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WO2012012858A1 - Método para embalar esporos de fungos em atmosfera modificada visando ao aumento da vida-de-prateleira de fungos - Google Patents

Método para embalar esporos de fungos em atmosfera modificada visando ao aumento da vida-de-prateleira de fungos Download PDF

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Publication number
WO2012012858A1
WO2012012858A1 PCT/BR2011/000254 BR2011000254W WO2012012858A1 WO 2012012858 A1 WO2012012858 A1 WO 2012012858A1 BR 2011000254 W BR2011000254 W BR 2011000254W WO 2012012858 A1 WO2012012858 A1 WO 2012012858A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
spores
packaging
water activity
days
spore
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/BR2011/000254
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Marcos Rodrigues De Faria
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria EMBRAPA
Original Assignee
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria EMBRAPA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to MX2013001230A priority patent/MX357404B/es
Priority to JP2013522060A priority patent/JP2013534135A/ja
Priority to KR1020137005428A priority patent/KR102045980B1/ko
Priority to US13/813,326 priority patent/US10407661B2/en
Priority to RU2013108510A priority patent/RU2631826C2/ru
Application filed by Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria EMBRAPA filed Critical Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria EMBRAPA
Priority to CA2807103A priority patent/CA2807103C/en
Priority to EP11811669.8A priority patent/EP2599857B1/en
Publication of WO2012012858A1 publication Critical patent/WO2012012858A1/pt
Anticipated expiration legal-status Critical
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Priority to ZA2013/01530A priority patent/ZA201301530B/en
Ceased legal-status Critical Current

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    • B65—CONVEYING; PACKING; STORING; HANDLING THIN OR FILAMENTARY MATERIAL
    • B65B—MACHINES, APPARATUS OR DEVICES FOR, OR METHODS OF, PACKAGING ARTICLES OR MATERIALS; UNPACKING
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q3/00—Condition responsive control processes

Definitions

  • the present invention relates to fungal spore packaging methods such as entomopathogenic fungi of the genera Beauver ⁇ a, Isaria, Lecanicillium, Nomuraea, Metarhizium and Tr ⁇ choderma for extending shelf life.
  • Bio pesticides are an alternative to those obtained synthetically as they are not toxic to humans. These include those produced from entomopathogenic fungi, whose spores are dehydrated, to remain viable for extended periods (Moore et al. Effects of moisture content and temperature on storage of Metarhizium flavoride conidia. Biocontrol Science and Technology, v .6, pp. 51-61.) ⁇ Dehydration also causes spores to survive in extreme environments characterized by dry heat, freezing and thawing as well as acid medium.
  • Fungi used in biological pest control that are used as pesticides are exposed to high temperatures, reaching 50 ° C or more during transport or storage.
  • This Environmental impact affects the viability of temperature-sensitive fungal spores such as Metarhizium, Beauveria, Lecanicillium and Trichoderma.
  • Studies to date have focused mainly on the storage of these fungi under refrigerated conditions or ambient temperatures below approximately 30 ° C.
  • Mycopesticides experience rapid drop in viability during uncooled storage and this compromises the market acceptance of the product, while also causing undesirable results in target pest control.
  • US5989898 discloses the use of waterproof packaging and moisture and oxygen absorbers to generate atmospheres with relative humidity of less than 10% and less than 5% oxygen. Another proposal of this document is the elimination of oxygen by vacuum packaging, or the application of nitrogen to the spore package.
  • the microorganisms used were Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae for storage at 25 ° C and 37 ° C.
  • US5989898 uses surfactant to reactivate spores, unlike the present invention, which enables storage at temperatures above 37 ° C, the use of different non-toxic gases (CO 2 , H 2 and He) in place of oxygen, and adopts compliance with pre-incubation period of the packaged product.
  • CO 2 , H 2 and He non-toxic gases
  • WO9718294 discloses extending two to six times the shelf life of fungal or bacterial spores by reducing the oxygen content, whether or not associated with moisture reduction methods.
  • the maximum storage temperature evaluated was 30 ° C, and after only 70 days of storage the initial viability had already been reduced by 85% or more in the treatment with O 2 absorber sachet or treatment with nitrogen use.
  • the present invention allows the viability of fungal spores stored at temperatures above 40 ° C to be maintained for a period of three to six months.
  • the method comprises the steps of: i) reducing the initial moisture content of spores to a range of water activity viable to organisms; (ii) placing the spores in gas and vapor-impermeable packaging with at least one oxygen and moisture absorbing agent; (iii) keeping spores in the packaging for at least two days at 15 to 25 ° C, preferably at 25 ° C or at another viable temperature to organisms before exposure to elevated temperatures.
  • a second embodiment of the invention is to provide spores of the genera Beauveria, Isaria, Lecanicillium, Nomuraea, Metarhizium and Trichoderma with increased shelf life.
  • a sealed package is obtained comprising: (i) viable fungal spores; and (ii) an environment with reduced moisture and oxygen content through the use of sachets and an incubation period at a suitable temperature in gas and water vapor-tight packaging.
  • Figure 1 Effect of different gases on the conidial viability of Beu-veria bassiana after storage at 50 ° C for 60 days. Viability was assessed by two germination protocols (rapid rehydration vs. slow rehydration).
  • Figure 2 Viability of Beauveria bassiana conidia after injection of 20% CO 2 (+ 80% N 2 ) and storage at 25, 40, or 50 ° C.
  • the present invention relates to a storage method for extending the shelf life of fungi under uncooled conditions, above 37 ° C and above. Through this methodology the spores remain viable even when subjected to high ambient temperatures.
  • modified atmosphere packaging is defined herein as the packaging process where material within said package is exposed to gases having a composition other than atmospheric air and may include techniques such as the injection of a particular gas or mixture of gases. inside the packaging or the use of elements whose components react with packaging components. These elements may be but are not limited to absorber sachets, gas emitters, or water vapor absorbers.
  • viability refers to the percentage of spore germination measured by a procedure that employs rapid rehydration, as it is considered a better protocol for assessing conidial quality. beyond mycopesticides.
  • Viable body temperature is considered to be the temperature that does not cause the death or debilitation of conidia of a particular species.
  • the viable temperature is preferably around 25 ° C.
  • Water activity (a w ) is defined as the ratio of a material's water vapor pressure to pure water vapor pressure at the same temperature. It is a measure of the water contained in the material that is available for chemical and biological reactions and is therefore an important parameter in studies with microorganisms.
  • pre-incubation period or equilibration period is the holding time of the spores in the impermeable package prior to exposure to high temperatures, which time is required to reduce water activity below 0 , Preferably between 0.02 and 0.03.
  • Shelf life is defined as the length of time a mycopesticide can be stored under a certain temperature condition without significant loss of attributes related to its efficiency.
  • the relative storage humidity should also be considered.
  • the period of 2 to 6 months is considered to be the minimum desirable shelf life for biological insecticides stored at temperatures close to 40 ° C.
  • Viability is the most commonly used attribute by pathologists to refer to conidial quality and should preferably be greater than 80%.
  • the shelf life for mycosinsicides was established as long as necessary for the viability to be reduced to 80% at a given temperature.
  • the shelf life extension method of entomopathogenic fungal spores consists of the following steps:
  • the initial moisture content of hydrated spores can be reduced by drying during the spore harvesting stage.
  • Fungus production usually takes place on solid substrates such as cooked rice and the like.
  • the colonized substrate can be stored in a room with low relative humidity, which results in conidia drying or using a chamber containing dehydrating material, until water activity is reduced to low values.
  • Such low pre-bottling water activity values are preferably less than 0.3.
  • This material may be selected from the group of but not limited to: calcium sulfate and silica gel.
  • a period of two days or more is expected at mild temperatures, preferably between 15 and 25 ° C, more preferably at about 25 ° C, or other temperature not affecting the temperature. spore viability, in which fungal dehydration can occur without weakening fungal structures.
  • the water activity of organisms is significantly reduced after filling, and thus maintained through the use of gas and vapor impermeable packaging.
  • sachets containing moisture and oxygen absorbing agents are preferably used. These sachets may have a single function, ie, they are individually oxygen absorbers or moisture absorbers, or have dual function when a single sachet functions as an oxygen and moisture absorber. The sachets must generate a non-spore atmosphere. As moisture absorbers calcium sulfate or silica gel may be used.
  • Useful sachets for the present invention may be selected from, but are not limited to: RP-3A (oxygen and moisture absorber), Ageless® ZPT 1000 (oxygen absorber), OxyFree TM 504A (oxygen and carbon dioxide absorber), OxyFree TM 504E (oxygen absorber and carbon dioxide generator) or anhydrous calcium sulfate (moisture absorber).
  • Impermeable packaging used in the method of the present invention may be, but is not limited to, aluminized and glass packaging.
  • the final water activity of mycopesticide and the atmospheric composition inside the package are essential factors for the maintenance of spore viability until its use. Maintaining spores in impervious packaging prior to exposure to high temperatures is called pre-incubation or "equilibration period", which is the time required to reduce final water activity to values below less than 0.1, preferably between 0.02 and 0.03.
  • the equilibration period is usually two days for small amounts of spores, or longer depending on factors such as package size, formulation type, amount of mycopesticide and quantity and efficiency of absorbent sachets. used.
  • the fungi which may be packaged and reactivated according to the present invention include, but are not limited to, those of the genera Beauveria, Isaria, Lecanicillium, Nomuraea, Metarhizium and Trichoderma.
  • Impermeable packages in which mold spores according to the invention are packaged may be, but are not limited to: glass, laminated materials containing aluminum or ceramics, or other materials impervious to gases and water vapor.
  • Beauveria bassiana spore samples (0.6 g) were kept in 125 mL airtight glass vials (Ball®, Jarden Corp., Muncie, IN, USA) sealed with metal caps containing rubber septa. Each glass vial was injected for 40 minutes at a rate of 40 mL.min "1 pure carbon dioxide, nitrogen, helium or hydrogen as well as 100% or 21% oxygen, equilibrated with N 2 (Airgas East, Inc. , Salem, NH, USA). in the flasks where it is not injected O 2 was measured concentration of this gas followed by injection to ensure that the environment was with undetectable concentrations of O 2.
  • gas samples 500 L were extracted from each vial with an airtight syringe (model 1750, Hamilton Company, Reno, NV, USA) and injected into a gas chromatograph (Varian Aerograph, Walnut Creek, CA, USA) equipped with a thermal conductivity detector. Peak heights were compared with a commercial standard containing 6.96% O 2 and 4.91% CO 2 , balanced with N 2. Each treatment consisting of exposure to gas was repeated three or four times to minimize exchanges. (O 2 inlet) during storage, 125 mL bottles were kept in larger hermetic Ball® jar containers (0.95 L) containing the same gas mixture. Using this arrangement, the glass vials were incubated at 50 ° C for 60 days.
  • the inoculated agar blocks (on glass slides) were incubated in paraffin waxed petri dishes at 25 ° C in the dark and germination counts were performed 24 post inoculation (pi).
  • Conidia were considered to have germinated when a germ tube of any size was visible at 400X magnification with phase contrast illumination. At least 200 conidia were examined in various microscopic fields for each suspension replicate of each experimental treatment.
  • the spore samples were injected with 20% CO 2 and 80% N 2 .
  • Four samples were tested for each treatment for residual O 2 and final water activity after storage for 45, 91, 180 and 240 days at 40 ° C. The experiment was repeated on a different date.
  • experiments were performed separately to investigate the effects of storage at 25 ° C (evaluations at 46, 120, 180, 365 and 480 days post-storage) and 50 ° C (evaluations at 15, 30, 47, 75 and 90 days after storage). In all cases, viability was also determined on "day zero", ie immediately before storage in incubators at different temperatures. Different vials were sampled on a single assessment date and, therefore, this study did not use a repeated measures design.
  • Data were transformed into square root of the sine and analyzed using a one-way analysis of variance. Means were compared by Tukey-Kramer HSD test or t-test and considered statistically different at the 5% significance level. Data were analyzed using the JMP statistical package (SAS Institute Inc, Cary, NC, USA).
  • Beauveria bassiana spores were dehydrated with NaOH in 125 ml glass flasks for 1 day at 25 ° C, resulting in 0.083 ⁇ 0.001 water activity.
  • Several randomly selected samples were transferred to glass vials and injected with N 2 . O 2 loss was reduced using a double glass container filling system.
  • the remaining samples were submitted to one of the three AE treatments comprising: i) aluminum bags (8 x 8.5 cm) with an O 2 absorber RP-3A sachet and moisture; ii) an O 2 absorber film (code M-0034, lot 19208A, 88.9x63.5x0.3 mm; CSP Technologies, Auburn, AL, USA) plus a moisture absorber film (CSP Technologies, code M-0026, lot 02208A, 63.5x38.1x0.6 mm) or; (iii) a dual action film that absorbs O 2 and humidity (CSP Technologies, code M-0033, batch 10808A, 76.2x76.2x0.6 mm). For control, spores were kept in 30 mm thick polyethylene bags (code P827-2.1.2; Empac Agroindustrial de Plasticos Ltda, Brasilia, Brazil) with an RP-3A sachet.
  • Example 4 Modified ATMOSPHERE SACHES Beauveria bassiana spore samples were stored in 125 ml glass vials with calcium sulfate desiccant (Drierite TM 8-mesh indicator, WA Hammond Drierite Co., Xenia, OH, USA) ) for two days at 25 ° C. The water activity of the spores before filling was 0.019 ⁇ 0.0005. In another treatment the spores were kept in saturated NaCl solution for 2 days at 25 ° C, which resulted in water activity of 0.738 ⁇ 0.0007 before of the filling.
  • calcium sulfate desiccant Drierite TM 8-mesh indicator, WA Hammond Drierite Co., Xenia, OH, USA
  • the samples were then transferred to laminate bags (10x12 cm) containing one of these sachets to atmosphere modification: The absorber 2 and moisture RP-3A, the second absorber Ageless® ZPT 1000 (Mitsubishi Gas Chemical Co., Japan) OxyFree TM 504A O 2 and CO 2 absorber (Tianhua Tech, China), OxyFree TM 504E O 2 absorber and CO 2 generator (Tianhua Tech, China), or Drierite TM based moisture absorber (56.7 g ). As control were used laminated bags without sachet. The pouches were incubated at 50 ° C without the preincubation period, quantifying the water activity of the spores and counting germination after 45 days. Each treatment (type of sachet vs. initial water activity) was repeated four times.
  • Beauveria bassiana spore samples were dried with Drierite TM for 2 days at 25 ° C (resulting in water activity 0.020 ⁇ 0.0008) and then transferred to 16x20 cm laminated pouches with different sachets: RP-5A for absorption of O2 and Moisture (same composition as RP-3A but indicated for larger packaging), 504E for O 2 absorption and CO2 generation or a 504E sachet plus a Drierite TM sachet (56.7 g). Each treatment was repeated three times and the spore water activity as well as germination were determined after 148 and 180 days post-storage at 40 ° C.
  • the moisture absorbing O 2 sachet (504E) was efficient when tested in conjunction with a desiccant (Drierite TM), but the isolated use of the 504E sachet resulted in total loss of viability (Table 2).
  • the initial 2 / humidity) 0.0000 b 0.0003 b was 0.020 ⁇ 0.0008, and spores were not preincubated at a moderate temperature prior to exposure to 40 ° C.
  • Beauveria bassiana pure spores had their water activity balanced inside the package before being exposed to high temperature regimes.
  • Beauveria bassiana samples were kept in Drierite TM or NaCI for 2 days at 25 ° C, resulting in water activity of 0.020 ⁇ 0.0008 and 0.740 ⁇ 0.0018, respectively.
  • the spores were then transferred to laminated pouches each containing an RP-3A sachet (O 2 and moisture absorber) and preincubated for an additional 5 days at 25 ° C before being stored at target temperatures. (25, 40 and 50 ° C).
  • samples were kept in Drierite TM or NaCI for 7 days at 25 ° C, transferred to laminated pouches containing RP-3A sachets and immediately stored at target temperatures without the 5 day equilibration period at 25 ° C. .
  • Each treatment was repeated four times and measurements of water activity and viability were performed at 60 days at 50 ° C and 180 days at 25 or 40 ° C.
  • the low and high initial W were 0.020 ⁇ 0.0008 and 0.740 ⁇ 0.0018, respectively.
  • Example 8 EFFECT OF ACTIVE PACKAGING ON SHELF LIFE OF THE FUNGUS Metarhizium anisopliae At 40 ° C
  • US5989898 discloses that Drierite TM dehydrated Metartiizone spores stored in supposedly 0 2 atmospheres obtained by using the Ageless sachet in moisture and gas impermeable pouches showed 74% viability after 2 months at 37 ° C, and showed no viability if kept in bags without 0 2 absorber or with high relative humidity, ranging from 40 to 100%.
  • Leite et al. (2002) (Milk, LG, et al. Preservation of Batkoa sp. And Fury sp. (Entomophthorales) mycelium in combination with desiccants and oxygen reducers. Archives of the Biological Institute 69, 117-122, 2002) preserved mycelia Batkoa sp. and Fury sp. for 3 months at 23 ° C using Ageless and silica gel, but no further studies on entomopathogenic fungi packaging in a modified atmosphere are known.
  • Water activity remained at low and constant levels after hermetic aluminum filling and the use of a 0 2 absorber and efficient moisture.
  • isolated enzymatic reactions may occur which lead to the production of free radicals and non-enzymatic reactions mediated by these free radicals.
  • phospholipid degradation reactions may occur, with accumulation of their by-products (fatty acids) in the membranes (McKersie, BD et al.
  • Senaratna, T., Walker, MA Evidence for free radical mediation In: LD Nooden, LD, Leopold, AC (Eds.), Senescence and Aging in Plants San Diego: Academic Press,, 442-464, 1988 ).
  • LD Nooden, LD, Leopold, AC (Eds.) Senescence and Aging in Plants San Diego: Academic Press,, 442-464, 1988 .
  • the aging under atmospheric conditions and free from extremely dry 0 2 is considerably slower than in non hermetic conditions.
  • pre-storage factors such as initial quality of fungal propagules, which in turn is influenced by culture conditions (Agosin, E. et al. the biocontrol agent Trichoderma harzianum World Journal of Microbiology and Biotechnology v. 13, pp 225-232, 1997; Frey S. Magan N. Production of the biocontrol agent Ulocladium atrum by submerged fermentation: accumulation of endogenous reserves and shelf-life studies Applied Microbiology and Biotechnolgy, v.
  • This invention has shown that it is necessary to dry packed spores subjected to moderate conditions prior to exposure to high temperature regimes so that the high initial water activity reaches the desired levels and thus to prevent premature death or debilitation of the spores.
  • Post-storage factors such as the germination protocol, although not directly related to shelf life, can result in erroneous viability if not properly performed.
  • the shelf lives presented in this example were estimated with emphasis on a rapid rehydration protocol (without prior exposure of spores to a slow rehydration regime within a humid chamber for 24 h).

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Abstract

A presente invenção refere-se a um método de embalagem para aumento da vida-de-prateleira de esporos de fungos, e à embalagem que contém tais esporos. O método de embalagem compreende as etapas de desidratação prévia dos esporos para uma faixa de atividade de água viável ao fungo de interesse, seguida de envase dos esporos em embalagens impermeáveis a gases e vapor d'água através do emprego de sachês que resultem em atmosfera de baixa umidade relativa e baixo teor de oxigénio, seguida de manutenção dos esporos na embalagem durante algum tempo em temperatura amena aos esporos antes da exposição dos mesmos a temperaturas elevadas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA EMBALAR ESPOROS DE FUNGOS EM ATMOSFERA MODIFICADA VISANDO AO AUMENTO DA VIDA-DE-PRATELEIRA DE FUNGOS "
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a métodos de embalagem de esporos de fungos, tais como os fungos entomopatogênicos dos géneros Beau- vería, Isaria, Lecanicillium, Nomuraea, Metarhizium e Tríchoderma, para aumento da vida-de-prateleira.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Pesticidas biológicos são uma alternativa aos obtidos sinteticamente, por não serem tóxicos aos seres humanos. Entre eles estão aqueles produzidos a partir de fungos entomopatogênicos, cujos esporos são desidratados, para que se mantenham viáveis por períodos prolongados (Moore et al. Effects of moisture content and temperature on storage of Me- tarhizium flavoride conidia. Biocontrol Science and Technology, v.6, p. 51- 61.)· desidratação também faz com que os esporos sobrevivam em ambientes extremos caracterizados por calor seco, congelamento e descongelamento, bem como meio ácido.
Há mais de um século que pesquisas demonstraram a interação entre fungos e pragas agrícolas. Tal interação favorece o desenvolvimento das plantas cultivadas por meio da eliminação de seus patógenos, insetos- praga e plantas daninhas. Estas constatações estimularam o emprego de micopesticidas para o controle de pragas agrícolas. A produção destes bio- pesticidas tem aumentado e, entre as causas desse aumento, estão a exi- gência de consumidores por alimentos mais saudáveis, alimentos com menos resíduos tóxicos, maior conscientização de profissionais do setor agro- pecuário quanto ao uso de agrotóxicos, legislação cada vez mais restritiva aos pesticidas químicos e necessidade do uso de produtos alternativos em programas de manejo de resistência aos químicos.
Fungos empregados no controle biológico de pragas e que são u- tilizados como pesticidas são expostos a temperaturas elevadas, chegando a atingir 50°C ou mais durante o transporte ou no armazenamento. Este fa- tor ambiental afeta a viabilidade de esporos de fungos sensíveis a elevações de temperatura, tais como Metarhizium, Beauveria, Lecanicillium e Tricho- derma. Os estudos realizados até o momento voltaram-se, sobretudo, para o armazenamento destes fungos sob condições refrigeradas ou temperaturas ambientais inferiores a, aproximadamente, 30°C. Micopesticidas experimentam rápida queda na viabilidade durante o armazenamento sem refrigeração e isto compromete a aceitação do produto no mercado, ocasionando ainda resultados indesejáveis no controle das pragas-alvo.
O estudo de Marques e Alves (Marques, E. J., Alves, S.B. Otimi- zação de formulações na preservação de esporos de Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. e Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorok. em diferentes condições de armazenamento. Arquivos de Biologia e Tecnologia, v. 39, p. 861- 877, 1996) demonstrou que a viabilidade de esporos com teor de umidade de 15,5% armazenados a 30°C pode ser bastante reduzida em menos de 30 dias.
O estudo de Sandhu et al. (Sandhu, S.S., Rajak, R.C., Agarwal, G.P. Studies on prolonged storage of Beauveria bassiana conidia: effects of temperature and relative humidity on conidial viability and virulence against chikpea borer, Helicoverpa armigera. Biocontrol Science and Technology, v. 3, p.47-53, 1993) revelou que esporos de Beauveria bassiana preservam mais a viabilidade quanto menor a temperatura e a umidade relativa de equilíbrio adotadas durante o armazenamento.
Tem-se dado grande enfoque ao armazenamento de fungos en- tomopatogênicos e outras espécies em ambientes com temperatura baixa ou moderada ou em embalagens que permitem trocas entre as atmosferas interna e externa, que não se configuram como métodos adequados para o armazenamento em temperaturas superiores a 25°C
O documento US5989898 revela a utilização de embalagem impermeável e de absorvedores de umidade e de oxigénio para gerar atmosfe- ra com umidade relativa inferior a 10% e menos de 5% de oxigénio. Outra proposta desse documento é a eliminação do oxigénio através de embalagem a vácuo, ou ainda a aplicação de nitrogénio à embalagem com esporos. Os micro-organismos utilizados foram Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae para armazenamento a 25°C e a 37°C. O documento US5989898 utiliza agente tensoativo para reativar os esporos, diferindo da presente invenção, que possibilita armazenamentos em temperaturas superiores a 37°C, utilização de diferentes gases atóxicos (CO2, H2 e He) em substituição ao oxigénio, e adota a observância de um período de pré-incubação do produto embalado. É importante que micopesticidas devidamente embalados sejam expostos a condição adequada de temperatura antes de expostos às condições extremas, para que haja tempo de os teores de oxigénio e umida- de serem reduzidos para níveis adequados. O documento WO9718294 revela a extensão de duas a seis vezes a vida-de-prateleira de esporos de fungos ou de bactérias mediante redução do teor de oxigénio, associado ou não a métodos de redução da umidade. Entretanto, a temperatura máxima de armazenamento avaliada foi de 30°C, e após apenas 70 dias de armazena- mento a viabilidade inicial já havia sido reduzida em 85% ou mais no tratamento com o emprego de sachê absorvedor de O2 ou no tratamento com emprego de nitrogénio. Já a presente invenção permite a manutenção da viabilidade de esporos de fungos armazenados a temperaturas superiores, por exemplo, de 40°C, durante o período de três a seis meses.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Constitui objeto da presente invenção prover um método para embalar esporos de fungos, de modo a aumentar a sua vida-de-prateleira. O método compreende as etapas de: i) redução do teor inicial de umidade dos esporos para uma faixa de atividade de água viável aos organismos; ii) colo- cação dos esporos em embalagens impermeáveis a gases e vapor d'água com pelo menos um agente absorvedor de oxigénio e de umidade; iii) manutenção dos esporos na embalagem durante, no mínimo, dois dias entre 15 e 25°C, preferencialmente a 25°C ou em outra temperatura viável aos organismos antes da exposição a temperaturas elevadas.
Uma segunda concretização da invenção consiste em prover esporos dos géneros Beauveria, Isaria, Lecanicillium, Nomuraea, Metarhizium e Trichoderma com vida-de-prateleira aumentada. Em outra concretização obtém-se uma embalagem selada compreendendo em seu interior: (i) esporos viáveis de fungos; e (ii) um ambiente com teor de umidade e oxigénio reduzidos pelo uso de sachês e com um período de incubação em uma temperatura adequada em embalagens im- permeáveis a gases e vapor d'água.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1 : Efeito de diferentes gases na viabilidade conidial de Be- auveria bassiana após armazenamento a 50 °C por 60 dias. A viabilidade foi avaliada por meio de dois protocolos de germinação (rehidratação rápida vs. rehidratação lenta).
Figura 2: Viabilidade de conídios de Beauveria bassiana após in- jeção de 20% CO2 (+80% N2) e armazenamento a 25, 40, ou 50 °C.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a um método de armazenamento para aumento da vida-de-prateleira de fungos sob condições não- refrigeradas, sobretudo temperatura superior ou igual a 37°C. Por meio desta metodologia os esporos permanecem viáveis mesmo quando submetidos a elevadas temperaturas ambientais.
Na descrição que segue, alguns termos são utilizados extensiva- mente. As seguintes definições são providas para facilitar o entendimento da invenção.
O termo "embalagem em atmosfera modificada" é aqui definido como o processo de embalagem onde o material no interior da referida embalagem é exposto a gases com composição distinta do ar atmosférico, po- dendo incluir técnicas como a injeção de determinado gás ou mistura de gases no interior da embalagem ou o uso de elementos cujos componentes reagem com componentes da embalagem. Estes elementos, podem ser mas não estão limitados a sachês absorvedores, emissores de gases, ou absorvedores de vapor d'água.
O termo "viabilidade" refere-se ao percentual de germinação de esporos medido por procedimento que emprega rehidratação rápida, por ser considerado um protocolo mais indicado para avaliação da qualidade conidi- al dos micopesticidas.
Considera-se "temperatura viável ao organismo" aquela que não causa a morte ou debilitação de conídios de determinada espécie. Na presente invenção a temperatura viável é preferencialmente em torno de 25°C.
Define-se "atividade de água" (aw) como a razão entre a pressão de vapor dágua de um material e a pressão de vapor da água pura, na mesma temperatura. É uma medida da água contida no material que está disponível para reações químicas e biológicas e, por isto, um parâmetro importante em estudos com micro-organismos.
Para os objetivos da presente invenção, "período de pré- incubação ou "período de equilíbrio" é o tempo de manutenção dos esporos na embalagem impermeável antes da exposição a elevadas temperaturas, tempo este necessário para redução da atividade de água para valores inferiores a 0,1 , preferencialmente entre 0,02 e 0,03.
O termo "vida-de-prateleira" é definido como o período de tempo em que um micopesticida pode ser armazenado em determinada condição de temperatura sem que ocorra considerável perda de atributos relacionados à sua eficiência. Para micopesticidas empacotados em embalagens não- herméticas, a umidade relativa de armazenamento deve ser igualmente con- siderada. Para efeito desta invenção, considera-se o período de 2 a 6 meses a mínima vida-de-prateleira desejável para inseticidas biológicos armazenados em temperaturas próximas a 40°C. A viabilidade é o atributo mais co- mumente utilizado por patologistas para referir-se à qualidade conidial e deve ser, preferencialmente, superior a 80%. Deste modo, estabeleceu-se co- mo a vida-de-prateleira para micoinseticidas o tempo necessário para que a viabilidade seja reduzida para 80% em uma determinada temperatura.
O método de extensão da vida-de-prateleira de esporos de fungos entomopatogênicos consiste nas seguintes etapas:
i) redução inicial do teor de umidade dos esporos para níveis muito baixos de atividade de água viável aos organismos;
ii) colocação dos esporos em embalagens impermeáveis a gases e vapor d'água com um agente absorvedor de oxigénio e um absorvedor de umidade, sendo que esses agentes preferencialmente estão na forma de sachês. Opcionalmente, pode-se utilizar um único sachê capaz de asborver tanto o oxigénio quanto a umidade.
iii) manutenção na embalagem durante no mínimo dias em uma temperatura amena antes da exposição a temperaturas elevadas.
A redução do teor inicial de umidade de esporos hidratados pode ser feita mediante secagem durante a etapa de colheita dos esporos. A produção de fungos normalmente se dá em substratos sólidos, como arroz cozido e similares. Imediatamente após o processo de produção do fungo o substrato colonizado pode ser acondicionado em sala com baixa umidade relativa, o que resulta na secagem dos conídios ou utilizando-se câmara contendo material desidratante, até que haja redução da atividade de água para valores baixos.
Tais valores baixos de atividade de água antes do envase são, preferencialmente, inferiores a 0,3. Esse material pode ser selecionado do grupo de, mas não sendo limitado a: sulfato de cálcio e sílica gel. Para esta redução do teor de umidade em câmara de secagem aguarda-se o período de dois dias ou mais a temperaturas amenas, de preferência entre 15 e 25°C, mais preferencialmente a cerca de 25°C, ou outra temperatura que não afete a viabilidade dos esporos, na qual a desidratação do fungo possa ocorrer sem debilitar as estruturas fúngicas.
A atividade de água dos organismos é reduzida significativamente após o envase, e assim mantida por meio do uso de embalagem impermeável a gases e vapor de água.
No processo de embalagem dos esporos, como meio de fornecer atmosfera adequada para a conservação dos mesmos, preferencialmente utilizam-se sachês contendo agentes absorvedores de umidade e de oxigénio. Esses sachês podem ter função única, ou seja, são individualmente absorvedores de oxigénio ou absorvedores de umidade, ou tem função dupla quando um único sachê funciona como absorvedor de oxigénio e umidade. Os sachês devem gerar atmosfera atóxica aos esporos. Como absorvedores de umidade podem ser usados sulfato de cálcio ou sílica gel. Sachês úteis para a presente invenção podem ser selecionados dentre, mas não estão limitados a: RP-3A (absorvedor de oxigénio e umidade), Ageless® ZPT 1000 (absorvedor de oxigénio), OxyFree™ 504A (absorvedor de oxigénio e gás carbónico), OxyFree™ 504E (absorvedor de oxigénio e gerador de gás car- bônico) ou sulfato de cálcio anidro (absorvedor de umidade). As embalagens impermeáveis utilizadas no método da presente invenção podem ser, mas não estão limitadas a embalagens aluminizadas e de vidro.
O resultado do uso de sachês em embalagens é diferente, dependendo da atividade de água inicial dos esporos. Quando se utiliza so- mente sachê absorvedor de oxigénio, a elevada umidade dos esporos prejudica a conservação dos mesmos, reduzindo a viabilidade após exposição a condições de elevada temperatura. Devem ser utilizados absorvedores de umidade que não liberem vapor d'água quando expostos a temperaturas elevadas, tal como o Drierite™, composto de sulfato de cálcio anidro, que somente libera vapor d'água após exposição a temperaturas superiores a 177°C.
A atividade de água final do micopesticida e a composição atmosférica no interior da embalagem são fatores essenciais para a manutenção da viabilidade dos esporos até seu uso. A manutenção dos esporos na em- balagem impermeável antes da exposição a elevadas temperaturas consiste no que se denomina pré-incubação ou "período de equilíbrio", tempo necessário para redução da atividade de água final para valores inferiores a inferiores a 0,1 , preferencialmente entre 0,02 e 0,03. Para o fungo Beauveria bassiana, por exemplo, o período de equilíbrio é geralmente de dois dias, para pequenas quantidades de esporos, ou mais dependendo de fatores como o tamanho da embalagem, tipo de formulação, quantidade de micopesticida e quantidade e eficiência dos sachês absorvedores utilizados.
Os fungos que podem ser embalados e reativados de acordo com a presente invenção incluem, mas não estão limitados àqueles dos géneros Beauveria, Isaria, Lecanicillium, Nomuraea, Metarhizium e Trichoderma.
As embalagens impermeáveis em que esporos de fungos de a- cordo com a invenção são acondicionados podem ser, mas não se limitam a: vidro, materiais laminados contendo alumínio ou cerâmica ou outros materiais impermeáveis a gases e vapor d'água.
Os exemplos abaixo são colocados de forma a ilustrar e elucidar melhor a invenção e não podem ser tidos como forma de limitar a presente invenção.
EXEMPLOS
Exemplo 1 : INJEÇÃO DE DIFERENTES GASES EM EMBALAGEM DE VIDRO
Amostras de esporos de Beauveria bassiana (0,6 g) foram manti- das em frascos herméticos de vidro de 125 mL (Ball®, Jarden Corp., Muncie, IN, USA) fechados com tampas metálicas contendo septos de borracha. Em cada frasco de vidro foram injetados durante 40 minutos à taxa de 40 mL.min"1 dióxido de carbono puro, nitrogénio, hélio ou hidrogénio, bem como 100% ou 21 % de oxigénio, equilibrados com N2 (Airgas East, Inc., Salem, NH, USA). Nos frascos onde não se injetou O2 mediu-se a concentração deste gás seguindo-se a injeção para assegurar que o ambiente estivesse com concentrações não detectáveis de O2. Amostras de gás (500 L) foram extraídas de cada frasco com uma seringa hermética (modelo 1750, Hamilton Company, Reno, NV, USA) e injetadas em um cromatógrafo a gás (Vari- an Aerograph, Walnut Creek, CA, USA) equipado com um detector de condutividade térmica. As alturas dos picos foram comparadas com um padrão comercial contendo 6,96 % de O2 e 4,91 % de CO2, equilibrados com N2. Cada tratamento consistindo na exposição a gás foi repetido três ou quatro vezes. Para se minimizar as trocas gasosas (entrada de O2) durante o arma- zenamento, os frascos de vidro de 125 mL foram mantidos em contentores herméticos maiores Ball® jar (0,95 L) contendo a mesma mistura de gases. Utilizando-se este arranjo, os frascos de vidro foram incubados a 50°C por 60 dias. As temperaturas foram monitoradas continuamente com dois data loggers digitais (Hobo®, Onset Computer Corp., Bourne, MA, USA) por incu- badora. Após este armazenamento, a concentração de O2 em cada frasco foi novamente determinada como indicativo da hermeticidade do sistema. A atividade de água dos esporos foi medida a 25°C com um medidor de ativi- dade de água (LabMaster-a^, Novasina, Pfãffikon, Switzerland) e determi- nou-se a germinação. A viabilidade foi determinada diretamente suspenden- do-se os conídios em pó na solução água-surfactante e dispondo este material sobre o meio extrato de levedura ágar-benomila (yeast extract A- gar/benomyl médium - YEA). As soluções (água-surfactante) foram equilibradas com a temperatura ambiente. Após a execução de cada protocolo de reidratação, os blocos de ágar inoculados (sobre lâminas de vidro) foram incubados em placas de Petri parafinadas a 25°C no escuro e as contagens de germinação foram realizadas 24 após a inoculação (p.i.). Considerou-se que os conídios haviam germinado quando um tubo de germe de qualquer tamanho fosse visível em aumento de 400X com iluminação de contraste de fase. No mínimo 200 conídios foram examinados em vários campos microscópicos para cada replicata de suspensão de cada tratamento experimental.
O experimento foi repetido em uma data diferente, sem o trata- mento com 21% de O2. Os frascos injetados com gases exceto O2 em que ocorreu considerável troca gasosa (teor final de O2 f> 3,5%) foram descartados. Os dados foram transformados em raiz quadrada do arco-seno e analisados utilizando análise de variância com um fator. As médias foram comparadas pelo teste Tukey-Kramer HSD ou teste-t e considerados estatistica- mente diferentes no nível de significância de 5%. Os dados foram analisados utilizando o pacote estatístico JMP (SAS Institute Inc, Cary, NC, USA).
Vê-se na Figura 1 que a atividade de água final para os esporos no primeiro ensaio não variaram com o tratamento de gás (P= 0,4150, F 5,13 =
1 ,1); a média global de atividade de água foi 0,099±0,0248. Diferenças signi- ficativas de germinação foram observadas após 60 dias a 50°C (P< 0,0001 , F = 122,0) e enquanto a exposição a N2, CO2, H2 e He produziu viabilida-
5,13
des equivalentes na faixa de 40-51 %, taxas de germinação muito baixas ou mesmo a ausência de esporos viáveis foram registradas a 21% e 100% de
O2, respectivamente.
Como no primeiro ensaio, os tratamentos não produziram diferenças significativas na atividade de água final dos esporos (P = 0,29, F =
1 ,4); atividade de água média de 0,119±0, 0021 entre os tratamentos. Injeção de 100% de O2 resultou novamente em nenhum sobrevivente (21 % de O2 não foi testado) O armazenamento com todos os outros gases resultou em viabilidade superior ao tratamento com O2 porém baixa, equivalente (faixa de
10-13%) (Fig. 1 B). Estas taxas de germinação foram marcadamente meno- res do que a faixa de 49-51 % observada no primeiro ensaio, em função da menor atividade de água dos esporos no primeiro experimento. À exceção dos frascos injetados com 02, as concentrações de O2 residual (1 ,6%-1 ,9%) não diferiram entre os frascos injetados com gases (P= 0,73, F2 g= 0,3).
Exemplo 2: INJEÇÃO DE CO2 E N2 PARA ARMAZENAMENTO DE ESPOROS EM DIFERENTES TEMPERATURAS
Utilizando-se o mesmo arranjo descrito no item anterior, as amostras de esporos foram injetadas com 20% de CO2 e 80% de N2. Testaram-se quatro amostras para cada tratamento quanto ao O2 residual e atividade de água final após o armazenamento durante 45, 91 , 180 e 240 dias a 40°C. O experimento foi repetido em uma data diferente. Além disso, realizaram-se experimentos separadamente para se investigar os efeitos de armazenamento a 25°C (avaliações aos 46, 120, 180, 365 e 480 dias pós- armazenamento) e 50°C (avaliações aos 15, 30, 47, 75 e 90 dias pós- armazenamento). Em todos os casos, a viabilidade também foi determinada no "dia zero", ou seja, imediatamente antes do armazenamento em incubadoras a diferentes temperaturas. Diferentes frascos foram amostrados em uma única data de avaliação e, portanto, este estudo não utilizou delineamento com medidas repetidas.
Os dados foram transformados em raiz quadrada do arco-seno e analisados utilizando uma análise de variância com um fator. As médias foram comparadas pelo teste Tukey-Kramer HSD ou teste-t e considerados estatisticamente diferentes no nível de significância de 5%. Os dados foram analisados utilizando o pacote estatístico JMP (SAS Institute Inc, Cary, NC, USA).
No experimento de armazenamento a 25°C observou-se uma significante queda na viabilidade (P= 0,0002, F = 8,8), mas o decréscimo foi
5,18
gradual e pequeno, sendo a viabilidade superior a 90% aos 365 dias, e de 87% aos 480 dias pós-armazenamento, conforme visto na Figura 2. A atividade de água dos esporos aumentou de 0,104 aos 46 dias pós- armazenamento para 0,204 ao final do experimento (P< 0,0001 , F ¾= 36,3) e a concentração média de 02 residual passou de 0,5% a 12,4% (P< 0,0001 , F4 15= 38,0).
No experimento a 40°C, registrou-se perda de viabilidade estatisticamente significante durante os primeiros 3 meses de armazenamento, mas a diminuição foi de somente 6 pontos percentuais (de 93 para 87%).
Isto foi seguido por um rápido declínio até 4% de viabilidade aos 240 dias pós-armazenamento (ANOVA P < 0,0001 , F = 361 ,7). Durante o intervalo
4,34
entre 45 e 240 dias, a concentração média de O2 residual aumentou de 1 ,2% para 6,6% (P = 0,0002, F = 9,4) e a atividade de água aumentou de 0,104
3,28
para 0, 145 (P < 0,0001 , F3 2?= 35,4).
A 50°C, a viabilidade inicial diminuiu rapidamente de 96 para 81 % nos primeiros 15 dias, e para cerca de 10% aos 90 dias pós-armazenamento (P < 0,0001 , F = 129,1). O O2 residual aumentou de 0,8% aos 15 dias para
6,21
3,2% aos 90 dias pós-armazenamento (P= 0,0074, F = 4,5), enquanto a
5,18
atividade de água dos esporos não mudou significativamente durante este período (de 0,104 aos 15 dias para 0,098 aos 90 dias; P= 0,3448, F = 1 ,2).
5,18 Exemplo 3: INJEÇÃO DE GÁS E EMPREGO DE EMBALAGEM
ATIVA (EA)
Esporos de Beauveria bassiana foram desidratados com NaOH em frascos de vidro de 125 ml_ por 1 dia a 25°C, resultando em 0,083±0,001 de atividade de água. Várias amostras selecionadas aleatoriamente foram transferidas para frascos de vidro e receberam injeção de N2. A perda de O2 foi reduzida utilizando um sistema de envase duplo com recipientes de vidro. As demais amostras (0,6 g) foram submetidas a um dos três tratamentos de EA compreendendo: i) bolsas de alumínio (8 x 8,5 cm) com um sachê RP-3A absorvedor de O2 e umidade; ii) um filme absorvedor de O2 (código M-0034, lote 19208A, 88.9x63.5x0.3 mm; CSP Technologies, Auburn, AL, USA) mais um filme absorvedor de umidade (CSP Technologies, código M-0026, lote 02208A, 63.5x38.1x0.6 mm) ou; iii) um filme com dupla ação absorvedor de O2 e umidade (CSP Technologies, código M-0033, lote 10808A, 76.2x76.2x0.6 mm). Para controle, esporos foram mantidos em bolsas de polietileno de 30 mm de espessura (código P827-2.1.2; Empac Agroindustri- al de Plásticos Ltda, Brasília, Brazil) com um sachê RP-3A.
Após o preparo, todas as embalagens com esporos foram pré- incubadas a 25°C por 5 dias e, em seguida, transferidas para 50°C. O O2 residual dos frascos de vidro injetados com N2 foi verificado imediatamente antes da incubação à temperatura elevada. Para todos os tratamentos, três embalagens foram empregadas para determinação destrutiva de atividade de água e da viabilidade dos esporos imediatamente antes da transferência para 50°C. Os esporos foram incubados a 50°C por 56 ou 129 dias. Após o armazenamento, mediu-se a atividade de água e avaliou-se a viabilidade conidial. Para cada tratamento e data, quatro embalagens preparadas independentemente foram avaliadas destrutivamente e, portanto, não foi adotado delineamento com medidas repetidas.
Exemplo 4: SACHES PARA ATMOSFERA MODIFICADA Amostras de esporos de Beauveria bassiana foram armazenados em frascos de vidro de 125 ml_ com o dessecante sulfato de cálcio (Drieri- te™indicador de 8-mesh, W.A. Hammond Drierite Co., Xênia, OH, USA) por dois dias a 25°C. A atividade de água dos esporos antes do envase foi de 0,019±0, 0005. Em outro tratamento os esporos foram mantidos sobre solução saturada de NaCI por 2 dias a 25°C, que resultou em atividade de água de 0,738±0,0007 antes do envase. As amostras foram então transferidas para bolsas laminadas (10x12 cm) contendo um dos seguintes sachês para modificação da atmosfera: absorvedor de O2 e umidade RP-3A, absorvedor de O2 Ageless® ZPT 1000 (Mitsubishi Gas Chemical Co., Japan), absorvedor de O2 e CO2 OxyFree™ 504A (Tianhua Tech, China), absorvedor de O2 e gerador de CO2 OxyFree™ 504E (Tianhua Tech, China), ou absorvedor de umidade à base de Drierite™ (56,7 g). Como controle foram utilizadas bolsas laminadas sem sachê. As bolsas foram incubadas a 50°C sem o período de pré-incubação, quantificando-se a atividade de água dos esporos e realizou- se a contagem de germinação após 45 dias. Cada tratamento (tipo de sachê vs. atividade de água inicial) foi repetido quatro vezes.
TABELA 1. Germinação (%) de esporos de Beauveria bassiana determinada após armazenamento por 45 dias a 50°C em bolsas contendo sachês absorvedores e/ou geradores de gases e vapor d'água.
Sachê Elevada aw inicial
Baixa aw inicial (0,019) (0,738)
Aw final % Aw final %
Ageless 0,807± 0,0% c 0,819± 0,0% c
(absorvedor de 02) 0.0012 a 0.0015 a
Drierite™ (absorvedor 0,022± 5,2±0,7% b 0,023+ 7,3%±1 ,3% b de umidade) 0,0003 de 0,0007 e
RP-3A 0.019± 79,0±1 ,3% 0,020± 72,8%±3,2%
(absorvedor de 0,0003 e a 0,0003 e a 02/umidade)
504 A 0,704± 0,0% c 0,729± 0,0% c
(absorvedor de 02 e 0,0003 c 0,0009 c
C02)
504 E (absorvedor de 02 0,761± 0,0% c 0,798± 0,0% c e gerador de C02) 0,0035 b 0,0024 b
Sem sachê (controle) 0,027± 3,8±0,4% b 0,709± 0,0% c
0,0003 d 0,0012 d
1Em cada coluna, médias (±EP) seguidas da mesma letra não são estatisticamente diferentes (Tukey HSD; a= 0,05). Germinação determinada através do protocolo de rehidratação rápida.
O uso de vários sachês de atmosfera modificada resultou em diferenças altamente significativas na viabilidade dos esporos, tanto para os de baixa (P< 0,0001 , F = 1631 ,4) quanto os de elevada atividade de água inicial (P< 0,0001 , F = 522,4) (Tab. 1). Conforme esperado, consideran- do-se as capacidades de absorção dos diferentes sachês, a atividade de água final dos esporos nos tratamentos com baixa ou alta atividade de água inicial também foram marcadamente diferentes. O uso de sachês que libe- ram umidade durante o armazenamento (Ageless, 504A e 504E) ou que absorveram umidade mas não 02 (Drierite™) resultou em menor viabilidade quando comparados com o uso de absorvedor de dupla ação, absorvedor de O2 e umidade (RP-3A).
Exemplo 5: COMBINAÇÃO DE SACHÊS DE ATMOSFERA MODIFICADA PARA A EXTENSÃO DA VIDA-DE-PRATELEIRA
Amostras de esporos de Beauveria bassiana foram secas com Drierite™por 2 dias a 25°C (resultando em atividade de água de 0,020±0,0008) e então transferidas para bolsas laminadas de 16x20 cm com diferentes sachês: RP-5A para absorção de O2 e umidade (mesma composição do RP-3A, mas indicado para embalagens maiores), 504E para absorção de O2 e geração de CO2 ou um sachê 504E mais um sachê de Drierite™ (56,7 g). Cada tratamento foi repetido três vezes e determinou-se a atividade de água dos esporos bem como a germinação após 148 e 180 dias pós- armazenamento a 40°C.
O sachê que absorve O2, mas libera umidade (504E) foi eficiente quando testado em conjunto com um dessecante (Drierite™), mas o uso iso- lado do sachê 504E resultou em perda total da viabilidade (Tab. 2). A estratégia de uso consorciado de sachês foi tão boa quanto o uso do sachê de dupla ação (RP-5A), tanto aos 148 dias (P< 0,0001 , F = 309,0) quanto aos
2,6
78 dias pós-armazenamento a 40°C (P< 0,0001 , F = 2,035).
2,6
TABELA 2. Efeito de um absorvedor de O2 e gerador de CO2, com ou sem sachê dessecante, sobre a atividade de água e a viabilidade de esporos de Beauveria bassiana armazenados a 40°C durante 5 ou 6 meses.
Dia 148 Dia 178
Sachê Aw final1 % Aw final1 %
504 E (absorvedor de 0,793± 0,0% b 0,809± 0,0% b
O2 e gerador de CO2) 0,0038 a 0,0168 a
504E + Drierite™ (ab0,030± 81 ,0±4,5% a 0,030± 79,3±1 ,9% a sorvedor de umidade) 0,0003 b 0,0003 b
RP-5A (absorvedor de 0,026± 83,5±2,2% a 0,028± 81 ,8±0,4% a
O2/umidade) 0,0000 b 0,0003 b inicial foi de 0,020±0,0008, e esporos não foram pré- incubados em temperatura moderada antes de exposição a 40 °C.
2Em cada coluna, médias (±EP) seguidas da mesma letra não são estatisticamente diferentes (Tukey HSD; a= 0,05). Germinação determinada por meio do protocolo de rehidratação rápida.
Exemplo 6: EFEITO DO PERÍODO DE EQUILÍBRIO SOBRE A VIDA-DE-PRATELEIRA
Os esporos puros de Beauveria bassiana tiveram a sua atividade de água equilibrada no interior da embalagem antes de serem expostos a regimes de temperatura elevada. As amostras de Beauveria bassiana foram mantidas em Drierite™ou NaCI por 2 dias a 25°C, resultando em atividade de água de 0,020±0,0008 e 0,740±0,0018, respectivamente. Então, os espo- ros foram transferidos para bolsas laminadas cada uma contendo um sachê RP-3A (absorvedor de O2 e umidade) e pré-incubados por um período adicional de 5 dias a 25°C antes de serem armazenados nas temperaturas-alvo (25, 40 e 50°C). De maneira alternativa, amostras foram mantidas em Drieri- te™ou NaCI por 7 dias a 25°C, transferidas para bolsas laminadas contendo saches RP-3A e imediatamente armazenadas nas temperaturas-alvo sem o período de equilíbrio de 5 dias a 25°C. Cada tratamento foi repetido quatro vezes e medições da atividade de água e da viabilidade foram realizadas aos 60 dias a 50°C e 180 dias a 25 ou 40°C.
A atividade de água final dos esporos não variou entre os trata- mentos em cada temperatura de armazenamento (Tab. 3). Percentagens de germinação após 180 dias a 25°C foram elevadas (91-94%) para todos os tratamentos, exceto para o tratamento com alta atividade de água inicial e sem o período de equilíbrio, que teve sua viabilidade reduzida para 88%.
Após 180 dias a 40°C, a viabilidade foi de 87-89% para a maioria dos trata- mentos mas significativamente menor (75%) no tratamento com elevada atividade de água inicial e sem o período de equilíbrio (P= 0,0068, F = 8,7).
3,8
Finalmente, após 60 dias a 50°C observou-se a mesma tendência, com as viabilidades para quase todos os tratamentos na faixa de 83-86%, exceto para o tratamento de alta atividade de água inicial e sem o período de equilí- brio, que teve sua viabilidade significativamente reduzida para 60% (P< 0,0001 , F = 37,8).
ó,o
As vidas-de-prateleira observadas no presente estudo são consi- deravelmente superiores às obtidas anteriormente. Atmosferas modificadas após a injeção de outros gases que não 02 (CO2, N2, H2 e He) resultaram em viabilidades comparáveis após 2 meses de armazenamento a 50°C. Quando se testou uma atmosfera com 20 % de CO2 (+ 80% N2) em frascos, os tempos para a viabilidade dos esporos cair para 80% foram superiores a 91 e a 15 dias à temperatura de 40 e 50°C, respectivamente. Esses tempos são similares para as estimativas obtidas a partir dos dados publicados por Hong et al. (2001) (Hong, T.D., et al.. The effect of storage environment on the longevity of conidia of Beauveria bassiana. Mycological Research v. 105, p. 597-602, 2001 ), sugerindo que os esporos desidratados a até 5% de u- midade e armazenados com ar atmosférico em embalagens hermeticamente fechadas retiveram 80% da viabilidade por 80 e 17 dias a 40 e 50°C, respectivamente. Estas foram, até então, as vidas-de-prateleira mais longas já registradas para esta espécie de fungo em temperaturas elevadas. Entretanto, quando se utilizou a embalagem ativa (com sachês que absorvem tanto 02 quanto umidade em embalagens herméticas) e introduzi-use um período de equilíbrio, a viabilidade atingiu valores inéditos, variando de 80 e 90% após 6 meses a 40°C, ou 2 meses a 50°C.
TABELA 3. Efeito de atividade de água inicial e do período de equilíbrio (pré-incubação) sobre a germinação de esporos de Beauveria bassiana armazenados em bolsas laminadas contendo sachê absorvedor de 02 e umidade.
180 dias a 25 °C 180 dias a 40 °C 60 dias a 50 °C
Condição Aw final % Aw final % Aw final 2 %
2 2
Aw inicial baixa 0,029± 93,2±0,4 0,028± 87,8± 0,022± 84,8±
/ pré- 0,0000 a % ab 0,0003 a 0,9% a 0,0000 3,5% a incubação
Aw inicial baixa 0,029+ 94,0±1 ,1 0,028± 88,8± 0,022± 86, 3±
/ sem pré- 0,0003 a % a 0,0003 a 0,8% a 0,0000 3,8% a incubação
Aw inicial alta 0,029± 91 ,0±1 ,3 0,028± 88,0± 0,021± 82,5±
/ pré- 0,0000 a % ab 0,0000 a 2,6% a 0,0000 1 ,0% a incubação 180 dias a 25 °C 180 dias a 40 °C 60 dias a 50 °C
Condição Aw final % Aw final % Aw final 2 %
2 2
Aw inicial alta 0,029± 88,3±0,4 0,028± 75,3+2, 0,021± 60,0±3,
/ sem pré- 0,0003 a % b 0,0003 a 2% b 0,0000 0% b incubação
1Em cada coluna, médias (±EP) seguidas da mesma letra não são estatisticamente diferentes (Tukey HSD; a= 0,05). Germinação determinada através do protocolo de rehidratação rápida.
2AW inicial baixa e alta foram 0,020±0,0008 e 0,740±0,0018, res- pectivamente.
Exemplo 7: EFEITO DA ETAPA DE DESIDRATAÇÃO (ANTES DO EMPACOAMENTO) SOBRE A VIDA-DE-PRATELEIRA
Pode-se verificar da Tabela 4 que o período de equilíbrio de 7 dias a 25 °C foi adotado para todos os tratamentos. Porém, no experimento 1 , verificou-se que a mera utilização do sachê RP-3A (que absorve vapor d'água e oxigénio no interior da embalagem) não é suficiente para garantir níveis de germinação elevados. No tratamento "Hidratação + RP-3A" a etapa de pré-secagem da amostra antes do empacotamento não foi adotada e, mesmo com a redução da atividade de água para 0,050 ao final do perído de equilíbrio (e de 0,020 ao final de 16 meses de armazenamento), o resultado final foi inferior ao do tratamento anterior, onde a atividade de água ao final do período de equilíbrio e durante todo o período de armazenamento a 40°C manteve-se abaixo de 0,1 , e dentro da faixa ideal de 0,02 a 0,03.. No experimento 2, os dois tratamentos seguiram as etapas recomendadas (pré- secagem, adoção de sachê(s) para absorção de umidade e oxigénio, observância do período de equilíbrio para remoção do oxigénio e redução da atividade de água para níveis próximos a 0,03 antes da exposição a temperaturas elevadas) e, portanto, os resultados obtidos foram satisfatórios. No primeiro experimento do tratamento 2 utilizou-se um sachê com dupla função (absorção de umidade e oxigénio), ao passo que no segundo adotou-se um sachê para cada função. É importante destacar que os processos e métodos conhecidos do estado da técnica nunca foram capazes de prover uma viabilidade (percentagem de germinação) do fungo Beauveria bassiana da ordem de 70% após 16 meses de armazenamento dos conídios a 40 °C.
TABELA 4: Efeito da atividade de água (aw) na viabilidade de Be- auveria bassiana conidia armazenada a 40 °C por 16 meses.
Dia 0b
16 meses
Percen- Percentual de
Tratamento aw Inicial tua' de aw Final Germinação
Germinação
Experimento 1
Desidratação pré 0.026± 92.5± 0.020± 71.0±1.51 a via + RP-3A (ab- 0.000 1.76 a 0.000
sorvedor de
02/H2O)a
Hidratação prévia + 0.050± 89.3± 0.020± 52.7±5.02 b
RP-3A 0.001 1.59 a 0.000
Experimento 2
Desidratação pré- 0.025± 95.5± 0.020± 71.4±0.92 a via + RP-3Aa 0.000 1.09 a 0.000
Desidratação pré- 0.032± 95.2± 0.024± 70.6±1.16 a via + 504E + drieri- 0.001 0.14 a 0.000
te a aTratamentos com etapas recomendas na presente invenção. No tratamento "Hidratação + RP-3A", a inobservância da primeira etapa (desidratação da atividade de água dos esporos antes do empacotamento para níveis inferiores a 0,3) resultou em atividadede água ao final do período de equilíbrio superior ao limite ótimo (0,02 a 0,03), levando a percentagens de germinação inferiores ao do tratamento anterior, onde todas as etapas re- comendadas na patente foram observadas.
bDados coletados imediatamente antes da estocagem a alta temperatura seguindo um período de equilíbrio inicial de 7 dias a 25°C.
Exemplo 8: EFEITO DO EMPACOTAMENTO ATIVO NA VIDA- DE-PRATELEIRA DO FUNGO Metarhizium anisopliae A 40°C
Em experimentos onde o período de equilíbrio (8 dias a 25°C) foi observado para esporos do fungo Metarhizium aniopliae (Tabela 5), a utilização do sache RP-3K (absorvedor de oxigénio, mas que libera vapor d'água), não foi suficiente para prover resultados satisfatórios. Utilizado isoladamen- te, a liberação de vapor d'água eleva a atividade de água dos esporos para valores muito elevados e, consequentemente, a vida-de-prateleira é drasticamente reduzida. Por outro lado, o tratamento com o sachê RP-3A que, além de absorver oxigénio também absorve o vapor d'água no interior das embalagens, manteve a atividade de água dos esporos dentro de valores étimos, contribuindo para elevadas percentagens de germinação após 2 semanas de armazenamento a 40°C.
Os dados da Tabela 6 demonstram que o método da presente invenção permitiu alcançar uma viabilidade (percentagem de germinação) da ordem de 70% para o fungo Metarhizium anisopliae após mais de 5 meses de armazenamento a 40°C, o que nunca havia sido possível para esta espécie através dos métodos convencionais conhecidos. De maneira geral, a viabilidade mínima aceitável para produtos comerciais (micopesticidas) é da ordem de 80%. Baseado em extrapolação dos dados obtidos acima, este percentual teria sido alcançado através do método da presente invenção após 4 meses de armazenamento a 40 °C. Estes valores são significativamente superiores àquele relatado, por exemplo, na U.S. patent 5,989,898 de Jin et al. (1999), na qual a viabilidade de aproximadamente 80% foi atingida após 2 meses de armazenamento a 37°C.
TABELA 5: Efeito da atividade de água (aw) ao final do período de equilíbrio na viabilidade de esporos de Metarhizium anisopliae armazenados a 40 °C por 2 semanas. Dia 0C
2 semanas
Percen¬
Tratamento aw Initual de Trataaw Inicial cial Germimento
nação
Dessecação + RP- 0.028± 80.0± 0.027± 78.9± 3A (absorvedor de 0.001 4.00 a 0.001 2.21 a
02/H2O)a
Dessecação + RP- 0.246± 79.3± 0.286± 26.9± 3K (absorvedor de 0.005 5.13 a 0.006 10.45 b 02) aTratamentos com etapas recomendas na presente invenção. bDados coletados imediatamente antes da estocagem a alta temperatura seguindo um período de equilíbrio inicial de 8 dias a 25°C.
TABELA 6: Percentagem de germinação de esporos após armazenagem de Metarhizium anisopliae a 40 °C por 5,4 meses.
Dia 0b
16 meses
Percentual
Tratamento aw Inicial de aw Inicial
Germinato
ção
RP-3A (absorvedor 0.037± 94.5± 0.021± 68.3± de 02/H2O)a 0.001 1.73 0.001 3.32 aTratamentos com etapas recomendas na presente invenção. bDados coletados imediatamente antes da estocagem a alta temperatura seguindo um período de equilíbrio inicial de 5 dias a 25°C.
Observou-se nos estudos do estado da técnica aqui relatados que atmosferas em que o ar foi substituído por C02 e N2 aumentaram a longevidade de esporos de Beauvería bassiana. As tentativas anteriores de estender a vida-de-prateleira desta espécie foram conduzidas na presença de ar, apesar dos efeitos benéficos da retirada de 02 (ou aumento da concentração de C02) durante a vida-de-prateleira de curto prazo do fungo Metarhizium anisopliae ter sido demonstrado há décadas por Clerk e Madelin (1965) (Clerk, C.G.; Madelin, M.F. The longevity of conidia of three insect- parasitizing hyphomycetes. Transactions of the British Mycological Society 48, 193-209, 1965). A patente US5989898 revela que esporos de Metartiizi- um desidratados com Drierite™e armazenados em atmosferas supostamente sem 02 obtidas pelo uso do sachê Ageless inseridos em bolsas impermeáveis a umidade e gás mostraram 74% de viabilidade após 2 meses a 37°C, e não apresentaram nenhuma viabilidade se mantidos em bolsas sem ab- sorvedor de 02 ou com umidade relativa do ar elevada, variando de 40 a 100%. Leite et al. (2002) (Leite, L.G., et al. Preservação de micélio de Bat- koa sp. e Fúria sp. (Entomophthorales) em combinação com dessecantes e redutores de oxigénio. Arquivos do Instituto Biológico 69, 117-122, 2002) preservaram micélios secos de Batkoa sp. e Fúria sp. durante 3 meses a 23 °C utilizando-se Ageless e sílica gel, mas não se conhecem estudos com- plementares sobre embalagem de fungos entomopatogênicos em atmosfera modificada.
Em embalagens não herméticas a disponibilidade de ar aos esporos é significativa (Hong, T.D., et al. Saturated salt solutions for humidity contrai and the survival of dry powder and oil formulations of Beauveria bassiana conidia. Journal of Invertebrate Pathology v. 89, p. 136-143, 2005) e, consequentemente, os resultados observados para longevidade dos esporos são desestimuladores. A presente invenção mostrou que a adoção de polímeros plásticos com alta permeabilidade a 02 e umidade são totalmente indesejáveis para embalagem de micopesticidas, mesmo se combinados com um eficiente sachê para embalagem ativa. A injeção de gás (por 40 min) em recipientes de vidro mostrou-se muito mais eficiente que o emprego de embalagens não-herméticas, porém menos eficiente que o emprego de laminados (+ sachês de embalagem ativa) para a extensão da vida-de-prateleira de esporos de Beauveria bassiana na presente tecnologia devido à presença de atividade de água maior do que a desejada após a injeção de gás, a trocas de ar com o ambiente externo e devido à incapacidade de os protocolos de injeção de gás utilizados em permitir maior retirada do O2 presente nas embalagens. O estudo de Teshler et al. (2007) (Teshler, M. P. et al. In- creased shelf life of a bioherbicide through combining modified atmosphere packaging and low temperatures. Biocontrol Science and Technology 17, 387-400, 2007). revelou que a concentração de O2 residual foi de 0,26% a- pós injeção de gás em embalagens laminadas. A atividade de água permaneceu em níveis baixos e constantes após o envase hermético com alumínio e o uso de um absorvedor de 02 e umidade eficiente. Em organismos ani- drobióticos, podem ocorrer reações enzimáticas isoladas que levam à produção de radicais livres e reações não-enzimáticas mediadas por estes radi- cais livres. Por exemplo, podem ocorrer reações de degradação de fosfolipí- dios, com acúmulo de seus subprodutos (ácidos graxos) nas membranas (McKersie, B.D. et al. Senaratna, T., Walker, M.A., Kendall, E.J. , Hethering- ton, P.R. Deterioration of membranes during aging in plants: Evidence for free radical mediation. In: L.D. Noodén, L.D., Leopold, A.C. (Eds.), Senes- cence and Aging in Plants. San Diego: Academic Press, , p. 442-464, 1988). No entanto, o envelhecimento sob condições atmosféricas isentas de 02 e extremamente secas é consideravelmente mais lento do que sob condições não herméticas.
A maioria dos sachês de embalagem ativa utilizados na indústria de alimentos testada não foi efetiva para estender a viabilidade de esporos de Beauveria bassiana, seja porque os níveis de atividade de água dos esporos aumentaram até níveis indesejáveis ou porque 02 não foi reduzido para níveis baixos. Um sachê com dupla ação, capaz de absorver 02 e umidade, foi mais eficiente que sachês que possuem somente um único atributo. Apesar de C02 ser conhecido por possuir atividade fungistática sobre alguns fungos em crescimento (Tabak and Cooke, 1968; Abellana et al., 2000), nenhum efeito deletério foi observado sobre esporos entomopatogênicos armazenados, o que sugere a possibilidade do uso de embalagem ativa mediante sachês absorvedores de O2 e emissores de C02.
A vida-de-prateleira de aproximadamente um ano foi registrada para o relativamente termotolerante M. acridum com umidade de 6,2% (mas o mesmo não foi alcançado para esporos com 7,0% de teor d'água) a 27- 32°C e armazenado sob vácuo (Hong et al., 1999), bem como para formulações oleosas de Beauveria bassiana a 25°C (Wraight et al, 2001). Na presente invenção chegou-se a 6 meses de vida-de-prateleira para esporos com 2,1-2,4% de umidade acondicionados em embalagem ativa, o que é tempo suficiente para distribuições em regiões com temperaturas médias efetivas próximas a 40°C. Os experimentos também foram realizados a 50°C. Temperaturas iguais ou superiores a esta podem ser atingidas em certas regiões (Hong, T.D., Ellis, R.H., Moore, D. Development of a model to predict the effect of temperature and moisture on fungai spore longevity. An- nals of Botany, v. 79, p. 121-128, 1997) ou durante o transporte (Ostrem and Godshall, 1979).
Além de fatores intrinsicamente relacionados ao armazenamento, fatores pré-armazenamento tais como a qualidade inicial dos propágulos de fungos, que por sua vez é influenciada pelas condições da cultura (Agosin, E. et al.. Effect of culture conditions on spore shelf life of the biocontrol agent Trichoderma harzianum. World Journal of Microbiology and Biotechnology v. 13, p. 225-232, 1997; Frey, S., Magan, N. Production of the fungai biocontrol agent Ulocladium atrum by submerged fermentation: accumulation of endo- genous reserves and shelf-life studies. Applied Microbiology and Biotechnol- ogy, v. 56, p. 372-377, 2001 ; Tarocco et al. Optimization of erythritol and gly- cerol accumulation in conidia of Beauveria bassiana by solid-state fermentation, using response surface methodology. Applied Microbiology and Biotechnology v.68, p. 481-488, 2005), processos de secagem e coleta (San- doval-Coronado, CF. et al. Drying and formulation of blastospores of Paeci- lomyces fumosoroseus (Hyphomycetes) produced in two different liquid media. World Journal of Microbiology and Biotechnology v. 17, p. 423-428, 2001 ; Bateman, R. Constraints and enabling technologies for mycopesticide development. Outlooks on Pest Management April, p. 64-69. 2004; Jackson, M.A., Payne A.R.,. Evaluation of the desiccation tolerance of blastospores of Paecilomyces fumosoroseus (Deuteromycotina: Hyphomycetes) using a lab- scale, air-drying chamber with controlled relative humidity. Biocontrol Science and Technology, v. 17, p. 709-719, 2007.) e formulação (Sandoval- Coronado, C.F., Luna-Olvera, HA, Arevalo-Nino, K., Jackson, M.A., Po- prawski, T.J., Galan-Wong, L.J.,. Drying and formulation of blastospores of Paecilomyces fumosoroseus (Hyphomycetes) produced in two different liquid media. World Journal of icrobiology and Biotechnology v. 17, p. 423-428, 2001 ; Batta, Y.A. Production and testing of novel formulations of the entomo- pathogenic fungus Metarhizium anisopliae (Metschinkoff) Sorokin (Deutero- mycotina: Hyphomycetes). Crop Protection, v. 22, p. 415-422, 2003; Friesen, T. J. et al. Effect of conditions and protectants on the survival of Penicillium bilaiae during storage. Biocontrol Science and Technology, v. 16, p. 89-98, 2006) têm profundo impacto sobre a longevidade. Esta invenção mostrou que é necessária a secagem de esporos embalados e submetidos a condições moderadas antes da exposição a regimes de alta temperatura para que a elevada atividade de água inicial atinja os níveis desejados e, assim, evitar a morte prematura ou debilitação dos esporos. Fatores pós-armazenamento, tais como o protocolo de germinação, embora não diretamente relacionados à vida-de-prateleira, podem resultar em viabilidades erróneas se não realizados de maneira apropriada. As vidas-de-prateleira apresentadas neste exemplo foram estimadas com ênfase em um protocolo de rehidratação rápida (sem prévia exposição dos esporos a um regime de rehidratação lenta dentro de uma câmara úmida por 24 h).
A atividade de água dos esporos pré-desidratados mantidos em bolsas herméticas com Drierite™ ou absorvedor de O2 e umidade estiveram consistentemente na faixa de 0,019-0,030 (umidade relativa de equilíbrio de 1 ,9-3,0%). Esta pequena variação foi observada entre as leituras realizadas no inverno (ar do laboratório mais frio e seco) e estações com maior temperatura e umidade relativa. A importância de desidratar os esporos aéreos de fungos para estender a vida-de-prateleira foi demonstrada previamente (Clerk, C.G.; Madelin, M.F. The longevity of conidia of three insect- parasitizing hyphomycetes. Transactions of the British Mycological Society 48, 193-209, 1965; Feng, M.G., Poprawski, T.J., Khachatourians, G.G. Production, formulation and application of the entomopathogenic fungus Beau- veria bassiana for insect control: current status. Biocontrol Science and Technology v. 4, p. 3-34, 1994; Shimizu, S.; Mitani, T. Effects of temperature on viability of conidia from Beauvería bassiana in oil formulations. Japanese Journal of Applied Entomology and Zoology v. 44, p.51-53, 2000). Nos estudos com armazenamento hermético em que o ar não foi retirado das emba- lagens (Hong, T.D., et al. Gunn, J.. The effect of storage environment on the longevity of conidia of Beauvería bassiana. Mycological Research 105, 597- 602, 2001) relataram que a longevidade de dois isolados de Beauvería bassiana não aumentou significativamente quando o conteúdo de umidade no armazenamento reduziu para valores abaixo da faixa de 4,6-5,2%, em equi- líbrio com umidade relativas de 1 1-14% a 20°C. Neste estudo, a melhor ati- vidade de água dos esporos foi consistentemente associada ao Drierite™, que tem conteúdo de umidade consideravelmente menor que 5%. Os resultados obtidos na presente invenção sugerem que sob condições praticamente anaeróbicas (< 0,03% O2) atividades de água ótimas para armazenamen- to são menores do que sob atmosferas aeróbicas.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Método para embalar esporos de fungos, caracterizado por compreender as etapas de: (i) redução da atividade de água inicial dos esporos para níveis inferiores a 0,3;
(ii) colocação dos esporos em uma embalagem impermeável a gases e vapor de água contendo um agente absorvedor de oxigénio e um agente absorvedor de umidade;
(iii) manutenção dos esporos na embalagem durante no mínimo dois dias a temperaturas entre 15 e 25°C.
2. Método de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por dito agente absorvedor de umídade ser selecionado dentre sulfato de cálcio ou sílica gel.
3. Método de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de os ditos agentes estarem na forma de um ou mais sachês atóxicos aos esporos.
4. Método de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato de a dita embalagem impermeável a gases e vapor de água ser selecio- nada do grupo consistindo de vidro, materiais laminados contendo alumínio ou cerâmica.
5. Método de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato de os valores de atividade de água finais, após a etapa (ii), serem inferiores a 0,1 , preferencialmente entre 0,02 e 0,03.
6. Método de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato de os ditos esporos serem selecionados do grupo de géneros Metarhizi- um, Beauvería, Isaria, Lecanicillium, Nomuraea e Trichoderma.
7. Esporos de fungos caracterizados pelo fato de ter vida-de- prateleira aumentada por um método tal como descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
8. Esporos de fungos de acordo com a reivindicação 7, caracteri- zados pelo fato de serem selecionados dos géneros Metarhizium, Beauvería,
Isaría, Lecanicillium, Nomuraea e Trichoderma.
9. Embalagem selada para armazenamento de fungos caracteri- zada pelo fato de ser impermeável a gases e vapor e por compreender em seu interior:
(i) esporos viáveis de fungos;
(ii) um ambiente interno no qual a umidade relativa, após a colocação dos esporos na embalagem, seja reduzido de tal forma que a ati- vidade de água dos esporos seja inferior a 0,1 após um período de no mínimo dois dias a temperaturas entre 15 e 25°C;
(iii) um agente absorvedor de oxigénio e um agente absorvedor de umidade.
10. Embalagem de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por dito agente absorvedor de umidade ser selecionado dentre sulfato de cálcio ou sílica gel.
1 1. Embalagem de acordo com uma das reivindicações 9 ou 10, caracterizada pelo fato de os ditos agentes estarem na forma de um ou mais sachês atóxicos aos esporos.
12. Embalagem de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de ser selecionada do grupo consistindo de vidro, materiais laminados contendo alumínio ou cerâmica.
13. Embalagem de acordo com a reivindicação 9 , caracterizada pelo fato de que os valores finais de atividade de água estão entre 0,02 e
0,03.
14. Embalagem de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que os ditos esporos são selecionados do grupo de géneros Metarhizium, Beauveria, Isaria, Lecanicillium, Nomuraea e Trichoderma.
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