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WO2011021391A1 - 培養細胞評価装置、インキュベータおよびプログラム - Google Patents

培養細胞評価装置、インキュベータおよびプログラム Download PDF

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Publication number
WO2011021391A1
WO2011021391A1 PCT/JP2010/005119 JP2010005119W WO2011021391A1 WO 2011021391 A1 WO2011021391 A1 WO 2011021391A1 JP 2010005119 W JP2010005119 W JP 2010005119W WO 2011021391 A1 WO2011021391 A1 WO 2011021391A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
cultured cell
cultured
cell
feature amount
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2010/005119
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
加藤竜司
本多裕之
山本若菜
名倉良英
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nagoya University NUC
Nikon Corp
Original Assignee
Nagoya University NUC
Nikon Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nagoya University NUC, Nikon Corp filed Critical Nagoya University NUC
Publication of WO2011021391A1 publication Critical patent/WO2011021391A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1429—Signal processing
    • G01N15/1433—Signal processing using image recognition
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1468—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry with spatial resolution of the texture or inner structure of the particle
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N2015/1497—Particle shape

Definitions

  • the present invention relates to a cultured cell evaluation apparatus, an incubator, and a program.
  • Patent Document 1 discloses a cancer cell evaluation method using a transcription factor as a marker.
  • the evaluation test process as described above it is actually difficult to perform an enormous evaluation only for ensuring cell stability. Therefore, the actual situation is that the evaluation of the degree of cell degradation is operated based on empirical and rough judgment criteria based on the number of passages and the number of freezing of cell lines.
  • an object of the present invention is to provide means for evaluating cells to be evaluated based on evaluation attributes by a relatively simple technique.
  • the cultured cell evaluation apparatus includes an image acquisition unit, a feature amount acquisition unit, a storage unit, and an evaluation processing unit.
  • the image acquisition unit acquires a plurality of images obtained by capturing the target cells cultured in the culture container in time series.
  • the feature amount acquisition unit obtains a plurality of types of feature amounts respectively indicating the morphological features of the target cells included in the image, for each image.
  • the storage unit stores a discrimination model for classifying cells having different evaluation attributes.
  • the classification of the discriminant model is performed based on an index selected from a combination of a plurality of types of feature amounts and observation periods.
  • the evaluation processing unit collates the index of the discrimination model with the feature quantity at each observation time of the target cell, and classifies the target cell.
  • the cultured cell evaluation method includes an image acquisition step of acquiring image data of cultured cells to be evaluated, a selection step, a feature amount acquisition step, and an evaluation step.
  • a type of feature amount indicating a morphological feature for classifying cultured cells and a threshold corresponding to the type of feature amount are selected.
  • a feature amount acquisition step a feature amount corresponding to the type selected in the selection step is acquired from the image data acquired in the image acquisition step.
  • the evaluation step the cultured cell is evaluated using the feature amount of the cultured cell acquired in the feature amount acquisition step and the threshold value selected in the selection step.
  • an incubator incorporating the above cultured cell evaluation apparatus, a program and a program storage medium for causing a computer to function as the above cultured cell evaluation apparatus, and an operation of the above cultured cell evaluation apparatus expressed in a method category, This is effective as a specific embodiment of the present invention.
  • the block diagram which shows the structural example of the cultured cell evaluation apparatus which concerns on 1st Embodiment.
  • the figure which shows the example of the change of the cytoskeleton amount per cell of the 4th passage -8th passage Flow chart of an operation example of the construction process of the degradation determination model according to the first embodiment (A)-(o): Diagram showing an overview of each feature value Flow chart showing an example of a construction subroutine for a degradation discrimination model The figure which shows the example of the deterioration discrimination model constructed
  • FIG. 1 Flow chart of an example of cell deterioration degree evaluation processing according to the first embodiment
  • FIG. 1 is a block diagram illustrating a configuration example of the cultured cell evaluation apparatus according to the first embodiment.
  • the cultured cell evaluation apparatus of the first embodiment is configured by a personal computer in which an evaluation processing program for evaluating the degree of deterioration of cultured cells is installed.
  • the cultured cell evaluation apparatus of the first embodiment reads a plurality of microscopic images (target images and teacher images) acquired from time-lapse observation of a culture vessel in which cells are cultured from the outside. Then, the cultured cell evaluation apparatus according to the first embodiment constructs a deterioration determination model that classifies cells having different degrees of deterioration by supervised learning using a teacher image. In addition, the cultured cell evaluation apparatus according to the first embodiment executes the evaluation of the degree of deterioration of the cells included in the target image by applying the above-described deterioration determination model.
  • the 1 includes a data reading unit 12, a storage device 13, a CPU 14, a memory 15, an input / output I / F 16, and a bus 17.
  • the data reading unit 12, the storage device 13, the CPU 14, the memory 15, and the input / output I / F 16 are connected to each other via a bus 17.
  • an input device 18 keyboard, pointing device, etc.
  • a monitor 19 are connected to the computer 11 via an input / output I / F 16.
  • the input / output I / F 16 receives various inputs from the input device 18 and outputs display data to the monitor 19.
  • the data reading unit 12 is used when reading the above-mentioned microscope image data and the above-described evaluation processing program from the outside.
  • the data reading unit 12 communicates with a reading device (such as an optical disk, a magnetic disk, or a magneto-optical disk reading device) that acquires data from a removable storage medium, or an external device in accordance with a known communication standard. It consists of communication devices (USB interface, LAN module, wireless LAN module, etc.) to be performed.
  • the storage device 13 is constituted by a storage medium such as a hard disk or a nonvolatile semiconductor memory, for example.
  • the storage device 13 stores an evaluation processing program and various data necessary for executing the program (for example, data of a deterioration determination model).
  • the storage device 13 can also store the microscope image data read from the data reading unit 12.
  • the CPU 14 is a processor that comprehensively controls each part of the computer 11.
  • the CPU 14 functions as a feature amount acquisition unit 21, a model construction unit 22, and an evaluation processing unit 23 by executing the above evaluation processing program (feature amount acquisition unit 21, model construction unit 22, evaluation processing unit 23, respectively). These operations will be described later).
  • the feature quantity acquisition unit 21 and the model construction unit 22 operate.
  • the feature amount acquisition unit 21 and the evaluation processing unit 23 operate.
  • the memory 15 temporarily stores various calculation results in the evaluation processing program.
  • the memory 15 is composed of, for example, a volatile SDRAM.
  • the observation magnification in the microscope image is 4 times, and the image size is set to 1360 pixels ⁇ 1024 pixels (about 1.4 million pixels).
  • the cultured cell evaluation apparatus in the first embodiment reads and acquires 450 microscopic images (3 ⁇ 5 fields of view ⁇ 6 days ⁇ 5 passages) acquired from the above conditions from the data reading unit 12. And
  • the prediction accuracy of the degree of cell degradation is verified by cross-validation using the above-described 450 microscope images.
  • 450 microscopic images were randomly divided into 10 sample groups. Then, the process of constructing the deterioration determination model is executed using 9 samples (405 sheets) as a teacher image, and the operation of executing the cell deterioration degree evaluation process is repeated 10 times with the remaining samples (45 sheets) by replacing the samples. (10-fold cross validation).
  • FIG. 2 shows an example of changes caused by subculture of human fibroblasts.
  • an image of normal human fibroblasts and each image of human fibroblasts at the 4th to 9th passages are shown.
  • Comparison of the images in FIG. 2 shows that human fibroblasts tend to spread thinly as the number of passages increases, and that the appearance of human fibroblasts changes depending on the number of passages.
  • FIGS. 3 to 5 are diagrams showing the degree of degradation of human fibroblasts by subculture based on conventional experimental methods, respectively.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of changes in the viable cell ratio (Calcein / PI) from the 4th to the 8th passages. According to FIG. 3, it can be seen that the viable cell rate gradually decreases as the number of passages progresses.
  • FIG. 4 is a diagram showing an example of changes in the number of senescent cells ( ⁇ galactosidase / DAPI) from the 4th to the 8th passages. According to FIG. 4, senescent cells were not detected at passages 4-6, but senescent cells were detected at passages 7 and 8.
  • FIG. 5 is a diagram showing an example of changes in cytoskeleton amount (Phaloidin / DAPI) per cell from the 4th passage to the 8th passage.
  • the amount of cytoskeleton gradually decreases as the number of passages progresses. This indicates that as the number of passages progresses, the intracellular order decreases and it becomes difficult to maintain the cell morphology.
  • FIGS. 3 to 5 it can be clearly seen that the degree of cell deterioration increases as the passage number advances.
  • Step S101 The CPU 14 acquires teacher image data. Note that, as described above, the CPU 14 in the first embodiment sets 405 images among the 450 microscope images stored in advance in the storage device 13 as teacher images.
  • Step S102 The CPU 14 designates a calculation target image from among a plurality of teacher images. Note that the CPU 14 in S102 sequentially designates all of the teacher images as calculation targets.
  • the feature quantity acquisition unit 21 extracts cells included in the image of the calculation target teacher image (specified in S102). For example, when a cell is imaged with a phase-contrast microscope, a halo appears in the vicinity of a region with a large change in phase difference, such as a cell wall. Therefore, the feature quantity acquisition unit 21 extracts a halo corresponding to the cell wall by a known edge extraction method, and estimates a closed space surrounded by edges by a contour tracking process as a cell. Thereby, individual cells can be extracted from the microscope image.
  • the feature quantity acquisition unit 21 obtains a feature quantity indicating a morphological feature of each cell extracted from the image in S103.
  • the feature amount acquisition unit 21 in S104 obtains the following 15 types of feature amounts for each cell.
  • Total area is a value indicating the area of the cell of interest.
  • the feature amount acquisition unit 21 can obtain the value of “Total area” based on the number of pixels in the cell area of interest.
  • Hole area is a value indicating the area of Hole in the cell of interest.
  • Hole refers to a portion where the brightness of the image in the cell is equal to or greater than a threshold value due to contrast (a portion that is close to white in phase difference observation).
  • a threshold value due to contrast (a portion that is close to white in phase difference observation).
  • stained lysosomes of intracellular organelles are detected as Hole.
  • a cell nucleus and other organelles can be detected as Hole.
  • the feature amount acquisition unit 21 may detect a group of pixels in which the luminance value in the cell is equal to or greater than the threshold value as a Hole, and obtain the value of “Hole area” based on the number of pixels of the Hole.
  • Perimeter is a value indicating the length of the outer periphery of the cell of interest.
  • the feature amount acquisition unit 21 can acquire the value of “Perimeter” by contour tracking processing when extracting cells.
  • Width is a value indicating the length of the cell of interest in the horizontal direction (X direction) of the image.
  • Height is a value indicating the length of the cell of interest in the image vertical direction (Y direction).
  • Length is a value indicating the maximum value (the total length of the cell) of the lines crossing the cell of interest.
  • “Breadth” is a value indicating the maximum value (lateral width of the cell) of lines orthogonal to “Length”.
  • Fiber Length is a value indicating the length when the target cell is assumed to be pseudo linear.
  • the feature quantity acquisition unit 21 obtains the value of “Fiber Length” by the following equation (1).
  • Fiber Breath is a value indicating a width (a length in a direction orthogonal to Fiber Length) when the target cell is assumed to be pseudo linear.
  • the feature quantity acquisition unit 21 calculates the value of “Fiber Breath” by the following equation (2).
  • Shape Factor is a value indicating the circularity of the cell of interest (cell roundness).
  • the feature quantity acquisition unit 21 obtains the value of “Shape Factor” by the following equation (3).
  • Inner radius is a value indicating the radius of the inscribed circle of the cell of interest.
  • Outer radius is a value indicating the radius of the circumscribed circle of the cell of interest.
  • Mean radius is a value indicating the average distance between all the points constituting the outline of the cell of interest and its center of gravity.
  • Equivalent radius is a value indicating the radius of a circle having the same area as the cell of interest.
  • the parameter “Equivalent radius” indicates the size when the cell of interest is virtually approximated to a circle.
  • the feature quantity acquisition unit 21 may obtain each feature quantity described above by adding an error to the number of pixels corresponding to the cell. At this time, the feature quantity acquisition unit 21 may obtain the feature quantity in consideration of imaging conditions of the microscope image (observation magnification, aberration of the optical system of the microscope, etc.).
  • the feature amount acquisition unit 21 obtains the center of gravity of each cell based on a known center of gravity calculation method. What is necessary is just to obtain
  • Step S105 The feature quantity acquisition unit 21 obtains the average value and the standard deviation within the image of the 15 types of feature quantities (S104) for the teacher image to be calculated. Then, the feature amount acquisition unit 21 records the in-image average value and the in-image standard deviation of each feature amount in the storage device 13.
  • Step S106 The CPU 14 determines whether or not all the teacher images have been processed (a feature amount has been acquired for all the teacher images). If the above requirement is satisfied (YES side), the CPU 14 shifts the process to S107. On the other hand, when the above requirement is not satisfied (NO side), the CPU 14 returns to S102 and repeats the above operation with another unprocessed teacher image as a calculation target.
  • Step S107 The feature amount acquisition unit 22 of the CPU 14 groups the teacher images having the same passage number by the following processes (A1) to (A3), and each feature between two teacher images in the grouped teacher image group. Find the amount of change in quantity.
  • the feature quantity acquisition unit 21 groups the six teacher images having the same cell passage number and different observation periods (from the first day to the sixth day). Although not particularly limited, it is preferable that the teacher images to be grouped are six microscopic images having the same culture container and captured position (field of view).
  • the feature quantity acquisition unit 21 combines two teacher images at different imaging points in the teacher image group grouped in (A1).
  • there are six teacher images in one group there are 15 combinations of two teacher images.
  • the amount of change obtained from one group of teacher images is 450 types (15 feature values ⁇ 2 patterns (average value, standard deviation) ⁇ 15 combinations). Become.
  • the feature amount acquisition unit 21 includes 15 types of change amounts indicating changes in the average value of each feature amount between two teacher images and two teacher images. 15 kinds of change amounts indicating changes in the standard deviation in the image of each feature amount in the meantime are obtained.
  • the model construction unit 22 constructs a deterioration determination model that classifies cells having different degrees of deterioration based on the feature amount obtained in S105 and the change amount of the feature amount obtained in S107.
  • the model construction unit 22 in the first embodiment constructed a model that classifies microscopic images according to the number of passages of cells by a decision tree method (AnswerTree).
  • Step S201 The model construction unit 22 obtains a parameter type (index type) and a parameter value (index value) to be applied when classifying cells having different passage numbers at the root node of the decision tree.
  • the types of the parameters are selected from the feature amounts (180 types) on the first day to the sixth day obtained in S105 and the feature amount change amounts (450 types) obtained in S107.
  • the model construction unit 22 selects a parameter to be calculated from the above 630 types of parameters. At this time, the model construction unit 22 extracts a teacher image group corresponding to the calculation target parameter in advance.
  • the extracted teacher image group includes teacher images having different cell passage numbers.
  • the model construction unit 22 sets a search range (upper limit and lower limit) for the parameter to be calculated, and divides the search range for the parameter to be calculated into a plurality of arbitrary increments.
  • the model construction unit 22 classifies the cells of the teacher image group corresponding to the parameter to be calculated into two sets using each step (parameter value) of the parameter to be calculated as a threshold value. As a result, the classification result of the cells of the teacher image group is obtained at each step of the parameter to be calculated. At this time, the model construction unit 22 obtains the distribution of the number of cells according to the number of passages of cells in each set of classification results.
  • the model construction unit 22 performs the same process for each of the above 630 types of parameters, and acquires the classification result of the teacher image group at each step of each parameter. Then, the model construction unit 22 determines a parameter type (index type) most suitable for classification of cells having different passage numbers and a threshold value (index value) for the parameter among all the classification results.
  • the model construction unit 22 determines a parameter type and an index value that can completely separate cells of any passage number into one set among combinations of parameter types and threshold values. When there are a plurality of combinations that meet the above conditions, the model building unit 22 determines the type and the index value of the above-mentioned index by giving priority to the one that can separate only one cell of any passage number into one set. do it.
  • the model building unit 22 may determine the type of index and the index value in the following manner. For example, although the model construction unit 22 includes two sets of teacher images having the same passage number, one set can extract only one kind of passage number of teacher images, and one set can extract teacher images.
  • the index type and the index value may be determined with priority given to the image having the largest number of images.
  • Step S202 The model construction unit 22 next designates the node to be calculated for obtaining the index type and the index value. For example, the model construction unit 22 designates the left node among the child nodes that branch left and right from the parent node. When the index type and index value have already been obtained in all nodes below the left child node, the model building unit 22 specifies a node that branches from the parent node to the right side.
  • Step S203 The model construction unit 22 determines whether or not the current computation target node is a terminal node that cannot branch further. For example, the model construction unit 22 determines that it is a terminal node when cells of one passage number can be separated at the current computation target node.
  • Step S204 The model construction unit 22 determines whether the calculation is completed. The model construction unit 22 determines that the calculation is completed when the index types and index values have been obtained at all nodes except the terminal node.
  • the model construction unit 22 ends the process of constructing the degradation determination model. Thereby, the process returns to the process of FIG. On the other hand, if the above requirement is not satisfied (NO side), the process proceeds to S205.
  • Step S205 The model construction unit 22 obtains an index type and an index value at the current calculation target node. Note that the processing in S205 is the same as that in S201, and therefore redundant description is omitted. Thereafter, the model construction unit 22 returns to S202 and changes the node to be calculated. Through the loop from S202 to S205, the index type and index value at each node are obtained recursively. This is the end of the description of the subroutine of FIG.
  • Step S109 The model construction unit 22 records the deterioration determination model data constructed in the process of S108 in the storage device 13. Above, description of the flowchart of FIG. 6 is complete
  • FIG. 9 shows an example of the deterioration determination model constructed in the first embodiment.
  • the root node index is “average of the first day after passage (Total area)”, and the root node index value is “716 pixels 2 ” or less.
  • the index of the node A branched to the left from the root node is “average of the long axis on the first day after passage”, and the index value of the node A is “71.6 pixels” or less. Note that all branches from node A are terminal nodes (left: 4th passage, right: 5th passage).
  • the index of the node B branched to the right from the root node is “the average of ellipticity on the first day after the passage”, and the index value of the node B is “3.77” or less. It is.
  • the right branch of this node B becomes a terminal node (passage 8th).
  • the index of the node C branched to the left from the node B is “average area on the fourth day after passage (Total area)”, and the index value of the node C is “793 pixels 2 ” or less. Note that all branches from node C are terminal nodes (left: 6th passage, right: 7th passage).
  • Step S301 The CPU 14 reads data of a plurality of microscope images to be evaluated from the storage device 13.
  • the image to be evaluated is an image obtained by time-lapse observation of cultured cells under the same conditions as those for obtaining the teacher image for one passage.
  • the operation of the degree of cell degradation was verified using 45 images excluding the teacher image among 450 microscope images stored in advance in the storage device 13.
  • Step S302 The CPU 14 reads the data of the deterioration determination model in the storage device 13 (recorded in S109 in FIG. 6).
  • Step S303 The feature amount acquisition unit 21 obtains the feature amount of the image to be evaluated and the change amount of the feature amount by the same processing as S102 to S107 in FIG.
  • Step S304 The evaluation processing unit 23 collates the feature amount of the image of the cultured cell and the change amount of the feature amount (S303) with the deterioration determination model, and classifies the cultured cell included in the evaluation target image. Thereafter, the evaluation processing unit 23 displays the classification result on the monitor 19 or the like. Above, description of FIG. 10 is complete
  • the images to be evaluated include images obtained by time-lapse observation of cultured cells from the 4th to 8th passages.
  • the evaluation processing unit 23 determines whether or not “average area on the first day after passage” is 716 pixels 2 or more in the root node of the deterioration determination model.
  • the index values at the 4th to 5th passages are each 716 pixels 2 or less, so the process proceeds to determination of node A.
  • the index values of the 6th to 8th passages among the evaluation targets are each larger than 716 pixels 2 , the process proceeds to the determination of the node B. Accordingly, the evaluation processing unit 23 can classify the cultured cells at the 4th to 5th passages and the cultured cells at the 6th to 8th passages by determining the root node.
  • the evaluation processing unit 23 determines whether or not “average of major axes on the first day after passage” is 71.6 pixels or less in the node A of the deterioration determination model.
  • the index value at the 4th passage is 71.6 pixels or less, and the index value at the 5th passage is larger than 71.6 pixels, so each belongs to a different node. Therefore, the evaluation processing unit 23 can classify the cultured cell at the 4th passage and the cultured cell at the 5th passage according to the determination of the node A.
  • the evaluation processing unit 23 determines whether or not “average ellipticity on the first day after passage” is 3.77 or less in the node B of the deterioration determination model. Since the index value at the 6th to 7th passages is 3.77 or less, the process proceeds to determination of node C. On the other hand, since the index value at the 8th passage is larger than 3.77, it belongs to another node. Therefore, the evaluation processing unit 23 can classify the cultured cells at the 6th to 7th passages and the cultured cells at the 8th passage according to the determination of the node B.
  • the evaluation processing unit 23 determines whether or not “average area on the fourth day after passage” is equal to or less than 793 pixels 2 in the node C of the deterioration determination model.
  • the index value at the 6th passage is 793 pixels 2 and the index value at the 7th passage is larger than 793 pixels 2 , so each of them belongs to a different node. Therefore, the evaluation processing unit 23 can classify the cultured cell at the sixth passage and the cultured cell at the seventh passage according to the determination of the node C.
  • the evaluation processing unit 23 executes the above-described cell deterioration degree evaluation process using an image group obtained by time-lapse observation of cultured cells of any passage number. But of course it does n’t matter.
  • FIG. 11 shows an example of evaluating the degree of deterioration of the cryopreserved cultured cells using the deterioration discrimination model of FIG.
  • the cultured cells used in the above experimental examples of FIGS. 2 to 10 were separated and stored frozen at the time of passage. Then, each frozen cell from the first generation to the tenth generation was thawed, and time-lapse observation was performed under the same conditions as in the above experimental example to obtain an image to be evaluated.
  • a cell cryopreserved in the nth passage is denoted as “PnC”.
  • the cultured cell evaluation apparatus collates the index of the deterioration determination model constructed by supervised learning with the feature amount at each observation time of the cells obtained from the evaluation target image. Then classify the cells of the image to be evaluated. Therefore, in the first embodiment, the degree of cell degradation can be evaluated easily and accurately from the image alone, and the work of evaluating the degree of cell degradation can be greatly saved.
  • the cultured cell evaluation apparatus of the first embodiment can be used as an evaluation target, it is extremely useful in a process for evaluating cells cultured for pharmaceutical screening or regenerative medicine, for example.
  • the information on the degree of cell degradation obtained in the first embodiment can be applied as means for detecting abnormalities in cultured cells and as means for engineeringly managing the quality of cultured cells.
  • Second Embodiment an example of heterogeneous cell classification evaluation by a cultured cell evaluation apparatus will be described.
  • a classification example of keratinocytes (NHEK) and fibroblasts (NHDF) will be described.
  • the second embodiment is a modification of the first embodiment, and the apparatus configuration is the same as that of the first embodiment.
  • a plurality of culture vessels (6-well plates) in which keratinocytes and fibroblasts were mixed and seeded were prepared.
  • images were continuously acquired every 8 hours from 0 hour to 56 hours.
  • Cell culture and image acquisition were performed by BioStation CT of Nikon Corporation.
  • the observation magnification was 4 times the objective lens, the number of fields of view in one well was 5, and the resolution of the image was set to about 1 million pixels.
  • 19 types of feature quantities are obtained for each sample. Then, using all of the 19 types of feature amounts, a polynomial (discriminant) defining a boundary line that best separates the two groups of cells was obtained.
  • the 19 types of feature values are measured using “relative hole area (hole area / total area value)” and “Pixel area (number of elements present in the cell). Cell area), “Area (area of the cell measured in a unit configured regardless of the number of elements)”, “Orientation (angle between the long axis of the cell and the horizontal axis)” Features are included.
  • the normal distance (Z value) from the boundary line in each sample can be acquired.
  • FIGS. 13A to 13D are histograms obtained by discriminating and classifying cell images (samples) at each observation period from 0h to 24h.
  • (a) to (d) in FIG. 14 are histograms obtained by discriminating and classifying cell images at each observation period from 32h to 56h.
  • Each of FIGS. 13 and 14 shows the frequency distribution of the Z value of the keratinocyte sample and the Z value of the fibroblast sample at each observation period.
  • the vertical axis of FIGS. 13 and 14 indicates the number of samples, and the horizontal axis of FIGS. 13 and 14 indicates the magnitude of the Z value.
  • the histogram of keratinocytes is indicated by a solid line
  • what is necessary is just to obtain
  • classification evaluation of heterogeneous cells was performed using an image of a sample after 24 hours of culture.
  • the cultured cell evaluation apparatus constructed a classification model for different types of cells using an algorithm that was almost the same as the degradation discrimination model construction process (FIGS. 6 and 8) in the first embodiment.
  • FIG. 15 is a diagram showing an example of a heterogeneous cell classification model constructed in the second embodiment.
  • each node in FIG. 15 represents an index type and an index value.
  • a terminal node denoted as “NHEK” indicates a branch on the keratinocyte side
  • a terminal node denoted as “NHDF” indicates a branch on the fibroblast side.
  • the fraction in the terminal node the number on the left indicates the number of NHEKs separated at the node, and the number on the right indicates the number of NHDFs separated at the node.
  • the heterogeneous cell classification model shown in FIG. 15 it is understood that keratinocytes and fibroblasts can be separated by the evaluation process by the cultured cell evaluation apparatus.
  • FIG. 16 is a schematic front view of an incubator according to the third embodiment.
  • FIG. 17 is a block diagram of an incubator according to the third embodiment.
  • the incubator 111 includes an upper casing 112 and a lower casing 113.
  • the upper casing 112 is placed on the lower casing 113.
  • the internal space between the upper casing 112 and the lower casing 113 is vertically divided by a base plate 114.
  • a door for carrying in / out the culture vessel 119 and equipment is provided on the front surface of the incubator 111 (FIG. 16 shows the door opened and the illustration of the door is omitted for the sake of simplicity). ).
  • a temperature-controlled room 115 for culturing cells is formed inside the upper casing 112.
  • the temperature-controlled room 115 is provided with a temperature adjusting device 115a, a humidity adjusting device 115b, and a temperature / humidity sensor 115c.
  • the temperature-controlled room 115 has an environment suitable for cell culture (for example, an atmosphere having a temperature of 37 ° C. and a humidity of 90%). (In FIG. 16, the temperature adjustment device 115a, the humidity adjustment device 115b, and the temperature / humidity sensor 115c are not shown).
  • a stocker 116 In addition, in the temperature-controlled room 115, a stocker 116, a microscope unit 117, and a container transport device 118 are arranged.
  • the stocker 116 is disposed on the left side (left side in FIG. 16) of the temperature-controlled room 115 when viewed from the front of the upper casing 112.
  • the stocker 116 has a plurality of shelves, and each shelf can store a plurality of culture vessels 119.
  • Each culture container 119 contains cells together with the medium.
  • the microscope unit 117 is disposed on the right side of the temperature-controlled room 15 (the right side in FIG. 16) when viewed from the front of the upper casing 112. In this microscope unit 117, time-lapse observation of the cells in the culture vessel 119 can be executed.
  • the microscope unit 117 is installed by being fitted into the opening of the base plate 114 of the upper casing 112.
  • the microscope unit 117 includes a sample stage 121, a stand arm 122 projecting above the sample stage 121, and a main body 123.
  • the sample stage 121 and the stand arm 122 are disposed in the temperature-controlled room 115, while the main body 123 is accommodated in the lower casing 113. With this configuration, it becomes possible to observe cells in the culture vessel 119 with the microscope unit 117 without changing the environmental conditions.
  • the sample stage 121 is made of a translucent material, and the culture vessel 119 can be placed on the upper surface of the sample stage 121. Moreover, the sample stage 121 is configured to be movable in the horizontal direction, and the position of the culture vessel 119 placed on the upper surface can be adjusted.
  • the container transport device 118 is disposed in the center of the temperature-controlled room 115 when viewed from the front of the upper casing 112.
  • the container transport device 118 is configured by further attaching an arm for holding the culture container 119 to a vertical robot having an articulated arm.
  • the container transport device 118 delivers the culture container 119 between the stocker 116 and the sample stage 121.
  • a control device 124 is accommodated in the lower casing 113.
  • the control device 124 is connected to the temperature adjustment device 115a, the humidity adjustment device 115b, the temperature / humidity sensor 115c, the microscope unit 117, and the container transport device 118, respectively, and performs overall control of the incubator 111.
  • control device 124 incorporates the cultured cell evaluation device of the above embodiment, and evaluates the cultured cells using the image captured by the microscope unit 117 as a processing target. According to the incubator of the third embodiment, it is possible to perform the evaluation based on the classification of the cultured cells by the same method as that of the first embodiment or the second embodiment while performing time-lapse observation of the cultured cells.
  • the cultured cell evaluation apparatus of the above embodiment the example in which the evaluation process of the degree of deterioration of the cultured cell and the classification evaluation of the heterogeneous cells are performed independently has been described.
  • the cultured cell evaluation apparatus of the present invention may be configured to sequentially perform the above two processes on the image to be evaluated. For example, when an image obtained by time-lapse observation of a cell whose cell type and degree of deterioration are both subject to evaluation, the cultured cell evaluation device first estimates the cell type by classification evaluation of different cells, and then In addition, by performing the evaluation process of the degree of deterioration of the cultured cells, it is possible to analyze the unknown cell type and the degree of deterioration.
  • the construction of the discriminant model in the above embodiment is an example, and the discriminant model is constructed by an algorithm such as clustering (hierarchical clustering, k-means clustering) or the basis of self-organizing maps (Self-Organizing) Maps). May be.

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Abstract

　培養細胞評価装置の画像取得部は、培養容器内で培養される対象細胞を時系列に撮像した複数の画像を取得する。特徴量取得部は、画像に含まれる対象細胞の形態的特徴をそれぞれ示す複数種類の特徴量を、各々の画像で求める。記憶部は、評価属性の異なる細胞をクラス分けする判別モデルを記憶する。判別モデルのクラス分けは、複数種類の特徴量および観察時期の組み合わせから選択された指標に基づいて行われる。評価処理部は、判別モデルの指標と、対象細胞の各観察時期での特徴量とを照合し、対象細胞をクラス分けする。

Description

培養細胞評価装置、インキュベータおよびプログラム
　本発明は、培養細胞評価装置、インキュベータおよびプログラムに関する。
　細胞の培養状態を評価する技術は、再生医療などの先端医療分野や医薬品のスクリーニングを含む幅広い分野での基盤技術となっている。例えば、ヒトに投与する薬剤や化粧品の開発等において、ヒト細胞を用いた機能性・毒性の評価試験は重要なプロセスとして認知されている。そして、上記の評価試験では、セルベースアッセイを継続的に行う観点から細胞の品質を安定して担保する手段が要請されている。なお、従来の細胞の品質評価の一例として、マーカーとして転写因子を用いたがん細胞の評価方法が、特許文献１に開示されている。
特開２００７－１９５５３３号公報
　ところで、上記のような評価試験の工程において、細胞の安定性の担保のためだけに膨大な評価を行うことは現実には困難である。そのため、細胞の劣化度合いの評価は、細胞株の継代数や凍結回数などに依拠した経験的で大まかな判断基準によって運用されているのが実情であった。
　また、種類の異なる細胞が混在して培養するケースにおいて、個々の細胞の識別は主に目視によって行われており、上記と同様に評価工程が非常に煩雑となるのが実情であった。
　そこで、本発明の目的は、比較的簡易な手法で評価対象の細胞を評価属性に基づいて評価する手段を提供することにある。
　一の態様の培養細胞評価装置は、画像取得部と、特徴量取得部と、記憶部と、評価処理部とを備える。画像取得部は、培養容器内で培養される対象細胞を時系列に撮像した複数の画像を取得する。特徴量取得部は、画像に含まれる対象細胞の形態的特徴をそれぞれ示す複数種類の特徴量を、各々の画像で求める。記憶部は、評価属性の異なる細胞をクラス分けする判別モデルを記憶する。判別モデルのクラス分けは、複数種類の特徴量および観察時期の組み合わせから選択された指標に基づいて行われる。評価処理部は、判別モデルの指標と、対象細胞の各観察時期での特徴量とを照合し、対象細胞をクラス分けする。
　一の態様の培養細胞評価方法は、評価対象の培養細胞の画像データを取得する画像取得ステップと、選択ステップと、特徴量取得ステップと、評価ステップと、を備える。選択ステップでは、培養細胞を分類するための形態的特徴を示す特徴量の種類および特徴量の種類に対応する閾値を選択する。特徴量取得ステップでは、選択ステップにより選択された種類に相当する特徴量を、画像取得ステップにて取得した画像データから取得する。評価ステップでは、特徴量取得ステップにて取得された培養細胞の特徴量と、選択ステップにて選択された閾値とを用いて培養細胞を評価する。
　なお、上記の培養細胞評価装置を組み込んだインキュベータや、コンピュータを上記の培養細胞評価装置として機能させるプログラムおよびプログラム記憶媒体や、上記の培養細胞評価装置の動作を方法のカテゴリで表現したものも、本発明の具体的態様として有効である。
第１実施形態に係る培養細胞評価装置の構成例を示すブロック図 ヒト繊維芽細胞の継代培養による変化の例を示す図 ４継代目－８継代目の生細胞率の変化の例を示す図 ４継代目－８継代目の老化細胞数の変化の例を示す図 ４継代目－８継代目の１細胞当たりの細胞骨格量の変化の例を示す図 第１実施形態に係る劣化判別モデルの構築処理の動作例の流れ図 （ａ）－（ｏ）：各特徴値の概要を示す図 劣化判別モデルの構築サブルーチンの例を示す流れ図 第１実施形態で構築された劣化判別モデルの例を示す図 第１実施形態に係る細胞の劣化度合い評価処理の例の流れ図 図９の劣化判別モデルを用いて、凍結保存した培養細胞の劣化度合いを評価した例を示す図 第２実施形態における各観察時期（０ｈ－５６ｈ）でのサンプルの画像数を示す表 （ａ）－（ｄ）：０ｈ－２４ｈまでの各観察時期での細胞の画像を判別分析で分類したヒストグラム （ａ）－（ｄ）：３２ｈ－５６ｈまでの各観察時期での細胞の画像を判別分析で分類したヒストグラム 第２実施形態で構築された判別モデルの例を示す図 第３実施形態に係るインキュベータの概要正面図 第３実施形態に係るインキュベータのブロック図
　＜第１実施形態の構成例＞
　図１は、第１実施形態に係る培養細胞評価装置の構成例を示すブロック図である。第１実施形態の培養細胞評価装置は、培養細胞の劣化度合いを評価する評価処理プログラムがインストールされたパーソナルコンピュータで構成される。
　第１実施形態の培養細胞評価装置は、細胞を培養している培養容器をタイムラプス観察して取得した複数の顕微鏡画像（対象画像や教師画像）を外部から読み込む。そして、第１実施形態での培養細胞評価装置は、教師画像を用いた教師付き学習によって、劣化度合いの異なる細胞をクラス分けする劣化判別モデルを構築する。また、第１実施形態での培養細胞評価装置は、上記の劣化判別モデルを適用して対象画像に含まれる細胞の劣化度合いの評価を実行する。
　図１に示すコンピュータ１１は、データ読込部１２、記憶装置１３、ＣＰＵ１４、メモリ１５および入出力Ｉ／Ｆ１６、バス１７を有している。データ読込部１２、記憶装置１３、ＣＰＵ１４、メモリ１５および入出力Ｉ／Ｆ１６は、バス１７を介して相互に接続されている。さらに、コンピュータ１１には、入出力Ｉ／Ｆ１６を介して、入力デバイス１８（キーボード、ポインティングデバイスなど）とモニタ１９とがそれぞれ接続されている。なお、入出力Ｉ／Ｆ１６は、入力デバイス１８からの各種入力を受け付けるとともに、モニタ１９に対して表示用のデータを出力する。
　データ読込部１２は、上記の顕微鏡画像のデータや、上記の評価処理プログラムを外部から読み込むときに用いられる。例えば、データ読込部１２は、着脱可能な記憶媒体からデータを取得する読込デバイス（光ディスク、磁気ディスク、光磁気ディスクの読込装置など）や、公知の通信規格に準拠して外部の装置と通信を行う通信デバイス（ＵＳＢインターフェース、ＬＡＮモジュール、無線ＬＡＮモジュールなど）で構成される。
　記憶装置１３は、例えば、ハードディスクや、不揮発性の半導体メモリなどの記憶媒体で構成される。この記憶装置１３には、評価処理プログラムや、プログラムの実行に必要となる各種のデータ（例えば劣化判別モデルのデータ）が記録されている。なお、記憶装置１３には、データ読込部１２から読み込んだ顕微鏡画像のデータを記憶しておくこともできる。
　ＣＰＵ１４は、コンピュータ１１の各部を統括的に制御するプロセッサである。このＣＰＵ１４は、上記の評価処理プログラムの実行によって、特徴量取得部２１と、モデル構築部２２と、評価処理部２３としてそれぞれ機能する（特徴量取得部２１、モデル構築部２２、評価処理部２３の各動作は後述する）。
　なお、劣化判別モデルの構築処理では、特徴量取得部２１、モデル構築部２２が動作する。また、細胞の劣化度合い評価処理では、特徴量取得部２１、評価処理部２３が動作する。
　メモリ１５は、評価処理プログラムでの各種演算結果を一時的に記憶する。このメモリ１５は、例えば揮発性のＳＤＲＡＭなどで構成される。
　＜第１実施形態の動作例＞
　以下、第１実施形態における培養細胞評価装置での動作を説明する。最初に、第１実施形態で使用される顕微鏡画像について説明する。第１実施形態では、３つのディッシュ（培養容器）でそれぞれヒト繊維芽細胞を継代培養し、４継代目から８継代目まで（５継時分）のタイムラプス観察を行って、位相差顕微鏡による顕微鏡画像を取得した。各培養容器での細胞の継代は全て６日間隔で行われた。なお、９継代目に細胞の増殖が完全に停止した。
　また、上記のタイムラプス観察は、各培養容器の５点観察による顕微鏡画像の撮像を全観察期間にわたって２４時間おきに実行した。なお、第１実施形態の例における顕微鏡画像における観察倍率は４倍であり、かつ画像サイズは１３６０画素×１０２４画素（約１４０万画素）に設定されるものとする。
　第１実施形態での培養細胞評価装置は、上記の条件で取得された４５０枚の顕微鏡画像（３×５視野×６日分×５継時分）をデータ読込部１２から読み込んで取得するものとする。
　なお、第１実施形態の実際の動作例では、上記の４５０枚の顕微鏡画像による交差妥当化で細胞の劣化度合いの予測精度を検証している。具体的には、第１実施形態の例では、４５０枚の顕微鏡画像をランダムに１０個のサンプル群に分割した。そして、９サンプル（４０５枚）を教師画像として劣化判別モデルの構築処理を実行するとともに、残りのサンプル（４５枚）で細胞の劣化度合い評価処理を実行する操作を、サンプルを入れ替えて１０回繰り返した(10-fold cross validation)。
　ここで、ヒト繊維芽細胞の継代培養による変化の例を図２に示す。図２の例では、正常なヒト繊維芽細胞の画像と、４継代目から９継代目のヒト繊維芽細胞の各画像とをそれぞれ示している。図２の各画像を比較すると、ヒト繊維芽細胞は継代数が増えるにつれて細胞が薄く広がる傾向を示しており、継代数に応じてヒト繊維芽細胞の外見には変化が現れることが分かる。
　また、図３－図５は、それぞれ従来の実験法に基づく継代培養によるヒト繊維芽細胞の劣化度合いを示す図である。図３は、４継代目から８継代目までの生細胞率(Calcein/PI)の変化の例を示す図である。図３によれば、継代数が進むにつれて除々に生細胞率が低下してゆくことが分かる。
　図４は、４継代目から８継代目までの老化細胞数(βgalactosidase/DAPI)の変化の例を示す図である。図４によれば、４－６継代目では老化細胞の検出はみられないが、７継代目および８継代目ではそれぞれ老化細胞が検出されている。
　図５は、４継代目から８継代目までの１細胞当たりの細胞骨格量（Phaloidin/DAPI)の変化の例を示す図である。図５によれば、継代数が進むにつれて除々に細胞骨格量が低下してゆくことが分かる。このことは、継代数が進むにつれて細胞内の秩序が低下し、細胞の形態維持が困難となってゆくことを示している。以上、図３－図５によれば、継代数が進むほど細胞の劣化度合いも強くなることが明らかに分かる。
　（劣化判別モデルの構築処理の例）
　以下、図６の流れ図を参照しつつ、劣化判別モデルの構築処理の動作例を説明する。図６の流れ図の処理は、ユーザからの指示に応じてＣＰＵ１４が実行する。
　（ステップＳ１０１）
　ＣＰＵ１４は、教師画像のデータを取得する。なお、第１実施形態でのＣＰＵ１４は、上記のように、記憶装置１３に予め記憶された４５０枚の顕微鏡画像のうち４０５枚の画像を教師画像として設定する。
　（ステップＳ１０２）
　ＣＰＵ１４は、複数の教師画像のうちから、演算対象の画像を指定する。なお、Ｓ１０２でのＣＰＵ１４は、教師画像のすべてを演算対象として順次指定してゆくものとする。
　（ステップＳ１０３）
　特徴量取得部２１は、演算対象の教師画像（Ｓ１０２で指定されたもの）について、画像内に含まれる細胞をそれぞれ抽出する。例えば、位相差顕微鏡で細胞を撮像すると、細胞壁のように位相差の変化の大きな部位の周辺にはハロが現れる。そのため、特徴量取得部２１は、細胞壁に対応するハロを公知のエッジ抽出手法で抽出するとともに、輪郭追跡処理によってエッジで囲まれた閉空間を細胞と推定する。これにより上記の顕微鏡画像から個々の細胞を抽出できる。
　（ステップＳ１０４）
　特徴量取得部２１は、Ｓ１０３で画像から抽出した各細胞について、細胞の形態的特徴を示す特徴量をそれぞれ求める。一例として、Ｓ１０４での特徴量取得部２１は、各細胞について以下の１５種類の特徴量をそれぞれ求める。
　・Ｔｏｔａｌ　ａｒｅａ（図７の（ａ）参照）
　「Ｔｏｔａｌ　ａｒｅａ」は、注目する細胞の面積を示す値である。例えば、特徴量取得部２１は、注目する細胞の領域の画素数に基づいて「Ｔｏｔａｌ　ａｒｅａ」の値を求めることができる。
　・Ｈｏｌｅ　ａｒｅａ（図７の（ｂ）参照）
　「Ｈｏｌｅ　ａｒｅａ」は、注目する細胞内のＨｏｌｅの面積を示す値である。ここで、Ｈｏｌｅは、コントラストによって、細胞内における画像の明るさが閾値以上となる部分（位相差観察では白に近い状態となる箇所）を指す。例えば、細胞内小器官の染色されたリソソームなどがＨｏｌｅとして検出される。また、画像によっては、細胞核や、他の細胞小器官がＨｏｌｅとして検出されうる。なお、特徴量取得部２１は、細胞内における輝度値が閾値以上となる画素のまとまりをＨｏｌｅとして検出し、このＨｏｌｅの画素数に基づいて「Ｈｏｌｅ　ａｒｅａ」の値を求めればよい。
　・Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ（図７（ｃ）参照）
　「Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ」は、注目する細胞の外周の長さを示す値である。例えば、特徴量取得部２１は、細胞を抽出するときの輪郭追跡処理により「Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ」の値を取得することができる。
　・Ｗｉｄｔｈ（図７の（ｄ）参照）
　「Ｗｉｄｔｈ」は、注目する細胞の画像横方向（Ｘ方向）での長さを示す値である。
　・Ｈｅｉｇｈｔ（図７の（ｅ）参照）
　「Ｈｅｉｇｈｔ」は、注目する細胞の画像縦方向（Ｙ方向）での長さを示す値である。
　・Ｌｅｎｇｔｈ（図７の（ｆ）参照）
　「Ｌｅｎｇｔｈ」は、注目する細胞を横切る線のうちの最大値（細胞の全長）を示す値である。
　・Ｂｒｅａｄｔｈ（図７の（ｇ）参照）
　「Ｂｒｅａｄｔｈ」は、「Ｌｅｎｇｔｈ」に直交する線のうちの最大値（細胞の横幅）を示す値である。
　・Ｆｉｂｅｒ　Ｌｅｎｇｔｈ（図７の（ｈ）参照）
　「Ｆｉｂｅｒ　Ｌｅｎｇｔｈ」は、注目する細胞を擬似的に線状と仮定した場合の長さを示す値である。特徴量取得部２１は、下式（１）により「Ｆｉｂｅｒ　Ｌｅｎｇｔｈ」の値を求める。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
但し、本明細書の式中において「Ｐ」はＰｅｒｉｍｅｔｅｒの値を示す。同様に「Ａ」はＴｏｔａｌ　Ａｒｅａの値を示す。
　・Ｆｉｂｅｒ　Ｂｒｅａｄｔｈ（図７の（ｉ）参照）
　「Ｆｉｂｅｒ　Ｂｒｅａｄｔｈ」は、注目する細胞を擬似的に線状と仮定した場合の幅（Ｆｉｂｅｒ　Ｌｅｎｇｔｈと直交する方向の長さ）を示す値である。特徴量取得部２１は、下式（２）により「Ｆｉｂｅｒ　Ｂｒｅａｄｔｈ」の値を求める。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　・Ｓｈａｐｅ　Ｆａｃｔｏｒ（図７の（ｊ）参照）
　「Ｓｈａｐｅ　Ｆａｃｔｏｒ」は、注目する細胞の円形度（細胞の丸さ）を示す値である。特徴量取得部２１は、下式（３）により「Ｓｈａｐｅ　Ｆａｃｔｏｒ」の値を求める。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　・Ｅｌｌｉｐｔｉｃａｌ　ｆｏｒｍ　Ｆａｃｔｏｒ（図７の（ｋ）参照）
　「Ｅｌｌｉｐｔｉｃａｌ　ｆｏｒｍ　Ｆａｃｔｏｒ」は、「Ｌｅｎｇｔｈ」の値を「Ｂｒｅａｄｔｈ」の値で除した値（Ｅｌｌｉｐｔｉｃａｌ　ｆｏｒｍ　Ｆａｃｔｏｒ＝Ｌｅｎｇｔｈ／Ｂｒｅａｄｔｈ）であって、注目する細胞の細長さの度合い（楕円形度）を示すパラメータとなる。
　・Ｉｎｎｅｒ　ｒａｄｉｕｓ（図７の（ｌ）参照）
　「Ｉｎｎｅｒ　ｒａｄｉｕｓ」は、注目する細胞の内接円の半径を示す値である。
　・Ｏｕｔｅｒ　ｒａｄｉｕｓ（図７の（ｍ）参照）
　「Ｏｕｔｅｒ　ｒａｄｉｕｓ」は、注目する細胞の外接円の半径を示す値である。
　・Ｍｅａｎ　ｒａｄｉｕｓ（図７の（ｎ）参照）
　「Ｍｅａｎ　ｒａｄｉｕｓ」は、注目する細胞の輪郭を構成する全点とその重心点との平均距離を示す値である。
　・Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ　ｒａｄｉｕｓ（図７の（ｏ）参照）
　「Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ　ｒａｄｉｕｓ」は、注目する細胞と同面積の円の半径を示す値である。この「Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ　ｒａｄｉｕｓ」のパラメータは、注目する細胞を仮想的に円に近似した場合の大きさを示している。
　ここで、特徴量取得部２１は、細胞に対応する画素数に誤差分を加味して上記の各特徴量を求めてもよい。このとき、特徴量取得部２１は、顕微鏡画像の撮像条件（観察倍率や顕微鏡の光学系の収差など）を考慮して特徴量を求めるようにしてもよい。なお、「Ｉｎｎｅｒ　ｒａｄｉｕｓ」、「Ｏｕｔｅｒ　ｒａｄｉｕｓ」、「Ｍｅａｎ　ｒａｄｉｕｓ」、「Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ　ｒａｄｉｕｓ」を求めるときには、特徴量取得部２１は、公知の重心演算の手法に基づいて各細胞の重心点を求め、この重心点を基準にして各パラメータを求めればよい。
　（ステップＳ１０５）
　特徴量取得部２１は、演算対象の教師画像について、１５種類の特徴量（Ｓ１０４）の画像内平均値および画像内標準偏差をそれぞれ求める。そして、特徴量取得部２１は、上記の各特徴量の画像内平均値および画像内標準偏差をそれぞれ記憶装置１３に記録する。
　これにより、細胞の継代数が同一であって観察時期（１日目－６日目）がいずれも異なる６枚分の教師画像について、各観察時期（６日）においてそれぞれ３０の特徴量（１５種類×２通り（平均値、標準偏差））が求まることとなる。
　（ステップＳ１０６）
　ＣＰＵ１４は、全ての教師画像が処理済み（全ての教師画像で特徴量が取得済みの状態）であるか否かを判定する。上記要件を満たす場合（ＹＥＳ側）には、ＣＰＵ１４はＳ１０７に処理を移行させる。一方、上記要件を満たさない場合（ＮＯ側）には、ＣＰＵ１４はＳ１０２に戻って、未処理の他の教師画像を演算対象として上記動作を繰り返す。
　（ステップＳ１０７）
　ＣＰＵ１４の特徴量取得部２２は、以下の（Ａ１）－（Ａ３）の処理によって、継代数が共通する教師画像をグループ化し、グループ化した教師画像群のうちの２つの教師画像間で各特徴量の変化量を求める。
　（Ａ１）特徴量取得部２１は、細胞の継代数が同一であって観察時期（１日目－６日目）がいずれも異なる６枚分の教師画像をそれぞれグループ化する。特に限定するものではないが、グループ化する教師画像は、培養容器および撮像した位置（視野）が共通する６枚の顕微鏡画像であることが好ましい。
　（Ａ２）特徴量取得部２１は、上記（Ａ１）でグループ化した教師画像群において、撮像時点の異なる２つの教師画像を組み合わせる。ここで、１グループの教師画像は６枚であるので、２つの教師画像の組み合わせは１５通りとなる。また、２つの教師画像の組み合わせは１５通りであるため、１グループの教師画像群から求まる変化量は４５０種類（１５の特徴量×２通り（平均値、標準偏差）×１５通りの組み合わせ）となる。
　（Ａ３）特徴量取得部２１は、上記（Ａ２）の１つの組み合わせごとに、２つの教師画像間における各特徴量の画像内平均値の変化を示す１５種類の変化量と、２つの教師画像間における各特徴量の画像内標準偏差の変化を示す１５種類の変化量とをそれぞれ求める。
　（ステップＳ１０８）
　モデル構築部２２は、Ｓ１０５で求めた特徴量と、Ｓ１０７で求めた特徴量の変化量とに基づいて、劣化度合いの異なる細胞をクラス分けする劣化判別モデルを構築する。第１実施形態でのモデル構築部２２は、決定木法（ＡｎｓｗｅｒＴｒｅｅ）により、細胞の継代回数に応じて顕微鏡画像をクラス分けするモデルを構築した。
　一例として、図８の流れ図を参照しつつ、劣化判別モデルの構築サブルーチンを説明する。
　ステップＳ２０１：モデル構築部２２は、決定木の根ノードにおいて、継代数の異なる細胞を分類するときに適用するパラメータの種類（指標の種類）とそのパラメータの値（指標値）とを求める。なお、上記のパラメータの種類は、Ｓ１０５で求めた１日目－６日目の各特徴量（１８０種類）およびＳ１０７で求めた特徴量の変化量（４５０種類）のうちから選択される。
　以下、上記の指標の種類および指標値の求め方の一例を説明する。まず、モデル構築部２２は、上記の６３０種類のパラメータのうちから演算対象のパラメータを選択する。このとき、モデル構築部２２は、演算対象のパラメータに対応する教師画像群を予め抽出する。なお、抽出された教師画像群には、細胞の継代数の異なる教師画像が含まれる。
　次に、モデル構築部２２は、演算対象のパラメータに探索範囲（上限および下限）を設定するとともに、演算対象のパラメータの探索範囲を任意の刻みで複数に区切る。モデル構築部２２は、演算対象のパラメータの各刻み（パラメータの値）を閾値として、演算対象のパラメータに対応する教師画像群の細胞を２つの集合に分類する。これにより、演算対象のパラメータの各刻みにおいて、教師画像群の細胞の分類結果がそれぞれ得られる。このとき、モデル構築部２２は、分類結果の各集合において、細胞の継代数に応じた細胞の数の分布をそれぞれ求めておく。
　モデル構築部２２は、上記の６３０種類の全パラメータでそれぞれ同様の処理を行い、各パラメータの個々の刻みにおける教師画像群の分類結果を取得する。そして、モデル構築部２２は、全ての分類結果のうちから、継代数の異なる細胞の分類に最も適したパラメータの種類（指標の種類）およびそのパラメータでの閾値（指標値）を決定する。
　一例として、モデル構築部２２は、パラメータの種類および閾値の組み合わせのうち、任意の継代数の細胞を一方の集合に完全に分離できるものを、指標の種類および指標値に決定する。上記条件に該当する組み合わせが複数ある場合、モデル構築部２２は、１種類分の任意の継代数の細胞のみを一方の集合に分離できるものを優先して上記の指標の種類および指標値を決定すればよい。
　また、上記条件に該当する組み合わせがない場合、モデル構築部２２は、以下の要領で指標の種類および指標値を決定してもよい。例えば、モデル構築部２２は、２つの集合に同じ継代数の教師画像が含まれるが、一方の集合は１種類分の継代数の教師画像のみを抽出でき、かつ、一方の集合で抽出できる教師画像の数が最も多くなるものを優先して上記の指標の種類および指標値を決定すればよい。
　ステップＳ２０２：モデル構築部２２は、次に指標の種類および指標値を求める演算対象のノードを指定する。例えば、モデル構築部２２は、親ノードから左右に分岐する子ノードのうち左側のノードを指定する。なお、左側の子ノードよりも下層の全ノードで既に指標の種類および指標値が求められている場合、モデル構築部２２は、親ノードから右側に分岐するノードを指定する。
　ステップＳ２０３：モデル構築部２２は、現在の演算対象のノードがそれ以上に分岐できないターミナルノードであるか否かを判定する。例えば、モデル構築部２２は、現在の演算対象のノードで１種類分の継代数の細胞が分離できている場合、ターミナルノードであると判定する。
　ターミナルノードであると判定された場合（ＹＥＳ側）にはＳ２０４に処理が移行する。一方、ターミナルノードではないと判定された場合（ＮＯ側）にはＳ２０５に処理が移行する。
　ステップＳ２０４：モデル構築部２２は、演算が完了したか否かを判定する。なお、モデル構築部２２は、ターミナルノードを除くすべてのノードで指標の種類および指標値を求め終えた場合に演算が完了したものと判定する。
　上記要件を満たす場合（ＹＥＳ側）には、モデル構築部２２は劣化判別モデルの構築処理を終了する。これにより、図６の処理に復帰する。一方、上記要件を満たさない場合（ＮＯ側）にはＳ２０５に処理が移行する。
　ステップＳ２０５：モデル構築部２２は、現在の演算対象のノードにおいて、指標の種類および指標値を求める。なお、Ｓ２０５での処理は、Ｓ２０１と同様であるので重複説明を省略する。その後、モデル構築部２２は、Ｓ２０２に戻って演算対象のノードを変更する。Ｓ２０２からＳ２０５のループにより、各ノードでの指標の種類および指標値が再帰的に求められる。以上で、図８のサブルーチンの説明を終了する。
　（ステップＳ１０９）
　モデル構築部２２は、Ｓ１０８の処理で構築された劣化判別モデルのデータを記憶装置１３に記録する。以上で、図６の流れ図の説明を終了する。
　また、第１実施形態で構築された劣化判別モデルの例を図９に示す。第１実施形態の劣化判別モデルにおいて、根ノードの指標は「継代後１日目の面積（Ｔｏｔａｌ　ａｒｅａ）の平均」であり、根ノードの指標値は「７１６ｐｉｘｅｌｓ２」以下か否かである。根ノードから左に分岐したノードＡの指標は「継代後１日目の長軸（Ｌｅｎｇｔｈ）の平均」であり、ノードＡの指標値は「７１．６ｐｉｘｅｌｓ」以下か否かである。なお、ノードＡからの分岐はいずれもターミナルノード（左：継代４回目、右：継代５回目）となる。
　一方、根ノードから右に分岐したノードＢの指標は「継代後１日目の楕円形度（Ｅｌｌｉｐｔｉｃａｌ　ｆｏｒｍ　Ｆａｃｔｏｒ）の平均」であり、ノードＢの指標値は「３．７７」以下か否かである。このノードＢの右側の分岐はターミナルノード（継代８回目）となる。また、ノードＢから左側に分岐したノードＣの指標は「継代後４日目の面積（Ｔｏｔａｌ　ａｒｅａ）の平均」であり、ノードＣの指標値は「７９３ｐｉｘｅｌｓ２」以下か否かである。なお、ノードＣからの分岐はいずれもターミナルノード（左：継代６回目、右：継代７回目）となる。
　（細胞の劣化度合い評価処理の例）
　次に、図１０の流れ図を参照しつつ、細胞の劣化度合い評価処理の例を説明する。
　ステップＳ３０１：ＣＰＵ１４は、評価対象となる複数の顕微鏡画像のデータを記憶装置１３から読み込む。ここで、評価対象の画像は、上記の１継代分の教師画像を取得するときと同じ条件で培養細胞をタイムラプス観察して取得した画像である。なお、第１実施形態の例では、記憶装置１３に予め記憶された４５０枚の顕微鏡画像のうち、教師画像を除いた４５枚の画像を用いて細胞の劣化度合いの動作を検証した。
　ステップＳ３０２：ＣＰＵ１４は、記憶装置１３の劣化判別モデルのデータ（図６のＳ１０９で記録されたもの）を読み込む。
　ステップＳ３０３：特徴量取得部２１は、図６のＳ１０２からＳ１０７までと同様の処理により、評価対象の画像の特徴量および特徴量の変化量を求める。
　ステップＳ３０４：評価処理部２３は、培養細胞の画像の特徴量および特徴量の変化量（Ｓ３０３）を劣化判別モデルに照合して、評価対象の画像に含まれる培養細胞をクラス分けする。その後、評価処理部２３は、クラス分けの結果をモニタ１９などに表示する。以上で、図１０の説明を終了する。
　以下、再び図９を参照しつつ、上記のＳ３０４での処理の例を詳細に説明する。上記の評価対象の画像は、４継代目から８継代目までの培養細胞をそれぞれタイムラプス観察して得た画像が含まれている。
　まず、評価処理部２３は、劣化判別モデルの根ノードにおいて、「継代後１日目の面積の平均」が７１６ｐｉｘｅｌｓ２以上か否かを判定する。評価対象のうちで４－５継代目の指標値はそれぞれ７１６ｐｉｘｅｌｓ２以下であったので、ノードＡの判定に移行する。一方、評価対象のうちで６－８継代目の指標値はそれぞれ７１６ｐｉｘｅｌｓ２より大きいので、ノードＢの判定に移行する。これにより、評価処理部２３は、根ノードの判定により４－５継代目の培養細胞と、６－８継代目の培養細胞とをクラス分けできる。
　また、評価処理部２３は、劣化判別モデルのノードＡにおいて、「継代後１日目の長軸の平均」が７１．６ｐｉｘｅｌｓ以下か否かを判定する。４継代目の指標値は７１．６ｐｉｘｅｌｓ以下であり、５継代目の指標値は７１．６ｐｉｘｅｌｓよりも大きいので、それぞれが別のノードに属することとなる。よって、評価処理部２３は、ノードＡの判定により４継代目の培養細胞と５継代目の培養細胞とをクラス分けできる。
　また、評価処理部２３は、劣化判別モデルのノードＢにおいて、「継代後１日目の楕円形度の平均」が３．７７以下か否かを判定する。６－７継代目の指標値は３．７７以下であったので、ノードＣの判定に移行する。一方、８継代目の指標値は３．７７よりも大きいので、別のノードに属することとなる。よって、評価処理部２３は、ノードＢの判定により６－７継代目の培養細胞と、８継代目の培養細胞とをクラス分けできる。
　また、評価処理部２３は、劣化判別モデルのノードＣにおいて、「継代後４日目の面積の平均」が７９３ｐｉｘｅｌ２以下か否かを判定する。６継代目の指標値は７９３ｐｉｘｅｌｓ２であり、７継代目の指標値は７９３ｐｉｘｅｌｓ２よりも大きいので、それぞれが別のノードに属することとなる。よって、評価処理部２３は、ノードＣの判定により６継代目の培養細胞と７継代目の培養細胞とをクラス分けできる。
　なお、図９の例に限定されることなく、評価処理部２３は、任意の継代数の培養細胞をタイムラプス観察して得た画像群を用いて、上記の細胞の劣化度合い評価処理を実行しても勿論かまわない。
　また、図１１は、図９の劣化判別モデルを用いて、凍結保存した培養細胞の劣化度合いを評価した例を示す。図１１の例では、上記の図２－図１０の実験例で用いた培養細胞を継代時に取り分けて凍結保存した。そして、１代目から１０代目までの各凍結細胞を解凍し、上記の実験例と同じ条件でタイムラプス観察を行って評価対象の画像を得た。なお、図１１では、ｎ回目の継代で凍結保存した細胞を「ＰｎＣ」と表記する。
　図１１の例において、比較的少ない継代数で凍結された細胞（Ｐ１Ｃ－Ｐ３Ｃ）でも、継代４－７回目の各クラスに属する細胞が発生する。このことから、凍結保存後に解凍された細胞には、凍結保存のダメージによる劣化が認められる。また、図１１の例において、Ｐ４Ｃ－Ｐ１０Ｃの細胞はいずれも継代６－８回目のクラスに属する比率が高くなる。したがって、Ｐ４Ｃ以降の細胞では、凍結保存のダメージがより重大であることが分かる。
　以上のように、第１実施形態の培養細胞評価装置は、教師付き学習で構築された劣化判別モデルの指標と、評価対象の画像から得た細胞の各観察時期での特徴量とを照合して、評価対象の画像の細胞をクラス分けする。したがって、第１実施形態では、細胞の劣化度合いを画像のみから簡単かつ精度よく評価でき、細胞の劣化度合いの評価作業を大幅に省力化できる。
　また、第１実施形態の培養細胞評価装置は、ありのままの細胞を評価対象にできるので、例えば医薬品のスクリーニングや再生医療の用途で培養される細胞を評価するプロセスで極めて有用である。なお、第１実施形態で求めた細胞の劣化度合いの情報は、培養細胞の異常検出の手段や、培養細胞の品質を工学的に管理するときの手段として適用できる。
　＜第２実施形態の説明＞
　次に、第２実施形態として、培養細胞評価装置による異種細胞の分類評価の例を説明する。第２実施形態では、角化細胞（ＮＨＥＫ）と繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）との分類例を説明する。なお、第２実施形態は上記第１実施形態の変形例であって、装置構成は第１実施形態と共通するので重複説明は省略する。
　第２実施形態では、角化細胞および線維芽細胞を混在させて播種した培養容器（６－ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ）を複数準備した。そして、各々の培養容器において、０時間目から５６時間目まで８時間おきに継続的に画像取得を行った。なお、細胞の培養および画像の取得は株式会社ニコンのＢｉｏＳｔａｔｉｏｎＣＴによって行った。上記の観察において、観察倍率は対物レンズ４倍とし、１ｗｅｌｌ中の視野数は５点とし、画像の解像度は約１００万画素に設定した。
　そして、複数の培養容器から得た顕微鏡画像群から、それぞれ１００％状態の角化細胞の部分画像および繊維芽細胞の部分画像を抽出した。これにより、１画像につき１細胞が含まれるサンプルが生成される。なお、第２実施形態における各観察時期（０ｈ－５６ｈ）でのサンプルの画像数を図１２に示す。
　ここで、第２実施形態では、判別モデルを構築するときの前処理として、細胞の分類が容易となる観察時期を以下の判別分析の手法により求めた。
　上記の判別分析では、各観察時期において、ランダムに抽出した角化細胞および繊維芽細胞のサンプルをそれぞれ同数ずつ合計約１６０００個用いた。また、角化細胞の各サンプルには教師値として－１のラベルを付与し、繊維芽細胞の各サンプルには教師値として＋１のラベルを付与した。
　また、判別分析では、各サンプルについて１９種類の特徴量を求める。そして、この１９種類の特徴量をすべて用いて、２群の細胞を最もよく分離する境界線を規定する多項式（判別式）を求めた。なお、１９種類の特徴量は、図７に示す１５種類の特徴量に加えて、「Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｈｏｌｅ　ａｒｅａ（ｈｏｌｅ　ａｒｅａ／ｔｏｔａｌ　ａｒｅａの値）」、「Ｐｉｘｅｌ　ａｒｅａ（細胞内に存在する素子数で測定した細胞の面積）」、「Ａｒｅａ（素子数によらずに構成された単位で測定した細胞の面積）」、「Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ（細胞の長軸と水平軸との間の角度）」の４種類の特徴量が含まれる。
　上記の判別式に各サンプルの特徴量をそれぞれ代入すると、各サンプルにおける境界線からの法線距離（Ｚ値）がそれぞれ取得できる。
　図１３の（ａ）－（ｄ）は、０ｈから２４ｈの各観察時期での細胞の画像（サンプル）を判別分析して分類したヒストグラムである。同様に、図１４の（ａ）－（ｄ）は、３２ｈから５６ｈの各観察時期での細胞の画像を判別分析して分類したヒストグラムである。
図１３、図１４の各図は、各観察時期において、角化細胞のサンプルのＺ値と、繊維芽細胞のサンプルのＺ値との度数分布をそれぞれ示したものである。図１３、図１４の縦軸はサンプルの個数を示し、図１３、図１４の横軸はＺ値の大きさを示す。また、図１３、図１４において角化細胞のヒストグラムは実線で示し、図１３、図１４において繊維芽細胞のヒストグラムは破線で示す。なお、図１３、図１４の横軸の刻みは、公知のシャリエの式を用いて求めればよい。
　上記の図１３、図１４の各ヒストグラムを比較すると、培養１６時間目に繊維芽細胞の度数分布は単一の山を形成し、その後の度数分布は大きく変化しない。よって、角化細胞および繊維芽細胞について、１６時間目以降の観察結果には集団としての特徴が現れることが分かる。
　以上の知見から、第２実施形態の例では、培養２４時間目のサンプルの画像を用いて、異種細胞の分類評価を行った。具体的には、培養細胞評価装置は、第１実施形態における劣化判別モデルの構築処理（図６、図８）とほぼ同様のアルゴリズムにより、異種細胞の分類モデルを構築した。
　図１５は、第２実施形態で構築された異種細胞の分類モデルの例を示す図である。なお、図１５の各ノードには指標の種類および指標値をそれぞれ表記する。また、「ＮＨＥＫ」と表記されたターミナルノードは角化細胞側の分岐を示し、「ＮＨＤＦ」と表記されたターミナルノードは繊維芽細胞側の分岐を示す。なお、ターミナルノードにおける分数は、左側の数字がそのノードで分離されたＮＨＥＫの数を示し、右側の数字がそのノードで分離されたＮＨＤＦの数を示している。この図１５に示す異種細胞の分類モデルによれば、培養細胞評価装置による評価処理で、角化細胞および繊維芽細胞の分離が可能であることが分かる。
　＜第３実施形態の説明＞
　次に、第３実施形態として、第１実施形態および第２実施形態の培養細胞評価装置を組み込んだインキュベータ（細胞培養装置）の構成例を説明する。図１６は、第３実施形態に係るインキュベータの概要正面図である。また、図１７は、第３実施形態に係るインキュベータのブロック図である。
　第３実施形態のインキュベータ１１１は、上部ケーシング１１２と下部ケーシング１１３とを有している。図１６に示すインキュベータ１１１の組立状態において、上部ケーシング１１２は下部ケーシング１１３の上に載置されている。なお、上部ケーシング１１２と下部ケーシング１１３との内部空間は、ベースプレート１１４によって上下に仕切られている。また、インキュベータ１１１の正面には、培養容器１１９や機材を搬出入するための扉が設けられている（図１６では扉が開放された状態を示すとともに、簡単のために扉の図示は省略する）。
　上部ケーシング１１２の内部には、細胞の培養を行う恒温室１１５が形成されている。この恒温室１１５には温度調整装置１１５ａ、湿度調整装置１１５ｂおよび温度・湿度センサ１１５ｃが配置されており、恒温室１１５内は細胞の培養に適した環境（例えば温度３７℃、湿度９０％の雰囲気）に維持されている（なお、図１６では温度調整装置１１５ａ、湿度調整装置１１５ｂ、温度・湿度センサ１１５ｃの図示は省略する）。
　また、恒温室１１５には、ストッカー１１６、顕微鏡ユニット１１７、容器搬送装置１１８が配置されている。
　ストッカー１１６は、上部ケーシング１１２の正面からみて恒温室１１５の左側（図１６の左側）に配置される。ストッカー１１６は複数の棚を有しており、各々の棚には培養容器１１９を複数収納することができる。そして、各々の培養容器１１９には細胞が培地とともに収容されている。
　顕微鏡ユニット１１７は、上部ケーシング１１２の正面からみて恒温室１５の右側（図１６の右側）に配置される。この顕微鏡ユニット１１７では、培養容器１１９の細胞のタイムラプス観察を実行することができる。
　この顕微鏡ユニット１１７は、上部ケーシング１１２のベースプレート１１４の開口部に嵌め込まれて設置される。顕微鏡ユニット１１７は、試料台１２１と、試料台１２１の上方に張り出したスタンドアーム１２２と、本体部１２３とを有している。試料台１２１およびスタンドアーム１２２は恒温室１１５に配置される一方で、本体部１２３は下部ケーシング１１３に収納される。かかる構成により、環境条件を変化させずに顕微鏡ユニット１１７で培養容器１１９内の細胞の観察を行うことが可能となる。
　試料台１２１は透光性の材質で構成されており、試料台１２１の上面には培養容器１１９を載置できる。また、試料台１２１は水平方向へ移動可能に構成されており、上面に載置した培養容器１１９の位置を調整することができる。
　容器搬送装置１１８は、上部ケーシング１１２の正面からみて恒温室１１５の中央に配置される。容器搬送装置１１８は、多関節アームをもつ垂直ロボットに、培養容器１１９を挟持するアームをさらに取り付けて構成されている。この容器搬送装置１１８は、ストッカー１１６、試料台１２１との間で培養容器１１９の受け渡しを行う。
　さらに、下部ケーシング１１３には、制御装置１２４が収納されている。この制御装置１２４は、温度調整装置１１５ａ、湿度調整装置１１５ｂ、温度・湿度センサ１１５ｃ、顕微鏡ユニット１１７、容器搬送装置１１８にそれぞれ接続されており、インキュベータ１１１の統括的な制御を行う。
　また、制御装置１２４は、上記実施形態の培養細胞評価装置を内蔵しており、顕微鏡ユニット１１７の撮像した画像を処理対象として、培養細胞の評価を行う。この第３実施形態のインキュベータによれば、培養細胞のタイムラプス観察を行いつつ、第１実施形態または第２実施形態と同様の手法で培養細胞のクラス分けによる評価を行うことができる。
　＜実施形態の補足事項＞
　（１）上記実施形態の培養細胞評価装置では、培養細胞の劣化度合いの評価処理と、異種細胞の分類評価とをそれぞれ独立して行う例を説明した。しかし、本発明の培養細胞評価装置は、評価対象の画像に対して上記の２つの処理を順次行う構成であってもよい。例えば、細胞の種類および劣化度合いがいずれも未知の細胞をタイムラプス観察して得た画像を評価対象とした場合、まず、培養細胞評価装置が異種細胞の分類評価によって細胞の種類を推定し、その後に培養細胞の劣化度合いの評価処理を行うことで、未知の細胞の種類および劣化度合いを分析することが可能となる。
　（２）上記実施形態に示した特徴量および判別モデルの内容はあくまで一例にすぎず、評価対象の細胞の種類や評価項目などに応じて適宜変更することが可能である。
　（３）上記の第２実施形態では、角化細胞と繊維芽細胞との分類の例を説明したが、異なる細胞についても本発明を適用できることはいうまでもない。例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）と、分化誘導された細胞との分類を行う場合には、細胞の分化誘導の度合いの評価に用いることも可能となる。
　（４）上記実施形態の培養細胞評価装置では、特徴量取得部２１と、モデル構築部２２と、評価処理部２３の各機能をプログラムでソフトウェア的に実現する例を説明したが、これらの処理をＡＳＩＣによってハードウエア的に実現しても勿論かまわない。
　（５）上記実施形態の判別モデルの構築は一例であって、クラスタリング(階層的クラスタリング、k-meansクラスタリング)、自己組織化マップ(Self-Organizing Maps)の基礎、などのアルゴリズムで判別モデルを構築してもよい。
　以上の詳細な説明により、実施形態の特徴点および利点は明らかになるであろう。これは、特許請求の範囲が、その精神および権利範囲を逸脱しない範囲で前述のような実施形態の特徴点および利点にまで及ぶことを意図するものである。また、当該技術分野において通常の知識を有する者であれば、あらゆる改良および変更に容易に想到できるはずであり、発明性を有する実施形態の範囲を前述したものに限定する意図はなく、実施形態に開示された範囲に含まれる適当な改良物および均等物によることも可能である。
１１…コンピュータ、１２…データ読込部、１３…記憶装置、１４…ＣＰＵ、２１…特徴量取得部、２２…モデル構築部、２３…評価処理部、１１１…インキュベータ、１２４…制御装置

Claims (11)

  1. 　培養容器内で培養される対象細胞を時系列に撮像した複数の画像を取得する画像取得部と、
    　前記画像に含まれる前記対象細胞の形態的特徴をそれぞれ示す複数種類の特徴量を、各々の前記画像で求める特徴量取得部と、
    　複数種類の前記特徴量および観察時期の組み合わせから選択された指標に基づいて評価属性の異なる細胞をクラス分けする判別モデルを記憶する記憶部と、
    　前記判別モデルの前記指標と、前記対象細胞の各観察時期での前記特徴量とを照合し、前記対象細胞をクラス分けする評価処理部と、
    を備える培養細胞評価装置。
  2. 　請求項１に記載の培養細胞評価装置において、
    　前記判別モデルは、同種類の細胞の劣化度合いを細胞の継代回数相当でクラス分けするモデルである培養細胞評価装置。
  3. 　請求項２に記載の培養細胞評価装置において、
    　前記判別モデルは、それぞれ継代回数の異なる細胞を時系列に撮像して取得した複数組の教師画像群を用いる教師付き学習で構築される培養細胞評価装置。
  4. 　請求項１に記載の培養細胞評価装置において、
    　前記判別モデルは、異なる種類の細胞をクラス分けするモデルである培養細胞評価装置。
  5. 　請求項４に記載の培養細胞評価装置において、
    　前記判別モデルは、細胞を時系列に撮像して取得した複数組の教師画像群のうちから異なる種類の細胞をそれぞれ抽出して行った教師付き学習で構築される培養細胞評価装置。
  6. 　細胞を培養する培養容器を収納するとともに、所定の環境条件に内部を維持可能な恒温室と、
    　前記恒温室内で前記培養容器に含まれる前記細胞の画像を撮像する撮像装置と、
    　請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の培養細胞評価装置と、
    　を備えるインキュベータ。
  7. 　コンピュータを、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の培養細胞評価装置として機能させるプログラム。
  8. 　評価対象の培養細胞の画像データを取得する画像取得ステップと、
    　前記培養細胞を分類するための形態的特徴を示す特徴量の種類および前記特徴量の種類に対応する閾値を選択する選択ステップと、
    　前記選択ステップにより選択された前記種類に相当する前記特徴量を、前記画像取得ステップにて取得した前記画像データから取得する特徴量取得ステップと、
    　前記特徴量取得ステップにて取得された前記培養細胞の特徴量と、前記選択ステップにて選択された前記閾値とを用いて前記培養細胞を評価する評価ステップと、を備える培養細胞の評価方法。
  9. 　請求項８に記載の培養細胞の評価方法において、
    　前記評価ステップでは、前記培養細胞を継代数の異なる細胞に分類する培養細胞の評価方法。
  10. 　請求項８または請求項９に記載の培養細胞の評価方法において、
    　前記選択ステップでは、記憶装置に複数記憶された前記特徴量の種類および前記閾値の組み合わせのうちから、前記特徴量の種類および前記閾値を選択する培養細胞の評価方法。
  11. 　請求項８から請求項１０のいずれか１項に記載の培養細胞の評価方法において、
    　複数の培養細胞から教師画像データを取得する教師画像取得ステップと、
    　前記複数の教師画像データから複数種類の前記特徴量を取得するステップと、
    　前記教師画像データを前記特徴量の種類および前記特徴量の閾値に分類する画像分類ステップと、をさらに備え、
    　前記選択ステップでは、前記画像分類ステップにて分類された結果に基づき、前記培養細胞の評価に適した前記特徴量および前記特徴量の閾値の組合せを選択する培養細胞の評価方法。
     
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