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WO2011039289A1 - Markersequenzen für pankreaskrebserkrankungen, pankreaskarzinom und deren verwendung - Google Patents

Markersequenzen für pankreaskrebserkrankungen, pankreaskarzinom und deren verwendung Download PDF

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Publication number
WO2011039289A1
WO2011039289A1 PCT/EP2010/064510 EP2010064510W WO2011039289A1 WO 2011039289 A1 WO2011039289 A1 WO 2011039289A1 EP 2010064510 W EP2010064510 W EP 2010064510W WO 2011039289 A1 WO2011039289 A1 WO 2011039289A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pancreatic
marker sequences
case
marker
pancreatic cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2010/064510
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Peter Amersdorfer
Annabel HÖPFNER
Angelika Lueking
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Protagen GmbH
Original Assignee
Protagen GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Protagen GmbH filed Critical Protagen GmbH
Priority to EP10760676A priority Critical patent/EP2483690A1/de
Priority to CA2775978A priority patent/CA2775978A1/en
Priority to US13/498,964 priority patent/US20120264634A1/en
Publication of WO2011039289A1 publication Critical patent/WO2011039289A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G01N33/57525—
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/60—Complex ways of combining multiple protein biomarkers for diagnosis

Definitions

  • the present invention relates to novel marker sequences for pancreatic cancers, pancreatic carcinoma and their
  • diagnostic use including a method of screening for potential drugs for such pancreatic cancers by means of these marker sequences. Furthermore, the invention relates to a diagnostic device containing such
  • Pancreatic carcinoma in particular a protein biochip and its use.
  • pancreatic cancer such as PDAC (Pancreatic ductal adenocarcinoma), PanlN
  • PanIn Pancreatic intraepithelial neoplasia
  • pancreatic lesions pancreatic lesions
  • CP chronic pancreatitis
  • PanIn refers to pancreatic lesions and subdivides them morphologically into Panels 1A, 1B, 2 and 3 (Kern, S., R. Hruban, et al., 2001. "A white paper: the product of a pancreatic cancer think tank.” Cancer Res. 61 (12): 4923-32).
  • Pancreatic lesions are also described for CP.
  • endocrine benign or malignant tumors of the pancreas, especially neuroendocrine tumors.
  • WO2008064670 describes e.g. Marker genes to pancreas, which have been obtained by proteome analysis and histological studies.
  • Protein biochips are gaining an increasing industrial
  • Protein biochips require the necessary proteins to be available. In particular,
  • GATEWAY recombinational cloning application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeems. Methods Enzymol, 328, 575-592).
  • ORFeems open reading frames
  • Methods Enzymol, 328, 575-592 are strongly related to the progress of the genome sequencing proce- dures and the annotation of these gene sequences.
  • determination of the expressed sequence is due
  • a human cDNA library for high-throughput protein expression screening Genomics, 65, 1-8; Holz, C., Lueking, A., Bovekamp, L., Guther, C., Bolotina, N., Lehrach, H. and Cahill, DJ (2001).
  • the cDNA of a particular tissue in a bacterial or a eukaryotic expression vector, such as yeast, is cloned.
  • the vectors used for the expression are generally characterized by the fact that they carry inducible promoters, with which the timing of protein expression can be controlled.
  • expression vectors have sequences for so-called
  • Affinity epitopes or proteins on the one hand for the specific detection of the recombinant fusion proteins by means of a directed against the affinity epitope
  • Antibody on the other hand becomes the specific one
  • Protein biochips advantageously have a high sensitivity.
  • the object of the present invention is to provide improved marker sequences and their diagnostic use for the treatment of pancreatic cancers to pancreatic carcinoma.
  • SEQ 1 - 1004 new marker sequences, which could be determined for the first time by means of a protein biochip, in particular together with bioinformatory evaluation. Therefore, SEQ 1 - 1004 were first identified using a protein biochip.
  • the invention relates to the use of
  • pancreatic cancers including pancreatic carcinoma, with at least one
  • pancreatic carcinoma can be identified.
  • Pancreatic carcinoma includes a group of diseases and their precursors and / or comorbidities, pancreatic cancer and / or pancreatic carcinoma as such, but in particular PDAC (pancreatic ductal adenocarcinoma), PanlN (pancreatic intraepithelial neoplasia), pancreatic lesions, CP (chronic pancreatitis), including endocrine Tumors of the pancreas, in particular pancreatic tumors and pancreatic neoplasms (definition, for example, according to Pschyrembel, de Gruyter, 261st edition (2007), Berlin).
  • PDAC pancreatic ductal adenocarcinoma
  • PanlN pancreatic intraepithelial neoplasia
  • pancreatic lesions pancreatic lesions
  • CP chronic pancreatitis
  • endocrine Tumors of the pancreas in particular pancreatic tumors and pancreatic neoplasm
  • marker sequences or 50 to 100 or more marker sequences are added to or from one
  • the marker sequences according to the invention can also be combined, supplemented or extended with known biomarkers for this indication.
  • the determination of the marker sequences takes place outside the human body and the determination takes place in an ex vivo / in vitro diagnosis.
  • the invention relates to the use of marker sequences as diagnostic agents, wherein at least one marker sequence of a cDNA selected from the group SEQ 1-1004, preferably SEQ 503-1004, or in each case a protein coding therefor or in each case one
  • the invention relates to a method for the diagnosis of pancreatic cancers up to pancreatic carcinoma, wherein a.) At least one marker sequence of a cDNA selected from the group SEQ 1-1004, preferably SEQ 503-1004, or in each case a protein coding therefor or each one
  • Partial sequence or fragment thereof is applied to a solid support and b.
  • Tissue extract of a patient is brought into contact and c.)
  • the detection of an interaction of the body fluid or tissue extract with the marker sequences from a.) Is done.
  • the invention also relates to diagnostics for
  • Pancreatic carcinoma selected in each case from the group SEQ 1-1004, preferably SEQ 503-1004, or in each case a protein coding for it or in each case a partial sequence or
  • the detection of such an interaction can, for example, by a probe, in particular by an antibody
  • the invention therefore likewise has the object of providing a diagnostic device or an assay, in particular a protein biochip, which is suitable for the
  • pancreatic cancer to pancreatic cancer a diagnosis or examination allowed. Furthermore, the invention relates to a method for
  • Pancreatic cancer up to pancreatic carcinoma wherein at least one marker sequence of a cDNA selected from the
  • pancreatic cancer to pancreatic cancer in new or established subgroups of pancreatic cancers to pancreatic carcinoma, as well as the judicious selection of patient groups for the clinical development of new
  • therapy control also includes the classification of patients into responders and non-responders with regard to a therapy or its course of therapy.
  • pancreatic cancers to pancreatic carcinoma.
  • diagnosis includes medical diagnosis and related investigations, especially in vitro
  • diagnosis also includes the
  • pancreatic carcinoma by means of the marker sequences of the invention and the prognosis of pancreatic cancers,
  • the term "stratification" includes in particular the
  • patient is understood to mean any subject - human or mammal - with the proviso that the subject is examined for pancreatic cancers up to pancreatic carcinoma.
  • marker sequences in the sense of this invention means that the cDNA or the respectively obtainable polypeptide or protein significantly for
  • pancreatic cancers pancreatic carcinoma.
  • the cDNA or each of them are examples of them.
  • pancreatic carcinoma eg, antigen (epitope) / antibody (paratope) interaction
  • at least one marker sequence of a cDNA selected from the group SEQ 1-1004, preferably SEQ 503-1004, or in each case one protein coding for this or one each
  • Partial sequence or fragment thereof is determined on a patient to be examined "that an interaction between the body fluid or tissue extract of a patient and the marker sequences according to the invention is detected, for example, a bond, in particular a binding substance to at least one of the invention
  • Marker sequence or, in the case of a cDNA, hybridization with a suitable substance under selected conditions, in particular stringent conditions (for example, as usual
  • Hybridization conditions is hybridization in 4 x SSC at 37 ° C followed by several washing steps in 1 x SSC
  • Body fluid in particular blood, whole blood, blood plasma, blood serum, patient serum, urine, cerebrospinal fluid, synovial fluid or a tissue extract of the patient.
  • the marker sequences according to the invention may be present at a significantly higher or lower expression rate or concentration, which has an effect on the pancreatic cancers, Pancreatic carcinoma indicates.
  • the relative expression rate or concentration which has an effect on the pancreatic cancers, Pancreatic carcinoma indicates.
  • Pancreatic carcinoma determined.
  • the marker sequences have in a further embodiment of the invention a
  • the recognition signal for a protein is preferably an epitope and / or paratope and / or hapten and, for a cDNA, a hybridization or binding region.
  • Sequences 503 to 1004 are preferred sequences which have been determined directly with the protein biochip according to the invention.
  • the marker sequences also include such
  • Amino acid sequence such as chemical modification, such as
  • marker sequences In particular, such subsequences, which have an identity of 95%, 90%, in particular 80% or 70% with the marker sequences according to the invention.
  • Such partial sequences or fragments of the marker sequences according to the invention are functionally defined and have the same diagnostic function.
  • Subsequences are therefore also those sequences which have 50 to 100 nucleotides, 70-120 nucleotides of a sequence of SEQ 1-1004, preferably SEQ 503-1004, or peptides obtainable therefrom.
  • sequences which have 50 to 100 nucleotides, 70-120 nucleotides of a sequence of SEQ 1-1004, preferably SEQ 503-1004, or peptides obtainable therefrom.
  • the respective amino acids amino acids
  • Marker sequence can be represented in different amounts in one or more areas on a solid support. This allows a variation of the sensitivity.
  • the regions may each comprise a total of marker sequences, i. a sufficient number of different marker sequences, in particular 2 to 5 or 10 or more and optionally further nucleic acids and / or proteins, in particular biomarkers.
  • Biomarkers Further preferred are more than 2,500, more preferably 10,000 or more different or the same
  • Marker sequences and optionally other nucleic acids and / or proteins, in particular biomarkers are optionally other nucleic acids and / or proteins, in particular biomarkers.
  • Another object of the invention relates to an arrangement of marker sequences containing at least one marker sequence of a cDNA selected from the group SEQ 1 - 1004,
  • the arrangement contains at least 2 to 5 or 10, preferably 30 to 50
  • “arrangement” synonymously means “array” and insofar as this "array” is used to identify substances on marker sequences, this is to be understood as meaning an “assay” or a diagnostic device.
  • the arrangement is designed such that those represented on the assembly
  • Marker sequences in the form of a grid on a solid support are preferred which include a high density array of protein binders
  • Such high density spotted assemblies are disclosed, for example, in WO 99/57311 and WO 99/57312, and may be advantageously used in a robotic automated high throughput method.
  • say or diagnostic device also includes such
  • Embodiments of a device such as ELISA, bead-based assay, line assay, Western blot, immunochromatographic
  • Invention is the systematic arrangement of proteins on a solid support.
  • the marker sequences of the assembly are fixed to a solid support, but preferably spotted or immobilized even printed, that is applied reproducibly.
  • One or more marker sequences can be duplicated in the totality of all Marker sequences are present and available in different quantities based on a spot. Furthermore, the
  • Marker sequences on the solid support e.g., by serial dilution series of e.g.
  • the invention relates to an assay or protein biochip consisting of an array containing marker sequences according to the invention.
  • the marker sequences are present as clones.
  • Such clones can be obtained, for example, by means of a cDNA expression library according to the invention (Büssow et al., 1998 (supra)).
  • such expression libraries become
  • These expression vectors preferably contain inducible promoters. The induction of
  • Expression can e.g. by means of an inductor, such as IPTG.
  • IPTG inductor
  • Suitable expression vectors are described in Terpe et al. (Terpe T Appl Microbiol Biotechnol 2003 Jan; 60 (5): 523-33).
  • Expression libraries are known to the person skilled in the art, these can be prepared according to standard works, such as Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Handbook, 2nd edition (1989), CSH press, Cold Spring Harbor, New York Further preferred are such expression libraries
  • tissue specific eg human tissue, especially human organs.
  • expression libraries are also included according to the invention, which by means of exon Trapping can be obtained.
  • expression library can be spoken synonymously from an expression bank.
  • Uniclone® library protein biochips or corresponding expression libraries which have no redundancy
  • Uniclone® library protein biochips or corresponding expression libraries which have no redundancy
  • These preferred Uniclone libraries have a high content of non-defective, fully expressed proteins of a cDNA expression library.
  • the clones may not be such as transformed bacteria, recombinant phage or transformed cells of mammals, insects, fungi, yeasts or plants.
  • the clones are fixed on a solid support, spotted or immobilized.
  • the invention relates to an arrangement, wherein the
  • Marker sequences are present as clones.
  • marker sequences may be in the form of a fusion protein in the particular form
  • At least one affinity epipope or "tag” contains.
  • the tag may be one such as c-myc, His-tag, Arg-tag, FLAG, alkaline phosphatase, V5 tag, T7 tag or Strep tag, HAT tag, NusA, S-tag, SBP tag , Thioredoxin, DsbA, a fusion protein, preferably a cellulose-binding one
  • Protein Protein, calmodulin-binding protein, glutathione S-transferase or lacZ.
  • solid support includes embodiments such as a filter, a membrane, a magnetic or fluorophore-labeled bead, a
  • a filter is preferred according to the invention. Also preferred as the filter is PVDF, nitrocellulose or nylon (e.g., Immobilon P Millipore, Protran Whatman, Hybond N + Amersham).
  • this corresponds to a grid having the order of a microtiter plate (8-12 wells strips, 96 wells, 384 wells or more), a silicon wafer, a chip, a mass spectrometric target or a matrix.
  • the invention relates to an assay or protein biochip for identifying and
  • inventive arrangement or assay with a.) At least one substance to be examined is brought into contact and b.) A binding success is detected.
  • the invention relates to a method for identifying and characterizing a substance for
  • pancreatic cancer pancreatic carcinoma
  • an arrangement or assay according to the invention is brought into contact with a.) at least one substance to be investigated and b.) a binding success is detected.
  • the substance to be tested may be any native or non-native biomolecule, a synthetic chemical
  • protein to marker sequence e.g., protein to marker sequence
  • Antigen / antibody or corresponding "means for detecting the binding success" can, for example, by means of
  • reporter enzymes such as alkaline
  • a readout is e.g. by means of a microarray laser scanner, a CCD camera or visually.
  • the invention relates to a drug / drug or prodrug for
  • pancreatic cancer, pancreatic carcinoma developed and available by the use of the assay or protein biochip according to the invention. Therefore, the invention also relates to the use of an arrangement according to the invention or an assay for the screening of active substances for pancreatic cancer diseases, pancreatic carcinoma.
  • the invention also relates to a target for the treatment and therapy of
  • pancreatic cancers pancreatic carcinoma, respectively
  • SEQ 1 - 1004 selected from the group SEQ 1 - 1004, preferably SEQ 503 - 1004, or in each case a protein coding therefor.
  • the invention also relates to the use of the invention
  • Marker sequences preferably in the form of an arrangement, as an affinity material for performing an apheresis or iwS. a blood wash, wherein substances from bodily fluids of a patient with pancreatic cancers,
  • Pancreatic carcinoma such as blood or plasma
  • pancreatic cancer, pancreatic carcinoma-specific expression clones were identified by comparison with ten or more healthy specimens. The identity of
  • Protein biochips each from a cDNA expression library of a patient and a healthy subjects shown. The
  • Differential clones are detected by fluorescence labeling and evaluated bioinformatorisch.
  • biomarker identification various bioinformatic analyzes are carried out. For each serum, microarray reactivities against about 2000
  • Intensity data performed.
  • an internal standard is used, which is spotted on each chip. Since a p-value is calculated for each antigen, methods for correcting multiple testing are used. As a very conservative approach, a Bonferroni correction is performed and, in addition, the less restrictive False Discovery Rate (FDR) is calculated according to Benjamini & Hochberg.
  • FDR False Discovery Rate
  • the data are used to classify the sera.
  • different multivariate methods are used. These are methods from the statistical
  • Threshold method which is suitable for both classification and visual representation of the data.

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Markersequenzen für Pankreaskrebserkrankungen, Pankreaskarzinom und deren diagnostische Verwendung samt einem Verfahren zum Screenen von potentiellen Wirkstoffen für solche Pankreas-Erkrankungen mittels dieser Markersequenzen. Ferner betrifft die Erfindung eine diagnostische Vorrichtung enthaltend solche Markersequenzen für Pankreaskrebserkrankungen, Pankreaskarzinom, insbesondere ein Proteinbiochip und dessen Verwendung.

Description

MarkerSequenzen für Pankreaskrebserkrankungen,
Pankreaskarzinom und deren Verwendung Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Markersequenzen für Pankreaskrebserkrankungen, Pankreaskarzinom und deren
diagnostische Verwendung samt einem Verfahren zum Screenen von potentiellen Wirkstoffen für solche Pankreaskrebserkrankungen mittels dieser Markersequenzen. Ferner betrifft die Erfindung eine diagnostische Vorrichtung enthaltend solche
MarkerSequenzen für Pankreaskrebserkrankungen,
Pankreaskarzinom, insbesondere ein Proteinbiochip und dessen Verwendung.
Für Pankreaskrebs ist die 5 Jahr-Überlebensrate mit ca. 1 % die niedrigste Rate unter allen Krebsarten (Parkin, D. M., F. Bray, et al . (2001) . "Estimating the world Cancer bürden:
Globocan 2000." Int J Cancer 94(2): 153-6). Eine frühzeitige Diagnose könnte die 5 Jahr-Überlebensrate auf 40 % erhöhen
(Yeo, C. J. and J. L. Cameron (1998) . "Prognostic factors in ductal pancreatic Cancer." Langenbecks Arch Surg 383(2): 129- 33) . Zur Diagnose sind daher ebenfalls die
Vorläufererkrankungen von Pankreaskrebs heranzuziehen, solche wie PDAC (Pancreatic ductal adenocarcinoma) , PanlN
(Pankreatische intraepitheliale Neoplasien) , Pankreasläsionen, CP (Chronische Pankreatitis), einschließlich endokrine Tumore der Pankreas. Insbesondere PanlN betrifft Pankreasläsionen und unterteilt diese morphologisch in Panln 1A, 1B, 2 und 3 (Kern, S., R. Hruban, et al . (2001) . "A white paper : the product of a pancreas Cancer think tank." Cancer Res 61(12) : 4923-32) . Pankreasläsionen sind ebenfalls für CP beschrieben. Ebenfalls relevant sind endokrine (benignen oder maligne) Tumoren der Pankreas, insbesondere neuroendokrine Tumore.
WO2008064670 beschreibt z.B. Markergene zu Pankreas, die mittels Proteomanalyse und histologischen Untersuchungen erzielt worden sind.
Proteinbiochips gewinnen eine zunehmende industrielle
Bedeutung in der Analytik und Diagnostik sowie in der
Pharmaentwicklung . Proteinbiochips haben sich als
Screeninginstrumente etabliert.
Hierbei wird die schnelle und hochparallele Detektion einer Vielzahl spezifisch bindender Analysemoleküle in einem
einzigen Experiment ermöglicht. Zur Herstellung von
Proteinbiochips ist es erforderlich, die benötigten Proteine zur Verfügung zu haben. Hierzu haben sich insbesondere
Protein-Expressionsbibliotheken etabliert. Die Hochdurchsat z- Klonierung von definierten offenen Leserahmen ist eine
Möglichkeit (Heyman, J.A., Cornthwaite, J., Foncerrada, L., Gilmore, J.R., Gontang, E., Hartman, K.J., Hernandez, C.L., Hood, R., Hull, H.M., Lee, W.Y., Marcil, R., Marsh, E.J., Mudd, K.M., Patino, M.J., Purcell, T.J., Rowland, J.J.,
Sindici, M.L. and Hoeffler, J.P. (1999) Genome-scale cloning and expression of individual open reading frames using
topoisomerase I-mediated ligation. Genome Res, 9, 383-392; Kersten, B., Feilner, T., Kramer, A., Wehrmeyer, S., Possling, A., Witt, I., Zanor, M.I., Stracke, R., Lueking, A.,
Kreut zberger, J., Lehrach, H. and Cahill, D.J. (2003)
Generation of Arabidopsis protein chip for antibody and serum Screening. Plant Molecular Biology, 52, 999-1010; Reboul, J., Vaglio, P., Rual, J.F., Lamesch, P., Martinez, M., Armstrong, C. M., Li, S., Jacotot, L., Bertin, . , Janky, R., Moore, T . , Hudson, J.R., Jr . , Hartley, J.L., Brasch, M.A., Vandenhaute, J., Boulton, S., Endress, G.A., Jenna, S., Chevet, E.,
Papasotiropoulos , V., Tolias, P.P., Ptacek, J., Snyder, M., Huang, R., Chance, M.R., Lee, H., Doucette-Stamm, L., Hill,
D. E. and Vidal, M. (2003) C. elegans ORFeome version 1.1:
experimental verification of the genome annotation and
resource for proteome-scale protein expression. Nat Geriet, 34, 35-41.; Walhout, A.J., Temple, G.F., Brasch, M.A., Hartley, J.L., Lorson, M.A., van den Heuvel, S. and Vidal, M. (2000)
GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol , 328, 575-592) . Allerdings hängt ein solcher Ansatz stark mit dem Fortschritt der Genom-Sequenzierungspro ekte und der Annotierung dieser Gensequenzen zusammen. Darüber hinaus ist die Bestimmung der exprimierten Sequenz aufgrund
differenzieller Spleißvorgänge nicht immer eindeutig. Dieses Problem kann durch die Anwendung von cDNA-
Expressionsbibliotheken umgangen werden (Büssow, K., Cahill, D., Nietfeld, W., Bancroft, D., Scherzinger, E., Lehrach, H. and Walter, G. (1998) A method for global protein expression and antibody Screening on high-density filters of an arrayed cDNA library. Nucleic Acids Research, 26, 5007-5008; Büssow, K., Nordhoff, E., Lübbert, C., Lehrach, H. and Walter, G.
(2000) A human cDNA library for high-throughput protein expression Screening. Genomics, 65, 1-8; Holz, C., Lueking, A., Bovekamp, L., Gut ähr, C., Bolotina, N., Lehrach, H. and Cahill, D.J. (2001) A human cDNA expression library in yeast enriched for open reading frames. Genome Res, 11, 1730-1735; Lueking, A., Holz, C, Gotthold, C, Lehrach, H. and Cahill, D. (2000) A System for dual protein expression in Pichia pastoris and Escherichia coli, Protein Expr . Purif. , 20, 372- 378) . Hierbei wird die cDNA eines bestimmten Gewebes in einen bakteriellen oder einen eukaryotischen Expressionsvektor, wie z.B. Hefe, einkloniert. Die für die Expression verwendeten Vektoren zeichnen sich im Allgemeinen dadurch aus, dass sie induzierbare Promotoren tragen, mit denen sich der Zeitpunkt der Proteinexpression steuern lässt. Darüber hinaus weisen Expressionsvektoren Sequenzen für so genannte
Affinitätsepitope oder -proteine auf, die zum einen den spezifischen Nachweis der rekombinanten Fusions-Proteine mittels eines gegen das Affinitätsepitop gerichteten
Antikörpers erlauben, zum anderen wird die spezifische
Aufreinigung über Affinitätschromatographie (IMAC) ermöglicht.
Beispielsweise wurden die Genprodukte einer cDNA- Expressionsbibliothek aus humanem fötalem Hirngewebe in dem bakteriellen Expressionssystem Escherichia coli im Hochdichte- Format auf einer Membran angeordnet und konnten erfolgreich mit unterschiedlichen Antikörpern gescreent werden. Es konnte gezeigt werden, dass der Anteil an Volllänge-Proteinen bei mindestens 66% liegt. Die rekombinanten Proteine aus
Expressionsbibliotheken konnten darüber hinaus im
Hochdurchsatz exprimiert und aufgereinigt werden (Braun P., Hu, Y., Shen, B., Halleck, A., Koundinya, M., Harlow, E. and LaBaer, J. (2002) Proteome-scale purification of human
proteins from bacteria. Proc Natl Acad Sei U S A, 99, 2654- 2659; Büssow (2000) supra; Lueking, A., Horn, M., Eickhoff, H., Büssow, K., Lehrach, H. and Walter, G. (1999) Protein microarrays for gene expression and antibody Screening.
Analytical Biochemistry, 270, 103-111). Solche Proteinbiochips auf der Basis von cDNA-Expressionsbibliotheken sind
insbesondere Gegenstand der WO 99/57311 und WO 99/57312. Ferner sind neben Antigen-präsentierenden Proteinbiochips ebenfalls Antikörper-präsentierende Anordnungen beschrieben (Lal et al (2002) Antibody arrays : An embryonic but rapidly growing technology, DDT, 7, 143-149; Kusnezow et al . (2003), Antibody microarrays: An evaluation of production parameters, Proteomics, 3, 254-264).
Proteinbiochips weisen vorteilhaft eine hohe Empfindlichkeit aus .
Es besteht jedoch ein hohes Bedürfnis indikationsspezifische diagnostische Vorrichtungen, wie einen Proteinbiochip, bereitzustellen.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von verbesserten Markersequenzen und deren diagnostische Verwendung zur Behandlung von Pankreaskrebserkrankungen bis hin zum Pankreaskarzinom.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die
Bereitstellung von SEQ 1 - 1004 neuen Markersequenzen, die erstmalig mittels eines Proteinbiochips, insbesondere samt bioinformatorischer Auswertung ermittelt werden konnte. Daher wurden die SEQ 1 - 1004 mit Hilfe eines Proteinbiochips erstmalig identifiziert.
Die Bereitstellung von spezifischen Markersequenzen erlaubt eine sichere Diagnose und Stratifizierung von Patienten mit Pankreaskrebserkrankungen, bis hin zum Pankreaskarzinom, insbesondere mittels eines Proteinbiochips.
Daher betrifft die Erfindung die Verwendung von
MarkerSequenzen zur Diagnose von Pankreaskrebserkrankungen, bis hin zum Pankreaskarzinom, wobei mindestens eine
Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 1004 oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon (nachstehend:
erfindungsgemäße Markersequenzen) an oder von einem zu
untersuchenden Patienten bestimmt wird. Die erfindungsgemäßen Markersequenzen konnten mittels
differentiellem Screenen von Proben und zwar gesunder
Probanden mit Patientenproben mit Pankreaskrebserkrankungen, Pankreaskarzinom identifiziert werden.
Der Begriff „Pankreaskrebserkrankungen bis hin zum
Pankreaskarzinom" umfasst eine Gruppe von Erkrankungen und dessen Vorläufer- und/oder Begleiterkrankungen, Pankreaskrebs und / oder Pankreaskarzinom als solche, jedoch insbesondere PDAC (Pancreatic ductal adenocarcinoma) , PanlN (Pankreatische intraepitheliale Neoplasien) , Pankreasläsionen, CP (Chronische Pankreatitis), einschließlich endokriner Tumoren der Pankreas, insbesondere pankreatische Tumore und pankreatische Neoplasmen (Definition z.B. nach Pschyrembel, de Gruyter, 261. Auflage (2007) , Berlin) .
In einer weiteren Ausführungsform werden daher mindestens 2 bis 5 oder 10, vorzugsweise 30 bis 50 Markersequenzen oder 50 bis 100 oder mehr Markersequenzen an oder von einem zu
untersuchenden Patienten bestimmt.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die erfindungsgemäßen Markersequenzen ebenfalls mit bekannten Biomarkern für diese Indikation kombiniert, ergänzt oder erweitert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bestimmung der Markersequenzen außerhalb des menschlichen Körpers und die Bestimmung erfolgt in einer ex vivo / in vitro Diagnose. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung betrifft die Erfindung die Verwendung von Markersequenzen als Diagnostika, wobei mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 1004, vorzugsweise SEQ 503 - 1004, oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer
Teilsequenz oder Fragment davon ist.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose von Pankreaskrebserkrankungen bis hin zum Pankreaskarzinom, wobei a.) mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 1004, vorzugsweise SEQ 503 - 1004, oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer
Teilsequenz oder Fragment davon auf einem festen Träger aufgebracht wird und b.) mit Körperflüssigkeit oder
Gewebeauszug eines Patienten in Kontakt gebracht wird und c.) der Nachweis einer Wechselwirkung der Körperflüssigkeit oder Gewebeauszug mit den Markersequenzen aus a.) erfolgt.
Daher betrifft die Erfindung ebenfalls Diagnostika zur
Diagnose von Pankreaskrebserkrankungen bis hin zum
Pankreaskarzinom jeweils ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 1004, vorzugsweise SEQ 503 - 1004, oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder
Fragment davon.
Der Nachweis einer solchen Wechselwirkung kann beispielsweise durch eine Sonde, insbesondere durch einen Antikörper
erfolgen.
Daher betrifft die Erfindung ebenfalls die Aufgabe eine diagnostische Vorrichtung oder einen Assay, insbesondere einen Proteinbiochip, bereitzustellen, der für die
Pankreaskrebserkrankungen bis hin zum Pankreaskarzinom eine Diagnose oder Untersuchung erlaubt. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum
Stratifizieren, insbesondere zur Risikostratifizierung und / oder Therapiesteuerung eines Patienten mit
Pankreaskrebserkrankungen bis hin zum Pankreaskarzinom, wobei mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der
Gruppe SEQ 1 - 1004, vorzugsweise SEQ 503 - 1004, oder jeweils ein dafür kodierendes Protein an einem zu untersuchenden
Patienten bestimmt wird.
Ferner umfasst ist die Stratifizierung der Patienten mit
Pankreaskrebserkrankungen bis hin zum Pankreaskarzinom in neue oder etablierte Subgruppen der Pankreaskrebserkrankungen bis hin zum Pankreaskarzinom, sowie die sinnvolle Auswahl von Patientengruppen für die klinische Entwicklung von neuen
Therapeutika. Der Begriff Therapiesteuerung umfasst ebenfalls die Einteilung von Patienten in Responder und Nicht-Responder bezüglich einer Therapie oder dessen Therapieverlauf.
„Diagnose" im Sinne dieser Erfindung bedeutet die positive Feststellung der Pankreaskrebserkrankungen bis hin zum
Pankreaskarzinom mittels der erfindungsgemäßen Markersequenzen sowie die Zuordnung der Patienten zu den
Pankreaskrebserkrankungen bis hin zum Pankreaskarzinom. Der Begriff der Diagnose umfasst die medizinische Diagnostik und diesbezügliche Untersuchungen, insbesondere die in-vitro
Diagnostik und Labordiagnostik, ebenfalls Proteomics und
Nukleinsäureblots . Weitere Untersuchungen können zur
Absicherung und zum Ausschluss anderer Krankheiten vonnöten sein. Daher umfasst der Begriff Diagnose ebenfalls die
Differentialdiagnose von Pankreaskrebserkrankungen,
Pankreaskarzinom mittels der erfindungsgemäßen Markersequenzen sowie die Prognose der Pankreaskrebserkrankungen,
Pankreaskarz inom . „Stratifizieren (auch: Stratifikation) oder Therapiesteuerung" im Sinne dieser Erfindung bedeutet, dass das erfindungsgemäße Verfahren Entscheidungen zur Behandlung und Therapie des
Patienten erlaubt, sei es Hospitalisierung des Patienten, Einsatz, Wirkung und / oder Dosierung eines oder mehrerer Arzneimittel, eine therapeutische Maßnahme oder die
Überwachung eines Krankheitsverlaufes sowie Therapieverlauf bzw. Ätiologie oder Klassifizierung einer Erkrankung, z.B. in einen neuen oder bestehenden Subtyp oder die Differenzierung von Krankheiten und dessen Patienten.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst der Begriff „Stratifizierung" insbesondere die
Risikostratifizierung mit der Prognose eines „outcome" eines nachteiligen gesundheitlichen Ereignisses. Im Rahmen dieser Erfindung wird unter „Patient" ein beliebiger Proband - Mensch oder Säugetier - verstanden, mit der Maßgabe, dass der Proband auf Pankreaskrebserkrankungen bis hin zum Pankreaskarzinom untersucht wird.
Der Begriff „Markersequenzen" im Sinne dieser Erfindung bedeutet, dass die cDNA oder das jeweils daraus erhältliche Polypeptid oder Protein signifikant für
Pankreaskrebserkrankungen, Pankreaskarzinom sind.
Beispielsweise können die cDNA oder das jeweils daraus
erhältliche Polypeptid oder Protein eine Wechselwirkung mit Substanzen aus der Körperflüssigkeit oder Gewebeauszug eines Patienten mit Pankreaskrebserkrankungen bis hin zum
Pankreaskarzinom aufweisen (z.B. Antigen (Epitop) / Antikörper (Paratop) Wechselwirkung) . Im Sinne der Erfindung bedeutet „wobei mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 1004, vorzugsweise SEQ 503 - 1004, oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer
Teilsequenz oder Fragment davon an einem zu untersuchenden Patienten bestimmt wird", dass eine Wechselwirkung zwischen der Körperflüssigkeit oder Gewebeauszuges eines Patienten und den erfindungsgemäßen Markersequenzen nachgewiesen wird. Eine solche Wechselwirkung ist z.B. eine Bindung, insbesondere eine bindende Substanz an mindestens einer erfindungsgemäßen
Markersequenz oder im Fall einer cDNA die Hybridisierung mit einer geeigneten Substanz unter gewählten Bedingungen, insbesondere stringenten Bedingungen (z.B. wie üblich
definiert in J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd Edition, Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Habor, USA oder Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green
Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)). Ein Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen ist: Hybridisierung in 4 x SSC bei 65° C (alternativ in 50%
Formamid und 4 X SSC bei 42° C) , gefolgt von mehreren
Waschschritten in 0,1 x SSC bei 65°C für insgesamt etwa eine Stunde. Ein Beispiel für wenig stringente
Hybridisierungsbedingungen ist Hybridisierung in 4 x SSC bei 37° C, gefolgt von mehreren Waschritten in 1 x SSC bei
Raumtemperatur .
Solche Substanzen sind erfindungsgemäß Bestandteil einer
Körperflüssigkeit, insbesondere Blut, Vollblut, Blutplasma, Blutserum, Patientenserum, Urin, Cerebrospinalflüssigkeit , Synovialflüssigkeit oder eines Gewebeauszuges des Patienten.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können jedoch die erfindungsgemäßen Markersequenzen in einer signifikant höheren oder niedrigeren Expressionsrate oder Konzentration vorliegen, dass auf die Pankreaskrebserkrankungen, Pankreaskarziom hinweist. Hierbei wird mittels einem erfindungsgemäßen Proteinbiochip die relativen
Expressionsraten krank / gesund der erfindungsgemäßen
MarkerSequenzen für Pankreaskrebserkrankungen,
Pankreaskarzinom bestimmt. Die Markersequenzen verfügen in einer weiteren Ausführungsgform der Erfindung über ein
Erkennungssignal, welches an die zu bindende Substanz
adressiert ist (z.B. Antikörper, Nukleinsäure) und eine quantitative und qualitative Analyse erlaubt. Erfindungsgemäß bevorzugt ist für ein Protein das Erkennungssignal ein Epitop und / oder Paratop und / oder Hapten und für eine cDNA eine Hybridisierungs- oder Bindungsregion.
Die erfindungsgemäßen Markersequenzen sind Gegenstand der Tabelle A und können durch den jeweilig zitierten
Datenbankeintrag (auch mittels Internet:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) identifiziert werden (siehe in Tabelle A) , siehe ebenfalls das zugehörige Sequenzprotokoll. Bei den Sequenzen 1 bis 502 handelt es sich um die
Volllängesequenzen der Sequenzen 503 bis 1004. Die Sequenzen 503 bis 1004 sind bevorzugte Sequenzen, die unmittelbar mit dem erfindungsgemäßen Proteinbiochip ermittelt worden sind.
Erfindungsgemäß umfassen die Markersequenzen auch solche
Modifikationen der cDNA-Sequenz und der entsprechenden
Aminosäuresequenz, wie chemische Modifikation, wie
Citrullinierung, Acetylierung, Phosphorylierung,
Glykosilierung oder polyA-Strang und weiteren dem Fachmann einschlägig bekannte Modifikationen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind ebenfalls Teilsequenzen oder Fragmente der erfindungsgemäßen
Markersequenzen umfasst. Insbesondere solche Teilsequenzen, die eine Identität von 95%, 90 %, insbesondere 80% oder 70 % mit den erfindungsgemäßen Markersequenzen aufweisen.
Solche Teilsequenzen oder Fragmente der erfindungsgemäßen Markersequenzen sind funktionell definiert und weisen die gleiche diagnostische Funktion auf.
Teilsequenzen sind daher ebenfalls solche Sequenzen, die 50 bis 100 Nukleotide, 70-120 Nukleotide einer Sequenz der SEQ 1- 1004, vorzugsweise SEQ 503 - 1004, aufweisen, oder davon erhältliche Peptide. In einer weiteren Ausführungsform kann die jeweilige
Markersequenz in unterschiedlichen Mengen in einen oder mehreren Bereichen auf einem festen Träger repräsentiert sein. Dies erlaubt eine Variation der Sensitivität . Die Bereiche können jeweils eine Gesamtheit von Markersequenzen aufweisen, d.h. eine genügende Zahl an verschiedenen Markersequenzen, insbesondere 2 bis 5 oder 10 oder mehr und ggfs. weiteren Nukleinsäuren und/oder Proteinen, insbesondere Biomarker.
Bevorzugt sind jedoch mindestens 96 bis 25.000 (numerisch) oder mehr aus verschiedenen oder gleichen Markersequenzen und weiteren Nukleinsäuren und/oder Proteinen, insbesondere
Biomarker. Weiterhin bevorzugt sind mehr als 2.500, besonders bevorzugt 10.000 oder mehr verschiedene oder gleiche
MarkerSequenzen und ggfs. weiteren Nukleinsäuren und/oder Proteinen, insbesondere Biomarker.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine Anordnung von Markersequenzen enthaltend mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 1004,
vorzugsweise SEQ 503 - 1004, oder jeweils ein dafür
kodierendes Protein. Vorzugsweise enthält die Anordnung mindestens 2 bis 5 oder 10, vorzugsweise 30 bis 50
Markersequenzen oder 50 bis 100 oder mehr Markerseque
Im Rahmen dieser Erfindung bedeutet „Anordnung" synonym „Array" und sofern dieser „Array" zur Identifizierung von Substanzen an Markersequenzen verwendet wird, ist hierunter ein „Assay" oder eine diagnostische Vorrichtung zu verstehen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Anordnung derart gestaltet, dass die auf der Anordnung repräsentierten
Markersequenzen in Form eines Gitters auf einem festen Träger vorliegen. Ferner sind solche Anordnungen bevorzugt, die eine hochdichte (high-density ) Anordnung von Proteinbindern
erlauben und die Markersequenzen gespottet werden. Solche hochdichte gespotteten Anordnungen sind beispielsweise in der WO 99/57311 und WO 99/57312 offenbart und können vorteilhaft in einem robotergestützten automatisierten High-Throughput Verfahren zur Anwendung kommen.
Im Rahmen dieser Erfindung umfasst jedoch der Begriff „Assay oder diagnostische Vorrichtung ebenfalls solche
Ausführungsformen einer Vorrichtung, wie ELISA, Bead-based Assay, Line Assay, Western Blot, immunchromatographische
Verfahren (z.B. so genannte Lateral Flow Immunoassays ) oder ähnliche immunologische Single- oder Multiplex- Nachweisverfahren. Ein Proteinbiochip im Sinne dieser
Erfindung ist die systematische Anordnung von Proteinen auf einem festen Träger.
Die Markersequenzen der Anordnung sind auf einen festen Träger fixiert, vorzugsweise jedoch gespottet oder immobilisiert gar aufgedruckt, d.h. reproduzierbar aufgebracht. Ein oder mehrere Markersequenzen können mehrfach in der Gesamtheit aller Markersequenzen präsent sein und in unterschiedlichen Mengen bezogen auf einen Spot vorliegen. Ferner können die
Markersequenzen auf dem festen Träger standardisiert sein (z.B. mittels serieller Verdünnungsreihen von z.B.
Humanglobulinen als interne Kaiibratoren zur
Datennormalisierung und quantitativen Auswertung) .
Daher betrifft die Erfindung einen Assay oder Proteinbiochip bestehend aus einer Anordnung enthaltend erfindungsgemäße MarkerSequenzen . In einer weiteren Ausführungsform liegen die Markersequenzen als Clone vor. Solche Clone können beispielsweise mittels einer erfindungsgemäßen cDNA-Expressionsbibliothek erhalten werden (Büssow et al . 1998 (supra) ) . In einer bevorzugten Ausführungsform werden solche Expressionsbibliotheken
enthaltend Clone mittels Expressionsvektoren aus einer
exprimierenden cDNA Bibliothek bestehend aus den cDNA
Markersequenzen erhalten. Diese Expressionsvektoren enthalten vorzugsweise induzierbare Promotoren. Die Induktion der
Expression kann z.B. mittels eines Induktors, solche wie IPTG, erfolgen. Geeignete Expressionsvektoren sind beschrieben in Terpe et al . (Terpe T Appl Microbiol Biotechnol. 2003 Jan; 60(5) : 523-33) .
Expressionsbibliotheken sind dem Fachmann bekannt, diese können nach Standardwerken, wie Sambrook et al, "Molecular Cloning, A laboratory handbook, 2nd edition (1989), CSH press, Cold Spring Harbor, New York hergestellt werden. Weiterhin bevorzugt sind solche Expressionsbibliotheken, die
gewebespezifisch sind (z.B. humanes Gewebe, insbesondere humane Organe) . Ferner sind erfindungsgemäß ebenfalls solche Expressionsbibliotheken mit eingeschlossen, die mittels exon- trapping erhalten werden können. Statt Expressionsbibliothek kann synonym von einer Expressionsbank gesprochen werden.
Weiterhin bevorzugt sind Proteinbiochips oder entsprechende Expressionsbibliotheken, die keine Redundanz aufweisen (so genannte: Uniclone®-Bibliothek ) und nach den Lehren der WO 99/57311 und WO 99/57312 beispielsweise hergestellt werden können. Diese bevorzugten Uniclone- Bibliotheken weisen einen hohen Anteil an nicht-fehlerhaften vollständig exprimierten Proteinen einer cDNA-Expressionsbibliothek auf. Im Rahmen dieser Erfindung können die Clone ebenfalls nicht abschließend solche sein, wie transformierte Bakterien, rekombinante Phagen oder transformierte Zellen von Säugern, Insekten, Pilzen, Hefen oder Pflanzen.
Die Clone werden auf einen festen Träger fixiert, gespottet oder immobilisiert.
Daher betrifft die Erfindung eine Anordnung, wobei die
Markersequenzen als Clone vorliegen.
Zusätzlich können die Markersequenzen in der jeweiligen Form in Form eines Fusionsproteins vorliegen, welches
beispielsweise mindestens ein Affinitätsepiptop oder "Tag" enthält. Der Tag kann ein solcher sein wie wie c-myc, His-Tag, Arg-tag, FLAG, alkalische Phosphatase, V5-Tag, T7-Tag oder Strep-Tag, HAT-tag, NusA, S-tag, SBP-tag, Thioredoxin, DsbA, ein Fusionsprotein, vorzugsweise eine Cellulose-bindende
Domäne, grünfluoreszierendes Protein, Maltose bindendes
Protein, calmodulin-bindendes Protein, Glutathione S- transferase oder lacZ enthalten.
In sämtlichen Ausführungsformen umfasst der Begriff "fester Träger" Ausführungen wie einen Filter, eine Membran, ein magnetisches oder Fluorophor-markiertes Kügelchen, ein
Silizium-Wafer , Glas, Metall, Kunststoff, ein Chip, ein massenspektrometrisches Target oder eine Matrix. Ein Filter ist jedoch erfindungsgemäß bevorzugt. Als Filter ist weiterhin PVDF, Nitrocellulose oder Nylon bevorzugt (z.B. Immobilon P Millipore, Protran Whatman, Hybond N+ Amersham) .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der
erfindungsgemäßen Anordnung entspricht diese einem Gitter, dass die Größenordnung einer Mikrotiterplatte (8-12 Wells Streifen, 96 Wells, 384 Wells oder mehr) , eines Silizium- Wafers, eines Chips, eines massenspektrometrischen Targets oder einer Matrix besitzt.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Assay oder Proteinbiochip zum Identifizieren und
Charakterisieren einer Substanz für Pankreaskrebserkrankungen, Pankreaskarzinom, dadurch gekennzeichnet, dass eine
erfindungsgemäße Anordnung oder Assay mit a.) mindestens einer zu untersuchenden Substanz in Kontakt gebracht wird und b.) ein Bindungserfolg nachgewiesen wird.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren und Charakterisieren einer Substanz für
Pankreaskrebserkrankungen, Pankreaskarzinom, dadurch
gekennzeichnet, dass eine erfindungsgemäße Anordnung oder Assay mit a.) mindestens einer zu untersuchenden Substanz in Kontakt gebracht wird und b.) ein Bindungserfolg nachgewiesen wird . Die zu untersuchende Substanz kann ein beliebiges natives oder nicht-natives Biomolekül, ein synthetisches chemisches
Molekül, eine Mischung oder eine Substanzbibliothek sein.
Nachdem die zu untersuchende Substanz eine Markersequenz kontaktiert, erfolgt die Auswertung des Bindungserfolges, die beispielsweise unter Verwendung mit handelsüblicher Image- Analyse Software (GenePix Pro (Axon Laboratories), Aida
(Raytest), ScanArray (Packard Bioscience) erfolgt.
Die Visualisierung erfindungsgemäßer Protein-Protein- Wechselwirkungen (z.B. Protein an Markersequenz, wie
Antigen/Antikörper ) oder entsprechende „Mittel zum Nachweis des Bindungserfolges" kann beispielsweise mittels
Fluoresenzmarkierung, Biotiniylierung, Radio-Isotopen- Markierung oder kolloidale Gold- oder Latex-Partikel- Markierung in üblicher Weise erfolgen. Ein Nachweis von gebundenen Antikörpern erfolgt mit Hilfe von sekundären
Antikörpern, die mit handelsüblichen Reportermolekülen
markiert sind (z.B. Cy-, Alexa-, Dyomics, FITC- oder ähnliche Fluoreszenzfarbstoffe, , kolloidale Gold- oder Latex- Partikel), oder mit Reporter-Enzymen wie alkalischer
Phosphatase, Meerrettichperoxidase, usw. und den
entsprechenden colorimetrischen, fluoreszenten oder
chemolumineszenten Substraten. Eine Auslesung erfolgt z.B. mittels eines Microarray-Laserscanners , einer CCD-Kamera oder visuell .
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Arzneimittel / Wirkstoff oder Prodrug für
Pankreaskrebserkrankungen, Pankreaskarzinom entwickelt und erhältlich durch den Einsatz des erfindungsgemäßen Assays oder Proteinbiochip. Daher betrifft die Erfindung ebenfalls die Verwendung einer erfindungsgemäßen Anordnung oder einem Assay zum Screenen von Wirkstoffen für Pankreaskrebserkrankungen, Pankreaskarzinom.
Daher betrifft die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ebenfalls ein Target zur Behandlung und Therapie von
Pankreaskrebserkrankungen, Pankreaskarzinom, jeweils
ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 1004, vorzugsweise SEQ 503 - 1004, oder jeweils ein dafür kodierendes Protein.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ebenfalls die Verwendung der erfindungsgemäßen
Markersequenzen, vorzugsweise in Form einer Anordnung, als Affinitätsmaterial zur Durchführung einer Apherese bzw. iwS . einer Blutwäsche, wobei Substanzen aus Körperflüssigkeiten eines Patienten mit Pankreaskrebserkrankungen,
Pankreaskarzinom, wie Blut oder Plasma, an die
erfindungsgemäßen Markersequenzen binden und folglich der Körperflüssigkeit selektiv entzogen werden können.
Beispiele und Figuren:
Zehn oder mehr Patientenproben wurden individuell gegen eine cDNA Expressionsbibliothek gescreent. Die
Pankreaskrebserkrankungen, Pankreaskarzinom -spezifischen Expressionsklone wurden ermittelt durch einen Vergleich mit zehn oder mehr gesunden Proben. Die Identität der
Markersequenzen wurde durch DNA-Sequenzierung ermittelt. In Figur 1 wird das differentielle Screenen zwischen zwei
Proteinbiochips aus jeweils einer cDNA-Expressionsbank eines Patienten und einem gesunden Probanden gezeigt. Die
differentiellen Clone werden mittels Fluoresenzmarkierung nachgewiesen und bioinformatorisch ausgewertet. Im Rahmen der Biomarkeridentifizierung werden verschiedene bioinformatische Analysen durchgeführt. Für jedes Serum werden mittels Microarray Reaktivitäten gegen ca. 2000
unterschiedliche Antigene gemessen. Diese Daten werden für ein Ranking der gespotteten Antigene bzgl. ihrer
Differenzierungsfähigkeit zwischen gesunden und erkrankten Seren benutzt. Diese Auswertung wird mittels des nicht
parametrischen Mann-Whitney Tests auf normalisierten
Intensitätsdaten durchgeführt. Zur Normalisierung wird ein interner Standard benutzt, der auf jedem Chip mitgespottet wird. Da für jedes Antigen ein p-Wert berechnet wird, werden Methoden zur Korrektur des multiplen Testens eingesetzt. Als sehr konservativer Ansatz wird eine Bonferroni Korrektur durchgeführt und zusätzlich wird die weniger restriktive False Discovery Rate (FDR) nach Benjamini & Hochberg berechnet.
Desweiteren werden die Daten zur Klassifikation der Seren benutzt. Hierbei kommen unterschiedliche multivariate Methoden zum Einsatz. Dies sind Methoden aus den statistischen
Lernverfahren wie Support Vector Machines (SVM), Neuronale Netze oder Klassifikationsbäume, sowie eine
Schwellenwertmethode, welche sowohl zur Klassifikation als auch zur visuellen Repräsentation der Daten geeignet ist.
Zur Vermeidung von Overfitting wird eine lOfache Cross- Validierung der Daten durchgeführt. Tabelle A:
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Claims

Patentansprüche
Verwendung der Markersequenzen zur Diagnose von
Pankreaskrebserkrankungen, Pankreaskarzinom, wobei mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 1004, vorzugsweise SEQ 503 - 1004, oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon an oder von einem zu untersuchenden Patienten bestimmt wird.
Verwendung der Markersequenzen zur Diagnose von
Pankreaskrebserkrankungen, Pankreaskarzinom nach
Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, mindestens 2 bis 5 oder 10, vorzugsweise 30 bis 50 Markersequenzen oder 50 bis 100 oder mehr Markersequenzen an oder von einem zu untersuchenden Patienten bestimmt wird.
Verwendung der Markersequenzen zur Diagnose von
Pankreaskrebserkrankungen, Pankreaskarzinom nach
Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung mittels in-vitro Diagnose erfolgt.
Verwendung einer Markersequenz einer cDNA jeweils ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 1004, vorzugsweise SEQ 503 - 1004, oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon als Diagnostikum.
Verwendung der Markersequenzen zur Diagnose von
Pankreaskrebserkrankungen, Pankreaskarzinom nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Markersequenzen auf einem festen Träger aufgebracht werden, insbesondere einen Filter, eine Membran, ein magnetisches oder Fluorophor-markiertes Kügelchen, ein Silizium-Wafer , Glas, Metall,
Kunststoff, ein Chip, ein massenspektrometrisches
Target oder eine Matrix.
Verfahren zur Diagnose von Pankreaskrebserkrankungen, Pankreaskarzinom, wobei
a. ) mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 1004, vorzugsweise SEQ 503 - 1004, oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon auf einem festen Träger aufgebracht wird und
b. ) mit Körperflüssigkeit oder Gewebeauszug eines
Patienten in Kontakt gebracht wird und
c. ) der Nachweis einer Wechselwirkung der
Körperflüssigkeit oder Gewebeauszug mit den
Markersequenzen aus a.) erfolgt.
Verfahren zum Stratifizieren, insbesondere zur
Risikostratifizierung, oder zur Therapiesteuerung eines Patienten mit Pankreaskrebserkrankungen,
Pankreaskarzinom, wobei mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 1004, vorzugsweise SEQ 503 - 1004, oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon an einem zu untersuchenden Patienten bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Stratifizieren oder die Therapiesteuerung Entscheidungen zur
Behandlung und Therapie des Patienten, insbesondere Hospitalisierung des Patienten, Einsatz, Wirkung und / oder Dosierung eines oder mehrerer Arzneimittel, eine therapeutische Maßnahme oder die Überwachung eines Krankheitsverlaufes sowie Therapieverlauf, Ätiologie oder Klassifizierung einer Erkrankung samt Prognose umfasst .
9. Anordnung von Markersequenzen enthaltend mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 1004, vorzugsweise SEQ 503 - 1004, oder jeweils ein dafür kodierendes Protein.
10. Anordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 2 bis 5 oder 10, vorzugsweise 30 bis 50 Markersequenzen oder 50 bis 100 oder mehr
Markersequenzen enthalten sind.
11. Anordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Markersequenzen als Clone vorliegen.
12. Assay, Proteinbiochip bestehend aus einer Anordnung
nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die
Markersequenzen auf einem festen Träger aufgebracht sind .
13. Verwendung einer Anordnung nach einem der Ansprüche 9 bis 11 oder einem Assay nach Anspruch 12 zum
Identifizieren und Charakterisieren einer Substanz für Pankreaskrebserkrankungen, Pankreaskarzinom enthaltend Mittel zum Nachweis eines Bindungserfolges, dadurch gekennzeichnet, dass eine Anordnung oder Assay mit a.) mindestens einer zu untersuchenden Substanz in Kontakt gebracht wird und b.) ein Bindungserfolg nachgewiesen wird .
14. Verwendung einer Anordnung nach einem der Ansprüche 9 bis 11 oder einem Assay nach Anspruch 12 zum Screenen von Wirkstoffen für Pankreaskrebserkrankungen,
Pankreaskarz inom .
15. Diagnostika zur Diagnose von Pankreaskrebserkrankungen, Pankreaskarzinom, jeweils ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 1004, vorzugsweise SEQ 503 - 1004, oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer
Teilsequenz oder Fragment davon.
16. Target zur Behandlung und Therapie von
Pankreaskrebserkrankungen, Pankreaskarzinom, jeweils ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 1004, vorzugsweise SEQ 503 - 1004, oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon .
17. Verwendung einer Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 1004, vorzugsweise SEQ 503 - 1004, oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon als
Affinitätsmaterial zur Durchführung einer Apherese oder Blutwäsche für Patienten mit Pankreaskrebserkrankungen, Pankreaskarz inom .
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