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WO2012168342A1 - Biopassivierende membranstabilisation mittels nitrocarbonsäuren-enthaltenden phospholipiden in zubereitungen und beschichtungen - Google Patents

Biopassivierende membranstabilisation mittels nitrocarbonsäuren-enthaltenden phospholipiden in zubereitungen und beschichtungen Download PDF

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WO2012168342A1
WO2012168342A1 PCT/EP2012/060773 EP2012060773W WO2012168342A1 WO 2012168342 A1 WO2012168342 A1 WO 2012168342A1 EP 2012060773 W EP2012060773 W EP 2012060773W WO 2012168342 A1 WO2012168342 A1 WO 2012168342A1
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WO
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acid
nitro
dinitro
cyclo
hydroxy
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Ulrich Dietz
Udo Nubbemeyer
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Original Assignee
Individual
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    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • C07F9/10—Phosphatides, e.g. lecithin

Definitions

  • the present invention relates to nitrocarboxylic acid-containing phospholipids, medical devices coated with said compounds, such as stents, catheter balloons, implants, wound inserts or surgical sutures, and biopassivant compositions, rinse solutions, impregnation solutions, coating solutions, cryoprotective solutions, cryopreservation media, lyoprotective solutions, contrast agent solutions, preservative solutions, and perfusion solutions containing these compounds and the preparation of these solutions and the coated medical devices and their uses.
  • medical devices coated with said compounds such as stents, catheter balloons, implants, wound inserts or surgical sutures, and biopassivant compositions, rinse solutions, impregnation solutions, coating solutions, cryoprotective solutions, cryopreservation media, lyoprotective solutions, contrast agent solutions, preservative solutions, and perfusion solutions containing these compounds and the preparation of these solutions and the coated medical devices and their uses.
  • Any physical, chemical or hypoxic cell alteration will result in a response of the affected cells which may cause migration, proliferation, matrix and cytokine production, apoptosis or necrosis.
  • the extent of the cell reaction depends essentially on the severity of the alteration, whereby the effects of cell alterations can be potentiated in simultaneous presence.
  • the type of cell aging is of minor importance because the cellular reaction patterns are basically the same.
  • the cellular response to alteration may be different under different conditions.
  • the willingness to mast cell degranulation increases with increased adrenergic stimulation or there is an increased mechanical fragility of erythrocytes in the presence of hypoosmolarity and cell toxins.
  • membrane proteins By dimerization, many membrane proteins first acquire their functionally active form. A such can be achieved by a translocation of the protein subunits, eg by the cytoskeleton.
  • the membrane conductivity has a considerable influence on the translocation of membrane proteins.
  • the physical properties of cell membranes cause the conformation of membrane proteins and thus their functionality.
  • the physical cell membrane properties are essentially due to hydrophobic alternating forces of the alkyl chains of the membrane phospholipids.
  • the physical membrane properties are, however, also by physiologically interponêt Arthur molecules, or nonspecific and transient by physiosorbed molecules such as fatty acids changed.
  • the magnitude of potentiating alteration mechanisms is virtually unpredictable, but crucial to the on-going repair and healing process.
  • the repair mechanisms can take on an unphysiological scale if significantly more cells or matrix proteins are formed than are needed to stabilize a defect.
  • the result is connective tissue growth (eg fibrosis, capsule formation, celloid), which leads to a functional impairment of the tissue / organ / body part or causes cosmetic / esthetic problems.
  • Of prime importance are cell alterations caused by contact with non-cellular foreign materials.
  • Percutaneous transluminal balloon angioplasty of arterial stenoses leads to a barotrauma of the cells of the affected vessel wall and to a rupture of vessel wall structures.
  • a large wound surface that is in direct contact with blood is generated.
  • the consequence is rapid attachment of plasma proteins and subsequently of platelets.
  • the extent of this aggregate formation causes the secretion of cytokines that stimulate vascular cell proliferation as well as enhance thrombus formation.
  • the latter condition can lead to a closure thrombosis in the treated vessel section.
  • similar mechanisms are found after implantation of a vascular stent.
  • stents and catheter balloons have been coated with antiproliferative agents, such as paclitaxel and rapamycin, to inhibit stent-associated cell proliferation. These agents are released spontaneously over a longer period from the stent strut coating. Due to the dense contact of the stent and / or balloon surface with the vessel wall, these substances are taken up by the vascular smooth muscle cells and effectively inhibit their further proliferation.
  • antiproliferative agents such as paclitaxel and rapamycin
  • microparticles comprising phospholipids and proteins
  • Platelets may release phospholipid membranes from the cells that are delivered as microparticles into the blood or surrounding tissue fluid.
  • the ability to deliver microparticles has also been described for other cell types.Microparticles have a local and systemic effect that enhances or reduces them Tissue responses (Meziani et al., Pharmacol Rep 2008, 60, 75-84), this information is passed on to the cells directly surrounding it, but can also lead to the recruitment of remote cells, ie the bone marrow
  • microparticles have a significant influence on the pathophysiological changes in e in sepsis
  • biocompatibility of an artificial surface that is in direct contact with cells is a crucial determinant for subsequent cell responses. While less biocompatible surfaces can induce cell dedifferentiation, migration, proliferation or apoptosis, the ideal biocompatible surface would not result in such a cellular response and would rather retain the physiological status and metabolism of the adherent cells. Furthermore, biocompatibility is inversely proportional to the rate and amount of biomolecules, such as albumin, fibronectin, or complement factors that attach to the artificial surface. This is also true for the amount of extracellular matrix proteins produced by adherent cells on the artificial surfaces. Furthermore, the quantity and quality of serum proteins adhering to an artificial surface will determine which cells will attach to such surface as well as their rates of proliferation.
  • Biocompatibility is not the same for the different mammalian cell types.
  • Cells react to incompatibilities in their chemical environment (eg pH), surface geometry (eg roughness of the surface), fluidity of the interface (such as determined by water content) and quality and quantity of cell contacts with the artificial surface.
  • chemical environment eg pH
  • surface geometry eg roughness of the surface
  • fluidity of the interface such as determined by water content
  • phospholipids have similar physicochemical properties at the interface with the adherent cell as the cell membranes themselves.
  • Phospholipids have the property of spontaneously forming membrane-like structures, resulting in a homogeneous surface which, in the event that the head group carries a choline residue, resulting in a high density of bound water molecules.
  • Another advantage of a boundary layer that is not firmly anchored to the support material is the free lateral mobility of the phospholipids.
  • the melting point of natural phospholipids found in human cell membranes is low, so that the high degree of mobility under body temperature conditions facilitates mechanical or thermodynamically driven detachment.
  • phosphorylcholines were polymerized with a co-polymer (eg, lauryl methacrylate); Such phospholipid compounds are not found in nature and have fundamentally different physicochemical properties than natural phospholipids, which is why a coating with polymerized phosphorylcholines must be named as a synthetic phospholipid layer. Since a covalent anchoring to the support material was not intended, the resistance to shear forces was achieved by a polymerization process, which resulted in a coating with a thickness of 50 ⁇ .
  • a co-polymer eg, lauryl methacrylate
  • Biopassivant coatings are not only beneficial on cardiovascular implants, but are also desirable for wound materials, wound inserts, surgical sutures, or other implants such as face and breast implants because they are expected to have anti-fibrotic properties. It has surprisingly been found that nitrocarboxylic acid-containing phospholipids have such biopassivating properties.
  • biopassivating compounds which are suitable for coating medical devices, in particular for the biopassivative coating of medical devices and for producing biopassivating compositions, rinsing solutions, impregnating solutions, coating solutions, Cryoprotektionsaten, cryopreservation media, Lyoprotektions55en, contrast agent solutions, preservative solutions and perfusion solutions are suitable and the provision of such solutions and such coated medical devices.
  • the medical devices are preferably those which come into direct contact with cells / tissues and lead to a cell / tissue alteration, which without a surface coating leads to an increased production of matrix proteins / fibrosis and / or cell migration / cell proliferation and / or apoptosis / Lead to necrosis.
  • Solutions or biopassivating compositions in the form of rinse solutions, impregnation solutions, coating solutions, cryoprotective solutions, cryopreservation media, lyoprotective solutions, contrast agent solutions, preservative solutions and perfusion solutions are a suitable application if trauma / intoxication as well as medical / cosmetic interventions involving similar cell / tissue alterations and cell / tissue reactions go hand in hand, are expansive and difficult to reach, so that a coating of the cells / tissues can be ensured or an immediate treatment of medical devices that come into contact with tissues can be made.
  • X is O or S
  • R 1 and R 2 are independently selected from the group consisting of or consisting of: linear nitroalkyl radicals having 5 to 30 carbon atoms, branched nitroalkyl radicals having 5 to 30 carbon atoms, linear nitroalkenyl radicals having 5 to 30 carbon atoms, branched nitroalkenyl radicals having 5 to 30 carbon atoms, linear nitroalkynyl radicals having 5 to 30 carbon atoms, branched nitroalkynyl radicals having 5 to 30 carbon atoms, nitroalkyl radicals 5 to 30 carbon atoms, wherein the nitroalkyl radical contains a cycloalkyl radical or a heterocycloalkyl radical or a carbonyl group,
  • alkyl radical, alkenyl radical and alkynyl radical having one, two or three hydroxyl groups, thiol groups, halogen radicals, carboxylate groups, C 1 -C 5 -alkoxycarbonyl groups, C 1 -C 5 -alkylcarbonyloxy groups, C 1 -C 5 -alkoxy groups, C 1 -C 5 -alkylamino groups, C 1 -C 4 -alkyl 5 -dialkylamino and / or amino groups may be substituted and wherein the nitroalkyl, Nitroalkenylrest and Nitroalkinylrest with one, two or three hydroxy groups, thiol groups, halogen radicals, carboxylate groups, Ci-C5 alkoxycarbonyl, C1-C5 alkylcarbonyloxy groups, Ci-C 5 - Alkoxy groups, C 1 -C 5 -alkylamino groups, C 1 -C 5 -dialkylamino groups and
  • R 1 and R 2 must contain at least one nitro group
  • R 3 is one of the following radicals: -H, -CH 2 -CH (COO " ) - NH 3 + ,
  • R 4 - R 14 are independently
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the nitrocarboxylic acid (s) -containing phospholipids of the invention for the preparation of medical compositions and for coating medical devices.
  • the medical compositions are preferably biopassivating compositions such as e.g. Rinsing solutions for medical devices, rinsing solutions for wounds, impregnation solutions for dressings, wound and suture materials, coating solutions for medical devices, cryoprotection solutions, cold preservation media, lyoprotection solutions, contrast agent solutions, preservation solutions and perfusion solutions for cells, tissues and organs.
  • biopassivating compositions such as e.g. Rinsing solutions for medical devices, rinsing solutions for wounds, impregnation solutions for dressings, wound and suture materials, coating solutions for medical devices, cryoprotection solutions, cold preservation media, lyoprotection solutions, contrast agent solutions, preservation solutions and perfusion solutions for cells, tissues and organs.
  • the terms “medical device” or “medical device” are used herein as generic terms that include any implants, natural and artificial grafts, suture and bandage materials, as well as parts of medical devices such as catheters.
  • the medical products which also include cosmetic or partially cosmetic and partially medical implants, are preferably medical devices, more preferably implants that are temporarily or permanently introduced into the organism and medical articles that come into contact with cells / tissues, such as Wound materials, suture materials, wound and body oil closure systems, biological grafts, artificial grafts, biological implants, artificial implants, artificial blood vessels, natural blood vessels, blood conductors, blood pumps, dialyzers, dialysis machines, vascular prostheses, vascular supports, heart valves, artificial hearts, vascular clamps, autologous implants, Bone implants, intraocular lenses, shunts, dental implants, infusion tubes, medical cuffs, bandages, medical clamps, pumps, pacemakers, laboratory gloves, medical scissors, medical cutlery, needles, cannulas, endoprostheses
  • the surface coatings according to the invention are thus suitable for all medical devices or medical devices that come into contact with cells / tissues / organs temporarily or permanently and that this contact can lead to irritation of the coming in contact cells / tissues / organs that are undesirable Reaction (as described below or on page 8 above) of said structures leads.
  • Vital cells can respond to external stimuli by altering their metabolism and / or phenotype and / or genotype. The reaction behavior depends on the type and intensity of the irritation as well as on the affected cell species and preconditioning factors such. The integrity of a cell network or the presence of mediators.
  • the cell reaction is dependent on the abovementioned determinants and may result in formation of mediators or extracellular matrix, cell migartion or cell proliferation as well as necrosis or apoptosis. Therefore, the reaction to a cell irritation is not exactly predictable. The quantification of a change in the response to a cell / tissue irritation must therefore be done by comparing the reaction behavior under the same starting conditions.
  • biopassivation or “biopassivating” is understood to mean the following.
  • a biopassivation according to the invention is when the cell / tissue response to a physical, chemical or hypoxic cell or tissue alteration is limited to a level as would be expected under the same conditions but without additional cell / tissue alteration.
  • the cell / tissue alteration may be due to introduction of foreign material, addition of barotrauma or thermal trauma, hypoxia, toxins and / or radiation.
  • a biopassivation of cells / tissues according to the invention is present if the cell / tissue reactions resulting from physical, chemical or hypoxic cell or tissue alterations, consisting of production of mediators or matrix proteins and / or cell migration / proliferation and / or necrosis / Apoptosis, preferably at least 10%, preferably at least 20%, more preferably at least 30%, more preferably at least 40%, further preferably at least 50%, even more preferably at least 60% and most preferably at least about 70% compared to a similar alteration of Cells and tissues that have not come into contact with the phospholipids according to the invention are reduced.
  • biopassivating effects are present when cellular or tissue response, which is the production of mediators and / or matrix proteins, cell migration and / or proliferation, necrosis and / or apoptosis due to physical, chemical or hypoxic cell or tissue alterations, in their Scope to preferably at least 10%, preferably at least 20%, more preferably at least 30%, more preferably at least 40%, further preferably at least 50%, even more preferably at least 60% and most preferably at least reduced by 70%.
  • the present invention relates to biopassivierende compounds of general formula (I), biopassivierende compositions containing at least one of the biopassivierenden compounds of the general formula (I) and biopassivierende coatings of or containing the biopassivierenden compounds of the general formula (I).
  • biopassivating compounds, compositions and coatings are particularly suitable for direct or indirect contact with living cells, tissues and organs.
  • biopassivating means that the cells and / or tissues which have come into contact or have been treated with the biopassivating compounds, coatings or compositions, compared to comparable cells and / or or tissues which have not been contacted or treated with the biopassivating compounds, coatings or compositions, at least 10%, preferably at least 20%, more preferably at least 30%, more preferably at least 40%, even more preferably at least 50%, more preferably at least 60%, and most preferably at least 70%, less cell reactions and / or tissue reactions due to physical, chemical or hypoxic cell or tissue alterations, wherein the cell responses and / or tissue reactions are the production of mediators and / or Ma trix proteins, cell migration and / or cell proliferation as well as necrosis and / or apoptosis.
  • Biopassivation therefore preferably does not mean the at least 10% lower production of mediators or the at least 10% lower production of matrix proteins or the at least 10% lower cell migration or the at least 10% lower cell proliferation or at least 10% lower necrosis or at least 10% lower apoptosis; Biopassivation preferably means at least 10% lower production of mediators and / or matrix proteins and at least 10% less cell migration and / or cell proliferation and at least 10% less necrosis and / or apoptosis.
  • the aforementioned effects production of mediators / matrix proteins, cell migration / proliferation, necrosis / apoptosis
  • the reduction by at least 10% or more refers only to the effects that actually occur in the considered biological process.
  • the expression "at least 50% lower” or at least 10% / at least 20% / at least 30% / at least 40% / at least 60% / at least 70%) not that all the aforementioned effects must be reduced by this percentage. It is sufficient if one of the actually occurring effects is reduced by this percentage, whereby the other occurring effects can be reduced by the same, the same or a lower percentage but preferably there is a measurable reduction.
  • this reduction is at least 10%, preferably at least 20%, more preferably at least 30%, more preferably at least 40%, even more preferably at least 50%, more preferably at least 60% and most preferably at least 70% by the following experiments.
  • biocompatibility is meant also a broad chemical and biological neutrality of a surface coating for cells or tissues in contact with the biopassivating compounds, coatings or compositions Such chemical and biological neutrality is present when the cell / tissue reactions occur
  • Contact with a biopassivating surface of the present invention with or without simultaneous physical, chemical or hypoxic cell or tissue alterations, exhibits cell and / or tissue reactions that are no more pronounced than 30%, more preferably no more pronounced than 10% and no more attenuated than 10 % in comparison to cell and / or tissue reactions of cells which have not come into contact with a biopassivating surface according to the invention, wherein the cell and / or tissue reactions are the production of mediators and / or matrix proteins, cell migration and / or Cell proliferation as well as necrosis and / or apoptosis.
  • a biocompatibility of a coating or medical preparation according to the invention is present if, under the same in vitro / ex vivo / in vivo conditions, the cell and / or tissue reactions take the form of a production of mediators and / or matrix proteins Cell migration and / or cell proliferation and necrosis and / or apoptosis are not more pronounced than 30%, more preferably not more pronounced than 10% and no more attenuated than 10% compared to a similar cell / tissue alteration without contact of the coated material or a medical Preparation under otherwise identical conditions.
  • antiproliferative an inhibitory effect on the migration, proliferation, and formation of extracellular matrix of cells / tissues in contact with the compounds of the invention, such as when the cell / tissue response to a physical, chemically or hypoxically induced cell or tissue alteration consisting of production of matrix proteins and / or cell migration and / or cell proliferation between 55% and 100% are reduced, preferably by 60% -65% and more preferably by 75% -85% in comparison to the cell or tissue reactions with a similar alteration of comparable cells and tissues, with comparable surfaces or medical preparations that were not coated with the compounds of the invention or in which the compounds of the invention were not included in the medical preparations in Konakt came.
  • a proliferation reduction according to the invention of a coating or medical preparation is then present if, under the same in vitro / ex vivo / in vivo conditions, the cell and / or tissue reactions take the form of a production of matrix proteins, cell migration and / or cell proliferation between 55% and 100%, preferably by 60% -65% and more preferably by 75% -85%, compared to a similar cell / tissue alteration in the case of a material or medical preparation coated or uncoated with the compounds according to the invention does not contain compounds according to the invention.
  • nitrocarboxylic acid-containing phospholipid or “nitrocarboxylic acid-containing phospholipid” or “nitrocarboxylic acid-containing phospholipid”, which are used synonymously, it is meant that at least one of the two lipid residues R 1 and / or R 2 is a nitro group Contains (-NO2).
  • the carboxylic acid radical R 1 COO- or the carboxylic acid radical R 2 COO- has at least one nitro group or both carboxylic acid radicals R 1 COO- and R 2 COO- each have at least one nitro group.
  • R 1 denotes the carbon radical or the carbon chain of the carboxylic acid radical R 1 COO-
  • the corresponding carboxylic acid is R 1 COOH.
  • R 2 denotes the carbon radical or the carbon chain of the carboxylic acid radical
  • Phospholipid are included, this means the radicals R 1 COO- and R 2 COO-, which are derived from the corresponding carboxylic acids R 1 COOH and R 2 COOH and are bound via an ester bond to the glycerol.
  • Phosphoglycerides with glycerol as a backbone are also called glycerophospholipids or phosphatides.
  • phospholipids are referred to as phospholipids and preferably glycerophospholipids whose lipid residues carry no nitro groups.
  • the compounds according to the invention are called nitrocarboxylic acid (s) -containing phospholipids in order to express that at least one of the two carbon chains R 1 or R 2 carries at least one nitro group.
  • Phospholipids containing unsaturated nitrocarboxylic acid residues are preferred.
  • the nitro group in R 1 and / or R 2 has no specific position. It can be located at any of the carbon atoms (a to co), ie at any point in the carbon chain. If several nitro groups are present at R 1 and / or R 2 , these may be located at any position in the carbon chains R 1 and R 2 .
  • the at least one nitro group is preferably located on a vinyl group of an unsaturated carbon chain. Accordingly, the at least one nitro group is preferably located on a double bond of the unsaturated carbon chain. It is possible that the carbon chain contains more than one nitro group. It is further preferred if the nitro group or nitro groups are in allylic position to the double bond.
  • the carbon chain can also double It may contain a carbocycle or a heterocycle or an aromatic ring or a heteroaromatic ring or a carbonyl group, it may be linear or branched and may carry further substituents.
  • the term "carbon chain” refers not only to linear and saturated alkyl groups but also to monounsaturated, polyunsaturated, cyclic, branched, and higher substituted alkyl, alkenyl, or alkynyl groups.
  • the mono-, di- or polyunsaturated carbon chains of the unsaturated carboxylic acids are preferred. Most preferred are double bonds in the carbon chain of the carboxylic acid, whereas triple bonds and saturated carbon chains are less preferred.
  • the term "nitrated carbon chain” means a carbon chain having at least one nitro group and consisting of 5 to 30 carbon atoms, which carbon chain may contain one or more double bonds and / or one or more triple bonds, may be cyclic Carbocyclic, heterocyclic, aromatic ring or heteroaromatic ring, may be substituted by one or more further nitro groups and having one, two or three hydroxyl groups, thiol groups, halogen radicals, carboxylate groups, C 1 -C 5 -alkoxycarbonyl groups, C 1 -C 5 -alkylcarbonyloxy groups, C 1 -C 5 -alkoxy groups, C 1 -C 5 -alkylamino groups, C 1 -C 5 -dialkylamino groups and / or amino groups may be substituted.
  • branched means that the carbon chain of the carboxylic acid moiety has at least one branch, i. no linear carbon chain is present.
  • nitroalkyl refers to a linear or branched and saturated carbon chain of 5 to 30 carbon atoms and at least one nitro group. At most, the nitroalkyl radical can carry 10 nitro groups. Preferably, the nitroalkyl radical carries 1, 2 or 3 nitro groups if it has 5 to 10 carbon atoms and preferably 1, 2, 3, 4 or 5 nitro groups if it has 1 1 to 20 carbon atoms and preferably 1, 2, 3, 4, 5 , 6 or 7 nitro groups if it has 21-30 carbon atoms.
  • the nitroalkyl radical also preferably contains between 8 and 28 carbon atoms, more preferably between 10 and 26 carbon atoms, even more preferably between 12 and 24 carbon atoms, and most preferably between 14 and 22 carbon atoms.
  • nitroalkenyl radical or “nitrated alkenyl radical” refers to a 5-30 linear or branched and double bond unsaturated carbon chain Carbon atoms and at least one nitro group. At most, the nitroalkenyl radical can carry 10 nitro groups. Preferably, the nitroalkenyl radical carries 1, 2 or 3 nitro groups if it has 5-10 carbon atoms, and preferably
  • the nitroalkenyl group contains one, two or three nitro groups.
  • the nitroalkenyl radical contains at least one and a maximum of 15 double bonds. Preference is given to one, two or three double bonds, further preferred are one or two double bonds and particularly preferred is a double bond.
  • the double bonds may each independently be E (opposite, sometimes also referred to as "trans") or Z (together, sometimes also referred to as "ice"). Preference is given to Z double bonds.
  • the nitroalkenyl radical also preferably contains between 8 and 28 carbon atoms, more preferably between 10 and 26 carbon atoms, even more preferably between 12 and 24 carbon atoms, and most preferably between 14 and 22 carbon atoms.
  • nitroalkynyl or “nitrated alkynyl” refers to a linear or branched and triply unsaturated carbon chain of 5 to 30 carbon atoms and at least one nitro group. At most, the nitroalkynyl radical can carry 10 nitro groups. Preferably, the nitroalkynyl moiety carries 1, 2 or 3 nitro groups if it has 5-10 carbon atoms and preferably 1,
  • the nitroalkynyl moiety contains one, two or three nitro groups.
  • the nitroalkynyl radical contains at least one and a maximum of ten triple bonds. Preference is given to one, two or three triple bonds, more preferred are one or two triple bonds and particularly preferred is a triple bonds.
  • the nitroalkynyl moiety also preferably contains between 8 and 28 carbon atoms, more preferably between 10 and 26 carbon atoms, even more preferably between 12 and 24 carbon atoms, and most preferably between 14 and 22 carbon atoms.
  • nitrogenalkyl radicals having 5 to 30 carbon atoms containing a cycloalkyl radical or a heterocycloalkyl radical or a carbonyl group refers to a linear or branched carbon chain having 5 to 30 carbon atoms, in which carbon chain is a cycloalkyl radical or a heterocycloalkyl radical or a carbonyl group.
  • the carbon atoms of the cycloalkyl radical or the heterocycloalkyl radical or the carbonyl group are contained in the total number of carbon atoms, that is contained in the 5-30 carbon atoms.
  • the A nitroalkyl radical having 5 to 30 carbon atoms containing a cycloalkyl radical or a heterocycloalkyl radical or a carbonyl group carries a maximum of 10 nitro groups and preferably carries 1, 2 or 3 nitro groups if it has 5 to 10 carbon atoms and preferably 1, 2, 3, 4 or 5 nitro groups, when it has 1 1 - 20 carbon atoms and preferably 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7 nitro groups, if it has 21 - 30 carbon atoms. Most preferably, this nitroalkyl radical contains one, two or three nitro groups.
  • the nitroalkyl radical containing a cycloalkyl radical or a heterocycloalkyl radical or a carbonyl group preferably has between 8 and 28 carbon atoms, more preferably between 10 and 26 carbon atoms, even more preferably between 12 and 24 carbon atoms, and most preferably between 14 and 22 carbon atoms.
  • alkyl refers to a linear or branched and saturated carbon chain of 5 to 30 carbon atoms and no nitro group.
  • the alkyl group further preferably contains between 8 and 28 carbon atoms, more preferably between 10 and 26 carbon atoms, even more preferably between 12 and 24 carbon atoms, and most preferably between 14 and 22 carbon atoms.
  • alkenyl refers to a linear or branched and double bond unsaturated carbon chain of 5 to 30 carbon atoms and no nitro group.
  • the alkenyl radical contains at least one and a maximum of 15 double bonds. Preference is given to one, two or three double bonds, further preferred are one or two double bonds and particularly preferred is a double bond.
  • the double bonds may each independently be E (opposite, sometimes also referred to as “trans”) or Z (together, sometimes also referred to as "ice”). Preference is given to Z double bonds.
  • the alkenyl group further preferably contains between 8 and 28 carbon atoms, more preferably between 10 and 26 carbon atoms, even more preferably between 12 and 24 carbon atoms, and most preferably between 14 and 22 carbon atoms.
  • alkynyl refers to a linear or branched and triply unsaturated carbon chain of 5 to 30 carbon atoms and at least one nitro group.
  • the alkynyl radical contains at least one and a maximum of ten triple bonds. Preference is given to one, two or three triple bonds, more preferred are one or two triple bonds and particularly preferred is a triple bonds.
  • the alkynyl radical preferably also contains between 8 and 28 carbon atoms, more preferably between 10 and 26 carbon atoms, even more preferably between 12 and 24 carbon atoms, and most preferably between 14 and 22 carbon atoms.
  • nitroalkyl radical, nitroalkenyl radical, nitroalkynyl radical, nitroalkyl radicals having from 5 to 30 carbon atoms containing a cycloalkyl radical or a heterocycloalkyl radical or a carbonyl group, alkyl radical, alkenyl radical and alkynyl radical can furthermore be substituted by one, two or three hydroxyl groups, thiol groups, halogen radicals (-F, -Cl, -Br , -I), carboxylate groups, Ci-C5 alkoxycarbonyl, Ci-C 5 oxy groups alkylcarbonyl, Ci-C5 alkoxy groups, Ci-C 5 substituted alkylamino, Ci-C groups and 5 dialkylamino / or amino groups his. Further preferred are hydroxyl and C 1 -C 5 -alkoxy groups and particularly preferred are hydroxyl groups.
  • the following carboxylic acids represented as free acid R 1 COOH and R 2 COOH are preferably used as radicals R 1 COO- and R 2 COO- in the nitrocarboxylic acid-containing phospholipids according to formula (I). That is to say that the following carboxylic acids are preferably used in nitrated form, ie with at least one nitro group and optionally further substituents as listed above for the esterification of the glycerol residue in the phospholipids according to the invention: hexanoic acid (caproic acid), octanoic acid (caprylic acid), decanoic acid (capric acid), dodecanoic acid (lauric acid ), Tetradecanoic acid (myristic acid), hexadecanoic acid (palmitic acid), heptadecanoic acid (margaric acid), octadecanoic acid (stearic acid), eicosanoic acid (arachidic acid), docosanoic acid (
  • Octadecatrienoic acid ( ⁇ -linolenic acid), 6,9,12,15-octadecatetraenoic acid
  • Step 1 (Stearidonic acid), 8,1 1,14,17-eicosatetraenoic acid, 5,8,1,1,14,17-eicosapentaenoic acid (EPA), 7,10,13,16,19-docosapentaenoic acid (DPA), 4,7, 10,13,16,19-docosahexaenoic acid (DHA), 5,8,1-eicosatrienoic acid (meadklare), 9c1 1 t13t-eleostearic acid, 8t10t12c-calendulic acid, 9c1 1113c-catalpinic acid,
  • the radicals R 1 COO and R 2 COO- in the nitrocarboxylic acid-containing phospholipids according to the present invention shown as the free acid R 1 COOH and R 2 COOH, may represent a nitrated carboxylic acid, wherein the respective (s) carboxylic acid (n ) are selected from the above group.
  • carboxylic acids are preferably used as radicals R 1 COO- or as radical R 2 COO- in the phospholipids according to general formula (I) according to the invention and the nitrated form of these concretely mentioned carboxylic acids preferably as second lipid radical R 2 COO or R 1 COO be used or the nitrated form of these concretely mentioned carboxylic acids are preferably used for both lipid R 1 COO and R 2 COO-.
  • Particularly preferred lipid radicals in the phospholipids according to the invention are the following nitrated carboxylic acid radicals R 1 COO- and R 2 COO-:
  • trans-9-nitro-9-octadecenoyl and trans-10-nitro-9-octadecenoyl Mixtures of trans-9-nitro-9-octadecenoyl and trans-10-nitro-9-octadecenoyl, trans-9-nitro-10-octadecenoyl, trans -10-nitro-8-octadecenoyl.
  • trans-6-nitro-6-octadecenoyl trans-7-nitro-6-octadecenoyl.
  • trans-1 1 -nitro-1 1 -octadecenoyl Mixtures of trans-1 1 -nitro-1 1 -octadecenoyl and trans-12-nitro-1 1 -octadecenoyl, trans-1 1 -nitro-12-octadecenoyl, trans-12-nitro-10-octadecenoyl.
  • trans-1 1 -nitro-1 1 -eicosenoyl Mixtures of trans-1 1 -nitro-1 1 -eicosenoyl and trans-12-nitro-1 1 -eicosenoyl, trans-1 1 -nitro-12-eicosenoyl, trans-12-nitro-10-eicosenoyl.
  • E, Z -6,9-dinitro-5,8,1-eicosathenoyl, (E, Z, E) -5,1 1 -dinitro-5,8,1-eicosathenoyl, (E, Z, E) -5,12-dinitro-5,8,1-eicosathenoyl, (E, Z, E) -6,1 1 -dinitro-5,8,1-eicosathenoyl, (E, Z, E) - 6,12-dinitro-5,8,1-eicosathenoyl, (Z, E, E) -8,1 l -dinitro-5,8,1-eicosatrienoyl, (Z, E, E) -8,12 -Dinitro-5,8,1-eicosatrienoyl, (Z, E, E) -9,1 1 -dinitro-5,8,1-eicosathenoyl, (Z, E, E)
  • nitration reactions and in particular the acid or free-radical nitration can often not be carried out selectively and the nitrated carboxylic acids are sometimes difficult to separate
  • mixtures of nitrated carboxylic acids are also preferred. These mixtures are preferably regioisomers, in particular of carboxylic acids having a plurality of double bonds, as well as mixtures of mono-, di-, di- or poly-nitrated carboxylic acids.
  • Nitrated carboxylic acids as pure (i.e., no mixtures) are best prepared by a substitution reaction, as shown below:
  • Non-selective nitration reactions are described in Gorczynski, Michael J .; Huang, Jinming; King, S. Bruce; Organic Letters, 2006, 8, 11, 2305-2308 and shown in the following overview:
  • the unselective nitration of a double bond of the carboxylic acid can also proceed in an acidic medium, as shown below (Scheme 2):
  • Scheme 3 Another possibility of nitration (Scheme 3) of unsaturated carboxylic acid is shown in the following reaction diagram and uses PhSeBr.
  • the nitrocarboxylic acid-containing phospholipids of the invention can be obtained by esterifying the two OH groups of the glycerol unit with the same nitrocarboxylic acid.
  • R 1 COOH is identical to R 2 COOH and R 1 is identical to R 2 (see Scheme 4).
  • the esterifications must be carried out successively, preferably first selectively esterifying the primary OH group and then the secondary OH group.
  • a nitrocarboxylic acid can be used in the first esterification and a non-nitrated carboxylic acid in the second esterification or a non-nitrated carboxylic acid in the first esterification and a nitrocarboxylic acid in the second esterification or a different nitrocarboxylic acid in both esterifications (see Scheme 4).
  • the esterifications are carried out according to standard reactions known to the person skilled in the art.
  • nitrocarboxylic acid (s) -containing phospholipids Another possibility for the preparation of the nitrocarboxylic acid (s) -containing phospholipids according to the invention is shown in Scheme 5.
  • PL results primarily with different radicals in positions 1 and 2, ie R 1 COO- ⁇ R 2 COO-
  • the reaction sequence according to Scheme 5 allows the introduction of non-nitrated carboxylic acid residues (R 1 COO-) Position 1 and a nitrated carboxylic acid residue (R 2 COO-) at position 2.
  • the reaction sequence shown in Scheme 5 is also applicable when R 1 represents COO- a nitrated saturated carboxylic acid residue.
  • R 2 COO may mean any nitrated or non-nitrated as well as saturated or unsaturated carboxylic acid residues.
  • the reaction sequence shown in Scheme 5 is not or only poorly applicable when R 1 is COO- a nitrated unsaturated carboxylic acid radical and above all a vinylated (ie at the double bond) nitrated unsaturated carboxylic acid radical. The further esterification with R 2 COO then takes place only under drastic yield losses. For such a case, a new synthesis was developed, which is shown in Scheme 6.
  • both positions 1 and 2 are esterified with non-nitrated carboxylic acid residues or with nitrated saturated carboxylic acid residues and then saponified enzymatically by means of phospholipase selectively position 1, so that then at position 1, a nitrated unsaturated carboxylic acid residue can be introduced.
  • General as well as concrete reaction instructions are given in the experimental part.
  • the radicals R 1 COO- and R 2 COO- in the nitrocarboxylic acid (s) -containing phospholipids can be varied widely, at least one of the radicals R 1 COO- and R 2 COO- represents one of the aforementioned nitrocarboxylic ,
  • the radical R 3 may be, for example, hydrogen, serine, choline, a sugar such as inositol or colamine (ethanolamine). If it is an esterification with cholines, then lecithins (also phosphatidylcholines) are formed, in the esterification with ethanolamine cephalins are formed. The phosphatidylcholines are preferred.
  • Phosphatidylethanolamine also cephalin, short PE
  • Phosphatidylcholine also lecithin, short PC
  • the nitrocarboxylic acid-containing phospholipids can be used as pure substances, diastereomer mixtures, regioisomer mixtures or mixtures of different nitrocarboxylic acid-containing phospholipids for the preferably biopassivating compositions according to the invention and the preferably biopassivating coatings according to the invention.
  • product mixtures of nitrocarboxylic acids which are regioisomers as well as mono- or poly-nitrated carboxylic acids.
  • Such product mixtures of different nitrated carboxylic acids obtained in the nitration reaction can thus be used as a mixture for the esterification with the Phospholipidrest such as sn-glycero-3-phosphocholine are used and the resulting mixtures of differently nitrated carboxylic acid - containing phospholipids can be used without being a separation into pure substances, as a mixture for the uses of the invention.
  • the pure nitrocarboxylic acid (s) -containing phospholipids and the mixtures of nitrocarboxylic acid-containing phospholipids can be used in combination with or as a mixture with non-nitrated PL.
  • all layers also consist of mixtures of nitrated phospholipids with phospholipids which do not contain a nitro group.
  • the advantage of a high proportion of nitrated phospholipids is the improved physico-chemical properties of phospholipid mixtures on surfaces compared to non-nitrated phospholipids, and a high degree of coverage and a low rate of multiple layer formation.
  • residual phospholipid vacancies close spontaneously when phospholipid mixtures with a high content of nitrated phospholipids are used and moderate heat (up to 50 ° C) and high humidity are used (Example 1).
  • SAMs with a significant proportion of nitro-phospholipids were more resistant to mechanical and chemical changes than SAMs, which consist of comparable non-nitrated phospholipids.
  • the lateral mobility of SAM with nitrated phospholipids is lower than that of SAM from non-nitrated phospholipids, but the lateral mobility in monolayers of pure nitrated phospholipids is still measurable.
  • Hydrophilic polymers such as PEG were physisorbed onto phospholipid coatings in the presence of electrolytes such as calcium. An overcoat of hydrophilic polymers extended the shelf life of a closed formation of the phospholipid layer. The physisorbed polymers could be quickly removed by rinsing. When such a combined coating was used on catheter balloons, no defect of the phospholipid monolayer after balloon expansion could be observed.
  • nitrated phospholipids exhibit a low dissociation rate from a monolayer assembly than comparable non-nitrated phospholipids. This effect can be attributed to the denser packing of nitrated phospholipids and the stronger hydrophobic adhesion forces (Example 3). About a relevant effect of a nitrogen oxide is not known in this context. The number of nitro groups before and after cell experiments was almost the same. It is still unlikely that one pharmacologically relevant concentration of nitrated phospholipids in the cell membranes of the adherent cells was inserted, as shown by experiments with radioactively labeled nitrated phospholipids (Example 4).
  • endothelial cells adhering to a SAM with nitrated phospholipids expressed significantly fewer cell adhesion molecules than cells adhering to phospholipid-coated surfaces without nitrated carboxyl chains.
  • vascular smooth muscle cells VSMC
  • SAM nitrocarboxylic acid Phospholipids contained
  • the biopassivating properties of the nitrated phospholipids cause an increased survival of cells (eg macrophages) by a lower apoptosis induction compared to a coating of non-nitrated phospholipids.
  • the higher survival rate causes a lower cytokine production, whereby the possible immune reactions at the site of the implant are lower and thereby a tissue-proliferating stimulus by the implant is absent (Example 7).
  • the results surprisingly and unexpectedly show that coatings of SAM with nitrated phospholipids enhance the cell homing of cells such as VSMC and endothelial cells, while cell responses to one cell Artificial surface can be reduced by providing a highly biocompatible surface without pharmacological effects.
  • Naturally occurring and synthetic phospholipids have been proposed for coating implant materials.
  • free nitrated fatty acids have been suggested for inhibiting an aggressive healing pattern.
  • an improvement in biocompatibility over the use of the uncoated materials has been assumed.
  • biopassivating effects as disclosed herein, have neither been proven nor have been expected by a person skilled in the art.
  • an interaction between the phospholipids according to the invention and the cell / tissue structures is required, for which purpose these molecules should or must be present in unbound form.
  • nitrocarboxylic acid-containing phospholipids according to the invention were investigated in direct comparison with comparable natural phospholipids and fatty acids with or without nitration. The main results are summarized below:
  • the free fatty acids are absorbed by cells to a much greater extent than phospholipids, whereby intracellular vesicles are formed. This is associated with a significantly lower toxicity limit and a significant increase in apoptosis rate. But native phospholipids are also taken up by cells in the cell membrane, causing them to enlarge. This can subsequently promote the willingness to cell division. Such behavior was not present in the phospholipids containing nitrocarboxylic acid (s) (Example 8, 16).
  • nitrocarboxylic acid (s) -containing phospholipids differ significantly from the corresponding non-nitrated phospholipids (PL) but also compared to the free nitrofatty acids. It could thus be shown that in the case of a coating with nitrocarboxylic acid-containing phospholipids, these have a significantly higher adherence to the coating material, whereby the retention of lubricity is significantly stronger and longer lasting than with the comparable substances (Experiment 10) , 12).
  • microparticles require a partial protuberance of the cell membrane and is therefore highly dependent on the physico-chemical membrane properties. Also for the deposition of microparticles clearly different values between nitrocarboxylic acid (s) -containing phospholipids, natural PL and the free nitrofatty acids were found, which are consistent with the aforementioned changes in membrane properties (experiment 10, 14, 15).
  • the noception and transmembrane signal transduction is significantly influenced by the physicochemical properties of the cell membrane.
  • the opening of ion channels plays an outstanding role here. It has been shown that the transmembrane ion channel opening observed under different conditions, e.g. in the context of a hypoxia, a mechanical cell aging or a receptor excitation, to a considerable extent by the nitrocarboxylic acid (s) -containing phospholipids is reduced (Experimental O, 1 1, 13, 16, 17, 19, 20).
  • nitrocarboxylic acid (s) -containing phospholipids Studies on the long-term stability of the natural and the nitrocarboxylic acid (s) -containing phospholipids showed a significantly lower in the nitrocarboxylic acid (s) -containing phospholipids Tendency to Transisomehe the nitrated fatty acids on (experiment 12). Since adverse biological effects have been described for cellular uptake of trans fatty acids, avoidance of the provision of trans fatty acids is advantageous.
  • the nitrocarboxylic acid-containing phospholipids according to the invention have shown biocompatible, biopassivating but also proliferation-reducing effects under various conditions. It can therefore be assumed that these effects are also transferable to other cell types and clinical situations, where in particular a biopassivating effect is desired.
  • Biopassivation preferably causes no or almost no pathologically altered response in the cells or tissues that come in contact with the coated surface. As a result, for example, there is a healing of the foreign surface, which is characterized by a lower tissue proliferation. This results in endothelialization / healing of the thus coated material, with a physiologically required amount of cells / matrix proteins.
  • an anti-restenotic effect is indirectly achieved such that the biopassivating properties of such coated vascular grafts provide them with the ability to passively prevent, inhibit, or arrest symptoms of restenosis, ie, overgrowth of the implanted stent and stent-stabilized site ,
  • phospholipids containing nitrocarboxylic acids by their properties for coatings of medical devices are suitable because they counteract passive mechanisms of restenosis or overgrowth of the medical device and blood clotting and cell damage at the site of implantation of the medical device.
  • Another aspect of the effects of phospholipids with nitrocarboxylic acids is their effect on the release and composition of microparticles secreted by traumatized cells. This may result in uptake / incorporation of nitrocarboxylic acid-containing phospholipids into cell membranes, which could have a passive effect on the local as well as systemic tissue responses. In this case, an influence of the proteins enclosed in the microparticles can also be assumed. This particularly concerns glycoprotein tissue factors whose biological activity is passively inhibited by nitrocarboxylic acid-containing phospholipids.
  • Another effect is the stabilization of cell membrane properties (resistance to mechanical, chemical, osmotic or electrical irritations as well as against mechanical, chemical, osmotic or electrical trauma) and functionality (membrane potential, regulation of ion channels, signal membrane transduction).
  • Tissue hypoxia rapidly leads to changes in the cell membranes. This activates phospholipases that release fatty acids from the phospholipids. A consequent increase in the concentration of lysophospholipids is associated with a reperfusion injury. While a saturation of cell membranes with natural phospholipid (PL) prior to ischemia had no relevant influence on ischemia tolerance and reperfusion damage, surprisingly a significant reduction in hypoxia-related cell damage could be demonstrated by the compounds according to the invention. The analysis carried out for the evaluation of the reperfusion damage is limited due to the experiments carried out under ex-vivo conditions. Nonetheless, it has been demonstrated in the literature that the extent of reperfusion damage is correlated with the loss of NAD + in the cytoplasm as well as intramitochondrially.
  • nitrocarboxylic acid (s) -containing phospholipids according to the invention have advantageous properties on phospholipid membranes which can be summarized as cell-protective, biocompatible, and biopassivating, the common inventive concept being summarized under the term biopassivation.
  • nitrocarboxylic acid (s) -containing phospholipids of the invention are useful in biopassivating or biocompatible uses, e.g. for the production of medical compositions and for the coating of medical devices.
  • the phospholipids containing nitrocarboxylic acid (s) are particularly suitable for bi-neutral monolayers or bilayer coatings of medical implants.
  • the present invention is also directed to medical devices coated with at least one nitrocarboxylic acid-containing phospholipid.
  • a coating is preferably present as a monolayer, bilayer or multilayer and has biopassivierende properties.
  • coatings may also contain active ingredients, such as anti-restenotic agents, which is advantageous in catheter balloons and cardiovascular implants and will be discussed in more detail below.
  • Preferred implant materials are stents that are inserted into hollow organs to keep them open.
  • stents are made in tube form and classically consist of a framework of struts.
  • Stents are used for vascular stabilization, especially to keep them open, which is especially important for blood vessels, especially coronary arteries, to keep them open or to prevent re-occlusion (restenosis) after expansion by balloon catheters.
  • Stents can also be used to stabilize the airways, the esophagus or the bile ducts.
  • the coating of stents is preferred according to the invention.
  • stents which are introduced into blood vessels are particularly preferred.
  • Balloon catheters are also preferred medical products according to the invention.
  • implants particularly, but not exclusively, include soft tissue implants, in particular breast implants.
  • Joint and cartilage implants include soft tissue implants, in particular breast implants.
  • grafts of biological or artificial origin include intraocular lenses, surgical nets and adhesion barriers, nerve regeneration suite, shunts, biological or artificial vessel vessels, catheters, probes, ports, drains, stoma junctions, endoluminal tubes, sutures, ligatures, implantable devices such as defibrillators, surgical instruments such as hooks and tweezers.
  • a further field of application is the provision of nitrocarboxylic acid-containing phospholipids for tissue / organ systems which, by incorporation of these phospholipids or the phospholipids containing their surface with nitrocarboxylic acid-containing phospholipids, have improved tolerance to metabolic, physical and chemical alterations demonstrate. This leads to a passivation of these cells to the body's own (eg cytokines, growth factors) or foreign (eg toxins) substances that otherwise lead to cell proliferation or apoptosis / necrosis. These documented effects differ substantially from the effects of naturally occurring phospholipids as well as the effects of nitrated fatty acids.
  • tissue / organ trauma is caused by physical (e.g., mechanical, thermal), chemical, or electrical mechanisms. Examples include: cuts and sores, burns, frostbite, burns, ulcerations, radiation, and allergen and toxin exposures.
  • This relates to wound care preparations which are applied to carrier materials or are contained in pharmaceutical preparations and applied superficially to a tissue or introduced into the organism.
  • the physical properties of the nitrocarboxylic acid (s) -containing phospholipids can also be used to effect a delayed dissolution / release of substances from a mixture, as well as to effect their physical stabilization.
  • Particularly preferred fields of application include surgical treatment methods in which tissue is separated or connected, in particular if this separation / connection occurs in connection with a trauma or other chemical or physical irritation of the tissue, and includes in particular plastic-reconstructive and cosmetic procedures.
  • Preferred wound care materials are: wound dressings in the form of gels, tablets, colloids, adhesives, aglinates, foams, adsorbents, gauzes, cotton swabs and bandages. 3. Preparations for tissue / organ protection
  • nitrocarboxylic acid (s) -containing phospholipids causes a Prolongation of the ischemia tolerance, so that a pretreatment of such tissue makes sense. This can be done in the form of a previous perfusion of the tissue / organ but also an installation or placement in a solution with nitrocarboxylic acid (s) - containing phospholipids, since the phospholipids are rapidly absorbed from the surrounding medium or on the cell and / or tissue surface supports.
  • nitrocarboxylic acid (s) - containing phospholipids are also suitable for cryopreservation of tissues / organs via the previously reported preparatory measures.
  • Cell membranes have a variety of functions and tasks. Many of these functions are conditioned by the physical properties of cell membranes. These include mechanical stability to physical and chemical alterations. But also interactions between the alkyl chains and membrane proteins have an influence on the functionality of ion channels and receptor proteins.
  • nitrocarboxylic acid-containing phospholipids By including nitrocarboxylic acid-containing phospholipids and the resulting change in membrane properties, it is possible to influence some of these membrane functions. Thus it could be proven that changes which lead to a disruption of the membrane potential can be reduced, whereby nitrocarboxylic acid-containing phospholipids have antiarrhythmic properties. Furthermore, it has been demonstrated that, in principle, cell-toxic substances which are absorbed by an intact cell membrane via different mechanisms by a prior uptake of nitrocarboxylic acid (s) -containing phospholipids into the cell membrane, the uptake / action of such toxins can be significantly reduced.
  • nitrocarboxylic acid (s) -containing phospholipids By including nitrocarboxylic acid (s) -containing phospholipids and the resulting change in membrane properties, it is possible to influence some of these membrane functions. Thus it could be proven that changes which lead to a disruption of the membrane potential can be reduced, whereby nitrocarboxylic acid-containing phospho
  • nitrocarboxylic acid-containing phospholipids results in greater resistance to an osmotic gradient.
  • stabilization of the cell membrane has a significant effect on ionic nodules, especially those that undergo a change in intracellular Calcium concentrations cause, which also z. B. cause antiarrhythmic effects and inhibition of degranulation of eosin cells.
  • the investigations show that the above-mentioned changes in the membrane properties by the nitrocarboxylic acid-containing phospholipids also influence the cell reactivity / noumption on endogenous or exogenous stimulators and inhibitors. So z.
  • the diminished nociception of TNF alpha or TGF-beta has an antifibrotic effect.
  • biodegradable medical devices according to the invention are thus selectable from the group comprising or consisting of: medical pulp, dressing materials, wound inserts, surgical sutures, compresses, sponges, medical textiles, ointments, gels or film-forming sprays.
  • the medical pulp and medical textiles preferably are two-dimensional structures of small thickness impregnated with the nitrocarboxylic acid-containing phospholipids.
  • the Nitrocarboxylic acid-containing phospholipids attach themselves to the fibrous structures of these medical devices, which can be used in dry or pre-moistened form.
  • a preferred form of medical device according to the invention are sponges or generally biodegradable porous three-dimensional structures which may contain the nitrocarboxylic acid-containing phospholipids both on the surface and in the interior of the porous structure in the cavities.
  • These sponges can e.g. after an operation are placed in the wound and fill the operating room largely or only partially. From these sponge-like structures, the nitrocarboxylic acid-containing phospholipids can be released, but the nitrocarboxylic acid-containing phospholipids can also be present in firmly bound form. The release can be effected both by diffusion of only loosely bound nitrocarboxylic acid (s) -containing phospholipids from the cavities of the porous structure and by biodegradation of the sponge structure.
  • a carrier having the nitrocarboxylic acid-containing phospholipids and serving as a "carrier", among others.
  • the tissues, pulps, gels, film-forming compositions, etc. described in detail herein, which may be biodegradable or biostable.
  • the carriers may also be made of living matter and may contain x-ray markers or contrast agents.
  • tissue refers to any medically used textile or pulp from which dressing materials, dressings, dressings, or other medical wipes or fabrics are made.
  • Polyhydroxybutyrates and cellulose derivatives, chitosan derivatives as well as collagen, polyethylene glycol, polyethylene oxide and polylactides are preferred materials for medical pulps and textiles.
  • alginates When alginates are used as the wound dressing, it is preferred to use calcium alginate with sodium carboxymethylcellulose interwoven products.
  • the SeaSorb Soft from Coloplast is an example.
  • Surgical sutures may be subdivided into monofilament and polyfile filaments in terms of their construction. Polyfile threads can show a so-called wicking effect. That is, by capillary action tissue fluid migrates along the thread. This can also be associated with a migration of microbial germs, so that can propagate along the thread material infections. It is therefore desirable to provide surgical suture material in such a way that germ colonization on the thread surface and thus migration of germs along the thread are effectively prevented.
  • the suture is wetted with a homogeneous methanolic solution containing at least one nitrocarboxylic acid-containing phospholipid, and then the methanol is evaporated, forming a coating on the thread surface.
  • a homogeneous methanolic solution containing at least one nitrocarboxylic acid-containing phospholipid
  • the methanol is evaporated, forming a coating on the thread surface.
  • other lower alcohols such as ethanol, propanol and isopropanol or mixtures thereof with methanol instead of methanol.
  • the nitrocarboxylic acid-containing phospholipids disinfectant solutions are added, such as octenidine dichloride solutions (eg, sold under the name OcteniseptB by the company Schüle & Mayr) or added to dequalinium chloride solutions.
  • the weight ratio of octenidine dichloride or dequalinium chloride to nitrocarboxylic acid-containing phospholipids is preferably 1 to 0.1 to 1 to 5, and more preferably 1 to 1.
  • sutures are preferably used which are preferably polyglycolic acid, polycaprolactone-co-glycolide, or poly-p-dioxanone. Examples include the products Marlin ® , PCL and Marisorb ® Catgut GmbH called.
  • nitrocarboxylic acid-containing phospholipids I particularly sterile 100% cotton gauze compresses are to be used here.
  • Examples include the product lines Stericomp ® and Askina ® .
  • the medical textiles and pulps are sprayed or dipped therein with a solution of the nitrocarboxylic acid-containing phospholipids in water, organic solvents such as ethanol or mixtures thereof, the dipping or spraying process after drying the medical device can be repeated several times.
  • Per cm 2 surface of the medical device 10 g to 100 mg of nitrocarboxylic acid (s) -containing phospholipids are applied.
  • the medical sponges are bioresorbable implants with a sponge-like, porous structure. Preferred materials for the medical sponges are collagen, oxidized cellulose, chitosan, thrombin, fibrin, chitin, alginates, hyaluronic acid, PLGA, PGA, PLA, polysaccharides and globin. If medical sponges are used, those having a proportion of more than 90% of collagen are preferred.
  • an ointment base containing or consisting of purified water may be used in an amount of preferably 5 to 50% by weight, more preferably 10 to 40% by weight, and most preferably from 20-30% by weight.
  • the ointment also preferably contains Vaseline in an amount of 40-90% by weight, more preferably 50-80% by weight and most preferably 20-60% by weight.
  • the ointment may still contain thick liquid paraffin in an amount of 5-50% by weight, more preferably 10-40% by weight, and most preferably 20-30% by weight.
  • gel formers and / or film formers may be added in an amount of up to 30% by weight.
  • polymers such as cellulose, chitosan, thrombin, fibrinogen, chitin, alginates, albumin, hyaluronic acid, hyaluronan, polysaccharides, globin, polylactide, polyglycolide, polylactide-co-glycolide, polyhydroxybutyrates, cellulose derivatives, chitosan derivatives, polyethylene glycol and polyethylene oxide in amounts up to 30 wt .-% are used.
  • the phospholipids according to the invention containing nitrocarboxylic acids can also be incorporated into spray solutions or be constituents of film-forming sprays.
  • the phospholipids containing nitrocarboxylic acids described herein can be combined with gel or film formers.
  • Film-forming sprays contain at least one or more film formers.
  • Suitable film formers are preferably cellulose-based substances such as cellulose nitrate or ethylcellulose or physiologically acceptable polymers thereof, polyvinyl acetate, partially saponified polyvinyl acetate, copolymers of vinyl acetate and acrylic acid or crotonic acid or monoalkyl maleate, ternary copolymers of vinyl acetate and crotonic acid and vinyl neodecanoate, or crotonic acid and vinyl propionate, copolymers of methyl vinyl ether and monoalkyl maleate, in particular monobutyl maleate, copolymers of fatty acid vinyl ester and acrylic acid or methacrylic acid, copolymers of N-vinylpyrrolidone, methacrylic acid and methacrylic acid, copolymers of acrylic acid and methacrylic acid or alkyl acrylates or methacrylates, in particular containing quaternary ammonium groups , or polymers, copolymers or mixtures containing e
  • the film formers also include water-soluble polymers such as ionic polyamides, polyurethanes and polyesters and homo- and copolymers of ethylenically unsaturated monomers.
  • water-soluble polymers such as ionic polyamides, polyurethanes and polyesters and homo- and copolymers of ethylenically unsaturated monomers.
  • Such materials are, for example, under the trade names Acronal ®, Acudyne ®, Amerhold ®, Amphome ®, Eastman AQ ®, Ladival ®, Lovocryl ®, Luviflex VBM ®, Luvimer ®, Luviset PU R ®, Luviskol ®, Luviskol ® Plus, Stepanhold ® , Ultrahold ® , Ultrahold Strong ® or Versatyl ® .
  • Luvimer ® is developed by the company BASF AG is a polyacrylate as a hair styling polymer.
  • nitrocarboxylic acid (s) -containing phospholipid-coated implants by means of dipping or spraying.
  • the products to be implanted are immersed in a solution or suspension of the nitrocarboxylic acid-containing phospholipids or sprayed with an appropriate solution. Thereafter, the implants are dried and packaged sterile.
  • the gels, ointments, solutions and sprays are obtained by preparing the desired pharmaceutical preparation according to standard methods and preferably in a last step adding the desired amount of phospholipids containing nitrocarboxylic acids. Also part of the present invention are the medical devices of the invention obtainable thereby.
  • the rinsing solutions according to the invention for medical devices containing at least one nitrocarboxylic acid-containing phospholipid according to the invention can be used for rinsing u. Cleaning instruments and. Accessories, for moistening Wundtamponaden, towels u. Bandages, filling of the respiratory humidification equipment, to check the permeability of catheters - nasal rinsing and intra- u. postoperative irrigation during endoscopic surgery, rinsing and cleaning of wound drainage catheters.
  • the rinsing solutions according to the invention for wounds containing at least one nitrocarboxylic acid-containing phospholipid according to the invention comprise rinsing solutions for rinsing and cleaning during surgical interventions, rinsing and cleaning in the case of stoma care, for rinsing wounds and burns and for mechanical eye rinsing.
  • Woundwash solutions are generally used to remove cell debris, necroses, blood and pus remnants but also residues of wound dressings.
  • the phospholipids containing nitrocarboxylic acids according to the invention can form a coating or a film on the rinsed surfaces and thus cause biopassivation of the surfaces.
  • Suitable basic solutions or formulations which nitro carboxylic acid of the invention (s) -containing phospholipids may be added and which are used as flushing solution such as physiological saline, Ringer's or lactated Ringer's solution, solutions containing polyhexanide or polyethylene glycol, and commercially available irrigation solutions like Prontosan ® or Lavanid ®.
  • biological samples includes cells, both eukaryotic and prokaryotic, organs and tissues, and biologically active molecules, eg, macromolecules, such as nucleic acids or proteins, Especially preferred is cryopreservation of human embryos and embryos of other mammals.
  • biological samples includes cells, both eukaryotic and prokaryotic, organs and tissues, and biologically active molecules, eg, macromolecules, such as nucleic acids or proteins, Especially preferred is cryopreservation of human embryos and embryos of other mammals.
  • One preferred embodiment of the present invention consists of a cryoprotective solution or a cryopreservation medium containing at least one nitrocarboxylic acid (s) according to the present invention.
  • the nitrocarboxylic acid-containing phospholipids according to the invention have a positive effect on the survival rate of the cells / microorganisms.
  • Cryoprotective solutions or cryopreservation media generally comprise a cryoprotectant which is ensured by cryoprotectants, for example glycerol, dimethyl sulfoxide (DMSO) amorphous solidifying disaccharides and polymers.
  • cryoprotectants for example glycerol, dimethyl sulfoxide (DMSO) amorphous solidifying disaccharides and polymers.
  • Cryoprotection solutions or cryopreservation media which should be suitable for freezing cells, organs and tissues, have as base a corresponding culture medium.
  • As culture medium all common culture media for the culture of microorganisms, cells and tissues can be used. In addition, it may also contain: buffer substances, indicators, dyes, inhibitors (for example antibiotics) or growth aids (hormones, vitamins and the like).
  • Cryoprotection solutions for freezing macromolecules contain no nutrient media as base, but preferably aqueous buffer solutions.
  • the cryoprotectants used for macromolecules are preferably amorphous solidifying disaccharides and polymers.
  • lycoprotective solutions according to the invention differ from the above-described Cryoprotektionslosungen only by the stabilizing additives used. While the cryoprotectants ensure stability during freezing, lyoprotectors are used during drying. Lyoprotectors form a matrix by means of hydrogen bonds to functional polar groups of macromolecules and act as a water substitute. For this reason, molecules which have hydrophilic groups and, due to their structure, are sufficiently flexible to be able to form hydrogen bonds to the surface of the macromolecules are particularly suitable for this purpose. Preference is given here to call disaccharides and mannitol.
  • the present invention also encompasses solutions comprising at least one nitrocarboxylic acid-containing phospholipid according to the invention and both a cryoprotector and a lyoprotector.
  • inventive contrast agent solutions which contain at least one nitrocarboxylic acid-containing phospholipid according to the invention and a contrast agent or contrast agent analogues.
  • a contrast agent or contrast agent analogues such Barium, iodine, manganese, iron, lanthanum, cerium, praseodymium, neodymium, samarium, europium, gadolinium, terbium, dysprosium, holmium, erbium, thulium, ytterbium and / or lutetium are preferred as contrast agents and / or contrast agents / or complexed form.
  • Preferred X-ray contrast agents are those used for joint imaging (arthrography) and CT (computed tomography).
  • X-rays, computed tomography (CT), magnetic resonance imaging, magnetic resonance imaging (MRI) and ultrasound are used as imaging methods, with magnetic resonance imaging and magnetic resonance imaging (MRI) being preferred.
  • iodine-containing contrast agents are preferred, which are used in angiography and venography (CT) and CT (computed tomography).
  • CT computed tomography
  • MRI magnetic resonance imaging
  • MRI magnetic resonance imaging
  • iodine-containing contrast agents are preferred, which are used in angiography and venography (CT) and CT (computed tomography).
  • CT venography
  • iodinated contrast media the following examples can be mentioned: amidotrizoic, iotrolan, iopamidol, lodoxaminklare, iodine-Lipiodol ® and amidotrizoate.
  • Another class of preferred contrast agents are the paramagnetic contrast agents, which usually contain a lanthanide such as gadolinium (Gd 3+ ), europium (Eu 2+ , Eu 3+ ), dysprosium (Dy 3+ ) or holmium (Ho 3+ ) ,
  • gadolinium-containing contrast agents are gadolinium diethylenetriaminepentaacetic acid, gadopentetic acid (GaDPTA), gadodiamide, meglumine gadoterate and gadoteridol.
  • the term "medicinal composition” or “solution” as used herein means the mixture of at least one nitrocarboxylic acid-containing phospholipid according to the invention and a solvent and / or excipient and / or carrier, ie an actual solution, dispersion, suspension or An emulsion of a nitrocarboxylic acid-containing phospholipid or a mixture of different phospholipids containing nitrocarboxylic acids and at least one further constituent selected from the solvents, oils, fatty acids, fatty acid esters, phospholipids, amino acids, vitamins, contrast agents, salts and / or membrane-forming substances mentioned herein ,
  • solution should also clarify that it is a liquid mixture, which, however, may also be gelatinous, viscous or pasty (viscous or highly viscous).
  • a perfusion and preservation solution comprising at least one nitrocarboxylic acid-containing phospholipid according to the invention for the preservation of cells in the absence of a blood supply, in particular in the preservation of complex cell systems such as organs or living tissue is provided.
  • Organ transplantation is currently available for the kidney, liver, heart, lung, pancreas, intestine, cornea, and skin. Upon removal, the vascular system of a transplant organ is perfused with a preservative solution.
  • This solution is designed to facilitate lowering of the temperature of the organ, to prevent swelling of cells, to eliminate oxygen free radicals, to control the pH, to reduce ischemic damage, to prolong the safe time while allowing the organs to be stored outside the body , and to facilitate the recovery of the organ during reperfusion.
  • preservative solutions such as Eurocollins solution ® , the University of Wisconsin solution ® , Celsior solution ® and the low-potassium-dextran solution (Perfadex® solution) available.
  • a perfusion or preservation solution of the invention is formed by aqueous pH buffer systems, preferably selected from a sodium phosphate buffer and a potassium phosphate buffer having a pH in the range of 6.8 to 7.4, e.g. Krebs-Henseleit buffer (KHB).
  • aqueous pH buffer systems preferably selected from a sodium phosphate buffer and a potassium phosphate buffer having a pH in the range of 6.8 to 7.4, e.g. Krebs-Henseleit buffer (KHB).
  • a perfusion or preservation solution of the invention may contain, in addition to the nitrocarboxylic acid-containing phospholipids of the invention: water for injection, sucrose, at least one component having pH buffering properties, at least one component having calcium transport blocking properties, calcium ions, blood coagulation inhibitor such as acetylsalicylic acid , Colloid osmotic drugs such as polyethylene glycol (PEG) or chelators such as amino acids.
  • PEG polyethylene glycol
  • Medical devices which are particularly preferred according to the invention are coated stents for use in blood vessels which are coated with nitrocarboxylic acid-containing phospholipids on one or two layers.
  • This embodiment is particularly advantageous because it is easy to manufacture, its small dimensions increase the thickness of the stent only insignificantly and lead to biopassivation of the stent and at the same time to the passive anti-restenotic effect described above.
  • a phospholipid coating is preferred as a monolayer (monolayer), where, as the name implies, the layer height is exactly one molecule.
  • a monolayer according to the invention preferably corresponds to the complete coverage of the medical device with a layer of nitrocarboxylic acid-containing phospholipids. However, it is also possible that only parts of the medical device are covered with a monolayer.
  • stents with a bilayer of nitrocarboxylic acid-containing phospholipids are also preferred.
  • stents with a bilayer of nitrocarboxylic acid-containing phospholipids are also preferred.
  • Another preferred embodiment is stents with a monolayer or bilayer of nitrocarboxylic acid-containing phospholipids having a superposed layer of at least one bioresorbable polymer.
  • coated balloon catheters which have a pure layer of nitrocarboxylic acid-containing phospholipids.
  • balloon catheters having a bilayer of nitrocarboxylic acid-containing phospholipids are also preferred.
  • balloon catheters and stents that have a pure coating with nitrocarboxylic acid-containing phospholipids and a superposed layer of contrast agent.
  • the stents, balloon catheters and other artificial implants may have alternating coatings of nitrocarboxylic acid-containing phospholipid layers and layers of contrast agent and / or comparable substances.
  • Embodiments with 2-10 nitrocarboxylic acid-containing phospholipid layers, more preferably 2-6 layers and even more preferably 2-4 layers are preferred.
  • implants are suitable for coating with nitrocarboxylic acid-containing phospholipids, since the documented effects lead to an improved healing compared to an uncoated implant material.
  • implants for reconstructive and plastic surgery such as surgical nets, implants for tissue replacement or construction, implanted indwelling catheter and ports, and drainage are particularly suitable for a coating according to the invention.
  • the phospholipid layers are naturally very thin.
  • the thickness of a single phospholipid layer can be given as 2-4 nm. Accordingly, the thickness of a phospholipid bilayer is 4 - 8 nm, and even more layers add up to the corresponding values.
  • the stents may have a hemocompatible layer of the hemocompatible substances mentioned below, which is preferably bound to the surface.
  • At least one pharmacologically active substance preferably an antiproliferative or antirestenotic active ingredient, is applied to the coating of at least one nitrocarboxylic acid-containing phospholipid layer as a pure active substance layer or together with an adjuvant.
  • the active substances are used individually or combined in the same or different concentrations. Particularly preferred are active substances which, in addition to their anti-restenotic action, have further supporting properties, ie antiproliferative, antimigrative, antiangiogenic, antiinflammatory, antiphlogistic, cytostatic, cytotoxic and / or antithrombotic.
  • the active ingredient (s) is / are preferably contained at a pharmaceutically active concentration of 0.001 -10 mg per cm 2 of stent surface.
  • adjuvants may be applied to the nitrocarboxylic acid-containing phospholipid layer or layers together with the drug solution, either to provide visualization of the medical device as a contrast agent or to act as a so-called transport mediator and accelerate uptake of the drug into the cell.
  • vasodilators include endogenous substances such as kinins, substances of plant origin such as gingko biloba, DMSO, xanthones, flavonoids, terpenoids, plant and animal dyes, contrast agents and contrast agent analogues, as well as cholesterols also to these tools or are themselves used synergistically as an active ingredient.
  • 2-pyrrolidone tributyl and triethyl citrate such as their acteylated derivatives, dibutyl phthalate, benzyl benzoate, diethanolamine, diethyl phthalate, isopropyl myristate and palmitate, triacetin, etc.
  • DMSO iodine-containing contrast agents
  • PETN tributyl and triethyl citrate
  • the nitrocarboxylic acid-containing phospholipid layer may be surrounded by a layer of polymers or polysaccharides with or without an active substance layer.
  • the polymer layer can consist of biostable and / or biodegradable polymers.
  • the biodegradable polymer layer is preferred.
  • the active ingredient can be slowly released into the environment over a first period of time. Thereafter, the biopassivated stent would still have an anti-biopassive long-term effect.
  • at least one active substance may be contained in the polymer layer itself.
  • biodegradable or resorbable polymers it is possible to use, for example: polyvalerolactones, poly-s-decalactones, polylactides, polyglycolides, copolymers of polylactides and polyglycolides, poly-s-caprolactone, polyhydroxybutyric acid, polyhydroxybutyrates,
  • Polyhydroxyvalerates polyhydroxybutyrate-co-valerates, poly (1,4-dioxane-2,3-diones), poly (1,3-dioxan-2-ones), poly-para-dioxanones, polyanhydrides such as
  • Polymaleic anhydrides polyhydroxymethacrylates, poly (lactate-co-glycolic acid), fibrin, polycyanoacrylates, polycaprolactone dimethyl acrylates, poly-b-maleic acid, polycaprolactone butyl acrylates, multiblock polymers, e.g. from oligocaprolactone diols and oligodioxanonediols, polyetherester multiblock polymers such as e.g.
  • Polyhydroxypentanoic acid polyethylene oxide-propylene oxide, soft polyurethanes, polyurethanes with amino acid residues in the backbone, polyether esters such as Polyethylene oxide, polyalkene oxalates, polyorthoesters and their copolymers, carrageenans, fibrinogen, starch, collagen, protein-based polymers, polyamino acids, synthetic polyamino acids, zein, polyhydroxyalkanoates, pectinic acid, actinic acid, fibrin, casein, carboxymethylsulfate, albumin, hyaluronic acid, heparan sulfate, heparin, chondroitin sulfate , Dextran, ⁇ -cyclodextrins, copolymers with PEG and polypropylene glycol, gum arabic, guar, gelatin, collagen, collagen N-hydroxysuccinimide, lipids and lipids, polymerizable oils with low degree of crosslinking, modifications
  • the coatings according to the invention for medical products and compositions for medical or cosmetic procedures are particularly suitable for the prevention, reduction or treatment of vascular or restenoses, and in vascular injuries, vascular interventions, bypass supplies, in coronary heart disease or arterial disease, valvular heart disease, varicosis, vasculitis, lymphangitis, Erysipelas, extracorporeal circulation, for keeping open artificial or natural exits (eg stomata).
  • the medical devices according to the invention are suitable for the treatment and prophylaxis of restenosis.
  • the medical devices according to the invention for treatment with artificial blood conductors or pumps is understood to mean endoprostheses, for example of PTFE, PET, polyester, etc. for use in or instead of a natural blood vessel or pump systems for intracorporeal or extracorporeal circulation and their connections, eg of PU, PTFE , Polyesther, uam.
  • This also includes the application to Pachmaterialien which may consist of polyester or allogenic or xenogeneic tissue.
  • the medical devices are coated with a viscoelastic layer consisting of the phospholipids according to the invention. It has been found that the lubricity of such coated medical devices in the vascular system is improved.
  • nitrocarboxylic acid-containing phospholipids disclosed herein are used to coat medical devices, particularly to improve the lubricity of medical devices.
  • lubricity of tissue-contacting medical devices is improved, and more particularly, of catheters, angioplasty catheters, dilatation catheters, catheter balloons, guidewires, guiding catheters, stents and other medical devices for use in blood vessels.
  • tissue replacement materials such as artificial tendons, and bone replacement materials.
  • a coating to improve lubricity may be advantageous in device implants, but also soft tissue implants such as breast implants.
  • lubricity enhancement refers to lubricity of the coated medical device when inserted and advanced into a preformed or non-preformed body cavity that is superior to the lubricity of the uncoated medical device when inserted into tissue layers or cavities.
  • the monolayers, bilayer systems or multilayer systems on a stent, a balloon catheter or other implants are preferably applied by spraying, spin-coating, dipping, pipetting, chemical vapor deposition (CVD) and atomic layer deposition (ALD), but more preferably by dipping and vapor deposition.
  • CVD chemical vapor deposition
  • ALD atomic layer deposition
  • the preferably uncoated or covered with a hemocompatible layer surface of the stent or the preferably uncoated surface of the balloon catheter is coated with a nitrocarboxylic acid (s) -containing phospholipid coating solution.
  • Phospholipids can form self-assembled monolayers (SAM) by dip coating on suitable surfaces.
  • SAM forms spontaneously when immersing surfactants or organic substances in a solution or suspension.
  • the film formation can be assisted by a previous coating of the surface with a covalently bonded alkane layer, e.g. in the form of alkanethiols, whereby the physisorbed carbon chains of the phospholipids receive high physical adherence.
  • Hydrophobic molecules, such as cholesterol, incorporated into the phospholipid membranes have been described as being suitable for the formation of focal adhesion points necessary for cell adhesion and cell migration on a surface. Cholesterol and related substances can be readily integrated into an artificial phospholipid layer in a known manner.
  • cell adhesion proteins such as cell adhesion proteins.
  • B. RDG tripeptides RDG tripeptides.
  • Physisorption is the general form of adsorption in which an adsorbed molecule is bound by physical forces on a substrate.
  • the implant is dipped in a tank or container containing the coating solution. The procedure is repeated until a complete and even distribution of coating on the implant surface is achieved.
  • the implant may optionally be immersed in the tank while permanently changing its position, e.g. through a rotation.
  • the dipping process is also suitable for polymers. If a polymer layer is applied, the coated implant can be dried by rotary drying after the dipping process.
  • Another preferred coating method is vapor deposition. This method is particularly advantageous for the production of very thin layers, in which the layer thickness and uniformity of the coating must be well controlled, such as the individual phospholipid or drug layers.
  • a fine nozzle or cannula is attached to the medical device and the coating solution is sprayed onto the medical device.
  • This method allows accurate and precise coating of the surface of the medical device.
  • This method is equally suitable for the nitrocarboxylic acid-containing phospholipids, the active compounds and the polymers of the invention.
  • Particularly preferred is the method for coating the medical device with drug solutions and polymers.
  • This method should be carried out with any coating solution which is still so viscous that it is drawn over the medical device within 5 minutes, preferably 2 minutes due to adhesive forces or additionally by utilizing gravity, and covers the medical device largely completely.
  • the medical device is immersed in a liquid vertically and slowly pulled out again.
  • the so-called Langmuir-Blodgett layer transfers as a monolayer of organic molecules from the surface of the liquid to the medical device.
  • the organic molecules used form a film.
  • the number of dipping operations can control the number of monolayers and thus the thickness of the coating.
  • the hydrophobic end of the organic molecule aligns with the hydrophobic surface of the medical device while the hydrophilic end of the organic molecule orients toward the water. This can be reversed by repeated immersion and withdrawal, since there is once a hydrophobic and once a hydrophilic end on the surface of the medical device. Therefore, in this coating method, organic molecules having both a hydrophilic and a hydrophobic end are preferred. This technique is particularly suitable for coating with phospholipids and long-chain fatty acids.
  • nonpolar long-chain molecules such as the said phospholipids
  • a detergent solution Suitable detergents for this purpose are, for example, cholate, deoxycholate, octyl-glucoside, heptyl-glucoside and Triton X-100. This solution is then dialyzed to remove the detergent.
  • the phospholipids can form in this way liposomes on the surface of the medical device to be coated.
  • the medical device is attached by vacuum suction on the bottom of a turntable.
  • a metering device above the center of the medical device the desired amount of the solution is applied.
  • a uniform coating with a film is achieved.
  • Excess coating solution, however, is thrown away by the centrifugal forces acting.
  • FIG. 1 shows investigations on the effects of nitrocarboxylic acids
  • the first line shows the
  • the tested substances are: PC: phosphatidylcholine, SOPC (1-stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-PC), DOPC (1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-PC),
  • POPC 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-PC
  • ONOPC 1-oloyl-2- (E-9-nitrooleoyl) -sn-glycero-3-PC
  • PNLPC 1-palmitoyl- 2- (E-9-nitrolinoleoyl-sn-glycero-3-PC) and the free fatty acids OA (oleic acid), LA (linoleic acid), NOOA (E-9-nitrooleic acid) and NOLA (E-9-nitrolinolic acid).
  • FIG. 2 shows investigations on the effects of nitrocarboxylic acids
  • the tested substances are: SOPC, DOPC, POPC, ONOPC, PNLPC and the free fatty acids OA, LA, NOOA and NOLA.
  • the first two lines show the effect of the tested substances on the proliferation of the cells after incubation with concentrations of ⁇ ⁇ and ⁇ ⁇ after 24h, 48h or 72h. Shown are the relative numbers (%) of cells compared to the untreated control. The following two lines show the cell detachment after each 24h and 72h preincubation with the substances 10 and
  • Figure 3 shows studies on the stability of nitrocarboxylic acid containing
  • Balloon catheter applied by the Langmuir-Schäfer method The table shows the relative (%) change in substance volume after 24 h, after heat treatment and after the slide examination as well as the relative change of the tensile work compared to an uncoated balloon catheter.
  • FIG. 4 a shows investigations on long-term erythrocyte stability
  • FIG. 4b shows studies on mast cell activation with mastoparan.
  • cells were first preincubated with the natural phospholipids SOPC and PLPC and the analog phospholipids with nitration of the unsaturated fatty acids SNOPC and PNLPC for one hour and then with
  • the Ca 2+ influx was determined by normalizing the calcium influx to the respective baseline measurement and expressing it as a percentage increase.
  • histamine release from the C2 cells was determined by histamine ELISA and expressed in ng / ml.
  • FIG. 4 c shows investigations for the examination of the influence on the mechanical
  • Phospholipids SOPC and PLPC as well as the analog phospholipids with nitration of the unsaturated fatty acids SNOPC and PNLPC.
  • erythrocyte samples were treated in an ultrasonic bath at a temperature of 30 ° and 50 ° C for two and five minutes at 10 watts. Subsequently, the samples were centrifuged and the supernatant analyzed. Shown are the hemolysis rates in percent.
  • Figure 4d shows examinations for testing the influence on the osmotic
  • Phospholipids SOPC and PLPC as well as the analog phospholipids with nitration of the unsaturated fatty acids SNOPC and PNLPC.
  • Purified, resuspended erythrocytes were placed in distilled water and NaCI solutions increasing in concentration from 0.1 to 1.0 g / dl.
  • the photometrically determined hemoglobin concentration of a completely lysed reference sample was related to the hemoglobin concentration determined in each case.
  • the Y-axis indicates the relative hemolysis fraction.
  • Figure 5 shows studies on cell vitality after pretreatment with NaCl solution or the natural phospholipids SOPC and PLPC and the analogous phospholipids with nitration of the unsaturated fatty acids SNOPC and PNLPC with a concentration of 10 and 50 ⁇ / ⁇ or nitrofatty acids nitrooleate (NOA) and nitrolinolate (NLA) in a concentration of 10 or 30 ⁇ . Subsequently, the cells were washed with
  • Cisplatin 25 and 50 ⁇ / ⁇
  • cyclosporin 50 and 100 ⁇ / ⁇
  • lipopolysaccharide LPS
  • the table shows the number of dead cells after treatment with a concentration of 10 / 50 ⁇ for the related PL, as well as 10 / 30 ⁇ for the related fatty acids in relation to the absolute
  • Figure 6 shows studies on the vitality of porcine uterine arteries, with the natural phospholipids POPC and SLPC and the analogous Phospholipids with nitration of the unsaturated fatty acids (1-palmitoyl-2- (E-9-nitrooleoyl) -sn-glycero-3-PC and 1-stearoyl-2- (E-9-nitrolinoleoyl) -sn-3-glycero-phosphatidylcholine were pretreated and then incubated for one hour at 15 bar in a pressure chamber. The evaluation was carried out via a TUNEL staining (TUNEL positive cells in%) and the determination of the microparticles in cell culture supernatant (microparticles / ⁇ ).
  • TUNEL staining TUNEL positive cells in
  • FIG. 6a The values determined were statistically significant
  • FIG. 7 shows investigations on the membrane-stabilizing effects of
  • the vessel segments were incubated in NaCl solution, a NaCl solution with natural phospholipids SOPC and PLPC and the analogous phospholipids with nitration of the unsaturated fatty acids SNOPC and PNLPC in a concentration of 200 mmol / l for one hour.
  • the isometric force development under noradrenaline (arteries) as well as histamine stimulation (veins) (tensile strength in grams) as well as the vascular dilatation under acetylcholine was investigated.
  • a native vessel segment which was not frozen, was similarly examined and the value determined for the treated vessel segments was reproduced as a percentage compared to the native control.
  • FIG. 7a The values determined were statistically significant
  • Figure 8 shows studies on effects of nitrocarboxylic acid (s) -containing
  • the oocytes were previously treated with phospholipids SOPC and PLPC as well as the analog phospholipids with nitration of the unsaturated fatty acids SNOPC and PNLPC in a concentration of 50 mmol / l, furthermore with the natural fatty acids oleic acid and linoleic acid as well as nitrooleic acid and nitrolinolic acid in each case in a concentration of 30 ⁇ incubated for 10 and for 60 minutes.
  • Non-pretreated oocytes served as control, the measurement results of which were assumed to be the reference value. After pretreatment there was an increase and decrease in the inducible inone stream, which is expressed as a percentage of the reference.
  • FIG. 8a The values determined were statistically significant
  • Soft tissue implant material with phospholipids containing nitrocarboxylic acids on the tissue reaction in vivo Soft tissue implant material with phospholipids containing nitrocarboxylic acids on the tissue reaction in vivo.
  • sterile silicone pads were used as the implant material, which by spray coating in two layers with the natural phospholipids SOPC and PLPC as well as the analogous phospholipids with nitration of the unsaturated fatty acids SNOPC and PNLPC were coated or left untreated.
  • the silicone pads were inserted into Wistar rats and the cellular response and fibrous tissue formation after implantation evaluated according to the following key.
  • A) Cellular reaction A1: none; A2: isolated monocytic cells or lymphocytes; A3: moderate number or groups of monocytic cells or lymphocytes; A4: Dense infiltrate of monocytes, eosinophils or giant cells.
  • FIG. 10a shows investigations on the effects of phospholipids containing nitrocarboxylic acids on the dimerization properties of a
  • FIG. 10b shows the effect of phospholipids containing nitrocarboxylic acids on the anisotropy in vesicles as a function of the temperature.
  • the anisotropy is plotted on the y-axis and the temperature on the x-axis.
  • PNOPE 1 Palmitoyl-2- (E-9-nitrooleoyl) -sn-3-glycero-phosphatidylethanolamine
  • NPL nitrocarboxylic acid
  • acid chloride 4 may be a nitrosol acid chloride or a non-nitrided acid chloride.
  • fatty acid 2 a nitrofatty acid or a non-nitrated fatty acid may also be used.
  • nitrocarboxylic acid-containing phospholipids wherein R 1 COO- is a non-nitrated carboxylic acid residue and R 2 COO- is a nitrocarboxylic acid residue requires two consecutive regioselective esterifications. Due to the base-sensitive nitrocarboxylic acids, the selective esterification of the sn-1 position must first be carried out with a suitable fatty acid constituent (eg palmitoyl chloride). For this purpose, a method published by Servi was modified.
  • a suitable fatty acid constituent eg palmitoyl chloride
  • the sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a is converted with dibutyltin oxide into the cyclic dibutyltin diester which is then converted in situ with the acid chloride of the carboxylic acid 4a and triethylamine into the monoester 5a (analogous to Servi, Org , 2974 and Servi, Chem. Phys. Lipids 2007, 147, 1 13).
  • This can be worked up and cleaned with standard methods.
  • the 1-acyl-2-lyso-sn-3-glycero-phospholipids 5a are subsequently converted into the lipid 6a according to the advanced method of Salomon (Salomon, Biorg. & Med. Chem. 2011, 19, 580) with a nitrocarboxylic acid esterified.
  • the sn-1 position can be selectively liberated here to the 1 -lyso compound 10 '(analogous to J. Sakakibara, Tetrahedron Lett. 1993, 34, 2487), a final esterification according to R. Salomon (Biorg. & Med. Chem. 2011, 19, 580) then provides the unsymmetrically substituted 1-nitroacyl-2- (acyl) -sn-3-glycero-phosphatide 10, which, after careful cleaning, used for the coatings becomes.
  • Example B Synthesis of 1,2-di- (9-nitrooleoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine 3a sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a is commercially available or prepared in a known manner from egg or soy lecithin. 1a could be esterified with nitrooleic acid according to the method developed by RG Salomon (Salomon, Biorg. & Med. Chem. 2011, 19, 580).
  • the solvent is removed in vacuo and the oily residue dissolved in 10 ml of EtOH.
  • the lyso compound 5a is precipitated by adding 40 ml of acetone at -10 ° C.
  • the compound can be purified by HPLC. (Phenomenex Gemini NX 5 ⁇ C18 1 10 A, 95% MeOH / H 2 O). Yield: 0.9 g (1 .8 mmol, 45%) of 5a as a white solid. (Purity control via HPLC, 1 H and 13 C NMR spectroscopy).
  • R 1 COO and R 2 COO- represent a nitrated or non-nitrated and preferably a non-nitrated Carbonklarrest. Since the nitrated carboxylic acid residues R 1 COO- and / or R 2 COO are base-sensitive and can be destroyed by the reaction in pyridine, it is advisable to use for R 1 COO as well as R 2 COO non-nitrated carboxylic acid residues. The non-nitrated carboxylic acid residues R 1 COO- and R 2 COO- can then be re-saponified by NaOMe in methanol and washed with nitrated carboxylic acid residues as described herein reesterify.
  • R 3 * herein means one of the protected head groups listed at 8b, 8c, 8d and 8e.
  • R 1 COO- and R 2 COO- are palmitoyl radicals.
  • Tris-Cl triisopropylbenzenesulfonyl chloride
  • N- (BOC) -ethanolamine 137 mg, 0.85 mmol
  • Di- (palmitoyl-sn-3-glycerophosphate 7 500 mg, 0.85 mmol) in pyridine added via syringe pump The mixture is stirred for 5 hours at 35 ° C.
  • reaction is then terminated by hydrolysis with water, after phase separation
  • aqueous phase is extracted with dichloromethane and the organic phases are dried over Na 2 SO 4 and, after the solvent has been removed by evaporation (removal with toluene to remove the pyridine), the residue is purified by preparative column chromatography on silica gel (EtOAc / hexane). Yield 559.2 mg (0.765 mmol, 90%) 9c. (Purity control via HPLC, 1 H and 13 C NMR spectroscopy).
  • Example E Preparation of 1,2-di- (palmitoyl-sn-3-glycerophosphatidyl- (N-BOC) - (S) -serine-tert-butyl ester 9d:
  • Example F Preparation of 1, 2-di-palmitoyl-sn-3-glycerophosphatidyl-penta-O-methoxymethylinositol 9e:
  • Example G Preparation of sn-3-glycero-di-tert-butyl phosphate 1 b analogously to J. Brimacombe (J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 1995, 1673) or H. Brockerhoff, M. Yurkowski ⁇ Can. J. Biochem., 1965, 43, 1777).
  • the starting material di- (palmitoyl-sn-3-glycero-di-tert-butyl phosphate 9b is prepared according to P. Konradsson, (J. Org. Chem., 2002, 67, 194)
  • a solution of di- (palmitoyl-sn-3 Glycerol di-tert-butyl phosphate 9b (600 mg, 0.871 mmol) is dissolved in diethyl ether / methanol (50 ml, 1: 1) and treated with a catalytic amount of sodium methoxide
  • Amberlite 1 becomes R120
  • the solvents are removed in vacuo and the residue is recrystallized or purified by preparative column chromatography (silica gel, chloroform / MeOH gradient) or preparative HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 ⁇ C18 1 10 A, 9Gradient MeOH / H 2 O).
  • nitrocarboxylic acids can be carried out according to two strategies.
  • the direct nitration can be carried out starting from the commercially available carboxylic acid.
  • regioisomeric products which must be finally separated, unless they are used as a mixture.
  • the polyunsaturated starting materials require carefully elaborated techniques.
  • a second strategy starts with selected nitroalkanes and aldehydes, which are then converted into nitroalkene in the sense of a Henry reaction followed by condensation.
  • Unsaturated and polyunsaturated carboxylic acids can be radically nitrated analogously to Ishibashi (Org. Lett. 2010, 12, 124).
  • the example of linoleic acid [(Z, Z) -9,12-octadecadienoic acid] describes the radical nitration, which leads to regioisomer mixtures. It is usually advisable to replace the gaseous toxic N 2 O 4 with the combination of FeCl3 Fe (NOs) 3.
  • Linoleic acid 1 (840 mg, 3 mmol) and FeCb (730 mg, 4.5 mmol) are dissolved in THF (30 mL). Then Fe (NOs) 3-nonahydrate (1.46 mg, 3.6 mmol) is added and the reaction is refluxed for 2 hours. After cooling to room temperature, a mixture of ⁇ -chloro-nitroalkanes 2 and nitroalkenes 3/4 is present. To complete the HCl elimination then dilute with THF (20 mL) N, N-dimethylaminopyridine (550 mg, 4.5 mmol) is added. After stirring overnight at room temperature, the suspension is diluted with diethyl ether and the solid (iron and ammonium salts) is filtered off.
  • the solvents are distilled off in vacuo and the residue is pre-purified by preparative column chromatography on silica gel (hexane / ethyl acetate gradient) and pre-separated.
  • the fine purification is carried out by preparative HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 ⁇ C18 1 10 A, gradient MeOH / H 2 O).
  • Arachidonic acid 9 (100 mg, 0.33 mmol) is treated with a solution of NO 2 in hexane (0.7 mM, density 3.4 g / cm 3 ) and stirred at room temperature for 15 min. Excess NO2 is then purged in the nitrogen stream and the residue is taken up in water and EtOAc (1: 1, 10 mL). The organic phase is extracted several times with water, then the solvent is distilled off. The residue is analyzed by HPLC and separated (Phenomenex Gemini NX 5 ⁇ C18 1 10 A, gradient MeOH / H 2 O). There are formed various regioisomer Mononitnanss employment with low yield and other unspecified compounds.
  • 6-nitroarachidonic acid 10 (6 mg, 0.017 mmol, 5.2%), 14-nitroarachidonic acid 11 (8 mg, 0.023 mmol, 6.9%), 5-nitroarachidonic acid 12 (3 mg, 0.009 mmol, 2.6%).
  • Purity control via HPLC, 1 H and 13 C NMR spectroscopy (Purity control via HPLC, 1 H and 13 C NMR spectroscopy).
  • Example H2 According to the procedure of Example H2, (Z, Z, Z, Z, Z, Z, Z) -4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic acid (DHA) (100 mg, 0.30 mmol) is nitrated. Analysis and separation via HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 ⁇ C18 1 10 A, gradient MeOH / H 2 O). There are formed various regioisomer Mononitn proceedingss occur with low yield and other unspecified compounds. A mixture of 4-nitro-DHA, 5-nitro-DHA, 19-nitro-DHA and 20-nitro-DHA was isolated in a yield of about 7.1%.
  • cis-9-hexadecenoic acid (palmitoleic acid) (200 mg, 0.79 mmol) is nitrated. Analysis and separation via HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 ⁇ C18 1 10 A, gradient MeOH / H 2 O). A mixture of 9-nitropalmitoleic acid (68 mg, 0.23 mmol, 29%) and 10-nitropalmitoleic acid (52 mg, 0.17 mmol, 22%) was obtained.
  • the electrophilic nitration of linoleic acid 1 is carried out according to M. d'lschia (J. Org. Chem. 2008, 73, 7517).
  • the precipitate (AgBr) is removed by filtration through a short celite column (thorough rinsing with diethyl ether). After removal of the solvents in vacuo, the residue was taken up in dichloromethane and washed several times with saturated NaCl solution and dried over Na 2 SO 4 . After renewed removal of the solvent, the residue is purified by preparative HPLC chromatography separated (Phenomenex Gemini NX 5 ⁇ C18 1 10 A, gradient MeCN / H 2 O). The main fractions are the two regioisomers 9/10-nitro-10/9-phenylselenyl-fatty acid derivatives 17 obtained as diastereomer mixtures. The fractions can be used together or separately in the following eliminations.
  • the fractions 17a and / or 17b are dissolved in dichloromethane (10 ml) and treated with vigorous stirring with an excess of aqueous H2O2 (about 8% in H 2 0, at least 4 eq.). After 1 hour at 0 ° C and one hour at room temperature, diluted with ether, the phases are separated and the organic phase is thoroughly washed with saturated NaCl solution and dried over Na 2 SO. 4 After removal of the solvation, the residue is separated by preparative HPLC chromatography (Phenomenex Gemini NX 5 ⁇ C18 1 10 A, MeCN / H 2 O).
  • Example 12 Electrophilic nitration of gadoleic acid
  • the nitration is carried out as described in Example 11.
  • aqueous tetrabutylammonium hydroxide solution and dichloromethane adds the Nitroalkene smooth H 2 O.
  • the 9-hydroxy-10-nitro-12-octadecenoic acid 19 is obtained from 10-nitrolinolic acid 4 and the 10-hydroxy-9-nitro-12-octadecenoic acid 18 from the 9-nitrolinolic acid 3rd work-up described in Example 11. Purification via preparative HPLC as in Example 11. The respective separation of the diastereomers is possible, but expensive.
  • 9-hydroxy-10-nitro-12-octadecenoic acid 19 we obtained in a yield of 10% and 10-hydroxy-9-nitro-12-octadecenoic acid 18 in a yield of 30%.
  • Example J2 Addition of water to nitrated gadoleic acid
  • Example J1 -9-eicosenoic acid (gadoleic acid) (150 mg, 0.48 mmol) is reacted with aqueous solution of tetrabutylammonium hydroxide and dichloromethane. It takes place addition of water and there is a product mixture of 10-hydroxy-9-nitroeicosanklare and 9-hydroxy-10-nitroeicosanklare in a ratio of about 5: 2 and a yield of about 30% (54 mg mixture, 0.86 mmol mixture). Analysis and separation via HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 ⁇ C18 1 10 A, gradient MeOH / H 2 O). The diastereomers can be separated, which is complicated and for the purposes of the present invention is not required.
  • Example J3 Addition of water to nitrated EPA
  • Example J1 According to the procedure of Example J1 nitrated according to Example 13 ( ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ ) - 5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid (EPA) (100 mg, 0.33 mmol) with aqueous Implemented tetrabutylammonium hydroxide solution and dichloromethane. It takes place addition of water and there is a product mixture of 6-hydroxy-5-nitro-EPA (14 mg) and 5-hydroxy-6-nitro-EPA (5 mg) in a ratio of about 5: 2 and a yield of about 16% (0.05 mmol). Analysis and separation via HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 ⁇ C18 1 10 A, gradient MeOH / H 2 O). The diastereomers can be separated, which is very expensive and is not required for the purposes of the present invention.
  • EPA 5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid
  • Example J4 Addition of water to nitrated a-linolenic acid
  • Example J1 According to the procedure of Example J1 nitrated according to Example 14 ( ⁇ , ⁇ , ⁇ ) - 9,12,15-Octadecatrien Acid (a-linolenic acid) (150 mg, 0.54 mmol) with aqueous tetrabutylammonium hydroxide solution and dichloromethane. It takes place addition of water and there is a product mixture of 10-hydroxy-9-nitro- ⁇ -linolenic acid and 9-hydroxy-10-nitro- ⁇ -linolenic acid in a ratio of about 2: 1 and a yield of approx 26% (48 mg mixture, 0.14 mmol mixture). Analysis and separation via HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 ⁇ C18 1 10 A, gradient MeOH / H 2 O). The diastereomers can be separated, which is complicated and for the purposes of the present invention is not required.
  • Example K1 Electrophilic double-nitration of linoleic acid 1
  • Example K2 Electrophilic double nitration of gadoleic acid
  • Example K3 Electrophilic double nitration of EPA
  • Example 13 By repeating the nitration described in Example 13 with the nitration products obtained according to Example 13, a second nitration was carried out. A mixture of 5-nitro-EPA and 6-nitro-EPA (24 mg, 0.07 mmol) was used. A regioisomeric mixture of 5,17-dinitro-EPA, 5,18-dinitro-EPA, 6,17-dinitro-EPA and 6,18-dinitro-EPA was obtained in 10% yield (3 mg, 0.007 mmol).
  • Example K4 Electrophilic double-nitration of ⁇ -linolenic acid
  • Example 14 By repeating the nitration described in Example 14 with the nitration products obtained according to Example 14, a second nitration was carried out. A mixture of 9-nitro- ⁇ -linolenic acid and 10-nitro- ⁇ -linolenic acid (50 mg, 0.15 mmol) was used. A regioisomer mixture of 9,15-dinitro- ⁇ -linolenic acid, 9,16-dinitro- ⁇ -linolenic acid, 10,15-dinitro- ⁇ -linolenic acid and 10,16-dinitro- ⁇ -linolenic acid was obtained in a yield of 9% (cf. 5 mg, 0.014 mmol).
  • Example L1 Henry's reaction of nitroalkanes and aldehydes
  • the stereoisomeric E-9-nitroolic acid 25a can be separated off at the methyl ester 24a stage as a minor product (389 mg, 10% yield). Purity control via 1 H and 13 C NMR spectroscopy). A Z / E isomerization of Z-9-nitroolic acid 24a was achieved by Branchaud (1 PhSeSePh, NaBH, then HOAc, 2H2O2) using 1 mmol (207 mg) of acid 24a in 71% yield as Z / E. Mixture of 1: 3, the separation of nitroolefins 24a and 25a by HPLC as above, purity control via 1 H and 13 C NMR spectroscopy).
  • Example L1 Reaction according to Example L1 with 9-oxo-nonanoic acid methyl ester 26 (1, 0 g, 5.38 mmol) and 1 -nitroheptane 27b (0.78 g, 5.38 mmol) over the sequence described in Example L1 gives the 10-nitropalmitoleic acid 30b with 38.5% (620 mg, 2.07 mmol) yield over all steps.
  • HPLC purification Phenomenex Gemini NX 5 ⁇ C18 1 10 A, MeCN / H 2 O). (Purity control via 1 H and 13 C NMR spectroscopy).
  • HPLC purification Phenomenex Gemini NX 5 ⁇ C18 1 10 A, MeCN / H 2 O). (Purity control via 1 H and 13 C NMR spectroscopy).
  • Example N1 Synthesis of the mixture of 1,2-di- (9-nitrolinoleoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine, 1,2-di- (10-nitrolinoleoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine, 1 - ( 9-nitrolinoleoyl) -2- (10-nitrolinoleoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine and 1- (10-nitrolinoleoyl) -2- (9-nitrolinoleoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine
  • Example B sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (103 mg, 0.4 mmol) was treated with a mixture of 9- Nitrolinolic acid 3 and 10-nitrolinolic acid 4 (mixture in the ratio 1: 1, 0.4 g, 1, 2 mmol) esterified.
  • Example N2 nitrolinolic acid ester of sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a
  • Example B sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (0.13 g, 0.5 mmol) was treated with a mixture of 9-nitrolinolic acid 3, 10-nitrolinolic acid 4, 12-nitolinolic acid and 9- Nitro-10,1 1-octadienoic acid (mixture in the ratio 7: 12: 5: 2, 0.5 g, 1, 5 mmol) esterified. There was obtained a product mixture of differently esterified 1, 2-di (nitrolinoleoyl) -sn-glycero-3-phosphatidylcholinen in a yield of 61% (212 mg, 0.24 mmol). (Purity control via HPLC, 1 H and 13 C NMR spectroscopy).
  • Example N3 Nitroarachidonic acid ester of sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a
  • sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (0.13 g, 0.5 mmol) was treated with a mixture of 6- nitroarachidonic acid 10, 14-nitroarachidonic acid 11 and 5-nitroarachidonic acid 12 (mixture in the ratio 8: 6: 3, 0.45 g, 1, 5 mmol) esterified.
  • a product mixture of differently esterified 1,2-di (nitroarachidonoyl) -sn-glycero-3-phosphatidylcholines was obtained in a yield of 53% (244 mg, 0.27 mmol). (Purity control via HPLC, 1 H and 13 C NMR spectroscopy).
  • Example N4 nitroarachidonic acid ester of sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a
  • sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (0.13 g, 0.5 mmol) was treated with a mixture of 6- nitroarachidonic acid 14, 14-nitroarachidonic acid 15 and 5-nitroarachidonic acid 16 (mixture in the ratio 4: 5: 3, 0.45 g, 1, 5 mmol) esterified.
  • a product mixture of differently esterified 1,2-di (nitroarachidonoyl) -sn-glycero-3-phosphatidylcholines was obtained in a yield of 55% (253 mg, 0.28 mmol). (Purity control via HPLC, 1 H and 13 C NMR spectroscopy).
  • Example N5 Nitro-y-linolenic acid ester of sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a
  • Example B sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (0.13 g, 0.5 mmol) was treated with a mixture of 6-nitro-1-linolenic acid 14, 12-nitro-Y-linolenic acid obtained according to Example H4 15 and 5-nitro-Y-linolenic acid 16 (mixture in Ratio 4: 4: 1, 485 mg, 1, 5 mmol) esterified. There was obtained a product mixture of differently esterified 1, 2-di (nitro-Y-linolenoyl) -sn-glycero-3-phosphatidylcholinen in a yield of 59% (257 mg, 0.30 mmol). (Purity control via HPLC, 1 H and 13 C NMR spectroscopy).
  • Example N6 Nitro-DHA-ester of sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a
  • Example B sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (0.13 g, 0.5 mmol) was treated with a mixture of 4-nitro-DHA, 5-nitro-DHA, 19-nitrobenzene obtained according to Example H5. DHA and 20-nitro-DHA (0.56 g, 1.5 mmol) esterified. There was obtained a product mixture of differently esterified 1, 2-di (nitro-DHA) -sn-glycero-3-phosphatidylcholinen in a yield of 31% (150 mg, 0.16 mmol). (Purity control via HPLC, 1 H and 13 C NMR spectroscopy).
  • Example N7 Nitropalmitoleic acid ester of sn-glycero-3-phosphatidylcholine Following the procedure of Example B, sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (0.13 g, 0.5 mmol) was treated with a mixture of 9-nitropalmitoleic acid obtained according to Example H6 10-Nitropalmitoleic acid (mixture in the ratio 4: 3, 0.45 g, 1, 5 mmol) esterified.
  • sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (0.13 g, 0.5 mmol) was mixed with a mixture of 10-nitolinolic acid 4 and 9-nitrolinolic acid 3 (mixture in the ratio 1: 3 , 0.49 g, 1, 5 mmol) esterified.
  • Example B According to the procedure of Example B, sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (0.13 g, 0.5 mmol) was treated with a mixture of 9-nitrogadoleic acid and 10-nitrogadoleic acid obtained according to Example 12 (mixture in the ratio 2: 1, 0 , 53 g, 1, 5 mmol) esterified.
  • Example N10 Nitro-EPA ester of sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a
  • Example B According to the procedure of Example B, sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (0.13 g, 0.5 mmol) was treated with a mixture of 5-nitro-EPA and 6-nitro-EPA obtained according to Example 13 (mixture in the ratio 5 : 2, 0.46 g, 1.5 mmol) esterified.
  • Example N11 Nitro- ⁇ -linolenic acid ester of sn-glycero-3-phosphatidylcholine
  • Example B According to the procedure of Example B, sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (0.13 g, 0.5 mmol) was treated with a mixture of 9-nitro-a-linolenic acid and 10-nitro- ⁇ -linolenic acid (obtained according to Example 14). Mixture in the ratio 1: 2, 485 mg, 1, 5 mmol) esterified.
  • Example N12 Dinitrolinolic acid ester of sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a
  • sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (0.13 g, 0.5 mmol) was treated with a mixture of 9,12-dinitrolinolic acid, 9,13-dinitrolinic acid, 10,12- Dinitrolinolic acid and 10,13-dinitrolinolic acid (0.56 g, 1, 5 mmol) esterified.
  • Example N13 Dinitro EPA ester of sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a
  • Example B sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (0.13 g, 0.5 mmol) was reacted with a mixture of 5,17-dinitro-EPA, 5,18-dinitro-EPA obtained according to Example K2, Esterified 6,17-dinitro-EPA and 6,18-dinitro-EPA (0,59 g, 1, 5 mmol). There was obtained a product mixture of differently esterified 1, 2-di (dinitroeicosapentaenoyl) -sn-glycero-3-phosphatidylcholinen in a yield of 33% (165 mg, 0.17 mmol). (Purity control via HPLC, 1 H and 13 C NMR spectroscopy).
  • Example N14 Dinitro- ⁇ -linolenic acid ester of sn-glycero-3-phosphatidylcholine
  • Example B According to the procedure of Example B, sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (0.13 g, 0.5 mmol) was treated with a mixture of 9,15-dinitro- ⁇ -linolenic acid, 9,16-dinitro-acid obtained according to Example K4. ⁇ -linolenic acid, 10,15-dinitro- ⁇ -linolenic acid and 10,16-dinitro- ⁇ -linolenic acid (0.55 g, 1, 5 mmol) esterified.
  • Example B According to the procedure of Example B, sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (0.13 g, 0.5 mmol) was esterified with the E-9-nitroolic acid 25a (0.49 g, 1.5 mmol) obtained according to Example L1 , 1,2-Di - ((E) -9-nitrooleoyl) -sn-3-glycerophosphocholine was obtained in 75% yield (328 mg, 0.38 mmol). (Purity control via HPLC, 1 H and 13 C NMR spectroscopy).
  • Example N16 Synthesis of 1,2-di- (9-nitrooleoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine Following the procedure of Example B, sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (0.13 g, 0.5 mmol) esterified with the obtained according to Example L1 Z-9-nitroic acid 24a (0.49 g, 1, 5 mmol). 1,2-Di - ((Z) -9-nitrooleoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine was obtained in a yield of 74% (323 mg, 0.37 mmol). (Purity control via HPLC, 1 H and 13 C NMR spectroscopy).
  • Example N17 Synthesis of 1,2-di- (10-nitrooleoyl) -sn-3-glycerophosphocholine
  • Example B According to the procedure of Example B, sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (0.13 g, 0.5 mmol) was esterified with the 10-nitro-oleic acid 30a (0.49 g, 1.5 mmol) obtained according to Example L2. There was obtained 1, 2-di- (10-nitrooleoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine in a yield of 70% (306 mg, 0.35 mmol). (Purity control via HPLC, 1 H and 13 C NMR spectroscopy).
  • Example N19 Synthesis of 1,2-di- (Z-10-nitropalmitoleoyl) -sn-3-glycerophospho-choline
  • Example B According to the procedure of Example B, sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (0.13 g, 0.5 mmol) was esterified with the Z-10-nitropalmitoleic acid 30b (0.45 g, 1.5 mmol) obtained according to Example L4 , There was obtained 1, 2-di (Z-9-nitropalmitoleoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine in a yield of 70% (287 mg, 0.35 mmol). (Purity control via HPLC, 1 H and 13 C NMR spectroscopy).
  • Example B sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (0.13 g, 0.5 mmol) was reacted with the Z-15-nitro- ⁇ -linolenic acid obtained according to Example M1 (0.49 g, 1, 5 mmol) esterified. There was obtained 1, 2-di (Z-15-nitro-a-linolenoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine in a yield of 65% (282 mg, 0.33 mmol). (Purity control via HPLC, 1 H and 13 C NMR spectroscopy).
  • Example 01 Preparation of 1,2-di- (9-nitro-10-hydroxy-stearoyl) -sn-3-glycerophosphocholine ( ⁇ , Y-di (9-nitro-10-hydroxystearoyl) -La-phosphatidylcholine ) 3a1
  • the esterification according to R. Salomon (Biorg. & Med. Chem. 2011, 19, 580) can be directly adopted for the incorporation of further functionalized nitroolic acids.
  • Example 02 Preparation of 1-palmitoyl-2- (9-nitro-10-hydroxystearoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine ( ⁇ - (9-nitro-10-hydroxystearoyl) -Y-palmitoyl-l-phosphatidylcholine ) 6a1
  • Example 01 The reaction was carried out according to the procedure of Example 01, but employing racemic but regioisomerically pure 9-nitro-10-hydroxystearic acid the regioisomeric mixture of 9-hydroxy-10-nitrostearic acid and 9-nitro-10-hydroxystearic acid was used.
  • Example 04 Example 04:
  • Example O2 The reaction was carried out according to the procedure of Example O2, employing racemic but regioisomerically pure 9-nitro-10-hydroxystearic acid the regioisomeric mixture of 9-hydroxy-10-nitrostearic acid and 9-nitro-10-hydroxystearic acid was used.
  • Example J3 a mixture of 6-hydroxy-5-nitro-8,1 1, 14,17-eicosatetraenic acid and 5-hydroxy-6-nitro-8,1,1,14,17-eicosatetraenoic acid in a ratio of 5: 2 was prepared , Thereafter, according to Example 03 was the
  • Example J4 a mixture of 10-hydroxy-9-nitro- ⁇ -linolenic acid and 9-hydroxy-10-nitro- ⁇ -linolenic acid was prepared in a ratio of about 2: 1. Thereafter, according to Example O4, the regioisomer mixture of 10-hydroxy-9-nitro- ⁇ -linolenic acid and 9-hydroxy-10-nitro- ⁇ -linolenic acid in a ratio of about 2: 1 with 1-palmitoyl-2-lyso-sn 3-glycero-phosphocholine 5a (0.1 g, 0.202 mmol).
  • Example P1 Synthesis of the mixture of 1-oloyl-2- (9-nitropalmitoleoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine and 1-oloyl-2- (10-nitropalmitoleoyl) -sn-3-glycerophosphocholine
  • sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (1, 0 g, 3.9 mmol) was treated with dibutyltin oxide (1.1 g, 4.3 mmol, 1.1 equivalents (eq)) in 100 ml Isopropanol suspended, heated to reflux and then in a first esterification by adding 0.25 ml of triethylamine (7.8 mmol, 2 eq) with oleic acid chloride (2.35 g, 7.8 mmol, 2 eq). The yield of 1-oloyl-2-lyso-sn-3-glycerophosphocholine was 44% (0.89 g, 1.72 mmol).
  • the second esterification was carried out according to Example C by reacting 0.89 g (1.72 mmol) of 1-oloyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholine with the mixture of 9-nitropalmitoleic acid and 10-nitropalmitoleic acid obtained according to Example H6 (Mixture in the ratio 4: 3; 1, 03 g, 3.44 mmol) in dry dichloromethane with addition of (5.1 mmol, 3.0 eq) 1-methyl in idazol and 2,6-dichlorobenzoyl chloride (5, 7 mmol, 3.3 eq.).
  • Example P2 Synthesis of the mixture of 1-stearoyl-2- (10-nitrolinoleoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine and 1-stearoyl-2- (9-nitrolinoleoyl) -sn-3-glycerophosphocholine
  • sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (1.0g, 3.9mmol) was activated with dibutyltin oxide and then in a first esterification with stearic acid chloride (2.36g, 7.8mmol, 2 eq ) implemented.
  • the yield of 1-stearoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholine was 40% (0.82 g, 1.56 mmol).
  • the second esterification was carried out according to Example C by reacting 0.82 g (1, 56 mmol) of 1-stearoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholine with the mixture obtained according to Example 11 from 10-nitrolinolic acid 4 and 9- Nitrolinolic acid 3 (mixture in the ratio 1: 3; 1, 13 g, 3.44 mmol).
  • the mixture of 1-stearoyl-2- (10-nitrolinoleoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine and 1-stearoyl-2- (9-nitrolinoleoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine is obtained in 64% yield (0.78 g, 1.00 mmol).
  • Example P3 Synthesis of the mixture of 1-eircinyl-2- (9-nitrogadoleoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine and 1-erucinyl-2- (10-nitrogadoleoyl) -sn-3-glycerophosphocholine
  • sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (1.0g, 3.9mmol) was activated with dibutyltin oxide and then in a first esterification with erucic acid chloride (2.79g, 7.8mmol, 2 eq ) implemented.
  • the yield of 1-erucinyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholine was 36% (0.86 g, 1.48 mmol).
  • the second esterification was carried out according to Example C by reacting 0.86 g (1, 48 mmol) of 1-erucinyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholine with the mixture of 9-nitrogadoleic acid and 10-nitrogadoleic acid obtained according to Example 12 (Mixture in the ratio 5: 2; 1, 58 g, 4.44 mmol).
  • sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (1.0g, 3.9mmol) was activated with dibutyltin oxide and then in a first esterification with eicosapentaenoic acid chloride (2.50g, 7.8mmol, 2 eq ) implemented.
  • the yield of 1-eicosapentaenoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholine was 33% (0.70 g, 1.29 mmol).
  • the second esterification was carried out according to Example C by reacting 0.70 g (1, 29 mmol) of 1-eicosapentaenoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholine with the mixture of 5-nitro-EPA and 6 obtained according to Example 13 Nitro-EPA (mixture in the ratio 5: 2; 1, 34 g, 3.87 mmol).
  • Example P5 Synthesis of the mixture of 1- (5,8,1-eicosatrienoyl) -2- (9-nitro-a-linolenoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine and 1- (5,8,1-eicosatrienoyl) -2- (10-nitro-a-linolenoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine
  • sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (1, 0 g, 3.9 mmol) was activated with dibutyltin oxide and then in a first esterification with 5,8,1-eicosatrienoic acid chloride (2.54 g, 7.8 mmol, 2 eq).
  • the yield of 1- (5,8,1-eicosatrienoyl) -2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholine was 50% (1.06 g, 1.95 mmol).
  • the second esterification was carried out according to Example C by reacting 1.06 g (1.95 mmol) of 1- (5.8.1 1 -eicosatrienoyl) -2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholine with the product obtained according to Example 14 Mixture of 9-nitro- ⁇ -linolenic acid and 10-nitro- ⁇ -linolenic acid (mixture in the ratio 2: 1, 1, 89 g, 5.85 mmol).
  • Example P6 Synthesis of the mixture of 1-linoleoyl-2- (dinitrolinoleoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine
  • sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (1.0 g, 3.9 mmol) was activated with dibutyltin oxide and then in a first esterification with linoleic acid chloride (2.33 g, 7.8 mmol, 2 eq ) implemented.
  • the yield of 1-linoleoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholine was 57% (1.15 g, 2.22 mmol).
  • the second esterification was carried out according to Example C by reacting 1.15 g (2.22 mmol) of 1 -linoleoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholine with the mixture of 9,12-dinitrolinolic acid obtained according to Example K1, 9 , 13-Dinitrolinolic acid, 10,12-dinitrolinolic acid and 10,13-dinitrolinolic acid (2.49 g, 6.66 mmol).
  • sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (1.0g, 3.9mmol) was activated with dibutyltin oxide and then in a first esterification with palmitic acid chloride (2.14g, 7.8mmol, 2 eq ) implemented.
  • the yield of 1-palmitoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholine was 40% (0.77 g, 1.56 mmol).
  • the second esterification was carried out according to Example C by reacting 0.77 g (1, 56 mmol) of 1-palmitoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholine with the obtained according to Example 11 (E) -9-nitrolinolic (1 , 19 g, 3.12 mmol).
  • the 1-palmitoyl-2- (E-9-nitrolinoleoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine is obtained in a yield of 66% (0.83 g, 1.03 mmol).
  • Example P8 Synthesis of 1-palmitoyl-2- (Z-9-nitrooleoyl) -sn-3-glycerophosphocholine
  • sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (1.0g, 3.9mmol) was activated with dibutyltin oxide and then in a first esterification with palmitic acid chloride (2.14g, 7.8mmol, 2 eq ) implemented.
  • the yield of 1-palmitoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholine was 40% (0.77 g, 1.56 mmol).
  • the second esterification was carried out according to Example C by reacting 0.77 g (1, 56 mmol) of 1-palmitoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholine with the obtained according to Example L1 Z-9-nitroolic acid 24a (1, 02 g, 3.12 mmol).
  • the 1-palmitoyl-2- (Z-9-nitrooleoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine is obtained in 63% yield (0.79 g, 0.98 mmol).
  • Example P9 Synthesis of 1- (S) -lipoyl-2- (10-nitrooleoyl) -sn-3-glycerophosphocholine According to the procedure of Example P1, sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (1.0 g, 3.9 mmol) was activated with dibutyltin oxide and then in a first esterification with (S) -liponic acid chloride (1.75 g, 7.8 mmol, 2 eq). The yield of 1- (S) -lipoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholine was 31% (0.54 g, 1.21 mmol).
  • the second esterification was carried out according to Example C by reacting 0.54 g (1.21 mmol) of 1- (S) -lipoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholine with the 10-nitroolic acid 30a obtained according to Example L2 ( 0.79 g, 2.24 mmol).
  • the 1- (S) -lipoyl-2- (10-nitrooleoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine is obtained in 51% yield (0.44 g, 0.62 mmol).
  • sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (1.0 g, 3.9 mmol) was activated with dibutyltin oxide and then in a first esterification with behenic acid chloride (2.80 g, 7.8 mmol, 2 eq ) implemented.
  • the yield of 1-behenyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholine was 30% (0.68 g, 1.17 mmol).
  • the second esterification was carried out according to Example C by reacting 0.68 g (1, 17 mmol) of 1-behenyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholine with the obtained according to Example L3 Z-9-Nitropalmitoleic acid 24b (0, 71 g, 2.34 mmol).
  • the 1-behenyl-2- (Z-9-nitropalmitoleoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine is obtained in 42% yield (0.42 g, 0.49 mmol).
  • Example P11 Synthesis of 1-DHA-2- (Z-10-nitropalmitoleoyl) -sn-3-glycerophosphocholine
  • sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (1.0g, 3.9mmol) was activated with dibutyltin oxide and then in a first esterification with docosahexaenoic acid chloride (2.71g, 7.8mmol, 2 eq ) implemented.
  • the yield of 1-docosahexaenyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholine was 25% (0.55 g, 0.98 mmol).
  • the second esterification was carried out according to Example C by reacting 0.55 g (0.98 mmol) of 1-docosahexaenyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholine with the Z-10-nitropalmitoleic acid 30b obtained according to Example L4 (0, 67 g, 2.2 mmol).
  • the 1-docosahexaenyl-2- (Z-10-nitropalmitoleoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine is obtained in a yield of 31% (0.26 g, 0.30 mmol).
  • Example P12 Synthesis of 1-linolenoyl-2- (Z-15-nitro-a-linolenoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine
  • sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (1.0 g, 3.9 mmol) was activated with dibutyltin oxide and then in a first esterification with linoleic acid chloride (2.33 g, 7.8 mmol, 2 eq).
  • the yield of 1-linoleoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholine was 60% (1.21 g, 2.34 mmol).
  • the second esterification was carried out according to Example C by reacting 1.21 g (2.34 mmol) of 1 -linoleoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholine with the Z-15-nitro- ⁇ -linolenic acid obtained according to Example M1 41 (0.77 g, 2.4 mmol).
  • the 1-linoleoyl-2- (Z-15-nitro-a-linolenoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine is obtained in 55% yield (0.55 g, 0.67 mmol).
  • sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (1.0g, 3.9mmol) was activated with dibutyltin oxide and then in a first esterification with stearic acid chloride (2.36g, 7.8mmol, 2 eq ) implemented.
  • the yield of 1-stearoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholine was 40% (0.82 g, 1.56 mmol).
  • the second esterification was carried out according to Example C by reacting 0.82 g (1, 56 mmol) of 1-stearoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholine with the obtained according to Example 11 (E) -9-nitrolinolic acid (0 , 89 g, 2.34 mmol).
  • 1-Stearoyl-2- (E-9-nitrolinoleoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine is obtained in a yield of 61% (0.79 g, 0.95 mmol).
  • sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (1.0g, 3.9mmol) was activated with dibutyltin oxide and then in a first esterification with stearic acid chloride (2.36g, 7.8mmol, 2 eq ) implemented.
  • the yield of 1-stearoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholine was 40% (0.82 g, 1.56 mmol).
  • the second esterification was carried out according to Example C by reacting 0.82 g (1, 56 mmol) of 1-stearoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholine with (E) -9-nitroolic acid (0.77 g, 2 , 34 mmol).
  • 1-Stearoyl-2- (E-9-nitrooleoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine is obtained in 64% yield (0.83 g, 1.00 mmol).
  • sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1a (1.0 g, 3.9 mmol) was activated with dibutyltin oxide and then in a first esterification with oleic acid chloride (2.35 g, 7.8 mmol, 2 eq ) implemented.
  • the yield of 1-oloyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholine was 44% (0.89 g, 1.72 mmol).
  • the second esterification was carried out according to Example C by reacting 0.89 g (1.72 mmol) of 1-oloyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholine with (E) -9-nitroolic acid (1, 13 g, 3.44 mmol).
  • 1-Oleoyl-2- (E-9-nitrooleoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine is obtained in 69% yield (0.99 g, 1.19 mmol).
  • Example Q 1- (9-nitrooleoyl) -2- (palmitoyl) -sn-3-glycero-phosphatidylcholine
  • Example R 1-Stearoyl-2- (E-9-nitrolinoleoyl) -sn-3-glycero-phosphatidylethanolamine
  • Example D sn-3-glycerophosphatidyl- (N-BOC) -ethanolamine 1c is prepared.
  • the sn-3-glycerophosphatidyl- (N-BOC) -ethanolamine 1c (1, 04 g, 3.3 mmol) is then activated according to Example P1 with dibutyltin oxide and then in a first esterification with stearic acid chloride (2.0 g, 6, 6 mmol, 2 eq) are reacted.
  • the yield of 1-stearoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphatidyl- (N-BOC) -ethanolamine was 48% (0.92 g, 1.58 mmol).
  • the second esterification was carried out according to Example C by reacting 0.92 g (1, 58 mmol) of 1-stearoyl-2-lyso-sn-3-glycerophosphatidyl- (N-BOC) -ethanolamine with the product obtained according to Example 11 ( E) -9-Nitrolinolic acid (0.89 g, 2.34 mmol).
  • 1-Stearoyl-2- (E-9-nitrolinoleoyl) -sn-3-glycerophosphatidyl- (N-BOC) -ethanolamine is obtained in a yield of 55% (0.78 g, 0.87 mmol).
  • the deprotection takes place. There is obtained 1-stearoyl-2- (E-9-nitrolinoleoyl) -sn-3-glycerophosphatidylethanolamine in a yield of 93% (0.64 g, 0.81 mmol).
  • Example S 1-Palmitoyl-2- (E-9-nitrooleoyl) -sn-3-glycero-phosphatidylethanolamine
  • sn-3-glycerophosphatidyl- (N-BOC) -ethanolamine 1c is prepared.
  • the sn-3-glycerophosphatidyl (N-BOC) -ethanolamine 1c (1, 04 g, 3.3 mmol) is then activated according to Example P1 with dibutyltin oxide and then in a first esterification with palmitic acid chloride (1, 81 g, 6, 6 mmol, 2 eq) are reacted.
  • the yield of 1-palmitoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphatidyl- (N-BOC) -ethanolamine was 50% (0.91 g, 1.65 mmol).
  • the second esterification was carried out according to Example C by reacting 0.91 g (1.65 mmol) of 1-palmitoyl-2-lyso-sn-3-glycerophosphatidyl- (N-BOC) -ethanolamine (E) -9-nitroolic acid (0.98 g, 3.0 mmol).
  • a commercially available LVM 316 stainless steel stent was degreased in an ultrasonic bath with acetone and ethanol (15 minutes) and dried at 100 ° C in a dry box. Thereafter, the stent was gently esterified for 7 minutes in a 1% solution of phosphatidylcholine with 9-nitro-cis-oleic acid (50%) and oleic acid (50%) in a mixture of ethanol / diethyl ether (50/50 (v / v)). ) and then dried at 100 ° C for 10 min. The dipping process and the subsequent drying were repeated two more times. Finally, the stent was washed overnight in ethanol (70%) and dried at 100 ° C for 15 min.
  • Nitrocarboxylic acid-containing phospholipids allow rapid and complete coverage of surfaces.
  • the blending of nitrated phospholipids with native phospholipids improves coating quality through greater completeness of coverage and by reducing multilayer formation as well as increasing the adhesion of the coating.
  • Example 2 Nitrocarboxylic acid-containing phospholipids allow rapid and complete coverage of surfaces. The blending of nitrated phospholipids with native phospholipids improves coating quality through greater completeness of coverage and by reducing multilayer formation as well as increasing the adhesion of the coating.
  • Example 2
  • tochloroctadecylsilane n-octyltriethoxysilane, n-butyltrimethoxysilane, n-decyltriethoxysilane, hexadecyltrimethoxysilane, isooctyltrimethoxysilane, 13- (trichlorosilylmethyl) -heptacosane, N-phenylaminomethyltrimethoxysilane, N-cyclohexylaminomethyltriethoxysilane, isooctyltriethoxysilane , Hexadecyltrimethoxysilane, phenyltriethoxysilane or dicyclopentyldimethoxysilane.
  • the stent was then removed, immersed in a Teflon beaker in chloroform, then immersed in methanol / chloroform (1: 1, v / v volume) and finally in methanol, and sonicated for 5 minutes each.
  • silane-coated stent is highly water repellent. If you immerse this stent in water and pull it out quickly and in a straight line, no water droplets stick to its surface.
  • silane-coated stent was then immersed in a solution of phosphatidylcholine (0.007 mmol per ml) in which the two fatty acid residues are nitrool acid residues in 5 ml of chloroform for 15 minutes, and dried in a nitrogen stream while rotating the stent.
  • the coating process was repeated a further 2 times.
  • the coating result is examined by confocal laser microscopy using fluorescein isothiocyanate as a fluorescent marker for the amine group of the choline residue.
  • the slides were rinsed several times with alcoholic solutions and finally transferred to a 10% ethanol bath for one hour, which was then replaced with a 0.9% NaCl solution in which the slides remained for an additional 15 minutes. After a final rinse, the slides were placed in a 20% FCS dish. The dishes were continuously agitated at 37 ° C for 1, 3, or 7 days. In a further experimental approach, the prepared slides were placed in culture dishes and 2,500 x 10 5 / ml fibroblasts were suspended in the culture dish where they could grow for 3 and 7 days, respectively. After completion of the cell culture studies, the cells were trypsinized and washed twice carefully. Thereafter, the cells were homogenized and prepared for scintillation measurement.
  • Radioactive labeled phospholipids were detected in the serum of samples with nitrated as well as non-nitrated phospholipid coatings. However, the level of samples of nitrated phospholipid coatings tended to be lower compared to samples of phospholipid coatings with native fatty acids. The level of phospholipids released from the coating after 24 hours could be determined to be less than 0.5% and increased to 0.7% on day 3 and to 0.8% on day 7. In the case of non-nitrated phospholipid coatings, the content of released phospholipids was measured correspondingly at 0.8%, 1.0% and 1.2%.
  • nitric oxide in the culture medium and in the adherent cells was measured. 1,2-Diaminoanthraquinone (Invitrogen) was used to measure nitric oxide in the culture medium and the DAF-FM nitric oxide indicator (Invitrogen) was used to measure accumulated nitric oxide within cells. Fibroblasts were transferred to a 1% DMSO solution to reach a cell density of 2,500 x 10 5 / ml. Cells were incubated for 30 min with DAF-FM, which was added to a concentration of 5 ⁇ .
  • 1,2-Diaminoanthraquinone Invitrogen
  • DAF-FM nitric oxide indicator Invitrogen
  • nitric oxide intracellularly and in the culture medium was determined by means of a confocal laser-scanning microscope (Fluoview 300, Olympus Europa) and a photomultiplier-based microfluorimetry (Seefelder Messtechnik, Germany).
  • nitric oxide production or accumulation was significantly higher in cell culture on uncoated slides than on coated slides, both intracellular and in culture medium. Nitric oxide production or accumulation was both higher intracellular and tend to be higher in culture medium in cultures grown with native fatty acid phospholipid coatings compared to those grown on nitrocarboxylic acid containing phospholipid coatings.
  • the higher content of nitric oxide in cultures on uncoated artificial surfaces compared to cultures on biocompatible surfaces can be interpreted as endogenous nitric oxide production as a result of the reaction and proliferation induction of the fibroblasts.
  • Example 1 To determine the adsorption of biomolecules on SAM coated with native and nitrocarboxylic acid-containing phospholipids, supports were prepared as in Example 1. Analogously, carriers were also coated with nitrocarboxylic acid-containing phospholipids according to Example N1, namely mixtures of 1,2-di (9-nitrolinoleoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine, 1,2-di (10) nitrolinoleoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine, 1- (9-nitrolinoleoyl) -2- (10-nitrolinol-oyl) -sn-3-glycero-phosphocholine and 1- (10-nitrolinoleoyl) -2- (9- nitrolinoleoyl) -sn-3-glycero-phosphocholine with nitrocarboxylic acid-containing phospholipids according to Example D (1,2-di- (9-nitrooleoyl) -sn
  • Coated and uncoated carriers were placed in Petri dishes. Solutions of 2% bovine albumin or bovine serum with or without the addition of fibronectin or laminin, as well as a 0.9% NaCl solution as a control, were added to the Petri dishes. These were moved slightly for 24 or 72 hours. After the end of the exposure time, the slides were gently rinsed twice with 0.9% NaCl solution. The surfaces were examined for protein absorption by an antibody staining method. Results: The surfaces of the native supports showed a homogeneous layer of albumin except slides incubated in NaCl solution. The addition of fibronectin or laminin resulted in denser protein layers. Complement factors were present on the surface of control slides, as shown by selective staining.
  • Carriers coated with native phosphatidylcholine showed negligible amounts of albumin, laminin, fibronectin or complement.
  • Carriers coated with a combination of 80% native phosphatidylcholine and 20% phosphatidylserine showed comparable albumin adhesion to uncoated supports and increased adsorption of fibronectin and laminin. The level of complement that adhered to these supports was higher than native supports. All carriers coated with nitrocarboxylic acid-containing phosphohydidylcholine showed significantly lower adsorption of albumin than native carriers. However, the content of albumin, fibronectin and laminin was slightly higher than on carriers with native phosphatidylcholine, while the level of complement was the same.
  • Coatings containing a combination of nitrocarboxylic acid-containing phosphatidylcholine (80%) and phosphatidylserine (20%) showed significantly lower absorption of albumin, laminin, fibronectin, and complement than a comparable combination of native phospholipids. The content was also lower than on uncoated carriers. The results were stable over both observation periods.
  • Example 2 To study cell homing of endothelial cells on phospholipid-coated artificial surfaces, a cobalt-chromium metal grid was coated as described in Example 2. Similarly, metal lattices were coated with nitrocarboxylic acid-containing phosphatidylcholine according to Examples N2-N6 and O6.
  • An uncoated metal grid served as a control.
  • the lattices were placed in a culture dish containing a gel matrix in which human umbilical venous endothelial cells (HUVEC) had grown to confluency.
  • the culture medium consisted of 5% FCS, which was replaced every two days. The cultivation was carried out according to the standard conditions.
  • the culture dishes were rinsed several times superficially with NaCl solution after 3, 7 and 14 days. Thereafter, the surface was stained with methylene blue. Using a reflected light microscope, the samples were investigated immediately after the following measurement parameters: propagation of the cells from the lattice edge to the lattice center, cell density, multilayer formation, and cell shape.
  • Glass supports were coated with nitrocarboxylic acid-containing and native phosphatidylcholine, and a mixture of 50% each of phosphatidylcholine and phosphatidyletholamine was applied as described in Example 2. Furthermore, carriers were coated with mixtures of nitrocarboxylic acid-containing phosphatidylcholines according to Examples N12-N14, E, 02, 06, Q and P3-P7. The glass slides covered the bottom of a teflon dish into which the coated and control uncoated carriers were placed. Murine macrophages (RAW 264.7) were cultured to a cell density of 5x10 5 .
  • the vitality was significantly higher than in the case of coatings with native phospholipids, namely phosphatidylcholines containing 95% after 48 h for nitrocarboxylic acids and 90% after 48 h for nitrocarboxylic acid-containing phospholipid mixtures.
  • the values lay between 85% and 95% after 48 h, with no tendency for individual product mixtures to be recognized.
  • the values were between 90% and 95% after 48 h and for the cholines according to Q, O6 and P3 the values were between 95% and 98% after 48 h.
  • Physiologically occurring phospholipids can be taken up by virtually all cell lines in large quantities. It is known that phospholipids containing non-physiologically occurring fatty acid residues can cause cell lysis or death.
  • Three cell lines (HUVEC, HeLa and L929 fibroblasts) were cultured in an adequate culture medium with 5% FCS at 37 ° C and 5% CO2 content to a subconfluent concentration of 1.5 * 10 5 cells.
  • SOPC SOPC
  • DOPC DOPC
  • POPC POPC
  • ONOPC PNLPC
  • the free fatty acids OA, LA, NOOA, and NOLA were dissolved in 0.5% DMSO.
  • Nile red staining a 1 ⁇ Nile red solution in PBS was added to the cell suspension for 15 minutes. The solution was then decanted and the cell suspension washed twice with PBS. The fat accumulation was quantified by fluorescence microscopy after 1 h, 12 h and 24 h, respectively.
  • phenol red was added to the resuspended cells. After 4 h, the medium was renewed and 10 ⁇ of the MTT solution was added. The cells were cultured for 4 h, then a 10% SDS solution was pipetted. After 24 h, the absorption of the dissolved formazan crystals at 500 nm was determined by means of a Power Wave X (Bio-Tek Instruments, Inc., USA). The EC50 was determined for the quantitative comparison.
  • the cells were resuspended in a HistoDenz (Sigma) solution with an effective 0.9% NaCl concentration (about 290 mOsm), heated to 37 ° C and sonicated for 2 minutes. The measurement was carried out with a Coulter Counter Z2.
  • the free fatty acids had a significantly stronger effect on the vitality in the MTT assay, the EC50 was 48 hours for the different cell lines between 180 - 260 ⁇ for oleic acid, 240 - 260 ⁇ for linoleic acid, 10 - 50 ⁇ for nitroolic acid and 50 - 100 ⁇ for nitrolinolic acid.
  • Determination of the cell volume showed that cells incubated with the natural phospholipids DOPC, POCP and SOPC showed a time-dependent increase in size to 180%, 160% and 150% respectively and for pretreated cells with the fatty acids oleic acid 200%, linoleic acid 170% , Nitrooleic acid 140% and nitro-linoleic acid 120%. Cells incubated with the nitrated phospholipids had a non-significant increase in cell volume to 1 10-120%.
  • Phospholipids containing nitrocarboxylic acids have similar effects in the assay assays, whereby no significant differences between the various nitrocarboxylic acid (s) -containing phospholipids could be detected.
  • Phospholipids with a nitrated fatty acid were taken up in a smaller amount of cells compared to naturally occurring phospholipids and compared to native or nitrated free fatty acids.
  • the cellular uptake of nitrofatty acid-containing phospholipids causes a reduction in cell metabolism activity.
  • Nitrated free fatty acids also lead to a decrease in cell metabolism activity, with this effect overlapping with the toxic effects.
  • the cells remain predominantly vital after intake of nitrocarboxylic acid-containing phospholipids despite a reduced metabolic activity.
  • nitrocarboxylic acid-containing phospholipids are not toxic in a much larger concentration range, in contrast to free native or nitrated fatty acids. Despite apparently only a small amount of nitrated phospholipids absorbed, a significant reduction of the metabolism is effected (in contrast to native phospholipids), whereby antiproliferative effects can be derived.
  • Phospholipids can be directly absorbed by cells into their outer membrane and thereby alter the properties of the cell membrane. Therefore, it should be investigated whether phospholipids containing at least one nitrocarboxylic acid lead to different effects on cells that ingest them.
  • nitrocarboxylic acid-containing phospholipids were tested according to the examples N7-N9, F, O2-O4, P1, P2, P5, P6, P8-P10, P15 and Q.
  • the three cell lines were cultured in 5% FCS and 5% CO2 at 37 ° C.
  • the cell suspensions were divided into the incubation vessels when a cell density of 1.5 ⁇ 10 5 in a 4-fold batch was obtained and POPC, DOPC, POPE, ONOPC, PNLPC, PNOPE or one of the nitrocarboxylic acid-containing phospholipids or phospholipid mixtures according to the examples N7 - N9, F, 02 - 04, P1, P2, P5, P6, P8 - added P10, P15 and Q, so that final concentrations of 10 ⁇ and 100 ⁇ resulted. In one approach, only a 0.5% DMSO solution was added.
  • the cells were then washed twice with PBS and cultured under the above standard conditions for 24h, 48h and 96h.
  • the cells were detached with trypsin-ethylenediaminetetraacetate solution.
  • the detached cells were separated and the activity of trypsin stopped by adding culture medium. Aliquots were taken to determine the cell number and analyzed in a CASY 1 cell counter and analyzer system, model TTC (Schärfe System, Reutlingen), whereby not only cell concentration but also cell diameter and volume were determined.
  • 6-well plates were completely coated with collagen XXII.
  • Cell suspensions pretreated with 10 ⁇ and 100 ⁇ of said phospholipids and native fatty acids were cultured with a cell number of 2.5 - 3.5 * 10 5 in the 6-well plates for 24 h and 72 h in fresh nutrient medium under standard conditions , Thereafter, the culture medium was withdrawn and replaced with a 0.05% trypsin-EDTA solution. Under cultivation conditions and on a shaking plate, 2 wells were withdrawn after 10, 30 and 60 minutes and refilled with PBS. Finally, a 2% trypsin solution was added and incubated for a further hour and the suspension was stripped off. The withdrawn cell suspensions were analyzed with an automatic cell counter (see above) in terms of cell number and cell volume.
  • Cell migration was performed using a standardized wound healing assay.
  • the three cell lines were incubated with phospholipids and fatty acids as described above. After washing twice with PBS, 2 - 3 * 10 5 cells were placed in Ibidi culture inserts overlaying the agar plate and cultured for 24 h under standard conditions. Thereafter, the culture surface interrupting stamp was removed with a width of ⁇ . This was followed by further cultivation for three days. Every eight hours there was a photo documentation of the cultural area. The pictures were evaluated with a software for the automatic detection of cell-covered areas.
  • nitrocarboxylic acid-containing phospholipids and phospholipid mixtures according to the examples N7-N9, F, 02-04, P1, P2, P5, P6, P8-P10, P15 and Q showed overall very homogeneous results, not far from the Deviated effects of the other tested nitrocarboxylic acid (s) -containing phospholipids ONOPC, PNLPC or PNOPE. It can thus be stated that the mixtures of nitrocarboxylic acid-containing phospholipids also exhibit a uniform action which does not differ from the effects of individual nitrocarboxylic acid-containing phospholipids used.
  • the incorporation of phospholipids into a cell membrane can lead to a change in their physicochemical properties. It should therefore be investigated what effect nitrated alkyl chains in phospholipids have on the membrane properties.
  • the membrane pressure, the degree of anisotropy and the phase transition temperature can be estimated in model membranes of unilaminar vesicles via the reporter molecule Laurdan.
  • membrane proteins only become functional after a subunit interaction has been established.
  • the folding process of membrane proteins is mediated, among other things, by the lateral interaction of adjacent transmembrane helices.
  • FRET Förster resonance energy transfer
  • the change in Förster resonance energy transfer (FRET) of fluorescently labeled peptides with ⁇ -helical transmembrane structures in a lipid bilayer can be used to determine the concentration of monomeric and dimeric transmembrane helices and thus to quantify helix-helix interactions.
  • FRET Förster resonance energy transfer
  • the FRET measurements were performed with fluorescently labeled glycophorin A peptides (GpA).
  • GpA fluorescently labeled glycophorin A peptides
  • the transmembrane GpA forms dimers, whereby an energy transfer is measurable.
  • 5-carboxyfluorescein and tetramethyl-6-carboxy rhodamine were used as chromophores.
  • the native phospholipids SOPC and SLPC and the analogous phospholipids SNOPC and SNPLC were each mixed alone and in each case with the phospholipid DSPC 1: 1 (w / w).
  • the phospholipids according to the examples N1 - N5, N15 - N20, O1, O2, P1 - P4, D, F, Q, R and S were investigated in further mixtures.
  • the determination of the degree of dimerization of the model protein was carried out in a direct comparison between native phospholipids and the corresponding phospholipids with a nitrated Alcylkette for the investigated concentrations of phospholipids (10 - 50%, mol / mol) in DSPC vesicles.
  • the phospholipids were dissolved in a CHCIs / MeOH mixture (1: 1), the total concentration of phospholipids was always 1 mM.
  • Laurdan (in EtOH) in the ratio 1: 500 (2 ⁇ ) was added to the lipid mixtures and the mixture was homogenized.
  • the samples were freed of solvent and dried under vacuum. It was then hydrated with 250 ⁇ M HEPES buffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4) and incubated for at least 30 minutes at 65 ° C and 1400 rpm in the Thermomixer, forming multilamellar vesicles.
  • the samples were first frozen in liquid nitrogen in five cycles, then thawed again at 65 ° C. in a water bath and homogenized for 1 min at 1400 rpm in a thermomixer. 200 ⁇ were taken from each sample and measured. The measurements were carried out on a Horiba Scientific FluoroMax-4 fluorescence spectrometer additionally equipped with a Horiba Scientific F-3004 digital temperature control.
  • the peptides FL-GpAwt and TAMRA-GpAwt were weighed and dissolved in TFE. The measurements were carried out on an Aminco Bowman Series 2 (Thermo Spectronic) fluorescence spectrometer.
  • Examples D and F showed a 10-20% stronger effect on the membrane melting point (depression) and the degree of anisotropy (increase), for which examples were N1 - N5, N15 - N20, O1, O2, P1 - P4, Q the effects comparable to the results of SNOPC and SNLPC.
  • examples F, Q, R and S the effects described above were 15% to 30% less pronounced
  • the addition of phospholipids with an unsaturated fatty acid lowered the degree of dimerization of the model membrane protein.
  • Analogous phospholipids with a nitro group on the unsaturated fatty acid led to a significantly greater reduction in dimerization (P13, SNLPC, P14, SNOPC).
  • Phospholipids with a nitrated unsaturated fatty acid have a significantly stronger effect on the membrane fluidity and thus the membrane melting point than the corresponding native phospholipids.
  • a reduction in the degree of order within the membrane at temperatures in the liquid-crystalline phase, while in the gel phase and here in particular at higher Tepmeraturen the degree of order is significantly greater than in the native phospholipids.
  • the increase in the degree of order is very likely the cause of the found disturbance of dimerization of model membrane proteins, which is considerably stronger in phospholipids with nitrated fatty acids than that of native phospholipids.
  • nitrocarboxylic acid-containing phospholipids into a model cell membrane results in an increase in their stability at physiological temperatures, or a decrease in membrane fluidity. Since the cell perception depends to a large extent on the membrane fluidity, the effects found show a reduction in the perception of mechanical, chemical and osmotic alterations.
  • nitrocarboxylic acid-containing phospholipids and phospholipid mixtures according to Examples N4-N8, N10, N1 1, D, B, 02, 04, 06, P8-P12, P15 and Q were tested.
  • the collagen synthesis was assessed semiquantitatively by means of immunohistological detection.
  • Mouse fibroblasts were cultured and after 5 passages with the native phospholipids SOPC, DOPC and PLPC, the nitrated phospholipids SONPC, PNOPC and PNLPC, the fatty acids oleic acid, linoleic acid and nitroolic acid and nitrolinolic acid and NaCl solution or the nitrocarboxylic acid (s) -containing phospholipids or Phospholipidgemischen according to Examples N4 - N8, N10, N1 1, D, B, 02, 04, 06, P8 - P12, P15 and Q incubated for 24 hours. The final concentrations of the phospholipids were 10 ⁇ , 100 ⁇ and 200 ⁇ , the fatty acids 10 ⁇ and 100 ⁇ .
  • the secondary biotinylated link antibody (anti-mouse and anti-rabbit immunoglobulins, Dako) was incubated for 20 minutes and then washed again.
  • streptavidin labeled with peroxidase (Dako) was then incubated for 10 minutes.
  • the substrate chromogen AEC (3-amino-9-ethylcarbazole, Dako) was added for 10 minutes. This was followed by counterstaining with hematoxylin for 5 minutes. The preparations were evaluated semiquantitatively in a light microscope.
  • Fibroblasts of the control group showed a linear increase in the amount of collagen matrix over the entire examination period; multiplication was increased disproportionately when stimulated with TGF-ß.
  • the native fatty acids had no significant effect on collagen synthesis in the low concentration; at high concentrations, collagen synthesis on day 3 was reduced from control and increased on day 7.
  • the nitrofatty acids caused a reduced collagen synthesis at the low concentration until day 5.
  • the collagen synthesis was more reduced and the difference was still significant on day 7 compared to the control.
  • Under stimulation with TGF-ß an increased collagen synthesis after incubation with native fatty acids in low concentration at all time points of investigation was shown.
  • At high concentration of native fatty acids on day 3 there was a small reduction and then a significant increase in collagen synthesis.
  • the Nitrofatty acids had comparable effects on collagen synthesis, but the reduction of collagen synthesis on day 3 was stronger (ns), on day 7 there was no difference to the native fatty acids.
  • the native phospholipids had no effect on collagen synthesis when incubated at a concentration of 10 ⁇ and 100 ⁇ . At the highest concentration there was a reduction in collagen synthesis on day 3 and an increase on day 7.
  • TGF- ⁇ Upon stimulation with TGF- ⁇ , there was a significant increase in collagen synthesis over control for all native phospholipids, except for the highest concentration group Day 3.
  • a nitrocarboxylic acid-containing phospholipid such as SNOPC, PNOPC or PNLPC.
  • Native and nitrated fatty acids can lead to a short-term reduction of collagen synthesis depending on the concentration, but have no influence on the cytokine-induced stimulation of collagen synthesis.
  • Incubation with native phospholipids has no relevant effect on collagen synthesis.
  • nitrocarboxylic acid-containing phospholipids cause a strong inhibition of collagen synthesis.
  • this effect is retained when stimulated with cytokines.
  • Balloon catheters were coated by the Langmuir-Schäfer method with the balloon area aligned coaxially with the liquid surface and immersing a region of about 1 mm in the liquid.
  • the catheter was rotated 5 times around its axis.
  • the phospholipids were dissolved in a concentration of 3 mmol in an ion-free aqueous solution at 50 ° C. Thereafter, the solution was cooled and placed in the coater. If the phospholipids do not dissolve completely or precipitate on cooling, then up to 20% by volume, preferably up to 10% by volume, of DMSO was added to the aqueous solution. After coating, the catheters were removed by vacuum drying for 8 hours from residual solvent.
  • the coating stability was tested for its abrasion stability by placing the balloon catheters, which had an outer diameter of 0.85 mm, in a PTFE tubing with an inner diameter of 1.0 mm placed in a silicone model, which consecutively had several angulations of up to 60 ° in four levels, was advanced by means of an automated cable pulling device with a constant speed of 3cm / s.
  • the tube system was filled with a 10% human albumin solution at a temperature of 35 ° C.
  • the cable system which had previously been inserted through the tube system, was connected to the catheter tip and passed over deflection rollers, which allowed the rope to be moved in an exactly vertical direction from above to one motorized winch arrived.
  • the winch was mounted on a precision digital car.
  • the catheters thus secured were pulled through the tubing system and the weight changes due to the guided pulling work digitally recorded during the catheter passage, the readings were integrated over time. This was used to calculate the work done to estimate the total shear forces during catheter passage through the tube system.
  • the abrasion or loss of the coating layers was determined by weighing the catheters before and after coating and after the mechanical stability test by shearing in the above-described tube system by means of a precision balance.
  • the phospholipid-coated catheters were additionally sealed with polyethylene glycol 1000 (Roth, Germany).
  • PEG 1000 was melted at 50 ° C and mixed with a 10% ethanolic solution.
  • Part of the phospholipid-coated balloon catheter as described above was coated by dip coating with the 50 ° C warm PEG solution and dried again in a vacuum oven for 8 hours.
  • the starting substances had only a small proportion of trans fatty acids ( ⁇ 5%) in all phospholipids studied. Twenty-four hours after application of the phospholipids to a catheter, there was a trend to higher levels of trans fatty acid in the natural phospholipids over the nitrated phospholipids. After heat treatment, the proportion of trans fatty acids in natural phospholipids increased to 80% (POPC) and 86% (SLPE), respectively. In contrast, the proportion of trans fatty acids in the nitrated phospholipids was significantly lower at 25% and 28% (PNOPL, SNLPE), respectively. After two months, the degree of transisomation was in the sole coatings with natural phospholipids at 95 and 98% and at 30% and 32% in the nitrated phospholipids. In the combination of the natural and nitrated phospholipids, the degree of tris isomerisation was significantly lower than the calculated mean of the degree of transisomension of the two pure substances.
  • An improvement in the lubricity of an object / implant to be introduced into the organism may contribute to a reduction in tissue trauma. Furthermore, a material coating should have sufficient resistance to premature abrasion during introduction into the organism. Furthermore, a chemical and thermal stability should exist. These requirements were met by the Nitrocarboxylic acid (s) -containing phospholipids significantly better fulfilled than by the native phospholipids.
  • the physico-chemical membrane properties of a cell represent a significant resistance factor to physical, chemical and immunological external influences.
  • human erythrocytes and mouse mast cells were treated with physiological NaCl solution, the natural one Phospholipids SOPC and PLPC as well as the analogous phospholipids with nitration of the unsaturated fatty acids (1-stearoyl-2- (9-nitrooleoyl) -sn-PC (example P14) and 1-palmitoyl-2- (9-nitrolinoleoyl) - sn-PC) (Example P7) was incubated at a concentration of 30 mmol / l for one hour.
  • the cells were treated with mixtures of nitrocarboxylic acid-containing phospholipids according to Examples F, Q, S, N2-N14, 03-06, P1-P3 and P6.
  • the erythrocytes separated from the serum by centrifugation were first cleaned three times with physiological NaCl solution.
  • the erythrocytes were resuspended in physiological NaCl solution and the suspended phospholipids were added. This stock was agitated on a slow speed rotisserie plate at 30 ° C for 1 hour. From this aliquots of 3 ml were filled into glass tubes and centrifuged. After removal of the supernatant, distilled water and NaCl solutions of increasing concentration of 0.1 to 1.0 g / dl were added. After incubation for 30 minutes under the above conditions, the tubes were centrifuged and an aliquot taken for photometric measurement of the hemoglobin by absorbance at a wavelength of 546 nm and 30 ° C temperature.
  • C2 cells dog mast cells
  • the cells were cultured in 5% FCS medium under standard conditions.
  • the cells were washed several times in a calcium- and magnesium-free buffer solution and finally concentrated.
  • the cells were distributed on 96-well plates and incubated with NaCl solution and the above-mentioned phospholipids for one hour at 37 ° C.
  • mastoparan Sigma, Germany
  • the determination of Ca 2+ influx was determined with a calcium ionophore (A23187, Sigma Germany).
  • the calcium influx was normalized to the respective baseline measurement and expressed as a percentage increase.
  • Histamine release from the C2 cells was determined using a histamine ELISA (ILB, Germany).
  • Toxic effects of substances on cells can be mediated in a number of ways: (1) damage to surface features of the cell translating alteration by membrane proteins into the cell, (2) direct damage to the cell membrane or (3) transmembrane uptake of the substance into the cell. Irrespective of the basic principle of these types of damage, the degree of damage depends essentially on the physico-chemical properties of the cell membrane. Therefore, it should be investigated whether the membrane-stabilizing effects of nitrated phospholipids alter the cytotoxicity of known cytotoxic agents mediated through one or more of these mechanisms. Since vascular and tubular endothelial cells are particularly sensitive to cytotoxic substances, they were exposed to various substances under in vitro culture conditions.
  • the cell line LLC-PK1 was cultured in complete medium (D-MEM medium) with 10% fetal calf serum (FCS) and sodium bicarbonate (26 mmol / L) in 5% CO2 atmosphere.
  • cisplatin 25 and 50 ⁇ / ⁇
  • cyclosporin 50 and 100 ⁇ / ⁇
  • murine aortic endothelial cells were cultured in standard medium with 10% FCS.
  • Cell suspensions of the lysates were preincubated as previously described.
  • lipopolysaccharide of Escherichia coli (4 and 8 pg / ml, Simga) was added to the cell suspensions and the procedure described above.
  • the cell suspensions were labeled with two fluorescent dyes (LIVE / DEAD®, Molecular Probes). This was followed by flow cytometry (FACSCalibur, Becton & Dickinson). The proportion of avital cells was calculated from the ratio between the red fluorescent cells and the total number of cells determined.
  • Freshly harvested porcine iliacae were initially prepared except for the adventitia and then cultured for three days in PBS with 1% FCS. Segments 5mm in length were atraumatically separated and placed in culture vessels containing the natural phospholipids POPC and SLPC and the analogous phospholipids with nitration of the unsaturated fatty acids (1-palmitoyl-2- (9-nitrooleoyl) -sn-PC and 1-stearoyl-2 - (9-nitrolinoleoyl) -sn-PC) in each case in a concentration of 50mmol, as well as with the nitrated free fatty acids nitroolic acid (NOA) and nitrolinols (NLA) in each case in a concentration of 30 ⁇ inserted for a further two days.
  • NOA nitroolic acid
  • NLA nitrolinols
  • the phospholipids according to the invention according to the examples N1 - N5, N1 1, N15 - N17, N20, O2 - O5, P4 - P6, E, G and Q were tested.
  • the vessels were placed in a pressure chamber and a Exposed to pressure of 15 bar for one hour. Thereafter, rapidly releasing the pressure within 5 seconds.
  • the culture bottles were slowly agitated for 7 days on a vibratory plate under standardized culture conditions.
  • the culture medium was changed after the 3rd day and further analyzed to determine microparticles.
  • the vessel segments were then fixed and embedded.
  • TUNEL staining In Situ Cell Death Detection Kit, AP, Boehringer, Germany
  • the evaluation was carried out by light microscopy, a differentiation between apoptosis and necrosis was not made and the number of cells stained in relation to the total number of cells analyzed.
  • annexin V-allophycocyanin APC
  • BD Pharmingen annexin V-allophycocyanin
  • the number of microparticles was then determined by flow cytometry (FACSCanto, Becton & Dickinson). The measurement window was set to particle diameters of 0.3 to 1, 0 ⁇ .
  • the effect of the nitrocarboxylic acid-containing phospholipids according to the invention is independent of the phospholipid used, ie also independent of the head group of the phospholipid and independent of the phospholipid mixture, and thus the decisive factor is the presence of at least one nitrated carboxylic acid or nitrated fatty acid in the phospholipid appears to be.
  • Barotrauma occurs in particular in angioplasty, in which, for example, a balloon catheter is advanced to the narrowed point in the blood vessel to be filled there under considerable pressure (up to 20 bar).
  • the resulting vessel wall damage causes a wound reaction that contributes to re-constriction of the vessel under the clinical picture of restenosis.
  • the nitrocarboxylic acid-containing phospholipids can counteract this effect and are therefore particularly suitable for all indications in which cells / tissue are exposed to a pneumatic / compressive stress.
  • Neurons were prepared from young mice according to a published method (Goldberg MP, Choi DW, Combined oxygen and glucose deprivation in cortical cell culture: calcium-dependent and calcium-independent mechanisms of neuronal injury, J Neurosci 1993; 13: 3510-3524).
  • the freshly prepared cortex tissue was separated with papain and the tissue suspension was cultured in culture vessels (Primara, BD Biosciences, USA) with Neurobasal A / B27 medium (Invitrogen) for 10-12 days.
  • the cell suspension was then divided, with the addition of NaCl (0.9%), the natural phospholipids SOPC and PLPC and the analogous phospholipids with nitration of the unsaturated fatty acids (1-stearoyl-2- (9-nitrooleoyl) -sn-PC and 1 Palmitoyl-2- (9-nitrolinoleoyl) -sn-PC) at a concentration of 10 and 50 ⁇ / ⁇ .
  • the phospholipids according to the invention according to Examples C, D, F, N3-N7, N13-N19, O1, O2, O5, 06, P3, P8 and Q were used.
  • the cells were rinsed three times with buffered NaCl solution and added to the buffered NaCl solution with the addition of MgCl 2 and CaCl 2 of an anaerobic atmosphere (85% N 2 , 5% H 2 , 10% CO 2 , 35 ° C ) for 10 and 30 minutes. Subsequently, the cells were washed once and cultured in the culture medium under aerobic conditions for 24 hours.
  • the cells were then separated according to a published technique (Meiler R, Skradski SL, Simon RP, Henshall DC, Expression proteolysis and activation of caspases 6 and 7 during rat C6 glioma cell apoptosis, Neurosci Lett 2002; 324: 33-36).
  • the cells were washed with Annexin V-FITC and propidium iodide (Molecular Probes, USA) stained.
  • the vital and avital cells were determined by flow cytometry (FACSCalibur, Becton & Dickinson).
  • the volume of the culture medium was determined and an aliquot taken to determine the LDH concentration.
  • Cardiac myocytes were obtained from neonatal rat hearts (Nitobe J, et al, Reactive oxygene species regulate FLICE inhibitory protein and susceptibility to FAS mediated apoptosis in cardiac myocytes, Cardiovasc Res 2003, 1 19-28).
  • the heart muscle cells were cultured in Dulbecco / Eagle medium (DMEM) with 10% FCS for two days under standard conditions. The incubation with the natural and nitrated phospholipids as well as the Hypoxie collectede carried out as described above.
  • the cells were cultured in culture medium for 24 hours under standard conditions. This was followed by vitality staining as described above. A portion of the cell suspensions were frozen immediately after hypoxia end and after 10 and 30 minutes in liquid nitrogen.
  • the frozen cells were later thawed to -4 ° C for NAD + analysis and homogenized.
  • NAD + analysis and homogenized.
  • a pellet was separated with mitochondria (Di Lisa, et al., 1993; Am. J. Physiol. 264, H2188-H2197).
  • the NAD + content was determined fluorometrically and normalized against protein content (Veloso, D., and Veech, R.L., 1974, Anal. Biochem., 449-1550).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Nitrocarbonsäure(n)-enthaltende Phospholipide, mit besagten Verbindungen beschichtete Medizinprodukte wie beispielsweise Stents, Katheterballons, Wundeinlagen oder chirurgisches Nahtmaterial und biopassivierende Zusammensetzungen, Spüllösungen, Imprägnierlösungen, Beschichtungslösungen, Cryoprotektionslösungen, Kältekonservierungsmedien, Lyoprotektionslösungen, Kontrastmittellösungen, Konservierungslösungen und Perfusionslösungen enthaltend diese Verbindungen sowie die Herstellung dieser Lösungen und der beschichteten Medizinprodukte und deren Verwendungen.

Description

Biopassivierende Membranstabilisation mittels Nitrocarbonsäuren- enthaltenden Phospholipiden in Zubereitungen und Beschichtungen Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Nitrocarbonsäure(n)-enthaltende Phospholipide, mit besagten Verbindungen beschichtete Medizinprodukte wie beispielsweise Stents, Katheterballons, Implantate, Wundeinlagen oder chirurgisches Nahtmaterial und biopassivierende Zusammensetzungen, Spüllösungen, Imprägnierlösungen, Beschichtungslösungen, Cryoprotektionslösungen, Kältekonservierungsmedien, Lyoprotektionslösungen, Kontrastmittellösungen, Konservierungslösungen und Perfusionslösungen enthaltend diese Verbindungen sowie die Herstellung dieser Lösungen und der beschichteten Medizinprodukte und deren Verwendungen.
Jede physikalische, chemische oder hypoxische Zellalteration führt zu einer Reaktion der betroffenen Zellen, die eine Migration, Proliferation, Matrix- und Cytokinproduktion, Apoptose oder Nekrose bedingen kann. Das Ausmaß der Zellreaktion hängt dabei im Wesentlichen von der Schwere der Alteration ab, wobei sich die Effekte der Zellalterationen bei gleichzeitigem Vorliegen potenzieren können. Die Art der Zellalteration ist dabei von untergeordneter Bedeutung da die zellulären Reaktionsmuster prinzipiell die Gleichen sind. Das zelluläre Reaktionsverhalten auf eine Alteration kann unter verschiedenen Bedingungen unterschiedlich sein. So erhöht sich die Bereitschaft zur Mastzelldegranulation bei einer erhöhten adrenergen Stimulation oder es kommt zu einer verstärkten mechanischen Fragibilität von Erythrozyten bei Vorliegen einer Hypoosmolarität sowie Zelltoxinen. Auf der anderen Seite kommt es zu einer Minderung der zellulären Reaktionen auf eine Hypoxie von Zellen bei gleichzeitiger Hypothermie. Mechanische Alterationen werden durch Zugwirkung auf das Cytoskelett an den Zellkern übertragen, wodurch eine der o. g. Zellreaktionen ausgelöst werden kann. Zugwirkungen kommen insbesondere durch Krafteinwirkung an Anhäsionsmolekülen der Zellmembran zu Stande. Ein weiterer Auslöser für Zellreaktionen ist eine verstärkte Permeabilität für Ionen wie z.B. Calcuim. Physikalische und chemische Alterationen sind in der Lage, die Integrität der Zellmembran so zu verändern, dass es zu solchen lonenströmen kommt, die zu einer Zellaktivierung führen. Ein anderer Mechanismus mittels dessen Zellen auf veränderte Milieubedingungen reagieren ist eine Aktivierung von Zellmembranproteinen durch Mechanismen, die zum großen Teil noch nicht aufgeklärt sind. Ein Aspekt ist dabei eine Erhöhung des Dimerisationsgrades von Membranproteinen, die aus 2 oder mehr Untereinheiten bestehen. Durch eine Dimerisation erlangen viele Membranproteine erst ihre funktionell aktive Form. Eine solche kann durch eine Translokation der Proteinuntereinheiten, z.B. durch das Cytoskelet, erreicht werden. Die Membranfuidität hat einen erheblichen Einfluss auf die Translokal isation von Membranproteinen. Weiterhin bedingen die physikalischen Eigenschaften von Zellmembranen, die Konformation von Membranproteinen und somit deren Funktionalität. Die physikalischen Zellmembraneigenschaften werden im Wesentlichen durch hydropphobe Wechselkräfte der Alkylketten der Membranphospholipide bedingt. Die physikalischen Membraneigenschaften werden allerdings auch durch physiologischerweise interponierte Moleküle wie z. B. Cholesterin, oder unspezifisch und transient durch physiosorbierte Moleküle wie z.B. Fettsäuren verändert. Derartige Membraninterponate führen zu einer Veränderung des lateralen Membrandruckes was sich ebenfalls auf die vorgenannten Wechselwirkungen zwischen den Membranphospholipiden und den Membranproteinen auswirkt. Dabei ist ein weiterer bekannter Interaktionsmechanismus zwischen physikalischen Membraneigenschaften und der Funktionalität von Membranproteinen, die Interponierbarkeit von alkylierten Membranproteinuntereinheiten in die Phospholipidschicht. Somit tragen physikalische Eigenschaften der Zellmembran wesentlich zur Art und Bereitschaft zellulärer Reaktionen auf die o.g. Zellalterationen bei.
Eine Desintegration von Gewebe bedingt durch ein Trauma, Chemikalien/Toxine oder chirurgisch bzw. interventionell bedingt eine Zellalteration, wobei in der Regel die o.g. Schädigungsmechanismen überlappend vorliegen: z. B. mechanisches Trauma gefolgt von einer verminderten Blutversorgung (Hypoxie) und hieraus resultierender chemischer Alteration (Azidose). Das Ausmaß der sich potenzierenden Alterationsmechanismen lässt sich praktisch nicht vorhersagen, ist aber für den unmittelbar einsetzenden Reparatur- und Heilungsprozess von entscheidender Bedeutung. Die Reparaturmechanismen können ein unphysiologisches Ausmaß annehmen, wenn erheblich mehr Zellen oder Matrixproteine entstehen, als diese für eine Stabilisierung eines Defektes benötigt werden. Folge ist eine Bindegewebewucherung (z. B. Fibrose, Kapselbildung, Kelloid), die zu einer funktionellen Beeinträchtigung des Gewebes/Organs/Körperteils führt oder kosmetische/ästhetische Probleme bedingt. Von herausragender Bedeutung sind dabei Zellalterationen, die durch den Kontakt mit nicht zellulären Fremdmaterialien bedingt werden. Auch hier kommen prinzipiell die gleichen Schädigungsmechanismen wie oben beschrieben zu Tragen, wobei im Wesentlichen nur die mit dem Fremdmaterial in Kontakt kommenden Zellen diesen Zellalterationen ausgesetzt sind. Es ist allerdings wissenschaftlich gut belegt, dass diese lokalen Gewebealterationen im Wesentlichen für die beobachteten unphysiologischen Reparaturprozesse verantwortlich zu machen sind. Somit kommt der Oberfläche von Fremdmaterialien, die mit einem geschädigten Gewebe in intensiven Kontakt kommt, eine zentrale Bedeutung für den klinischen Verlauf zu. Für Fremdoberflächen, die zu einem physiologischen Heilungsverlauf beitragen, wurde der Begriff der Biokompatibilität geprägt. Im Folgenden sollen exemplarisch pathophysiologische Prozesse, die durch eine Zell/Gewebealteration im Rahmen eines therapeutsichen Verfahrens entstehen, anhand der bekannten Prozesse bei/ nach einer Gefäßintervention aufgeführt werden. Eine perkutane transluminale Ballonangioplastie (PTCA) von Arterienengstellen führt zum einen zu einem Barotrauma der Zellen der betroffenen Gefäßwand und zum anderen zu einer Zerreißung von Gefäßwandstrukturen. Eine große Wundoberfläche, die in direktem Kontakt mit Blut ist wird erzeugt. Folge ist rasche Anlagerung von Plasmaproteinen und nachfolgend von Blutplättchen. Das Ausmaß dieser Aggregatbildung bedingt die Sezernierung von Zytokinen, die eine Proliferation von Gefäßzellen anregen sowie auch die Thrombusbildung verstärken. Der letztgenannte Zustand kann mit lebensbedrohlichen Konsequenzen zu einer Verschlussthrombose in dem behandelten Gefäßabschnitt führen. Prinzipiell gleichartige Mechanismen werden nach der Implantation eines Gefäßstents gefunden. Weder anti-inflammatorische noch antithrombotische Substanzen, die zusammen mit dem Stent appliziert werden, haben gezeigt dass sie Stent-induzierte Zellproliferation oder Thrombusbildung in klinisch relevantem Maße reduzieren. Darum wurden Stents und Katheterballons mit antiproliferativen Wirkstoffen beschichtet, wie z.B. Paclitaxel und Rapamycin, um die Stent-assoziierte Zellproliferation zu unterbinden. Diese Wirkstoffe werden spontan über eine längere Periode aus der Beschichtung der Stentstreben freigesetzt. Durch den dichten Kontakt der Stent- und/oder Ballonoberfläche mit der Gefäßwand werden diese Substanzen durch die vaskulären glatten Muskelzellen aufgenommen und inhibieren effektiv deren weitere Proliferation. Dies führt partiell zu einem abnormalen Heilprozess, der eine verringerte Stabilität der Gefäßwand (Aneurysma-Bildung), bedingen kann oder dazu führt, dass die Bildung der Intima (essentiell für die Gefäßoberflächenfunktion) stark inhibiert oder sogar komplett aufgehoben ist. Dasselbe gilt für die Effekte einer Ionisation der Gefäßwand. Darum, zeigt der Reparaturprozess, der durch Zytostatika und Ionisation in undifferenzierter Weise gehemmt ist, oft eine unzureichende Heilung des Schadens. Ferner wird ein solcher Stent oft erst nach vielen Jahren durch eine sogenannte Neointima vollständig abgedeckt, so dass bis dahin die Gefahr einer akuten Thrombose und hierdurch der Entwicklung eines Organinfarkts besteht. Weiterhin ist die Nutzung einer polymeren Beschichtung für eine kontrollierte Freisetzung der anti-proliferativen Wirkstoffe notwendig, die nur begrenzt biokompatibel ist und darum dem Effekt der antiproliferativen Therapie entgegenwirkt. Ein weiterer Aspekt der zellulären„Antwort auf die Verletzung" der traumatisierten Zellen ist die Freisetzung von Mikropartikeln, die Phospholipide und Proteine umfassen (Chironi et al., Cell Tissue Res 2009, 335, 143-151 ). Im Rahmen einer Alteration von Endothelzellen und Thrombozyten, kann es zu einer Freisetzung von Phospholipidmembranen der Zellen kommen, die als Mikropartikel ins Blut oder die umgebende Gewebeflüssigkeit abgegeben werden. Die Fähigkeit zur Mikropartikelabgabe wurde auch für andere Zelltypen beschrieben. Mikropartikel haben einen lokalen und systemischen Effekt, der zu einer Verstärkung oder Verringerung von Gewebeantworten führen kann (Meziani et al., Pharmacol Rep 2008, 60, 75-84). Dadurch wird diese Information an die direkt umliegenden Zellen weitergegeben, kann aber auch zu der Rekrutierung entfernt liegender Zellen, d.h. des Knochenmarks, führen. So haben z. B. Mikropartikel einen erheblichen Einfluss auf die pathophysiologieschen Veränderungen bei einer Sepsis. Die Bedingungen unter welchen diese Mikropartikel eine physiologische oder pathologische Gewebereaktion hervorrufen sind noch weitgehend ungeklärt.
Die wissenschaftliche Literatur dokumentiert, dass die Biokompatibilität einer künstlichen Oberfläche, die in direktem Kontakt mit Zellen ist steht, eine entscheidende Determinante für darauffolgende Zellreaktionen ist. Während weniger biokompatible Oberflächen Zell-Dedifferenzierung, -Migration, -Proliferation oder Apoptose induzieren können, würde die ideale biokompatible Oberfläche nicht zu einer solchen Zellantwort führen und eher den physiologischen Status und Metabolismus der adhärierenden Zellen beibehalten. Weiterhin ist die Biokompatibilität umgekehrt proportional zur Geschwindigkeit und Menge von Biomolekülen, wie Albumin, Fibronektin oder Komplementfaktoren, die sich an der künstlichen Oberfläche anheften. Das trifft auch für die Menge an extrazellulären Matrixproteinen zu, die durch an den künstlichen Oberflächen adhärierende Zellen produziert werden. Weiterhin determinieren die Quantität und die Qualität der an eine künstliche Oberfläche adhärierenden Serumproteine welche Zellen sich an eine solche Oberfläche anheften sowie deren Proliferationsraten. Biokompatibilität ist nicht für die verschiedenen Säugetier-Zelltypen gleich. Zellen reagieren auf Inkompatibilitäten in ihrer chemischen Umgebung (z.B. pH-Wert), die Oberflächengeometrie (z.B. Rauheit der Oberfläche), die Fluidität der Grenzfläche (wie z.B. determiniert durch den Wassergehalt) und Qualität und Quantität von Zellkontakten mit der künstlichen Oberfläche. In der Summe der vorgenannten Effekte, die zu bekannten Verbesserungen der Biokompatibilität von Fremdoberflächen beitragen, führen Oberflächen, die eine Minderung der Reibungsenergie adherierender Zellen, z.B. durch Anbindung von Wassermolekülen, bedingen sowie keine Strukturen aufweisen, die zu einer immunologischen Reaktion durch Interaktion mit Zellmembranbindungsstellen führen, sowie chemisch innert sind, zu einem Optimum an Biokompatibilität.
Diese Anforderungen erfüllen Phospholipide zum großen Teil, vorausgesetzt sie weisen ähnliche physiko-chemische Eigenschaften an der Grenzfläche zur adherierenden Zelle auf wie die Zellmembranen selbst. Phospholipide besitzen die Eigenschaft spontan membranartige Strukturen auszubilden, wodurch eine homogene Oberfläche entsteht, die, für den Fall, dass die Kopfgruppe einen Cholinrest trägt, ein hohe Dichte an gebundenen Wassermolekülen zur Folge hat. Ein weiterer Vorteil einer nicht mit dem Supportmaterial fest verankerten Grenzschicht ist die freibleibende laterale Beweglichkeit der Phospholipide. Auch ergibt sich die Möglichkeit der Herauslösung von Molekülen. Aus diesem Grund ist es erforderlich Phospholipide zu verwenden, die bei einer Aufnahme in die adherierende Zelle nicht zu unerwünschten Effekten führt. Der Schmelzpunkt von natürlichen, in humanen Zellmembranen vorkommenden Phospholipiden ist gering, so dass der hohe Mobilitätsgrad unter Körpertemperaturbedingen eine mechanische oder thermodynamisch getriebene Ablösung erleichtert.
Um solche Beschichtungen an der Luft stabil zu machen und den Widerstand gegen mechanische Scherkräfte zu verstärken, wurden Phosphorylcholine mit einem Co- Polymer (z. B. Laurylmethacrylat) polymerisiert; solche Phospholipidverbindungen kommen in der Natur nicht vor und haben grundsätzlich andere physiko-chemische Eigenschaften als natürliche Phospholipide weshalb eine Beschichtung mit polymerisierten Phosphorylcholinen als synthetische Phospholipidschicht benannt werden muss. Da eine kovalente Verankerung zum Trägermaterial nicht beabsichtigt war, wurde der Widerstand gegen Scherkräfte durch einen Polymerisierungsprozess erreicht, der eine Beschichtung mit einer Dicke von 50 μιτι ergab. Polymerisierte Phosphorylcholine waren immer noch Thrombus-resistenter als andere hydrophile Polymere (van der Glessen, et al. Marked inflammatory sequelae to Implantation of biodegradable polymers in porcine coronary arteries, Circulation 1996;94:1690-7). Während eine Polymerisation die mechanische Stabilität einer solchen Beschichtung erhöht, wurde die laterale Beweglichkeit aufgehoben, was zu einer niedrigeren Biokompatibilität führte als bei fluiden Phospholipidbeschichtungen und mit einer verstärkten Zellreaktion als Antwort auf einen Zellkontakt mit einer solchen Oberfläche verbunden ist. Koronare Stents mit polymerisierter Phosphorylcholin-Beschichtung wurden in Tierversuchen untersucht. Sowohl Thrombusbildung also auch Gewebsreaktion unterschieden sich in Kurz- und Langzeit-Gewebsuntersuchungen nicht von unbeschichteten Stents. Das wurde auch in humanen klinischen Studien gefunden, wodurch eine Machbarkeit von polymerisierten Phosphotidylcholin-Beschichtungen gezeigt wurde; jedoch wurde soweit eine verbesserte Biokompatibilität verglichen mit dem schon optimierten Metallträgermaterial nicht berichtet. Weiterhin wurde gezeigt, dass Beschichtungen aus polymerisierten Phospholipiden während der Expansion der Stents reißen können und delaminiert werden. Eine weitere medizinische Herausforderung sind Gefäßtransplantate. Bis jetzt ist keine über längere Zeit stabil bleibende Oberflächenbeschichtung bekannt, die eine künstliche Oberfläche vor der Adhärenz von Serumproteinen, vor der Aktivierung des Immunsystems und vor Thrombusbildung schützen würde. Darum ist die Gerinnungshemmung zwingend nach der Implantation eines synthetischen Gefäßimplantats. Die Verwendung einer die Adhärenz von Epithelzellen oder von Knochenmark-abgeleiteten pluripotenten Zellen erlaubenden Oberflächenbeschichtung resultierte in einer Epithelisierung, wobei es bei den synthetischen Transplantaten mit einem Durchmesser von < 5 mm durch unkontrolliertes Wachstum von endothelialen Zellen (Intima-Hyperplasie) sehr häufig zu einer klinisch relevanten Verkleinerung des Restlumens kommt, sodass keine ausreichende Durchgängigkeit mehr besteht. Andererseits ist die einzig mögliche Modalität um eine Verklumpung innerhalb eines Gefäßtransplantats zu vermeiden die Einführung einer geschlossenen endothelialen Auskleidung. Jedoch endotheliarisieren die herkömmlich verwendeten Materialien überhaupt nicht. Darum ist eine antithrombotische Beschichtung, die gleichzeitig die Adhäsion von Endothelzellen erlaubt, wünschenswert.
Somit besteht weiterhin ein großer Bedarf, die zelluläre Interaktion mit einer Fremdoberfläche durch geeignete Maßnahmen so zu modifizieren, dass der Kontakt nicht zu einer Zellaktivierung führt. Für diese Eigenschaft wurde der Begriff Biopassivierung geprägt.
Biopassivierende Beschichtungen sind nicht nur auf kardiovaskulären Implantaten vorteilhaft, sondern auch wünschenswert auch für Wundmaterialien, Wundeinlagen, chirurgischem Nahtmaterial oder anderen Implantaten wie beispielsweise Gesichtsund Brustimplantaten, da hierdurch anti-fibrotische Eigenschaften zu erwarten sind. Überraschenderweise konnte festgstellt werden, dass Nitrocarbonsäure(n)- enthaltende Phospholipide über derartige biopassivierende Eigenschaften verfügen.
Beschreibung Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Verbindungen vorzugsweise biopassivierende Verbindungen bereitzustellen, welche zur Beschichtung von Medizinprodukten, insbesondere zur biopassivierenden Beschichtung von Medizinprodukten sowie zu Herstellung von biopassivierenden Zusammensetzungen, Spüllösungen, Imprägnierlösungen, Beschichtungslosungen, Cryoprotektionslösungen, Kältekonservierungsmedien, Lyoprotektionslösungen, Kontrastmittellösungen, Konservierungslösungen und Perfusionslösungen geeignet sind sowie die Bereitstellung derartiger Lösungen und derartig beschichteter Medizinprodukte. Vorzugsweise sind die Medizinprodukte solche, welche in direkten Kontakt mit Zellen/Geweben kommen und zu einer Zell-/Gewebealteration führen (können), die ohne eine Oberflächenbeschichtung zu einer vermehrten Produktion von Matrixproteinen/Fibrose und/oder Zellmigration/Zellproliferation und/oder Apotose/Nekrose führen. Lösungen oder biopassivierenden Zusammensetzungen in Form von Spüllösungen, Imprägnierlösungen, Beschichtungslösungen, Cryoprotektionslösungen, Kältekonservierungsmedien, Lyoprotektionslösungen, Kontrastmittellösungen, Konservierungslösungen und Perfusionslösungen stellen eine geeignete Anwedungsform dar, wenn Traumata/Intoxikationen sowie medizinische/kosmetische Interventionen, die mit gleichartigen Zell/Gewebealterationen und Zell/Gewebereaktionen einhergehen, ausgedeht und schwer erreichbar sind, sodass hierüber eine Beschichtung der Zellen/Gewebe sichergestellt werden kann oder eine unmittelbare Behandlung von Medizinprodukten, welche mit Geweben in Kontakt kommen vorgenommen werden kann.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die technische Lehre der unabhängigen Ansprüche gelöst. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung, den Figuren sowie den Beispielen.
Uberraschenderweise wurde gefunden, dass Nitrocarbonsäure(n)-enthaltende Phospholipide der allgemeinen Struktur (I)
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worin
X ist O oder S;
R1 und R2 unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe umfassend oder bestehend aus: lineare Nitroalkylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, verzweigte Nitroalkylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, lineare Nitroalkenylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, verzweigte Nitroalkenylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, lineare Nitroalkinylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, verzweigte Nitroalkinylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, Nitroalkylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, wobei der Nitroalkylrest einen Cycloalkylrest oder einen Heterocycloalkylrest oder eine Carbonylgruppe enthält,
lineare Alkylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, verzweigte Alkylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, lineare Alkenylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, verzweigte Alkenylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, lineare Alkinylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, verzweigte Alkinylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, Alkylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, wobei der Alkylrest einen Cycloalkylrest oder einen Heterocycloalkylrest oder eine Carbonylgruppe enthält,
wobei der Alkylrest, Alkenylrest und Alkinylrest mit einem, zwei oder drei Hydroxygruppen, Thiolgruppen, Halogenresten, Carboxylatgruppen, C1-C5- Alkoxycarbonylgruppen, Ci-C5-Alkylcarbonyloxygruppen, Ci-C5-Alkoxygruppen, Ci- Cs-Alkylaminogruppen, Ci-C5-Dialkylaminogruppen und/oder Aminogruppen substituiert sein kann und wobei der Nitroalkylrest, Nitroalkenylrest und Nitroalkinylrest mit einem, zwei oder drei Hydroxygruppen, Thiolgruppen, Halogenresten, Carboxylatgruppen, Ci-C5-Alkoxycarbonylgruppen, C1-C5- Alkylcarbonyloxygruppen, Ci-C5-Alkoxygruppen, Ci-C5-Alkylaminogruppen, C1-C5- Dialkylaminogruppen und/oder Aminogruppen,
wobei zumindest einer der Reste R1 und R2 mindestens eine Nitrogruppe enthalten muss,
R3 für einen der folgenden Reste steht: -H, -CH2-CH(COO")-N H3+,
-CH2-CH2-NH3 + -CH2-CH2-N(CH3)3+
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-CR4R5R6, -CR4R5-CR6R7R8, -CR4R5-CR6R7-CR8R9R10, -CR4R5-CR6R7- CR8R9-CR10R1 1R12, -CR4R5-CR6R7-CR8R9-CR10R11-CR12R13R14;
R4 - R14 bedeuten unabhängig voneinander
-OH, -OP(O)(OH)2, -P(O)(OH)2, -P(O)(OCH3)2, -P(O)(OC2H5)2, -OCH3, -OC2H5, -OC3H7, -O-cyclo-CsHs, -OCH(CH3)2, -OC(CH3)3, -OC4H9, -OC4H9, -OC5H11 , -OCH2CH(CH3)2, -OCH(CH3)C2H5, -OC6Hi 3, -O-cyclo-C4H7, -O-cyclo-CsHg, -OPh, -OCH2-Ph, -OCPh3, -SH, -SCH3, -SC2H5, -F, -Cl, -Br, -I, -CN, -OCN, -NCO, -SCN, -NCS, -CHO, -COCH3, -COC2H5, -COC3H7, -CO-cyclo-C3H5, -COCH(CH3)2, -COC(CH3)3, -COOH, -COOCH3j -COOC2H5, -COOC3H7, -COO-cyclo-C3H5 -COOCH(CH3)2, -COOC(CH3)3, -OOC-CH3, -OOC-C2H5, -OOC-C3H7 -OOC-cyclo-C3H5, -OOC-CH(CH3)2, -OOC-C(CH3)3, -CONH2, -CONHCH3 -CONHC2H5, -CONHC3H7, -CON(CH3)2, -CON(C2H5)2, -CON(C3H7)2, -NH2 -NO2, -NHCH3, -NHC2H5, -NHC3H7, -NH-cyclo-C3H5, -NHCH(CH3)2; -NHC(CH3)3, -N(CH3)2, -N(C2H5)2, -N(C3H7)2, -N(CH3)3 +, -N(C2H5)3 + -N(C3H7)3 +, -N(cyclo-C3H5)3\ -N[CH(CH3)2]3 +, -N(cyclo-C3H5)2, -N[CH(CH3)2]2; -N[C(CH3)3]2, -NH-cyclo-C4H7, -NH-cyclo-C5Hn, -NH-cyclo-C6Hi3; -N(cyclo-C4H7)2, -N(cyclo-C5Hn)2j -N(cyclo-C6Hi3)2, -NH(Ph) , -NPh2, -SOCH3 -SOC2H5, -SOC3H7, -SO2CH3, -SO2C2H5, -SO2C3H7, -SO3H, -SO3CH3 -SO3C2H5, -SO3C3H7, -OCF3, -OC2F5, -O-COOCH3, -O-COOC2H5 -O-COOC3H7, -O-COO-cyclo-C3H5, -O-COOCH(CH3)2, -O-COOC(CH3)3 -NH-CO-NH2, -NH-CO-NHCH3, -NH-CO-NHC2H5, -NH-CO-N(CH3)2 -NH-CO-N(C2H5)2, -0-CO-NH2, -O-CO-NHCH3j -O-CO-NHC2H5 -O-CO-NHC3H7, -O-CO-N(CH3)2, -O-CO-N(C2H5)2, -O-CO-OCH3; -O-CO-OC2H5, -O-CO-OC3H7, -O-CO-O-cyclo-C3H5, -O-CO-OCH(CH3)2 -O-CO-OC(CH3)3, -CH2F, -CHF2, -CF3, -CH2CI, -CH2Br, -CH2I, -CH2-CH2F; — CH2— CHF2, — CH2— CF3, — CH2— CH2CI, — CH2— CH2B , — CH2— CH2I, — CH3, — C2Hs -C3H7, -cyclo-C3H5, -CH(CH3)2, -C(CH3)3, -C4H9, -cyclo-C4H7, -cyclo-C5H9 -cyclo-CeHn, -CH2-CH(CH3)2, -CH(CH3)-C2H5, -CsH , -Ph, -CH2-Ph; -CPh3, -CH=CH2, -CH2-CH=CH2, -C(CH3)=CH2, -CH=CH-CH3 - -CH=CH2, -CH=C(CH3)2, -C^CH, -C^C-CH3, -CH2-C^CH;
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sowie Salze, Solvate, Hydrate, Enantiomere, Diastereomere, Racemate, Enantionnerengennische, Diastereonnerengennische der vorgenannten Verbindungen die erfindungsgemäße Aufgabe lösen.
Somit betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipide zur Herstellung von medizinischen Zusammensetzungen und zur Beschichtung von Medizinprodukten.
Bei den medizinischen Zusammensetzungen handelt es sich um vorzugsweise biopassivierende Zusammensetzungen wie z.B. Spüllösungen für Medizingeräte, Spüllösungen für Wunden, Imprägnierlösungen für Verbands-, Wund- und Nahmaterialien, Beschichtungslösungen für Medizinprodukte, Cryoprotektions- lösungen, Kältekonservierungsmedien, Lyoprotektionslösungen, Kontrastmittel - lösungen, Konservierungslösungen und Perfusionslösungen für Zellen, Gewebe und Organe. Diese Lösungen und Medien, welche alle vorzugsweise biopassivierende Lösungen und Medien sind, werden weiter unten eingehend beschrieben.
Die Begriffe "Medizinprodukt" oder "Medizinprodukte" werden hierin als Oberbegriffe verwendet, die jedwede Implantate, natürliche und künstliche Transplantate, Naht- und Verbandsmaterialien als auch Teile von medizinischen Geräten wie z.B. Kathetern einbeziehen. Bei den Medizinprodukten, welche auch kosmetische oder teilweise kosmetische und teilweise medizinische Implantate umfassen, handelt es sich vorzugsweise um Medizingeräte, weiter bevorzugt um Implantate, die temporär oder permanent in den Organismus eingebracht werden und medizinische Gegenstände, die in Kontakt mit Zellen/Geweben kommen, wie z. B. Wundmaterialien, Nahtmaterialien, Wund- und Körperhölenverschlusssysteme, biologische Transplantate, künstliche Transplantate, biologische Implantate, künstliche Implantate, künstliche Blutgefäße, natürliche Blutgefäße, Blutleiter, Blutpumpen, Dialysatoren, Dialysemaschienen, Gefäßprothesen, Gefäßstützen, Herzklappen, Kunstherzen, Gefäßklemmen, autologe Implantate, Knochenimplantate, intraokulare Linsen, Shunts, Dentalimplantate, Infusionsschläuche, medizinische Manschetten, Binden, medizinische Klemmen, Pumpen, Herzschrittmacher, Laborhandschuhe, medizinische Scheren, medizinisches Besteck, Nadeln, Kanülen, Endoprothesen, Exoprothesen, Skalpelle, Lanzetten, Weichteilimplantate, Brustimplantate, Gesichtsimplantate, Katheter, Führungsdrähte, Ports, Stents, Katheterballons und Katheterballons mit aufgesetztem Stent. Die erfindungsgemäßen Oberflächenbeschichtungen eignen sich somit für alle Medizinprodukte bzw. Medizingeräte, die mit Zellen/Geweben/Organen temporär oder dauerhaft in Kontakt kommen und es durch diesen Kontakt zu einer Irritation der in Kontakt kommenden Zellen/Geweben/Organen kommen kann, die zu einer unerwünschten Reaktion (wie im folgenden oder oben auf S. 8 beschrieben) besagter Strukturen führt. Dies schließt medizinische oder kosmetische Verfahren, die gleichartige Eigenschaften haben ein. Vitale Zellen können auf äußere Reize reagieren, indem sie ihren Metabolismus und/oder Phänotypus und/oder Genotypus verändern. Das Reaktionsverhalten ist abhängig von der Art und der Intensität der Irritation sowie von der betroffenen Zellspezies und präkonditionierenden Faktoren wie z. B. der Integrität eines Zellverbundes oder der Präsenz von Mediatoren. Die Zellreaktion ist von den vorgenannten Determinaten abhängig und kann sich in einer Bildung von Mediatoren oder extrazellulärer Matrix, einer Zellmigartion oder Zellproliferation sowie aber auch einer Nekrose oder Apoptose ausdücken. Daher ist die Reaktion auf eine Zellirritation nicht exakt vorhersagbar. Die Quantifizierung einer Änderung der Reaktion auf eine Zell/Gewebeirritation muss daher durch einen Vergleich des Reaktionsverhaltens unter gleichen Ausgangsbedingungen erfolgen.
Unter dem Begriff "Biopassivierung" oder "biopassivierend" soll folgendes verstanden werden. Eine erfindungsgemäße Biopassivierung liegt vor, wenn die Zell-/Gewebe- Reaktion auf eine physikalische, chemische oder hypoxische Zell- oder Gewebealteration auf ein Maß beschränkt bleibt, wie dies zu erwarten wäre unter gleichen Bedingungen aber ohne eine zusätzliche Zell/Gewebealteration. Dabei kann die Zell/Gewebealteration durch Einbringen von Fremdmaterial, Zufügung eines Baro- oder Thermotraumas, einer Hypoxie, von Toxinen und/oder durch Bestrahlungen bedingt sein.
Mehr spezifisch liegt eine erfindungsgemäße Biopassivierung von Zellen/Geweben vor, wenn die durch physikalische, chemische oder hypoxische Zell- oder Gewebealterationen bedingten Zell-/Gewebereaktionen, bestehend aus einer Produktion von Mediatoren bzw. Matrixproteinen und/oder einer Zellmigration/Proliferation und/oder Nekrose/Apoptose, um bevorzugt mindestens 10%, bevorzugt mindestens 20%, weiter bevorzugt mindestens 30%, bevorzugter mindestens 40%, weiterhin bevorzugt mindestens 50%, noch bevorzugter mindestens 60% und am bevorzugtesten mindestens um 70% im Vergleich zu einer gleichartigen Alteration von Zellen und Geweben, die nicht mit den erfindungsgemäßen Phospholipiden in Konakt gekommen sind, gemindert werden. Anders gesagt, liegen biopassivierende Effekte dann vor, wenn zelluläre oder gewebliche Reaktion, welche die Produktion von Mediatoren und/oder Matrixproteinen, Zellmigration und/oder Proliferation, Nekrose und/oder Apoptose sind infolge physikalischer, chemischer oder hypoxischer Zell- oder Gewebealterationen, in ihrem Umfang um bevorzugt mindestens 10%, bevorzugt mindestens 20%, weiter bevorzugt mindestens 30%, bevorzugter mindestens 40%, weiterhin bevorzugt mindestens 50%, noch bevorzugter mindestens 60% und am bevorzugtesten mindestens um 70% gemindert werden. Somit betrifft die vorliegende Erfindung biopassivierende Verbindungen der allgemeinen Formel (I), biopassivierende Zusammensetzungen enthaltend mindestens eine der biopassivierenden Verbindungen der allgemeinen Formel (I) sowie biopassivierende Beschichtungen aus oder enthaltend die biopassivierenden Verbindungen der allgemeinen Formel (I). Diese biopassivierenden Verbindungen, Zusammensetzungen und Beschichtungen sind insbesondere für den direkten oder indirekten Kontakt mit lebenden Zellen, Geweben und Organen geeignet. Somit betrifft die vorliegende Erfindung biopassivierende Verbindungen, biopassivierende Zusammensetzungen und biopassivierende Beschichtungen, wobei biopassivierend bedeutet, dass die Zellen und/oder Gewebe, welche mit den biopassivierenden Verbindungen, Beschichtungen oder Zusammensetzungen in Kontakt gekommen oder behandelt worden sind, im Vergleich zu vergleichbaren Zellen und/oder Geweben, welche nicht mit den biopassivierenden Verbindungen, Beschichtungen oder Zusammensetzungen in Kontakt gekommen oder behandelt worden sind, mindestens 10%, bevorzugt mindestens 20%, weiter bevorzugt mindestens 30%, weiter bevorzugt mindestens 40%, weiter bevorzugt mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 60% und am meisten bevorzugt mindestens 70% weniger durch physikalische, chemische oder hypoxische Zell- oder Gewebealterationen bedingte Zellreaktionen und/oder Gewebereaktionen zeigen, wobei es sich bei den Zellreaktionen und/oder Gewebereaktionen um die Produktion von Mediatoren und/oder Matrixproteinen, die Zellmigration und/oder die Zellproliferation sowie eine Nekrose und/oder Apoptose handelt.
Biopassivierung bedeutet daher vorzugsweise nicht die mindestens 10% geringere Produktion von Mediatoren oder die mindestens 10% geringere Produktion von Matrixproteinen oder die mindestens 10% geringere Zellmigration oder die mindestens 10% geringere Zellproliferation oder mindestens 10% geringere Nekrose oder mindestens 10% geringere Apoptose, sondern Biopassivierung bedeutet vorzugsweise die mindestens 10% geringere Produktion von Mediatoren und/oder Matrixproteinen und die mindestens 10% geringere Zellmigration und/oder Zellproliferation und mindestens 10% geringere Nekrose und/oder Apoptose.
Die vorgenannten Effekte (Produktion von Mediatoren/Matrixproteinen, Zellmigration/Proliferation, Nekrose/Apoptose) können natürlich nur dann um mindestens 10% oder mehr gemindert werden, wenn diese Effekte auftreten. Nicht bei allen biologischen Vorgängen treten alle vorgenannten Effekte zeitgleich auf, so dass sich die Minderung um mindestens 10% oder mehr nur auf die Effekte bezieht, welche bei dem betrachteten biologischen Vorgang tatsächlich auch auftreten. Zudem besagt der Ausdruck "mindestens 50% geringere" (bzw. mindestens 10% / mindestens 20% / mindestens 30% / mindestens 40% / mindestens 60% / mindestens 70%) nicht, dass alle vorgenannten Effekte um diesen Prozentsatz verringert sein müssen. Es genügt, wenn einer der tatsächlich auftretenden Effekte um diesen Prozentsatz verringert ist, wobei die anderen auftretenden Effekte um denselben, den gleichen oder einen geringeren Prozentsatz gemindert sein können aber vorzugsweise ein messbare Verringerung vorliegt.
Wissenschaftlich nachweisen last sich diese Verringerung um mindestens 10%, bevorzugt mindestens 20%, weiter bevorzugt mindestens 30%, weiter bevorzugt mindestens 40%, weiter bevorzugt mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 60% und am meisten bevorzugt mindestens 70% durch folgende Versuche.
Immunhistochemische Nachweisverfahren für Cytokine und Matrixproteine auf Oberflächen, in-situ Zell-Gewebepräparaten oder in Kultur-/Gewebeflüssigkeiten, desitometrische und elastographische Nachweisverfahren in-vitro und in-vivo; sowie Migration-/Proliferations Assays bei in-vitro/ex-vivo Zell-/Gewebeuntersuchungen, histochemischen Bestimmung der proliferativen Zellaktivität, histopathologischen Bestimmung der ZellmorphologieAzahl, volumetrische Bestimmung einer Gewebeneubildung mittels Sonographie/Radiologie/Resonanztomographie; sowie histochemischen Nachweisverfahren für einen nekrotischen oder apoptotischen Zelluntergang wie die Live/Dead Färbung, den MTT- bzw NUR-Test, Bestimmung der Caspaseaktivität und zelllytisch freigesetzter Substanzen wie der LDH oder Kreatinkinase, ferner von Zellstrukturfragmenten wie Vesikel/DNA, histopathologische Nachweisverfahren wie H&E, Nissel oder Fuchsin Färbungen sowie in-vivo Nachweisverfahren wie PET/CT/MRT. Unter dem Begriff „Biokompatibilität" ist ferner eine weitgehende chemische und biologische Neutralität einer Oberfächenbeschichtung für mit den biopassivierenden Verbindungen, Beschichtungen oder Zusammensetzungen in Kontakt kommende Zellen oder Geweben zu verstehen. Eine solche chemische und biologische Neutralität liegt vor, wenn die Zell-/Gewebereaktionen bei Kontakt mit einer erfindungsgemäßen biopassivierenden Oberfläche mit oder ohne gleichzeitige physikalische, chemische oder hypoxische Zell- oder Gewebealterationen Zell- und/oder Gewebereaktionen zeigen, die nicht ausgeprägter sind als 30%, mehr bevorzugt nicht ausgeprägter sind als 10% und nicht mehr gemindert sind als 10% im Vergleich zu Zell- und/oder Gewebereaktionen von Zellen, die nicht mit einer erfindungsgemäßen biopassivierenden Oberfläche in Kontakt gekommen sind, wobei es sich bei den Zell- und/oder Gewebereaktionen um die Produktion von Mediatoren und/oder Matrixproteinen, die Zellmigration und/oder Zellproliferation sowie Nekrose und/oder Apoptose. Wissenschatlich nachweisen lässt sich dies in gleicher Art und Wesie, wie dies zuvor beschrieben ist. Dabei liegt beispielsweise eine erfindungsgemäße Biokompatibilität einer Beschichtung oder medizinischen Zubereitung dann vor, wenn unter gleichen in-vitro/ex-vivo/in-vivo-Bedingungen, die Zell- und/oder Gewebereaktionen in Form einer Produktion von Mediatoren und/oder Matrixproteinen, einer Zellmigration und/oder Zellproliferation sowie einer Nekrose und/oder Apoptose nicht ausgeprägter sind als 30%, mehr bevorzugt nicht ausgeprägter sind als 10% und nicht mehr gemindert sind als 10% gegenüber einer gleichartige Zell/Gewebealteration ohne in Kontaktbringung des beschichteten Materials oder einer medizinischen Zubereitung unter ansonsten gleichen Bedingungen.
Unter dem Begriff„proliferationsmindernd" ist zu verstehen ein hemmender Effekt auf die Migration, Proliferation und die Bildung von extrazellulärer Matrix von mit den erfindungsgemäßen Verbindungen in Kontakt kommenden Zellen/Geweben. Eine solche liegt vor, wenn die Zell-/Gewebereaktion auf eine physikalisch, chemisch oder hypoxisch bedingte Zell- oder Gewebealteration, bestehend aus einer Produktion von Matrixproteinen und/oder einer Zellmigration und/oder einer Zellproliferation zwischen 55% und 100% gemindert sind, bevorzugt um 60% - 65% und mehr bevorzugt um 75% - 85% im Vergleich zu den Zell- oder Gewebereaktionen bei einer gleichartigen Alteration von vergleichbaren Zellen und Geweben, die mit vergleichbaren Oberflächen oder medizinischen Zubereitungen, die nicht mit den erfindungsgemäßen Verbindungen beschichtet waren oder bei denen die erfindungsgemäßen Verbindungen nicht in den medizinischen Zubereitungen enthalten waren, in Konakt gekommen sind.
Wissenschatlich nachweisen lässt sich dies in gleicher Art und Wesie, wie dies zuvor beschrieben ist. Dabei liegt eine erfindungsgemäße Proliferationsminderung einer Beschichtung oder medizinischen Zubereitung dann vor, wenn unter gleichen in- vitro/ex-vivo/in-vivo-Bedingungen, die Zell- und/oder Gewebereaktionen in Form einer Produktion von Matrixproteinen, einer Zellmigration und/oder Zellproliferation zwischen 55% und 100% gemindert sind, bevorzugt um 60% - 65% und mehr bevorzugt um 75% - 85% gegenüber einer gleichartige Zell/Gewebealteration bei einer in Kontaktbringung eines nicht mit den erfindungsgemäßen Verbindungen beschichteten oder unbeschichteten Materials oder einer medizinischen Zubereitung die erfindungsgemäßen Verbindungen nicht enthält.
Wie in der Beschreibung und den Beispielen dargelegt, können die biokompatiblen, biopassivierenden und proliferationsmindernden Effekte durch entsprechende Versuche zuverlässig nachgewiesen und quantifiziert werden. Unter dem Begriff "Nitrocarbonsäure-enthaltendes Phospholipid" oder "Nitrocarbonsäuren-enthaltendes Phospholipid" oder "Nitrocarbonsäure(n)- enthaltendes Phospholipid", welche synonym verwendet werden, wird verstanden, dass zumindest einer der beiden Lipidreste R1 und/oder R2 eine Nitrogruppe (-NO2) enthält. Somit weist der Carbonsäurerest R1COO- oder der Carbonsäurerest R2COO- mindestens eine Nitrogruppe auf oder beide Carbonsäurereste R1COO- und R2COO- weisen jeweils mindestens eine Nitrogruppe auf.
R1 bezeichnet den Kohlenstoffrest bzw. die Kohlenstoffkette des Carbonsäurerestes R1COO- Die korrespondierende Carbonsäure ist R1COOH.
R2 bezeichnet den Kohlenstoffrest bzw. die Kohlenstoffkette des Carbonsäurerestes
R2COO- Die korrespondierende Carbonsäure ist R2COOH.
Wird somit von Carbonsäuren oder von Nitrocarbonsäuren gesprochen, welche im
Phospholipid enthalten sind, so meint dies die Reste R1COO- und R2COO-, welche von den entsprechenden Carbonsäuren R1COOH und R2COOH abgeleitet sind und über eine Esterbindung an den Glycerinrest gebunden sind.
Phosphoglyceride mit Glycerin als Grundgerüst werden auch Glycerophospholipide oder Phosphatide genannt.
Wird in der vorliegenden Anmeldung von Phospholipiden (PL) gesprochen, sind damit Phospholipide und vorzugsweise Glycerophospholipide gemeint, deren Lipidreste keine Nitrogruppen tragen.
Hingegen werden die erfindungsgemäßen Verbindungen Nitrocarbonsäure(n)- enthaltende Phospholipide genannt, um auszudrücken, dass mindestens einer der beiden Kohlenstoffketten R1 oder R2 mindestens eine Nitrogruppe trägt. Es werden Phospholipide, die ungesättigte Nitrocarbonsäurereste enthalten bevorzugt.
Die Nitrogruppe in R1 und/oder R2 hat keine spezifische Position. Sie kann sich an jedem der Kohlenstoffatome (a bis co) befinden, d.h. an jeder Stelle der Kohlenstoffkette. Sind mehrere Nitrogruppen an R1 und/oder R2 vorhanden, so können sich diese an beliebigen Positionen in den Kohlenstoffketten R1 und R2 befinden. Bevorzugt befindet sich die mindestens eine Nitrogruppe an einer Vinylgruppe einer ungesättigten Kohlenstoffkette. Dementsprechend befindet sich die mindestens eine Nitrogruppe vorzugsweise an einer Doppelbindung der ungesättigten Kohlenstoffkette. Es ist möglich, dass die Kohlenstoffkette mehr als eine Nitrogruppe enthält. Ferner ist bevorzugt, wenn sich die Nitrogruppe oder die Nitrogruppen in allylischer Position zur Doppelbindung befinden. Auch bevorzugt ist die vicinale Position von Nitrogruppen zu Hydroxylgruppen insbesondere an gesättigten Kohlenstoffatomen. Zudem kann die Kohlenstoffkette auch Doppel- und/oder Dreifachbindungen enthalten, sie kann einen Carbocyclus oder einen Heterocyclus oder einen aromatischen Ring oder einen heteroaromatischen Ring oder eine Carbonylgruppe enthalten, sie kann linear oder verzweigt sein und kann weitere Substituenten tragen. Somit bezieht sich der Begriff "Kohlenstoffkette" nicht nur auf lineare und gesättigte Alkylgruppen, sondern auch auf einfach ungesättigte, vielfach ungesättigte, einen Cyclus enthaltende, verzweigte und höher substituierte Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppen. Die einfach, doppelt oder vielfach ungesättigten Kohlenstoffketten der ungesättigten Carbonsäuren sind bevorzugt. Am meisten bevorzugt sind Doppelbindungen in der Kohlenstoffkette der Carbonsäure, wohingegen Dreifachbindungen und gesättigte Kohlenstoffketten weniger bevorzugt sind.
Somit steht der Begriff "nitrierte Kohlenstoffkette" für eine Kohlenstoffkette, an der sich mindestens eine Nitrogruppe befindet und die aus 5 bis 30 Kohlenstoffatomen besteht, wobei diese Kohlenstoffkette eine oder mehrere Doppelbindungen und/oder eine oder mehrere Dreifachbindungen enthalten kann, zyklisch sein kann, einen Carbocyclus, Heterocyclus, aromatischen Ring oder heteroaromatischen Ring umfassen kann, durch eine weitere oder mehrere weitere Nitrogruppen substituiert sein kann und mit einem, zwei oder drei Hydroxylgruppen, Thiolgruppen, Halogenresten, Carboxylatgruppen, Ci-C5-Alkoxycarbonylgruppen, C1-C5- Alkylcarbonyloxygruppen, Ci-C5-Alkoxygruppen, Ci-C5-Alkylaminogruppen, C1-C5- Dialkylaminogruppen und/oder Aminogruppen substituiert sein kann.
Der Begriff "verzweigt" bedeutet, dass die Kohlenstoffkette des Carbonsäurerestes mindestens eine Verzweigung aufweist, d.h. keine lineare Kohlenstoffkette vorliegt.
Der Begriff "Nitroalkylrest" oder "nitrierter Alkylrest" bezieht sich auf eine lineare oder verzweigte und gesättigte Kohlenstoffkette mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen und mindestens einer Nitrogruppe. Maximal kann der Nitroalkylrest 10 Nitrogruppen tragen. Vorzugsweise trägt der Nitroalkylrest 1 , 2 oder 3 Nitrogruppen, wenn er 5 - 10 Kohlenstoffatome aufweist und vorzugsweise 1 , 2, 3, 4 oder 5 Nitrogruppen, wenn er 1 1 - 20 Kohlenstoffatome aufweist und vorzugsweise 1 , 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 Nitrogruppen, wenn er 21 - 30 Kohlenstoffatome aufweist. Der Nitroalkylrest enthält ferner vorzugsweise zwischen 8 und 28 Kohlenstoffatome, weiter bevorzugt zwischen 10 und 26 Kohlenstoffatome, noch weiter bevorzugt zwischen 12 und 24 Kohlenstoffatome, und am meisten bevorzugt zwischen 14 und 22 Kohlenstoffatome.
Der Begriff "Nitroalkenylrest" oder "nitrierter Alkenylrest" bezieht sich auf eine lineare oder verzweigte und mit Doppelbindungen ungesättigte Kohlenstoffkette mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen und mindestens einer Nitrogruppe. Maximal kann der Nitroalkenylrest 10 Nitrogruppen tragen. Vorzugsweise trägt der Nitroalkenylrest 1 , 2 oder 3 Nitrogruppen, wenn er 5 - 10 Kohlenstoffatome aufweist und vorzugsweise
1 , 2, 3, 4 oder 5 Nitrogruppen, wenn er 1 1 - 20 Kohlenstoffatome aufweist und vorzugsweise 1 , 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 Nitrogruppen, wenn er 21 - 30 Kohlenstoffatome aufweist. Am meisten bevorzugt enthält der Nitroalkenylrest eine, zwei oder drei Nitrogruppen. Der Nitroalkenylrest enthält mindestens eine und maximal 15 Doppelbindungen. Bevorzugt sind eine, zwei oder drei Doppelbindungen, weiter bevorzugt sind eine oder zwei Doppelbindungen und insbesondere bevorzugt ist eine Doppelbindung. Die Doppelbindungen können jeweils unabhängig voneinander E (entgegen; teilweise auch als "trans" bezeichnet) oder Z (zusammen; teilweise auch als "eis" bezeichnet) sein. Bevorzugt sind Z-Doppelbindungen. Der Nitroalkenylrest enthält ferner vorzugsweise zwischen 8 und 28 Kohlenstoffatome, weiter bevorzugt zwischen 10 und 26 Kohlenstoffatome, noch weiter bevorzugt zwischen 12 und 24 Kohlenstoffatome, und am meisten bevorzugt zwischen 14 und 22 Kohlenstoffatome.
Der Begriff "Nitroalkinylrest" oder "nitrierter Alkinylrest" bezieht sich auf eine lineare oder verzweigte und mit Dreifachbindungen ungesättigte Kohlenstoffkette mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen und mindestens einer Nitrogruppe. Maximal kann der Nitroalkinylrest 10 Nitrogruppen tragen. Vorzugsweise trägt der Nitroalkinylrest 1 , 2 oder 3 Nitrogruppen, wenn er 5 - 10 Kohlenstoffatome aufweist und vorzugsweise 1 ,
2, 3, 4 oder 5 Nitrogruppen, wenn er 1 1 - 20 Kohlenstoffatome aufweist und vorzugsweise 1 , 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 Nitrogruppen, wenn er 21 - 30 Kohlenstoffatome aufweist. Am meisten bevorzugt enthält der Nitroalkinylrest eine, zwei oder drei Nitrogruppen. Der Nitroalkinylrest enthält mindestens eine und maximal 10 Dreifachbindungen. Bevorzugt sind eine, zwei oder drei Dreifachbindungen, weiter bevorzugt sind eine oder zwei Dreifachbindungen und insbesondere bevorzugt ist eine Dreifachbindungen. Der Nitroalkinylrest enthält ferner vorzugsweise zwischen 8 und 28 Kohlenstoffatome, weiter bevorzugt zwischen 10 und 26 Kohlenstoffatome, noch weiter bevorzugt zwischen 12 und 24 Kohlenstoffatome, und am meisten bevorzugt zwischen 14 und 22 Kohlenstoffatome.
Der Begriff "Nitroalkylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen enthaltend einen Cycloalkylrest oder einen Heterocycloalkylrest oder eine Carbonylgruppe" bezieht sich auf eine lineare oder verzweigte Kohlenstoffkette mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, wobei sich in dieser Kohlenstoffkette ein Cycloalkylrest oder ein Heterocycloalkylrest oder eine Carbonylgruppe befindet. Die Kohlenstoffatome des Cycloalkylrestes oder des Heterocycloalkylrestes oder der Carbonylgruppe sind in der Gesamtzahl der Kohlenstoffatome enthalten, also in den 5 - 30 Kohlenstoffatomen enthalten. Der Nitroalkylrest mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen enthaltend einen Cycloalkylrest oder einen Heterocycloalkylrest oder eine Carbonylgruppe trägt maximal 10 Nitrogruppen und vorzugsweise trägt er 1 , 2 oder 3 Nitrogruppen, wenn er 5 - 10 Kohlenstoffatome aufweist und vorzugsweise 1 , 2, 3, 4 oder 5 Nitrogruppen, wenn er 1 1 - 20 Kohlenstoffatome aufweist und vorzugsweise 1 , 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 Nitrogruppen, wenn er 21 - 30 Kohlenstoffatome aufweist. Am meisten bevorzugt enthält dieser Nitroalkylrest eine, zwei oder drei Nitrogruppen. Der Nitroalkylrest enthaltend einen Cycloalkylrest oder einen Heterocycloalkylrest oder eine Carbonylgruppe besitzt vorzugsweise zwischen 8 und 28 Kohlenstoffatome, weiter bevorzugt zwischen 10 und 26 Kohlenstoffatome, noch weiter bevorzugt zwischen 12 und 24 Kohlenstoffatome, und am meisten bevorzugt zwischen 14 und 22 Kohlenstoffatome.
Der Begriff "Alkylrest" bezieht sich auf eine lineare oder verzweigte und gesättigte Kohlenstoffkette mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen und ohne Nitrogruppe. Der Alkylrest enthält ferner vorzugsweise zwischen 8 und 28 Kohlenstoffatome, weiter bevorzugt zwischen 10 und 26 Kohlenstoffatome, noch weiter bevorzugt zwischen 12 und 24 Kohlenstoffatome, und am meisten bevorzugt zwischen 14 und 22 Kohlenstoffatome.
Der Begriff "Alkenylrest" bezieht sich auf eine lineare oder verzweigte und mit Doppelbindungen ungesättigte Kohlenstoffkette mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen und ohne Nitrogruppe. Der Alkenylrest enthält mindestens eine und maximal 15 Doppelbindungen. Bevorzugt sind eine, zwei oder drei Doppelbindungen, weiter bevorzugt sind eine oder zwei Doppelbindungen und insbesondere bevorzugt ist eine Doppelbindung. Die Doppelbindungen können jeweils unabhängig voneinander E (entgegen; teilweise auch als "trans" bezeichnet) oder Z (zusammen; teilweise auch als "eis" bezeichnet) sein. Bevorzugt sind Z-Doppelbindungen. Der Alkenylrest enthält ferner vorzugsweise zwischen 8 und 28 Kohlenstoffatome, weiter bevorzugt zwischen 10 und 26 Kohlenstoffatome, noch weiter bevorzugt zwischen 12 und 24 Kohlenstoffatome, und am meisten bevorzugt zwischen 14 und 22 Kohlenstoffatome.
Der Begriff "Alkinylrest" bezieht sich auf eine lineare oder verzweigte und mit Dreifachbindungen ungesättigte Kohlenstoffkette mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen und mindestens einer Nitrogruppe. Der Alkinylrest enthält mindestens eine und maximal 10 Dreifachbindungen. Bevorzugt sind eine, zwei oder drei Dreifachbindungen, weiter bevorzugt sind eine oder zwei Dreifachbindungen und insbesondere bevorzugt ist eine Dreifachbindungen. Der Alkinylrest enthält ferner vorzugsweise zwischen 8 und 28 Kohlenstoffatome, weiter bevorzugt zwischen 10 und 26 Kohlenstoffatome, noch weiter bevorzugt zwischen 12 und 24 Kohlenstoffatome, und am meisten bevorzugt zwischen 14 und 22 Kohlenstoffatome.
Der Nitroalkylrest, Nitroalkenylrest, Nitroalkinylrest, Nitroalkylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen enthaltend einen Cycloalkylrest oder einen Heterocycloalkylrest oder eine Carbonylgruppe, Alkylrest, Alkenylrest und Alkinylrest kann ferner mit einer, zwei oder drei Hydroxylgruppen, Thiolgruppen, Halogenresten (-F, -Cl, -Br, -I), Carboxylatgruppen, Ci-C5-Alkoxycarbonylgruppen, Ci-C5-Alkylcarbonyl- oxygruppen, Ci-C5-Alkoxygruppen, Ci-C5-Alkylaminogruppen, Ci-C5-Dialkylamino- gruppen und/oder Aminogruppen substituiert sein. Weiter bevorzugt sind Hydroxyl- und Ci-C5-Alkoxygruppen und besonders bevorzugt sind Hydroxylgruppen.
Bevorzugt sind erfindungsgemäße Phospholipide und deren Verwendungen, worin R1 ein Nitroalkylrest und R2 ein Nitroalkylrest oder worin R1 ein Nitroalkylrest und R2 ein Nitroalkenylrest oder worin R1 ein Nitroalkylrest und R2 ein Alkylrest oder worin R1 ein Nitroalkylrest und R2 ein Alkenylrest oder worin R1 ein Nitroalkenylrest und R2 ein Nitroalkylrest oder worin R1 ein Nitroalkenylrest und R2 ein Nitroalkenylrest oder worin R1 ein Nitroalkenylrest und R2 ein Alkylrest oder worin R1 ein Nitroalkenylrest und R2 ein Alkenylrest oder worin R1 ein Alkylrest und R2 ein Nitroalkylrest oder worin R1 ein Alkylrest und R2 ein Nitroalkenylrest oder worin R1 ein Alkenylrest und R2 ein Nitroalkylrest oder worin R1 ein Alkenylrest und R2 ein Nitroalkenylrest ist.
Folgende Carbonsäuren dargestellt als freie Säure R1COOH und R2COOH werden vorzugsweise als Reste R1COO- und R2COO- in den Nitrocarbonsäure- enthaltenden Phospholipiden gemäß Formel (I) verwendet. D.h. die folgenden Carbonsäuren werden vorzugsweise in nitrierter Form, d.h. mit mindestens einer Nitrogruppe und optional weiteren Substituenten wie oben aufgeführt zur Veresterung des Glycerinrestes in den erfindungsgemäßen Phospholipiden benutzt: Hexansäure (Capronsäure), Octansäure (Caprylsäure), Decansäure (Caprinsäure), Dodecansäure (Laurinsäure), Tetradecansäure (Myristinsäure), Hexadecansäure (Palmitinsäure), Heptadecansäure (Margarinsäure), Octadecansäure (Stearinsäure), Eicosansäure (Arachinsäure), Docosansäure (Behensäure), Tetracosansäure (Lignocerinsäure), cis-9-Tetradecensäure (Myristoleinsäure), cis-9-Hexadecensäure (Palmitoleinsäure), cis-6-Octadecensäure (Petroselinsäure), cis-9-Octadecensäure (Ölsäure), cis-1 1 -Octadecensäure (Vaccensäure), cis-9-Eicosensäure (Gadoleinsäure), cis-1 1 -Eicosensäure (Gondoinsäure), cis-13-Docosensäure (Erucinsäure), cis-15-Tetracosensäure (Nervonsäure), t9-Octadecensäure, t1 1 - Octadecensäure, t3-Hexadecensäure, 9,12-Octadecadiensäure (Linolsäure), 6,9,12- Octadecatriensäure (/-Linolensäure), 8,1 1 ,14-Eicosatriensäure (Dihomo-γ- linolensäure), 5,8,1 1 ,14-Eicosatetraensäure (Arachidonsäure), 7,10,13,16- Docosatetraensäure, 4,7,10,13,16-Docosapentaensäure, 9,12,15-
Octadecatriensäure (α-Linolensäure), 6,9,12,15-Octadecatetraensäure
(Stearidonsäure), 8,1 1 ,14,17-Eicosatetraensäure, 5,8,1 1 ,14,17-Eicosapentaensäure (EPA), 7,10,13,16,19-Docosapentaensäure (DPA), 4,7,10,13,16,19- Docosahexaensäure (DHA), 5,8,1 1 -Eicosatriensäure (Meadsäure), 9c1 1 t13t- Eleostearinsäure, 8t10t12c-Calendulasäure, 9c1 1113c-Catalpinsäure,
4,7,9,1 1 ,13,16,19-Docosaheptadecansäure, Taxoleinsäure, Pinolensäure, Sciadonsäure, 6-Octadecinsäure (Taririnsäure), t1 1 -Octadecen-9-insäure (Santalbinsäure oder auch Ximeninsäure), 9-Octadecinsäure (Stearolsäure), 6- Octadecen-9-insäure, t10-Heptadecen-8-insäure (Pyrulinsäure), 9-Octadecen-12- insäure (Crepeninsäure), t7,t1 1 -Octadecadien-9-insäure (Heisterinsäure), t8,t10- Octadecadien-12-insäure, 5,8,1 1 ,14-Eicosatetrainsäure (ETYA), Retinsäure, Isopalmitinsäure, Pristansäure, 3,7,1 1 ,15-Tetramethylhexadecansäure (Phytansäure), 1 1 ,12-Methylen-Octadecansäure, 9,10-Methylen-Hexadecansäure, Coronarinsäure, (R,S)- Lipon säure, (S)-Liponsäure, (R)- Lipon säure, 6,8- (Methylsulfanyl)-octansäure, 4,6-bis(Methylsulfanyl)-hexansäure, 2,4- bis(Methylsulfanyl)-butansäure, 1 ,2-Dithiolancarboxylsäure, (R,S)-6,8-Dithian- octansäure, (S)-6,8-Dithian-octansäure, 6,9-Octadeceninsäure, t8,t10-Octadecadien- 12-insäure, Hydroxytetracosansäure (Cerebronsäure), 2-Hydroxy-15- tetracosensäure (Hydroxynervonsäure), 12-Hydroxy-9-octadecensäure
(Ricinoleinsäure), 14-Hydroxy-1 1 -eicosensäure (Lesquerolinsäure), Pimelinsäure, Suberinsäure, Azelainsäure, Sebacinsäure, Brassylinsäure und Thapsinsäure. Ist nur ein Carbonsäurerest R1COO- oder R2COO- nitriert, so wird der andere nicht nitrierte Carbonsäurerest vorzugsweise auch aus der obigen Liste ausgewählt.
Bevorzugt ist zudem die Verwendung der nitrierten Formen der vorgenannten Säuren. Die Reste R1COO- und R2COO- in den Nitrocarbonsäure-enthaltenden Phospholipiden gemäß der vorliegenden Erfindung, dargestellt als freie Säure R1COOH und R2COOH, können dabei eine nitrierte Carbonsäure repräsentieren, wobei die jeweilige(n) Carbonsäure(n) aus der obigen Gruppe ausgewählt werden.
Dies bedeutet, dass die obigen konkret genannten Carbonsäuren vorzugsweise als Reste R1COO- oder als Rest R2COO- in den erfindungsgemäßen Phospholipiden gemäß allgemeiner Formel (I) verwendet werden und die nitrierte Form dieser oben konkret genannten Carbonsäuren vorzugsweise als zweiter Lipidrest R2COO- oder R1COO- eingesetzt werden oder die nitrierte Form dieser oben konkret genannten Carbonsäuren vorzugsweise für beide Lipidreste R1COO- und R2COO- verwendet werden. Besonders bevorzugt als Lipidreste in den erfindungsgemäßen Phospholipiden sind die folgenden nitrierten Carbonsäurereste R1COO- und R2COO-:
Nitrohexadecanoyl, Dinitrohexadecanoyl, Trinitrohexadecanoyl, Nitroheptadecanoyl, Dinitroheptadecanoyl, Trinitroheptadecanoyl, Nitrooctadecanoyl, Dinitrooctadecanoyl, Trinitrooctadecanoyl, Nitroeicosanoyl, Dinitroeicosanoyl, Trinitroeicosanoyl, Nitrodocosanoyl, Dinitrodocosanoyl, Trinitrodocosanoyl, Nitrotetracosanoyl, Dinitrotetracosanoyl, Trinitrotetracosanoyl, Nitro-cis-9-tetradecenoyl, Dinitro-cis-9- tetradecenoyl, Trinitro-cis-9-tetradecenoyl, Nitro-cis-9-hexadecenoyl, Dinitro-cis-9- hexadecenoyl, Trinitro-cis-9-hexadecenoyl, Nitro-cis-6-octadecenoyl, Dinitro-cis-6- octadecenoyl, Trinitro-cis-6-octadecenoyl, Nitro-cis-9-octadecenoyl, Dinitro-cis-9- octadecenoyl, Trinitro-cis-9-octadecenoyl, Nitro-cis-1 1 -octadecenoyl, Dinitro-cis-1 1 - octadecenoyl, Trinitro-cis-1 1 -octadecenoyl, Nitro-cis-9-eicosenoyl, Dinitro-cis-9- eicosenoyl, Trinitro-cis-9-eicosenoyl, Nitro-cis-1 1 -eicosenoyl, Dinitro-cis-1 1 - eicosenoyl, Trinitro-cis-1 1 -eicosenoyl, Nitro-cis-13-docosenoyl, Dinitro-cis-13- docosenoyl, Trinitro-cis-13-docosenoyl, Nitro-cis-15-tetracosenoyl, Dinitro-cis-15- tetracosenoyl, Trinitro-cis-15-tetracosenoyl, Nitro-t9-octadecenoyl, Dinitro-t9- octadecenoyl, Trinitro-t9-octadecenoyl, Nitro-t1 1 -octadecenoyl, Dinitro-t1 1 - octadecenoyl, Trinitro-t1 1 -octadecenoyl, Nitro-t3-hexadecenoyl, Dinitro-t3- hexadecenoyl, Trinitro-t3-hexadecenoyl, Nitro-9,12-octadecadienoyl, Dinitro-9,12- octadecadienoyl, Trinitro-9,12-octadecadienoyl, Nitro-6,9,12-octadecatrienoyl, Dinitro-6,9,12-octadecatrienoyl, Trinitro-6,9,12-octadecatrienoyl, Nitro-8,1 1 ,14- eicosatrienoyl, Dinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, Trinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, Nitro-
5.8.1 1 .14- eicosatetraenoyl , Din itro-5,8, 1 1 , 14-eicosatetraenoyl , Trin itro-5,8, 1 1 ,14- eicosatetraenoyl, Nitro-7,10,13,16-docosatetraenoyl, Dinitro-7,10,13,16- docosatetraenoyl, Trinitro-7,10,13,16-docosatetraenoyl, Nitro-4,7,10,13,16- docosapentaenoyl, Dinitro-4,7,10,13,16-docosapentaenoyl, Trinitro-4,7,10,13,16- docosapentaenoyl, Nitro-9,12,15-octadecatrienoyl, Dinitro-9,12,15-octadecatrienoyl, Trin itro-9, 12,15-octadecatrienoyl , N itro-6,9, 12,15-octadecatetraenoyl , Din itro-
6.9.12.15- octadecatetraenoyl, Trinitro-6,9,12,15-octadecatetraenoyl, Nitro- 8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, Trinitro-8,1 1 ,14,17- eicosatetraenoyl, Nitro-5,8,1 1 ,14,17-eicosapentaenoyl, Dinitro-5,8,1 1 ,14,17- eicosapentaenoyl, Trinitro-5,8,1 1 ,14,17-eicosapentaenoyl, Nitro-7,10,13,16,19- docosapentaenoyl , Dinitro-7,10,13,16,19-docosapentaenoyl , Trinitro-7,10,13,16,19- docosapentaenoyl, Nitro-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoyl, Dinitro-4,7,10,13,16,19- docosahexaenoyl, Trinitro-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoyl, Nitro-5,8,1 1 - eicosatrienoyl, Dinitro-5,8,1 1 -eicosatrienoyl, Trinitro-5,8,1 1 -eicosatrienoyl, Nitro- 9c1 1113t-eleostearinoyl, Dinitro-9c1 1113t-eleostearinoyl, Trinitro-9c1 1113t- eleostearinoyl, Nitro-8t10t12c-calendulaoyl, Dinitro-8t10t12c-calendulaoyl, Trinitro- 8t10t12c-calendulaoyl, Nitro-9c1 1 t13c-catalpinoyl, Dinitro-9c1 1t13c-catalpinoyl, Trinitro-9c1 1113c-catalpinoyl, Nitro-4, 7,9,1 1 ,13,16,19-docosaheptadecanoyl, Dinitro- 4,7,9,1 1 ,13,16,19-docosaheptadecanoyl, Trinitro-4,7,9,1 1 ,13,16,19- docosaheptadecanoyl, Nitrotaxoleinoyl, Dinitrotaxoleinoyl, T nitrotaxoleinoyl, Nitropinolenoyl, Dinitropinolenoyl, T nitropinolenoyl, Nitrosciadonoyl, Dinitrosciadonoyl, T nitrosciadonoyl, Nitro-6-octadecinoyl, Dinitro-6-octadecinoyl, Trinitro-6-octadecinoyl, Nitro-t1 1 -octadecen-9-inoyl, Dinitro-t1 1 -octadecen-9-inoyl, Trinitro-t1 1 -octadecen-9-inoyl, Nitro-9-octadecinoyl, Dinitro-9-octadecinoyl, Trinitro-9- octadecinoyl, Nitro-6-octadecen-9-inoyl, Dinitro-6-octadecen-9-inoyl, Trinitro-6- octadecen-9-inoyl, Nitro-t10-heptadecen-8-inoyl, Dinitro-t10-heptadecen-8-inoyl, Trinitro-t10-heptadecen-8-inoyl, Nitro-9-octadecen-12-inoyl, Dinitro-9-octadecen-12- inoyl, Thnitro-9-octadecen-12-inoyl, Nitro-t7,t1 1 -octadecadien-9-inoyl, Dinitro-t7,t1 1 - octadecadien-9-inoyl, Thnitro-t7,t1 1 -octadecadien-9-inoyl, Nitro-t8,t10-octadecadien- 12-inoyl, Dinitro-t8,t10-octadecadien-12-inoyl, Trinitro-t8,t10-octadecadien-12-inoyl, Nitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetrainoyl, Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetrainoyl, Thnitro-5,8,1 1 ,14- eicosatetrainoyl, Nitroretinoyl, Dinitroretinoyl, T nitroretinoyl, Nitroisopalmitinoyl, Dinitroisopalmitinoyl, T nitroisopalmitinoyl, Nitropristanoyl, Dinitropristanoyl, T nitrophstanoyl, Nitrophytanoyl, Dinitrophytanoyl, T nitrophytanoyl, Nitro-1 1 ,12- methylen-Octadecanoyl, Dinitro-1 1 ,12-methylen-Octadecanoyl, Thnitro-1 1 ,12- methylen-Octadecanoyl, Nitro-9,10-methylen-Hexadecanoyl, Dinitro-9,10-methylen- Hexadecanoyl, Thnitro-9,10-methylen-Hexadecanoyl, Nitrocoronarinoyl, Dinitrocoronarinoyl, T nitrocoronarinoyl, Nitro-6,9-octadeceninoyl, Dinitro-6,9- octadeceninoyl, Thnitro-6,9-octadeceninoyl, Nitro-t8,t10-octadecadien-12-inoyl, Dinitro-t8,t10-octadecadien-12-inoyl, Trinitro-t8,t10-octadecadien-12-inoyl,
Nitrohydroxytetracosanoyl, Dinitrohydroxytetracosanoyl, T nitrohydroxytetracosanoyl, Nitro-2-hydroxy-15-tetracosenoyl, Dinitro-2-hydroxy-15- tetracosenoyl, Thnitro-2-hydroxy-15-tetracosenoyl, Nitrobrassylinoyl,
Dinitrobrassylinoyl, T nitrobrassylinoyl, Nitrothapsinoyl, Dinitrothapsinoyl und T nitrothapsinoyl. Weitere insbesondere bevorzugte nitrierte Carbonsäurereste R1COO- und R2COO- als auch Mischungen von Carbonsäureresten sind auf den folgenden Seiten genannt:
trans-9-Nitro-9-octadecenoyl, trans-10-Nitro-9-octadecenoyl.
Mischungen von trans-9-Nitro-9-octadecenoyl und trans-10-Nitro-9-octadecenoyl, trans-9-Nitro-10-octadecenoyl, trans-10-Nitro-8-octadecenoyl.
Mischungen von trans-9-Nitro-10-octadecenoyl und trans-10-Nitro-8-octadecenoyl,
10-Hydroxy-9-nitrooctadecanoyl, 9-Hydroxy-10-nitrooctadecanoyl.
Mischungen von 10-Hydroxy-9-nitrooctadecanoyl und 9-Hydroxy-10- nitrooctadecanoyl. trans-9-Nitro-9-tetradecenoyl, trans-10-Nitro-9-tetradecenoyl.
Mischungen von trans-9-Nitro-9-tetradecenoyl und trans-10-Nitro-9-tetradecenoyl, trans-9-Nitro-10-tetradecenoyl, trans-10-Nitro-8-tetradecenoyl.
Mischungen von trans-9-Nitro-10-tetradecenoyl und trans-10-Nitro-8-tetradecenoyl, 10-Hydroxy-9-nitrotetradecanoyl, 9-Hydroxy-10-nitrotetradecanoyl.
Mischungen von 10-Hydroxy-9-nitrotetradecanoyl und 9-Hydroxy-10- nitrotetradecanoyl.
trans-9-Nitro-9-hexadecenoyl, trans-10-Nitro-9-hexadecenoyl.
Mischungen von trans-9-Nitro-9-hexadecenoyl und trans-10-Nitro-9-hexadecenoyl, trans-9-Nitro-10-hexadecenoyl, trans-10-Nitro-8-hexadecenoyl.
Mischungen von trans-9-Nitro-10-hexadecenoyl und trans-10-Nitro-8-hexadecenoyl,
10-Hydroxy-9-nitrohexadecanoyl, 9-Hydroxy-10-nitrohexadecanoyl.
Mischungen von 10-Hydroxy-9-nitrohexadecanoyl und 9-Hydroxy-10- nitrohexadecanoyl.
trans-6-Nitro-6-octadecenoyl, trans-7-Nitro-6-octadecenoyl.
Mischungen von trans-6-Nitro-6-octadecenoyl und trans-7-Nitro-6-octadecenoyl, trans-6-Nitro-7-octadecenoyl, trans-7-Nitro-5-octadecenoyl.
Mischungen von trans-6-Nitro-7-octadecenoyl und trans-7-Nitro-5-octadecenoyl, 7-
Hydroxy-6-nitrooctadecanoyl, 6-Hydroxy-7-nitrooctadecanoyl.
Mischungen von 7-Hydroxy-6-nitrooctadecanoyl und 6-Hydroxy-7-nitrooctadecanoyl. trans-1 1 -Nitro-1 1 -octadecenoyl, trans-12-Nitro-1 1 -octadecenoyl.
Mischungen von trans-1 1 -Nitro-1 1 -octadecenoyl und trans-12-Nitro-1 1 -octadecenoyl, trans-1 1 -Nitro-12-octadecenoyl, trans-12-Nitro-10-octadecenoyl.
Mischungen von trans-1 1 -Nitro-12-octadecenoyl und trans-12-Nitro-10-octadecenoyl, 12-Hydroxy-1 1 -nitrooctadecanoyl, 1 1 -Hydroxy-12-nitrooctadecanoyl.
Mischungen von 12-Hydroxy-1 1 -nitrooctadecanoyl und 1 1 -Hydroxy-12- nitrooctadecanoyl.
trans-9-Nitro-9-eicosenoyl, trans-10-Nitro-9-eicosenoyl.
Mischungen von trans-9-Nitro-9-eicosenoyl und trans-10-Nitro-9-eicosenoyl, trans-9- Nitro-10-eicosenoyl, trans-10-Nitro-8-eicosenoyl.
Mischungen von trans-9-Nitro-10-eicosenoyl und trans-10-Nitro-8-eicosenoyl, 10-
Hydroxy-9-nitroeicosanoyl, 9-Hydroxy-10-nitroeicosanoyl.
Mischungen von 10-Hydroxy-9-nitroeicosanoyl und 9-Hydroxy-10-nitroeicosanoyl. trans-1 1 -Nitro-1 1 -eicosenoyl, trans-12-Nitro-1 1 -eicosenoyl.
Mischungen von trans-1 1 -Nitro-1 1 -eicosenoyl und trans-12-Nitro-1 1 -eicosenoyl, trans-1 1 -Nitro-12-eicosenoyl, trans-12-Nitro-10-eicosenoyl.
Mischungen von trans-1 1 -Nitro-12-eicosenoyl und trans-12-Nitro-10-eicosenoyl, 12-
Hydroxy-1 1 -nitroeicosanoyl, 1 1 -Hydroxy-12-nitroeicosanoyl.
Mischungen von 12-Hydroxy-1 1 -nitroeicosanoyl und 1 1 -Hydroxy-12-nitroeicosanoyl. trans-13-Nitro-13-docosenoyl, trans-14-Nitro-13-docosenoyl.
Mischungen von trans-13-Nitro-13-docosenoyl und trans-14-Nitro-13-docosenoyl, trans-13-Nitro-14-docosenoyl, trans-14-Nitro-12-docosenoyl.
Mischungen von trans-13-Nitro-14-docosenoyl und trans-14-Nitro-12-docosenoyl, 14- Hydroxy-13-nitrodocosenoyl, 13-Hydroxy-14-nitrodocosenoyl.
Mischungen von 14-Hydroxy-13-nitrodocosenoyl und 13-Hydroxy-14- nitrodocosenoyl.
trans-15-Nitro-15-docosenoyl, trans-16-Nitro-15-docosenoyl.
Mischungen von trans-15-Nitro-15-docosenoyl und trans-16-Nitro-15-docosenoyl, trans-15-Nitro-16-docosenoyl, trans-16-Nitro-14-docosenoyl.
Mischungen von trans-15-Nitro-16-docosenoyl und trans-16-Nitro-14-docosenoyl, 16-
Hydroxy-15-nitrodocosenoyl, 15-Hydroxy-16-nitrodocosenoyl.
Mischungen von 16-Hydroxy-15-nitrodocosenoyl und 15-Hydroxy-16- nitrodocosenoyl.
(E,Z)-9-Nitro-9,12-octadecadienoyl, (E,Z)-10-Nitro-9,12-octadecadienoyl, (Z,E)-12- Nitro-9,12-octadecadienoyl, (Z,E)-13-Nitro-9,12-octadecadienoyl.
Mischungen von (E,E)-9-Nitro-9,12-octadecadienoyl, (E,E)-10-Nitro-9,12- octadecadienoyl, (E,E)-12-Nitro-9,12-octadecadienoyl und (E,E)-13-Nitro-9,12- octadecadienoyl.
(E,E)-9,12-Dinitro-9,12-octadecadienoyl, (E,E)-9,13-Dinitro -9,12-octadecadienoyl, (E,E)-10,12-Dinitro-9,12-octadecadienoyl, (E,E)-10,13-Dinitro-9,12-octadecadienoyl. Mischungen von (E,E)-9,12-Dinitro-9,12-octadecadienoyl, (E,E)-9,13-Dinitro -9,12- octadecadienoyl, (E,E)-10,12-Dinitro-9,12-octadecadienoyl, (E,E)-10,13-Dinitro-9,12- octadecadienoyl.
Mischungen von (E,E)-9-Nitro-9,12-octadecadienoyl, (E,E)-10-Nitro-9,12- octadecadienoyl, (E,E)-12-Nitro-9,12-octadecadienoyl, (E,E)-13-Nitro-9,12- octadecadienoyl, (E,E)-9,12-Dinitro-9,12-octadecadienoyl, (E,E)-9,13-Dinitro -9,12- octadecadienoyl, (E,E)-10,12-Dinitro-9,12-octadecadienoyl, (E,E)-10,13-Dinitro-9,12- octadecadienoyl.
(E,Z)-9-Nitro-10,12-octadecadienoyl, (E,Z)-10-Nitro-8,12-octadecadienoyl, (Z,E)-12- Nitro-9,13-octadecadienoyl, (Z,E)-13-Nitro-9,1 1 -octadecadienoyl.
Mischungen von (E,Z)-9-Nitro-10,12-octadecadienoyl, (E,Z)-10-Nitro-8,12- octadecadienoyl, (Z,E)-12-Nitro-9,13-octadecadienoyl, (Z,E)-13-Nitro-9,1 1 - octadecadienoyl.
(Z)-10-Hydroxy-9-nitro-12-octadecenoyl, (Z)-9-Hydroxy-10-nitro-12-octadecenoyl, (Z)-13-Hydroxy-12-nitro-9-octadecenoyl, (Z)-12-Hydroxy-13-nitro-9-octadecenoyl, 10,13-Dihydroxy-9,12-dinitrooctadecanoyl, 9,13-Dihydroxy-10,12- dinitrooctadecanoyl, 10,12-Dihydroxy-9,13-dinitrooctadecanoyl, 9,12-Dihydroxy- 10,13-dinitrooctadecanoyl. Mischungen von (Z)-10-Hydroxy-9-nitro-12-octadecenoyl, (Z)-9-Hydroxy-10-nitro-12- octadecenoyl, (Z)-13-Hydroxy-12-nitro-9-octadecenoyl, (Z)-12-Hydroxy-13-nitro-9- octadecenoyl, 10,13-Dihydroxy-9,12-dinitrooctadecanoyl, 9,13-Dihydroxy-10,12- dinitrooctadecanoyl, 10,12-Dihydroxy-9,13-dinitrooctadecanoyl, 9,12-Dihydroxy- 10,13-dinitrooctadecano l,
Figure imgf000027_0001
(Z,Z,Z)-6,9,12-Octadecatriensäure (γ-Linolensäure) (E,Z,Z)-6-Nitro-6,9,12-octadecathenoyl, (E,Z,Z)-7-Nitro-6,9,12-octadecathenoyl, (Z,E,Z)-9-Nitro-6,9,12-octadecathenoyl, (Z,E,Z)-10-Nitro-6,9,12-octadecathenoyl, (Z,Z,E)-12-Nitro-6,9,12-octadecathenoyl, (Z,Z,E)-13-Nitro-6,9,12-octadecatrienoyl. Mischungen von (E,Z,Z)-6-Nitro-6,9,12-octadecathenoyl, (E,Z,Z)-7-Nitro-6,9,12- octadecatrienoyl, (Z,E,Z)-9-Nitro-6,9,12-octadecatrienoyl, (Z,E,Z)-10-Nitro-6,9,12- octadecatrienoyl, (Z,Z,E)-12-Nitro-6,9,12-octadecatrienoyl, (Z,Z,E)-13-Nitro-6,9,12- octadecatrienoyl.
Figure imgf000027_0002
(Z,E,Z)-10-Nitro-6,9,12-octadecatrienoyl (E,E,Z)-6,9-Dinitro-6,9,12-octadecatrienoyl, (E,E,Z)-6,10-Dinitro-6,9,12- octadecatrienoyl, (E,E,Z)-7,9-Dinitro-6, 9,12-octadecatrienoyl, (E,E,Z)-7,10-Dinitro- 6,9,12-octadecatrienoyl, (E,Z,E)-6,12-Dinitro-6,9,12-octadecatrienoyl, (E,Z,E)-6,13- Dinitro-6, 9,12-octadecatrienoyl, (E,Z,E)-7,12-Dinitro-6, 9,12-octadecatrienoyl, (Ε,Ζ,Ε)- 7,13-Dinitro-6, 9,12-octadecatrienoyl, (Z,E,E)-9,12-Dinitro-6, 9,12-octadecatrienoyl, (Z,E,E)-9,13-Dinitro-6,9,12-octadecatrienoyl, (Z,E,E)-10,12-Dinitro-6,9,12- octadecatrienoyl, (Z,E,E)-10,13-Dinitro-6, 9,12-octadecatrienoyl.
Figure imgf000027_0003
(E,Z,E)-7,12-Dinitro-6,9,12-octadecatrienoyl
Mischungen von (E,E,Z)-6,9-Dinitro-6, 9,12-octadecatrienoyl, (E,E,Z)-6,10-Dinitro- 6,9,12-octadecatrienoyl, (E,E,Z)-7,9-Dinitro-6,9,12-octadecatrienoyl, (E,E,Z)-7,10- Dinitro-6,9,12-octadecatrienoyl, (E,Z,E)-6,12-Dinitro-6,9,12-octadecathenoyl, (Ε,Ζ,Ε)- 6,13-Dinitro-6,9,12-octadecatrienoyl, (E,Z,E)-7,12-Dinitro-6, 9,12-octadecathenoyl, (E,Z,E)-7,13-Dinitro-6,9,12-octadecathenoyl, (Z,E,E)-9,12-Dinitro-6,9,12- octadecatrienoyl, (Z,E,E)-9,13-Dinitro-6, 9,12-octadecatrienoyl, (Z,E,E)-10,12-Dinitro- 6,9,12-octadecatrienoyl und (Z,E,E)-10,13-Dinitro-6, 9,12-octadecatrienoyl.
(E,E,E)-6,9,12-Trinitro-6,9,12-octadecatrienoyl, (E,E,E)-6,9,13-Trinitro-6,9,12- octadecatrienoyl, (E,E,E)-6,10,12-Trinitro-6,9,12-octadecatrienoyl, (E,E,E)-6,10,13- Trinitro-6, 9,12-octadecatrienoyl, (E, E,E)-7, 9, 12-Trinitro-6, 9,12-octadecatrienoyl, (E,E,E)-7,9,13-Trinitro-6,9,12-octadecatrienoyl, (E,E,E)-7,10,12-Trinitro-6,9,12- octadecatrienoyl, (E,E,E)-7,10,13-Trinitro-6, 9,12-octadecatrienoyl.
Figure imgf000028_0001
(E,E,E)-6,9,13-Trinitro-6,9,12-octadecatrienoyl,
Mischungen von (E,E,E)-6,9,12-Trinitro-6,9,12-octadecatrienoyl, (E,E,E)-6,9,13- Trinitro-6, 9,12-octadecatrienoyl, (E,E,E)-6,10,12-Trinitro-6, 9,12-octadecatrienoyl, (E,E,E)-6,10,13-Trinitro-6,9,12-octadecatrienoyl, (E,E,E)-7,9,12-Trinitro-6,9,12- octadecatrienoyl, (E, E,E)-7, 9,13-Trinitro-6,9,12-octadecatrienoyl, (E,E,E)-7,10,12- Trinitro-6, 9,12-octadecatrienoyl und (E,E,E)-7,10,13-Trinitro-6, 9,12-octadecatrienoyl.
Mischungen von (E,Z,Z)-6-Nitro-6,9,12-octadecatrienoyl, (E,Z,Z)-7-Nitro-6,9,12- octadecatrienoyl, (Z,E,Z)-9-Nitro-6,9,12-octadecatrienoyl, (Z,E,Z)-10-Nitro-6,9,12- octadecatrienoyl, (Z,Z,E)-12-Nitro-6,9,12-octadecatrienoyl, (Z,Z,E)-13-Nitro-6,9,12- octadecatrienoyl, (E,E,Z)-6,9-Dinitro-6, 9,12-octadecatrienoyl, (E,E,Z)-6,10-Dinitro- 6,9,12-octadecatrienoyl, (E,E,Z)-7,9-Dinitro-6,9,12-octadecatrienoyl, (E,E,Z)-7,10- Dinitro-6,9,12-octadecatrienoyl, (E,Z,E)-6,12-Dinitro-6,9,12-octadecatrienoyl, (Ε,Ζ,Ε)- 6,13-Dinitro-6, 9,12-octadecatrienoyl, (E,Z,E)-7,12-Dinitro-6, 9,12-octadecatrienoyl, (E,Z,E)-7,13-Dinitro-6,9,12-octadecatrienoyl, (Z,E,E)-9,12-Dinitro-6,9,12- octadecatrienoyl, (Z,E,E)-9,13-Dinitro-6,9,12-octadecatrienoyl, (Z,E,E)-10,12-Dinitro- 6,9,12-octadecatrienoyl, (Z,E,E)-10,13-Dinitro-6,9,12-octadecatrienoyl, (Ε,Ε,Ε)- 6,9,12-Trinitro-6,9,12-octadecatrienoyl, (E,E,E)-6,9,13-Trinitro-6,9,12- octadecatrienoyl, (E,E,E)-6,10,12-Trinitro-6,9,12-octadecatrienoyl, (E,E,E)-6,10,13- Trinitro-6, 9,12-octadecatrienoyl, (E, E,E)-7, 9, 12-Trinitro-6, 9,12-octadecatrienoyl, (E,E,E)-7,9,13-Trinitro-6,9,12-octadecatrienoyl, (E,E,E)-7,10,12-Trinitro-6,9,12- octadecatrienoyl und (E,E,E)-7,10,13-Trinitro-6, 9,12-octadecatrienoyl.
Figure imgf000029_0001
(Z,E,Z)-10-Nitro-6,8,12-octadecatrienoyl (E,Z,Z)-6-Nitro-7, 9,12-octadecatrienoyl, (E,Z,Z)-7-Nitro-5, 9,12-octadecatrienoyl, (Z,E,Z)-9-Nitro-6,10,12-octadecatrienoyl, (Z,E,Z)-10-Nitro-6,8,12-octadecatrienoyl, (Z,Z,E)-12-Nitro-6,9,13-octadecatrienoyl, (Z,Z,E)-13-Nitro-6,9,1 1 -octadecatrienoyl. Mischungen von (E,Z,Z)-6-Nitro-7, 9,12-octadecatrienoyl, (E,Z,Z)-7-Nitro-5,9,12- octadecatrienoyl, (Z,E,Z)-9-Nitro-6,10,12-octadecatrienoyl, (Z,E,Z)-10-Nitro-6,8,12- octadecatrienoyl, (Z,Z,E)-12-Nitro-6,9,13-octadecatrienoyl, (Z,Z,E)-13-Nitro-6,9,1 1 - octadecatrienoyl,
Figure imgf000029_0002
(Z,Z)-9-Hydroxy-10-Nitro-6,12-octadecadienoyl
(Z,Z)-6-Hydroxy-7-Nitro-9,12-octadecadienoyl, (Z,Z)-7-Hydroxy-6-Nitro-9,12- octadecadienoyl, (Z,Z)-9-Hydroxy-10-Nitro-6,12-octadecadienoyl, (Z,Z)-10-Hydroxy- 9-Nitro-6,12-octadecadienoyl, (Z,Z)-12-Hydroxy-13-Nitro-6,9-octadecadienoyl, (Z,Z)- 13-Hydroxy-12-Nitro-6,9-octadecadienoyl.
Mischungen von (Z,Z)-6-Hydroxy-7-Nitro-9,12-octadecadienoyl, (Z,Z)-7-Hydroxy-6- Nitro-9,12-octadecadienoyl, (Z,Z)-9-Hydroxy-10-Nitro-6,12-octadecadienoyl, (Z,Z)-10- Hydroxy-9-Nitro-6,12-octadecadienoyl, (Z,Z)-12-Hydroxy-13-Nitro-6,9- octadecadienoyl, (Z,Z)-13-Hydroxy-12-Nitro-6,9-octadecadienoyl,
Figure imgf000029_0003
(Z)-6,9-Dihydroxy-7,10-dinitro-12-octadecenoyl, (Z)-6,10-Dihydroxy-7,9-dinitro-12- octadecenoyl, (Z)-7,9-Dihydroxy-6,10-dinitro-12-octadecenoyl, (Z)-7,10-Dihydroxy- 6, 9-dinitro-12-octadecenoyl, (Z)-6,12-Dihydroxy-7,13-dinitro-9-octadecenoyl, (Z)- 6,13-Dihydroxy-7,12-dinitro-9-octadecenoyl, (Z)-7,12-Dihydroxy-6,13-dinitro-9- octadecenoyl, (Z)-7,13-Dihydroxy-6,12-dinitro-9-octadecenoyl, (Z)-9,12-Dihydroxy- 10,13-dinitro-6-octadecenoyl, (Z)-9,13-Dihydroxy- 10,12-dinitro-6-octadecenoyl, (Z)- 10,12-Dihydroxy-9,13-dinitro-6-octadecenoyl, (Z)-10,13-Dihydroxy-9,12-dinitro-6- octadecenoyl.
Mischungen von (Z)-6,9-Dihydroxy-7,10-dinitro-12-octadecenoyl, (Z)-6,10-Dihydroxy-
7.9- dinitro-12-octadecenoyl, (Z)-7,9-Dihydroxy-6,10-dinitro-12-octadecenoyl, (Z)-
7.10- Dihydroxy-6,9-dinitro-12-octadecenoyl, (Z)-6,12-Dihydroxy-7,13-dinitro-9- octadecenoyl, (Z)-6,13-Dihydroxy-7,12-dinitro-9-octadecenoyl, (Z)-7,12-Dihydroxy- 6,13-dinitro-9-octadecenoyl, (Z)-7,13-Dihydroxy-6,12-dinitro-9-octadecenoyl, (Z)- 9,12-Dihydroxy- 10,13-dinitro-6-octadecenoyl, (Z)-9,13-Dihydroxy- 10,12-dinitro-6- octadecenoyl, (Z)-10,12-Dihydroxy-9,13-dinitro-6-octadecenoyl, (Z)-10,13-Dihydroxy- 9,12-dinitro-6-octadecenoyl,
6,9,12-Trihydroxy-7,10,13-trinitrooctadecanoyl, 6,9,13-Trihydroxy-7,10,12- trinitrooctadecanoyl, 6, 10,12-Trihydroxy-7,9,13-trinitrooctadecanoyl, 6,10,13- Trihydroxy-7,9,12-trinitrooctadecanoyl, 7,9,12-Trihydroxy-6,10,13- trinitrooctadecanoyl, 7,9,13-Trihydroxy-6,10,12-trinitrooctadecanoyl, 7,10,12- Trihydroxy-6,9,13-trinitrooctadecanoyl, 7,10,13-Trihydroxy-6,9,12- trinitrooctadecanoyl.
Mischungen von 6,9,12-Trihydroxy-7,10,13-trinitrooctadecanoyl, 6,9,13-Trihydroxy- 7,10,12-trinitrooctadecanoyl, 6,10,12-Trihydroxy-7, 9,13-trinitrooctadecanoyl, 6,10,13- Trihydroxy-7,9,12-trinitrooctadecanoyl, 7,9,12-Trihydroxy-6,10,13- trinitrooctadecanoyl, 7,9,13-Trihydroxy-6,10,12-trinitrooctadecanoyl, 7,10,12- Trihydroxy-6,9,13-trinitrooctadecanoyl, 7,10,13-Trihydroxy-6,9,12- trinitrooctadecanoyl,
Mischungen von (Z,Z)-6-Hydroxy-7-Nitro-9,12-octadecadienoyl, (Z,Z)-7-Hydroxy-6- Nitro-9,12-octadecadienoyl, (Z,Z)-9-Hydroxy-10-Nitro-6,12-octadecadienoyl, (Z,Z)-10- Hydroxy-9-Nitro-6,12-octadecadienoyl, (Z,Z)-12-Hydroxy-13-Nitro-6,9- octadecadienoyl, (Z,Z)-13-Hydroxy-12-Nitro-6,9-octadecadienoyl, (Z)-6,9-Dihydroxy- 7,10-dinitro-12-octadecenoyl, (Z)-6,10-Dihydroxy-7,9-dinitro-12-octadecenoyl, (Z)- 7,9-Dihydroxy-6,10-dinitro-12-octadecenoyl, (Z)-7,10-Dihydroxy-6,9-dinitro-12- octadecenoyl, (Z)-6,12-Dihydroxy-7,13-dinitro-9-octadecenoyl, (Z)-6,13-Dihydroxy-
7.12- dinitro-9-octadecenoyl, (Z)-7,12-Dihydroxy-6,13-dinitro-9-octadecenoyl, (Z)- 7,13-Dihydroxy-6,12-dinitro-9-octadecenoyl, (Z)-9,12-Dihydroxy- 10,13-dinitro-6- octadecenoyl, (Z)-9,13-Dihydroxy- 10,12-dinitro-6-octadecenoyl, (Z)-10,12-Dihydroxy-
9.13- dinitro-6-octadecenoyl, (Z)-10,13-Dihydroxy-9,12-dinitro-6-octadecenoyl, 6,9,12- Trihydroxy-7,10,13-trinitrooctadecanoyl, 6,9,13-Trihydroxy-7,10,12- trinitrooctadecanoyl, 6, 10,12-Trihydroxy-7,9,13-trinitrooctadecanoyl, 6,10,13- Trihydroxy-7,9,12-trinitrooctadecanoyl 7,9,12-Trihydroxy-6, 10,13- trinitrooctadecanoyl, 7,9,13-Trihydroxy-6,10,12-trinitrooctadecanoyl,
Trihydroxy-6,9,13-trinitrooctadecanoyl 7,10,13-Trihydroxy-6,9, 12- trin itrooctadecanoyl ,
6-Nitro-6-octadecen-9-inoyl, 7-Nitro-6-octadecen-9-inoyl.
Mischungen von 6-Nitro-6-octadecen-9-inoyl und 7-Nitro-6-octadecen-9-inoyl, 6- Nitro-7-octadecen-9-inoyl, 7-Nitro-5-octadecen-9-inoyl.
Mischungen von 6-Nitro-7-octadecen-9-inoyl und 7-Nitro-5-octadecen-9-inoyl, 6- Hydroxy-7-nitro-9-octadecinoyl, 7-Hydroxy-6-nitro-9-octadecinoyl.
Mischungen von 6-Hydroxy-7-nitro-9-octadecinoyl und 7-Hydroxy-6-nitro-9- octadecinoyl.
1 1 -Nitro-1 1 -octadecen-9-inoyl, 12-Nitro-1 1 -octadecen-9-inoyl.
Mischungen von 1 1 -Nitro-1 1 -octadecen-9-inoyl und 12-Nitro-1 1 -octadecen-9-inoyl, 1 1 -Nitro-12-octadecen-9-inoyl, 12-Nitro-10-octadecen-9-inoyl,
Mischungen von 1 1 -Nitro-12-octadecen-9-inoyl und 12-Nitro-10-octadecen-9-inoyl, 1 1 -Hydroxy-12-nitro-9-octadecinoyl, 12-Hydroxy-1 1 -nitro-9-octadecinoyl.
Mischungen von 1 1 -Hydroxy-12-nitro-9-octadecinoyl und 12-Hydroxy-1 1 -nitro-9- octadecinoyl.
10-Nitro-10-heptadecen-8-inoyl, 1 1 -Nitro-10-heptadecen-8-inoyl.
Mischungen von 10-Nitro-10-heptadecen-8-inoyl und 1 1 -Nitro-10-heptadecen-8-inoyl,
10-Nitro-1 1 -heptadecen-8-inoyl, 1 1 -Nitro-9-heptadecen-8-inoyl.
Mischungen von 10-Nitro-1 1 -heptadecen-8-inoyl und 1 1 -Nitro-9-heptadecen-8-inoyl,
10-Hydroxy-1 1 -nitro-8-heptadecinoyl, 1 1 -Hydroxy-10-nitro-8-heptadecinoyl.
Mischungen von 10-Hydroxy-1 1 -nitro-8-heptadecinoyl und 1 1 -Hydroxy-10-nitro-8- heptadecinoyl.
9-Nitro-9-octadecen-12-inoyl, 10-Nitro-9-octadecen-12-inoyl.
Mischungen von 9-Nitro-9-octadecen-12-inoyl und 10-Nitro-9-octadecen-12-inoyl, 9- Nitro-10-octadecen-12-inoyl, 10-Nitro-8-octadecen-12-inoyl.
Mischungen von 9-Nitro-10-octadecen-12-inoyl und 10-Nitro-8-octadecen-12-inoyl, 9- Hydroxy-10-nitro-12-octadecinoyl, 10-Hydroxy-9-nitro-12-octadecinoyl.
Mischungen von 9-Hydroxy-10-nitro-12-octadecinoyl und 10-Hydroxy-9-nitro-12- octadecinoyl.
(E,Z,Z)-8-Nitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (E,Z,Z)-9-Nitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl,
(Z,E,Z)-1 1 -Nitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (Z,E,Z)-12-Nitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (Z,Z,E)-14-Nitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (Z,Z,E)-15-Nitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl.
Mischungen von (E,Z,Z)-8-Nitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (E,Z,Z)-9-Nitro-8,1 1 ,14- eicosatrienoyl, (Z,E,Z)-1 1 -Nitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (Z,E,Z)-12-Nitro-8,1 1 ,14- eicosatrienoyl, (Z,Z,E)-14-Nitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl und (Z,Z,E)-15-Nitro-8,1 1 ,14- eicosatrienoyl. (E,E,Z)-8,1 1 -Dinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (E,E,Z)-8,12-Dinitro-8,1 1 ,14- eicosatrienoyl, (E,E,Z)-9,1 1 -Dinitro-8,1 1 ,14-eicosathenoyl, (E,E,Z)-9,12-Dinitro- 8,1 1 ,14-eicosathenoyl, (E,Z,E)-8,14-Dinitro-8,1 1 ,14-eicosathenoyl, (E,Z,E)-8,15- Dinitro-8,1 1 ,14-eicosathenoyl, (E,Z,E)-9,14-Dinitro-8,1 1 ,14-eicosathenoyl, (Ε,Ζ,Ε)- 9,15-Dinitro-8,1 1 ,14-eicosathenoyl, (Z,E,E)-1 1 ,14-Dinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (Z,E,E)-1 1 ,15-Dinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (Z,E,E)-12,14-Dinitro-8,1 1 ,14- eicosatrienoyl, (Z,E,E)-13,15-Dinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl.
Mischungen von (E,E,Z)-8,1 1 -Dinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (E,E,Z)-8,12-Dinitro- 8,1 1 ,14-eicosathenoyl, (E,E,Z)-9,1 1 -Dinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (E,E,Z)-9,12- Dinitro-8,1 1 ,14-eicosathenoyl, (E,Z,E)-8,14-Dinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (Ε,Ζ,Ε)- 8,15-Dinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (E,Z,E)-9,14-Dinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (E,Z,E)-9,15-Dinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (Z,E,E)-1 1 ,14-Dinitro-8,1 1 ,14- eicosatrienoyl, (Z,E,E)-1 1 ,15-Dinitro-8, 1 1 ,14-eicosathenoyl, (Z,E,E)-12,14-Dinitro- 8,1 1 ,14-eicosatrienoyl und (Z,E,E)-13,15-Dinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl.
(E,E,E)-8,1 1 ,14-Trinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (E,E,E)-8,1 1 ,15-Trinitro-8,1 1 ,14- eicosatrienoyl, (E,E,E)-8,12, 14-Trinitro-8, 1 1 ,14-eicosathenoyl, (E,E,E)-8,12,15- Trinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (E,E,E)-9,1 1 ,14-Trinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl,
(E,E,E)-9,1 1 ,15-Trinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (E,E,E)-9,12,14-Trinitro-8,1 1 ,14- eicosatrienoyl, (E,E,E)-9,12,15-Trinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl.
Mischungen von (E,E,E)-8,1 1 ,14-Trinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (E,E,E)-8,1 1 ,15- Trinitro-8, 1 1 ,14-eicosathenoyl, (E,E,E)-8,12,14-Trinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl,
(E,E,E)-8,12,15-Trinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (E,E,E)-9,1 1 ,14-Trinitro-8,1 1 ,14- eicosatrienoyl, (E,E,E)-9,1 1 ,15-Trinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (E,E,E)-9,12,14- Trinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl und (E,E,E)-9,12,15-Trinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl. Mischungen von (E,Z,Z)-8-Nitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (E,Z,Z)-9-Nitro-8,1 1 ,14- eicosatrienoyl, (Z,E,Z)-1 1 -Nitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (Z,E,Z)-12-Nitro-8,1 1 ,14- eicosatrienoyl, (Z,Z,E)-14-Nitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (Z,Z,E)-15-Nitro-8,1 1 ,14- eicosatrienoyl, (E,E,Z)-8,1 1 -Dinitro-8,1 1 ,14-eicosathenoyl, (E,E,Z)-8,12-Dinitro- 8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (E,E,Z)-9,1 1 -Dinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (E,E,Z)-9,12- Dinitro-8,1 1 ,14-eicosathenoyl, (E,Z,E)-8,14-Dinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (Ε,Ζ,Ε)- 8,15-Dinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (E,Z,E)-9,14-Dinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (E,Z,E)-9,15-Dinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (Z,E,E)-1 1 ,14-Dinitro-8,1 1 ,14- eicosatrienoyl, (Z,E,E)-1 1 ,15-Dinitro-8, 1 1 ,14-eicosathenoyl, (Z,E,E)-12,14-Dinitro- 8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (Z,E,E)-13,15-Dinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (E,E,E)-8,1 1 ,14- Trinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (E,E,E)-8,1 1 ,15-Trinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl,
(E,E,E)-8,12, 14-Trinitro-8, 1 1 ,14-eicosathenoyl, (E,E,E)-8,12,15-Trinitro-8,1 1 ,14- eicosatrienoyl, (E,E,E)-9,1 1 ,14-Trinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (E,E,E)-9,1 1 ,15- Trinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (E,E,E)-9,12,14-Trinitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl und (E,E,E)-9,12,15-Trinitro-8,1 1 ,14-eicosathenoyl. (Z,Z)-8-Hydroxy-9-Nitro-1 1 ,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-9-Hydroxy-8-Nitro-1 1 ,14- eicosadienoyl, (Z,Z)-1 1 -Hydroxy-12-Nitro-8,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-12-Hydroxy-1 1 - Nitro-8,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-14-Hydroxy-15-Nitro-8,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-15- Hydroxy-14-Nitro-8,1 1 -eicosadienoyl.
Mischungen von (Z,Z)-8-Hydroxy-9-Nitro-1 1 ,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-9-Hydroxy-8- Nitro-1 1 ,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-1 1 -Hydroxy-12-Nitro-8,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-12- Hydroxy-1 1 -Nitro-8,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-14-Hydroxy-15-Nitro-8,1 1 -eicosadienoyl und (Z,Z)-15-Hydroxy-14-Nitro-8,1 1 -eicosadienoyl.
(Z)-8,1 1 -Dihydroxy-9,12-dinitro-14-eicosenoyl, (Z)-8,12-Dihydroxy-9,1 1 -dinitro-14- eicosenoyl, (Z)-9,1 1 -Dihydroxy-8,12-dinitro-14-eicosenoyl, (Z)-9,12-Dihydroxy-8,1 1 - dinitro-14-eicosenoyl, (Z)-8,14-Dihydroxy-9,15-dinitro-1 1 -eicosenoyl, (Z)-8,15- Dihydroxy-9,14-dinitro-1 1 -eicosenoyl, (Z)-9,14-Dihydroxy-8,15-dinitro-1 1 -eicosenoyl, (Z)-9,15-Dihydroxy-8,14-dinitro-1 1 -eicosenoyl, (Z)-1 1 ,14-Dihydroxy-12,15-dinitro-8- eicosenoyl, (Z)-1 1 ,15-Dihydroxy-12,14-dinitro-8-eicosenoyl, (Z)-12,14-Dihydroxy- 1 1 ,15-dinitro-8-eicosenoyl, (Z)-12,15-Dihydroxy-1 1 ,14-dinitro-8-eicosenoyl.
Mischungen von (Z)-8,1 1 -Dihydroxy-9,12-dinitro-14-eicosenoyl, (Z)-8,12-Dihydroxy- 9,1 1 -dinitro-14-eicosenoyl, (Z)-9,1 1 -Dihydroxy-8,12-dinitro-14-eicosenoyl, (Z)-9,12- Dihydroxy-8,1 1 -dinitro-14-eicosenoyl, (Z)-8,14-Dihydroxy-9,15-dinitro-1 1 -eicosenoyl, (Z)-8,15-Dihydroxy-9,14-dinitro-1 1 -eicosenoyl, (Z)-9,14-Dihydroxy-8,15-dinitro-1 1 - eicosenoyl, (Z)-9,15-Dihydroxy-8,14-dinitro-1 1 -eicosenoyl, (Z)-1 1 ,14-Dihydroxy- 12,15-dinitro-8-eicosenoyl, (Z)-1 1 ,15-Dihydroxy-12,14-dinitro-8-eicosenoyl, (Z)- 12,14-Dihydroxy-1 1 ,15-dinitro-8-eicosenoyl und (Z)-12,15-Dihydroxy-1 1 ,14-dinitro-8- eicosenoyl.
8,1 1 ,14-Trihydroxy-9, 12,15-trinitroeicosanoyl, 8,1 1 ,15-Trihydroxy-9,12,14- trinitroeicosanoyl, 8,12,14-Trihydroxy-9,1 1 ,15-trinitroeicosanoyl, 8,12,15-Trihydroxy-
9.1 1 .14- trinitroeicosanoyl, 9,1 1 ,14-Trihydroxy-8,12,15-trinitroeicosanoyl, 9,1 1 ,15- Trihydroxy-8,12,14-trinitroeicosanoyl, 9,12,14-Trihydroxy-8,1 1 ,15-trinitroeicosanoyl,
9.12.15- Trihydroxy-8, 1 1 , 14-trinitroeicosanoyl .
Mischungen von 8,1 1 ,14-Trihydroxy-9,12,15-trinitroeicosanoyl, 8,1 1 ,15-Trihydroxy- 9,12,14-trinitroeicosanoyl, 8,12,14-Trihydroxy-9,1 1 ,15-trinitroeicosanoyl, 8,12,15- Trihydroxy-9,1 1 ,14-trinitroeicosanoyl, 9,1 1 ,14-Trihydroxy-8,12,15-trinitroeicosanoyl, 9,1 1 ,15-Trihydroxy-8, 12,14-trinitroeicosanoyl, 9,12,14-Trihydroxy-8,1 1 ,15- trinitroeicosanoyl und 9,12,15-Trihydroxy-8,1 1 ,14-trinitroeicosanoyl.
Mischungen von (Z,Z)-8-Hydroxy-9-Nitro-1 1 ,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-9-Hydroxy-8- Nitro-1 1 ,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-1 1 -Hydroxy-12-Nitro-8,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-12- Hydroxy-1 1 -Nitro-8,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-14-Hydroxy-15-Nitro-8,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-15-Hydroxy-14-Nitro-8,1 1 -eicosadienoyl, (Z)-8,1 1 -Dihydroxy-9,12-dinitro-14- eicosenoyl, (Z)-8,12-Dihydroxy-9,1 1 -dinitro-14-eicosenoyl, (Z)-9,1 1 -Dihydroxy-8,12- dinitro-14-eicosenoyl, (Z)-9,12-Dihydroxy-8,1 1 -dinitro-14-eicosenoyl, (Z)-8,14- Dihydroxy-9,15-dinitro-1 1 -eicosenoyl, (Z)-8,15-Dihydroxy-9,14-dinitro-1 1 -eicosenoyl, (Z)-9,14-Dihydroxy-8,15-dinitro-1 1 -eicosenoyl, (Z)-9,15-Dihydroxy-8,14-dinitro-1 1 - eicosenoyl, (Z)-1 1 ,14-Dihydroxy-12,15-dinitro-8-eicosenoyl, (Z)-1 1 ,15-Dihydroxy- 12,14-dinitro-8-eicosenoyl, (Z)-12,14-Dihydroxy-1 1 ,15-dinitro-8-eicosenoyl, (Z)- 12,15-Dihydroxy-1 1 ,14-dinitro-8-eicosenoyl, 8,1 1 ,14-Trihydroxy-9,12,15- trinitroeicosanoyl, 8,1 1 ,15-Trihydroxy-9,12,14-trinitroeicosanoyl, 8,12,14-Trihydroxy- 9,1 1 ,15-trinitroeicosanoyl, 8,12,15-Trihydroxy-9,1 1 ,14-trinitroeicosanoyl, 9,1 1 ,14- Trihydroxy-8,12,15-trinitroeicosanoyl, 9,1 1 ,15-Trihydroxy-8,12,14-trinitroeicosanoyl, 9,12, 14-Trihydroxy-8,1 1 ,15-trinitroeicosanoyl und 9,12,15-Trihydroxy-8,1 1 ,14- trinitroeicosanoyl.
(E,Z,Z)-5-Nitro-5, 8, 1 1 -eicosatnenoyl, (E,Z,Z)-6-Nitro-5, 8, 1 1 -eicosatnenoyl, (Z,E,Z)-8- Nitro-5, 8, 1 1 -eicosatnenoyl, (Z,E,Z)-9-Nitro-5,8,1 1 -eicosatrienoyl, (Z,Z,E)-1 l -Nitro- 5,8,1 1 -eicosatrienoyl, (Z,Z,E)-12-Nitro-5,8,1 1 -eicosatrienoyl.
Mischungen von (E,Z,Z)-5-Nitro-5,8,1 1 -eicosatrienoyl, (E,Z,Z)-6-Nitro-5,8,1 1 - eicosatrienoyl, (Z,E,Z)-8-Nitro-5, 8,1 1 -eicosatrienoyl, (Z,E,Z)-9-Nitro-5,8,1 1 - eicosatrienoyl, (Z,Z,E)-1 1 -Nitro-5, 8,1 1 -eicosatrienoyl und (Z,Z,E)-12-Nitro-5,8,1 1 - eicosatrienoyl.
(E,E,Z)-5,8-Dinitro-5, 8,1 1 -eicosatrienoyl, (E,E,Z)-5,9-Dinitro-5, 8,1 1 -eicosatrienoyl, (E,E,Z)-6,8-Dinitro-5, 8,1 1 -eicosatrienoyl, (E,E,Z)-6,9-Dinitro-5, 8,1 1 -eicosatrienoyl, (E,Z,E)-5,1 1 -Dinitro-5,8,1 1 -eicosatrienoyl, (E,Z,E)-5,12-Dinitro-5,8,1 1 -eicosatrienoyl, (E,Z,E)-6,1 1 -Dinitro-5,8,1 1 -eicosatrienoyl, (E,Z,E)-6,12-Dinitro-5,8,1 1 -eicosatrienoyl, (Z,E,E)-8,1 1 -Dinitro-5,8,1 1 -eicosatrienoyl, (Z,E,E)-8,12-Dinitro-5,8,1 1 -eicosatrienoyl, (Z,E,E)-9,1 1 -Dinitro-5,8,1 1 -eicosatrienoyl, (Z,E,E)-9,12-Dinitro-5,8,1 1 -eicosatrienoyl. Mischungen von (E,E,Z)-5,8-Dinitro-5, 8,1 1 -eicosatrienoyl, (E,E,Z)-5,9-Dinitro-5,8,1 1 - eicosatrienoyl, (E,E,Z)-6,8-Dinitro-5, 8,1 1 -eicosatrienoyl, (E,E,Z)-6,9-Dinitro-5,8,1 1 - eicosatrienoyl, (E,Z,E)-5,1 1 -Dinitro-5,8,1 1 -eicosatrienoyl, (E,Z,E)-5,12-Dinitro-5,8,1 1 - eicosatrienoyl, (E,Z,E)-6,1 1 -Dinitro-5,8,1 1 -eicosatrienoyl, (E,Z,E)-6,12-Dinitro-5,8,1 1 - eicosatrienoyl, (Z,E,E)-8,1 1 -Dinitro-5,8,1 1 -eicosatrienoyl, (Z,E,E)-8,12-Dinitro-5,8,1 1 - eicosatrienoyl, (Z,E,E)-9,1 1 -Dinitro-5,8,1 1 -eicosatrienoyl und (Z,E,E)-9,12-Dinitro- 5,8,1 1 -eicosatrienoyl.
(E,E,E)-5,8,1 1 -Trinitro-5,8,1 1 -eicosatrienoyl, (E,E,E)-5,8,12-Trinitro-5,8,1 1 - eicosatrienoyl, (E,E,E)-5,9,1 1 -Trinitro-5,8,1 1 -eicosatrienoyl, (E,E,E)-5,9,12-Trinitro- 5,8,1 1 -eicosatrienoyl, (E, E,E)-6, 8, 1 1 -Trinitro-5,8,1 1 -eicosatrienoyl, (E,E,E)-6,8,12- Trinitro-5, 8,1 1 -eicosatrienoyl, (E, E,E)-6, 9,1 1 -Trinitro-5,8,1 1 -eicosatrienoyl, (Ε,Ε,Ε)- 6,9,12-Trinitro-5, 8,1 1 -eicosatrienoyl.
Mischungen von (E, E,E)-5, 8, 1 1 -Trinitro-5,8,1 1 -eicosatrienoyl, (E,E,E)-5,8,12-Trinitro- 5,8,1 1 -eicosatrienoyl, (E, E,E)-5, 9,1 1 -Trinitro-5,8,1 1 -eicosatrienoyl, (E,E,E)-5,9,12- Trinitro-5, 8,1 1 -eicosatrienoyl, (E, E,E)-6, 8, 1 1 -Trinitro-5,8,1 1 -eicosatrienoyl, (Ε,Ε,Ε)- 6,8,12-Trinitro-5,8,1 1 -eicosatrienoyl und (E,E,E)-6,9,1 1 -Thnitro-5,8,1 1 -eicosatrienoyl, (E,E,E)-6,9,12-Thnitro-5,8,1 1 -eicosatrienoyl.
Mischungen von (E,Z,Z)-5-Nitro-5,8,1 1 -eicosathenoyl, (E,Z,Z)-6-Nitro-5,8,1 1 - eicosathenoyl, (Z,E,Z)-8-Nitro-5,8,1 1 -eicosathenoyl, (Z,E,Z)-9-Nitro-5,8,1 1 - eicosathenoyl, (Z,Z,E)-1 1 -Nitro-5, 8,1 1 -eicosatrienoyl, (Z,Z,E)-12-Nitro-5,8,1 1 - eicosatrienoyl, (E,E,Z)-5,8-Dinitro-5,8,1 1 -eicosathenoyl, (E,E,Z)-5,9-Dinitro-5,8,1 1 - eicosathenoyl, (E,E,Z)-6,8-Dinitro-5,8,1 1 -eicosathenoyl, (E,E,Z)-6,9-Dinitro-5,8,1 1 - eicosathenoyl, (E,Z,E)-5,1 1 -Dinitro-5,8,1 1 -eicosathenoyl, (E,Z,E)-5,12-Dinitro-5,8,1 1 - eicosathenoyl, (E,Z,E)-6,1 1 -Dinitro-5,8,1 1 -eicosathenoyl, (E,Z,E)-6,12-Dinitro-5,8,1 1 - eicosathenoyl, (Z,E,E)-8,1 1 -Dinitro-5,8,1 1 -eicosatrienoyl, (Z,E,E)-8,12-Dinitro-5,8,1 1 - eicosatrienoyl, (Z,E,E)-9,1 1 -Dinitro-5,8,1 1 -eicosathenoyl, (Z,E,E)-13,12-Dinitro-
5.8.1 1 - eicosatrienoyl, (E, E,E)-5, 8, 1 1 -Trinitro-5, 8,1 1 -eicosatrienoyl, (E,E,E)-5,8,12- Trinitro-5, 8,1 1 -eicosatrienoyl, (E, E,E)-5, 9,1 1 -Trinitro-5, 8,1 1 -eicosatrienoyl, (Ε,Ε,Ε)-
5.9.12- Trinitro-5, 8,1 1 -eicosatrienoyl, (E, E,E)-6, 8, 1 1 -Trinitro-5, 8,1 1 -eicosatrienoyl, (E,E,E)-6,8,12-Trinitro-5,8,1 1 -eicosatrienoyl und (E,E,E)-6,9,1 1 -Trinitro-5,8,1 1 - eicosatrienoyl, (E,E,E)-6,9,12-Trinitro-5,8,1 1 -eicosathenoyl.
(Z,Z)-5-Hydroxy-6-Nitro-8,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-6-Hydroxy-5-Nitro-8,1 1 - eicosadienoyl, (Z,Z)-8-Hydroxy-9-Nitro-5,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-9-Hydroxy-8-Nitro- 5,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-1 1 -Hydroxy-12-Nitro-5,8-eicosadienoyl, (Z,Z)-12-Hydroxy- 1 1 -Nitro-5, 8-eicosadienoyl.
Mischungen von (Z,Z)-5-Hydroxy-6-Nitro-8,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-6-Hydroxy-5- Nitro-8,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-8-Hydroxy-9-Nitro-5,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-9- Hydroxy-8-Nitro-5,1 1 -eicosadienoyl und (Z,Z)-1 1 -Hydroxy-12-Nitro-5,8-eicosadienoyl, (Z,Z)-12-Hydroxy-1 1 -Nitro-5, 8-eicosadienoyl.
(Z)-5,8-Dihydroxy-6,9-dinitro-1 1 -eicosenoyl, (Z)-5,9-Dihydroxy-6,8-dinitro-1 1 - eicosenoyl, (Z)-6,8-Dihydroxy-5,9-dinitro-1 1 -eicosenoyl, (Z)-6,9-Dihydroxy-5,8-dinitro- 1 1 -eicosenoyl, (Z)-5,1 1 -Dihydroxy-6,12-dinitro-8-eicosenoyl, (Z)-5,12-Dihydroxy- 6,1 1 -dinitro-8-eicosenoyl, (Z)-6,1 1 -Dihydroxy-5,12-dinitro-8-eicosenoyl, (Z)-6,12- Dihydroxy-5,1 1 -dinitro-8-eicosenoyl, (Z)-8,1 1 -Dihydroxy-9,12-dinitro-5-eicosenoyl, (Z)-8,12-Dihydroxy-9,1 1 -dinitro-5-eicosenoyl, (Z)-9,1 1 -Dihydroxy-8,12-dinitro-5- eicosenoyl, (Z)-9,12-Dihydroxy-8,1 1 -dinitro-5-eicosenoyl.
Mischungen von (Z)-5,8-Dihydroxy-6,9-dinitro-1 1 -eicosenoyl, (Z)-5,9-Dihydroxy-6,8- dinitro-1 1 -eicosenoyl, (Z)-6,8-Dihydroxy-5,9-dinitro-1 1 -eicosenoyl, (Z)-6,9-Dihydroxy- 5, 8-dinitro-1 1 -eicosenoyl, (Z)-5,1 1 -Dihydroxy-6,12-dinitro-8-eicosenoyl, (Z)-5,12- Dihydroxy-6,1 1 -dinitro-8-eicosenoyl, (Z)-6,1 1 -Dihydroxy-5,12-dinitro-8-eicosenoyl, (Z)-6,12-Dihydroxy-5,1 1 -dinitro-8-eicosenoyl, (Z)-8,1 1 -Dihydroxy-9,12-dinitro-5- eicosenoyl, (Z)-8,12-Dihydroxy-9,1 1 -dinitro-5-eicosenoyl, (Z)-9,1 1 -Dihydroxy-8,12- dinitro-5-eicosenoyl und (Z)-9,12-Dihydroxy-8,1 1 -dinitro-5-eicosenoyl. 5,8,1 1 -Trihydroxy-6,9,12-trinitroeicosanoyl, 5,8,12-Trihydroxy-6, 9,1 1 - trinitroeicosanoyl, 5,9,1 1 -Trihydroxy-6, 8,12-trinitroeicosanoyl, 5,9,12-Trihydroxy- 6,8,1 1 -trinitroeicosanoyl, 6,8,1 1 -Trihydroxy-5, 9,12-trinitroeicosanoyl, 6,8,12- Trihydroxy-5,9,1 1 -trinitroeicosanoyl, 6,9,1 1 -Trihydroxy-5,8,12-trinitroeicosanoyl, 6,9, 12-Trihydroxy-5, 8,1 1 -trinitroeicosanoyl.
Mischungen von 5,8,1 1 -Trihydroxy-6,9,12-trinitroeicosanoyl, 5,8,12-Trihydroxy-
6.9.1 1 - trinitroeicosanoyl, 5,9,1 1 -Trihydroxy-6, 8,12-trinitroeicosanoyl, 5,9,12- Trihydroxy-6,8,1 1 -trinitroeicosanoyl, 6,8,1 1 -Trihydroxy-5, 9,12-trinitroeicosanoyl,
6.8.12- Trihydroxy-5, 9,1 1 -trinitroeicosanoyl, 6,9,1 1 -Trihydroxy-5,8,12- trinitroeicosanoyl und 6,9,12-Trihydroxy-5, 8,1 1 -trinitroeicosanoyl.
Mischungen von (Z,Z)-5-Hydroxy-6-Nitro-8,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-6-Hydroxy-5- Nitro-8,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-8-Hydroxy-9-Nitro-5,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-9- Hydroxy-8-Nitro-5,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-1 1 -Hydroxy-12-Nitro-5,8-eicosadienoyl, (Z,Z)-12-Hydroxy-1 1 -Nitro-5,8-eicosadienoyl, (Z)-5,8-Dihydroxy-6,9-dinitro-1 1 - eicosenoyl, (Z)-5,9-Dihydroxy-6,8-dinitro-1 1 -eicosenoyl, (Z)-6,8-Dihydroxy-5,9-dinitro- 1 1 -eicosenoyl, (Z)-6,9-Dihydroxy-5,8-dinitro-1 1 -eicosenoyl, (Z)-5,1 1 -Dihydroxy-6,12- dinitro-8-eicosenoyl, (Z)-5,12-Dihydroxy-6,1 1 -dinitro-8-eicosenoyl, (Z)-6,1 1 - Dihydroxy-5,12-dinitro-8-eicosenoyl, (Z)-6,12-Dihydroxy-5,1 1 -dinitro-8-eicosenoyl, (Z)-8,1 1 -Dihydroxy-9,12-dinitro-5-eicosenoyl, (Z)-8,12-Dihydroxy-9,1 1 -dinitro-5- eicosenoyl, (Z)-9,1 1 -Dihydroxy-8,12-dinitro-5-eicosenoyl, (Z)-9,12-Dihydroxy-8,1 1 - dinitro-5-eicosenoyl, 5,8,1 1 -Trihydroxy-6,9,12-trinitroeicosanoyl, 5,8,12-Trihydroxy- 6,9,1 1 -trinitroeicosanoyl, 5,9,1 1 -Trihydroxy-6,8,12-trinitroeicosanoyl, 5,9,12- Trihydroxy-6,8,1 1 -trinitroeicosanoyl, 6,8,1 1 -Trihydroxy-5, 9,12-trinitroeicosanoyl, 6,8, 12-Trihydroxy-5, 9,1 1 -trinitroeicosanoyl, 6,9,1 1 -Trihydroxy-5,8,12- trinitroeicosanoyl und 6,9,12-Trihydroxy-5, 8,1 1 -trinitroeicosanoyl.
(E,Z,Z)-9-Nitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (E,Z,Z)-10-Nitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (Z,E,Z)-12-Nitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (Z,E,Z)-13-Nitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (Z,Z,E)-15-Nitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (Z,Z,E)-19-Nitro-9,12,15-octadecatrienoyl. Mischungen von (E,Z,Z)-9-Nitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (E,Z,Z)-10-Nitro-9,12,15- octadecatrienoyl, (Z,E,Z)-12-Nitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (Z,E,Z)-13-Nitro-9,12,15- octadecatrienoyl, (Z,Z,E)-15-Nitro-9,12,15-octadecatrienoyl und (Z,Z,E)-19-Nitro- 9,12,15-octadecatrienoyl .
(E,E,Z)-9,12-Dinitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (E,E,Z)-9,13-Dinitro-9,12,15- octadecatrienoyl, (E,E,Z)-10,12-Dinitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (E,E,Z)-10,13- Dinitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (E,Z,E)-9,15-Dinitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (E,Z,E)-9,19-Dinitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (E,Z,E)-10,15-Dinitro-9,12,15- octadecatrienoyl, (E,Z,E)-10,19-Dinitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (Z,E,E)-12,15- Dinitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (Z,E,E)-12,19-Dinitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (Z,E,E)-13,15-Dinitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (Z,E,E)-13, 19-Din itro-9, 12,15- octadecatrienoyl.
Mischungen von (E,E,Z)-9,12-Dinitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (E,E,Z)-9,13-Dinitro- 9,12,15-octadecatrienoyl, (E,E,Z)-10,12-Dinitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (Ε,Ε,Ζ)- 10,13-Dinitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (E,Z,E)-9,15-Dinitro-9,12,15- octadecatrienoyl, (E,Z,E)-9,19-Dinitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (E,Z,E)-10,15- Dinitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (E,Z,E)-10,19-Dinitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (Z,E,E)-12,15-Dinitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (Z,E,E)-12,19-Dinitro-9,12,15- octadecatrienoyl, (Z,E,E)-13,15-Dinitro-9,12,15-octadecatrienoyl und (Z,E,E)-13,19- Din itro-9, 12,15-octadecatrienoyl .
(E,E,E)-9,12,15-Trin itro-9, 12,15-octadecatrienoyl, (E,E,E)-9,12,19-Trin itro-9, 12,15- octadecatrienoyl, (E,E,E)-9,13, 15-Trin itro-9, 12,15-octadecatrienoyl, (E,E,E)-9,13,19- Trinitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (E,E,E)-10,12, 15-Trin itro-9, 12,15-octadecatrienoyl, (E,E,E)-10,12,19-Trin itro-9, 12,15-octadecatrienoyl, (E,E,E)-10,13,15-Trin itro-9, 12,15- octadecatrienoyl, (E,E,E)-10,13,19-Trin itro-9, 12,15-octadecatrienoyl.
Mischungen von (E,E,E)-9,12,15-Trin itro-9, 12,15-octadecatrienoyl, (E,E,E)-9,12,19- Trinitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (E,E,E)-9,13, 15-Trin itro-9, 12,15-octadecatrienoyl, (E,E,E)-9,13,19-Trin itro-9, 12,15-octadecatrienoyl, (E,E,E)-10,12,15-Trin itro-9, 12,15- octadecatrienoyl, (E,E,E)-10,12, 19-Trin itro-9, 12,15-octadecatrienoyl, (Ε,Ε,Ε)- 10,13,15-Trin itro-9, 12,15-octadecatrienoyl und (E,E,E)-10,13,19-Trin itro-9, 12,15- octadecatrienoyl.
Mischungen von (E,Z,Z)-9-Nitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (E,Z,Z)-10-Nitro-9,12,15- octadecatrienoyl, (Z,E,Z)-12-Nitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (Z,E,Z)-13-Nitro-9,12,15- octadecatrienoyl, (Z,Z,E)-15-Nitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (Z,Z,E)-19-Nitro-9,12,15- octadecatrienoyl, (E,E,Z)-9,12-Dinitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (E,E,Z)-9,13-Dinitro- 9,12,15-octadecatrienoyl, (E,E,Z)-10,12-Dinitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (Ε,Ε,Ζ)- 10,13-Dinitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (E,Z,E)-9,15-Dinitro-9,12,15- octadecatrienoyl, (E,Z,E)-9,19-Dinitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (E,Z,E)-10,15- Dinitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (E,Z,E)-10,19-Dinitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (Z,E,E)-12,15-Dinitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (Z,E,E)-12,19-Dinitro-9,12,15- octadecatrienoyl, (Z,E,E)-13,15-Dinitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (Z,E,E)-13,19- Dinitro-9,12,15-octadecatrienoyl, (E,E,E)-9,12, 15-Trin itro-9, 12,15-octadecatrienoyl, (E,E,E)-9,12,19-Trin itro-9, 12,15-octadecatrienoyl, (E,E,E)-9,13,15-Trin itro-9, 12,15- octadecatrienoyl, (E,E,E)-9,13, 19-Trin itro-9, 12,15-octadecatrienoyl, (Ε,Ε,Ε)- 10,12,15-Trin itro-9, 12,15-octadecatrienoyl, (E,E,E)-10,12,19-Trin itro-9, 12,15- octadecatrienoyl, (E,E,E)-10,13, 15-Trin itro-9, 12,15-octadecatrienoyl und (Ε,Ε,Ε)- 10,13,19-Trin itro-9, 12,15-octadecatrienoyl .
(Z,Z)-9-Hydroxy-10-Nitro-12,15-octadecadienoyl, (Z,Z)-10-Hydroxy-9-Nitro-12,15- octadecadienoyl, (Z,Z)-12-Hydroxy-13-N itro-9, 15-octadecadienoyl, (Z,Z)-13-Hydroxy- 12-Nitro-9,15-octadecadienoyl, (Z,Z)-15-Hydroxy-19-Nitro-9,12-octadecadienoyl, (Z,Z)-19-Hydroxy-15-Nitro-9,12-octadecadienoyl.
Mischungen von (Z,Z)-9-Hydroxy-10-Nitro-12,15-octadecadienoyl, (Z,Z)-10-Hydroxy- 9-Nitro-12,15-octadecadienoyl, (Z,Z)-12-Hydroxy-13-Nitro-9,15-octadecadienoyl, (Z,Z)-13-Hydroxy-12-Nitro-9,15-octadecadienoyl, (Z,Z)-15-Hydroxy-19-Nitro-9,12- octadecadienoyl und (Z,Z)-19-Hydroxy-15-Nitro-9,12-octadecadienoyl.
(Z)-9,12-Dihydroxy-10,13-dinitro-15-octadecenoyl, (Z)-9,13-Dihydroxy-10,12-dinitro- 15-octadecenoyl, (Z)-10,12-Dihydroxy-9,13-dinitro-15-octadecenoyl, (Z)-10,13- Dihydroxy-9,12-dinitro-15-octadecenoyl, (Z)-9,15-Dihydroxy- 10,19-dinitro-12- octadecenoyl, (Z)-9,19-Dihydroxy-10,15-dinitro-12-octadecenoyl, (Z)-10,15- Dihydroxy-9,19-dinitro-12-octadecenoyl, (Z)-10,19-Dihydroxy-9,15-dinitro-12- octadecenoyl, (Z)-12,15-Dihydroxy- 13,19-dinitro-9-octadecenoyl, (Z)-12,19- Dihydroxy-13,15-dinitro-9-octadecenoyl, (Z)-13,15-Dihydroxy- 12,19-dinitro-9- octadecenoyl, (Z)-13,19-Dihydroxy-12,15-dinitro-9-octadecenoyl.
Mischungen von (Z)-9,12-Dihydroxy-10,13-dinitro-15-octadecenoyl, (Z)-9,13- Dihydroxy-10,12-dinitro-15-octadecenoyl, (Z)-10,12-Dihydroxy-9,13-dinitro-15- octadecenoyl, (Z)-10,13-Dihydroxy-9,12-dinitro-15-octadecenoyl, (Z)-9,15-Dihydroxy- 10,19-dinitro-12-octadecenoyl, (Z)-9,19-Dihydroxy-10,15-dinitro-12-octadecenoyl, (Z)-10,15-Dihydroxy-9,19-dinitro-12-octadecenoyl, (Z)-10,19-Dihydroxy-9,15-dinitro- 12-octadecenoyl, (Z)-12,15-Dihydroxy-13,19-dinitro-9-octadecenoyl, (Z)-12,19- Dihydroxy-13,15-dinitro-9-octadecenoyl, (Z)-13,15-Dihydroxy- 12,19-dinitro-9- octadecenoyl und (Z)-13,19-Dihydroxy-12,15-dinitro-9-octadecenoyl.
9,12,15-Trihydroxy-10,13,19-trinitrooctadecanoyl, 9,12,19-Trihydroxy-10,13,15- trinitrooctadecanoyl, 9,13,15-Trihydroxy-10,12,19-trinitrooctadecanoyl, 9,13,19- Trihydroxy-10,12,15-trinitrooctadecanoyl, 10,12,15-Trihydroxy-9,13,19- trinitrooctadecanoyl, 10,12,19-Trihydroxy-9,13,15-trinitrooctadecanoyl, 10,13,15- Trihydroxy-9,12,19-trinitrooctadecanoyl, 10,13,19-Trihydroxy-9,12,15- trinitrooctadecanoyl.
Mischungen von 9,12,15-Trihydroxy-10,13,19-trinitrooctadecanoyl, 9,12,19- Trihydroxy-10,13,15-trinitrooctadecanoyl, 9,13,15-Trihydroxy-10,12,19- trinitrooctadecanoyl, 9,13,19-Trihydroxy-10,12,15-trinitrooctadecanoyl, 10,12,15- Trihydroxy-9,13,19-trinitrooctadecanoyl, 10,12,19-Trihydroxy-9,13,15- trinitrooctadecanoyl, 10,13,15-Trihydroxy-9,12,19-trinitrooctadecanoyl und 10,13,19- Trihydroxy-9,12,15-trinitrooctadecanoyl.
Mischungen von (Z,Z)-9-Hydroxy-10-Nitro-12,15-octadecadienoyl, (Z,Z)-10-Hydroxy- 9-Nitro-12,15-octadecadienoyl, (Z,Z)-12-Hydroxy-13-Nitro-9,15-octadecadienoyl, (Z,Z)-13-Hydroxy-12-Nitro-9,15-octadecadienoyl, (Z,Z)-15-Hydroxy-19-Nitro-9,12- octadecadienoyl, (Z,Z)-19-Hydroxy-15-Nitro-9,12-octadecadienoyl, (Z)-9,12- Dihydroxy-10,13-dinitro-15-octadecenoyl, (Z)-9,13-Dihydroxy-10,12-dinitro-15- octadecenoyl, (Z)-10,12-Dihydroxy-9,13-dinitro-15-octadecenoyl, (Z)-10,13- Dihydroxy-9,12-dinitro-15-octadecenoyl, (Z)-9,15-Dihydroxy-10,19-dinitro-12- octadecenoyl, (Z)-9,19-Dihydroxy-10,15-dinitro-12-octadecenoyl, (Z)-10,15- Dihydroxy-9,19-dinitro-12-octadecenoyl, (Z)-10,19-Dihydroxy-9,15-dinitro-12- octadecenoyl, (Z)-12,15-Dihydroxy-13,19-dinitro-9-octadecenoyl, (Z)-12,19- Dihydroxy-13,15-dinitro-9-octadecenoyl, (Z)-13,15-Dihydroxy-12,19-dinitro-9- octadecenoyl, (Z)-13,19-Dihydroxy-12,15-dinitro-9-octadecenoyl, 9,12,15-Trihydroxy- 10,13,19-trinitrooctadecanoyl, 9,12,19-Thhydroxy-10,13,15-trinitrooctadecanoyl, 9,13,15-Thhydroxy-10,12,19-thnitrooctadecanoyl, 9,13,19-Trihydroxy-10,12,15- trinitrooctadecanoyl, 10,12,15-Thhydroxy-9,13,19-trinitrooctadecanoyl, 10,12,19- Trihydroxy-9,13,15-trinitrooctadecanoyl, 10,13,15-Trihydroxy-9,12,19- trinitrooctadecanoyl und 10,13,19-Trihydroxy-9,12,15-trinitrooctadecanoyl.
(E,Z,Z,Z)-5-Nitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,Z,Z,Z)-6-Nitro-5,8,1 1 ,14- eicosatetraenoyl , (Z,E,Z,Z)-8-Nitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Z,E,Z,Z)-9-Nitro- 5, 8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Z,Z,E,Z)-1 1 -Nitro-5, 8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Ζ,Ζ,Ε,Ζ)- 12-Nitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl.(Z,Z,Z,E)-14-Nitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Ζ,Ζ,Ζ, E)-15-N itro-5,8, 1 1 , 14-eicosatetraenoyl .
Mischungen von (E,Z,Z,Z)-5-Nitro-5, 8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,Z,Z,Z)-6-Nitro- 5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Z,E,Z,Z)-8-Nitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Z,E,Z,Z)-9- Nitro-5, 8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Z,Z,E,Z)-1 1 -Nitro-5, 8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Z,Z,E,Z)-12-Nitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl. (Z,Z,Z,E)-14-Nitro-5,8,1 1 ,14- eicosatetraenoyl, (Z,Z,Z,E)-15-Nitro-5, 8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl.
(E,E,Z,Z)-5,8-Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,E,Z,Z)-5,9-Dinitro-5,8,1 1 ,14- eicosatetraenoyl, (E,E,Z,Z)-6,8-Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,E,Z,Z)-6,9- Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,Z,E,Z)-5,1 1 -Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,Z,E,Z)-5,12-Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,Z,E,Z)-6,1 1 -Dinitro-5,8,1 1 ,14- eicosatetraenoyl, (E,Z,E,Z)-6,12-Dinitro-5, 8, 1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,Z,Z,E)-5,14- Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,Z,Z,E)-5,15-Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,Z,Z,E)-6,14-Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,Z,Z,E)-6,15-Dinitro-5,8,1 1 ,14- eicosatetraenoyl, (Z,E,E,Z)-8,1 1 -Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Z,E,E,Z)-8,12- Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Z,E,E,Z)-9,1 1 -Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Z,E,E,Z)-9,12-Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl.(Z,E,Z,E)-8,14-Dinitro-5,8,1 1 ,14- eicosatetraenoyl, (Z,E,Z,E)-8,15-Dinitro-5, 8, 1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Z,E,Z,E)-9,14- Dinitro-5,8, 1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Z,E,Z,E)-9,15-Dinitro-5,8,1 1 ,14- eicosatetraenoyl. (Z,Z,E,E)-1 1 ,14-Dinitro-5, 8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Z,Z,E,E)-1 1 ,15- Dinitro-5,8, 1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Ζ,Ζ,Ε, E)-12,14-Dinitro-5,8,1 1 ,14- eicosatetraenoyl, (Ζ,Ζ,Ε, E)-12, 15-Dinitro-5, 8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl.
Mischungen von (E,E,Z,Z)-5,8-Dinitro-5, 8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,E,Z,Z)-5,9- Dinitro-5, 8, 1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,E,Z,Z)-6,8-Dinitro-5, 8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,E,Z,Z)-6,9-Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,Z,E,Z)-5,1 1 -Dinitro-5,8,1 1 ,14- eicosatetraenoyl, (E,Z,E,Z)-5,12-Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,Z,E,Z)-6,1 1 - Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,Z,E,Z)-6,12-Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,Z,Z,E)-5,14-Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,Z,Z,E)-5,15-Dinitro-5,8,1 1 ,14- eicosatetraenoyl, (E,Z,Z,E)-6,14-Dinitro-5, 8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,Z,Z,E)-6,15- Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Z,E,E,Z)-8,1 1 -Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Z,E,E,Z)-8,12-Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Z,E,E,Z)-9,1 1 -Dinitro-5,8,1 1 ,14- eicosatetraenoyl, (Z,E,E,Z)-9,12-Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl. (Z,E,Z,E)-8, 14- Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Z,E,Z,E)-8,15-Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Z,E,Z,E)-9,14-Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Z,E,Z,E)-9,15-Dinitro-5,8,1 1 ,14- eicosatetraenoyl.(Z,Z,E,E)-1 1 ,14-Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Z,Z,E,E)-1 1 ,15- Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Ζ,Ζ,Ε, E)-12,14-Dinitro-5,8,1 1 ,14- eicosatetraenoyl und (Z,Z,E,E)-12,15-Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl.
Mischungen von (E,Z,Z,Z)-5-Nitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,Z,Z,Z)-6-Nitro- 5, 8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Z,E,Z,Z)-8-Nitro-5, 8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Z,E,Z,Z)-9- Nitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Z,Z,E,Z)-1 1 -Nitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Z,Z,E,Z)-12-Nitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl.(Z,Z,Z,E)-14-Nitro-5,8,1 1 ,14- eicosatetraenoyl, (Z,Z,Z,E)-15-Nitro-5, 8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,E,Z,Z)-5,8-Dinitro- 5, 8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,E,Z,Z)-5,9-Dinitro-5, 8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,E,Z,Z)-6,8-Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,E,Z,Z)-6,9-Dinitro-5,8,1 1 ,14- eicosatetraenoyl, (E,Z,E,Z)-5,1 1 -Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,Z,E,Z)-5,12- Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,Z,E,Z)-6,1 1 -Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,Z,E,Z)-6,12-Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,Z,Z,E)-5,14-Dinitro-5,8,1 1 ,14- eicosatetraenoyl, (E,Z,Z,E)-5,15-Dinitro-5, 8, 1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,Z,Z,E)-6,14- Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (E,Z,Z,E)-6,15-Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Z,E,E,Z)-8,1 1 -Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Z,E,E,Z)-8,12-Dinitro-5,8,1 1 ,14- eicosatetraenoyl, (Z,E,E,Z)-9,1 1 -Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Z,E,E,Z)-9,12- Dinitro-5, 8, 1 1 ,14-eicosatetraenoyl. (Z,E,Z,E)-8,14-Dinitro-5, 8, 1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Z,E,Z,E)-8,15-Dinitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Z,E,Z,E)-9,14-Dinitro-5,8,1 1 ,14- eicosatetraenoyl, (Ζ,Ε,Ζ, E)-9,15-Dinitro-5, 8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl. (Z,Z,E,E)-1 1 ,14- Dinitro-5,8, 1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Z,Z,E,E)-1 1 ,15-Dinitro-5,8,1 1 ,14- eicosatetraenoyl, (Z,Z,E,E)-12, 14-Dinitro-5, 8, 1 1 ,14-eicosatetraenoyl und (Ζ,Ζ,Ε,Ε)- 12,15-Din itro-5,8, 1 1 , 14-eicosatetraenoyl .
(Z,Z,Z)-5-Hydroxy-6-Nitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (Z,Z,Z)-6-Hydroxy-5-Nitro-8,1 1 ,14- eicosadienoyl, (Z,Z,Z)-8-Hydroxy-9-Nitro-5,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (Z,Z,Z)-9-Hydroxy-8- Nitro-5,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (Z,Z,Z)-1 1 -Hydroxy-12-Nitro-5,8,14-eicosatrienoyl, (Z,Z,Z)-12-Hydroxy-1 1 -Nitro-5,8,14-eicosatrienoyl.(Z,Z,Z)-14-Hydroxy-15-Nitro- 5,8,14-eicosatrienoyl, (Z,Z,Z)-15-Hydroxy-14-Nitro-5,8,14-eicosatrienoyl. Mischungen von (Z,Z,Z)-5-Hydroxy-6-Nitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (Z,Z,Z)-6-Hydroxy- 5-Nitro-8,1 1 ,14-eicosadienoyl, (Z,Z,Z)-8-Hydroxy-9-Nitro-5,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (Z,Z,Z)-9-Hydroxy-8-N itro-5, 1 1 , 14-eicosatrienoyl , (Z,Z,Z)-1 1 -Hydroxy-12-N itro-5,8, 14- eicosatrienoyl, (Z,Z,Z)-12-Hydroxy-1 1 -Nitro-5, 8,14-eicosatrienoyl. (Z,Z,Z)-14-Hydroxy- 15-Nitro-5,8,14-eicosatrienoyl und (Z,Z,Z)-15-Hydroxy-14-Nitro-5, 8,14-eicosatrienoyl. (Z,Z)-5,8-Dihydroxy-6,9-dinitro-1 1 ,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-5,9-Dihydroxy-6,8-dinitro- 1 1 ,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-6,8-Dihydroxy-5,9-dinitro-1 1 ,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-6,9- Dihydroxy-5,8-dinitro-1 1 ,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-5,1 1 -Dihydroxy-6,12-dinitro-8,14- eicosadienoyl, (Z,Z)-5,12-Dihydroxy-6,1 1 -dinitro-8,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-6,1 1 - Dihydroxy-5,12-dinitro-8,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-6,12-Dihydroxy-5,1 1 -dinitro-8,14- eicosadienoyl, (Z,Z)-8,1 1 -Dihydroxy-9,12-dinitro-5,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-8,12- Dihydroxy-9,1 1 -dinitro-5,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-9,1 1 -Dihydroxy-8,12-dinitro-5,14- eicosadienoyl, (Z,Z)-9,12-Dihydroxy-8,1 1 -dinitro-5,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-5,14- Dihydroxy-6,15-dinitro-8,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-5,15-Dihydroxy-6,14-dinitro-8,1 1 - eicosadienoyl, (Z,Z)-6,14-Dihydroxy-5,15-dinitro-8,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-6,15- Dihydroxy-5,14-dinitro-8,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-8,14-Dihydroxy-9,15-dinitro-5,1 1 - eicosadienoyl, (Z,Z)-8,15-Dihydroxy-9,14-dinitro-5,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-9,14- Dihydroxy-8,15-dinitro-5,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-9,15-Dihydroxy-8,14-dinitro-5,1 1 - eicosadienoyl, (Z,Z)-1 1 ,14-Dihydroxy-12,15-dinitro-5,8-eicosadienoyl, (Z,Z)-1 1 ,15- Dihydroxy-12,14-dinitro-5,8-eicosadienoyl, (Z,Z)-12,14-Dihydroxy-1 1 ,15-dinitro-5,8- eicosadienoyl, (Z,Z)-12,15-Dihydroxy-1 1 ,14-dinitro-5,8-eicosadienoyl.
Mischungen von (Z,Z)-5,8-Dihydroxy-6,9-dinitro-1 1 ,14-eicosadienoyl,
(Z,Z)-5,9-Dihydroxy-6,8-dinitro-1 1 ,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-6,8-Dihydroxy-5,9-dinitro- 1 1 ,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-6,9-Dihydroxy-5,8-dinitro-1 1 ,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-5,1 1 - Dihydroxy-6,12-dinitro-8,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-5,12-Dihydroxy-6,1 1 -dinitro-8,14- eicosadienoyl, (Z,Z)-6,1 1 -Dihydroxy-5,12-dinitro-8,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-6,12- Dihydroxy-5,1 1 -dinitro-8,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-8,1 1 -Dihydroxy-9,12-dinitro-5, 14- eicosadienoyl, (Z,Z)-8,12-Dihydroxy-9,1 1 -dinitro-5,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-9,1 1 - Dihydroxy-8,12-dinitro-5,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-9,12-Dihydroxy-8,1 1 -dinitro-5,14- eicosadienoyl, (Z,Z)-5,14-Dihydroxy-6,15-dinitro-8,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-5,15- Dihydroxy-6,14-dinitro-8,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-6,14-Dihydroxy-5,15-dinitro-8,1 1 - eicosadienoyl, (Z,Z)-6,15-Dihydroxy-5,14-dinitro-8,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-8,14- Dihydroxy-9,15-dinitro-5,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-8,15-Dihydroxy-9,14-dinitro-5,1 1 - eicosadienoyl, (Z,Z)-9,14-Dihydroxy-8,15-dinitro-5,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-9,15- Dihydroxy-8,14-dinitro-5,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-1 1 ,14-Dihydroxy-12,15-dinitro-5,8- eicosadienoyl, (Z,Z)-1 1 ,15-Dihydroxy-12,14-dinitro-5,8-eicosadienoyl, (Z,Z)-12,14- Dihydroxy-1 1 ,15-dinitro-5,8-eicosadienoyl und (Z,Z)-12,15-Dihydroxy-1 1 ,14-dinitro- 5,8-eicosadienoyl. Mischungen von (Z,Z,Z)-5-Hydroxy-6-Nitro-8,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (Z,Z,Z)-6-Hydroxy- 5-Nitro-8,1 1 ,14-eicosadienoyl, (Z,Z,Z)-8-Hydroxy-9-Nitro-5,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (Z,Z,Z)-9-Hydroxy-8-Nitro-5,1 1 ,14-eicosatrienoyl, (Z,Z,Z)-1 1 -Hydroxy-12-Nitro-5,8,14- eicosatrienoyl, (Z,Z,Z)-12-Hydroxy-1 1 -Nitro-5,8,14-eicosatrienoyl.(Z,Z,Z)-14-Hydroxy- 15-Nitro-5,8,14-eicosatrienoyl, (Z,Z,Z)-15-Hydroxy-14-Nitro-5,8,14-eicosatrienoyl, (Z,Z)-5,8-Dihydroxy-6,9-dinitro-1 1 ,14-eicosadienoyl,
(Z,Z)-5,9-Dihydroxy-6,8-dinitro-1 1 ,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-6,8-Dihydroxy-5,9-dinitro- 1 1 ,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-6,9-Dihydroxy-5,8-dinitro-1 1 ,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-5,1 1 - Dihydroxy-6,12-dinitro-8,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-5,12-Dihydroxy-6,1 1 -dinitro-8,14- eicosadienoyl, (Z,Z)-6,1 1 -Dihydroxy-5,12-dinitro-8,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-6,12- Dihydroxy-5,1 1 -dinitro-8,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-8,1 1 -Dihydroxy-9,12-dinitro-5,14- eicosadienoyl, (Z,Z)-8,12-Dihydroxy-9,1 1 -dinitro-5,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-9,1 1 - Dihydroxy-8,12-dinitro-5,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-9,12-Dihydroxy-8,1 1 -dinitro-5,14- eicosadienoyl, (Z,Z)-5,14-Dihydroxy-6,15-dinitro-8,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-5,15- Dihydroxy-6,14-dinitro-8,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-6,14-Dihydroxy-5,15-dinitro-8,1 1 - eicosadienoyl, (Z,Z)-6,15-Dihydroxy-5,14-dinitro-8,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-8,14- Dihydroxy-9,15-dinitro-5,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-8,15-Dihydroxy-9,14-dinitro-5,1 1 - eicosadienoyl, (Z,Z)-9,14-Dihydroxy-8,15-dinitro-5,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-9,15- Dihydroxy-8,14-dinitro-5,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-1 1 ,14-Dihydroxy-12,15-dinitro-5,8- eicosadienoyl, (Z,Z)-1 1 ,15-Dihydroxy-12,14-dinitro-5,8-eicosadienoyl, (Z,Z)-12,14- Dihydroxy-1 1 ,15-dinitro-5,8-eicosadienoyl und (Z,Z)-12,15-Dihydroxy-1 1 ,14-dinitro- 5,8-eicosadienoyl.
(E,Z,Z,Z)-8-N itro-8, 1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl , (E,Z,Z,Z)-9-N itro-8, 1 1 ,14,17- eicosatetraenoyl, (Z,E,Z,Z)-1 1 -Nitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (Z,E,Z,Z)-12-Nitro- 8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (Z,Z,E,Z)-14-Nitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl,
(Z,Z,E,Z)-15-Nitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl. (Z,Z,Z,E)-17-Nitro-8,1 1 ,14,17- eicosatetraenoyl,
(Z,Z,Z,E)-18-Nitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl.
Mischungen von (E,Z,Z,Z)-8-Nitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (E,Z,Z,Z)-9-Nitro- 8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (Z,E,Z,Z)-1 1 -Nitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl,
(Z,E,Z,Z)-12-Nitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (Z,Z,E,Z)-14-Nitro-8,1 1 ,14,17- eicosatetraenoyl, (Z,Z,E,Z)-15-Nitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl. (Z,Z,Z,E)-17-Nitro- 8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl und (Ζ,Ζ,Ζ, E)-18-N itro-8, 1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl . (E,E,Z,Z)-8,1 1 -Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (E,E,Z,Z)-8,12-Dinitro-8,1 1 ,14,17- eicosatetraenoyl, (E,E,Z,Z)-9,1 1 -Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (E,E,Z,Z)-9,12- Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (E,Z,E,Z)-8,14-Dinitro-8,1 1 ,14,17- eicosatetraenoyl, (E,Z,E,Z)-8,15-Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (E,Z,E,Z)-9,14- Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (E,Z,E,Z)-9,15-Dinitro-8,1 1 ,14,17- eicosatetraenoyl , (E,Z,Z,E)-8,17-Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (E,Z,Z,E)-8,18- Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (E,Z,Z,E)-9,17-Dinitro-8,1 1 ,14,17- eicosatetraenoyl, (E,Z,Z,E)-9,18-Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (Ζ,Ε,Ε,Ζ)- 1 1 ,14-Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (Z,E,E,Z)-1 1 ,15-Dinitro-8,1 1 ,14,17- eicosatetraenoyl, (Z,E, E,Z)-12, 14-Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (Ζ,Ε,Ε,Ζ)- 12,15-Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl. (Z,E,Z,E)-1 1 ,17-Dinitro-8,1 1 ,14,17- eicosatetraenoyl , (Z,E,Z,E)-1 1 ,18-Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (Ζ,Ε,Ζ,Ε)-
12.17- Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (Z,E,Z,E)-12,18-Dinitro-8,1 1 ,14,17- eicosatetraenoyl.(Z,Z,E,E)-14,17-Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (Ζ,Ζ,Ε,Ε)-
14.18- Dinitro-8,11 ,14,17-eicosatetraenoyl, (Z,Z,E,E)- 5, 7-Dinitro-8,1 1 , 4, 7- eicosatetraenoyl, (Z,Z,E,E)-15,18-Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl.
Mischungen von (E,E,Z,Z)-8,1 1 -Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (E,E,Z,Z)-8,12- Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (E,E,Z,Z)-9,1 1 -Dinitro-8,1 1 ,14,17- eicosatetraenoyl, (E,E,Z,Z)-9,12-Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (E,Z,E,Z)-8,14- Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (E,Z,E,Z)-8,15-Dinitro-8,1 1 ,14,17- eicosatetraenoyl, (E,Z,E,Z)-9,14-Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (E,Z,E,Z)-9,15- Dinitro-8,11 ,14,17-eicosatetraenoyl, (E,Z,Z,E)-8, 17-Dinitro-8,11 ,14,17- eicosatetraenoyl, (E,Z,Z,E)-8,18-Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (E,Z,Z,E)-9,17- Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (E,Z,Z,E)-9,18-Dinitro-8,1 1 ,14,17- eicosatetraenoyl , (Z,E,E,Z)-1 1 ,14-Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (Ζ,Ε,Ε,Ζ)- 1 1 ,15-Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (Z,E,E,Z)-12,14-Dinitro-8,1 1 ,14,17- eicosatetraenoyl, (Z,E,E,Z)-12,15-Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl. (Ζ,Ε,Ζ, E)-
1 1 .17- Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (Z,E,Z,E)-1 1 ,18-Dinitro-8,1 1 ,14,17- eicosatetraenoyl, (Z, E,Z,E)-12, 17-Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (Ζ,Ε,Ζ,Ε)-
12.18- Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl. (Z,Z,E,E)-14,17-Dinitro-8,1 1 ,14,17- eicosatetraenoyl, (Z,Z, E,E)-14, 18-Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (Ζ,Ζ,Ε,Ε)- 15,17-Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl und (Z,Z,E,E)-15,18-Dinitro-8,1 1 ,14,17- eicosatetraenoyl .
Mischungen von (E,Z,Z,Z)-8-Nitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (E,Z,Z,Z)-9-Nitro- 8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (Z,E,Z,Z)-1 1 -Nitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (Z,E,Z,Z)-12-Nitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (Z,Z,E,Z)-14-Nitro-8,1 1 ,14,17- eicosatetraenoyl, (Z,Z,E,Z)-15-Nitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl. (Z,Z,Z,E)-17-Nitro- 8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl , (Ζ,Ζ,Ζ, E)-18-N itro-8, 1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl ,
(E,E,Z,Z)-8,1 1 -Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (E,E,Z,Z)-8,12-Dinitro-8,1 1 ,14,17- eicosatetraenoyl, (E,E,Z,Z)-9,1 1 -Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (E,E,Z,Z)-9,12- Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (E,Z,E,Z)-8,14-Dinitro-8,1 1 ,14,17- eicosatetraenoyl , (E,Z, E,Z)-8, 15-Din itro-8 ,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl , (E,Z, E,Z)-9, 14- Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (E,Z,E,Z)-9,15-Dinitro-8,1 1 ,14,17- eicosatetraenoyl, (E,Z,Z,E)-8, 7-Dinitro-8, , 4, 7-eicosatetraenoyl, (E,Z,Z,E)-8, 8- Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (E,Z,Z,E)-9,17-Dinitro-8,1 1 ,14,17- eicosatetraenoyl, (E,Z,Z,E)-9,18-Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (Ζ,Ε,Ε,Ζ)-
1 1 .14- Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (Z,E,E,Z)-1 1 ,15-Dinitro-8,1 1 ,14,17- eicosatetraenoyl, (Z,E, E,Z)-12, 14-Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (Ζ,Ε,Ε,Ζ)-
12.15- Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl. (Z,E,Z,E)-1 1 ,17-Dinitro-8,1 1 ,14,17- eicosatetraenoyl, (Z,E,Z,E)-1 1 ,18-Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (Ζ,Ε,Ζ,Ε)-
12.17- Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (Z,E,Z,E)-12,18-Dinitro-8,1 1 ,14,17- eicosatetraenoyl.(Z,Z,E,E)-14, 17-Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (Ζ,Ζ,Ε,Ε)-
14.18- Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (Z,Z,E,E)-15,17-Dinitro-8,1 1 ,14,17- eicosatetraenoyl und (Z,Z,E,E)-15,18-Dinitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl.
(Z,Z,Z)-8-Hydroxy-9-Nitro-1 1 ,14,17-eicosatrienoyl, (Z,Z,Z)-9-Hydroxy-8-Nitro- 1 1 ,14,17-eicosadienoyl, (Z,Z,Z)-1 1 -Hydroxy-12-Nitro-8,14,17-eicosatrienoyl,
(Z,Z,Z)-12-Hydroxy-1 1 -Nitro-8,14,17-eicosatrienoyl, (Z,Z,Z)-14-Hydroxy-15-Nitro- 8,1 1 ,17-eicosatrienoyl, (Z,Z,Z)-15-Hydroxy-14-Nitro-8,1 1 ,17-eicosatrienoyl. (Ζ,Ζ,Ζ)- 17-Hydroxy-18-Nitro-8,1 1 ,17-eicosatrienoyl, (Z,Z,Z)-18-Hydroxy-17-Nitro-8,1 1 ,17- eicosatrienoyl.
Mischungen von (Z,Z,Z)-8-Hydroxy-9-Nitro-1 1 ,14,17-eicosatrienoyl, (Z,Z,Z)-9- Hydroxy-8-Nitro-1 1 ,14,17-eicosadienoyl, (Z,Z,Z)-1 1 -Hydroxy-12-Nitro-8,14,17- eicosatrienoyl, (Z,Z,Z)-12-Hydroxy-1 1 -Nitro-8,14,17-eicosatrienoyl, (Z,Z,Z)-14- Hydroxy-15-Nitro-8,1 1 ,17-eicosatrienoyl, (Z,Z,Z)-15-Hydroxy-14-Nitro-8,1 1 ,17- eicosatrienoyl, (Z,Z,Z)-17-Hydroxy-18-Nitro-8,1 1 ,17-eicosatrienoyl und (Z,Z,Z)-18- Hydroxy-17-Nitro-8,1 1 ,17-eicosatrienoyl.
(Z,Z)-8,1 1 -Dihydroxy-9,12-dinitro-14,17-eicosadienoyl, (Z,Z)-8,12-Dihydroxy-9,1 1 - dinitro-14,17-eicosadienoyl, (Z,Z)-9,1 1 -Dihydroxy-8,12-dinitro-14,17-eicosadienoyl, (Z,Z)-9,12-Dihydroxy-8,1 1 -dinitro-14,17-eicosadienoyl, (Z,Z)-8,14-Dihydroxy-9,15- dinitro-1 1 ,17-eicosadienoyl, (Z,Z)-8,15-Dihydroxy-9,14-dinitro-1 1 ,17-eicosadienoyl, (Z,Z)-9,14-Dihydroxy-8,15-dinitro-1 1 ,17-eicosadienoyl, (Z,Z)-9,15-Dihydroxy-8,14- dinitro-1 1 ,17-eicosadienoyl, (Z,Z)-1 1 ,14-Dihydroxy-12,15-dinitro-8,17-eicosadienoyl, (Z,Z)-1 1 ,15-Dihydroxy-12,14-dinitro-8,17-eicosadienoyl, (Z,Z)-12,14-Dihydroxy- 1 1 ,15-dinitro-8,17-eicosadienoyl, (Z,Z)-12,15-Dihydroxy-1 1 ,14-dinitro-8,17- eicosadienoyl, (Z,Z)-8,17-Dihydroxy-9,18-dinitro-1 1 ,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-8,18- Dihydroxy-9,17-dinitro-1 1 ,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-9,17-Dihydroxy-8,18-dinitro-1 1 ,14- eicosadienoyl, (Z,Z)-9,18-Dihydroxy-8,17-dinitro-1 1 ,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-1 1 ,17- Dihydroxy-12,18-dinitro-8,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-1 1 ,18-Dihydroxy-12,17-dinitro- 8,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-12, 17-Dihydroxy-1 1 ,18-dinitro-8,14-eicosadienoyl, (Z,Z)- 12,18-Dihydroxy-1 1 ,17-dinitro-8,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-14,17-Dihydroxy-15,18- dinitro-8,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-14,18-Dihydroxy-15,17-dinitro-8,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-15,17-Dihydroxy-14,18-dinitro-8,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-15,18-Dihydroxy- 14,17-d in itro-8 , 1 1 -eicosad ienoyl . Mischungen von (Z,Z)-8,1 1 -Dihydroxy-9,12-dinitro-14,17-eicosadienoyl, (Z,Z)-8,12- Dihydroxy-9,1 1 -dinitro-14,17-eicosadienoyl, (Z,Z)-9,1 1 -Dihydroxy-8,12-dinitro-14,17- eicosadienoyl, (Z,Z)-9,12-Dihydroxy-8,1 1 -dinitro-14,17-eicosadienoyl, (Z,Z)-8,14- Dihydroxy-9,15-dinitro-1 1 ,17-eicosadienoyl, (Z,Z)-8,15-Dihydroxy-9,14-dinitro-1 1 ,17- eicosadienoyl, (Z,Z)-9,14-Dihydroxy-8,15-dinitro-1 1 ,17-eicosadienoyl, (Z,Z)-9,15- Dihydroxy-8,14-dinitro-1 1 ,17-eicosadienoyl, (Z,Z)-1 1 ,14-Dihydroxy-12,15-dinitro- 8,17-eicosadienoyl, (Z,Z)-1 1 ,15-Dihydroxy-12,14-dinitro-8,17-eicosadienoyl, (Z,Z)-
12.14- Dihydroxy-1 1 ,15-dinitro-8,17-eicosadienoyl, (Z,Z)-12,15-Dihydroxy-1 1 ,14- dinitro-8,17-eicosadienoyl, (Z,Z)-8,17-Dihydroxy-9,18-dinitro-1 1 ,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-8,18-Dihydroxy-9,17-dinitro-1 1 ,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-9,17-Dihydroxy-8,18- dinitro-1 1 ,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-9,18-Dihydroxy-8,17-dinitro-1 1 ,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-1 1 ,17-Dihydroxy-12,18-dinitro-8,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-1 1 ,18-Dihydroxy- 12,17-dinitro-8,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-12,17-Dihydroxy-1 1 ,18-dinitro-8,14- eicosadienoyl, (Z,Z)-12,18-Dihydroxy-1 1 ,17-dinitro-8,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-14,17- Dihydroxy-15,18-dinitro-8,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-14,18-Dihydroxy-15,17-dinitro- 8,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-15,17-Dihydroxy-14,18-dinitro-8,1 1 -eicosadienoyl und (Z,Z)-15,18-Dihydroxy-14,17-dinitro-8,1 1 -eicosadienoyl.
Mischungen von (Z,Z,Z)-8-Hydroxy-9-Nitro-1 1 ,14,17-eicosathenoyl, (Z,Z,Z)-9- Hydroxy-8-Nitro-1 1 ,14,17-eicosadienoyl, (Z,Z,Z)-1 1 -Hydroxy-12-Nitro-8,14,17- eicosat enoyl, (Z,Z,Z)-12-Hydroxy-1 1 -Nitro-8,14,17-eicosatrienoyl, (Z,Z,Z)-14- Hydroxy-15-Nitro-8,1 1 ,17-eicosatrienoyl, (Z,Z,Z)-15-Hydroxy-14-Nitro-8,1 1 ,17- eicosat enoyl, (Z,Z,Z)-17-Hydroxy-18-Nitro-8,1 1 ,17-eicosatrienoyl, (Z,Z,Z)-18- Hydroxy-17-Nitro-8,1 1 ,17-eicosatrienoyl, (Z,Z)-8,1 1 -Dihydroxy-9,12-dinitro-14,17- eicosadienoyl, (Z,Z)-8,12-Dihydroxy-9,1 1 -dinitro-14,17-eicosadienoyl, (Z,Z)-9,1 1 - Dihydroxy-8,12-dinitro-14,17-eicosadienoyl, (Z,Z)-9,12-Dihydroxy-8,1 1 -dinitro-14,17- eicosadienoyl, (Z,Z)-8,14-Dihydroxy-9,15-dinitro-1 1 ,17-eicosadienoyl, (Z,Z)-8,15- Dihydroxy-9,14-dinitro-1 1 ,17-eicosadienoyl, (Z,Z)-9,14-Dihydroxy-8,15-dinitro-1 1 ,17- eicosadienoyl, (Z,Z)-9,15-Dihydroxy-8,14-dinitro-1 1 ,17-eicosadienoyl, (Z,Z)-1 1 ,14- Dihydroxy-12,15-dinitro-8,17-eicosadienoyl, (Z,Z)-1 1 ,15-Dihydroxy-12,14-dinitro- 8,17-eicosadienoyl, (Z,Z)-12, 14-Dihydroxy-1 1 ,15-dinitro-8,17-eicosadienoyl, (Z,Z)-
12.15- Dihydroxy-1 1 ,14-dinitro-8,17-eicosadienoyl, (Z,Z)-8,17-Dihydroxy-9,18-dinitro- 1 1 ,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-8,18-Dihydroxy-9,17-dinitro-1 1 ,14-eicosadienoyl, (Z,Z)- 9,17-Dihydroxy-8,18-dinitro-1 1 ,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-9,18-Dihydroxy-8,17-dinitro- 1 1 ,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-1 1 ,17-Dihydroxy-12,18-dinitro-8,14-eicosadienoyl, (Z,Z)- 1 1 ,18-Dihydroxy-12,17-dinitro-8,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-12,17-Dihydroxy-1 1 ,18- dinitro-8,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-12,18-Dihydroxy-1 1 ,17-dinitro-8,14-eicosadienoyl, (Z,Z)-14,17-Dihydroxy-15,18-dinitro-8,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-14,18-Dihydroxy- 15,17-dinitro-8,1 1 -eicosadienoyl, (Z,Z)-15,17-Dihydroxy-14,18-dinitro-8,1 1 - eicosadienoyl und (Z,Z)-15,18-Dihydroxy-14,17-dinitro-8,1 1 -eicosadienoyl. (E,Z,Z,Z)-7-Nitro-7,10,13,16-docosatetraenoyl, (E,Z,Z,Z)-8-Nitro-7,10,13,16- docosatetraenoyl, (Z,E,Z,Z)-10-Nitro-7,10,13,16-docosatetraenoyl, (Z,E,Z,Z)-1 1 - Nitro-7,10,13,16-docosatetraenoyl, (Z,Z,E,Z)-13-Nitro-7,10,13,16-docosatetraenoyl, (Z,Z,E,Z)-14-Nitro-7,10,13,16-docosatetraenoyl, (Z,Z,Z,E)-16-Nitro-7,10,13,16- docosatetraenoyl, (Z,Z,Z,E)-17-Nitro-7,10,13,16-docosatetraenoyl.
Mischungen von (E,Z,Z,Z)-7-Nitro-7,10,13,16-Docosatetraenoyl, (E,Z,Z,Z)-8-Nitro- 7,10,13,16-Docosatetraenoyl, (Z,E,Z,Z)-10-Nitro-7,10,13,16-Docosatetraenoyl,
(Z,E,Z,Z)-1 1 -Nitro-7,10,13,16-Docosatetraenoyl, (Z,Z,E,Z)-13-Nitro-7,10,13,16- Docosatetraenoyl, (Z,Z,E,Z)-14-Nitro-7,10,13,16-Docosatetraenoyl, (Z,Z,Z,E)-16- Nitro-7,10,13,16-Docosatetraenoyl und (Z,Z,Z,E)-17-Nitro-7,10,13,16-
Docosatetraenoyl.
(Z,Z,Z)-7-Hydroxy-8-nitro-10,13,16-docosatrienoyl,(Z,Z,Z)-8-Hydroxy-7-nitro- 10,13,16-docosatrienoyl,(Z,Z,Z)-10-Hydroxy-1 1 -nitro-8,13,16-docosatrienoyl,(Z,Z,Z)- 1 1 -Hydroxy-10-nitro-8,13,16-docosatrienoyl,(Z,Z,Z)-13-Hydroxy-14-nitro-8,10,16- docosatrienoyl,(Z,Z,Z)-14-Hydroxy-13-nitro-8,10,16-docosatrienoyl,(Z,Z,Z)-16- Hydroxy-17-nitro-8,10,13-docosatrienoyl,(Z,Z,Z)-17-Hydroxy-16-nitro-8,10,13- docosatrienoyl, sowie Mischungen der vorgenannten Reste.
(E,Z,Z,Z)-6-Nitro-6,9,12,15-octadecatetraenoyl, (E,Z,Z,Z)-7-Nitro-7,10,13,16-
Docosatetraenoyl, (Z,E,Z,Z)-9-Nitro-7,10,13,16-Docosatetraenoyl, (Z,E,Z,Z)-10-Nitro- 7,10,13,16-Docosatetraenoyl, (Z,Z,E,Z)-12-Nitro-7,10,13,16-Docosatetraenoyl,
(Z,Z,E,Z)-13-Nitro-7,10,13,16-Docosatetraenoyl, (Z,Z,Z,E)-15-Nitro-7,10,13,16- Docosatetraenoyl, (Z,Z,Z,E)-16-Nitro-7,10,13,16-Docosatetraenoyl sowie Mischungen der vorgenannten Reste.
(Z,Z,Z)-6-Hydroxy-7-nitro-9,12,15-octadecatrienoyl,(Z,Z,Z)-7-Hydroxy-6-nitro-9,12,15- octadecatrienoyl,(Z,Z,Z)-9-Hydroxy-10-nitro-6,12,15-octadecatrienoyl,(Z,Z,Z)-10- Hydroxy-9-nitro-6, 12,15-octadecatrienoyl,(Z,Z,Z)-12-Hydroxy-13-nitro-6, 9,15- octadecatrienoyl,(Z,Z,Z)-13-Hydroxy-12-nitro-6,9,15-octadecatrienoyl,(Z,Z,Z)-15- Hydroxy-16-nitro-6,9,12-octadecatrienoyl,(Z,Z,Z)-16-Hydroxy-15-nitro-6,9,12- octadecatrienoyl sowie Mischungen der vorgenannten Reste.
(E,Z,Z,Z,Z)-4-Nitro-4,7,10,13,16-docosapentaenoyl, (E,Z,Z,Z,Z)-5-Nitro-4,7,10,13,16- docosapentaenoyl, (Z,E,Z,Z,Z)-7-Nitro-4, 7,10,13,16-docosapentaenoyl, (Ζ,Ε,Ζ,Ζ,Ζ)- 8-Nitro-4,7,10,13,16-docosapentaenoyl, (Z,Z,E,Z,Z)-10-Nitro-4,7,10,13,16- docosapentaenoyl, (Z,Z,E,Z,Z)-1 1 -Nitro-4,7,10,13,16-docosapentaenoyl, (Ζ,Ζ,Ζ,Ε,Ζ)- 13-Nitro-4,7,10,13,16-docosapentaenoyl, (Z,Z,Z,E,Z)-14-Nitro-4,7,10,13,16- docosapentaenoyl, (Z,Z,Z,Z,E)-16-Nitro-4, 7,10,13,16-docosapentaenoyl, (Ζ,Ζ,Ζ,Ζ,Ε)- 17-Nitro-4,7,10,13,16-docosapentaenoyl sowie Mischungen der vorgenannten Reste. (Z,Z,Z,Z)-4-Hydroxy-5-nitro-7,10,13,16-docosatetraenoyl, (Z,Z,Z,Z)-5-Hydroxy-4- nitro-7,10,13,16-docosatetraenoyl, (Z,Z,Z,Z)-7-Hydroxy-8-nitro-4,10,13,16- docosatetraenoyl, (Z,Z,Z,Z)-8-Hydroxy-7-nitro-4,10,13,16-docosatetraenoyl, (Z,Z,Z,Z)-10-Hydroxy-1 1 -nitro-4,7,13,16-docosatetraenoyl, (Z,Z,Z,Z)-1 1 -Hydroxy-10- nitro-4,7,13,16-docosatetraenoyl, (Z,Z,Z,Z)-13-Hydroxy-14-nitro-4,7,10,16- docosatetraenoyl, (Z,Z,Z,Z)-14-Hydroxy-13-nitro-4,7,10,16-docosatetraenoyl, (Z,Z,Z,Z)-16-Hydroxy-17-nitro-4,7,10,13-docosatetraenoyl, (Z,Z,Z,Z)-17-Hydroxy-16- nitro-4,7,10,13-docosatetraenoyl sowie Mischungen der vorgenannten Reste.
(E,Z,Z,Z,Z)-5-Nitro-5,8,1 1 ,14,17-eicosapentaenoyl, (E,Z,Z,Z,Z)-6-Nitro-5,8,1 1 ,14,17- eicosapentaenoyl, (Z,E,Z,Z,Z)-8-Nitro-5,8,1 1 ,14,17-eicosapentaenoyl, (Z,E,Z,Z,Z)-9- Nitro-5,8,1 1 ,14,17-eicosapentaenoyl, (Z,Z,E,Z,Z)-1 1 -Nitro-5,8,1 1 ,14,17- eicosapentaenoyl, (Z,Z,E,Z,Z)-12-Nitro-5, 8,1 1 ,14,17-eicosapentaenoyl, (Ζ,Ζ,Ζ,Ε,Ζ)- 14-Nitro-5,8,1 1 ,14,17-eicosapentaenoyl, (Z,Z,Z,E,Z)-15-Nitro-5,8,1 1 ,14,17- eicosapentaenoyl, (Z,Z,Z,Z,E)-17-Nitro-5, 8,1 1 ,14,17-eicosapentaenoyl, (Ζ,Ζ,Ζ,Ζ,Ε)-
18- Nitro-5, 8,1 1 ,14,17-eicosapentaenoyl sowie Mischungen der vorgenannten Reste. (Z,Z,Z,Z)-5-Hydroxy-6-nitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (Z,Z,Z,Z)-6-Hydroxy-5-nitro- 8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl , (Z,Z,Z,Z)-8-Hydroxy-9-n itro-5, 1 1 ,14,17- eicosatetraenoyl, (Z,Z,Z,Z)-9-Hydroxy-8-nitro-5,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl, (Ζ,Ζ,Ζ,Ζ)- 1 1 -Hydroxy-12-nitro-5, 8, 14,17-eicosatetraenoyl, (Z,Z,Z,Z)-12-Hydroxy-1 1 -nitro- 5,8,14,17-eicosatetraenoyl, (Z,Z,Z,Z)-14-Hydroxy-15-nitro-5,8,1 1 ,17- eicosatetraenoyl, (Z,Z,Z,Z)-15-Hydroxy-14-nitro-5,8,1 1 ,17-eicosatetraenoyl,
(Z,Z,Z,Z)-17-Hydroxy-18-nitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl, (Z,Z,Z,Z)-18-Hydroxy-17- nitro-5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoyl sowie Mischungen der vorgenannten Reste.
(E,Z,Z,Z,Z)-7-Nitro-7,10,13,16,19-docosapentaenoyl, (E,Z,Z,Z,Z)-8-Nitro- 7,10,13,16,19-docosapentaenoyl, (Z,E,Z,Z,Z)-10-Nitro-7,10,13,16,19- docosapentaenoyl, (Z,E,Z,Z,Z)-1 1 -Nitro-7,10,13,16,19-docosapentaenoyl,
(Z,Z,E,Z,Z)-13-Nitro-7,10,13,16,19-docosapentaenoyl, (Z,Z,E,Z,Z)-14-Nitro- 7,10,13,16,19-docosapentaenoyl, (Z,Z,Z,E,Z)-16-Nitro-7,10,13,16,19- docosapentaenoyl, (Z,Z,Z,E,Z)-17-Nitro-7,10,13,16,19-docosapentaenoyl,
(Z,Z,Z,Z,E)-19-Nitro-7,10,13,16,19-docosapentaenoyl, (Z,Z,Z,Z,E)-20-Nitro- 7,10,13,16,19-docosapentaenoyl sowie Mischungen der vorgenannten Reste.
(Z,Z,Z,Z)-7-Hydroxy-8-nitro-10,13,16,19-docosatetraenoyl, (Z,Z,Z,Z)-8-Hydroxy-7- nitro-10,13,16,19-docosatetraenoyl, (Z,Z,Z,Z)-10-Hydroxy-1 1 -nitro-7,13,16,19- docosatetraenoyl, (Z,Z,Z,Z)-1 1 -Hydroxy-10-nitro-7,13,16,19-docosatetraenoyl, (Z,Z,Z,Z)-13-Hydroxy-14-nitro-7,1 1 ,16,19-docosatetraenoyl, (Z,Z,Z,Z)-14-Hydroxy- 13-nitro-7,1 1 ,16,19-docosatetraenoyl, (Z,Z,Z,Z)-16-Hydroxy-17-nitro-7,1 1 ,13,19- docosatetraenoyl, (Z,Z,Z,Z)-17-Hydroxy-16-nitro-7,1 1 ,13,19-docosatetraenoyl,
(Z,Z,Z,Z)-19-Hydroxy-20-nitro-7,1 1 ,13,16-docosatetraenoyl, (Z,Z,Z,Z)-20-Hydroxy-
19- nitro-7,1 1 ,13,16-docosatetraenoyl sowie Mischungen der vorgenannten Reste. (E,Z,Z,Z,Z,Z)-4-Nitro-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoyl, (E,Z,Z,Z,Z,Z)-5-Nitro- 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoyl, (Z,E,Z,Z,Z,Z)-7-Nitro-4,7,10,13,16,19- docosahexaenoyl, (Z,E,Z,Z,Z,Z)-8-Nitro-4, 7,10,13,16,19-docosahexaenoyl,
(Z,Z,E,Z,Z,Z)-10-Nitro-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoyl, (Z,Z,E,Z,Z,Z)-1 1 -Nitro- 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoyl, (Z,Z,Z,E,Z,Z)-13-Nitro-4,7,10,13,16,19- docosahexaenoyl, (Z,Z,Z,E,Z,Z)-14-Nitro-4, 7, 10, 13, 16,19-docosahexaenoyl,
(Z,Z,Z,Z,E,Z)-16-Nitro-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoyl, (Z,Z,Z,Z,E,Z)-17-Nitro- 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoyl, (Z,Z,Z,Z,Z,E)-19-Nitro-4,7,10,13,16,19- docosahexaenoyl, (Z,Z,Z,Z,Z,E)-20-Nitro-4, 7,10,13,16,19-docosahexaenoyl sowie Mischungen der vorgenannten Reste.
(Z,Z,Z,Z,Z)-4-Hydroxy-5-n itro-7, 10,13,16,19-docosapentaenoyl , (Z,Z,Z,Z,Z)-5- Hydroxy-4-nitro-7,10,13,16,19-docosapentaenoyl, (Z,Z,Z,Z,Z)-7-Hydroxy-8-nitro- 4,10,13,16,19-docosapentaenoyl, (Z,Z,Z,Z,Z)-8-Hydroxy-7-nitro-4,10,13,16,19- docosapentaenoyl, (Z,Z,Z,Z,Z)-10-Hydroxy-1 1 -nitro-4,7,13,16,19-docosapentaenoyl, (Z,Z,Z,Z,Z)-1 1 -Hydroxy-10-nitro-4,7,13,16,19-docosapentaenoyl, (Z,Z,Z,Z,Z)-13- Hydroxy-14-nitro-4, 7,10,16,19-docosapentaenoyl, (Z,Z,Z,Z,Z)-14-Hydroxy-13-nitro- 4,7,10,16,19-docosapentaenoyl, (Z,Z,Z,Z,Z)-16-Hydroxy-17-nitro-4,7,10,13,19- docosapentaenoyl, (Z,Z,Z,Z,Z)-17-Hydroxy-16-nitro-4, 7,10,13,19-docosapentaenoyl, (Z,Z,Z,Z,Z)-19-Hydroxy-20-nitro-4,7,10,13,16-docosapentaenoyl, (Z,Z,Z,Z,Z)-20- Hydroxy-19-nitro-4,7,10,13,16-docosapentaenoyl sowie Mischungen der vorgenannten Reste.
(E,Z,Z,Z,Z,Z,Z)-4-Nitro-4,7,9,1 1 ,13,16,19-docosaheptaenoyl, (E,Z,Z,Z,Z,Z,Z)-5-Nitro- 4,7,9,1 1 ,13,16,19-docosaheptaenoyl, (Z,E,Z,Z,Z,Z,Z)-7-Nitro-4,7,9,1 1 ,13,16,19- docosaheptaenoyl, (Z,E,Z,Z,Z,Z,Z)-8-Nitro-4,7,9,1 1 ,13,16,19-docosaheptaenoyl, (Z,Z,E,Z,Z,Z,Z)-9-Nitro-4,7,9,1 1 ,13,16,19-docosaheptaenoyl, (Z,Z,E,Z,Z,Z,Z)-10- Nitro-4,7,9,1 1 ,13,16,19-docosaheptaenoyl, (Z,Z,Z,E,Z,Z,Z)-1 1 -Nitro-
4,7,9,1 1 ,13,16,19-docosaheptaenoyl, (Z,Z,Z,E,Z,Z,Z)-12-Nitro-4,7,9,1 1 ,13,16,19- docosaheptaenoyl, (Z,Z,Z,Z,E,Z,Z)-13-Nitro-4,7,9,1 1 ,13,16,19-docosaheptaenoyl, (Z,Z,Z,Z,E,Z,Z)-14-Nitro-4,7,9,1 1 ,13,16,19-docosaheptaenoyl, (Z,Z,Z,Z,Z,E,Z)-16- Nitro-4,7,9,1 1 ,13,16,19-docosaheptaenoyl, (Z,Z,Z,Z,Z,E,Z)-17-Nitro-
4,7,9,1 1 ,13,16,19-docosaheptaenoyl, (Z,Z,Z,Z,Z,Z,E)-19-Nitro-4,7,9,1 1 ,13,16,19- docosaheptaenoyl, (Z,Z,Z,Z,Z,Z,E)-20-Nitro-4, 7,9,1 1 ,13,16,19-docosaheptaenoyl sowie Mischungen der vorgenannten Reste.
(Z,Z,Z,Z,Z,Z)-4-Hydroxy-5-nitro-7,9,1 1 ,13,16,19-docosahexaenoyl, (Z,Z,Z,Z,Z,Z)-5- Hydroxy-4-nitro-7, 9,1 1 ,13, 16,19-docosahexaenoyl, (Z,Z,Z,Z,Z,Z)-7-Hydroxy-8-nitro- 4,9,1 1 ,13,16,19-docosahexaenoyl, (Z,Z,Z,Z,Z,Z)-8-Hydroxy-7-nitro-4,9,1 1 ,13,16,19- docosahexaenoyl, (Z,Z,Z,Z,Z,Z)-9-Hydroxy-10-nitro-4, 7,1 1 ,13, 16,19-docosahexaenoyl, (Z,Z,Z,Z,Z,Z)-10-Hydroxy-9-nitro-4,7,1 1 ,13,16,19-docosahexaenoyl, (Z,Z,Z,Z,Z,Z)-1 1 -Hydroxy-12-nitro-4,7,9,13,16,19-docosahexaenoyl, (Z,Z,Z,Z,Z,Z)-12- Hydroxy-1 1 -nitro-4, 7,9,13,16,19-docosahexaenoyl, (Z,Z,Z,Z,Z,Z)-13-Hydroxy-14- nitro-4, 7,9,1 1 ,16,19-docosahexaenoyl, (Z,Z,Z,Z,Z,Z)-14-Hydroxy-13-nitro-4, 7,9,1 1 , 16,19-docosahexaenoyl, (Z,Z,Z,Z,Z,Z)-16-Hydroxy-17-nitro-4,7,9,1 1 ,13,19-docosahexaenoyl, (Z,Z,Z,Z,Z,Z)-17-Hydroxy-16-nitro-4, 7,9,1 1 ,13,19-docosahexaenoyl, (Z,Z,Z,Z,Z,Z)-19-Hydroxy-20-nitro-4,7,9,1 1 ,13,16-docosahexaenoyl, (Z,Z,Z,Z,Z,Z)-20- Hydroxy-19-nitro-4, 7,9,1 1 ,13,16-docosahexaenoyl sowie Mischungen der vorgenannten Reste.
Nitrohexanoly, Dinitrohexanoly, Trinitrohexanoly, Nitrooctanoly, Dinitrooctanoly, Trinitrooctanoly, Nitrodecanoyl, Dinitrodecanoyl, Trinitrodecanoyl, Nitrododecanoyl, Dinitrododecanoyl, Trinitrododecanoyl, Nitrotetradecanoyl, Dinitrotetradecanoyl, Trinitrotetradecanoyl, Nitrohexadecanoyl, Dinitrohexadecanoyl, Trinitrohexadecanoyl, Nitroheptadecanoyl, Dinitroheptadecanoyl, Trinitroheptadecanoyl, Nitrooctadecanoyl, Dinitrooctadecanoyl, Trinitrooctadecanoyl, Nitroeicosanoyl, Dinitroeicosanoyl, Trinitroeicosanoyl, Nitrodocosanoyl, Dinitrodocosanoyl, Trinitrodocosanoyl, Nitrotetracosanoyl, Dinitrotetracosanoyl, Trinitrotetracosanoyl, Nitroisopalmitinoyl, Dinitroisopalmitinoyl, Trinitroisopalmitinoyl, Nitro-1 1 ,12-methylen-octadecanoyl, Dinitro-1 1 ,12-methylen-octadecanoyl, Trinitro-1 1 ,12-methylen-octadecanoyl, Nitro- 9,10-methylen-hexadecanoyl, Dinitro-9,10-methylen-hexadecanoyl, Trinitro-9,10- methylen-hexadecanoyl, Nitroretinoyl, Dinitroretinoyl, Trinitroretinoyl, Nitrophytanoyl, Dinitrophytanoyl als auch abschließend Trinitrophytanoyl.
Da die Nitrierungsreaktionen und insbesondere die saure oder radikalische Nitrierung oftmals nicht selektiv durchgeführt werden können und die nitrierten Carbonsäuren teilweise schlecht zu trennen sind, ist auch die Verwendung von Gemischen von nitrierten Carbonsäuren bevorzugt. Bei diesen Gemischen handelt es sich vorzugsweise um Regioisomere vor allem von Carbonsäuren mit mehreren Doppelbindungen als auch um Gemische von einfach, zweifach, freifach oder mehrfach nitrierten Carbonsäuren. Nitrierte Carbonsäuren als Reinsubstanz (d.h. keine Gemsiche) lassen sich am besten durch eine Substitutionsreaktion herstelen, wie im Folgenden gezeigt:
Figure imgf000049_0001
Werden freie Halogencarbonsäuren, d.h. noch nicht an das Phospholipid gebundene Carbonsäuren mit Silbernitrat umgesetzt, kann die Maskierung der Carboxylatgruppe vorteilhaft sein.
Nicht selektive Nitrierungsreaktionen sind in Gorczynski, Michael J.; Huang, Jinming; King, S. Bruce; Organic Letters, 2006, 8, 1 1 , 2305 - 2308 beschrieben und in folgender Übersicht dargestellt:
Schema 1
Figure imgf000050_0001
ONO N02 N02
HOOC— (CH2)X- HOOC— (CH2)X-
Nitronitrilcarbonsäuren
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Die Umsetzung von ungesättigten Carbonsäuren mit NO2-Radikalen führt über eine radikalische Nitrocarbonsäure, welche durch H-Abstraktion ungesättigte Nitrocarbonsäuren ergibt, bei denen sich die Nitrogruppe in allylischer Position zur Doppelbindung befindet. Die ursprüngliche Doppelbindung wurde dabei umgelagert. Hingegen entstehen durch eine radikalische Anlagerung von NO2 Nitro-Nitril- Carbonsäuren, welche durch Hydrolyse in Hydroxy-Nitro-Carbonsäuren überführt werden können, bei denen faktisch eine Hydroxygruppe und eine Nitrogruppe an eine Doppelbindung angelagert worden sind oder unter HNO2-Abspaltung entstehen ungesättigte Nitrocarbonsauren mit der eingeführten Nitrogruppe in vinylischer Position, also an der Doppelbindung. Die ursprüngliche Doppelbindung ist in unveränderter Lage vorhanden. Diese Reaktionen können mehrfach ablaufen und bei dem Vorhandensein von mehreren Doppelbindungen theoretisch an allen Doppelbindugen ablaufen, so dass Dinitrocarbonsäure, Trinitrocarbonsäuren und Polynitrocarbonsäuren entstehen können, wobei fast immer Gemische vorliegen.
Die unselektive Nitrierung einer Doppelbindung der Carbonsäure kann auch im sauren Milieu ablaufen, wie im Folgenden (Schema 2) gezeigt:
Schema 2
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Eine weitere Möglichkeit der Nitrierung (Schema 3) von ungesättigten Carbonsäu ist im folgenden Reaktionsdiagramm dargestellt und verwendet PhSeBr.
Schema 3
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Die erfindungsgemäßen Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipide können erhalten werden, indem die beiden OH-Gruppen der Glycerineinheit mit derselben Nitrocarbonsaure verestert werden. In diesem Fall ist R1COOH identisch mit R2COOH und R1 ist identisch mit R2 (s. Schema 4).
Sollen unterschiedliche Nitrocarbonsäuren verwendet werden, so müssen die Veresterungen nacheinander erfolgen, wobei vorzugsweise zuerst selektiv die primäre OH-Gruppe und danach die sekundäre OH-Gruppe verestert werden. Dabei kann bei der ersten Veresterung eine Nitrocarbonsäure und bei der zweiten Veresterung eine nicht nitrierte Carbonsäure oder bei der ersten Veresterung eine nicht nitrierte Carbonsäure und bei der zweiten Veresterung eine Nitrocarbonsäure oder bei beiden Veresterungen eine unterschiedliche Nitrocarbonsäure eingesetzt werden (s. Schema 4). Die Veresterungen erfolgen nach dem Fachmann bekannten Standardreaktionen.
Schema 4
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Eine weitere Möglichkeit zur Herstellung der erfindungsgemäßen Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipide ist in Schema 5 gezeigt. Werden Gemische von Nitrocarbonsäure eingesetzt, so ergeben sich vorrangig PL mit unterschiedlichen Resten in Position 1 und 2, d.h. R1COO- Φ R2COO- Ferner ermöglicht die Reaktionssequenz gemäß Schema 5 die Einführung von nicht nitrierten Carbonsäureresten (R1COO-) an Position 1 und eines nitrierten Carbonsäurerestes (R2COO-) an Position 2. Die in Schema 5 gezeigte Reaktionssequenz ist zudem anwendbar, wenn R1COO- einen nitrierten gesättigten Carbonsäurerest darstellt. Dann kann R2COO- beliebige nitrierte oder nicht nitrierte als auch gesättigte oder ungesättigte Carbonsäurereste bedeuten. Nicht oder nur schlecht anwendbar ist die in Schema 5 gezeigte Reaktionssequenz hingegen, wenn R1COO- ein nitrierter ungesättigter Carbonsäurerest und vor allem ein in Vinylstellung (d.h. an der Doppelbindung) nitrierter ungesättigter Carbonsäurerest ist. Die weitere Veresterung mit R2COO- erfolgt dann nur noch unter drastischen Ausbeuteverlusten. Für einen solchen Fall wurde eine neue Synthese entwickelt, welche in Schema 6 dargestellt ist. Dabei werden zuerst beide Positionen 1 und 2 mit nicht nitrierten Carbonsäureresten oder mit nitrierten gesättigten Carbonsäureresten verestert und danach enzymatisch mittels Phospholipase selektiv die Position 1 verseift, so dass danach an Position 1 ein nitrierter ungesättigter Carbonsäurerest eingeführt werden kann. Allgemeine als auch konkrete Reaktionsvorschriften dazu sind im Experimentalteil wiedergegeben. Wie die obigen Ausführungen zeigen, können die Reste R1COO- und R2COO- in den Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden breit variiert werden, wobei zumindest einer der Reste R1COO- und R2COO- eine der vorgenannten Nitrocarbonsäurereste darstellt.
Der Rest R3 kann beispielsweise Wasserstoff, Serin, Cholin, ein Zucker wie z.B. Inosit oder Colamin (Ethanolamin) sein. Handelt es sich um eine Veresterung mit Cholinen, so entstehen Lecithine (auch Phosphatidylcholine), bei der Veresterung mit Ethanolamin werden Kephaline gebildet. Die Phosphatidylcholine sind bevorzugt.
Bekannte Beispiele für Phospholipide sind:
Phosphatidsäure
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Phosphatidylethanolamin (auch Kephalin, kurz PE)
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Phosphatidylcholin (auch Lecithin, kurz PC)
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Phosphatidylserin (auch PS)
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Phosphatidylinositol
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Die Existenz von Phospholipiden, die eine Nitrocarbon säure als Glycerinsubstituent tragen sind bisher nicht in Zellen/Organisnnen nachgewiesen worden und es besteht hierfür auch keine Biosynthese.
Überraschenderweise konnte gezeigt werden, dass Nitrocarbonsäuren-enthaltende Phospholipide eine Wechselwirkung mit anderen Phospholipiden aufweisen, die eine Erhöhung des Ordnungsgrads unter den Phospholipiden bei Ausbildung einer membranartigen Struktur bewirkten. Gleiches gilt für die Aufnahme von nitrierten Phospholipiden in eine Phospholipidschicht, die aus physiologisch vorkommenden Phospholipiden besteht. Diese Effekte sind weder in der Literatur beschrieben noch waren sie für einen Fachmann vorhersehbar.
Die Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipide können als Reinsubstanzen, Diastereomerengemische, Regioisomerengemsiche oder Gemische unterschiedlicher Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipide für die erfindungsgemäßen vorzugsweise biopassivierenden Zusammensetzungen und die erfindungsgemäßen vorzugsweise biopassivierenden Beschichtungen eingesetzt werden. Bei vielen Nitrierungsreaktionen entstehen (wie hierin auch eingehend beschrieben) Produktgemische von Nitrocarbonsäuren, wobei es sich um Regioisomere als auch um einfach oder mehrfach nitrierte Carbonsäuren handelt. Derartige bei der Nitrierungsreaktion erhaltene Produktgemische unterschiedlich nitrierter Carbonsäuren können so als Gemisch für die Veresterung mit dem Phospholipidrest wie z.B. sn-Glycero-3-phosphocholin eingesetzt werden und die danach erhaltenen Gemische an unterschiedlich nitrierten Carbonsäure(n)- enthaltenden Phospholipide können ohne dass eine Trennung in Reinsubstanzen erforderlich ist, als Gemsich für die erfindungsgemäßen Verwendungen eingesetzt werden. Zudem können die reinen Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipide als auch die Gemische von Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden in Kombination mit oder als Gemisch mit nicht nitrierten PL eingesetzt werden.
Bei den erfindugnsgemäßen Beschichtungen können z.B. alle Schichten auch aus Mischungen von nitrierten Phospholipiden mit Phospholipiden bestehen, die keine Nitrogruppe enthalten. Der Vorteil eines hohen Anteils von nitrierten Phospholipiden zeigt sich in verbesserten physiko-chemischen Eigenschaften von Phospholipid- Mischungen auf Oberflächen verglichen mit nichtnitrierten Phospholipiden, und in einem hohen Deckungsgrad und einer niedrigen Rate von multipler Schichtbildung. Weiterhin schließen sich Restlücken von Phospholipiden spontan wenn Phospholipidmischungen mit einem hohen Gehalt an nitrierten Phospholipiden verwendet werden und mäßige Wärme (bis zu 50°C) und hohe Feuchtigkeit verwendet wurden (Beispiel 1 ). Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass SAM mit einem signifikanten Anteil an Nitro-Phospholipiden gegen mechanische und chemische Veränderungen stabiler waren als SAM, die aus vergleichbaren nichtnitrierten Phospholipiden bestehen. Die laterale Beweglichkeit von SAM mit nitrierten Phospholipiden ist niedriger als bei SAM aus nicht nitrierten Phospholipiden, jedoch ist die laterale Beweglichkeit in Monoschichten aus reinen nitrierten Phospholipiden noch messbar. Hydrophile Polymere wie PEG wurden in der Anwesenheit von Elektrolyten wie Calcium auf Phospholipidbeschichtungen physisorbiert. Eine Oberbeschichtung mit hydrophilen Polymeren verlängerte die Haltbarkeit einer geschlossenen Formation der Phospholipidschicht. Die physisorbierten Polymere konnten schnell durch Abspülen entfernt werden. Wenn solch eine kombinierte Beschichtung auf Katheterballons verwendet wurde, konnte kein Defekt der Phospholipid-Monoschicht nach Ballonexpansion beobachtet werden.
Überraschenderweise zeigte sich, dass nitrierte Phospholipide eine niedrige Dissoziationsrate aus einem Monoschicht-Assembly ausweisen als vergleichbare nicht-nitrierte Phospholipide. Dieser Effekt kann der dichteren Packung von nitrieren Phospholipiden und den stärkeren hydrophoben Adhäsionskräften zugeschrieben werden (Beispiel 3). Über einen relevanten Effekt eines Stickstoffoxids ist in diesem Zusammenhang nichts bekannt. Die Zahl der Nitrogruppen vor und nach den Zellexperimenten war fast gleich. Es ist weiterhin unwahrscheinlich, dass eine pharmakologisch relevante Konzentration an nitrierten Phospholipiden in die Zellmembranen der adhärierenden Zellen eingefügt wurde, wie durch Experimente mit radioaktiv markierten nitrierten Phospholipiden gezeigt wurde (Beispiel 4).
SAM aus Phospholipiden mit variierenden Mengen von nitrierten Phospholipiden zeigten einen vernachlässigbaren Größe an Plasmaproteinadsorption, was noch der Fall war wenn nur Nitrocarbonsäuren-enthaltende Phospholipide benutzt wurden (Beipiel 5).
Zelladhäsionsexperimente auf künstlichen Oberflächen mit SAM-Beschichtung, die Nitrocarbonsäuren-enthaltende Phospholipide enthalten zeigen signifikante Unterschiede zu SAM ohne Nitrocarbonsäuren-enthaltende Phospholipide. Während nicht-Nitrocarbonsäuren-enthaltende Phospholipide mit einer Cholinkopfgruppe die Adhäsion von glatten Gefäßmuskelzellen und Endothelzellen hemmen, befähigte die Zufuhr von nitrierten Phospholipiden mit einer Cholinkopfgruppe zu einer SAM- Beschichtung zur Bildung von Adhäsionsstellen dieser Zellen, die eine Zellmigration erlauben. Dieser Effekt kann durch Zusatz von hydrophoben Molekülen wie Cholesterol zu Monoschichten aus nitrocarbosäureenthaltenden Phospholipiden noch verstärkt werden. Zusätzlich konnten Endothelzellen immobilisiert werden, die sich zu einer geschlossenen Schicht von Zellen zusammenfanden. Dazu kommt, dass Endothelzellen, die an ein SAM mit nitrierten Phospholipiden adhärierten, signifikant weniger Zelladhäsionsmoleküle exprimierten als Zellen, die sich an Phospholipid-beschichtete Oberflächen ohne nitrierte Carboxyl ketten adhärierten. Weiterhin zeigte sich, dass glatte Gefäßmuskelzellen (VSMC), die auf einer synthetischen Oberfläche mit Phospholipid SAM wachsen durften und während der Zellmigration und Proliferation mit Wachstumsfaktoren stimuliert wurden, eine signifikant niedrigere Proliferationsrate und eine niedrigere Produktion von extrazellulären Matrixproteinen aufweisen, wenn SAM Nitrocarbonsäuren- enthaltende Phospholipide enthielten (Beispiel 6).
Die biopassivierenden Eigenschaften der nitrierten Phospholipide bewirken eine erhöhte Überlebensrate von Zellen (z.B. Makrophagen) durch eine geringere Apoptoseinduktion im Vergleich einer Beschichtung aus nichtnitrierten Phospholipiden. Die höhere Überlebensrate bedingt eine geringere Zytokinproduktion, wodurch die mögliche Immunreaktionen am Ort des Implantats geringer sind und hierdurch ein gewebsproliferirender Reiz durch das Implantat ausbleibt (Beispiel 7). Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse überraschend und unerwartet, dass Beschichtungen aus SAM mit nitrierten Phospholipiden das Zell-Homing von Zellen wie z.B. VSMC und Endothelzellen verbessern, während Zellantworten auf eine künstliche Oberfläche verringert werden durch die Bereitstellung einer hoch- biokompatiblen Oberfläche ohne pharmakologische Effekte. Weiterhin wurde überraschend festgestellt, dass Zellen, die an SAM mit nitrierten Phospholipiden adhärieren weniger stark durch Zytokine und immunologische Stimuli stimulierbar sind als Zellen auf vergleichbaren SAM aus Phospholipiden ohne nitrierten Carboxyl ketten wachsen. Darum kann eine solche Beschichtung für eine Biopassivierung benutzt werden.
Überraschenderweise ist es möglich durch die physiko-chemischen Eigenschaften von Phospholipiden, die mindestens eine nitrierte Kohlenstoffkette aufweisen, künstlich hergestellte Phospholipidbeschichtungen aber auch Phospholipidmem- branen von Zellen zu stabilisieren und hierdurch eine Biopassivierung zu erzeugen, die zum einen eine verminderte Zell/Gewebereaktion auf den Kontakt mit derartig beschichteten Implantatoberflächen bedingt und zum anderen auch zum Schutz und zur Behandlung von Zell-/Gewebeschäden eingesetzt werden kann. Synthetische und natürliche Phospholipide mit Nitrogruppen-freien Kohlenstoffketten, d.h. mit nicht nitrierten Fettsäureresten zeigen derartige Effekte nicht oder nur in deutlich vermindertem Maße. Dieser Aspekt wird im Folgenden noch weiter ausgeführt. Unterschiede physikalischer und biologischer Effekte von Nitrocarbonsäure(n)- enthaltenden Phospholipiden zu Vergleichssubstanzen.
Natürlich vorkommende und synthetische Phospholipide (PL) wurden zur Beschichtung von Implantationsmaterialien vorgeschlagen. In einer anderen Offenbarung wurden freie nitrierte Fettsäuren zur Hemmung eines aggressiven Heilungsmusters vorgeschlagen. Für derartige Beschichtungen von medizinischen Implantatmaterialien wurde eine Verbesserung der Biokompatibilität gegenüber der Verwendung der unbeschichteten Materialien angenommen. Gleichwohl konnte soweit für die verwandten Phospholipide, wie eingangs erläutert, eine klinisch belegbare Verbesserung nicht darstellt werden. Für kovalent gebundene oder durch Polymerisation immobilisierte Phospholipide sind biopassivierende Effekte, wie sie hier offenbart werden, weder belegt noch für einen Fachmann zu ewarten gewesen. Zur Erlangung der beschriebenen Effekte ist eine Interaktion zwischen den erfindungsgemäßen Phospholipiden und den Zell/Gewebestrukturen erforderlich, wozu diese Moleküle in ungebundener Form vorliegen sollten oder müssen. Es existieren einige wenige Untersuchungen zu den Effekten von nicht nitrierten Phospholipiden auf Modellphospholipidmembranen. Aus den Untersuchungen zu den erfindungsgemäßen Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden geht hervor, dass sowohl der Membranschmelzpunkt als auch andere physiko-chemische Parameter von Modellmembranen sowie Effekte von Membranen von lebenden Zellen sich vollständig anders darstellen als dies bei gleichartigen Phospholipiden ohne Nitrierung eines Fettsäurerestes zu erwarten gewesen wäre. Dies trifft insbesondere für die Veränderungen der Membrananisotropie zu, die sich auch gegensätzlich zu beschriebenen Veränderungen, die für eine Verteilung von NO- Radikalen in Modellmembranen gefunden wurde, verhält.
Zur Klärung von Gemeinsamkeiten, Unterschieden und Besonderheiten wurden die erfindungsgemäßen Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipide im direkten Vergleich mit vergleichbaren natürlichen Phospholipiden sowie Fettsäuren mit oder ohne Nitrierung untersucht. Die wesentlichen Ergebnisse sind im Folgenden zusammengefasst:
1. Die freien Fettsäuren (nativ oder nitriert) werden von Zellen in erheblich stärkerem Maß aufgenommen als Phospholipide wobei intrazelluläre Vesikel gebildet werden. Dies ist verbunden mit einer erheblich geringeren Toxizitätsgrenze und einer deutlichen Erhöhung der Apoptoserate. Aber auch native Phospholipide werden von Zellen in die Zellmembran aufgenommen, wodurch sie sich vergrößern. Dies kann in der Folge die Bereitschaft zur Zellteilung fördern. Ein derartiges Verhalten lag bei den Nitrocarbonsäure(n)- enthaltenden Phospholipiden nicht vor (Beispiel 8, 16).
2. Die Aufnahme von nativen freien Fettsäuren und Phospholipiden in die Zellen ist verbunden mit einer Steigerung der Zellproliferation. Erst bei toxischen Konzentrationen wirken die nativen Fettsäuren proliferationshemmend. Die Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipide zeigen einen proliferationshemmenden Effekt bereits weit unter der Toxizitätsgrenze (Versuche 6, 8, 9). Im Vergleich zu den Vergleichssubstanzen waren Zellen, die mit Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden inkubiert wurden, deutlich starker an einer Oberfläche adhärent.
3. Die physiko-chemischen Eigenschaften der Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipide unterscheiden sich erheblich von den entsprechenden nicht nitrierten Phospholipiden (PL) aber auch im Vergleich zu den freien Nitrofettsäuren. So konnte gezeigt werden, dass im Falle einer Beschichtung mit Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden diese eine deutlich höhere Adhärenz an das Beschichtungsmaterial aufweisen, wodurch der Erhalt der Gleitfähigkeit deutlich stärker und länger anhält als dies mit den vergleichbaren Substanzen der Fall war (Versuch 10, 12).
4. Vorgenannte Unterschiede können zum Teil auch durch ein unterschiedliches Adsorbtionsverhalten von Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden im Vergleich zu natürlichen PL gegenüber Serumproteinen erklärt werden (Versuch 5). Sowohl Unterschiede im Adhäsionsverhalten von Zellen bei einer Beschichtung mit nitrierten und nativen PL als auch ein zellmembranstabilisiernder Effekt können für die gefundenen Unterschiede auf die Freisetzung von Zytokinen (Versuch 7) als auch die Unterschiede bei der Zelladhäsion (Versuch 6, 9) angenommen werden.
Unterschiedliche physiko-chemische Eigenschaften erhalten bzw. schützen und stabilisieren auch Zellmembranen bei einer Inkubation mit Nitrocarbonsäure(n)- enthaltenden Phospholipide im Vergleich zu nicht nitrierten PL aber auch zu freien Nitrofettsäuren. So konnte gezeigt werden, dass die Membranstabilität gegenüber osmotischem Druck, fluidisierenden Toxinen sowie gegenüber erhöhtem Druck und thermischen Veränderungen durch die Nitrocarbonsäure(n)- enthaltenden Phospholipide erheblich gesteigert wurde (Versuche 10, 1 1 , 13, 14, 15, 16, 18, 20, 21 , 22).
Die Abscheidung von Mikropartikeln setzt eine partielle Ausstülpung der Zellmembran voraus und ist daher stark von den physiko-chemischen Membraneigenschaften abhängig. Auch für die Abscheidung von Mikropartikeln konnten deutlich differente Werte zwischen Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden, natürlichen PL und den freien Nitrofettsäuren gefunden werden, die mit den vorgenannten Veränderungen der Membraneigenschaften in Einklang stehen (Versuch 10, 14, 15).
Auch die Nozeption und transmembranäre Signaltransduktion wird durch die physiko-chemischen Eigenschaften der Zellmembran maßgeblich beeinflusst. Dabei spielt die Öffnung von lonenkanälen eine herausragende Rolle. Es konnte gezeigt werden, dass die transmembranäre lonenkanalöffnung, die bei verschiedenen Bedingungen beobachtet wird, z.B. im Rahmen einer Hypoxie, einer mechanischen Zellalteration oder einer Rezeptorerregung, zu einem erheblichen Teil durch die Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipide reduziert wird (Versuchel O, 1 1 , 13, 16, 17, 19, 20).
Zellmembranen erfahren eine erhebliche physikalische Belastung bei Unter- und Überschreiten des Gefrierpunktes des Zytosols aber auch der membrangebundenen Wassermoleküle, wodurch es zu Zellwanddurchlässigkeiten bis hin zur Zytolyse kommt. Die zusätzliche Bereitstellung von natürlichen Phospholipiden vor einer Cryokothermie hat hierauf keinen Einfluss. Für die erfindungsgemäßen nitrierten Phosholipide konnte ein cryokonser- vierender Effekt eindeutig belegt werden, wobei auch gezeigt werden konnte, dass die wiedererwärmten Zellen aufgrund der Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipide zum großen Teil funktionstüchtig blieben (Versuch 18, 21 , 22). Untersuchungen zur Langzeitstabilität der natürlichen und der Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipide wiesen bei den Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden eine deutlich geringere Tendenz zur Transisomehe der nitrierten Fettsäuren auf (Versuch 12). Da für die zelluläre Aufnahme von Transfettsäuren adverse biologische Effekte beschrieben sind, ist eine Vermeidung der Bereitstellung von Transfettsäuren vorteilhaft. Die erfindungsgemäßen Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipide haben unter verschiedenen Bedingungen biokompatible, biopassivierende aber auch proliferationsminderde Effekte gezeigt. Es kann daher angenommen werden, dass diese Effekte auch auf andere Zellformen und klinische Situationen übertragbar sind, wo insbesondere ein biopassivierender Effekt erwünscht wird.
Ein Aspekt der Effekte von Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden ist ihre biopassivierende Wirkung auf die Reaktion des Organismus auf ein Trauma/Intoxikatuion bzw. eine Fremdoberfläche. Durch eine Biopassivierung wird bei den Zellen oder Geweben, die mit der beschichteten Oberfläche in Kontakt kommen, vorzugsweise keine oder fast keine pathologisch veränderte Reaktion hervorgerufen. Dadurch kommt es beispielsweise zu einer Einheilung der Fremdoberfläche, die durch eine geringere Gewebeproliferation charakterisiert ist. Dies führt zu einer Endotheliarisierung/Einheilung des derart beschichteten Materials, mit einer physiologisch erforderlichen Menge an Zellen/Matrixproteinen. Somit wird indirekt ein anti-restenotischer Effekt erzielt, sodass durch die biopassivierenden Eigenschaften derartig beschichteter Gefäßimplantate diese die Fähigkeit erhalten, Symptomen einer Restenose, also dem Überwachsen des implantierten Stents und Zuwachsen der durch den Stent stabilisierten Stelle, passiv vorzubeugen, zu hemmen oder zu stoppen.
Überraschend wurde gefunden, dass Phospholipide, die Nitrocarbonsäuren enthalten, durch ihre Eigenschaften für Beschichtungen von Medizinprodukten geeignet sind, weil sie über passive Mechanismen einer Restenose bzw. Überwuchs des Medizinprodukts und Blutgerinnung sowie Zellschäden am Ort der Implantation des Medizinprodukts entgegenwirken.
Ein weiterer Aspekt der Effekte von Phospholipiden mit Nitrocarbonsäuren ist ihre Wirkung auf die Freisetzung und Zusammensetzung von Mikropartikeln, die von traumatisierten Zellen abgeschieden werden. Hierbei kommt es möglicherweise zu einer Aufnahme / einem Einbau von Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden in Zellmembranen, was einen passiven Effekt auf die lokalen als auch systemischen Gewebeantworten haben könnte. Dabei kann ein Einfluss der in die Mikropartikel eingeschlossenen Proteine ebenfalls angenommen werden. Das betrifft besonders Glycoprotein Gewebefaktoren, deren biologische Aktivität durch Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipide passiv gehemmt wird. Ein weiterer Effekt ist die Stabilisierung von Zellmembraneigenschaften (Widerstand gegen mechanische, chemische, osmotische oder elektrische Irritationen als auch gegen mechanisches, chemisches, osmotisches oder elektrisches Trauma) und Funktionalität (Membranpotential, Regulierung von lonenkanälen, Signalmembrantransduktion).
Eine Gewebehypoxie führt rasch zu Veränderungen in den Zellmembranen. So werden Phospholipasen aktiviert, die Fettsären aus den Phospholipiden freisetzen. Eine hierdurch bedingte Erhöhung der Konzentration an Lysophospholipiden ist mit einem Reperfusionsschaden verbunden. Während eine Aufsättigung von Zellmembranen mit natürlichen Phospholipid (PL) vor einer Ischämie keinen relevanten Einfluss auf die Ischämietoleranz und den Reperfusionsschaden aufwies, konnte überraschenderweise eine deutliche Minderung der Hypoxie bedingten Zellschädigung durch die erfingsgemäßen Verbindungen dargestellt werden. Die für die Evaluation des Reperfusionsschades durchgeführte Analytik ist aufgrund der unter ex-vivo-Bedingungen durchgeführten Versuche eingeschränkt. Gleichwohl ist in der Literatur belegt, dass das Ausmaß des Reperfusionsschadens mit dem Verlust an NAD+ im Zytoplasma sowie intramitochondrial korreliert ist. Somit kann eine Reduktion des Hypoxie/Reperfusions-Schadens durch eine Aufnahme von Nitrocarbonsäure(n)- enthaltenden Phospholipiden angenommen werden. Ferner trägt die durch die erfindungsgemäßen nitrierten Phospholipide erzeugte Reduktion des Metabolismus zu einer Minderung der Hypoxie-bedingten Schädigungen bei.
Die erfindungsgemäßen Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipide haben auf Phospholipidmembranen vorteilhafte Eigenschaften, welche sich als zellprotektiv, biokompatible, und biopassivierend zusammenfassen lassen, wobei das gemeinsame erfinderische Konzept unter dem Begriff Biopassivierung zusammengefasst werden kann.
Somit eignen sich die erfindungsgemäßen Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipide für biopassivierende oder biokompatible Verwendungen wie z.B. zur Herstellung von medizinischen Zusammensetzungen und zur Beschichtung von Medizinprodukten.
Aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften eignen sich die Nitrocarbonsäure(n)- enthaltenden Phospholipide besonders für bioneutrale Monoschichten oder Doppelschicht-Beschichtungen von medizinischen Implantaten.
Demgemäß ist die vorliegende Erfindung auch auf Medizinprodukt gerichtet, die mit mindestens einem Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipid beschichtet sind. Eine derartige Beschichtung liegt vorzugsweise als Monoschicht, Doppelschicht oder Mehrfachschicht vor und weist biopassivierende Eigenschaften auf. Auf oder in dieser Besch ichtugn können noch Wirkstoffe enthalten sein, wie beispielsweise anti- restenotische Wirkstoffe, was bei Katheterballons und kardiovaskulären Implantaten vorteilhaft ist und weiter unten noch eingehender ausgeführt wird. Medizinprodukte
1 . Implantatbeschichtungen
Bevorzugte Implantatmaterialien sind Stents, die in Hohlorgane eingebracht werden, um sie offen zu halten. Stent werden praktischerweise in Röhrchenform hergestellt und bestehen klassischerweise aus einem Gittergerüst aus Streben. Stents dienen zu Gefäßstabilisierung, besonders um sie offen zu halten, was speziell für Blutgefäße, besonders für Herzkranzgefäße, wichtig ist, um sie offen zu halten oder nach einer Aufdehnung durch Ballonkatheter den erneuten Verschluss (Restenose) zu verhindern. Stents können weiterhin zur Stabilisierung von Atemwegen, der Speiseröhre oder den Gallenwegen dienen. Die Beschichtung von Stents ist gemäß der Erfindung bevorzugt.
Erfindungsgemäß sind Stents, die in Blutgefäße eingebracht werden, besonders bevorzugt.
Ballonkatheter sind gemäß der Erfindung ebenfalls bevorzugte medizinische Produkte.
Weiter bevorzugte Instrumente und Implantatmaterialien sind solche, die während chirurigscher, plastischer oder kosmetischer Prozeduren zu einer Gewebetraumatisierung führen in Form von Schnittwunden, Zerreißungen, Resektionen, Verbindungen und Verschlüssen, Graft- und Protheseneinlagen Die Implantate betreffen besonders aber nicht ausschließlich Weichteilimplantate, hier besonders Brustimplantate, Gelenk- und Knorpelimplantate, Grafts biologischer oder artifizieller Herkunft, intraocculäre Linsen, chirurgische Netze und Adhäsionsbarrieren, Nervenregenerationsconduite, Shunts, Gefäßleiter biologischer oder artifizieller Herkunft Katheter, Sonden, Ports, Drainagen, Stomaverbindungen, endoluminale Röhren, Nahtmaterialien, Ligaturen, implantierbare Geräte wie Defibrillatoren, chirurgische Instrumente wie Haken und Pinzetten.
2. Wunddressingmaterialien
Ein weiteres Anwendungsgebiet stellt die Bereitstellung von Nitrocarbonsäure(n)- enthaltenden Phospholipide für Gewebe/Organsysteme dar, die durch Aufnahme dieser Phospholipide oder die durch Beschichtung ihrer Oberfläche mit den Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden eine verbesserte Toleranz gegenüber metabolischen, physikalischen und chemischen Alterationen zeigen. Hierdurch kommt es zu einer Passivierung dieser Zellen gegenüber körpereigenen (z.B. Zytokinen, Wachstumsfaktoren) oder körperfremden (z.B. Toxine) Substanzen, die ansonsten zu einer Zellproliferation oder Apoptose/Nekrose führen. Diese dokumentierten Effekte unterscheiden sich substantiell von den Effekten natürlich vorkommender Phospholipide aber auch von Effekten von nitrierten Fettsäuren.
Dies reduziert zum einen zelldestruierende Effekte und reduziert zum anderen endogene oder exogene Effekte, die ein unphysiologisches hyperregeneratisches Heilungsmuster bewirken. Dabei ist es unerheblich, ob das Gewebe/Organtrauma durch physikalische (z.B. mechanisch, thermisch), chemische oder elektrische Mechanismen verursacht wird/wurde. Als Beispiele sollen hier angeführt werden: Schnitt- und Quetschwunden, Verbrennungen, Erfrierungen, Verätzungen, Ulkerationen, Bestrahlungen sowie Allergen- und Toxinexpositionen.
Dies betrifft Wundversorgungspräparationen, die auf Trägermaterialien aufgebracht sind oder in pharmazeutischen Präparationen enthalten sind und oberflächlich auf ein Gewebe aufgebracht oder in den Organismus eingebracht werden.
Darüberhinaus können die dokumentierten antiadhäsiven Effekte von Materialien, die mit Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden beschichtet sind, zu einer besseren Wiederablösbarkeit von Wundversorungsmaterialien führen. Ferner tragen diese Effekte zu einer Reduktion der Ausbildung von Verwachsungen/Verklebungen (Briden) bei.
Die physikalischen Eigenschaften der nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipide können dabei auch eingesetzt werden, um eine verzögerte Auflösung/Freisetzung von Stoffen aus einem Gemisch zu bewirken, sowie deren physikalische Stabilisierung zu bewirken. Besonders bevorzugte Anwendungsgebiete erstrecken sich auf chirurgische Behandlungsverfahren, bei denen Gewebe getrennt oder verbunden wird, insbesondere wenn diese Trennung/Verbindung in Zusammenhang mit einem Trauma oder einer sonstigen chemischen oder physikalischen Irritation des Gewebes vorkommt und schließt insbesondere plastisch-rekonstruktive sowie kosmetische Eingriffe mit ein.
Bevorzugte Wundversorungsmaterialien sind: Wundauflagen in Form von Gelen, Tabletten, Kolloiden, Klebstoffen, Aglinaten, Schäumen, Adsorbentien, Gazen, Baumwolltupfer und Verbänden. 3. Präparationen zur Gewebe-/Organprotektion
Medizinische Maßnahmen bedingen häufig die Notwendigkeit einer passageren Unterbrechung der Blutzufuhr von Geweben oder Organen. Beispiele hierfür sind die Gewinnung von Gefäß- oder Organtransplantaten. Eine Vorbehandlung solcher Gewebe/Organe mit Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden bewirkt eine Verlängerung der Ischämietoleranz, sodass eine Vorbehandlung solcher Gewebe sinnvoll ist. Dies kann in Form einer zuvorigen Perfusion des Gewebes/Organs aber auch einer Installation oder Einlegen in eine Lösung mit Nitrocarbonsäure(n)- enthaltenden Phospholipiden erfolgen, da die Phospholipide rasch aus dem Umgebungsmedium aufgenommen werden bzw. sich auf der Zell- und/oder Gewebeoberfläche auflagern.
Eine spezielle Situation stellt der Schutz von vitalem Gewebe vor dem Zelluntergang bei einer längeren Hypoxiedauer dar. Hierzu werden die betroffenen Gewebe/Organe gekühlt bzw. gefrohren. Bei Temperaturen unter 10 °C kommt es aber in Abhängigkeit von Gewebe und den Konservierungsbedingungen zu einem Untergang von Zellen. Es konnte gezeigt werden, dass Nitrocarbonsäure(n)- enthaltende Phospholipide auch in der Lage sind, die Zellwandintegrität während der Kühl- und Wiederaufwärumgsphase deutlich besser zu bewahren, als dies mit natürlichen Phospholipiden der Fall ist. Somit eignen sich die Nitrocarbonsäure(n)- enthaltenden Phospholipide über die zuvor berichteten Vorbereitungsmaßnahmen auch für eine Kryokonservierung von Geweben/Organen.
4. Präparationen zur Stabilisierung von Zellmembranfunktionen und Zellmembranitegrität.
Zellmembranen weisen vielfältige Funktionen und Aufgaben auf. Viele dieser Funktionen werden durch physikalische Eigenschaften der Zellmembranen bedingt/verändert. Hierzu gehört die mechanische Stabilität gegenüber physikalischen und chemischen Alterationen. Aber auch Interaktionen zwischen den Alkylketten und Membranproteinen haben einen Einfluss auf die Funktionalität von lonenkanälen und Rezeptorproteinen.
Durch Aufnahme von Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden und den daraus resultierenden Änderung der Membraneigenschaften ist es möglich, einige dieser Membranfunktionen zu beeinflussen. So konnte belegt werden, dass Veränderungen, die zu einer Störung des Membranpotentials führen verringert werden können, wodurch Nitrocarbonsäure(n)-enthaltende Phospholipide antiarhythmische Eigenschaften erglangen. Ferner konnte nachgewiesen werden, dass prinzipiell zelltoxische Substanzen, die über verschiedene Mechanismen durch eine intakte Zellmembran aufgenommen werden durch eine zuvorige Aufnahme von Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden in die Zellmembran, die Aufnahme/Wirkung derartiger Toxine deutlich reduziert werden kann.
Ferner resultiert aus der Aufnahme von Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden eine stärkere Resistenz gegenüber einem osmotischen Gradienten. Zusätzlich hat die Stabilisierung der Zellmembran einen signifikanten Effekt auf lonenaknäle, insbesondere auf solche, die eine Veränderung der intrazellulären Calciumkonzentrationen bewirken, wodurch sich auch z. B. antiarrhytische Effekte und eine Inhibition der Degranulation von eosinen Zellen bewirken lassen.
Darüber hinaus zeigen die Untersuchungen, dass über die voranstehenden Veränderungen der Membraneigenschaften durch die Nitrocarbonsäure(n)- enthaltenden Phospholipide auch eine Beinflussung der Zel I reag i bil ität/Nozeption auf endogene oder exogen Stimulatoren und Inhibitoren besteht. So bewirkt z. B. die verminderte Nocizeption von TNF alpha oder TGF-ß einen antifibrotischen Effekt. Durch pharmazeutische Formulierungen, die eine Bereitstellung von Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden für Gewebe gewährleisten, kann eine Stabilisierung der Zellmembranen erreicht werden, die für prophylaktische und therapeutische Gewebewirkungen genutzt werden kann. Diese Effekte sind auf die folgenden Indikationen nicht beschränkt:
Frost- und Verbrennungsschäden, Säure- oder Alkaliverätzung, chronischen Überlastungsschäden wie Tendinitiden und Faszikulitiden, fibrosierende Erkrankungen wie die Osteomyelofibrose oder die interstitielle Lungenfibrose, Herzrhythmusstörungen wie Vorhofextrasystolie, Vorhofflattern Iimmern, ventrikuläre Extrasystolie, Kammerflimmern, allergische Reaktionen wie Urtikaria, allergische Rhinitis/Konjunktivitis, Astha bronchiale, Anaphylaxie; Gastro- Enteropathien wie tropische Sprue oder Zoeliakie, Intoxikationen mit Tier- oder Pflanzengiften, Chemikalien, sowie toxinbildenden Bakterien oder Mikroorganismen, chronisch hyperregeneratorische Erkrankungen wie Psoriasis, Riesenzellarteriitis, aber auch primär atrophische Erkrankungen wie die atrophische Dermatitis und die Sudecksche Atrophie. Schmerzsyndrome wie Neurophathien oder eine Meralgia parästhetika.
Mit Hilfe der Imprägnierlösungen für Verbands-, Wund- und Nahmaterialien, die die erfindungsgemäßen nitrierten Phospholipide enthalten, können neben den bislang genannten Medizinprodukten insbesondere sämtliche nicht starren Träger, welche sich einer vorgegebenen Oberfläche anpassen und diese weitestgehend abdecken mit den erfindungsgemäßen Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden beschichtet werden. Die erfindungsgemäßen vorzugsweise biologisch abbaubaren Medizinprodukte sind somit auswählbar aus der Gruppe umfassend oder bestehend aus: medizinischem Zellstoff, Verbandsmaterialien, Wundeinlagen, chirurgischem Nahtmaterial, Kompressen, Schwämmen, medizinischen Textilien, Salben, Gelen oder filmbildende Sprays.
Der medizinische Zellstoff und die medizinischen Textilien stellen vorzugsweise zweidimensionale Strukturen mit geringer Dicke dar, welche mit den Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden imprägniert sind. Die Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden lagern sich an die Faserstrukturen dieser Medizinprodukte an, welche in trockener oder vorbefeuchteter Form verwendet werden können.
Eine bevorzugte Form von erfindungsgemäßen Medizinprodukten sind Schwämme oder allgemein biologisch abbaubare poröse dreidimensionale Strukturen, welche die Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden sowohl auf der Oberfläche als auch im Inneren der porösen Struktur in den Hohlräumen enthalten können. Diese Schwämme können z.B. nach einer Operation in die Wunde gelegt werden und füllen den Operationsraum weitgehend oder auch nur teilweise aus. Aus diesen schwammartigen Strukturen können die Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden freigesetzt werden, wobei die Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden aber auch in fest gebundener Form vorliegen können. Die Freisetzung kann sowohl durch Diffusion von nur locker gebundenen Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden aus den Hohlräumen der porösen Struktur als auch durch biologischen Abbau der Schwammstruktur erfolgen.
Als geeignetes Medizinprodukt wird hierin auch ein Träger mit den Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden bezeichnet und als "Träger" dienen u.a. die hierin ausführlich beschriebenen Geweben, Zellstoffe, Gele, filmbildende Zusammensetzungen, usw., welche biologisch abbaubar oder biostabil sein können. Die Träger können auch aus lebender Materie bestehen und können Röntgenmarker oder Kontrastmittel enthalten. Ferner lassen sich wie weiter unten beschrieben, auch pharmakologische Wirkstoffe in das Medizinprodukt einbringen, welche durch Diffusion und/oder biologischen Abbau des Trägers freigesetzt werden können.
Als "Gewebe" wird hierin jedes medizinisch verwendete Textil oder Zellstoff bezeichnet, woraus Verbandsmaterialien, Wundauflagen, Verbände oder andere medizinische Tücher oder Stoffe hergestellt werden.
Polyhydroxybutyrate und Cellulosederivate, Chitosanderivate als auch Collagen, Polyethylenglykol, Polyethylenoxid und Polylactide sind bevorzugte Materialien für die medizinischen Zellstoffe und Textilien. Werden Alginate als Wundauflage verwendet, werden bevorzugt Calciumalginat mit Natriumcarboxymethylcellulose verwobene Produkte verwendet. Hierbei ist das SeaSorb Soft der Firma Coloplast als Beispiel zu nennen.
Falls die Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden auf Wundverbände und/oder Wundeinlagen aufgebracht werden, sind besonders die Produkte Tabotamp® und Spongostan® der Firma Johnson und Johnson zu erwähnen. Diese Produkte werden durch kontrollierte Oxidation aus regenerierter Cellulose hergestellt. Chirurgisches Nahtmaterial kann man hinsichtlich seines Aufbaus in monofile und in polyfile Fäden unterteilen. Polyfile Fäden können einen so genannten Dochteffekt zeigen. Das bedeutet, durch Kapillarwirkung wandert Gewebsflüssigkeit entlang des Fadens. Damit kann auch eine Migration von mikrobiellen Keimen verbunden sein, so dass sich entlang des Fadenmaterials Infektionen ausbreiten können. Es ist daher wünschenswert, chirurgisches Nahtmaterial so auszurüsten, dass eine Keimbesiedelung auf der Fadenoberfläche und damit eine Migration von Keimen entlang des Fadens wirksam verhindert werden. Zur Beschichtung bzw. Imprägnierung des chirurgischen Nahtmaterials wird das Nahtmaterial mit einer homogenen methanolischen Lösung enthaltend mindestens ein Nitrocarbonsäure(n)- enthaltendes Phospholipid benetzt und anschließend das Methanol verdampft, wobei sich eine Beschichtung auf der Fadenoberfläche ausbildet. Es ist auch möglich, anstelle von Methanol anderen niederen Alkoholen, wie Ethanol, Propanol und Isopropanol oder deren Gemische mit Methanol einzusetzen. Bevorzugt werden die Nitrocarbonsäuren enthaltenden Phospholipiden Desinfektionslösungen zugesetzt, wie Octenidindichlorid-Lösungen (z.B. unter dem Namen OcteniseptBvon der Firma Schüle & Mayr vertrieben) oder Dequaliniumchlorid-Lösungen zugesetzt. Das Gewichtsverhältnis von Octenidindichlorid oder Dequaliniumchlorid zu Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden beträgt vorzugsweise 1 zu 0,1 bis 1 zu 5 und ist besonders bevorzugt 1 zu 1 . Falls chirurgisches Nahtmaterial mit den Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden imprägniert werden soll, werden Nahtmaterialien verwendet, die bevorzugt aus Polyglykolsäure, Polycaprolacton- Coglykolid, oder aus Poly-p-dioxanon bestehen. Als Beispiele seien hier die Produkte Marlin®, PCL und Marisorb® der Firma Catgut GmbH genannt.
Falls Kompressen mit den Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden I imprägniert werden sollen, sind hier besonders sterile Mullkompressen aus 100 % Baumwolle zu verwenden. Als Beispiele seien hier die Produktlinien Stericomp® und Askina® genannt.
Falls medizinischer Zellstoff verwendet wird, ist ein solcher, der einen Anteil von mehr als 90% Zellulose besitzt, bevorzugt. Falls medizinische Textilien verwendet werden, sind Trevira®-Produkte bevorzugt.
Die medizinischen Textilien und Zellstoffe werden mit einer Lösung der Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden in Wasser, organischen Lösungsmitteln wie Ethanol oder Gemischen hieraus besprüht oder darin getaucht, wobei der Tauch- oder Sprühvorgang nach dem Trocknen des Medizinproduktes mehrmals wiederholt werden kann. Pro cm2 Oberfläche des Medizinproduktes werden 10 g bis 100 mg an Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden aufgetragen. Bei den medizinischen Schwämmen handelt es sich um bioresorbierbare Implantate mit schwammartiger, poröser Struktur. Bevorzugte Materialien für die medizinischen Schwämme sind Collagen, oxidierte Cellulose, Chitosan, Thrombin, Fibrin, Chitin, Alginate, Hyaluronsäure, PLGA, PGA, PLA, Polysaccharide und Globin. Falls medizinische Schwämme verwendet werden, sind solche, die einen Anteil von mehr als 90% Kollagen besitzen, bevorzugt.
Falls die Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden in Salben eingebracht werden, kann eine Salbengrundlage verwendet werden enthaltend oder bestehend aus gereinigtem Wasser in einer Menge von bevorzugt 5 - 50 Gew. %, besonders bevorzugt von 10 - 40 Gew. % und am meisten bevorzugt von 20 - 30 Gew. %. Die Salbe enthält zudem bevorzugt noch Vaseline in einer Menge von 40 - 90 Gew. %, besonders bevorzugt von 50 - 80 Gew. % und am meisten bevorzugt von 20 - 60 Gew. %. Zudem kann die Salbe noch dickflüssiges Paraffin in einer Menge von 5 - 50 Gew. %, besonders bevorzugt von 10 - 40 Gew. % und am meisten bevorzugt von 20 - 30 Gew. % enthalten. Weiterhin können Gelbildner und/oder Filmbildner in einer Menge von bis zu 30 Gew.-% zugesetzt werden. Zudem können Polymere wie beispielsweise Cellulose, Chitosan, Thrombin, Fibrinogen, Chitin, Alginate, Albumin, Hyaluronsäure, Hyaluronan, Polysaccharide, Globin, Polylactid, Polyglykolid, Polylactid-co-glykolid, Polyhydroxybutyrate, Cellulosederivate, Chitosanderivate, Polyethylenglykol und Polyethylenoxid in Mengen bis zu 30 Gew.-% eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäße(n)-Nitrocarbonsäuren enthaltenden Phospholipide können auch in Sprühlösungen eingebracht werden oder Bestandteile von filmbildenden Sprays sein. Zur besseren Stabilisierung der filmbildenden Sprays können die hierin beschriebenen Nitrocarbonsäuren enthaltenden Phospholipiden mit Gel- oder Filmbildnern kombiniert werden. Filmbildende Sprays enthalten mindestens einen oder mehrere Filmbildner. Geeignete Filmbildner sind vorzugsweise Stoffe auf Cellulosebasis wie Cellulosenitrat oder Ethylcellulose oder physiologisch unbedenkliche Polymerisate davon, Polyvinylacetat, partiell verseiftes Polyvinylacetat, Mischpolymerisate aus Vinylacetat und Acrylsäure oder Crotonsäure oder Maleinsäuremonoalkylester, ternäre Mischpolymerisate aus Vinylacetat und Crotonsäure und Vinylneodecanoat, oder Crotonsäure und Vinylpropionat, Mischpolymerisate aus Methylvinylether und Maleinsäuremonoalkylester, insbesondere als Maleinsäuremonobutylester, Mischpolymerisate aus Fettsäurevinylester und Acrylsäure oder Methacrylsäure, Mischpolymerisate aus N-Vinylpyrrolidon, Methacrylsäure und Methacrylsäurealkylester, Mischpolymerisate aus Acrylsäure und Methacrylsäure oder Acrylsäurealkylester oder Methacrylsäurealkylester, insbesondere mit einem Gehalt an quartären Ammoniumgruppen, oder Polymere, Copolymere oder Mischungen, enthaltend Ethylacrylat, Methylmethacrylat oder Trimethylammonioethylmethacrylat-chlorid, oder Polyvinylacetale und Polyvinylbutyrale, alkylsubstituierte Poly-N-vinylpyrrolidone, Alkylester aus Mischpolymerisaten aus Olefinen und Maleinsäureanhydrid, Umsetzungsprodukte von Kolophonium mit Acrylsäure sowie Benzoeharze, Chitosan, Luvimer 100®, Alumniumstearat, Carbomere, Cocamid MEA, Carboxymethyldextran, Carboxymethylhydroxypropyl-Guar oder Rotalgen-Carrageenane. In den vorgenannten Estern sind die Alkylreste gewöhnlich kurzkettig und haben meistens nicht mehr als vier C-Atome.
Zu den Filmbildnern zählen auch wasserlösliche Polymere wie beispielweise ionische Polyamide, Polyurethane und Polyester sowie Homo- und Copolymere von ethylenisch ungesättigten Monomeren. Derartige Stoffe sind zum Beispiel unter den Handelsnamen Acronal®, Acudyne®, Amerhold®, Amphome®, Eastman AQ®, Ladival®, Lovocryl®, Luviflex VBM®, Luvimer®, Luviset P. U. R ®, Luviskol®, Luviskol Plus®, Stepanhold®, Ultrahold®, Ultrahold Strong® oder Versatyl®. Bei Luvimer® handelt es sich um ein Polyacrylat als Hair Styling-Polymer entwickelt von der Firma BASF AG.
Als Lösungsmittel sind Wasser, Ethanol oder Wasser-Ethanol-Mischungen bevorzugt. Die Herstellung der Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden beschichteten Implantate erfolgt mittels Tauch- oder Sprühverfahren. Dabei werden die zu implantierenden Produkte in eine Lösung oder Suspension der Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden eingetaucht oder mit einer entsprechenden Lösung besprüht. Danach werden die Implantate getrocknet und steril verpackt. Die Gele, Salben, Lösungen und Sprays werden erhalten, indem die gewünschte pharmazeutische Zubereitung nach Standardmethoden hergestellt wird und vorzugsweise in einem letzten Schritt die gewünschte Menge an Nitrocarbonsäuren enthaltenden Phospholipiden zugesetzt wird. Bestandteil der vorliegenden Erfindung sind auch die hierdurch erhältlichen erfindungsgemäßen Medizinprodukte. Die erfindungsgemäßen Spüllösungen für Medizingeräte enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Nitrocarbonsäure(n)-enthaltendes Phospholipid können zum Spülen u. Reinigen von Instrumenten u. Zubehör, zum Anfeuchten von Wundtamponaden, Tüchern u. Verbänden, Befüllen vom Atembefeuchtungsgeräten, zur Überprüfung der Durchlässigkeit von Kathetern - Nasenspülung und zur intra- u . postoperativen Spülung bei endoskopischen Eingriffen, Spülen und Reinigen von Wunddrainagekathetern geeignet sein. Die erfindungsgemäßen Spüllösungen für Wunden enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Nitrocarbonsäure(n)- enthaltendes Phospholipid umfassen Spüllösungen zur Spülung und Reinigung bei operativen Eingriffen, Spülen und Reinigen bei Stomaversorgung, zur Spülung von Wunden und Verbrennungen und zur mechanischen Augenspülung verwendet werden. Wundspüllösungen dienen generell zur Entfernung von Zellrückständen, Nekrosen, Blut- und Eiterresten aber auch Reste von Wundauflagen.
Bei Verwendung der Spüllösungen können die erfindungsgemäßen Nitrocarbonsäuren enthaltenden Phospholipide auf den gespülten Oberflächen eine Beschichtung oder einen Film bilden und so eine Biopassivierung der Oberflächen hervorrufen. Geeignete Basislösungen oder Formulierungen, denen die erfindungsgemäßen Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipide zugesetzt werden können und die als Spüllösung Verwendung finden sind z.B. physiologische Kochsalzlösung, Ringer oder Ringer-Lactat-Lösung, Lösungen enthaltend Polyhexanid oder Polyethylenglycol und kommerziell erhältliche Wundspüllösungen wie Prontosan®oder Lavanid®.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung bezieht sich auf die Kältekonservierung biologischer Proben. Der Ausdruck„biologische Proben", wie er hierin verwendet wird, umfasst Zellen, sowohl eukaryotisch und als auch prokaryotische, Organe und Gewebe und biologisch aktive Moleküle, z.B. Makromoleküle wie Nukleinsäuren oder Proteine. Besonders bevorzugt ist die Kältekonservierung menschlicher Embryos und Embryos anderer Säugetiere. Die Lagerung von Zellen im gefrorenen Zustand (Cryo- oder Kälteaufbewahrung) ist ein Verfahren, was üblicherweise zur Langzeitaufrechterhaltung von lebensfähigem Zellmaterial und genetischer Stabilität eingesetzt wird. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht aus einer Cryoprotektionslösung oder einem Kältekonservierungsmedium enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Nitrocarbonsäure(n)-enthaltendes Phospholipid. Die erfindungsgemäßen Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipide wirken sich dabei positiv auf die Überlebensrate der Zellen/Mikroorganismen aus. Cryoprotektionslosungen oder Kältekonservierungsmedien umfassen generell einen Kälteschutz der durch Kryoprotektoren, z.B. Glycerin, Dimethylsulfoxid (DMSO) amorph erstarrenden Disaccharide und Polymere, gewährleistet wird. Cryoprotektionslosungen oder Kältekonservierungsmedien, welche zum Einfrieren von Zellen, Organen und Geweben geeignet sein sollen haben als Basis ein entsprechendes Kulturmedium. Als Kulturmedium können alle gängigen Nährmedien zur Kultur von Mikroorganismen, Zellen und Geweben eingesetzt werden. Daneben können noch enthalten sein: Puffersubstanzen, Indikatoren, Farbstoffe Hemmstoffe (zum Beispiel Antibiotika) oder Wachstumshilfsstoffe (Hormone, Vitamine und dergleichen).
Cryoprotektionslosungen zum Einfrieren von Makromolekülen enthalten als Basis keine Nährmedien sondern bevorzugt wässrige Pufferlösungen. Als Kryoprotektoren für Makromoleküle werden bevorzugt amorph erstarrenden Disaccharide und Polymere eingesetzt.
Bei der Lyophilisation reiner Proteinlösungen treten gelegentlich Instabilitäten der Proteine auf, die durch Zusatz von Lyoprotektoren verhindert werden können. Die erfindungsgemäßen Lyoprotektionslösungen unterscheiden sich von den oben beschriebenen Cryoprotektionslosungen nur durch die verwendeten, stabilisierenden Zusätze. Während die Kryoprotektoren während des Einfrierens die Stabilität gewährleisten werden während einer Trocknung Lyoprotektoren eingesetzt. Lyoprotektoren bilden zu funktionellen polaren Gruppen von Makromoleküle eine Matrix mit Hilfe von Wasserstoffbrücken und fungieren als Wasserersatz. Deshalb kommen hierfür vor allem Moleküle in Frage, die über hydrophile Gruppen verfügen und aufgrund ihrer Struktur ausreichend flexibel sind, um Wasserstoffbrücken zur Oberfläche der Makromoleküle ausbilden zu können. Bevorzugt sind hier Disaccharide und Mannit zu nennen.
Da die Lyophilisation sowohl Einfrieren als auch Trocknungsschritte umfasst, umfasst die vorliegende Erfindung auch Lösungen enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes, Nitrocarbonsäure(n)-enthaltendes Phospholipid und sowohl einen Kryoprotektor als auch einen Lyoprotektor.
Von besonderem Interesse sind erfindungsgemäße Kontrastmittellösungen, die mindestens ein erfindungsgemäßes, Nitrocarbonsäure(n)-enthaltendes Phospholipid und ein Kontrastmittel oder Kontrastmittelanaloga enthalten. Derartige Kontrastmittel und/oder Kontrastmittelanaloga enthalten zumeist Barium, lod, Mangan, Eisen, Lanthan, Cer, Praseodym, Neodym, Samarium, Europium, Gadolinium, Terbium, Dysprosium, Holmium, Erbium, Thulium, Ytterbium und/oder Lutetium bevorzugt als Ionen in gebundener und/oder komplexierter Form.
Bevorzugte Röntgenkontrastmittel sind diejenigen, welche zur Gelenkdarstellung (Arthrographie) und bei der CT (Computertomographie) eingesetzt werden. Als bildgebende Verfahren werden Röntgenaufnahmen, Computertomographie (CT), Kernspintomographie, Magnetresonanztomographie (MRT) und Ultraschall eingesetzt, wobei Kernspintomographie und Magnetresonanztomographie (MRT) bevorzugt sind. Des Weiteren sind iodhaltige Kontrastmittel bevorzugt, welche bei der Gefäßdarstellung (Angiographie und Phlebographie) und bei der CT (Computertomographie) verwendet werden. Als iodhaltige Kontrastmittel können folgende Beispiele genannt werden: Amidotrizoesäure, lotrolan, lopamidol, lodoxaminsäure, Jod-Lipiodol® und Amidotrizoat. Eine weitere Klasse von bevorzugten Kontrastmitteln stellen die paramagnetischen Kontrastmittel dar, welche zumeist ein Lanthanoid wie z.B. Gadolinium (Gd3+), Europium (Eu2+, Eu3+), Dysprosium (Dy3+) oder Holmium (Ho3+) enthalten. Beispiele für Gadolinium-haltige Kontrastmittel sind Gadolinium-Diethylentriaminpentaessigsäure, Gadopentetsäure (GaDPTA), Gadodiamid, Meglumin-Gadoterat und Gadoteridol.
Unter dem Begriff "medizinische Zusammensetzung" oder "Lösung" wie hierin verwendet wird das Gemisch aus mindestens einem erfindungsgemäßen Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipid und einem Lösungsmittel und/oder Hilfsstoff und/oder Träger verstanden, also eine tatsächliche Lösung, Dispersion, Suspension oder Emulsion aus einem Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipid oder einem Gemisch aus verschiedenen Phospholipiden enthaltend Nitrocarbonsäuren und mindestens einem weiteren Bestandteil ausgewählt aus den hierin genannten Lösungsmitteln, Ölen, Fettsäuren, Fettsäureester, Phospholipiden, Aminosäuren, Vitaminen, Kontrastmitteln, Salzen und/oder membranbildenden Substanzen. Der Begriff "Lösung" soll ferner verdeutlichen, dass es sich um ein flüssiges Gemisch handelt, welches jedoch auch gelartig, zähflüssig bzw. pastös (dickviskos oder hochviskos) sein kann. Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Perfusions- und Konservierungslösung enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes, Nitrocarbonsäure(n)-enthaltendes Phospholipid für die Konservierung von Zellen in Abwesenheit einer Blutzufuhr insbesondere bei der Konservierung komplexer Zellsysteme wie Organen oder lebendem Gewebe bereitgestellt. Die Organtransplantation ist heute für Niere, Leber, Herz, Lunge, Bauchspeicheldrüse, Darm, Hornhaut und Haut verfügbar. Bei der Entnahme wird das Gefäßsystem eines Transplantationsorgans mit einer Konservierungslösung perfundiert. Diese Lösung ist dafür ausgelegt, die Temperatursenkung des Organs zu erleichtern, das Anschwellen von Zellen zu verhindern, freie Sauerstoffradikale zu beseitigen, den pH zu kontrollieren, ischämische Schädigungen zu mindern, die sichere Zeit zu verlängern, während der Organe außerhalb des Körpers aufbewahrt werden können, und die Erholung des Organs bei der Reperfusion zu erleichtern. Es stehen hierfür verschiedene kommerziell erhältliche Konservierungslösungen wie z.B. Eurocollins-Lösung®, die University-of-Wisconsin-Lösung®, Celsior-Lösung® und die low-potassium-dextran-Lösung (Perfadex®-Lösung) zur Verfügung.
Die Basis einer erfindungsgemäßen Perfusions- oder Konservierungslösung bilden wässrige pH-Puffersystem, vorzugsweise aus einem Natriumphosphatpuffer und einem Kaliumphosphatpuffer mit einen pH-Wert im Bereich von 6,8 bis 7,4 ausgewählt, wie z.B. Krebs-Henseleit-Puffer (KHB).
Allgemein kann eine erfindungsgemäßen Perfusions- oder Konservierungslösung neben den erfindungsgemäßen Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden enthalten: Wasser für Injektionszwecke, Saccharose, mindestens einen Bestandteil mit pH-Puffer-Eigenschaften, mindestens einen Bestandteil mit Calciumtransportblockierungseigenschaften, Calciumionen, Blutgerinnungs-Inhibitor, wie Acetylsalicylsäure, Kolloidosmotikunn wie Polyethyenglykol (PEG) oder Chelator wie Aminosäuren.
Beschichtung von Medizinprodukten
Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Medizinprodukte sind beschichtete Stents zum Einsatz in Blutgefäßen, die mit Nitrocarbonsäure-enthaltenden Phospholipiden ein- oder doppellagig beschichtet sind. Diese Ausführungsform ist besonders vorteilhaft, weil sie sich leicht herstellen lässt, durch ihre geringen Ausmaße die Dicke des Stents nur unwesentlich erhöht und zu einer Biopassivierung des Stents und gleichzeitig zu der zuvor beschriebenen passiven anti-restenotischen Wirkung führt. Bevorzugt ist eine Phospholipidbeschichtung als Monoschicht (mono-layer), wobei wie der Name sagt die Schichthöhe genau ein Molekül beträgt. Eine Monoschicht entspricht gemäß der Erfindung bevorzugt der vollständigen Bedeckung des Medizinprodukts mit einer Lage Nitrocarbonsäure enthaltender Phospholipide. Es ist jedoch auch möglich, dass nur Teile des Medizinprodukts mit einer Monoschicht bedeckt sind. Weiterhin bevorzugt sind Stents mit einer Doppelschicht aus Nitrocarbonsäure- enthaltenden Phospholipiden. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform sind Stents mit einer Monoschicht oder Doppelschicht aus Nitrocarbonsäure-enthaltenden Phospholipiden, die eine aufliegende Schicht aus mindestens einem bioresorbierbaren Polymer haben.
Weiterhin bevorzugte Medizinprodukte sind beschichtete Ballonkatheter, die eine reine Schicht von Nitrocarbonsäuren-enthaltenden Phospholipiden haben. Weiterhin bevorzugt sind Ballonkatheter mit einer Doppelschicht aus Nitrocarbonsäure- enthaltenden Phospholipiden. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform sind Ballonskatheter mit einer Monoschicht oder Doppelschicht aus Nitrocarbonsäure- enthaltenden Phospholipiden, die eine aufliegende Schicht aus mindestens einem bioresorbierbaren Polymer haben. Diese Doppelschicht-Systeme sind für Ballonkatheter bevorzugt.
Bevorzugt sind weiterhin Ballonkatheter und Stents, die eine reine Beschichtung mit Nitrocarbonsäuren-enthaltenden Phospholipiden und eine aufliegende Schicht aus Kontrastmittel haben.
Weiterhin bevorzugt können die Stents, Ballonkatheter und andere künstlichen Implantate alternierende Beschichtungen aus Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipidschichten und Schichten aus Kontrastmittel und/oder vergleichbaren Stoffen haben. Bevorzugt sind dabei Ausführungsformen mit 2 - 10 Nitrocarbonsäure-enthaltenden Phospholipidschichten, mehr bevorzugt 2- 6 Schichten und noch mehr bevorzugt 2 - 4 Schichten.
Prizipiell sich alle Körperimplantate geeignt für eine Beschichtung mit Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden, da sich aus den dokumentierten Effekten eine verbesserte Einheilung gegenüber einem unbeschichteten Implantatmaterial ableiten lässt. Darunter hinaus sind Implantate für die rekonstruktive und plastische Chirurgie wie chirurgische Netze, Implantate für den Gewebeersatz- bzw. -aufbau, implantierte Verweil katheter und Ports, sowie Drainagen besonders geeignet für eine erfindungsgemäße Beschichtung.
Die Phospholipidschichten sind naturgemäß sehr dünn. Die Dicke einer einzelnen Phospholipidschicht kann mit 2 - 4 nm angegeben werden. Entsprechend beträgt die Dicke einer Phospholipiddoppelschicht 4 - 8 nm und bei noch mehr Schichten summieren sich die entsprechenden Werte. Optional können die Stents eine hämokompatible Schicht aus den unten erwähnten hämokompatiblen Substanzen haben, die vorzugsweise an die Oberfläche gebunden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist auf die Beschichtung aus mindestens einer Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipidschicht mindestens einem pharmakologischen Wirkstoff, vorzugsweise einem antiproliferativen oder antirestenotischen Wirkstoff, als reine Wirkstoffschicht oder zusammen mit einem Hilfsstoff aufgebracht. Besonders erwähnt seien hier: Rapamycin, Tacrolimus, Bleomycin, Mitomycin, Methotrexat, Fludarabin, Fludarabin-5'-dihydrogenphosphat, Cladribin, Mercaptopurin, Thioguanin, Cytarabin, Fluorouracil, Capecitabin, Docetaxel, Carboplatin, Cisplatin, Oxaliplatin, Irinotecan, Topotecan, Hydroxycarbamid, Adriamycin, Azithromycin, Bromocriptin SMC-Proliferation- lnhibitor-2w, Mitoxanthrone, Azathioprin, Dacarbazin, Fluroblastin, Probucol, Colchicin, Tamoxifen, Estradiol, Tranilast, Taxane und dessen Derivate, wie Paclitaxel und Taxotere, synthetisch hergestellte als auch aus nativen Quellen gewonnene macrocyclische Oligomere des Kohlensuboxids (MCS) und seine Derivate, Heparin, Hirudin, Histaminantagonisten, Tocopherol, Kortikoide, nichtsteroidale Substanzen (NSAIDS) sowie Diastereomerengemische, Metaboliten und Mischungen der vorgenannten Wirkstoffe.
Die Wirkstoffe werden einzeln oder kombiniert in gleicher oder unterschiedlicher Konzentration eingesetzt. Besonders bevorzugt sind Wirkstoffe, welche neben ihrer anti-restenotischen Wirkung weitere unterstützende Eigenschaften aufweisen, also antiproliferative, antimigrative, antiangiogene, antiinflammatorische, antiphlogistische, zytostatische, zytotoxische und/oder antithrombotische.
Der Wirkstoff oder die Wirkstoffe ist bzw. sind bevorzugt in einer pharmazeutisch aktiven Konzentration von 0,001 -10 mg pro cm2 Stentoberfläche enthalten.
Zusätzlich können Hilfsstoffe zusammen mit der Wirkstofflösung auf die Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipidschicht oder -schichten aufgetragen sein, die entweder als Kontrastmittel die Sichtbarmachung des Medizinprodukts gewährleisten oder als sogenannte Transportvermittler fungieren und die Aufnahme des Wirkstoffes in die Zelle beschleunigen. Dazu gehören Vasodilatatoren, zu denen körpereigene Substanzen wie die Kinine, Substanzen pflanzlichen Ursprungs wie Gingko biloba, DMSO, Xanthone, Flavonoide, Terpenoide, pflanzliche und tierische Farbstoffe, Kontrastmittel und Kontrastmittelanaloga, sowie Cholesterole gehören ebenfalls zu diesen Hilfsmitteln bzw. sind selbst als Wirkstoff synergistisch einsetzbar.
Weitere zu nennende Substanzen sind 2-Pyrrolidon, Tributyl- und Triethylcitrat wie deren acteylierten Derivate, Dibutylphtalat, Benzoesäurebenzylester, Diethanolamin, Diethylphtalat, Isopropylmyristate und -palmitate, Triacetin usw.
Insbesondere bevorzugt werden DMSO, jodhaltige Kontrastmittel, PETN, Tributyl- und Triethylcitrat wie deren acteylierten Derivate, Isopropylmyristate und -palmitate, Triacetin und Benzoesäurebenzylester. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die Nitrocarbonsäure- enthaltenden Phospholipidschicht mit oder ohne Wirkstoffschicht von einer Schicht aus Polymeren bzw. Polysacchariden umgeben sein. Dabei ist das Vorhandensein einer Wirkstoffschicht auf der Phospholipidschicht aber bevorzugt. Die Polymerschicht kann aus biostabilen und/oder bioabbaubaren Polymeren bestehen. Die bioabbaubare Polymerschicht ist dabei jedoch bevorzugt. Diese bevorzugte Ausführungsform ist vorteilhaft, weil durch und während des Abbaus des Polymers der Wirkstoff langsam über einen ersten Zeitraum in die Umgebung abgegeben werden kann. Danach hätte der biopassivierte Stent immer noch eine anti- biopassivierende Langzeitwirkung. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann dabei mindestens ein Wirkstoff in der Polymerschicht selbst enthalten sein.
Als in der Regel biologisch abbaubare oder resorbierbare Polymere können beispielsweise verwendet werden: Polyvalerolactone, Poly-s-Decalactone, Polylactide, Polyglycolide, Copolymere der Polylactide und Polyglycolide, Poly-s-caprolacton, Polyhydroxybuttersäure, Polyhydroxybutyrate,
Polyhydroxyvalerate, Polyhydroxybutyrate-co-valerate, Poly(1 ,4-dioxan-2,3-dione), Poly(1 ,3-dioxan-2-one), Poly-para-dioxanone, Polyanhydride wie
Polymaleinsäureanhydride, Polyhydroxymethacrylate, Poly(laktat-co-glycolsäure), Fibrin, Polycyanoacrylate, Polycaprolactondimethylacrylate, Poly-b-Maleinsäure Polycaprolactonbutyl-acrylate, Multiblockpolymere wie z.B. aus Oligocaprolactondiole und Oligodioxanondiole, Polyetherester-multiblockpolymere wie z.B. PEG und Poly(butylenterephtalat. Polypivotolactone, Polyglycolsäuretrimethyl-carbonate Polycaprolacton-glycolide, Poly(y-ethylglutamat), Poly(DTH-lminocarbonat), Poly(DTE-co-DT-carbonat), Poly(Bisphenol α-iminocarbonat), Polyorthoester, Polyglycol-säuretrimethyl-carbonate, Polytrimethylcarbonate, Polyiminocarbonate, Poly(N-vinyl)-Pyrolidon, Polyvinylalkohole, Polyesteramide, glycolierte Polyester, Polyphosphoester, Polyphosphazene, Poly[p-carboxyphenoxy)propan],
Polyhydroxypentansäure, Polyethylenoxid-propylenoxid, weiche Polyurethane, Polyurethane mit Aminosäurereste im Backbone, Polyetherester wie das Polyethylenoxid, Polyalkenoxalate, Polyorthoester sowie deren Copolymere, Carrageenane, Fibrinogen, Stärke, Kollagen, protein-basierte Polymere, Polyaminosäuren, synthetische Polyaminosäuren, Zein, Polyhydroxyalkanoate, Pectinsäure, Actinsäure, Fibrin, Kasein, Carboxymethylsulfat, Albumin, Hyaluronsäure, Heparansulfat, Heparin, Chondroitinsulfat, Dextran, ß-Cyclodextrine, Copolymere mit PEG und Polypropylenglycol, Gummi arabicum, Guar, Gelatine, Collagen, Collagen-N-Hydroxysuccinimid, Lipide und Lipoide, polymerisierbare Öle mit geringem Vernetzungsgrad, Modifikationen und Copolymere und/oder Mischungen der vorgenannten Substanzen.
Verwendungen
Die erfindungsgemäßen Beschichtungen für Medizinprodukte und Zusammensetzungen für medizinische oder kosmetische Verfahren sind besonders geeignet zur Verhinderung, Verminderung oder Behandlung von Gefäßstenosen bzw. Restenosen, sowie bei Gefäßverletzungen, Gefäßinterventionen, Bypassversorgungen, bei koronarer Herzkrankheit oder arterieller Verschlusskrankheit, Herzklappenerkrankungen, Varikosis, Vaskulitis, Lymphangitis, Erysipel, extrakorporaler Zirkulation, zur Offenhaltung künstlicher oder natürlicher Ausgänge (z.B. Stomata),. Schürf- und Schnittwunden, Quetsch- und Platzwunden Ulcera, Aphten, Nekrosen, Dermtitiden, Urtikaria, Pruritus, Verbrennungen, Frostschäden, Strahlenschäden, stumpfe und spitze Traumata, Bindegewebeerkrankungen wie Dermatomyositis, Sudek Syndrom und Fibromyalgie, Nervenirritationen wie das Karpaltunnelsyndrom und Meralgia parästhetika, chronisch obstruktive Lungenerkrankungen incl. Asthma bronchale, Anaphylaxie incl. Toxic shock Syndrom, Allergien incl. Heuschnupfen, Intoxikationen, Gewebeverbindungen durch Adaptation, Naht, Klammerung oder Welding, Gewebeentnahme, Organtransplantation, Gewebstraffung, Gewebe- und Hautplastik, Narbenrevision, Hernienreparatur, Glaucom, Polypen, Allopezie, Atropie und Barotrauma. Besonders bevorzugt sind die Medizinprodukte gemäß der Erfindung zur Behandlung und Prophylaxe von Restenose geeignet.
Unter der Verwendung der erfindungsgemäßen Medizinprodukte zur Behandlung mit artifiziellen Blutleitern oder Pumpen versteht man Endoprthesen z.B. aus PTFE, PET, Polyester u.a.m. zum Einsatz in oder anstatt eines natürlichen Blutgefäßes oder Pumpensysteme zur intra- oder extrakorporalen Zirkulation sowie deren Anschlüsse, die z.B. aus PU, PTFE, Polyesther, u.a.m. sein können. Hierzu zählt auch die Anwendung an Pachmaterialien die z.B. aus Polyester oder allogenem oder xenogenem Gewebe bestehen können. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Medizinprodukte mit einer viskoelastischen Schicht bestehend aus den erfindungsgemäßen Phospholipiden überzogen. Es hat sich herausgestellt, dass die Gleitfähigkeit von derart beschichteten Medizinprodukten im Gefäßsystem verbessert wird. Hierdurch werden zum einen Verletzungen der Endothelschicht beim Vorbringen des Medizinproduktes gemindert und zum anderen der Einheilungsprozess gefördert, bei gleichzeitiger Reduktion ungewünschter Reaktionen auf den Fremdkörperkontakt. Die hierin offenbarten Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipide werden zur Beschichtung von Medizinprodukten verwendet, um insbesondere zur Verbesserung der Gleitfähigkeit der Medizinprodukte zu sorgen. Vorzugsweise wird die Gleitfähigkeit von mit Geweben in Berührung kommenden Medizinprodukten verbessert und insbesondere von Kathetern, Angioplastiekathetern, Dilatationskatheter, Katheterballons, Führungsdrähten, Führungskathetern, Stents und anderen Medizinprodukten zum Einsatz in Blutgefäßen. Ferner von Wundversorgungsmatenalien wie Nahmaterial, Nadeln, Cerglagen, Drähten sowie chirurgischen Netzen aber auch Gewebeersatzmaterialien wie künstliche Sehnen, und Knochenersatzmaterialien. Ferner kann eine Beschichtung zur Verbesserung der Gleitfähigkeit vorteilhaft sein bei Gerätimplantaten aber auch Weichteilimplantaten wie Brustimplantaten.
Der Begriff „Verbesserung der Gleitfähigkeit" wie hierin verwendet bezeichnet eine Gleitfähigkeit des beschichteten Medizinproduktes beim Einführen und Vorbringen in eine präformierte oder nicht präformierten Körperhöhle, welche besser ist als die Gleitfähigkeit des unbeschichteten Medizinproduktes beim Einführen in bzw. durch die Gewebeschichten, bzw. Hohlräume.
Beschichtungsverfahren
Die Monoschichten, Doppelschichtsysteme oder Multischichtsysteme auf einem Stent, einem Ballonkatheter oder anderen Implantaten werden bevorzugt durch Sprühverfahren, Spin-coating-Verfahren, Tauchverfahren, Pipettierverfahren, Gasphasenabscheidung (CVD) und die Atomlagenabscheidung (ALD), besonders bevorzugt jedoch durch Tauchverfahren und Gasphasenabscheidung aufgetragen. Dabei wird die vorzugsweise unbeschichtete oder mit einer hämokompatiblen Schicht bedeckte Oberfläche des Stents oder die vorzugsweise unbeschichtete Oberfläche des Ballonkatheters mit einer Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipid-Beschichtungslösung beschichtet. Tauchbeschichtung
Phospholipide können durch Tauchbeschichtung auf geeigneten Oberflächen selbst- assemblierende Monoschichten (SAM) bilden. Die SAM bildet sich spontan beim Eintauchen von oberflächenaktiven Stoffen oder organischen Substanzen in eine Lösung bzw. Suspension. Die Schichtbildung kann unterstützt werden durch eine zuvorige Beschichtung der Oberfläche mit einer kovalent gebundenen Alkanschicht, z.B. in Form von Alkanthiolen, wodurch die physisorbierten Kohlenstoffketten der Phospholipide eine hohe physikalische Adhärenz erhalten. Hydrophobe Moleküle wie Cholesterin, die in die Phospholipidmembranen eingelagert sind, wurden als geeignet für die Ausbildung von fokalen Adhäsionspunkten beschrieben, die für die Zelladhäsion und Zellmigration auf einer Oberfläche notwendig sind. Cholesterin und verwandte Stoffe lassen sich auf bekannte Weise leicht in eine artifizielle Phospholipidschicht integrieren. Eine andere Methode, die die Entwicklung fokaler Adhäsionen von Ankerzellen erlaubt ist die Implementierung von Zelladhäsionsproteinen wie z. B. RDG-Tripeptide. Jedoch müssen diese kovalent an die Oberfläche gebunden sein um die physische Stabilität zu gewährleisten, während komplexe hydrophobe Moleküle, die in einer Phospholipidschicht integriert sind, nicht leicht entfernt werden können. Verschiedene Phospholipide mit nitrierten Phospholipiden können für die Beschichtung von metallischen und polymeren Oberflächen via Physisorptionsmethoden verwendet werden, wie das durch die Beispiele gezeigt wird. Physisorption ist die allgemeine Form der Adsorption, bei der ein adsorbiertes Molekül durch physikalische Kräfte auf einem Substrate gebunden wird. Beim bevorzugten Beschichtungsverfahren durch Tauchen wird das Implantat in einen die Beschichtungslösung enthaltenden Tank oder Behälter getaucht. Die Prozedur wird wiederholt bis eine vollständige und gleichmäßig verteile Beschichtung der Implantatoberfläche erreicht ist. Für eine bessere Verteilung der Beschichtung kann das Implantat optional unter dauernder Veränderung seiner Position in den Tank getaucht werden, z.B. durch eine Rotation.
Das Tauchverfahren ist wie für Phospholipide auch für Polymere geeignet. Wird noch eine Polymerschicht aufgetragen, kann das beschichtete Implantat nach dem Tauchverfahren durch Rotationstrocknung getrocknet werden.
Gasphasenabscheidungsverfahren
Eine weitere bevorzugte Beschichtungsmethode ist die Gasphasenabscheidung. Diese Methode ist besonders vorteilhaft für die Herstellung sehr dünner Schichten, bei denen die Schichtdicke und Gleichmäßigkeit der Beschichtung gut kontrolliert werden muss, wie z.B. die einzelner Phospholipid- oder Wirkstoffschichten.
Pipettierverfahren - Kapillarverfahren
Bei diesem bevorzugten Verfahren wird eine feine Düse oder Kanüle an das Medizinprodukt angesetzt und die Beschichtungslösung auf das Medizinprodukt gespritzt. Dieses Verfahren ermöglicht eine genaue und präzise Beschichtung der Oberfläche des Medizinprodukts. Dieses Verfahren ist für die erfindungsgemäßen Nitrocarbonsäure-enthaltenden Phospholipide, die Wirkstoffe und die Polymere gleichermaßen geeignet. Besonders bevorzugt ist das Verfahren für die Beschichtung des Medizinprodukts mit Wirkstofflösungen und Polymeren.
Dieses Verfahren ist mit jeder Beschichtungslösung durchzuführen, welche noch derart viskos ist, dass sie innerhalb von 5 Minuten, vorzugsweise 2 Minuten aufgrund von Adhäsionskräften oder zusätzlich unter Ausnutzung der Schwerkraft über das Medizinprodukt gezogen wird und das Medizinprodukt weitgehend vollständig bedeckt.
Verfahren nach Langmuir-Blodgett
Hierbei wird das Medizinprodukt in eine Flüssigkeit vertikal eingetaucht und langsam wieder herausgezogen. Hierbei überträgt sich die sog. Langmuir-Blodgett-Schicht als eine Monolage organischer Moleküle von der Oberfläche der Flüssigkeit auf das Medizinprodukt. Auf der Flüssigkeit bilden die verwendeten organischen Moleküle einen Film. Idealerweise kann durch die Anzahl der Eintauchvorgänge die Anzahl der Monolagen und damit die Dicke der Beschichtung gesteuert werden. Wenn es sich um eine wässrige Lösung handelt, richtet sich das hydrophobe Ende des organischen Moleküls zu der hydrophoben Oberfläche des Medizinproduktes aus, während sich das hydrophile Ende des organischen Moleküls zum Wasser hin orientiert. Durch mehrmaliges Eintauchen und Herausziehen kann sich dies jeweils umdrehen, da einmal ein hydrophobes und einmal ein hydrophiles Ende auf der Oberfläche des Medizinproduktes vorhanden ist. Daher werden bei diesem Beschichtungsverfahren organische Moleküle bevorzugt, die sowohl ein hydrophiles wie auch ein hydrophobes Ende haben. Diese Technik ist besonders zur Beschichtung mit Phospholipiden und langkettigen Fettsäuren geeignet.
Um optimales Ergebnis zu erzielen, wird die Molekülschicht auf der wässrigen Lösung durch eine sog. Filmwaage zusammengeschoben. Diese hält den sog. Transferdruck und somit die Flächendichte der organischen Moleküle konstant. Verfahren nach Langmuir-Schaefer
Dieses Verfahren ist eine Variante des zuvor beschriebenen Langmuir-Blodgett- Verfahrens. Bei hochviskosen Filmen oder bei der Bildung von Aggregaten oder Kristalliten kann das vertikale Eintauchen problematisch sein. Bessere Ergebnisse werden in diesem Fall durch das Langmuir-Schaefer-Verfahren erzielt, bei dem das Medizinprodukt horizontal eingetaucht wird. Die übrige Vorgehensweise entspricht dem Langmuir-Blodgett-Verfahren. Detergenzverdünnung
Bei diesem Verfahren werden unpolare langkettige Moleküle wie beispielsweise die besagten Phospholipide mit Hilfe einer Detergenzlösung zur Mizellenbildung gebracht. Geeignete Detergentien hierfür sind beispielsweise Cholat, Desoxycholat, Octyl-Glukosid, Heptyl-Glukosid und Triton X-100. Diese Lösung wird dann dialysiert, um das Detergenz zu entfernen. Die Phospholipide können auf diese Weise Liposomen an der Oberfläche des zu beschichtenden Medizinproduktes bilden.
Rotationsbeschichtung (spin coating)
Hierbei wird das Medizinprodukt mittels Vakuumansaugung an der Unterseite auf einem Drehteller befestigt. Über eine Dosiereinrichtung über dem Zentrum des Medizinproduktes wird die gewünschte Menge der Lösung aufgetragen. Durch eine geeignete Wahl der Beschleunigung, der maximalen Drehzahl und der Drehdauer wird eine gleichmäßige Beschichtung mit einem Film erzielt. Überschüssige Beschichtungslösung wird hingegen durch die wirkenden Zentrifugalkräfte weggeschleudert.
Painting
Desweiteren können erfindungsgemäß verschiedene Verfahren, die aus der Aufragung von Farben und Lacken auf Substraten bekannt sind, zur Beschichtung der Medizinprodukte mit den erfindungsgemäßen Phospholipiden verwendet werden. Besonders geeignet ist hierbei die Verwendung von Dekan oder Hexan als Lösungsmittel. Beschreibung der Figuren
Figur 1 zeigt Untersuchungen zu Effekten von Nitrocarbonsäuren enthaltenden
Phospholipiden auf die Zellphysiologie. Die erste Zeile zeigt die
Ergebnisse der Lipidfärbung, die zweite Zeile die Ergebnisse des MTT- assays, die dritte Zeile die Änderung des Zellvolumens und in der vierten Zeile die Rate vitaler Zellen im Live/Dead assay. Bei den getesten Substanzen handelt es sich um: PC: Phosphatidylcholin, SOPC (1 - Stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-PC), DOPC (1 ,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-PC),
POPC (1 -Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-PC), ONOPC (1 -Oleoyl-2-(E-9- nitrooleoyl)-sn-glycero-3-PC), PNLPC (1 -Palmitoyl-2-(E-9-nitrolinoleoyl-sn- glycero-3-PC) sowie die freien Fettsäuren OA (Ölsäure), LA (Linolsäure), NOOA (E-9-Nitroölsäure) und NOLA (E-9-Nitrolinolsäure).
Figur 2 zeigt Untersuchungen zu Effekten von Nitrocarbonsäuren enthaltenden
Phospholipiden auf die Adhäsion, Migration und Proliferation von Zellen. Bei den getesten Substanzen handelt es sich um: SOPC, DOPC, POPC, ONOPC, PNLPC sowie die freien Fettsäuren OA, LA, NOOA und NOLA. Die ersten beiden Zeilen zeigen die Wirkung der getesten Substanzen auf die Proliferation der Zellen nach einer Inkubation mit Konzentrationen von Ι ΟμηηοΙ und Ι ΟΟμηηοΙ nach 24h, 48h oder 72h. Dargestellt sind die relativen Anzahlen (%) an Zellen im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Die folgenden beiden Zeilen zeigen die Zellablösung nach jeweils 24h und 72h Vorinkubation mit den Substanzen mit 10 und
Ι ΟΟμηηοΙ. In den letzten Zeilen sind die Ergebnisse des Zellmigrations- assay abgebildet, nach jeweils 24h, 48h bzw. 72h nach Inkubation mit den Substanzen. Auch hier sind die relativen Anzahlen (%) an Zellen im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle dargestellt. Die Werte beziehen sich auf das Ergenbins nach Inkubation mit 10 oder Ι ΟΟμηηοΙ der jeweiligen
Substanz.
Figur 2a Bei Vorliegen vergleichbarer Ergebnisse innerhalb von Verbindungsklassen wurde diese summarisch angegeben. Die ermittelten Werte wurden auf einen statistisch signifikanten Unterschied zu den Ergebnissen der natürliche PL POPC und DOPC analysiert, sowie auf eine Vergleichbarkeit zu den nitrierten PL ONOPC und PNLPC . Stoffgemische mit ähnlichem Verhalten wurden wie angegeben zusammengefasst. Bei Vorliegen eines statistischen Unterschieds zu den natürliche PL, wurde ermittelt, ob der gefundene Wert innerhalb der Standardabweichung der für die nitrierten PL ermittelten Werte lag (= o) oder darüber (= +), deutlich darüber (= ++) oder darunter lag ( = -). Für Werte, die sich statistisch nicht von den Werten der natürlichen PL unterschieden, wird n.s. angegeben.
Figur 3 zeigt Untersuchungen zur Stabilität von Nitrocarbonsäurenenthaltenden
Phospholipiden und deren Effekte auf Phospholipidgemische. Es wurden die natürlichen Phospholipide POPC (1 -Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3- PC) und SLPE (1 -Stearoyl-2-linoleoyl-sn-3-glycero-phosphatidylethanol- amin) sowie die analogen Phospholipide mit Nitrierung der ungesättigten
Fettsäuren (1 -Palmitoyl-2-(E-9-nitrooleoyl)-sn-glycero-3-PC (Beispiel C) und 1 -Stearoyl-2-(E-9-nitrolinoleoyl)-sn-3-glycero-phosphatidylethanolamin (Beispiel R) als Monosubstanz sowie als Kombination aus dem nativen Phospholipide und dem korrespondierenden Nitrocarbonsäure(n)- enthaltenden Phospholipid in einem Mischungsverhältnis von 1 :1 auf
Ballonkatheter mittels des Langmuir-Schäfer Verfahrens aufgetragen. Die Tabelle zeigt die relative (%) Substanzmengenänderung nach 24h, nach Hitzebehandlung und nach der Gleituntersuchung sowie die relative Änderung der Zugarbeit gegenüber einem unbeschichteten Ballonkatheter.
Figur 4a zeigt Untersuchungen zur Langzeit Erythrozytenstabilität nach
Vorbehandlung mit den natürlichen Phospholipiden SOPC und PLPC sowie die analogen Phospholipide mit Nitrierung der ungesättigten Fettsäuren SNOPC (1 -Stearoyl-2-(E-9-nitrooleoyl)-sn-glycero-3-PC und PNLPC (1 -Palmitoyl-2-(E-9-nitrolinoleoyl-sn-glycero-3-PC) und anschließender Lagerung über 2 Tage bei 4°C. Dann erfolgte eine Aufwärmung auf 30°C, je eine Probe diente als Leerwert. Die erwärmten Proben wurden für 24 und 48 Stunden auf einer Schüttelplatte mit einer geringen Rotationsfrequenz bei 30°C bewegt. Anschließend erfolgte die Probenaufbereitung. Dargestellt ist die Hämolyserate in Prozent.
Figur 4b zeigt Untersuchungen zur Mastzellaktivierung mit Mastoparan. Hierzu wurden zunächst Zellen mit den natürlichen Phospholipiden SOPC und PLPC sowie die analogen Phospholipide mit Nitrierung der ungesättigten Fettsäuren SNOPC und PNLPC für eine Stunde vorinkubiert und dann mit
5 oder 25 μιτιοΙ Mastoparan inkubiert. Anschließend wurde der Ca2+- Einstrom bestimmt, indem der Calciumeinstrom auf die jeweilige Basismessung normiert und als prozentualer Zuwachs ausgedrückt wurde. Weiterhin wurde die Histaminfreisetzung aus den C2-Zellen mithilfe eines Histamin-ELISA bestimmt und ist in ng/ml ausgedrückt.
Figur 4c zeigt Untersuchungen zur Prüfung des Einflusses auf die mechanische
Stabilität der Erythrozyten nach Vorbehandlung mit den natürlichen
Phospholipiden SOPC und PLPC sowie die analogen Phospholipide mit Nitrierung der ungesättigten Fettsäuren SNOPC und PNLPC. Es wurden entsprechend vorbereitete und in physiologischer NaCI-Lösung resuspendierte Erythrozytenproben in einen Ultraschallbad bei einer Temperatur von 30° und 50°C für zwei und fünf Minuten mit 10 Watt behandelt. Anschließend wurden die Proben zentrifugiert und der Überstand analysiert. Dargestellt sind die Hämolyseraten in Prozent.
Figur 4d zeigt Untersuchungen zur Prüfung des Einflusses auf die osmotische
Stabilität der Erythrozyten nach Vorbehandlung mit den natürlichen
Phospholipiden SOPC und PLPC sowie die analogen Phospholipide mit Nitrierung der ungesättigten Fettsäuren SNOPC und PNLPC. Gereinigte, resuspendierte Erythrozyten wurden in destilliertes Wasser sowie NaCI- Lösungen mit ansteigender Konzentration von 0,1 bis 1 ,0 g/dl gegeben. Die photometrisch bestimmte Hämoglobinkonzentration einer vollständig lysierten Vergleichsprobe wurde in Bezug gesetzt zur jeweils ermittelten Hämoglobinkonzentration. Auf der Y-Achse ist der relative Hämolyseanteil angegeben. Figur 5 zeigt Untersuchungen zur Zellvitalität nach Vorbehandlung mit NaCI- Lösung oder den natürlichen Phospholipiden SOPC und PLPC sowie die analogen Phospholipide mit Nitrierung der ungesättigten Fettsäuren SNOPC und PNLPC mit einer Konzentration von 10 und 50 μηηοΙ/Ι oder den Nitrofettsäuren Nitrooleat (NOA) und Nitrolinolat (NLA) in einer Konzentration von 10 oder 30 μιτιοΙ. Anschließend wurden die Zellen mit
Cisplatin (25 und 50 μηηοΙ/Ι), Cyclosporin (50 und 100 μηηοΙ/Ι) oder Lipopolysaccharid (LPS) inkubiert und die Zellen über 24 Stunden weiter kultiviert. In der Tabelle gezeigt sind die Anzahl der toten Zellen nach Behandlung mit einer Konzentration von 10/50μηηοΙ für die verwandten PL, sowie 10/30μηηοΙ für die verwandten Fettsäuren in Relation zur absoluten
Zellanzahl.
Figur 6 zeigt Untersuchungen zur Vitalität von Arteriae iliacae vom Schwein, die mit den natürlichen Phospholipiden POPC und SLPC sowie die analogen Phospholipide mit Nitrierung der ungesättigten Fettsäuren (1 -Palmitoyl-2- (E-9-nitrooleoyl)-sn-glycero-3-PC und 1 -Stearoyl-2-(E-9-nitrolinoleoyl)-sn- 3-glycero-phosphatidylcholin vorbehandelt wurden und anschließend für eine Stunde bei 15 bar in einer Druckkammer inkubiert wurden. Die Auswertung erfolgte über eine TUNEL-Färbung (TUNEL positive Zellen in %) und der Bestimmung der Mikropartikel im Zellkultur Überstand (Mikropartikel/μΙ).
Figur 6a Die ermittelten Werte wurden auf einen statistisch signifikanten
Unterschied zu den Ergebnissen der natürliche PL POPC und SLPC analysiert, sowie auf eine Vergleichbarkeit zu den nitrierten PL PNOPC und SNLPC. Stoffgemische mit ähnlichem Verhalten wurden wie angegeben zusammengefasst. Bei Vorliegen eines statistischen Unterschieds zu den natürliche PL, wurde ermittelt, ob der gefundene Wert innerhalb der Standardabweichung der für die nitrierten PL ermittelten Werte lag (= o) oder darüber (= +), deutlich darüber (= ++) oder darunter lag ( = -), bzw. deutlich darunter lag (= --). Für Werte, die sich statistisch nicht von den Werten der natürlichen PL unterschieden, wird n.s. angegeben.
Figur 7 zeigt Untersuchungen zu den membranstabilisierenden Effekten von
Nitrocarbonsäuren enthaltenden Phospholipiden bei der Cryokonservierung von Geweben. Hierzu wurden die Gefäßsegmente in NaCI-Lösung, eine NaCI-Lösung mit natürlichen Phospholipiden SOPC und PLPC sowie die analogen Phospholipide mit Nitrierung der ungesättigten Fettsäuren SNOPC und PNLPC in einer Konzentration von 200 mmol/l für eine Stunde inkubiert. Zur Funktionsfähigkeitsprüfung der Gefäßsegmente wurde die isometrische Kraftentwicklung unter Noradrenalin- (Arterien) sowie Histaminstimulation (Venen) (Zugkraft in Gramm) sowie die Gefäßdilatation unter Acetylcholin untersucht. Für die Berechnung der Kapazität zur Vasodilatation wurde als Referenz ein natives Gefäßsegment, welches nicht eingefroren war gleichartig untersucht und der für die behandelten Gefäßsegmente ermittelte Wert als prozentualer Anteil gegenüber der Nativkontrolle wiedergegeben.
Figur 7a Die ermittelten Werte wurden auf einen statistisch signifikanten
Unterschied zu den Ergebnissen der natürliche PL SOPC und PLPC analysiert, sowie auf eine Vergleichbarkeit zu den nitrierten PL SNOPC und PNLPC. Stoffgemische mit ähnlichem Verhalten wurden wie angegeben zusammengefasst. Bei Vorliegen eines statistischen Unterschieds zu den natürliche PL, wurde ermittelt, ob der gefundene Wert innerhalb der Standardabweichung der für die nitrierten PL ermittelten Werte lag (= o) oder darüber (= +), deutlich darüber (= ++) oder darunter lag ( = -). Für Werte, die sich statistisch nicht von den Werten der natürlichen PL unterschieden, wird n.s. angegeben.
Figur 8 zeigt Untersuchungen zu Effekten von Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden
Phospholipiden auf Membranrezeptoren der TRP-Proteinfamilie. Membranionenstrommessungen erfolgten an Oozyten, die TRPV 1 , 2 oder 4 sowie TRPA1 Rezeptoren exprimierten und mit Caspaicin (Ι ΟμηηοΙ), Cannabiol (Ι ΟμηηοΙ), 4a-PDD (50μηηοΙ) bzw. Cinnamaldehyd (50μηηοΙ) simmuliert wurden. Die Oozyten wurden zuvor mit Phospholipiden SOPC und PLPC sowie die analogen Phospholipide mit Nitrierung der ungesättigten Fettsäuren SNOPC und PNLPC in einer Konzentration von jeweils 50 mmol/1, ferner mit den natürlichen Fettsäuren Ölsäure und Linolsäure sowie der Nitroölsäure und Nitrolinolsäure jeweils in einer Konzentration von 30 μιτιοΙ für 10 sowie für 60 Minuten inkubiert. Nicht vorbehandelte Oozyten dienten als Kontrolle, deren Messergebnisse als Referenzwert angenommen wurde. Nach Vorbehandlung kam es zu einer Zu- sowie Abnahme des induzierbaren Inonensroms der als prozentualer Wert gegeüber der Referenz wiedergegeben wird.
Figur 8a Die ermittelten Werte wurden auf einen statistisch signifikanten
Unterschied zu den Ergebnissen der natürliche PL SOPC und PLPC analysiert, sowie auf eine Vergleichbarkeit zu den nitrierten PL SNOPC und PNLPC. Stoffgemische mit ähnlichem Verhalten wurden wie angegeben zusammengefasst. Bei Vorliegen eines statistischen Unterschieds zu den natürliche PL, wurde ermittelt, ob der gefundene Wert innerhalb der Standardabweichung der für die nitrierten PL ermittelten Werte lag (= o) oder darüber (= +), deutlich darüber (= ++) oder darunter lag ( = -). Für Werte, die sich statistisch nicht von den Werten der natürlichen PL unterschieden, wird n.s. angegeben. Figur 9 zeigt Untersuchungen zu Effekten einer Beschichtung von
Weichteilimplantatmaterial mit Nitrocarbonsäuren enthaltenden Phospholipiden auf die Gewebereaktion in vivo. Hierzu wurde als Implantatmaterial sterile Silikonkissen verwandt, die per Sprühbeschichtung in zwei Lagen mit den natürlichen Phospholipiden SOPC und PLPC sowie die analogen Phospholipide mit Nitherung der ungesättigten Fettsäuren SNOPC und PNLPC beschichtet wurden oder unbehandelt blieben. Die Silikonkissen wurden Wistar Ratten eingesetzt und die zelluläre Reaktion und die fibröse Gewebeformation nach Implantation gemäß folgendem Schlüssel bewertet.
A) Zelluläre Reaktion: A1 : keine; A2: vereinzelte monozytäre Zellen oder Lymphozyten; A3: moderate Anzahl oder Gruppen von monozytären Zellen oder Lymphozyten; A4: Dichtes Infiltrat aus Monozyten, Eosinophilen oder Riesenzellen.
B) Fibröses Gewebeformation: B1 : keine; B2: dünne kollagenreiche
Schicht um das Implantat; B3: dicke (>1 mm) und dichte kollagenreiche Gewebeformation um das Implantat.
Figur 9a A = alle zellulären Reaktionen nach Kategorien zusammengefasst und bezüglich jeder Ausprägung verglichen; B = alle fibrösen Gewebeformationen zusammengefasst und bezüglich jeder Ausprägung verglichen. Die ermittelten Werte wurden auf einen statistisch signifikanten Unterschied zu den Ergebnissen der natürliche PL SOPC und PLPC analysiert, sowie auf eine Vergleichbarkeit zu den nitrierten PL SNOPC (Beispiel P14) und PNLPC (Beispiel P7). Stoffgemische mit ähnlichem Verhalten wurden wie angegeben zusammengefasst. Bei Vorliegen eines statistischen Unterschieds zu den natürliche PL, wurde ermittelt, ob der gefundene Wert innerhalb der Standardabweichung der für die nitrierten PL ermittelten Werte lag (= o) oder darüber (= +), deutlich darüber (= ++) oder darunter lag ( = -), bzw. deutlich darunter lag (= --). Für Werte, die sich statistisch nicht von den Werten der natürlichen PL unterschieden, wird n.s. angegeben.
Figur 10a zeigt Untersuchungen zu den Effekten von Nitrocarbonsäuren enthaltenden Phospholipiden auf die Dimerisationseigenschaften eines
Modelproteins. Der Vergleich fand zwischen nativen Phospholipiden SOPC und SLPC sowie den analogen Phospholipiden mit Nitrierung der ungesättigten Fettsäuren SNOPC (1 -Stearoyl-2-(E-9-nitrooleoyl)-sn- glycero-3-PC) (Beispiel 14) und SNLPC (1 -Stearoyl-2-(9-nitrolinoleoyl)-sn- 3-glycero-phosphocholin) (Beispiel 13) statt, die in einem Gemisch mit dem Phospholipid DSPC (Di-Stearoyl-PC) vorlagen. Auf der y-Achse wurde der Wert der FRET-Messung von DSPC ohne Zugabe von anderen Phospholipiden als 100% normiert. Die x-Achse zeigt den Phospholipidzusatz in Prozent an. Figur 10b zeigt den Effekt von Nitrocarbonsauren enthaltenden Phospholipiden auf die Anistropie in Vesikeln in Abhängigkeit von der Temperatur. Auf der y- Achse ist die Anisotropie aufgetragen und auf der x-Achse die Temperautur.
Abkürzungsverzeichnis
DOPC 1 ,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-PC
DSPC 1 ,2-Distearoyl-sn-glycero-3-PC
LA Linolsäure
NOLA E-9-Nitrolinolsäure
NOOA E-9-Nitroölsäure
OA Ölsäure
ONOPC 1 -Oleoyl-2-(E-9-nitrooleoyl)-sn-glycero-3-PC
PC Phosphatidylcholin bzw. Glycerophosphatidylcholin
PE Phosphatidylethanolamin
PL Phospholipid(e)
PLPC 1 -Palmitoyl-2-linoleoyl-sn-glycero-3-PC
PNLPC 1 -Palmitoyl-2-(E-9-nitrolinoleoyl-sn-glycero-3-PC
PNOPC 1 -Palmitoyl-2-(E-9-nitrooleoyl)-sn-glycero-3-PC
PNOPE 1 -Palmitoyl-2-(E-9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero-phosphatidylethanolamin
PNOPI 1 -Palmitoyl-2-(E-9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero-phosphatidylinositol
POPC 1 -Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-PC
POPE 1 -Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamin
POPI 1 -Palmitoyl-2-oleoyl-sn-3-glycero-phosphatidylinositol
SLPC 1 -Stearoyl-2-linoleoyl-sn-glycero-3-PC
SLPE 1 -Stearoyl-2-linoleoyl-sn-3-glycero-phosphatidylethanolamin
SNLPC 1 -Stearoyl-2-(9-nitrolinoleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin
SNOPC 1 -Stearoyl-2-(E-9-nitrooleoyl)-sn-glycero-3-PC
SNLPE 1 -Stearoyl-2-(E-9-nitrolinoleoyl)-sn-3-glycero-phosphatidylethanolamin
SOPC 1 -Stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-PC Synthesebeispiele
Beispiel A: Allgemeine Synthese von NPL
Inn Folgenden wird die allgemeine Synthese von Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden (hierin auch als NPL oder Nitrophospholipide bezeichnet) beschrieben. Die NPLs werden durch Veresterung von sn-Glycero-3-phosphatiden 1 gewonnen.
Sollen beide freien OH-Gruppen mit derselben Nitrofettsäure 2 (R2 (NO)CO2H = Nitrofettsäure) verestert werden, so wird das Ausgangsmaterial 1 unmittelbar mit 2 Nitrofettsäuren 2 über intermediäre Aktivester (wie Acyl-2,6-Dichlorbenzoate) umgesetzt. Die „symmetrischen" (d.h. R1 = R2) 1 ,2-Di-(Nitrocacyl-sn-3- glycerophosphatide 3 werden nach Reinigung mit gutem Erfolg erhalten. An den Positionen 1 und 2 unterschiedlich acylierte Glycerophosphatide 6 werden über zwei aufeinanderfolgende Veresterungen gewonnen. Zunächst wird die sn-1 - Position durch die Kondensation mit Dibutylzinnoxid regioselektiv auf die erste Veresterung vorbereitet. Das intermediär gewonnene „Zinnacetal" wird mit dem Säurechlorid 4 in Gegenwart von Triethylamin zum 1 -Acyl-2-lyso-sn-3- glycerophosphatid 5 umgesetzt (zur Herstellung solcher lyso-Verbindungen siehe D'Arrigo, Servi, Molecules 2010, 15, 1354). Die zweite Veresterung der OH-Gruppe in 2-Position mit der (Nitro)fettsäure 2 über die Aktivestermethode liefert abschließend das unsymmetrisch substituierte 1 -"Nitro"Acyl-2-("nitro"acyl)-sn-3- glycero-phosphatid 6, welches nach sorgfältiger Reinigung für die Beschichtungen genutzt wird. Bei dieser Synthese kann als Säurechlorid 4 ein Nitrosäurechlorid oder ein nicht nitriertes Säurechlorid eingesetzt werden. Als Fettsäure 2 kann ebenfalls eine Nitrofettsäure oder eine nicht nitrierte Fettsäure verwendet werden. Voraussetzung ist nur, dass entweder Säurechlorid 4 oder Fettsäure 2 nitriert ist. Damit ergeben sich die folgenden Produkte: 1 -Nitroacyl-2-(acyl)-sn-3-glycero- Phosphatid 6, 1 -Acyl-2-(nitroacyl)-sn-3-glycero-phosphatid 6 oder 1 -Nitroacyl-2- (nitroacyl)-sn-3-glycero-phosphatid 6. Diese robuste Vorgehensweise wird insbesondere zur Synthese von weitestgehend stabile Nitrofettsäuren enthaltende Phospatide angewendet. Für die Anbindung der empfindlichen Nitrocarbonsäuren ist es unumgänglich, diese erst zum Schluss der Phosphatidsynthese einzuführen. Der Einbau gelingt in der Regel nicht mit klassischen Veresterungsmethoden, da die eingebrachten α,β- ungesättigten Nitroverbindungen exzellente Akzeptoren für viele Nukleophile darstellen. Aus diesem Grunde muss üblicherweise auf die Aufarbeitung und die Aufreinigung im Basischen oder im Wässrig-Basischen verzichtet werden. Für die Umsetzung mit den Nitrocarbonsäuren konnte die von R. G. Salomon (Salomon, Biorg. & Med. Chem. 2011 , 19, 580) vorgestellte und für α,β-ungesättigte Ketone enthaltende Fettsäuren entwickelte Veresterungen adaptiert werden. Hier ist insbesondere darauf zu achten, das jegliche intramolekulare Umesterungen ausgeschlossen werden (zur Problematik der Wanderungen von Estergruppen in Diolen siehe Adlercreutz, Biocatal. Biotransfor. 2000, 18, 1 und Biotechnol. Bioeng. 2002, 78, 403).
Die Herstellung von Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden, worin R1COO- ein nicht nitrierter Carbonsäurerest und R2COO- ein Nitrocarbonsäurerest ist, erfordert zwei aufeinanderfolgende regioselektive Veresterungen. Aufgrund der baseempfindlichen Nitrocarbonsäuren muss zunächst die selektive Veresterung der sn-1 -Position mit einem geeigneten Fettsäurebaustein (z.B. Palmitoylchlorid) erfolgen. Hierzu wurde eine von Servi publizierte Methode abgewandelt. Zunächst wird das sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a mit Dibutylzinnoxid in den cyclischen Dibutylzinndiester überführt, welcher dann in situ mit dem Säurechlorid der Carbonsäure 4a und Triethylamin in den Monoester 5a überführt wird (analog Servi, Org. Biomol. Chem. 2006, 4, 2974 und Servi, Chem. Phys. Lipids 2007, 147, 1 13). Dieser kann mit Standardmethoden aufgearbeitet und gereinigt werden. Die so erhaltenen 1 -Acyl-2-lyso-sn-3-glycero-phospholipide 5a werden im Anschluss gemäß der weiterentwickelten Methode von Salomon (Salomon, Biorg. & Med. Chem. 2011 , 19, 580) mit einer Nitrocarbonsäure zum Lipid 6a verestert.
Die möglichen Synthesen sind in folgendem Syntheseschema 5 zusammengestellt:
Schema 5
Figure imgf000091_0001
sn-Glycero- 1 ,2-Di-(nitroacyl)- 3-phosphatid 1 sn-3-glycero-phosphatid 3
1. Bu2SnO, /PrOH
COCI 4, Et3N,
3
Figure imgf000091_0002
1 -Acyl-2-lyso-sn-3- 1 -Acyl-2-(nitroacyl)-sn-3- glycero-phosphatid 5 glycero-phosphatid 6 Die Herstellung von an den Positionen 1 und 2 unterschiedlich acylierten Glycerophosphatide 10 mit empfindlichen Nitroacylgruppen in Position 1 und gewöhnlichen Acylgruppen in Position 2 starten idealerweise vom 2-fach veresterten symmetrisch substituierten Baustein 7, der leicht durch Veresterung aus dem sn- Glycero-3-Phosphatid 1 gewonnen werden kann (analog B. Smith, J. Org: Chem. 2008, 73, 6058). Mittels Phospholipase A (PL-A2) oder ähnliche Lipasen kann hier selektiv die sn-1 -Position zur 1 -lyso-Verbindung 10' freigesetzt werden (analog J. Sakakibara, Tetrahedron Lett. 1993, 34, 2487), eine abschließende Veresterung gemäß R. Salomon (Biorg. & Med. Chem. 2011 , 19, 580) liefert dann das unsymmetrisch substituierte 1 -Nitroacyl-2-(acyl)-sn-3-glycero-phosphatid 10, welches nach sorgfältiger Reinigung für die Beschichtungen genutzt wird.
Schema 6
Figure imgf000092_0001
Beispiel B: Synthese von 1 ,2-Di-(9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin 3a sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a ist kommerziell erhältlich oder wird auf bekannte Weise aus Eier- oder Sojalecithin hergestellt. 1a konnte gemäß der von R. G. Salomon entwickelten Methode (Salomon, Biorg. & Med. Chem. 2011 , 19, 580) mit Nitroölsäure verestert werden. Die Herstellung von 1 ,2-Di-(9-nitrooleoyl)-sn-3- glycero-phosphocholin (ß,Y-Di-(9-nitrooleoyl)-L-a-phosphatidylcholine) 3a gelingt bei konsequentem Vermeiden von basisch-nukleophilen Bedingungen mit gutem Erfolg. Zu einer Suspension aus 0,5 g (1 ,95 nnnnol, 1 Äq.) sn-Glycero-3-phosphocholin 1a in 100 ml trockenem Dichlormethan werden 1 ,93g (5.85 mmol, 3 Äq.) 9-Nitroölsäure (kommerziell erhältlich oder herstellbar nach literaturbekanntem Verfahren) und 0,48 g (0,47 ml, 5,85 mmol, 3 Äq.) 1 -Methylimidazol und 1 ,224 g (5,85 mmol 3 Äq.) 2,6- Dichlorbenzoylchlorid gegeben. Dann wird für drei Tage bei 23 °C gerührt. Die Suspension löst sich langsam auf. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde mittels praparativer Säulenchromatographie und präparativer HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, 95 % MeOH/H2O) gereinigt. Ausbeute: 1 ,21 g (1 ,38 mmol, 71 %) 3a. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C- NMR-Spektroskopie).
1 ,2-Di-(9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero-phosphatidylcholin 3a
173.5, 173.0 (C=O), 150.0, 149.5 (2x C-NO2), 134.5, 133.5 (2x HC=), 71 .5 (d), 67.0 (d), 64.5 (d), 63.0, 60 (d), 54.5 (NMe3), 34.5 - 20.5 (28x CH2), 14.0 (2x CH3).
Beispiel C: Synthese von (E)-1 -Palmitoyl-2-(9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero- phosphocholin 6a
Schema 7
Figure imgf000093_0001
sn-Glycero-3- 1 ,2-Di-(9-nitrooleoyl)-sn-3- phosphatidylcholin 1a glycero-phosphatidylcholin 3a
1. Bu2SnO, /'PrOH
2. C15H31COCI 4a, Et3N,
Figure imgf000093_0002
1 -Palmitoyl-2-lyso-sn-3- 1 -Palmitoyl-2-(9-nitrooleoyl)-sn-3- glycero-phosphatidylcholin 5a glycero-phosphatidylcholin 6a
9-Nitroölsäure wurde gemäß einer bekannten Synthese erhalten (Woodcock, Org. Lett. 2006, 8, 3931 und King, Org. Lett. 2006, 8, 2305) Herstellung von 1 -Palmitoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholin (ß-Lyso-v-palimitoyl-L- α-phosphatidylcholin) 5a
1 g (3.9 nnnnol, 1 Äq) sn-Glycero-3-phosphocholin 1a und 1 .1 g (4.3 nnnnol, 1 .1 Äq) Dibutylzinnoxid werden in 100 ml Isopropanol suspendiert und für 1 h unter Rückfluss erhitzt. Die Lösung wird auf 25 °C abgekühlt und 0.25 ml (7.8 mmol, 2 Äq) Triethylamin und 2.4 ml (7.8 mmol, 2 Äq) Palmitoylchlorid werden zugegeben. Nach 15 min werden 100 ml Wasser hinzugefügt und das Reaktionsgemisch wird mit Heptan (4 x 50 ml) extrahiert. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und der ölige Rückstand in 10 ml EtOH gelöst. Die Lyso-Verbindung 5a wird durch Zugabe von 40 ml Aceton bei -10°C ausgefällt. Die Verbindung kann mittels HPLC aufgereinigt werden. (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, 95 % MeOH/H2O). Ausbeute: 0.9 g (1 .8 mmol, 45 %) 5a als weißer Feststoff. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie). Herstellung von (E)-1 -Palmitoyl-2-(9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin (ß-(9- Nitrooleoyl)-Y-palmitoyl-L-a-phosphatidylcholin) 6a:
Zu einer Lösung aus 0,135 g (0.412 mmol, 2,04 Äq.) (E)-9-Nitroölsäure 25a (erhalten gemäß Beispiel L1 ) und 0.1 g (0.202 mmol) 1 -Palmitoyl-2-lyso-sn-3-glycero- phosphocholin 5a in 10 ml trockenem Dichlormethan werden 0,05 g (0,05 ml, 0,6 mmol, 2,97 Äq.) 1 -Methyl im idazol und 0,14 g (0,01 ml, 0,67 mmol 3,32 Äq.) 2,6- Dichlorbenzoylchlorid gegeben. Dann wird für drei Tage bei 23 °C gerührt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und der Rückstand wird mittels präparativer Säulenchromatographie und präparativer HPLC gereinigt. (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, 95 % MeOH/H2O). Ausbeute: 127,4 mg(0,155 mmol, 77 %) 6a als weißer Feststoff. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie). 1 -Palmitoyl-2-(9-nitrooleoyl)-3-glycerophosphatidylcholin 6a
174.0, 173.5 (C=O), 150.0 (C-NO2), 134.0 (HC=), 71 .0 (d), 66.0 (d), 63.5 (d), 63.0, 59.5 (d), 54.5 (NMe3), 34.5 - 21 .0 (28x CH2), 14.5, 14.0 (2x CH3). Synthese von Phosphatidsäuren, Phosphatidsäureester, Phosphatidyl- ethanolamin und Phosphatidylserin
Schema 8
Figure imgf000095_0001
worin 8b, 8c, 8d, 8e und NL die folgende Bedeutung haben:
Figure imgf000095_0002
worin R1COO- und R2COO- einen nitrierten oder nicht nitrierten und vorzugsweise einen nicht nitrierten Carbonsäurrest darstellen. Da die nitrierten Carbonsäurereste R1COO- und/oder R2COO- basenempfindlich sind und durch die Reaktion in Pyridin zerstört werden können, empfielt sich, für R1COO- als auch R2COO- nicht nitrierte Carbonsäurereste zu verwenden. Die nicht nitrierten Carbonsäurereste R1COO- und R2COO- lassen sich danach durch NaOMe in Methanol wieder verseifen und mit nitrierten Carbonsäureresten so wie hierin beschrieben wieder verestern.
Schutzgruppenabspaltung erfolgt abschließend durch Trifluoressigsäure.
Figure imgf000096_0001
R3* bedeutet hierin eine der unter 8b, 8c, 8d und 8e aufgeführen geschützten Kopfgruppen.
Im Folgenden werden die Synthesen für den Fall beschrieben, dass es sich bei R1COO- und R2COO- um Palmitoylreste handelt.
Herstellung von 1 ,2-Di-(palmitoyl-sn-3-glycerophosphat 7 (analog B. Smith, J. Org: Chem. 2008, 73, 6058):
Zu einer Lösung von 1 ,2-Di-(palmitoyl-sn-3-glycerophosphatidylcholin (1 ,023 g 1 ,52 mmol) in Chloroform/Acetat-Puffer pH 5,6, 80 mM CaCI2, 100/140 ml) wird Phospholipase D (PL-D, 0.5 mg, Str.) gegeben und die Mischung wird bei 40°C über Nacht gerührt. Dann werden die Phasen getrennt und die wässrige wird mit CHCb/MeOH (2:1 ) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit Wasser gewaschen und über Na2SO4 getrocknet. Nach Abziehen des Solvenz wird der Rückstand mittels präparativer Säulenchromatographie an Kieselgel (CHCI3, MeOH, H2O) gereinigt. Ausbeute 831 ,2 mg (1 ,41 mmol, 93%) 7. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Beispiel D: Herstellung von 1 ,2-Di-(palmitoyl-sn-3-glycerophosphatidyl-(N-BOC)- ethanolamin 9c (analog R. Aneja, Tetrahedron Lett. 2000, 41, 847):
Zu einer Lösung von Triisopropylbenzolsulfonsäurechlorid (Tris-Cl, 257 mg, 0,85 mmol) und N-(BOC)-Ethanolamin (137 mg, 0,85 mmol) in trockenem Pyridin (10 ml) wird über eine Stunde 1 ,2-Di-(palmitoyl-sn-3-glycerophosphat 7 (500 mg, 0,85 mmol) in Pyridin via Spritzenpumpe zugegeben. Die Mischung wird für 5 Stunden bei 35 °C gerührt. Dann wird die Reaktion durch Hydrolyse mit Wasser beendet, nach Phasentrennung wird die wässrige noch mit Dichlormethan extrahiert. Die organischen Phasen werden über Na2SO4 getrocknet und nach Abrotieren des Solvenz (Abrauchen mit Toluol zum Entfernen des Pyridins) wird der Rückstand mittels präparativer Säulenchromatographie an Kieselgel (EtOAc/Hexan) gereinigt. Ausbeute 559,2 mg (0,765 mmol, 90%) 9c. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Herstellung von sn-3-Glycerophosphatidyl-(N-BOC)-ethanolamin 1c:
Ansatz und Reaktion wie unter 1b beschrieben mit 1 ,2-Di-(palmitoyl-sn-3- glycerophosphatidyl-(N-BOC)-ethanolamin 9c (500 mg, 0,684 mmol). Reinigung durch Umkristallisieren oder (Kieselgel, Chloroform/MeOH Gradient) oder praparativer HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, 9Gradient MeOH/H2O). Ausbeute 187,4 mg (0,595 mmol, 87%) 1c. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Herstellung von 1 ,2-Di-(9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero-phosphatidyl-N-BOC-ethanolamin (ß,Y-Di-(9-nitrooleoyl)-L-a-phosphatidyl-N-BOC-ethanolamin 3c':
Ansatz und Reaktion wie unter 3a beschrieben mit sn-3-Glycero-phosphatidyl-N- BOC-ethanolamin 1c (150 mg, 0,476 mmol) und 9-Nitroölsäure (467 mg, 1 ,43 mmol). Reinigung durch (Kieselgel, Dichlormethan/MeOH Gradient) oder praparativer HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, Gradient MeOH/H2O). Ausbeute 333,1 mg (0,357 mmol, 75%) 3c'. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR- Spektroskopie).
Herstellung von 1 ,2-Di-(9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero-phosphatidylethanolamin (β,γ-Di- (9-nitrooleoyl)-L-a-phosphatidylethanolamin) 3c:
Ansatz und Reaktion wie unter 3b beschrieben mit 1 ,2-Di-(9-nitrooleoyl)-sn-3- glycero-phosphatidyl-N-BOC-ethanolamin 3c' (300 mg, 0,322 mmol). Reinigung durch (Kieselgel, Dichlormethan/MeOH Gradient) oder praparativer HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, Gradient MeOH/H2O). Ausbeute 260,2 mg (0,312 mmol, 97%) 3c. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR- Spektroskopie).
1 ,2-Di-(9-nitrooleoyl)-3-glycerophosphatidylethanolamin 3c
174.0, 173.0 (C=O), 150.0 (2x C-NO2), 134.5 (2x HC=), 70.5 (d), 63.5 (d), 63.0, 62.0, 41 .0 (d), 34.0 - 22.0 (28x CH2), 14.0 (2x CH3).
Beispiel E: Herstellung von 1 ,2-Di-(palmitoyl-sn-3-glycerophosphatidyl-(N-BOC)- (S)-serin-tert-butylester 9d:
Ansatz und Reaktion wie unter 9c beschrieben mit Di-(palmitoyl-sn-3- glycerophosphat 7 (500 mg, 0,85 mmol) und N-(BOC)-(S)-Serin-tert-butylester (222 mg, 0,85 mmol). Reinigung durch präparative Säulenchromatographie an Kieselgel (EtOAc/Hexan). Ausbeute 652,1 mg (0,773 mmol, 91 %) 9d. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie). Herstellung von sn-3-Glycerophosphatidyl-(N-BOC)-(S)-serin-tert-butylester 1d:
Ansatz und Reaktion wie unter 1b beschrieben mit 1 ,2-Di-(palmitoyl-sn-3- glycerophosphatidyl-(N-BOC)-(S)-serin-tert-butylester 9d (500 mg, 0,602 mmol). Reinigung durch Umkristallisieren oder (Kieselgel, Chloroform/MeOH Gradient) oder präparativer HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, 9Gradient MeOH/H2O). Ausbeute 227,0 mg (0,547 mmol, 91 %) 1d. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie). Herstellung von 1 ,2-Di-(9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero-phosphatidyl-N-BOC-(S)-serin- tert-butylester (ß,Y-Di-(9-nitrooleoyl)-L-a-phosphatidyl-N-BOC-(S)-serin-tert-butylester 3d':
Ansatz und Reaktion wie unter 3a beschrieben mit sn-3-Glycero- phosphatidyl-N- BOC-(S)-serin-tert-butylester 1d (150 mg, 0,361 mmol) und 9-Nitroölsäure (355 mg, 1 ,08 mmol). Reinigung durch (Kieselgel, Dichlormethan/MeOH Gradient) oder präparativer HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, Gradient MeOH/H2O). Ausbeute 287,2 mg (0,278 mmol, 77%) 3d'. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie). Herstellung von 1 ,2-Di-(9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero-phosphatidylserin (ß,v-Di-(9- nitrooleoyl)-L-a-phosphatidylserin) 3d:
Ansatz und Reaktion wie unter 3b beschrieben mit 1 ,2-Di-(9-nitrooleoyl)-sn-3- glycero-phosphatidyl-N-BOC-(S)-serin-tert-butylester 3d' (250 mg, 0,242 mmol). Reinigung durch (Kieselgel, Dichlormethan/MeOH Gradient) oder präparativer HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, Gradient MeOH/H2O). Ausbeute 210,1 mg (0,240 mmol, 99%) 3d. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR- Spektroskopie).
Beispiel F: Herstellung von 1 ,2-Di-palmitoyl-sn-3-glycerophosphatidyl-penta-O- methoxymethylinositol 9e:
Ansatz und Reaktion wie unter 9c beschrieben mit Di-(palmitoyl-sn-3- glycerophosphat 7 (500 mg, 0,85 mmol) und Penta-O-methoxymetyl-inositol (320 mg, 0,85 mmol). Reinigung durch präparative Säulenchromatographie an Kieselgel (EtOAc/Hexan). Ausbeute 692,6 mg (0,714 mmol, 84%) 9e. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Herstellung von sn-3-Glycerophosphatidyl-penta-O-methoxymethylinositol 9e:
Ansatz und Reaktion wie unter 1b beschrieben mit 1 ,2-Di-(palmitoyl-sn-3- glycerophosphatidyl-penta-O-methoxymethylinositol 9e (500 mg, 0,515 mmol). Reinigung durch Umkristallisieren oder (Kieselgel, Chloroform/MeOH Gradient) oder präparativer HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, 9Gradient MeOH/H2O). Ausbeute 257,1 mg (0,464 mmol, 90%) 1e. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Herstellung von 1 ,2-Di-(9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero-phosphatidyl-penta-O- methoxymethylinositol (ß,v-Di-(9-nitrooleoyl)-L-a-phosphatidyl-penta-O- methoxymethylinositol 3e':
Ansatz und Reaktion wie unter 3a beschrieben mit sn-3-Glycero-phosphatidyl-penta- O-methoxymethylinositol 1e (150 mg, 0,271 mmol) und 9-Nitroölsäure (266 mg, 0,812 mmol). Reinigung durch (Kieselgel, Dichlormethan/MeOH Gradient) oder präparativer HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, Gradient MeOH/H2O). Ausbeute 244,9 mg (0,209 mmol, 77%) 3e'. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Herstellung von 1 ,2-Di-(9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero-phosphatidylinositol (ß,v-Di-(9- nitrooleoyl)-L-a-phosphatidylinositol) 3e:
Ansatz und Reaktion wie unter 3b beschrieben mit 1 ,2-Di-(9-nitrooleoyl)-sn-3- glycero-phosphatidyl-penta-O-methoxymethylinositol 3e' (200 mg, 0,171 mmol). Reinigung durch (Kieselgel, Dichlormethan/MeOH Gradient) oder präparativer HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, Gradient MeOH/H2O). Ausbeute 160,8 mg (0,169 mmol, 99%) 3e. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR- Spektroskopie). Beispiel G: Herstellung von sn-3-Glycero-di-tert.-butylphosphat 1 b analog J. Brimacombe (J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 1995, 1673) oder H. Brockerhoff, M. Yurkowski {Can. J. Biochem., 1965, 43, 1777).
Das Ausgangsmaterial Di-(palmitoyl-sn-3-glycero-ditert.-butylphosphat 9b wird nach P. Konradsson, (J. Org. Chem. 2002, 67, 194) hergestellt. Eine Lösung von Di- (palmitoyl-sn-3-glycero-ditert.-butylphosphat 9b (600 mg, 0,871 mmol) wird in Diethylether/Methanol (50 ml, 1 :1 ) gelöst und mit einer katalytischen Menge an Natriummethanolat versetzt. Nach Rühren für 1 Stunde bei Raumtemperatur wird mit Amberlit 1 R120 neutralisiert. Die Lösungsmittel werden im Vakuum entfernt und der Rückstand wird umkristallisiert oder mittels präparativer Säulenchromatographie (Kieselgel, Chloroform/MeOH Gradient) oder präparativer HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, 9Gradient MeOH/H2O) gereinigt. Ausbeute: mg 204,5 mg (0,749 mmol, 86%) 1 b. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR- Spektroskopie). Herstellung von 1 ,2-Di-(9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero-di-tert.-butylphosphat (ß,v-Di-(9- nitrooleoyl)-L-a-di-tert.-butylphosphat) 3b' (nach R. Salomon, Biorg. & Med. Chem. 2011 , 19, 580).
Ansatz und Reaktion wie unter 3a beschrieben mit sn-3-Glycero-di-tert.- butylphosphat 1 b (150 mg, 0,549 mmol) und 9-Nitroölsäure (539 mg, 1 ,65 mmol). Reinigung durch (Kieselgel, Dichlormethan/MeOH Gradient) oder praparativer HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, Gradient MeOH/H2O). Ausbeute 413,4 mg (0,464 mmol, 58%) 3b'. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR- Spektroskopie).
Herstellung von 1 ,2-Di-(9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero-phosphat (ß,v-Di-(9-nitrooleoyl)-L- α-phosphat) 3b (analog P. Konradsson: J. Org. Chem. 2002, 67, 194 und B. Smith: J. Org: Chem. 2008, 73, 6058):
Schutzgruppenabspaltung: 1 ,2-Di-(9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero-di-tert. -butylphosphat (300 mg, 0,337 mmol) in Dichlormethan (30 ml) wird unter Rühren bei Raumtemperatur mit Trifluoressigsäure (8 ml) versetzt. Nach 30 Minuten wird die Reaktion durch Zugabe von Methanol (0,4 ml) beendet. Die Lösung wird mit Toluol (80 ml) verdünnt, dann werden die Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wird durch praparative Säulenchromatographie und praparativer HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, Gradient MeOH/H2O) gereinigt. Ausbeute: 264 mg (0,336 mmol, 99 %) 3b. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR- Spektroskopie).
Analytik der erfindungsgemäßen Verbindungen
13C-NMR-Daten (beim Auftreten von 31P-13C-Kopplungen 2J, 3J sind die Multiplizitäten als Dublett„d" angegeben)
13C-NMR Messung jeweils mit Bruker ARX400 oder Bruker Avance II (AV) 400 bei 100.6 MHz, in CDCI3, 22°C, Breitband-entkoppelt) Allgemeine Synthese von Nitrocarbonsäuren
Die Synthese von Nitrocarbonsäuren kann nach zwei Strategien erfolgen. Einerseits kann ausgehend von der kommerziell erhältlichen Carbonsäure die direkte Nitrierung erfolgen. Hier ist jedoch zu berücksichtigen, dass in der Regel regioisomere Produkte erhalten werden, die zum Schluss getrennt werden müssen, sofern sie nicht als Gemisch eingesetzt werden (M. D'lschia, J. Org. Chem. 2000, 65, 4853). Insbesondere die mehrfach ungesättigten Ausgangsmaterialien erfordern hier sorgfältig ausgearbeitete Techniken. Eine zweite Strategie startet von ausgewählten Nitroalkanen und Aldehyden, die dann im Sinne einer Henry-Reaktion mit anschließender Kondensation zum Nitroalken umgesetzt werden. Dieser Ansatz ist zwar vom Syntheseaufwand her komplizierter und langwieriger, liefert dafür aber keine Produkt-Regioisomerengemische, die Aufreinigung der Zielsubstanzen ist signifikant leichter. Die hier notwendigen Ausgangsmaterialien können entweder aus kommerziellen Quellen bezogen oder durch geeigneten Abbau von Fettsäuren gewonnen werden. Alle Synthesen sind an literaturbekannte Vorschriften angelehnt. Alle mehrfach ungesättigten Fettsäuren sind luftempfindlich, so dass unter Schutzgasatmosphäre gearbeitet werden sollte. Alle Nitroalkene addieren rasch im Basischen Nukleophile wie OH", Amine, etc.. Beispiel H1 : radikalische Nitrierung von Linolsäure 1
Ungesättigte und mehrfach ungesättigte Carbonsäuren lassen sich radikalisch nitrieren analog Ishibashi (Org. Lett. 2010, 12, 124). Am Beispiel der Linolsäure [(Z,Z)-9,12-Octadecadiensäure] wird die radikalische Nitrierung beschrieben, welche zu Regioisomerengemische führt. Es meist ratsam, das gasförmige giftige N2O4 durch die Kombination FeCl3 Fe(NOs)3 zu ersetzen.
Schema 9
Figure imgf000101_0001
Linolsäure 1 (840 mg, 3 mmol) und FeCb (730 mg, 4,5 mmol) werden in THF (30 ml) gelöst. Dann wird Fe(NOs)3-nonahydrat (1 ,46 mg, 3,6 mmol) zugegeben und der Ansatz wird für 2 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur liegt ein Gemisch aus ß-Chlor-Nitroalkanen 2 und Nitroalkenen 3/4 vor. Zur Vervollständigung der HCI-Eliminierung wird mit THF (20 ml) verdünnt dann wird N,N-Dimethylaminopyridin (550 mg, 4,5 mmol) zugegeben. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wird die Suspension mit Diethylether verdünnt und der Feststoff (Eisen- und Ammoniumsalze) wird abfiltriert. Die Lösungsmittel werden im Vakuum abdestilliert und der Rückstand wird mittels präparativer Säulenchromatographie an Kieselgel (Hexan/Essigester-Gradient) vor-gereinigt und vor-getrennt. Die Feinreinigung erfolgt durch präparative HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, Gradient MeOH/H2O) gereinigt. Ausbeute: 214,5 mg (0,66 mmol, 22 %) 9-Nitrolinolsäure 3, 361 mg (1 ,1 1 mmol, 37 %) 10-Nitrolinolsäure 4, 156 mg (0,48 mmol, 16 %) 12-Nitrolinolsäure, 9-Nitro-10,1 1 -octadiensäure,16 mg (0,05 mmol, 1 ,6 %) und weitere Mindermengenisomere. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Anmerkung: Die Reaktion von 9-Nitrolinolsäure 3 (50 mg, 0,154 mmol) liefert nach Reaktion unter oben beschriebenen Bedingungen 9,12-Dinitrolinolsäure 5 (8 mg, 0,022 mmol, 13,9 %), 9,13-Dinitrolinolsäure 6 (7 mg, 0,019 mmol, 12,1 %) sowie weitere Produkte.
Die Reaktion von 10-Nitrolinolsäure 4 (50 mg, 0,154 mmol) liefert nach Reaktion unter oben beschriebenen Bedingungen 10,12-Dinitrolinolsäure 7 (8 mg, 0,022 mmol, 13,9 %), 10,13-Dinitrolinolsäure 8 (9 mg, 0,024 mmol, 16 %) sowie weitere Produkte.
Beispiel H2: radikalische Nitrierung von Arachidonsäure 9
Analog zu M. d'lschia (J. Org. Chem. 2000, 65, 4853), M. Balazy {Free Rad. Biol. & Med. 2008, 45, 269 sowie Free Rad. Biol. & Med. 201 1 , 50, 41 1 ) wurde 5,8,1 1 ,14- Eicosatetraensäure (Arachidonsäure) radikalisch nitriert.
Schema 10
Figure imgf000102_0001
9 13
N02, Hexan NO, 02, Hexan dann H20, dann H20,
EtOAc EtOAc
Figure imgf000102_0002
Arachidonsäure 9 (100 mg, 0,33 mmol) wird mit einer Lösung von NO2 in Hexan (0,7 mM, Dichte 3,4 g/cm3) versetzt und bei Raumtemperatur für 15 min gerührt. Überschüssiges NO2 wird dann im Stickstoff-Strom ausgeblasen und der Rückstand wird in Wasser und EtOAc (1 :1 , 10 ml) aufgenommen. Die organische Phase wird mehrfach mit Wasser extrahiert, dann wird das Solvenz abdestilliert. Der Rückstand wird via HPLC analysiert und aufgetrennt (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, Gradient MeOH/H2O). Es bilden sich diverse regioisomere Mononitnerungsprodukte mit niedriger Ausbeute sowie weitere nicht näher charakterisierte Verbindungen. 6-Nitroarachidonsäure 10 (6 mg, 0,017 mmol, 5,2%), 14-Nitroarachidonsäure 11 (8 mg, 0,023 mmol, 6,9%), 5-Nitroarachidonsäure 12 (3 mg, 0,009 mmol, 2,6%). (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Beispiel H3: radikalische Nitrierung von Arachidonsäure 9
Analoge Reaktionsführung wie in Beispiel H2 jedoch mit NO-Gas (einleiten) und O2- gesättigtem Hexan.
Es wird ein Gemisch aus 6-Nitroarachidonsäure 14, 14-Nitroarachidonsäure 15, 5- Nitroarachidonsäure 16 im Verhältnis 4:5:3 und einer Ausbeute bezogen auf das Gemisch von ca. 12% erhalten. Beispiel H4: radikalische Nitrierung von γ-Linolensäure 13
Gemäß der Vorschrift aus Beispiel H2 wird 6,9,12-Octadecatriensäure (γ- Linolensäure) 13 (100 mg, 0,36 mmol) nitriert. Analyse und Trennung via HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, Gradient MeOH/H2O). Es bilden sich diverse regioisomere Mononitnerungsprodukte mit niedriger Ausbeute sowie weitere nicht näher charakterisierte Verbindungen. 6-Nitro-Y-linolensäure 14 (8 mg, 0,025 mmol, 6,9 %), 12-Nitro-Y-linolensäure 15 (8 mg, 0,025 mmol, 6,9%), 5-Nitro-y- linolensäure 16 (2 mg, 0,006 mmol, 1 ,7%) Struktur nicht ganz sicher.
Beispiel H5: radikalische Nitrierung von DHA
Gemäß der Vorschrift aus Beispiel H2 wird (Z,Z,Z,Z,Z,Z)-4,7,10,13,16,19- Docosahexaensäure (DHA) (100 mg, 0,30 mmol) nitriert. Analyse und Trennung via HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, Gradient MeOH/H2O). Es bilden sich diverse regioisomere Mononitnerungsprodukte mit niedriger Ausbeute sowie weitere nicht näher charakterisierte Verbindungen. Isoliert wurde ein Gemisch aus 4-Nitro- DHA, 5-Nitro-DHA, 19-Nitro-DHA und 20-Nitro-DHA in einer Ausbeute von ca. 7,1 %.
Beispiel H6: radikalische Nitrierung von Palmitoleinsäure
Gemäß der Vorschrift aus Beispiel H2 wird cis-9-Hexadecensäure (Palmitoleinsäure) (200 mg, 0,79 mmol) nitriert. Analyse und Trennung via HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, Gradient MeOH/H2O). Erhalten wurde ein Gemisch aus 9-Nitropalmitoleinsäure (68 mg, 0,23 mmol, 29%) und 10-Nitropalmitoleinsäure (52 mg, 0,17 mmol, 22%).
Beispiel 11 : Elektrophile Nitrierung von Linolsäure 1
Die elektrophile Nitrierung von Linolsäure 1 erfolgt gemäß M. d'lschia (J. Org. Chem. 2008, 73, 7517).
Schema 1 1
Figure imgf000104_0001
Bei -78°C unter Argon wird eine Lösung von Linolsäure 1 (1 g, 3,6 mmol) in trockenem THF (6 ml) langsam zu einer Lösung von Phenylselenylbromid (843 mg, 3,6 mmol) in trockenem THF (10 ml) unter Rühren getropft. Nach etwa 20 min Reaktionszeit wird HgC (1 ,26 g, 4,6 mmol) zugegeben, danach wird eine Lösung von AgNO2 (550 mg, 3,6 mmol) in trockenem Acetonitril (15 ml) via Spritzenpumpe binnen 60 min langsam zugetropft. Nach zwei Stunden Rühren bei tiefer Temperatur und weiteren zwei Stunden bei Raumtemperatur wird die Reaktion gestoppt. Der Niederschlag (AgBr) wird durch Filtration über eine kurze Celite-Säule entfernt (gründliches Nachwaschen mit Diethylether). Nach Entfernen der Lösungsmittel im Vakuum wir der Rückstand in Dichlormethan aufgenommen und mehrfach mit gesättigter NaCI-Lösung gewaschen und über Na2SO4 getrocknet. Nach erneutem Entfernen des Solvenz wird der Rückstand mittels präparativer HPLC-Chromatographie getrennt (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, Gradient MeCN/H2O). Als Hauptfraktionen werden die beiden Regioisomeren 9/10-Nitro- 10/9-phenylselenyl-fettsäurederivate 17 als Diastereomerengemische erhalten. Die Fraktionen können gemeinsam oder getrennt in den folgenden Eliminierungen eingesetzt werden. Die Fraktionen 17a und/oder 17b werden in Dichlormethan (10 ml) gelöst und unter intensivem Rühren mit einem Überschuss an wässrigem H2O2 (ca 8% in H20, mindestens 4 Äq.) versetzt. Nach 1 Stunde bei 0°C und einer Stunde bei Raumtemperatur wird mit Ether verdünnt, die Phasen werden getrennt und die organische Phase wird intensiv mit gesättigter NaCI-Lösung gewaschen und über Na2SO4 getrocknet. Nach Entfernen des Solvenz wird der Rückstand mittels präparativer HPLC-Chromatographie getrennt (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, MeCN/H2O). Ausbeute: 1 15 mg (0,354 mmol, 10 %) 10-Nitrolinolsäure 4 und 320 mg 9-Nitrolinolsäure 3 (0,98 mmol, 27 %). (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C- NMR-Spektroskopie).
Beispiel 12: Elektrophile Nitrierung von Gadoleinsäure
Gemäß der Vorschrift aus Beispiel 11 wird (Z)-9-Eicosensäure (Gadoleinsäure) (150 mg, 0,48 mmol) nitriert. Analyse und Trennung via HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, Gradient MeOH/H2O). Erhalten wurde ein Gemisch aus 9- Nitrogadoleinsäure (42 mg, 0,12 mmol, 25%) und 10-Nitrogadoleinsäure (19 mg, 0,05 mmol, 1 1 %).
Beispiel 13: Elektrophile Nitrierung von EPA
Gemäß der Vorschrift aus Beispiel 11 wird (Z,Z,Z,Z,Z)-5,8,1 1 ,14,17-Eicosapenta- ensäure (EPA) (100 mg, 0,33 mmol) nitriert. Analyse und Trennung via HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, Gradient MeOH/H2O). Erhalten wurde ein Gemisch aus 5-Nitro-EPA (17 mg, 0,05 mmol, 15%) und 6-Nitro-EPA (7 mg, 0,02 mmol, 6%). Beispiel 14: Elektrophile Nitrierung von a-Linolensäure
Gemäß der Vorschrift aus Beispiel 11 wird (Z,Z,Z)-9,12,15-Octadecatriensäure (a- Linolensäure) (150 mg, 0,54 mmol) nitriert. Analyse und Trennung via HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, Gradient MeOH/H2O). Erhalten wurde ein Gemisch aus 9-Nitro-a-Linolensäure (37 mg, 0,1 1 mmol, 21 %) und 10-Nitro-a- Linolensäure (21 mg, 0,06 mmol, 12%).
Beispiel J1 : Addition von Wasser an nitrierte Linolsäure 1
Die Nitrierung wird durchgeführt, wie im Beispiel 11 beschrieben. In Gegenwart von wässriger Tetrabutylammoniumhydroxid-Lösung und Dichlormethan addiert das Nitroalken glatt H2O. Man erhält die 9-Hydroxy-10-nitro-12-octadecensäure 19 aus 10-Nitrolinolsäure 4 bzw. die 10-Hydroxy-9-nitro-12-octadecensäure 18 aus der 9- Nitrolinolsäure 3. Aufarbeitung wie im Beispiel 11 beschrieben. Reinigung via präparative HPLC wie im Beispiel 11 . Die jeweilige Trennung der Diastereomere ist möglich, aber aufwendig. 9-Hydroxy-10-nitro-12-octadecensäure 19 wir in einer Ausbeute von 10% und 10-Hydroxy-9-nitro-12-octadecensäure 18 in einer Ausbeute von 30% erhalten.
Beispiel J2: Addition von Wasser an nitrierte Gadoleinsäure
Gemäß der Vorschrift aus Beispiel J1 wird die gemäß Beispiel 12 nitrierte (Z)-9- Eicosensäure (Gadoleinsäure) (150 mg, 0,48 mmol) mit wässriger Tetrabutylammoniumhydroxid-Lösung und Dichlormethan umgesetzt. Es findet Addition von Wasser statt und es ergibt sich ein Produktgemisch aus 10-Hydroxy-9- nitroeicosansäure und 9-Hydroxy-10-nitroeicosansäure in einem Verhältnis von ca. 5:2 und einer Ausbeute von ca. 30% (54 mg Gemisch, 0,86 mmol Gemisch). Analyse und Trennung via HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, Gradient MeOH/H2O). Die Diastereomeren lassen sich trennen, was jedoch aufwendig ist und für die Zwecke der vorliegenden Erfindung auch nicht erforderlich ist. Beispiel J3: Addition von Wasser an nitrierte EPA
Gemäß der Vorschrift aus Beispiel J1 wird die gemäß Beispiel 13 nitrierte (Ζ,Ζ,Ζ,Ζ,Ζ)- 5,8,1 1 ,14,17-Eicosapentaensäure (EPA) (100 mg, 0,33 mmol) mit wässriger Tetrabutylammoniumhydroxid-Lösung und Dichlormethan umgesetzt. Es findet Addition von Wasser statt und es ergibt sich ein Produktgemisch aus 6-Hydroxy-5- nitro-EPA (14 mg) und 5-Hydroxy-6-nitro-EPA (5 mg) in einem Verhältnis von ca. 5:2 und einer Ausbeute von ca. 16% (0,05 mmol). Analyse und Trennung via HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, Gradient MeOH/H2O). Die Diastereomeren lassen sich trennen, was jedoch sehr aufwendig ist und für die Zwecke der vorliegenden Erfindung auch nicht erforderlich ist.
Beispiel J4: Addition von Wasser an nitrierte a-Linolensäure
Gemäß der Vorschrift aus Beispiel J1 wird die gemäß Beispiel 14 nitrierte (Ζ,Ζ,Ζ)- 9,12,15-Octadecatriensäure (a-Linolensäure) (150 mg, 0,54 mmol) mit wässriger Tetrabutylammoniumhydroxid-Lösung und Dichlormethan umgesetzt. Es findet Addition von Wasser statt und es ergibt sich ein Produktgemisch aus 10-Hydroxy-9- nitro-a-Linolensäure und 9-Hydroxy-10-nitro-a-Linolensäure in einem Verhältnis von ca. 2:1 und einer Ausbeute von ca. 26% (48 mg Gemisch, 0,14 mmol Gemisch). Analyse und Trennung via HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, Gradient MeOH/H2O). Die Diastereomeren lassen sich trennen, was jedoch aufwendig ist und für die Zwecke der vorliegenden Erfindung auch nicht erforderlich ist.
Beispiel K1 : Elektrophile Zweifachnitrierung von Linolsäure 1
Durch Wiederholung der in Beispiel 11 beschriebenen Nitrierung mit den gemäß Beispiel 11 erhaltenen Nitrierungsprodukten können 2-fach nitrierte Linolsäuren 5 - 8 gemäß Schema 9 erhalten werden. Bei der zweiten Nitrierung reagiert die elektronenreiche Doppelbindung regioselektiv. Bei der Nitrierung von 10-Nitrolinolsäure 4 und 9-Nitrolinolsäure 3 entsteht ein Produktgemisch aus 9,12-Dinitrolinolsäure, 9,13-Dinitrolinolsäure, 10,12-Dinitrolinolsäure und 10,13- Dinitrolinolsäure.
Beispiel K2: Elektrophile Zweifachnitrierung von Gadoleinsäure
Es konnte gezeigt werden, dass eine gemäß Beispiel 12 einmal nitrierte Doppelbindung gemäß der Vorschrift nach Beispiel 12 nicht ein weiteres Mal nitiert werden kann, was auf den elektronenziehenden Effekt der vorhandenen Nitrogruppe zurückzuführen ist.
Beispiel K3: Elektrophile Zweifachnitrierung von EPA
Durch Wiederholung der in Beispiel 13 beschriebenen Nitrierung mit den gemäß Beispiel 13 erhaltenen Nitrierungsprodukten wurde eine zweite Nitrierung durchgeführt. Eingesetzt wurde ein Gemisch aus 5-Nitro-EPA und 6-Nitro-EPA (24 mg, 0,07 mmol). Es wurde ein Regioisomerengemisch aus 5,17-Dinitro-EPA, 5,18- Dinitro-EPA, 6,17-Dinitro-EPA und 6,18-Dinitro-EPA in einer Ausbeute 10% (3 mg, 0,007 mmol) erhalten.
Beispiel K4: Elektrophile Zweifachnitrierung von a-Linolensäure
Durch Wiederholung der in Beispiel 14 beschriebenen Nitrierung mit den gemäß Beispiel 14 erhaltenen Nitrierungsprodukten wurde eine zweite Nitrierung durchgeführt. Eingesetzt wurde ein Gemisch aus 9-Nitro-a-Linolensäure und 10- Nitro-a-Linolensäure (50 mg, 0,15 mmol). Es wurde ein Regioisomerengemisch aus 9,15-Dinitro-a-Linolensäure, 9,16-Dinitro-a-Linolensäure, 10,15-Dinitro-a- Linolensäure und 10,16-Dinitro-a-Linolensäure in einer Ausbeute 9% (5 mg, 0,014 mmol) erhalten. Beispiel L1 : Henry-Reaktion aus Nitroalkanen und Aldehyden
Im folgenden wird die Henry-Reaktion aus Nitroalkanen und Aldehyden nach B. King (Org. Lett. 2006, 8, 2305) und B. Branchaud (Org. Lett. 2006, 8, 3931 ) dargestellt.
Schema 12 P
Figure imgf000108_0001
20 21 22
(PhSe)2, NaBH4
Figure imgf000108_0002
23 24 P
Figure imgf000108_0003
26 27 28
1 . (PhSe)2, NaBH4
Figure imgf000108_0004
Addition: Zu einer Mischung von 9-Nitrononansäuremethylester 20 (4,2 g, 19,33 mmol) und Nonanal 21a (2,75g, 19,33 mmol) werden bei 0°C mit DBU (0,3 g, 1 ,93 mmol, 10 mol%) zugetropft. Nach beendeter Zugabe wird über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionmischung wird dann mit 20 ml Diethylether und 20 ml 0,1 M Salzsäure versetzt. Die wässrige Phase wird mit Diethylether extrahiert und die vereinigten organischen Phasen werden mit Wasser und gesättigter NaCI-Lösung gewaschen und über Na2SO4 getrocknet. Nach Abziehen des Lösungsmittels und säulenchromatographischer Reinigung (Kieselgel, EtOAc/Hexan 1 :3) wird das ß- Hydroxynitroalkan 22a (6,56 g, 17,01 mmol, 88% Ausbeute) erhalten. (Reinheitskontrolle via 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Kondensation: Zu einer Lösung von ß-Hydroxynitroalkan 22a (6,56 g, 17,01 mmol), DMAP (25,9 mg, 0,17 mmol) in Diethylether (40 ml) wird Acetanhydrid gegeben (1 ,91g, 18,71 mmol). Die Mischung wird für 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Entfernen des Ethers im Vakuum wir der Rückstand in Dichlormethan (40 ml) gelöst, mit DMAP (2,49g, 20,4 mmol) versetzt und bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Dann wird mit Dichlormethan (300 ml) verdünnt und mit Wasser 0,1 M Salzsäure und gesättigter NaCI-Lösung gewaschen. Die organischen Phasen werden über MgSO4 getrocknet, nach Abziehen des Solvenz wird das Rohprodukt mittels Säulenchromatographie an Kieselgel und präparative HPLC gereinigt (Poly- gosil 60-5, 1 ,3% EtOAc in Hexan). Ausbeute an 9-Nitroölsäuremethylester 23a: 3,89 g (1 1 ,4 mmol, 67%). (Reinheitskontrolle via 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie). Esterhydrolyse: Der 9-Nitroölsäuremethylester 23a (3,89 g, 1 1 ,4 mmol) wird mit 6 M Salzsäure (100 ml) für 18 Stunden unter Ruckfluss gekocht. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird die Reaktionsmischung gründlich mit EtOAc extrahiert. Die organischen Phasen werden mit gesättigter NaCI-Lösung gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Nach Abziehen des Solvenz wird das Rohprodukt mittels Säulenchromatographie an Kieselgel und präparative HPLC gereinigt (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, MeCN/H2O). Ausbeute an 9-Nitroölsäure 24a: 2,57 g (7,87 mmol, 69 %). (Reinheitskontrolle via 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Die stereoisomere E-9-Nitroölsäure 25a kann auf der Stufe des Methylesters 24a als Mindermengenprodukt (389 mg, 10% Ausbeute) abgetrennt werden. Reinheitskontrolle via 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie). Eine Z/E-Isomerisierung der Z-9-Nitroölsäure 24a gelingt nach Branchaud (1 . PhSeSePh, NaBH , dann HOAc, 2. H2O2) unter Einsatz von 1 mmol (207 mg) Säure 24a mit 71 % Ausbeute als Z/E-Gemisch von 1 :3, die Trennung der Nitroolefine 24a und 25a mittels HPLC wie oben, Reinheitskontrolle via 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Beispiel L2: Synthese von 10-Nitroöl säure 30a
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel L1 wird 9-Oxo-nonansäuremethylester 26 (1 , 0 g, 5,38 mmol) mit 1 -Nitrononan 27a (0,93 g, 5,38 mmol) umgesetzt und liefert 10- Nitroölsäure 30a mit 44,5% (784 mg, 2,39 mmol) über alle Stufen. HPLC-Reinigung (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, MeCN/H2O). (Reinheitskontrolle via 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Beispiel L3: Herstellung von Z-9-Nitropalmitoleinsäure 24b:
Reaktion gemäß Beispiel L1 mit 9-Nitrononansäuremethylester 20 (1 g, 4,6 mmol) und Heptanal 21 b (524,4 mg, 4,6 mmol) über die in Beispiel L1 beschriebene Sequenz liefert 9-Nitropalmitoleinsäure 24b mit 41 ,6% (573 mg, 1 ,91 mmol) Ausbeute über alle Stufen. HPLC-Reinigung (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, MeCN/H2O). (Reinheitskontrolle via 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Beispiel L4: Herstellung von Z-10-Nitropalmitoleinsäure 30b:
Reaktion gemäß Beispiel L1 mit 9-Oxo-nonansäuremethylester 26 (1 , 0 g, 5,38 mmol) und 1 -Nitroheptan 27b (0,78 g, 5,38 mmol) über die in Beispiel L1 beschriebene Sequenz ergibt die 10-Nitropalmitoleinsäure 30b mit 38,5% (620 mg, 2,07 mmol) Ausbeute über alle Stufen. HPLC-Reinigung (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, MeCN/H2O). (Reinheitskontrolle via 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Beispiel M1 : Semisynthesen aus a-Linolensäure 32 Reaktionen von a-Linolensäure 32: Kommerziell erhältliche a-Linolensäure 32 wird analog A. Makriyannis (J. Lab. Comp. Radiopharm. 2003, 46, 645) bzw. W. Boland {Tetrahedron 2003, 59, 135) via Epoxid 33 zum Aldehyd 34 abgebaut. Nach B. Branchaud {Org. Lett. 2006, 8, 3931 ) wird der Aldehyd 34 in den Nitroester 36 weiter umgesetzt. Die Henry-Kondensation erfolgt, wie oben beschrieben, mit Propanal 37 (R = CH3) zu 38. Die Esterhydrolyse 38 zu 41 erfolgt abweichend nach einer Methode von G. Zanoni und G. Vidari (J. Org. Chem. 2010, 75, 831 1 ):
(Enzymatische Esterspaltung) Z-15-Nitro-a-linolensäuremethylester 38 (120 mg, 0,356 mmol, R = Me) wird in t-Butylmethylether (35 ml) und Wasser (0,178 ml, 0,178 mmol) gelöst. Dann wird unter Rühren Festkörper-geträgerte Candida Antarctica Lipase B (CAL-B, 30 mg) wird zugegeben und die Mischung wird für 18 Stunden bei 35°C gerührt. Nach Abfiltrieren des Enzyms (Filter mit MeCN/t.-Butylmethylether gründlich spülen) wird das Lösungsmittel bei Temperaturen unter 15°C im Vakuum abgezogen. Die Feinreinigung erfolgt mittel präparativer HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, MeCN/H2O). Ausbeute: Z-15-Nitro-a-linolensäure 41 : 106,9 mg (0,331 mmol, 93%, R=Me). (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR- Spektroskopie).
Schema 13
Figure imgf000110_0001
1 . 10% HCI04, Et20
2. Pb(OAc)4, C H2CI2, -30°C
Figure imgf000110_0002
41 Beispiel M2: Herstellung von Z-15-Nitro-a-linolensäure 41 (R = CH3)
Reaktion mit 15-Nitro-9,12-pentadecadiensäuremethylester 36 (198 mg, 0,667 mmol) und Propanal 37 (38,7 mg, 0,667 mmol, R = CH3) über die in Beispiel M1 beschriebene Sequenz und die enzymatische Esterspaltung liefert Z-15-Nitro-a- linolensäure 41 mit 49,6% (106,9 mg, 0,331 mmol, R = CH3). Ausbeute über alle Stufen. HPLC-Reinigung (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, MeCN/H2O). (Reinheitskontrolle via 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie). Beispiel M3: Herstellung von Z-16-Nitro-a-linolensäure 42 (R = CH3)
Reaktion mit 15-Oxo-9,12-pentadecadiensäuremethylester 34 (201 mg, 0,756 mmol) und Nitropropan 39 (67,3 mg, 0,756 mmol, R = CH3) über die in Beispiel M1 beschriebene Sequenz und die enzymatische Esterspaltung 40 in 42 liefert Z-16- Nitro-a-linolensäure 42 mit 54,1 % (138,2 mg, 0,41 mmol, R = CH3). Ausbeute über alle Stufen. HPLC-Reinigung (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, MeCN/H2O). (Reinheitskontrolle via 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Beispiel M4: Herstellung von Z-15-Nitro-9,12,15-eicosatriensäure 41 (R = C3H7) Reaktion mit 15-Nitro-9,12-pentadecadiensäuremethylester 36 (198 mg, 0,667 mmol) und Pentanal 37 (57,4 mg, 0,667 mmol, R = C3H7) über die in Beispiel M1 beschriebene Sequenz und die enzymatische Esterspaltung liefert Z-15-Nitro- 9,12,15-eicosatriensäure 41 mit 48,1 % (1 12,6 mg, 0,321 mmol, R = C3H7). Ausbeute über alle Stufen. HPLC-Reinigung (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, MeCN/H2O). (Reinheitskontrolle via 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Beispiel M5: Herstellung von Z-16-Nitro-9,12,15-docosatetraensäure 42 (R = C5Hn) Reaktion mit 15-Oxo-9,12-pentadecadiensäuremethylester 34 (151 mg, 0,568 mmol) und Nitroheptan 39 (64,7 mg, 0,568 mmol, R = C5Hn) über die in Beispiel M1 beschriebene Sequenz und die enzymatische Esterspaltung 40 in 42 liefert Z-16- Nitro-9,12,15-docosatetraensäure 42 mit 42,4% (91 ,3 mg, 0,241 mmol, R = C5Hn) Ausbeute über alle Stufen. HPLC-Reinigung (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, MeCN/H2O). (Reinheitskontrolle via 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Beispiel N1 : Synthese des Gemisches von 1 ,2-Di-(9-nitrolinoleoyl)-sn-3- glycero-phosphocholin, 1 ,2-Di-(10-nitrolinoleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin, 1 -(9-nitrolinoleoyl)-2-(10-nitrolinoleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin und 1 -(10- nitrolinoleoyl)-2-(9-nitrolinoleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel B wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (103 mg, 0,4 mmol) mit einem gemäß Beispiel H1 erhaltenen Gemisch aus 9- Nitrolinolsäure 3 und 10-Nitrolinolsäure 4 (Gemisch im Verhältnis 1 :1 , 0,4 g, 1 ,2 mmol) verestert. Es wurde ein Produktgemisch aus 1 ,2-Di-(9-nitrolinoleoyl)-sn-3- glycero-phosphocholin, 1 ,2-Di-(10-nitrolinoleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin, 1 -(9- nitrolinoleoyl)-2-(10-nitrolinoleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin und 1 -(10- nitrolinoleoyl)-2-(9-nitrolinoleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin in einer Ausbeute von 68% (237 mg, 0,27 mmol) erhalten. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C- NMR-Spektroskopie).
Beispiel N2: Nitrolinolsäureester von sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel B wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (0,13 g, 0,5 mmol) mit einem gemäß Beispiel H1 erhaltenen Gemisch aus 9- Nitrolinolsäure 3, 10-Nitrolinolsäure 4, 12-Nitrolinolsäure und 9-Nitro-10,1 1 - octadiensäure (Gemisch im Verhältnis 7:12:5:2, 0,5 g, 1 ,5 mmol) verestert. Es wurde ein Produktgemisch aus unterschiedlich veresterten 1 ,2-Di(nitrolinoleoyl)-sn- glycero-3-phosphatidylcholinen in einer Ausbeute von 61 % (212 mg, 0,24 mmol) erhalten. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Beispiel N3: Nitroarachidonsäureester von sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel B wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (0,13 g, 0,5 mmol) mit einem gemäß Beispiel H2 erhaltenen Gemisch aus 6- Nitroarachidonsäure 10, 14-Nitroarachidonsäure 11 und 5-Nitroarachidonsäure 12 (Gemisch im Verhältnis 8 : 6 : 3, 0,45 g, 1 ,5 mmol) verestert. Es wurde ein Produktgemisch aus unterschiedlich veresterten 1 ,2-Di(nitroarachidonoyl)-sn- glycero-3-phosphatidylcholinen in einer Ausbeute von 53% (244 mg, 0,27 mmol) erhalten. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Beispiel N4: Nitroarachidonsäureester von sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel B wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (0,13 g, 0,5 mmol) mit einem gemäß Beispiel H3 erhaltenen Gemisch aus 6- Nitroarachidonsäure 14, 14-Nitroarachidonsäure 15 und 5-Nitroarachidonsäure 16 (Gemisch im Verhältnis 4 : 5 : 3, 0,45 g, 1 ,5 mmol) verestert. Es wurde ein Produktgemisch aus unterschiedlich veresterten 1 ,2-Di(nitroarachidonoyl)-sn- glycero-3-phosphatidylcholinen in einer Ausbeute von 55% (253 mg, 0,28 mmol) erhalten. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Beispiel N5: Nitro-y-linolensäureester von sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel B wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (0,13 g, 0,5 mmol) mit einem gemäß Beispiel H4 erhaltenen Gemisch aus 6-Nitro-y- linolensäure 14, 12-Nitro-Y-linolensäure 15 und 5-Nitro-Y-linolensäure 16 (Gemisch im Verhältnis 4 : 4 : 1 , 485 mg, 1 ,5 mmol) verestert. Es wurde ein Produktgemisch aus unterschiedlich veresterten 1 ,2-Di(nitro-Y-linolenoyl)-sn-glycero-3- phosphatidylcholinen in einer Ausbeute von 59% (257 mg, 0,30 mmol) erhalten. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Beispiel N6: Nitro-DHA-ester von sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel B wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (0,13 g, 0,5 mmol) mit einem gemäß Beispiel H5 erhaltenen Gemisch aus 4-Nitro- DHA, 5-Nitro-DHA, 19-Nitro-DHA und 20-Nitro-DHA (0,56 g, 1 ,5 mmol) verestert. Es wurde ein Produktgemisch aus unterschiedlich veresterten 1 ,2-Di(nitro-DHA)-sn- glycero-3-phosphatidylcholinen in einer Ausbeute von 31 % (150 mg, 0,16 mmol) erhalten. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Beispiel N7: Nitropalmitoleinsäureester von sn-Glycero-3-phosphatidylcholin Gemäß der Vorschrift nach Beispiel B wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (0,13 g, 0,5 mmol) mit einem gemäß Beispiel H6 erhaltenen Gemisch aus 9- Nitropalmitoleinsäure und 10-Nitropalmitoleinsäure (Gemisch im Verhältnis 4 : 3, 0,45 g, 1 ,5 mmol) verestert. Es wurde ein Produktgemisch aus 1 ,2-Di-(9- nitropalmitoleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin, 1 ,2-Di-(10-nitropalmitoleoyl)-sn-3- glycero-phosphocholin, 1 -(9-nitropalmitoleoyl)-2-(10-nitropalmitoleoyl)-sn-3-glycero- phosphocholin und 1 -(10-nitropalmitoleoyl)-2-(9-nitropalmitoleoyl)-sn-3-glycero- phosphocholin in einer Ausbeute von 77% (315 mg, 0,39 mmol) erhalten. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie). Beispiel N8: Nitrolinolsäureester von sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel B wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (0,13 g, 0,5 mmol) mit einem gemäß Beispiel 11 erhaltenen Gemisch aus 10- Nitrolinolsäure 4 und 9-Nitrolinolsäure 3 (Gemisch im Verhältnis 1 : 3, 0,49 g, 1 ,5 mmol) verestert. Es wurde ein Produktgemisch aus 1 ,2-Di-(9-nitrolinoleoyl)-sn-3- glycero-phosphocholin, 1 ,2-Di-(10-nitrolinoleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin, 1 -(9- nitrolinoleoyl)-2-(10-nitrolinoleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin und 1 -(10- nitrolinoleoyl)-2-(9-nitrolinoleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin in einer Ausbeute von 79% (323 mg, 0,40 mmol) erhalten. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C- NMR-Spektroskopie). Gemisch wurde für Analytik getrennt.
1 ,2-Di-(9-nitrolinoleoyl)-sn-3-glycero-phosphatidylcholin
173.5, 173.0 (C=O), 150.0, 149.0 (2x C-NO2), 133.5, 133.0 (2x HC=), 131 .5, 131 .0 (2x HC=), 125.0, 124.5 (2x HC=), 71 .0 (d), 66.5 (d), 64.0 (d), 62.5, 59.5 (d), 54.5 (NMe3), 35.0 (2x =CH2=), 34.5 - 20.5 (22x CH2), 14.0, 13.5 (2x CH3).
1 ,2-Di-(10-nitrolinoleoyl)-sn-3-glycero-phosphatidylcholin 173.5, 173.0 (C=O), 152.0, 151 .5 (2x C-NO2), 134.5, 134.0 (2x HC=), 132.5, 132.0 (2x HC=), 124.0, 123.5 (2x HC=), 71 .0 (d), 66.5 (d), 64.5 (d), 63.0, 60.0 (d), 54.5 (NMe3), 37.5, 37.0 (2x =CH2=), 34.5 - 21 .5 (22x CH2), 14.0 (2x CH3). Beispiel N9: Nitrogadoleinsäureester von sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel B wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (0,13 g, 0,5 mmol) mit einem gemäß Beispiel 12 erhaltenen Gemisch aus 9- Nitrogadoleinsäure und 10-Nitrogadoleinsäure (Gemisch im Verhältnis 2 : 1 , 0,53 g, 1 ,5 mmol) verestert. Es wurde ein Produktgemisch aus 1 ,2-Di-(9-nitrogandoleoyl)- sn-3-glycero-phosphocholin, 1 ,2-Di-(10-nitrogandoleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin, 1 -(9-nitrogandoleoyl)-2-(10-nitrogandoleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin und 1 -(10- nitrogandoleoyl)-2-(9-nitrogandoleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin in einer Ausbeute von 67% (0,31 g, 0,34 mmol) erhalten. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C- NMR-Spektroskopie).
Beispiel N10: Nitro-EPA-ester von sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel B wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (0,13 g, 0,5 mmol) mit einem gemäß Beispiel 13 erhaltenen Gemisch aus 5-Nitro-EPA und 6-Nitro-EPA (Gemisch im Verhältnis 5 : 2, 0,46 g, 1 ,5 mmol) verestert. Es wurde ein Produktgemisch aus 1 ,2-Di-(5-nitroeicosapentaenoyl)-sn-3-glycero- phosphocholin, 1 ,2-Di-(6-nitroeicosapentaenoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin, 1 -(5- nitroeicosapentaenoyl)-2-(6-nitroeicosapentaenoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin und 1 -(6-nitroeicosapentaenoyl)-2-(5-nitroeicosapentaenoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin in einer Ausbeute von 49% (224 mg, 0,25 mmol) erhalten. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Beispiel N11 : Nitro-a-linolensäureester von sn-Glycero-3-phosphatidylcholin
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel B wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (0,13 g, 0,5 mmol) mit einem gemäß Beispiel 14 erhaltenen Gemisch aus 9-Nitro-a- linolensäure und 10-Nitro-a-linolensäure (Gemisch im Verhältnis 1 : 2, 485 mg, 1 ,5 mmol) verestert. Es wurde ein Produktgemisch aus 1 ,2-Di-(9-nitro-a-linolenoyl)-sn- 3-glycero-phosphocholin, 1 ,2-Di-(10-nitro-a-linolenoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin, 1 -(9-nitro-a-linolenoyl)-2-(10-nitro-a-linolenoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin und 1 - (10-nitro-a-linolenoyl)-2-(9-nitro-a-linolenoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin in einer Ausbeute von 54% (235 mg, 0,27 mmol) erhalten. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Beispiel N12: Dinitrolinolsäureester von sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a Gemäß der Vorschrift nach Beispiel B wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (0,13 g, 0,5 mmol) mit einem gemäß Beispiel K1 erhaltenen Gemisch aus 9,12- Dinitrolinolsäure, 9,13-Dinitrolinolsäure, 10,12-Dinitrolinolsäure und 10,13- Dinitrolinolsäure (0,56 g, 1 ,5 mmol) verestert. Es wurde ein Produktgemisch aus unterschiedlich veresterten 1 ,2-Di(dinitrolinoleoyl)-sn-glycero-3-phosphatidylcholinen in einer Ausbeute von 64% (0,31 g, 0,32 mmol) erhalten. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Beispiel N13: Dinitro-EPA-ester von sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel B wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (0,13 g, 0,5 mmol) mit einem gemäß Beispiel K2 erhaltenen Gemisch aus 5,17- Dinitro-EPA, 5,18-Dinitro-EPA, 6,17-Dinitro-EPA und 6,18-Dinitro-EPA (0,59 g, 1 ,5 mmol) verestert. Es wurde ein Produktgemisch aus unterschiedlich veresterten 1 ,2- Di(dinitroeicosapentaenoyl)-sn-glycero-3-phosphatidylcholinen in einer Ausbeute von 33% (165 mg, 0,17 mmol) erhalten. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C- NMR-Spektroskopie).
Beispiel N14: Dinitro-a-linolensäure ester von sn-Glycero-3-phosphatidylcholin
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel B wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (0,13 g, 0,5 mmol) mit einem gemäß Beispiel K4 erhaltenen Gemisch aus 9,15- Dinitro-a-Linolensäure, 9,16-Dinitro-a-Linolensäure, 10,15-Dinitro-a-Linolensäure und 10,16-Dinitro-a-Linolensäure (0,55 g, 1 ,5 mmol) verestert. Es wurde ein Produktgemisch aus unterschiedlich veresterten 1 ,2-Di(dinitro-a-linolenoyl)-sn- glycero-3-phosphatidylcholinen in einer Ausbeute von 35% (0,17 g, 0,18 mmol) erhalten. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Beispiel N15: Synthese von 1 ,2-Di-(9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel B wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (0,13 g, 0,5 mmol) mit der gemäß Beispiel L1 erhaltenen E-9-Nitroölsäure 25a (0,49 g, 1 ,5 mmol) verestert. Es wurde 1 ,2-Di-((E)-9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero- phosphocholin in einer Ausbeute von 75% (328 mg, 0,38 mmol) erhalten. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Beispiel N16: Synthese von 1 ,2-Di-(9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin Gemäß der Vorschrift nach Beispiel B wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (0,13 g, 0,5 mmol) mit der gemäß Beispiel L1 erhaltenen Z-9-Nitroöl säure 24a (0,49 g, 1 ,5 mmol) verestert. Es wurde 1 ,2-Di-((Z)-9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero- phosphocholin in einer Ausbeute von 74% (323 mg, 0,37 mmol) erhalten. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie). Beispiel N17: Synthese von 1 ,2-Di-(10-nitrooleoyl)-sn-3-glycero- phosphocholin
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel B wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (0,13 g, 0,5 mmol) mit der gemäß Beispiel L2 erhaltenen 10-Nitroöl säure 30a (0,49 g, 1 ,5 mmol) verestert. Es wurde 1 ,2-Di-(10-nitrooleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin in einer Ausbeute von 70% (306 mg, 0,35 mmol) erhalten. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
173.5, 173.0 (C=O), 150.0 (2x C-NO2), 134.0, 133.5 (2x HC=), 71 .0 (d), 66.5 (d), 64.0 (d), 63.0, 59.5 (d), 54.5 (NMe3), 34.5 - 20.5 (28x CH2), 14.5 (2x CH3).
Beispiel N18: Synthese von 1 ,2-Di-(Z-9-nitropalmitoleoyl)-sn-3-glycero- phospho-cholin
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel B wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (0,13 g, 0,5 mmol) mit der gemäß Beispiel L3 erhaltenen Z-9-Nitropalmitoleinsäure 24b (0,45 g, 1 ,5 mmol) verestert. Es wurde 1 ,2-Di-(Z-9-nitropalmitoleoyl)-sn-3- glycero-phosphocholin in einer Ausbeute von 72% (295 mg, 0,36 mmol) erhalten. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie). Beispiel N19: Synthese von 1 ,2-Di-(Z-10-nitropalmitoleoyl)-sn-3-glycero- phospho-cholin
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel B wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (0,13 g, 0,5 mmol) mit der gemäß Beispiel L4 erhaltenen Z-10-Nitropalmitoleinsäure 30b (0,45 g, 1 ,5 mmol) verestert. Es wurde 1 ,2-Di-(Z-9-nitropalmitoleoyl)-sn-3- glycero-phosphocholin in einer Ausbeute von 70% (287 mg, 0,35 mmol) erhalten. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Beispiel N20: Synthese von 1 ,2-Di-(Z-15-nitro-a-linolenoyl)-sn-3-glycero- phospho-cholin
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel B wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (0,13 g, 0,5 mmol) mit der gemäß Beispiel M1 erhaltenen Z-15-Nitro-a-linolensäure 41 (0,49 g, 1 ,5 mmol) verestert. Es wurde 1 ,2-Di-(Z-15-nitro-a-linolenoyl)-sn-3- glycero-phosphocholin in einer Ausbeute von 65% (282 mg, 0,33 mmol) erhalten. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Beispiel 01 : Herstellung von 1 ,2-Di-(9-nitro-10-hydroxy-stearoyl)-sn-3-glycero- phosphocholin (ß,Y-Di-(9-nitro-10-hydroxystearoyl)-L-a-phosphatidylcholin) 3a1 Die Veresterung nach R. Salomon (Biorg. & Med. Chem. 2011 , 19, 580) kann direkt für den Einbau weiterer funktionalisierter Nitroölsäuren übernommen werden.
Figure imgf000117_0001
1 ,2-Di-(9-nitro-10-hydroxystearyl)
-sn-3-glycero-phosphatidylcholin 3a1
Zu einer Suspension aus 0,15 g (0,585 mmol, 1 Äq.) sn-Glycero-3-phosphocholin 1a in 50 ml trockenem Dichlormethan werden 0,605g (1 .755 mmol, 3 Äq.) 9-Nitro-10- Hydroxystearinsäure (racemisch, 3:1 Diastereomerengemisch) und 0,144 g (0,141 ml, 1 ,755 mmol, 3 Äq.) 1 -Methylimidazol und 0,367 g (1 ,755 mmol 3 Äq.) 2,6- Dichlorbenzoylchlorid gegeben. Dann wird für drei Tage bei 23 °C gerührt. Die Suspension löst sich langsam auf. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde mittels praparativer Säulenchromatographie und praparativer HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, 95 % MeOH/H2O) gereinigt. Ausbeute: 250,5 mg (0,275 mmol, 47 %) 3a1 (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie). Das Produkt fällt als schwer trennbares
Diastereomerengemisch bezüglich der N FS-Stereozentren an und wird daher als Diastereomerengemisch weiter verwendet.
Beispiel 02: Herstellung von 1 -Palmitoyl-2-(9-nitro-10-hydroxystearoyl)-sn-3- glycero-phosphocholin (ß-(9-Nitro-10-hydroxystearoyl)-Y-palmitoyl-L-a- phospha-tidylcholin) 6a1
Die Veresterung nach R. Salomon (Biorg. & Med. Chem. 2011 , 19, 580) kann direkt für den Einbau weiterer funktionalisierter Nitroölsäuren übernommen werden.
Figure imgf000117_0002
1 -Palmitoyl-2-(9-nitro-10-hydroxystearyl)
-sn-3-glycero-phosphatidylcholin 6a1
Zu einer Lösung aus 0,142 g (0.412 mmol, 2,04 Äq.) 9-Nitro-10-hydroxystearinsäure (racemisch, 3:1 Diastereomerengemisch) und 0,1 g (0.202 mmol) 1 -Palmitoyl-2-lyso- sn-3-glycero-phosphocholin 5a in 10 ml trockenem Dichlormethan werden 0,05 g (0,05 ml, 0,6 mmol, 2,97 Äq.) 1 -Methyl im idazol und 0,14 g (0,01 ml, 0,67 mmol 3,32 Äq.) 2,6-Dichlorbenzoylchlorid gegeben. Dann wird für drei Tage bei 23 °C gerührt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und der Rückstand wird mittels praparativer Säulenchromatographie und praparativer HPLC gereinigt. (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 Ä, 95 % MeOH/H2O). Ausbeute: 86,1 mg (0,105 mmol, 52 %) 6a1 als weißer Feststoff (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR- Spektroskopie). Das Produkt fällt als schwer trennbares Diastereomerengemisch bezüglich der N FS-Stereozentren an und wird daher als Diastereomerengemisch (im Verhältnis von etwa 3:3:1 :1 ) weiter verwendet.
1 -Palmitoyl-2-(9-nitro-10-hydroxystearoyl)-sn-3-glycerophosphatidylcholin 6a1
173.5 (2x C=O), 91 .0 (CH-NO2), 72.5 (HC-OH), 71 .0 (d), 66.0 (d), 63.0 (d), 62.5, 59.5 (d), 54.0 (NMe3), 34.5 - 21 .0 (28x CH2), 14.0 (2x CH3).
Beispiel 03:
Die Reaktion wurde gemäß der Vorschrift nach Beispiel O1 durchgeführt, wobei anstellt von racemischem aber regioisomerenreiner 9-Nitro-10-Hydroxystearinsäure das regioisomere Gemsich von 9-Hydroxy-10-nitrostearinsäure und 9-Nitro-10- Hydroxystearinsäure eingesetzt wurde. Die Regioisomeren, 9-Hydroxy-10- nitrostearinsäure und 9-Nitro-10-Hydroxystearinsäure im Verhältnis 1 : 3, wurden gemäß der Vorschrift nach Beispiel J1 hergestellt und reagieren in entsprechenden Ansätzen analog wie die regioisomerenreinen Verbindungen. Man gewinnt 1 ,2-Di- (9-hydroxy-10-nitrostearoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin, 1 -(9-hydroxy-10- nitrostearoyl)-2-(10-hydroxy-9-nitrostearoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin, 1 -(10- hydroxy-9-nitrostearoyl)-2-(9-hydroxy-10-nitrostearoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin und 1 ,2-Di-(10-hydroxy-9-nitrostearoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin in einer Gesamtausbeute von 45% (240 mg, 0,263 mmol). Es entstehen wiederum Diastereomerengemische. Beispiel 04:
Die Reaktion wurde gemäß der Vorschrift nach Beispiel O2 durchgeführt, wobei anstellt von racemischem aber regioisomerenreiner 9-Nitro-10-hydroxystearinsäure das regioisomere Gemsich von 9-Hydroxy-10-nitrostearinsäure und 9-Nitro-10- hydroxystearinsäure eingesetzt wurde. Die Regioisomeren, 9-Hydroxy-10- nitrostearinsäure und 9-Nitro-10-hydroxystearinsäure im Verhältnis 1 : 3, wurden gemäß der Vorschrift nach Beispiel J1 hergestellt und reagieren in entsprechenden Ansätzen analog wie die regioisomerenreinen Verbindungen. Man gewinnt 1 - Palmitoyl-2-(9-hydroxy-10-nitrostearoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin und 1 -Palmitoyl- 2-(10-hydroxy-9-nitrostearoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin in einer Gesamtausbeute von 48% (79,5 mg, 0,097 mmol). Es entstehen wiederum Diastereomerengemische. 1 -Palmitoyl-2-(9-hydroxy-10-nitrostearoyl)-3-glycerophosphatidylcholin 6a2
173.5, 173.0 (2x C=O), 92.0 (CH-NO2), 73.0 (HC-OH), 70.5 (d), 66.5 (d), 63.5 (d), 63.0, 59.5 (d), 54.5 (NMe3), 34.5 - 21 .0 (28x CH2), 14.0 (2x CH3).
Beispiel 05: Herstellung von 1 ,2-Di-(hydroxynitro-8,11,14,17-eicosatetraenoyl)- sn-3-glycero-phosphocholin
Gemäß Beispiel J3 wurde ein Gemisch aus 6-Hydroxy-5-nitro-8,1 1 ,14,17- eicosatetraensäure und 5-Hydroxy-6-nitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraensäure in Verhältnis 5:2 hergestellt. Danach wurde gemäß Beispiel 03 das
Regioisomerengemisch aus 6-Hydroxy-5-nitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraensäure und 5- Hydroxy-6-nitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraensäure in Verhältnis 5:2 mit sn-Glycero-3- phosphocholin 1a (0,15 g, 0,585 mmol, 1 Äq.) ungesetzt.
Man gewinnt 1 ,2-Di-(5-Hydroxy-6-nitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl)-sn-3-glycero- phosphocholin, 1 -(5-Hydroxy-6-nitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl)-2-(6-Hydroxy-5- nitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin, 1 -(6-Hydroxy-5-nitro- 8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl)-2-(5-Hydroxy-6-nitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl)-sn-3- glycero-phosphocholin und 1 ,2-Di-(6-Hydroxy-5-nitro-8,1 1 ,14,17-eicosatetraenoyl)- sn-3-glycero-phosphocholin in einer Gesamtausbeute von 35% (195 mg, 0,208 mmol). Es entstehen wiederum Diastereomerengemische.
Beispiel 06:
Gemäß Beispiel J4 wurde ein Gemisch aus 10-Hydroxy-9-nitro-a-Linolensäure und 9-Hydroxy-10-nitro-a-Linolensäure in einem Verhältnis von ca. 2:1 hergestellt. Danach wurde gemäß Beispiel O4 das Regioisomerengemisch aus 10-Hydroxy-9- nitro-a-Linolensäure und 9-Hydroxy-10-nitro-a-Linolensäure in einem Verhältnis von ca. 2:1 mit 1 -Palmitoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholin 5a (0,1 g, 0.202 mmol) ungesetzt. Man gewinnt 1 -Palmitoyl-2-(10-hydroxy-9-nitro-a-linolenoyl)-sn-3- glycero-phosphocholin und 1 -Palmitoyl-2-(9-hydroxy-10-nitro-a-linolenoyl)-sn-3- glycero-phosphocholin in einer Gesamtausbeute von 37% (61 mg, 0,075 mmol). Es entstehen wiederum Diastereomerengemische.
Beispiel P1 : Synthese des Gemisches von 1 -Oleoyl-2-(9-nitropalmitoleoyl)-sn- 3-glycero-phosphocholin und 1 -Oleoyl-2-(10-nitropalmitoleoyl)-sn-3-glycero- phosphocholin
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel C wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (1 ,0 g, 3,9 mmol) mit Dibutylzinnoxid (1 ,1 g, 4,3 mmol, 1 ,1 Äquivalente (Äq)) in 100 ml Isopropanol suspendiert, auf Rückfluß erhitzt und danach in einer ersten Veresterung unter Zugabe von 0,25 ml Triethylamin (7,8 mmol, 2 Äq) mit Ölsäurechlorid (2,35 g, 7,8 mmol, 2 Äq) umgesetzt. Die Ausbeute an 1 -Oleoyl-2-lyso-sn-3-glycero- phosphocholin betrug 44% (0,89 g, 1 ,72 mmol).
Die zweite Veresterung erfolgte nach Beispiel C durch Umsetzung von 0,89 g (1 ,72 mmol) 1 -Oleoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholin mit dem gemäß Beispiel H6 erhaltenen Gemisch aus 9-Nitropalmitoleinsäure und 10-Nitropalmitoleinsäure (Gemisch im Verhältnis 4:3; 1 ,03 g, 3,44 mmol) in trockenem Dichlormethan unter Zugabe von (5,1 mmol, 3,0 Äq.) 1 -Methyl im idazol und 2,6-Dichlorbenzoylchlorid (5,7 mmol, 3,3 Äq.). Das Gemisch aus 1 -Oleoyl-2-(9-nitropalmitoleoyl)-sn-3-glycero- phosphocholin und 1 -Oleoyl-2-(10-nitropalmitoleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin wird in einer Ausbeute von 73% erhalten (1 ,01 g, 1 ,26 mmol).
Beispiel P2: Synthese des Gemisches von 1 -Stearoyl-2-(10-nitrolinoleoyl)-sn- 3-glycero-phosphocholin und 1 -Stearoyl-2-(9-nitrolinoleoyl)-sn-3-glycero- phosphocholin
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel P1 wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (1 ,0 g, 3,9 mmol) mit Dibutylzinnoxid aktiviert und danach in einer ersten Veresterung mit Stearinsäurechlorid (2,36 g, 7,8 mmol, 2 Äq) umgesetzt. Die Ausbeute an 1 - Stearoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholin betrug 40% (0,82 g, 1 ,56 mmol).
Die zweite Veresterung erfolgte nach Beispiel C durch Umsetzung von 0,82 g (1 ,56 mmol) 1 -Stearoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholin mit dem gemäß Beispiel 11 erhaltenen Gemisch aus 10-Nitrolinolsäure 4 und 9-Nitrolinolsäure 3 (Gemisch im Verhältnis 1 :3; 1 ,13 g, 3,44 mmol). Das Gemisch aus 1 -Stearoyl-2-(10- nitrolinoleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin und 1 -Stearoyl-2-(9-nitrolinoleoyl)-sn-3- glycero-phosphocholin wird in einer Ausbeute von 64% erhalten (0,78 g, 1 ,00 mmol).
Beispiel P3: Synthese des Gemisches von 1 -Erucinyl-2-(9-nitrogadoleoyl)-sn- 3-glycero-phosphocholin und 1-Erucinyl-2-(10-nitrogadoleoyl)-sn-3-glycero- phosphocholin
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel P1 wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (1 ,0 g, 3,9 mmol) mit Dibutylzinnoxid aktiviert und danach in einer ersten Veresterung mit Erucinsäurechlorid (2,79 g, 7,8 mmol, 2 Äq) umgesetzt. Die Ausbeute an 1 - Erucinyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholin betrug 36% (0,86 g, 1 ,48 mmol).
Die zweite Veresterung erfolgte nach Beispiel C durch Umsetzung von 0,86 g (1 ,48 mmol) 1 -Erucinyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholin mit dem gemäß Beispiel 12 erhaltenen Gemisch aus 9-Nitrogadoleinsäure und 10-Nitrogadoleinsäure (Gemisch im Verhältnis 5:2; 1 ,58 g, 4,44 mmol). Das Gemisch aus 1 -Erucinyl-2-(9-nitro- gadoleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin und 1 -Erucinyl-2-(10-nitrogadoleoyl)-sn-3- glycero-phosphocholin wird in einer Ausbeute von 60% erhalten (0,77 g, 0,89 mmol). Beispiel P4: Synthese des Gemisches von 1 -Eicosapentaenoyl-2-(5-nitro- EPA)-sn-3-glycero-phosphocholin und 1 -Eicosapentaenoyl-2-(6-nitro-EPA)-sn- 3-glycero-phosphocholin
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel P1 wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (1 ,0 g, 3,9 mmol) mit Dibutylzinnoxid aktiviert und danach in einer ersten Veresterung mit Eicosapentaensäurechlorid (2,50 g, 7,8 mmol, 2 Äq) umgesetzt. Die Ausbeute an 1 -Eicosapentaenoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholin betrug 33% (0,70 g, 1 ,29 mmol).
Die zweite Veresterung erfolgte nach Beispiel C durch Umsetzung von 0,70 g (1 ,29 mmol) 1 -Eicosapentaenoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholin mit dem gemäß Beispiel 13 erhaltenen Gemisch aus 5-Nitro-EPA und 6-Nitro-EPA (Gemisch im Verhältnis 5:2; 1 ,34 g, 3,87 mmol). Das Gemisch aus 1 -Eicosapentaenoyl-2-(5- nitroeicosapentaenoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin und 1 -Eicosapentaenoyl-2-(6- nitronitroeicosapentaenoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin wird in einer Ausbeute von 52% erhalten (0,58 g, 0,67 mmol).
Beispiel P5: Synthese des Gemisches von 1 -(5,8,11 -Eicosatrienoyl)-2-(9-nitro- a-linolenoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin und 1 -(5,8,11 -Eicosatrienoyl)-2-(10- nitro-a-linolenoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel P1 wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (1 ,0 g, 3,9 mmol) mit Dibutylzinnoxid aktiviert und danach in einer ersten Veresterung mit 5,8,1 1 -Eicosatriensäurechlorid (2,54 g, 7,8 mmol, 2 Äq) umgesetzt. Die Ausbeute an 1 -(5,8,1 1 -Eicosatrienoyl)-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholin betrug 50% (1 ,06 g, 1 ,95 mmol).
Die zweite Veresterung erfolgte nach Beispiel C durch Umsetzung von 1 ,06 g (1 ,95 mmol) 1 -(5,8,1 1 -Eicosatrienoyl)-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholin mit dem gemäß Beispiel 14 erhaltenen Gemisch aus 9-Nitro-a-Linolensäure und 10-Nitro-a- Linolensäure (Gemisch im Verhältnis 2:1 ; 1 ,89 g, 5,85 mmol). Das Gemisch aus 1 - Eicosapentaenoyl-2-(5-nitroeicosapentaenoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin und 1 - Eicosapentaenoyl-2-(6-nitronitroeicosapentaenoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin wird in einer Ausbeute von 59% erhalten (0,98 g, 1 ,15 mmol).
Beispiel P6: Synthese des Gemisches von 1 -Linoleoyl-2-(dinitrolinoleoyl)-sn- 3-glycero-phosphocholin
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel P1 wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (1 ,0 g, 3,9 mmol) mit Dibutylzinnoxid aktiviert und danach in einer ersten Veresterung mit Linolsäurechlorid (2,33 g, 7,8 mmol, 2 Äq) umgesetzt. Die Ausbeute an 1 - Linoleoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholin betrug 57% (1 ,15 g, 2,22 mmol). Die zweite Veresterung erfolgte nach Beispiel C durch Umsetzung von 1 ,15 g (2,22 mmol) 1 -Linoleoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholin mit dem gemäß Beispiel K1 erhaltenen Gemisch aus 9,12-Dinitrolinolsäure, 9,13-Dinitrolinolsäure, 10,12- Dinitrolinolsäure und 10,13-Dinitrolinolsäure (2,49 g, 6,66 mmol). Das Gemisch aus 1 -Linoleoyl-2-(9,12-dinitrolinoleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin, 1 -Linoleoyl-2-(9,13- dinitrolinoleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin, 1 -Linoleoyl-2-(10,12-dinitrolinoleoyl)-sn- 3-glycero-phosphocholin und 1 -Linoleoyl-2-(10,13-dinitrolinoleoyl)-sn-3-glycero- phosphocholin wird in einer Ausbeute von 40% erhalten (0,77 g, 0,89 mmol). Beispiel P7: Synthese von 1 -Palmitoyl-2-(9-nitrolinoleoyl)-sn-PC
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel P1 wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (1 ,0 g, 3,9 mmol) mit Dibutylzinnoxid aktiviert und danach in einer ersten Veresterung mit Palmitinsäurechlorid (2,14 g, 7,8 mmol, 2 Äq) umgesetzt. Die Ausbeute an 1 - Palmitoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholin betrug 40% (0,77 g, 1 ,56 mmol).
Die zweite Veresterung erfolgte nach Beispiel C durch Umsetzung von 0,77 g (1 ,56 mmol) 1 -Palmitoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholin mit der gemäß Beispiel 11 erhaltenen (E)-9-Nitrolinolsäure (1 ,19 g, 3,12 mmol). Das 1 -Palmitoyl-2-(E-9- nitrolinoleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin wird in einer Ausbeute von 66% erhalten (0,83 g, 1 ,03 mmol).
1 -Palmitoyl-2-(9-nitrolinoleoyl)-3-glycerophosphatidylcholin
173.5, 173.0 (C=O), 149.0 (C-NO2), 133.0 (HC=), 131 .5 (HC=), 125.0 (HC=), 70.5 (d), 65.0 (d), 63.5 (d), 63.0, 59.5 (d), 54.5 (NMe3), 35.0 (=CH2=), 34.5 - 21 .0 (25x CH2), 14.5, 14.0 (2x CH3). Beispiel P8: Synthese von 1 -Palmitoyl-2-(Z-9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero- phosphocholin
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel P1 wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (1 ,0 g, 3,9 mmol) mit Dibutylzinnoxid aktiviert und danach in einer ersten Veresterung mit Palmitinsäurechlorid (2,14 g, 7,8 mmol, 2 Äq) umgesetzt. Die Ausbeute an 1 - Palmitoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholin betrug 40% (0,77 g, 1 ,56 mmol).
Die zweite Veresterung erfolgte nach Beispiel C durch Umsetzung von 0,77 g (1 ,56 mmol) 1 -Palmitoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholin mit der gemäß Beispiel L1 erhaltenen Z-9-Nitroölsäure 24a (1 ,02 g, 3,12 mmol). Das 1 -Palmitoyl-2-(Z-9- nitrooleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin wird in einer Ausbeute von 63% erhalten (0,79 g, 0,98 mmol).
Beispiel P9: Synthese von 1 -(S)-Lipoyl-2-(10-nitrooleoyl)-sn-3-glycero- phosphocholin Gemäß der Vorschrift nach Beispiel P1 wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (1 ,0 g, 3,9 mmol) mit Dibutylzinnoxid aktiviert und danach in einer ersten Veresterung mit (S)-Liponsäurechlorid (1 ,75 g, 7,8 mmol, 2 Äq) umgesetzt. Die Ausbeute an 1 - (S)-Lipoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholin betrug 31 % (0,54 g, 1 ,21 mmol).
Die zweite Veresterung erfolgte nach Beispiel C durch Umsetzung von 0,54 g (1 ,21 mmol) 1 -(S)-Lipoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholin mit der gemäß Beispiel L2 erhaltenen 10-Nitroölsäure 30a (0,79 g, 2,24 mmol). Das 1 -(S)-Lipoyl-2-(10- nitrooleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin wird in einer Ausbeute von 51 % erhalten (0,44 g, 0,62 mmol).
Beispiel P10: Synthese von 1 -Behenyl-2-(Z-9-nitropalmitoleoyl)-sn-3-glycero- phosphocholin
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel P1 wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (1 ,0 g, 3,9 mmol) mit Dibutylzinnoxid aktiviert und danach in einer ersten Veresterung mit Behensäurechlorid (2,80 g, 7,8 mmol, 2 Äq) umgesetzt. Die Ausbeute an 1 - Behenyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholin betrug 30% (0,68 g, 1 ,17 mmol).
Die zweite Veresterung erfolgte nach Beispiel C durch Umsetzung von 0,68 g (1 ,17 mmol) 1 -Behenyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholin mit der gemäß Beispiel L3 erhaltenen Z-9-Nitropalmitoleinsäure 24b (0,71 g, 2,34 mmol). Das 1 -Behenyl-2-(Z- 9-nitropalmitoleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin wird in einer Ausbeute von 42% erhalten (0,42 g, 0,49 mmol).
Beispiel P11 : Synthese von 1 -DHA-2-(Z-10-nitropalmitoleoyl)-sn-3-glycero- phosphocholin
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel P1 wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (1 ,0 g, 3,9 mmol) mit Dibutylzinnoxid aktiviert und danach in einer ersten Veresterung mit Docosahexaensäurechlorid (2,71 g, 7,8 mmol, 2 Äq) umgesetzt. Die Ausbeute an 1 -Docosahexaenyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholin betrug 25% (0,55 g, 0,98 mmol).
Die zweite Veresterung erfolgte nach Beispiel C durch Umsetzung von 0,55 g (0,98 mmol) 1 -Docosahexaenyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholin mit der gemäß Beispiel L4 erhaltenen Z-10-Nitropalmitoleinsäure 30b (0,67 g, 2,2 mmol). Das 1 - Docosahexaenyl-2-(Z-10-nitropalmitoleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin wird in einer Ausbeute von 31 % erhalten (0,26 g, 0,30 mmol).
Beispiel P12: Synthese von 1 -Linoleoyl-2-(Z-15-nitro-a-linolenoyl)-sn-3- glycero-phosphocholin
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel P1 wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (1 ,0 g, 3,9 mmol) mit Dibutylzinnoxid aktiviert und danach in einer ersten Veresterung mit Linolsäurechlorid (2,33 g, 7,8 mmol, 2 Äq) umgesetzt. Die Ausbeute an 1 - Linoleoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholin betrug 60% (1 ,21 g, 2,34 mmol).
Die zweite Veresterung erfolgte nach Beispiel C durch Umsetzung von 1 ,21 g (2,34 mmol) 1 -Linoleoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholin mit der gemäß Beispiel M1 erhaltenen Z-15-Nitro-a-linolensäure 41 (0,77 g, 2,4 mmol). Das 1 -Linoleoyl-2-(Z- 15-nitro-a-linolenoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin wird in einer Ausbeute von 55% erhalten (0,55 g, 0,67 mmol).
Beispiel P13: Herstellung von 1 -Stearoyl-2-(9-nitrolinoleoyl)-sn-3-glycero- phosphocholin
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel P1 wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (1 ,0 g, 3,9 mmol) mit Dibutylzinnoxid aktiviert und danach in einer ersten Veresterung mit Stearinsäurechlorid (2,36 g, 7,8 mmol, 2 Äq) umgesetzt. Die Ausbeute an 1 - Stearoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholin betrug 40% (0,82 g, 1 ,56 mmol).
Die zweite Veresterung erfolgte nach Beispiel C durch Umsetzung von 0,82 g (1 ,56 mmol) 1 -Stearoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholin mit der gemäß Beispiel 11 erhaltenen (E)-9-Nitrolinolsäure (0,89 g, 2,34 mmol). 1 -Stearoyl-2-(E-9- nitrolinoleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin wird in einer Ausbeute von 61 % (0,79 g, 0,95 mmol) erhalten.
Beispiel P14: Herstellung von 1 -Stearoyl-2-(9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero- phosphocholin
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel P1 wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (1 ,0 g, 3,9 mmol) mit Dibutylzinnoxid aktiviert und danach in einer ersten Veresterung mit Stearinsäurechlorid (2,36 g, 7,8 mmol, 2 Äq) umgesetzt. Die Ausbeute an 1 - Stearoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholin betrug 40% (0,82 g, 1 ,56 mmol).
Die zweite Veresterung erfolgte nach Beispiel C durch Umsetzung von 0,82 g (1 ,56 mmol) 1 -Stearoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholin mit (E)-9-Nitroölsäure (0,77 g, 2,34 mmol). 1 -Stearoyl-2-(E-9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin wird in einer Ausbeute von 64% (0,83 g, 1 ,00 mmol) erhalten.
Beispiel P15: Herstellung von 1 -Oleoyl-2-(9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero- phosphocholin
Gemäß der Vorschrift nach Beispiel P1 wurde sn-Glycero-3-phosphatidylcholin 1a (1 ,0 g, 3,9 mmol) mit Dibutylzinnoxid aktiviert und danach in einer ersten Veresterung mit Ölsäurechlorid (2,35 g, 7,8 mmol, 2 Äq) umgesetzt. Die Ausbeute an 1 -Oleoyl-2- lyso-sn-3-glycero-phosphocholin betrug 44% (0,89 g, 1 ,72 mmol).
Die zweite Veresterung erfolgte nach Beispiel C durch Umsetzung von 0,89 g (1 ,72 mmol) 1 -Oleoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphocholin mit (E)-9-Nitroölsäure (1 ,13 g, 3,44 mmol). 1 -Oleoyl-2-(E-9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin wird in einer Ausbeute von 69% (0,99 g, 1 ,19 mmol) erhalten.
173.5, 173.0 (C=O), 150.0 (C-NO2), 134.0 (HC=), 130.0 (HC=), 129.5 (HC=), 71 .0 (d), 66.0 (d), 64.0 (d), 63.0, 60.0 (d), 54.5 (NMe3), 34.5 - 22.0 (28x CH2), 14.5, 14.0 (2x CH3).
Beispiel Q: 1-(9-Nitrooleoyl)-2-(palmitoyl)-sn-3-glycero-phosphatidylcholin
Schema 14
Figure imgf000125_0001
1 -lyso-2-(palmitoyl)-sn-3- 1 -(9-Nitrooleyl)-2-(palmitoyl)-sn-3- glycero-phosphatidylcholin 10a' glycero-phosphatidylcholin 10a
Herstellung von 1 -lyso-2-Palmitoyl-sn-3-glycero-phosphatidyl-cholin 10a' (analog J. Sakakibara, Tetrahedron Lett. 1993, 34, 2487):
Eine Lösung aus 1 ,2-Dipalmitoyl-sn-3-glycero-phosphatidylcholin 7a (500 mg, 0,571 mmol), Mucor javanicus lipase (300 mg) und Triton X-100 (500 mg) in einem Borsäure-Borax-Puffer (0,05 M, 90 ml) wird bei 37°C für 2 Stunden gerührt. Die Reaktion wird durch Zugabe von 5% Essigsäure und Ethanol beendet. Abziehen der Lösungsmittel im Vakuum wird der Rückstand mittels Säulenchromatographie (Kieselgel, Dichlormethan/MeOH Gradient) oder präparativer HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, Gradient MeOH/H2O) gereinigt (Vorsicht: intramolekulare Umesterungen!). Ausbeute 307,8 mg (0,543 mmol, 95%) 10a'. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Herstellung von 1 -(9-Nitrooleoyl)-2-(palmitoyl)-sn-3-glycero-phosphatidylcholin (ß- (Palmitoyl)-Y-(9-nitrooleoyl)-L-a-phosphatidylinositol) 10a (analog R. Salomon (Biorg. & Med. Chem. 2011 , 19, 580): Ansatz und Reaktion wie unter 6a beschrieben mit 1 -lyso-2-Palmitoyl-sn-3-glycero- phosphatidyl-cholin 10a' (300 mg, 0,645 mmol) und 9-Nitroölsäure (21 1 mg, 0,645 mmol). Reinigung durch Säulenchromatogrphie (Kieselgel, Dichlormethan/MeOH Gradient) oder präparativer HPLC (Phenomenex Gemini NX 5 μ C18 1 10 A, Gradient MeOH/H2O). Ausbeute 394,4 mg (0,510 mmol, 79%) 10a. (Reinheitskontrolle via HPLC, 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie).
Beispiel R: 1 -Stearoyl-2-(E-9-nitrolinoleoyl)-sn-3-glycero-phosphatidylethanol- amin
Gemäß Beispiel D wird sn-3-Glycerophosphatidyl-(N-BOC)-ethanolamin 1c hergestellt. Das sn-3-Glycerophosphatidyl-(N-BOC)-ethanolamin 1c (1 ,04 g, 3,3 mmol) wird danach gemäß Beispiel P1 mit Dibutylzinnoxid aktiviert und danach in einer ersten Veresterung mit Stearinsäurechlorid (2,0 g, 6,6 mmol, 2 Äq) umgesetzt. Die Ausbeute an 1 -Stearoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphatidyl-(N-BOC)-ethanolamin betrug 48% (0,92 g, 1 ,58 mmol). Die zweite Veresterung erfolgte nach Beispiel C durch Umsetzung von 0,92 g (1 ,58 mmol) 1 -Stearoyl-2-lyso-sn-3-glycero- phosphatidyl-(N-BOC)-ethanolamin mit der gemäß Beispiel 11 erhaltenen (E)-9- Nitrolinolsäure (0,89 g, 2,34 mmol). 1 -Stearoyl-2-(E-9-nitrolinoleoyl)-sn-3-glycero- phosphatidyl-(N-BOC)-ethanolamin wird in einer Ausbeute von 55% (0,78 g, 0,87 mmol) erhalten. Abschließend erfolgt gemäß letztem Schritt in Beispiel D die Schutzgruppenabspaltung. Es wird 1 -Stearoyl-2-(E-9-nitrolinoleoyl)-sn-3-glycero- phosphatidylethanolamin in einer Ausbeute von 93% erhalten (0,64 g, 0,81 mmol).
Beispiel S: 1 -Palmitoyl-2-(E-9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero-phosphatidylethanolamin Gemäß Beispiel D wird sn-3-Glycerophosphatidyl-(N-BOC)-ethanolamin 1c hergestellt. Das sn-3-Glycerophosphatidyl-(N-BOC)-ethanolamin 1c (1 ,04 g, 3,3 mmol) wird danach gemäß Beispiel P1 mit Dibutylzinnoxid aktiviert und danach in einer ersten Veresterung mit Palmitinsäurechlorid (1 ,81 g, 6,6 mmol, 2 Äq) umgesetzt. Die Ausbeute an 1 -Palmitoyl-2-lyso-sn-3-glycero-phosphatidyl-(N-BOC)- ethanolamin betrug 50% (0,91 g, 1 ,65 mmol). Die zweite Veresterung erfolgte nach Beispiel C durch Umsetzung von 0,91 g (1 ,65 mmol) 1 -Palmitoyl-2-lyso-sn-3-glycero- phosphatidyl-(N-BOC)-ethanolamin (E)-9-Nitroölsäure (0,98 g, 3,0 mmol). 1 - Palmitoyl-2-(E-9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero-phosphatidyl-(N-BOC)-ethanolamin wird in einer Ausbeute von 54% (0,77 g, 0,89 mmol) erhalten. Abschließend erfolgt gemäß letztem Schritt in Beispiel D die Schutzgruppenabspaltung. Es wird 1 -Palmitoyl-2- (E-9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero-phosphatidylethanolamin in einer Ausbeute von 90% erhalten (0,62 g, 0,80 mmol). Versuchsbeispiele
Beispiel 1 :
Untersuchung der Ausführbarkeit von nitrierten Phospholipiden zur Verbesserung von Oberflächeneigenschaften durch Tauchbeschichtung
Ein kommerziell erhältlicher Stent aus medizinischem Edelstahl LVM 316 wurde in einem Ultraschallbad mit Aceton und Ethanol entfettet (15 min) und bei 100°C in einem Trockenschrank getrocknet. Danach wurde der Stent vorsichtig für 7 Minuten in eine 1 %ige Lösung von Phosphatidylcholin verestert mit 9-nitro-cis-Ölsäure (50%) und Ölsäure (50%) in einem Gemisch Ethanol/Diethylether (50/50 (v/v)) getaucht und danach für 10 min bei 100°C getrocknet. Der Tauchvorgang und die anschließende Trocknung wurden zwei weitere Male wiederholt. Abschließend wurde der Stent über Nacht in Ethanol (70%) gewaschen und für 15 min bei 100°C getrocknet.
Man erhält eine amorphe gleichmäßige Beschichtung der gesamten Oberfläche des Stents.
Schlussfolgerung: Nitrocarbonsäure(n)-enthaltende Phospholipide gestatten eine schnelle und vollständige Abdeckung von Oberflächen. Die Mischung von nitrierten Phospholipiden mit nativen Phospholipiden verbessert die Beschichtungsqualität durch höhere Vollständigkeit der Bedeckung und durch Reduktion der Multischichtformierung genauso wie die Erhöhung der Adhäsion der Beschichtung. Beispiel 2:
Untersuchung der Ausführbarkeit von nitrierten Phospholipiden zur Verbesserung von Oberflächeneigenschaften durch Physiosorption an eine hydrophobisierte Oberfläche 1 ) Ein Stent wurde gewaschen und entfettet, indem der Stent zuerst mit wasserfreiem Methanol, danach mit Methanol / Chloroform (1 :1 , voLvol.) und dann mit wasserfreiem Chloroform in einem Teflonbecher für jeweils 5 Minuten in einem Ultraschallbad eingetaucht wurde. Der Stent wurde danach in getrocknetem Chloroform aufbewahrt.
2) Eine Mischung aus Dekalin / Tetrachlorkohlenstoff / und Chloroform (7:2:1 , vol.:vol.:vol.) wurde zubereitet in einem Teflonbecher und der Stent wurde aus dem wasserfreien Chloroform entnommen und in diese Mischung eingetaucht. Danach wurde zu dieser Mischung 1 % (vol.) OTS (Tnchloroctadecylsilan) gegeben und der Stent wurde für 12h in dieser Mischung aufbewahrt.
Anstelle von Tnchloroctadecylsilan kann auch eines der folgenden anderen Silane verwendet werden: n-Octyltriethoxysilan, n-Butyltrimethoxysilan, n-Decyltriethoxy- silan, Hexadecyltrimethoxysilan, Isooctyltrimethoxysilan, 13-(Trichlorosilylmethyl)- heptacosan, N-Phenylaminomethyltrimethoxysilan, N-Cyclohexylaminomethyltri- ethoxysilan, Isooctyltriethoxysilan, Hexadecyltrimethoxysilan, Phenyltriethoxysilan oder Dicyclopentyldimethoxysilan.
Dann wurde der Stent entnommen, in einen Teflonbecher in Chloroform getaucht, danach in Methanol / Chloroform (1 :1 , voLvol.) und abschließend in Methanol eingetaucht und jeweils für 5 Minuten mit Ultraschall behandelt.
Der so mit einem Silan beschichtete Stent ist stark wasserabweisend. Taucht man dieses Stent in Wasser und zieht ihn zügig und geradlinig wieder heraus, so bleiben keine Wassertröpfchen auf seiner Oberfläche haften.
Der so mit einem Silan beschichtete Stent wurde dann in eine Lösung von Phosphatidylcholin (0,007 mmol pro ml), worin die beiden Fettsäurereste Nitroöl säurereste sind, in 5 ml Chloroform für 15 Minuten eingetaucht, entnommen und im Stickstoffstrom unter Drehung des Stents getrocknet. Der Beschichtungsvorgang wurde noch weitere 2 Male wiederholt. Das Beschichtungsergebnis wird mittels Konfokaler Laser-Mikroskopie unter Verwendung von Fluoresceinisothiocyanat als Fluoreszenzmarker für die Amingruppe des Cholinrestes untersucht.
Ergebnis: Es zeigt sich eine vollständige und gleichmäßige Beschichtung ohne erkennbare Lücken.
Beispiel 3:
Untersuchung von radioaktiv markierten Nitro-Phosphatidylcholinen zur Verteilung aus einer SAM-Beschichtung und Freisetzung Stickstoffmonoxiden.
Um den Anteil an Phospholipiden zu bestimmen, die aus der Beschichtung in ein umgebendes wässriges Medium (Rinderserum) abgegeben werden, sowie den Anteil an Phospholipiden zu bestimmen, die durch die Zellen aus dem wässrigen Medium oder den direkten Kontakt mit der Oberfläche aufgenommen werden, wurden Objektträger mit Phospholipiden beschichtet, die radioaktiv markierte Fettsäuren enthielten. Für diesen Zweck wurden Phosphatidylcholine synthetisiert, die H3- markierte Palmitinsäure bei SN-1 und nitrierte oder native Ölsäuren bei SN-2 enthielten. 10% der radioaktiv markierten Phospholipide wurden zu ansonsten identischen synthetischen Phospholipiden hinzugefügt. Aus dieser Mischung wurden Beschichtungen von Objektträgern entsprechend Beispiel 1 angefertigt. Die Träger wurden mehrfach mit alkoholischen Lösungen gespült und schließlich für eine Stunde in ein 10%iges Ethanolbad überführt, das dann gegen eine 0,9%ige NaCI- Lösung ausgetauscht wurde, in der die Objektträger für weitere 15 min blieben. Nach einem letzten Spülen wurden die Träger in einer Schale mit 20% FCS platziert. Die Schalen wurden kontinuierlich bei 37°C für 1 , 3, bzw. 7 Tage bewegt. In einem weiteren experimentellen Ansatz wurden die vorbereiteten Objektträger in Kulturschalen gelegt, und 2.500x105/ml Fibroblasten wurden in der Kulturschale suspendiert, worin sie für 3 bzw. 7 Tage wachsen konnten. Nach Abschluss der Zellkulturuntersuchungen wurden die Zellen trypsiniert und zweimal sorgfältig gewaschen. Danach wurden die Zellen homogenisiert und für eine Scintillationsmessung vorbereitet. Es erfolgten Messungen der Zelllysate und repräsentativer Serumproben an einem liquid scintillation counter (LSC-5000, Aloka, Japan) nach Hinzugabe der Scintillationsflüssigkeit (ACSII, Amersham, UK) zu den Scintillationsgefäßen.
Ergebnisse: Radioakiv markierte Phospholipide wurden im Serum von Proben mit nitrierten sowie mit nicht-nitrierten Phospholipidbeschichtungen detektiert. Jedoch war der Gehalt bei Proben von nitrierten Phospholipidbeschichtungen im Vergleich zu Proben von Phospholipidbeschichtungen mit nativen Fettsäuren tendenziell niedriger. Der Gehalt an Phospholipiden, die aus der Beschichtung nach 24 Stunden freigesetzt wurden, konnte mit weniger als 0,5% bestimmt werden, und stieg auf 0,7% an Tag 3 und auf 0,8% an Tag 7 an. Bei nicht-nitrierten Phospholipidbeschichtungen wurde der Gehalt an freigesetzten Phospholipiden entsprechend mit 0,8%, 1 ,0% und 1 ,2% gemessen. Messungen von Zelllysaten zeigten einen Gehalt von in die Zelle aufgenommenen nitrierten Phospholipiden von 0,1 % des berechneten Gesamtgehalts von Phospholipiden, die für die Beschichtung verwendet wurden. An Tag 3 wurde ein Gehalt von 0,2% und an Tag 7 von 0,26% bestimmt. In Lysaten von Zellen, die auf nichtnitrierten Phospholipiden gewachsen waren, zeigten einen Gehalt von 0,4%, 0,6% und 0,7% an aufgenommenen Phospholipiden.
Schlussfolgerung: Die physisorbierten Phospholipide werden zu einem kleinen Teil in eine Serum-enthaltende Umgebung freigesetzt mit einer abklingenden Freisetzungskinetik. Die Freisetzung von nitrierten Phospholipidbeschichtungen ist tendenziell geringer als die von nicht-nitrierten Phospholipidbeschichtungen, wahrscheinlich wegen der höheren intermolekularen Adhärenz. Zellen, die auf Phospholipidbeschichtung wuchsen, nahmen freigesetzte Phospholipide auf, jedoch war der Gehalt an aufgenommenen Phospholipiden vernachlässigbar gering. Beispiel 4
Untersuchungen zur Quantifizierung der Freisetzung von NO und der Einfluss auf die Biopassivierung
Um zu detektieren, ob Stickstoffmonoxid aus nitrierten Phospholipiden freigesetzt wird oder nicht, wurde die Konzentration an Stickstoffmonoxid im Kulturmedium und in den adhärenten Zellen gemessen. Zur Bestimmung von Stickstoffmonoxid im Kulturmedium wurde 1 ,2-Diaminoanthraquinone (Invitrogen) verwendet und zur Bestimmung von akkumuliertem Stickstoffmonoxid innerhalb von Zellen wurde der DAF-FM Stickstoffmonoxid Indikator (Invitrogen) verwendet. Fibroblasten wurden in eine 1 %ige DMSO-Lösung überführt, um eine Zelldichte von 2.500x105/ml zu erreichen. Zellen wurden für 30 min mit DAF-FM inkubiert, welches bis zu einer Konzentration von 5 μιτιοΙ zugefügt wurde. Danach wurden die Zellen gewaschen und in eine Kulturschale überführt, die mit Phosphatidylcholin oder nitriertem Phosphatidylcholin beschichtet war, wie ausgeführt in Beispiel 2, wobei Kulturschalen ohne Beschichtung als Kontrolle dienten. Zellkulturen wurden für einen bzw. 3 Tage in 5% FCS unter Standardbedingungen wachsen gelassen. Danach wurden die Zellen trypsiniert und in 2%iger DMSO-Lösung suspendiert um die kumulierte Stickstoffmonoxid Produktion bzw. -akkumulation zu messen. Der Gehalt an Stickstoffmonoxid intrazellulär sowie im Kulturmedium wurde mittels eines konfokalen Laser-scanning Mikroskops (Fluoview 300, Olympus Europa) und einer Photomultiplier-basierten Mikrofluorimetrie (Seefelder Messtechnik, Deutschland) bestimmt.
Ergebnisse: Die gemessenen Stickstoffmonoxid Produktion bzw. -akkumulation war sowohl intrazellulär also auch in Kulturmedium signifikant höher bei einem Zellwachstum auf unbeschichteten Trägern, als auf beschichteten Objektträgern. Die Stickstoffmonoxidproduktion bzw. -akkumulation war sowohl intrazellulär also auch in Kulturmedium tendentiell höher in Kulturen die Phospholipidbeschichtungen mit nativen Fettsäuren gewachsen waren verglichen mit denen die auf Nitrocarbonsäure- enthaltenden Phospholipidbeschichtungen gewachsen waren. Interpretation: Der höhere Gehalt an Stickstoffmonoxid in Kulturen auf unbeschichteten künstlichen Oberflächen verglichen mit Kulturen auf biokompatiblen Oberflächen kann als endogene Stickstoffmonoxid-Produktion als Ergebnis der Reaktion und Proliferationsinduktion der Fibroblasten interpretiert werden. Da die NO-Akkumulation in Kulturen, die auf Nitrocarbonsäure-enthaltenden Phospholipiden gewachsen waren, vergleichbar war mit denen, die auf Phospholipiden ohne Nitrierung gewachsen waren, kann die Freisetzung einer klinisch relevanten Menge an NO aus Nitrocarbonsäure-enthaltenden Phospholipiden ausgeschlossen werden. Beispiel 5
Untersuchung zur Protein- und Biomoleküladhäsion auf Oberflächen mit Beschichtungen aus nitrierten und nativen Phospholipiden.
Um die Adsorption von Biomolekülen auf mit SAM aus nativen und Nitrocarbonsäure- enthaltenden Phospholipiden beschichteten Oberflächen zu bestimmen, wurden Träger wie in Beispiel 1 vorbereitet. Analog hierzu wurden auch Träger mit Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden gemäß Beispiel N1 beschichtet, nämlich Gemische von 1 ,2-Di-(9-nitrolinoleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin, 1 ,2-Di- (10-nitrolinoleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin, 1 -(9-nitrolinoleoyl)-2-(10-nitrolinole- oyl)-sn-3-glycero-phosphocholin und 1 -(10-nitrolinoleoyl)-2-(9-nitrolinoleoyl)-sn-3- glycero-phosphocholin mit Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden gemäß Beispiel D (1 ,2-Di-(9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero-phosphatidylethanolamin), Beispiel E (1 ,2-Di-(9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero-phosphatidylserin), Beispiel F (1 ,2-Di-(9-nitro- oleoyl)-sn-3-glycero-phosphatidylinositol), Beispiel G (1 ,2-Di-(9-nitrooleoyl)-sn-3- glycero-phosphat) und Beispiel 01 (1 ,2-Di-(9-nitro-10-hydroxy-stearoyl)-sn-3-glycero- phosphocholin).
Beschichtete und unbeschichtete Träger wurden in Petrischalen gegeben. Lösungen aus 2% Rinderalbumin oder Rinderserum mit oder ohne Zusatz von Fibronektin oder Laminin, sowie eine 0,9% NaCI-Lösung als Kontrolle, wurden in die Petrischalen gegeben. Diese wurden für 24 bzw. 72 Stunden leicht bewegt. Nach Ende der Expositionszeit wurden die Träger vorsichtig zweimal mit 0.9%iger NaCI-Lösung abgewaschen. Die Oberflächen wurden mit einer Antikörperfärbemethode auf eine Proteinabsorption untersucht. Ergebnisse: Die Oberflächen der nativen Träger zeigten eine homogene Schicht aus Albumin mit der Ausnahme von Trägern, die in NaCI-Lösung inkubiert wurden. Die Zugabe von Fibronektin oder Laminin ergab dichtere Proteinschichten. Komplementfaktoren waren auf der Oberfläche von Kontrollträgern vorhanden, wie durch selektive Färbungen gezeigt werden konnte. Träger, die mit nativem Phosphatidylcholin beschichtet waren, zeigten vernachlässigbare Mengen an Albumin, Laminin, Fibronektin oder Komplement. Träger, die mit einer Kombination aus 80% nativem Phosphatidylcholin und 20% Phosphatidylserin beschichtet waren, zeigten eine mit unbeschichteten Trägern vergleichbare Adhäsion von Albumin und eine erhöhte Adsorption von Fibronektin und Laminin. Der Gehalt an Komplement, der an diese Träger adhärierte, war höher als bei nativen Trägern. Alle Träger, die mit Nitrocarbonsäure-enthaltendem Phospohatidylcholin beschichtet waren, zeigten eine signifikant niedrigere Adsorption von Albumin als native Träger. Jedoch war der Gehalt an Albumin, Fibronektin und Laminin leicht höher als auf Trägern mit nativen Phosphatidylcholin, während der Gehalt an Komplement derselbe war. Beschichtungen mit einer Kombination aus Nitrocarbonsaure-enthaltenden Phosphatidylcholin (80%) und Phosphatidylserin (20%) zeigten eine signifikant niedrigere Absorption von Albumin, Laminin, Fibronektin und Komplement als bei einer vergleichbaren Kombination von nativen Phospholipiden. Der Gehalt war auch niedriger als auf unbeschichteten Trägern. Die Ergebnisse waren über beide Beobachtungszeiträume stabil.
Schlussfolgerung: Eine Beschichtung von künstlichen Oberflächen mit Phosphatidylcholin hemmt fast vollständig die Adsorption von Proteinen und Biomolekülen. Eine Nitrierung von Phosphatidylcholin reduziert diesen Antiadherenz- Effekt leicht für Albumin, Fibronektin und Laminin, jedoch bleibt der Antiadherenz- Effekt für Komplement bestehen. Für Kombinationen aus Phospholipiden, die die Adsorption von Serumproteinen verstärken, bewirkt eine Nitrierung dieser Phospholipide einen singnifikaten anti-adhäsiven Effekt. Beispiel e
Untersuchungen zum Effekt von Nitrocarbonsäure-enthaltenden Phospholipiden auf Adhäsion, Ausbreitung und Wachstum von Endothelzellen
Um das Zellhoming von Endothelzellen auf Phospholipid-beschichteten künstlichen Oberflächen zu untersuchen, wurde ein Metallgitter aus Kobalt-Chrom-Legierung wie in Beispiel 2 beschrieben beschichtet. Analog hierzu wurden Metallgitter mit Nitrocarbonsäure-enthaltendem Phosphatidylcholin gemäß den Beispielen N2 - N6 und O6 beschichtet. Dabei handelte es sich speziell um Produktgemische aus unterschiedlich veresterten 1 ,2-Di(nitrolinoleoyl)-sn-glycero-3-phosphatidylcholinen (N2), aus unterschiedlich veresterten 1 ,2-Di(nitroarachidonoyl)-sn-glycero-3- phosphatidylcholinen (N3), aus unterschiedlich veresterten 1 ,2-Di(nitroarachidonoyl)- sn-glycero-3-phosphatidylcholinen (N4), aus unterschiedlich veresterten 1 ,2-Di(nitro- Y-linolenoyl)-sn-glycero-3-phosphatidylcholinen (N5) oder aus unterschiedlich veresterten 1 ,2-Di(nitro-DHA)-sn-glycero-3-phosphatidylcholinen (N6) und Gemisch aus 1 -Palmitoyl-2-(10-hydroxy-9-nitro-a-linolenoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin und 1 -Palmitoyl-2-(9-hydroxy-10-nitro-a-linolenoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin (O6). Ein unbeschichtetes Metallgitter diente als Kontrolle. Die Gitter wurden in eine Kulturschale gegeben, die eine Gelmatrix enthielt, in der humane umbilikale venöse Endothelzellen (HUVEC) bis zur Konfluenz gewachsen waren. Das Kulturmedium bestand aus 5% FCS, welches alle zwei Tage ersetzt wurde. Die Kultivierung wurde entsprechend den Standardbedingungen durchgeführt. Die Kulturschalen wurden nach 3, 7 und 14 Tagen oberflächlich mit NaCI-Lösung mehrfach gespült. Hiernach wurde die Oberfläche mit Methylenblau angefärbt. Unter Verwendung eines Auflichtmikroskop wurden die Proben unmittelbar nach folgenden Messparametern untersucht: Ausbreitung der Zellen vom Gitterrand zum Gitterzentrum hin, Zelldichte, Multischichtbildung, und Zellform.
Ergebnisse: Die Zellausbreitung war am schnellsten auf unbeschichteten Gittern, was zu einer vollständigen Bedeckung an Tag 3 führte. Fast keine Zellanheftung wurde auf Phosphatidylcholin-beschichteten Gittern beobachtet, wobei die Zwischenräume zwischen den Stentstreben nach 3 Tagen vollständig bedeckt waren. Auf den mit Nitrocarbonsäure-enthaltenden Phosphatidylcholin bedeckten Oberflächen bildeten sich Inseln von adhärenten Zellen. Diese Beobachtung konnte durchgängig bei allen verwendeten Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phosphatidylcholinen gemacht werden. Eine Multischichtbildung zwischen den Stentstreben in Kulturen mit unbeschichteten Metallgittern wurde an Tag 7 beobachtet welche sich an Tag 14 weiter verstärkte, wobei dann auch auf den Streben eine Multischichtbildung beobachtet wurde. Die Bedeckung durch Zellen auf Phosphatidylcholin-beschichteten Streben blieb bis zu Tag 14 unvollständig wobei wenige Multischichtbildungen zwischen den Streben an Tag 14 gefunden wurden. Im Gegensatz dazu waren mit Nitrocarbonsäure-enthaltendem Phosphatidylcholin bedeckte Streben an Tag 7 bzw. Tag 14 teilweise und schließlich vollständig mit Endothelzellen bedeckt. Hierbei zeigte sich bei Gemischen gemäß den Beispielen N2 und N6 eine leichte Tendenz zum stärkeren Bewuchs mit Zellen, die aber statistisch nicht signifikant war. Weiterhin wurde keine Multischichtbildung beobachtet, weder auf den Streben noch in den Zwischenräumen.
Schlussfolgerung: Unbeschichtete Metallgitter aus Kobalt-Chrom-Legierung erlauben ein schnelles Zellhoming von Endothelzellen. Jedoch kommt es zu einer fortschreitenden Proliferation dieser Zellen auf und zwischen den Stentstreben. Phosphatidylcholinbeschichtung verzögert das Zellhoming, jedoch scheint die Beschichtung keinen Effekt auf die Multischichtbildung von Endothelzellen zwischen den Streben zu haben. Die Kulturergebnisse mit Metallgittern, die mit Nitrocarbonsäure-enthaltenden Phosphatidsylcholin beschichtet waren, dokumentieren ein schnelleres Homing von Endothelzellen auf den so beschichteten Oberflächen im Vergleich zu einer Beschichtung mit nativen Phosphatidylcholin, während eine Multischichtbildung von Endothelzellen im Wesentlichen ausbleibt.
Beispiel 7
Untersuchungen zum Effekt von Nitrocarbonsäure-enthaltenden Phospholipiden auf zellimmunologische Effekte Um die biopassivierenden Eigenschaften von verschiedenen Nitrocarbonsäure- enthaltenden Phopholipiden zu evaluieren wurden die Überlebensrate und Zytokinproduktion von adherirenden Makrophagen untersucht.
Träger aus Glas wurden mit Nitrocarbonsäure-enthaltendem und nativem Phosphatidylcholin beschichtet, und eine Mischung aus jeweils 50% Phosphatidylcholin und Phosphatidyletholamin wie in Beispiel 2 beschrieben aufgetragen. Weiterhin wurden Träger mit Gemischen von Nitrocarbonsäure- enthaltende(n) Phosphatidylcholinen gemäß den Beispielen N12 - N14, E, 02, 06, Q und P3 - P7 beschichtet. Die Glasträger bedeckten den Boden einer Teflonschale, in welche die beschichteten und die als Kontrolle dienenden unbeschichteten Träger gegeben wurden. Murine Makrophagen (RAW 264.7) wurden bis zu einer Zelldichte von 5x105 kultiviert. Zellsuspensionen wurden zu den Testschalen hinzugegeben, so dass die Makrophagen sich unter Standardkulturbedingungen für 24 und 48 Stunden an die Träger anheften konnten. Kultur-Überstände wurden zu Beginn und zum Ende der Experimente mit Assays auf IL6, IL8 und Makrophagen Chemoattractant Protein 1 (MCP-1 ) untersucht. Die Überlebensrate wurde mit einem MTT-Assay untersucht.
Ergebnisse: Bei unbeschichteten Glasträgern wurde während der Beobachtungsperiode eine signifikante Erhöhung aller Zytokine beobachtet. Im Gegensatz dazu wurde in Kulturen mit Trägern, die mit Phosphatidylcholin beschichtet waren, nach 24 Stunden fast keine Veränderung festgestellt, nach 48 Stunden zeigte sich dann eine mäßige Erhöhung. In Kulturen von Trägern, die mit einer Mischung von natürlichen Phospholipiden beschichtet waren, kam es zu einer progressiven Erhöhung der Zytokinkonzentrationen, deren Konzentration etwa dieselbe war wie in Experimenten mit nativen Glasoberflächen. In Überständen aus Kulturen von Trägern, die mit Nitrocarbonsäure-enthaltendem Phosphatidylcholin beschichtet waren, war IL-8 nach 24 h minimal erhöht, während sich die anderen Zytokine nicht veränderten. Nach 48 h zeigte sich für alle Zytokine eine geringe Erhöhung; jedoch war die Konzentration signifikant geringer als in Experimenten mit nativer Phosphatidycholin-Beschichtung. In Experimenten bei denen die Glasträger mit einer Mischung aus Nitrocarbonsäure- enthaltenden Phospholipiden bedeckt waren, zeigte sich eine insignifikante Erhöhung aller Zytokine, die allerdings geringer war als die Erhöhung, die bei einer gleichartigen Beschichtung einer Phospholipid-Mischung mit native Carbonsäuren bestand. Dabei zeigten sich bei den verwendeten Produktgemischen gemäß den Beispielen N12 - N14, E, O2, 06, Q und P3 - P7 nur minimale Unterschiede.
Zellen, die auf unbeschichteten Trägern adherierten, blieben zu einem hohen Anteil vital (95% nach 24 h bzw. 90% nach 48 h). Auf Phosphatidylcholin-beschichteten Trägern war die Vitalität der Zellen nach 24 h in etwa dieselbe wie auf unbeschichteten Glasträgern, aber nach 48 h im Vergleich hierzu deutlich geringer (75%). In Experimenten mit einer Phospholipid-Mischbeschichtung kam es zu einem rapiden Verlust der Vitalität (70% nach 24 h und 50% nach 48 h). In Experimenten, die mit nitrierten Phospholipiden durchgeführt wurden, war die Vitalität signifikant höher als bei Beschichtungen mit nativen Phospholipiden, nämlich für Nitro- carbonsäuren-enthaltende Phosphatidylcholine 95% nach 48 h, und für Nitro- carbonsäuren-enthaltende Phospholipidmischungen 90% nach 48 h. Bei den Nitro- carbonsäure-enthaltenden Phosphatidylcholingemischen gemäß den Beispielen N12 - N14 und E lagen die Werte zwischen 85% und 95% nach 48 h, wobei keine Tendenz für einzelne Produktgemische erkannt werden konnten. Bei den Cholinen ge- mäß O2 und P4 - P7 lagen die Werte zwischen 90% und 95% nach 48 h und bei den Cholinen gemäß Q, O6 und P3 lagen die Werte zwischen 95% und 98% nach 48 h.
Schlussfolgerung: Unbeschichtete Glasoberflächen aktivieren Makrophagen. Diese Aktivierung wird durch die Oberflächenbeschichtung mit Phospholipiden auf ein Minimum reduziert. Jedoch bedingt die reduzierte Adhesion von Makrophagen auf einer Phosphatidylcholin-Oberfläche eine verstärkte Apoptose, was im Verlauf zu einer Zytokinproduktion führt. Wenn Phosphatidyletholamin zur Oberflächenbeschichtung gegeben wird kommt es zu einer differenzierten Zytokinfreisetzung, wahrscheinlich durch die bekannten Effekte der Oberflächenladung. Dieser Effekt wird durch Nitrocarbonsäure-enthaltende Phospholipide reduziert. Die Vitalität von Makrophagen, die auf Nitrocarbonsäure- enthaltende Phospholipidbeschichtungen kultiviert werden, ist höher als die von Makrophagen, die auf vergleichbaren Beschichtungen ohne Nitrocarbonsäure enthaltende Phospholipide kultiviert werden. Beispiel 8
Untersuchungen zu Effekten von Nitrocarbonsäuren enthaltenden Phospholipiden auf die Zellphysiologie
Physiologisch vorkommende Phospholipide können von praktisch allen Zellinien in großen Mengen aufgenommen werden. Es ist bekannt, dass Phospholipide, die nicht physiologischerweise vorkommende Fettsäurereste enthalten, eine Zelllyse oder ein Absterben bewirken können. Drei Zelllinien (HUVEC, HeLa und L929 Fibroblasten) wurden in einem adäquaten Kulturmedium mit 5% FCS bei 37°C und 5% CO2-Gehalt zu einer subkonfluenten Konzentration von 1 ,5*105 Zellen kultiviert.
SOPC, DOPC, POPC, ONOPC, PNLPC sowie die freien Fettsäuren OA, LA, NOOA, und NOLA wurden in 0,5% DMSO gelöst.
Weiterhin wurden die Versuche mit Nitrocarbonsäuren enthaltenden Phospholipiden gemäß der Beispiele N15 - N20, G, O3, 05, P2, P5, P8, P9, P1 1 und Q durchgeführt. Es wurden den Kulturflaschen Lipidsuspensionen hinzugegeben, um eine Lipidkonzentration von 10 μιτιοΙ bis 1 mmol zu erreichen. Die Zellkulturen wurden für 24h und 48h inkubiert. Hiernach wurde das Kulturmedium entfernt und die Zellen zweimal gewaschen. Im Anschluss hierzu wurden die Zellen auf vier Vials aufgeteilt und folgenden Analysen zugeführt:
1 . Lipidfärbung mittels Nilrot-Färbung;
2. Zellvitalität mit dem MTT-Test;
3. Volumetrie;
4. Zellstabilität.
Bei der Nilrotfärbung wurde eine 1 μιτιοΙ Nilrotlösung in PBS für 15 Minuten zu der Zellsuspension gegeben. Anschließend wurde die Lösung dekantiert und die Zellsuspension zweimal mit PBS gewaschen. Die Quantifizierung der Fettakkumulation erfolgte mittels Fluoreszenzmikroskopie nach jeweils 1 h, 12h und 24h.
Für die Vitalitätsbestimmung wurde den resuspendierten Zellen Phenolrot zugesetzt. Nach 4h wurde das Medium erneuert und 10 μΙ der MTT-Lösung hinzugefügt. Die Zellen wurden für 4h kultiviert, danach wurde eine 10% SDS Lösung hinzu pipettiert. Nach 24h wurde die Absorption der gelösten Formazankristalle bei 500 nm mit Hilfe eines Power Wave X (Bio-Tek Instruments, Inc., USA) bestimmt. Für den quantitativen Vergleich wurde jeweils die EC50 ermittelt.
Für die volumetrische Messung wurden die Zellen in einer HistoDenz (Sigma)- Lösung mit einer effektiven 0,9%igen NaCI-Konzentration (ca. 290 mOsm) resuspendiert, auf 37°C erwärmt und für 2 Minuten sonifiziert. Die Messung erfolgte mit einem Coulter Counter Z2.
Untersuchungen zur Zellvitalität wurden ferner mit dem Live/Dead-Assay (Molecular probes) durchgeführt. Hierzu wurden die Zellen zweimal mit PBS-Lösung gewaschen und anschließend in einem Kulturmedium ausgesät. Die Inkubation mit der Färbelösung (in 0,1 % DMSO) erfolgte über 30 Minuten im Dunkeln. Die Vitalitätsanalyse erfolgte über Fluoreszenzmikroskopie.
Ergebnisse (Diese sind als Tabelle in Figur 1 zusammengefasst):
Eine Inkubation mit freien Fettsäuren führte zu einer zeitabhängigen, zellulären Aufnahme von Fettsäuren, die als Fettvesikel im Zytoplasma vorlagen. Die Vesikelflächen korrelierten mit der Konzentration der Fettsäurekonzentration der Inkubationslösung. Die Aufnahme war bei den beiden Nitrofettsäuren rascher und stärker als bei den nativen Fettsäuren. Nach Inkubation mit Phospholipiden waren nur bei Phospholipiden mit nitrierten Fettsäuren Lipidvesikel im Zytoplasma nach 24 Stunden sichtbar, die Vesikelflächen korrelierten mit der Konzentration der Phospholipidkonzentration der Inkubationslösung. Die Vitalität im MTT-Assay war nach Inkubation mit SOPC, DOPC und POPC bei den untersuchten Konzentrationen nur gering erniedrigt, so dass sich die EC50 mit den verwandten Konzentrationen nicht berechnen ließ. Nach Inkubation mit ONOPC und PNLPC zeigte sich eine mäßige Zytotoxizität nach 24 Stunden bei der höchsten Phospholipidkonzentration (Gesamtvitalität 83 % bzw. 75%). Nach 48 Stunden konnte eine EC50 bei einer Konzentration von ONOPC um 0,8 - 5 mmol und für PNLPC um 0,4 - 3,9 mmol ermittelt werden. Die freien Fettsäuren wiesen eine erheblich stärkeren Effekt auf die Vitalität im MTT-Assay auf, die EC50 betrug nach 48 Stunden für die verschiedenen Zelllinien zwischen 180 - 260 μιτιοΙ für Ölsäure, 240 - 260 μιτιοΙ für Linolsäure, 10 - 50 μιτιοΙ für Nitroölsäure und 50 - 100 μιτιοΙ für Nitrolinolsäure.
Die Bestimmung des Zellvolumens ergab, dass Zellen, die mit den natürlichen Phospholipiden DOPC, POCP und SOPC inkubiert worden waren, eine zeitabhängige Größenzunahme auf 180%, 160% bzw. 150% sowie für vorbehandelte Zellen mit den Fettsäuren Ölsäure 200%, Linolsäure 170%, Nitroölsäure 140% und Nitro-Linolsäure 120% aufwiesen. Zellen, die mit den nitrierten Phospholipiden inkubiert wurden, wiesen eine nicht signifikante Zunahme des Zellvolumens auf 1 10- 120% auf.
Die Ergebnisse der Live/Dead-Färbung stimmten nur teilweise mit den Ergebnissen des MTT-Vitalitätstest überein. In Übereinstimmung mit dem MTT-Assay wiesen Zellen, die mit den natürlichen Phospholipiden SOPC, DOPC und POPC inkubiert wurden, eine hohe Vitalitätsrate auf. Bei einer Konzentration der nativen oder nitrierten Fettsäuren, die im MTT-assay zu einem 50%igen Vitalitätsverlust geführt haben, wies die Vitalitätsprüfung deutlich geringere Vitalität für Zellen auf, die mit nativen Fettsäuren inkubiert wurden und eine mäßig geringere Vitalität bei Zellen nach Inkubation mit nitrierten Fettsäuren. Keine Übereinstimmung zeigte sich bei der Bewertung der Vitalität von Zellen, die mit nitrofettsäuretragenden Phospholipiden behandelt worden sind, hier zeigte sich nahezu die gleiche Vitalität wie bei den übrigen Phospholipiden.
Die Versuche mit den Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden gemäß der Beispiele N15 - N20, G, O3, O5, P2, P5, P8, P9, P1 1 und Q ergaben keine signifikanten Abweichungen im Vegleich zu den Inkubationen mit ONOPC und PNLPC. Es wurde durchweg nur eine geringe Menge an Lipidvesikeln im Zytoplasma detektiert, einhergehend mit einer geringen Zytotoxizität (Werte zwischen 0,6 und 4,5 mmol im MTT-assay) und nahezu unveränderter Werte im Live/Dead assay (85 - 95%). Das Zellvolumen war auch kaum verändert und zeigte leichte Tendenzen etwas vergrößert zu sein, wie es sich bereits bei den Inkubationen mit ONOPC und PNLPC abgezeichnet hat. Insgesamt zeigten alle
Nitrocarbonsäuren enthaltenden Phospholipide ähnliche Effekte in den getesten Assays, wobei keine signifikanten Unterschiede zwischen den verschiedenen Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden festgestellt werden konnten.
Interpretation: Phospholipide mit einer nitrierten Fettsäure wurden im Vergleich zu natürlich vorkommenden Phospholipiden sowie im Vergleich zu nativen oder nitrierten freien Fettsäuren in einer geringeren Menge von Zellen aufgenommen. Die zelluläre Aufnahme von nitrofettsäurenenthaltenden Phospholipiden bewirkt eine Verminderung der Zellstoffwechselsaktivität. Nitrierte freie Fettsäuren führen ebenfalls zu einer Minderung der Zellstoffwechselaktivität, wobei sich dieser Effekt mit den toxischen Effekten überschneidet. Im Gegensatz zu nitrierten freien Fettsäuren bleiben die Zellen nach Aufnahme von Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden trotz einer reduzierten Stoffwechselaktivität überwiegend vital.
Aus den Ergebnissen lässt sich ableiten, dass Nitrocarbonsäure(n)-enthaltende Phospholipide in einem deutlich größeren Konzentrationsbereich nicht toxisch sind, im Gegensatz zu freien nativen oder nitrierten Fettsäuren. Trotz scheinbar nur einer geringen Menge an aufgenommenen nitrierten Phospholipiden wird eine erhebliche Reduktion des Stoffwechsels bewirkt (im Gegensatz zu nativen Phospholipiden), wodurch sich antiproliferative Effekte ableiten lassen.
Beispiel 9
Untersuchungen zu Effekten von Nitrocarbonsäuren enthaltenden Phospholipiden auf die Adhäsion, Migration und Proliferation von Zellen.
Phospholipide können unmittelbar von Zellen in ihre äußere Membran aufgenommen werden und hierdurch die Eigenschaften der Zellmembran verändern. Daher sollte untersucht werden, ob Phospholipide, die mindestens eine Nitrocarbon säure enthalten, zu unterschiedlichen Effekten bei Zellen führen, die diese aufnehmen. POPC, DOPC, POPE, ONOPC, PNLPC, PNOPE 1 -Palmitoyl-2-(E-9-nitrooleoyl)-sn- 3-glycero-phosphatidylethanolamin sowie die freien Fettsäuren Ölsäure, E-9- Nitroölsäure und E-9-Nitrolinolsäure wurden in 0,5% DMSO gelöst.
Weiterhin wurden Nitrocarbonsäure(n)-enthaltende Phospholipide gemäß der Beispiele N7 - N9, F, O2 - O4, P1 , P2, P5, P6, P8 - P10, P15 und Q. getestet.
Die Untersuchungen wurden mit humanen umbilikalen Endothelzellen (HUVEC) sowie mit humanen glatten Gefäßmuskelzellen und Mausfibroblasten durchgeführt. Die Zellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen über 2 Stunden vor Versuchsbeginn inkubiert.
Für die Untersuchungen zur Zellproliferation wurden die drei Zelllinien in 5% FKS und 5% CO2 bei 37 °C kultiviert. Die Zellsuspensionen wurden bei Erreichen einer Zelldichte von 1 ,5*105 in 4 fächern Ansatz in die Inkubationsgefäße aufgeteilt und POPC, DOPC, POPE, ONOPC, PNLPC, PNOPE oder eines der Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipide bzw. Phospholipidgemische gemäß den Beispielen N7 - N9, F, 02 - 04, P1 , P2, P5, P6, P8 - P10, P15 und Q zugesetzt, so dass Endkonzentrationen von 10 μιτιοΙ und 100 μιτιοΙ resultierten. In einem Ansatz wurde nur eine 0,5%ige DMSO-Lösung hinzugegeben. Die Zellen wurden dann zweimal mit PBS gewaschen und unter den oben genannten Standardbedingungen für 24h, 48h und 96h kultiviert. Die Zellen wurden mit Trypsin- Ethylendiamintetraacetat-Lösung abgelöst. Die abgelösten Zellen wurden vereinzelt und die Aktivität des Trypsins durch Zugabe von Kulturmedium gestoppt. Zur Bestimmung der Zellzahl wurden Aliquote entnommen und in einem CASY 1 Cell- Counter and Analyzer System, Modell TTC (Schärfe System, Reutlingen) analysiert, wobei neben der Zellkonzentration auch Zelldurchmesser und -volumen bestimmt wurden.
Für die Untersuchungen zur Bestimmung der Zelladhäsion wurden 6-well Platten mit Kollagen XXII vollflächig beschichtet. Zellsuspensionen, die mit 10 μιτιοΙ und 100 μιτιοΙ der genannten Phosholipide und nativen Fettsäuren vorbehandelt waren, wurden mit einer Zellzahl von 2,5 - 3,5*105 in den 6-well-Platten für 24h und 72h in frischem Nährmedium unter Standardbedingungen kultiviert. Hiernach wurde das Kulturmedium abgezogen und durch eine 0,05%ige Trypsin-EDTA-Lösung ersetzt. Unter Kultivierungsbedingungen und auf einer Schüttelplatte wurde nach 10, 30 und 60 Minuten jeweils 2 Wells abgezogen und mit PBS wieder aufgefüllt. Abschließend wurde eine 2 %ige Trypsinlösung hinzugegeben und für eine weitere Stunde inkubiert und die Suspension abgezogen. Die abgezogenen Zellsuspensionen wurden mit einem automatischen Zellcounter (s.o.) hinsichtlich der Zellzahl und des Zellvolumens analysiert.
Die Zellmigration wurde anhand eines standardisierten Wundheilungs- Versuchsaufbaus durchgeführt. Hierzu wurden die drei Zelllinien wie zuvor beschrieben mit Phospholipiden und Fettsäuren inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS wurden 2 - 3*105 Zellen in Ibidi Kultur-Einlageformen, die der Agarplatte auflag, gegeben und für 24h unter Standardbedingungen kultiviert. Hiernach wurde der die Kulturfläche unterbrechende Stempel mit einer Breite von δθθμιτι entfernt. Anschließend erfolgte eine weitere Kultivierung für drei Tage. Alle acht Stunden erfolgte eine Fotodokumentation des Kulturareals. Die Bilder wurden mit einer Software zur automatischen Erkennung der mit Zellen bedeckten Flächen ausgewertet.
Ergebnisse (Diese sind als Tabelle in Figur 2 und 2a zusammengefasst):
Im Vergleich zu den Kontrollgruppen bewirken natürliche Phospholipide sowie die native Ölsäure eine Zellproliferation. Bei Phospholipiden mit Cholinkopfgruppe nimmt die Zellproliferation bei hohen Konzentrationen weiter zu, während bei einer Etholaminkopfgruppe die Proliferation abnimmt. Die nitrierten freien Fettsäuren weisen im Vergleich zur Kontrollgruppe bei der geringen Konzentration keinen signifikanten Effekt auf, aber einen deutlichen anti-proliferativen Effekt bei hoher Konzentration. Die Nitrofettsäuren weisen in allen Konzentrationen einen erheblichen anti-adhäsiven Effekt auf, der stärker ist, als der der Ölsäure. Die Abnahme der Proliferation wird begleitet von einer zunehmenden Zellablösung sowie einem reduzierten Defektverschluss. Die Proliferationssteigerung durch Phospholipide mit Cholinkopfgruppe geht einher mit einer verminderten Zellablösung und einem rascheren und vollständigen Defektverschluss.
Zellen, die mit nitrierten Phospholipiden inkubiert wurden, weisen im Gegensatz hierzu eine leichte Reduktion der Zellproliferation bei geringer Konzentration und eine signifikante Reduktion bei hoher Konzentration auf. Der Effekt blieb über den gesamten Untersuchungszeitraum erhalten. Gegenüber der kalkulatorischen Ablöserate bei der Kontrollgruppe bzw. den Gruppen, die mit Phosphocholin- Phospholipiden inkubiert wurden, bestand kein signifikanter Unterschied in der Rate der Zellablösung. Der Wundverschluss war bei Inkubation mit der hohen Konzentration nitrierten Phospholipiden zu allen Zeitpunkten gegenüber den anderen Gruppen am stärksten reduziert.
Die Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipide und Phospholipidgemische gemäß den Beispielen N7 - N9, F, 02 - 04, P1 , P2, P5, P6, P8 - P10, P15 und Q zeigten dabei insgesamt sehr homogene Ergebnisse, die nicht weit von den Effekten der weiteren getesteten Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipide ONOPC, PNLPC oder PNOPE abwichen. Somit lässt sich feststellen, dass auch die Gemische aus Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden eine einheitliche Wirkung zeigen, die sich nicht von den Effekten einzelner verwendeter Nitrocarbonsäure(n)-enthaltender Phospholipide unterscheidet.
Interpretation:
Die Inkubation mit Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden bewirkte über den verwandten Konzentrationsbereich eine deutliche Reduktion der Zellproliferation, deren Ausmaß nur noch durch Inkubation mit einer hohen Konzentration an nitrierten Fettsäuren erreicht wurde. Gleichzeitig ließen sich die mit den erfindungsgemäßen Verbindungen inkubierten Zellen erheblich schwerer wieder von der Oberfläche ablösen, insbesondere im Vergleich zu den nitrierten Fettsäuren. Somit kann gefolgert werden, dass das Zellwachstum durch Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden zwar reduziert aber gleichzeitig die Zellanhaftung gefördert wird. In der Summe begünstigen diese Eigenschaften einen physiologischen Defektverschluss bzw. das Zellhoming. Es ist zu erwarten, dass sich diese Eigenschaften auf die Einheilung eines entsprechend beschichteten Implatats günstig auswirken.
Beispiel 10
Untersuchungen zu Effekten von Fettsäuren und Phospholipiden, die native oder nitrierte Carboxylsäuren enthalten, auf Phospholipid-Modellmembranen und Membranproteine.
Die Inkorporation von Phospholipiden in eine Zellmembran kann zu einer Änderung ihrer physiko-chemischen Eigenschaften führen. Es sollte daher untersucht werden, welchen Effekt nitrierte Alkylketten in Phospholipiden auf die Membraneigenschaften haben. Der Membrandruck, der Grad der Anisotropie und die Phasenübergangstemperatur können in Modellmembranen unilaminärer Vesikel über das Reportermolekül Laurdan abgeschätzt werden.
Viele Membranproteine erlangen ihre Funktionalität erst nach Herstellung einer Interaktion von Untereinheiten. Der Faltungsprozess von Membranproteinen wird unter anderem durch die laterale Interaktion benachbarter Transmembranhelices vermittelt. Die Veränderung des Förster-Resonanz-Energietransfers (FRET) von fluoreszenzmarkierten Peptiden mit α-helikalen Transmembranstrukturen in einer Lipiddoppelschicht kann zu einer Konzentrationsbestimmung von monomeren und dimeren Transmembranhelices und damit zur quantitativen Bestimmung von Helix- Helix-Interaktionen verwendet werden. Durch Variation der Lipidzusammensetzung der Lipiddoppelschicht lassen sich deren physikalische Eigenschaften verändern und die mögliche Auswirkung auf die Dimerisierung bestimmen.
Die FRET-Messungen wurden mit fluoreszenzmarkierten Glykophorin A-Peptiden (GpA) durchgeführt. Das transmembrane GpA bildet Dimere, wodurch ein Energietransfer messbar ist. Als Chromophore kamen dabei 5-Carboxyfluorescein und Tetramethyl- 6-carboxyrhodamin zum Einsatz.
Für die Bestimmung der Membrananisotropie wurden die nativen Phospholipide SOPC und SLPC sowie die analogen Phospholipide SNOPC und SNPLC jeweils alleine und jeweils mit dem Phospholipid DSPC 1 :1 (w/w) gemischt. Als Referenz wurden unilaminare Vesikel aus DSPC untersucht. Ferner wurden in weiteren Ansätzen die Phospholipide gemäß den Beispielen N1 - N5, N15 - N20, 01 , 02, P1 - P4, D, F, Q, R und S untersucht.
Die Bestimmung des Dimerisationsgrades des Modellproteins erfolgte im direkten Vergleich zwischen nativen Phospholipiden und den korrespondierenden Phospholipiden mit einer nitrierten Alcylkette für die untersuchten Konzentrationen der Phospholipide (10 - 50%, mol/mol) in DSPC-Vesikeln.
Die Phospholipide wurden in einem CHCIs/MeOH-Gemisch (1 :1 ) gelöst, die Gesamtkonzentration an Phospholipiden lag stets bei 1 mM. Zu den Lipidmischungen wurde Laurdan (in EtOH) im Verhältnis 1 :500 (2 μΜ) hinzugegeben und das Gemisch homogenisiert. Die Proben wurden vom Lösungsmittel befreit und unter Vakuum getrocknet. Anschließend wurde mit 250 μΙ HEPES-Puffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCI, pH 7,4) hydratisiert und mindestens 30 Minuten bei 65°C und 1400 rpm im Thermomixer inkubiert, wodurch multilamellare Vesikel gebildet werden. Um daraus unilamellare Vesikel zu formen, wurden die Proben in fünf Zyklen zunächst in flüssigem Stickstoff eingefroren, anschließend bei 65 °C im Wasserbad wieder aufgetaut und 1 min bei 1400 rpm im Thermomixer homogenisiert. Aus jeder Probe wurden 200 μΙ entnommen und vermessen. Die Messungen wurden an einem Fluoreszenz-Spektrometer des Typs Horiba Scientific FluoroMax-4, zusätzlich ausgestattet mit einer digitalen Temperaturregelung des Typs Horiba Scientific F- 3004, durchgeführt.
Für die Bestimmung der Dimerisation wurden die Peptide FL-GpAwt und TAMRA- GpAwt eingewogen und in TFE gelöst. Die Messungen wurden an einem Fluoreszenz-Spektrometer des Typs Aminco Bowman Series 2 (Thermo Spectronic) durchgeführt.
Ergebnisse: (Die Ergebnisse sind in den Figuren 10a und 10b zusammengefasst). Die nativen Phospholipide zeigten in der Gelphase ein uniformes Verhalten, der Phasenübergangspunkt lag zwischen 52 und 54°C. Mit höheren Temperaturen nahm der Anisotropiegrad zu. Im Gegensatz hierzu war der Anisotropiegrad bei Zugabe nitrierter Phospholipide in der Gelphase geringer als bei den nativen Phospholipiden, der Übergangspunkt signifikant nach links verschoben (40-42°C) und es lag eine geringerer Anisotropiegrad bei höheren Temperaturen vor.
Für die Beispiele D und F ergab sich ein um 10 - 20% stärkrer Effekt auf den Membranschmelzpunkt (Absenkung) und den Anisotropiegrad (Erhöhung), für die Beispiele N1 - N5, N15 - N20, O1 , O2, P1 - P4, Q waren die Effekte vergleichbar mit den Ergebnissen von SNOPC und SNLPC. Für die Beispiele F, Q, R und S waren die vorbeschriebenen Effekte 15% bis 30% geringer ausgeprägt Der Zusatz von Phospholipiden mit einer ungesättigten Fettsäure erniedrigten den Dimerisationsgrad des Modell-Membranproteins. Analoge Phospholipide mit einer Nitrogruppe an der ungesättigten Fettsäure führten zu einer signifikant stärkeren Reduktion der Dimerisation (P13, SNLPC; P14, SNOPC). (Der Wert der FRET- Messung von DSPC ohne Zugabe von anderen Phospholipiden wurde als 100% normiert). Für die nitrierten PL gemäß den Beispielen N1 - N5, N15 - N20, 01 , 02, P1 - P4, D, F, Q, R und S zeigte sich, dass die Reduktion des Dimerisationsgrad sich ganz analog zu der von P13 und P14 verhielt..
Interpretation: Phospholipide mit einer nitrierten ungesättigten Fettsäure haben einen erheblich stärkeren Effekt auf die Membranfluidität und damit den Membranschmelzpunkt als die korrespondierenden nativen Phospholipide. Darüber hinaus stellt sich eine Erniedrigung des Ordnungsgrades innerhalb der Membran bei Temperaturen in der flüssig-kristallinen Phase ein, während in der Gelphase und hier insbesondere bei höheren Tepmeraturen der Ordnungsgrad signifikant größer ist als bei den nativen Phospholipiden. Die Erhöhung des Ordnungsgrades ist sehr wahrscheinlich ursächlich für die gefundene Störung der Dimerisation von Modell-Membranproteinen, die bei Phospholipiden mit nitrierten Fettsäuren erheblich stärker ist als die von nativen Phospholipiden. Somit führt die Aufnahme von Nitrocarbonsäure(n)- enthaltenden Phospholipden in eine Modellzellmembran zu einer Erhöhung ihrer Stabilität bei physiologischen Temperaturen, bzw. zu einer Abnahme der Membranfluidität. Da die Zellnozeption zu einem großen Teil von der Membranfluidität abhängt ist aus den gefundenen Effekten eine Reduktion der Wahrnemung gegenüber mechanischen, chemischen und osmotischen Alterationen anzunehmen.
Beispiel 11
Untersuchungen zu Effekten von Fettsäuren und Phospholipiden, die native oder nitrierte Carboxylsäuren enthalten, auf eine Fibroseinduktion durch Fibroblasten. Eine inadäquate Produktion von Kollagen durch stimulierte Fibroblasten ist maßgeblich für eine überschießende Narbengewebebildung bzw. Fibrosierung verantwortlich. In einem in-vitro Zellmodell wurde der Effekt einer Inkubation von Fibroblasten mit nativen (SOPC, POPC) Phospholipiden und den Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden SNOPC, PNOPC, PNLPC sowie den nativen Fettsäuren Ölsäure, Linolsäure und den nitrierten Fettsäuren Nitroölsäure und Nitrolinolsäure auf Fibroblasten untersucht. Zusätzlich wurden die Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden und Phospholipidgemischen gemäß den Beispielen N4 - N8, N10, N1 1 , D, B, 02, 04, 06, P8 - P12, P15 und Q getestet. Hierzu wurde die Kollagensynthese mittels eines immunhistologischen Nachweises semiquantitativ beurteilt. Mausfibroblasten wurden kultiviert und nach 5 Passagen mit den nativen Phospholipiden SOPC, DOPC sowie PLPC, den nitrierten Phospholipiden SONPC, PNOPC sowie PNLPC, den Fettsäuren Ölsäure, Linolsäure, und Nitroölsäure sowie Nitrolinolsäure und NaCI-Lösung oder den Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden oder Phospholipidgemischen gemäß den Beispielen N4 - N8, N10, N1 1 , D, B, 02, 04, 06, P8 - P12, P15 und Q über 24 Stunden inkubiert. Die finalen Konzentrationen der Phospholipide betrugen 10 μιτιοΙ, 100 μιτιοΙ und 200 μιτιοΙ, die der Fettsäuren 10 μιτιοΙ und 100 μιτιοΙ. Jeweils 1 ,5*104 Fibroblasten wurden auf einer 8-Kammer- Objektträgerplatte (Lab-Tek II, Nunc) in Standardmedium mit 2 % FKS über 3, 5 und 7 Tage kultiviert. In einer parallel durchgeführten Zellkultur wurde zusätzlich TGF-ß gegeben. Zur immunhistochemische Darstellung (LSAB2 System, Dako, USA) wurden die Kulturen mit PBS gewaschen und in Ethanol/Aceton (99:1 v/v) für 10 Minuten fixiert. Dann wurden die Platten mit 0,05 M Tris/HCI-Puffer, pH 7.2-7.6 (Merck) gewaschen und mit 3% H2O2-Lösung inkubiert. Nach erneutem Waschen wurde für 10 Minuten monoklonaler anti-Kollagen I-Antikörper (MAB3391 , Chemicon) hinzugegeben. Nach erneutem Waschen wurde der sekundäre, biotinylierte Link- Antikörper (anti-Maus- und anti-Kaninchen-lmmunglobuline, Dako) für 20 Minuten inkubiert und anschließend erneut gewaschen. Als Enzymkonjugat wurde dann Streptavidin, markiert mit Peroxidase (Dako), für 10 Minuten inkubiert. Nach nochmaligem Waschen erfolgte die Zugabe des Substratchromogens AEC (3-Amino- 9-Ethylcarbazol, Dako) für 10 Minuten. Anschließend erfolgte eine Gegenfärbung mit Hämatoxylin für 5 Minuten. Die Präparate wurden semiquantitativ im Lichtmikroskop ausgewertet.
Ergebnisse: Fibroblasten der Kontrollgruppe wiesen eine lineare Vermehrung der Kollagenmatrixmenge über den gesamten Untersuchungszeitraum auf, bei Stimulation mit TGF-ß war die Vermehrung überproportional gesteigert. Die nativen Fettsäuren hatten in der geringen Konzentration keinen signifikanten Effekt auf die Kollagensynthese, bei hohen Konzentrationen war die Kollagensynthese an Tag 3 gegenüber der Kontrolle reduziert und am Tag 7 vermehrt. Die Nitrofettsäuren bedingten bei der geringen Konzentration eine verminderte Kollagensynthese bis zum Tag 5. Bei hoher Konzentration war die Kollagensynthese stärker gemindert und der Unterschied war auch noch am Tag 7 gegenüber der Kontrolle signifikant. Unter Stimulation mit TGF-ß zeigte sich eine gesteigerte Kollagensynthese nach Inkubation mit nativen Fettsäuren in geringer Konzentration zu allen Untersuchungszeitpunkten. Bei hoher Konzentration der nativen Fettsäuren kam es an Tag 3 zu einer geringen Reduktion und danach zu einer deutlichen Steigerung der Kollagensynthese. Die Nitrofettsäuren wiesen vergleichbare Effekte auf die Kollagensynthese auf, allerdings war die Minderung der Kollagensynthese an Tag 3 stärker (n.s.), an Tag 7 zeigte sich kein Unterschied zu den nativen Fettsäuren. Die nativen Phospholipide hatten bei Inkubation mit einer Konzentration von 10 μιτιοΙ und 100 μιτιοΙ keinen Effekt auf die Kollagensynthese. Bei der höchsten Konzentration bestand eine Reduktion der Kollagensynthese an Tag 3 und eine Steigerung an Tag 7. Unter Stimulation mit TGF-ß kam es zu einer signifikanten Steigerung der Kollagensynthese gegenüber der Kontrolle bei allen nativen Phospholipiden, mit Ausnahme der Gruppe mit der höchsten Konzentration an Tag 3. Die Inkubation mit den Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden bei einer Konzentration von 10 μιτιοΙ führte zu einer Minderung der Kollagensynthese, die signifikant war an Tag 3 und die als Trend noch an Tag 5 und 7 beobachtet wurde. Die Verwendung hoher Konzentrationen führte zu einer nahezu vollständigen Unterbindung der Kollagensynthese zu allen Untersuchungszeitpunkten. Nach Stimulation mit TGF-ß zeigte sich bei Zellen, die mit der niedrigen Konzentration der Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipide vorbehandelt waren, kein signifikanter Unterschied in der Kollagensynthese zu den Ergebnissen ohne TGF-ß- Stimulation, aber eine erhebliche Abnahme gegenüber der Kontrollgruppe zu allen Untersuchungszeitpunkten. Bei Inkubation mit einer Konzentration von 100 μιτιοΙ war, wie bei den unstimulierten Fibroblastenkulturen, keine Kollagensynthese zu registrieren. Diese Ergebnisse waren auch unabhängig davon, ob Gemische von Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden gemäß den Beispielen N4 - N8, N10, N1 1 , D, B, O2, O4, O6, P8 - P12, P15 und Q verwendet worden sind, oder, ob die Inkubation der Zellen nur mit einem Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipid wie z.B. SNOPC, PNOPC oder PNLPC durchgeführt wurde. Entscheidend scheint hierbei, dass ein nitrierter Alkylrest vorliegt, weitestgehend unabhängig davon, um welches Phospholipid es sich im Endeffekt handelt. Interpretation: native und nitrierte Fettsäuren können konzentrationsabhängig zu einer kurzzeitigen Reduktion der Kollagensynthese führen, haben aber keinen Einfluss auf die zytokininduzierte Stimulation der Kollagensynthese. Die Inkubation mit nativen Phospholipiden hat keinen relevanten Einfluss auf die Kollagensynthese. Im Gegensatz hierzu bewirken Nitrocarbonsäure(n)-enthaltende Phospholipide eine starke Hemmung der Kollagensynthese. Im Gegensatz zu nitrierten Fettsäuren bleibt dieser Effekt bei Stimulation mit Cytokinen erhalten. Diese Effekte sind geeignet um eine übermäßige, Cytokin mediierte Fibrosierung zu unterbinden. Dies kann beispielsweise zu einer deultichen Minderung einer Fibrosekapselbildung um ein Implantat führen. Beispiel 12
Untersuchungen zur Stabilität von Nitrocarbonsäuren enthaltenden Phospholipiden und deren Effekte auf Phospholipidgemische Beschichtungen von Medizinprodukten sollen bei einer Sterilisationsprozedur nicht relevant verändert werden, ferner ist eine Langzeitstabilität nachzuweisen. Die Stabilität einer Phospholipidschicht an der Luft ist begrenzt. Die Stabilität wird maßgeblich beeinflusst durch intermolekulare Bindungskräfte sowie den Wassergehalt der polaren Kopfgruppe. Ferner ist bekannt, dass es zur Oxidation von ungesättigten Fettsäuren in Phospholipiden kommt.
Es wurden die natürlichen Phospholipide POPC und SLPE sowie die analogen Phospholipide gemäß Beispiel C (PNOPC) und Beispiel R (SNLPE) als auch die Phospholipide gemäß den Beispielen B, D, E, F, G, N1 , 01 , P2, P5, Q, und S als Monosubstanz sowie als Kombination aus dem nativen Phospholipid und dem korrespondierenden Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipid in einem Mischungsverhältnis von 1 :1 untersucht.
Ballonkatheter wurden mittels des Langmuir-Schäfer Verfahrens beschichtet, wobei der Ballonbereich koaxial zur Flüssigkeitsoberfläche ausgerichtet war und ein Bereich von ca 1 mm in die Flüssigkeit eintaucht. Dabei wurde der Katheter 5 mal um seine Achse rotiert. Die Phospholipide wurden in einer Konzentration von 3mmol in einer ionenfreien wässrigen Lösung bei 50°C gelöst. Danach wurde die Lösung abgekühlt und in die Beschichtungsvorrichtung gegeben. Sollten sich die Phospholipide nicht vollständig lösen oder beim Abkühlen abscheiden, so wurde der wässrigen Lösung bis zu 20 Vo.-%, vorzugsweise bis zu 10 Vol.-% DMSO zugesetzt. Nach der Beschichtung wurden die Katheter im Vakuumtrocknung über 8 Stunden von Resten des Lösungsmittels befreit. Die Beschichtungsstabiltät wurde hinsichtlich ihrer Abriebsstabilität getestet, indem die Ballonkatheter, die einen Außendurchmesser von 0,85 mm aufwiesen, in einem PTFE Schlauch mit einem Innendurchmesser von 1 ,0 mm, der in ein Siliconmodell eingelegt war, das konsekutiv mehrere Angulationen von bis zu 60° in vier Ebenen aufwies, mittels einer automatisierten Seilzugvorrichtung mit einer konstanten Geschwindigkeit von 3cm/s vorgezogen wurde. Das Schlauchsystem war mit einer 10%igen Humanalbuminlösung bei einer Temperatur von 35°C gefüllt. Das Seilsystem, welches zuvor durch das Schlauchsystem eingebracht worden war, wurde mit der Katheterspitze verbunden und über Ablenkrollen geführt, die ermöglichten, dass das Seil in exakt vertikaler Richtung von oben zu einer motorisierten Seilwinde gelangte. Die Seilwinde war auf einer digitalen Präzisionswage befestigt. Die so befestigten Katheter wurden durch das Schlauchsystem gezogen und die Gewichtsveränderungen infolge der geleiteten Zugarbeit während der Katheterpassage digital aufgezeichnet, die Messwerte wurden über die Zeit integriert. Hierüber erfolgte die Berechnung der geleisteten Zugarbeit zur Abschätzung der Gesamtscherkräfte während der Katheterpassage durch das Schlauchsystem.
Der Abrieb bzw. Verlust der Beschichtungslagen wurde durch Wiegen der Katheter vor und nach Beschichtung bestimmt sowie nach der mechanischen Stabilitätsprüfung durch Abscherung in dem oben beschriebenen Schlauchsystem mittels einer Präzisionwage. Für die Prüfung der Langzeitstabilität wurden die mit Phospholipid beschichteten Katheter zusätzlich mit Polyethylenglykol 1000 (Roth, Deutschland) versiegelt. Hierzu wurde PEG 1000 bei 50°C geschmolzen und mit einer 10%igen ethanolischen Lösung gemischt. Ein Teil des wie zuvor beschriebenen mit Phospholipid beschichteten Ballonkatheters, wurde mittels Dip- coating mit der 50°C warmem PEG-Lösung beschichtet und erneut im Vakuumschrank für 8 Stunden getrocknet.
Zur Bestimmung der Stabilität der cis-Konformität der ungesättigten Fettsäuren innerhalb der verwendeten Phospholipide erfolgte eine Hitzebehandlung mit 60°C für 3 Stunden im Wärmeschrank. Nach 24 Stunden sowie nach 2 Monaten wurden die Phospholipide von den Ballonoberflächen abgelöst und untersucht. Die Ablösung der Beschichtung erfolgte in 50 ml mit einem Chloroform- Methanolgemisch (3:1 , v:v). Ein 10μΙ Aliquot wurde für eine FTIR-Spektroskopie verwandt. Hierzu wurden die Proben auf einen ZnSe-ATR Kristall getropft und anschließend das Lösungsmittel verdampft. Der Transisomensationsgrad wurde über dem Integral der Intensität der Protonenresonanz im Vergleich zu dem bei einer Cis-Konfiguration sowie gegen Referenzsubstanzen ermittelt. Alle Messungen erfolgten 24 Stunden nach Beschichtung, nach Hitzebehandlung sowie nach 2 Monaten Lagerung bei 25°C unter sterilen Raumluftbedingungen.
Ergebnisse (Diese sind als Tabelle in Figur 3 zusammengefasst):
Die Ausgangssubstanzen hatten nur einen geringen Anteil an Trans-Fettsäuren (< 5%) in allen untersuchten Phospholipiden. 24 Stunden nach Aufbringung der Phospholipide auf einen Katheter war ein Trend zu höheren Transfettsäureanteil bei den natürlichen Phospholipiden gegenüber den nitrierten Phospholipiden vorhanden. Nach der Hitzebehandlung stieg der Anteil an Trans-Fettsäuren in den natürlichen Phospholipden auf 80% (POPC) bzw. 86% (SLPE). Im Gegensatz dazu war der Anteil an Trans-Fettsäuren der nitrierten Phospholipide mit 25% bzw. 28% (PNOPL, SNLPE) signifikant niedriger. Nach zwei Monaten lag der Transisomensationsgrad bei den alleinigen Beschichtungen mit natürlichen Phospholipiden bei 95 und 98% und bei 30% und 32% bei den nitrierten Phospholipiden. Bei der Kombination der natürlichen und nitrierten Phospholipide stellte sich der Trinsisomerisationsgrad deutlich geringer dar, als das rechnerische Mittel des Transisomensationsgrades der beiden Reinsubstanzen.
Bei Phospholipid-Beschichtungen, die anschließend mit einem PEG-Beschichtung versehen wurden, änderten sich die Transisomerisationsgrade bei den natürlichen Phospholipiden gering auf 86% bzw. 92% (POPL, SLPE) und blieben bei den nitrierten Phospholipiden praktisch unverändert (32% PNOPL, 33% SNLPE). Bei der Kombination von natürlichen und nitrierten Phospholipiden war der Transisomerisationsgrad deutlich geringer als bei der Kombination ohne ein zusätzliches Coating. Nach Trocknung war der Verlust an Beschichtungssubstanz minimal. Durch die Hitzebehandlung kam es zu einem bedeutenden Substanzmengenverlust bei mit natürlichen Phospholipiden beschichteten Kathetern. Im Gegensatz hierzu war der Substanzverlust der nitrierten Phospholipide gering. Bei der Kombination von natürlichen und nitrierten Fettsäuren war nach 24 Stunden ein stärkerer Substanzverlust als bei den Messungen zum gleichen Zeitpunkt mit den reinen Ausgangssubstanzen auffällig. Nach Hitzebehandlung war der Substanzverlust nicht signifikant geringer als das rechnerische Mittel des Verlusts der beiden Reinsubstanzen. Die mechanische Abtragung von Beschichtungssubstanz war signifikant stärker bei Beschichtungen mit natürlichen Phospholipiden als mit den nitrierten Phospholipiden gemäß Beispiel C (PNOPC) und Beispiel R (SNLPE). Bei der Kombination der natürlichen und nitrierten Phospholipide war ein etwas stärkerer Verlust an Beschichtungsmaterial zu verzeichnen, als das rechnerische Mittel des Verlustes von beiden Reinsubstanzen. Der Zugarbeit verhielt sich proportional zum jeweiligen Verlust an Beschichtungsmaterial. Sehr ähnliche Ergebnisse zeigten auch die Phospholipide gemäß den Beispielen B, D, E, F, G, N1 , O1 , P2, P5, Q und S.
Interpretation: Eine Verbesserung der Gleitfähigkeit eines in den Organismus einzubringenden Gegenstandes/Implantats kann zu einer Verringerung des Gewebetraumas beitragen. Ferner sollte eine Materialbeschichtung eine ausreichende Resistenz gegenüber einem vorzeitigen Abrieb während der Einbringung in den Organismus aufweisen. Ferner sollte eine chemische und thermische Stabilität bestehen. Diese Anforderungen wurden durch die Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipide deutlich besser erfüllt als durch die nativen Phospholipide.
Beispiel 13
Untersuchung der Zellmembraneffekte von Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden
Die physiko-chemischen Membraneigenschaften einer Zelle stellen einen wesentlichen Resistenzfaktor gegenüber physikalischen, chemischen und immunologischen äußeren Einflüssen dar. Zur Prüfung der Auswirkungen einer Aufnahme von Phospholipiden auf die Zellmembran hinsichtlich veränderter Zellresistenz wurden humane Erythrozyten sowie Mastzellen von Mäusen mit physiologischer NaCI-Lösung, den natürlichen Phospholipiden SOPC und PLPC sowie die analogen Phospholipide mit Nitrierung der ungesättigten Fettsäuren (1 - Stearoyl-2-(9-nitrooleoyl)-sn-PC (Beispiel P14) und 1 -Palmitoyl-2-(9-nitrolinoleoyl)- sn-PC) (Beipsiel P7) mit einer Konzentration von 30mmol/l über eine Stunde inkubiert. Ebenso wurden die Zellen mit Gemischen von Nitrocarbonsäure(n)- enthaltenden Phospholipiden gemäß der Beispielen F, Q, S, N2 - N14, 03 - 06, P1 - P3 und P6 behandelt.
Zur Prüfung der osmotischen Stabilität wurden die durch Zentrifugation vom Serum separierten Erythrozyten zunächst dreimal mit physiologischer NaCI-Lösung gereinigt. Die Erythrozythen wurden in physiologischer NaCI-Lösung resuspendiert und die suspendierten Phospholipide hinzugegeben. Dieser Stammansatz wurde auf einer Rüttelplatte mit langsamer Rotationsgeschwindigkeit bei 30°C für 1 Stunde bewegt. Hieraus wurden Aliquots von 3ml in Glasröhrchen gefüllt und zentrifugiert. Nach Entfernung des Überstandes wurden destilliertes Wasser sowie NaCI- Lösungen mit ansteigender Konzentration von 0,1 bis 1 ,0 g/dl hinzugegeben. Nach 30 minütiger Inkubation unter den oben genannten Bedingungen wurden die Röhrchen zentrifugiert und ein Aliquot zur photometrischen Messung des Hämoglobins durch Extinktion bei einer Wellenlänge von 546 nm und 30 °C Temperatur entnommen.
Zur Prüfung des Einflusses auf die mechanische Stabilität der Erythrozyten wurden entsprechend vorbereitete und in physiologischer NaCI-Lösung resuspendierte Erythrozyten proben in einen Ultraschallbad (Bandelin DT 31 H, Berlin, Deutschland) bei einer Temperatur von 30° und 50°C für zwei und fünf Minuten mit 10 Watt behandelt. Anschließend wurden die Proben zentrifugiert und der Überstand wie oben analysiert. Zur Prüfung der Lagerungsstabilität von Erythrozyten wurden Proben, die wie oben vorbereitet waren, über 2 Tage bei 4°C gelagert. Dann erfolgte eine Aufwärmung auf 30°C, je eine Probe diente als Leerwert. Die erwärmten Proben wurden für 24 und 48 Stunden auf einer Schüttelplatte (Bandelin, Sonoshake, Berlin, Deutschland) mit einer geringen Rotationsfrequenz bei 30°C bewegt. Anschließend erfolgte die Probenaufbereitung wie oben beschrieben.
Zur Prüfung von zellmembranstabilisierenden Eigenschaften von Phospholipiden wurde ein in vitro Modell mit Hundemastzellen (C2-Zellen) etabliert. Die Zellen wurden in 5%igen FKS Medium unter Standardbedingungen kultiviert. Für die Versuche wurden die Zellen in einer calcium- und magnesiumfreien Pufferlösung mehrfach gewaschen und schließlich aufkonzentriert. Die Zellen wurden auf 96-well- Platten verteilt und mit NaCI-Lösung sowie den oben genannten Phospholipiden für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde Mastoparan (Sigma, Deutschland) in den Konzentrationen 5 μιτιοΙ und 25 μιτιοΙ hinzugegeben. Die Bestimmung des Ca2+ -Einstroms wurde mit einen Calcium-Ionophor (A23187, Sigma Deutschland) bestimmt. Der Calciumeinstrom wurde auf die jeweilige Basismessung normiert und als prozentualer Zuwachs ausgedrückt. Die Histaminfreisetzung aus den C2-Zellen wurde mithilfe eines Histamin-ELISA (ILB, Deutschland) bestimmt.
Ergebnisse (Diese sind als Tabelle in Figur 4a bis 4d zusammengefasst):
Die Inkubation mit natürlichen Phospholipiden weist einen geringen membranstabilisierenden Effekt gegenüber osmotischem Stress auf. Die mechanische Stabilität wird durch natürliche Phospholipide mit ungesättigter Fettsäure tendenziell verschlechtert. Auch auf die Langzeitstabilität der Erythrozytenmembran haben natürliche Phospholipide nur einen geringen Einfluss. Im Gegensatz hierzu führt eine Inkubation von Erythrozyten mit nitrierten Phospholipiden zu einer signifikanten Steigerung der Zellstabilität gegenüber einem osmotischen und mechanischen Stress, ferner wird die Langzeitstabilität erheblich erhöht. Schließlich konnte gezeigt werden, dass nitrierte Phospholipide auch die Mastzellmembran stabilisiert und eine Degranulation weitgehend unterbunden wird. Wie sich bereits in anderen Versuchen zeigte, hatten die Gemische aus verschiedenen Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden prinzipiell die gleiche Wirkung wie die reinen Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipide, welche Stereoisomere aber keine Regioisomere enthalten. Es konnten keine signifikanten Unterschiede zu den Effekten von 1 -Stearoyl-2-(9-nitrooleoyl)-sn-PC und 1 -Palmitoyl-2-(9-nitrolinoleoyl)-sn-PC festgestellt werden. Ferner ist zu erwähnen, dass auch das Phosphatidylinositol (F) und das Phosphatidylethanolamin (S) sehr ähnliche Werte wie die Phosphocholine lieferten. Interpretation: Die im Gegensatz zu natürlichen Phospholipiden dokumentierte Erhöhung der Zellmembranstabilität durch Nitrocarbonsäure(n)-enthaltende Phospholipide kann auch zur Verbesserung der ex-vivo Lagerungsfähigkeit z.B. von Blutkonserven verwandt werden, aber auch in-vivo zu einer Zellstabilisierung z.B. bei Verwendung einer extrakorporalen Zirkulation beitragen. Die Effekte können aber auch zur Reduktion einer mediatorbedingten Zellwanddurchlässigkeit eingesetzt werden. Dieser Effekt kann z.B. eine anti-allergische Wirkung haben. Beispiel 14
Untersuchungen zu den zellprotektiven Eigenschaften von Nitrocarbonsäuren enthaltenden Phospholipiden
Toxische Effekte von Substanzen auf Zellen können auf verschiedene Arten vermittelt werden: (1 ) Schädigung von Oberflächenmerkmalen der Zelle mit Translation der Alteration durch Membranproteine in die Zelle, (2) direkte Schädigung der Zellmembran oder (3) transmembranäre Aufnahme der Substanz in die Zelle. Unabhängig von dem Grundprinzip dieser Schädigungsarten hängt der Schädigungsgrad im Wesentlichen von den pysiko-chemischen Eigenschaften der Zellmembran ab. Es sollte daher untersucht werden, ob die membranstabilisierenden Effekte von nitrierten Phospholipiden, die Zytotoxizität bekannter zytotoxischer Substanzen, die über eine oder mehrere dieser Mechanismen vermittelt werden, verändert. Da vaskuläre und tubuläre Endothelzellen besonders sensitiv auf zytotoxische Substanzen reagieren, wurden diese verschiedenen Substanzen unter in-vitro- Kulturbedingungen ausgesetzt. Die Zelllinie LLC-PK1 wurde in Komplettmedium (D- MEM Medium) mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) und Natriumbicarbonat (26 mmol/l) in 5% CO2 Atmosphäre kultiviert.
Zellsuspensionen mit einer Zellzahl von 1 ,5*105 wurden entweder mit NaCI-Lösung oder den natürlichen Phospholipiden SOPC und PLPC sowie den analogen Phospholipiden mit Nitrierung der ungesättigten Fettsäuren (1 -Stearoyl-2-(9- nitrooleoyl)-sn-PC und 1 -Palmitoyl-2-(9-nitrolinoleoyl)-sn-PC) mit einer Konzentration von 10 und 50 μηηοΙ/Ι oder den Nitrofettsäuren Nitrooleat (NOA) und Nitrolinolat (NLA) in einer Konzentration von 10 oder 30 μιτιοΙ behandelt. Die Kulturen wurden auf einer Schüttelplatte für 2 Stunden mit langsamer Geschwindigkeit bewegt. Anschließend wurden den Zellsuspensionen Cisplatin (25 und 50μηηοΙ/Ι) oder Cyclosporin (50 und 100μηηοΙ/Ι) hinzugefügt und die Zellen unter leichter Bewegung über 24 Stunden weiter kultiviert. Des Weiteren wurden murine aortale Endothelzellen in Standardmedium mit 10% FKS kultiviert. Zellsuspensionen der Lysate wurden wie zuvor beschrieben mit preinkubiert. Anschließend wurde den Zellsuspensionen Lipopolysacharid von Eschericha coli (4 und 8 pg/ml; Simga) hinzugegeben und wie zuvor beschrieben verfahren.
Die Zellsuspensionen wurden mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen (LIVE/DEAD®, Molecular Probes) markiert. Anschließend erfolgte eine Durchflusszytometrie (FACSCalibur, Becton & Dickinson). Aus dem Verhältnis zwischen den rot fluoreszierenden Zellen und der Gesamtanzahl der ermittelten Zellen wurde der Anteil der avitalen Zellen berechnet.
Ergebnisse (Diese sind als Tabelle in Figur 5 zusammengefasst):
Die Inkubation von Endothel- und Tubuluszellen mit natürlichen Phospholipiden hat einen minimalen Effekt auf die Zytotoxizität von Substanzen mit unterschiedlichem Pathomechanismen. Nitrierte Fettsäuren wiesen teilweise eine Tendenz zur Reduktion der zytotoxischen Effekte bei der geringen Konzentration auf. Für alle untersuchten Toxine konnte eine signifikante Reduktion der Toxizität durch eine Vorbehandlung mit nitrierten Phospholipiden dargestellt werden. Somit konnte gezeigt werden, dass eine Vorbehandlung mit Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden eine Resistenzverbesserung gegen Zelltoxine bewirken kann. Die erfindungsgemäßen Phospholipide können sich somit als vorteilhaft bei exogenen und endogenen Intoxikationen erweisen, z. B. bei der Wundheilung nach Eintrag von Toxinen, allerdings ebenso bei Patienten mit einer systemischen Vergiftung. Beispiel 15
Untersuchungen zellprotektiver Eigenschaften von Nitrocarbonsäure(n)- enthaltenden Phospholipiden bei Barotrauma
Frisch entnommene Arteriae iliacae vom Schwein wurden zunächst bis auf die Adventitia präpariert und dann für drei Tage in PBS mit 1 % FCS kultiviert. Segmente von 5mm Länge wurden atraumatisch abgetrennt und in Kulturgefäße, die mit den natürlichen Phospholipiden POPC und SLPC sowie die analogen Phospholipide mit Nitrierung der ungesättigten Fettsäuren (1 -Palmitoyl-2-(9-nitrooleoyl)-sn-PC und 1 - Stearoyl-2-(9-nitrolinoleoyl)-sn-PC) jeweils in einer Konzentration von 50mmol, sowie mit den nitrierten freien Fettsäuren Nitroolsäure (NOA) und Nitrolinolsäre (NLA) jeweils in einer Konzentration von 30μηηοΙ für weitere zwei Tage eingelegt. Zudem wurden die erfindungsgemäßen Phospholipide gemäß der Beispiele N1 - N5, N1 1 , N15 - N17, N20, O2 - O5, P4 - P6, E, G und Q getestet. Nach Auswechseln des Kulturmediums wurden die Gefäße in eine Druckkammer eingebracht und einem Druck von 15 bar über eine Stunde ausgesetzt. Danach rasches Ablassens des Druckes innerhalb von 5 Sekunden. Die Kulturflaschen wurden für 7 Tage auf einer Rüttelplatte unter standardisierten Kulturbedingungen langsam bewegt. Das Kulturmedium wurde nach dem 3. Tag ausgewechselt und zur Bestimmung von Mikropartikeln weiter analysiert. Die Gefäßsegmente wurden sodann fixiert und eingebettet. Eine TUNEL-Färbung (In Situ Cell Death Detection Kit, AP, Boehringer, Deutschland) erfolgte 48 Stunden nach Lufttrocknung der Schnitte. Die Auswertung erfolgte lichtmikroskopisch, eine Differenzierung zwischen Apoptose und Nekrose wurde nicht vorgenommen und die Anzahl der Zellen mit einer Anfärbung im Verhältnis zur analysierten Gesamtzellzahl angegeben.
50 μΙ des Kulturmediumüberstandes wurden mit 3 μΙ Annexin V-allophycocyanin (APC) versehen (BD Pharmingen) und dann mit 100 μΙ der Annexin-Bindungspuffer- Lösung (BD Pharmingen; 1 :10 vol/vol in distilled water) aufgefüllt. Die Bestimmung der Mikropartikel-Anzahl erfolgte dann mittels Durchflusszytometrie (FACSCanto, Becton & Dickinson). Dabei war das Messfenster auf Partikeldiameter von 0,3 bis 1 ,0 μιτι eingestellt.
Ergebnisse (Diese sind als Tabelle in Figur 6 und 6a zusammengefasst):
Das Barotrauma von Gefäßsegmenten verursachte eine ausgedehnte Apoptose (Nekrose). Während die Vorinkubation mit natürlichen Phospholipiden keine Änderung bewirkte, zeigten Präparate, die mit nitrierten Fettsäuren vorbehandelt waren, eine geringe Verstärkung der Apoptose. Eine Vorinkubation mit nitrierten Phospholipiden hingegen führte zu einer signifikanten Abnahme der Apoptose (Nekrose). Parallel zu diesen Ergebnissen kam es zu weniger Mikropartikeln nach Vorbehandlung mit nitrierten Phospholipiden, während bei Vorinkubation mit natürlichen Phospholipiden keine Änderung gegenüber der Kontrollgruppe bestand. Eine Vorbehandluung mit nitrierten Fettsäuren führte zu einer deutlichen Reduktion der Mikropartikelbildung, die aber geringer war, als nach Inkubation mit Nitrocarbon- säure(n)-enthaltenden Phospholipiden. Diese Ergebnisse konnten sich auch mit den Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipide gemäß der Beispiele N1 - N5, N1 1 , N15 - N17, N20, O2 - O5, P4 - P6, E, G und Q reproduzieren lassen. Hier zeigten sich erneut keine signifikanten Unterschiede im Gegensatz zu 1 -Palmitoyl-2-(9- nitrooleoyl)-sn-PC und 1 -Stearoyl-2-(9-nitrolinoleoyl)-sn-PC. Somit scheint es, dass die Wirkung der erfindungsgemäßen Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospho- lipide unabhängig von dem eingesetzten Phospholipid, d.h. auch unabhängig von der Kopfgruppe des Phospholipids als auch unabhängig von dem Phospholipidgemisch ist und der entscheidende Faktor damit das Vorliegen zumindest einer nitrierten Carbonsäure oder nitrierten Fettsäure in dem Phospholipid zu sein scheint. Interpretation: Barotraumata treten insbesondere bei der Angioplastie auf, bei der z.B. ein Ballonkatheter bis zu der verengten Stelle im Blutgefäß vorgeschoben wird, um dort unter erheblichen Druck (bis zu 20 bar) aufgefüllt zu werden. Der resultierende Gefäßwandschaden, bedingt eine Wundreaktion, die zur Wiedereinengung des Gefäßes beiträgt unter dem klinischen Bild einer Restenose. Die Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden können diesem Effekt entgegenwirken und sind somit besonders für alle Indikationen geeignet, in denen Zellen/Gewebe einem pneumatischen/kompressorischen Stress ausgesetzt sind. Beispiel 16
Untersuchungen zellprotektiver Eigenschaften von Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden gegenüber einer Hypoxie und eines Reperfusionsschadens.
Sowohl die Apoptose als auch die Nekrose infolge einer schweren Zellischämie ist eng verbunden mit Veränderungen innerhalb der Zellmembranen. Zur Prüfung, ob die membranstabilisierenden Eigenschaften der nitrierten Phospholipide eine
Veränderung der Ischämietoleranz und des Reperfusionsschadens bewirken können, wurden Versuche an corticalen Neuronen und Herzmuskelzellen vorgenommen.
Hierzu wurden Neuronen von jungen Mäusen präpariert, gemäß eines publizierten Verfahrens (Goldberg MP, Choi DW. Combined oxygen and glucose deprivation in cortical cell culture: calciumdependent and calcium-independent mechanisms of neuronal injury. J Neurosci 1993;13:3510-3524).
Das frisch präparierte Cortexgewebe wurde mit Papain aufgetrennt und die Gewebssuspension in Kulturgefäßen (Primara; BD Biosciences, USA) mit Neurobasal-A/B27 Medium (Invitrogen) für 10-12 Tage kultiviert. Die Zellsuspension wurde nun aufgeteilt, mit Zusatz von NaCI (0,9%), den natürlichen Phospholipiden SOPC und PLPC sowie den analogen Phospholipiden mit Nitrierung der ungesättigten Fettsäuren (1 -Stearoyl-2-(9-nitrooleoyl)-sn-PC und 1 -Palmitoyl-2-(9- nitrolinoleoyl)-sn-PC) mit einer Konzentration von 10 und 50 μηηοΙ/Ι. In weiteren Ansätzen wurden die erfindungsgemäßen Phospholipide gemäß der Beispiele C, D, F, N3 - N7, N13 - N19, O1 , O2, O5, 06, P3, P8 und Q verwendet. Nach 4 Stunden wurden die Zellen dreimal mit gepufferter NaCI-Lösung gespült und in der gepufferten NaCI-Lösung unter Zusatz von MgCI2 sowie CaCI2 einer anaeroben Atmosphäre (85% N2, 5% H2, 10% CO2; 35 °C) für 10 und 30 Minuten ausgesetzt. Anschließend wurden die Zellen einmal gewaschen und im Kulturmedium unter aeroben Bedingungen für 24 Stunden kultiviert. Anschließend wurden die Zellen separiert, gemäß einer publizierten Technik (Meiler R, Skradski SL, Simon RP, Henshall DC. Expression proteolysis and activation of caspases 6 and 7 during rat C6 glioma cell apoptosis, Neurosci Lett 2002;324:33-36). Die Zellen wurden mit Annexin V-FITC und Propidium Jodid (Molecular Probes, USA) gefärbt. Die Bestimmung der vitalen und avitalen Zellen erfolgte mittels Durchflusszytometrie (FACSCalibur, Becton & Dickinson).
Das Volumen des Kulturmediums wurde ermittelt und ein Aliquot zur Bestimmung der LDH-Konzentration entnommen.
Herzmuskelzellen wurden aus neonatalen Rattenherzen gewonnen (Nitobe J, et al, Reactive oxygene species regulate FLICE inhibitory protein and susceptibility to FAS-mediated apoptosis in cardiac myocytes. Cardiovasc Res 2003, 1 19-28). Die Herzmuskelzellen wurden in Dulbecco/Eagle Medium (DMEM) mit 10% FKS für zwei Tage unter Standardbedingungen kultiviert. Die Inkubation mit den natürlichen und nitrierten Phospholipiden sowie die Hypoxieversuche erfolgten wie oben beschrieben. Die Zellen wurden in Kulturmedium für 24 Stunden unter Standardbedingungen kultiviert. Anschließend erfolgte eine Vitalitätsfärbung wie oben beschrieben. Ein Teil der Zellsuspensionen wurde unmittelbar nach dem Hypoxieende sowie nach 10 und 30 Minuten in flüssigem Stickstoff gefroren. Die gefrorenen Zellen wurden später zur NAD+-Analytik auf - 4°C aufgetaut und homogenisiert. Mittels Differentialzent fugation wurde ein Pellet mit Mitochondrien separiert (Di Lisa, et al, 1993; Am. J. Physiol. 264, H2188-H2197). Der NAD+ Gehalt wurde fluorometrisch bestimmt und gegen den Proteingehalt normiert (Veloso, D., and Veech, R. L., 1974; Anal. Biochem., 449^150).
Ergebnisse: In der Kontrollgruppe wiesen corticale Zellen eine Vitalität von 35% bzw. 0% 24 Stunden nach einer 10 bzw. 30 minütigen Ischämie auf. Dies war begleitet von einem Anstieg der LDH (Lactatdehydrogenase) um das 350 fache und 800 fache des Wertes einer parallel geführten Kultur unter Normoxie. Die Vitalität der mit den natürlichen Phospholipiden vorbehandelten Zellen war nicht signifikant unterschiedlich von der Kontrollgruppe (SOPC: 33% bzw. 0%; PLPC: 30% bzw. 0%). Gleiches stellte sich für den LDH-Verlauf dar (SOPC: 280 bzw. 640 fach; PLPC: 380 und 630 fach). Zellen, die mit den nitrierten Phospholipiden vorbehandelt wurden, wiesen dagegen eine signifikant höhere Vitalität (SNOPC: 68% bzw. 54%; PNLPC: 70% bzw. 52%) und einen geringeren Anstieg der LDH auf (SNOPC: 120 bzw. 230 fach; PNLPC: 130 bzw. 290 fach).
Herzmuskelzellen, die als Kontrollgruppe unter Normoxie kultiviert wurden, wiesen eine minimalen Vitalitätsverlust auf (< 3%). In der hypoxischen Kontrollgruppe kam es zu einer Abnahme der Vitalität um 16% und 43 %. Herzmuskelzellen, die mit den natürlichen Phospholipiden SOPC und PLPC vorbehandelt wurden, wiesen eine minimalen Unterschied in der Abnahme der Vitalität im Vergleich zur Kontrollgruppe auf (SOPC: 14% bzw. 40%; PNPC: 16% bzw. 42%). Herzmuskelzellen, die mit den nitrierten Phospholipiden vorbehandelt waren, wiesen eine deutlich geringere Abnahme der Vitalität auf (SNOPC: 6% bzw.16%; PNLPC: 5% bzw. 18%). Der mitochondreale NAD+ Gehalt der Herzmuskelzellen nahm in der Kontroll- Hypoxiegruppe gegenüber dem Ausgangswert (5nmol/mg Protein) rasch und progredient ab (2,8; 0,9 nmol/mg Protein). Weder SOPC noch PLPC führten zu einer relevanten Änderung der NAD+ Abnahme (3,0; 1 ,1 bzw. 2,4; 0,7 nmol/mg Protein). Nach Vorinkubation mit SNOPC bzw. PNLPC waren deutlich höhere NAD+- Konzentrationen vorhanden (3,8; 3,3 bzw. 3,6; 3,1 nmol/mg Protein). Die Versuche mit 1 -Palmitoyl-2-(E-9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin (C) und 1 -Palmitoyl-2-(Z-9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin (P8) zeigten gegenüber den Versuchen mit 1 -Stearoyl-2-(9-nitrooleoyl)-sn-PC (P14) und 1 -Palmitoyl-2-(9- nitrolinoleoyl)-sn-PC (P7) keine großen Abweichungen. Die Phospholipide gemäß den Beispielen D, F, N3 - N7, N13 - N19, O2 und Q zeigten sogar leicht bessere Werte als 1 -Palmitoyl-2-(E-9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin und die Phospholipide gemäß den Beispielen O1 , 05 und 06 leicht schlechtere Werte als 1 - Palmitoyl-2-(E-9-nitrooleoyl)-sn-3-glycero-phosphocholin.
Interpretation: Die Verwendung von Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden stabilisiert hiermit inkubierte Zellen und Gewebe und macht diese weniger anfällig gegen die negativen Auswirkungen von Hypoxie und Reperfusion. Diese Eigenschaften sind geeignet, um Gewebe und Organe vor den Folgen einer Mangelversorgung mit Blut oder Sauerstoff zu schützen und einen Gewebeuntergang oder Organinfarkt zu mindern.
Beispiel 17
Untersuchungen zu Eigenschaften von Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden auf die intrazelluläre Calciumhomöostase Die Kompartimentierung und Bereitstellung von Calcium stellt eine wichtige Voraussetzung für die Funktionsfähigkeit vieler Zellen dar. Dies trifft besonders für Herzmuskelzellen zu. Eine Undichtigkeit der Membran des sarkoplasmatischen Retikulums, die zu einem cytosolischen Anstieg der Calciumkonzentration führt, hat zur Folge, dass die Kontraktionskraft gemindert wird sowie Repolarisationsstörungen auftreten können, die zu Arrhythmien führen. Es ist ferner bekannt, dass eine ß- adrenerge Stimulation den membrandefektbedingten Ausstrom von Calcium verstärken kann, worüber sich die proarrhythmogene Wirkung der ß- Rezeptorstimulation miterklärt. Eine Hypoxie induzierte Azidose kann Auslöser für eine derartige Störung der Calciumhomöostase sein. Herzmuskelzellen wurden aus Kaninchenherzen nach einer andernorts beschriebenen Methode entnommen (Shannon TR, Ginsburg KS, Bers DM. Quantitative assessment of the SRCa2+ leak-load relationship. Circ Res. 2002;91 :594-600). Die präparierten Zellen wurden über 72 Stunden kultiviert. Anschließend wurden dem Kulturmedium die natürlichen Phospholipide SOPC und PLPC sowie die analogen Phospholipide mit Nitrierung der ungesättigten Fettsäuren (1 -Stearoyl-2-(9-nitrooleoyl)-sn-PC (P14) und 1 -Palmitoyl-2-(9-nitrolinoleoyl)-sn-PC) (P7) sowie in weiteren Ansätzen die Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipide gemäß der Beispiele B, C, D, F, N2, N4 - N7, N10 - N16, O1 - O3, P8 - P12 in einer Konzentration von 80 mmol/l zugesetzt und für 2 Stunden inkubiert.
Die cytosolische Ca2+ Konzentration wurde mit fluo-4 Fluorescence bestimmt. Hierzu wurden die Zellen über 30 Minuten mit 10 μιτιοΙ fluo-4AM (1 %; 1 Stunde) inkubiert und danach dreimal mit PBS gewaschen.
Die Zellen wurden in einer Tryode-Lösung über eine Platinelektrode mit einer Frequenz von 0,5 Hz über 20 Zyklen stimuliert. Anschließend wurde das Umgebungsmedium auf eine elektrolytfreie Kolloidallösung gewechselt. Jede Messung der Ca-Konzentration erfolgte nach einer erneuten Stimulation über 20 Zyklen. Der Calciumgehalt wurde mittels Confokaler laser scanning Mikroskopie (Olympus) durchgeführt. Es wurden mindestens 10 Zellen pro Versuch in einem postsystolischen Intervall von 1000 ms ausgewertet. Die Messungen wurden mindestens dreimal wiederholt. Zur ß-adrenergen Stimulation wurde 250 nmol/L Isoprenalin zu den Medium gegeben. Die Hypoxieversuche erfolgten in einer anaeroben Atmosphäre (85% N2, 5% H2, 10% CO2; 35 °C) über 30 Minuten.
Ergebnisse: In der Kontrollgruppe stiegen die post-systolischen (PS) zytosolischen Calciumwerte von 20 nmol auf 40 nmol am Ende der Diastole (ED) an. Die Stimulation mit Isoprenalin führte bei der Kontrollgruppe nur zu einem geringen Abfall PS und einem geringen Anstieg des ED Calciumniveaus. Nach Hypoxie war das Calciumniveau deutlich höher (PS 80 nmol, ED 360 nmol). Durch Stimulation erhöhte sich das ED Calciumniveau auf 450 nmol. Eine Preinkubation mit natürlichen Phospholipiden hatte keinen Einfluss auf das Calciumniveau unter normoxischen Bedingungen. Nach Hypoxie waren die ED Calciumwerte tendenziell geringer als in der Kontrollgruppe (SOPC 300 nmol; PLPC 320 nmol), während bei zusätzlicher Stimulation mit Isoprenalin kein relevanter Unterschied zur Kotrollgruppe bestand (SOPC: ED 440 nmol; PLPC: ED 430 nmol). Nach Preinkubation mit den nitrierten Phospholipiden lagen unter Normoxie etwas geringere Calciumwerte vor (SNOPC sowie PNLPC: PS 10 nmol, ED 30 nmol). Die cytosolischen Calciumspiegel nach Hypoxie waren signifikant niedriger gegenüber der Kontrolle nach Preinkubation mit den nitrierten Phospholipiden (SNOPC: PS 40 nmol, ED 80 nmol; PNLPC: PS 30 nmol, ED 70 nmol). Ferner kam es nur minimal zu einem weiteren Calciumanstieg nach zusätzlicher Isoprenalingabe (SNOPC: ED 90 nmol; PNLPC ED 100 nmol). Die Inkubation mit den Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden gemäß den Beispielen B, C, D, F, N2, N4 - N7, N10 - N16, O1 - O3 und P8 - P12 zeigte keine signifikanten Unterschiede in der Wirkung im Vergleich zu einer Inkubation mit 1 - Stearoyl-2-(9-nitrooleoyl)-sn-PC und 1 -Palmitoyl-2-(9-nitrolinoleoyl)-sn-PC.
Interpretation: Der Ca2+-Einstrom in Zellen ist für eine Vielzahl von physiologischen Vorgängen notwendig. Zellen reagieren dabei auf äußere Stimuli, insbesondere auf physikalische Alterationen, mit einem vermehrten Ca2+-Einstrom. Dies kann zur Folge haben, dass es durch eine zelluläre Ca2+ Überlastung oder Störungen der intrazellulären Ca2+ Kompartimentierung, eine Apopotose bzw. Nekrose der Zelle eingeleitet wird. Die Behandlung mit Nitrocarbonsäuren enthaltenden Phospholipiden wirkt diesem Effekt entgegen und ist somit vorteilhaft bei Anwendungen, bei denen das Calciumniveau kontrolliert werden soll. Diese Effekte können sich besonders vorteilhaft erweisen, zur Reduktion einer Zellschädigung durch eine Reperkusion nach einer Gewebe- oder Organischämie. So ist zu erwarten, dass die Ausdehnung eines Organ infarktes verringert wird. Bei einer Anwendung im Rahmen einer Myokardischämie ist eine Verminderung von reperfusionsbedingten Herzrhythmussörungen zu erwarten. Die Effekte können allerding auch eine Relevanz bei anderen Zellaktivierungsvorgängen haben, wie z.B. der Mastzelldegranulation und somit einen antiallergischen Effekt aufweisen. Beispiel 18
Untersuchungen zu den membranstabilisierenden Effekten von Nitrocarbonsäuren enthaltenden Phospholipiden bei der Cryokonservierung von Geweben
Viele Zellen können unter bestimmten Bedingungen eingefroren werden und erlangen nach dem Wiederauftauen wieder ihre Funktion. Dabei kommt dem Umgebungsmedium eine entscheidende Rolle zu. Aus diesem Grund ist die Cryokonservierung von Gewebeblöcken oder ganzen Organen weiterhin problematisch. Es sollte daher untersucht werden ob, eine Vorbehandlung mit nitrierten Phospholipiden zu einer Minderung des Gewebeschadens nach einer Cryokonservierung führt.
Hierzu wurden Aa. femorales sowie Vv. saphenea magnae von Kaninchen (New Zealand White rabbits, 2.0-3.0 kg) skelettiert, mit PBS gespült und in DMEM eingelegt. Die Arterien- und Venensegmente wurden atraumatisch in exakt 5mm lange Segmente getrennt. Es folgte eine Kultivierung in Dulbecco/Eagle Medium (DMEM) mit 1 % FCS für zwei Tage unter Standardbedingungen.
Für jede Versuchsserie wurden immer Gefäßsegmente, die von dem gleichen Gefäß stammten, miteinander verglichen, wobei zwei Segmente nicht eingefroren wurden und als Referenzgruppe dienten. Die Gefäßsegmente wurden in NaCI-Lösung (0,9%), eine NaCI-Lösung mit natürlichen Phospholipiden SOPC und PLPC sowie den analogen Phospholipiden mit Nitrierung der ungesättigten Fettsäuren (1 - Stearoyl-2-(9-nitrooleoyl)-sn-PC und 1 -Palmitoyl-2-(9-nitrolinoleoyl)-sn-PC) in einer Konzentration von 200 mmol/l hinzugegeben und für eine Stunde inkubiert. Anschließend wurde das Medium gewechselt (DMEM mit 2,5% Chondroitinsulfat und 10% FCS). Hierin erfolgte eine rasche Absenkung der Temperatur (Δ 30°C/min) auf - 70°C. Nach 12 Stunden wurden die Proben in einem Bad erwärmt, sodass eine Gewebetemperatur von 37°C innerhalb von 5 Minuten erreicht wurde. Es erfolgte erneut eine Kultivierung für zwei Tage. Die Versuche wurden für die Beispielsubstanzen B, F, N10 - N15 und G wiederholt.
Zur Prüfung der Funktionsfähigkeit der Gefäßsegmente wurde die isometrische Kraftentwicklung unter Noradrenalin- (Arterien) sowie Histaminstimulation (Venen) sowie die Gefäßdilatation unter Acetylcholin untersucht. Hierzu wurden die Segmente, die sich in einem Organbad befanden, an zwei gegenüberliegenden, bügelartigen Halterungen eingespannt und an den Kraftaufnehmer angeschlossen, hiermit war es auch möglich, eine Längenzunahme zu messen (HSE F30, B40, Bridge Coupler, Sachs Elektronik, Deutschland). Dabei waren die Gefäßsegmente von einer oxigenierten Krebs-Henseleit-Lösung bei 37°C umgeben.
Zur Kontrakturinduktion der Venensegmente wurde Histamin (3x10"5 mol, Sigma, Deutschland) dem Medium hinzugegeben. Nach erneutem zweimaligem Spülen des Organbades erfolgte eine Vorkontraktion der Venensegmente mittels Zugabe von Kalium (50mmol). Anschließend Zusatz von Acetylcholine (250 mmol, Sigma, Deutschland). Die hiermit erreichte maximale Durchmesserzunahme innerhalb der 5. bis 10. Minute wurde registriert.
Eine Kontraktur der Arteriensegmente wurde mit Noradrenalin (5x10"5 mol) induziert. Die Vasodilatation wurde analog zu der bei den Venensegmenten durchgeführt. Nach Abschluss der funktionellen Untersuchungen wurden die Gefäßsegmente fixiert, eingebettet, geschnitten und gefärbt (H&E) und lichtmikroskopisch hinsichtlich der Integrität der Gefäßwandschichten untersucht.
Ergebnisse (Diese sind als Tabelle in Figur 7 und 7a zusammengefasst):
Unbehandelte tiefgefrorene Arterien- und Venengsegmente zeigten nur noch ein minimales Ansprechen auf eine vasokonstriktorische und vasodilatierende Stimulation. Eine Vorbehandlung mit nativen Phospholipiden ergab nur einen Trend zu einem besser erhaltenen Reaktionsvermögen der Gefäßsegmente. Im Gegensatz hierzu war die Vasomotorik sowohl bei den Venen- als auch den Arteriensegmenten, die mit Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden vorbehandelt waren, nur gering reduziert. Lichtmikroskopisch konnten bei aufgetauten und unbehandelten Arterien eine partielle Ablösung der Intima beobachtet werden. Die Ablösung war tendentiell geringer bei mit SOPC vorbehandelten Gefäßen. Nach Vorbehandlung mit den Nitrocarbonsäuren enthaltenden Phospholipiden konnte eine Separation zwischen der Intima und der Lamina elastica interna nur gelegentlich beobachtet werden, eine vollständige Denudierung wurde nicht gefunden.
Interpretation: Eine Abkühlung intakter Zellen unter den Gefrierpunkt führt zu einer erheblichen mechanischen Belastung der Zellmembran, gleiches gilt für die Wiedererwärmung, wodurch es zu einem deutlichen Verlust der Funktionsfähigkeit aber auch der Vitalität von Zellen bzw. Gewebe kommt. Durch Vorbehandlung mit nitrierten Phospholipiden konnte eine deutliche Minderung des Gewebeschadens nach einer Cryokonservierung festgestellt werden. Die so behandelten Gefäßsegmente zeigten nach Wiederauftauen ein Ansprechverhalten, welches dem nicht Cryo-behandelter Gefäßsegmenten entsprach. Somit eignent sich eine Vorbehandlung von Geweben mit Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden zur Verbesserung des Gewebeerhalts von Cryokonservaten.
Beispiel 19
Untersuchungen zu Effekten von Nitrocarbonsäuren enthaltenden Phospholipiden auf Membranrezeptoren der TRP-Proteinfamilie
Die physiko-chemischen Eigenschaften der Zellmembranen haben einen Einfluss auf die Geometrie von Membranproteinen sowie auf die Lage von Untereinheiten, wodurch Änderungen in der Membranfluidität Auswirkungen auf die Funktion von Membranproteinen haben können. Es sollte daher untersucht werden, ob Nitrocarbonsäuren enthaltende Phospholipide Rezeptoren der TRP-Rezeptorfamilie in ihrer Funktion beeinträchtigen.
Die Untersuchungen hierzu fanden an einem in-vitro Modell an Xenopus Oozyten statt (Dascal, N. (1987), The use of Xenopus oocytes for the study of Ion Channels CRC Critical Reviews in Biochemistry 22, 317-387). Hierzu wurden defollikulierte Oozyten mit cRNA (Ratte) von TRPV1 , 2 und 4 sowie TRPA1 transfiziert und für 7 bis 10 Tage in antibiotikahaltigem Kulturmedium (ND 96) in Gewebekulturplatten vereinzelt bei 15 °C unter ständiger Bewegung im Inkubator aufbewahrt. Für die Untersuchungen wurden die Oozyten unmittelbar vor den Messungen mit den natürlichen Phospholipiden SOPC und PLPC sowie den analogen Phospholipiden SNOPC (Beispiel P14) und PNLPC (Beispiel P7) und den Phospholipiden gemäß der Beispeile B, D, E, F, P8 und S in einer Konzentration von 50 mmol/l, ferner mit den natürlichen Fettsäuren OA, LA und nitrierten Fettsäuren NOA und NLA jeweils in einer Konzentration von 30 μιτιοΙ für 10 sowie für 60 Minuten inkubiert.
Die Induzierbarkeit von Leckströmen durch die Aktivierung der TRP-Rezeptoren wurde mittels Doppelelektroden-Voltage-Clamp Technik ermittelt (Ahern GP, Brooks IM, Miyares RL &Wang XB (2005), Extracellular cations sensitize and gate capsaicin receptor TRPV1 modulating pain Signalling. J Neurosci 25, 5109-51 16). Die Oozyten wurden mit Borosilikatglaskapillaren (Clark) sondiert und mit dem Rückkopplungsverstärker (Gene Clamp Amplifier, Axon Instruments) verbunden. Das Membranpotential der Oozyten wurde auf -60 bzw. -90 mV geklemmt. Das Vorliegen eines gerichteten Auswärtsstroms wurde gegenüber einer nicht transfizierten Kontrollgruppe getestet. Die Untersuchungen erfolgten in einem miniaturisierten Organbad in calciumfreier gepufferter (Hepes, pH 7,3) NaCI-Lösung. Die TRPV1 - Rezeptorerregung erfolgte durch rasches Auswechseln der Spüllösung mit einer Capsaicin-Lösung (Ι ΟμηηοΙ). Das Ergebnis diente zur Normierung der Messergebnisse vorbehandelter Zellen. Die Untersuchungen wurden in gleicher Weise für transfizierte Oozyten mit den TRPV2 und TRPV4 sowie TRPA1 -Kanälen durchgeführt, wobei als Rezeptoragonisten Cannabidiol (Ι ΟμηηοΙ) und 4a-PDD (4 a- phorbol 12,13-didecanoate, 50μηηοΙ) sowie Cinnamaldehyde (50μηηοΙ) verwendet wurden. Ergebnisse (Diese sind als Tabelle in Figur 8 und 8a zusammengefasst):
Die Inkubation mit natürlichen Phospholipiden führte zu einer Zunahme der stimulierbaren Membrankanalaktivität. Im Gegensatz hierzu führten sowohl die nitrierten Fettsäuren als auch die Nitrocarbonsäuren enthaltenden Phospholipide zu einer signifikanten Abnahme der Membrankanalstimulierbarkeit. Dieser Effekt war bei den Nitrocarbonsäuren enthaltenden Phospholipiden deutlich stärker ausgeprägt und länger anhaltend als bei den Nitrofettsäuren.
Interpretation:
Die Vorbehandlung mit den Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden gemäß der Beispeile B, D, E, F, P7, P8, P 14 und S führte zu einer deutlichen Abnahme der Stimulierbarkeit der TRP-Kanäle. Die untersuchte Membranproteinfamilie vermitelt die Wahrnehmung verschiedener Stressoren (Temperatur, Osmolarität, pH) und löst bei Erregung verschiedene Zellreaktionen aus. Von herausragender Bedeutung ist die Induktion eines Schmerzreizes, so dass für Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipide u. a. ein analgesierender Effekt anzunehmen ist.
Beispiel 20
Untersuchungen zu Effekten einer Beschichtung von Weichteilimplantatmaterial mit Nitrocarbonsäuren enthaltenden Phospholipiden auf die Gewebereaktion in vivo.
Der Einfluss auf die Bindegewebsreaktion nach Implantation von Fremdmaterial bei gleichzeitiger Induktion einer fibrosierenden Gewebereaktion wurde in einem in vivo Tiermodel untersucht. Als Implantatmaterial wurden sterile Silikonkissen mit einen Durchmesser von 1 cm verwandt, die per Sprühbeschichtung in zwei Lagen mit den natürlichen Phospholipiden SOPC und PLPC sowie den nitrierten Phospholipiden SNOPC (Beispiel P14) und PNLPC (Beispiel P7) und den Phospholipiden gemäß der Beispiele B, D, F, G, N8, P2, P12, und R beschichtet wurden oder unbehandelt blieben.
Bei männlichen Wistar Ratten (190 - 240g) erfolgte nach einer Woche identischer artgerechter Haltung und Ernährung eine Allgemeinanästhesie durch intramuskuläre Injektion von 0.008 mL/100 g Ketamin und 0.004 mL/100 g Xylocain Chlorid 2%. Anschließend wurde der Tierrücken rasiert, sterilisiert und mit Xylocain Chlorid infiltriert. Es erfolge beidseits paravertebral eine 1 ,5 cm lange Inzision und Präparation des subkutanen Gewebes, sodass beidseits eine ca. 2 x 2 cm große Tasche entstand. Die Blutstillung erfolgte bei Bedarf kaustisch. Dann wurde ein mit Bleomycin (cell-pharm-GmbH, Hannover, Deutschland: 1 % in 0,9% NaCI-Lsg) gesättigter Baumwollballen für 3 Minuten in die Taschen eingelegt und danach entfernt. Ohne Spülung wurde in die linke Unterhauttasche das Implantat, das mit einem nitrierten Phospholipid beschichtet war, eingebracht und in die Tasche der rechten Seite, das mit natürlichen Phospholipid beschichtete Implantat. Anschließend folgten ein schichtweiser Wundverschluss und die Anlage eines sterilen Klebepflasters.
Die Tiere wurden unter Standardbedingungen über 7, 14, 30, 60 und 90 Tage gehalten. Zu jedem Untersuchungszeitpunkt wurden zwei Tiere euthanasiert. Nach Eintritt des Todes wurde der gut sieht- und tastbare Bereich mit den Implantaten mittels Enblock-Resektion entfernt und fixiert. Nach Einbettung in Parafin wurde das Präparat hälftig geteilt und der flüssige Silikonanteil entfernt. Danach erneute Einbettung und Anfertigung von Dünnschnitten, die mit H&E sowie Sirius-Red gefärbt und lichtmikroskopisch beurteilt wurden:
A) Zelluläre Reaktion: A1 : keine; A2: vereinzelte monozytäre Zellen oder Lymphozyten; A3: moderate Anzahl oder Gruppen von monozytären Zellen oder Lymphozyten; A4: Dichtes Infiltrat aus Monozyten, Eosinophilen oder Riesenzellen.
B) Fibröses Gewebeformation:
B1 : keine; B2: dünne kollagenreiche Schicht um das Implantat; B3: dicke (>1 mm) und dichte kollagenreiche Gewebeformation um das Implantat.
Es wurde in jedem 10. Serienschnitt 10 über die Zirkumferenz des Implantates gleichmäßig verteilte Sichtfelder beurteilt und die hierin vorherrschende Ausprägungsform einer Ereignistabelle zugeordnet. Es wurden insgesamt 200 Sichtfelder pro Implantat analysiert.
Ergebnisse (Diese sind als Tabelle in Figur 9 und 9a zusammengefasst):
Nach zuvoriger Induktion mit Bleomycin kam es um die mit natürlichen Phospholipiden beschichteten Weichteilimplantate rasch zu einem entzündlichen Zellinfiltrat. Dies wurde begleitet von einer erheblichen Gewebefibrosierung. Die Gewebereaktion auf Implantate, die mit nitrierten Phospholipiden beschichtet waren, fiel deutlich geringer aus. Auch die Gewebefibrosierung war im Grad und Umfang signifikant geringer.
Interpretation:
Die Beschichtung mit den Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden gemäß der Beispeile B, D, F, G, N8, P2, P7, P12, P14, und R hat die Biokompatibilität der hiermit beschichteten Implantate in vivo um ein Vielfaches gesteigert. Adverse Reaktionen des Körpers auf Implantate, wie z.B. Hyperproliferation, Fibrose, mithin bis zur Abstoßung bzw. pathologischen Überwucherung, stellen eines der größten Probleme beim Einbringen von Fremdmaterial in den Körper dar. Dies gilt generell auch für Materialien, die zwar nicht im Körper eingesetzt werden, aber mit Zellen und Gewebe in Kontakt kommen, z.B. bei Wunden. Die Beschichtung von solchen Materialien mit Nitrocarbonsäuren enthaltenden Phospholipiden hat hierbei hervorragende Eigenschaften gezeigt, die von nitrierten Fettsäuren bzw. nicht nitrierten Phospholipiden nicht reproduziert werden konnten.
Beispiel 21 : Untersuchungen zu cryokonservierenden Effekten von Nitrocarbonsäurenenthaltenden Phospholipiden auf die Vitalität und den Funktionserhalt von Geweben in-vivo.
Die Cryokonservierung ist ein gebräuchliches Verfahren zur Langzeitkonservierung von autologen Geweben und findet besonders Verwendung zur Aufbewahrung von Geweben zur Reproduktion. Hierzu müssen die Gewebestrukturen aber auch deren Funktionalität und Teilungsfähigkeit erhalten bleiben. Bei weiblichen Schafen wurde eine Ovarekomie durchgeführt, die in 60 Ovarialgewebestreifen aufgetrennt wurden. Die Ovarialstreifen wurden entweder direkt kultiviert (n=4) oder mit einer gebräuchlichen Vitrifizierungslosung (Gruppe VL)(Vitrification Kit, Sage, USA) oder nitrierten PL (Gruppe NPL) vorbehandelt. Hierzu wurden die Gewebestreifen mit der Equilibrierungslösung (ART-8025-A) bestehend aus einer MOPS-gepufferte Aminosäuren und Gentamicinsulfat (10 mg/l) enthaltenden Lösung, die jeweils 7,5 % (v/v) DMSO und Äthylenglycol und 12 mg/ml Humanserumalbumin enthält für 30 Minuten eingelegt. Hiernach einlegen in die Vitrifikationslösung (ART-8025-B), die eine Aminosäuren und Gentamicinsulfat enthaltende MOPS-gepufferte Lösung ist, die jeweils 15 % (v/v) DMSO und Äthylenglycol, 12 mg/ml Humanalbumin und 0,6 M Sucrose enthält. Die Konservierung mit nitrierten PL erfolgte durch Einlegen der Ovarealstreifen in eine PBS gepufferte 1 %ige DMSO Lösung die 5% Humanalbumin und 25% SNOPC oder PNLPC enthielt für 60 Minuten. Anschließend wurden die vorbehandelten Gewebestücke in flüssigen Stickstoff getaucht und hierin für 14 Tage aufbewahrt. Anschließend Herausnahme und Aufwärmung der Gewebestücke in AIM-V Medium (Gibco, Invitrogen) in einer sterilen Kulturschale bei zuerst 5°C über 20 Minuten, danach Erwärmen im Wasserbad bis 37°C über 60 Minuten. Anschließend Auswechseln des Kulturmediums und Kultivierung über 14 Tage. Hiernach wurden die Gewebestücke fixiert und zur histologischen Untersuchung in Paraffin eingebettet und geschnitten. Die Quantifizierung der primordialen sowie der Primär- und Sekundärfollikel erfolgte gemäß einer vorbeschriebenen Methode (Paynter SJ, Cooper A, Füller BJ, Shaw RW, 1999; Cryopreservation of bovine ovarian tissue: structural normality of follicles after thawing and culture in vitro. Cryobiology 38 301- 309). Die Gesamtzahl an intakten Follikeln in der Kontrollgruppe wurde als Referenz zu der Anzahl der Follikel in den verschiedenen Gruppen genommen.
Das Kulturmedium wurde alle 2 Tage gewechselt, es wurden jeweils Proben für eine Hormonbestimmung eingefroren. Die Bestimmung von 17b-Östradiol und Progesteron wurden mit einem Radioimmunoassay (Diagnostic Systems Laboratories, USA) durchgeführt. Dieser Versuch wurde mit den Phospholipiden gemäß der Beispiele N1 - N6, N9 - N13, O2 - O4, P2 - P5, P8 - P12 und Q wiederholt.
Ergebnisse: Im Vergleich zur Kontrollgruppe wurde in der Gruppe VL eine signifikant geringere Anzahl intakter Follikel gefunden (56%). Dagegen waren die intakten Follikel quantitativ gleich häufig nach einer Cyrokonserviernung in der Gruppe NPL (SNPOC: 96%; PNLPC: 98%). Sehr ähnliche Ergebnisse wurden für die Phospholipide gemäß den Beispielen N1 - N6, N9 - N13, 02 - 04, P2 - P5, P8 - P12 und Q erhalten, welche in der folgenden Tabelle zusammengestellt sind:
N1 93% N2 94% N3 94% N4 92%
N5 89% N6 92% N9 90% N10 98%
N1 1 95% N12 88% N13 91 % 02 87%
03 91 % 04 93% P2 85% P3 97%
P4 93% P5 90% P8 96% P9 90%
P1 1 97% P12 91 % Q 96% Im Vergleich zur Kontrollgruppe kam es in der Gruppe VL zu einem signifikant geringeren Anstieg von Östradiol (8,2 vs. 26,5 ng/ml) und einem signifikanten Anstieg von Progesteron (6,2 vs. 0,8 ng/ml). In der Gruppe NPL ergaben sich relevante Untersiede gegenüber der Kontrollgruppe bei den gemessenen Hormonwerten (Östradiol SNOPC 8,6 ng/ml, PNLPC 8,3 ng/ml; Progesteron: SNOPC 0,6 ng/ml, PNLPC 0,4 ng/ml). Auch hier wurden sehr ähnliche Ergebnisse für die Phospholipide gemäß den Beispielen N1- N6, N9 - N13, 02 - 04, P2 - P5, P8 - P12 und Q erhalten, wobei die Hormonwerte dieser Phospholipide im Bereich von 0,2 ng/ml bis 0,9 ng/ml (Progesteron) und von 7,8 ng/ml bis 8,9 ng/ml (Östradiol) lagen.
Interpretation:
Die funktionelle Integrität der Hormonproduktion ist entscheidend für transplantiertes Ovarialgewebe. Es konnte in Versuch gezeigt werden, dass die Produktion aber auch das Verhältnis der Steroide untereinander dem nicht eingefrorenen Ovarialgewebes entspricht.
Beispiel 22: Untersuchungen zur Viabilität von cryokonservierten Nerventransplantaten nach Vorbehandlung mit Nitrocarbonsäurenenthaltenden Phospholipiden.
Die Funktionsfähigkeit von peripheren Nerventransplantaten hängt zu einem großen Teil von dem Erhalt der Schwannschen Zellen ab. Bei einer Cryokonservierung wird ein Großteil der Schwannschen Zellen zerstört. Es sollte daher untersucht werden, ob eine Inkubation mit PL oder Nitrierten PL die Überlebensrate dieser Zellpopulation während einer Cryokonservierung verbessert.
Hierzu wurde bei anästhesierten Ratten der N. ischiaticus präpariert und herausgetrennt. Die Nervenstücke wurden von Bindegewebe befreit und in 3 Teile getrennt. Danach Kultivierung in DMEM mit niedrigem Glukosegehalt (1 g/L) mit L- Glutamin (PAA, Pasching Österreich) für 24 Stunden. Je 3 Nervensegmente von unterschiedlichen Tieren wurden mit SNOPC, PNOPI oder SNLPE und den PL gemäß den Beispielen B, D, F, Q, R, S, 06, P1 - P4, N2, N6, N9, N10, N14, N19 und N20, sowie den natürlichen PL SOPC, POPI und SLPE durch Einlegen in eine 100 mmolare Lösung für 1 Stunde vorbehandet. Als Kontrolle wurden Nervenstücke der gleichen Tiere, die keine Vorbehandlung erhielten, 24 Stunden weiter kultiviert; eine weitere Kontrollgruppe wurde ohne Vorbehandung in ansonsten gleicher Weise cryokonserviert. Die Nervenstücke wurden mit einer sterilen Gase bedeckt und mit Kulturmedium befeuchtet. Hiernach graduelle Abkühlung auf -30°C. Die Nervenstücke wurden nach 72 Stunden graduell wiedererwärmt bis auf 37°C. Hiernach erneute Kultivierung über 48 Stunden. Die Nervenstücke wurden dann enzymatisch disseziert (Kollagenase A und D, Roche, Mannheim, Deutschland) gefolgt von einer mechanischen Auftrennung durch mehrfaches Aufnehmen in eine Glaspipette. Die vereinzelten Zellen wurden gewaschen und mit einer Lebend/Tod- Färbung (Annexin-V-Fluos Staining Kit Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) markiert und mittels FACS-Analytik quantifiziert. Die Anzahl der ermittelten lebenden Zellen an der Gesamtzahl der gezählten Zellen wurde ermittelt. Das Verhältnis dieser Zählung bei nicht gefrorenen Zellen wurde als Referenzwert angenommen und der das gefundene Ergebnis hierzu in Relation gesetzt.
Ergebnisse: Im Vergleich zur nativen Kontrollgruppe waren von den eingefrorenen Nervenstücken der Kontrollgruppe nur noch wenige Zellen vital (5%). Der Anteil an viablen Schwannschen bei Nervenstücken, die mit natürlichen PL inkubiert waren lag bei 26% für SOPC, 20% bei POPI und 15% bei SLPE. Bei Nervenstücken, die mit den nitrierten PL inkubiert wurden zeigte sich eine durchweg nur minimale Vitalitätsabnahme, viable Zellen lagen vor in 86% nach SNOPC, 82% nach PNOPI und 80% nach SNLPE-Inkubation. Vergleichbare Werte ergaben sich auch mit den weiteren PL gemäß den Beispielen B, D, F, Q, R, S, O6, P1 - P4, N2, N6, N9, N10, N14, N19 und N20 wie die folgende tabelle zeigt:
B 83% D 89% F 88% O6 78%
N2 79% N6 72% N9 79% N10 82%
N14 81 % N19 84% N20 82% P1 90%
P2 82% P3 90% P4 74%
Q 80% R 75% S 85%
Beispiel 23: Herstellung einer Imprägnierlösung
In einem Ansatz wurde SOPC und in einem anderen wurde ONOPC in 1 % Chloroform gelöst, um eine Lipidkonzentration von 10 μιτιοΙ bis 1 mmol zu erreichen. Beispiel 24: Mit Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden imprägnierte Wundeinlage
Ein handelsüblicher Tabotamp® -Schwamm wurde für 6 Minuten in die unter Beispiel 21 hergestellte Imprägnierlösung getaucht. Nach dem Trocknen wurde der Tauchvorgang noch weitere zwei Mal wiederholt. Alternativ kann die Imprägnierlösung mit einer Spritze aufgetragen werden. Dieser Prozess kann mehrmals wiederholt werden, bis die gewünschte Beladung des Schwamms erreicht ist.
Beispiel 25: Medizinischer Zellstoff beschichtet mit Nitrocarbonsäure(n)- enthaltenden Phospholipiden
Ein 3 cm breites und 6 cm langes Stück einer Wundauflage wie beispielsweise SeaSorb Soft der Firma Coloplast bestehend aus Calciumalginat und Natriumcarboxymethylcellulose wurde 5 Mal mit ca. 1 ml der Imprägnierlösung gemäß Beispiel 21 besprüht und nach jedem Sprühvorgang ca. 20 Minuten an der Luft getrocknet. Alternativ kann die Imprägnierlösung mit einer Spritze aufgetragen werden. Dieser Prozess kann mehrmals wiederholt werden, bis die gewünschte Beladung des Zellstoffs erreicht ist.
Beispiel 26: Nahtmaterial getränkt mit Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipiden
In 28,800 g Methanol (Fluka) werden 300 mg Dequaliniurnchlorid (Solmag) und 300 mg ONOPC bei Raumtemperatur gelöst. Es entsteht eine klare Lösung. In diese Lösung wird ein 50 cm langes Stück eines geflochtenen Polyglycolid-Fadens (USP 2.0) getaucht. Anschließend wurde das Methanol bei Raumtemperatur verdampft. Die Masse der Beschichtung wird gravimetrisch erfasst. Die Masse der Beschichtung beträgt 0,5 mg.
Beispiel 27: Herstellung einer Wundspüllösung mit Nitrocarbonsäure(n)- enthaltenden Phospholipiden
Einer Ringerlösung (Elektrolytzusammensetzung Natriumchlorid: 8,6 g, Kaliumchlorid: 0,3 g und Calciumchlorid: 0,33 g pro 1 L Lösung; pH 7.0) wurden 0,5 g Polyhexanid, 0,3 g PEG und 0,6 g 1 -Stearoyl-2-(9-nitrooleoyl)-sn-PC (oder in einem anderen Ansatz 0,7 g 1 -Palmitoyl-2-(9-nitrolinoleoyl)-sn-PC) zugegeben und anschließend sterilisiert.

Claims

Patentansprüche
Verwendung von Nitrocarbonsäure(n)-enthaltenden Phospholipide allgemeinen Struktur (I)
Figure imgf000168_0001
worin
X ist O oder S;
R1 und R2 unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe umfassend:
lineare Nitroalkylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, verzweigte Nitroalkylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, lineare Nitroalkenylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, verzweigte Nitroalkenylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, lineare Nitroalkinylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, verzweigte Nitroalkinylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, Nitroalkylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, wobei der Nitroalkylrest einen Cycloalkylrest oder einen Heterocycloalkylrest oder eine Carbonylgruppe enthält,
lineare Alkylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, verzweigte Alkylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, lineare Alkenylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, verzweigte Alkenylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, lineare Alkinylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, verzweigte Alkinylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, Alkylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, wobei der Alkylrest einen Cycloalkylrest oder einen Heterocycloalkylrest oder eine Carbonylgruppe enthält,
wobei der Alkylrest, Alkenylrest und Alkinylrest mit einem, zwei oder drei Hydroxygruppen, Thiolgruppen, Halogenresten, Carboxylatgruppen, C1-C5- Al koxycarbonylg ru ppen , Ci -C5-Al kyl carbonyloxyg ru ppen , Ci -C5-Al koxyg ru ppen , Ci-C5-Alkylaminogruppen, Ci-C5-Dialkylaminogruppen und/oder Aminogruppen substituiert sein kann und wobei der Nitroalkylrest, Nitroalkenylrest und Nitroalkinylrest mit einem, zwei oder drei Hydroxygruppen, Thiolgruppen, Halogenresten, Carboxylatgruppen, Ci-C5-Alkoxycarbonylgruppen, C1-C5- Alkylcarbonyloxygruppen, Ci-C5-Alkoxygruppen, Ci-C5-Alkylaminogruppen, Ci- Cs-Dialkylaminogruppen und/oder Aminogruppen substituiert sein kann, wobei zumindest einer der Reste R1 und R2 mindestens eine Nitrogruppe enthalten muss,
R3 für einen der folgenden Reste steht: -H, -CH2-CH(COO")-N H3+,
HO OH
-CH2-CH2-NH3 +, -CH2-CH2-N(CH3)3+, ( >— OH
HO OH
-CR4R5R6, -CR4R5-CR6R7R8, -CR4R5-CR6R7-CR8R9R10, -CR4R5-CR6R7- CR8R9-CR10R1 1 R12, -CR4R5-CR6R7-CR8R9-CR10R1 1-CR12R13R14;
R4 - R14 bedeuten unabhängig voneinander
-H, -OH, -OP(O)(OH)2, -P(0)(OH)2> -P(O)(OCH3)2, -P(O)(OC2H5)2, -OCH3 -OC2H5, -OC3H7, -O-cyclo-C3H5, -OCH(CH3)2, -OC(CH3)3, -OC4H9 -OC4H9, -OCsHn , -OCH2CH(CH3)2, -OCH(CH3)C2H5, -OC6Hi3 -O-cyclo-C4H7, -O-cyclo-C5H9, -OPh, -OCH2-Ph, -OCPh3, -SH
-SCH3, -SC2H5, -F, -Cl, -Br, -I, -CN, -OCN, -NCO, -SCN, -NCS -CHO, -COCH3, -COC2H5, -COC3H7, -CO-cyclo-C3H5, -COCH(CH3)2 -COC(CH3)3, -COOH, -COOCH3j -COOC2H5, -COOC3H7, -COO-cyclo C3H5, -COOCH(CH3)2, -COOC(CH3)3, -OOC-CH3, -OOC-C2H5, -OOC- C3H7, -OOC-cyclo-C3H5, -OOC-CH(CH3)2, -OOC-C(CH3)3, -CONH2
-CONHCH3j -CONHC2H5, -CONHC3H7, -CON(CH3)2, -CON(C2H5)2 -CON(C3H7)2, -NH2, -NO2, -NHCH3, -NHC2H5, -NHC3H7, -NH-cyclo C3H5, -NHCH(CH3)2, -NHC(CH3)3, -N(CH3)2, -N(C2H5)2, -N(C3H7)2 -N(cyclo-C3H5)2, -N[CH(CH3)2]2, -N[C(CH3)3]2, -NH-cyclo-C4H7, -NH-cyclo C5Hn , -NH-cyclo-C6Hi3, -N(cyclo-C4H7)2, -N(cyclo-C5Hn)2, -N(cyclo-C6Hi3)2
-NH(Ph) , -NPh2, -SOCH3, -SOC2H5, -SOC3H7, -SO2CH3, -SO2C2H5 -SO2C3H7, -SO3H, -SO3CH3, -SO3C2H5, -SO3C3H7, -OCF3, -OC2F5 -O-COOCH3j -O-COOC2H5, -O-COOC3H7, -O-COO-cyclo-C3H5 -O-COOCH(CH3)2, -O-COOC(CH3)3, -NH-CO-NH2, -NH-CO-NHCH3 -NH-CO-NHC2H5, -NH-CO-N(CH3)2, -NH-CO-N(C2H5)2, -O-CO-NH2
-O-CO-NHCH3j -O-CO-NHC2H5, -O-CO-NHC3H7, -O-CO-N(CH3)2 -O-CO-N(C2H5)2, -O-CO-OCH3j -O-CO-OC2H5, -O-CO-OC3H7, -O-CO- O-cyclo-C3H5, -O-CO-OCH(CH3)2, -O-CO-OC(CH3)3, -CH2F, -CHF2, -CF3 -CH2CI, -CH2Br, -CH2I, -CH2-CH2F, -CH2-CHF2, -CH2-CF3, -CH2-CH2CI -CH2-CH2Br, -CH2-CH2I, -CH3, -C2H5, -C3H7, -cyclo-C3H5, -CH(CH3)2
-C(CH3)3, -C4H9, -cyclo-C4H7, -cyclo-C5H9, -cyclo-C6Hn , -CH2-CH(CH3)2 -CH(CH3)-C2H5, -CsHn, -Ph, -CH2-Ph, -CPh3, -CH=CH2 -CH2-CH=CH2, -C(CH3)=CH2, -CH=CH-CH3, -C2H4-CH=CH2, -CH=C(CH3)2 -C=CH, -C^C-CH3, -CH2-C^CH;
Figure imgf000170_0001
sowie Salze, Solvate, Hydrate, Enantiomere, Diastereomere, Racemate, Enantiomerengemische, Diastereomerengemische der vorgenannten Verbindungen zur Herstellung von medizinischen Zusammensetzungen und zur Beschichtung von Medizinprodukten.
Verwendung gemäß Anspruch 1 , wobei es sich bei den medizinischen Zusammensetzungen um biopassivierende Zusammensetzungen, Spüllösungen für Medizingeräte, Spüllösungen für Wunden, Imprägnierlösungen für Verbands-, Wund- und Nahmaterialien, Beschichtungslösungen für Medizinprodukte, Cryoprotektionslösungen, Kältekonservierungsmedien, Lyoprotektionslösungen, Kontrastmittellösungen, Konservierungslösungen und Perfusionslösungen für Zellen, Gewebe und Organe handelt.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei mindestens einer der Reste R1COO- und R2COO- dargestellt als freie Säure R1COOH und R2COOH eine nitrierte Carbonsäure ausgewählt aus der folgenden Gruppe repräsentiert:
Hexansäure, Octansäure, Decansäure, Dodecansäure, Tetrad ecan säure, Hexadecansäure, Heptadecansäure, Octadecansäure, Eicosansäure, Docosansäure, Tetracosansäure, cis-9-Tetradecensäure, cis-9- Hexadecensäure, cis-6-Octadecensäure, cis-9-Octadecensäure, cis-1 1 - Octadecensäure, cis-9-Eicosensäure, cis-1 1 -Eicosensäure, cis-13- Docosensäure, cis-15-Tetracosensäure, t9-Octadecensäure, t1 1 - Octadecensäure, t3-Hexadecensäure, 9,12-Octadecadiensäure, 6,9,12- Octadecatriensäure, 8,1 1 ,14-Eicosatriensäure, 5,8,1 1 ,14-Eicosatetraensäure, 7,10,13,16-Docosatetraensäure, 4,7,10,13,16-Docosapentaensäure, 9,12,15- Octadecatriensäure, 6,9,12,15-Octadecatetraensäure, 8,1 1 ,14,17-
Eicosatetraensäure, 5,8,1 1 ,14,17-Eicosapentaensäure, 7,10,13,16,19- Docosapentaensäure, 4,7,10,13,16,19-Docosahexaensäure, 5,8,1 1 - Eicosatriensäure, 9c1 1113t-Eleostearinsäure, 8t10t12c-Calendulasäure, 9c1 1113c-Catalpinsäure, 4,7,9,1 1 ,13,16,19-Docosaheptadecansäure,
Taxoleinsäure, Pinolensaure, Sciadonsaure, 6-Octadecinsäure, t1 1 -Octadecen- 9-insäure, 9-Octadecinsäure, 6-Octadecen-9-insäure, t10-Heptadecen-8- insäure, 9-Octadecen-12-insäure, t7,t1 1 -Octadecadien-9-insäure, t8,t10- Octadecadien-12-insäure, 5,8,1 1 ,14-Eicosatetrainsäure, Retinsäure, Isopalmitinsäure, Pristansäure, 3,7,1 1 ,15-Tetramethylhexadecansäure, 1 1 ,12- Methylen-Octadecansäure, 9,10-Methylen-Hexadecansäure, Coronarinsäure, (R,S)-Liponsäure, (S)-Liponsäure, (R)-Liponsäure, 6,8-(Methylsulfanyl)- octansäure, 4,6-bis(Methylsulfanyl)-hexansäure, 2,4-bis(Methylsulfanyl)- butansäure, 1 ,2-Dithiolancarboxylsäure, (R,S)-6,8-Dithian-octansäure, (S)-6,8- Dithian-octansäure, 6,9-Octadeceninsäure, t8,t10-Octadecadien-12-insäure, Hydroxytetracosansäure, 2-Hydroxy-15-tetracosensäure, 12-Hydroxy-9- octadecensäure, 14-Hydroxy-1 1 -eicosensäure, Pimelinsäure, Suberinsäure, Azelainsäure, Sebacinsäure, Brassylinsäure und Thapsinsäure.
Nitrocarbonsäuren-enthaltende Phospholipide der allgemeinen Struktur (I)
Figure imgf000171_0001
worin
X ist O oder S;
R1 und R2 unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe umfassend:
lineare Nitroalkylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, verzweigte Nitroalkylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, lineare Nitroalkenylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, verzweigte Nitroalkenylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, lineare Nitroalkinylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, verzweigte Nitroalkinylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, Nitroalkylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, wobei der Nitroalkylrest einen Cycloalkylrest oder einen Heterocycloalkylrest oder eine Carbonylgruppe enthält,
lineare Alkylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, verzweigte Alkylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, lineare Alkenylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, verzweigte Alkenylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, lineare Alkinylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, verzweigte Alkinylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, Alkylreste mit 5 - 30 Kohlenstoffatomen, wobei der Alkylrest einen Cycloalkylrest oder einen Heterocycloalkylrest oder eine Carbonylgruppe enthält,
wobei der Alkylrest, Alkenylrest und Alkinylrest mit einem, zwei oder drei Hydroxygruppen, Thiolgruppen, Halogenresten, Carboxylatgruppen, C1-C5- Al koxycarbonylg ru ppen , Ci -C5-Al kyl carbonyloxyg ru ppen , Ci -C5-Al koxyg ru ppen , Ci-C5-Alkylaminogruppen, Ci-C5-Dialkylaminogruppen und/oder Aminogruppen substituiert sein kann und wobei der Nitroalkylrest, Nitroalkenylrest und Nitroalkinylrest mit einem, zwei oder drei Hydroxygruppen, Thiolgruppen, Halogenresten, Carboxylatgruppen, Ci-C5-Alkoxycarbonylgruppen, C1-C5- Alkylcarbonyloxygruppen, Ci-C5-Alkoxygruppen, Ci-C5-Alkylaminogruppen, Ci- Cs-Dialkylaminogruppen und/oder Aminogruppen substituiert sein kann, wobei zumindest einer der Reste R1 und R2 mindestens eine Nitrogruppe enthalten muss,
R3 für einen der folgenden Reste steht: -H, -CH2-CH(COO")-N H3+,
HO OH
-CH2-CH2-NH3 +, -CH2-CH2-N(CH3)3 +, ( / OH
HO OH
-CR4R5R6, -CR4R5-CR6R7R8, -CR4R5-CR6R7-CR8R9R10, -CR4R5-CR6R7- CR8R9-CR10R1 1R12, -CR4R5-CR6R7-CR8R9-CR10R11-CR12R13R14;
R4 - R14 bedeuten unabhängig voneinander
-OH, -OP(O)(OH)2, -P(O)(OH)2, -P(O)(OCH3)2, -P(O)(OC2H5)2, -OCH3, -OC2H5, -OC3H7, -O-cyclo-C3H5, -OCH(CH3)2, -OC(CH3)3, -OC4H9,
-OC4H9, -OC5H11 , -OCH2CH(CH3)2, -OCH(CH3)C2H5, -OC6H i3, -O-cyclo-C4H7, -O-cyclo-C5H9, -OPh, -OCH2-Ph, -OCPh3, -SH, -SCH3, -SC2H5, -F, -CI, -Br, -I, -CN, -OCN, -NCO, -SCN, -NCS, -CHO, -COCH3, -COC2H5, -COC3H7, -CO-cyclo-C3H5, -COCH(CH3)2, -COC(CH3)3, -COOH, -COOCH3, -COOC2H5, -COOC3H7, -COO-cyclo-
C3H5, -COOCH(CH3)2, -COOC(CH3)3, -OOC-CH3, -OOC-C2H5, -OOC- C3H7, -OOC-cyclo-C3H5, -OOC-CH(CH3)2, -OOC-C(CH3)3, -CONH2, -CONHCHs, -CONHC2H5, -CONHC3H7, -CON(CH3)2, -CON(C2H5)2, -CON(C3H7)2, -NH2, -NO2, -NHCH3, -NHC2H5, -NHC3H7, -NH-cyclo- C3H5, -NHCH(CH3)2, -NHC(CH3)3, -N(CH3)2, -N(C2H5)2, -N(C3H7)2,
-N(CH3)3 +, -N(C2H5)3 +, -N(C3H7)3 +, -N(cyclo-C3H5)3 +, -N[CH(CH3)2]3 +, -N(cyclo-C3H5)2, -N[CH(CH3)2]2, -N[C(CH3)3]2, -NH-cyclo-C4H7, -NH-cyclo- C5H11 , -NH-cyclo-C6Hi3, -N(cyclo-C4H7)2, -N(cyclo-C5Hn )2, -N(cyclo-C6Hi3)2, -NH(Ph) , -NPh2, -SOCH3, -SOC2H5, -SOC3H7, -SO2CH3, -SO2C2H5, -SO2C3H7, -SO3H, -SO3CH3, -SO3C2H5, -SO3C3H7j -OCF3, -OC2F5, -O-COOCH3j -O-COOC2H5, -O-COOC3H7, -O-COO-cyclo-C3H5, -O-COOCH(CH3)2, -O-COOC(CH3)3, -NH-CO-NH2, -NH-CO-NHCH3, -NH-CO-NHC2H5, -NH-CO-N(CH3)2, -NH-CO-N(C2H5)2, -O-CO-NH2, -O-CO-NHCH3j -O-CO-NHC2H5, -O-CO-NHC3H7, -O-CO-N(CH3)2, -O-CO-N(C2H5)2, -O-CO-OCH3j -O-CO-OC2H5, -O-CO-OC3H7, -O-CO- O-cyclo-C3H5, -O-CO-OCH(CH3)2, -O-CO-OC(CH3)3, -CH2F, -CHF2, -CF3, -CH2CI, -CH2Br, -CH2I, -CH2-CH2F, -CH2-CHF2, -CH2-CF3, -CH2-CH2CI, -CH2-CH2Br, -CH2-CH2I, -CH3, -C2H5, -C3H7, -cyclo-C3H5, -CH(CH3)2, -C(CH3)3, -C4H9, -cyclo-C4H7, -cyclo-C5H9, -cyclo-C6Hn, -CH2-CH(CH3)2, -CH(CH3)-C2H5, -CsHn, -Ph, -CH2-Ph, -CPh3, -CH=CH2, -CH2-CH=CH2, -C(CH3)=CH2, -CH=CH-CH3, -C2H4-CH=CH2, -CH=C(CH3)2, -C^CH, -C^C-CH3, -CH2-C^CH;
Figure imgf000173_0001
sowie Salze, Solvate, Hydrate, Enantiomere, Diastereomere, Racemate, Enantiomerengemische, Diastereomerengemische der vorgenannten Verbindungen.
Nitrocarbonsäuren-enthaltende Phospholipide gemäß Anspruch 4, wobei mindestens einer der Reste R1COO- und R2COO- dargestellt als freie Säure R1COOH und R2COOH eine nitrierte Carbonsäure ausgewählt aus der folgenden Gruppe repräsentiert:
Hexansäure, Octansäure, Decansäure, Dodecansäure, Tetradecansäure, Hexadecansäure, Heptadecansäure, Octadecansäure, Eicosansäure,
Docosansäure, Tetracosansäure cis-9-Tetradecensäure cis-9-
Hexadecensäure, cis-6-Octadecensäure cis-9-Octadecensäure cis-1 1 -
Octadecensäure, cis-9-Eicosensäure cis-1 1 -Eicosensäure cis-13-
Docosensäure, cis-15-Tetracosensäure t9-Octadecensäure t1 1 -
Octadecensäure, t3-Hexadecensäure 9,12-Octadecadiensäure 6,9,12-
Octadecatriensäure, 8,1 1 ,14-Eicosatriensäure, 5,8,1 1 ,14-Eicosatetraensäure, 7,10,13,16-Docosatetraensäure, 4,7,10,13,16-Docosapentaensäure, 9,12,15- Octadecatriensäure, 6,9,12,15-Octadecatetraensäure, 8,1 1 ,14,17-
Eicosatetraensäure, 5,8,1 1 ,14,17-Eicosapentaensäure, 7,10,13,16,19- Docosapentaensäure, 4,7,10,13,16,19-Docosahexaensäure, 5,8,1 1 - Eicosatriensäure, 9c1 1113t-Eleostearinsäure, 8t10t12c-Calendulasäure, 9c1 1113c-Catalpinsäure, 4,7,9,1 1 ,13,16,19-Docosaheptadecansäure,
Taxoleinsäure, Pinolensäure, Sciadonsäure, 6-Octadecinsäure, t1 1 -Octadecen- 9-insäure, 9-Octadecinsäure, 6-Octadecen-9-insäure, t10-Heptadecen-8- insäure, 9-Octadecen-12-insäure, t7,t1 1 -Octadecadien-9-insäure, t8,t10- Octadecadien-12-insäure, 5,8,1 1 ,14-Eicosatetrainsäure, Retinsäure, Isopalmitinsäure, Pristansäure, 3,7,1 1 ,15-Tetramethylhexadecansäure, 1 1 ,12- Methylen-Octadecansäure, 9,10-Methylen-Hexadecansäure, Coronarinsäure, (R,S)-Liponsäure, (S)-Liponsäure, (R)-Liponsäure, 6,8-(Methylsulfanyl)- octansäure, 4,6-bis(Methylsulfanyl)-hexansäure, 2,4-bis(Methylsulfanyl)- butansäure, 1 ,2-Dithiolancarboxylsäure, (R,S)-6,8-Dithian-octansäure, (S)-6,8- Dithian-octansäure, 6,9-Octadeceninsäure, t8,t10-Octadecadien-12-insäure, Hydroxytetracosansäure, 2-Hydroxy-15-tetracosensäure, 12-Hydroxy-9- octadecensäure, 14-Hydroxy-1 1 -eicosensäure, Pimelinsäure, Suberinsäure, Azelainsäure, Sebacinsäure, Brassylinsäure und Thapsinsäure.
Nitrocarbonsäuren-enthaltende Phospholipide gemäß einem der Ansprüche 4 oder 5 zur Verwendung bei der Behandlung von Schnittwunden, Dissektionen, Resektionen, Wundverschluss, Gewebenähten, Kauterisation, Drainagen, Grafteinlagen, Implantateinlagen, Osteosynthesen, Hyperthermie, Bestrahlung, Licht/Laserenergieabgabe, Kryoablation und Gewebeverschmelzung.
Nitrocarbonsäuren-enthaltende Phospholipide gemäß einem der Ansprüche 4 oder 5 zur Verwendung zur Biopassivierung von geschädigten Zellen, Geweben und Organen, wobei die Schädigung entstanden ist durch ein physikalisches, chemisches, osmotisches oder elektrisches Trauma.
Nitrocarbonsäuren-enthaltende Phospholipide gemäß einem der Ansprüche 4 oder 5 zur Verwendung zur Cryokonservierung von Zellen und Geweben und zum Schutz von Zellen, Geweben und Organen vor einer Schädigung durch Toxine, pathogene Biomoleküle, Allergene, Hypoxie, Cryothermie, Hyperthermie, Barotrauma, Bestrahlung, Licht/Laserenergieabgabe und Reperfusion.
9. Medizinprodukt beschichtet mit mindestens einem Nitrocarbonsauren- enthaltenden Phospholipid gemäß einem der Ansprüche 4 oder 5.
10. Medizinprodukt gemäß Anspruch 9, wobei die Beschichtung als Monoschicht, Doppelschicht oder Mehrfachschicht vorliegt.
1 1 . Medizinprodukt gemäß Anspruch 9 oder 10, wobei die Beschichtung biopassivierende, biokompatibilitätsverbessernde und/oder proliferations- mindernde Eigenschaften aufweist.
12. Medizinprodukt gemäß Anspruch 9, 10 oder 1 1 , wobei die Beschichtung des weiteren Hilfsstoffe und/oder pharmakologische Wirkstoffe enthält.
13. Medizinprodukt gemäß einem der Ansprüche 9 - 12, wobei die Beschichtung eine verbesserte Stabilität gegen Ablösung aufweist und/oder eine verbesserte
Adhäsion von Zellen ermöglicht.
14. Medizinprodukt gemäß einem der Ansprüche 9 - 13, wobei es sich bei dem Medizinprodukt um Medizingeräte, Implantate, temporär in den Körper einführbare medizinische Gegenstände, Wundmaterialien und Nahmaterialien handelt.
Medizinprodukt gemäß Anspruch 14, wobei es sich bei dem Medizinprodukt um ein biologisches oder künstliches Transplantat oder Implantat, künstliche oder natürliche Blutgefäße, Blutleiter, Blutpumpen, Dialysatoren, Dialysemaschinen, Herzklappen, Weichteilimplantate, Brustimplantate, Gesichtsimplantate, Stents, Katheterballons oder Katheterballons mit aufgesetztem Stent handelt.
Medizinprodukt gemäß einem der Ansprüche 9 - 15, wobei die Beschichtung aus dem mindestens einen Nitrocarbonsäuren-enthaltenden Phospholipid des weiteren mindestens einen anti-restenotischen Wirkstoff enthält.
Biopassivierende Zusammensetzungen, Spüllösungen für Medizingeräte, Spüllösungen für Wunden, Imprägnierlösungen für Verbands-, Wund- und Nahtmaterialien, Beschichtungslösungen für Medizinprodukte, Cryoprotektionslösungen, Kältekonservierungsmedien, Lyoprotektionslösungen, Kontrastmittellösungen, Konservierungslösungen und Perfusionslösungen für Zellen, Gewebe und Organe enthaltend mindestens ein Nitrocarbonsäure- enthaltendes Phospholipid gemäß einem der Ansprüche 4 oder 5.
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