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WO2012099180A1 - 目的物質移行方法、結晶製造方法、組成物製造方法、目的物質移行装置 - Google Patents

目的物質移行方法、結晶製造方法、組成物製造方法、目的物質移行装置 Download PDF

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WO2012099180A1
WO2012099180A1 PCT/JP2012/051002 JP2012051002W WO2012099180A1 WO 2012099180 A1 WO2012099180 A1 WO 2012099180A1 JP 2012051002 W JP2012051002 W JP 2012051002W WO 2012099180 A1 WO2012099180 A1 WO 2012099180A1
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WO
WIPO (PCT)
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phase
target substance
gel
crystal
bubble
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2012/051002
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
森　勇介
井上　豪
和文 高野
浩由 松村
安達　宏昭
成 杉山
良多 村井
将輝 倉田
洋史 吉川
美帆子 平尾
智詞 中山
高橋　義典
村上　聡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Osaka NUC
Original Assignee
Osaka University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Osaka University NUC filed Critical Osaka University NUC
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Priority to EP12736266.3A priority patent/EP2659962B1/en
Priority to US13/980,212 priority patent/US9751068B2/en
Publication of WO2012099180A1 publication Critical patent/WO2012099180A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J19/008—Processes for carrying out reactions under cavitation conditions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D9/00—Crystallisation
    • B01D9/0081—Use of vibrations, e.g. ultrasound
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J19/08—Processes employing the direct application of electric or wave energy, or particle radiation; Apparatus therefor
    • B01J19/10—Processes employing the direct application of electric or wave energy, or particle radiation; Apparatus therefor employing sonic or ultrasonic vibrations
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J19/08—Processes employing the direct application of electric or wave energy, or particle radiation; Apparatus therefor
    • B01J19/12—Processes employing the direct application of electric or wave energy, or particle radiation; Apparatus therefor employing electromagnetic waves
    • B01J19/121—Coherent waves, e.g. laser beams
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C30—CRYSTAL GROWTH
    • C30B—SINGLE-CRYSTAL GROWTH; UNIDIRECTIONAL SOLIDIFICATION OF EUTECTIC MATERIAL OR UNIDIRECTIONAL DEMIXING OF EUTECTOID MATERIAL; REFINING BY ZONE-MELTING OF MATERIAL; PRODUCTION OF A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; SINGLE CRYSTALS OR HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; AFTER-TREATMENT OF SINGLE CRYSTALS OR A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; APPARATUS THEREFOR
    • C30B29/00—Single crystals or homogeneous polycrystalline material with defined structure characterised by the material or by their shape
    • C30B29/54—Organic compounds
    • C30B29/58—Macromolecular compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C30—CRYSTAL GROWTH
    • C30B—SINGLE-CRYSTAL GROWTH; UNIDIRECTIONAL SOLIDIFICATION OF EUTECTIC MATERIAL OR UNIDIRECTIONAL DEMIXING OF EUTECTOID MATERIAL; REFINING BY ZONE-MELTING OF MATERIAL; PRODUCTION OF A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; SINGLE CRYSTALS OR HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; AFTER-TREATMENT OF SINGLE CRYSTALS OR A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; APPARATUS THEREFOR
    • C30B5/00—Single-crystal growth from gels

Definitions

  • the present invention relates to a target substance transfer method, a crystal manufacturing method, a composition manufacturing method, and a target substance transfer apparatus.
  • crystal structure analysis particularly crystal structure analysis by X-ray diffraction imaging is excellent and widely used.
  • a method of depositing (crystallizing) the crystal of the sample from a solution containing the sample is performed.
  • it is difficult to precipitate (crystallize) crystals from a solution of protein, nucleic acid, etc. and very advanced techniques are required. This is thought to be because crystal nuclei do not occur in a solution of protein, nucleic acid, or the like, or disappear immediately after generation.
  • Patent Document 2 there is a method of obtaining crystals more easily by crystallizing proteins or nucleic acids in a gel instead of a solution.
  • Patent Document 2 a method of obtaining crystals more easily by crystallizing proteins or nucleic acids in a gel instead of a solution.
  • Non-patent Document 1 attempts have been made to generate and crystallize protein crystal nuclei by irradiating a protein solution with laser light.
  • the principle of this method can be explained as follows. That is, first, when a protein solution is irradiated with laser light, a so-called cavitation phenomenon occurs in which bubbles are generated and disappear in a short time. When bubbles are generated and expanded, proteins in the solution are adsorbed on the surface of the bubbles. When the bubbles are about to shrink and disappear, the surface area of the bubbles is reduced, so that the adsorbed protein is concentrated and the protein concentration (density) is increased. It is considered that crystal nuclei are likely to be generated in the portion where this protein is concentrated (concentrated).
  • Non-patent Document 2 the generation of crystal nuclei can be induced more efficiently by making the protein solution highly viscous or gelled and irradiating it with laser light.
  • the solution is a fluid
  • the time during which the target substance for crystallization (protein, etc.) is high in concentration is short, and crystal nucleation (hereinafter simply referred to as “nucleation”).
  • nucleation crystal nucleation
  • the size of bubbles generated is smaller than that of a solution, so that there are few molecules of the target substance gathering on the bubble surface.
  • the conventional technique has a limit in increasing the concentration of the target substance by cavitation.
  • an object of the present invention is to provide a target substance transfer method, a crystal manufacturing method, a composition manufacturing method, and a target substance transfer device that can easily and effectively increase the concentration of the target substance.
  • the target substance transfer method of the present invention comprises: A method of transferring the target substance in a first phase formed from a liquid phase or a solid phase containing a target substance into a second phase that is a liquid phase or a solid phase, A phase proximity step of bringing the first phase and the second phase into proximity; A bubble collapse step of generating bubbles in the vicinity of the boundary between the first phase and the second phase and causing the bubbles to collapse.
  • the crystal production method of the present invention comprises: A target substance transfer step for transferring a target substance to be crystallized, and a crystal precipitation step,
  • the target substance transfer step is a step of transferring the target substance from the first phase into the second phase by the target substance transfer method of the present invention
  • the crystal precipitation step is a step of precipitating crystals of the target substance inside or at the interface of the second phase after the target substance transfer step.
  • the method for producing the composition of the present invention comprises: Including the target substance transfer process,
  • the target substance transfer step is a step of transferring the target substance from the first phase into the second phase by the target substance transfer method of the present invention,
  • the composition is a composition containing the target substance in the second phase.
  • the target substance transfer device of the present invention comprises: An apparatus for transferring the target substance in a first phase formed from a liquid phase or a solid phase containing the target substance into a second phase that is a liquid phase or a solid phase, Phase proximity means for bringing the first phase and the second phase into proximity; And bubble collapse means for generating bubbles to be collapsed in the vicinity of the boundary between the first phase and the second phase.
  • a target substance transfer method it is possible to provide a target substance transfer method, a crystal manufacturing method, a composition manufacturing method, and a target substance transfer apparatus that can easily and effectively increase the concentration of a target substance.
  • FIG. 1 is a schematic view showing an example of the target substance transfer apparatus of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph illustrating the relationship between the nucleus generation rate and the irradiation laser light energy when laser light irradiation is performed in a one-phase system of lysozyme solution.
  • FIG. 3 is a graph illustrating the relationship between the nucleus generation rate and the wavelength and energy of irradiated laser light when laser light is irradiated into a one-phase system of lysozyme solution.
  • FIG. 4 is a photograph illustrating the change of bubbles over time when laser light is irradiated into a one-phase system of lysozyme solution.
  • FIG. 1 is a schematic view showing an example of the target substance transfer apparatus of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph illustrating the relationship between the nucleus generation rate and the irradiation laser light energy when laser light irradiation is performed in a one-phase system of lys
  • FIG. 5 is a graph illustrating the relationship between the maximum diameter of bubbles and the laser energy when laser light is irradiated into a one-phase system of lysozyme solution.
  • FIG. 6 shows an example of the change over time of the lysozyme concentration around the bubbles when laser light is irradiated into a one-phase lysozyme solution system.
  • FIG. 6A is a photograph
  • FIG. 6B is a graph.
  • FIG. 7 is a photograph showing an example of the change over time in the concentration of cytochrome C around the bubble when laser light is irradiated into the single-phase system of cytochrome C solution.
  • FIG. 8 is a graph showing an example of the nucleation rate in a lysozyme solution one-phase system and a lysozyme-containing gel one-phase system.
  • FIG. 9 is a photograph showing an example of the change over time of bubbles when there is no interface near the cavitation occurrence position and when there is no interface. The upper part of the figure is a case where there is no interface, and the lower part of the figure is a case where there is an interface.
  • FIG. 10 is a cross-sectional view schematically showing an example of a mechanism in the target substance transfer method of the present invention.
  • FIG. 11 is a cross-sectional view schematically illustrating a two-phase system of a liquid phase and a gel phase in a well.
  • FIG. 12A is a graph showing a nucleus generation rate in the example.
  • FIG. 12B is a photograph of the position of the lysozyme crystals precipitated in the example.
  • FIG. 13 is a graph showing the nuclear generation rate in another example.
  • FIG. 14A is a photograph showing a protein crystal produced in still another example together with a comparative example.
  • FIG. 14B is a photograph showing protein crystals produced in yet another example together with a comparative example.
  • FIG. 15 is a graph illustrating the relationship between the distance from the focusing point to the interface, the maximum bubble radius, and the bubble movement distance when bubbles are generated by laser beam focusing.
  • FIG. 16A is a graph illustrating the average number of precipitated crystals in yet another example.
  • FIG. 16B is a photograph illustrating crystals produced in the example of FIG. 16A.
  • FIG. 17 is a graph showing the nucleus generation rate in yet another example.
  • FIG. 18A is a graph showing a nucleus generation rate in still another example.
  • FIG. 18B is a photograph illustrating crystals produced in the example of FIG. 18A.
  • FIG. 19 is a graph showing the nucleus generation rate in still another example.
  • FIG. 20A is a photograph illustrating crystals produced in the reference example.
  • FIG. 20B is a photograph illustrating crystals produced in the example.
  • FIG. 21 is a photograph showing the protein transfer into Florinart (trade name) in yet another example.
  • FIG. 22 is a graph showing an example of a gel strength measurement result of an agarose gel.
  • FIG. 22 is a graph showing an example of a gel strength measurement result of an agarose gel.
  • FIG. 23 is a graph in which a part of the data of the graph of FIG. 22 is extracted.
  • FIG. 24 is a diagram schematically showing the arrangement of the gel on the well in still another example.
  • FIG. 25 is a diagram schematically showing a state in which an organic low molecular weight aqueous solution is further dispensed onto the well of FIG.
  • FIG. 26 is a photograph and a schematic diagram showing crystal precipitation by laser light irradiation in the examples of FIGS.
  • FIG. 27 is a photograph showing a state in which a protein moves from an aqueous protein solution into a gel in still another example.
  • the target substance transfer method of the present invention allows the target substance in the first phase formed from the liquid phase or solid phase containing the target substance to be contained in the second phase that is the liquid phase or solid phase.
  • the position where the bubbles are generated is not particularly limited as long as it is in the vicinity of the boundary between the first phase and the second phase.
  • the position where the bubbles are generated may be, for example, in the first phase or in the second phase, but is preferably in the first phase.
  • the target substance is not particularly limited, but is preferably an organic substance, and is a protein, natural protein, artificial protein, peptide, natural peptide, artificial peptide, nucleic acid, natural nucleic acid, artificial nucleic acid, lipid, natural lipid, artificial lipid, sugar chain, More preferably, it is at least one selected from the group consisting of natural sugar chains, artificial sugar chains, organic polymer compounds, organic low molecular compounds, biological materials, biopolymer compounds, and biological low molecular compounds.
  • the target substance may be used alone or in combination.
  • the biological material is not particularly limited, and examples thereof include biopolymer compounds, biomolecular compounds, proteins, natural proteins, artificial proteins, peptides, natural peptides, artificial peptides, nucleic acids, natural nucleic acids, artificial nucleic acids, Examples include lipids, natural lipids, artificial lipids, sugar chains, natural sugar chains, and artificial sugar chains, and one type may be used or a plurality of types may be used in combination.
  • the “biological substance”, “biopolymer compound” and “biological low molecular compound” may be a substance derived from a living body, but may be a synthetic substance having the same structure as that of the living body, or derived from a living body.
  • the biological substance when it is a biopolymer compound, it may be a polymer compound derived from a living body, a synthetic polymer compound having the same structure as it, or a derivative or artificial material having a structure similar to that of a bio-derived polymer compound. It may be a polymer compound.
  • the biological material when it is a biological low molecular weight compound, it may be a biologically derived low molecular weight compound, a synthetic low molecular weight compound having the same structure, or a derivative or artificial low molecular weight having a similar structure to the biologically derived low molecular weight compound. It may be a compound.
  • the biological substance when it is a protein, it may be a biologically derived (naturally-derived) protein, a synthetic protein, a naturally occurring natural protein, or an artificial protein having a non-naturally occurring structure.
  • the biological substance when it is a peptide, it may be a peptide derived from a living body (naturally-derived), a synthetic peptide, a naturally occurring peptide having a naturally occurring structure, or an artificial peptide having a non-naturally occurring structure.
  • the biological material when it is a nucleic acid, it may be a biological nucleic acid (naturally-derived) nucleic acid, a synthetic nucleic acid, a natural nucleic acid having a naturally occurring structure, or an artificial nucleic acid having a non-naturally occurring structure.
  • the biological material when it is a lipid, it may be a lipid derived from a living body (naturally-derived), a synthetic lipid, a natural lipid having a structure that exists in nature, or an artificial lipid having a structure that does not exist in nature.
  • the biological substance when it is a sugar chain, it may be a sugar chain derived from a living body (naturally derived), a synthetic sugar chain, a natural sugar chain having a naturally occurring structure, or an artificial sugar chain having a non-naturally occurring structure.
  • the natural nucleic acid is not particularly limited, and examples thereof include DNA and RNA.
  • the artificial nucleic acid is not particularly limited, and examples thereof include LNA and PNA.
  • the molecular weight of the organic substance is not particularly limited.
  • an organic substance having a molecular weight of 1000 or more may be referred to as “organic polymer compound”, and an organic compound having a molecular weight of less than 1000 may be referred to as “organic low molecular compound”, but is not limited thereto.
  • a biological material having a molecular weight of 5000 or more may be referred to as a “biopolymer compound”, and a biological material having a molecular weight of less than 5000 may be referred to as a “biological low molecular compound”, but is not limited thereto.
  • the biological substance is a peptide
  • the molecular weight is, for example, 300 or more.
  • the first phase is formed from a liquid phase or a solid phase containing the target substance.
  • the liquid phase is not particularly limited, and may be, for example, a solution, a suspension, or a dispersion (for example, an emulsion, a suspension, etc.) of the target substance.
  • the solid phase is not particularly limited.
  • the target substance is impregnated into a solid even in a gel or the like, in which a solution, suspension, dispersion (for example, emulsion, suspension, etc.) of the target substance is solidified. Things can be used.
  • the first phase is preferably a liquid phase, for example, as will be described later, so that the target substance can be easily transferred to the second phase.
  • a solid phase solid
  • a liquid phase liquid
  • an amorphous solid amorphous
  • a gel refers to a sol that has been solidified, but may also refer to a sol that has become a highly viscous liquid.
  • the liquid or solid in which the target substance is dissolved, suspended, or dispersed may be simply referred to as “medium”.
  • the liquid phase or solid phase may or may not contain a substance other than the target substance and the medium as appropriate.
  • the first phase may be a solution containing a protein and a precipitating agent.
  • the medium for the target substance is not particularly limited, and may be appropriately selected according to the type of the target substance, the composition of the second phase, and the like. Only one type of the medium may be used, or a plurality of types may be used in combination.
  • the concentration of the target substance is not particularly limited, and may be set as appropriate according to the purpose of the target substance transfer method of the present invention.
  • the first phase when the first phase is a solution, it may be a saturated solution, an unsaturated solution, or a supersaturated solution.
  • the concentration of the target substance in the solution is, for example, 0.5 to 20.0 times, preferably 0.8 to 10.0 times, more preferably 1.0 to 5.0 times the saturation concentration. is there.
  • the second phase is not particularly limited as long as it can be distinguished from the first phase by a physical boundary.
  • the physical boundary is preferably an interface between the first phase and the second phase. That is, the first phase and the second phase are preferably in contact with each other to form an interface from the viewpoint of ease of migration of the target substance.
  • the first phase and the second phase may form the interface due to, for example, the property that they do not mix themselves.
  • at least one of the first phase and the second phase may be a solid phase.
  • the first phase may be an aqueous phase and the second phase may be an oil phase.
  • the first phase may be an oil phase and the second phase may be an aqueous phase. May be.
  • the first phase and the second phase are separated by the presence of a membrane (for example, a reverse osmosis membrane) or another phase (solid phase, liquid phase, or gas phase) at the interface. May be.
  • the second phase may be a solid phase (solid) or a liquid phase (liquid).
  • solid phase solid
  • liquid phase liquid
  • an amorphous solid amorphous
  • a gel refers to a sol that has been solidified, but may also refer to a sol that has become a highly viscous liquid.
  • the second phase may be, for example, a solid phase, a gel, a liquid phase, an oil phase, an aqueous phase, or a protein film.
  • the liquid phase for example, a liquid having a high solubility of the target substance may be used, but an inert liquid such as fluorinate (a fluorine compound, a trade name of 3M Company) may be used.
  • fluorinate a fluorine compound, a trade name of 3M Company
  • the target substance transfer method of the present invention for example, even if the second phase is a phase in which it is difficult to dissolve the target substance, the target substance can be transferred. By utilizing this, for example, it can also be used in the crystal production method and composition production method of the present invention described later.
  • the second phase in which it is difficult to transfer the target substance is not particularly limited, for example, an inert liquid, an oil phase for a water-soluble target substance, an aqueous phase for a water-insoluble target substance, or Examples of the usual method include a solid phase in which the target substance is difficult to penetrate.
  • the hardness is not particularly limited.
  • the hardness of the solid phase can be expressed, for example, by compressive strength.
  • the lower limit value of the compressive strength when the first phase and the second phase are solid phases is not particularly limited, but is, for example, a value exceeding 0 or a measurement limit lower limit value by a measuring instrument.
  • the first phase is a solid phase, for example, from the viewpoint of easy generation and collapse of bubbles in the bubble collapse step, or into the second phase of the target substance From the viewpoint of ease of migration, it is preferably not too hard.
  • the upper limit of the compressive strength of the first phase is preferably 1000 Pa or less, more preferably 800 Pa or less, still more preferably 600 Pa or less, and particularly preferably 400 Pa or less.
  • the target substance is not too hard from the viewpoint of easy migration of the target substance into the second phase.
  • the upper limit value of the compressive strength of the second phase is preferably 3000 Pa or less, more preferably 2000 Pa or less, still more preferably 1500 Pa or less, and particularly preferably 1000 Pa or less.
  • the compressive strength is a numerical value measured at a frequency of 1 Hz and a measurement temperature of 20 ° C.
  • a rheo-stress RS1 Rheometer (trade name of a rheometer manufactured by Eihiro Seiki Co., Ltd.) in a dynamic viscoelasticity measurement mode.
  • the measured values shown in FIGS. 22 and 23 were also measured by this method.
  • this measurement method is an example of the compression strength measurement method, and the present invention is not limited by the steps and conditions in this measurement method. Even if other rheometers are used, if the measurement is performed in the same measurement mode, measurement temperature, and frequency, the measurement value of the same compressive strength can be obtained without errors.
  • the compressive strength is referred to as “gel strength”.
  • the compressive strength is the melting temperature temperature.
  • the measured value at the highest measurable temperature among the Celsius temperatures that are lower than 5 and divisible by 5 (example: 15 ° C., 10 ° C., 5 ° C., 0 ° C., ⁇ 5 ° C.).
  • the gel dissolution temperature is higher than 20 ° C.
  • the gel does not enter a gel state at 20 ° C. (in the form of a sol).
  • Is a measured value at the lowest measurable temperature among the Celsius temperatures eg, 25 ° C., 30 ° C., 35 ° C.
  • the shortest distance between the first phase and the second phase is preferably 4 times or less, more preferably 2 times or less of the maximum radius of the bubbles. This is because, if the distance is equal to or shorter than this distance, the target substance is easily transferred from the first phase to the second phase in the bubble collapse step.
  • the maximum radius of the bubble can be measured using a high-speed camera (sometimes referred to as a high-speed camera or a CCD camera) as in the following examples.
  • the shortest distance between the first phase and the second phase varies depending on the maximum radius of the bubble, but is, for example, 5000 ⁇ m or less, preferably 3000 ⁇ m or less, more preferably 1000 ⁇ m or less.
  • the phase proximity step is preferably an interface formation step in which the first phase and the second phase are brought into contact with each other to form an interface. That is, as described above, it is more preferable that the first phase and the second phase are in contact with each other to form an interface from the viewpoint of ease of migration of the target substance.
  • the bubble collapse step is a bubble collision step in which bubbles are generated in the vicinity of the interface and collide with the interface from the viewpoint of easy transfer of the target substance.
  • the position where the bubbles are generated may be in the first phase or in the second phase, but is preferably in the first phase.
  • a method for generating bubbles is not particularly limited, but in the vicinity of the boundary with the other phase in the first phase or the second phase (the first phase and the second phase).
  • laser light is easy to control the irradiation intensity, condensing point, etc., it is easy to set appropriate conditions for the transfer of the target substance.
  • ultrasonic irradiation can be performed at low cost.
  • the sum of the irradiation energy of the laser beam and the ultrasonic wave is not particularly limited, but is, for example, 60 nJ or more, preferably 100 nJ or more, more preferably 200 nJ or more.
  • the upper limit of the sum total of the irradiation energy is not particularly limited, it is, for example, 10 J or less.
  • the method for breaking the bubbles is not particularly limited.
  • the bubbles may be collapsed by cavitation behavior exhibited by the bubbles.
  • a method for causing bubbles to collide with the interface is not particularly limited.
  • the bubbles may move in the direction of the interface and collide with each other.
  • the bubbles may collide with the interface by cavitation behavior exhibited by the bubbles.
  • the bubbles may be automatically collided with the interface by cavitation behavior without using a special means for colliding the bubbles with the interface.
  • FIG. 9 shows an example of the cavitation behavior.
  • This figure is an example of the cavitation behavior when laser light is focused on ultrapure water in a glass cell, and is a photograph taken with a high-speed camera (sometimes called a high-speed camera or a CCD camera).
  • the upper part of the figure shows the cavitation behavior, that is, the change with time of bubbles when the laser beam is condensed (irradiated) at a position away from the wall surface of the container.
  • the lower part of the figure shows the cavitation behavior, that is, the change with time of bubbles when laser light is condensed (irradiated) in the vicinity of the wall surface of the container. All of the bubbles are generated at or near the laser beam condensing position.
  • ⁇ s in the figure represents the elapsed time (microseconds) from the start of laser light irradiation.
  • bubbles generated at a position away from the wall surface disappear without contacting the wall surface.
  • bubbles generated by laser irradiation in the vicinity of the container wall surface are accelerated so as to be attracted to the wall, collide with the wall, and disappear.
  • the present inventors have found such a phenomenon and reached the present invention. For example, by utilizing the cavitation behavior in the lower part of FIG. 9, molecules of the target substance adsorbed on the bubble surface are accelerated in the interface direction with the second phase and injected into the second phase. It is also possible to achieve target substance concentrations that are not normally reached in the second phase.
  • the generation of crystal nuclei can be promoted in the second phase, and a protein chip in which the protein is condensed at a high concentration in the gel can also be produced.
  • this mechanism is an example and does not limit the present invention.
  • the target substance transfer method using the mechanism (cavitation behavior) of FIG. 9 can be schematically exemplified as shown in the cross-sectional view of FIG.
  • 101 is a first phase (for example, a solution) containing a target substance
  • 102 is a second phase (for example, a gel).
  • Reference numeral 103 denotes particles (for example, molecules) of the target substance.
  • 104 is not limited to a laser beam,
  • other stimuli such as an ultrasonic wave
  • other stimuli such as an ultrasonic wave
  • a high concentration region of the target substance for example, protein
  • the target substance can be injected.
  • injection of a target substance into a specific site is a completely new concept technique in the field of crystal nucleus generation.
  • it is possible to realize a high concentration state at a level that cannot be realized in an equilibrium state, for example, as in the case of ion implantation into a semiconductor. Also useful.
  • the target substance in the first phase can be transferred into the second phase by the collapse of the bubbles.
  • the second point is generated from the condensing point of the laser beam.
  • the distance to the surface on the first phase side in the phase is the distance of the bubbles It is preferable from the viewpoint of easy transfer of the target substance into the second phase that is not more than 4 times the maximum radius.
  • the distance from the condensing point of the laser to the first phase side surface in the second phase is more preferably twice the maximum radius of the bubbles.
  • the first phase and the second phase are in contact with each other to form an interface, and the distance from the condensing point of the laser beam to the interface is a maximum radius of the bubble. 2 times or less.
  • the bubbles are likely to collide with the interface due to cavitation behavior, and thus the target substance is more easily transferred into the second phase.
  • the mechanism by which the target substance in the first phase moves into the second phase is not necessarily clear.
  • the mechanism is estimated as follows, for example, when the second phase is a gel. That is, first, in the bubble collapse step, when the bubbles collapse in the first phase or in the gel (second phase) (particularly when the bubbles collide with the interface in the bubble collision step). ), A flow of material in the first phase flows into the gel (second phase). At this time, force is applied to the gel (second phase), and the gel is deformed. For this reason, the mesh size of the gel (the size of the molecular network) increases at the location where the force is applied, and the target substance in the first phase passes through the increased mesh size. And move into the gel.
  • the target substance in the gel is prevented from returning to the first phase.
  • the gel strength is preferably not too high as described above.
  • the method for producing a crystal according to the present invention includes a target substance transfer step for transferring a target substance to be crystallized, and a crystal precipitation process, and the target substance transfer step includes the target substance of the present invention.
  • the target substance may be an organic low molecular weight compound or any other substance.
  • the first phase and the second phase are not particularly limited and are arbitrary.
  • a bubble is mainly generated in the said 1st phase (for example, protein solution) in the said bubble collapse process is demonstrated.
  • the present invention is not limited to this, and for example, bubbles may be generated in the second phase in the bubble collapse step. Specifically, these are as described in, for example, the target substance transfer method of the present invention.
  • the first phase may be a solid phase (eg, gel), but is preferably a liquid phase.
  • the liquid phase will be mainly described.
  • a liquid phase described below may be added with a gelling agent similar to the second phase described later.
  • the medium (solvent etc.) in the first phase is not particularly limited. Specific examples of the medium include water, ethanol, methanol, acetonitrile, acetone, anisole, isopropanol, ethyl acetate, butyl acetate, chloroform, cyclohexane, diethylamine, dimethylacetamide, dimethylformamide, toluene, butanol, and butyl methyl ether.
  • the target substance is water-soluble, for example, it is convenient and preferable to use water or a mixed solvent containing water.
  • the concentration of the target substance is not particularly limited, but in the case of biological substances such as proteins and nucleic acids, for example, 0.5 to 200 mg / mL, preferably 1.0 to 100 mg / mL, more preferably 2.0 to 50 mg / mL. mL.
  • the second phase is optional as described above.
  • the second phase is preferably a gel, for example.
  • Crystal production in a gel has advantages such as easy to obtain crystals having excellent strength and quality, and is difficult to break because the crystal is coated with the gel. This is particularly advantageous when, for example, brittle and fragile crystals such as proteins and nucleic acids are subjected to X-ray crystal structure analysis.
  • the second phase is a gel, for example, crystals are more likely to precipitate than when the second phase is a solution.
  • the gel can be produced by, for example, dissolving a gelling agent in a solvent and solidifying (gelling) the gelling agent.
  • the solvent is not particularly limited, but for example, water, ethanol, methanol, acetonitrile, acetone, anisole, isopropanol, ethyl acetate, butyl acetate, chloroform, cyclohexane, diethylamine, dimethylacetamide, dimethylformamide, toluene, butanol, butyl methyl ether , Hexane, benzene, methyl ethyl ketone, and the like.
  • the gelling agent is not particularly limited, but is preferably at least one selected from the group consisting of a polysaccharide, a thickening polysaccharide, a protein, and a gelled gel at elevated temperature, for example, agarose, agar, More preferably, it is at least one selected from the group consisting of carrageenan, gelatin, collagen, polyacrylamide, and gelled polyacrylamide gel at elevated temperature.
  • the gelation temperature is not particularly limited, but is, for example, 0 to 90 ° C., preferably 0 to 60 ° C., more preferably 0 to 35 ° C. from the viewpoint of ease of crystal production.
  • the gelling agent may be, for example, a gel that gels at a low temperature and forms a sol at a high temperature, or a gel that forms a sol at a low temperature and gels at a high temperature. Gels that sol at a low temperature and gel at a high temperature are referred to as “gels at elevated temperature”. Further, for example, a gel that returns to a sol again when the temperature of the gel obtained by cooling is increased again or when the temperature of the gel obtained by increasing temperature is cooled again is preferable. Such a gelling agent is called “thermo-reversible gel”.
  • the gelling agent may be, for example, a hydrogel or an organogel, but is preferably a hydrogel.
  • the hydrogel for example, it is more preferable to use a gelled hydrogel at elevated temperature.
  • the gelled hydrogel at elevated temperature has the property of solling at a low temperature and gelling at a high temperature as described above, contrary to a general gel that gels at a low temperature and sols at a high temperature.
  • the coated crystal coated with the gelled hydrogel at elevated temperature has advantages such as being particularly strong in drying and capable of easily removing the gel by cooling.
  • limit especially as a gelatinization type hydrogel at the time of temperature rising For example, a meviol gel is mentioned.
  • Mebiol gel is a trade name of a gelled hydrogel produced by Mebiol Co., Ltd. and has the following chemical structure, for example.
  • Meviol gel is a polyacrylamide gel having properties as a gelling hydrogel at elevated temperature and properties as a thermoreversible hydrogel.
  • the second phase may or may not contain the target substance.
  • the interface may be formed by contacting with the first phase.
  • the target substance in the first phase is allowed to stand for a while, for example. You may make it transfer in the said 2nd phase.
  • a solution (first phase) containing a target substance may be brought into contact with a gel (second phase) to transfer the target substance into the gel.
  • a gel second phase
  • the second phase is a gel containing the target substance
  • it can be prepared, for example, by adding a gelling agent to the target substance solution and gelling.
  • the gelling agent may be added directly to the target substance solution, but it is preferable to prepare a gelling agent solution separately and then mix it with the target substance solution because it is easy to mix uniformly.
  • the solvent of the gelling agent solution is not particularly limited, but is the same as the target substance solution, for example.
  • the concentration of the gelling agent in the gelling agent solution is not particularly limited, but from the viewpoint of the gel strength and the like described later, for example, 0.1 to 50% by mass, preferably It is 0.1 to 30% by mass, more preferably 0.1 to 20% by mass, still more preferably 0.2 to 15% by mass, and particularly preferably 0.2 to 10% by mass.
  • the method of gelling after adding a gelling agent to the target substance solution is not particularly limited.
  • the gelling agent solution may be prepared at a temperature higher than the gelation temperature (for example, 20 to 45 ° C.), mixed with the target substance solution, and then allowed to stand at a temperature equal to or lower than the gelation temperature.
  • the gelling agent solution and the target substance solution may be sealed in a capillary and gelled in the capillary.
  • the gel is sealed in the capillary.
  • the gelling agent solution may be prepared at a low temperature, mixed with the target substance solution, and then gelled by increasing the temperature.
  • the gel strength after the gelation is, for example, 5 Pa or more, preferably 10 Pa or more, more preferably 30 Pa or more, from the viewpoint of easily protecting the target substance crystal precipitated in the crystal precipitation step described later from physical impact. Preferably it is 50 Pa or more, Most preferably, it is 100 Pa or more. Further, as described above, the gel strength after the gelation is preferably not too high from the viewpoint of easy migration of the target substance into the gel.
  • the upper limit value is, for example, as described as the upper limit value of the compressive strength of the second phase in the target substance transfer method of the present invention.
  • the gel strength after gelation can be appropriately set by adjusting the gelling agent concentration.
  • the gel strength at the same gelling agent concentration varies depending on the type of the gelling agent. For example, as shown in the graph of FIG. 22, agarose III, agarose SP (Agarose Sea Plaque), and agarose 9A (all trade names of Takara Bio Inc.) are usually agarose after gelation at the same concentration.
  • the gel strength increases in the order of III> agarose SP> agarose 9A.
  • the measurement result of only the agarose 9A in FIG. 22 is shown in the graph of FIG. 22 and 23, the horizontal axis represents the concentration (% by mass) of each agarose, and the vertical axis represents the gel strength (g / cm 2 ).
  • 1 g / cm 2 corresponds to 98.0665 Pa.
  • the gelling agent concentration is less than a certain critical concentration, the gel strength cannot be measured (0 on the graph) because the solution containing the gelling agent does not clearly gel.
  • the gelling agent concentration is equal to or higher than the critical concentration, the gel strength can be measured because the solution can be clearly gelled.
  • the concentration of the gelling agent is not less than the critical concentration.
  • the critical concentration is about 0.6% by mass as shown in FIG. 22 and FIG.
  • the gel (second phase) does not contain the target substance
  • the gel is prepared in the same manner as described above (for example, by dissolving only the gelling agent in a solvent) except that the target substance is not added. be able to.
  • the gel containing no target substance (second phase) is allowed to stand in contact with the solution containing the target substance (first phase), and impregnated with the target substance.
  • the bubble collision step may be performed.
  • the contact time between the first phase and the second phase is not particularly limited, and is, for example, 0 to 240 hr, preferably 0 to 72 hr, more preferably 0 to 24 hr.
  • the bubble collision step may be performed after the target substance concentration is brought into contact in the first phase and the second phase until equilibrium is reached.
  • a precipitating agent may be used. This method is particularly effective when the target substance is a substance that is difficult to crystallize (eg, protein, nucleic acid, etc.).
  • the method for using the precipitating agent is not particularly limited.
  • the precipitating agent may be included in the second phase as in the examples described later.
  • the precipitating agent is not particularly limited, and for example, the same precipitating agent as used in a known crystal production method may be used.
  • the precipitating agent examples include sodium chloride, calcium chloride, sodium acetate, ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium sulfate, potassium sodium tartrate, sodium citrate, PEG (polyethylene glycol), magnesium chloride, sodium cacodylate, HEPES (2 -[4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid), MPD (2-methyl-2,4-pentanediol), and Tris-HCl (trishydroxymethylaminomethane hydrochloride) It is at least one selected.
  • the concentration thereof is not particularly limited, but is, for example, 0.0001 to 10M, preferably 0.0005 to 8M, more preferably 0.0005 to 6M.
  • the said precipitating agent may contain the pH adjuster etc. suitably as needed.
  • the precipitating agent may also be referred to as “precipitating agent”.
  • the precipitating agent may be contained in the first phase instead of or in addition to the second phase.
  • the concentration thereof is not particularly limited, but is the same as, for example, the case where it is included in the second phase.
  • the first phase containing the precipitating agent may be brought into contact with the second phase (gel or the like) and impregnated with the precipitating agent.
  • the contact time between the first phase and the second phase is not particularly limited, and is, for example, 0 to 240 hr, preferably 0 to 72 hr, more preferably 0 to 24 hr.
  • the bubble collision step may be performed after the precipitating agent concentration is brought into contact in the first phase and the second phase until equilibrium is reached.
  • the crystallization (crystallization precipitation) of the target substance can be controlled by, for example, the substance amount ratio of the target substance to be used and the precipitating agent.
  • the substance amount ratio in more detail, for example, it is possible to obtain a higher quality and larger single crystal.
  • the gel for example, agarose gel
  • the precipitating agent for example, the first phase
  • a concentration gradient of the precipitating agent can also be formed therein. This makes it possible to easily control the substance amount ratio between the target substance and the precipitating agent in the second phase.
  • the diffusion rate of the precipitating agent is sufficiently slower than the crystal growth rate.
  • the target substance such as the protein can be crystallized under the optimum mixing ratio, the production of the crystal is further simplified. Accordingly, the production method of the present invention can also be applied to a crystallization screening method as a “combinatorial crystallization technique” capable of searching a mixture ratio of various combinations all at once.
  • phase proximity process is preferably an interface formation process in which the first phase and the second phase are brought into contact with each other to form an interface.
  • This interface forming step includes, for example, a step of bringing the first phase and the second phase into contact with each other and allowing them to stand for a while and impregnating the second phase (gel or the like) with the target substance or the like. It may be included.
  • this bubble collapse step is preferably a bubble collision step in which bubbles are generated in the vicinity of the interface in the first phase and collide with the interface.
  • the method of generating and collapsing bubbles is, for example, as described in the target substance transfer method of the present invention. That is, for example, by laser light irradiation, in the vicinity of the second phase in the first phase (when the first phase and the second phase are in contact with each other to form an interface, the interface Air bubbles are generated in the vicinity.
  • the generated bubbles collapse (preferably, collide with the interface) due to, for example, cavitation behavior as described above.
  • a femtosecond laser is particularly preferable from the viewpoint of easy control of the condensing point, bubble size, and the like, or difficulty in inducing unnecessary heat and chemical reaction.
  • the total sum of the laser beam irradiation energies is not particularly limited, and is, for example, as described in the target substance transfer method of the present invention.
  • the pulse width of the laser beam is not particularly limited, but is, for example, 10 ⁇ 15 to 10 ⁇ 6 seconds, preferably 10 ⁇ 15 to 10 ⁇ 9 seconds, and more preferably 10 ⁇ 15 to 10 ⁇ 12 seconds.
  • the frequency of the laser beam is not particularly limited, but is, for example, 1 to 10 6 Hz, preferably 1 to 10 4 Hz, more preferably 1 to 10 3 Hz.
  • the irradiation time of the laser light is not particularly limited, but is, for example, 0.01 to 10 6 seconds, preferably 0.1 to 10 5 seconds, and more preferably 1 to 10 4 seconds.
  • the target substance is transferred from the first phase into the second phase, and then crystals are precipitated in the second phase or at the interface (the “crystal precipitation”).
  • the method for precipitating the crystal is not particularly limited.
  • the second phase is kept until the first phase and the second phase are in contact with each other or after the first phase is removed until the crystal is precipitated. It is sufficient to leave the phase of From the viewpoint of the stability of the precipitated crystals and the continuous supply of the target substance, it is preferable to leave the first phase as it is without removing it.
  • the temperature at the time of standing is not particularly limited, but is, for example, 0 to 200 ° C., preferably 0 to 150 ° C., more preferably 0 to 100 ° C.
  • the target substance for example, protein
  • the target substance transfer step is infiltrated by the target substance transfer step, and the target substance is left in the second phase (for example, gel) in which the target substance concentration is increased while being retained. You can also.
  • the crystal production method of the present invention for example, it is difficult to crystallize by laser light irradiation in a liquid phase (solution, dispersion, suspension, etc.) containing a target substance or in a solid phase (gel, etc.). Even the target substance can be crystallized to obtain crystals.
  • the crystal production method of the present invention is particularly effective for producing crystals of target substances that are difficult to crystallize (for example, biological substances such as proteins and nucleic acids). The reason for this is unknown, but, for example, as described above, it is considered that the concentration of the target substance in the second phase is likely to be higher than that of a normal method.
  • the impact caused by the collapse of the bubbles induces the generation of crystal nuclei in the second phase or at the interface, and This is likely to happen.
  • these mechanisms are speculations and do not limit the present invention.
  • the crystal precipitated in the second phase or at the interface is, for example, entirely or partially covered with the second phase.
  • the mechanism is unknown, but there are advantages such as easy to obtain crystals with excellent strength and quality as described above. Further, as will be described later, there is an advantage that the crystal is covered with the gel and is not easily broken.
  • the target substance transfer step and the crystal precipitation step it is preferable to stir at least one of the first phase and the second phase.
  • the mechanism is unknown, it is also possible to obtain a crystal with higher resolution (smaller resolution) that is more suitable for, for example, X-ray crystal structure analysis.
  • This method is particularly suitable for target substances (for example, proteins such as xylanase, AcrB, human lysozyme, and adenosine deaminase, nucleic acids, etc.) that are difficult to obtain high-resolution crystals suitable for X-ray crystal structure analysis without stirring. It is valid.
  • the resolution for X-ray crystal structure analysis is, for example, 3.5 mm or less, preferably 3.0 mm or less, more preferably 2.6 mm or less, further preferably 2.2 mm or less, and particularly preferably 1.8 mm or less. .
  • the lower limit of the resolution is not particularly limited, but is, for example, a value exceeding 0 ⁇ . Note that 1 mm is equal to 10 ⁇ 10 m (1/10 nm).
  • the stirring speed is not particularly limited, but is, for example, 10 to 250 rpm, preferably 20 to 200 rpm, more preferably 30 to 150 rpm.
  • the stirring time is not particularly limited, but for example, 0.5 minutes to 1.0 ⁇ 10 6 minutes, more preferably 1.0 minutes to 1.0 ⁇ 10 5 minutes, and particularly preferably 1.0 minutes to 5.0 ⁇ 10 4 minutes.
  • the crystal precipitation step in the present invention may be performed with or without removing the first phase.
  • the first phase is not removed and the first phase is removed. It is also possible to obtain the effect by stirring by performing the phase 1 while stirring.
  • the second phase may be, for example, a gel as described above, but may also be a sol solution containing a gelling agent.
  • a sol solution by including a gelling agent, there are cases where an effect is obtained that crystals are likely to precipitate and that damage to crystals is less likely to occur.
  • the method for crystallizing the biological material in the gelling agent solution in the sol state is particularly useful when, for example, the gelling agent is a thermoreversible hydrogel.
  • the target substance for example, biological substance such as protein, nucleic acid, etc.
  • the target substance for example, biological substance such as protein, nucleic acid, etc.
  • the solution is gelled, It is particularly preferable to further grow the target substance crystal in the gel.
  • the crystal produced by the crystal production method of the present invention is preferably, for example, a coated crystal coated with the gel.
  • the production conditions of the coated crystal are not particularly limited.
  • the crystal of the biological material is precipitated from the gel, so that the coated crystal covered with the gel is necessarily formed. Also good.
  • the covering crystal is particularly preferably entirely covered with the gel, but only a part may be covered with the gel.
  • crystals of biological materials such as proteins are brittle and are easily altered by drying or the like. For this reason, biological material crystals are damaged by physical impact or drying unless they are operated carefully and quickly, for example, when they are used as samples for crystal structure analysis (mounting) and when they are used as seed crystals (seeding).
  • the coated crystal has improved resistance to drying and physical impact because the crystal is coated with a gel, and the crystal is hardly deteriorated or damaged. For this reason, for example, the mounting operation and the seeding operation are extremely easy to perform. Furthermore, the preservability of crystals is improved.
  • the gel covering the crystal is preferably removed in advance if there is a problem such as causing measurement noise in the crystal structure analysis described later.
  • the removal method is not particularly limited.
  • the gel is a thermoreversible hydrogel
  • the gel becomes a sol by cooling and can be easily removed.
  • the cooling temperature for making the sol is not particularly limited, but in the case of meviol gel, for example, it is 15 ° C. or lower.
  • the coated crystal can be processed by an appropriate method, and only the crystal not containing the gel can be taken out.
  • the processing method is not particularly limited, for example, there is processing using laser light.
  • the laser light is not particularly limited, but it is particularly preferable to use a femtosecond laser.
  • the femtosecond laser can be processed only in the vicinity of the condensing point, and thus has an advantage that it can be easily processed while the crystal manufacturing (growing) container is sealed, for example.
  • a crystal can be cut into a size and shape suitable for applications such as structural analysis.
  • the crystal having the appropriate size and shape can be manufactured by cutting the crystal into an appropriate size and shape by such a processing step.
  • the processing step it is possible to appropriately remove only the gel from the coated crystal and manufacture a processed crystal that leaves only the crystal portion. That is, the processed crystal may be a coated crystal coated with a gel or may not be coated with a gel.
  • a high-quality and large-sized crystal can be obtained with a higher probability than in the past, and according to the screening method (concentration gradient method) using the above-described concentration gradient formation, A wide range of search conditions (combinatorial search) is possible. With respect to these, for example, it is possible to obtain results superior to the vapor diffusion method that has been conventionally most commonly used for crystallization of proteins and the like.
  • the crystal manufacturing method of the present invention for example, by precipitating crystals of the biological material in the second phase (for example, gel) or from the interface with the first phase, the following advantages are obtained. You can also get the second phase (for example, gel) or from the interface with the first phase.
  • the crystal obtained in the solution freely moves in the solution when the crystal is mounted, it may be damaged before the X-ray measurement by indirect or direct contact with the loop or the like. For this reason, in order to perform measurement with high accuracy, a skilled skill in handling the loop is required.
  • the biological material crystal is fixed in the gel by, for example, precipitating the crystal of the biological material (protein, etc.) from the gel or the interface with the first phase, particularly from the gel. It will be in the state. Therefore, the mounting operation is easy and the mounting operation is highly reproducible due to the fact that the biological material crystal is fixed by the gel and the movement is inhibited, and the biological material crystal is protected by the gel and is not easily damaged. According to this, for example, by automating the crystal mounting process, it is possible to achieve full automation of X-ray structural analysis of protein crystals and the like, which could not be achieved conventionally.
  • the second phase is a solid phase such as a gel
  • the target substance is a biological substance such as a protein or a nucleic acid. Any substance may be used.
  • the second phase is not limited to a solid phase such as a gel as described above.
  • the second phase may be a liquid phase.
  • the target substance may be water-soluble
  • the first phase may be an aqueous phase
  • the second phase may be an oil phase.
  • the target substance may be water-insoluble
  • the first phase may be an oil phase
  • the second phase may be an aqueous phase.
  • the second phase may be an inert liquid such as florinate regardless of the target substance and the first phase. Even if the second phase is a liquid phase in which it is usually difficult to transfer the target substance, as described above, according to the target substance transfer method of the present invention, the target phase is contained in the second phase.
  • the substance can be transferred and dissolved, suspended, dispersed, etc. in the second phase, for example.
  • the crystal production method of the present invention using a liquid phase as the second phase is particularly effective, for example, when the target substance is an organic low molecule, a functional organic polymer, or the like.
  • This method can be used, for example, for producing a crystal of a target substance such as a low molecular weight organic compound or a functional organic polymer having pharmacological activity, and for producing a pharmaceutical or pharmaceutical composition containing the target substance.
  • the target substance is not limited to this and may be any other substance. Specifically, for example, as described in the target substance transfer method of the present invention.
  • the method for producing a composition according to the present invention includes a target substance transfer step, and the target substance transfer step is configured to remove the target substance from the first phase by the target substance transfer method of the present invention. It is a step of transferring into the second phase, wherein the composition is a composition containing the target substance in the second phase.
  • the method for producing the composition of the present invention is not particularly limited.
  • the composition produced by the method for producing a composition of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a protein chip in which a protein is condensed at a high concentration in a gel as described above.
  • a protein chip in which a protein is condensed at a high concentration in a gel as described above Other than this, for example, an analysis sample used in analysis or the like, a circuit or an integrated body such as an organic functional device, and the like can be given.
  • an analysis sample used in analysis or the like a circuit or an integrated body such as an organic functional device, and the like can be given.
  • the composition production method of the present invention can produce a composition having a novel composition, which was difficult to produce by the conventional method.
  • the target substance transfer device of the present invention puts the target substance in the first phase formed from the liquid phase or solid phase containing the target substance into the second phase that is the liquid phase or solid phase.
  • the target substance transfer apparatus of the present invention is not particularly limited.
  • FIG. 1 schematically shows an example of the target substance transfer apparatus of the present invention.
  • this apparatus includes a femtosecond laser 1, a green laser 2, a container 3, a lens 4, a beam splitter 5, dichroic mirrors 6 and 7, a shutter 8, an infrared light blocking filter 9, a photo detector 10, and a function generator 11.
  • Laser light emitted from the femtosecond laser 1 can be separated by the beam splitter 5. A part of the separated laser beam can be reflected by the dichroic mirror 6 and irradiated onto the sample in the container 3 through the objective lens 14.
  • the sample includes the first phase and the second phase, and the laser light is irradiated in the vicinity of the second phase in the first phase.
  • the remainder of the laser beam separated by the beam splitter 5 can be detected by the photodetector 10 and used for controlling the shutter 8 and the function generator 11.
  • the shutter 8 By opening and closing the shutter 8, irradiation (pulse width, irradiation time, etc.) of the laser light emitted from the femtosecond laser 1 onto the sample in the container 3 can be controlled.
  • the function generator 11 can function as a generator for generating an arbitrary waveform for the femtosecond laser 1 and can also be used for controlling the CCD camera 12 and the strobe light source 13.
  • the green laser 2 can be used for controlling a condensing point of laser light emitted from the femtosecond laser 1.
  • the laser light emitted from the green laser 2 can pass through the lens 4, be reflected by the dichroic mirror 7, and irradiate the sample in the container 3 through the objective lens 14.
  • the first phase and the second phase are brought close to each other (preferably in contact with each other to form an interface) in the container 3. It can be said that there is.
  • the apparatus shown in the figure does not have any special means for causing the generated bubbles to collide with the interface, and the bubbles collapse (preferably, collide with the interface) due to cavitation behavior.
  • the femtosecond laser 1, the beam splitter 5, the photodetector 10, the shutter 8, and the dichroic mirror 6 irradiate laser light in the vicinity of the second phase in the first phase to generate bubbles, Collapse (preferably, colliding with the interface with the second phase). Therefore, for example, the combination of the femtosecond laser 1, the beam splitter 5, the photodetector 10, the shutter 8, and the dichroic mirror 6 can be said to be the “bubble collapse means”.
  • an apparatus having the structure shown in FIG. 1 was used for laser light irradiation.
  • IFRIT-SA10 (trade name) manufactured by Cyber Laser was used.
  • the fundamental wavelength of this laser is 780 nm, and it is possible to oscillate 260 nm laser light by wavelength conversion.
  • the pulse time width can be selected from 200 to 2000 fs.
  • the frequency of the laser beam was 1 kHz in the following examples and reference examples unless otherwise specified.
  • the state of the focusing point is observed with a high-speed (CCD) camera 12 (HyperVision HPV-2 [product name] from Shimadzu Corporation, or Photon MAX 512B [product name] from Princeton Instruments) with a time resolution of microsecond order. Is possible.
  • CCD high-speed
  • a 96-well Imp @ ct plate (trade name) manufactured by Greiner was used as a crystal production (growth) container (reference numeral 3 in FIG. 1) unless otherwise specified.
  • the nucleation rate shown in each example or reference example is a value obtained by dividing the number of wells in which crystal generation was observed by the number of all wells used, unless otherwise specified.
  • “shot” or “shots” represents the number of times of laser light irradiation.
  • Crystals were prepared using a lysozyme solution one-phase system that did not contain a second phase. That is, first, in a crystal production container (plate), a 40 mg / mL lysozyme aqueous solution (an aqueous solution (pH 4.5) containing 0.1 M sodium acetate as a pH adjusting agent, lysozyme and 3 wt% sodium chloride as a precipitating agent). 100 ⁇ L was dispensed into each well in an equal amount.
  • the total energy (laser energy) of the irradiated laser light was variously changed, and the nucleus generation rate was confirmed.
  • the laser is irradiated at a certain energy threshold (200 fs: 0.7 ⁇ J / pulse or 1800 fs: 1 ⁇ J / pulse) or more, it is compared with the case where no laser light is irradiated. As a result, an increase in nucleation rate (promotion of nucleation) was observed.
  • the threshold required for nucleation increases, so it is considered that nucleation is induced using nonlinear absorption by femtosecond laser as a trigger (factor).
  • a threshold value was similarly observed in the laser energy intensity at which nucleation promotion occurred.
  • the threshold value is slightly different from that shown in FIG. 2 because the numerical aperture (NA) of the objective lens used is different.
  • NA numerical aperture
  • the absorption efficiency of the laser light was high, precipitation that appeared to be a denatured product of protein occurred at the condensing point. Since this precipitation was also observed under conditions where nucleation promotion did not occur, it is presumed that the photochemically generated protein denatured product is not the main trigger (main factor) of nucleation in this reference example.
  • ⁇ Reference Example 2 Cavitation behavior by laser light irradiation in protein solution> The state of the lysozyme solution when the lysozyme solution (aqueous solution) in Reference Example 1 was irradiated with laser light was observed using a high-speed (CCD) camera. As a result, as shown in the photograph of FIG. 4, bubbles are generated from the condensing point within a few microseconds after laser light irradiation, and collapsed in about several tens of microseconds while repeating expansion and contraction, leaving fine bubbles remaining. Cavitation behavior was confirmed. In addition, it was confirmed using a submerged pressure sensor that a shock wave was generated when cavitation occurred.
  • the cavitation generation (bubble generation) thresholds (200 fs: 0.2 ⁇ J / pulse, 1800 fs: 0.7 ⁇ J / pulse) Quantitatively determined and confirmed to be similar to the lysozyme nucleation threshold.
  • the maximum expansion and contraction rate of cavitation ( ⁇ 60 ⁇ m / ⁇ s) estimated from this observation result was three orders of magnitude greater than the free diffusion rate of solute (lysozyme to 0.015 ⁇ m / ⁇ s).
  • Such high-speed expansion / contraction behavior is considered to cause local concentration fluctuations in the solution, and it is assumed that this can be a trigger (factor) of nucleation.
  • FIG. 6A is a photograph showing the time-dependent change of the high-speed fluorescence image observation
  • FIG. 6B is a graph showing the fluorescence intensity distribution at 20 ⁇ s after laser irradiation.
  • the horizontal axis represents the measurement position ( ⁇ m), and the vicinity of 80 ⁇ m is the focal point.
  • the vertical axis represents the fluorescence intensity. As shown in the figure, a particularly strong tendency was observed near the focal point.
  • the concentration distribution of the solution was observed as the lightness distribution of the image. As a result, as shown in the photograph of FIG. It was confirmed that a low-concentration region was formed near the condensing point and a high-concentration region was formed around it.
  • the protein crystallization technique (crystal production method) using light includes molecular alignment by a photoelectric field and crystallization using a protein denatured product generated by ultraviolet light absorption as a nucleus.
  • the method of this reference example acts on an essential part of nucleation called supersaturation. Therefore, according to the principle of this reference example, it is not limited to lysozyme, and nucleation can be induced for any other protein or any other target substance regardless of its type and physical properties. Can be inferred. If this principle is applied to a two-phase system of the first phase and the second phase, for example, the crystal production method of the present invention can be carried out as in the examples described later.
  • ⁇ Reference Example 3 Production of protein crystals by laser light irradiation in gel>
  • a gel is added to the same lysozyme solution (aqueous solution) as in Reference Example 1 to increase the viscosity, thereby suppressing molecular diffusion and prolonging the relaxation time in the high protein concentration region due to cavitation to increase the probability of nucleation. Tried to increase.
  • 1 wt% (weight%) agarose was added, and the diffusion constant of the lysozyme monomer was reduced to 50 to 80%.
  • This gel-added solution was irradiated with femtosecond laser light under conditions of 5.5 ⁇ J / pulse, 1 pulse, and 80 shot, and then allowed to stand for a certain period of time to observe the generation of crystals (crystal nuclei), and the nucleation rate ( %) was calculated. Note that “80shot” represents not the number of irradiations but 80 points in one well.
  • crystals were also produced (nucleation) in the same way for a lysozyme aqueous solution to which no gel (agarose) was added for comparison. The result is shown in the graph of FIG. FIG.
  • FIG. 3 is a three-dimensional graph showing the correlation between the nucleation rate and various conditions in the crystal production (nucleation) of this reference example.
  • the axis in the depth direction indicates the standing time (1 to 5 days) after the laser irradiation, and the axis in the horizontal direction on the paper indicates various other conditions in parallel.
  • “Agarose free” represents that no agarose was added, and “1 wt% agarose” represents that 1 wt% agarose was added.
  • “7 mg / mL”, “8 mg / mL”, “4 mg / mL”, and “6 mg / mL” represent lysozyme concentrations, respectively.
  • aqueous solution pH 4.5
  • 0.1 M sodium acetate as a pH adjuster was used as the solvent.
  • the nucleation rate is shown on the vertical axis of the drawing. As shown in the figure, when no agarose was added, no nucleation was observed in the low supersaturated solution having a supersaturation degree ⁇ of 1.3 or less regardless of the presence or absence of laser light irradiation.
  • the correlation between the distance from the condensing point of the laser beam to the wall surface and the maximum radius and moving distance of the bubbles observed by the CCD camera was confirmed.
  • the result is shown in the graph of FIG.
  • the horizontal axis indicates the distance ( ⁇ m) from the condensing point of the laser beam to the wall surface.
  • the condensing point of a laser beam is substantially equal to the bubble generation point.
  • the vertical axis represents the maximum bubble radius ( ⁇ m) or the bubble movement distance ( ⁇ m).
  • ⁇ indicates the correlation between the maximum radius of the bubble and the distance from the condensing point of the laser beam to the wall surface.
  • (2) represents the correlation between the distance traveled by the bubble and the distance from the focal point of the laser beam to the wall surface.
  • the laser irradiation position condensing point
  • the bubbles moved greatly toward the wall surface and collapsed without contracting.
  • Such bubble movement and collapse was noticeable when the distance between the condensing point and the wall surface was less than twice the bubble maximum radius.
  • Bubbles generated by laser light irradiation usually collapse after repeated expansion and contraction, but the number of expansions and contractions increases as the irradiation laser energy increases, and the maximum radius of the bubbles tends to increase. .
  • the collapse due to the collision of bubbles with the container wall surface suppresses the formation of a high concentration region of the crystallization target substance.
  • the size of the crystal growth vessel and the solution volume can be a factor in determining the laser energy suitable for nucleation.
  • the induction efficiency of nucleation decreased when bubbles moved and collided with the wall surface by laser light irradiation near the container wall surface.
  • irradiating laser light near the interface with the gel in the solution has higher nucleation (crystal production) efficiency than irradiating laser light far from the interface It is thought that it falls.
  • the present inventors have found that, on the contrary, the efficiency of nucleation (crystal production) is improved by irradiating a laser beam near the interface with the gel and causing bubbles to collide with the interface. The results are shown in the following examples.
  • Example 1 Production of lysozyme crystals in a two-phase system of solution and gel> Lysozyme crystals were produced in a two-phase system of lysozyme solution (said “first phase”) and gel (said “second phase”). That is, first, as shown in FIG. 11, a gel 102 containing a precipitating agent was laid on the bottom of a well of a crystal production (growth) container (Imp @ ct plate).
  • aqueous solution containing 1M was dispensed in 3 to 4 ⁇ L in each well and allowed to stand for 1 day or longer to completely gel. Furthermore, as shown in FIG. 11, 5 to 6 ⁇ L of 13 mg / mL lysozyme aqueous solution 101 was dispensed into each well and left for 3 days or longer to soak lysozyme in the gel. Although not confirmed, it is considered that the lysozyme concentration in the lysozyme aqueous solution (first phase) 101 and the gel (second phase) 102 reached equilibrium during this period.
  • FIG. 12A shows the result.
  • FIG. 3 is a graph showing three-dimensionally the correlation between the nucleation rate and various conditions in crystal production (nucleation) of this example.
  • the graph on the left represents the case where the agarose concentration in the gel (second phase) is 0.5 wt%, and the graph on the right represents the case where the agarose concentration in the gel (second phase) is 4 wt%.
  • the axis in the depth direction indicates the standing time (1 to 5 days) after the laser irradiation
  • the axis in the horizontal direction on the paper indicates the laser light irradiation conditions a to g in parallel.
  • “In Gel” represents that the laser beam was irradiated in the gel
  • “On Gel” represents that the laser beam was irradiated near the interface with the gel in the solution. In the case of 5 shots (5 irradiations), the interval between each irradiation was 1 second. Further, the nucleation rate is shown on the vertical axis of the drawing.
  • Example 2 Production of glucose isomerase crystals in a two-phase system of solution and gel> Crystals were produced in the same manner as in Example 1 except that glucose isomerase was used in place of lysozyme as the target substance for crystallization.
  • the concentration of agarose SP was 2 wt%, and the laser light irradiation conditions were fixed at 30 ⁇ J, 125 pulses, 5 shots (each irradiation interval was 1 second).
  • FIG. 13 shows the result.
  • FIG. 3 is a graph showing three-dimensionally the correlation between the nucleation rate and various conditions in crystal production (nucleation) of this example.
  • the axis in the depth direction shows the standing time (1 to 7 days) after the laser irradiation
  • the axis in the horizontal direction on the paper shows the concentration of glucose isomerase.
  • the left bar graph shows the case where the laser beam is not irradiated
  • the right bar graph shows the case where the laser beam is irradiated.
  • the nucleation rate is shown on the vertical axis of the drawing. As shown in the figure, no nucleation was observed when no laser beam was irradiated. However, according to this example, a high nucleation rate was confirmed at glucose isomerase concentrations of 4.3 mg / mL and 5.4 mg / mL. It was done.
  • Example 3 Crystal production of membrane protein AcrB in a two-phase system of solution and gel> Crystals were produced in the same manner as in Examples 1 and 2 except that lysozyme or glucose isomerase was used as the target substance for crystallization, and the hardly crystalline membrane protein AcrB was used.
  • Example 3 it was shown that hardly crystalline proteins such as cell growth essential factor SAT and membrane protein AcrB could induce nucleation with low supersaturation by laser irradiation into the gel.
  • the nucleation (crystal production) effect was further superior to laser light irradiation into the gel.
  • an actually superior effect was demonstrated by using a hardly crystalline membrane protein AcrB and better than laser light irradiation into the gel.
  • the protein (AcrB) concentration at the time of preparing the protein solution (aqueous solution) was 28 mg / mL
  • the agarose SP concentration was 0.5 wt%
  • PEG2000 polyethylene glycol 2000
  • 18 wt% aqueous solution was used.
  • the amount dispensed to each well was 4 ⁇ L of gel, 2 ⁇ L of AcrB aqueous solution, and 2 ⁇ L of a precipitating agent (18 wt% PEG2000 aqueous solution).
  • the AcrB concentration is 14 mg / mL and the PEG2000 concentration is 9 wt% in the first phase.
  • the laser light irradiation conditions were 20 ⁇ J, 1 pulse, 5 shots (the interval between each irradiation was 1 second). Except these, it is the same as Example 1 and 2.
  • a photograph of the crystal obtained in this example is shown on the left side of FIG. 14A. In addition, this photograph was taken after leaving still for 3 days after laser light irradiation. As shown in the figure, according to this example, a large AcrB single crystal having a clear crystal form was obtained.
  • the photograph on the right side of the figure is a photograph taken under the same conditions except that laser light irradiation is not performed. In this case, as shown in the figure, crystals (crystal nuclei) were not obtained.
  • FIG. 14B shows a comparison result with the case where the gel is irradiated with laser light.
  • the photograph on the left side of the figure is a photograph showing the results of this example.
  • the agarose SP concentration was 6 wt%
  • the concentration of the aqueous PEG2000 (polyethylene glycol 2000) solution was 17 wt%.
  • the right side of the figure is a photograph of the gel irradiated with laser light.
  • the quality of the crystal form (surface) was inferior and the quality such as high transparency was inferior to this example.
  • the conditions in this photograph are different from those of the present example in that the agarose SP concentration is 2 wt% and the concentration of the aqueous PEG2000 (polyethylene glycol 2000) solution is 10 wt%. This is because no crystallization (nucleation) occurred under the same conditions as in this example.
  • an AcrB crystal having a clearer surface and higher transparency than that of laser irradiation into the gel was obtained.
  • the crystal production method of the present invention is not limited to this, and may be applied to crystal production of various proteins that are more difficult to crystallize than SAT, AcrB, and the like.
  • Example 4 Production of lysozyme crystals in a two-phase system of a highly supersaturated solution and a gel> Lysozyme crystals were produced in the same manner as in Example 1 except that the lysozyme concentration at the time of preparing the lysozyme aqueous solution was 20 mg / mL.
  • the gel and the aqueous solution were allowed to stand for 48 hours. The result is shown in the graph of FIG. 16A.
  • the horizontal axis represents the laser light irradiation conditions
  • the vertical axis represents the average number of crystals precipitated in each well.
  • the number of times of laser beam irradiation was 1 shot (one time).
  • crystallization was attempted for an agarose concentration of 2 wt%, an agarose concentration of 4 wt%, and no agarose (that is, a one-phase system of lysozyme solution, which corresponds to a reference example).
  • no agarose that is, a one-phase system of lysozyme solution, which corresponds to a reference example.
  • the number of crystal precipitates increased under the irradiation conditions of 5 ⁇ J and 1 pulse as compared with the case where no laser light was irradiated. Further, under the irradiation condition of high energy, as shown in the figure, the number of crystal precipitates was reduced as compared with the case of not irradiating with laser light, but a larger and higher quality crystal was obtained.
  • the photograph obtained in this example is illustrated in the photograph of FIG. 16B. As shown in the figure, this crystal has a large maximum diameter of several tens of ⁇ m, a clear crystal form (plane), and high transparency.
  • Example 5 Crystal production of lysozyme and glucose isomerase (2)> Crystal production of lysozyme (crystallization) except that the concentration of lysozyme during preparation of the solution (first phase) is 14 mg / mL and the irradiation intensity of laser light is 20 ⁇ J / pulse. )
  • the result is shown in the graph of FIG.
  • the figure shows the result after standing for 3 days after laser light irradiation.
  • the horizontal axis shows the laser light irradiation conditions.
  • “In Gel” indicates that the gel was irradiated with laser light
  • “On Gel” indicates that the vicinity of the interface with the gel in the solution was irradiated with laser light.
  • the vertical axis represents the nucleus generation rate. As shown in the figure, improvement in the nucleus generation rate by laser light irradiation was observed.
  • crystals were produced (crystallized) in the same manner except that the lysozyme concentration at the time of preparing the solution (first phase) was changed from 14 mg / mL to 13 mg / mL as in Example 1.
  • the result is shown in the graph of FIG. 18A.
  • FIG. 17 it can be seen that, without laser irradiation and with laser light irradiation into the gel, the lysozyme concentration was slightly lowered and no crystallization occurred.
  • crystals were stably obtained by laser light irradiation (this example) near the interface with the gel in the solution.
  • the crystal obtained in this example shown in FIG. 18A is, for example, a large crystal having a maximum diameter of a few hundred tens of ⁇ m as shown in the photograph of FIG. 18B, the crystal form (plane) is clear, and the transparency It was also excellent.
  • a glucose isomerase crystal was produced (crystallized) in the same manner as in Example 2 except that the laser light irradiation conditions were 20 ⁇ J, 125 pulses, and 5 shots. The result is shown in the graph of FIG. The figure shows the result after standing still for 4 days after laser light irradiation. As shown in the figure, crystals were obtained with a good nucleation rate as in Example 2. In addition, when the laser beam was not irradiated, and although not shown, when the laser beam was irradiated in the gel and when the gel was not used (protein solution one-phase system), no crystal nucleus was obtained.
  • FIGS. 20A and 20B show crystals obtained by laser irradiation in 0.5 wt% agarose 9A (trade name of Takara Bio Inc.) or 1.0 wt% agarose SP (trade name of Takara Bio Inc.) (reference) This is a photograph of the example).
  • the gel contains 9.3 mg / mL of AcrB as a protein and 6.5 wt% of PEG2000 as a precipitating agent.
  • FIG. 20B shows a crystal manufactured according to the example of the present invention, in which the vicinity of the interface with the gel in the solution is irradiated with laser light in the two-phase system of the protein solution and the gel.
  • 0.5 wt% of agarose SP was used as the gel when preparing the gel (second phase).
  • a 28 mg / mL aqueous solution of AcrB and a 20 wt% aqueous solution of PEG2000 as a precipitating agent were mixed in the same amount in the well as in Example 3 to obtain the first Phased.
  • the laser light irradiation conditions were 20 ⁇ J, 1 pulse, 5 shots (irradiation interval 1 second), and the laser light irradiation was allowed to stand for 3 days.
  • the crystal of the example of the present invention (FIG. 20B) was very large compared to the crystal of the reference example (FIG. 20A), the crystal form (plane) was clear, and the transparency was excellent. .
  • Example 6 Transfer of protein from protein solution into florinate>
  • the protein was transferred from the protein solution into the florinate.
  • a Nunclon DELTA Surface 96 well microbatch plate was used as the reaction vessel. Thereto, 100 ⁇ L of fluorinate (fluorine compound, trade name of 3M) was dispensed into each well in an equivalent amount, and further 100 ⁇ L of an aqueous solution containing 16 mg / mL of lysozyme as protein was dispensed into each well. did. Thereafter, laser light was irradiated at 30 ⁇ J, 100 pulses, and 10 shots to the interface with florinate in the protein aqueous solution. The photograph on the left side of FIG.
  • FIG. 21 shows a photograph of florinate immediately after laser light irradiation.
  • a protein drop droplet was observed in the florinate due to the transfer of the protein into the florinate. This drop was retained in the florinate for at least one day, even if the aqueous protein solution was not removed from the florinate.
  • the laser beam was not irradiated, or when the laser beam was irradiated at a position away from the interface with florinate (distance 300 ⁇ m from the interface) in the protein solution, as shown in the photograph on the right side of FIG.
  • transfer of protein into florinate did not occur.
  • the inert liquid is difficult to transfer proteins by a normal method due to cavitation behavior (collision of bubbles to the interface) between the first phase and the second phase.
  • the protein could be transferred into and retained in the inert liquid.
  • any target substance such as an organic low molecular weight compound or a functional organic polymer compound may be used, and an aqueous phase, an oil phase, or the like may be used instead of an inert liquid.
  • Example 7 Crystal production of paracetamol, a low molecular weight organic compound in a two-phase system of solution and gel>
  • paracetamol also referred to as N- (4-hydroxyphenyl) acetamide or acetaminophen
  • Phase 1 the target substance for crystallization instead of protein
  • Paracetamol crystals were produced in a two-phase system of “phase 1”) and gel (the “second phase”). That is, first, as shown in FIG. 24, the gel was placed in a part of the well of the crystal production (growing) container (Matsunami bottom dish).
  • this crystal production (growth) container 241 has a round plate shape and has a well 242 at the center thereof.
  • the gel 243 was disposed only on the left half in the figure on the well 242. Specifically, first, a 6 wt% aqueous solution of agarose SP was solidified in a refrigerator, and then heated in a block incubator heated to 95 ° C. for 15 minutes to impart fluidity to the gel. 100 ⁇ L of this was dispensed into the well 242 of the crystal production (growing) container, and the gel was solidified again. Thereafter, a part of the gel on the well 242 was cut and removed with a gel cutter to obtain a state as shown in FIG.
  • a 40 mg / mL paracetamol (purity 98%, manufactured by Acros) aqueous solution 244 is formed on the well 242 where the gel is cut and removed (in the figure, the right half on the well 242).
  • the paracetamol aqueous solution was completely dissolved by heating at 70 ° C. for 1 hour in a block incubator, and then dispensed after the temperature was lowered to 60 ° C.
  • FIG. 26 shows the result.
  • FIG. 26 (a) (upper part of FIG. 26) is a photograph (transmission image by CCD camera) in which the state of laser light irradiation and crystal precipitation is traced over time, and FIG.
  • 26 (b) (lower part of FIG. 26) It is a figure (scheme) which shows typically a time-dependent change in 26 (a).
  • the organic low-molecular solution 261 corresponding to the paracetamol aqueous solution 244 in FIG. 25
  • the gel 262 corresponding to the gel 243 in FIGS. 24 and 25
  • the focused point 264 on the low molecular solution 261 side was irradiated. After the laser irradiation, the sample was left still for 20 seconds and observed with a CCD camera every 10 seconds.
  • the crystal 265 of paracetamol (organic low molecular weight compound) was precipitated from the vicinity of the laser irradiated interface about 10 to 20 seconds after the laser irradiation. Further, it was confirmed that the paracetamol crystal 265 grew larger at 20 seconds after the laser irradiation than at 10 seconds after the laser irradiation.
  • Example 8 Visualization of in-gel injection process of protein in two-phase system of solution and gel>
  • a lysozyme solution (the “first phase”) stained with Coomassie Brilliant Blue (hereinafter CBB) and a gel (the “second phase”) are visualized in order to visualize the process in which the protein is injected into the gel by cavitation.
  • CBB Coomassie Brilliant Blue
  • a gel (the “second phase”)
  • Coomassie Brilliant Blue R-250 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.0475 mg / ml and chicken egg white lysozyme (6 times recrystallization, Lot No. E40314, Seikagaku Corporation) 20.2 mg / 200 ⁇ L of a supersaturated aqueous solution prepared by adjusting the aqueous solution containing ml to 5 wt% NaCl, 0.1 M NaAc (pH 4.5) was prepared.
  • Agarose SP Agarose Sea Plaque (trade name), Lot No. 0000215666, Lonza), which was adjusted to 6.0 wt% and stored at 4 ° C., was heated in an incubator at 95 ° C. for 15 minutes or more.
  • the agarose SP after the heating was adjusted to 1.0 wt% agarose, 5 wt% NaCl, 0.1 M NaAc (pH 4.5). 45 ⁇ L each was dispensed into a self-made container whose side surface of a cylindrical container (manufactured by Nunc) having a maximum capacity of 400 ⁇ L was processed into a flat surface, and 2500 rpm by a plate centrifuge (PlateSpin (trade name), KUBOTA (Kubota Corporation)) The mixture was centrifuged for 30 minutes at 4 ° C., and then allowed to stand for 24 hours in a 4 ° C. incubator. Thereafter, the gel in the self-made container was transferred to the incubator at 20 ° C.
  • the present invention it is possible to provide a target substance transfer method, a crystal manufacturing method, a composition manufacturing method, and a target substance transfer device that can easily and effectively increase the concentration of a target substance.
  • the present invention can be used for, for example, crystallization of biological materials such as proteins and nucleic acids, organic low molecular compounds, functional organic high molecular compounds, etc., or production of compositions containing these substances at high concentrations, etc.
  • the present invention is not limited to these and can be applied to a wide range of technical fields.

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Abstract

　簡便かつ効果的に目的物質の高濃度化ができる目的物質移行方法、結晶製造方法、組成物製造方法、目的物質移行装置を提供する。　目的物質１０３を含む液相または固相から形成された第１の相１０１中の目的物質１０３を、第２の相１０２中に移行させる方法であって、　第１の相１０１と第２の相１０２とを近接させる相近接工程と、　第１の相１０１と第２の相１０２との境界の近傍に気泡を発生させて崩壊させる気泡崩壊工程とを含むことを特徴とする方法。

Description

目的物質移行方法、結晶製造方法、組成物製造方法、目的物質移行装置
　本発明は、目的物質移行方法、結晶製造方法、組成物製造方法、目的物質移行装置に関する。
　タンパク質、核酸等の生体物質の立体構造を明らかにすることは、産業上極めて有用である。具体的には、例えば、前記生体物質の生体中における機能が明らかになるため、能率的な医薬品の開発が可能となる。
　タンパク質、核酸等の立体構造を解析するための方法としては、例えば結晶構造解析、特にＸ線回折像撮影による結晶構造解析が優れており、広く用いられている。この方法により解析するためには、検体（被解析物質）である前記タンパク質、核酸等の結晶を製造する必要がある。そのために、前記検体を含む溶液から前記検体の結晶を析出（結晶化）させる方法（特許文献１等）が行われている。しかし、タンパク質、核酸等の溶液から結晶を析出（結晶化）させることは困難であり、非常に高度な技術が必要である。この原因は、タンパク質、核酸等の溶液中において、結晶核が発生しないか、または、発生してもすぐに消滅してしまうためと考えられる。
　一方、溶液に代えて、ゲル中でタンパク質または核酸を結晶化させることで、より簡便に結晶を得る方法がある（特許文献２）。しかしながら、品質、強度等に優れた結晶をより簡便に得るために、さらなる技術の向上が求められる。
　そこで、タンパク質溶液中にレーザー光を照射することで、タンパク質の結晶核を発生させ、結晶化させることが試みられている（非特許文献１）。この方法の原理は、以下のように説明できる。すなわち、まず、タンパク質溶液にレーザー光照射すると、短時間に気泡が発生して消滅する、いわゆるキャビテーションという現象が起こる。気泡が発生して膨張する時、気泡表面に溶液中のタンパク質が吸着される。そして、気泡が収縮して消滅しようとする時に、気泡の表面積が小さくなるために、吸着されたタンパク質が濃縮されてタンパク質濃度（密度）が高くなる。このタンパク質が高濃度になった（濃縮された）部分において、結晶核が発生しやすくなると考えられる。
　さらに、タンパク質溶液を高粘性化もしくはゲル化してレーザー光照射することで、より効率的に結晶核発生を誘起可能であることが明らかになっている（非特許文献２）。
国際公開パンフレットＷＯ２００４／１０６５９８号公報 国際公開パンフレットＷＯ２００９／０９１０５３号公報
Ｈ．　Ａｄａｃｈｉ　ｅｔ．　ａｌ，　Ｊｐｎ．　Ｊ．　Ａｐｐｌ．　Ｐｈｙｓ．４３　（２００３）　Ｌ１３７６． Ｒ．　Ｍｕｒａｉ　ｅｔ．　ａｌ，　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｐｈｙｓ．　Ｌｅｔｔ．，　９６　（２０１０）　０４３７０２
　しかし、溶液は、流体であるために、レーザー光照射等によりキャビテーションを起こしても、結晶化の目的物質（タンパク質等）が高濃度である時間は短く、結晶核発生（以下、単に「核発生」という場合がある）のための高濃度化という観点からは限界がある。一方、流動性が低いゲル状物質等では、同じエネルギーのレーザー光を照射しても、溶液と比較して発生する気泡のサイズが小さいために、気泡表面に集まる目的物質の分子が少ない。いずれにしても、従来の技術では、キャビテーションによる目的物質の高濃度化には限界がある。これは、タンパク質、核酸等に限定されず、結晶化の目的物質となり得る全ての物質に共通する課題である。さらには、結晶化に限らず、目的物質の高濃度化が必要な技術に共通する課題でもある。
　したがって、本発明は、簡便かつ効果的に目的物質の高濃度化ができる目的物質移行方法、結晶製造方法、組成物製造方法、目的物質移行装置の提供を目的とする。
　前記目的を達成するために、本発明の目的物質移行方法は、
　目的物質を含む液相または固相から形成された第１の相中の前記目的物質を、液相または固相である第２の相中に移行させる方法であって、
　前記第１の相と前記第２の相とを近接させる相近接工程と、
　前記第１の相と前記第２の相との境界の近傍に気泡を発生させて崩壊させる気泡崩壊工程とを含むことを特徴とする。
　本発明の結晶製造方法は、
　結晶化の目的となる目的物質を移行する目的物質移行工程と、結晶析出工程とを含み、
　前記目的物質移行工程が、前記本発明の目的物質移行方法により、前記目的物質を前記第１の相中から前記第２の相中に移行させる工程であり、
　前記結晶析出工程が、前記目的物質移行工程後、前記第２の相の内部または界面で前記目的物質の結晶を析出させる工程であることを特徴とする。
　本発明の組成物製造方法は、
　目的物質移行工程を含み、
　前記目的物質移行工程が、前記本発明の目的物質移行方法により、前記目的物質を前記第１の相中から前記第２の相中に移行させる工程であり、
　前記組成物が、前記第２の相中に前記目的物質を含む組成物であることを特徴とする。
　本発明の目的物質移行装置は、
　目的物質を含む液相または固相から形成された第１の相中の前記目的物質を、液相または固相である第２の相中に移行させる装置であって、
　前記第１の相と前記第２の相とを近接させる相近接手段と、
　前記第１の相と前記第２の相との境界の近傍に気泡を発生させて崩壊させる気泡崩壊手段とを含むことを特徴とする。
　本発明によれば、簡便かつ効果的に目的物質の高濃度化ができる目的物質移行方法、結晶製造方法、組成物製造方法、目的物質移行装置を提供可能である。
図１は、本発明の目的物質移行装置の一例を示す模式図である。 図２は、リゾチーム溶液一相系中にレーザー光照射した場合の核発生率と照射レーザー光エネルギーとの関係を例示するグラフである。 図３は、リゾチーム溶液一相系中にレーザー光照射した場合の核発生率と照射レーザー光の波長およびエネルギーとの関係を例示するグラフである。 図４は、リゾチーム溶液一相系中にレーザー光照射した場合の気泡の経時変化を例示する写真である。 図５は、リゾチーム溶液一相系中にレーザー光照射した場合の気泡の最大直径とレーザーエネルギーとの関係を例示するグラフである。 図６は、リゾチーム溶液一相系中にレーザー光照射した場合の気泡周囲におけるリゾチーム濃度の経時変化の一例を示す。図６（ａ）は写真であり、図６（ｂ）はグラフである。 図７は、チトクロムＣ溶液一相系中にレーザー光照射した場合の気泡周囲におけるチトクロムＣ濃度の経時変化の一例を示す写真である。 図８は、リゾチーム溶液一相系とリゾチーム含有ゲル一相系とにおける核発生率の一例を示すグラフである。 図９は、キャビテーション発生位置付近に界面がない場合とある場合との気泡の経時変化の一例を示す写真である。同図上段が、界面がない場合であり、同図下段が、界面がある場合である。 図１０は、本発明の目的物質移行方法におけるメカニズムの一例を模式的に示す断面図である。 図１１は、ウェル中における液相とゲル相の二相系を模式的に例示する断面図である。 図１２Ａは、実施例における核発生率を示すグラフである。 図１２Ｂは、実施例において析出したリゾチーム結晶の位置を観測した写真である。 図１３は、別の実施例における核発生率を示すグラフである。 図１４Ａは、さらに別の実施例において製造したタンパク質結晶を、比較例とともに示す写真である。 図１４Ｂは、さらに別の実施例において製造したタンパク質結晶を、比較例とともに示す写真である。 図１５は、レーザー光集光により気泡を発生させた場合の、集光点から界面までの距離と気泡最大半径と気泡移動距離との関係を例示するグラフである。 図１６Ａは、さらに別の実施例における結晶の平均析出個数を例示するグラフである。 図１６Ｂは、図１６Ａの実施例において製造した結晶を例示する写真である。 図１７は、さらに別の実施例における核発生率を示すグラフである。 図１８Ａは、さらに別の実施例における核発生率を示すグラフである。 図１８Ｂは、図１８Ａの実施例において製造した結晶を例示する写真である。 図１９は、さらに別の実施例における核発生率を示すグラフである。 図２０Ａは、参考例において製造した結晶を例示する写真である。 図２０Ｂは、実施例において製造した結晶を例示する写真である。 図２１は、さらに別の実施例において、フロリナート（商品名）中へのタンパク質の移行を示す写真である。 図２２は、アガロースゲルのゲル強度測定結果の一例を示すグラフである。 図２３は、図２２のグラフのデータの一部を抜粋したグラフである。 図２４は、さらに別の実施例の、ウェル上におけるゲルの配置を模式的に示す図である。 図２５は、図２４のウェル上にさらに有機低分子水溶液を分注した状態を模式的に示す図である。 図２６は、図２４および２５の実施例において、レーザー光照射による結晶の析出を示す写真および模式図である。 図２７は、さらに別の実施例において、タンパク質水溶液中からゲル中にタンパク質が移動する様子を示す写真である。
　以下、本発明について例を挙げて説明する。ただし、本発明は、以下の例に限定されない。
＜目的物質移行方法＞
　本発明の目的物質移行方法は、前記のとおり、目的物質を含む液相または固相から形成された第１の相中の前記目的物質を、液相または固相である第２の相中に移行させる方法であって、前記第１の相と前記第２の相とを近接させる相近接工程と、前記第１の相と前記第２の相との境界の近傍に気泡を発生させて崩壊させる気泡崩壊工程とを含むことを特徴とする。前記気泡を発生させる位置は、前記第１の相と前記第２の相との境界の近傍であれば特に限定されない。前記気泡を発生させる位置は、例えば、前記第１の相中でも、前記第２の相中でも良いが、前記第１の相中が好ましい。
　前記目的物質は、特に限定されないが、有機物質が好ましく、タンパク質、天然タンパク質、人工タンパク質、ペプチド、天然ペプチド、人工ペプチド、核酸、天然核酸、人工核酸、脂質、天然脂質、人工脂質、糖鎖、天然糖鎖、人工糖鎖、有機高分子化合物、有機低分子化合物、生体物質、生体高分子化合物および生体低分子化合物からなる群から選択される少なくとも一つであることがより好ましい。なお、前記目的物質は、１種類でも良いし複数種類併用しても良い。
　本発明において、前記生体物質は、特に制限されないが、例えば、生体高分子化合物、生体低分子化合物、タンパク質、天然タンパク質、人工タンパク質、ペプチド、天然ペプチド、人工ペプチド、核酸、天然核酸、人工核酸、脂質、天然脂質、人工脂質、糖鎖、天然糖鎖、および人工糖鎖があげられ、１種類でも良いし複数種類併用しても良い。また、本発明において、「生体物質」、「生体高分子化合物」および「生体低分子化合物」とは、生体由来の物質でも良いが、それと同一の構造を有する合成物質でも良く、または、生体由来物質と類似の構造を有する誘導体や人工物質であっても良いものとする。例えば、前記生体物質が生体高分子化合物の場合は、生体由来の高分子化合物でも、それと同一の構造を有する合成高分子化合物でも、または、生体由来高分子化合物と類似の構造を有する誘導体や人工高分子化合物であっても良い。前記生体物質が生体低分子化合物の場合は、生体由来の低分子化合物でも、それと同一の構造を有する合成低分子化合物でも、または、生体由来低分子化合物と類似の構造を有する誘導体や人工低分子化合物であっても良い。前記生体物質がタンパク質の場合は、生体由来（天然由来）のタンパク質でも、合成タンパク質でも良いし、天然に存在する構造の天然タンパク質でも、天然に存在しない構造の人工タンパク質でも良い。前記生体物質がペプチドの場合は、生体由来（天然由来）のペプチドでも、合成ペプチドでも良いし、天然に存在する構造の天然ペプチドでも、天然に存在しない構造の人工ペプチドでも良い。前記生体物質が核酸の場合は、生体由来（天然由来）の核酸でも、合成核酸でも良いし、天然に存在する構造の天然核酸でも、天然に存在しない構造の人工核酸でも良い。前記生体物質が脂質の場合は、生体由来（天然由来）の脂質でも、合成脂質でも良いし、天然に存在する構造の天然脂質でも、天然に存在しない構造の人工脂質でも良い。前記生体物質が糖鎖の場合は、生体由来（天然由来）の糖鎖でも、合成糖鎖でも良いし、天然に存在する構造の天然糖鎖でも、天然に存在しない構造の人工糖鎖でも良い。なお、前記天然核酸としては、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ等があげられる。前記人工核酸としては、特に制限されないが、例えば、ＬＮＡ、ＰＮＡ等があげられる。
　なお、本発明において、前記有機物質の分子量は、特に限定されない。例えば、分子量１０００以上の有機物質を「有機高分子化合物」とし、分子量１０００未満の有機化合物を「有機低分子化合物」としても良いが、これには限定されない。同様に、分子量５０００以上の生体物質を「生体高分子化合物」とし、分子量５０００未満の生体物質を「生体低分子化合物」としても良いが、これには限定されない。また、前記生体物質がペプチドの場合、分子量は、例えば３００以上である。
　前記第１の相は、前述のとおり、前記目的物質を含む液相または固相から形成される。前記液相は、特に限定されず、例えば、前記目的物質の溶液でも、懸濁液でも、分散液（例えばエマルジョン、サスペンジョン等）でも良い。前記固相も特に限定されず、例えば、ゲル等でも、前記目的物質の溶液、懸濁液、分散液（例えばエマルジョン、サスペンジョン等）等が固化したものでも、固体に前記目的物質をしみこませたものでも良い。前記第１の相は、例えば、後述の実施例のように、液相であると、前記目的物質を前記第２の相に移行させやすく好ましい。なお、固相（固体）と液相（液体）との区別は必ずしも明確ではなく、例えば、無定形固体（アモルファス）は、粘度が高い液体と考えることができる場合がある。また、例えば、ゲルとは、ゾルが固体化したものをいうが、ゾルが高粘性の液体状となったものもいう場合がある。なお、以下、前記第１の相において、前記目的物質を溶解、懸濁または分散等させている液体または固体を、単に「媒質」という場合がある。前記第１の相において、前記液相または固相は、前記目的物質および前記媒質以外の他の物質を、適宜含んでいても良いし、含んでいなくても良い。例えば、後述するように、前記第１の相が、タンパク質と沈殿化剤とを含む溶液であっても良い。
　前記第１の相において、前記目的物質に対する媒質は特に限定されず、前記目的物質の種類、前記第２の相の組成等に応じて適宜選択すれば良い。前記媒質は、１種類のみ用いても、複数種類併用しても良い。前記目的物質の濃度も特に限定されず、本発明の目的物質移行方法の目的等に応じて適宜設定すれば良い。例えば、前記第１の相が溶液の場合、飽和溶液でも、未飽和溶液でも、過飽和溶液でも良い。前記溶液中の前記目的物質の濃度は、その飽和濃度に対し、例えば０．５～２０．０倍、好ましくは０．８～１０．０倍、より好ましくは１．０～５．０倍である。
　前記第２の相は特に限定されず、物理的な境界により前記第１の相と区別できれば良い。前記物理的な境界は、前記第１の相と前記第２の相との界面であることが好ましい。すなわち、前記第１の相と前記第２の相とが接触して界面を形成していることが、前記目的物質の移行のしやすさ等の観点から好ましい。前記第１の相および前記第２の相は、例えば、それら自体が混合しない性質により、前記界面を形成しても良い。例えば、前記第１の相および前記第２の相の少なくとも一方が固相であっても良い。また、例えば、前記第１の相が水相で前記第２の相が油相であっても良いし、逆に、前記第１の相が油相で前記第２の相が水相であっても良い。また、例えば、前記第１の相と前記第２の相は、前記界面に膜（例えば、逆浸透膜）または他の相（固相、液相または気相）等が存在することにより、分離されていても良い。
　前記第２の相は、固相（固体）でも、液相（液体）でも良い。前記第１の相においても説明したとおり、固相（固体）と液相（液体）との区別は必ずしも明確ではなく、例えば、無定形固体（アモルファス）は、粘度が高い液体と考えることができる場合がある。また、例えば、ゲルとは、ゾルが固体化したものをいうが、ゾルが高粘性の液体状となったものもいう場合がある。前記第２の相は、例えば、固相、ゲル、液相、油相、水相、またはタンパク質膜であっても良い。液相の場合は、例えば、目的物質の溶解度が高い液体でも良いが、フロリナート（フッ素化合物、３Ｍ社の商品名）等の不活性液体でも良い。本発明の目的物質移行方法によれば、例えば、前記第２の相が、通常は目的物質を溶解させることが困難な相であっても、前記目的物質を移行させることもできる。これを利用して、例えば、後述する本発明の結晶製造方法、組成物製造方法等に用いることもできる。前記目的物質を移行させることが困難な前記第２の相としては、特に限定されないが、例えば、不活性液体、水溶性の目的物質に対する油相、非水溶性の目的物質に対する水相、または、通常の方法では前記目的物質が浸透しにくい固相等が挙げられる。
　なお、前記第１の相または前記第２の相が固相である場合、その硬さは特に限定されない。固相の硬さは、例えば、圧縮強さで表すことができる。前記第１の相および第２の相が固相である場合の圧縮強さの下限値は、特に限定されないが、例えば、０を超える値または測定機器による測定限界下限値以上である。また、前記第１の相が固相である場合、例えば、前記気泡崩壊工程における気泡の発生させやすさおよび崩壊させやすさの観点から、または、前記目的物質の前記第２の相中への移行しやすさの観点から、硬すぎないことが好ましい。前記第１の相の圧縮強さの上限値は、好ましくは１０００Ｐａ以下、より好ましくは８００Ｐａ以下、さらに好ましくは６００Ｐａ以下、特に好ましくは４００Ｐａ以下である。また、前記第２の相が固相である場合、前記目的物質の前記第２の相中への移行しやすさの観点から、硬すぎないことが好ましい。前記第２の相の圧縮強さの上限値は、好ましくは３０００Ｐａ以下、より好ましくは２０００Ｐａ以下、さらに好ましくは１５００Ｐａ以下、特に好ましくは１０００Ｐａ以下である。なお、前記圧縮強さは、レオストレス　ＲＳ１　Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ（英弘精機株式会社のレオメーターの商品名）を動的粘弾性測定モードで用い、周波数１Ｈｚ、測定温度２０℃で測定した数値とする。図２２および図２３に示す測定値も、この方法で測定した。ただし、この測定方法は、前記圧縮強さの測定方法の一例であって、本発明は、この測定方法における工程および条件によって何ら限定されない。また、他のレオメーターを用いても、同じ測定モード、測定温度および周波数で測定すれば、誤差を除いて同じ圧縮強さの測定値を得ることができる。なお、前記固相がゲルの場合、前記圧縮強さを「ゲル強度」という。また、融解温度（ゲルの場合は、ゲル溶解温度）が２０℃よりも低いために２０℃で固体（ゲルの場合は、ゲル状態）にならない場合は、前記圧縮強さは、前記融解温度温度よりも低く５で割り切れる摂氏温度（例：１５℃、１０℃、５℃、０℃、－５℃）のうち最も高い測定可能温度での測定値とする。また、例えば、前記固相が、熱可逆性でありゲル溶解温度が２０℃よりも高いために２０℃でゲル状態にならない（ゾル状である）ゲルの場合は、前記圧縮強さ（ゲル強度）は、前記ゲル溶解温度よりも高く５で割り切れる摂氏温度（例：２５℃、３０℃、３５℃）のうち最も低い測定可能温度での測定値とする。
　前記相近接工程において、前記第１の相と前記第２の相との最短距離を、前記気泡の最大半径の４倍以下とすることが好ましく、２倍以下とすることがさらに好ましい。この距離以下であれば、前記気泡崩壊工程において、前記目的物質を前記第１の相から前記第２の相に移行させやすいためである。なお、気泡の最大半径は、例えば後述の実施例のように、高速カメラ（高速度カメラまたはＣＣＤカメラなどともいう場合がある）を用いて測定することができる。前記第１の相と前記第２の相との最短距離は、前記気泡の最大半径によって異なるが、例えば５０００μｍ以下、好ましくは３０００μｍ以下、より好ましくは１０００μｍ以下である。前記相近接工程は、前記第１の相と前記第２の相とを接触させて界面を形成させる界面形成工程であることが好ましい。すなわち、前記のとおり、前記第１の相と前記第２の相とが接触して界面を形成していることが、前記目的物質の移行のしやすさ等の観点から、より好ましい。この場合において、前記気泡崩壊工程が、前記界面近傍に気泡を発生させて前記界面に衝突させる気泡衝突工程であることが、前記目的物質の移行のしやすさの観点から、さらに好ましい。前記気泡衝突工程において、前記気泡を発生させる位置は、前記第１の相中でも前記第２の相中でも良いが、前記第１の相中が好ましい。
　前記気泡崩壊工程において、気泡を発生させる方法は特に限定されないが、前記第１の相中または前記第２の相中における、他方の相との境界の近傍（前記第１の相と前記第２の相とが接触して界面を形成している場合は、前記界面近傍）にレーザー光および超音波の少なくとも一方を照射することが好ましい。例えば、前記第１の相中または前記第２の相中における、他方の相との境界の近傍に適宜な条件でレーザー光を集光すると、その集光点またはその近傍で気泡を発生させることもできる。レーザー光は、照射強度、集光点等の制御がしやすいため、目的物質の移行に適切な条件を設定しやすい。一方、超音波照射は、低コストで行うことができる。前記レーザー光および超音波の照射エネルギーの総和も特に限定されないが、例えば６０ｎＪ以上、好ましくは１００ｎＪ以上、より好ましくは２００ｎＪ以上である。前記照射エネルギーの総和の上限値は、特に限定されないが、例えば、１０Ｊ以下である。
　前記気泡崩壊工程において、前記気泡を崩壊させる方法は、特に限定されない。例えば、前記気泡を崩壊させる特別の手段を用いず、前記気泡が示すキャビテーション挙動により崩壊させても良い。また、前記気泡衝突工程において、気泡を前記界面に衝突させる方法は、特に限定されない。例えば、前記第１の相または前記第２の相に、任意の手段により圧力等を加えることにより、前記気泡を前記界面の方向に移動させ、衝突させても良い。または、前記気泡が示すキャビテーション挙動により、前記気泡を前記界面に衝突させても良い。この場合、例えば後述の実施例のように、前記気泡を前記界面に衝突させるための特別の手段を用いず、キャビテーション挙動により自動的に、前記気泡を前記界面に衝突させても良い。図９に、前記キャビテーション挙動の一例を示す。同図は、超純水に、ガラスセル中でレーザー光を集光した時のキャビテーション挙動の例示であり、高速カメラ（高速度カメラまたはＣＣＤカメラなどともいう場合がある）で撮影した写真である。同図上段は、前記容器の壁面から離れた位置にレーザー光を集光（照射）させたときの、キャビテーション挙動すなわち気泡の経時変化を表す図である。同図下段は、前記容器の壁面近傍にレーザー光を集光（照射）させたときの、キャビテーション挙動すなわち気泡の経時変化を表す図である。気泡は、いずれも、レーザー光集光位置またはその近傍で発生している。図中の「μｓ」は、レーザー光照射開始時からの経過時間（マイクロ秒）を表す。図示のとおり、壁面から離れた位置で発生した気泡は、壁面に接することなく消滅している。これに対し、容器壁面近傍でのレーザー照射により発生した気泡は、壁に吸い寄せられるように加速して壁に衝突し、消滅している。本発明者らは、このような現象を見出し、本発明に到達した。例えば、図９の下段のキャビテーション挙動を利用して、気泡表面に吸着した目的物質の分子を、第２の相との界面方向に加速し、前記第２の相中に注入する事で、前記第２の相中において通常では到達できない目的物質濃度を達成することもできる。これにより、例えば、後述するように、前記第２の相中で結晶核発生を促進することもできるし、ゲル中にタンパク質が高濃度で凝縮されたタンパク質チップ等を製造することもできる。ただし、このメカニズムは例示であって、本発明を限定するものではない。
　図９のメカニズム（キャビテーション挙動）を用いた目的物質移行方法は、例えば、図１０の断面図のように、模式的に例示することができる。図１０において、１０１は、目的物質を含む第１の相（例えば溶液）であり、１０２は、第２の相（例えばゲル）である。１０３は、目的物質の粒子（例えば分子）である。第１の相１０１に、レーザー光１０４を集光すると、集光点またはその近傍で気泡が発生する。その気泡が、矢印１０５の方向に移動して第２の相１０２との界面に衝突し、第２の相１０２内において、衝突位置１０６の近傍に、目的物質の濃度が高い領域が形成される。なお、１０４は、レーザー光に限定されず、例えば、超音波等の他の刺激でも良い。同図から分かるとおり、このメカニズムによれば、気泡発生点の直下において、局所的に目的物質（例えば、タンパク質）の高濃度領域が形成されるため、第２の相１０２の特定部位に集中的に目的物質を注入できると考えられる。このように、特定部位への目的物質の注入というのは、結晶核発生の分野において、全く新しい概念の技術である。これにより、例えば、半導体へのイオン注入法のように、平衡状態では実現できないレベルの高濃度状態の実現も可能であり、前述のように、結晶核発生の促進のみならず、他の技術分野にも有用である。
　なお、前記気泡が前記界面に衝突しなくても、気泡が崩壊することで、前記第１の相中の前記目的物質を前記第２の相中に移行させることは可能である。ただし、前述のとおり、前記気泡を前記界面に衝突させると、前記目的物質が前記第２の相中にさらに移行しやすいため好ましい。
　前記気泡崩壊工程において、前記第１の相と前記第２の相との境界の近傍にレーザー光を集光することにより、前記気泡を発生させる場合、前記レーザー光の集光点から前記第２の相における前記第１の相側表面までの距離（前記第１の相と前記第２の相とが接触して界面を形成している場合は、前記界面までの距離）が、前記気泡の最大半径の４倍以下であることが、前記目的物質の前記第２の相中への移行しやすさの観点から好ましい。前記レーザーの集光点から前記第２の相における前記第１の相側表面までの距離は、より好ましくは、前記気泡の最大半径の２倍である。特に好ましくは、前記第１の相と前記第２の相とが接触して界面を形成しており、かつ、前記レーザー光の集光点から前記界面までの距離が、前記気泡の最大半径の２倍以下である。この条件を満たすと、キャビテーション挙動により、前記気泡が前記界面に衝突しやすいので、前記目的物質が前記第２の相中にさらに移行しやすいためである。
　なお、本発明の目的物質移行方法において、前記第１の相中の前記目的物質が前記第２の相中に移行するメカニズムは、必ずしも明らかでない。前記メカニズムは、前記第２の相がゲルである場合は、例えば、以下のように推測される。すなわち、まず、前記気泡崩壊工程において、前記第１の相中または前記ゲル（第２の相）中で前記気泡が崩壊する時に（特に、前記気泡衝突工程において前記気泡が前記界面に衝突する時に）、前記第１の相中の物質が前記ゲル（第２の相）中に向かう流れが生じる。この時に、前記ゲル（第２の相）に力が加わり、前記ゲルが変形する。このため、前記力が加わった箇所において、前記ゲルのメッシュサイズ（分子の網の目のサイズ）が大きくなり、その大きくなった網の目を、前記第１の相中の前記目的物質が通り抜けて、前記ゲル中に移動する。その後、例えば、前記ゲルのメッシュサイズが元に戻ることにより、前記ゲル中の目的物質が前記第１の相中に戻ることが防止される。このため、前記ゲルの変形しやすさの観点から、前述のとおり、ゲル強度が高過ぎないことが好ましいと推測される。ただし、これらは、推測されるメカニズムの一例に過ぎず、本発明を何ら限定しない。
＜結晶の製造方法＞
　本発明による結晶の製造方法は、前記のとおり、結晶化の目的となる目的物質を移行する目的物質移行工程と、結晶析出工程とを含み、前記目的物質移行工程が、前記本発明の目的物質移行方法により、前記目的物質を前記第１の相中から前記第２の相中に移行させる工程であり、前記結晶析出工程が、前記目的物質移行工程後、前記第２の相中または界面で前記目的物質の結晶を析出させる工程であることを特徴とする。
　以下、主に、ゲル中におけるタンパク質、核酸等の生体物質の結晶化（結晶の製造方法）について説明するが、本発明による結晶の製造方法は、これに限定されない。例えば、前記目的物質は、有機低分子化合物、またはその他の任意の物質であっても良い。前記第１の相および前記第２の相も、特に限定されず、任意である。また、以下においては、主に、前記気泡崩壊工程において前記第１の相（例えば、タンパク質溶液）中に気泡を発生させる場合について説明する。しかし、本発明は、これに限定されず、例えば、前記気泡崩壊工程において、前記第２の相中に気泡を発生させても良い。これらについて、具体的には、例えば、前記本発明の目的物質移行方法において説明したとおりである。
　前記第１の相は、固相（例えばゲル等）でも良いが、液相が好ましい。以下、主に、液相について説明する。固相の場合は、例えば、以下に述べる液相に、後述する第２の相と同様のゲル化剤等を加えたものでも良い。前記第１の相における媒質（溶媒等）は特に制限されない。前記媒質は、具体的には、例えば、水、エタノール、メタノール、アセトニトリル、アセトン、アニソール、イソプロパノール、酢酸エチル、酢酸ブチル、クロロホルム、シクロヘキサン、ジエチルアミン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、トルエン、ブタノール、ブチルメチルエーテル、ヘキサン、ベンゼン、メチルエチルケトン、ジクロロエタン、イソブチルアルコール、イソプロピルアルコール、酢酸イソプロピル、ジオキサン、ジクロルエタン、テトラヒドロフラン、メチルイソブチルケトン等が挙げられ、１種類でも複数種類併用しても良い。前記目的物質が水溶性の場合、例えば、水または水を含む混合溶媒を用いることが簡便で好ましい。前記目的物質の濃度は、特に制限されないが、タンパク質、核酸等の生体物質の場合、例えば０．５～２００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１．０～１００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは２．０～５０ｍｇ／ｍＬである。また、必要に応じ、ｐＨ調整剤、後述の沈殿化剤等を適宜加えてもよい。
　前記第２の相は、前述のように任意である。特に、タンパク質、核酸等の生体物質の結晶を製造する場合、前記第２の相は、例えば、ゲルが好ましい。ゲル中での結晶製造は、強度および品質に優れた結晶が得やすい、結晶がゲルにより被覆されるため破壊されにくい等の利点がある。このことは、例えば、タンパク質、核酸等の、脆くて壊れやすい結晶を、Ｘ線結晶構造解析等に供する場合に、特に有利である。また、前記第２の相がゲルである場合は、例えば、前記第２の相が溶液である場合よりも結晶が析出しやすい。この理由は必ずしも明らかではないが、例えば、前記第２の相がゲルであると、前記第２の相中における前記目的物質の拡散が抑制され、前記目的物質が前記第２の相に移行した部分において前記目的物質濃度が局所的に高くなりやすいためと考えられる。ただし、この説明は、推測可能なメカニズムの一例であり、本発明を限定しない。
　前記第２の相がゲルである場合、前記ゲルは、例えば、ゲル化剤を溶媒に溶解させ、固化（ゲル化）させて製造できる。前記溶媒は、特に限定されないが、例えば、水、エタノール、メタノール、アセトニトリル、アセトン、アニソール、イソプロパノール、酢酸エチル、酢酸ブチル、クロロホルム、シクロヘキサン、ジエチルアミン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、トルエン、ブタノール、ブチルメチルエーテル、ヘキサン、ベンゼン、メチルエチルケトン等が挙げられ、１種類でも複数種類併用しても良い。
　前記ゲル化剤は特に限定されないが、例えば、多糖類、増粘多糖類、タンパク質、および昇温時ゲル化型ゲルからなる群から選択される少なくとも一つであることが好ましく、アガロース、寒天、カラギーナン、ゼラチン、コラーゲン、ポリアクリルアミド、昇温時ゲル化型ポリアクリルアミドゲルからなる群から選択される少なくとも一つであることがより好ましい。ゲル化温度は特に制限されないが、結晶製造の行いやすさの観点から、例えば０～９０℃、好ましくは０～６０℃、より好ましくは０～３５℃である。
　前記ゲル化剤は、例えば、低温でゲル化し高温でゾル化するゲルでも良いし、逆に低温でゾル化し高温でゲル化するゲルでも良い。低温でゾル化し高温でゲル化するゲルは、「昇温時ゲル化型ゲル」という。また、例えば、冷却により得られたゲルを再び昇温した時、あるいは昇温により得られたゲルを再び冷却した時、再びゾルに戻るゲルであることが好ましい。このようなゲル化剤は「熱可逆性ゲル」という。また、前記ゲル化剤は、例えば、ハイドロゲルでもオルガノゲルでも良いが、ハイドロゲルが好ましい。ハイドロゲルとしては、例えば、昇温時ゲル化型ハイドロゲルを用いることがより好ましい。昇温時ゲル化型ハイドロゲルは、低温でゲル化し高温でゾル化する一般的なゲルとは逆に、前述のように低温でゾル化し高温でゲル化する性質を持っている。このため、昇温時ゲル化型ハイドロゲルで被覆された被覆結晶は、例えば、乾燥に特に強い、冷却によりゲルを簡便に除去できる、などの利点を有する。昇温時ゲル化型ハイドロゲルとしては、特に制限されないが、例えば、メビオールジェルが挙げられる。メビオールジェルは、メビオール株式会社の昇温時ゲル化型ハイドロゲルの商品名であり、例えば下記の化学構造を有する。メビオールジェルは、昇温時ゲル化型ハイドロゲルとしての性質および熱可逆性ハイドロゲルとしての性質を有するポリアクリルアミドゲルである。
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　また、前記第２の相は、前記目的物質を含んでいても良いし、含んでいなくても良い。前記第２の相が前記目的物質を含む場合、例えば、目的物質を含む第２の相を製造してから、前記第１の相と接触させて界面を形成させても良い。または、目的物質を含まない第２の相を製造し、前記第１の相と接触させて界面を形成させた後に、しばらく静置等することによって、前記第１の相中の目的物質を、前記第２の相中に移行させても良い。より具体的には、例えば、目的物質を含む溶液（第１の相）を、ゲル（第２の相）に接触させ、前記ゲル中に前記目的物質を移行させても良い。例えば、前記第１の相および前記第２の相中の前記目的物質の濃度が平衡に達するまで静置することが好ましい。このようにして、前記第１の相と前記第２の相がともに前記目的物質を含み、かつ、それらの界面が形成された状態を形成し、その後に、前記気泡衝突工程を行うと、例えば、前記第２の相中で、通常では実現不可能な高い目的物質濃度を実現しやすい。
　前記第２の相が、前記目的物質を含むゲルである場合、例えば、前記目的物質溶液にゲル化剤を加え、ゲル化させて調製できる。ゲル化剤は、前記目的物質溶液中に直接加えても良いが、別途ゲル化剤溶液を調製した後、前記目的物質溶液に混合すると、均一に混合しやすいため好ましい。前記ゲル化剤溶液の溶媒は特に制限されないが、例えば、前記目的物質溶液と同じである。また、前記ゲル化剤溶液中におけるゲル化剤濃度は特に制限されないが、後述のゲル強度等の観点から、前記ゲル化剤溶液の全質量に対し、例えば０．１～５０質量％、好ましくは０．１～３０質量％、より好ましくは０．１～２０質量％、さらに好ましくは０．２～１５質量％、特に好ましくは０．２～１０質量％である。前記目的物質溶液にゲル化剤を加えた後、ゲル化させる方法は特に制限されない。例えば、ゲル化温度よりも高い温度（例えば２０～４５℃）で前記ゲル化剤溶液を調製し、前記目的物質溶液と混合した後、ゲル化温度以下の温度で静置すれば良い。より具体的には、例えば、前記ゲル化剤溶液と前記目的物質溶液を混合した後、キャピラリーに封入し、キャピラリー中でゲル化させてもよい。これにより、ゲルがキャピラリーに封入された状態となる。また、熱可逆性ハイドロゲルの場合は、例えば前記とは逆に、低温で前記ゲル化剤溶液を調製し、前記目的物質溶液と混合した後、温度を上昇させてゲル化させてもよい。
　前記ゲル化後のゲル強度は、後述する結晶析出工程で析出した前記目的物質結晶を物理的衝撃から保護しやすい等の観点から、例えば５Ｐａ以上、好ましくは１０Ｐａ以上、より好ましくは３０Ｐａ以上、さらに好ましくは５０Ｐａ以上、特に好ましくは１００Ｐａ以上である。また、前記ゲル化後のゲル強度は、前述のように、前記目的物質のゲル中への移行しやすさの観点から、高すぎないことが好ましい。その上限値は、例えば、前記本発明の目的物質の移行方法において、前記第２の相の圧縮強さの上限値として記載しているとおりである。
　前記ゲル化後のゲル強度は、前記ゲル化剤濃度を調節することによって、適宜設定することができる。同じゲル化剤濃度における前記ゲル強度は、前記ゲル化剤の種類によって異なる。例えば、図２２のグラフに示すとおり、アガロースＩＩＩ、アガロースＳＰ（アガロースＳｅａ　Ｐｌａｑｕｅ）、アガロース９Ａ（いずれもタカラバイオ株式会社の商品名）は、同じ濃度であれば、ゲル化後は、通常、アガロースＩＩＩ＞アガロースＳＰ＞アガロース９Ａの順にゲル強度が高くなる。なお、図２３のグラフに、図２２におけるアガロース９Ａのみの測定結果を示す。図２２および２３において、横軸は前記各アガロースの濃度（質量％）であり、縦軸はゲル強度（ｇ／ｃｍ２）である。なお、１ｇ／ｃｍ２は、９８．０６６５Ｐａに相当する。また、ゲル化剤濃度が一定の臨界的濃度未満である場合、前記ゲル化剤を含む溶液が明確にゲル化しないため、ゲル強度は測定不能（グラフ上の記載としては０）である。しかしながら、ゲル化剤濃度が前記臨界的濃度以上になると、前記溶液が明確にゲル化することが可能であるため、ゲル強度が測定可能となる。本発明においては、前記ゲル化剤濃度を前記臨界的濃度以上にすることが好ましい。前記臨界的濃度は、アガロースＩＩＩ、アガロースＳＰ、アガロース９Ａの場合、図２２および図２３に示すとおり、いずれも、約０．６質量％である。
　なお、前記ゲル（第２の相）が目的物質を含まない場合は、目的物質を添加しない以外は上記と同様にして（例えば、ゲル化剤のみを溶媒に溶解させて）前記ゲルを調製することができる。また、例えば、後述する実施例のように、目的物質を含まないゲル（第２の相）を、目的物質を含む溶液（第１の相）に接触させて静置し、目的物質を含浸させた後に、前記気泡衝突工程を行っても良い。このための前記第１の相と前記第２の相との接触時間は、特に限定されないが、例えば０～２４０ｈｒ、好ましくは０～７２ｈｒ、より好ましくは０～２４ｈｒである。例えば、前記目的物質濃度が、前記第１の相中および前記第２の相中で平衡に達するまで接触させた後に、前記気泡衝突工程を行っても良い。
　前記ゲル中から前記目的物質の結晶が析出しやすくするために、例えば、沈殿化剤を用いても良い。この方法は、前記目的物質が結晶化しにくい物質（例えば、タンパク質、核酸等）である場合に特に有効である。前記沈殿化剤の使用方法は特に限定されない。例えば、後述する実施例のように、前記第２の相に前記沈殿化剤を含ませておいても良い。前記沈殿化剤は特に制限されないが、例えば、公知の結晶製造方法に用いる沈殿化剤と同じ物を用いてもよい。前記沈殿化剤は、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、酒石酸カリウムナトリウム、クエン酸ナトリウム、PEG（ポリエチレングリコール）、塩化マグネシウム、カコジル酸ナトリウム、HEPES(2-〔4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル〕エタンスルホン酸)、MPD(2-メチル-2,4-ペンタンジオール)、およびTris-HCl（塩酸トリスヒドロキシメチルアミノメタン）からなる群から選択される少なくとも一つである。前記沈殿化剤を前記第１の相中に含ませる場合、その濃度は特に限定されないが、例えば０．０００１～１０Ｍ、好ましくは０．０００５～８Ｍ、より好ましくは０．０００５～６Ｍである。また、前記沈殿化剤は、必要に応じ、ｐＨ調整剤等を適宜含んでいてもよい。なお、沈殿化剤は、「沈殿剤」とも言うことがある。また、前記第２の相中に代えて、またはこれに加え、前記第１の相中に前記沈殿化剤を含ませても良い。前記沈殿化剤を前記第１の相中に含ませる場合、その濃度は特に限定されないが、例えば、前記第２の相中に含ませる場合と同様である。また、例えば、前記沈殿化剤を含む前記第１の相を、前記第２の相（ゲル等）に接触させ、前記沈殿化剤を含浸させても良い。このための前記第１の相と前記第２の相との接触時間は、特に限定されないが、例えば０～２４０ｈｒ、好ましくは０～７２ｈｒ、より好ましくは０～２４ｈｒである。例えば、前記沈殿化剤濃度が、前記第１の相中および前記第２の相中で平衡に達するまで接触させた後に、前記気泡衝突工程を行っても良い。
　目的物質（例えば、タンパク質、核酸等）の結晶化（結晶析出）は、例えば、用いる前記目的物質と沈殿化剤との物質量比により制御することができる。この物質量比をより詳細に制御することで、例えば、さらに高品質かつ大型の単結晶を得ることも可能である。本発明では、例えば、網目の分子構造を持ったゲル（例えばアガロースゲル）に沈殿化剤を含む溶液（例えば、前記第１の相）を接触させ、沈殿化剤を拡散させることによって、前記ゲル中で前記沈殿化剤の濃度勾配を形成することもできる。これにより、前記第２の相中で、前記目的物質と前記沈殿化剤との物質量比を容易に制御することが可能である。この場合、沈殿化剤の拡散速度が結晶成長速度に比べ十分遅いことがより好ましい。これにより、最適な混合比の条件で前記タンパク質等の目的物質の結晶化が実現できるため、結晶の製造がさらに簡便になる。また、これにより、本発明の製造方法は、様々な組み合わせの混合比を一気に検索することが可能な“コンビナトリアル結晶化技術”として、結晶化スクリーニング方法に応用することもできる。
　以上のような第１の相および第２の相を近接させる（前記「相近接工程」）。この相近接工程は、前述のとおり、前記第１の相と前記第２の相とを接触させて界面を形成させる界面形成工程であることが好ましい。この界面形成工程は、例えば、前記のように、第１の相および第２の相を接触させてしばらく静置し、前記目的物質等を前記第２の相（ゲル等）に含浸させる工程を含んでいても良い。
　つぎに、前記第１の相における前記界面近傍に気泡を発生させて崩壊させる（前記「気泡崩壊工程」）。この気泡崩壊工程は、前述のとおり、前記第１の相中における前記界面近傍に気泡を発生させて前記界面に衝突させる気泡衝突工程であることが好ましい。気泡を発生および崩壊（好ましくは、前記界面に衝突）させる方法は、例えば、前記本発明の目的物質移行方法において説明したとおりである。すなわち、例えばレーザー光照射により、前記第１の相中における前記第２の相の近傍（前記第１の相と前記第２の相とが接触して界面を形成している場合は、前記界面近傍）に気泡を発生させる。発生した気泡は、例えば、前述のように、キャビテーション挙動により、崩壊（好ましくは、前記界面に衝突）する。レーザー光を用いる場合、集光点および気泡サイズ等を制御しやすいという観点、または、不要な熱や化学反応が誘起され難い等の観点から、フェムト秒レーザーが特に好ましい。前記レーザー光の照射エネルギーの総和は特に限定されないが、例えば、前記本発明の目的物質移行方法において記載したとおりである。前記レーザー光のパルス幅は、特に限定されないが、例えば１０－１５～１０－６秒、好ましくは１０－１５～１０－９秒、より好ましくは１０－１５～１０－１２秒である。前記レーザー光の周波数は、特に限定されないが、例えば１～１０６Ｈｚ、好ましくは１～１０４Ｈｚ、より好ましくは１～１０３Ｈｚである。前記レーザー光の照射時間は、特に限定されないが、例えば０．０１～１０６秒、好ましくは０．１～１０５秒、より好ましくは１～１０４秒である。
　このような目的物質移行工程により、前記目的物質を前記第１の相中から前記第２の相中に移行させた後、前記第２の相中または界面で結晶を析出させる（前記「結晶析出工程」）。結晶を析出させる方法は特に限定されないが、例えば、前記第１の相および前記第２の相を接触させたまま、または、前記第１の相を除去した後、結晶が析出するまで前記第２の相を静置しておけば良い。析出させた結晶の安定性、および前記目的物質の継続的供給等の観点からは、前記第１の相を除去せずにそのまま静置することが好ましい。静置時の温度は、特に限定されないが、例えば、０～２００℃、好ましくは０～１５０℃、より好ましくは０～１００℃である。例えば、前記目的物質移行工程によって前記目的物質（例えばタンパク質）を浸透させ、前記目的物質濃度が高くなった前記第２の相（例えばゲル）中に、前記目的物質を保持させたまま静置することもできる。
　本発明の結晶製造方法によれば、例えば、目的物質を含む液相（溶液、分散液、懸濁液等）一相系、または固相（ゲル等）中へのレーザー光照射では結晶化しにくい目的物質であっても、結晶化させて結晶を得ることが可能である。このため、本発明の結晶製造方法は、結晶化しにくい目的物質（例えば、タンパク質、核酸等の生体物質）の結晶の製造に、特に有効である。この理由は不明であるが、例えば、前述のように、前記第２の相中における前記目的物質の濃度を、通常の方法よりも高濃度にしやすいためと考えられる。または、前記気泡の崩壊（好ましくは、前記第１の相との界面への前記気泡の衝突）による衝撃が、前記第２の相中または前記界面における結晶核の発生を誘発し、結晶化が起こりやすくなると考えられる。ただし、これらのメカニズムは推測であり、本発明を限定しない。
　前記第２の相が固相（例えばゲル）である場合、前記第２の相中または界面で析出させた結晶は、例えば、その全体または一部が前記第２の相で被覆されていると、メカニズムは不明であるが、例えば、前述のように、強度および品質等に優れた結晶が得やすい等の利点がある。また、後述するように、結晶がゲルにより被覆されるため破壊されにくい等の利点がある。
　前記目的物質移行工程および前記結晶析出工程の少なくとも一方において、前記第１の相および前記第２の相の少なくとも一方を撹拌することが好ましい。これによると、メカニズムは不明であるが、例えば、Ｘ線結晶構造解析等にさらに適した、より高分解能の（分解能が小さい）結晶を得ることもできる。この方法は、例えば、撹拌を行わなければＸ線結晶構造解析等に適した高分解能の結晶が得にくい目的物質（例えば、キシナラーゼ、ＡｃｒＢ、ヒトリゾチーム、アデノシンデアミナーゼ等のタンパク質、核酸等）に特に有効である。Ｘ線結晶構造解析に供するための分解能は、例えば３．５Å以下、好ましくは３．０Å以下、より好ましくは２．６Å以下、さらに好ましくは２．２Å以下、特に好ましくは１．８Å以下である。前記分解能の下限値は、特に限定されないが、例えば、０Åを超える値である。なお、１Åは、１０－１０ｍ（１０分の１ｎｍ）に等しい。前記撹拌の速度は、特に限定されないが、例えば１０～２５０ｒｐｍ、好ましくは２０～２００ｒｐｍ、より好ましくは３０～１５０ｒｐｍである。前記撹拌の時間は、特に限定されないが、例えば、０．５分間～１．０×１０６分間、より好ましくは１．０分間～１．０×１０５分間、特に好ましくは１．０分間～５．０×１０４分間である。例えば、タンパク質等をゲル中で結晶化させる従来の技術では、ゲルそのものを撹拌できないために、撹拌による前記効果を得ることが困難な場合がある。本発明における結晶析出工程は、前述のとおり、前記第１の相を除去して行っても、除去せずに行っても良いが、たとえば、前記第１の相を除去せず、かつ前記第１の相を撹拌しながら行うことで、撹拌による前記効果を得ることも可能である。
　なお、前記第２の相は、例えば、前記のようにゲルでも良いが、ゲル化剤を含むゾル状態の溶液でも良い。メカニズムは明らかではないが、ゾル状態の溶液でも、ゲル化剤を含むことにより、結晶が析出しやすくなり、結晶の破損等が起こりにくくなるという効果が得られる場合がある。前記ゾル状態のゲル化剤溶液中で前記生体物質を結晶化させる方法は、例えば、前記ゲル化剤が熱可逆性ハイドロゲルである場合に特に有用である。また、例えば、前記生体物質および前記熱可逆性ハイドロゲルを含むゾル状態溶液を攪拌しながら前記目的物質（例えば、タンパク質、核酸等の生体物質）を結晶化させ、その後前記溶液をゲル化させ、そのゲル中で前記目的物質結晶をさらに成長させることが特に好ましい。
　本発明の結晶製造方法により製造される結晶は、例えば、前記ゲルで被覆された被覆結晶であることが好ましい。この被覆結晶の製造条件は特に制限されないが、例えば、本発明の結晶製造方法において、前記ゲル中から前記生体物質の結晶を析出させることで、必然的に、前記ゲルで被覆された被覆結晶としてもよい。前記被覆結晶は、全体が前記ゲルで被覆されていることが特に好ましいが、一部のみが前記ゲルで被覆されていても良い。一般に、タンパク質等の生体物質の結晶は、脆く、かつ、乾燥等により変質しやすい。このため、生体物質結晶は、例えば、結晶構造解析の試料として供する操作（マウント）および種結晶として供する操作（Seeding）時など、慎重にかつ手早く操作を行わないと、物理的衝撃や乾燥により破損、変質等を起こしてしまうことが多い。これに対し、前記被覆結晶は、結晶がゲルで被覆されていることにより、乾燥や物理的衝撃に対する耐性が向上しており、結晶の変質、破損等が起こりにくい。このため、例えば、前記マウント操作やSeeding操作が極めて行いやすくなる。さらに、結晶の保存性も向上する。
　なお、前記被覆結晶において、結晶を被覆している前記ゲルは、例えば、後述の結晶構造解析において測定ノイズの原因となるなどの支障がある場合は、あらかじめ除去することが好ましい。除去方法は特に制限されない。例えば、前記ゲルが熱可逆性ハイドロゲルであれば、冷却により前記ゲルがゾル化するため、簡便に除去できる。ゾル化させるための冷却温度は特に制限されないが、メビオールジェルの場合、例えば、１５℃以下である。また、前記被覆結晶を適宜な方法で加工し、前記ゲルを含まない結晶だけを取り出すこともできる。前記加工の方法は特に制限されないが、例えば、レーザー光を用いた加工がある。前記レーザー光も特に制限されないが、フェムト秒レーザーを用いることが特に好ましい。フェムト秒レーザーは、集光点付近のみで加工を行うことが可能であるため、例えば、結晶製造（育成）用容器を密封したままで簡便に加工できる等の利点があるためである。また、レーザー光を用いた加工によれば、例えば、結晶を、構造解析等の用途に適した大きさや形状に切り出すこともできる。このような加工工程により、結晶を適切な大きさや形状に切り出すことで、前記適切な大きさや形状の結晶を製造することもできる。また、例えば、前記加工工程により、前記被覆結晶からゲルのみを適切に除去し、結晶部分のみを残した加工結晶を製造することもできる。すなわち、前記加工結晶は、ゲルで被覆された被覆結晶でも良いし、ゲルで被覆されていなくても良い。
　なお、レーザー光によるこのような加工は、ゲルで被覆されていない結晶に対しても行うことができる。しかしながら、前記被覆結晶であれば、結晶がゲルにより固定および保護されているため、結晶が加工しやすく損傷を受けにくい、加工の際のデブリ（切りくずや結晶の破片など）が拡散せず結晶表面に再付着しにくい、などの利点がある。
　本発明の結晶製造方法によれば、例えば、従来よりも高い確率で高品質かつ大型の結晶が得られ、かつ、前述の濃度勾配形成を利用したスクリーニング法（濃度勾配法）によれば、結晶化条件の広範な探索（コンビナトリアル探索）が可能である。これらに関しては、例えば、従来、タンパク質等の結晶化で最も良く用いられてきた蒸気拡散法よりも優れた結果を得ることもできる。
　また、本発明の結晶製造方法によれば、例えば、前記第２の相（例えばゲル）中または前記第１の相との界面から前記生体物質の結晶を析出させることで、以下のような利点を得ることもできる。
　構造ゲノム科学の分野におけるタンパク質結晶の構造解析等では、結晶のマウントに高度な技能を有する。例えば、低温における結晶構造解析を行うに際しては、抗凍結条件下に置いた結晶をナイロン糸を用いたループ状のマウント器具を用いて溶液ごとすくい取り、表面張力でループ内に結晶を保持した状態で凍結および測定を行う方法が従来から行われている。この方法では結晶の周りを抗凍結剤溶液が取り囲むので、測定中に結晶を非接触で保持が可能である。その反面、結晶の取り出し時にループの接触等による物理的な損傷を与える可能性がある。すなわち、溶液中で得られた結晶は、結晶マウントの際、溶液中を自由に移動するため、前記ループ等への間接・直接的な接触により、Ｘ線測定前に損傷を受けるおそれがある。このため、精度良い測定を行うにはループの取り扱いについての熟練した技能が要求される。
　一方、本発明の結晶製造方法では、例えばゲル中または前記第１の相との界面から、特にゲル中から前記生体物質（タンパク質等）の結晶を析出させることにより前記生体物質結晶がゲルで固定された状態となる。したがって、前記生体物質結晶がゲルで固定され移動が阻害されること、ゲルで保護され損傷を受けにくいこと等により、マウント操作が容易であり、再現性の高いマウント操作が可能となる。これによれば、例えば、結晶マウント工程を自動化することにより、従来達成不可能であったタンパク質結晶等のＸ線構造解析のフルオートメーション化も達成可能となる。また、ゲル中またはその界面から、特にゲル中から前記生体物質（タンパク質等）の結晶を析出させることで、得られた結晶はゲルに被覆されるため、結晶の凍結と簡便なマウント操作が可能となり、結晶の質を低下させずに凍結できるため高精度データが得られる。
　以上、前記第２の相がゲル等の固相である場合について、前記目的物質がタンパク質、核酸等の生体物質である場合を中心に説明したが、前記目的物質は、前述のとおり、これ以外の任意の物質であっても良い。
　また、本発明において、前記第２の相は、前述のとおり、ゲル等の固相に限定されない。例えば、前記第２の相が液相であっても良い。より具体的には、例えば、前記目的物質が水溶性であり、前記第１の相が水相であり、前記第２の相が油相であっても良い。または、前記目的物質が非水溶性であり、前記第１の相が油相であり、前記第２の相が水相であっても良い。また、例えば、前記目的物質および前記第１の相にかかわらず、前記第２の相が、フロリナート等の不活性の液体であっても良い。前記第２の相が、通常は前記目的物質を移行させることが困難な液相であっても、前述のとおり、本発明の目的物質移行方法によれば、前記第２の相中に前記目的物質を移行させ、例えば前記第２の相中に溶解、懸濁、分散等させることができる。前記第２の相として液相を用いる本発明の結晶製造方法は、例えば、前記目的物質が、有機低分子、機能性有機高分子等である場合に、特に有効である。この方法は、例えば、薬理活性を有する有機低分子、機能性有機高分子等の目的物質の結晶を製造し、さらに前記目的物質を含む医薬または薬学的組成物を製造するために用いることができる。ただし、前記目的物質はこれに限定されず、他の任意の物質でも良い。具体的には、例えば、前記本発明の目的物質移行方法で説明したとおりである。
＜組成物製造方法＞
　本発明による、組成物製造方法は、前述のとおり、目的物質移行工程を含み、前記目的物質移行工程が、前記本発明の目的物質移行方法により、前記目的物質を前記第１の相中から前記第２の相中に移行させる工程であり、前記組成物が、前記第２の相中に前記目的物質を含む組成物であることを特徴とする。これ以外は、本発明の組成物製造方法は特に限定されない。
　本発明の組成物製造方法により製造される組成物は、特に限定されないが、例えば、前述のように、ゲル中にタンパク質が高濃度で凝縮されたタンパク質チップが挙げられる。また、これ以外に、例えば、分析等で使用する解析標本、有機機能デバイスなどの回路もしくは集積体等が挙げられる。前述のとおり、通常の方法では、前記第２の相中への前記目的物質の移行、または前記第２の相中での前記目的物質の高濃度等が達成困難であっても、本発明の目的物質移行方法によれば、これらを達成することもできる。これを利用して、本発明の組成物製造方法では、従来の方法では製造困難であった新規な組成を有する組成物を製造することも可能である。
＜目的物質移行装置＞
　本発明の目的物質移行装置は、前述のとおり、目的物質を含む液相または固相から形成された第１の相中の前記目的物質を、液相または固相である第２の相中に移行させる装置であって、前記第１の相と前記第２の相とを近接させる相近接手段と、前記第１の相と前記第２の相との境界の近傍に気泡を発生させて崩壊させる気泡崩壊手段とを含むことを特徴とする。これ以外は、本発明の目的物質移行装置は特に限定されない。
　図１に、本発明の目的物質移行装置の一例を模式的に示す。ただし、これは例示に過ぎず、本発明の目的物質移行装置は、これにより何ら限定されない。図示のとおり、この装置は、フェムト秒レーザー１、グリーンレーザー２、容器３、レンズ４、ビームスプリッター５、ダイクロイックミラー６および７、シャッター８、赤外光遮断フィルター９、フォトディテクター１０、ファンクションジェネレーター１１、ＣＣＤカメラ１２、ストロボ光源１３および対物レンズ１４を有する。フェムト秒レーザー１から発射したレーザー光は、ビームスプリッター５により分離することができる。その分離したレーザー光の一部を、ダイクロイックミラー６で反射させ、対物レンズ１４を通して、容器３中の試料に照射することができる。前記試料は、前記第１の相および第２の相を含み、前記第１の相中における第２の相の近傍に、前記レーザー光を照射する。ビームスプリッター５で分離した前記レーザー光の残りは、フォトディテクター１０で検出し、シャッター８およびファンクションジェネレーター１１の制御に用いることができる。シャッター８を開閉することにより、フェムト秒レーザー１から発射したレーザー光の、容器３中の試料ヘの照射（パルス幅、照射時間等）を制御することができる。ファンクションジェネレーター１１は、例えば、フェムト秒レーザー１に対し、任意波形を発生させるための発生器として機能させることができるとともに、ＣＣＤカメラ１２およびストロボ光源１３の制御にも用いることができる。ストロボ光源１３により容器３中の試料に光照射するとともに、その光を、対物レンズ１４および赤外光遮断フィルター９を通してＣＣＤカメラ１２で観察し、写真撮影可能である。グリーンレーザー２は、フェムト秒レーザー１から発射するレーザー光の集光点制御等に用いることができる。グリーンレーザー２から発射したレーザー光は、レンズ４を透過させた後、ダイクロイックミラー７により反射させ、対物レンズ１４を通して容器３中の試料に照射することが可能である。同図の装置では、容器３中で前記第１の相と前記第２の相を近接（好ましくは、接触させて界面を形成）させるので、例えば、容器３が、前記「相近接手段」であるということができる。また、同図の装置は、発生した気泡を前記界面に衝突させるための特別の手段を有さず、前記気泡は、キャビテーション挙動により、崩壊（好ましくは、前記界面に衝突）する。この装置では、フェムト秒レーザー１、ビームスプリッター５、フォトディテクター１０、シャッター８およびダイクロイックミラー６により前記第１の相中における前記第２の相の近傍にレーザー光を照射して気泡を発生させ、崩壊（好ましくは、前記第２の相との界面に衝突）させる。したがって、例えば、フェムト秒レーザー１、ビームスプリッター５、フォトディテクター１０、シャッター８およびダイクロイックミラー６を合わせたものが、前記「気泡崩壊手段」であるということができる。
　以下、本発明の実施例について、参考例と併せて説明する。しかし、本発明は、以下の実施例における結果およびその考察のみには限定されない。
　以下の実施例および参考例において、レーザー光照射には、図１に示す構造の装置を用いた。フェムト秒レーザー１は、Ｃｙｂｅｒ　Ｌａｓｅｒ社のＩＦＲＩＴ－ＳＡ１０（商品名）を用いた。このレーザーの基本波長は７８０ｎｍであり、波長変換により２６０ｎｍのレーザー光を発振することが可能である。また、パルス時間幅は２００～２０００ｆｓの間で選択できる。また、レーザー光の周波数は、以下の実施例および参考例では、特に断らない限り、１ｋＨｚとした。集光点の様子は高速度（ＣＣＤ）カメラ１２（株式会社島津製作所のＨｙｐｅｒＶｉｓｉｏｎ　ＨＰＶ－２［商品名］、またはＰｒｉｎｃｅｔｏｎ　ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのＰｈｏｔｏｎ　ＭＡＸ　５１２Ｂ［商品名］）により、マイクロ秒オーダーの時間分解能で観察することが可能である。
　また、以下の実施例および参考例において、結晶製造（育成）用の容器（図１の符号３）は、特に断らない限り、Ｇｒｅｉｎｅｒ社の、９６ウェル　Ｉｍｐ＠ｃｔ　ｐｌａｔｅ（商品名）を用いた。各実施例または参考例において示した核発生率は、特に断らない限り、結晶の発生が観察されたウェル数を、用いた全てのウェル数で割った値である。「ｓｈｏｔ」または「ｓｈｏｔｓ」は、特に断らない限り、レーザー光の照射回数を表す。
＜参考例１：リゾチーム溶液一相系における、リゾチーム結晶製造＞
　第２の相を含まない、リゾチーム溶液一相系を用いて、結晶を製造した。すなわち、まず、結晶製造用容器（プレート）に、４０ｍｇ／ｍＬのリゾチーム水溶液（ｐＨ調整剤として酢酸ナトリウムを０．１Ｍ含む水溶液（ｐＨ４．５）に、リゾチームおよび沈殿化剤としての塩化ナトリウム３ｗｔ％を溶解させたもの）１００μＬを、各ウェルに等量ずつ分注した。２種類のパルス時間幅（２００ｆｓまたは１８００ｆｓ、共に波長７８０ｎｍ）を用い、照射したレーザー光のエネルギーの総和（レーザーエネルギー）を種々変化させて、核発生率を確認した。その結果、図２のグラフに示すように、一定のエネルギーしきい値（２００ｆｓ：　０．７μＪ／ｐｕｌｓｅまたは１８００ｆｓ：　１μＪ／ｐｕｌｓｅ）以上でレーザーを照射した場合に、レーザー光を照射しない場合と比較して核発生率の増加（核発生促進）がみられた。パルス時間幅が長くなると、核発生に要するしきい値が増加することから、フェムト秒レーザーによる非線形吸収をトリガー（要因）として核発生が誘起されると考えられる。図３のグラフに示す通り、波長を２６０ｎｍに変えても、核発生促進が起こるレーザーエネルギー強度には同様にしきい値が見られた。なお、前記しきい値は、図２とは若干異なるが、これは、使用した対物レンズの開口数（Ｎ．Ａ．）が異なるためである。また、波長２６０ｎｍのレーザー光を照射した場合は、レーザー光の吸収効率が高いため、集光点にタンパク質の変性物と思われる沈殿が生じた。この沈殿は核発生促進が起こらないような条件でも見られたことから、光化学的に生成されたタンパク質変性物は、本参考例における核発生のメイントリガー（主要因）ではないと推測される。
＜参考例２：タンパク質溶液中へのレーザー光照射によるキャビテーション挙動＞
　参考例１におけるリゾチーム溶液（水溶液）中にレーザー光照射した時の前記リゾチーム溶液の様子を、高速度（ＣＣＤ）カメラを用いて観察した。その結果、図４の写真に示すように、レーザー光照射後数マイクロ秒以内に集光点から気泡が発生し、膨張と収縮を繰り返しながら数十マイクロ秒程度で崩壊し、細かい気泡が残るというキャビテーション挙動が確認された。また、キャビテーション発生時に衝撃波が発生することを、液中圧力センサーを用いて確認した。この時の気泡の直径のレーザー光強度依存性から、図５のグラフに示す通り、キャビテーション発生（気泡発生）のしきい値（２００ｆｓ：　０．２μＪ／ｐｕｌｓｅ，　１８００ｆｓ：　０．７μＪ／ｐｕｌｓｅ）を定量的に決定し、リゾチームの核発生のしきい値と同程度であることを確認した。また、この観察結果から見積もられるキャビテーションの最大膨張および収縮速度（～６０μｍ／μｓ）は、溶質の自由拡散速度（リゾチーム～０．０１５μｍ／μｓ）よりも３桁以上大きいことを確認した。このような高速膨張・収縮挙動は、溶液中に局所的な濃度ゆらぎを生じさせると考えられ、これが核発生のトリガー（要因）となりうると推測される。
　さらに、蛍光分子（テトラメチルローダミン－５－イソチオシアネート［tetra-methylrhodamine-5-isothiocyanate］）をラベルしたリゾチームの溶液を用いて、キャビテーション周囲の濃度ゆらぎの直接観察を試みた。実験では、高感度カメラ（高感度なＣＣＤカメラの一種である、ＥＭＣＣＤを使用）を組み込んだ顕微システムを構築し、溶液中の高速蛍光像観察を行った。その結果、図６に示す通り、気泡の収縮時に周囲の領域より数倍程度強い蛍光を発する領域が生じることを観測した。図６（ａ）は、前記高速蛍光像観察の経時変化を示す写真であり、図６（ｂ）は、レーザー照射後２０μｓ時の蛍光強度分布を示すグラフである。図６（ｂ）において、横軸は測定位置（μｍ）を表し、８０μｍ付近が集光点である。縦軸は、蛍光強度を表す。同図に示す通り、集光点付近において、特に強い傾向が観測された。
　さらに、リゾチームに代えて有色の水溶性タンパク質チトクロムＣを用いて、溶液の濃度分布を画像の明度分布として観察した結果、図７の写真に示す通り、キャビテーションの発生前後でチトクロムＣの濃度分布が変化し、集光点付近に低濃度領域が、その周囲に高濃度領域が形成されることを確認した。
　以上の結果から、タンパク質溶液中において、気泡の膨張および収縮（キャビテーション）によって周囲の分子が強制的に移動させられ、局所的に高タンパク質濃度領域が形成されることで核発生の促進が起こると推測される。
　光を利用したタンパク質の結晶化手法（結晶製造方法）には、光電場による分子配列、紫外光吸収により生じたタンパク質変性物を核とした結晶化などがある。これらに対し、本参考例の方法は、過飽和度という核発生の本質的な部分に作用する。そのため、本参考例の原理によれば、リゾチームに限定されず、他の任意のタンパク質または他の任意の目的物質に対しても、その種類および物性によらず、核発生の誘起が可能であると推論できる。この原理を、前記第１の相と前記第２の相との二相系に応用すれば、例えば、後述の実施例のように、本発明の結晶製造方法を実施することができる。
＜参考例３：ゲル中へのレーザー光照射によるタンパク質結晶製造＞
　本参考例では、参考例１と同様のリゾチーム溶液（水溶液）にゲルを添加して高粘性化し、これにより分子拡散を抑制し、キャビテーションによる高タンパク質濃度領域の緩和時間を長くして核発生確率を高めることを試みた。前記ゲルとしては、１ｗｔ％（重量％）のアガロースを添加し、リゾチームモノマーの拡散定数を５０～８０％まで低下させた。このゲル添加溶液に、５．５μＪ／ｐｕｌｓｅ、１ｐｕｌｓｅ、８０ｓｈｏｔの条件で、フェムト秒レーザー光照射し、その後、一定時間静置させて、結晶（結晶核）の発生を観測し、核発生率（％）を算出した。なお、前記「８０ｓｈｏｔ」は、照射回数ではなく、１ウェル中の８０箇所に照射したことを表す。本参考例では、リゾチームの濃度を種々変化させるとともに、比較対照のために、ゲル（アガロース）を添加しないリゾチーム水溶液についても、同様に結晶製造（核発生）を行った。図８のグラフに、その結果を示す。同図は、本参考例の結晶製造（核発生）における核発生率と各種条件との相関関係を、三次元的に示すグラフである。同図において、奥行き方向の軸には、前記レーザー照射後の静置時間（１～５日）を示し、紙面横方向の軸には、それ以外の各種条件を、並列的に示す。「Ａｇａｒｏｓｅ　ｆｒｅｅ」は、アガロースを添加しなかったことを表し、「１ｗｔ％　ａｇａｒｏｓｅ」は、１ｗｔ％のアガロースを添加したことを表す。「７ｍｇ／ｍＬ」「８ｍｇ／ｍＬ」「４ｍｇ／ｍＬ」「６ｍｇ／ｍＬ」は、それぞれ、リゾチームの濃度を表す。「σ」は、過飽和度であり、σ＝（（タンパク質濃度）－（溶解度））／（溶解度）で表される。なお、それぞれ、沈殿化剤としての塩化ナトリウムを８ｗｔ％含む。また、溶媒としては、参考例１と同様に、ｐＨ調整剤として酢酸ナトリウムを０．１Ｍ含む水溶液（ｐＨ４．５）を用いた。さらに、紙面縦方向の軸には、核発生率を示す。図示のとおり、アガロースを添加しない場合は、過飽和度σが１．３以下の低過飽和溶液では、レーザー光照射の有無にかかわらず、全く核発生が見られなかった。これに対し、アガロースを添加した場合は、σ＝１．０の低過飽和溶液において結晶（結晶核）の発生がみられ、レーザー光照射によりさらに核発生率が増加した。アガロースを添加したσ＝０．３の低過飽和溶液の場合は、レーザー光照射なしでは結晶（結晶核）の発生がみられなかったが、レーザー光照射により、核発生が誘起され、結晶が製造できた。なお、細胞増殖必須因子ＳＡＴや膜タンパク質ＡｃｒＢ等の難結晶性タンパク質においても、溶液をゲル化してレーザー照射を行うことにより、より低過飽和度で核発生を誘起することができた。
＜参考例４：界面からの距離とキャビテーション挙動との相関関係＞
　超純水に、ガラスセル中でレーザー光を集光した時のキャビテーション挙動を、高速カメラ（ＣＣＤカメラ）で撮影した。図９の写真に、その結果を示す。前記「発明を実施するための形態」で説明したように、容器（ガラスセル）の壁面から離れた位置で発生した気泡は、壁面に接することなく消滅した（図９上段）。これに対し、容器壁面近傍でのレーザー照射により発生した気泡は、壁に吸い寄せられるように加速して壁に衝突し、消滅した（図９下段）。さらに、レーザー光の集光点から壁面までの距離と、ＣＣＤカメラで観測される気泡の最大半径および移動距離との相関関係を確認した。図１５のグラフに、その結果を示す。同図において、横軸は、レーザー光の集光点から壁面までの距離（μｍ）を示す。なお、レーザー光の集光点は、気泡の発生点とほぼ等しいと推定できる。縦軸は、気泡の最大半径（μｍ）または気泡の移動距離（μｍ）を示す。図中、◆は、気泡の最大半径と、レーザー光の集光点から壁面までの距離との相関関係を表す。■は、気泡の移動距離と、レーザー光の集光点から壁面までの距離との相関関係を表す。図示のとおり、レーザー照射位置（集光点）が容器（ガラスセル）壁面に近い場合に、気泡が壁面に向かって大きく移動し、収縮せずに崩壊した。このような気泡の移動および崩壊は、集光点と壁面の距離が気泡最大半径の２倍以下のときに顕著に見られた。なお、レーザー光照射により生じる気泡は、通常、膨張と収縮を繰り返した後に崩壊するが、照射するレーザーエネルギーが大きくなるにつれて膨張および収縮の回数は多くなり、気泡の最大半径は大きくなる傾向がある。
　なお、本参考例の溶液にアガロースを添加して粘度を増加させるとキャビテーションが抑制されることも確認した。すなわち、照射するレーザー光エネルギーが同じ場合、粘度の増加に伴い、気泡の最大半径は小さくなり、０．５ｗｔ％以上のアガロース濃度では気泡の崩壊が抑制された。
　さらに、前記参考例１および２と同様のリゾチーム溶液一相系（ゲルなし）の条件で、レーザー光の集光点および気泡半径と、キャビテーション挙動および核発生との相関関係について確認した。その結果、収縮せずに崩壊するような条件下（すなわち、容器壁面のごく近く）では、照射レーザー光エネルギーが同じであっても、核発生誘起効率に減少が見られた。また、レーザー光照射位置（集光点）を容器壁面から３００μｍに固定し、核発生率の気泡半径に対する依存性を調べた。その結果、核発生の誘起効率は、気泡の移動および壁面への衝突が起こらない半径５０～１００μｍ程度のときに最大となった。したがって、気泡の容器壁面への衝突による崩壊は、結晶化目的物質の高濃度領域の形成を抑制すると考えられる。この結果は、結晶育成容器のサイズおよび溶液ボリュームが、核発生に適したレーザーエネルギーを決める一つの要素になり得る事を示唆している。
　本参考例のタンパク質溶液一相系では、容器壁面近傍にレーザー光照射して気泡の移動および壁面への衝突が起こると、核発生の誘起効率が低下した。このことから推論すると、溶液とゲルとの二相系では、溶液中においてゲルとの界面近傍にレーザー光照射すると、界面から遠くにレーザー光照射する場合よりも、核発生（結晶製造）効率が低下するとも考えられる。しかし、本発明者らは、逆に、ゲルとの界面近傍にレーザー光照射して気泡を前記界面に衝突させると、核発生（結晶製造）効率が向上することを見出した。以下の実施例に、その結果を示す。
＜実施例１：溶液とゲルとの二相系におけるリゾチーム結晶製造＞
　リゾチーム溶液（前記「第１の相」）とゲル（前記「第二の相」）との二相系において、リゾチーム結晶を製造した。すなわち、まず、図１１に示すように、結晶製造（育成）容器（Ｉｍｐ＠ｃｔ　ｐｌａｔｅ）のウェルの底に、沈殿化剤入りのゲル１０２を敷いた。具体的には、アガロースＳＰ（アガロースＳｅａ　Ｐｌａｑｕｅ、タカラバイオ株式会社の商品名）を０～４ｗｔ％、および沈殿化剤としてのＮａＣｌを５ｗｔ％、およびｐＨ調整剤としてのＮａＡｃ（酢酸ナトリウム）を０．１Ｍ含む水溶液を、各ウェル中に３～４μＬずつ分注し、１日以上置いて完全にゲル化させた。さらにその上に、図１１に示すように、１３ｍｇ／ｍＬリゾチーム水溶液１０１を、各ウェル中に５～６μＬずつ分注し、３日以上置いて、ゲル中にリゾチームをしみこませた。なお、未確認であるが、この間に、リゾチーム水溶液（第１の相）１０１およびゲル（第２の相）１０２中におけるリゾチーム濃度は、平衡に達したと考えられる。
　そのウェルに、フェムト秒レーザーによりレーザー光照射し、その後静置して結晶を析出させた。レーザー光の照射エネルギーは、３０μＪ／ｐｕｌｓｅとし、周波数は、１ｋＨｚとした。図１２Ａに、その結果を示す。同図は、本実施例の結晶製造（核発生）における核発生率と各種条件との相関関係を、三次元的に示すグラフである。左側のグラフは、前記ゲル（第２の相）におけるアガロース濃度が０．５ｗｔ％の場合を表し、右側のグラフは、前記ゲル（第２の相）におけるアガロース濃度が４ｗｔ％の場合を表す。各グラフにおいて、奥行き方向の軸には、前記レーザー照射後の静置時間（１～５日）を示し、紙面横方向の軸には、レーザー光の照射条件ａ～ｇを、並列的に示す。「Ｉｎ　Ｇｅｌ」は、ゲル中にレーザー光照射したことを表し、「Ｏｎ　Ｇｅｌ」は、溶液中におけるゲルとの界面近傍にレーザー光照射したことを表す。５ｓｈｏｔｓ（５回照射）の場合、各照射の間隔は、１秒とした。さらに、紙面縦方向の軸には、核発生率を示す。
　図示のとおり、アガロース濃度０．５ｗｔ％の場合は、レーザー光照射しないとき（ａ）およびゲル中にレーザー光照射したとき（ｂ）は、全く結晶核の発生が見られなかったが、溶液中におけるゲルとの界面近傍にレーザー光照射したとき（ｃ～ｇ）は、結晶核が発生した。一方、アガロース濃度４ｗｔ％の場合は、レーザー光照射しないとき（ａ）およびゲル中にレーザー光照射したとき（ｂ）も結晶核が発生したが、溶液中におけるゲルとの界面近傍にレーザー光照射したとき（ｃ～ｇ）のうち条件ｅにおいて、最も核発生率が高かった。さらに、図示していないが、アガロースを用いなかった（すなわち、リゾチーム溶液一相系を用いた）こと以外は本実施例と同様の条件で結晶化を試みたところ、レーザー光照射の有無にかかわらず、全く核発生が見られなかった。
　すなわち、図１２Ａに示す通り、本実施例（溶液中において、ゲルとの界面近傍にレーザー光照射）によれば、核発生率にばらつきはあるものの、タンパク質溶液一相系またはゲル中へのレーザー光照射では全く核発生（結晶の製造）ができない条件でも核発生が可能であるという極めて優れた効果が確認できた。なお、前記参考例３において、細胞増殖必須因子ＳＡＴや膜タンパク質ＡｃｒＢ等の難結晶性タンパク質も、ゲル中へのレーザー照射により低過飽和度で核発生を誘起できたことを示した。しかし、本発明によれば、それよりもさらに優れた核発生（結晶の製造）効果を得ることも可能であることを、本実施例は示している。
　また、析出したリゾチーム結晶の位置を観測するために、側方（溶液―ゲル界面と平行方向）より顕微観察を行った。その結果、図１２Ｂに示すように、レーザー照射位置において、ゲル中から溶液方向に向かって成長している結晶が観察された。これは溶液からゲル中に高濃度のタンパク質分子が注入されて核発生が起こったことを明確に示している。
＜実施例２：溶液とゲルとの二相系におけるグルコースイソメラーゼ結晶製造＞
　結晶化の目的物質として、リゾチームに代えてグルコースイソメラーゼを用い、実施例１と同様にして結晶を製造した。ただし、本実施例では、アガロースＳＰの濃度を２ｗｔ％とし、レーザー光照射条件を、３０μＪ、１２５ｐｕｌｓｅｓ、５ｓｈｏｔｓ（各照射の間隔は、１秒）に固定した。図１３に、その結果を示す。同図は、本実施例の結晶製造（核発生）における核発生率と各種条件との相関関係を、三次元的に示すグラフである。同図において、奥行き方向の軸には、前記レーザー照射後の静置時間（１～７日）を示し、紙面横方向の軸には、グルコースイソメラーゼの濃度を示す。各濃度において、左側の棒グラフは、レーザー光照射しない場合を示し、右側の棒グラフには、レーザー光照射した場合を示す。さらに、紙面縦方向の軸には、核発生率を示す。図示のとおり、レーザー光照射しない場合は、全く核発生が見られなかったが、本実施例によれば、グルコースイソメラーゼ濃度４．３ｍｇ／ｍＬおよび５．４ｍｇ／ｍＬにおいて、高い核発生率が確認された。また、図示していないが、ゲル中にレーザー光照射した場合、またはアガロースを用いない（すなわち、タンパク質溶液一相系）場合は、レーザー光照射の有無にかかわらず、全く核発生が見られなかった。すなわち、本実施例によれば、目的物質の結晶化がきわめて困難な条件でも、溶液とゲルとの二相系を用い、かつ、溶液中におけるゲルとの界面近傍にレーザー光照射することで、はじめて結晶化（核発生）が可能になる場合があることが確認された。
＜実施例３：溶液とゲルとの二相系における膜タンパク質ＡｃｒＢの結晶製造＞
　結晶化の目的物質として、リゾチームまたはグルコースイソメラーゼに代えて、難結晶性の膜タンパク質ＡｃｒＢを用い、実施例１および２と同様にして結晶を製造した。
　前記参考例３においては、細胞増殖必須因子ＳＡＴや膜タンパク質ＡｃｒＢ等の難結晶性タンパク質も、ゲル中へのレーザー照射により低過飽和度で核発生を誘起できたことを示した。また、前記実施例１では、ゲル中へのレーザー光照射よりもさらに優れた核発生（結晶の製造）効果を示した。そして、本実施例では、実際に難結晶性の膜タンパク質ＡｃｒＢを用い、ゲル中へのレーザー光照射よりもさらに優れた効果を実証した。
　本実施例においては、タンパク質溶液（水溶液）調製時におけるタンパク質（ＡｃｒＢ）濃度を２８ｍｇ／ｍＬとし、アガロースＳＰ濃度を０．５ｗｔ％とし、沈殿化剤として、ＮａＣｌに代えてＰＥＧ２０００（ポリエチレングリコール２０００）の１８ｗｔ％水溶液を用いた。各ウェルへの分注量は、ゲルを４μＬ、ＡｃｒＢ水溶液を２μＬ、沈殿化剤（１８ｗｔ％のＰＥＧ２０００水溶液）２μＬとした。ＡｃｒＢ水溶液およびＰＥＧ２０００を混合したものが第１の相であるため、第１の相中においては、ＡｃｒＢ濃度は１４ｍｇ／ｍＬ、ＰＥＧ２０００濃度は９ｗｔ％となる。レーザー光照射条件は、２０μＪ、１ｐｕｌｓｅ、５ｓｈｏｔｓ（各照射の間隔は、１秒）とした。これら以外は、実施例１および２と同様である。図１４Ａの左側に、本実施例により得られた結晶の写真を示す。なお、この写真は、レーザー光照射後、３日静置した後に撮影した。図示のとおり、本実施例によれば、結晶形がはっきりした大きなＡｃｒＢ単結晶が得られた。また、同図右側の写真は、レーザー光照射しない以外は同条件で撮影した写真である。この場合は、図示のとおり、結晶（結晶核）が得られなかった。
　さらに、図１４Ｂに、ゲル中にレーザー光照射した場合との比較結果を示す。同図左側の写真が、本実施例の結果を示す写真である。ただし、この写真の場合は、アガロースＳＰ濃度を６ｗｔ％、ＰＥＧ２０００（ポリエチレングリコール２０００）水溶液の濃度を１７ｗｔ％とした。図示のとおり、この実施例では、結晶析出（育成）中に、容器中の沈殿（濁り）が消え、透明度が高く、面のはっきりとした結晶が得られた。また、同図右側は、ゲル中にレーザー光照射した場合の写真である。図示のとおり、結晶は得られたが、本実施例と比較すると、結晶形（面）の鮮明さ、透明度の高さ等の品質が劣っていた。なお、この写真における条件は、アガロースＳＰ濃度が２ｗｔ％、ＰＥＧ２０００（ポリエチレングリコール２０００）水溶液の濃度が１０ｗｔ％であり、本実施例と異なる。これは、本実施例と同条件では、全く結晶化（核発生）が起こらなかったためである。
　以上のとおり、本実施例によれば、ゲル中へのレーザー照射よりもさらに面のはっきりとした透明度の高いＡｃｒＢ結晶が得られた。本発明の結晶製造方法は、これに限定されず、例えば、ＳＡＴ、ＡｃｒＢ等よりもさらに難結晶性な種々のタンパク質等の結晶製造に適用しても良い。
＜実施例４：高過飽和度溶液とゲルとの二相系におけるリゾチーム結晶製造＞
　リゾチーム水溶液調製時のリゾチーム濃度を２０ｍｇ／ｍＬにすること以外は実施例１と同様にしてリゾチーム結晶の製造を行った。本実施例では、ゲルおよび水溶液の、ウェル中への分注（界面形成）後、４８時間静置し、さらに、レーザー光照射後、１日静置して結晶を析出させた。図１６Ａのグラフに、その結果を示す。同図において、横軸は、レーザー光照射条件を表し、縦軸は、各ウェル中における結晶の平均析出個数を表す。なお、レーザー光照射回数は、１ｓｈｏｔ（１回）とした。また、各照射条件において、アガロース濃度２ｗｔ％、アガロース濃度４ｗｔ％、およびアガロースなし（すなわちリゾチーム溶液一相系であり、参考例に相当する）について、それぞれ結晶化を試みた。図示のとおり、アガロースゲルなし（リゾチーム溶液一相系）では、レーザー光照射しない場合は全く結晶核が発生せず、レーザー光照射しない場合も、きわめてわずかしか結晶核が発生しなかった。これに対し、アガロースゲルを用いた場合（本実施例）は、５μＪ、１ｐｕｌｓｅの照射条件のとき、レーザー光照射しない場合と比較して結晶析出個数が増加した。さらに高エネルギーの照射条件では、図示のとおり、レーザー光照射しない場合と比較して結晶析出個数は減少したが、より大きくて高品質の結晶が得られた。図１６Ｂの写真に、本実施例で得られた結晶を例示する。図示のとおり、この結晶は、最大径が数十μｍと大きく、結晶形（面）もはっきりしており、透明度も高い。
＜実施例５：リゾチームおよびグルコースイソメラーゼの結晶製造（２）＞
　溶液（第１の相）調製時のリゾチーム濃度を１４ｍｇ／ｍＬとすることと、レーザー光の照射強度を２０μＪ／ｐｕｌｓｅとすること以外は実施例１と同様にして、リゾチームの結晶製造（結晶化）を行った。図１７のグラフに、その結果を示す。同図は、レーザー光照射後３日静置した後の結果である。横軸は、レーザー光照射条件を示す。実施例１と同様、「Ｉｎ　Ｇｅｌ」は、ゲル中にレーザー光照射したことを示し、「Ｏｎ　Ｇｅｌ」は、溶液中におけるゲルとの界面近傍にレーザー光照射したことを示す。縦軸は、核発生率である。図示のとおり、レーザー光照射による核発生率の向上が見られた。
　また、溶液（第１の相）調製時のリゾチーム濃度を、１４ｍｇ／ｍＬから実施例１と同じ１３ｍｇ／ｍＬに変えること以外は同様にして、結晶製造（結晶化）を行った。図１８Ａのグラフに、その結果を示す。同図を、図１７と対比すると、レーザー照射なし、およびゲル中へのレーザー光照射では、リゾチームの濃度がわずかに低くなっただけで、全く結晶化しなくなったことが分かる。これに対し、溶液中におけるゲルとの界面近傍へのレーザー光照射（本実施例）では、安定して結晶が得られた。また、図１８Ａに示す本実施例で得られた結晶は、例えば、図１８Ｂの写真に示す通り、最大径百数十μｍという大きな結晶であり、結晶形（面）もはっきりしており、透明度もすぐれていた。
　また、レーザー光照射条件を、２０μＪ、１２５ｐｕｌｓｅｓ、５ｓｈｏｔｓとすること以外は実施例２と同様にして、グルコースイソメラーゼの結晶製造（結晶化）を行った。図１９のグラフに、その結果を示す。同図は、レーザー光照射後４日静置した後の結果である。図示のとおり、実施例２と同様に良好な核発生率で結晶が得られた。また、レーザー光照射しなかった場合、および、図示していないがゲル中にレーザー光照射した場合およびゲルを用いなかった場合（タンパク質溶液一相系）は、全く結晶核が得られなかった。
　さらに、本発明の結晶製造方法によれば、高品質の結晶が得られることを、あらためて確認した。図２０Ａおよび図２０Ｂに、その結果を示す。図２０Ａは、０．５ｗｔ％のアガロース９Ａ（タカラバイオ株式会社の商品名）または１．０ｗｔ％のアガロースＳＰ（タカラバイオ株式会社の商品名）中にレーザー光照射して得られた結晶（参考例に相当）の写真である。ゲル中には、タンパク質としてＡｃｒＢを９．３ｍｇ／ｍＬ、沈殿化剤としてＰＥＧ２０００を６．５ｗｔ％含む。レーザー光照射条件は、５．５μＪ、１ｐｕｌｓｅ、２０ｓｈｏｔｓ（照射間隔１秒）とし、レーザー光照射後、２日静置した。また、図２０Ｂは、タンパク質溶液とゲルの二相系において、溶液中におけるゲルとの界面近傍にレーザー光照射した、本発明の実施例により製造した結晶である。この実施例では、ゲル（第２の相）調製時に、ゲルとしてアガロースＳＰを０．５ｗｔ％用いた。タンパク質水溶液（第１の相）調製時には、ＡｃｒＢの２８ｍｇ／ｍＬ水溶液と、沈殿化剤としてのＰＥＧ２０００の２０ｗｔ％水溶液とを、実施例３と同様にウェル中で同量ずつ混合させて第１の相とした。レーザー光照射条件は、２０μＪ、１ｐｕｌｓｅ、５ｓｈｏｔｓ（照射間隔１秒）とし、レーザー光照射後、３日静置した。図示のとおり、本発明の実施例（図２０Ｂ）の結晶は、参考例（図２０Ａ）の結晶と比較して、きわめて大きく、結晶形（面）がはっきりしており、透明度にも優れていた。
＜実施例６：タンパク質溶液からフロリナート中へのタンパク質の移行＞
　本実施例では、タンパク質溶液からフロリナート中へのタンパク質の移行を行った。反応容器としては、Ｎｕｎｃｌｏｎ　ＤＥＬＴＡ　Ｓｕｒｆａｃｅ９６ウェル　マイクロバッチプレートを用いた。そこに、フロリナート（フッ素化合物、３Ｍ社の商品名）１００μＬを、各ウェルに当量ずつ分注し、さらにその上に、タンパク質としてリゾチームを１６ｍｇ／ｍＬ含む水溶液を１００μＬ、各ウェルに当量ずつ分注した。その後、タンパク質水溶液中における、フロリナートとの界面に、レーザー光を、３０μＪ、１００ｐｕｌｓｅｓ、１０ｓｈｏｔｓで照射した。図２１の左側の写真に、レーザー光照射直後のフロリナートの写真を示す。図示のとおり、レーザー光照射後すぐに、フロリナート中へのタンパク質の移行により、フロリナート中にタンパク質のドロップ（液滴）が観測された。このドロップは、タンパク質水溶液をフロリナート上から除去せずそのままにしておいても、少なくとも１日はフロリナート中に保持された。これに対し、レーザー光照射しなかった場合、または、タンパク質溶液中においてフロリナートとの界面から離れた（界面からの距離３００μｍ）位置にレーザー光照射した場合は、図２１の右側の写真に示すように、タンパク質のフロリナート中への移行は起こらなかった。
　このように、本実施例によれば、第１の相と第２の相との界面近傍でのキャビテーション挙動（気泡の界面への衝突）により、通常の方法ではタンパク質の移行が難しい不活性液体中にタンパク質を移行させ、前記不活性液体中で保持させることができた。タンパク質に代えて、例えば有機低分子化合物、機能性有機高分子化合物等の任意の目的物質を用いてもよく、不活性液体に代えて、水相、油相等を用いても良い。
＜実施例７：溶液とゲルの二相系における有機低分子化合物パラセタモールの結晶製造＞
　本実施例では、結晶化の目的物質として、タンパク質に代えて有機低分子化合物であるパラセタモール（Ｎ－（４－ヒドロキシフェニル）アセトアミド、またはアセトアミノフェンともいう）を用い、パラセタモール溶液（前記「第１の相」）とゲル（前記「第２の相」）との二相系において、パラセタモール結晶を製造した。すなわち、まず、図２４に示すように、結晶製造（育成）容器（マツナミボトムディッシュ）のウェルの一部にゲルを配置した。図示のとおり、この結晶製造（育成）容器２４１は、丸皿形状であり、その中央部にウェル２４２を有する。本実施例では、図示のとおり、ウェル２４２上の、図中左半分のみにゲル２４３を配置した。具体的には、まず、アガロースＳＰの６ｗｔ％水溶液を冷蔵庫にて固化し、その後９５℃に加熱したブロックインキュベータにて１５分間加熱してゲルに流動性を持たせた。これを、前記結晶製造（育成）容器のウェル２４２内に１００μＬ分注し、再度ゲルを固化させた。その後、ゲルカッターにてウェル２４２上の一部のゲルを切断除去し、図２４に示すような状態にした。つぎに、図２５に示すように、前記ゲルを切断除去した箇所のウェル２４２上（同図において、ウェル２４２上の右半分）に、４０ｍｇ／ｍＬパラセタモール（純度９８％、Ａｃｒｏｓ社製）水溶液２４４を５０μＬ分注した。なお、前記パラセタモール水溶液は、ブロックインキュベータにて７０℃で１時間加熱して完全に溶解させた後、６０℃に温度降下させてから分注した。分注後、室温にて直ちにパラセタモール水溶液２４４内のゲル―溶液界面近傍に、フェムト秒レーザー（波長８００ｎｍ、パルス幅１８２ｆｓ、サイバーレーザー社製）によりレーザー光照射した。レーザー光の照射エネルギーは１０μＪ／ｐｕｌｓｅとし、周波数は１ｋＨｚ、照射パルス数は１２５ｐｕｌｓｅとした。その後静置して結晶を析出させた。図２６にその結果を示す。図２６（ａ）（図２６上段）は、レーザー光照射および結晶析出の様子を経時的に追跡した写真（ＣＣＤカメラによる透過像）であり、図２６（ｂ）（図２６下段）は、図２６（ａ）における経時変化を模式的に示す図（スキーム）である。図示のとおり、有機低分子溶液２６１（図２５のパラセタモール水溶液２４４に相当する）とゲル２６２（図２４および２５のゲル２４３に相当する）との境界（界面）近傍において、レーザー光２６３を、有機低分子溶液２６１側の集光点２６４に照射した。レーザー照射後、さらに２０秒間静置し、１０秒毎にＣＣＤカメラで観察した。図示のとおり、レーザー照射後１０～２０秒程度で、レーザー照射した界面付近からパラセタモール（有機低分子化合物）の結晶２６５が析出している様子が確認できた。また、レーザー照射後１０秒時よりも、レーザー照射後２０秒時の方が、パラセタモール結晶２６５がさらに大きく成長していることが確認できた。
＜実施例８：溶液とゲルの二相系におけるタンパク質のゲル内注入過程の可視化＞
　本実施例では、キャビテーションによりタンパク質がゲル中に注入される過程を可視化するために、クマシーブリリアントブルー（以下ＣＢＢ）で染色したリゾチーム溶液（前記「第１の相」）とゲル（前記「第２の相」）との二相系において、高速カメラによる撮影を行った。
　まず、タンパク質水溶液として、クマシーブリリアントブルー　Ｒ－２５０（和光純薬工業株式会社）０．０４７５ｍｇ／ｍｌおよびニワトリ卵白リゾチーム（６回再結晶、Ｌｏｔ　Ｎｏ．Ｅ４０３１４，　生化学工業株式会社）２０．２ｍｇ／ｍｌを含む水溶液を５ｗｔ％　ＮａＣｌ，　０．１Ｍ　ＮａＡｃ（ｐＨ４．５）に調整した過飽和水溶液２００μＬを準備した。一方、６．０ｗｔ％に調整して４℃で保存しておいたＡｇａｒｏｓｅ　ＳＰ（Ａｇａｒｏｓｅ　Ｓｅａ　Ｐｌａｑｕｅ（商品名），　Ｌｏｔ　Ｎｏ．００００２１５８６６，　Ｌｏｎｚａ社）を９５℃のインキュベーターで１５分以上加熱した。その加熱後のＡｇａｒｏｓｅ　ＳＰを、１．０ｗｔ％　ａｇａｒｏｓｅ，　５ｗｔ％　ＮａＣｌ，　０．１Ｍ　ＮａＡｃ（ｐＨ４．５）に調整した。それを、最大容量４００μＬの円筒状容器（Ｎｕｎｃ製）の側面を平面に加工した自作容器に４５μＬずつ分注し、プレート遠心機（ＰｌａｔｅＳｐｉｎ（商品名），ＫＵＢＯＴＡ（久保田商事株式会社））により２５００ｒｐｍで３０分間遠心した後、４℃のインキュベーターで２４時間静置した。その後、前記自作容器中のゲルを、前記自作容器ごと２０℃のインキュベーターに移し、更に１時間以上静置した。そのゲル上に、前記タンパク質の過飽和水溶液を分注し、１５分静置した。静置後、ゲル－溶液界面近傍のゲル側（ゲル中）に、フェムト秒レーザー（波長８００ｎｍ，　パルス時間幅１８２ｆｓ，　エネルギー３０μＪ／ｐｕｌｓｅ）を対物レンズ（×１０，　ＯＬＹＭＰＵＳ（オリンパス株式会社））で１ｐｕｌｓｅ集光照射した（照射方向は界面と平行）。動画撮影は２μｓ／ｆｒａｍｅで行った。その結果、図２７に示すように、気泡が発生し崩壊していくキャビテーション挙動の中で、透明なゲルに向かって染色した溶液が流れ込んでいく様子が確認できた。これはゲル中にタンパク質が注入された（移動した）ことを明確に示している。また、レーザー光照射位置を、ゲル－溶液界面近傍の溶液側（溶液中）とする以外は同様にしたところ、図９下段（参考例４）と同様、壁（本実施例ではゲル－溶液界面）に気泡が衝突して崩壊した。このとき、溶液中のタンパク質が気泡とともに移動し、気泡がゲル－溶液界面に衝突して崩壊した後に、前記溶液中のタンパク質がゲル中に移動したのが確認された。
　以上説明したとおり、本発明によれば、簡便かつ効果的に目的物質の高濃度化ができる目的物質移行方法、結晶製造方法、組成物製造方法、目的物質移行装置を提供可能である。本発明は、例えば、タンパク質、核酸等の生体物質、有機低分子化合物、機能性有機高分子化合物等の結晶化、または、これらの物質を高濃度で含む組成物の製造等に利用できるが、これらに限定されず、広範な技術分野に適用可能である。
１　フェムト秒レーザー
２　グリーンレーザー
３　容器
４　レンズ
５　ビームスプリッター
６、７　ダイクロイックミラー
８　シャッター
９　赤外光遮断フィルター
１０　フォトディテクター
１１　ファンクションジェネレーター
１２　ＣＣＤカメラ
１３　ストロボ光源
１４　対物レンズ
１０１　第１の相
１０２　第２の相
１０３　目的物質
１０４　レーザー光
１０５　気泡の移動方向
１０６　目的物質の高濃度領域
２４１　結晶製造（育成）容器
２４２　ウェル
２４３　ゲル
２４４　パラセタモール水溶液
２６１　有機低分子溶液
２６２　ゲル
２６３　レーザー光
２６４　集光点
２６５　パラセタモール（有機低分子化合物）結晶

Claims (15)

  1. 　目的物質を含む液相または固相から形成された第１の相中の前記目的物質を、液相または固相である第２の相中に移行させる方法であって、
    　前記第１の相と前記第２の相とを近接させる相近接工程と、
    　前記第１の相と前記第２の相との境界の近傍に気泡を発生させて崩壊させる気泡崩壊工程とを含むことを特徴とする方法。
  2. 　前記目的物質が、有機物質である請求項１記載の方法。
  3. 　前記有機物質が、タンパク質、天然タンパク質、人工タンパク質、ペプチド、天然ペプチド、人工ペプチド、核酸、天然核酸、人工核酸、脂質、天然脂質、人工脂質、糖鎖、天然糖鎖、人工糖鎖、有機高分子化合物、有機低分子化合物、生体物質、生体高分子化合物および生体低分子化合物からなる群から選択される少なくとも一つである請求項２記載の方法。
  4. 　前記相近接工程が、前記第１の相と前記第２の相とを接触させて界面を形成させる界面形成工程である請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記気泡崩壊工程が、前記界面近傍に気泡を発生させて前記界面に衝突させる気泡衝突工程である請求項４記載の方法。
  6. 　前記気泡崩壊工程において、前記第１の相と前記第２の相との境界の近傍にレーザー光および超音波の少なくとも一方を照射することにより、前記気泡を発生させる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　前記レーザー光および超音波の照射エネルギーの総和が、６０ｎＪ以上である請求項６記載の方法。
  8. 　前記気泡崩壊工程において、前記第１の相と前記第２の相との境界の近傍にレーザー光を集光することにより、前記気泡を発生させ、前記レーザー光の集光点から前記第２の相における前記第１の相側表面までの距離が、前記気泡の最大半径の４倍以下である請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　前記第２の相が、固相、ゲル、液相、油相、水相、またはタンパク質膜である請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　結晶の製造方法であって、
    　結晶化の目的となる目的物質を移行する目的物質移行工程と、結晶析出工程とを含み、
    　前記目的物質移行工程が、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法により、前記目的物質を前記第１の相中から前記第２の相中に移行させる工程であり、
    　前記結晶析出工程が、前記目的物質移行工程後、前記第２の相の内部または界面で前記目的物質の結晶を析出させる工程であることを特徴とする製造方法。
  11. 　前記目的物質移行工程および前記結晶析出工程の少なくとも一方において、前記第１の相および前記第２の相の少なくとも一方を撹拌する、請求項１０記載の製造方法。
  12. 　組成物の製造方法であって、
    　目的物質移行工程を含み、
    　前記目的物質移行工程が、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法により、前記目的物質を前記第１の相中から前記第２の相中に移行させる工程であり、
    　前記組成物が、前記第２の相中に前記目的物質を含む組成物であることを特徴とする製造方法。
  13. 　目的物質を含む液相または固相から形成された第１の相中の前記目的物質を、液相または固相である第２の相中に移行させる装置であって、
    　前記第１の相と前記第２の相とを近接させる相近接手段と、
    　前記第１の相と前記第２の相との境界の近傍に気泡を発生させて崩壊させる気泡崩壊手段とを含むことを特徴とする装置。
  14. 　前記相近接手段が、前記第１の相と前記第２の相とを接触させて界面を形成させる界面形成手段である請求項１３記載の装置。
  15. 　前記気泡崩壊手段が、前記界面近傍に気泡を発生させて前記界面に衝突させる気泡衝突手段である請求項１４記載の装置。
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