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WO2012080630A1 - Nouvelles strategies therapeutiques pour ameliorer un traitement anticancereux - Google Patents

Nouvelles strategies therapeutiques pour ameliorer un traitement anticancereux Download PDF

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WO2012080630A1
WO2012080630A1 PCT/FR2011/052927 FR2011052927W WO2012080630A1 WO 2012080630 A1 WO2012080630 A1 WO 2012080630A1 FR 2011052927 W FR2011052927 W FR 2011052927W WO 2012080630 A1 WO2012080630 A1 WO 2012080630A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
patched protein
activity
doxorubicin
protein
patched
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/FR2011/052927
Other languages
English (en)
Inventor
Isabelle Mus-Veteau
Michel Bidet
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to EP11811073.3A priority patent/EP2651427A1/fr
Priority to US13/993,934 priority patent/US20140011277A1/en
Priority to CA2821223A priority patent/CA2821223A1/fr
Publication of WO2012080630A1 publication Critical patent/WO2012080630A1/fr
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Ceased legal-status Critical Current

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Definitions

  • Hh The Hedgehog signaling pathway (Hh) plays an important role in the growth and structuring during embryonic development.
  • the mammalian H h signaling pathway involves many effectors, at least
  • Hedgehog (Shh), Indian Hedgehog (Ihh) and Hedgehog Desert (Dhh),
  • Dispatched proteins responsible for the secretion and transport of Hh proteins, including Dispatched (Disp),
  • Hh Patched (Ptc) signal
  • Hip Hedgehog interacting protein
  • Patched protein is a membrane protein that crosses the membrane 12 times and interacts with the H h protein at both large extracellular loops.
  • the Applicant has been able to show by several approaches on different cellular models (see the examples) that the Patched protein is able to fix the intracellular anticancer agents, particularly doxorubicin, and that the Patched protein may be responsible for the efflux of intracellular anticancer agents, particularly doxorubicin.
  • efflux of intracellular anticancer agents and / or doxorubicin is meant here that under the influence of the Patched protein intracellular anticancer agents and / or doxorubicin can be transported outside the cell.
  • Patched membrane protein In the absence of the Hh protein, the Patched membrane protein is present at the plasma membrane of the cells, the intracellular concentration of anticancer agents, particularly in doxorubicin, decreases with the increase of the efflux of anti-cancer agents, particularly doxorubicin, induced by Patched.
  • Patched protein is a transmembrane transporter and is involved in the efflux of anticancer agents, particularly doxorubicin.
  • the subject of the invention is firstly an in vitro method for regulating the intracellular concentration of intracellular anticancer agents, characterized in that cells and a modulator of the activity of the protein are brought into contact. Patched to regulate the intracellular concentration of anticancer agents.
  • anticancer agents includes both one and more intracellular anticancer agents.
  • modulator here means both an activator and an inhibitor.
  • the method is an in vitro method for increasing the intracellular concentration of anticancer agent, characterized in that cells and an inhibitor of the transport activity of anticancer agents are brought into contact. by the Patched protein.
  • the method is an in vitro method for decreasing the intracellular concentration of anticancer agents, characterized in that cells and a stimulator of the transport activity of the anticancer agents are brought into contact. by the Patched protein.
  • the invention also relates to the use of a modulator of the activity of the protein Patched for the preparation of a drug d estiné to regulate the intracellular concentration of anticancer agents.
  • the subject of the invention is the use of an activator of the activity of the Patched protein for the preparation of a medicament intended to reduce the intracellular concentration of anticancer agents.
  • the subject of the invention is the use of an inhibitor of the activity of the Patched protein for the preparation of a medicament intended to increase the intracellular concentration of anticancer agents.
  • inhibitor of the Patched protein is meant according to the invention:
  • Patched protein carries cholesterol from the inside to the outside of the cell. It is likely that the presence of a sufficient concentration of cholesterol or one of its analogues competes with the anti-cancer agent on the Patched protein and inhibits the release of the anti-cancer agent. untransported analogs of anti-cancer agents.
  • anticancer agents is meant according to the invention antitumor antibiotics, alkylating agents, antimetabolites, plant alkaloids, topoisomerase inhibitors or poisons mitotic spindle.
  • alkylating agents include for example Busulfan, Carboplatin, Chlorambucil, Cisplatin, Cyclophosphamide, Ifosfamide, Melphalan, Mechlorethamine, Oxaliplatin, Uramustine or Temozolomide;
  • antimetabolites are Azathioprine, Capecitabine, Cytarabine, Floxuridine, Fludarabine, Fluorouracil, Gemcitabine, Methotrexate or Pemetrexed;
  • plant alkaloids examples include Vinblastine or Vincristine (Vinorelbine);
  • topoisomerase inhibitors include for example Irinotecan, Topotecan or Etoposide;
  • Poisons of the mitotic spindle for example, Docetaxel, Paclitaxel, Vinblastine, Vincristine or Vinorelbine.
  • the intracellular anti-cancer agent (or agents) particularly targeted can (may) belong to the antitumor antibiotic family and even more advantageously the intracellular anticancer agent particularly targeted is doxorubicin.
  • the modulator (activator or inhibitor) of the activity of the Patched protein is presently present in combination with physiologically effective doses.
  • said medicament may be formulated for the digestive or parenteral route.
  • the medicaments according to the invention may furthermore comprise, in association with a modulator of the activity of the Patched protein, at least one other therapeutically active ingredient, whether it is active on the same pathology or on a pathology of the same, for Simultaneous use, separate or spread over time, especially during treatment in a subject with one of the pathologies mentioned above.
  • a modulator of the activity of the Patched protein at least one other therapeutically active ingredient, whether it is active on the same pathology or on a pathology of the same, for Simultaneous use, separate or spread over time, especially during treatment in a subject with one of the pathologies mentioned above.
  • another active ingredient there may be mentioned a statin, a Smoothened receptor antagonist or another modulator of the efflux activity of an anticancer agent, different from a modulator of the activity of the Patched protein.
  • the subject of the invention is also the combined use of a modulator of the activity of the Patched protein, with a statin, and / or a Smoothened receptor antagonist and / or another modulator of the activity of efflux of an anticancer agent, different from a modulator of the activity of the Patched protein.
  • the modulator of the activity of the Patched protein may be an inhibitor of the activity of the Patched protein.
  • the modulator (activator or inhibitor) of the activity of the Patched protein can be used in the medicament, in admixture with one or more excipients or inert carriers, that is to say pharmaceutically inactive and non-toxic vehicles.
  • compositions may contain one or more agents or vehicles selected from dispersants, solubilizers, stabilizers, preservatives, etc.
  • Agents or carriers which can be used in formulations include methylcellulose, hydroxymethylcellulose, carboxymethylcellulose, cyclodextrins, polysorbate 80, mannitol, gelatin, lactose, plant or animal herbs, acacia, etc.
  • vegetable oils are used.
  • the compositions may be formulated as injectable suspensions, gels, oils, tablets, suppositories, powders, capsules, capsules, etc., optionally by means of dosage forms or devices for prolonged and / or delayed release.
  • an agent such as cellulose, carbonates or starches is advantageously used.
  • the administration may be carried out by any method known to those skilled in the art, preferably orally or by injection, typically intraperitoneal, intracerebral, intrathecal, intravenous, intra-arterial or intramuscular. Oral administration is preferred.
  • the invention is usable in mammals, especially in humans.
  • the daily dose of the compound will be the minimum dose to achieve the desired therapeutic effect. If necessary, the daily dose may be administered in two, three, four, five, six or more doses taken daily or in multiple sub-doses administered at appropriate intervals during the day.
  • the amount selected will depend on multiple factors, in particular the route of administration, the duration of administration, the timing of administration, the rate of removal of the modulator (activator or inhibitor) from the activity of the protein Patched, the one or more products used in combination with the modulator (activator or inhibitor) of the activity of the Patched protein, the age, weight and physical condition of the patient, as well as his medical history, and any other information known in medicine.
  • the invention also relates to the use of a modulator of the activity of the Patched protein in an anti-cancer treatment, advantageously for improving the effectiveness of an anticancer treatment.
  • FIG. 1 represents the effect of doxorubicin on the resistance of yeasts expressing the human ( ⁇ ) or non (K699) Patched protein ( ⁇ )
  • Figure 2 shows the results of the study of doxorubicin efflux in yeasts expressing (Ptc) or not expressing (K699) the Patched protein. Fluorescence values are given in arbitrary units.
  • Figure 3 shows the results of experiments conducted to determine whether the endogenous Patched protein of mouse fibroblasts N1H3T3 promotes or not the efflux of doxorubicin. Fluorescence values are given in arbitrary units. ( ⁇ ) Witness without Shh ( ⁇ ) with Shh
  • Figure 4 shows the results of experiments conducted on xenopus oocytes and show the influence of the Patched protein on doxorubicin efflux.
  • RNA the human Patched protein Western Blot on oocyte membrane preparations injected with different amounts of ribonucleic acid encoding the human Patched protein (RNA the human Patched protein).
  • Figure 5 shows the results of the study of the binding of doxorubicin to the Patched protein present in yeasts expressing or not expressing the Patched protein.
  • mouse fibroblast cell line NIH 3T3 was maintained in a DMEM culture medium (Invitrogen, USA) supplemented with 10% fetal calf serum, 100 U / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin at 37 ° C. in a 5% C0 2 atmosphere saturated with water.
  • the cells were cultured in 90-100% confluent monolayer and subjected to no more than 20 cell passages with subculturing every 4/5 days.
  • S. cerevisiae strain K699 (Mata, ura3, and leu 2-3) was transformed with the plasmid YEpPMAhPtc-MAP (Joubert et al., 2009, BBA Biomembrane, 1788: 1813-1821, 2010, Methods in Molecular Biology , Humana Press, Musl et al (Ed.), 601: 87-103) by the lithium acetate procedure and plated in culture dishes containing minimal medium and a mixture of amino acids without leucine.
  • the clones were pre-cultured at 30 ° C to an optical density at 600 nm (OD 6 oo) of 3 on a minimum medium (MM) (0.67% yeast nitrogen base without amino acids, 0, 3 mM adenine, 0.5 mM uracil, 0.3 mM tyrosine and a mixture of amino acids lacking leucine) supplemented with 2% D-glucose.
  • MM minimum medium
  • This preculture is then diluted to a D0 6 oo of 0.1 -0.2 in rich medium (yeast extract, bactopeptone, adenine) in 2% D-glucose and cultured at 18 ° C with shaking at 200 rev / min to a D0 6 oo of 5-7.
  • rich medium yeast extract, bactopeptone, adenine
  • the yeasts were washed with cold water, resuspended in 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 2.5 mM EDTA, 1 mM PMSF and 4 mM benzamidine, and broken twice by vortexing for 15 minutes in the presence of glass beads (425 to 600 ⁇ , Sigma).
  • Unbroken yeasts and glass beads were removed by centrifugation for 5 min at 2000 g.
  • the membranes were collected by centrifugation of the supernatant obtained for 1 h at 100,000 g.
  • the pellet was washed twice in the same buffer without EDTA and resuspended at 5 mg / ml in a buffer containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1 mM PMSF and 4 mM benzamidine.
  • Proteins contained in the assays were separated by SDS / 8% polyacrylamide gel electrophoresis (8% SDS-PAGE) and transferred to nitrocellulose membrane (Amersham) using standard techniques.
  • the nitrocellulose membranes were first blocked for 1 hour at room temperature in a blocking buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 450 mM NaCl, 0.1% Tween-20, 4% skim milk), then contacted overnight at 4 ° C with polyclonal anti-PTC rabbit antibodies (1: 1000 dilution) (Joubert et al., 2009).
  • the membrane membranes were then washed twice in the blocking buffer.
  • Yeasts that do not express the human Patched protein (controls) K699 and yeasts expressing the human Patched protein were cultured at 18 ° C. in a normal rich medium and in a rich medium supplemented with 10 ⁇ g of doxorubicin per ml of medium.
  • the OD at 600 nm of the yeasts is measured over time.
  • NIH3T3 cells were seeded in the wells of 24-well plates in DMEM culture medium (Invitrogen, USA) supplemented with 10% fetal calf serum, 100 U / ml of penicillin and 100 ⁇ g / ml of streptomycin at 37 ° C in 5% C0 2 saturated with water. At 80% confluency, the medium is removed and replaced with medium containing 10 ⁇ l of doxorubicin. The cells are then incubated for 2 h at 37 ° C. with shaking at 50 rpm.
  • the cells are then rinsed with NaCl buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2 , 1 mM MgSO 4 , 5 mM glucose, 20 mM HEPES, pH 7.4) and then incubated with 250 ⁇ l of NaCl buffer. (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2 , 1 mM MgSO 4 , 5 mM glucose, 20 mM HEPES, pH 7.4) in the absence or in the presence of 30 nM Shh during, 30, 60 and 90 minutes.
  • NaCl buffer 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2 , 1 mM MgSO 4 , 5 mM glucose, 20 mM HEPES, pH 7.4
  • yeasts K699 control yeasts and yeasts expressing the human Patched protein were cultured at 18 ° C. to a D0 6 of 7 on a rich medium supplemented with 2% of D-glucose. The cells are then centrifuged (5 min, 3000g), washed 4 times with water and finally resuspended thoroughly with a D0 6 oo of 10 in 50 mM Hepes-NaOH buffer (pH 7.0) and incubated 2 hours with 10 ⁇ of doxorubicin.
  • yeasts After rinsing, the yeasts are resuspended in 50 mM NaOH-Hepes buffer (pH 7.0).
  • the yeasts are centrifuged and the doxorubicin contained in the supernatant is measured by fluorescence. 0 +/- 10 nm).
  • Oocytes are surgically removed from a female Xenopus laevis anesthetized with 0.2% MS222 (tricaine methanesulfonate) in accordance with procedures recommended by the Ethics Committee.
  • the oocytes are washed with MBS pH 7.4 saline solution (85 mM NaCl, 1 mM KCl, 2.4 mM NaHCO 3 , 0.82 mM MgSO 4 , 0.33 mM Ca (NO 3 ) 2 , CaCl 2 0.41 mM, 10 mM HEPES, 4.5 mM NaOH) supplemented with 50 U / ml penicillin and 50 ⁇ g / ml streptomycin.
  • MBS pH 7.4 saline solution 85 mM NaCl, 1 mM KCl, 2.4 mM NaHCO 3 , 0.82 mM MgSO 4 , 0.33 mM Ca (NO 3 ) 2 , CaCl 2 0.41 mM
  • the oocytes are then defolliculated by incubation for 16 h at 19 ° C. with 1.8 mg / ml of collagenase and then for 30 min with MBS without calcium, and placed in 50 nL MBS containing 10 or 20 ng of RNA coding for the human Patched protein. are injected by oocyte.
  • doxorubicin 50 nM of doxorubicin is added to 30 ⁇ g of membranes and the fluorescence of doxorubicin is measured as a function of time.
  • Example 1 Yeasts expressing the human Patched protein are more resistant to doxorubicin than yeasts that do not express it ( Figure 1).
  • Example 2 The human Patched protein expressed in yeast promotes the efflux of doxorubicin (FIG. 2)
  • NI H3T3 mouse fibroblasts were grown in 24-well confluent plates and then incubated in the presence of doxorubicin.
  • Shh inhibits the efflux of doxorubicin by 20 to 30%.
  • Shh interacts with the Patched protein on the cell surface and causes its internalization.
  • Fig. 4A shows a Western blot made on oocyte membrane preparations injected with 10 (lane 1) or 20 (lane 2) ng of RNA encoding the human Patched protein per oocyte. Lane 3 corresponds to the control consisting of uninjected oocytes.
  • Patched protein is expressed in the plasma membrane of oocytes and that this expression is proportional to the amount of RNA injected.
  • Figure 4B shows the efflux measurements of doxorubicin on oocytes. The experiments being carried out on 4 batches of 10 control oocytes (not injected) and injected with RNAs encoding the human Patched protein, the average of the values obtained for the 4 batches is presented.

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Abstract

L'invention a pour objet de nouveaux médicaments destinés à moduler la concentration intracellulaire en agents anticancéreux au travers de la modulation de l'activité de la protéine Patched. L'invention trouve des applications particulièrement dans l'amélioration du traitement des cancers.

Description

« Nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer un traitement anticancéreux »
La voie de signalisation Hedgehog (Hh) joue un rôle important dans la croissance et la structuration au cours du développement embryonnaire.
La voie de signalisation H h chez les mammifères met en jeu de nombreux effecteurs dont au moins
- les protéines de la famille Hh codées par trois gènes distincts Shh (Sonic
Hedgehog (Shh), Indian Hedgehog (Ihh) et Désert Hedgehog (Dhh),
- les protéines responsables de la sécrétion et du transport des protéines Hh, dont Dispatched (Disp),
- Shifted, qui agit à longue distance et est requise pour l'accumulation des protéines Hh,
- les protéines réceptrices du signal Hh : Patched (Ptc), Hedgehog interacting protein (Hip) ;
- Smoothened (Smo) responsable de la transmission du signal Hh à l'intérieur de la cellule réceptrice.
I I est généralement admis dans l'art antérieur que Smo est constitutivement inhibée par Ptc en l'absence de protéines Hh et que la liaison du ligand Hh sur son récepteur Ptc engendre l'activation de Smo qui à son tour va activer les facteurs de transcription à doigts de zinc les facteurs Gli.
Il est bien décrit que les troubles de la voie de signalisation Hh induisent chez l'homme des malformations congénitales et des troubles tels que le syndrome de Gorlin et l'holoprosencéphalie.
De même il est connu que les individus porteurs d'un allèle défectueux du gène PTCH1 , cond uisant à une réduction d 'activité de la protéine correspondante, présentent un ensemble de défauts morphologiques, notamment au niveau des doigts, du faciès, des dents, des côtes, englobés sous le nom de syndrome de Gorlin.
La protéine Patched est une protéine membranaire qui traverse 12 fois la membrane et interagit avec la protéine H h au niveau des deux larges boucles extracellulaires.
Les homologies de sa séquence avec celles des transporteurs bactériens de la famille RN D (résistance, nodulation, division) suggèrent que cette protéine pourrait avoir une fonction de transporteur. Cependant à la connaissance de la demanderesse, le rôle de transporteur de la protéine Patched n'a jamais été démontré, particulièrement celui de transporteur d'agents anticancéreux.
De manière surprenante et après de long travaux, et en utilisant comme prototype d'agents anticancéreux intracellulaires, la doxorubicine, la Demanderesse a pu montrer par plusieu rs approches sur différents modèles cellulaires (voir les exemples) que la protéine Patched est capable de fixer les agents anticancéreux intracellulaires, particulièrement la doxorubicine, et que la protéine Patched pourrait être responsable de l'efflux d'agents anticancéreux intracellulaires, particulièrement de la doxorubicine.
Par efflux d'agents anticancéreux intracellulaires et/ou de doxorubicine, on entend ici que sous l'influence de la protéine Patched les agents anticancéreux intracellulaires et/ou la doxorubicine peuvent être transportés à l'extérieur de la cellule.
En l'absence de la protéine Hh, la protéine membranaire Patched est présente au niveau de la membrane plasmique des cellules, la concentration intracellulaire en agents anticancéreux, particulièrement en doxorubicine, diminue avec l'augmentation de l'efflux des agents anticancéreux, particulièrement de la doxorubicine, induit par Patched.
A l'inverse, quand la protéine Hh est sécrétée dans le milieu extracellulaire, elle interagit avec Patched, le complexe Patched/Hh est alors internalisé et dégradé. La disparition de la protéine Patched au niveau de la membrane plasmique a pour conséquence l'arrêt de l'efflux des agents anticancéreux, particulièrement de la doxorubicine et donc l'augmentation de la concentration intracellulaire en agents anticancéreux, particulièrement en doxorubicine.
Ainsi les différents résultats obtenus par la demanderesse conduisent à proposer que la protéine Patched serait un transporteur transmembranaire et serait impliquée dans l'efflux des agents anticancéreux, particulièrement de la doxorubicine.
Ainsi une régulation de l'activité de la protéine Patched permettrait de réguler la concentration intracellulaire en agents anticancéreux, particulièrement en doxorubicine.
La découverte de cette nouvelle activité de la protéine Patched permet d'envisager de nouvelles voies d'amélioration de l'efficacité des traitements anticancéreux par la régulation de la concentration intracellulaire en agents anticancéreux, particulièrement de la doxorubicine.
Ainsi l'invention a pour objet premier une méthode in vitro de régulation de la concentration intracellulaire en agents anticancéreux intracellulaires caractérisée en ce que l'on met en contact des cellules et un modulateur de l'activité de la protéine Patched pour réguler la concentration intracellulaire en agents anticancéreux.
L'Homme du Métier sait pertinemment que lors des traitements à l'aide d'agents anticancéreux, particulièrement ceux à visée intracellulaire, les différents protocoles conduisent à utiliser soit un seul agent anticancéreux soit des combinaisons de plusieurs agents anticancéreux. Aussi dans le présent texte l'emploi de l'expression "agents anticancéreux " sous entend aussi bien un que plusieurs agents anticancéreux intracellulaires.
Par modulateur on entend ici aussi bien un activateur qu'un inhibiteur.
Ainsi selon une variante de l'invention la méthode est une méthode in vitro d'augmentation de la concentration intracellulaire en agent anticancéreux, caractérisée en ce que l'on met en contact des cellules et un inhibiteur de l'activité de transport des agents anticancéreux par la protéine Patched.
Et selon une autre variante de l'invention la méthode est une méthode in vitro de diminution de la concentration intracellulaire en agents anticancéreux, caractérisée en ce que l'on met en contact des cellules et un stimulateur de l'activité de transport des agents anticancéreux par la protéine Patched.
Des applications thérapeutiques sont également envisageables.
Ainsi l'invention a aussi pour objet l'utilisation d'un modulateur de l'activité de la protéine Patched pou r la préparation d'u n méd icament d estiné à régu ler la concentration intracellulaire en agents anticancéreux.
Selon une variante, l'invention a pour objet l'utilisation d'un activateur de l'activité de la protéine Patched pour la préparation d'un médicament destiné à diminuer la concentration intracellulaire en agents anticancéreux.
Et selon une autre variante, l'invention a pour objet l'utilisation d'un inhibiteur de l'activité de la protéine Patched pour la préparation d'un médicament destiné à augmenter la concentration intracellulaire en agents anticancéreux.
Par inhibiteur de la protéine Patched on entend selon l'invention :
des anticorps dirigés contre la protéine Patched comme le montre l'étude de Nakamura Masafumi et al, anticancer research 27, 3743-3748 (2007)
- le cholestérol, les oxystérols, ou autres analogues du cholestérol. En effet, les inventeurs ont montré (demande internationale N° PCT/FR201 1/000558, déposée le 18/10/201 1 et Bidet et al, Plos One, September 201 1 , vol. 6, Issue 9, 201 1 ) que la protéine Patched transporte du cholestérol de l'intérieur vers l'extérieur de la cellule. Il est probable que la présence d'une concentration suffisante de cholestérol ou d'un de ses analogues fasse compétition avec l'agent anti-cancéreux sur la protéine Patched et inhibe la sortie de l'agent anti-cancéreux. des analogues non transportés d'agents anti-cancéreux.
Par Agents anticancéreux on entend selon l'invention les Antibiotiques antitumoraux, les Agents alkylants, les Antimétabolites, les Alcaloïdes végétaux, Inhibiteurs de la topoisomérase ou encore les Poisons du fuseau mitotique.
A titre d'Antibiotiques antitumoraux on citera par exemple la Bléomycine, la
Daunorubicine, I a Doxorubicine, l'Épirubicine, l'Hydroxyurée, l 'Idarubicine, la Mitomycine C ou encore la Mitoxantrone ;
A titre d'Agents alkylants on citera par exemple le Busulfan, le Carboplatine, le Chlorambucil, le Cisplatine, la Cyclophosphamide, l'Ifosfamide, le Melphalan, la Méchloréthamine, l'Oxaliplatine, l'Uramustine ou encore la Témozolomide ;
A titre d'Antimétabolites on citera par exemple l'Azathioprine, le Capécitabine, la Cytarabine, l a Floxuridine, la Fludarabine, le Fluorouracil, la Gemcitabine, le Méthotrexate ou encore le Pémétrexed ;
A titre d'Alcaloïdes végétaux on citera par exemple la Vinblastine, ou encore la Vincristine (Vinorelbine) ;
A titre d'Inhibiteurs de la topoisomérase on citera par exemple l'Irinotécan, le Topotécan ou encore l'Étoposide ;
Et enfin à titre de Poisons du fuseau mitotique on citera par exemple le Docétaxel, le Paclitaxel, la Vinblastine, la Vincristine ou encore la Vinorelbine.
Avantageusement, selon l'invention l'agent (ou les agents) anticancéreux intracellulaire(s) particulièrement visé(s) peut (peuvent) appartenir à la famille des Antibiotiques antitumoraux et encore plus avantageusement l'agent anticancéreux intracellulaire particulièrement visé est la doxorubicine.
Selon l'invention le modulateur (activateur ou inhibiteur) de l'activité de la protéine Patched est ava ntageu sem ent présent d a n s l e m éd i ca ment à d es d oses physiologiquement efficaces.
Selon l'invention ledit médicament peut être formulé pour la voie digestive ou parentérale.
Les médicaments selon l'invention peuvent comprendre en outre, en association avec un modulateur de l'activité de la protéine Patched, au moins un autre ingrédient thérapeutiquement actif, qu'il soit actif sur la même pathologie ou sur une pathologie d ifférente, pour u ne uti lisation simu ltanée, séparée ou étalée dans le temps, notamment lors d'un traitement chez un sujet atteint de l'une des pathologies précédemment citées. Comme exemple d'autre ingrédient actif on peut citer une statine, un antagoniste du récepteur Smoothened ou encore un autre modulateur de l'activité d'efflux d'un agent anticancéreux, différent d'un modulateur de l'activité de la protéine Patched. Ainsi l'invention a aussi pour objet l'utilisation combinée d'un modulateur de l'activité de la protéine Patched, avec une statine, et/ou un antagoniste du récepteur Smoothened et/ou encore un autre modulateur de l'activité d'efflux d'un agent anticancéreux, différent d'un modulateur de l'activité de la protéine Patched. Préférentiellement le modulateur de l'activité de la protéine Patched peut être un inhibiteur de l'activité de la protéine Patched.
Selon l'invention, le modulateur (activateur ou inhibiteur) de l'activité de la protéine Patched peut être utilisé dans le médicament, en mélange avec un ou plusieurs excipients ou véhicules inertes, c'est à dire pharmaceutiquement inactifs et non toxiques.
On peut citer par exemple des solutions salines, physiologiques, isotoniques, tamponnées, etc., compatibles avec un usage pharmaceutique et connues de l'homme du métier. Les compositions peuvent contenir un ou plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, conservateurs, etc.
Des agents ou véh icu les utilisables dans des formulations (liquides et/ou injectables et/ou solides) sont notamment la méthylcellulose, l'hydroxyméthylcellulose, la carboxyméthylcellulose, les cyclodextrines, le polysorbate 80, le mannitol , la gélatine, le lactose, des h uiles végétales ou animales, l'acacia, etc. De façon préférentielle, on utilise des huiles végétales. Les compositions peuvent être formulées sous forme de suspension injectable, de gels, huiles, comprimés, suppositoires, poudres, gélules, capsules, etc., éventuellement au moyen dé formes galéniques ou de d ispositifs assu rant u ne libération prolongée et/ou retardée. Pou r ce type de formulation, on utilise avantageusement un agent tel que la cellulose, des carbonates ou des amidons.
L'administration peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, de préférence par voie orale ou par injection , typiquement par voie intra- péritonéale, intra-cérébrale, intra-thécale, intra-veineuse, intra-a rtérielle ou intramusculaire. L'administration par voie orale est préférée.
L'invention est utilisable chez les mammifères, notamment chez l'être humain. En général la dose journalière du composé sera la dose minimale pour obtenir l'effet thérapeutique souhaité. Si nécessaire, la dose journalière peut être administrée en deux, trois, quatre, cinq, six ou plus, prises par jour ou par sous-doses multiples administrées par intervalles appropriés pendant la journée.
La quantité choisie dépendra de multiples facteurs, en particulier de la voie d'administration, de la durée d'administration, du moment de l'administration, de la vitesse d'élimination du modulateur (activateur ou inhibiteur) de l'activité de la protéine Patched, du ou des différents produits utilisés en combinaison avec le modulateur (activateur ou inhibiteur) de l'activité de la protéine Patched, de l'âge, du poids et de la condition physique du patient, ainsi que de son histoire médicale, et de toutes autres informations connues en médecine.
L'invention a encore pour objet l'utilisation d'un modulateur de l'activité de la protéine Patched dans u n traitement anticancéreux, avantageusement pour l'amélioration de l'efficacité d'un traitement anticancéreux.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples de réalisation de l'invention qui suivent ainsi qu'à l'observation des figures parmi lesquelles
La figure 1 représente l'effet de la doxorubicine sur la résistance des levures exprimant la protéine Patched humaine (□) ou non (K699) (♦)
1A : dans des cultures en l'absence de doxorubicine ;
1 B : dans des cultures en présence de 10 μg mL de doxorubicine.
La figure 2 représente les résultats de l'étude de l'efflux de doxorubicine dans des levures exprimant (Ptc) ou n'exprimant pas (K699) la protéine Patched. Les valeurs de fluorescence sont données en unités arbitraires.
La figure 3 représente les résultats des expériences conduites afin de déterminer si la protéine Patched endogène des fibroblastes de souris N IH3T3 favorise ou non l'efflux de doxorubicine. Les val eu rs d e fluorescence sont données en unités arbitraires. (□) Témoin sans Shh (♦) avec Shh
La figure 4 représente les résultats des expériences conduites sur des ovocytes de xénope et montrent l'influence de la protéine Patched sur l'efflux de doxorubicine.
4A : Western Blot sur des préparations de membranes d'ovocytes injectés avec différentes quantités d'Acide Ribonucléique codant la protéine Patched humaine (ARN la protéine Patched humaine).
4B : Mesure de l'efflux de doxorubicine dans les ovocytes de xénope injectés avec différentes quantités d'ARN de la protéine Patched humaine. Les valeurs de fluorescence sont données en unités arbitraires.
La figure 5 représente les résultats de l'étude de la fixation de la doxorubicine à la protéine Patched présente dans des levures exprimant ou n'exprimant pas la protéine Patched.
Exemples
Matériels et méthodes
Culture cellulaire et préparation de membranes La lignée cellulaire de fibroblastes de souris NIH 3T3 a été maintenue dans un milieu de culture DMEM (Invitrogen, USA) complété avec 10% de sérum de veau fœtal, 100 U / ml de pénicilline et 100 μg / mL de streptomycine à 37°C en atmosphère à 5% C02 saturée en eau.
Les cellules ont été cultivées en monocouche à confluence 90-100% et soumises à pas plus de 20 passages cellulaires avec repiquage tous les 4/5 jours.
Culture de levures et préparation des membranes
La souche K699 de S. cerevisiae (Mata, ura3, et leu 2-3) a été transformée avec le plasmide YEpPMAhPtc-MAP (Joubert et col.. 2009, BBA Biomembrane, 1788: 1813- 1821 ; 2010, Methods in Molecular Biology, Humana Press, Mus /eteau (Ed.), 601 : 87- 103) par la procédure de l'acétate de lithium et étalées dans des boites de culture contenant un milieu minimal et un mélange d'acides aminés sans leucine.
Les clones ont été pré-cultivés à 30°C jusqu'à une densité optique à 600 nm (D06oo) de 3 sur un milieu minimum (MM) (0,67% de base azotée de levure sans acides aminés, 0,3 mM adénine, 0,5 mM uracile, 0,3 mM tyrosine et d'un mélange d'acides aminés dépourvu de leucine) additionné de 2% de D-glucose.
Cette préculture est ensuite diluée à une D06oo de 0,1 -0,2 dans un milieu riche (extrait de levure, bactopeptone, adénine) à 2% de D-glucose et cultivée à 18°C sous agitation à 200 tr / min jusqu'à une D06oo de 5-7.
Pour la préparation des membranes, toutes les mesures ont été effectuées à
4°C.
Les levures ont été lavées à l'eau froide, remises en suspension dans 50 mM Tris-HCI (pH 7,4), 150 mM NaCI, 2,5 mM EDTA, 1 mM PMSF et 4 mM benzamidine, et brisées deux fois par agitation au vortex pendant 15 min en présence de perles de verre (425 à 600 μηι, Sigma).
Les levures non cassées et les perles de verre ont été éliminées par centrifugation pendant 5 min à 2000 g.
Les membranes ont été collectées par centrifugation du surnageant obtenu pendant 1 h à 100 000 g.
Le culot a été lavé deux fois dans le même tampon sans EDTA et remis en suspension à 5 mg / ml dans un tampon contenant 50 mM Tris-HCI (pH 7,4), 150 mM NaCI, 10% de glycérol, 1 mM PMSF et 4 mM benzamidine.
Electrophorèse sur gel et western blot
Les protéi n es conten u es da n s l es écha nti l lon s ont été séparées pa r électrophorèse sur gel SDS/polyacrylamide 8% (8% SDS-PAGE) et transférées sur membrane de nitrocellulose (Amersham) en utilisant des techniques standards. Les membranes de nitrocellulose ont d'abord été bloquées 1 heure à température ambiante dans un tampon de blocage (20 mM Tris-HCI (pH 7.5), 450 mM NaCI, 0, 1 % Tween-20, 4% de lait écrémé), puis mises en contact pendant la nuit à 4°C avec des anticorps polyclonaux de lapin anti-PTC (dilution 1 : 1000) (Joubert et col. 2009).
Les mem branes de n itrocel lu lose ont ensu ite été lavées deux fois dans le tampon de blocage.
Des anticorps secondaires polyclonaux de chèvre anti-lapin (dilution 1 :3000) couplés à la peroxydase de raifort (Dako) ont ensuite été appliqués pendant 2 h à 4°C. La révélation des réactions a été réalisée en utilisant le kit ECL (Millipore), et un système de détection de ch imiol u minescence pou r le Western blot Fusion FX7® (Vilber-Lourmat).
Résistance des levures à la doxorubicine
Des levures n'exprimant pas la protéine Patched humaine (contrôles) K699 et des levures exprimant la protéine Patched humaine ont été cultivées à 18°C en milieu riche normal et en milieu riche additionné de 10μg de doxorubicine par mL de milieu.
La DO à 600 nm des levures est mesurée au cours du temps.
Mesure de l'efflux de doxorubicine
- sur cellules NIH3T3 : pour les expériences d'efflux de doxorubicine, des cellules N I H 3T3 ont été ensemencées dans les puits de plaques 24 puits en milieu de culture DMEM (Invitrogen, USA) complété avec 10% de sérum de veau fœtal, 100 U / ml de pénicilline et 1 00 μg / mL de streptomycine à 37°C en atmosphère à 5% C02 saturée en eau. A 80% de confluence, le milieu est éliminé et remplacé par du milieu contenant 10μ Μ de doxorubicine. Les cellules sont alors incu bées pendant 2h à 37°C sous agitation à 50 tr / min. Les cellules sont alors rincées avec du tampon NaCI (140 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM CaCI2, 1 mM MgS04, 5 mM glucose, 20 mM H EPES, pH 7,4) puis incubées avec 250 μί de tampon NaCI (140 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM CaCI2, 1 mM MgS04, 5 mM glucose, 20 mM HEPES, pH 7,4) en l'absence ou en présence de 30 nM de Shh pendant, 30, 60 et 90 minutes.
Après une centrifugation (5mn à 6800g) pour éliminer tout fragment de cellule, la lecture de la fluorescence de la doxorubicine
Figure imgf000009_0001
0 +/- 10 nm) été réalisée sur 200 μί de surnageant dans un lecteur de plaque (FLUOstar, Labtech).
- sur levures : des levures contrôles K699 et des levures exprimant la protéine Patched humaine ont été cultivées à 18°C jusqu'à une D06oo de 7 sur un milieu riche additionné de 2 % de D-glucose. Les cellules sont alors centrifugées, (5mn, 3000g), lavées 4 fois à l'eau et finalement remises en suspension avec soin à une D06oo de 10 dans du tampon 50 mM NaOH-Hepes (pH 7,0) et incubées 2 heures avec 10 μΜ de doxorubicine.
Après rinçage, les levures sont ressuspendues dans du tampon 50 mM NaOH- Hepes (pH 7,0).
Au bout de 20 min, les levures sont centrifugées et la doxorubicine contenue dans le surnageant est mesurée par fluorescence
Figure imgf000010_0001
0 +/- 10 nm).
- sur ovocytes de xénopes : Obtention et préparation des ovocytes
Les ovocytes sont prélevés par chirurgie sur une femelle Xenopus laevis anesthésiée avec 0,2% de MS222 (tricaine methanesulfonate) en accord avec les procédures recommandées par le comité d'éthique. Les ovocytes sont lavés avec une solution saline MBS pH 7.4 (NaCI 85 mM, KCI 1 mM, NaHC03 2,4 mM, MgS04 0,82 mM, Ca(N03)2 0,33 mM, CaCI2 0,41 m M , HEPES 10 mM, NaOH 4,5 mM) supplémentée de 50 U/ml de pénicilline et 50 μg/ml de streptomycine. Les ovocytes sont ensuite défolliculés par incubation 16 h à 19°C avec 1 ,8 mg/ml de collagénase puis 30 min avec du MBS sans calcium, et placés en MBS 50 nL contenant 10 ou 20 ng d'ARN codant la protéine Patched humaine sont injectés par ovocyte. Les ovocytes sont incubés 3 jours à 19°C dans du MBS. 4 lots de 10 ovocytes témoins (non injectés) et injectés avec des ARN codant la protéine Patched humaine ont été incubés 16h à 19°C avec 100μΜ de doxorubicine. Après rinçage, les ovocytes sont placés dans du MBS. Le surnageant est prélevé au bout de 90 min et la fluorescence de la doxorubicine présente dans l'échantillon est mesurée par fluorescence
Figure imgf000010_0002
+/- 10 nm, em=610 +/- 10 nm).
Fixation de la doxorubicine à la protéine Patched
La fixation de la doxorubicine à la protéine Patched est montrée par quenching de fluorescence de la doxorubicine sur des préparations membranaires de levures contrôles K699 et de levures exprimant la protéine Patched humaine.
50 nM de doxorubicine sont ajoutés à 30 μg de membranes et la fluorescence de la doxorubicine est mesurée en fonction du temps.
Exemple 1 : Les levures exprimant la protéine Patched humaine résistent mieux à la doxorubicine que les levures ne l'exprimant pas (Figure 1 ).
En milieu riche normal (1 A) les levures contrôles K699 (■) et les levures exprimant la protéine Patched humaine (♦) présentent une croissance dans le temps similaire. En présence de doxorubicine (1 B) les levures exprimant la protéine Patched humaine résistent mieux que les levures contrôles.
Exemple 2 : La protéine Patched humaine exprimée dans la levure favorise l'efflux de doxorubicine (Figure 2)
On observe que la présence de la protéine Patched humaine à la membrane des levures provoque une augmentation de l'efflux de doxorubicine.
Exemple 3 : La Protéine Patched endogène favorise l'efflux de doxorubicine dans des fibroblastes de souris (Figure 3)
Afin de vérifier si la protéine Patched possède la même fonction dans le système endogène, des fibroblastes de souris NI H3T3 ont été cultivées dans des plaques 24 puits à confluence, puis incubées en présence de doxorubicine.
On observe que la présence de Shh inhibe de 20 à 30 % l'efflux de doxorubicine. Shh interagit avec la protéine Patched à la surface des cellules et provoque son internalisation.
La diminution de l'efflux de doxorubicine observée en présence de Shh pourrait donc être due à la disparition de la protéine Patched de la surface de la cellule.
Exemple 4 : La protéine Patched humaine exprimée dans des ovocytes de xénope favorise l'efflux de doxorubicine (Figure 4)
La figu re 4A présente u n Western blot réalisé su r des préparations de membranes d'ovocytes injectés avec 10 (piste 1 ) ou 20 (piste 2) ng d'ARN codant la protéine Patched humaine par ovocyte. La piste 3 correspond au témoin constitué d'ovocytes non injectés.
On observe que la protéine Patched humaine est exprimée à la membrane plasmique des ovocytes et que cette expression est proportionnelle à la quantité d'ARN injectée.
La figure 4B présente les mesures d'efflux de doxorubicine sur les ovocytes. Les expériences étant réalisées sur 4 lots de 10 ovocytes témoins (non injectés) et injectés avec des ARNs codant la protéine Patched humaine, la moyenne des valeurs obtenues pour les 4 lots est présentée.
On observe que la présence de la protéine Patched humaine à la membrane plasmique des ovocytes provoque une augmentation de l'efflux de doxorubicine de la cellule.
Exemple 5 Fixation de la doxorubicine à la protéine Patched humaine exprimée dans des levures. (Figure 5)
♦ : Levures contrôles n'exprimant pas la protéine Patched humaine.
■ : Levures exprimant la protéine Patched humaine (préparation 1 ) x : Levures exprimant la protéine Patched humaine (préparation 2)
: Levures exprimant la protéine Patched humaine (préparation 3)
On observe un quenching de la fluorescence de la doxorubicine rapide et important avec les membranes contenant la protéine Patched humaine correspondant à la fixation de la doxorubicine à la protéine Patched humaine.

Claims

REVENDICATIONS
1 . ) Méthode in vitro de régulation de la concentration intracellulaire en agents anticancéreux caractérisée en ce que l'on met en contact des cellules et un modulateur de l'activité de la protéine Patched pour réguler la concentration intracellulaire en agents anticancéreux.
2. ) Méthode selon la revendication 1 , caractérisée en ce que l'on met en contact des cellules et un stimulateur de l'activité de transport des agents anticancéreux par la protéine Patched.
3. ) Méthode selon la revendication 1 , caractérisée en ce que l'on met en contact des cellules et un inhibiteur de l'activité de transport des agents anticancéreux par la protéine Patched.
4. ) Utilisation d'un modulateur de l'activité de la protéine Patched pour la préparation d'un médicament destiné à réguler la concentration intracellulaire en agents anticancéreux.
5. ) Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que le modulateur de l'activité de la protéine Patched est un activateur de l'activité de la protéine Patched et que le médicament est destiné à diminuer la concentration intracellulaire en agents anticancéreux.
6. ) Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que le modulateur de l'activité de la protéine Patched est un inhibiteur de l'activité de la protéine Patched pour la préparation d'un médicament destiné à augmenter la concentration intracellulaire en agents anticancéreux.
7. ) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 ou utilisation selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisée en ce que l'agent anticancéreux est choisi parmi les Antibiotiques antitumoraux, les Agents alkylants, les Antimétabolites, les Alcaloïdes végétaux, les Inhibiteurs de la topoisomérase ou encore les Poisons du fuseau mitotique.
8. ) Méthode ou utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'agent anticancéreux est un antibiotique antitumoral.
9. ) Méthode ou utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que l'antibiotique antitumoral est ch oi si pa rm i l a Bléomycine, la Daunorubicine, la Doxorubicine, l'Épirubicine, l'Hydroxyurée, l'Idarubicine, la Mitomycine C ou encore la Mitoxantrone, préférentiellement, la Doxorubicine.
10. ) Utilisation d'un modulateur de l'activité de la protéine Patched dans la préparation d'un médicament destiné à améliorer l'efficacité d'un traitement anticancéreux.
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