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WO2012115182A1 - セマフォリン阻害剤を有効成分とする角膜知覚神経障害治療薬 - Google Patents

セマフォリン阻害剤を有効成分とする角膜知覚神経障害治療薬 Download PDF

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Publication number
WO2012115182A1
WO2012115182A1 PCT/JP2012/054394 JP2012054394W WO2012115182A1 WO 2012115182 A1 WO2012115182 A1 WO 2012115182A1 JP 2012054394 W JP2012054394 W JP 2012054394W WO 2012115182 A1 WO2012115182 A1 WO 2012115182A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
corneal
therapeutic
formula
surgery
agent according
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2012/054394
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
岡野　栄之
一男 坪田
重人 榛村
雅弘 大本
岸野　晶祥
美穂 前田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Keio University
Sumitomo Pharma Co Ltd
Original Assignee
Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
Keio University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd, Keio University filed Critical Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
Priority to HK14103297.8A priority Critical patent/HK1190091B/en
Priority to US14/001,333 priority patent/US20140018416A1/en
Priority to CN201280009762.7A priority patent/CN103379906B/zh
Priority to EP12749626.3A priority patent/EP2679226B1/en
Priority to AU2012221110A priority patent/AU2012221110A1/en
Priority to ES12749626.3T priority patent/ES2577009T3/es
Priority to CA2827869A priority patent/CA2827869C/en
Priority to JP2013501114A priority patent/JP5898672B2/ja
Priority to KR1020137021897A priority patent/KR20140026368A/ko
Publication of WO2012115182A1 publication Critical patent/WO2012115182A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/78—Ring systems having three or more relevant rings
    • C07D311/80—Dibenzopyrans; Hydrogenated dibenzopyrans
    • C07D311/82—Xanthenes
    • C07D311/84—Xanthenes with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached in position 9
    • C07D311/86—Oxygen atoms, e.g. xanthones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
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    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P27/02—Ophthalmic agents
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    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/04—Artificial tears; Irrigation solutions
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for a sensory neuropathy caused by corneal disease or corneal surgery or a dry eye associated therewith containing a xanthone compound having semaphorin inhibitory activity as an active ingredient.
  • the cornea is a transparent film that covers the front surface of the eyeball, and has a function of taking light into the eye and refracting the light to focus the eye together with the crystalline lens. Further, since the cornea surface is always covered with tear fluid, the cornea also has a function of preventing dry eyes and bacterial infection inside the eyeball. The cornea may be weakened or denatured due to injury or disease, and as a result, these functions may be impaired. Drugs are first used for this treatment. When a sufficient therapeutic effect cannot be obtained with a drug, corneal transplantation for transplanting normal cornea is performed.
  • corneal sensory nerves which are sensory nerves derived from the trigeminal nerve, are distributed.
  • the trigeminal nerve is one of the cranial nerves and is also called the fifth cranial nerve.
  • the trigeminal nerve is branched into three nerves: an optic nerve, a maxillary nerve and a mandibular nerve.
  • the nerves that run in the cornea are corneal sensory nerves.
  • the corneal sensory nerve not only plays a role in protecting the cornea by causing a corneal reflex (blink reflex) by corneal perception, but also plays a role in maintaining corneal homeostasis by promoting secretion of tears and neurotrophic factors.
  • corneal diseases not only the degeneration of the cornea itself, but also the corneal sensory nerves are damaged, normal nerve function is impaired, and sensory disturbance occurs. Further, in corneal surgery represented by myopia correction surgery such as corneal transplantation and LASIK for disease treatment, the corneal sensory nerve is cut, so that sensory impairment always occurs for a long time after the operation.
  • These sensory disturbances that is, corneal sensory neuropathy, are specifically hypoperception such as tactile sensation and pain sensation on the corneal surface, lack of corneal reflex, dry eye due to abnormal tears (keratosis), eye damage Cause.
  • Corneal diseases that cause corneal sensory neuropathy and dry eye include keratitis, corneal vitiligo (due to corneal herpes, measles, syphilis, trauma), corneal infection, corneal degeneration, corneal dystrophy, corneal dystrophy, Known as bullous keratopathy, keratokeratosis, corneal endothelium decompensation, corneal ulcer, neuroparalytic keratopathy, diabetic keratopathy, corneal chemistry (due to drugs entering the eye), fever, etc. ing. In the treatment of these diseases, corneal transplantation can be performed in severe cases.
  • corneal surgery that causes corneal sensory neuropathy and dry eye
  • corneal transplantation myopic correction surgery
  • myopic correction surgery and insertion of an artificial lens (artificial lens) for cataract treatment are known.
  • Keratoplasty is also called keratoplasty or keratoplasty.
  • the corneal transplantation is not limited to the above case.
  • the purposes of corneal transplantation include 1) optical purposes, 2) therapeutic purposes, 3) orthopedic purposes, and 4) cosmetic purposes.
  • 1) Optical purpose means clearing of turbid cornea and recovery of visual acuity. Diseases that cause these are keratitis, corneal vitiligo (due to corneal herpes, measles, syphilis, trauma), cornea Infectious diseases, corneal degeneration, corneal dystrophy, corneal parenchymal dystrophy, bullous keratopathy, keratokeratosis, corneal endothelial decompensation and the like.
  • the therapeutic purpose means the calming of the infectious disease by excision of the cornea that is an infectious lesion, and the disease causing this is a corneal ulcer (mainly active phase infectious disease).
  • the orthopedic purpose means maintaining the shape of the eyeball in cases such as corneal perforations, and this may include corneal ulcers (bacterial, fungal, viral, aseptic) and trauma. . 4)
  • the cosmetic purpose is to cosmetically improve corneal vitiligo with corneal cloudiness.
  • corneal transplantation 1) full-thickness corneal transplantation, 2) superficial corneal transplantation, 3) deep superficial corneal transplantation, 4) sclera transplantation, 5) sclera transplantation, 6) cornea Examples include limbal transplantation and 7) amniotic membrane transplantation.
  • Full-thickness corneal transplantation is an operation that replaces the whole thickness from the corneal epithelium to the endothelium, and has turbidity extending to the deep corneal stroma such as diseases requiring vesicular corneal endothelial transplantation and ulcer perforation cases. Used in the treatment of disease.
  • Surface corneal transplantation is an operation in which only a corneal epithelium and a lesion in the parenchyma are excised and transplanted with a corneal segment of the same size. Is used when the skin is thin and the cornea is locally thin.
  • Deep surface corneal transplantation is an operation in which only the corneal epithelium and the parenchyma are excised, leaving only the Demes membrane and the endothelium, and transplanted only to the corneal epithelium and the parenchyma, and the endothelial cells are healthy. Used for cases.
  • the keratoplasty is an operation in which the cornea is excised together with the sclera and transplanted with a piece of keratoconus, and is used when a corneal ulcer is widespread.
  • the sclera transplantation is an operation for correcting the thinned sclera and is used when the cornea is normal and the sclera is reinforced.
  • Corneal limbal transplantation is an operation in which corneal limbal stem cells are transplanted to supply normal corneal epithelium.
  • Amnion transplantation is an operation in which the abnormal conjunctiva is removed and the amnion is transplanted. As a result, the normal conjunctiva is re-covered when the environment is prepared.
  • corneal transplantation is first keratokeratosis, second is corneal vitiligo, third is bullous keratopathy, fourth is corneal degeneration, and fifth is cornea.
  • Keratoconus is a corneal degenerative disease that occurs in puberty and is a disease in which the central part of the cornea gradually becomes thin and protrudes forward. The shape of the cornea is distorted, and the function as a lens is impaired. Corneal transplantation can be performed when the correction of visual acuity with a contact lens is insufficient or it is difficult to wear the lens for a long time due to the high degree of keratokeratopathy.
  • Corneal vitiligo is a disease that is common in elderly people and refers to a scar that remains in the cornea as a result of suffering from keratitis when young, and turbidity after herpes keratitis is also included in corneal vitiligo.
  • Bullous keratopathy refers to a condition where water is accumulated in the cornea as a result of a decrease in the number of endothelial cells that regulate the water in the cornea on the back side of the cornea.
  • Vesicular keratopathy also includes a condition called re-transplantation in which a patient who had undergone corneal surgery previously had reduced endothelial cells and required corneal transplantation again.
  • Corneal degeneration refers to turbidity caused by abnormal substances deposited in the cornea. Corneal chemistry and fever are those in which strong scars are caused by the entrance of chemicals or cement into the eye.
  • Such corneal transplantation is performed, for example, in Japan in about 1-2 thousand cases per year.
  • the number of patients who need corneal transplants is said to be about 20,000 per year.
  • myopia correction surgery is an example of surgery that causes corneal sensory nerve damage by cutting the corneal sensory nerve.
  • the myopia correction surgery mainly means an operation for recovering a reduction in visual acuity due to myopia.
  • Specific examples of surgery collectively referred to as myopic correction surgery are currently radial keratotomy (Radical Keratotomy, RK), PRF (Photorefractive Keratotomy, PRK), LASIK (Laser in situ Keratomileesis, LASIK laser refraction, LASIK refraction film Corrective surgery).
  • PRK and LASIK are surgeries that use an excimer laser.
  • the main myopia correction surgery has been radial keratotomy up to about 10 years ago, but recently LASIK is the most commonly performed.
  • the mainstream of myopia correction surgery has recently shifted to a short period of time, and it can be said that the surgical method currently at the forefront can be replaced by a new operation.
  • myopia correction surgery includes myopia correction methods other than surgery, including LASEK, intracorneal ring (ICRS), intracorneal lens, phakic intraocular lens, and orthokeratology. Corneal sensory neuropathy has occurred.
  • corneal curvature tomography A similar sensory neuropathy also occurs because the cornea sensory nerve is cut by a surgical operation on the cornea necessary for treating eye diseases such as eye diseases and corneal trauma.
  • eye diseases such as eye diseases and corneal trauma.
  • an operation to insert an artificial lens may be performed.
  • the cornea is incised small, so that the cornea sensory nerve may be damaged.
  • semaphorin is an endogenous protein that has been identified as a factor that retreats the nerve growth cone and suppresses axon elongation, and so far about 20 molecular species are known.
  • well-studied is a group of genes of a subfamily called class 3 type, and the proteins encoded by these genes are known to have strong neurite outgrowth inhibitory activity and growth cone retraction activity in vitro.
  • Semaphorin 3A Semaphorin 3A, Sema 3A, collapsin-1) (Non-patent Documents 1 and 2) is the most well-studied, and this protein induces growth cone retraction in cultured neurons at low concentrations and in a short time. .
  • Substances having semaphorin inhibitory activity include a series obtained from a culture of Penicillium sp. SPF-3059 strain (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Accession Number: FERM BP-7663).
  • Xanthone compounds Patent Documents 1 and 2) and derivatives obtained by chemically modifying xanthone compounds (Patent Document 3) are known.
  • the xanthone compound has a nerve regeneration promoting action in vivo. Furthermore, it has been reported that xanthone compounds are effective in the treatment and prevention of ischemic neuropathy by suppressing neuronal cell death involving ischemic damage (Patent Document 4).
  • Non-patent Document 3 The effect of semaphorin on sensory nerves in vivo using adult animals has been reported (Non-patent Document 3). Specifically, when the semaphorin 3 gene is introduced into a rabbit corneal epithelial cell with a gene gun, the trigeminal nerve is retracted, or when the Sema 3 gene is administered to an adult rabbit corneal wound model from which the corneal epithelium has been detached and removed. It has been reported that re-extension of the trigeminal nerve is suppressed. This report suggests that adult sensory nerves are repulsively regulated by the Sema3 gene, and also suggests treatment of chronic pain by administration of the Sema3 gene.
  • this report does not disclose or suggest a method for promoting the regeneration of corneal sensory nerves that have been cut due to injury of the cornea. This is because there is no indication that corneal sensory nerve regeneration is insufficient if nothing is done after corneal injury, and that semaphorin is expressed in the cornea and that semaphorin is the cause of insufficient regeneration of the corneal sensory nerve. It has not been clarified until there is.
  • Non-patent Document 4 the sensory nerves of the eyeball are normally formed so as to avoid the cornea during the embryonic period, and thus a circular nerve bundle is formed.
  • the lens is removed by a chicken embryo, this annular nerve bundle is removed. Is not formed normally, it is considered that a factor that repels nerve elongation is secreted from the lens.
  • the sensory nerve did not expand in the direction in which the lens was present.
  • Sema3A-blocking peptide when Sema3A-blocking peptide was added, the sensory nerve was elongated, thus repelling the sensory nerve elongation.
  • the factor is considered to be semaphorin 3A derived from the lens.
  • Sema3A-blocking peptide when Sema3A-blocking peptide was added to or near the crystalline lens of a normal embryo, elongation of sensory nerves in the cornea was confirmed. Based on these results, it has been reported in this document that semaphorin 3A derived from the lens repels control of the formation of corneal sensory nerves during development (embryonic period). However, this report does not disclose or suggest a method for promoting the regeneration of corneal sensory nerves that have been cut due to injury of the cornea.
  • the main point of this document is to elucidate the mechanism of the characteristic formation process of corneal sensory nerves during development. Therefore, this document does not discuss the relationship with the disease, and does not examine the disease state model.
  • the semaphorin 3A does not enter the cornea because the semaphorin 3A acts repulsively using Sema3A-blocking peptide, which is normal in embryos in the developmental stage (embryonic stage) This is a finding in the case of nerve formation.
  • the situation is fundamentally different from the inhibition of corneal sensory nerve elongation in the injured cornea.
  • inhibition experiments using a corneal injury model are not performed in this document, the extension of corneal sensory nerves in the damaged cornea cannot be considered.
  • only chicken embryos used in the in vivo model have not been studied in rodents. Thus, this report does not disclose or suggest a method for promoting the regeneration of corneal sensory nerves that have been cut due to injury to the cornea.
  • Non-patent Document 5 It has been reported that the presence and expression of semaphorin 3A in the rat cornea was analyzed by immunostaining and real-time PCR (Non-patent Document 5). However, this report does not disclose or suggest a method for promoting the regeneration of corneal sensory nerves that have been cut due to injury of the cornea. In this document, inhibition experiments are not performed, experiments with injury models and pathological models are not performed, and there is no description regarding corneal injury.
  • Non-patent Document 6 mainly discloses that semaphorin 3A is involved in the formation of the cornea immediately after birth from the embryonic period, and discloses a method for promoting the regeneration of the corneal sensory nerve cut by the cornea being injured. There is no suggestion. In this document, inhibition experiments are not performed, experiments with injury models and pathological models are not performed, and there is no description regarding corneal injury.
  • Non-patent Document 7 It has been reported that an in situ hybridization method or a real-time PCR method was used to analyze that semaphorin 3A expression change is involved in the formation of corneal nerves in the embryonic period using chickens.
  • this report is for birds, not mammals.
  • inhibition experiments are not performed, experiments with injury models and pathological models are not performed, and there is no description regarding corneal injury.
  • Non-Patent Literature 8 Changes in the expression of semaphorin 3A and its receptor neuropilin-1 were examined using an adult rat corneal wound model. Although the expression of pilin 1 was increased, its expression returned to normal by healing, suggesting that semaphorin 3A is deeply involved in the healing of corneal epithelial wounds (Non-Patent Literature). 8). However, this report is concerned with the regeneration of corneal epithelial cells, and there is no disclosure or suggestion of a method for promoting the regeneration of corneal sensory nerves that have been cut due to injury of the cornea. This injury model is different from corneal transplantation and sensory nerve injury models, no inhibition experiments have been performed, and there is no description of sensory nerve function.
  • the subject of this invention is providing the therapeutic agent or preventive agent with respect to the sensory neuropathy by a corneal disease or corneal surgery which uses the xanthone compound which has semaphorin 3A inhibitory activity as an active ingredient. It is another object of the present invention to provide a regeneration promoter for corneal sensory nerves, which contains a xanthone compound having semaphorin 3A inhibitory activity as an active ingredient.
  • the corneal sensory nerve is damaged by corneal disease or corneal transplantation, causing sensory neuropathy.
  • the corneal sensory nerve In the case of corneal transplantation, the corneal sensory nerve is always cut, and is considered to be the most severe model of corneal sensory nerve injury.
  • the corneal sensory nerve In the cornea after transplantation, the corneal sensory nerve cannot sufficiently extend again, resulting in sensory impairment.
  • the present inventors consider that the action of semaphorin 3A expressed in the lens (lens) or corneal epithelium is caused as a cause that the corneal sensory nerve cannot re-extend, and use a xanthone compound having semaphorin 3A inhibitory activity. Based on the above, we investigated whether it is possible to re-extend corneal sensory nerves and improve sensory impairment.
  • a xanthone compound having semaphorin 3A inhibitory activity promotes regeneration of corneal sensory nerves in a mouse corneal transplant model. Therefore, a xanthone compound having a semaphorin 3A inhibitory activity is effective as a therapeutic or prophylactic agent against corneal sensory neuropathy caused by corneal sensory nerve injury caused by corneal disease or corneal surgery. I found.
  • the present invention has been completed as a result of further intensive studies based on such findings.
  • a therapeutic or prophylactic agent for corneal diseases or sensory neuropathy caused by corneal surgery comprising a compound represented by the formula:
  • R 1 represents a hydrogen atom or a carboxyl group
  • R 2 represents a hydrogen atom or a hydroxyl group
  • R 3 represents a hydrogen atom or a carboxyl group
  • R 4 represents a hydrogen atom or a hydroxyl group.
  • Corneal diseases are keratitis, corneal vitiligo, corneal infection, corneal degeneration, corneal dystrophy, corneal dystrophy, bullous keratopathy, keratokeratopathy, corneal endothelial decompensation, corneal ulcer, neuroparalytic keratopathy,
  • the therapeutic or prophylactic agent according to any one of [1] to [8], which is diabetic keratopathy, corneal chemistry, or fever;
  • An agent for promoting regeneration of corneal sensory nerve comprising as an active ingredient a compound represented by formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof;
  • R 1 represents a hydrogen atom, a carboxyl group or an alkoxycarbonyl group
  • R 2 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group or an acyloxy group
  • R 3 represents a hydrogen atom, a carboxyl group or an alkoxycarbonyl group
  • R 4 represents Represents a hydrogen atom, a hydroxyl group or an acyloxy group.
  • R 1 represents a hydrogen atom or a carboxyl group
  • R 2 represents a hydrogen atom or a hydroxyl group
  • R 3 represents a hydrogen atom or a carboxyl group
  • R 4 represents a hydrogen atom or a hydroxyl group.
  • Corneal disease is keratitis, corneal vitiligo, corneal infection, corneal degeneration, corneal dystrophy, corneal stromal dystrophy, bullous keratopathy, keratopathy, corneal endothelium decompensation, corneal ulcer, neuroparalytic cornea
  • [10-1] The treatment or prevention method according to any one of [1-1] to [8-1], wherein the corneal surgery is corneal transplantation;
  • [14-1] The treatment or prevention method according to any one of [1-1] to [12-1], wherein the sensory neuropathy caused by corneal disease or corneal sensory nerve injury caused by corneal surgery is dry eye;
  • a method for promoting regeneration of a corneal sensory nerve comprising administering a compound represented by formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject in need thereof;
  • the present invention provides [1-2] Formula (1) for producing a therapeutic or prophylactic agent for sensory neuropathy caused by corneal disease or corneal surgery:
  • R 1 represents a hydrogen atom, a carboxyl group or an alkoxycarbonyl group
  • R 2 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group or an acyloxy group
  • R 3 represents a hydrogen atom, a carboxyl group or an alkoxycarbonyl group
  • R 4 represents Represents a hydrogen atom, a hydroxyl group or an acyloxy group.
  • R 1 represents a hydrogen atom or a carboxyl group
  • R 2 represents a hydrogen atom or a hydroxyl group
  • R 3 represents a hydrogen atom or a carboxyl group
  • R 4 represents a hydrogen atom or a hydroxyl group.
  • Corneal disease is keratitis, corneal vitiligo, corneal infection, corneal degeneration, corneal dystrophy, corneal parenchymal dystrophy, bullous keratopathy, keratoendothelial decompensation, corneal ulcer, neuroparalytic cornea
  • the disease is diabetic, diabetic keratosis, corneal chemistry, or fever;
  • [12-2] The use according to any one of [1-2] to [8-2], wherein the corneal surgery is a corneal surgery for a cornea necessary for the treatment of an eye disease or a corneal trauma;
  • [13-2] Use according to any one of [1-2] to [12-2], wherein the sensory neuropathy caused by corneal disease or corneal sensory nerve injury caused by corneal surgery is hypoperception;
  • [14-2] The use according to any one of [1-2] to [12-2], wherein the sensory neuropathy caused by corneal disease or corneal sensory nerve injury caused by corneal surgery is dry eye;
  • [17-2] The use according to [16-2], which is a regeneration promoter for treating or preventing corneal diseases or sensory neuropathy caused by corneal surgery;
  • [19-2] Use according to [17-2], wherein the sensory neuropathy due to corneal disease or corneal surgery is dry eye; [20-2] The use according to any one of [16-2] to [19-2], wherein the therapeutic or prophylactic agent is in the form of eye drops.
  • the present invention makes it possible to treat or prevent corneal diseases or sensory neuropathy caused by corneal surgery by using a drug containing a xanthone compound having semaphorin 3A inhibitory activity as an active ingredient. That is, sensory neuropathy caused by corneal disease, corneal transplantation, myopic correction surgery, sensory neuropathy caused by corneal surgery such as corneal surgery for the cornea required for treatment of eye disease or corneal trauma, In particular, the present invention enables treatment or prevention of sensory neuropathy caused by corneal disease or corneal sensory nerve injury caused by corneal surgery.
  • the xanthone compound can be effectively used as an agent for promoting regeneration of corneal sensory nerve, and is regenerated to treat or prevent sensory neuropathy caused by corneal disease or corneal sensory nerve injury caused by corneal surgery. It became clear that it can be used as an accelerator. Furthermore, the xanthone compound used in the present invention is chemically extremely stable in an aqueous solution such as a phosphate buffer. When used in the treatment or prevention of sensory neuropathy due to corneal disease or corneal surgery, or as a regeneration promoter, ophthalmic administration is most preferred. Therefore, the xanthone compound used in the present invention is administered into tears by ophthalmic administration. Or it was found to be very preferable because it is stable in the cornea.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of measuring the length of nerve fibers regenerated in a cornea transplanted by corneal transplantation in Example 1, that is, a corneal graft [Student's t-test, comparison with control group] *: P ⁇ 0.01].
  • the vertical axis means the total length of the regenerated fibers.
  • the horizontal axis represents the group administered with binaxanthone (SPF-3059-5) and the control group (administered only with a solvent containing no drug).
  • FIG. 1 nerve fiber regeneration into the corneal graft was promoted by the administration of binaxanthone.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of measurement of corneal perception at the central part of the corneal graft every week after surgery using a Cochet-Bonnet corneal sensory sensor as a function evaluation of regenerating nerve in Example 1. -Whitney U test, comparison with control group, *: p ⁇ 0.01].
  • the vertical axis means the strength of the force that can be perceived by the cornea.
  • the horizontal axis represents the results after 1 week, 2 weeks and 3 weeks after transplantation.
  • a black circle ( ⁇ ) represents a binaxanthone administration group
  • a white circle ( ⁇ ) represents a control group to which only a solvent containing no drug is administered.
  • FIG. 2 shows that administration of binaxanthone improved corneal perception.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of measuring the number of blood vessels born in the transplanted corneal graft in Example 1 [Student's t-test, no significant difference compared with the control group].
  • the vertical axis means the total length of the new blood vessels.
  • the horizontal axis represents the group administered with binaxanthone (SPF-3059-5) and the control group (administered only with a solvent containing no drug).
  • FIG. 3 shows that the administration of binaxanthone did not promote the formation of blood vessels in the corneal graft.
  • FIG. 3 shows that the administration of binaxanthone did not promote the formation of blood vessels in the corneal graft.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of measuring the retention of binaxanthone in the cornea after instillation administration when the concentration of the binaxanthone administration solution in Example 2 is 0.5 mg / mL.
  • the vertical axis means the residence concentration (ng / g).
  • 0.5 represents the retention after 0.5 hours from administration
  • 2 represents the retention after 2 hours from administration
  • 6 represents the retention after 6 hours from administration. From FIG.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of measuring the retention of binaxanthone in the cornea after administration by eye drop when the concentration of the binaxanthone administration solution is 1.5 mg / mL in Example 2, as in FIG.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of measuring the retention of binaxanthone in the cornea after instillation administration when the concentration of the binaxanthone administration liquid is 5.0 mg / mL in Example 2, as in FIG. FIG.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of measuring the stability of xanthone compounds in PBS (phosphate buffer) in Example 10.
  • the horizontal axis shows the names of the compounds used for the measurement.
  • the vertical axis means the residual rate of each compound. From FIG. 7, it can be seen that almost all xanthone compounds not included in the formula (1) were decomposed, whereas all xanthone compounds included in the formula (1) showed a residual rate of 90% or more.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of measuring the time course of stability of binaxanthone (SPF-3059-5) and SPF-3059-1 in PBS (phosphate buffer) in Example 11.
  • the horizontal axis means the storage days from dissolution.
  • the vertical axis means the residual rate of each compound.
  • the black triangle ( ⁇ ) represents the time course of the stability of binaxanthone
  • the black circle ( ⁇ ) represents the time course of the stability of SPF-3059-1. From FIG. 8, SPF-3059-1 was almost completely decomposed in about one week, whereas binaxanthone remained in 96% or more in PBS at 37 ° C. until 4 weeks and showed stability for 4 weeks or more. I understand that.
  • alkoxycarbonyl group represents a straight or branched alkoxycarbonyl group having 2 to 7 carbon atoms, specifically, a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, a propoxycarbonyl group, 1- Examples thereof include a methylethoxycarbonyl group, a butoxycarbonyl group, a 1-methylpropoxycarbonyl group, a 2-methylpropoxycarbonyl group, a 1,1-dimethylethoxycarbonyl group, a pentyloxycarbonyl group, and a hexyloxycarbonyl group.
  • “Acyloxy group” means a straight or branched acyloxy group having 2 to 6 carbon atoms, and specifically includes an acetoxy group, a propionyloxy group, a butyryloxy group, an isobutyryloxy group, a valeryloxy group, an isovale group. Examples thereof include a tolyloxy group and a pivaloyloxy group.
  • “Pharmaceutically acceptable salt” refers to a pharmaceutically or veterinary acceptable salt, such as an inorganic base salt such as sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salt, aluminum salt, ammonium salt, or triethyl.
  • examples thereof include organic base salts such as ammonium salt, triethanolammonium salt, pyridinium salt and diisopropylammonium salt, and basic amino acid salts such as arginine and lysine.
  • organic base salts such as ammonium salt, triethanolammonium salt, pyridinium salt and diisopropylammonium salt
  • basic amino acid salts such as arginine and lysine.
  • a salt of monosodium / monopotassium salt and the like can also be mentioned.
  • corneal diseases include keratitis, corneal vitiligo (due to corneal herpes, measles, syphilis, trauma), corneal infection, corneal degeneration, corneal dystrophy, corneal dystrophy, bullous Examples include keratosis, keratokeratosis, corneal endothelium decompensation, corneal ulcer, neuroparalytic keratopathy, diabetic keratopathy, corneal chemistry (due to drugs entering the eye), fever, and the like.
  • Cornnea surgery of “sensory neuropathy by corneal surgery” includes corneal transplantation, myopia correction surgery, and corneal surgery for the cornea necessary for the treatment of eye diseases or corneal trauma.
  • ⁇ Keratoplasty '' is also referred to as corneal transplantation or keratoplasty, full-layer corneal transplantation, superficial corneal transplantation, deep-surface corneal transplantation, sclera transplantation, scleral transplantation, corneal limbal transplantation, And amniotic membrane transplantation.
  • the purpose of corneal transplantation includes optical purposes, therapeutic purposes, orthopedic purposes, and cosmetic purposes.
  • keratitis corneal vitiligo (due to corneal herpes, measles, syphilis, trauma), corneal infection, corneal degeneration, corneal dystrophy, keratotic dystrophy, bullous keratopathy (eye with intraocular lens, Fuchs cornea Endothelial dystrophy, aphakic eye), keratokeratosis, corneal endothelial decompensation, and other corneal transplants and infections such as corneal ulcers (bacterial, fungal, viral, aseptic) Examples include corneal transplantation, corneal transplantation caused by trauma, corneal transplantation caused by corneal chemistry and fever, and corneal transplantation caused by neurotrophic keratopathy such as diabetic keratopathy.
  • Myopia correction surgery specifically includes radial keratotomy (Radial Keratotomy, RK), PRK (Photorefractive Keratotomy, PRK), LASIK (Laser in situ Keratomileis, LASIK) and the like. Also, myopia correction procedures such as LASEK, intracorneal ring, intracorneal lens, phakic intraocular lens, and orthokeratology are also included in myopia correction surgery.
  • eye disease in “corneal surgery for cornea necessary for treatment of eye disease or corneal trauma” include keratitis, corneal herpes, keratoconus, corneal degeneration, corneal vitiligo, bullous keratopathy, cornea Examples include softening and cataracts.
  • the corneal trauma in the corneal surgery for the cornea necessary for the treatment of eye diseases or corneal trauma involves irritating liquid entering the eyes, solids flying into the eyes, cutting with a blade Injuries include piercing with objects, being caught by pets, improper use of contact lenses, strong light rays, and bruises.
  • the “corneal surgery” in “corneal surgery for the cornea necessary for the treatment of eye diseases or corneal trauma” includes corneal incision, corneal resection, corneal refraction surgery, corneal correction surgery, corneal curvature surgery Can be mentioned.
  • a surgical operation for the cornea necessary for the treatment includes an insertion operation of an artificial lens (artificial lens).
  • “Sensitive neuropathy” of “sensory neuropathy due to corneal disease or corneal surgery” includes decreased perception such as tactile sensation and pain sensation. Due to a decrease in perception, blink reflection is lacking, which causes dry eye and eyeball damage. Thus, “sensory neuropathy” includes dry eye.
  • the “sensory nerve” means a sensory nerve distributed in the cornea and is synonymous with a trigeminal nerve (an optic nerve that runs in the cornea) running in the cornea, that is, synonymous with a corneal sensory nerve.
  • a corneal sensory nerve regeneration promoting agent refers to a drug that has a corneal sensory nerve regeneration promoting action
  • corneal sensory nerve regeneration promoting action refers to corneal perception that has been cut or damaged by corneal surgery or the like. An action that promotes nerve regeneration.
  • R 1 and R 3 each independently represents a hydrogen atom, a carboxyl group or an alkoxycarbonyl group.
  • the alkoxycarbonyl group include a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, and a propoxy group.
  • An alkoxycarbonyl group having 2 to 4 carbon atoms such as a carbonyl group is preferred, and a methoxycarbonyl group is more preferred.
  • R 1 is preferably a hydrogen atom or a carboxyl group, and more preferably a carboxyl group.
  • R 3 is preferably a hydrogen atom or a carboxyl group, and more preferably a carboxyl group.
  • R 2 and R 4 each independently represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, or an acyloxy group, and examples of the acyloxy group include those having 2 to 4 carbon atoms such as an acetoxy group, a propionyloxy group, a butyryloxy group, and an isobutyryloxy group.
  • An acyloxy group is preferable, and an acetoxy group is more preferable among them.
  • R 2 is preferably a hydrogen atom or a hydroxyl group, and more preferably a hydroxyl group.
  • R 4 is preferably a hydrogen atom or a hydroxyl group, and more preferably a hydroxyl group.
  • Specific examples of the compound represented by the formula (1) include SPF-3059-2, R 1 in which R 1 is a carboxyl group, R 2 is a hydroxyl group, R 3 is a hydrogen atom, and R 4 is a hydroxyl group.
  • SPF-3059-12 in which R 1 is a carboxyl group, R 2 is a hydrogen atom, R 3 is a carboxyl group, and R 4 is a hydroxyl group
  • R 1 is SPF-3059-24, wherein R 1 is a hydrogen atom R 2 is hydroxyl group R 3 is a carboxyl group is R 3 R 2 is a hydroxyl group is a hydrogen
  • the pharmaceutically acceptable salt of the compound represented by the formula (1) it is not necessary to adjust the pH of the solution because the solubility in water is improved. Among them, sodium salt is most preferable.
  • the compound represented by the formula (1) is a publicly known material obtained by culturing Penicillium sp. Strain SPF-3059, chemical total synthesis, or a product obtained by main culture or total synthesis. It can be obtained by chemical transformation by synthetic methods. That is, as the culture, the strain SPF-3059 belonging to the genus Penicillium isolated from the soil in Osaka Prefecture [this strain is based on the Budapest Treaty on International Approval of Deposit of Microorganisms in Patent Procedures on July 13, 2001 Deposited under the accession number FERM BP-7663 at the Patent Organism Depositary Center of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Ministry of Economy, Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) ] Can be effectively obtained by culturing.
  • Patent Document 1 International Publication No. 02/09756 pamphlet
  • Patent Document 2 International Publication No. 03/062423 pamphlet
  • the compound represented by the formula (1) can be obtained according to the method described in JP-A-2008-13530.
  • At least one of R 1 and R 3 represents an alkoxycarbonyl group, or at least one of R 2 or R 4 represents an acyloxy group
  • a known esterification using a compound represented by the formula (1) in which the alkoxycarbonyl group is a carboxyl group as a raw material and / or a compound represented by the formula (1) in which the acyloxy group is a hydroxyl group It can be synthesized by performing known acylation using bismuth as a raw material and chemical conversion.
  • the known esterification or acylation for example, the method described in JP-A-2006-335683 or WO03 / 062440 (Patent Document 3) may be referred to.
  • the pharmaceutically acceptable salt of the compound represented by the formula (1) is obtained by adding water, methanol, ethanol, acetone, acetic acid to the compound represented by the formula (1) obtained by any one of the above methods. It can be obtained by reacting a base in an appropriate solvent such as ethyl, chloroform or ether.
  • the compound represented by the formula (1) of the present invention is a compound also called a xanthone compound, and has an action of inhibiting the nerve elongation activity of semaphorin 3A, as will be clarified in Examples 4 and 5 described later.
  • the present invention revealed for the first time that the xanthone compound represented by the formula (1) promotes regeneration of corneal sensory nerves in a mouse corneal transplant model, Therefore, it is effective for the treatment or prevention of corneal sensory neuropathy caused by corneal disease or corneal sensory nerve injury.
  • Sensory neuropathy caused by corneal sensory nerve injury caused by corneal disease or corneal surgery includes decreased perception such as touch and pain.
  • the xanthone compound represented by the formula (1) is particularly effective in the reduction of perception such as tactile sensation and pain sensation and the prevention and treatment of dry eye.
  • the xanthone compound represented by the formula (1) promotes the regeneration of the corneal sensory nerve, as will be clarified in Example 1 described later, and is therefore effective as a regeneration promoting agent for the corneal sensory nerve.
  • By promoting regeneration of the corneal sensory nerve it is possible to treat or prevent a sensory neuropathy caused by a corneal disease or an injury of the corneal sensory nerve caused by corneal surgery. More specifically, it is effective for the prevention and treatment of hypoperception and dry eye caused by corneal disease or corneal sensory nerve injury caused by corneal surgery.
  • the therapeutic or preventive agent for corneal sensory neuropathy and the regeneration promoting agent for corneal sensory nerve of the present invention comprise a compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • a pharmaceutically acceptable salt thereof for various preparations such as normal pharmaceutically acceptable carriers, binders, stabilizers, excipients, diluents, pH buffers, disintegrants, solubilizers, solubilizers, isotonic agents, etc.
  • Formulation ingredients can be added.
  • these therapeutic or preventive agents and regeneration promoters can be administered orally or parenterally, and can be administered systemically or locally, more preferably parenterally, ocular It is administered locally to the department. That is, orally, it can be administered orally in dosage forms such as tablets, pills, powders, granules, capsules, syrups, emulsions, suspensions and the like that are usually used.
  • parenterally for example, eye drops, eye ointments, intraocular injections, subconjunctival injections, intravenous injections (infusions), intramuscular injections, subcutaneous injections, nasal drops (for nasal administration) (Spray agent). Of these, eye drops are preferable.
  • Solid preparations such as tablets have active ingredients as usual pharmacologically acceptable carriers or excipients such as lactose, sucrose and corn starch, binders such as hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, hydroxypropylmethylcellulose, It is prepared by mixing with a disintegrant such as sodium carboxymethylcellulose or sodium starch glycolate, a lubricant such as stearic acid or magnesium stearate, or a preservative.
  • active ingredients as usual pharmacologically acceptable carriers or excipients such as lactose, sucrose and corn starch, binders such as hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, hydroxypropylmethylcellulose, It is prepared by mixing with a disintegrant such as sodium carboxymethylcellulose or sodium starch glycolate, a lubricant such as stearic acid or magnesium stearate, or a preservative.
  • the active ingredient is dissolved or suspended in a physiologically acceptable carrier such as water, saline, oil, aqueous dextrose, etc., which contains emulsifiers, stabilizers, osmotic pressure adjusting salts as adjuvants. Or you may contain a buffering agent as needed.
  • a physiologically acceptable carrier such as water, saline, oil, aqueous dextrose, etc.
  • emulsifiers, stabilizers, osmotic pressure adjusting salts as adjuvants emulsifiers, stabilizers, osmotic pressure adjusting salts as adjuvants.
  • a buffering agent as needed.
  • Additives for eye drops isotonic agents such as glycerin and sodium chloride, buffers such as phosphoric acid and citric acid, pH regulators such as hydrochloric acid and sodium hydroxide, thickening agents such as hydroxypropylmethylcellulose and polyvinyl alcohol
  • the dose and number of administrations vary depending on the administration method and the age, weight, medical condition, etc. of the patient, but a method of locally administering to the bed part is preferred. Moreover, it is preferable to administer once or twice or more per day. When two or more doses are administered, it is desirable to administer them repeatedly every day or at appropriate intervals. Since regeneration of the corneal sensory nerve usually requires a period of several days to several months or more, it is desirable to administer continuously in order to suppress the activity of semaphorin.
  • the dosage may be several hundred ⁇ g to 2 g, preferably 5 to 100 mg, more preferably several tens of mg or less as the amount of active ingredient per adult patient, and can be used once or several times a day. Can be administered.
  • a sustained-release preparation can be used to reduce the number of administrations, and it can be administered in small amounts over a long period of time using an osmotic pump or the like.
  • Parenteral administration includes a dose of 0.1 to 100 mg / day, more preferably 0.3 to 50 mg / day per adult patient, and can be administered once or divided into several times a day.
  • Sustained release preparations can also be used to reduce the number of administrations.
  • the amount of the active ingredient can be 0.01 to 10 w / v%, preferably 0.05 to 5 w / v% per adult patient. It is desirable to administer 1 to several drops 1 to 6 times a day.
  • the xanthone compound represented by the formula (1) is excellent in corneal retention when administered by eye drops, and therefore, eye drops are a preferable dosage form.
  • the active ingredient can be used in an amount of 0.01 to 10 w / w%, preferably 0.1 to 5 w / w%. It is desirable to administer 6 times. In any of these administration methods, it is preferable to employ an administration route and an administration method so that the concentration of the semaphorin is sufficiently inhibited at the site of action.
  • the therapeutic agent or preventive agent for sensory neuropathy caused by corneal disease or corneal surgery and the agent for promoting regeneration of corneal sensory nerve of the present invention can be used as animal drugs. Among the animals, mammals are desirable and humans are most desirable.
  • green fluorescent protein in which corneal parenchymal cells, corneal endothelial cells and nerves are fluorescent proteins in the cornea.
  • GFP green fluorescent protein gene-modified mice
  • corneal sensory nerve fibers running in the cornea can be easily observed by removing one layer of corneal endothelial cells.
  • a syngeneic wild-type mouse cornea was transplanted into this mouse, and 50 ul of binaxanthone (dissolved in 0.1 mg / mL of Linderon (1 mg / ml betamethasone sodium phosphate injection)) was injected immediately after surgery by subconjunctival injection.
  • corneal sensitivity was performed by measuring the corneal sensitivity at the central part of the corneal graft every week after the operation using a Cochet-Bonnet corneal sensitometer.
  • Comparison of nerve fiber regeneration in the corneal graft was performed by immunostaining with ⁇ 3 tubulin antibody, and the fibers in the corneal graft that were double positive for ⁇ 3 tubulin and GFP were converted to regenerated nerve fibers.
  • the total length was measured and compared between the binaxanthone administration group and the control group. From the results shown in FIG. 1, regeneration of nerve fibers into the corneal graft was significantly promoted in the binaxanthone administration group as compared with the control group. Further, from the results of FIG. 2, it was found that at 3 weeks after the operation, the blink reflex was significantly improved in the binaxanthone administration group and the corneal perception was improved as compared with the control group.
  • the regenerative nerves seen in FIG. 1 are mainly corneal sensory nerves.
  • neovascularization of the cornea positive fibers by immunostaining using CD31 antibody were used as new blood vessels, traced by computer image software, the total length was measured, and compared between the binaxanthone administration group and the control group. From the result of FIG. 3, in the binaxanthone administration group, the neovascularization into the corneal graft was not promoted as compared with the control group. From these results, binaxanthone promotes the regeneration of the severed corneal sensory nerve and also promotes the recovery of its neural function, ie corneal sensation. Furthermore, it became clear that angiogenesis, an angiogenic event, does not promote angiogenesis.
  • the xanthone compound represented by formula (1) of the present invention is a known compound, and is described in International Publication No. 02/09756 (Patent Document 1) and International Publication. No. 03/062423 (Patent Document 2), International Publication No. 03/062440 (Patent Document 3), JP-A-2006-335683, and JP-A-2008-13530. It can be obtained by culturing SPF-3059 strain, chemical total synthesis, or chemical conversion. In addition to the production method, physicochemical properties are also described in these patent documents. Specifically, it is as follows.
  • One platinum loop of Penicillium sp. SPF-3059 strain (FERM BP-7663) cultured on a slope was inoculated, and cultured by shaking at 27 ° C. and 180 rpm for 4 days.
  • 125 ml of the same composition as above was dispensed into five 500 ml Erlenmeyer flasks and sterilized by autoclave. Then, 4 ml of the above-mentioned pre-cultured solution was added, and the mixture was shaken and cultured at 27 ° C. and 180 rpm for 4 days. Pre-cultured.
  • glucose 1.43%, sucrose 3.57%, cottonseed flour 1.43%, sodium nitrate 0.07%, L-histidine 0.07%, dipotassium phosphate 30 liters of medium adjusted to pH 7.0 containing 036%, potassium chloride 0.05%, magnesium sulfate heptahydrate 0.001%, Adecanol LG-295S (Asahi Denka Antifoam) 0.01%
  • 500 ml of the above precultured solution was added, followed by aeration and agitation culture at 27 ° C., 400 rpm, and aeration rate of 15 liters / min for 9 days.
  • the culture solution is centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes to separate the supernatant and cells, and the supernatant fraction is extracted twice with 20 liters of ethyl acetate-formic acid (99: 1). did.
  • the bacterial cell fraction was extracted with 30 liters of acetone, filtered, concentrated, and extracted with 10 liters of ethyl acetate-formic acid (99: 1) when it became an aqueous solution. Both extracts were mixed and concentrated under reduced pressure to obtain 224 g of a crude extract.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Preparative reverse phase HPLC conditions were as follows: Column: Wakopak-Wakosil (registered trademark) -II5C18HGprep ( ⁇ 5 ⁇ 10 cm and ⁇ 5 ⁇ 25 cm connected, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), eluent A: 1% formic acid aqueous solution, eluent B : Methanol, gradient: linear gradient of liquid B from 45% to 75% for 2 hours, flow rate: 25 ml / min, detection: absorbance at 260 nm, and the eluate was fractionated every minute.
  • Wakopak-Wakosil registered trademark
  • II5C18HGprep ⁇ 5 ⁇ 10 cm and ⁇ 5 ⁇ 25 cm connected, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • eluent A 1% formic acid aqueous solution
  • eluent B Methanol
  • gradient linear gradient of liquid B from 45% to 75% for 2 hours
  • Analytical HPLC conditions were as follows: Column: Wakopak-Wakosil (registered trademark) -II5C18RS ( ⁇ 4.6 ⁇ 150 mm, manufactured by Wako Pure Chemical Industries), eluent A: 1% formic acid aqueous solution, eluent B: methanol, gradient: B The linear gradient of the liquid ratio from 20% to 67% for 71.1 minutes, flow rate: 1.3 ml / min, detection: absorbance at 260 nm.
  • Inhibitory activity of xanthone compound against Sema3A collapse activity A 96-well plate (Sumitomo Bakelite) coated with polylysine was further coated with laminin (20 ⁇ g / ml laminin, room temperature for 1 hour). 100 ⁇ l of medium (F12 medium containing 10% fetal bovine serum, 20 ng / ml NGF, 100 units / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin) was placed in each well, which was removed from 7-day-old chicken embryos. The dorsal root ganglion is inoculated and cultured for 16-20 hours under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C.
  • medium F12 medium containing 10% fetal bovine serum, 20 ng / ml NGF, 100 units / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin
  • each compound of Example 3 was added to the medium at various concentrations and cultured for 1 hour, and then 2 units / ml of mouse semaphorin 3A (Sema3A) was added and further cultured for 1 hour.
  • glutaraldehyde was quickly added to a final concentration of 1%, and the tissue piece was fixed by allowing it to stand at room temperature for 15 minutes, and then the proportion of the growth cone retracted under a microscope was measured. A well to which Sema3A was not added was used as a control.
  • the growth cone regression rate of the negative control group (no compound or Sema3A added) is (A)%
  • the growth cone regression rate of the positive control group is (no compound added, Sema3A added) is (B)%
  • the results are shown below. This result shows that each compound of Example 3 strongly inhibits semaphorin 3A.
  • Sema3A-expressing COS7 cell mass was prepared by the following method. 1 ⁇ g of Sema3A expression plasmid was introduced into COS7 cells (100,000 cells / 35 mm culture dish) cultured overnight using FuGENE6 transfection reagent (Roche).
  • COS7 cells were detached from the culture dish using trypsin, collected by centrifugation, and resuspended in 200 ⁇ l of medium. 20 ⁇ l of the cell suspension was placed on the lid (inside) of the culture dish, and the lid was inverted and cultured for 20 hours (Hanging Drop Culture) (Cell 78, 425, 1994). After culturing, aggregated COS7 cells (lumps) were collected in a medium and trimmed to a size of 0.5 mm.
  • the Sema3A-expressing COS7 cell mass and the dorsal root ganglion were juxtaposed in a 0.2% collagen gel at a distance of 0.5 to 1 mm, and the collagen gel was placed in a medium containing various concentrations of the compound. And cultured under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. for 2 days. Thereafter, glutaraldehyde was quickly added to a final concentration of 1%, and the tissue piece was fixed by leaving it at room temperature for 1 hour, and then the state of neurite outgrowth was observed under a microscope.
  • Sema3A is secreted from the COS7 cell mass into which the Sema3A expression plasmid has been introduced to form a concentration gradient (the concentration closer to the COS7 cell mass is higher).
  • the neurites could not extend in the direction in which the COS7 cell mass having a high Sema3A concentration existed, but only in the opposite direction, but each compound of Example 3 was added to the medium. In some cases, neurite outgrowth in the direction of the Sema3A-expressing COS7 cell mass was observed.
  • Formulation Example 1 An eye drop can be prepared by suspending the following composition in 100 ml of sterile purified water and adjusting to pH 7.0 at a concentration that is isotonic with tear fluid. SPF-3059-5 50mg Potassium dihydrogen phosphate appropriate amount Disodium hydrogen phosphate appropriate amount Sodium chloride appropriate amount Benzethonium chloride 10mg Sterilized purified water
  • Formulation Example 2 An eye drop can be prepared by suspending the following composition in 100 ml of sterile purified water and adjusting to pH 7.0 at a concentration that is isotonic with tear fluid. SPF-3059-5 50mg Potassium dihydrogen phosphate appropriate amount Disodium hydrogen phosphate appropriate amount Sodium chloride appropriate amount Benzethonium chloride 10mg Sterilized purified water
  • Formulation Example 3 The ointment can be prepared according to the following prescription according to a conventional method. SPF-3059-5 50mg Liquid paraffin 10g White petrolatum
  • Formulation Example 4 The ointment can be prepared according to the following prescription according to a conventional method. SPF-3059-5 50mg Liquid paraffin 10g White petrolatum
  • PBS phosphate buffer
  • SPF-3059-2, SPF-3059-5, SPF-3059-24 and SPF-3059-26 which are xanthone compounds included in the formula (1)
  • SPF-3059-1, SPF-3059-3, SPF-3059-9 and SPF-3059-30 which are xanthone compounds not included in the formula (1)
  • PBS Dulbecco ′
  • HPLC conditions were as follows: Column: Wakopak-Wakosil (registered trademark) -II5C18RS ( ⁇ 4.6 ⁇ 150 mm, manufactured by Wako Pure Chemical Industries), eluent A: 1% formic acid aqueous solution, eluent B: methanol, gradient: B liquid ratio A linear gradient from 30% to 70% for 60 minutes, flow rate: 1.0 ml / min, detection: absorbance at 260 nm.
  • the result of evaluating the stability of the xanthone compound in PBS is shown in FIG. From the results of FIG. 7, all four types of xanthone compounds contained in the formula (1) showed a residual rate of 90% or more. On the other hand, almost all xanthone compounds not included in formula (1) were decomposed in all four types.
  • Stable binaxanthone (SPF-3059-5) and SPF- 3059-1 in PBS phosphate buffer
  • PBS Dulbecco's PBS ( ⁇ )
  • ⁇ ⁇ g / ml
  • These lysates were stored under conditions of 37 ° C., and the remaining amount of the drug in the lysate was quantified by HPLC at each time point from the start of storage to 4 weeks later to determine the change over time in the residual rate.
  • the HPLC conditions were the same as in Example 10.
  • the results of evaluating the stability of binaxanthone (SPF-3059-5) and SPF-3059-1 in PBS are shown in FIG. From the results shown in FIG.
  • binaxanthone which is a xanthone compound contained in the formula (1), is 96% or more remaining in PBS at 37 ° C. until 4 weeks and is stable for 4 weeks or more. It has been shown. On the other hand, almost all of SPF-3059-1 decomposed in about one week.
  • Each compound is dissolved in PBS to a concentration of 0.1 mg / mL to 1 mg / mL.
  • the compound solution of the present invention, the target compound solution, or PBS alone is instilled into 10 ⁇ L of one eye of each rat.
  • 1 ⁇ L to 10 ⁇ L of tear fluid is collected with a pipette, the rat is euthanized, the eyeball is removed, and the cornea is collected.
  • the content of each compound in tears and / or cornea is measured by LC-MS.
  • Add 0.1 M HCl to the sample, stir the tears and homogenize the cornea.
  • Add ethyl acetate, stir well and centrifuge collect upper layer. Ethyl acetate is further added to the lower layer, the above operation is repeated, and the upper layer for three times is collected, and a sample dried with nitrogen gas is used for LC-MS measurement.
  • the xanthone compound having semaphorin 3A inhibitory activity of the present invention is effective as a therapeutic or prophylactic agent for sensory neuropathy caused by corneal disease or corneal surgery.
  • corneas necessary for the treatment of sensory neuropathy, cornea transplantation, myopia correction surgery, eye disease or corneal trauma caused by corneal sensory nerve injury caused by corneal diseases such as keratosis, keratochemistry, fever corneal transplantation It can be effectively used as a therapeutic or prophylactic agent for sensory neuropathy caused by corneal sensory nerve injury caused by corneal surgery such as corneal surgery.
  • the xanthone compound having semaphorin 3A inhibitory activity of the present invention can also be used effectively as a regeneration promoter for corneal sensory nerves.
  • the xanthone compound used in the present invention is chemically extremely stable in an aqueous solution such as a phosphate buffer, it is stable in tears or cornea by eye drop administration, and is caused by corneal disease or corneal surgery. It is extremely preferable as a therapeutic agent or preventive agent for sensory neuropathy occurring in the above, and as a regeneration promoter for corneal sensory nerve.

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Abstract

　下記の式（１）：（式中、Ｒ１は水素原子またはカルボキシル基を表し、Ｒ２は水素原子または水酸基を表し、Ｒ３は水素原子またはカルボキシル基を表し、Ｒ４は水素原子または水酸基を表す。）で表される化合物またはその薬学上許容される塩は、角膜疾患もしくは角膜外科手術による知覚神経障害の治療剤または予防剤、並びに、角膜知覚神経の再生促進剤として有効である。

Description

セマフォリン阻害剤を有効成分とする角膜知覚神経障害治療薬
　本発明は、セマフォリン阻害活性を有するキサントン化合物を有効成分として含有する角膜疾患もしくは角膜外科手術などが原因の知覚神経障害、またはそれに伴うドライアイに対する治療薬などに関する。
　角膜とは、眼球の前面を覆う透明な膜であり、眼に光を取り入れ、光を屈折させて水晶体と共に眼の焦点を合わせる機能を有している。また、角膜表面が常に涙液で覆われていることから、角膜は眼の乾燥や眼球内部への細菌感染などを防ぐ機能も有している。この角膜は、傷害や疾患が原因で、弱くなることや変性することがあり、その結果これらの機能が損なわれてしまうことがある。この治療にはまずは薬剤が用いられる。また、薬剤では十分な治療効果が得られない場合には、正常な角膜を移植する角膜移植が行われる。
　角膜表層には、三叉神経由来の知覚神経である角膜知覚神経が、分布している。三叉神経とは、脳神経の一つであり、第５脳神経とも呼ばれる。三叉神経は、眼神経、上顎神経および下顎神経の三神経に枝分かれをしている。眼神経のうち、角膜内を走行する神経が、角膜知覚神経である。角膜知覚神経は、角膜知覚によって角膜反射（瞬き反射）を引き起こして角膜を守る役割だけでなく、涙液や神経栄養因子の分泌を促進することによって角膜の恒常性を維持する役割も果たしている。
　角膜疾患においては、角膜自体の変性だけでなく、角膜知覚神経も傷害され、正常な神経機能が損なわれ、知覚障害が起こる。また、疾患治療のための角膜移植やレーシックなどの近視矯正手術に代表される角膜外科手術においては、角膜知覚神経が切断されてしまうため、手術後の長期間、知覚障害が必ず生じる。これら知覚障害、すなわち角膜知覚神経障害とは、具体的には、角膜表面の触覚、痛覚などの知覚低下であり、角膜反射の欠如、涙液異常によるドライアイ（角膜乾燥症）、眼球の損傷などを引き起こす。
　このような角膜知覚神経障害やドライアイの原因となる角膜疾患として、角膜炎、角膜白斑（角膜ヘルペス、麻疹、梅毒、外傷による）、角膜感染症、角膜変性症、角膜ジストロフィ、角膜実質ジストロフィ、水疱性角膜症、円錐角膜症、角膜内皮代償不全、角膜潰瘍、神経麻痺性角膜症、糖尿病性角膜症、角膜化学症（薬品などが眼に入ったことによる。）、熱症などが知られている。これらの疾患治療では重症の場合は角膜移植が行われうる。
　また、このような角膜知覚神経障害やドライアイの原因となる角膜外科手術として、角膜移植、近視矯正手術、および白内障治療などのための人工レンズ（人工水晶体）の挿入手術が知られている。
　角膜移植（Ｋｅｒａｔｏｐｌａｓｔｙ）は、角膜移植術または角膜形成術とも呼ばれる。角膜移植が行われるのは前記の場合に限られない。角膜移植の目的としては、１）光学的な目的、２）治療的な目的、３）整形的な目的、および４）美容的な目的が挙げられる。
　１）光学的な目的とは、濁った角膜の透明化や視力の回復を意味し、これらの原因となる疾患としては、角膜炎、角膜白斑（角膜ヘルペス、麻疹、梅毒、外傷による）、角膜感染症、角膜変性症、角膜ジストロフィ、角膜実質ジストロフィ、水疱性角膜症、円錐角膜症、角膜内皮代償不全などが挙げられる。２）治療的な目的とは、感染病巣である角膜の切除による感染症の沈静化を意味し、この原因となる疾患としては角膜潰瘍（主には活動期の感染症）が挙げられる。３）整形的な目的とは、角膜穿孔例などに対し眼球の形態を保持することを意味し、この原因としては角膜潰瘍（細菌性、真菌性、ウイルス性、無菌性）や外傷が挙げられる。４）美容的な目的とは、角膜の白濁を伴う角膜白斑を美容上改善するものである。
　角膜移植としては、具体的には、１）全層角膜移植術、２）表層角膜移植術、３）深層表層角膜移植術、４）強角膜移植術、５）強膜移植術、６）角膜輪部移植術、および７）羊膜移植術が挙げられる。
　１）全層角膜移植術とは、角膜上皮から内皮までの全層を交換する手術であり、水疱性角膜性の内皮移植が必要な疾患や潰瘍穿孔例などの角膜実質深層に及ぶ混濁を有する疾患の治療に用いられる。２）表層角膜移植術とは、角膜上皮と実質部の病変のみを切除し同じ大きさに整えた角膜片を移植する手術であり、角膜実質の表層のみが混濁している場合や角膜周辺部が薄くなっている場合および角膜が局所的に薄くなっている場合に用いられる。３）深層表層角膜移植術とは、デメス膜と内皮のみを残して角膜上皮と実質の全てを切除し同じ大きさに整えた角膜上皮と実質のみを移植する手術であり、内皮細胞が健全な症例に用いられる。４）強角膜移植術とは、強膜と共に角膜を切除し強角膜片を移植する手術であり、角膜潰瘍が広範囲である場合などに用いられる。５）強膜移植術とは、菲薄化した強膜を矯正する手術であり、角膜が正常で強膜を補強する場合に用いられる。６）角膜輪部移植術とは、正常角膜上皮の供給のために角膜輪部幹細胞を移植する手術である。７）羊膜移植術とは、異常結膜を除去し羊膜を移植する手術であり、この結果環境が整うことにより正常結膜が再被覆する。
　角膜移植の原因疾患として高頻度なものとしては、例えば日本の場合、第１に円錐角膜症、第２に角膜白斑、第３に水疱性角膜症、第４に角膜変性症、第５に角膜化学症や熱症が挙げられる。円錐角膜症（ｋｅｒａｔｏｃｏｎｕｓ）とは、思春期に発祥する角膜変性疾患で、角膜中央部が徐々に薄くなり前に突出する疾患であり、角膜の形がゆがむためレンズとしての機能が損なわれる。円錐角膜症が高度なために、コンタクトレンズでの視力矯正が十分でないか長時間のレンズ装着が困難な場合に、角膜移植が行われ得る。角膜白斑とは、高齢者に多い疾患で、若い頃に角膜炎などを患った結果角膜に瘢痕が残ったものを言い、ヘルペス角膜炎後の混濁も角膜白斑に含まれる。水疱性角膜症とは、角膜の裏側で角膜の水分を調節する内皮細胞が減少した結果角膜に水分がたまってむくんだ状態を言う。以前に角膜手術を受けた患者でその内皮細胞が減少し再度角膜移植が必要になった再移植と呼ばれる状態も、水疱性角膜症に含まれる。角膜変性症とは、角膜内に異常物質が沈着して混濁したものを言う。角膜化学症や熱症とは、薬品やセメントが眼に入ったことにより強い瘢痕が生じたものを言う。
　このような角膜移植が行われるのは、例えば日本では年間１～２千件ほどとされている。角膜移植が必要とされる患者の数は、年間約二万件とも言われている。
　角膜移植の他に、角膜知覚神経の切断により角膜知覚神経障害が生じてしまう手術として、近視矯正手術が挙げられる。近視矯正手術とは、主には、近視による視力低下を回復するための手術を意味する。
　近視矯正手術と総称される手術の具体例としては、現在のところ、放射状角膜切開術（Ｒａｄｉａｌ　Ｋｅｒａｔｏｔｏｍｙ，ＲＫ）、ピーアールケー（Ｐｈｏｔｏｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ　Ｋｅｒａｔｅｃｔｏｍｙ，ＰＲＫ）、レーシック（Ｌａｓｅｒ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　Ｋｅｒａｔｏｍｉｌｅｕｓｉｓ，ＬＡＳＩＫ，レーザー角膜屈折矯正手術）が挙げられる。このうちピーアールケーとレーシックがエキシマレーザーを用いる手術である。近視矯正手術として主なものは、１０年ほど前までは放射状角膜切開術であったが、最近ではレーシックが最も良く行われている。このように近視矯正手術の主流は近年僅かの間に移行しており、現在最先端とされている手術方法も新しい手術に取って代わられ得るものと言える。レーシックの場合、例えば日本では年間５～６万件ほどとされており、その症例数は増加傾向にある。これに伴い、レーシックの後遺症としてドライアイなどが最近報告されている。
　また近視矯正手術には手術以外の近視矯正法として、ラセック（ＬＡＳＥＫ）、角膜内リング（ＩＣＲＳ）、角膜内レンズ、有水晶体眼内レンズ、オルソケラトロジーも含まれ、これらの矯正法によっても、同様の角膜知覚神経障害が生じている。
　さらに、角膜移植や近視矯正手術の他にも、角膜切開術（ｋｅｒａｔｏｔｏｍｙ）、角膜切除（ｋｅｒａｔｅｃｔｏｍｙ）、角膜屈折矯正手術（ｋｅｒａｔｏｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ　ｓｕｒｇｅｒｙ）、角膜矯正術（ｏｒｔｈｏｋｅｒａｔｏｌｏｇｉｃ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）、角膜曲率形成術（ｋｅｒａｔｏｍｉｌｕｓｉｓ）などの眼疾患や角膜外傷を治療するために必要な角膜を対象とする外科手術によっても、角膜知覚神経が切断されてしまうために、同様の知覚神経障害が生じている。また白内障などの治療では、人工レンズを挿入する手術を行うことがある。このような手術においても角膜が小さく切開されるために、角膜知覚神経が傷害される可能性がある。
　一方、セマフォリンは、神経成長円錐を退縮させ軸索の伸長を抑制する因子として同定された内因性のタンパク質であり、これまでに約２０種の分子種が知られている。このうち良く研究されているのがクラス３型と呼ばれるサブファミリーの遺伝子群であり、これらの遺伝子がコードするタンパク質はインビトロで強い神経突起伸長抑制活性や成長円錐退縮活性を有することが知られている。最も良く研究されているのがセマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ３Ａ，Ｓｅｍａ３Ａ，ｃｏｌｌａｐｓｉｎ－１）であり（非特許文献１、２）、このタンパク質は低濃度かつ短時間で培養神経細胞の成長円錐退縮を誘発する。
　セマフォリン阻害活性を有する物質としては、ペニシリウム・エスピー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｓｐ．）ＳＰＦ－３０５９株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－７６６３）の培養物から得られる一連のキサントン化合物（特許文献１、２）及びキサントン化合物を化学的に修飾した誘導体（特許文献３）が知られている。キサントン化合物は、インビボで神経再生促進作用を有する。更に、キサントン化合物が、虚血性障害が関与する神経細胞死を抑制し虚血性神経障害の治療や予防に有効であることも、報告されている（特許文献４）。
　成体動物を用いたインビボでの感覚神経に対するセマフォリンの作用が、報告されている（非特許文献３）。具体的には、ウサギ角膜上皮細胞に遺伝子銃（ｇｅｎｅ　ｇｕｎ）でセマフォリン３遺伝子を導入すると三叉神経が退縮することや、角膜上皮が剥離除去された成体ウサギ角膜創傷モデルにＳｅｍａ３遺伝子を投与すると三叉神経の再伸長が抑制されることが、報告されている。本報告により、アダルトの感覚神経もＳｅｍａ３遺伝子によって反発的に調整を受けることが示唆され、Ｓｅｍａ３遺伝子の投与による慢性疼痛の治療なども示唆されている。しかしながら、本報告には、角膜が傷害されたことにより切断された角膜知覚神経の再生を促進する方法については、開示も示唆もない。何故ならば、角膜の傷害後何も手当てされなければ角膜知覚神経の再生が不足する旨は示されていないし、角膜にセマフォリンが発現し更にそのセマフォリンが角膜知覚神経の再生不足の原因であるということまでは解明されていない。
　発達期（胎生期）における角膜知覚神経の形成に対し、水晶体由来のセマフォリン３Ａが反発的にコントロールしていることが、報告されている（非特許文献４）。本文献では、通常胎生期に眼球の知覚神経は角膜を避けるように形成されるため環状の神経束（ｎｅｒｖｅ　ｒｉｎｇ）が形成されるが、ニワトリ胚にて水晶体を除去したところこの環状の神経束は正常に形成されなかったことから、水晶体から神経伸長を反発させる因子が分泌されると考察されている。また、水晶体と知覚神経を共培養したところ水晶体の存在する方向には知覚神経が伸長しなかったが、Ｓｅｍａ３Ａ－ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅを添加したところ知覚神経は伸長したことから、知覚神経の伸長を反発させる因子は水晶体由来のセマフォリン３Ａであると考察している。さらに、正常胚の水晶体内または水晶体付近にＳｅｍａ３Ａ－ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅを添加したところ角膜の知覚神経の伸長が確認された。これらの結果に基づいて、発達期（胎生期）における角膜知覚神経の形成に対し、水晶体由来のセマフォリン３Ａが反発的にコントロールしていることが、本文献で報告されている。しかしながら、本報告には、角膜が傷害されたことにより切断された角膜知覚神経の再生を促進する方法については、開示も示唆もない。本文献の主旨は、発達期における角膜知覚神経の特徴的な形成過程の機序を解明することにある。よって、本文献は疾患との関わりを論じてもいないし、病態モデルにおける検討は行っていない。角膜へ知覚神経が進入しないのはセマフォリン３Ａが反発的に作用しているためであることをＳｅｍａ３Ａ－ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅを用いて明らかにしているが、これは発達期（胎生期）の胚における正常神経の形成期の場合の知見である。傷害を受けた角膜での角膜知覚神経の伸長の阻害とは状況が根本的に異なる。また本文献では角膜傷害モデルを用いた阻害実験は行われていないことから、傷害を受けた角膜での角膜知覚神経の伸長についてまでは考察できない。さらにインビボモデルで用いられたのはニワトリの胚のみであり、げっ歯類での検討は行われていない。よって、本報告には、角膜が傷害されたことにより切断された角膜知覚神経の再生を促進する方法については、開示も示唆もない。
　ラットの角膜にはセマフォリン３Ａが発現し存在していることを免疫染色法やリアルタイムＰＣＲ法で分析されたことが、報告されている（非特許文献５）。しかしながら、本報告には、角膜が傷害されたことにより切断された角膜知覚神経の再生を促進する方法については、開示も示唆もない。本文献には、阻害実験は行われていないし、傷害モデルや病態モデルでの実験も行われていないし、角膜傷害に関する記載も無い。
　マウスでは胎生期から少なくとも生後２週間にかけて角膜にセマフォリン３Ａおよびその受容体であるニューロピリン１（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ－１）とプレキシンＡ（ｐｌｅｘｉｎＡ）が発現し存在していることを免疫染色法やリアルタイムＰＣＲ法で分析されたことが、報告されている（非特許文献６）。しかしながら、本報告は、胎生期から生後直後における角膜の形成にセマフォリン３Ａが関与することを主旨とし、角膜が傷害されたことにより切断された角膜知覚神経の再生を促進する方法については、開示も示唆もない。本文献には、阻害実験は行われていないし、傷害モデルや病態モデルでの実験も行われていないし、角膜傷害に関する記載も無い。
　ニワトリを用いて、胎生期における角膜神経の形成にセマフォリン３Ａの発現変動が関与することをｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法やリアルタイムＰＣＲ法で分析されたことが、報告されている（非特許文献７）。しかしながら、本報告は、哺乳類ではなく鳥類での報告である。また、胎生期における角膜神経回路の形成機序の解明を主旨とし、角膜が傷害されたことにより切断された角膜知覚神経の再生を促進する方法については、開示も示唆もない。本文献には、阻害実験は行われていないし、傷害モデルや病態モデルでの実験も行われていないし、角膜傷害に関する記載も無い。
　成体ラット角膜創傷モデルを用いてセマフォリン３Ａとその受容体であるニューロピリン１（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ－１）の発現変動が調べられた結果、傷害によって創傷部のエッジ部分で全層にわたりセマフォリン３Ａとニューロピリン１の発現が上昇していたが、治癒によりその発現は正常に戻ったことから、セマフォリン３Ａが角膜上皮の創傷の治癒に深く関与していることが、示唆されている（非特許文献８）。しかしながら、本報告は、角膜上皮細胞の再生に関与するものであり、角膜が傷害されたことにより切断された角膜知覚神経の再生を促進する方法については、開示も示唆もない。本傷害モデルは角膜移植や知覚神経傷害モデルとは異なるし、阻害実験は行われていないし、知覚神経機能に関する記載も無い。
国際公開第０２／０９７５６号パンフレット 国際公開第０３／０６２２４３号パンフレット 国際公開第０３／０６２４４０号パンフレット 国際公開第２００５／０５３６７８号パンフレット
Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ７５，ｐ２１７，１９９３年 Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ７５，ｐ１３８９，１９９３年 Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌｕｍｅ３，Ｎｕｍｂｅｒ１２，ｐ１３９８，１９９７年 Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ３０６，Ｎｕｍｂｅｒ２，ｐ７５０，２００７年 Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｅｙｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ８６，Ｎｕｍｂｅｒ４，ｐ６６９，２００８年 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌｕｍｅ４０３，Ｎｕｍｂｅｒ３－４，ｐ３０５，２０１０年 Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ３４４，Ｎｕｍｂｅｒ１，ｐ１７２，２０１０年 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌｕｍｅ３９５，Ｎｕｍｂｅｒ４，ｐ４５１，２０１０年
　上記したように、角膜とセマフォリンについての多くの研究が報告されているが、しかしながら、セマフォリン３Ａ阻害活性を有するキサントン化合物が、角膜疾患や角膜移植などの角膜外科手術により傷害もしくは切断された角膜知覚神経の再伸長を促進し、角膜疾患や角膜外科手術が原因で生じる知覚神経障害に対して有効な治療剤または予防剤としての効果については、これまで何ら研究されておらず、全く何ら知られていなかった。
　従って、本発明の課題は、セマフォリン３Ａ阻害活性を有するキサントン化合物を有効成分とする、角膜疾患や角膜外科手術による知覚神経障害に対する治療剤または予防剤を提供することにある。更に、セマフォリン３Ａ阻害活性を有するキサントン化合物を有効成分とする、角膜知覚神経の再生促進剤を提供することにある。
　角膜疾患や角膜移植によって角膜知覚神経は傷害され、知覚神経障害を起こす。角膜移植の場合は、角膜知覚神経は必ず切断されるため、角膜知覚神経傷害の最も重篤なモデルと考えられる。移植後の角膜には角膜知覚神経が再び十分に伸長できないために、知覚障害が生じる。本発明者らは、角膜知覚神経が再伸長できない原因として、水晶体（レンズ）や角膜上皮に発現しているセマフォリン３Ａの作用を原因と考え、セマフォリン３Ａ阻害活性を有するキサントン化合物を用いることにより、角膜知覚神経の再伸長および知覚障害の改善が可能かどうかを、鋭意検討した。その結果、本発明者らは、セマフォリン３Ａ阻害活性を有するキサントン化合物がマウス角膜移植モデルにおいて角膜知覚神経の再生を促進することを初めて明らかとした。従って、角膜疾患や角膜外科手術により角膜知覚神経が傷害を受けたことなどが原因で生じる角膜知覚神経障害に対してセマフォリン３Ａ阻害活性を有するキサントン化合物が治療薬または予防薬として有効であることを見出した。本発明は、かかる知見に基づき更に鋭意研究を重ねた結果、完成したものである。
　すなわち、本発明は、
〔１〕　式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 （式中、Ｒ１は水素原子、カルボキシル基またはアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ２は水素原子、水酸基またはアシルオキシ基を表し、Ｒ３は水素原子、カルボキシル基またはアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ４は水素原子、水酸基またはアシルオキシ基を表す。）
で表される化合物またはその薬学上許容される塩を有効成分として含有する、角膜疾患もしくは角膜外科手術による知覚神経障害の治療剤または予防剤；
〔２〕　式（１）において、Ｒ１は水素原子またはカルボキシル基を表し、Ｒ２は水素原子または水酸基を表し、Ｒ３は水素原子またはカルボキシル基を表し、Ｒ４は水素原子または水酸基を表す、〔１〕に記載の治療剤または予防剤；
〔３〕　式（１）において、Ｒ２またはＲ４のうち少なくとも一方が水酸基を表す、〔１〕または〔２〕に記載の治療剤または予防剤；
〔４〕　式（１）において、Ｒ２が水酸基を表す、〔３〕に記載の治療剤または予防剤；
〔５〕　式（１）において、Ｒ２およびＲ４が水酸基を表す、〔３〕に記載の治療剤または予防剤；
〔６〕　式（１）において、Ｒ１またはＲ３のうち少なくとも一方がカルボキシル基を表す、〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の治療剤または予防剤；
〔７〕　式（１）において、Ｒ３がカルボキシル基を表す、〔６〕に記載の治療剤または予防剤；
〔８〕　式（１）において、Ｒ１およびＲ３がカルボキシル基を表し、Ｒ２およびＲ４が水酸基を表す、〔１〕に記載の治療剤または予防剤；
〔９〕　角膜疾患が角膜炎、角膜白斑、角膜感染症、角膜変性症、角膜ジストロフィ、角膜実質ジストロフィ、水疱性角膜症、円錐角膜症、角膜内皮代償不全、角膜潰瘍、神経麻痺性角膜症、糖尿病性角膜症、角膜化学症、もしくは熱症である、〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の治療剤または予防剤；
〔１０〕　角膜外科手術が角膜移植である、〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の治療剤または予防剤；
〔１１〕　角膜外科手術が近視矯正手術である、〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の治療剤または予防剤；
〔１２〕　角膜外科手術が眼疾患または角膜外傷の治療に必要な角膜を対象とする角膜外科手術である、〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の治療剤または予防剤；
〔１３〕　角膜疾患もしくは角膜外科手術による角膜知覚神経の傷害により生じる知覚神経障害が知覚低下である、〔１〕～〔１２〕のいずれかに記載の治療剤または予防剤；
〔１４〕　角膜疾患もしくは角膜外科手術による角膜知覚神経の傷害により生じる知覚神経障害がドライアイである、〔１〕～〔１２〕のいずれかに記載の治療剤または予防剤；
〔１５〕　点眼剤の形態にある、〔１〕～〔１４〕のいずれかに記載の治療剤または予防剤；
〔１６〕　式（１）で表される化合物またはその薬学上許容される塩を有効成分として含有する、角膜知覚神経の再生促進剤；
〔１７〕　角膜疾患もしくは角膜外科手術による知覚神経障害を治療または予防するための、〔１６〕に記載の再生促進剤；
〔１８〕　角膜疾患もしくは角膜外科手術による知覚神経障害が知覚低下である、〔１７］に記載の再生促進剤；
〔１９〕　角膜疾患もしくは角膜外科手術による知覚神経障害がドライアイである、〔１７〕に記載の再生促進剤；
〔２０〕　点眼剤の形態にある、〔１６〕～〔１９〕のいずれかに記載の再生促進剤
に関する。
　更に、本発明は、
〔１－１〕　式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 （式中、Ｒ１は水素原子、カルボキシル基またはアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ２は水素原子、水酸基またはアシルオキシ基を表し、Ｒ３は水素原子、カルボキシル基またはアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ４は水素原子、水酸基またはアシルオキシ基を表す。）
で表される化合物またはその薬学上許容される塩を、必要とする対象に投与することを含む、角膜疾患もしくは角膜外科手術による知覚神経障害の治療または予防方法；
〔２－１〕　式（１）において、Ｒ１は水素原子またはカルボキシル基を表し、Ｒ２は水素原子または水酸基を表し、Ｒ３は水素原子またはカルボキシル基を表し、Ｒ４は水素原子または水酸基を表す、〔１－１〕に記載の治療または予防方法；
〔３－１〕　式（１）において、Ｒ２またはＲ４のうち少なくとも一方が水酸基を表す、〔１－１〕または〔２－１〕に記載の治療または予防方法；
〔４－１〕　式（１）において、Ｒ２が水酸基を表す、〔３－１〕に記載の治療または予防方法；
〔５－１〕　式（１）において、Ｒ２およびＲ４が水酸基を表す、〔３－１〕に記載の治療または予防方法；
〔６－１〕　式（１）において、Ｒ１またはＲ３のうち少なくとも一方がカルボキシル基を表す、〔１－１〕～〔５－１〕のいずれかに記載の治療または予防方法；
〔７－１〕　式（１）において、Ｒ３がカルボキシル基を表す、〔６－１〕に記載の治療または予防方法；
〔８－１〕　式（１）において、Ｒ１およびＲ３がカルボキシル基を表し、Ｒ２およびＲ４が水酸基を表す、〔１－１〕に記載の治療または予防方法；
〔９－１〕　角膜疾患が角膜炎、角膜白斑、角膜感染症、角膜変性症、角膜ジストロフィ、角膜実質ジストロフィ、水疱性角膜症、円錐角膜症、角膜内皮代償不全、角膜潰瘍、神経麻痺性角膜症、糖尿病性角膜症、角膜化学症、もしくは熱症である、〔１－１〕～〔８－１〕のいずれかに記載の治療または予防方法；
〔１０－１〕　角膜外科手術が角膜移植である、〔１－１〕～〔８－１〕のいずれかに記載の治療または予防方法；
〔１１－１〕　角膜外科手術が近視矯正手術である、〔１－１〕～〔８－１〕のいずれかに記載の治療または予防方法；
〔１２－１〕　角膜外科手術が眼疾患または角膜外傷の治療に必要な角膜を対象とする角膜外科手術である、〔１－１〕～〔８－１〕のいずれかに記載の治療または予防方法；
〔１３－１〕　角膜疾患もしくは角膜外科手術による角膜知覚神経の傷害により生じる知覚神経障害が知覚低下である、〔１－１〕～〔１２－１〕のいずれかに記載の治療または予防方法；
〔１４－１〕　角膜疾患もしくは角膜外科手術による角膜知覚神経の傷害により生じる知覚神経障害がドライアイである、〔１－１〕～〔１２－１〕のいずれかに記載の治療または予防方法；
〔１５－１〕　点眼投与する、〔１－１〕～〔１４－１〕のいずれかに記載の治療または予防方法；
〔１６－１〕　式（１）で表される化合物またはその薬学上許容される塩を、必要とする対象に投与することを含む、角膜知覚神経の再生促進方法；
〔１７－１〕　角膜疾患もしくは角膜外科手術による知覚神経障害を治療または予防するための、〔１６－１〕に記載の再生促進方法；
〔１８－１〕　角膜疾患もしくは角膜外科手術による知覚神経障害が知覚低下である、〔１７－１］に記載の再生促進方法；
〔１９－１〕　角膜疾患もしくは角膜外科手術による知覚神経障害がドライアイである、〔１７－１〕に記載の再生促進方法；　
〔２０－１〕　点眼投与する、〔１６－１〕～〔１９－１〕のいずれかに記載の再生促進方法
に関する。
　更に、本発明は、
〔１－２〕　角膜疾患もしくは角膜外科手術による知覚神経障害の治療または予防剤を製造するための、式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 （式中、Ｒ１は水素原子、カルボキシル基またはアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ２は水素原子、水酸基またはアシルオキシ基を表し、Ｒ３は水素原子、カルボキシル基またはアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ４は水素原子、水酸基またはアシルオキシ基を表す。）
で表される化合物またはその薬学上許容される塩の使用；
〔２－２〕　式（１）において、Ｒ１は水素原子またはカルボキシル基を表し、Ｒ２は水素原子または水酸基を表し、Ｒ３は水素原子またはカルボキシル基を表し、Ｒ４は水素原子または水酸基を表す、〔１－２〕に記載の使用；
〔３－２〕　式（１）において、Ｒ２またはＲ４のうち少なくとも一方が水酸基を表す、〔１－２〕または〔２－２〕に記載の使用；
〔４－２〕　式（１）において、Ｒ２が水酸基を表す、〔３－２〕に記載の使用；
〔５－２〕　式（１）において、Ｒ２およびＲ４が水酸基を表す、〔３－２〕に記載の使用；
〔６－２〕　式（１）において、Ｒ１またはＲ３のうち少なくとも一方がカルボキシル基を表す、〔１－２〕～〔５－２〕のいずれかに記載の使用；
〔７－２〕　式（１）において、Ｒ３がカルボキシル基を表す、〔６－２〕に記載の使用；
〔８－２〕　式（１）において、Ｒ１およびＲ３がカルボキシル基を表し、Ｒ２およびＲ４が水酸基を表す、〔１－２〕に記載の使用；
〔９－２〕　角膜疾患が角膜炎、角膜白斑、角膜感染症、角膜変性症、角膜ジストロフィ、角膜実質ジストロフィ、水疱性角膜症、円錐角膜症、角膜内皮代償不全、角膜潰瘍、神経麻痺性角膜症、糖尿病性角膜症、角膜化学症、もしくは熱症である、〔１－２〕～〔８－２〕のいずれかに記載の使用；
〔１０－２〕　角膜外科手術が角膜移植である、〔１－２〕～〔８－２〕のいずれかに記載の使用；
〔１１－２〕　角膜外科手術が近視矯正手術である、〔１－２〕～〔８－２〕のいずれかに記載の使用；
〔１２－２〕　角膜外科手術が眼疾患または角膜外傷の治療に必要な角膜を対象とする角膜外科手術である、〔１－２〕～〔８－２〕のいずれかに記載の使用；
〔１３－２〕　角膜疾患もしくは角膜外科手術による角膜知覚神経の傷害により生じる知覚神経障害が知覚低下である、〔１－２〕～〔１２－２〕のいずれかに記載の使用；
〔１４－２〕　角膜疾患もしくは角膜外科手術による角膜知覚神経の傷害により生じる知覚神経障害がドライアイである、〔１－２〕～〔１２－２〕のいずれかに記載の使用；
〔１５－２〕　治療または予防剤が点眼剤の形態にある、〔１－２〕～〔１４－２〕のいずれかに記載の使用；
〔１６－２〕　角膜知覚神経の再生促進剤を製造するための、式（１）で表される化合物またはその薬学上許容される塩の使用；
〔１７－２〕　角膜疾患もしくは角膜外科手術による知覚神経障害を治療または予防するための再生促進剤である、〔１６－２〕に記載の使用；
〔１８－２〕　角膜疾患もしくは角膜外科手術による知覚神経障害が知覚低下である、〔１７－２］に記載の使用；
〔１９－２〕　角膜疾患もしくは角膜外科手術による知覚神経障害がドライアイである、〔１７－２〕に記載の使用；
〔２０－２〕　治療または予防剤が点眼剤の形態にある、〔１６－２〕～〔１９－２〕のいずれかに記載の使用
に関する。
　本発明により、セマフォリン３Ａ阻害活性を有するキサントン化合物を有効成分とする薬剤を用いることにより、角膜疾患もしくは角膜外科手術による知覚神経障害の治療または予防を行うことが可能になった。すなわち、角膜疾患が原因で生じる知覚神経障害、角膜移植、近視矯正手術、眼疾患または角膜外傷の治療に必要な角膜を対象とする角膜外科手術などの角膜外科手術が原因で生じる知覚神経障害、特に、角膜疾患もしくは角膜外科手術による角膜知覚神経の傷害により生じる知覚神経障害の治療または予防が、本発明により、可能となった。また、本発明により、キサントン化合物は角膜知覚神経の再生促進剤として有効に使用することができ、角膜疾患もしくは角膜外科手術による角膜知覚神経の傷害により生じる知覚神経障害を治療または予防するために再生促進剤として使用できることが明らかとなった。
　更に、本発明で用いるキサントン化合物は、リン酸緩衝液などの水溶液中において化学的に極めて安定である。角膜疾患もしくは角膜外科手術による知覚神経障害の治療または予防に、あるいは再生促進剤として使用する際には、点眼投与が最も好ましく、それ故に、本発明で用いるキサントン化合物は、点眼投与により涙液中または角膜中で安定であるため、極めて好ましいことが明らかとなった。
図１は、実施例１において、角膜移植により移植した角膜すなわち角膜グラフトの内で再生した神経線維の長さを測定した結果を示す図である〔Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔ、対照群との比較、＊：ｐ＜０．０１〕。縦軸は、その再生線維の長さの合計を意味する。横軸にビナキサントン（ＳＰＦ－３０５９－５）投与群と、対照群（薬剤を含まない溶媒のみを投与）を表す。図１より、ビナキサントンの投与により、角膜グラフト内への神経線維の再生が促進されたことが判る。 図２は、実施例１において、再生神経の機能評価として、Ｃｏｃｈｅｔ－Ｂｏｎｎｅｔ角膜知覚計を用いて、術後1週毎に角膜グラフト中央部における角膜知覚を測定した結果を示す図である〔マン・ホイットニーのＵ検定、対照群との比較、＊：ｐ＜０．０１〕。縦軸は、角膜が知覚できる力の強さを意味する。横軸は移植から１週後、２週後および３週後の結果を表す。図２中、黒丸（●）はビナキサントン投与群を表し、白丸（○）は薬剤を含まない溶媒のみを投与した対照群を表す。図２より、ビナキサントンの投与により、角膜知覚が改善されたことが判る。角膜知覚が改善されたことにより、実施例１における再生神経は主に角膜知覚神経であったことが判る。 図３は、実施例１において、移植した角膜グラフト内で新生した血管数を測定した結果を示す図である〔Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔ、対照群との比較で有意差なし〕。縦軸は、その新生血管の長さの合計を意味する。横軸にビナキサントン（ＳＰＦ－３０５９－５）投与群と、対照群（薬剤を含まない溶媒のみを投与）を表す。図３より、ビナキサントンの投与により、角膜グラフト内への血管の新生は促進されなかったことが判る。 図４は、実施例２においてビナキサントン投与液の濃度が０．５ｍｇ／ｍＬである場合の、点眼投与後のビナキサントンの角膜における滞留性を測定した結果を示す図である。点線は、インビトロ実験で得られたＩＣ５０値（７５ｎｇ／ｍＬ＝１３０ｎＭ）を示す。縦軸は、滞留濃度（ｎｇ／ｇ）を意味する。横軸の番号としては、０．５が投与０．５時間後の滞留性を表し、２が投与２時間後の滞留性を表し、６が投与後６時間の滞留性を表す。図３より、０．５ｍｇ／ｍＬで点眼投与されたビナキサントンが、薬効発現に必要と考えられる角膜中濃度で投与後０．５時間は滞留したことが判る。 図５は、図４と同様に、実施例２においてビナキサントン投与液の濃度が１．５ｍｇ／ｍＬである場合の、点眼投与後のビナキサントンの角膜における滞留性を測定した結果を示す図である。 図６は、図４と同様に、実施例２においてビナキサントン投与液の濃度が５．０ｍｇ／ｍＬである場合の、点眼投与後のビナキサントンの角膜における滞留性を測定した結果を示す図である。 図７は、実施例１０において、キサントン化合物のＰＢＳ（リン酸緩衝液）中における安定性を測定した結果を示す図である。横軸に、測定に用いた各化合物の名称を示す。縦軸は、各化合物の残存率を意味する。図７より、式（１）に含まれないキサントン化合物は何れもほぼ全量が分解したのに対し、式（１）に含まれるキサントン化合物は何れも９０％以上の残存率を示したことが判る。 図８は、実施例１１において、ビナキサントン（ＳＰＦ－３０５９－５）およびＳＰＦ－３０５９－１のＰＢＳ（リン酸緩衝液）中における安定性の経時変化を測定した結果を示す図である。横軸は、溶解からの保存日数を意味する。縦軸は、各化合物の残存率を意味する。図８中、黒三角（▲）は、ビナキサントンの安定性の経時変化を表し、黒丸（●）はＳＰＦ－３０５９－１の安定性の経時変化を表す。図８より、ＳＰＦ－３０５９－１は約１週間でほぼ全量が分解したのに対し、ビナキサントンは３７℃、ＰＢＳ中において４週間後まで９６％以上が残存し、４週間以上の安定を示したことが判る。
　本願明細書において、「アルコキシカルボニル基」とは、炭素数２～７の直鎖もしくは分枝のアルコキシカルボニル基を表し、具体的には、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、１－メチルエトキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、１－メチルプロポキシカルボニル基、２－メチルプロポキシカルボニル基、１，１－ジメチルエトキシカルボニル基、ペンチルオキシカルボニル基、ヘキシルオキシカルボニル基などを例示することができる。
　「アシルオキシ基」とは、炭素数２～６の直鎖もしくは分枝のアシルオキシ基を表し、具体的には、アセトキシ基、プロピオニルオキシ基、ブチリルオキシ基、イソブチリルオキシ基、バレリルオキシ基、イソバレリルオキシ基、ピバロイルオキシ基などを例示することができる。
　「薬学上許容される塩」とは、医薬的または獣医学的に許容される塩を表し、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩などの無機塩基塩や、トリエチルアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、ピリジニウム塩、ジイソプロピルアンモニウム塩などの有機塩基塩や、アルギニン、リジンなどの塩基性アミノ酸塩などが挙げられる。また、例えば式（１）で表される化合物が二つのカルボキシル基を有する場合には、一ナトリウム・一カリウム塩という塩なども挙げられる。
　「角膜疾患による知覚神経障害」の「角膜疾患」としては、角膜炎、角膜白斑（角膜ヘルペス、麻疹、梅毒、外傷による）、角膜感染症、角膜変性症、角膜ジストロフィ、角膜実質ジストロフィ、水疱性角膜症、円錐角膜症、角膜内皮代償不全、角膜潰瘍、神経麻痺性角膜症、糖尿病性角膜症、角膜化学症（薬品などが眼に入ったことによる）、熱症などが挙げられる。
　「角膜外科手術による知覚神経障害」の「角膜外科手術」としては、角膜移植、近視矯正手術、および眼疾患もしくは角膜外傷の治療に必要な角膜を対象とする角膜外科手術が挙げられる。
　「角膜移植」は、角膜移植術または角膜形成術とも言うが、全層角膜移植術、表層角膜移植術、深層表層角膜移植術、強角膜移植術、強膜移植術、角膜輪部移植術、および羊膜移植術が挙げられる。角膜移植の目的としては、光学的な目的、治療的な目的、整形的な目的、および美容的な目的などが挙げられる。具体的には、角膜炎、角膜白斑（角膜ヘルペス、麻疹、梅毒、外傷による）、角膜感染症、角膜変性症、角膜ジストロフィ、角膜実質ジストロフィ、水疱性角膜症（眼内レンズ挿入眼、フックス角膜内皮ジストロフィ、無水晶体眼）、円錐角膜症、角膜内皮代償不全などの疾患が原因である角膜移植や、角膜潰瘍（細菌性、真菌性、ウイルス性、無菌性）などの感染症が原因である角膜移植や、外傷が原因である角膜移植や、角膜化学症や熱症が原因である角膜移植、糖尿病性角膜症などの神経栄養性角膜症が原因である角膜移植などが挙げられる。
　「近視矯正手術」は、具体的には現在のところ、放射状角膜切開術（Ｒａｄｉａｌ　Ｋｅｒａｔｏｔｏｍｙ，ＲＫ）、ピーアールケー（Ｐｈｏｔｏｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ　Ｋｅｒａｔｅｃｔｏｍｙ，ＰＲＫ）、レーシック（Ｌａｓｅｒ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　Ｋｅｒａｔｏｍｉｌｅｕｓｉｓ，ＬＡＳＩＫ）などが挙げられる。また、ラセック（ＬＡＳＥＫ）、角膜内リング、角膜内レンズ、有水晶体眼内レンズ、オルソケラトロジーなどの近視矯正法も、近視矯正手術に含まれる。
　「眼疾患または角膜外傷の治療に必要な角膜を対象とする角膜外科手術」の「眼疾患」としては、角膜炎、角膜ヘルペス、円錐角膜、角膜変性症、角膜白斑、水疱性角膜症、角膜軟化症、白内障などが挙げられる。
　「眼疾患または角膜外傷の治療に必要な角膜を対象とする角膜外科手術」の「角膜外傷」としては、刺激性の液体が目に入る、固形物が飛んできて目に入る、刃物で切る、物で突き刺す、ペットに引っかかれる、コンタクトレンズの不適切な使用、強い光線、打撲などが受傷の原因として挙げられる。
　「眼疾患または角膜外傷の治療に必要な角膜を対象とする角膜外科手術」の「角膜外科手術」としては、角膜切開術、角膜切除、角膜屈折矯正手術、角膜矯正術、角膜曲率形成術が挙げられる。また眼疾患が白内障である場合には、その治療に必要な角膜を対象とする外科手術として、人工レンズ（人工水晶体）の挿入手術も含まれる。
　「角膜疾患または角膜外科手術による知覚神経障害」の「知覚神経障害」としては、触覚、痛覚などの知覚低下が挙げられる。知覚低下により瞬き反射が欠如し、ドライアイ、眼球の損傷などの原因となる。よって、「知覚神経障害」にはドライアイも含まれる。尚、この「知覚神経」とは、角膜に分布する知覚神経を意味し、角膜内を走行する三叉神経（角膜内を走行する眼神経）と同義であり、すなわち角膜知覚神経とも同義である。
　「角膜知覚神経の再生促進剤」とは、角膜知覚神経の再生促進作用を有する薬剤を言い、「角膜知覚神経の再生促進作用」とは、角膜外科手術などにより切断されあるいは傷害された角膜知覚神経の再生を促進する作用を言う。
　式（１）で表される化合物において、Ｒ１およびＲ３は、各々独立して、水素原子、カルボキシル基またはアルコキシカルボニル基を表し、アルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基などの炭素数２～４のアルコキシカルボニル基が好ましく、中でもメトキシカルボニル基がより好ましい。Ｒ１としては、水素原子またはカルボキシル基が好ましく、中でもカルボキシル基がより好ましい。Ｒ３としては、水素原子またはカルボキシル基が好ましく、中でもカルボキシル基がより好ましい。
　Ｒ２およびＲ４は、各々独立して、水素原子、水酸基またはアシルオキシ基を表し、アシルオキシ基としては、アセトキシ基、プロピオニルオキシ基、ブチリルオキシ基、イソブチリルオキシ基などの炭素数２～４のアシルオキシ基が好ましく、中でもアセトキシ基がより好ましい。Ｒ２としては、水素原子または水酸基が好ましく、中でも水酸基がより好ましい。Ｒ４としては、水素原子または水酸基が好ましく、中でも水酸基がより好ましい。
　式（１）で表される化合物としては、具体的には、Ｒ１がカルボキシル基でありＲ２が水酸基でありＲ３が水素原子でありＲ４が水酸基であるＳＰＦ－３０５９－２、Ｒ１がカルボキシル基でありＲ２が水酸基でありＲ３がカルボキシル基でありＲ４が水素原子であるＳＰＦ－３０５９－４、Ｒ１がカルボキシル基でありＲ２が水酸基でありＲ３がカルボキシル基でありＲ４が水酸基であるＳＰＦ－３０５９－５、Ｒ１がカルボキシル基でありＲ２が水素原子でありＲ３がカルボキシル基でありＲ４が水酸基であるＳＰＦ－３０５９－１２、Ｒ１が水素原子でありＲ２が水酸基でありＲ３がカルボキシル基でありＲ４が水酸基であるＳＰＦ－３０５９－２４、Ｒ１が水素原子でありＲ２が水酸基でありＲ３がカルボキシル基でありＲ４が水素原子であるＳＰＦ－３０５９－２５、およびＲ１が水素原子でありＲ２が水酸基でありＲ３が水素原子でありＲ４が水酸基であるＳＰＦ－３０５９－２６が挙げられ、中でもＳＰＦ－３０５９－５が最も好ましい。ＳＰＦ－３０５９－５は、ビナキサントンとも呼ばれる。
　式（１）で表される化合物の薬学上許容される塩については、水への溶解性が向上することや溶液のｐＨを調整する必要がなくなることから、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩が好ましく、中でもナトリウム塩が最も好ましい。
　式（１）で表される化合物は、ペニシリウム・エスピー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｓｐ．）ＳＰＦ－３０５９株の培養、化学的な全合成、または本培養もしくは全合成によって得られた物を原料に用いた公知の合成方法による化学的な変換によって、得ることができる。
　すなわち、培養としては、大阪府内土壌より分離したペニシリウム属に属するカビＳＰＦ－３０５９株［本菌株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づき、２００１年７月１３日に経済産業省独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５－８５６６茨城県つくば市東１－１－１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－７６６３として寄託されている。］を培養することにより効果的に得ることができる。具体的には、国際公開第０２／０９７５６号パンフレット（前記の特許文献１）または国際公開第０３／０６２２４３号パンフレット（前記の特許文献２）に記載された方法に従って、式（１）で表される化合物を得ることができる。
　全合成としては、特開２００８－１３５３０号公報に記載された方法に従って、式（１）で表される化合物を得ることができる。
　また、式（１）で表される化合物のうち、Ｒ１もしくはＲ３のうち少なくとも一方がアルコキシカルボニル基を表すか、またはＲ２もしくはＲ４のうち少なくとも一方がアシルオキシ基を表す化合物は、当該アルコキシカルボニル基がカルボキシル基である式（１）で表される化合物を原料に用いた公知のエステル化を行うか、および／または、当該アシルオキシ基が水酸基である式（１）で表される化合物を原料に用いた公知のアシル化を行い、化学的に変換することにより合成することが出来る。公知のエステル化またはアシル化としては、例えば、特開２００６－３３５６８３号公報または国際公開第０３／０６２４４０号パンフレット（前記の特許文献３）に記載された方法を、参照すればよい。
　さらに、式（１）で表される化合物の薬学上許容される塩は、前記のいずれかの方法で得られた式（１）で表される化合物に、水、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、エーテル等の適当な溶媒中で、塩基を作用させることによって、得ることができる。
　本発明の式（１）で表される化合物はキサントン化合物とも呼ばれる化合物であり、後述する実施例４および５で明らかにされているように、セマフォリン３Ａの神経伸長活性を阻害する作用を有する化合物である。後述する実施例２で明らかにされているように、本発明により、式（１）で表されるキサントン化合物は、マウス角膜移植モデルにおいて角膜知覚神経の再生を促進することが初めて明らかにされ、従って、角膜疾患や角膜外科手術により角膜知覚神経が傷害を受けたことなどが原因で生じる角膜知覚神経障害の治療または予防に有効である。角膜疾患もしくは角膜外科手術による角膜知覚神経の傷害により生じる知覚神経障害としては、触覚、痛覚などの知覚低下が挙げられる。知覚低下により瞬き反射が欠如し、ドライアイ、眼球の損傷などの原因となる。よって、式（１）で表されるキサントン化合物は、特に、触覚、痛覚などの知覚低下やドライアイの予防や治療に有効である。
　式（１）で表されるキサントン化合物は、後述する実施例１で明らかにされているように、角膜知覚神経の再生を促進し、従って、角膜知覚神経の再生促進剤としても有効である。角膜知覚神経の再生促進により、角膜疾患もしくは角膜外科手術による角膜知覚神経の傷害により生じる知覚神経障害を治療または予防することができる。より具体的には、角膜疾患もしくは角膜外科手術による角膜知覚神経の傷害により生じる知覚低下、ドライアイの予防や治療に有効である。
　本発明の角膜知覚神経障害の治療剤または予防剤、並びに、角膜知覚神経の再生促進剤は、式（１）で表される化合物もしくはその薬学上許容される塩を有効成分として含有するものであるが、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。
　またこれら治療剤もしくは予防剤、並びに再生促進剤は、経口的または非経口的に投与することができ、全身的投与または局所的投与のいずれも可能であり、より好ましくは非経口的に、眼部へ局所的に投与される。すなわち経口的には、通常用いられる投与形態、例えば錠剤、丸剤、粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁液などの剤型で経口的に投与することができる。非経口的には、例えば、点眼剤、眼軟膏剤、眼内注射剤、結膜下注射剤、静脈内注射用製剤（点滴剤）、筋注射剤、皮下注射剤、点鼻剤（鼻腔投与用スプレー剤）などの形態の製剤とすることができる。なかでも、点眼剤が好ましい。液体の製剤の場合には、適宜、溶液、乳化液、懸濁液などとすることができる。なかでも、例えば、リン酸緩衝液を用いた点眼用溶液が好ましい。錠剤のような固体製剤は、有効成分を乳糖、ショ糖、トウモロコシ澱粉などの通常の薬理的に許容しうる担体もしくは賦形剤、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプルピルメチルセルロースなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースナトリウムや澱粉グリコール酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸やステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、または保存剤などと、混合して調製される。非経口投与には、有効成分は水、生理食塩水、油、ブドウ糖水溶液などの生理的に許容しうる担体に溶解または懸濁し、これは補助剤として乳化剤、安定化剤、浸透圧調整用塩または緩衝剤を必要に応じて含有してもよい。点眼剤の添加物として、グリセリンや塩化ナトリウムなどの等張化剤、リン酸やクエン酸などの緩衝剤、塩酸や水酸化ナトリウムなどのｐＨ調節剤、ヒドロキシプルピルメチルセルロースやポリビニルアルコールなどの増粘剤、塩化ベンゼトニウムなどの保存剤、あるいは可溶化剤を必要に応じて含有してもよい。また、眼軟膏剤の添加剤としては、ワセリン、ポリエチレングリコール、精製ラノリン、流動パラフィン等が例示される。
　投与量及び投与回数は、投与法と患者の年齢、体重、病状等によって異なるが、病床部位に局所的に投与する方法が好ましい。また、１日あたり１回又は２回以上投与することが好ましい。２回以上投与するときは連日あるいは適当な間隔をおいて繰り返し投与することが望ましい。角膜知覚神経の再生には通常数日から数ヶ月以上の期間を要するので、その間セマフォリンの活性を抑制するために継続的に投与することが望ましい。
　投与量は、成人患者一人１回当たり有効成分の量として数百μｇ～２ｇ、好ましくは５～百ｍｇ、更に好ましくは数十ｍｇ以下を用いることができ、１日１回または数回にわけて投与することができる。投与回数を減らすために徐放性製剤を用いることができ、オスモティックポンプなどで長期間にわたって少量ずつ投与することもできる。非経口投与では、成人患者一人あたり０．１～１００ｍｇ／日、さらに好ましくは０．３～５０ｍｇ／日の投与量が挙げられ、１日１回または数回に分けて投与することができる。投与回数を減らすために徐放性製剤を用いることもできる。
　点眼剤として用いる場合には、有効成分の量として、成人患者一人あたり０．０１～１０ｗ／ｖ％、好ましくは０．０５～５ｗ／ｖ％を用いることができ、症状に応じて１回量１～数滴を１日１～６回投与することが望ましい。後述する実施例２で明らかにされているように、式（１）で表わされるキサントン化合物は、点眼投与した場合の角膜滞留性が優れており、従って、点眼剤が好ましい剤形である。また、眼軟膏剤として用いる場合には、有効成分の量として、０．０１～１０ｗ／ｗ％、好ましくは０．１～５ｗ／ｗ％を用いることができ、症状に応じて１日１～６回投与することが望ましい。
　これらのいずれの投与方法においても、作用部位においてセマフォリンの活性を充分に阻害する濃度になるような投与経路、投与方法を採用することが好ましい。また、本発明の角膜疾患もしくは角膜外科手術による知覚神経障害の治療剤または予防剤、並びに、角膜知覚神経の再生促進剤は、動物薬としての利用も可能である。当該動物の中でも、哺乳類が望ましく、ヒトが最も望ましい。
　以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
　マウス角膜移植モデルにおける、ビナキサントンによる、角膜グラフトへの角膜知覚神経の再生の促進作用
　本実験には、角膜において角膜実質細胞、角膜内皮細胞および神経が、蛍光タンパク質である緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）を発現する、遺伝子改変マウス（Ｐ０－Ｃｒｅ／Ｆｌｏｘｅｄ－ＥＧＦＰマウス）を用いた。本マウスでは、一層の角膜内皮細胞を除去することで、角膜内を走行する角膜知覚神経線維を容易に観察することができる。
　本マウスに、同系の野生型マウス角膜を移植し、ビナキサントン（リンデロン（１ｍｇ／ｍｌリン酸ベタメタゾンナトリウム注射液）にて０．１ｍｇ／ｍＬに溶解したもの）５０ｕｌを結膜下注射にて手術直後およびその後2日毎に合計１１回投与した。対照群には薬剤を含まない溶媒のみを同量投与した。抜糸は術後１週間で行った。術後3週間、角膜知覚を評価した後、安楽死させ、眼球を摘出し、角膜グラフト内への神経線維の再生を比較した。角膜知覚の評価は、Ｃｏｃｈｅｔ－Ｂｏｎｎｅｔ角膜知覚計を用いて、術後1週毎に角膜グラフト中央部における角膜知覚を測定した。角膜グラフト内への神経線維の再生の比較は、β３チューブリン抗体を用いた免疫染色により、β３チューブリンとＧＦＰが二重陽性である角膜グラフト内の線維を再生神経線維とし、コンピューターの画像ソフトによりトレースし、その長さの合計を計測、ビナキサントン投与群と対照群で比較した。
　図１の結果から、ビナキサントン投与群では、対照群と比較して、角膜グラフト内への神経線維の再生が、有意に促進された。
　また図２の結果から、術後３週では、ビナキサントン投与群は、対照群と比較して、有意に瞬き反射の改善が認められ、角膜知覚が改善したことが判った。このことから、図１で見られた再生神経は主に角膜知覚神経であることが示唆された。
　また、角膜への血管新生について、ＣＤ３１抗体を用いた免疫染色による陽性線維を新生血管とし、コンピューターの画像ソフトによりトレースし、その長さの合計を計測、ビナキサントン投与群と対照群で比較した。
　図３の結果から、ビナキサントン投与群では、対照群と比較して、角膜グラフト内への血管の新生は促進されなかった。
　これらの結果より、ビナキサントンは、切断された角膜知覚神経の再生を促進し、またその神経機能すなわち角膜知覚の回復も促進する。さらに有害事象である角膜への血管新生は促進しないことが、明らかとなった。
　ビナキサントン製剤の角膜組織滞留性評価
　ウサギ（Ｋｂｓ：ＪＷ，健康，オス，体重２．００－２．４９ｋｇ）に、ビナキサントンのＰＢＳ溶液（０．１２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４））（０．５，１．５および５．０ｍｇ／ｍＬ）各５０μLを右眼角膜上に点眼投与し、３０秒間閉眼させた。投与後０．５、２および６時間後に安楽死させ、摘出した眼球を生理食塩水で洗浄後、眼球から角膜を採取した。角膜をホモジナイズし、ビナキサントンを抽出し、ＨＰＬＣを用いて、角膜における経時的なビナキサントンの組織内含有量・濃度を調べた。
　図４、図５および図６の結果から、ビナキサントンは投与濃度・投与量依存的に角膜組織内へ移行していることが確認された。５．０ｍｇ／ｍＬ溶液の投与群においては、投与６時間後においても、角膜中に、インビトロ実験（実施例４のＳｅｍａ３Ａのコラプス活性に対する阻害活性の実験）より得られているＩＣ５０値（７５ｎｇ／ｍＬ＝１３０ｎＭ、各図中点線で示した）を超える量で、滞留していることが、認められた。点眼投与によっても、ビナキサントンによる薬効発現に必要と考えられる角膜中濃度が得られることが明らかとなった。
　この結果、ビナキサントンの投与法として、点眼投与が現実的であることが示唆された。
　式（１）で表わされるキサントン化合物の製造
　本発明の式（１）で表わされるキサントン化合物は、いずれも公知化合物であり、国際公開第０２／０９７５６号パンフレット（前記の特許文献１）、国際公開第０３／０６２２４３号パンフレット（前記の特許文献２）、国際公開第０３／０６２４４０号パンフレット（前記の特許文献３）、特開２００６－３３５６８３号公報、および特開２００８－１３５３０号公報に開示されており、ＳＰＦ－３０５９株の培養、化学的な全合成、または化学的な変換によって、得ることができる。製造方法に加え、物理化学的性質についても、これらの特許文献に記載されている。具体的には、次の通りである。
　グルコース２％、ショ糖５％、綿実粉２％、硝酸ナトリウム０．１％、Ｌ－ヒスチジン０．１％、リン酸２カリウム０．０５％、塩化カリウム０．０７％、硫酸マグネシウム７水和物０．００１４％を含み、ｐＨ７．０に調整した培地１０ｍｌを５０ｍｌ容の三角フラスコに分注しオートクレーブで滅菌した。これに斜面培養したペニシリウム・エスピーＳＰＦ－３０５９株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－７６６３）を１白金耳接種し、２７℃、１８０ｒｐｍにて４日間回転振盪培養して前々培養とした。５００ｍｌ容三角フラスコ５本に上記と同じ組成の培地を１２５ｍｌずつ分注しオートクレーブで滅菌した後、上記の前々培養液を４ｍｌずつ添加し、２７℃、１８０ｒｐｍにて４日間回転振盪培養して前培養とした。５０リットル容ジャーファーメンターに、グルコース１．４３％、ショ糖３．５７％、綿実粉１．４３％、硝酸ナトリウム０．０７％、Ｌ－ヒスチジン０．０７％、リン酸２カリウム０．０３６％、塩化カリウム０．０５％、硫酸マグネシウム７水和物０．００１％、アデカノールＬＧ－２９５Ｓ（旭電化製消泡剤）０．０１％を含み、ｐＨ７．０に調整した培地を３０リットル分注し、高圧蒸気滅菌（１２１℃、２０分）した後、上記の前培養液を５００ｍｌ添加し、２７℃、４００ｒｐｍ、通気量１５リットル／分にて９日間通気攪拌培養した。
　培養終了後、培養液を１０，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して上清液と菌体に分離し、上清液画分を２０リットルの酢酸エチル－蟻酸（９９：１）で２回抽出した。菌体画分は３０リットルのアセトンで抽出し、濾過、濃縮後、水溶液となったところで１０リットルの酢酸エチル－蟻酸（９９：１）で抽出した。両抽出液を混合し、減圧濃縮して粗抽出物２２４ｇを得た。粗抽出物１００ｇを５００ｍｌのメタノールに溶解し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）ＬＨ－２０（ＧＥヘルスケア社）を用いるカラムクロマトグラフィーに付し、メタノールで溶出した。活性画分を集め、溶媒を減圧留去し、油状物４８．８ｇを得た。これを４００ｍｌのメタノールに溶解し、ＴＳＫｇｅｌ　ＴＯＹＯＰＥＲＬ　ＨＷ－４０Ｆ（東ソー）を用いるカラムクロマトグラフィーに付し、メタノールで溶出した。活性画分を集め、溶媒を減圧留去し、粗精製物２１．８ｇを得た。これを２００ｍｇずつ２ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、分取逆相ＨＰＬＣに付した。分取逆相ＨＰＬＣの条件は、カラム：Ｗａｋｏｐａｋ－Ｗａｋｏｓｉｌ（登録商標）－ＩＩ５Ｃ１８ＨＧｐｒｅｐ（φ５×１０ｃｍとφ５×２５ｃｍを連結、和光純薬工業製）、溶出液Ａ：１％蟻酸水溶液、溶出液Ｂ：メタノール、グラジエント：Ｂ液割合４５％から７５％へ２時間の直線的グラジエント、流速：２５ｍｌ／分、検出：２６０ｎｍにおける吸光度、とし、溶出液を１分ずつ分取した。
　上記分取した画分を分析用ＨＰＬＣで分析した。分析用ＨＰＬＣの条件は、カラム：Ｗａｋｏｐａｋ－Ｗａｋｏｓｉｌ（登録商標）－ＩＩ５Ｃ１８ＲＳ（φ４．６×１５０ｍｍ、和光純薬工業製）、溶出液Ａ：１％蟻酸水溶液、溶出液Ｂ：メタノール、グラジエント：Ｂ液割合２０％から６７％へ７１．１分間の直線的グラジエント、流速：１．３ｍｌ／分、検出：２６０ｎｍにおける吸光度、とした。この分析用ＨＰＬＣにおける保持時間を指標に分取用ＨＰＬＣの溶出画分を集め、減圧下に溶媒を留去した後、再度分取用ＨＰＬＣに付して上記と同様に精製し、さらにＴＳＫｇｅｌ　ＴＯＹＯＰＥＲＬ　ＨＷ－４０Ｆ（東ソー）を用いるカラムクロマトグラフィーに付して上記と同様に精製し、溶媒を減圧留去、乾燥することにより、目的の化合物の精製品を得た。
　具体的に得られた化合物と、その物理化学的性状は、次の通り。
ＳＰＦ－３０５９－２
・外観：クリーム色粉末
・高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ－ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：実測値：５３３．０７１０、計算値：５３３．０７２１
・分子式：Ｃ２７Ｈ１６Ｏ１２
・紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：２０９（４０，６００）、２３６（４２，６００）、２８３（２８，５００）、３２３（２５，４００）
・赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ-1：３２６６、１６７８、１６５４、１６２３、１５６２、１４７１、１２９６
・１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δｐｐｍ：２．５３（６Ｈ，ｓ）、６．９３（１Ｈ，ｓ）、６．９５（１Ｈ，ｓ）、７．４７（１Ｈ，ｓ）、８．１５（１Ｈ，ｓ）、８．５４（１Ｈ，ｓ）、９．３８（１Ｈ，ｂｒｓ）、９．８９（１Ｈ，ｂｒｓ）、１０．７８（１Ｈ，ｂｒｓ）、１１．３７（１Ｈ，ｂｒｓ）、１２．６８（１Ｈ，ｂｒｓ）
・１３Ｃ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δｐｐｍ：２９．１、３２．１、１０２．３、１０３．１、１０８．７、１１２．５、１１３．５、１１９．６、１１９．８、１２０．９、１２６．２、１３２．４、１３３．６、１３６．１、１４１．７、１４４．５、１５０．７１、１５０．７４、１５２．４９、１５２．５４、１５２．７、１５４．４、１６７．４、１７２．９、１７３．４、１９９．２、２０１．２
　これらから化合物ＳＰＦ－３０５９－２の構造式を次式（２）と決定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
ＳＰＦ－３０５９－４
・外観：クリーム色粉末
・分子量：５６０
・分子式：Ｃ２８Ｈ１６Ｏ１３
・高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ－ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５６１（Ｍ＋Ｈ）＋
・高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ－ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５５９（Ｍ－Ｈ）－
・高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ－ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：実測値：５６１．０６６７、計算値：５６１．０６７０（Ｃ２８Ｈ１７Ｏ１３）
・紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：２２１（３５，６００）、２５０（３８，１００）、２７６ｓｈ（２５，８００）、３２３（２４，３００）
・赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ－１：３４１２、１６６５、１６１９、１５６３、１４６５、１４２７、１２６３
・１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δｐｐｍ：２．５３（３Ｈ，ｓ）、２．５６（３Ｈ，ｓ）、６．８４（１Ｈ，ｄ，２．１）、６．９５（１Ｈ，ｓ）、６．９６（１Ｈ，ｄ，２．１）、８．１７（１Ｈ，ｓ）、８．５２（１Ｈ，ｓ）、１０．１０～１１．４０（３Ｈ，ｂｒｓ）、１２．７１（１Ｈ，ｂｒｓ）、１３．２６（１Ｈ，ｂｒｓ）
・１３Ｃ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δｐｐｍ：２９．２、３２．１、１０２．３、１０３．２、１１０．１、１１２．４、１１２．８、１１９．６、１２０．３、１２０．８、１２６．３、１３３．１、１３３．４、１３６．７、１３７．５、１４１．７、１５０．８、１５２．３、１５２．７、１５２．８、１５７．２、１６３．９、１６７．４、１６９．３、１７２．２、１７２．９、１９９．３、２０１．０
・溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
　これらからＳＰＦ－３０５９－４の構造式を次式（３）と決定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
ＳＰＦ－３０５９－５（ビナキサントン）
・外観：クリーム色粉末
・高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ－ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：実測値：５７７．０６１５、計算値：５７７．０６１９
・分子式：Ｃ２８Ｈ１６Ｏ１４
・紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：２２９（３５，８００）、２８４（２２，６００）、３２２（２１，０００）
・赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ－１：３２６０、１６８４、１６２６、１５６７、１４６７、１２８８
・１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δｐｐｍ：２．５３（３Ｈ，ｓ）、２．５５（３Ｈ，ｓ）、６．９３（１Ｈ，ｓ）、６．９６（１Ｈ，ｓ）、８．１７（１Ｈ，ｓ）、８．５３（１Ｈ，ｓ）、９．５～１３．０（６Ｈ）
・１３Ｃ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δｐｐｍ：２９．１、３２．１、１０２．２６、１０２．３２、１０９．９、１１２．４、１１９．６、１１９．８、１２０．３、１２０．９、１２６．３、１３２．５、１３３．４、１３６．２、１４１．２、１４１．７、１５０．４、１５０．８、１５２．１、１５２．６８、１５２．７３、１５４．５、１６７．４、１６７．５、１７２．５、１７２．９、１９９．１、２０１．１
　これらから化合物ＳＰＦ－３０５９－５（ビナキサントン）の構造式を次式（４）と決定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
ＳＰＦ－３０５９－１２
・外観：クリーム色粉末
・分子量：５６０
・分子式：Ｃ２８Ｈ１６Ｏ１３
・高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ－ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５６１（Ｍ＋Ｈ）＋
・高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ－ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５５９（Ｍ－Ｈ）－
・高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ－ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：実測値：５６１．０６８０、計算値：５６１．０６７０（Ｃ２８Ｈ１７Ｏ１３）
・紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：２３２（３７，４００）、２５０ｓｈ（３４，８００）、２８５（２８，０００）、３０８ｓｈ（２３，２００）、３６０ｓｈ（９，０００）
・赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ－１：３０８０、１６９８、１６０８、１４６８、１２９１
・１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δｐｐｍ：２．５４（３Ｈ，ｓ）、２．５５（３Ｈ，ｓ）、６．８２（１Ｈ，ｄ，２．１）、６．８７（１Ｈ，ｓ）、６．９５（１Ｈ，ｄ，２．１）、８．２２（１Ｈ，ｓ）、８．５５（１Ｈ，ｓ）、９．５０～１３．５０（５Ｈ，ｂｒｓ）
・１３Ｃ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δｐｐｍ：２９．１、３２．２、１０２．１、１０３．０、１０９．４、１１２．１、１１３．５、１１９．８、１２０．０、１２１．７、１２６．６、１３２．０、１３３．３、１３５．９、１３６．７、１４１．７、１５０．６、１５２．１、１５３．０、１５５．４、１５７．６、１６２．４、１６７．４、１６７．６、１７２．２、１７２．９、１９９．１、２０１．１
・溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
　これらからＳＰＦ－３０５９－１２の構造式を次式（５）と決定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
ＳＰＦ－３０５９－２４
・外観：クリーム色粉末
・分子量：５３２
・分子式：Ｃ２７Ｈ１６Ｏ１２
・高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ－ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５３３（Ｍ＋Ｈ）＋
・高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ－ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５３１（Ｍ－Ｈ）－
・高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ－ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：実測値：５３１．０６２１、計算値：５３１．０５６４（Ｃ２７Ｈ１７Ｏ１２）
・紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：２１２（３６，９００）、２２９ｓｈ（３４，５００）、２８３（２６，３００）、３２３（２１，７００）
・赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ－１：３４４７、１６９７、１６２９、１５７８、１４７０、１２９０
・１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δｐｐｍ：２．５２（３Ｈ，ｓ）、２．５４（３Ｈ，ｓ）、６．９２（１Ｈ，ｓ）、６．９３（１Ｈ，ｓ）、７．２８（１Ｈ，ｓ）、８．１３（１Ｈ，ｓ）、８．５４（１Ｈ，ｓ）、９．５０～１３．００（５Ｈ，ｂｒｓ）
・１３Ｃ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δｐｐｍ：２９．１、３２．３、１０２．３、１０２．９、１０７．９、１１０．０、１１５．８、１１９．８、１２０．４、１２０．７、１２６．５、１３３．０、１３３．３、１３６．０、１４１．２、１４５．０、１５０．４、１５１．１、１５２．２、１５２．９、１５３．０、１５４．３、１６７．５、１７２．６、１７３．６、１９９．１、２０１．１
・溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
　これらからＳＰＦ－３０５９－２４の構造式を次式（６）と決定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
ＳＰＦ－３０５９－２５
・外観：クリーム色粉末
・分子式：Ｃ２７Ｈ１６Ｏ１１
・高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ－ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５１７（Ｍ＋Ｈ）＋
・高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ－ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５１５（Ｍ－Ｈ）－
・高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ－ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：実測値：５１７．０７７８、計算値：５１７．０７７１（Ｃ２７Ｈ１７Ｏ１１）
・紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：２１５（３５，０００）、２５３（３５，１００）、２７６ｓｈ（２５，２００）、３２３（２３，４００）
・赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ－１：３４１７、１６９１、１６２５、１４７１、１２９３
・１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δｐｐｍ：２．５４（６Ｈ，ｓ）、６．８２（１Ｈ，ｂｒｓ）、６．９２（２Ｈ，ｂｒｓ）、７．２７（１Ｈ，ｓ）、８．１４（１Ｈ，ｓ）、８．５３（１Ｈ，ｓ）、９．５～１４．０（４Ｈ，ｂｒｓ）
・１３Ｃ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δｐｐｍ：２９．２、３２．３、１０２．９、１０３．０、１０７．８、１０９．９、１１３．０、１１５．７、１２０．４、１２０．６、１２６．４、１３３．３、１３３．４、１３６．４（２ｃ）、１４５．０、１５１．２、１５２．３、１５２．９８、１５３．０１、１５７．３、１６４．２、１６９．４、１７２．６、１７３．６、１９９．２、２０１．０
・溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
　これらからＳＰＦ－３０５９－２５の構造式を次式（７）と決定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
ＳＰＦ－３０５９－２６
・外観：クリーム色粉末
・分子量：４８８
・分子式：Ｃ２６Ｈ１６Ｏ１０
・高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ－ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：４８９（Ｍ＋Ｈ）＋
・高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ－ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：４８７（Ｍ－Ｈ）－
・高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ－ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：実測値：４８９．０８２３、計算値：４８９．０８２２（Ｃ２６Ｈ１７Ｏ１０）
・紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：２１２（３１，５００）、２３５（３０，９００）、２８４（２３，９００）、３２４（１９，５００）
・赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ－１：３４５４、１６９４、１６２５、１５１７、１４７１、１２９３
・１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δｐｐｍ：２．５３（３Ｈ，ｓ）、２．５４（３Ｈ，ｓ）、６．９１（１Ｈ，ｓ）、６．９２（１Ｈ，ｓ）、７．２７（１Ｈ，ｓ）、７．４７（１Ｈ，ｓ）、８．１１（１Ｈ，ｓ）、８．５７（１Ｈ，ｓ）
・１３Ｃ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δｐｐｍ：２９．１、３２．２、１０２．９、１０３．０、１０７．９、１０８．５、１１３．３、１１５．７、１１９．８、１２０．７、１２６．３、１３２．７、１３３．５、１３５．８、１４４．６、１４５．０、１５０．８、１５１．１、１５２．５、１５２．９（２ｃ）、１５４．７、１７３．３、１７３．６、１９９．１、２０１．２
・溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
　これらからＳＰＦ－３０５９－２６の構造式を次式（８）と決定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　Ｓｅｍａ３Ａのコラプス活性に対するキサントン化合物の阻害活性
　ポリリジンを塗布した９６ウェルプレート（住友ベークライト）にさらにラミニン塗布（２０μｇ／ｍｌのラミニン、室温１時間）を行った。各ウェルに１００μｌの培地（１０％の牛胎仔血清、２０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＦ１２培地）を入れ、ここに７日齢ニワトリ胚から摘出した後根神経節を接種し、１６～２０時間５％ＣＯ２、３７℃の条件下で培養する。その後、実施例３の各化合物を種々の濃度で培地に添加し１時間培養後、２ユニット／ｍｌのマウスセマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）を添加し、更に１時間培養した。１時間経過後、速やかに最終濃度１％になるようにグルタルアルデヒドを添加し、室温に１５分間放置して組織片を固定した後、顕微鏡下で退縮した成長円錐の割合を測定した。またＳｅｍａ３Ａを添加しないウェルを対照とした。陰性対照群（化合物、Ｓｅｍａ３Ａ共に不添加）の成長円錐退縮割合を（Ａ）％、陽性対照群（化合物不添加、Ｓｅｍａ３Ａ添加）の成長円錐退縮割合を（Ｂ）％、試験群（各化合物及びＳｅｍａ３Ａ添加）の成長円錐退縮割合を（Ｃ）％として、Ｃ＝（Ａ＋Ｂ）／２となる各化合物の濃度をＩＣ５０値とした。結果を以下に示す。この結果から、実施例３の各化合物は強くセマフォリン３Ａを阻害することがわかる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　セマフォリン３Ａの神経伸長阻害活性に対するキサントン化合物の抑制作用
　Ｓｅｍａ３Ａ発現ＣＯＳ７細胞塊と７～８日齢ニワトリ胚後根神経節のコラーゲンゲル共培養（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　４，１１６，１９９４）により、実施例３の各化合物が、Ｓｅｍａ３Ａに対する持続的阻害作用を示すかどうかを検討した。Ｓｅｍａ３Ａ発現ＣＯＳ７細胞塊は以下の方法で作製した。一夜培養したＣＯＳ７細胞（１０００００細胞／３５ｍｍ培養皿）にＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（ロッシュ）を用いて１μｇのＳｅｍａ３Ａ発現プラスミドを導入した。トランスフェクション開始２．５時間経過後、トリプシンを用いてＣＯＳ７細胞を培養皿から剥離し、遠心分離により集め、２００μｌの培地に再懸濁した。細胞懸濁液２０μｌを培養皿の蓋（内側）に載置し、この蓋を反転させ２０時間培養した（ハンギングドロップカルチャー）（Ｃｅｌｌ　７８，４２５，１９９４）。培養後、凝集したＣＯＳ７細胞（塊）を培地に回収し、０．５ｍｍ径の大きさにトリミングした。このＳｅｍａ３Ａ発現ＣＯＳ７細胞塊と上記後根神経節を０．５～１ｍｍの距離を隔てて０．２％のコラーゲンゲル内に並置し、このコラーゲンゲルを、上記化合物を種々の濃度で含む培地内で、２日間５％ＣＯ２、３７℃の条件下に培養した。その後、速やかに最終濃度が１％になるようにグルタルアルデヒドを添加し、室温に１時間放置して組織片を固定した後、顕微鏡下で神経突起伸長の様子を観察した。
　上記コラーゲンゲル内では、Ｓｅｍａ３Ａ発現プラスミドを導入したＣＯＳ７細胞塊からＳｅｍａ３Ａが分泌され濃度勾配が形成される（ＣＯＳ７細胞塊に近い方が高濃度）。被験化合物を含まない培地を用いた場合、神経突起はＳｅｍａ３Ａ濃度が高いＣＯＳ７細胞塊が存在する方向には伸長できず、反対方向のみに伸長するが、実施例３の各化合物を培地に添加した場合の、Ｓｅｍａ３Ａ発現ＣＯＳ７細胞塊方向への神経突起伸長を観測した。
　Ｓｅｍａ３Ａ非発現ＣＯＳ７細胞を用いた対照群と同様の、完全に同心円状に神経とっくが伸長している場合を＋＋＋（強いＳｅｍａ３Ａ阻害効果）、ほぼ同心円状だがＳｅｍａ３Ａ発現ＣＯＳ７細胞側への伸長がやや抑えられている場合を＋＋、半月状にＳｅｍａ３Ａ発現ＣＯＳ７細胞側への伸長がかなり抑えられている場合を＋、Ｓｅｍａ３Ａ発現ＣＯＳ７細胞側への伸長が全く無い場合を－（Ｓｅｍａ３Ａ阻害効果なし）として、測定結果を次に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
製剤例１
　１００ｍｌ中、以下の組成物を滅菌精製水中に懸濁し、涙液と等張となる濃度でｐＨ７．０に調製することにより、点眼剤を調製することができる。
　ＳＰＦ－３０５９－５　　　　　５０ｍｇ
　リン酸二水素カリウム　　　　　適量
　リン酸水素二ナトリウム　　　　適量
　食塩　　　　　　　　　　　　　適量
　塩化ベンゼトニウム　　　　　　１０ｍｇ
　滅菌精製水　　　　　　　　　　適量
製剤例２
　１００ｍｌ中、以下の組成物を滅菌精製水中に懸濁し、涙液と等張となる濃度でｐＨ７．０に調製することにより、点眼剤を調製することができる。
　ＳＰＦ－３０５９－５　　　　　５０ｍｇ
　リン酸二水素カリウム　　　　　適量
　リン酸水素二ナトリウム　　　　適量
　食塩　　　　　　　　　　　　　適量
　塩化ベンゼトニウム　　　　　　１０ｍｇ
　滅菌精製水　　　　　　　　　　適量
製剤例３
　眼軟膏剤常法に従い、次の処方で眼軟膏剤を調整することができる。
　ＳＰＦ－３０５９－５　　　　　５０ｍｇ
　流動パラフィン　　　　　　　　１０ｇ
　白色ワセリン　　　　　　　　　適量
製剤例４
　眼軟膏剤常法に従い、次の処方で眼軟膏剤を調整することができる。
　ＳＰＦ－３０５９－５　　　　　５０ｍｇ
　流動パラフィン　　　　　　　　１０ｇ
　白色ワセリン　　　　　　　　　適量
　キサントン化合物のＰＢＳ（リン酸緩衝液）中における安定性
　式（１）に含まれるキサントン化合物であるＳＰＦ－３０５９－２、ＳＰＦ－３０５９－５、ＳＰＦ－３０５９－２４およびＳＰＦ－３０５９－２６、並びに、式（１）に含まれないキサントン化合物であるＳＰＦ－３０５９－１、ＳＰＦ－３０５９－３、ＳＰＦ－３０５９－９およびＳＰＦ－３０５９－３０を１００μg/mlの濃度となるようにＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ＰＢＳ（－）、リン酸濃度１０ｍＭ）中に溶解した。（化合物ＳＰＦ－３０５９－１、ＳＰＦ－３０５９－３、ＳＰＦ－３０５９－９およびＳＰＦ－３０５９－３０の構造式、製造方法および物理化学的性質については、国際公開第０２／０９７５６号パンフレット（前記の特許文献１）に記載されている。）これらの溶解液を３７℃の条件下で保存し、４週間後のそれぞれの化合物の残存量をＨＰＬＣにより定量し残存率を求めることで、３７℃、ＰＢＳ中におけるキサントン化合物の安定性を評価した。ＨＰＬＣの条件は、カラム：Ｗａｋｏｐａｋ－Ｗａｋｏｓｉｌ（登録商標）－ＩＩ５Ｃ１８ＲＳ（φ４．６×１５０ｍｍ、和光純薬工業製）、溶出液Ａ：１％蟻酸水溶液、溶出液Ｂ：メタノール、グラジエント：Ｂ液割合３０％から７０％へ６０分間の直線的グラジエント、流速：１．０ｍｌ/分、検出：２６０ｎｍにおける吸光度、とした。
　ＰＢＳ中におけるキサントン化合物の安定性を評価した結果を、図７に示す。図７の結果から、式（１）に含まれるキサントン化合物は４種類全てが９０％以上の残存率を示した。一方、式（１）に含まれないキサントン化合物は４種類全てにおいてほぼ全量が分解した。
　ビナキサントンのＰＢＳ（リン酸緩衝液）中における安定性
　ビナキサントン（ＳＰＦ－３０５９－５）およびＳＰＦ－３０５９－１を１００μg/mlの濃度となるようにＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ＰＢＳ（－））中に溶解した。これらの溶解液を３７℃の条件下で保存し、保存開始から４週間後までの各時点において溶解液中の薬物残存量をＨＰＬＣにより定量することで残存率の経時変化を求めた。ＨＰＬＣの条件は実施例１０と同様とした。
　ＰＢＳ中におけるビナキサントン（ＳＰＦ－３０５９－５）およびＳＰＦ－３０５９－１の安定性を評価した結果を、図８に示す。図８の結果から、式（１）に含まれるキサントン化合物であるビナキサントン（ＳＰＦ－３０５９－５）は３７℃、ＰＢＳ中において４週間後まで９６％以上が残存し、４週間以上安定であることが示された。一方、ＳＰＦ－３０５９－１は約１週間でほぼ全量が分解した。
　本発明化合物の涙液中および角膜中の含量変化の検討
　角膜神経傷害に対する治療では、薬剤の点眼投与が最も好ましい。このため、薬剤の点眼投与後の涙液中および／または角膜中の薬剤含量の変化の検討は重要である。この含量変化の検討は、例えば以下の試験方法に従って、行うことができる。
［試験方法］
　本発明の式（１）で表される化合物（例えば、ＳＰＦ－３０５９－５などが挙げられる。以下、本発明化合物と略す。）、および対象化合物（式（１）に含まれない化合物。例えば、前述のＳＰＦ－３０５９－１などが挙げられる。）について、含量変化を検討する。各化合物を０．１ｍｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬの濃度となるようにＰＢＳ中に溶解する。ラットの片眼に本発明化合物溶液、対象化合物溶解液、またはＰＢＳのみを各々１０μＬに点眼投与する。投与から３０分後、２時間後、１０時間後に、ピペットにて涙液１μＬ～１０μＬを採取した後、ラットを安楽死させ眼球を摘出し、角膜を採取する。
　涙液中および／または角膜中の各化合物含量は、ＬＣ－ＭＳにて測定する。試料に０．１Ｍ　ＨＣｌを添加し、涙液に対しては攪拌、角膜に対してはホモジナイズを行なう。酢酸エチルを添加して、十分に攪拌して遠心を行い、上層を集める。下層にさらに酢酸エチルを添加して、上記操作を繰り返し、３回分の上層を集め、窒素ガスで乾燥した試料をＬＣ－ＭＳ測定に用いる。
　本発明のセマフォリン３Ａ阻害活性を有するキサントン化合物は、角膜疾患もしくは角膜外科手術が原因で生じる知覚神経障害の治療剤または予防剤として有効である。具体的には、角膜炎、角膜白斑、角膜感染症、角膜変性症、角膜ジストロフィ、角膜実質ジストロフィ、水疱性角膜症、円錐角膜症、角膜内皮代償不全、角膜潰瘍、神経麻痺性角膜症、糖尿病性角膜症、角膜化学症、熱症角膜移植などの角膜疾患が原因で角膜知覚神経の傷害により生じる知覚神経障害、角膜移植、近視矯正手術、眼疾患もしくは角膜外傷の治療に必要な角膜を対象とする角膜外科手術などの角膜外科手術が原因で角膜知覚神経の傷害により生じる知覚神経障害に対して、治療剤または予防剤として、有効に用いることができる。また、本発明のセマフォリン３Ａ阻害活性を有するキサントン化合物は、角膜知覚神経の再生促進剤として有効に用いることもできる。
　更に、本発明で用いるキサントン化合物は、リン酸緩衝液などの水溶液中において化学的に極めて安定であるため、点眼投与により涙液中または角膜中で安定であり、角膜疾患もしくは角膜外科手術が原因で生じる知覚神経障害の治療剤または予防剤として、また角膜知覚神経の再生促進剤として、極めて好ましい。

Claims (19)

  1. 　式（１）： 
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｒ１は水素原子またはカルボキシル基を表し、Ｒ２は水素原子または水酸基を表し、Ｒ３は水素原子またはカルボキシル基を表し、Ｒ４は水素原子または水酸基を表す。）
    で表される化合物またはその薬学上許容される塩を有効成分として含有する、角膜疾患もしくは角膜外科手術による知覚神経障害の治療剤または予防剤。
  2. 　式（１）において、Ｒ２またはＲ４のうち少なくとも一方が水酸基を表す、請求項１に記載の治療剤または予防剤。
  3. 　式（１）において、Ｒ２が水酸基を表す、請求項２に記載の治療剤または予防剤。
  4. 　式（１）において、Ｒ２およびＲ４が水酸基を表す、請求項２に記載の治療剤または予防剤。
  5. 　式（１）において、Ｒ１またはＲ３のうち少なくとも一方がカルボキシル基を表す、請求項１～４のいずれかに記載の治療剤または予防剤。
  6. 　式（１）において、Ｒ３がカルボキシル基を表す、請求項５に記載の治療剤または予防剤。
  7. 　式（１）において、Ｒ１およびＲ３がカルボキシル基を表し、Ｒ２およびＲ４が水酸基を表す、請求項１に記載の治療剤または予防剤。
  8. 　角膜疾患が、角膜炎、角膜白斑、角膜感染症、角膜変性症、角膜ジストロフィ、角膜実質ジストロフィ、水疱性角膜症、円錐角膜症、角膜内皮代償不全、角膜潰瘍、神経麻痺性角膜症、糖尿病性角膜症、角膜化学症、もしくは熱症である、請求項１～７のいずれかに記載の治療剤または予防剤。
  9. 　角膜外科手術が角膜移植である、請求項１～７のいずれかに記載の治療剤または予防剤。
  10. 　角膜外科手術が近視矯正手術である、請求項１～７のいずれかに記載の治療剤または予防剤。
  11. 　角膜外科手術が眼疾患または角膜外傷の治療に必要な角膜を対象とする角膜外科手術である、請求項１～７のいずれかに記載の治療剤または予防剤。
  12. 　角膜疾患もしくは角膜外科手術による角膜知覚神経の傷害により生じる知覚神経障害が知覚低下である、請求項１～１１のいずれかに記載の治療剤または予防剤。
  13. 　角膜疾患もしくは角膜外科手術による角膜知覚神経の傷害により生じる知覚神経障害がドライアイである、請求項１～１１のいずれかに記載の治療剤または予防剤。
  14. 　点眼剤の形態にある、請求項１～１３のいずれかに記載の治療剤または予防剤。
  15. 　式（１）で表される化合物またはその薬学上許容される塩を有効成分として含有する、角膜知覚神経の再生促進剤。
  16. 　角膜疾患もしくは角膜外科手術による知覚神経障害を治療または予防するための、請求項１５に記載の再生促進剤。
  17. 　角膜疾患もしくは角膜外科手術による知覚神経障害が知覚低下である、請求項１６に記載の再生促進剤。
  18. 　角膜疾患もしくは角膜外科手術による知覚神経障害がドライアイである、請求項１６に記載の再生促進剤。
  19. 　点眼剤の形態にある、請求項１５～１８のいずれかに記載の再生促進剤。
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