当該充填剤の製造方法及びそれを用いた温度応答性クロマトグラフィー法が開示されている。特許文献２には、原子移動ラジカル重合法によって、基材表面に０～８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを高密度に固定化した温度応答性クロマトグラフィー担体が開示されている。特許文献３には、イソプロピルアルコールを溶媒として、原子移動ラジカル法により、荷電を有し、０～８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを成長反応させる温度応答性クロマトグラフィー担体の製造方法が開示されている。
　特許文献４には、水系移動相を含む特定の条件下で、生物学、医学、及び薬学等の分野において有用な高分子量の生理活性物質を分離できる、０～８０℃の温度範囲内で水和力が変化する荷電ポリマーを固体表面に被覆した液体クロマトグラフィー担体の製造方法が開示されている。非特許文献１には、原子移動ラジカル重合法により調製された、カルボキシル基を有する温度応答性クロマトグラフィー担体及びその製造法が開示されている。また、原子移動ラジカル重合法に用いるモノマー組成において、リゾチームの分離に最適化されたモノマー組成が開示されている。特許文献５には、温度変化に伴う立体構造の変化等によって、抗体との結合性が変化する変異プロテインＡ（温度応答性プロテインＡ）を用いた分離方法が開示されている。
　これらのクロマトグラフィーによる分離方法を組み合わせることで、精製の対象たる生体成分の損傷、機能の喪失、又は意図しない機能の発生などの不具合が引き起こされないような条件下（ｐＨ５～９、６０℃未満）で、生理活性物質の精製が実施されている。
国際公開第９９／０６１９０４号パンフレット 特開２００７－６９１９３号公報 特開２００９－８５９３３号公報 国際公開第０１／０７４４８２号パンフレット 国際公開第０８／１４３１９９号パンフレット
Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ，Ｊａｐａｎ　Ｖｏｌ．５８，Ｎｏ．２，３Ｔ１－１３（２００９）
　温度応答性イオン交換クロマトグラフィー担体は、高温で抗体と結合し、結合時の温度よりも低い温度で抗体を溶出できるという特性がある。温度応答性イオン交換クロマトグラフィー担体に抗体を結合させるには、抗体溶液を、予め、温度応答性イオン交換クロマトグラフィー担体が抗体に結合性を有する時の温度と等価な温度まで昇温しておく必要がある。抗体精製を産業規模で実施する場合、抗体溶液を所望の温度まで迅速に昇温させるには、抗体溶液を所望の温度よりも出来るだけ高温の熱媒体と熱交換させる必要がある。しかしながら、生理活性物質である抗体は、高温の熱媒体との接触により変性し、凝集体が形成されたり、生理活性が失活したりする等のリスクがある。一方、抗体が変性しない程度の、あまり高温でない温度の熱媒体を用いると、大容量の熱交換器が必要となり、且つ、単位時間あたりに昇温できる抗体の量が少なくなってしまうという問題がある。このように、抗体を変性させることなく、抗体溶液の温度を短時間で昇温させることは困難である。
　そこで、本発明は、抗体を変性させることなく、温度応答性イオン交換クロマトグラフィーにより抗体を効率的に精製可能な方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて、研究開発を行った。その結果、温度応答性イオン交換クロマトグラフィー担体で抗体を精製する前に、温度応答性アフィニティークロマトグラフィー担体に低温領域で抗体を結合させ、温度応答性アフィニティークロマトグラフィー担体が抗体に対して結合性を失う温度領域であり、且つ、温度応答性イオン交換クロマトグラフィー担体が抗体と結合性を有する温度領域である高温領域の緩衝液で温度応答性アフィニティークロマトグラフィー担体から抗体を溶出し、引き続き、温度応答性イオン交換クロマトグラフィー担体で抗体を精製することで、抗体の変性を抑制し、抗体を効率的に精製できることを見出した。本発明で示される技術は、従来技術からは全く予想し得なかったもので、従来技術には全くなかった新規な抗体の分離システムへの発展が期待される。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。
　本発明に記載される製造方法により、抗体の変性を抑制し、温度応答性イオン交換クロマトグラフィー担体を用いて抗体を効率的に精製することが可能となる。この精製方法を利用すれば、抗体等の有用な生理活性物を温度変化によって工業規模で分離精製できるようになる。
本実施形態の実施例１に係る生理活性物質の精製システムを示す模式図である。 本実施形態の実施例２に係る生理活性物質の精製システムを示す模式図である。 本実施形態の比較例に係る生理活性物質の精製システムを示す第１の模式図である。 本実施形態の比較例に係る生理活性物質の精製システムを示す第２の模式図である。
　以下、図面を参照して、本発明の実施の形態（以下において、「本実施形態」という。）を詳細に説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号を付している。なお以下の示す実施の形態は、この発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、この発明の技術的思想は構成部品の配置等を下記のものに特定するものではない。この発明の技術的思想は、特許請求の範囲において種々の変更を加えることができる。
　本実施形態に係る生理活性物質の精製方法は、少なくとも第１及び第２の温度応答性クロマトグラフィー担体を使用する。第１の温度応答性クロマトグラフィー担体は、低温領域で生理活性物質を吸着し、高温領域で生理活性物質を脱離する性質を有する。第１の温度応答性クロマトグラフィー担体としては、温度応答性アフィニティークロマトグラフィー担体が使用可能であり、好ましくは温度応答性プロテインＡ担体が使用可能である。
　第２の温度応答性クロマトグラフィー担体は、高温領域で生理活性物質を吸着し、低温領域で生理活性物質を脱離する性質を有する。第２の温度応答性クロマトグラフィー担体としては、温度応答性イオン交換クロマトグラフィー担体が使用可能である。
　本実施形態において、第１の温度応答性クロマトグラフィー担体における低温領域とは、担体が特定の生理活性物質との吸着性を有する温度の領域であり、一定量の担体に結合可能な生理活性物質の最大結合量に対して、生理活性物質の結合量が５０％以上となる温度の領域である。一方、第１の温度応答性クロマトグラフィー担体における高温領域とは、担体が特定の生理活性物質との吸着性を有さない温度の領域であり、一定量の担体に結合可能な生理活性物質の最大結合量に対して、生理活性物質の結合量が５０％未満となる温度の領域である。
　第１の温度応答性クロマトグラフィー担体における低温領域、及び高温領域を特定する具体的な方法は、以下の手順で行う。
１．第１の温度応答性クロマトグラフィー担体にそれぞれ５℃未満、１０℃、以後、生理活性物質が変性する温度の直下まで１０℃間隔で設定された温度のそれぞれにおいて、生理活性物質を結合させる。
２．特定の生理活性物質が変性する温度の直下まで昇温して、結合した生理活性物質を溶出させ、生理活性物質を定量する。
３．生理活性物質の溶出量を、タンパクを吸着させた温度に対してプロットし、生理活性物質の結合量（溶出量）の最大値の５０％とプロット間を結んだ線の交点（以下、「５０％結合温度」と呼ぶ。）を境とし、５０％以上の生理活性物質の結合量を有する温度領域を第１の温度応答性クロマトグラフィー担体における低温領域、５０％未満の生理活性物質の結合量を有する温度領域を第１の温度応答性クロマトグラフィー担体における高温領域とする。
　本実施形態において、第２の温度応答性クロマトグラフィー担体における高温領域とは、担体が特定の生理活性物質との吸着性を有する温度の領域であり、一定量の担体に結合可能な生理活性物質の最大結合量に対して、生理活性物質の結合量が５０％以上となる温度の領域である。一方、第２の温度応答性クロマトグラフィー担体における低温領域とは、担体が特定の生理活性物質との吸着性を有さない温度の領域であり、一定量の担体に結合可能な生理活性物質の最大結合量に対して、生理活性物質の結合量が５０％未満となる温度の領域である。
　第２の温度応答性クロマトグラフィー担体における高温領域、及び低温領域を特定する具体的な方法は、以下の手順で行う。
１．第２の温度応答性クロマトグラフィー担体に、生理活性物質が変性する温度の直下から５℃未満になるまで、１０℃間隔で設定された温度のそれぞれにおいて、生理活性物質を結合させる。
２．５℃未満まで降温して、結合した生理活性物質を溶出させ、生理活性物質を定量する。
３．生理活性物質の溶出量を、タンパクを吸着させた温度に対してプロットし、生理活性物質の結合量（溶出量）の最大値の５０％とプロット間を結んだ線の交点（以下、「５０％結合温度」と呼ぶ。）を境とし、５０％以上の生理活性物質の結合量を有する温度領域を、第２の温度応答性クロマトグラフィー担体における高温領域、５０％未満の生理活性物質の結合量を有する温度領域を第２の温度応答性クロマトグラフィー担体における低温領域とする。
　第１の温度応答性クロマトグラフィー担体が生理活性物質を吸着する低温領域とは、例えば０℃以上２０℃未満、好ましくは１℃以上１５℃未満、最も好ましくは２℃以上１３℃未満である。第１の温度応答性クロマトグラフィー担体が生理活性物質を脱離する高温領域とは、例えば２０℃以上６０℃未満、好ましくは２５℃以上５０℃未満、最も好ましくは３０℃以上４５℃未満である。
　第２の温度応答性クロマトグラフィー担体が生理活性物質を吸着する高温領域とは、例えば２０℃以上６０℃未満、好ましくは２５℃以上５０℃未満、最も好ましくは３０℃以上４５℃未満である。第２の温度応答性クロマトグラフィー担体が生理活性物質を脱離する低温領域とは、例えば０℃以上２０℃未満、好ましくは１℃以上１５℃未満、最も好ましくは２℃以上１３℃未満である。
　本実施形態に係る生理活性物質の精製方法は、少なくとも、Ａ－１）低温領域で第１の温度応答性クロマトグラフィー担体に生理活性物質を吸着する工程と、Ａ－２）生理活性物質を吸着した第１の温度応答性クロマトグラフィー担体を昇温する工程と、Ａ－３）高温領域で第１の温度応答性クロマトグラフィー担体から生理活性物質を脱離する工程と、Ｂ－１）高温領域で第２の温度応答性クロマトグラフィー担体に生理活性物質を吸着する工程と、Ｂ－２）生理活性物質を吸着した第２の温度応答性クロマトグラフィー担体を降温する工程と、Ｂ－３）低温領域で第２の温度応答性クロマトグラフィー担体から生理活性物質を脱離する工程と、を含む。
　上記Ａ－１）工程において、第１の温度応答性クロマトグラフィー担体に生理活性物質を吸着させる時の温度は、生理活性物質を含有する溶液が凍結する温度以上であり、第１の温度応答性クロマトグラフィー担体の５０％結合温度から－３０℃以内であることが好ましく、さらに好ましくは－２５℃以内、最も好ましくは－２０℃以内である。第１の温度応答性クロマトグラフィー担体に生理活性物質を吸着させる時の温度が低ければ、生理活性物質の吸着性を高めることが出来るが、カラム内の圧力が高まる傾向があるため、第１の温度応答性クロマトグラフィー担体の５０％結合温度から－３０℃以内であることが好ましい。
　上記Ａ－３）工程において、第１の温度応答性クロマトグラフィー担体から生理活性物質を脱離させる時の温度は、第１の温度応答性クロマトグラフィー担体の５０％結合温度から＋３０℃以内であることが好ましく、さらに好ましくは＋２５℃以内、最も好ましくは＋２０℃以内である。第１の温度応答性クロマトグラフィー担体から生理活性物質を脱離させる時の温度が高ければ、生理活性物質の脱離性が高まり、回収率を高めることが出来るが、生理活性物質が熱により分解、失活する傾向もある。
　上記Ｂ－１）工程において、第２の温度応答性クロマトグラフィー担体に生理活性物質を吸着させる時の温度が、第２の温度応答性クロマトグラフィー担体の５０％結合温度から＋３０℃以内であることが好ましく、さらにさらに好ましくは＋２５℃以内、最も好ましくは＋２０℃以内である。第２の温度応答性クロマトグラフィー担体に生理活性物質を吸着させる時の温度が高ければ生理活性物質の脱離性が高まり、回収率を高めることが出来るが、生理活性物質が熱により分解、失活する傾向もある。
　また、上記Ｂ－１）工程において、第２の温度応答性クロマトグラフィー担体に生理活性物質を吸着させる時の温度が、第１の温度応答性クロマトグラフィー担体から生理活性物質を脱離させる時の温度以下であることが好ましく、最も好ましくは０～－５℃の範囲内である。生理活性物質の精製を産業規模で実施する場合、生理活性物質を含有する溶液を昇温させたり、高温に維持したりするには、上記溶液を高温の熱媒体と熱交換させる必要がある。しかしながら、生理活性物質は、高温の熱媒体との接触により変性し、凝集体が形成されたり、生理活性が失活したりしうる。したがって、高温の熱媒体との接触は必要最小限にとどめることが好ましい。
　上記Ｂ－３）工程において、第２の温度応答性クロマトグラフィー担体から生理活性物質を脱離させる時の温度は、生理活性物質を含有する溶液が凍結する温度以上であり、第２の温度応答性クロマトグラフィー担体の５０％結合温度から－４０℃以内であることが好ましく、さらに好ましくは－３５℃以内、最も好ましくは－３０℃以内である。第２の温度応答性クロマトグラフィー担体に生理活性物質を吸着させる時の温度が低ければ、生理活性物質の脱離性が高まり、回収率を高めることが出来るが、カラム内の圧力が高まる傾向があるため、第２の温度応答性クロマトグラフィー担体の５０％結合温度から－４０℃以内であることが好ましい。
　さらに、上記第２の温度応答性クロマトグラフィー担体の５０％結合温度が、第１の温度応答性クロマトグラフィー担体の５０％結合温度から＋２０℃以下であることが好ましい。第２の温度応答性クロマトグラフィー担体の５０％結合温度が、第１の温度応答性クロマトグラフィー担体の５０％結合温度より２０℃を超えて高い場合、第１の温度応答性クロマトグラフィー担体から生理活性物質を脱離させる時の温度を高く設定しなくてはならないため、生理活性物質が熱により分解、失活する傾向がある。
　Ａ－１）～Ｂ－３）工程までの間の、上記生理活性物質を含有する溶液のｐＨ条件が、４～８で、変動幅が、１以内であることが好ましい。生理活性物質を含有する溶液のｐＨが酸性、もしくはアルカリ性になると、生理活性物質の失活や、凝集等が生じる傾向にある。
　また、本実施形態に係る生理活性物質の精製キットは、上述した少なくとも第１及び第２の温度応答性クロマトグラフィー担体を備える。第１の温度応答性クロマトグラフィー担体が生理活性物質を脱離する性質を有する高温領域の温度Th1と、第２の温度応答性クロマトグラフィー担体が生理活性物質を吸着する性質を有する高温領域の温度Th2とは、
　　　　Th1　－　１０（℃）　　≦　Th2　≦　Th1　＋　１０（℃）
　の関係を有する。第２の温度応答性クロマトグラフィー担体が生理活性物質を吸着する性質を有する高温領域の温度Th2を、第１の温度応答性クロマトグラフィー担体が生理活性物質を脱離する性質を有する高温領域の温度Th1の±１０℃以内とすることにより、精製対象である生理活性物質の変性を抑制することが可能となる。
　さらに、本実施形態において、生理活性物質を含有する溶液中に混入したウイルスを不活性化するために、既知のウイルス不活化法を組合せることも可能である。ウイルス不活化法としては、例えば、低ｐＨ法、ＵＶ照射法、界面活性剤処理（ＳＤ処理）、熱処理、そして高圧処理等が例示される。ウイルス不活化工程は、Ａ－１）工程の前、Ａ－３）工程の後、Ｂ－１）の前、そしてＢ－３）工程の後等に挿入することが出来る。低ｐＨ法は操作が簡便なため好適に用いられるが、生理活性物質の失活や、凝集等が生じない程度の条件で実施することが好ましい。具体的には、ｐＨは３～５、処理時間は１～２４０分で実施することができる。
　次に、まず、本実施形態に係る第２の温度応答性クロマトグラフィー担体としての温度応答性イオン交換クロマトグラフィー担体について詳細に説明する。
　温度応答性イオン交換クロマトグラフィー担体としては、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド等を含む共重合体を基材表面に固定した温度応答性イオン交換体が使用可能である。共重合体は、少なくともイオン交換基を有する。例えば、本実施形態に係る温度応答性イオン交換体は、イオン交換基を有するモノマー及び／又はイオン交換基導入前駆体モノマー、及びＮ－イソプロピルアクリルアミドモノマーからなるモノマー混合物を表面グラフト重合法によって基材表面に重合して形成される。
　本実施形態に係る温度応答性イオン交換クロマトグラフィー担体で使用する基材の形状は、特に限定されるものではなく、例えばビーズ状、平板状、管状のものがある。ビーズ状の場合、さまざまな粒径のビーズが入手可能であり特に限定されるものではないが、粒径は例えば１～３００μｍであり、好ましくは１０～２００μｍであり、さらに好ましくは２０～１５０μｍである。粒径が１μｍ以下であると、カラム内でビーズの圧密化が起きやすいために、高流速での処理が困難になる傾向にある。また粒径が３００μｍ以上ではビーズ間の隙間が大きくなり、生体高分子を吸着させる際に、溶液の漏れが発生する傾向にある。
　本実施形態で使用する基材は、例えば複数の細孔を有する。細孔径は、特に限定されるものではないが、例えば５～１０００ｎｍであり、好ましくは１０～７００ｎｍであり、さらに好ましくは２０～５００ｎｍである。細孔径が５ｎｍ以下であると、分離できる生体高分子の分子量が低くなる傾向にある。また細孔径が１０００ｎｍ以上であると基材の表面積が少なくなり、抗体の結合容量が小さくなる傾向にある。
　基材の材料は、特に限定されるものではないが、ビーズ状である場合、ガラス、シリカ、ポリスチレン樹脂、メタクリル樹脂、架橋アガロース、架橋デキストラン、架橋ポリビニルアルコール、及び架橋セルロースなどが使用できる。
　本実施形態では、上記基材にイオン交換基を有する温度応答性ポリマーが固定化される。その固定化方法としては、基材表面に原子移動ラジカル重合開始剤を固定化し、その開始剤から触媒の存在下で温度応答性ポリマーを成長反応させる「原子移動ラジカル法」や、基材に放射線を照射してラジカルを生成し、生成したラジカルを起点として温度応答性ポリマーを成長反応させる「放射線グラフト重合法」等があるが、特に限定されるものではない。他に、固定化方法として、表面リビングラジカル重合法である「原子移動ラジカル重合法」がある。「原子移動ラジカル重合法」は、基材表面にポリマーを高密度に固定することが出来るため、好適に用いることができる。
　温度応答性ポリマーが「原子移動ラジカル重合法」で固定される場合、その際に使用する開始剤は特に限定されるものではないが、本実施形態のように基材に水酸基を有している場合、例えば、１－トリクロロシリル－２－（ｍ，ｐ－クロロメチルフェニル）エタン、２－（４－クロロスルホニルフェニル）エチルトリメトキシシラン、（３－（２－ブロモイソブチリル）プロピル）ジメチルエトキシシラン、及び２－ブロモイソ酪酸ブロミドなどが挙げられる。本実施形態では、この開始剤よりポリマー鎖を成長させる。その際の触媒としては特に限定されるものでないが、ハロゲン化銅（ＣｕＩＸ）としてＣｕＩＣｌ、ＣｕＩＢｒ等を挙げることができる。また、そのハロゲン化銅に対するリガンド錯体も特に限定されるものではないが、トリス（２－（ジメチルアミノ）エチル）アミン（Ｍｅ６ＴＲＥＮ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’’，Ｎ’’－ペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＥＴＡ）、１，１，４，７，１０，１０－ヘキサメチルトリエチレンテトラアミン（ＨＭＴＥＴＡ）、１，４，８，１１－テトラメチル １，４，８，１１－アザシクロテトラデカン（Ｍｅ４Ｃｙｃｌａｍ）、及びビピリジン等が挙げられる。
　温度応答性ポリマーが「放射線グラフト重合法」で固定される場合、基材にラジカルを生成させるためにはいかなる手段も採用し得るが、基材全体に均一なラジカルを生成させるためには、電離性放射線の照射が好ましい。電離性放射線の種類としては、γ線、電子線、β線、及び中性子線等が利用できるが、工業規模での実施には電子線又はγ線が好ましい。電離性放射線はコバルト６０、ストロンチウム９０、及びセシウム１３７などの放射性同位体から、又はＸ線撮影装置、電子線加速器及び紫外線照射装置等により得られる。
　電離性放射線の照射線量は、例えば１ｋＧｙ以上１０００ｋＧｙ以下であり、好ましくは２ｋＧｙ以上５００ｋＧｙ以下であり、より好ましくは５ｋＧｙ以上２００ｋＧｙ以下である。照射線量が１ｋＧｙ未満では、ラジカルが均一に生成しにくくなる傾向にある。また、照射線量が１０００ｋＧｙを超えると、基材の物理的強度の低下を引き起こす傾向にある。
　電離性放射線の照射によるグラフト重合法には、一般に基材にラジカルを生成した後、次いでそれを反応性化合物と接触させる前照射法と、膜を反応性化合物と接触させた状態で基材にラジカルを生成させる同時照射法と、に大別される。本実施形態においては、いかなる方法も適用し得るが、オリゴマーの生成が少ない前照射法が好ましい。
　本実施形態において重合時に使用する溶媒は、反応性化合物を均一溶解できるものであれば特に限定されない。このような溶媒として、例えば、エタノールやイソプロパノール、ｔ－ブチルアルコール等のアルコール類、ジエチルエーテルやテトラヒドロフラン等のエーテル類、アセトンや２－ブタノン等のケトン類、水、又はそれらの混合物等が挙げられる。
　本実施形態において、基材表面に被覆されるポリマーは、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド等の温度応答性モノマーを有する。ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）は３２度に下限臨界温度を有することが知られている。このポリマー表面に導入した担体は、臨界温度で親水性／疎水性の表面物性を大きく変化させるため、これをクロマトグラフィー担体の基材（充填剤）の表面にグラフトもしくはコーティングして使用した場合、試料に対する保持力が温度によって得られるようになる。その結果、溶出液の組成を変化させずに保持挙動を温度によって制御することができるようになる。
　下限臨界温度を３２℃以上にするためには、イソプロピルアクリルアミドよりも親水性のモノマーであるアクリルアミド、メタクリル酸、アクリル酸、ジメチルアクリルアミド、及びビニルピロリドンなどの親水性のコモノマーをＮ－イソプロピルアクリルアミドと共重合させることによって調製することが可能である。また、下限臨界温度を３２℃以下にしたいときは、疎水性モノマーであるスチレン、アルキルメタクリレート、アルキルアクリレートなどとの疎水性のコモノマーとの共重合によって調製することができる。
　イオン交換基は、強アニオン交換基、弱アニオン交換基、強カチオン交換基、弱カチオン交換基に大別することが可能であるが、精製する生理活性物質の種類によって最適なイオン交換基を選択する必要がある。一般的に、免疫グロブリン、リゾチーム、ヘモグロビンβ鎖、カタラーゼ、アネキシン、及びエズリン等の塩基性タンパク質を吸着させる場合は、カチオン交換基を選択することが好ましく、アルブミン等の酸性タンパク質を吸着させる場合は、アニオン交換基を選択することが好ましい。本実施形態においては、イオン交換基として強カチオン交換基を選択し、抗体を吸着させる場合について詳細に説明するが、本実施形態はこれに限定されない。
　上述したように、本実施形態において、基材表面に被覆されるポリマーとして、スルホン酸基等の強カチオン交換基を有するものを以下説明する。強カチオン交換基を与える方法は特に限定されないが、第１の方法として、担体表面に被覆される温度応答性ポリマー鎖を合成する際、強カチオン交換基を有するモノマーを含めて共重合する方法が挙げられる。スルホン酸基を有するモノマーとしては、スルホン酸を有するポリマーの構成単位である（メタ）アクリルアミドアルキルスルホン酸等が挙げられる。
　基材表面に被覆されるポリマーに強カチオン交換基を与える第２の方法として、「強カチオン交換基導入前駆体」を有するモノマーを含めて共重合した後、前駆体をスルホン酸基に変換する方法が挙げられる。なお、「強カチオン交換基導入前駆体」とは、「強カチオン交換基の前駆体」を含みうる。また、「強カチオン交換基の前駆体」とは、例えば強カチオン交換基に保護基がついたものである。スルホン酸基の前駆体を有するモノマーとして、フェニルビニルスルホネート等が挙げられるが、本実施形態はこれらに限定されるものではない。
　基材表面に被覆されるポリマーに強カチオン交換基を与える第３の方法として、強カチオン交換基を付与し得る官能基を有するモノマーを含めて共重合した後、強カチオン交換基を付与し得る官能基をスルホン酸基に変換する方法が挙げられる。強カチオン交換基を付与し得る官能基を有するモノマーとしては、グリシジルメタクリレート等が挙げられる。強カチオン交換基を有するモノマーを表面リビングラジカル重合法により重合する場合、十分な重合速度が得られない場合が多いが、グリシジルメタクリレート等の強カチオン交換基導入前駆体モノマーを用いることで、十分な重合速度を得ることが可能となる。
　本実施形態においては、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドに対する、強カチオン交換基を有するモノマー及び/又は強カチオン交換基導入前駆体モノマーの比率が、０．０１～５ｍｏｌ％であるモノマー組成物を、表面グラフト重合法によって重合する。上記比率は、好ましくは０．１～４ｍｏｌ％、より好ましくは０．２～３ｍｏｌ％、さらに好ましくは０．３～２ｍｏｌ％、最も好ましくは０．５～１．５ｍｏｌ％である。上記比率が５ｍｏｌ％を超えると、共重合体中のＮ－イソプロピルアクリルアミドに対する強カチオン交換基の量が過剰量となってしまう。そのため、温度応答性吸着剤への免疫グロブリンの吸着量が増大するものの、吸着した免疫グロブリンを温度変化によって溶出することが困難になる傾向にある。一方、上記比率が０．０１ｍｏｌ％未満では、強カチオン交換基導入量が少なすぎるため、免疫グロブリンの吸着量が少なくなる傾向にある。
　本実施形態において、基材表面に被覆されているポリマーは温度を変えることで水和、脱水和を起こすものであり、その温度域は０℃以上８０℃未満、好ましくは５℃以上５０℃未満、さらに好ましくは１０℃以上４５℃未満である。８０℃を越えると移動相が水であるので蒸発等が生じ、作業性が悪くなる傾向にある。また、０℃より低いと移動相が凍結する傾向にある。
　本実施形態によって得られる温度応答性イオン交換クロマトグラフィー担体は、通常の液体クロマトグラフィー装置に取り付けて、液体クロマトグラフィーシステムとして利用される。その際、温度応答性イオン交換クロマトグラフィー担体への温度の負荷方法は特に限定されないが、例えば温度応答性イオン交換クロマトグラフィー担体に所定の温度にしたアルミブロック、水浴、空気層、あるいはジャケットなどを装着すること等が挙げられる。
　本実施形態の温度応答性吸着剤を用いた分離方法は特に限定されるものではないが、一例としては、得られた温度応答性液体クロマトグラフィー担体に目的とする生体高分子を一度吸着させ、その後、温度を変えて担体表面の特性を変化させることで吸着した生体高分子を遊離させるような、キャッチアンドリリース法に基づいて利用する方法が挙げられる。その際に吸着させる溶質量は担体に吸着しうる量を超えていてもよく、超えていなくてもよい。いずれにせよ一度吸着させ、その後、温度を変えて担体表面の特性を変化させることで、吸着した溶質を遊離させる精製法である。
　上述したように、第２の温度応答性クロマトグラフィー担体である温度応答性イオン交換クロマトグラフィー担体が生理活性物質を吸着する温度領域は、例えば２０℃以上６０℃未満、好ましくは２５℃以上５０℃未満、最も好ましくは３０℃以上４５℃未満の高温領域である。温度応答性イオン交換クロマトグラフィー担体が生理活性物質を脱離する温度領域は、例えば０℃以上２０℃未満、好ましくは１℃以上１５℃未満、最も好ましくは２℃以上１３℃未満の低温領域である。
　その他の分離方法は特に限定されるものではないが、あらかじめ担体の親水性／疎水性の表面物性が変わる温度を確認しておき、その温度を挟むようにして温度変化させながら不純物の分離を行う方法が挙げられる。この場合、温度変化だけで担体の親水性／疎水性の表面物性が大きく変わるので、溶質によってはシグナルの出てくる時間（保持時間）に大きな差が生じることが期待される。本実施形態の場合、この担体の親水性／疎水性の表面物性が大きく変わる温度を挟むようにして分離することが最も効果的な実施形態の一つである。
　本実施形態で示されるクロマトグラフィーは移動相として緩衝液を利用すればよく、有機溶媒を必要としないものである。ここで、緩衝液とは無機塩類を含む水溶液であって、具体的には、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、及び酢酸緩衝液等が挙げられるが、通常利用される緩衝液であれば特に限定されるものではない。その無機塩類の濃度は例えば１～５０ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは３～４０ｍｍｏｌ／Ｌであり、さらに好ましくは５～３０ｍｍｏｌ／Ｌである。移動相の無機塩類の濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌより低いと、溶質である生理活性物質の活性を損ねる傾向にある。また、温度応答性吸着剤表面のイオン交換基の解離度が高くなり、温度応答性吸着剤表面へ溶質が強固に吸着してしまい、その後の操作で担体表面から溶質を剥がすことが困難となる傾向にある。また、無機塩類の濃度が５０ｍｍｏｌ／Ｌより高くなると、温度応答性吸着剤表面のイオン交換基の解離度が低くなり、担体表面への溶質の保持が困難となり、最終的に溶質を分離することが困難となる傾向にある。
　本実施形態で用いられる中性の緩衝液とは、例えばｐＨが４．０～７．５であり、好ましくは４．５～７．０であり、さらに好ましくは５．０～６．５である。緩衝液のｐＨが７．５より高くなると免疫グロブリン（等電点７．５～１０）は負に荷電するため、本実施形態の温度応答性吸着剤が有する強カチオン交換基と荷電反発がおこり、吸着容量が極端に低下する傾向にある。また、ｐＨが４．０より低くなると、免疫グロブリンの変性が起こり、活性の低下や、凝集体の生成等の品質低下が引き起こされる傾向にある。本実施形態において、精製対象となるタンパク質は特に限定されないが、強カチオン交換基を有する担体表面を利用する場合、塩基性タンパク質が好ましい。塩基性タンパク質としては、例えば免疫グロブリン、リゾチーム、ヘモグロビンβ鎖、カタラーゼ、アネキシン、及びエズリン等が挙げられる。強力カチオン交換基を有する担体は、特に免疫グロブリンの精製に好適に用いることができる。
　次に、本実施形態に係る第１の温度応答性クロマトグラフィー担体としての温度応答性アフィニティークロマトグラフィー担体について詳細に説明する。
　本実施形態に係る温度応答性アフィニティークロマトグラフィー担体で使用される支持体の形状は、特に限定されるものではなく、例えば平膜状、中空糸状等の膜状、又はビーズ状のものがある。中空糸状の支持体は、モジュール成型が容易であり、モジュール容器あたりに充填できる膜面積が大きいため、好適に用いることができる。また、ビーズ状のものは一般的に、体積あたりの表面積が膜状のものと比較して大きく、大量の抗体を吸着できるため、好適に用いることができる。
　支持体の材料は、特に限定されるものではないが、担体が膜状である場合、多孔性膜を形成しうる高分子材料が好適に用いることができる。例えば、ポリエチレンやポリプロピレン等のオレフィン樹脂、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンテレナフタレート等のポリエステル樹脂、ナイロン６、ナイロン６６等のポリアミド樹脂、ポリフッ化ビニリデン、ポリクロロトリフルオロエチレン等の含フッ素樹脂、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、及びポリカーボネート等の非結晶性樹脂などが使用できる。担体がビーズ状である場合、支持体の材料としては、ガラス、シリカ、ポリスチレン樹脂、メタクリル樹脂、架橋アガロース、架橋デキストラン、架橋ポリビニルアルコール、及び架橋セルロースなどが使用できる。架橋ポリビニルアルコール、及び架橋セルロースは親水性が高く、不純物成分の吸着を抑制できるため好適に用いることができる。
　本実施形態で使用する支持体は、例えば複数の細孔を有する。細孔径は、特に限定されるものではないが、例えば５～１０００ｎｍであり、好ましくは１０～７００ｎｍであり、さらに好ましくは２０～５００ｎｍである。細孔径が５ｎｍ以下であると、分離できる抗体の分子量が低くなる傾向にある。また細孔径が１０００ｎｍ以上であると基材の表面積が少なくなり、抗体の結合容量が小さくなる傾向にある。
　支持体には、任意のカップリング基を導入してよい。カップリング基としては、例えば、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化されたカルボキシル基、カルボキシル基、臭化シアン活性化基、水酸基、エポキシ基、アルデヒド基、及びチオール基等が挙げられる。温度応答性アフィニティークロマトグラフィー担体が温度応答性プロテインＡを備える場合、温度応答性プロテインＡは一級アミノ基を有しているため、上述したカップリング基のうち、一級アミノ基とカップリングできるＮＨＳ活性化されたカルボキシル基、カルボキシル基、臭化シアン活性基、エポキシ基、及びホルミル基等が好ましい。特に、ＮＨＳで活性化されたカルボキシル基は、カップリング反応時に他の薬品が不要であり、反応が迅速で強固な結合を形成するため好適に用いられる。
　本実施形態では、支持体へのカップリング基の導入方法はいかなる方法でもよいが、支持体と、カップリング基と、の間にスペーサーを導入するのが一般的である。カップリング基の導入方法は、さまざまな文献によって開示されている。
　本実施形態では、カップリング基を末端、及び／又は側鎖に有するグラフト高分子鎖を支持体に導入してもよい。カップリング基を有するグラフト高分子鎖を支持体に導入することで、カップリング基の密度を任意に高める等、制御することが可能となる。カップリング基を有する高分子鎖を支持体にグラフトするか、あるいはカップリング基に変換しうる前駆体官能基を有する高分子鎖を支持体にグラフトし、その後にグラフトした前駆体官能基をカップリング基に変換してもよい。
　グラフト高分子鎖の導入方法はいかなる方法でもよい。あらかじめ高分子鎖を調製し、支持体にカップリングしてもよい。また、「リビングラジカル重合法」や「放射線グラフト重合法」の手法により、支持体上で直接グラフト鎖を重合してもよい。「放射線グラフト法」は、支持体にあらかじめ反応開始剤を導入する必要がなく、適応可能な支持体が多種であるため、好適に用いることができる。
　「放射線グラフト重合法」でグラフト鎖を導入する場合、支持体にラジカルを生成させるためにはいかなる手段も採用し得るが、支持体全体に均一なラジカルを生成させるためには、電離性放射線の照射が好ましい。電離性放射線の種類としては、γ線、電子線、β線、及び中性子線等が利用できるが、工業規模での実施には電子線又はγ線が好ましい。電離性放射線はコバルト６０、ストロンチウム９０、及びセシウム１３７などの放射性同位体から、あるいはＸ線撮影装置、電子線加速器及び紫外線照射装置等から得られる。
　電離性放射線の照射線量は、例えば１ｋＧｙ以上１０００ｋＧｙ以下が好ましく、より好ましくは２ｋＧｙ以上５００ｋＧｙ以下、さらに好ましくは５ｋＧｙ以上２００ｋＧｙ以下である。照射線量が１ｋＧｙ未満では、ラジカルが均一に生成しにくくなる傾向にある。また、照射線量が１０００ｋＧｙを超えると、支持体の物理的強度の低下を引き起こす傾向にある。
　電離性放射線の照射によるグラフト重合法には、一般に支持体にラジカルを生成した後、次いでそれを反応性化合物と接触させる前照射法と、支持体を反応性化合物と接触させた状態で支持体にラジカルを生成させる同時照射法と、に大別される。本実施形態においては、いかなる方法も適用し得るが、オリゴマーの生成が少ない前照射法が好ましい。
　本実施形態においてグラフト重合時に使用する溶媒は、反応性化合物を均一溶解できるものであれば特に限定されない。このような溶媒として、例えば、エタノールやイソプロパノール、ｔ－ブチルアルコール等のアルコール類；ジエチルエーテルやテトラヒドロフラン等のエーテル類；アセトンや２－ブタノン等のケトン類；水、又はそれらの混合物等が挙げられる。
　本実施形態において、グラフト重合に使用されるカップリング基を有するモノマーとしては、カルボキシル基をカップリング基とする場合、アクリル酸、及びメタクリル酸等のモノマーが挙げられる。一級アミノ基をカップリング基とする場合、アリルアミン等が挙げられる。そして、エポキシ基をカップリング基とする場合、グリシジルメタクリレート等が挙げられる。
　本実施形態において、カップリング基に変換しうる前駆体官能基を有するモノマーを支持体にグラフトし、その後にグラフトした前駆体官能基をカップリング基に変換してもよい。エポキシ基を有するグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）は、さまざまなエポキシ基の開環反応を利用してさまざまな官能基に変換することが可能であるため、工業的にも好適に用いることが可能である。
　カルボキシル基をカップリング基とする場合には、まずＧＭＡをグラフト重合後、ＧＭＡのエポキシ基を加水分解してジオールとし、ジオール由来の水酸基に環状酸無水物を開環ハーフエステル化反応させることにより、環状酸無水物に由来するカルボキシル基を形成（開環ハーフエステル化反応）することが可能である。製造コストの点で、環状酸無水物は無水コハク酸又は無水グルタル酸であることが望ましいが、これらに限定されない。
　開環ハーフエステル化反応に用いられる触媒としては本反応を促進するものであれば特に限定されないが、具体的にはトリエチルアミン、イソブチルエチルアミン、ピリジン、及び４－ジメチルアミノピリジンなどが挙げられ、トリエチルアミン又は４－ジメチルアミノピリジンが好ましく、反応速度や収率の点で４－ジメチルアミノピリジンが最も好ましい。
　開環ハーフエステル化反応は、上記触媒を添加したトルエン等の不活性有機溶媒中で行われることが好ましい。
　本実施形態においてＮＨＳ活性反応とは、上記開環ハーフエステル化反応により形成されたカルボキシル基を活性エステルに変換する工程である。カルボキシル基と比較して活性エステルは反応性が高いことから、温度応答性プロテインＡを担体上に迅速に固定化することが望まれる場合には活性エステル化工程を行うことが好ましい。
　活性エステルは、親水性化合物と、固定化対象物質と、を共有結合によって結びつける役目を果たす。ここで、活性エステルとはＲ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｘという化学構造を意味する。Ｘは、ハロゲンやＮ－ヒドロキシスクシンイミド基又はその誘導体、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール基又はその誘導体、ペンタフルオロフェニル基、並びにパラニトロフェニル基などの脱離性基であるが、これらに限定されない。活性エステルとしては、反応性、安全性及び製造コストの点で、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルが望ましい。カルボキシル基のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルへの変換は、カルボキシル基にＮ－ヒドロキシスクシンイミドと、カルボジイミドと、を同時に反応させることによって達成される。ここで、カルボジイミドとは－Ｎ＝Ｃ＝Ｎ－の化学構造を有する有機化合物を意味し、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、及び１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等が挙げられるが、これらに限定されない。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド及びカルボジイミドの濃度は１～１００ｍｍｏｌ／Ｌ、反応温度は０℃以上１００℃未満、反応時間は２分～１６時間の範囲で設定されるのが望ましい。反応溶媒としては、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）やトルエンなどを使用することができる。
　本実施形態において、温度応答性アフィニティークロマトグラフィー担体が温度に依存して抗体との結合性が変化するよう変異されたプロテインＡである温度応答性プロテインＡを備える場合、温度応答性プロテインＡは、特許文献（ＷＯ２００８／１４３１９９号パンフレット）を参考に調製することができる。
　本実施形態において、ＮＨＳ活性化されたカルボキシル基と、温度応答性プロテインＡと、のカップリング反応は、例えば以下のように行われる。まず、クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０～６．２）、酢酸緩衝液（ｐＨ３．６～５．６）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ５．８～８．５）、又は炭酸緩衝液（ｐＨ９．２～１０．６）などのアミノ基成分を含まない緩衝液を用いて、０．１～１００ｍｇ／ｍLの温度応答性プロテインＡ溶液を準備する。この水溶液を活性エステル表面と接触させると、温度応答性プロテインＡに含まれるアミノ基等の官能基が活性エステルと反応し、アミド結合が形成される。その結果、温度応答性プロテインＡは共有結合によって表面に固定化される。ここで、接触時間は２分～１６時間の範囲で設定するとよい。温度応答性プロテインＡを固定化した後は、適当な洗浄液で担体を洗浄することが望ましい。このとき、洗浄液は０．５ｍｏｌ／Ｌ程度の塩（ＮａＣｌ）及び０．１％程度の非イオン性界面活性剤を含む緩衝液であることが望ましい。これによって、共有結合せずに物理吸着しているだけの温度応答性プロテインＡを取り除くことができるからである。
　温度応答性プロテインＡを担体表面に固定化した後（好ましくは更に温度応答性プロテインＡ固定化担体を洗浄した後）は、未反応のカルボキシル基又は活性エステルを、アミノ基を有する低分子化合物と結合させることにより、当該カルボキシル基又は活性エステルを反応性のより低い官能基に変換させることが好ましい。これによって、不純物等の精製対象外の分子が不本意に担体表面に固定化されるのを防ぐことができる。特に温度応答性プロテインＡ固定用担体の末端の官能基が活性エステルである場合、この操作がされることが好ましい。
　ここでは、活性エステル基にアミノ基を有する低分子化合物を反応させる操作を特に「ブロッキング」と記述することがある。ただし、カルボキシル基又は活性エステルを低分子化合物と反応させた後の担体表面は、親水性であることが望ましい。なぜなら、親水性の表面は一般に生体関連物質の非特異的吸着を抑制する効果をもつからである。このためにはアミノ基を含有する低分子化合物として、アミノ基以外に親水性基を更に有する低分子化合物を使用することが好ましい。このような低分子化合物の非限定的な例としては、エタノールアミン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、及びジグリコールアミン（ＩＵＰＡＣ名：２－（２－アミノエトキシ）エタノール）が挙げられる。これらの低分子化合物はＰＢＳなどの緩衝液に１０～１，０００ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶解し、溶解液を温度応答性プロテインＡを固定化した担体と接触させる。例えば、反応温度は４～３７℃、反応時間は２分～１６時間の範囲で設定するとよい。
　温度応答性プロテインＡ固定化担体は、ｐＨ４～８の範囲の中性溶液を保存液とし、２～１０℃程度の低温で保存する。保存液としては、抗菌性を考慮して、２０％エタノールが好ましい。
　温度応答性プロテインＡは、低温で抗体を結合し、結合時の温度よりも高い温度で抗体を溶出できるといった特性がある。あらかじめ温度応答性プロテインＡの特性が変わる温度を確認しておき、その温度を挟むようにして温度変化させることにより抗体を吸脱着させることが好ましい。抗体を温度応答性プロテインＡに吸着させる温度領域は、例えば０℃以上２０℃未満、好ましくは１℃以上１５℃未満、最も好ましくは２℃以上１３℃未満の低温領域である。抗体を温度応答性プロテインＡから脱離させる温度は、例えば２０℃以上６０℃未満、好ましくは２５℃以上５０℃未満、最も好ましくは３０℃以上４５℃未満の高温領域である。
　次に、本実施形態に係る少なくとも第１及び第２の温度応答性クロマトグラフィー担体を用いた生理活性物質の精製方法について詳細に説明する。
　本実施形態の抗体を含有する混合物から該抗体を精製する方法において、抗体を含有する混合物には、抗体を産生するハイブリドーマ、ＮＳＯ等のミエローマ細胞、抗体をコードする遺伝子で形質転換され該抗体を発現産生し得る動物細胞、酵母等の培養上清が含まれる。好ましくは、本実施形態の方法による精製を行なうときはこれらの培養上清は清澄化しておく。清澄化は例えば、０．２μｍのメンブランフィルターによる濾過等により行なえばよい。
　本実施形態で精製する抗体には、限定はなく例えばヒト抗体、マウスやウシ、ヤギ、ヒツジなどの有蹄動物等の非ヒト動物抗体、ヒトと非ヒト動物とのキメラ抗体、並びに非ヒト動物抗体をヒト化したヒト化抗体等が含まれ、好ましくはヒト抗体である。更に好ましくはヒトモノクローナル抗体である。また、抗体のクラス、サブクラスは限定されず、いずれのクラス、サブクラスの抗体も本実施形態において精製し得るが、好ましくはＩｇＧ、その中でもＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４である。また、抗体が、抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列において、天然に存在する重鎖定常領域のアミノ酸の少なくとも一つのアミノ酸が欠失し、又は天然に存在する重鎖定常領域のアミノ酸の少なくとも一つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換し、又は天然に存在する重鎖定常領域に少なくとも一つのアミノ酸が付加した抗体であってもよい。さらに、抗体が他の化合物と共有あるいは配位結合していてもよい。
　温度応答性クロマトグラフィー担体がビーズ状の担体に固定されている場合は、市販の空カラム又はガラス管から作製した空カラムに詰めて用いてもよい。市販のジャケット付き空カラム（商品名　ＸＫカラム、ＧＥヘルスケア・ジャパン）は、カラム自体の温度をジャケット循環水の温度を制御することで任意に制御することが出来るので、好適に使用することが出来る。温度応答性クロマトグラフィー担体が膜状の場合は、それぞれの形状に従い、市販の膜ホルダーに固定するか、任意のモジュール形状に加工して使用してもよい。
　本実施形態において、例えば図１に示すように、第１の温度応答性クロマトグラフィー担体としての温度応答性プロテインＡを備える温度応答性アフィニティークロマトグラフィー担体を備えるカラム１０、及び第２の温度応答性クロマトグラフィー担体としての温度応答性カチオン交換クロマトグラフィー担体を備えるカラム２０は、配管１０４を介して直列に連結される。カラム間の配管１０４の長さは、放熱による温度変化を最小化するために、出来るだけ短くし、さらに保温するとよい。また、カラム間の配管１０４に、流路切り替え用の三方バルブを設置し、ドレーン弁６０を配してもよい。ドレーン弁６０は、抗体を含有する混合物を温度応答性プロテインＡを備える温度応答性アフィニティークロマトグラフィー担体カラム１０に供給する際に、温度応答性アフィニティークロマトグラフィー担体カラム１０から流出した夾雑物を含む廃液を排出し、温度応答性カチオン交換クロマトグラフィー担体カラム２０へ夾雑物を含む廃液が供給されることを防ぐために用いられる。
　１）温度応答性プロテインＡへの抗体の結合
　本実施形態の精製方法において、上記抗体を含有する混合物溶液は、温度応答性プロテインＡに吸着される温度まで冷却された後に、温度応答性プロテインＡを備える温度応答性アフィニティークロマトグラフィー担体カラム１０に供給される。その場合、予め、温度応答性プロテインＡが抗体に対して結合性を有する温度を確認しておき、抗体を含有する混合物溶液の温度をその温度に調整する必要がある。抗体を温度応答性プロテインＡに吸着させる温度は０℃以上２０℃未満、好ましくは１℃以上１５℃未満、最も好ましくは２℃以上１３℃未満である。抗体を含有する混合物溶液は、プロテアーゼ等の不純物を含有している場合があり、低温で保存されている場合がある。抗体を含有する混合物の保存温度が、温度応答性プロテインＡが抗体に対して結合性を有する温度の範囲内の場合は、そのまま抗体を温度応答性プロテインＡに吸着させてもよい。また、温度応答性プロテインＡカラムの直上流に熱交換器を配置して、抗体を含有する混合物溶液を温度応答性プロテインＡカラムにロードしながら、連続的に抗体を含有する混合物溶液の温度を調節することも可能である。また、温度応答性プロテインＡカラムを、所定の温度に調節した恒温水槽に浸漬することによって抗体を含有する混合物溶液の温度を調節することも可能である。温度応答性プロテインＡカラムの直上流に配した熱交換器を用いるだけでなく、さらに、温度応答性プロテインＡカラムを、所定の温度に調節した恒温水槽に浸漬することによって、抗体を含有する混合物溶液の温度を調節することも可能である。
　本実施形態の精製方法において、抗体を含有する混合物溶液を温度応答性アフィニティークロマトグラフィー担体カラム１０に供給して抗体を温度応答性プロテインＡに結合させた後、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の緩衝液で担体カラム１０を洗浄してもよい。緩衝液で洗浄することで、担体カラム１０に残留した夾雑物を洗浄することで、回収する抗体の純度を改善することが出来る。洗浄に使用する緩衝液は、温度応答性プロテインＡが抗体に対して結合性を有する温度領域に調整した後に使用する。
　２）温度応答性プロテインＡからの抗体の溶出
　温度応答性プロテインＡに結合した抗体は、高温の緩衝液で溶出することができる。抗体を溶出する際の緩衝液の温度は、温度応答性プロテインＡが抗体に対して結合性を失う温度領域であって、温度応答性カチオン交換クロマトグラフィー担体が抗体と結合性を有する温度領域にあることが好ましい。抗体を溶出する際の緩衝液の温度は、用いる温度応答性カチオン交換クロマトグラフィー担体によっても異なるが２０℃以上６０℃未満、好ましくは２５℃以上５０℃未満、最も好ましくは３０℃以上４５℃未満である。
　３）温度応答性カチオン交換クロマトグラフィー担体への抗体の結合
　温度応答性プロテインＡから溶出された抗体は、そのままの温度を保ったまま、温度応答性カチオン交換クロマトグラフィー担体カラム２０に供給することにより、温度応答性カチオン交換クロマトグラフィー担体に結合される。温度応答性プロテインＡから溶出された抗体溶液は、タンク等で一時的に貯蔵することも可能であるが、温度応答性カチオン交換クロマトグラフィー担体が抗体と結合性を有する温度領域から逸脱しない程度に保温することが好ましい。温度応答性プロテインＡから溶出された抗体は、ゲルろ過、アニオン交換、クロマトフォーカシング、アフィニティー、群特異的アフィニティー、疎水性相互作用、及び逆相等のクロマトグラフィーや、膜による精製ステップを経た後、温度応答性カチオン交換クロマトグラフィー担体カラム２０に供給されてもよい。なお、温度応答性プロテインＡカラムと温度応答性カチオン交換クロマトグラフィー担体カラムとの間にタンクや他の精製ステップを配置せず、保温された最短の配管で直接連結すると、温度応答性プロテインＡから溶出された抗体を、温度応答性カチオン交換クロマトグラフィー担体が抗体と結合性を有する温度領域から逸脱しない程度に保温することが容易であるため、好ましい。
　４）温度応答性カチオン交換クロマトグラフィー担体からの抗体の溶出
　温度応答性カチオン交換クロマトグラフィー担体に結合した抗体は、低温の緩衝液で溶出することができる。溶出時の緩衝液の温度は、温度応答性カチオン交換クロマトグラフィー担体が抗体に対して結合性を失う温度領域である。緩衝液の温度は、用いる温度応答性カチオン交換クロマトグラフィー担体によっても異なるが０℃以上２０℃未満、好ましくは１℃以上１５℃未満、最も好ましくは２℃以上１３℃未満である。
　抗体の溶出において、温度応答性カチオン交換カラムの直上流に熱交換器を配置して、連続的に所定の温度の緩衝液を通液することも可能である。また、温度応答性カチオン交換カラムを、所定の温度に調節した恒温水槽に浸漬することによって抗体を溶出することも可能である。温度応答性カチオン交換カラムの直上流に配した熱交換器を用いるだけでなく、さらに、温度応答性カチオン交換カラムを、所定の温度に調節した恒温水槽に浸漬することによって、抗体を溶出することも可能である。
　以下に、本実施形態を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本実施形態を何ら限定するものではない。
　（温度応答性プロテインＡ担体の調製）
　架橋ポリビニルアルコールビーズにカルボキシル基を導入した後に、カルボキシル基をＮＨＳ活性化した。さらに、ＮＨＳ活性化された架橋ポリビニルアルコールビーズと、温度応答性プロテインＡと、を接触させることで、温度応答性プロテインＡを架橋ポリビニルアルコールビーズに固定化した。詳細は以下のとおりである。
　１）カルボキシル基の導入
　無水コハク酸３．０ｇ及び４－ジメチルアミノピリジン３．６ｇをトルエン４５０ｍＬに溶解させたものを反応液として用いた。架橋ポリビニルアルコール（平均粒子径１００μｍ）１ｇを上記反応液と５０℃で接触させ、２時間攪拌した。その後、架橋ポリビニルアルコールビーズを脱水イソプロピルアルコールで洗浄した。
　２）カラムパッキング
　上記架橋ポリビニルアルコールビーズを、空カラム（Ｔｒｉｃｏｒｎ５／２０ｃｏｌｕｍｎ、ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製）に充填した。
　３）ＮＨＳ活性化
　上記カラムを４０℃に加温しながら、ＮＨＳ活性化反応液（ＮＨＳ０．０７ｇ、脱水イソプロピルアルコール４５ｍＬ、ジイソプロピルカルボジイミド０．０９ｍＬ）を０．４ｍＬ／分の流速で３０分間透過し、カルボキシル基をＮＨＳ活性化した。反応後、中空糸モジュールを氷冷しながら、カラムに脱水イソプロピルアルコールを０．４ｍＬ／分の流速で３０分間透過させることで洗浄した。洗浄後のカラムは、脱水イソプロピルアルコールを封入した状態で、４℃で保存した。
　４）温度応答性プロテインＡのカップリング
　温度応答性プロテインＡは、特許文献（ＷＯ２００８／１４３１９９号パンフレット）の実施例を参考に温度応答性プロテインＡを調製した。さらにカルボキシル基をＮＨＳ活性化したカラムに氷冷した１ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸を２ｍＬ透過して、保存液である脱水イソプロピルアルコールを置換した。次いで、温度応答性プロテインＡ３０ｍｇを１ｍＬのカップリング緩衝液（０．２ｍｏｌ／Ｌ　リン酸緩衝液、０．５ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）に溶解後し、０．４ｍＬ／分の流速でモジュールに供給した後、４時間保持させた。所定時間経過後、カラムにカップリング緩衝液を透過させることで、ＮＨＳ活性基とカップリング反応しなかった温度応答性プロテインＡを洗浄し、回収した。
　５）ブロッキング
　温度応答性プロテインＡをカップリングしたカラムにブロッキング反応液（０．５ｍｏｌ／Ｌ　エタノールアミン、０．５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を１０ｍＬ透過し、室温で３０分間放置することで、残留ＮＨＳをエタノールアミンでブロッキングした。反応後、このカラムを純水で洗浄し、その後２０％エタノールでカラムに封入した状態で、４℃で保存した。
　６）５０％結合温度の算出
　上述した手順で、５０％結合温度を算出した。その結果、ある一定量の温度応答性プロテインＡは、環境温度（抗体結合温度）が２℃の場合に、１４．５ｍｇ／ｍｌの抗体と結合可能であり、当該２℃において、最大結合量を示した。また、５０％吸着温度は１５．０℃であった。この場合、１５．０℃以下の温度が上述した低温領域であり、１５．０℃より高い温度が高温領域である。
　（温度応答性カチオン交換クロマトグラフィー担体の調製）
　原子移動ラジカル重合法によって、スルホン酸基を有するビーズ状の温度応答性吸着剤を調製した。詳細は以下のとおりである。
　１）開始剤の固定
　架橋ポリビニルアルコールビーズ１ｇ（粒径１００μｍ）を純水で湿潤させ、３００ｍLのガラス製三角フラスコに入れた。三角フラスコに、テトラヒドラフラン（安定剤不含、関東化学（株）社製）２００ｍＬ、２－ブロモイソ酪酸ブロミド（東京化成工業（株）製）１．２３ｍＬ、及びトリエチルアミン（和光純薬工業（株）社製）１．４０ｍＬを加え、室温で１６時間震とうさせた。反応後、ろ過してから２００ｍLエタノールで３回洗浄し、脱水イソプロパノール中で保存した。これにより、架橋ポリビニルアルコールビーズ表面に原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）開始剤である２－ブロモイソ酪酸ブロミドが導入された。
　２）表面グラフト重合
　スルホン酸基の前駆体モノマーであるグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ、東京化成工業（株）製）を、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドに対して１ｍｏｌ％の割合で含有するモノマー組成物を調製した。具体的には、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＩＰＡＡｍ、和光純薬工業（株）製）１８．４０ｇ、ＧＭＡ０．２３１ｇ、ブチルメタクリレート（ＢＭＡ、東京化成工業（株）製）１．２１７ｇ、塩化銅Ｉ（ＣｕＣｌ、和光純薬工業（株）製） ０．０８５ｇ、及び塩化銅ＩＩ（ＣｕＣｌ２、和光純薬工業（株）製）０．０１２ｇを９０容量％イソプロパノール（ＩＰＡ）水溶液４２．８ｍＬに溶解させ、３０分間、窒素バブリングした。その後、窒素雰囲気下で溶液にトリス（２－ジメチルアミノエチル）アミン（Ｍｅ６ＴＲＥＮ）（Ａｌｆａ　Ａｅｓａｒ社製）０．２２１ｇを加えて、５分間攪拌しＣｕＣｌ／ＣｕＣｌ２／Ｍｅ６ＴＲＥＮの触媒を形成させた。この反応溶液を窒素雰囲気下で開始剤導入架橋ポリビニルアルコールビーズに反応させ、室温で１６時間のＡＴＲＰをおこなった。反応後、エタノール、５０ｍｍｏｌ／Ｌ―ＥＤＴＡ水溶液、純水の順に洗浄し、モノマー、ポリマー、及び銅触媒を洗浄した。
　３）スルホン酸基の導入
　原子移動ラジカル重合法によりグラフト鎖を導入したビーズを、亜硫酸ナトリウムと、ＩＰＡと、の混合水溶液（亜硫酸ナトリウム／ＩＰＡ／純水＝１０／１５／７５ｗｔ％）２００ｇに投入し、８０℃で２４時間反応を行い、グラフト鎖中のエポキシ基をスルホン酸基に変換した。反応後、このビーズを純水で洗浄した。その後、このビーズを０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸中に投入し、８０℃で２時間反応を行うことで、グラフト鎖中に残存していたエポキシ基をジオール基に変換した。反応後、このビーズを純水で洗浄した。
　４）５０％結合温度の算出
　上述した手順で、５０％結合温度を算出した。その結果、ある一定量の温度応答性カチオン交換クロマトグラフィー担体は、環境温度（抗体結合温度）が４０℃の場合に、３０．１ｍｇ／ｍｌの抗体と結合可能であり、当該４０℃において、最大結合量を示した。また、５０％吸着温度は３１．０℃であった。この場合、３１．０℃未満の温度が上述した低温領域であり、３１．０℃より高い温度が高温領域である。
　（抗体の精製試験）
　１）温度応答性プロテインＡによる精製ステップ
クロマトグラフィーシステム（ＡＫＴＡ　ＦＰＬＣ、ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製）を用いて、温度変化による抗体（献血ヴェノグロブリ－ＩＨ、株式会社ベネシス製）の吸着・溶出試験を行った。まず、温度応答性プロテインＡ担体を充填したカラム１０及び温度応答性カチオン交換クロマトグラフィー担体カラム２０を、図１に示すように、緩衝液を含む容器３０、抗体溶液を含む容器４０、ポンプ５０、及び配管１０１，１０２，１０３，１０４と接続した。カラム１０の温度変化操作は、クロマトグラフィーシステムのポンプ５０を一時停止し、カラム１０の上流の配管１０３（ＧＥヘルスケア・ジャパン製、ＰＥＥＫ　ｔｕｂｉｎｇ、ｏ．ｄ．１／１６、ｉ．ｄ．０．５ｍｍ、オレンジ）１ｍをループ状に巻き、配管１０３をカラム１０と共に所定温度の恒温水槽中に浸漬し、その後１０分間以上温置した後にクロマトグラフィーシステムのポンプ５０を再度起動することにより行った。温度応答性プロテインＡ担体を充填したカラム１０による抗体の吸着、及び溶出は、以下の条件で行った。
　１－１）吸着ステップ
・     抗体濃度：２．５ｍｇ／ｍＬ
・     吸着緩衝液：１５ｍｍｏｌ／Ｌ　リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
・     平衡化：１０ビーズ体積（吸着緩衝液使用）
・     抗体負荷量：２０ｍＬ
・     流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・     ビーズ体積：０．５９ｍＬ
・     吸着温度：２℃
　１－２）洗浄ステップ
・     洗浄緩衝液：吸着緩衝液と同一
・     流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・     洗浄温度：２℃
　１－３）温度溶出ステップ
・     温度溶出緩衝液：吸着緩衝液と同一
・     流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・     透過液量：２０ｍL
・     溶出温度：４０℃
　２）温度応答性カチオン交換クロマトグラフィー担体による精製ステップ
　次に、温度応答性プロテインＡ担体を充填したカラム１０から溶出した溶出液を４０℃に保ったまま直ちに温度応答性カチオン交換カラム２０に送り、温度応答性カチオン交換カラム２０による抗体の吸着、及び溶出を行った。カラム２０の温度変化操作は、クロマトグラフィーシステムのポンプ５０を一時停止し、カラム１０の上流の配管１０３（ＧＥヘルスケア・ジャパン製、ＰＥＥＫ　ｔｕｂｉｎｇ、ｏ．ｄ．１／１６、ｉ．ｄ．０．５ｍｍ、オレンジ）１ｍをループ状に巻き、配管１０３をカラム１０と共に所定温度の恒温水槽中に浸漬し、その後１０分間以上温置した後にクロマトグラフィーシステムのポンプ５０を再度起動することにより行った。各ステップは、以下の条件で行った。
　　２－１）吸着ステップ
・     抗体溶液ロード量：２０ｍＬ
・     流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・     カラム体積：０．５４ｍＬ
・     吸着温度：４０℃
　２－２）洗浄ステップ
・     洗浄バッファー：１５ｍｍｏｌ／Ｌ　リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
・     流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・     洗浄温度：４０℃
　２－３）温度溶出ステップ
・     温度溶出緩衝液：１５ｍｍｏｌ／Ｌ　リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
・     流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・     流量：２０ｍＬ
・     溶出温度：２℃
　温度応答性カチオン交換クロマトグラフィー担体カラム２０の温度溶出ステップから得られた分画のＵＶ吸収（２８０ｎｍ）を測定し、下記式より抗体濃度を算出して、免疫グロブリンの温度溶出量を算出した。
　　　抗体濃度（ｍｇ／ｍＬ）＝２８０ｎｍでの吸光度／１４×１０
　　　温度溶出量（ｍｇ／ｍＬ）＝
　　　　　　温度溶出画分の免疫グロブリン濃度×温度溶出画分の液量／カラム体積
　また、温度応答性カチオン交換クロマトグラフィー担体カラム２０の温度溶出ステップから得られた分画の凝集体比率（単量体と、多量体と、の重量比率）を測定した。抗体の単量体と、多量体と、の重量比率は、高速液体クロマトグラフフィー測定（株式会社島津製作所製ＬＣ－２０Ａシステム、東ソー株式会社製のカラムＧ３０００ＳＷＸＬ）を行い、２８０ｎｍ波長における吸収ピーク面積比から求めた。
　　　凝集体比率（％）＝（多量体の面積比／単量体の面積比）×１００
　（結果）
　温度応答性カチオン交換クロマトグラフィー担体カラム２０の温度溶出ステップに含まれていた抗体は８ｍｇであり、凝集体比率は５．８％（温度応答性プロテインＡ担体を充填したカラム１０による精製前の抗体の凝集体比率は５．６％）であった。この結果から、温度応答性プロテインＡ担体カラム１０、及び温度応答性カチオン交換クロマトグラフィー担体カラム２０により、凝集体の比率を増加させずに、抗体を精製することができた。
　実施例１で精製された抗体（温度応答性カチオン交換クロマトグラフィー担体カラム２０の温度溶出分画）を、図２に示すように、アニオン交換クロマトグラフィー担体膜２００に直接透過することで、アニオン交換クロマトグラフィー担体に不純物を結合させ、溶液から不純物を除去した。アニオン交換クロマトグラフィー担体膜２００は、特開２０１０－２４１７６１の参考例１に従い調製した中空糸膜を用いた。アニオン交換クロマトグラフィー担体膜２００によるフロースルーステップは、以下の条件で行った。
・     平衡化緩衝液：１５ｍｍｏｌ／Ｌ　リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
・     平衡化：１０ビーズ体積
・     流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・     有効膜体積：０．５３ｍＬ
・     吸着温度：室温
　（結果）
　アニオン交換クロマトグラフィー担体膜２００のフロースルー画分に含まれる抗体は８ｍｇであり、凝集体比率は５．８％であった。この結果から、温度応答性プロテインＡ担体カラム１０及び温度応答性カチオン交換クロマトグラフィー担体カラム２０に加えて、アニオン交換クロマトグラフィー担体膜２００を用いる３ステップ精製により、凝集体の比率を増加させることなく、抗体を精製できた。
比較例
　抗体の精製試験において、図３に示すように、温度応答性プロテインＡ担体カラム１０の温度溶出ステップの後、溶出画分をポリプロピレン製遠心管（容量５０ｍＬ）に回収し、冷蔵庫（４℃）に一昼夜保存した。その後、図４に示すように、温度応答性カチオン交換クロマトグラフィー担体２０の吸着温度まで溶出画分を昇温させてから、溶出画分を温度応答性カチオン交換クロマトグラフィー担体２０に結合させた以外は、実施例１に従って抗体を精製した。抗体溶液を昇温させる操作は、カラム２０上流の配管１０３（ＧＥヘルスケア・ジャパン製、ＰＥＥＫ　ｔｕｂｉｎｇ、ｏ．ｄ．１／１６、ｉ．ｄ．０．５ｍｍ、オレンジ）１ｍをループ状に巻き、７０℃の恒温水槽中に浸漬することにより実施した。
　（結果）
　図４に示す温度応答性カチオン交換クロマトグラフィー担体カラム２０の温度溶出ステップに含まれる抗体は７ｍｇであり、凝集体比率は７．２％（温度応答性プロテインＡ担体を充填したカラム１０による精製前の抗体の凝集体比率は５．６％）であった。図３に示す温度応答性プロテインＡカラム１０から得られた溶出液を冷蔵した後、図４に示すループ状の配管１０３で７０℃の熱媒体で昇温させる過程において、抗体が熱変性し、凝集体比率が増大したものであった。
　以上示した実施例及び比較例より、温度応答性プロテインＡカラム１０から得られた溶出液を、そのままの温度を保ったまま、温度応答性カチオン交換クロマトグラフィー担体カラム２０に供給することにより、凝集を抑制し、効率的に抗体を精製可能であることが示された。
  本実施形態に係る抗体の精製方法により、温度応答性クロマトグラフィー担体を利用して、抗体等の有用な生理活性物質を、変性を抑制しつつ、産業規模で精製することが可能になる。

Claims (18)

  1. 　少なくとも第１及び第２の温度応答性クロマトグラフィー担体を使用する生理活性物質の精製方法であって、
    　前記第１の温度応答性クロマトグラフィー担体は、低温領域で生理活性物質を吸着し、高温領域で前記生理活性物質を脱離する性質を有し、
    　前記第２の温度応答性クロマトグラフィー担体は、高温領域で前記生理活性物質を吸着し、低温領域で前記生理活性物質を脱離する性質を有し、
    　少なくとも
    　Ａ－１）低温領域で前記第１の温度応答性クロマトグラフィー担体に前記生理活性物質を吸着する工程と、
    　Ａ－２）前記生理活性物質を吸着した前記第１の温度応答性クロマトグラフィー担体を昇温する工程と、
    　Ａ－３）高温領域で前記第１の温度応答性クロマトグラフィー担体から前記生理活性物質を脱離する工程と、
    　Ｂ－１）高温領域で前記第２の温度応答性クロマトグラフィー担体に前記生理活性物質を吸着する工程と、
    　Ｂ－２）前記生理活性物質を吸着した前記第２の温度応答性クロマトグラフィー担体を降温する工程と、
    　Ｂ－３）低温領域で前記第２の温度応答性クロマトグラフィー担体から前記生理活性物質を脱離する工程と、
    　を含む、生理活性物質の精製方法。
  2. 　少なくとも第１及び第２の温度応答性クロマトグラフィー担体を使用する生理活性物質の精製方法であって、
    　前記第１の温度応答性クロマトグラフィー担体は、第１の温度応答性クロマトグラフィー担体における低温領域で生理活性物質を吸着し、第１の温度応答性クロマトグラフィー担体における高温領域で前記生理活性物質を脱離する性質を有し、
    　前記第２の温度応答性クロマトグラフィー担体は、第２の温度応答性クロマトグラフィー担体における高温領域で前記生理活性物質を吸着し、第２の温度応答性クロマトグラフィー担体における低温領域で前記生理活性物質を脱離する性質を有し、
    　少なくとも
    　Ａ－１）前記第１の温度応答性クロマトグラフィー担体における低温領域の範囲内の特定の温度で前記第１の温度応答性クロマトグラフィー担体に前記生理活性物質を吸着する工程と、
    　Ａ－２）前記生理活性物質を吸着した前記第１の温度応答性クロマトグラフィー担体を前記第１の温度応答性クロマトグラフィー担体における低温領域の範囲内の特定の温度から昇温する工程と、
    　Ａ－３）前記第１の温度応答性クロマトグラフィー担体における高温領域の範囲内の特定の温度で前記第１の温度応答性クロマトグラフィー担体から前記生理活性物質を脱離する工程と、
    　Ｂ－１）前記第２の温度応答性クロマトグラフィー担体における高温領域の範囲内の特定の温度で前記第２の温度応答性クロマトグラフィー担体に前記生理活性物質を吸着する工程と、
    　Ｂ－２）前記生理活性物質を吸着した前記第２の温度応答性クロマトグラフィー担体を前記第２の温度応答性クロマトグラフィー担体における高温領域の範囲内の特定の温度から降温する工程と、
    　Ｂ－３）前記第２の温度応答性クロマトグラフィー担体における低温領域の範囲内の特定の温度で前記第２の温度応答性クロマトグラフィー担体から前記生理活性物質を脱離する工程と、
    　を含む、生理活性物質の精製方法。
  3. 　前記Ａ－２）工程において、高温領域の移動相を通液することによって、前記第１の温度応答性クロマトグラフィー担体を充填したカラムが昇温される、請求項１又は２に記載の生理活性物質の精製方法。
  4. 　前記第１の温度応答性クロマトグラフィー担体が、温度応答性アフィニティークロマトグラフィー担体である、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の生理活性物質の精製方法。
  5. 　前記第２の温度応答性クロマトグラフィー担体が、温度応答性イオン交換クロマトグラフィー担体である、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の生理活性物質の精製方法。
  6. 　前記Ｂ－３）工程の後に、アニオン交換クロマトグラフィー担体に不純物を結合させる工程を更に含む、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の生理活性物質の精製方法。
  7. 　前記Ａ－３）工程において、前記第１の温度応答性クロマトグラフィー担体から前記生理活性物質を脱離させる時の温度が、前記第２の温度応答性クロマトグラフィー担体が前記生理活性物質に対して吸着性を有する温度領域の範囲内である、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の生理活性物質の精製方法。
  8. 　請求項２に記載の第１の温度応答性クロマトグラフィー担体における高温領域の範囲内の特定の温度が、前記第１の温度応答性クロマトグラフィー担体に対する前記生理活性物質の温度に依存する結合量の最大値の５０％を与える温度から＋３０℃以内である、請求項２乃至７のいずれか１項に記載の生理活性物質の精製方法。
  9. 　前記Ａ－３）工程において前記第１の温度応答性クロマトグラフィー担体に吸着した前記生理活性物質を脱離させた後から、前記Ｂ－１）工程において前記第２の温度応答性クロマトグラフィー担体に前記生理活性物質を吸着させるまでの間、前記生理活性物質を含む液の温度を、前記第２の温度応答性クロマトグラフィー担体が前記生理活性物質に対して吸着性を有する温度領域の範囲内から逸脱させない、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の生理活性物質の精製方法。
  10. 　請求項２に記載の第２の温度応答性クロマトグラフィー担体における高温領域の範囲内の特定の温度が、前記第２の温度応答性クロマトグラフィー担体に対する前記生理活性物質の温度に依存する結合量の最大値の５０％を与える温度から＋３０℃以内である、請求項２乃至９のいずれか１項に記載の生理活性物質の精製方法。
  11. 　請求項２に記載の第２の温度応答性クロマトグラフィー担体における高温領域の範囲内の特定の温度が、請求項２に記載の第１の温度応答性クロマトグラフィー担体における高温領域の範囲内の特定の温度以下である、請求項２乃至１０のいずれか１項に記載の生理活性物質の精製方法。
  12. 　前記第２の温度応答性クロマトグラフィー担体に対する前記生理活性物質の温度に依存する結合量の最大値の５０％を与える温度が、前記第１の温度応答性クロマトグラフィー担体に対する前記生理活性物質の温度に依存する結合量の最大値の５０％を与える温度から＋２０℃以下である、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の生理活性物質の精製方法。
  13. 　Ａ－１）～Ｂ－３）工程までの間の、前記生理活性物質を含有する溶液のｐＨ条件が、４～８で、変動幅が、１以内である、請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の生理活性物質の精製方法。
  14. 　前記Ａ－１）工程の前、又はＡ－３）工程の後、又はＢ－１）の前、又はＢ－３）工程の後に、ウイルス不活性化工程を含むことを特徴とする、請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の生理活性物質の精製方法。
  15. 　前記生理活性物質が抗体であり、前記第１の温度応答性クロマトグラフィー担体が温度応答性プロテインＡを備える、請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の抗体の精製方法。
  16. 　請求項１乃至１５のいずれか１項に記載の方法により精製された抗体。
  17. 　少なくとも第１及び第２の温度応答性クロマトグラフィー担体を使用する備える生理活性物質の精製用のキットであって、
    　前記第１の温度応答性クロマトグラフィー担体は、低温領域で生理活性物質を吸着し、高温領域で前記生理活性物質を脱離する性質を有し、
    　前記第２の温度応答性クロマトグラフィー担体は、高温領域で前記生理活性物質を吸着し、低温領域で前記生理活性物質を脱離する性質を有し、
    　前記第１の温度応答性クロマトグラフィー担体が前記生理活性物質を脱離する性質を有する前記高温領域の温度Th1と、前記第２の温度応答性クロマトグラフィー担体が前記生理活性物質を吸着する性質を有する前記高温領域の温度Th2とが、
    　　　　Th1　－　１０（℃）　　≦　Th2　≦　Th1　＋　１０（℃）
    　の関係を有する、ことを特徴とする生理活性物質の精製用キット。
  18. 　前記高温領域で前記第１の温度応答性クロマトグラフィー担体から脱離した前記生理活性物質を含む溶液が、前記高温領域の温度を維持したまま、前記第２の温度応答性クロマトグラフィー担体に運搬されるよう、前記第１の温度応答性クロマトグラフィー担体と、前記第２の温度応答性クロマトグラフィー担体と、が接続されている、請求項１７に記載の生理活性物質の精製キット。
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