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WO2012007581A1 - Verfahren zur anreicherung von bakterien, viren sowie zellen und zur nachfolgenden nukleinsäureisolierung - Google Patents

Verfahren zur anreicherung von bakterien, viren sowie zellen und zur nachfolgenden nukleinsäureisolierung Download PDF

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Publication number
WO2012007581A1
WO2012007581A1 PCT/EP2011/062161 EP2011062161W WO2012007581A1 WO 2012007581 A1 WO2012007581 A1 WO 2012007581A1 EP 2011062161 W EP2011062161 W EP 2011062161W WO 2012007581 A1 WO2012007581 A1 WO 2012007581A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
viruses
bacteria
nucleic acids
beads
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2011/062161
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Timo Hillebrand
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AJ Innuscreen GmbH
Original Assignee
AJ Innuscreen GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by AJ Innuscreen GmbH filed Critical AJ Innuscreen GmbH
Publication of WO2012007581A1 publication Critical patent/WO2012007581A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles

Definitions

  • the invention relates to a universal and greatly simplified method for combining accumulation of bacteria, viruses or cells from a sample and the subsequent isolation of the nucleic acid from these targets.
  • the method can be carried out manually or fully automated.
  • the isolation of DNA from cells and tissues is characterized in that the nucleic acid-containing starting materials under strongly denaturing and reducing conditions, partially using protein-degrading enzymes, digested and purified the exiting nucleic acid fractions via phenol / chloroform extraction steps and the nucleic acids are recovered from the aqueous phase by dialysis or ethanol precipitation (Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T., 1989, CSH, "Molecular Cloning").
  • This method has received a number of modifications to date and is currently used for different methods of extracting and purifying nucleic acids from different sources (Marko, MA, Chipperfield, R. and Birnboim, HG, 1982, Anal. Biochem. , 121, 382-387).
  • kits are based on the well-known principle of binding of nucleic acids to mineral carriers in the presence of solutions of different chaotropic salts and use as support materials suspensions finely ground glass powder (eg Glasmilk, BIO 101, La Jolla, CA), Diatom enerden (Sigma) or silica gel. (Diagen, DE 41 39 664 AI).
  • the patent EP 1135479 discloses that so-called for the adsorption of nucleic acids to the known and used in the art silicate materials Antichaotropic salts can be used very efficiently and successfully as a component of lysis / binding buffer systems.
  • the advantage of this method is that by avoiding the use of chaotropic salts, a significantly lower health risk emanates from the extraction systems.
  • high salt concentrations > 1.5 M
  • lysing buffers used contain salt concentrations between 1.5M-3M.
  • lysis buffers identified in the patent always contain salt concentrations of 4 M-8 M; in particular, the salts used are guanidine hydrochloride, guanidine thiocyanate or potassium iodide. It is known that these salts realize a lysis of the starting material as well as a potent inactivation of nucleolytic enzymes. After lysis of the starting material then the addition of an alcohol. The patent discloses that the addition of the alcoholic components to the high salt lysis buffer mediates a particularly good efficiency of the binding of the nucleic acids to the silicate filter materials used.
  • the lysis of the virus is carried out by means of a lysis buffer.
  • the lysis buffer is then placed on a filter column and the nucleic acid bound in a conventional manner to the filter column, washed and subsequently isolated the viral nucleic acid. Again, this process is extremely expensive and not robust for field use.
  • the object of the present invention was to eliminate the disadvantages of the solutions described in the prior art.
  • the present invention solves the problem in a surprising manner.
  • these beads have no antibodies on the surface, they surprisingly highly efficiently bind cells, bacteria and viruses, but no proteins. It turns out that the incubation of a corresponding bead solution with a cell suspension of NIH 3T3 cells results in all cells of the suspension adsorbing to the beads. This observation could also be observed on the nonspecific adsorption of bacteria or viruses.
  • viruses, bacteria or cells, etc. of a sample nonspecific adsorb to magnetic or paramagnetic materials and
  • the process according to the invention combines for the first time the adsorption of , viruses or cells etc. of a sample to a carrier material with the subsequent isolation and purification of nucleic acids using the same carrier material.
  • the method can be carried out as a “single-tube process” or else in the form of an automated "walk-away method".
  • the carrier material used is inexpensive, since it is not antibody-coupled beads. In addition, the beads are stable even without cooling and thus suitable for mobile field use.
  • the method with respect to the volume of the sample and also not with respect to the nature of the sample.
  • the last point has a decisive advantage, because it also allows samples to be processed efficiently, which can only be processed with the known methods of nucleic acid isolation consuming, especially samples with high inhibitory potential.
  • the advantage is based on the method according to the invention.
  • the cells, bacteria or viruses are adsorbed from a sample to the beads. Since proteins are not adsorbed to the beads, this is at the same time a separation of any existing free (outside of cells) existing proteins.
  • the sample can be discarded and in this context, the inhibitory matrix components.
  • the cells, bacteria or viruses etc. on the beads can now be washed with water. For the subsequent nucleic acid isolation then you have clean cells, bacteria or viruses etc .. This then simplifies the process of the actual nucleic acid isolation enormously, since expensive washing steps can be omitted.
  • the process sequence is simple, extremely fast and extremely efficient and, according to the invention, combines an enrichment of targets with the subsequent extraction of the nucleic acid.
  • the method according to the invention differs from the previously customary methods for isolating nucleic acids, since cells, bacteria, viruses etc. of a sample are first brought into contact with a carrier material.
  • previous methods always start with the lysis of the sample (cells, bacteria, viruses, etc.) and then bring the released nucleic acids into contact with a carrier material (optionally after addition of a binding buffer).
  • the method of the invention uses such a simple means as magnetic or paramagnetic materials, which are commonly used for the isolation of nucleic acids, but not for the adsorption of cells, Bacteria, viruses etc ..
  • nucleic acids For the lysis / binding of nucleic acids, in principle, all known reagents can be used, which are used for the hitherto known methods of isolating nucleic acids.
  • the method according to the invention can be used universally for the isolation of nucleic acids from liquid samples or from solid samples which have been converted into a liquid state.
  • a particular advantage of the method makes it possible that a higher diagnostic sensitivity is achievable via the use of large sample volumes. This is important, inter alia, in food diagnostics.
  • the detection of food pathogens by culturing the original sample in a Stomacher bag and a specific culture medium. Pathogen cultivation takes several hours to days. Thereafter, 1 ml of the culture is used for the nucleic acid isolation and subsequent PCR. Thus, the time until the presence of the diagnostic result is extremely long.
  • the cultivation time can be significantly reduced since, instead of the usual 1 ml sample, a much larger sample volume is used and thus the sensitivity is increased.
  • the nucleic acid is isolated and can be used in diagnostic PCR. The result is much earlier.
  • This example exemplifies the potential of this new method.
  • the invention will be explained in more detail with reference to embodiments. The embodiments do not represent a limitation of the invention.
  • Embodiments Embodiment 1 Embodiments Embodiment 1
  • the supernatant was assayed for the presence of non-adsorbed cells (isolation of the nucleic acid by a standard procedure from the supernatant, after centrifugation to pellet any cells that may be present).
  • the beads were subsequently incubated with a high salt buffer (4M guanidine thiocyanate) for cell lysis for 10 minutes at room temperature and with continuous shaking. Subsequently, the addition of isopropanol (same volume as the lysis buffer used). The batch was briefly mixed by means of a pipette and incubated for 2 min. This step serves to attach the liberated after lysis nucleic acids to the beads. Subsequently, the beads were separated by means of a magnet and the supernatant discarded. The beads were then washed twice with 80% ethanol and finally the residual ethanol was removed at 70 ° C. for 3 min.
  • a high salt buffer 4M guanidine thiocyanate
  • the beads were resuspended and incubated for 3 min at 70 ° C. Finally, the beads were separated by means of a magnet and the supernatant was transferred to a new vessel. To analyze the isolation of the nucleic acids, the DNA was applied to an agarose gel. As a control, the corresponding supernatants were used after adsorption of the cells to the beads. These supernatants were also used for DNA isolation by a standard procedure. It can be seen that with the method according to the invention the cells were first adsorbed to the beads efficiently and Subsequently, the DNA could be isolated from the cells by means of the same beads. The corresponding supernatants contained no DNA.
  • a low salt buffer 10 mM Tris HCl
  • Figure 1 shows the analysis of the isolated nucleic acids on an agarose gel.
  • the individual samples in FIG. 1 show:
  • Embodiment 2 is a diagrammatic representation of Embodiment 1:
  • the aim of the investigation was to check whether unfunctionalized iron oxide particles for the adsorption of cells and subsequent isolation of DNA can be used. Iron oxide beads without functionalization and OH-functionalized iron oxide beads were used.
  • the supernatant was assayed for the presence of non-adsorbed cells (isolation of the nucleic acid by a standard procedure from the supernatant, after centrifugation to pellet any cells that may be present).
  • the beads were subsequently incubated with a high salt buffer (4M guanidine thiocyanate) for cell lysis for 10 minutes at room temperature and with continuous shaking. Subsequently, the addition of isopropanol (same volume as the lysis buffer used). The batch was briefly mixed by means of a pipette and incubated for 2 min. This step serves to attach the liberated after lysis nucleic acids to the beads.
  • the beads were separated by means of a magnet and the supernatant discarded. The beads were then washed twice with 80% ethanol and finally the residual ethanol was removed at 70 ° C for 3 min. After addition of a low salt buffer (10 mM Tris HCl), the beads were resuspended and incubated for 3 min at 70 ° C. Finally, the beads were separated by means of a magnet and the supernatant was transferred to a new vessel. To analyze the isolation of the nucleic acids, the DNA was applied to an agarose gel. As a control, the corresponding supernatants were used after adsorption of the cells to the beads. These supernatants were also used for DNA isolation by a standard procedure. It can be seen that with the method according to the invention both with functionalized beads and with unfunctionalized beads, the cells were first adsorbed efficiently to the beads and subsequently the DNA could be isolated from the cells by means of the same beads.
  • FIG. 2 shows the analysis of the isolated nucleic acids on an agarose gel.
  • the individual samples in FIG. 2 show:
  • the aim of the investigation was to check whether the adsorption of the cells to the beads is possible efficiently even in a very short time.
  • Each 2.5 ⁇ 10 6 NIH 3T3 cells were resuspended in 1 ml of water.
  • the supernatant was assayed for the presence of non-adsorbed cells (isolation of the nucleic acid by a standard procedure from the supernatant, after centrifugation to pellet any cells that may be present).
  • the beads were subsequently incubated with a high salt buffer (4M guanidine thiocyanate) for cell lysis for 10 minutes at room temperature and continuous shaking. Subsequently, the addition of isopropanol (same volume as the lysis buffer used). The batch was briefly mixed by means of a pipette and incubated for 2 min. This step serves to attach the liberated after lysis nucleic acids to the beads. Subsequently, the beads were separated by means of a magnet and the supernatant discarded. The beads were then washed twice with 80% ethanol and finally the residual ethanol was removed at 70 ° C for 3 min.
  • a high salt buffer 4M guanidine thiocyanate
  • the beads were resuspended and incubated for 3 min at 70 ° C. Finally, the beads were separated by means of a magnet and the supernatant was transferred to a new vessel. To analyze the isolation of the nucleic acids, the DNA was applied to an agarose gel. As a control, the corresponding supernatants were used after adsorption of the cells to the beads. These supernatants were also used for DNA isolation by a standard procedure. It turns out that with the method according to the invention the adsorption of the cells to the beads is possible even with very short incubation times. The corresponding supernatants contained no DNA.
  • FIG. 3 shows the analysis of the isolated nucleic acids on an agarose gel.
  • the individual samples in FIG. 3 show:
  • the beads were subsequently treated with solutions from a commercial kit for the isolation of nucleic acids (innuPREP DNA Mini Kit, Analytik Jena AG).
  • the beads were mixed with 300 ⁇ of a lysis buffer (Lysis Solution TLS) and 25 ⁇ proteinase K (20 mg / ml) and resuspended. Then incubation was carried out at 70 ° C for 15 min. After lysis, 300 ⁇ l of a binding buffer (Binding Solution TBS) were added. The sample was mixed thoroughly and incubated for 2 min at room temperature. This step serves to attach the released after lysis bacterial nucleic acids to the beads. Subsequently, the beads were separated by means of a magnet and the supernatant discarded.
  • the beads were then washed twice with Washing Solution MS and final at 70 ° C removed the remaining ethanol for 3 min. After addition of a low-salt buffer (elution buffer), the beads were resuspended and incubated for 3 min at 70 ° C. Finally, the beads were separated by means of a magnet and the supernatant was transferred to a new vessel.
  • Salmonella could be adsorbed to the beads used with the method according to the invention and could subsequently be isolated from the Salmonella DNA by means of the same beads and detected. It is important that the method is also suitable for enriching bacteria from large-volume samples (10 ml) and subsequently isolating nucleic acids. This is crucial if greater sensitivity is only possible over a larger sample volume.
  • FIG. 4 shows the detection of the enriched salmonella by means of the rapidSTRIPE Salmonella assay on lateral flow test strips.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung von Bakterien, Zellen oder Viren aus biologischen Proben, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe in eine flüssige Probe überführt und mit magnetischen Partikeln versetzt und anschließend diese magnetischen Partikel mit den adsorbierten Bakterien, Zellen oder Viren aus der flüssigen Probe entfernt werden. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur nachfolgenden Isolierung von Nukleinsäuren aus den angereicherten Bakterien, Zellen oder Viren aus biologischen Proben, dadurch gekennzeichnet, dass die angereicherten Bakterien, Zellen oder Viren nach bekannten Verfahren lysiert und die Nukleinsäuren nach einem bekannten Verfahren isoliert wird.

Description

VERFAHREN ZUR ANREICHERUNG VON BAKTERIEN, VIREN SOWIE ZELLEN UND ZUR NACHFOLGENDEN NUKLEINSÄUREISOLIERUNG
Beschreibung
[0001] Gegenstand der Erfindung ist ein universelles und stark vereinfachtes Verfahren zur Kombination von Anreicherung von Bakterien, Viren oder Zellen aus einer Probe und der nachfolgenden Isolierung der Nukleinsäure aus diesen Targets. Das Verfahren kann dabei manuell oder vollautomatisiert durchgeführt werden.
Stand der Technik
[0002] Unter klassischen Bedingungen erfolgt die Isolierung von DNA aus Zellen und Geweben dadurch, dass die Nukleinsäuren enthaltenden Ausgangsmaterialien unter stark denaturierenden und reduzierenden Bedingungen, teilweise auch unter Verwendung von proteinabbauenden Enzymen, aufgeschlossen und die austretenden Nukleinsäurefraktionen über Phenol-/ Chloroform- Extraktionsschritte gereinigt und die Nukleinsäuren mittels Dialyse oder Etha- nolpräzipitation aus der wässrigen Phase gewonnen werden (Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T., 1989, CSH, "Molecular Cloning" ).
[0003] Diese "klassischen Verfahren" zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Zellen und besonders aus Geweben sind sehr zeitaufwendig (teilweise länger als 48 h ), erfordern einen erheblichen apparativen Aufwand und sind darüber hinaus auch nicht unter Feldbedingungen realisierbar. Außerdem sind solche Methoden auf Grund der verwendeten Chemikalien wie Phenol und Chloroform in einem nicht geringen Maße gesundheitsgefährdend.
[0004] Die klassische Methodik der Isolierung von Nukleinsäuren wurde in den zurückliegenden Jahren deutlich verbessert. Die„neuen" Verfahren basieren auf einer von Vogelstein und Gillespie (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1979, 76, 615-619) entwickelten und erstmals beschriebenen Methode zur präparativen und analytischen Reinigung von DNA- Fragmenten aus Agarosegelen. Die Methode kombiniert die Auflösung einer zu isolierende DNA- Bande enthaltende Agarose in einer gesättigten Lösung eines chaotropen Salzes (NaJ) mit einer Bindung der DNA an Glaspartikel. Die an die Glaspartikel fixierte DNA wird anschließend mit einer Waschlösung (20 mM Tris HCl [pH 7,2]; 200mM NaCl; 2 mM EDTA; 50% v/v Etha- nol) gewaschen und danach von den Trägerpartikeln abgelöst.
[0005] Diese Methode erfuhr bis heute eine Reihe von Modifikationen und wird zum gegenwärtigen Zeitpunkt für unterschiedliche Verfahren der Extraktion und Reinigung von Nukleinsäuren aus unterschiedlichen Herkünften angewendet (Marko, M. A., Chipperfield, R. und Birnboim, H. G., 1982, Anal. Biochem., 121, 382-387).
[0006] Darüber hinaus existieren heute weltweit auch eine Vielzahl von Reagenziensystemen, vor allem zur Reinigung von DNA- Fragmenten aus Agarosegelen und für die Isolierung von Plasmid-DNA aus bakteriellen Lysaten, aber auch für die Isolierung von längerkettigen Nukleinsäuren (genomische DNA, zelluläre Gesamt- RNA) aus Blut, Geweben oder auch Zellkulturen.
[0007] Alle diese kommerziell verfügbaren Kits basieren auf dem hinlänglich bekannten Prinzip der Bindung von Nukleinsäuren an mineralische Träger unter Anwesenheit von Lösungen unterschiedlicher chaotroper Salze und verwenden als Trägermaterialien Suspensionen feingemahlener Glaspulver (z.B. Glasmilk , BIO 101, La Jolla, CA), Diatom enerden (Fa. Sigma) oder auch Silicagele. (Diagen, DE 41 39 664 AI).
[0008] Ein für eine Vielzahl unterschiedlicher Anwendungen praktikables Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren ist in US 5,234,809 (Boom) dargestellt. Dort ist ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus nukleinsäurehaltigen Ausgangsmaterialien durch die Inkubation des Ausgangsmaterials mit einem chaotropen Puffer und einer DNA- bindenden festen Phase beschrieben. Die chaotropen Puffer realisieren sowohl die Lyse des Ausgangsmaterials als auch die Bindung der Nukleinsäuren an die feste Phase. Das Verfahren ist gut geeignet, um Nukleinsäuren aus kleinen Probenmengen zu isolieren und findet speziell im Bereich der Isolierung viraler Nukleinsäuren seine praktische Anwendung.
[0009] Spezifische Modifikationen dieser Verfahren betreffen den Einsatz von neuartigen Trägermaterialien, welche für bestimmte Fragestellungen applikative Vorteile zeigen (WO-A 95/34569). Weitere verbesserte Extraktions- Varianten betrafen dann den Einsatz von neuartigen Lyse-/ Bindungspuffern.
[0010] Die Patentschriften EP 1135479 offenbart, dass für die Adsorption von Nukleinsäuren an die dem Fachmann bekannten und eingesetzten silikatischen Materialien auch sogenannte antichaotrope Salze als Bestandteil von Lyse-/ Bindungspuffer- Systemen sehr effizient und erfolgreich eingesetzt werden können. Vorteil dieses Verfahrens ist, dass durch die Umgehung der Verwendung von chaotropen Salzen eine deutlich geringere gesundheitliche Gefährdung von den Extraktionssystemen ausgeht. Allerdings werden für eine effiziente Isolierung von Nukleinsäuren aus einer komplexen biologischen Probe insbesondere in Hinblick auf eine möglichst ausbeutestarke Nukleinsäure- Gewinnung im Lysepuffer wiederum hohe Salzkonzentrationen (> 1.5 M) benötigt. So offenbart die Patentschrift, dass die Verwendung findenden Lysepuffer Salzkonzentrationen zwischen 1,5 M - 3 M enthalten.
[0011] In der Patentschrift DE 4321904 wird ein Verfahren beschrieben, dass bei Kombination von chaotropen Hochsalzpuffern mit alkoholischen Komponenten eine effiziente Isolierung von Nukleinsäuren möglich ist. Die in der Patentschrift ausgewiesenen Lysepuffer enthalten dabei immer Salzkonzentrationen von 4 M - 8 M, insbesondere werden als Salze Gua- nidinhydrochlorid, Guanidinthiocyanat oder Kaliumjodid eingesetzt. Es ist bekannt, dass diese Salze eine Lyse des Ausgangsmaterials sowie eine potente Inaktivierung nukleolytischer Enzyme realisieren. Nach Lyse des Ausgangsmaterials erfolgt dann die Zugabe eines Alkohols. Die Patentschrift offenbart, dass die Zugabe der alkoholischen Komponenten zum Hochsalz- Lysepuffer eine besonders gute Effizienz der Anbindung der Nukleinsäuren an die eingesetzten silikatischen Filtermaterialien vermittelt.
[0012] Die Analyse des Standes der Technik verdeutlicht eindrucksvoll, dass eine Vielzahl von Möglichkeiten existiert, Nukleinsäuren an feste Trägermaterialien, insbesondere mineralische Trägermaterialien auf Siliziumbasis oder aber auch an magnetische oder paramagnetische Trägermaterialien, zu binden, nachfolgend zu waschen und die Nukleinsäuren vom Trägermaterial wieder abzulösen. Es wird dabei sehr deutlich, dass für die Isolierung von Nukleinsäuren aus komplexen biologischen Proben sowohl sog. chaotrope Salze oder sog. antichaotrope Salze eingesetzt werden.
[0013] Alle diese Verfahren arbeiten dabei unabhängig der für die Anbindung der Nukleinsäuren nach dem gleichen Prozessablauf:
1. Lyse der Probe
2. Optional Zugabe des für die Anbindung der Nukleinsäure notwendigen Bindungspuffers (oder eines Alkohols)
3. Inkontaktbringen des Reaktionsansatzes mit einer nukleinsäurebindenden festen Phase (Trägermaterial) und nachfolgende Anbindung der Nukleinsäure an dieses Material)
4. Waschen der am Trägermaterial gebundenen Nukleinsäure
5. Ablösen der gebundenen Nukleinsäure vom Trägermaterial
[0014] Der Stand der Technik offenbart, dass diese Verfahren für die Isolierung von Nukleinsäuren aus kleinvolumigen Proben sehr effizient funktionieren. Sollen dagegen große Probenvolumina bearbeitet werden, dann verlieren diese Verfahren deutlich an Effizienz und werden darüber hinaus auch in ihrer Durchführung zunehmend kompliziert.
[0015] Das Problem wird insbesondere dann wesentlich, wenn große Volumen an Proben aufgearbeitet werden sollen, wenn z.B. in Bezug auf eine diagnostische Testdurchführung eine höhere Sensitivität nur durch die Vergrößerung des Probenvolumens erzielbar ist.
[0016] Technische Lösungen basieren darauf, dass man die Probe in gewohnter Weise mit einem größeren Volumen an Lysepuffer versetzt, nachfolgend den Bindungspuffer zugibt und den Ansatz mittels einer„Trichtervorrichtung" sukzessive über eine Filtermembran zur Anbindung der Nukleinsäure leitet. Mittels diesbezüglicher kommerzieller Systeme können dann z.B. 1 ml einer Probe zur Isolierung viraler Nukleinsäure eingesetzt werden. Diese Verfahren sind aber extrem teuer und aufwendig in der Durchführung.
[0017] Weitere Möglichkeiten zur Bearbeitung größerer Probenvolumina mit dem Ziel der Isolierung von Nukleinsäuren insbesondere aus pathogenen Mikroorganismen basieren auf dem Einsatz sog. immunomagneti scher Verfahren. Diese Verfahren basieren auf dem Einsatz von z.B. magnetischen Beads (Partikel), welche mit einem Fängermolekül gekoppelt sind (z.B. mit einem targetspezifischen Antikörper). Diese Beads werden mit der biologischen Probe in Kontakt gebracht und für mehrere Stunden inkubiert. Dabei soll das Target spezifisch an den Antikörper binden. Die Beads werden nachfolgend separiert und gewaschen. Dann erfolgt das Ablösen der gebundenen Targets. Im Falle der geplanten Isolierung von Nukleinsäuren aus den gebundenen Analyten lysiert man den gebundenen Analyten und führt nachfolgend eine bekannte Nukleinsäureisolierung durch.
[0018] Diese Verfahren sind aufwendig und extrem teuer, da sie immer auf der Verwendung von an magnetische Beads gekoppelte Antikörper basieren. Darüber hinaus sind solche Verfahren auch nicht robust, da die Beads mit den gekoppelten Antikörpern auch immer gekühlt sein müssen. Insbesondere für einen z.B. mobilen diagnostischen Einsatz unter Feldbedingungen sind diese Verfahren nicht geeignet. Ein weiteres diesbezügliches Verfahren findet man im Journal of Virology (Vol. 83, No. lO; 2009). Dabei handelt es sich um die immuno- magnetische Anreicherung von Virusantigen in Urinproben. Dabei konnten 1.5 ml Probe eingesetzt werden. Das Verfahren nutzt magnetische Beads, welche mit einem Protein (ApoH) gekoppelt sind. Diese Beads dienen der Bindung von Virusantigen aus der Probe. Die Inkubation von Probe mit Beads beträgt 2h. Danach werden die Beads separiert und mehrmals gewaschen. Nachfolgend erfolgt die Lyse der Viren mittels eines Lysepuffers. Der Lysepuffer wird dann auf eine Filtersäule gegeben und die Nukleinsäure in an sich bekannter Weise an der Filtersäule gebunden, gewaschen und nachfolgend die virale Nukleinsäure isoliert. Auch dieses Verfahren ist wieder extrem teuer und nicht robust für einen Feldeinsatz.
[0019] Diese Verfahren zeigen, dass es möglich ist, größere Probenvolumina zu bearbeiten. Es zeigt sich aber auch, dass es sich um zwei getrennte Verfahrensabläufe handelt:
1. Selektive oder unselektive Anbindung von Mikroorganismen an mit Beads gekoppelte Antikörper
2. Lyse der gebundenen Targets
3. Extraktion der freigesetzten Nukleinsäuren über die Verwendung dem Fachmann bekannter Verfahren; z.B. über die Anbindung der Nukleinsäuren an eine feste Phase.
[0020] Es ist hervorzuheben, dass für die Isolierung der Nukleinsäuren ein zusätzliches Trägermaterial eingesetzt werden muss.
[0021] Damit werden diese Verfahren aufwendig und sind auch nur sehr schwer zu automatisieren.
Aufgabe der Erfindung
[0022] Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, die Nachteile der im Stand der Technik beschriebenen Lösungen zu beseitigen.
Lösung der Aufgabe
[0023] Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst. [0024] Erfindungsgemäß wurde ein universelles Verfahren zur Anreicherung und nachfolgenden Isolierung von Nukleinsäuren aus Bakterien, Viren oder auch Zellen bereitgestellt, das einfach, schnell, robust (auch geeignet für einen Einsatz unter Feldbedingungen) und preiswert ist. Dieses Verfahren gestattet, auch große Probenvolumina (> 10 ml) einfach und effizient zu bearbeiten. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es auch möglich, dass der Pro- zess einfach zu automatisieren ist.
[0025] Die vorliegende Erfindung löst die Problemstellung dabei in einer überraschenden Weise.
[0026] Zufällige experimentelle Beobachtungen zeigten, das die Verwendung von einfachen magnetischen, vorzugsweise paramagnetischen, Beads (z.B. Partikel aus Eisenoxyd mit OH- Funktionalisierung), die routinemäßig für die Isolierung von Nukleinsäuren nach den bekannten und ausführlich beschriebenen Verfahrensabläufen eingesetzt werden, noch andere Eigenschaften besitzen.
[0027] Obwohl diese Beads keine Antikörper auf der Oberfläche besitzen, binden sie überraschenderweise hocheffizient Zellen, Bakterien und Viren, aber keine Proteine. Es zeigt sich, dass die Inkubation einer diesbezüglichen Beads-Lösung mit einer Zellsuspension von NIH 3T3 Zellen dazu führt, dass alle Zellen der Suspension an die Beads adsorbierten. Diese Beobachtung lies sich auch auf die unspezifische Adsorption von Bakterien oder Viren beobachten.
[0028] Entsprechend der Zielstellung der vorliegenden Erfindung konnte ein völlig neuartiges Verfahren entwickelt werden, welches es erlaubt,
[0029] erstens, Viren, Bakterien oder Zellen etc. einer Probe unspezifisch an magnetische oder paramagnetische Materialien zu adsorbieren und
[0030] zweitens, die virale, bakterielle oder zelluläre etc. Nukleinsäure der gebundenen Viren, Bakterien oder Zellen etc. über dasselbe Trägermaterial zu isolieren.
[0031] Das erfindungsgemäße Verfahren kombiniert dabei erstmalig die Adsorption von Bäk- terien, Viren oder Zellen etc. einer Probe an ein Trägermaterial mit der nachfolgenden Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren unter Verwendung desselben Trägermaterials.
[0032] Dabei kann das Verfahren als„single- Tube- Prozess" oder auch in Form eines automatisierten„Walk- Away- Verfahrens" durchgeführt werden.
[0033] Das eingesetzte Trägermaterial ist preiswert, da es sich nicht um Antikörpergekoppelte Beads handelt. Darüber hinaus sind die Beads auch ohne Kühlung stabil und somit auch für den mobilen Feldeinsatz geeignet.
[0034] Es gibt keine wirkliche Limitation des Verfahrens in Bezug auf das Volumen der Probe und auch nicht in Bezug auf die Art der Probe. Gerade der letzte Punkt ist mit einem entscheidenden Vorteil behaftet, da damit auch Proben effizient bearbeitet werden können, die mit den bekannten Methoden der Nukleinsäureisolierung nur aufwendig bearbeitet werden können, insbesondere Proben mit hohem inhibitorischen Potenzial. Der Vorteil begründet sich im erfindungsgemäßen Verfahren. Im ersten Verfahrensschritt werden die Zellen, Bakterien oder Viren aus einer Probe an die Beads adsorbiert. Da Proteine nicht an die Beads adsorbiert werden, erfolgt damit gleichzeitig eine Trennung von eventuell vorhandenen freien (außerhalb von Zellen) existierenden Proteinen. Damit kann dann die Probe verworfen werden und in diesem Zusammenhang auch die inhibitorischen Matrixkomponenten. Die an den Beads befindlichen Zellen, Bakterien oder Viren etc. können nun mit Wasser gewaschen werden. Für die nachfolgende Nukleinsäureisolierung hat man dann bereits saubere Zellen, Bakterien oder Viren etc.. Dies vereinfacht dann den Prozess der eigentlichen Nukleinsäureisolierung enorm, da aufwendige Waschschritte entfallen können.
[0035] Der Prozessablauf ist einfach, extrem schnell und überaus effizient und kombiniert erfindungsgemäß eine Anreicherung von Targets mit der nachfolgenden Extraktion der Nukleinsäure. Damit unterscheidet sich das erfindungsgemäße Verfahren von den bisher üblichen Verfahren zu Isolierung von Nukleinsäuren, da zuerst Zellen, Bakterien, Viren etc. einer Probe in Kontakt mit einem Trägermaterial gebracht werden. Bisherige Verfahren beginnen dagegen immer mit der Lyse der Probe (Zellen, Bakterien, Viren etc.) und bringen dann die freigesetzten Nukleinsäuren in Kontakt mit einem Trägermaterial (optional nach Zugabe eines Bindungspuffers).
[0036] Neuartig ist auch, dass sich das erfindungsgemäße Verfahren einem so einfachen Mittel wie magnetischen oder paramagnetischen Materialien bedient, die üblicherweise für die Isolierung von Nukleinsäuren eingesetzt werden, nicht jedoch für die Adsorption von Zellen, Bakterien, Viren etc..
[0037] Der erfindungsgemäße Ablauf des Verfahrens realisiert sich wie folgt:
1. Bereitstellen einer flüssigen Probe, welche Zellen, Bakterien, Viren etc. enthält
2. Zugabe der beschriebenen Beads zur Probe und Inkubation
3. Separation der Beads mittels eines Magneten und Verwerfen des Überstandes
4. Optional waschen der Beads mit den gebundenen Zellen, Bakterien, Viren etc.
5. Zugabe eines Lysepuffers zu den Beads und Lyse der Zellen, Bakterien, Viren etc.
6. Optional Zugabe eines Bindungspuffers oder Alkohols
7. Waschen der Beads
8. Trocknen der Beads
9. Elution der Nukleinsäuren von den Beads mit Wasser oder einem Niedrigsalzpuffer
[0038] Für die Lyse/ Bindung der Nukleinsäuren können prinzipiell alle bekanten Reagenzien eingesetzt werden, die für die bisher bekanten Methoden der Isolierung von Nukleinsäuren eingesetzt werden.
[0039] Das erfindungsgemäße Verfahren kann dabei universell für die Isolierung von Nukleinsäuren aus flüssigen Proben oder aus festen Proben, die in einen flüssigen Zustand überführt wurden, eingesetzt werden.
[0040] Ein besonderer Vorteil des Verfahrens gestattet es dabei, dass über die Nutzung von großen Probenvolumina eine höhere diagnostische Sensitivität erreichbar wird. Dies ist u.a. in der Lebensmitteldiagnostik wichtig. Hier erfolgt der Nachweis von Lebensmittelpathogenen durch eine Kultivierung der Ausgangsprobe in einem Stomacher-Beutel und einem spezifischen Kultivierungsmedium. Die Erregerkultivierung benötigt mehrere Stunden bis Tage. Danach wird 1 ml der Kultur für die Nukleinsäureisolierung und nachfolgende PCR eingesetzt. Damit ist die Zeitspanne bis zum Vorliegen des diagnostischen Ergebnisses extrem lange. Mittels der erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Kultivierungszeit deutlichst reduziert werden, da anstelle der üblichen 1 ml Probe ein sehr viel größeres Probenvolumen eingesetzt und damit die Sensitivität erhöht werden. Nach Adsorption der Bakterien wird die Nukleinsäure isoliert und kann in der diagnostischen PCR eingesetzt werden. Das Ergebnis liegt dann sehr viel früher vor. Dieses Beispiel zeigt exemplarisch das Potenzial dieser neuen Methode. [0041] Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. Die Ausführungsbeispiele stellen dabei keine Limitierung der Erfindung dar.
Ausführungsbeispiele Ausführungsbeispiel 1:
Anreicherung von NIH 3T3 Zellen aus einer Suspension und nachfolgende Isolierung der genomischen DNA aus den Zellen
[0042] Jeweils 2,5 x 106 IH 3T3 Zellen wurden in 1 ml Wasser resuspendiert.
[0043] Zugabe von 15 μΐ einer Bead-Suspension (Eisenoxydpartikel mit OH-
Funktionalisierung; Menge ca. 5 mg) zur Zellsuspension. Mischen der Probe und Inkubation unter Schütteln für 30 min bei Raumtemperatur.
[0044] Separation der Beads mittels eines Magneten.
[0045] Überführen des Überstandes in ein neues Gefäß. Der Überstand wurde nachfolgend auf das Vorhandensein von nichtadsorbierten Zellen untersucht (Isolierung der Nukleinsäure mittels eines Standardverfahrens aus dem Überstand, nach erfolgter Zentrifugation zur Pelletierung von eventuell vorkommenden Zellen).
[0046] Die Beads wurden nachfolgend mit einem Hochsalzpuffer (4M Guanidinthiocyanat) zur Zelllyse für 10 min bei Raumtemperatur und kontinuierlichem Schütteln inkubiert. Nachfolgend erfolgte die Zugabe von Isopropanol (gleiches Volumen wie der eingesetzte Lysepuffer). Der Ansatz wurde kurz mittels einer Pipette gemischt und für 2 min inkubiert. Dieser Schritt dient der Anbindung der nach Lyse freigesetzten Nukleinsäuren an die Beads. Nachfolgend wurden die Beads mittels eines Magneten separiert und der Überstand verworfen. Die Beads wurden dann zweimal mit 80%- igem Ethanol gewaschen und final bei 70°C für 3 min der restliche E- thanol entfernt. Nach Zugabe eines Niedrigsalzpuffers (10 mM Tris HCl) wurden die Beads resuspendiert und für 3 min bei 70°C inkubiert. Final wurden die Beads mittels eines Magneten separiert und der Überstand in ein neues Gefäß überführt. Zur Analyse der Isolierung der Nukleinsäuren wurde die DNA auf einem Agarosegel aufgetragen. Als Kontrolle dienten die korrespondierenden Überständer nach Adsorption der Zellen an die Beads. Diese Überstände wurde ebenfalls für die DNA Isolierung mittels eines Standardverfahrens eingesetzt. Es zeigt sich, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren effizient die Zellen zuerst an die Beads adsorbierten und nachfolgend mittels derselben Beads aus den Zellen die DNA isoliert werden konnte. In den korrespondierenden Überstände war keine DNA enthalten.
[0047] Figur lzeigt die Analyse der isolierten Nukleinsäuren auf einem Agarosegel. [0048] Die einzelnen Proben in Figur 1 zeigen:
1 DNA aus den an die Beads gebundenen Zellen; Probe 1
2 Überstand von Probe 1 (keine DNA)
3 DNA aus den an die Beads gebundenen Zellen; Probe 2
4 Überstand von Probe 2 (keine DNA)
5 DNA aus den an die Beads gebundenen Zellen; Probe 3
6 Überstand von Probe 3 (keine DNA)
7 DNA aus den an die Beads gebundenen Zellen; Probe 4
8 Überstand von Probe 4 (keine DNA)
Ausführungsbeispiel 2:
Anreicherung von NIH 3T3 Zellen aus einer Suspension und nachfolgende Isolierung der genomischen DNA aus den Zellen unter Verwendung von zwei verschiedenen Beads
[0049] Ziel der Untersuchung war, zu überprüfen, ob auch unfunktionalisierte Eisenoxydpartikel für die Adsorption von Zellen und eine nachfolgende Isolierung von DNA eingesetzt werden können. Verwendet wurden Eisenoxyd- Beads ohne Funktionalisierung sowie OH- funktionali- sierte Eisenoxyd- Beads.
Jeweils 2,5 x 106NIH 3T3 Zellen wurden in 1 ml Wasser resuspendiert.
[0050] Zugabe von 15 μΐ einer Bead-Suspension ( Eisenoxydpartikel mit OH- Funktionalisierung bzw. ohne Funktionalisierung; Menge ca. 5 mg) zur Zell Suspension. Mischen der Probe und Inkubation unter Schütteln für 30 min bei Raumtemperatur.
[0051] Separation der Beads mittels eines Magneten.
[0052] Überführen des Überstandes in ein neues Gefäß. Der Überstand wurde nachfolgend auf das Vorhandensein von nichtadsorbierten Zellen untersucht (Isolierung der Nukleinsäure mittels eines Standardverfahrens aus dem Überstand, nach erfolgter Zentrifugation zur Pelletierung von eventuell vorkommenden Zellen). [0053] Die Beads wurden nachfolgend mit einem Hochsalzpuffer (4M Guanidinthiocyanat) zur Zelllyse für 10 min bei Raumtemperatur und kontinuierlichem Schütteln inkubiert. Nachfolgend erfolgte die Zugabe von Isopropanol (gleiches Volumen wie der eingesetzte Lysepuffer). Der Ansatz wurde kurz mittels einer Pipette gemischt und für 2 min inkubiert. Dieser Schritt dient der Anbindung der nach Lyse freigesetzten Nukleinsäuren an die Beads. Nachfolgend wurden die Beads mittels eines Magneten separiert und der Überstand verworfen. Die Beads wurden dann zweimal mit 80%igem Ethanol gewaschen und final bei 70°C für 3 min der restliche Ethanol entfernt. Nach Zugabe eines Niedrigsalzpuffers (10 mM Tris HCl) wurden die Beads resuspendiert und für 3 min bei 70°C inkubiert. Final wurden die Beads mittels eines Magneten separiert und der Überstand in ein neues Gefäß überführt. Zur Analyse der Isolierung der Nukleinsäuren wurde die DNA auf einem Agarosegel aufgetragen. Als Kontrolle dienten die korrespondierenden Überständer nach Adsorption der Zellen an die Beads. Diese Überständen wurde ebenfalls für die DNA- Isolierung mittels eines Standardverfahrens eingesetzt. Es zeigt sich, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sowohl mit funktionalisierten Beads als auch mit un- funktionalisierten Beads effizient die Zellen zuerst an die Beads adsorbierten und nachfolgend mittels derselben Beads aus den Zellen die DNA isoliert werden konnte.
[0054] Dabei wurde der Beweis erbracht, dass auch native Eisenoxydpartikel für eine effiziente Adsorption von Zellen und eine nachfolgende Isolierung der DNA geeignet sind. In den korrespondierenden Überstände war keine DNA enthalten.
[0055] Figur 2 zeigt die Analyse der isolierten Nukleinsäuren auf einem Agarosegel. [0056] Die einzelnen Proben in Figur 2 zeigen:
1 DNA Leiter
2 DNA aus den an die OH- funktionalisierten Beads gebundenen Zellen; Probe 1
3 Überstand von Probe 1 (keine DNA)
4 DNA aus den an die OH- funktionalisierten Beads gebundenen Zellen; Probe 2
5 Überstand von Probe 2 (keine DNA)
6 DNA aus den an die unfunktionalisierten Beads gebundenen Zellen; Probe 3
7 Überstand von Probe 3 (keine DNA)
8 DNA aus den an die unfunktionalisierten Beads gebundenen Zellen; Probe 4
9 Überstand von Probe 4 (keine DNA) Ausführungsbeispiel 3:
Anreicherung von NIH 3T3 Zellen aus einer Suspension und nachfolgende Isolierung der genomischen DNA aus den Zellen. Testung des Einflusses der Inkubationszeit von Beads und Zellen.
[0057] Ziel der Untersuchung war, zu überprüfen, ob die Adsorption der Zellen an die Beads auch in sehr kurzer Zeit effizient möglich ist. Jeweils 2,5 x 106 NIH 3T3 Zellen wurden in 1 ml Wasser resuspendiert. Zugabe von 15 μΐ einer Bead-Suspension (Eisenoxydpartikel mit OH- Funktionalisierung bzw. ohne Funktionali sierung; Menge ca. 5 mg) zur Zell Suspension. Mischen der Probe und Inkubation unter Schütteln für 2 min bzw. für 15 min bei Raumtemperatur. Separation der Beads mittels eines Magneten. Überführen des Überstandes in ein neues Gefäß. Der Überstand wurde nachfolgend auf das Vorhandensein von nichtadsorbierten Zellen untersucht (Isolierung der Nukleinsäure mittels eines Standardverfahrens aus dem Überstand, nach erfolgter Zentrifugation zur Pelletierung von eventuell vorkommenden Zellen).
[0058] Die Beads wurden nachfolgend mit einem Hochsalzpuffer (4M Guanidinthiocyanat) zur Zelllyse für 10 min bei Raumtemperatur und kontinuierlichem Schütteln inkubiert. Nachfolgend erfolgte die Zugabe von Isopropanol (gleiches Volumen wie der eingesetzte Lysepuffer). Der Ansatz wurde kurz mittels einer Pipette gemischt und für 2 min inkubiert. Dieser Schritt dient der Anbindung der nach Lyse freigesetzten Nukleinsäuren an die Beads. Nachfolgend wurden die Beads mittels eines Magneten separiert und der Überstand verworfen. Die Beads wurden dann zweimal mit 80%igem Ethanol gewaschen und final bei 70°C für 3 min der restliche Ethanol entfernt. Nach Zugabe eines Niedrigsalzpuffers (10 mM Tris HCl) wurden die Beads resuspendiert und für 3 min bei 70°C inkubiert. Final wurden die Beads mittels eines Magneten separiert und der Überstand in ein neues Gefäß überführt. Zur Analyse der Isolierung der Nukleinsäuren wurde die DNA auf einem Agarosegel aufgetragen. Als Kontrolle dienten die korrespondierenden Überständer nach Adsorption der Zellen an die Beads. Diese Überständen wurde ebenfalls für die DNA- Isolierung mittels eines Standardverfahrens eingesetzt. Es zeigt sich, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren die Adsorption der Zellen an die Beads auch bei sehr kurzen Inkubationszeiten möglich ist. In den korrespondierenden Überstände war keine DNA enthalten.
[0059] Figur 3 zeigt die Analyse der isolierten Nukleinsäuren auf einem Agarosegel. [0060] Die einzelnen Proben in Figur 3 zeigen:
1 DNA Leiter
2 Inkubation 2 min; DNA aus den an die Beads gebundenen Zellen; Probe 1
3 Überstand von Probe 1 (keine DNA)
4 Inkubation 2 min; DNA aus den an die Beads gebundenen Zellen; Probe 2
5 Überstand von Probe 2 (keine DNA)
6 Inkubation 15 min DNA aus den an die Beads gebundenen Zellen; Probe 3
7 Überstand von Probe 3 (keine DNA)
8 Inkubation 15 min; DNA aus den an die gebundenen Zellen; Probe 4
9 Überstand von Probe 4 (keine DNA)
Ausführungsbeispiel 4:
Anreicherung von Salmonellen aus einer wässrigen Probe und nachfolgende Isolierung der bakteriellen Nukleinsäure sowie Nachweis der isolierten DNA auf einem kommerziellen Streifentest
[0061] Jeweils ca. 500 bzw. 250 Salmonellen wurden in 1.0 ml, 1.5 ml bzw. 10 ml Wasser gespiked. Die Anreicherung der Bakterien und die Isolierung der bakteriellen Nukleinsäure erfolgte wie folgt.
[0062] Zugabe von 5 μΐ einer Bead- Suspension (Eisenoxydpartikel mit OH-Funktionalisierung; Menge ca. 1.5 mg) zur jeweiligen Probe. Mischen der Probe und Inkubation unter Schütteln für 30 min bei Raumtemperatur.
[0063] Separation der Beads mittels eines Magneten.
[0064] Die Beads wurden nachfolgend mit Lösungen aus einem kommerziellen Kit zur Isolierung von Nukleinsäuren (innuPREP DNA Mini Kit; Analytik Jena AG) behandelt. Die Beads wurden dazu mit 300 μΐ eines Lysepuffers (Lysis Solution TLS) sowie 25 μΐ Proteinase K (20mg/ml) versetzt und resuspendiert. Dann erfolgte eine Inkubation bei 70°C für 15 min. Nach Lyse erfolgte die Zugabe von 300 μΐ eines Bindungspuffers (Binding Solution TBS). Die Probe wurde sorgfältig gemischt und für 2 min bei Raumtemperatur inkubiert. Dieser Schritt dient der Anbindung der nach Lyse freigesetzten bakteriellen Nukleinsäuren an die Beads. Nachfolgend wurden die Beads mittels eines Magneten separiert und der Überstand verworfen. Die Beads wurden dann zweimal mit Waschpuffer (Washing Solution MS) gewaschen und final bei 70°C für 3 min der restliche Ethanol entfernt. Nach Zugabe eines Niedrigsalzpuffers (Elution Buffer) wurden die Beads resuspendiert und für 3 min bei 70°C inkubiert. Final wurden die Beads mittels eines Magneten separiert und der Überstand in ein neues Gefäß überführt.
[0065] Der Nachweis einer erfolgreichen Anreicherung und Nukleinsäureextraktion aus den Proben erfolgte mittel eines kommerziellen Testsystems zum Nachweis von Salmonellen (rapidSTRIPE Salmonella Assay).
[0066] Es zeigt sich, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Salmonellen an die eingesetzten Beads adsorbierten und nachfolgend mittels derselben Beads aus den Salmonellen DNA isoliert und nachgewiesen werden konnte. Wichtig ist dabei, dass sich das Verfahren auch dazu eignet, aus großvolumigen Proben (10 ml) Bakterien anzureichern und nachfolgend Nukleinsäuren zu isolieren. Dies ist entscheidend, wenn eine größere Sensitivität nur über ein größeres Probenvolumen möglich wird.
[0067] Darüber hinaus zeigt sich, dass die Isolierung der Nukleinsäuren mit Reagenzien von kommerziell verfügbaren Kits durchführbar ist.
[0068] Auf Figur 4 ist der Nachweis der angereicherten Salmonellen mittels des rapidSTRIPE Salmonella Assay s auf Lateral Flow Teststreifen zu erkennen.
[0069] Die einzelnen Proben in Figur 4 zeigen:
1 ca. 500 Kopien Salmonellen aus 1.0 ml Wasser
2 ca. 500 Kopien Salmonellen aus 1.5 ml Wasser
3 ca. 250 Kopien Salmonellen aus 1.0 ml Wasser
4 ca. 250 Kopien Salmonellen aus 1.5 ml Wasser
5 ca. 500 Kopien Salmonellen aus 10 ml Wasser
6 Positivkontrolle
7 Negativkontrolle

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Anreicherung von Bakterien, Zellen oder Viren aus biologischen Proben, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe in eine flüssige Probe überführt und mit magnetischen Partikeln versetzt und anschließend diese magnetischen Partikel mit den adsorbierten Bakterien, Zellen oder Viren aus der flüssigen Probe entfernt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den magnetischen Partikeln um ferro- oder paramagnetische Partikel handelt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den magnetischen Partikeln um
a) silicatische Magnetpartikel oder
b) Partikel aus Eisenoxid
handelt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Eisenoxid- Partikeln um nichtfunktionalisierte oder funktionalisierte Eisenoxid-Partikel, vorzugsweise OH- oder COO-funktionalisierte, handelt
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Eisenoxid-Partikel eine Größe von 10 nm bis 5 μιτι, vorzugsweise von 50 nm bis 1 μιτι, besonders bevorzugt von 100 bis 300 nm, aufweisen.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen euka- ryotische oder prokaryotische Zellen sind.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Proben Blut, Serum, Plasma, Zerebrospinalflüssigkeit, Speichel, Wasser, Urin, Stuhlproben, Zellkultur-Supensionen, Kultivierungsmedien oder Kultivierungsmedien aus Stomacher-Beuteln der Lebensmitteldiagnostik darstellen.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausgangsvolumen beliebig ist.
9. Verfahren zur nachfolgenden Isolierung von Nukleinsäuren aus den gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 angereicherten Bakterien, Zellen oder Viren aus biologischen Proben, da- durch gekennzeichnet, dass die angereicherten Bakterien, Zellen oder Viren nach bekannten Verfahren lysiert und die Nukleinsäuren nach einem bekannten Verfahren isoliert wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, gekennzeichnet durch folgende Schritte:
a) Separation der magnetischen Partikel mit den adsorbierten Bakterien, Zellen oder Viren aus der flüssigen Probe mittels eines Magneten und Verwerfen des Überstandes b) Waschen der magnetischen Partikel mit den adsorbierten Bakterien, Zellen oder Viren c) Zugabe eines Lysepuffers zu den gewaschenen magnetischen Partikel mit den adsorbierten Bakterien, Zellen oder Viren und Lyse der Biomoleküle zur Freisetzung der Nukleinsäuren
d) Zugabe eines Bindungspuffers oder Alkohols zur Anbindung der Nukleinsäuren an eine feste Phase
e) Waschen der feste Phase mit den gebundenen Nukleinsäuren
f) Elution der Nukleinsäuren von der festen Phase mit Wasser oder einem Niedrigsalzpuffer.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass als feste Phase dieselben magnetischen Partikel wie in Anspruch 1 verwendet werden.
12. Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 7 bis 11 als „One-Tube- Verfahren" oder„Walk-Away-Prozess".
13. Verwendung von magnetischen Partikeln gemäß Anspruch 1 zu Isolierung von Bakterien, Zellen oder Viren aus biologischen Proben.
14. Verwendung von magnetischen Partikeln gemäß Anspruch 1 zur Trennung von Bakterien, Zellen oder Viren von freien Proteinen einer biologischen Probe.
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