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WO2011058284A1 - Preparation d'un concentre de facteur h - Google Patents

Preparation d'un concentre de facteur h Download PDF

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Publication number
WO2011058284A1
WO2011058284A1 PCT/FR2010/052424 FR2010052424W WO2011058284A1 WO 2011058284 A1 WO2011058284 A1 WO 2011058284A1 FR 2010052424 W FR2010052424 W FR 2010052424W WO 2011058284 A1 WO2011058284 A1 WO 2011058284A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
factor
arginine
concentration
salts
fraction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2010/052424
Other languages
English (en)
Inventor
Cornelius Pompe
Annie Bardat
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
LFB SA
Original Assignee
LFB SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by LFB SA filed Critical LFB SA
Publication of WO2011058284A1 publication Critical patent/WO2011058284A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/472—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to the preparation of concentrated H-factor formulations for therapeutic use.
  • Complement plays a vital role in the defense of the body against infectious agents and in the inflammatory process. It represents an auxiliary system of immunity, in particular of the humoral response and the innate response.
  • the complement comprises a set of approximately 30 plasma and sometimes membrane proteins, synthesized essentially by the liver and macrophages and which can be activated by proteolytic cascades. It includes both plasma proteins, many different cell surface receptors, some present on inflammatory cells and others on immune system cells, as well as regulating membrane proteins that protect host cells from autoattacking. . Plasma complement proteins function either as enzymes, as binding proteins, or as regulators (inhibitors or activators).
  • Factor H is the main regulator of the alternative complement pathway. It acts in the liquid phase as on the surface of the cells. Originally referred to as "beta 1H globulin", this serum 155 kDa glycoprotein is also referred to as the H1, FH, CFH, or HF1 factor. Factor H is synthesized in the liver, macrophages, fibroblasts, endothelial cells and platelets. The secreted form of the protein is composed of 20 repetitive units (or "short consensus repeats", SCRs) of 60 amino acids.
  • Factor H The anti-complementary activity of Factor H is reflected in the regulation of the rate of immune complexes in the blood, it therefore contributes to the balance between process resulting in their generation or degradation.
  • Factor H reduces the half life of C3 convertase (C3bBb) alternately by binding C3b and dissociating Bb and serves as a cofactor for Factor I in C3b proteolysis, free or bound to cell surface, in C3bi.
  • C3bBb C3 convertase
  • immune complexes composed of an antigen-antibody complex associated with the complement component C3b can no longer activate the subsequent cascade of complement (C5-C9 components).
  • Factor H has been proposed in the treatment of Atypical Hemolytic Uremic Syndrome (aHUS) associated with a hereditary anomaly of the complement system (patent application FR2894145). Moreover, the Factor H is indicated for the treatment of chronic nephropathies (WO2007 / 038995).
  • aHUS Atypical Hemolytic Uremic Syndrome
  • FR2894145 a hereditary anomaly of the complement system
  • a suitable source for the preparation of a Therapeutic Factor H concentrate is blood plasma.
  • Blood plasma has long been used for the preparation of albumin-like blood products, immunoglobulin preparations, clotting factor concentrates (Factor VIII, Factor IX etc.), etc.
  • Plasma fractionation methods are known, making it possible to enrich certain fractions with the desired products.
  • Patent applications WO2007 / 066017 and WO2008 / 1 13589 describe various methods for the purification of the factor H. Simplified schematics of the modified industrial Cohn / Oncley plasma fractionation and the industrial plasma fractionation Kistler / Nitschmann are presented in the patent application WO2008 / 1 13589, which relates to a preparation of factor H from an ethanolic fraction.
  • Purified Factor H must then be formulated in a form suitable for freeze-drying and storage, and reconstituted for injection. This formulation must preserve the functionality of the Factor H, and must be as stable as possible, so that it can be stored and handled with ease.
  • the formulations proposed until now only partially meet these constraints. Above all, they are only insufficiently concentrated in factor H, which imposes large volume injections, representing a major disadvantage, especially for the treatment of children.
  • the invention now provides a process for preparing a Factor H concentrate, and the concentrated formulations thus obtained, which exhibit advantageous chemical and physical stability.
  • the invention provides a method for obtaining a liquid injectable composition of factor H, comprising
  • n is 2.
  • the concentration C in Factor H in the injectable liquid composition may be between 0.5 and 50 g / l, preferably between 1 and 30 g / l, more preferably between 5 and 20 g / l, or between 10 and 30 g / l. and 20g / L.
  • the invention also provides a liquid injectable composition of Factor H, comprising, besides Factor H at a concentration of between 0.5 and 50 g / l, preferably between 1 and 30 g / l, more preferably between 5 and 20 g / l. , or between 10 and
  • Arginine or its salts (preferably hydrochloride) 24g / L
  • Lysine or its salts preferably hydrochloride 1, 2g / L
  • Sodium citrate preferably in dihydrate form 1, 5g / L
  • the invention also provides a solid composition of Factor H obtained by lyophilization of a formulation comprising, besides Factor H at a concentration of between 0.5 and 50 g / l, preferably between 1 and 30 g / l, more preferably between 5 and 20g / L, or between 10 and 20g / L,
  • Factor H is the main regulator of the alternative complement pathway. It acts in the liquid phase as on the surface of the cells. Originally referred to as "beta 1H globulin", this soluble 155 kDa serum glycoprotein is also referred to as the H1, FH, CFH, or HF1 factor. Factor H is synthesized in the liver, macrophages, fibroblasts, endothelial cells and platelets. The secreted form of the protein is composed of 20 repetitive units (or "short consensus repeats", SCRs) of 60 amino acids.
  • Vector H any protein having the amino acid sequence of human native Factor H or from another species (eg, bovine, porcine, canine, murine).
  • the term also includes any recombinant, derivative or mutant having a sequence substantially homologous to native H-factor.
  • substantially homologous sequence includes any sequence subject to one or more substitutions, additions and / or deletions, preferably conservative.
  • conservative substitutions, additions and / or deletions mean any replacement, addition or deletion of amino acid residue by another, without major alteration of the general conformation and / or biological activity of Factor H.
  • the conservative substitution includes , but not limited to, replacement with an amino acid having similar properties (such as, for example, shape, polarity, hydrogen bonding potential, acidity, basicity, hydrophobicity and the like). Amino acids with similar properties are well known in the art.
  • Factor H further includes naturally occurring allelic variations and / or Factor H isoforms found naturally in individuals of the same species, and any form or degree of glycosylation or other post-translational modification. Also included are homologues or derivatives of Factor H which exhibit the same or higher biological activity with respect to the activity of the wild form and / or which have a sequence identity of at least 80%, preferably at least 85%. %, more preferably at least 90%.
  • the factor H comes from human plasma.
  • the term "biological activity" of Factor H includes the ability to inhibit C3 convertase and / or to act as a factor I cofactor, resulting in the inhibition of complement cascade activation.
  • the activity of the factor H can be measured in various ways, well known to those skilled in the art.
  • stable composition here means that the formation of aggregates (insoluble or soluble) is minimized, and / or that the chemical degradation is reduced, the pH is maintained and the conformation of the protein is not substantially modified during the production or preservation of the compositions of the invention, such that the biological activity and stability of the protein are maintained.
  • the stabilization of the compositions involves lyoprotection and cryoprotection of the protein.
  • the term "physical stability" of Factor H refers to the reduction or absence of formation of insoluble or soluble aggregates of the dimeric, oligomeric or polymeric forms of Factor H, as well as the reduction or absence of any denaturation. structural of the molecule.
  • a lyophilized composition prepared according to the invention also has a structural stability, that is to say that it is capable of forming a cake ("cake” or "plug") which does not crumble spontaneously, and which is easily soluble in water before use.
  • Factor H preferably human
  • the Factor H is obtained from serum, plasma fractions, or non-cryoprecipitable plasma fraction, preferably human, by standard purification methods well known to those skilled in the art, or by a process described in Example 1.
  • the factor H can be purified from blood plasma according to the protocols described in the patent applications WO2007 / 066017 and WO2008 / 1 13589.
  • Patent application WO2007 / 066017 describes a method for purifying Factor H comprising anion exchange chromatography, followed by two stages of heparin-type affinity chromatography, then, in order, cation exchange chromatography. , and anion exchange chromatography.
  • the patent application WO2008 / 1 13589 describes obtaining a purified factor H by affinity chromatography with heparin from an ethanolic fraction of blood plasma, followed by anion exchange chromatography, and a cation exchange chromatography.
  • a chromatography consists in putting the Factor H in contact with the solution
  • the factor H can thus be obtained by a process comprising the steps of:
  • step (ii) subjecting the fraction obtained in step (i) to a single heparin affinity chromatography
  • step (iii) subjecting the fraction enriched in Factor H obtained in step (ii) to cation exchange chromatography;
  • step (iv) subjecting the fraction enriched in Factor H obtained in step (iii) to anion exchange chromatography;
  • At least one viral inactivation step preferably by the action of a solvent and / or detergent, and / or at least one viral elimination step, preferably by nanofiltration.
  • the purification comprises the steps of:
  • step (iii) (a) subjecting the fraction obtained in step (ii) to cation exchange chromatography, for example on SP-Sepharose;
  • step (iv) subjecting the H factor fraction obtained in step (iii) (a) or (b) to anion exchange chromatography, for example on Q-Sepharose.
  • this purification process may comprise the following steps: (i) obtaining a fraction of plasma containing Factor H, for example the supernatant of a cryoprecipitate of blood plasma optionally mixed with a plasma fraction not retained on a chromatography exchange system. anions;
  • the starting material used is the supernatant of a cryoprecipitate of blood plasma optionally mixed with a plasma fraction not retained on anion exchange chromatography, DEAE-Sephadex type. It is also possible to use the supernatant resulting from an ethanolic precipitation.
  • heparin-type affinity chromatography uses a matrix or a support, which is most often an agarose gel, on which heparin or heparin derivatives or mimetics are grafted.
  • heparin-type ligands mention may in particular be made of the following ligands: chondroitin sulfate, heparan sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, or synthetic oligomers, for example the cellubiosis sulfate ester (Matrex TM Celluline Sulfate), or therapeutic analogs of the invention.
  • heparin for example sulfated oligosaccharides.
  • the pH is adjusted to a value of 6, for example by equilibrating the column with a 20 mM sodium phosphate buffer solution, with an osmolality of 60 ⁇ 5 mOsm / kg, and a pH of 6.0 ⁇ 0, 1.
  • This step makes it possible to fix the factor H and the antithrombin III (AT III).
  • a cation exchange chromatography uses a matrix, most often of the agarose or polymeric type, on which are grafted ligands such as carboxymethyl (CM), sulfopropyl (SP) or methyl sulfonate (S).
  • Cation exchange supports are commercially available, for example CM-Sepharose, SP-Sepharose (GE Healthcare), Toyopearl CM-650, Toyopearl SP-650 (Tosoh Biosciences), Fractogel EMD S03 TM, Fractogel carriers.
  • EMD COO (Merck KGaA), Macro-Prep CM Support, Macro-Prep High S Support (BioRad), CM HyperD, S HyperD, Trisacryl CM, SP Trisacryl, SP Sperodex (all Pall).
  • SP-Sepharose FF is used.
  • This step essentially eliminates the complement component C3, immunoglobulin M (IgM), and apolipoprotein B (Apo B).
  • Factor H can under certain conditions bind to anion exchange resins, and be desorbed by high ionic strength buffer systems.
  • Anion exchange chromatography uses a matrix, most often of the agarose or polymeric type, on which are grafted ligands such as diethylaminoethyl (DEAE), quaternary aminoethyl (QAE) or quaternary ammonium (Q).
  • DEAE diethylaminoethyl
  • Q quaternary aminoethyl
  • Q quaternary ammonium
  • Anion exchange supports are commercially available, for example DEAE-Sepharose, Q-Sepharose (GE Healthcare), Toyopearl DEAE-650, Toyopearl Super Q-650 (Tosoh Biosciences), Fractogel EMD DEAE, Fractogel EMD TMAE (Merck KGaA), Macro-Prep DEAE Support, Macro-Prep High Q Support (BioRad), DEAE HyperD, Q HyperD, DEAE Trisacryl, DEAE Sperodex (all Pall).
  • Q-Sepharose FF is used. This step essentially eliminates Factor B and Factor I.
  • the pH of the fraction of blood plasma containing Factor H and obtained in step (i) is adjusted to be in the range of pH 5.5 to pH 6.5 and preferably to be equal to pH 6.0.
  • the pH of the fraction eluted from step (ii) and then diluted before step (iii) is adjusted to be in the range from pH 6.0 to pH 7.5, preferably 6.0 at 7.0 preferably to be about pH 6.5.
  • the pH of the fraction eluted from step (iii) and then diluted before step (iv) is adjusted to be in the range from 6.0 to 7.0 and preferably to be equal to 6. 5.
  • the purification comprises the steps of:
  • step (iii) (a) subjecting the fraction obtained in step (ii) to cation exchange chromatography, for example on SP-Sepharose;
  • step (iv) subjecting the H factor fraction obtained in step (iii) (a) or (b) to anion exchange chromatography, for example on Q-Sepharose.
  • the method of the invention contains no chromatography other than those provided in steps (ii) to (iv) defined above.
  • the purification process may optionally comprise additional steps, for example other anion or cation exchange chromatographies, but also, where appropriate, one or more hydrophobic interaction chromatographies, hydroxylapatite chromatography, delipidation, etc.
  • the H-factor preparation useful in the invention has generally undergone at least one step of removing or inactivating at least one infectious agent.
  • Infectious agents include viruses and NCTAs (unconventional transmissible agents) such as prions.
  • Viral inactivation often involves treatment with chemicals, for example solvent, detergent and / or heat, for example by pasteurization. Viral elimination, for example by means of nanofiltration, is also possible.
  • the process comprises at least a solvent and detergent treatment, and a nanofiltration.
  • Pasteurization refers to methods exposing the liquid compositions of Factor H at a temperature of 60 ° C for at least 10 hours.
  • Solvent and / or detergent treatment comprises, in particular, treatment with tri-n-butyl phosphate and / or a detergent which is chosen from Triton X-100, Tween (preferably Tween 80) and cholate. sodium.
  • the obtained Factor H concentrate is formulated with suitable excipients and stabilizers. They may be diluents, agents, cryoprotectants, lyoprotectants, etc.
  • At least one of arginine or one of its salts and sodium citrate is used.
  • the arginine in the formulation is in the form of hydrochloride or arginine phosphate.
  • Sodium citrate, or trisodium citrate, is preferably in dihydrate form.
  • the liquid formulation of Factor H before lyophilization further comprises at least one other hydrophilic amino acid and / or in addition at least one hydrophobic amino acid.
  • the amino acids are chosen according to its hydrophobicity according to the classification of Kyte and Doolittle (1982) "A simple method for displaying the hydropathic character of a protein". J. Mol. Biol. 157: 105-132, cf. Following table:
  • Hydrophilic (or polar) amino acids include Arginine, Lysine, Histidine, Asparagine, Glutamine, and Glutamic and Aspartic Acids.
  • Amino acids such as glycine and / or lysine or serine can be advantageously added.
  • hydrophobic amino acids include the following amino acids: Alanine, Valine, Leucine, Isoleucine, Phenylalanine.
  • the hydrophobic amino acid in the context of this invention is isoleucine, leucine or a mixture of both.
  • the liquid formulation of Factor H before lyophilization comprises arginine, preferably in the form of its hydrochloride, sodium citrate, preferably dihydrate, isoleucine, glycine, and lysine or one of its salts.
  • arginine preferably in the form of its hydrochloride, sodium citrate, preferably dihydrate, isoleucine, glycine, and lysine or one of its salts.
  • sugars sucrose, trehalose, glucose, lactose, etc.
  • polyols mannitol, sorbitol
  • amino acids glycine, arginine, histidine, alanine
  • Polysorbate surfactants Teween 20 or Tween 80 for example
  • polyoxamer for example poloxamer 188
  • polyethylene glycol can also be added.
  • the injectable liquid composition will not include sugar.
  • the proposed formulation makes it possible to maintain the stability of the product without the use of sugars or polyols, which are conventionally used to freeze the proteins but which are deleterious in the main therapeutic indication envisaged, namely the Atypical Hemolytic and Uremic Syndrome ( aHUS).
  • aHUS Atypical Hemolytic and Uremic Syndrome
  • the presence of sugars in the composition is not recommended because they are recognized as being able to induce problems of acute renal failure.
  • Antioxidants eg methionine, monothioglycerol, glutathione, citric acid, ascorbic acid, sodium metabisulfite, and sodium sulfite
  • Antioxidants eg methionine, monothioglycerol, glutathione, citric acid, ascorbic acid, sodium metabisulfite, and sodium sulfite
  • Buffer substances may be further used, for example in the form of carbonate, phosphate, citrate, acetate, borate, trimethamine [(2-amino-2-hydroxymethyl-1, 3-propanediol), TRIS], glycine and lysine (PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology, Vol 51 (4), 1997: Excipients and their use in injectable products (SANDEEP MA, RJ WASHKUHN, RJ BRENDEL, pp166-171).
  • Factor H in this formulation, is stabilized in liquid form, in frozen form, during lyophilization and during storage after lyophilization, as described below.
  • the liquid formulation of Factor H is then lyophilized to obtain a solid form.
  • Lyophilization methods are well known to those skilled in the art, see, for example, Wang et al, Lyophilization and Development of Solid Protein Pharmaceuticals, International Journal of Pharmaceutics, Vol 203, p 1 -60, 2000.
  • the degree of humidity is less than or equal to 3% by weight, preferably less than or equal to 2.5%, preferably less than or equal to 2%, preferably less than or equal to 1.5%.
  • the solid composition is then dissolved in water for injection (or "water for injection” or WFI) to obtain a composition for therapeutic use.
  • This reconstitution volume is n times smaller than the volume V initial of the liquid formulation subjected to lyophilization, n being a number greater than 1, preferably 2 or 3.
  • the concentrations of excipients (whose C2 and C3 concentrations, respectively arginine and sodium citrate) and the reconstitution volume are chosen so that the final injectable liquid composition is iso-osmolar with human plasma.
  • the liquid formulation of the factor H thus has an osmolarity of between 250 and 350 mOsmol / kg.
  • the liquid formulation of Factor H before lyophilization comprises, in addition to the factor H,
  • Arginine or its salts (preferably hydrochloride) 12g / L
  • Lysine or its salts 0.6 g / L
  • the inventors have shown that, in the proposed formulation, the factor H was stable, even by diluting to half each of the excipients.
  • the solution thus obtained has a low osmolality before lyophilization, which makes it possible to concentrate the active ingredient (factor H) by rehydrating the lyophilisate with a volume twice as small as the diluent (that is to say water for injection). ) to obtain an isosomolar injectable product with human plasma.
  • a solution A was used as the starting material, obtained in the following manner: Thawed plasma was cryoprecipitated. After centrifugation, a part of the cryosurnant was subjected to chromatography on DEAE Sephadex, which fixes the K-dependent vitamin factors. A fraction not retained on DEAE-Sephadex is mixed with the remaining cryosurnant to constitute Solution A.
  • the batches are subjected to a column chromatography BP 13 loaded with 1500 ml of heparin-Sepharose Fast Flow (FF) gel (15 cm ⁇ 10 cm) equilibrated in a 20 mM sodium phosphate buffer, an osmolality of 60 ⁇ 5 mOsm / kg, pH 6.0 ⁇ 0.1. The same buffer solution was used to wash the gel until it returned to the baseline optical density (OD) measured at 280 nm.
  • OD optical density
  • the protein loading applied was 560 and 720 mg protein / ml gel for L1 and L2 batches respectively.
  • a 20mM sodium phosphate buffer solution, 60mM sodium chloride, osmolality of 165110 mOsm / kg, pH 7.4 ⁇ 0.1 was then injected into the column to elute proteins that were weakly adsorbed on the gel.
  • the gel was re-equilibrated by the injection of 2 to 3 volumes of equilibrated buffer solution at pH 6.5.
  • Factor H was then eluted by the injection of a buffer solution containing 20mM sodium phosphate, 250mM sodium chloride, 4.5g / L arginine-HCl, osmolality of 550110 mOsm / kg, pH 6.5 ⁇ 0 , 1.
  • a final washing of the column was carried out by injecting a 2M sodium chloride solution to elute the proteins which were strongly adsorbed on the gel, in particular antithrombin III.
  • the linear flow rate was 50 cm / h for all chromatography steps.
  • the fraction of eluted Factor H was frozen at -80 ° C until the next step.
  • the fraction containing the Factor H eluted from the heparin-Sepharose FF column was thawed in a regulated water bath at 30 ° C. and then adjusted to the equilibration conditions of the SP-Sepharose FF column by dilution in water. purified to reach an osmolality of 95 ⁇ 5 mOsm / kg, and if necessary addition of a 0.5N HCl solution to obtain a pH of 6.5 ⁇ 0.1.
  • the adjusted fraction was subjected to two parallel columns K50 columns, each containing 137mL of SP-Sepharose FF gel (7cm x 5cm) and equilibrated with a buffer solution containing 20mM sodium phosphate, 4.5g / L arginine -HCl, osmolality of 95 ⁇ 5 mOsm / kg, pH 6.5 ⁇ 0.1.
  • the same buffer solution was used to wash the gel until it returned to the baseline optical density (OD) measured at 280 nm.
  • Factor H was then eluted by injection of a solution containing a buffer containing 20mM sodium phosphate, 165mM sodium chloride, 4.5g / L arginine-HCl, osmolality of 40015 mOsm / kg, pH 6.510.1.
  • the fraction of Factor H eluted from the SP-Sepharose FF column was thawed in a regulated water bath at 30 ° C. It was then subjected to Solvent-Detergent treatment in the presence of 1% polysorbate 80 (Tween 80) (w / v) and 0.3% tri-n-butyl phosphate (TnBP) (v / v) at 25 ° C. +1 ° C.
  • the Solvent-Detergent treated Factor H fraction was adjusted to the equilibration conditions for the Q-Sepharose FF column by dilution with purified water to reach an osmolality of 140 + 10 mOsm / kg, and addition of a 1 N NaOH solution to obtain a pH of 7.5 + 0.1 for batch L1 and using a 0.5M HCl solution if necessary to obtain a pH of 6.5 + 0.1 for batch L2 .
  • the adjusted fraction was chromatographed on a K50 column containing 190mL of Q-Sepharose FF gel (9.5cm x 5cm) and equilibrated with a buffer solution containing 20mM sodium phosphate, 25mM sodium chloride, 4.5g / ml.
  • Arginine-HCl osmolality of 140 + 10 mOsm / kg, pH 7.5 + 0.1 for batch L1, and pH of 6.5 + 0.1 for batch L2.
  • the same buffer solution was used to wash the gel until it returned to the baseline optical density (OD) measured at 280 nm.
  • the gel was washed to remove unadsorbed proteins on the gel and TnBP and Tween 80.
  • a buffer solution containing 20mM sodium phosphate, 55mM sodium chloride, 4.5g / L arginine-HCl, osmolality of 200 + 10 mOsm / kg, pH 7.5 + 0.1 for lot L1, and pH 6.5 + 0.1 for batch L2 was then injected into the column to elute proteins that were weakly adsorbed to the gel.
  • Factor H was then eluted by injection of a buffer solution containing 20mM sodium phosphate, 165mM sodium chloride, 4.5g / L arginine-HCl, osmolality of 390 + 10mOsm / kg, pH 7.5 + 0, 1 for lot L1, and pH 6.5 + 0.1 for lot L2.
  • the fraction eluted from the Q-Sepharose FF column was adjusted to a pH of 6.5 ⁇ 0.1 for batch L2, and pH 7.5 ⁇ 0.1 for batch 1, and was then clarified by filtration on a filter with a pore size of 0.1 ⁇ and stored overnight at 4 ° C.
  • the clarified fraction was filtered through a sequence of PLANOVA 20N and 15N filters previously equilibrated with a buffer solution containing 20mM sodium phosphate, 165mM sodium chloride, 4.5g / L arginine-HCl, osmolality of 390 ⁇ 10mOsm / kg pH 7.5 for lot L1 and pH 6.5 for lot L2.
  • the filtration pressure at the inlet, applied to the 15nm filter was 300 ⁇ 50mbar and was kept constant. Filtration was performed at laboratory temperature.
  • the filtered Factor H fraction was formulated and diafiltered on an ultrafiltration module equipped with a membrane with a molecular weight cut-off of 100kD.
  • the batches were formulated with a buffer solution composed of 12g / L arginine HCl, 3g / L isoleucine, 0.6g / L glycine, 0.6g / L lysine HCl, 0.75g / L trisodium citrate, osmolality 150 ⁇ 10mOsm / kg, pH 7.5 ⁇ 0.1.
  • the final protein concentration in Factor H was 5g / L.
  • the concentrated and formulated product was filtered through a 0.22 ⁇ m Millipak 20 filter under a laminar flow hood and conditioned.
  • the Factor H assay is conventionally performed by immunoenzymatic method (ELISA) with commercial reagents (Diagnostica Stago). Briefly, the Factor H to be assayed is captured by a human anti-Factor H antibody immobilized on a solid phase. The fixed Factor H is then recognized by a peroxidase immunoconjugate. The level of bound peroxidase is measured by its activity on the ortho-phenylenediamine substrate in the presence of hydrogen peroxide. The intensity of the staining, after stopping the reaction with a strong acid, is a function of the amount of factor H present initially in the sample. Factor H thus measured is called "Antigen Factor" or "Ag".
  • Feasibility batches L3 and L4 Two other batches of blood plasma, called “feasibility batches” L3 and L4, were subjected to the purification process described in Example 1.
  • the resulting Factor H concentrates were formulated as follows.
  • Part was lyophilized into capped glass vials with elastomeric stoppers and stored at 40 ° C. Another portion was stored in liquid form at 5 ° C to estimate the stability of the formulation in this form for 6 months.
  • composition was lyophilized into capped glass vials with elastomeric stoppers, one portion was stored at 40 ° C, the other portion was stored at 5 ° C.
  • OD optical density
  • SHIMADZU UV spectrophotometer 2401 Thanks to the aromatic cycles of certain amino acids (tryptophan, tyrosine, phenylalanine), proteins absorb in the ultraviolet.
  • OD is a function of protein concentration.
  • DSC Differential Scanning Calorimetry
  • the glass transition temperature was determined by a differential scanning thermoanalyzer DSC 7 (Perkin Elmer) calibrated with indium (melting temperature (Tm) 156.6 ° C) and n-octadecane (Tm 38). , 2 ° C). The samples were subjected to temperatures of -50 to 138 ° C at a rate of 20 ° C / min. Helium was used to conduct the experiments at a temperature below room temperature. The glass transition temperature (Tg) was taken at the midpoint of the endothermic change in the apparent specific heat. Two measurements were made and the average gives the Tg.
  • DSC 7 differential scanning thermoanalyzer
  • the size distribution of the monomeric populations of the protein by intensity and volume was calculated from the Dispersion Technology Software of Malvern (version 4.00).
  • the refractive indices of the material and the dispersant were defined at 1, 33 and 1, 45 respectively.
  • the temperature during the measurements was checked and set at 20 ° C.
  • One of the quality parameters for the tested formulations is the diameter of the protein population as monomers. Determination of the anti-factor convertase activity of factor H.
  • the calculated rate corresponds to the amount of factor H which makes it possible to dissociate 50% of the preformed C3 convertase, it is also called EC 50 (effective concentration to have 50% of the activity).
  • EC 50 effective concentration to have 50% of the activity.
  • a plasma pool sample is passed to each analysis for reference. The higher the percentage, the more H factor is needed to dissociate the same amount of C3 convertase so the lower the factor H is active. Any increase in the rate reflects a denaturation of the protein.
  • Example 3 Additional stability tests of freeze-dried concentrated formulations
  • a batch L7 of Factor H was manufactured and formulated, according to the following composition:
  • the product is reconstituted with a volume two times lower than the filling volume, the final solution being iso-osmolar.
  • This batch was distributed and freeze-dried in its final form, namely 20 ml of the above formulation, in a 30 ml bottle. Then the reconstitution was carried out by injection into the flask of 10 ml of water for injection. The stability of the reconstituted formulation was confirmed after storage at 5 ° C and 25 ° C for 24 hours.

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Abstract

L'invention concerne un procédé d'obtention d'une composition liquide injectable de Facteur H, comprenant (a) la fourniture d'une composition solide obtenue par lyophilisation d'un volume V d'une formulation liquide comprenant du Facteur H de concentration C1, de l'arginine ou l'un de ses sels, de concentration C2, du citrate de sodium, de concentration C3, puis (b) l'ajout d'un volume V/n d'eau, avec n>1, par ce en quoi on obtient une composition liquide injectable contenant du Facteur H à une concentration C=C1xn.

Description

Préparation d'un concentré de Facteur H
L'invention concerne la préparation de formulations concentrées en Facteur H à usage thérapeutique.
Arrière-plan technologique de l'invention :
Le complément joue un rôle essentiel dans la défense de l'organisme contre des agents infectieux et dans le processus inflammatoire. Il représente un système auxiliaire de l'immunité, en particulier de la réponse humorale et de la réponse innée.
Le complément comprend un ensemble d'environ 30 protéines plasmatiques et parfois membranaires, synthétisées essentiellement par le foie et les macrophages et qui peuvent être activées par des cascades protéolytiques. Il comprend à la fois des protéines plasmatiques, de nombreux récepteurs cellulaires de surface différents, certains présents sur les cellules inflammatoires et d'autres sur les cellules du système immunitaire, ainsi que des protéines membranaires de régulation qui protègent les cellules hôte d'une autoattaque. Les protéines plasmatiques du complément fonctionnent soit comme des enzymes, soit comme des protéines de liaison, soit comme des régulateurs (inhibiteurs ou activateurs).
Il existe 3 voies de déclenchement de la cascade du complément : la voie classique déclenchée par les anticorps, la voie alterne déclenchée par des substances bactériennes en absence d'anticorps, la voie dépendante des lectines qui reconnaissent certains polysaccharides bactériens. Ces deux dernières voies sont mises en jeu dans la réponse innée et sont extrêmement importantes dans la défense de l'hôte contre les infections bactériennes.
Le Facteur H est le principal régulateur de la voie alterne du complément. Il agit en phase liquide comme à la surface des cellules. Initialement désignée « bêta 1 H globuline », cette glycoprotéine sérique de 155 kDa est également appelée Facteur H 1 , FH, CFH, ou HF1 . Le Facteur H est synthétisé dans le foie, les macrophages, les fibroblastes, les cellules endothéliales et les plaquettes. La forme sécrétée de la protéine est composée de 20 unités répétitives (ou « short consensus repeats », SCR) de 60 acides aminés.
L'activité anti-complémentaire du Facteur H se traduit par la régulation du taux de complexes immuns dans le sang, il participe par conséquent à l'équilibre entre les processus résultant en leur génération ou en leur dégradation. Le facteur H réduit la demi- vie de la C3 convertase (C3bBb) alterne en liant le C3b et en dissociant le Bb et sert de cofacteur au Facteur I dans la protéolyse du C3b, libre ou lié à la surface des cellules, en C3bi. Ainsi, les complexes immuns composés d'un complexe antigène-anticorps associé au composant du complément C3b ne peuvent plus activer la cascade subséquente du complément (composants C5-C9).
Le Facteur H a été proposé dans le traitement du Syndrome Hémolytique et Urémique atypique (SHUa) associé à une anomalie héréditaire du système du complément (demande de brevet FR2894145). Par ailleurs, le Facteur H est indiqué pour le traitement de néphropathies chroniques (WO2007/038995).
Une source appropriée pour la préparation d'un concentré de Facteur H à usage thérapeutique est du plasma sanguin. Le plasma sanguin est utilisé depuis longtemps pour la préparation de produits dérivés du sang de type albumine, préparations d'immunoglobulines, concentrés de facteur de la coagulation (Facteur VIII, Facteur IX etc.), etc. Des méthodes de fractionnement du plasma sont connues, permettant d'enrichir certaines fractions en produits désirés. Les demandes de brevet WO2007/066017 et WO2008/1 13589 décrivent divers procédés de purification du Facteur H. Des schémas simplifiés du fractionnement plasmatique industriel Cohn/Oncley modifié, et du fractionnement plasmatique industriel Kistler/Nitschmann sont présentés dans la demande de brevet WO2008/1 13589, qui concerne une préparation de facteur H à partir d'une fraction éthanolique. Le Facteur H purifié doit être ensuite formulé sous une forme appropriée pour être lyophilisée et stockée, puis reconstituée pour une injection. Cette formulation doit préserver la fonctionnalité du Facteur H, et doit être la plus stable possible, pour pouvoir être conservée et manipulée avec facilité. Or les formulations proposées jusqu'à maintenant ne répondent que partiellement à ces contraintes. Surtout, elles ne sont qu'insuffisamment concentrées en Facteur H, ce qui impose des injections de volumes importants, représentant un inconvénient majeur, en particulier pour le traitement des enfants.
L'invention vise à résoudre ces problèmes. Résumé de l'invention :
L'invention fournit maintenant un procédé de préparation d'un concentré de Facteur H, et les formulations concentrées ainsi obtenues, qui présentent une stabilité chimique et physique avantageuse.
Plus précisément, l'invention fournit un procédé d'obtention d'une composition liquide injectable de Facteur H, comprenant
a. la fourniture d'une composition solide obtenue par lyophilisation d'un volume V d'une formulation liquide comprenant du Facteur H de concentration C1 , de l'arginine ou l'un de ses sels, de concentration C2, du citrate de sodium de concentration C3,
b. l'ajout d'un volume V/n d'eau, avec n>1 ,
par ce en quoi on obtient une composition liquide injectable contenant du Facteur H à une concentration C=C1xn.
De préférence n est égal à 2.
De cette manière, la concentration C en Facteur H dans la composition liquide injectable peut être comprise entre 0,5 et 50g/L, de préférence entre 1 et 30g/L, de préférence encore entre 5 et 20g/L, ou encore entre 10 et 20g/L.
L'invention fournit également une composition liquide injectable de Facteur H, comprenant, outre du Facteur H à une concentration comprise entre 0,5 et 50g/L, de préférence entre 1 et 30g/L, de préférence encore entre 5 et 20g/L, ou encore entre 10 et
20g/L,
Arginine ou ses sels (de préférence le chlorhydrate) 24g/L
Isoleucine 6g/L
Glycine 1 ,2g/L
Lysine ou ses sels (de préférence le chlorhydrate) 1 ,2g/L
Citrate de sodium, de préférence sous forme dihydratée 1 ,5g/L
L'invention fournit aussi une composition solide de Facteur H obtenue par lyophilisation d'une formulation comprenant, outre du Facteur H à une concentration comprise entre 0,5 et 50g/L, de préférence entre 1 et 30g/L, de préférence encore entre 5 et 20g/L, ou encore entre 10 et 20g/L,
Arginine ou ses sels 12g/L
Isoleucine 3g/L
Glycine 0,6g/L
Lysine*HCI 0,6g/L
Citrate de sodium, de préférence sous forme dihydratée 0,75g/L Description détaillée de l'invention :
Définitions
Le Facteur H est le principal régulateur de la voie alterne du complément. Il agit en phase liquide comme à la surface des cellules. Initialement désignée « bêta 1 H globuline », cette glycoprotéine sérique soluble de 155 kDa est également appelée Facteur H 1 , FH, CFH, ou HF1 . Le Facteur H est synthétisé dans le foie, les macrophages, les fibroblastes, les cellules endothéliales et les plaquettes. La forme sécrétée de la protéine est composée de 20 unités répétitives (ou « short consensus repeats », SCR) de 60 acides aminés.
Par « Facteur H » on entend ici toute protéine ayant la séquence en acides aminés du Facteur H natif humain ou provenant d'une autre espèce (par exemple bovin, porcin, canin, murin). Le terme comprend également tout recombinant, dérivé ou mutant ayant une séquence substantiellement homologue au facteur H natif. L'expression « séquence substantiellement homologue » comprend toute séquence soumise à une ou plusieurs substitutions, additions et/ou délétions, de préférence conservatives. Les expressions « substitutions, additions et/ou délétions conservatives » expriment tout remplacement, ajout ou suppression de résidu acide aminé par un autre, sans altération majeure de la conformation générale et/ou de l'activité biologique du Facteur H. La substitution conservative inclut, sans s'y limiter, le remplacement par un acide aminé ayant des propriétés similaires (comme par exemple la forme, la polarité, le potentiel de liaison hydrogène, l'acidité, la basicité, l'hydrophobicité et autres). Les acides aminés ayant des propriétés similaires sont bien connus dans l'art.
Le terme « Facteur H » comprend en outre les variations alléliques naturelles et/ou les isoformes du Facteur H trouvées naturellement chez les individus d'une même espèce, et toute forme ou degré de glycosylation ou autre modification post-traductionnelle. Sont aussi compris les homologues ou dérivés du Facteur H qui présentent la même ou une activité biologique supérieure par rapport à l'activité de la forme sauvage et/ou qui présentent une identité de séquence d'au moins 80%, de préférence au moins 85%, de préférence encore d'au moins 90%.
De préférence, le Facteur H provient de plasma humain.
Le terme « activité biologique » du Facteur H inclut la capacité à inhiber la C3 convertase et/ou à servir de co-facteur du Facteur I, résultant à l'inhibition de l'activation de la cascade du complément. L'activité du Facteur H peut être mesurée de différentes manières, bien connues de l'homme du métier. Le terme "composition stable" signifie ici que la formation d'agrégats (insolubles ou solubles) est minimisée, et/ou que la dégradation chimique est réduite, le pH est maintenu et la conformation de la protéine n'est pas substantiellement modifiée pendant la production ou la conservation des compositions de l'invention, de telle sorte que l'activité biologique et la stabilité de la protéine soient conservées. Lorsque les compositions sont soumises à une lyophilisation, la stabilisation des compositions impliquent une lyoprotection et une cryoprotection de la protéine.
Le terme "stabilité physique" du Facteur H se réfère à la réduction ou l'absence de formation d'agrégats insolubles ou solubles des formes dimériques, oligomériques ou polymériques du Facteur H, ainsi qu'à la réduction ou l'absence de toute dénaturation structurale de la molécule.
Le terme "stabilité chimique" se réfère à la réduction ou l'absence de toute modification chimique du facteur H pendant le stockage, à l'état solide ou sous forme dissoute, dans des conditions accélérées. Par exemple, les phénomènes d'hydrolyse, déamination, et/ou oxydation sont évités ou retardés. L'oxydation des acides aminés contenant du soufre est limitée. Une composition lyophilisée préparée selon l'invention présente aussi une stabilité structurale, c'est-à-dire qu'elle est capable de former un gâteau (« cake » ou « plug ») qui ne s'effrite pas spontanément, et qui est facilement soluble dans de l'eau avant utilisation.
Purification du Facteur H
Le Facteur H, de préférence humain, peut être préparé par toutes les techniques classiques de purification, par synthèse peptidique, à savoir notamment par synthèse chimique, ou génie génétique.
Dans un mode de réalisation préféré, le Facteur H est obtenu à partir du sérum, de fractions plasmatiques, ou de fraction non cryoprécipitable du plasma, de préférence humain, par des procédés de purification classiques bien connus de l'homme du métier, ou par un procédé décrit dans l'exemple 1 .
Par exemple le Facteur H peut être purifié à partir de plasma sanguin selon les protocoles décrits dans les demandes de brevet WO2007/066017 et WO2008/1 13589. La demande de brevet WO2007/066017 décrit un procédé de purification du Facteur H comprenant une chromatographie par échange d'anions, suivie par deux étapes de chromatographie d'affinité de type héparine, puis, dans l'ordre, une chromatographie par échange de cations, et une chromatographie par échange d'anions.
La demande de brevet WO2008/1 13589 décrit l'obtention d'un Facteur H purifié par une chromatographie d'affinité avec héparine à partir d'une fraction éthanolique de plasma sanguin, suivie d'une chromatographie par échange d'anions, et une chromatographie par échange de cations.
De manière générale, une chromatographie consiste à mettre en contact le Facteur H en solution
avec une matrice à laquelle le Facteur H se lie, éventuellement laver la matrice dans des conditions appropriées pour que le Facteur H reste lié, puis appliquer à la matrice une solution qui provoque l'élution du Facteur H de la matrice, ou de manière alternative avec une matrice qui lie les impuretés mais pas le Facteur H
Un autre procédé de purification est en outre décrit ci-après.
Le Facteur H peut ainsi être obtenu par un procédé comprenant les étapes consistant à :
(i) obtenir une fraction de plasma sanguin contenant du Facteur H ;
(ii) soumettre la fraction obtenue à l'étape (i) à une unique chromatographie d'affinité de type héparine;
(iii) soumettre la fraction enrichie en Facteur H obtenue à l'étape (ii) à une chromatographie échangeuse de cations ;
(iv) soumettre la fraction enrichie en Facteur H obtenue à l'étape (iii) à une chromatographie échangeuse d'anions ;
et comprenant en outre au moins une étape d'inactivation virale, de préférence par l'action d'un solvant et/ou d'un détergent, et/ou au moins une étape d'élimination virale, de préférence par nanofiltration.
De préférence, la purification comprend les étapes consistant à :
(i) obtenir une fraction de plasma contenant du Facteur H, par exemple le surnageant d'un cryoprécipité de plasma sanguin éventuellement mélangé avec une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions ; (ii) soumettre ledit surnageant à une chromatographie d'affinité de type héparine, par exemple sur gel de sépharose sur lequel est greffée de l'héparine;
(iii) (a) soumettre la fraction obtenue à l'étape (ii) à une chromatographie échangeuse de cations, par exemple sur SP-Sépharose ;
(iii) (b) suivie le cas échéant par un traitement par solvant et détergent ;
(iv) soumettre la fraction en en facteur H obtenue à l'étape (iii) (a) ou (b) à une chromatographie échangeuse d'anions, par exemple sur Q-Sépharose.
Plus précisément, ce procédé de purification peut comprendre les étapes suivantes : (i) obtenir une fraction de plasma contenant du Facteur H, par exemple le surnageant d'un cryoprécipité de plasma sanguin éventuellement mélangé avec une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions ;
(ii) soumettre ledit surnageant à une chromatographie d'affinité de type héparine, par exemple sur gel de sépharose sur lequel est greffée de l'héparine;
éluer le facteur H par un tampon de force ionique supérieure à celle du tampon d'équilibrage de la chromatrographie d'affinité de type héparine, diluer la fraction éluée, puis
(iii) (a) la soumettre à une chromatographie échangeuse de cations, par exemple sur SP- Sépharose ;
éluer le facteur H par un tampon de force ionique supérieure à celle du tampon d'équilibrage de la chromatrographie échangeuse de cations, diluer la fraction éluée, puis
(iii) (b) le cas échéant la soumettre à un traitement par solvant et détergent ;
(iv) puis la soumettre à une chromatographie échangeuse d'anions, par exemple sur Q- Sépharose ;
(v) laver et éluer le Facteur H ;
(vi) formuler le Facteur H dans une solution tampon.
Ces étapes sont décrites avec de plus amples détails ci-dessous. Etape (i) obtention d'une fraction de plasma sanguin contenant du Facteur H :
De préférence on utilise comme matériau de départ le surnageant d'un cryoprécipité de plasma sanguin éventuellement mélangé avec une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions , type DEAE-Séphadex. On peut encore utiliser le surnageant issu d'une précipitation éthanolique.
Etape (ii) chromatographie d'affinité de type héparine : La chromatographie d'affinité de type héparine met en œuvre une matrice ou un support, qui est le plus souvent un gel d'agarose, sur lequel est greffé de l'héparine ou des dérivés ou mimétiques de l'héparine. Parmi les ligands de type héparine on peut citer notamment les ligands suivants : chondroitin sulfate, heparan sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, ou des oligomères synthétiques, par exemple le cellubiose sulfate ester (Matrex ™ Cellufine Sulfate), ou des analogues thérapeutiques de l'héparine, par exemple des oligosaccharides sulfatés.
De préférence le pH est ajusté à une valeur de 6, par exemple en équilibrant la colonne avec une solution tampon de phosphate de sodium à 20 mM, avec une osmolalité de 60±5 mOsm/kg, et un pH 6,0±0,1 .
Cette étape permet de fixer le Facteur H et l'antithrombine III (AT III).
Etape (iii) chromatographie échangeuse de cations :
Une chromatographie échangeuse de cations met en oeuvre une matrice, le plus souvent de type agarose ou polymérique, sur laquelle sont greffés des ligands tels que carboxymethyl (CM), sulfopropyl (SP) ou methyl sulfonate (S). Des supports échangeurs de cations sont disponibles dans le commerce: on peut citer par exemple des supports CM-Sepharose, SP-Sepharose (GE Healthcare), Toyopearl CM-650, Toyopearl SP-650 (Tosoh Biosciences), Fractogel EMD S03", Fractogel EMD COO" (Merck KGaA), Macro- Prep CM Support, Macro-Prep High S Support (BioRad), CM HyperD, S HyperD, CM Trisacryl, SP Trisacryl, SP Sperodex (all Pall). De préférence, on utilise la SP-Sépharose FF.
Cette étape permet d'éliminer essentiellement le composant C3 du complément, les immunoglobulines M (IgM), et l'apolipoprotéine B (Apo B).
Etape (iv) chromatographie échangeuse d'anions :
Le Facteur H peut dans certaines conditions se lier à des résines échangeuses d'anions, et en être désorbé par des systèmes tampons à force ionique élevée.
Une chromatographie échangeuse d'anions met en oeuvre une matrice, le plus souvent de type agarose ou polymérique, sur laquelle sont greffés des ligands tels que diethylaminoethyle (DEAE), aminoethyle quaternaire (QAE) ou ammonium quaternaire (Q). Des supports échangeurs d'anions sont disponibles dans le commerce: on peut citer par exemple des supports DEAE-Sepharose, Q- Sepharose (GE Healthcare), Toyopearl DEAE-650, Toyopearl Super Q-650 (Tosoh Biosciences), Fractogel EMD DEAE, Fractogel EMD TMAE (Merck KGaA), Macro- Prep DEAE Support, Macro-Prep High Q Support (BioRad), DEAE HyperD, Q HyperD, DEAE Trisacryl, DEAE Sperodex (all Pall). De préférence, on utilise la Q- Sepharose FF. Cette étape permet d'éliminer essentiellement le Facteur B et le Facteur I.
Avantageusement, le pH de la fraction de plasma sanguin contenant du Facteur H et obtenue à l'étape (i) est ajusté pour être compris dans la gamme allant de pH 5,5 à pH 6,5 et de préférence pour être égal à pH 6,0. Avantageusement, le pH de la fraction éluée de l'étape (ii) puis diluée avant l'étape (iii) est ajusté pour être compris dans la gamme allant de pH 6,0 à pH 7,5, de préférence de 6,0 à 7,0 de préférence pour être égal à pH 6,5 environ. Avantageusement encore, le pH de la fraction éluée de l'étape (iii) puis diluée avant l'étape (iv) est ajusté pour être compris dans la gamme allant de 6,0 à 7,0 et de préférence pour être égal à 6,5.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la purification comprend les étapes consistant à :
(i) obtenir une fraction de plasma enrichie en Facteur H, par exemple le surnageant d'un cryoprécipité de plasma sanguin éventuellement mélangé avec une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions et/ou une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'ions;
(ii) soumettre ledit surnageant et/ou fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'ions, à une chromatographie d'affinité de type héparine, par exemple sur gel de sépharose sur lequel est greffée de l'héparine;
(iii) (a) soumettre la fraction obtenue à l'étape (ii) à une chromatographie échangeuse de cations, par exemple sur SP-Sépharose ;
(iii) (b) suivie le cas échéant par un traitement par solvant et détergent ;
(iv) soumettre la fraction en en facteur H obtenue à l'étape (iii) (a) ou (b) à une chromatographie échangeuse d'anions, par exemple sur Q-Sépharose.
Autres étapes possibles :
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention ne contient aucune autre chromatographie que celles prévues aux étapes (ii) à (iv) définies plus haut.
Toutefois, le procédé de purification peut éventuellement comprendre des étapes supplémentaires, par exemple d'autres chromatographies d'échanges d'anions ou de cations, mais aussi le cas échéant une ou plusieurs chromatographies par interaction hydrophobe, chromatographie de type Hydroxyapatite, une délipidation, etc.
Il peut aussi être avantageux d'éliminer ou inhiber les impuretés protéolytiques, à savoir les enzymes ou protéines qui seraient capables de cliver la molécule de Facteur H en des formes tronquées inactives. Inactivation des virus
La préparation de Facteur H utile dans l'invention a généralement subi au moins une étape d'élimination ou d'inactivation d'au moins un agent infectieux. Parmi les agents infectieux, on peut citer les virus et les ATNC (agents transmissibles non conventionnels) comme le prion. Une inactivation virale comprend souvent un traitement avec des produits chimiques, par exemple par solvant, détergent et/ou par la chaleur, par exemple par pasteurisation. Une élimination virale, par exemple au moyen d'une nanofiltration, est aussi possible. De préférence le procédé comprend au moins un traitement par solvant et détergent, et une nanofiltration.
La pasteurisation se réfère à des méthodes exposant les compositions liquides de Facteur H à une température de 60°C pendant au moins 10h.
Le traitement par solvant et/ou détergent (appelé généralement traitement solvant/détergent) comprend notamment le traitement par tri-n-butylphosphate et/ou un détergent qui est choisi parmi le Triton X-100, Tween (de préférence Tween 80) et cholate sodium.
Formulation
De manière à obtenir des préparations de Facteur H à usage thérapeutique, qui soient chimiquement et physiquement stables, le concentré de Facteur H obtenu est formulé avec des excipients et agents stabilisants appropriés. Il peut s'agir de diluants, d'agents, cryoprotecteurs, lyoprotecteurs, etc.
Selon l'invention, on utilise au moins de l'arginine ou l'un de ses sels, et du citrate de sodium.
De préférence, l'arginine dans la formulation est sous forme de chlorhydrate ou de phosphate d'arginine. Le citrate de sodium, ou citrate trisodique, est de préférence sous forme dihydratée.
De préférence, la formulation liquide de Facteur H avant lyophilisation comprend en outre au moins un autre acide aminé hydrophile et/ou en outre au moins un acide aminé hydrophobe. Les acides aminés sont choisis en fonction de son hydrophobicité selon la classification de Kyte et Doolittle (1982) « A simple method for displaying the hydropathic character of a protein ». J. Mol. Biol. 157: 105-132, cf. Tableau suivant :
\ Code à Score
Acide aminé
\ une lettre jd'hydropathie i
Isoleucine I 4.5
Valine v 4.2
Leucine L 3.8 Phenylalanine F 2.8
Cysteine C 2.5
Methionine M 1.9
Alanine 1.8
Glycine G -0.4
Threonine T -0.7
Tryptophan w -0.9
Serine s -0.8
Tyrosine Y -1.3
Proline p -1.6
Histidine H -3.2
Glutamic acid E -3.5
Glutamine Q -3.5
Aspartic acid D -3.5
Asparagine N -3.5
Lysine K -3.9
Arginine R -4.5
Les acides aminés hydrophiles (ou polaires) incluent l'Arginine, la Lysine, l'Histidine, l'Asparagine, la Glutamine, et les acides glutamiques et aspartiques.
Des acides aminés comme la glycine et/ou la lysine, ou encore la sérine, peuvent être avantageusement ajoutés.
Les acides aminés hydrophobes (à chaîne latérale apolaire) incluent notamment les acides aminés suivants : Alanine, Valine, Leucine, Isoleucine, Phénylalanine. De préférence, l'acide aminé hydrophobe dans le cadre de cette invention est l'isoleucine, la leucine ou un mélange des deux.
Selon un mode de réalisation préféré, la formulation liquide de Facteur H avant lyophilisation comprend de l'arginine, de préférence sous forme de son chlorhydrate, du citrate de sodium, de préférence dihydraté, de l'isoleucine, de la glycine, et de la lysine ou l'un de ses sels. Parmi les lyoprotecteurs classiques, on peut citer les sucres (saccharose, tréhalose, glucose, lactose etc.), les polyols (mannitol, sorbitol) et les acides aminés (glycine, arginine, histidine, alanine) qui peuvent être utilisés à une concentration entre 0 et 10%. Des tensio-actifs de type polysorbate (Tween 20 ou Tween 80 par exemple), polyoxamer (par exemple poloxamer 188), polyéthylèneglycol peuvent être ajoutés également.
Cependant de manière préférée, la composition liquide injectable ne comprendra pas de sucre. La formulation proposée permet en effet de maintenir la stabilité du produit sans avoir recours à des sucres ni des polyols, qui sont classiquement utilisés pour lyophiliser les protéines mais qui sont délétères dans la principale indication thérapeutique envisagée, à savoir le Syndrome Hémolytique et Urémique atypique (SHUa). Dans cette pathologie liée à un dysfonctionnement des reins, la présence de sucres dans la composition n'est pas recommandée car ceux-ci sont reconnus comme pouvant induire des problèmes d'insuffisance rénale aiguë.
On peut encore ajouter des antioxydants (par exemple methionine, monothioglycérol, glutathion, acide citrique, acide ascorbique, sodium metabisulfite, et sodium sulfite).
Des substances tampon peuvent être encore utilisées, par exemple sous forme de carbonate, phosphate, citrate, acétate, borate, trimethamine [(2-amino-2-hydroxymethyl- 1 ,-3- propanediol),TRIS], glycine et lysine (PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology, Vol. 51 (4), 1997: Excipients and their use in injectable products (SANDEEP NE MA, R.J. WASHKUHN, R.J. BRENDEL, pp166-171 ).
Le Facteur H, dans cette formulation, est stabilisé sous forme liquide, sous forme congelée, lors de la lyophilisation et lors du stockage après lyophilisation, comme décrit ci-dessous.
Lyophilisation
La formulation liquide de Facteur H subit ensuite une lyophilisation, pour l'obtention d'une forme solide.
Les méthodes de lyophilisation sont bien connues de l'homme du métier, voir par exemple Wang et al, Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals, International Journal of Pharmaceutics, Vol 203, p 1 -60, 2000.
De préférence le degré d'humidité est inférieur ou égal à 3% en poids, de préférence inférieur ou égal à 2,5%, de préférence inférieur ou égal à 2%, de préférence inférieur ou égal à 1 ,5%.
Reconstitution
La composition solide est ensuite dissoute dans de l'eau pour préparations injectables (ou « water for injection ou WFI ») pour obtenir une composition à usage thérapeutique.
Les inventeurs sont parvenus à concentrer le Facteur H, en diminuant le volume nécessaire à la reconstitution. Ce volume de reconstitution est n fois inférieur au volume V initial de la formulation liquide soumise à lyophilisation, n étant un nombre supérieur à 1 , de préférence 2 ou 3.
Les concentrations en excipients (dont les concentrations C2 et C3, respectivement en arginine et citrate de sodium) et le volume de reconstitution sont choisies de manière à ce que la composition liquide injectable obtenue finalement soit iso-osmolaire avec le plasma humain. De préférence la formulation liquide de Facteur H présente donc une osmolarité comprise entre 250 et 350 mOsmol/kg.
Dans un exemple particulier, la formulation liquide de Facteur H avant lyophilisation comprend, outre du Facteur H,
Arginine ou ses sels (de préférence le chlorhydrate) 12g/L
Isoleucine 3g/L
Glycine 0,6g/L
Lysine ou ses sels (de préférence le chlorhydrate) 0,6g/L
Citrate de sodium, de préférence sous forme dihydratée 0,75g/L et n=2.
Les inventeurs ont montré que, dans la formulation proposée, le facteur H était stable, même en diluant au demi chacun des excipients. La solution ainsi obtenue présente une faible osmolalité avant lyophilisation ce qui permet de concentrer le principe actif (Facteur H) en réhydratant le lyophilisât avec un volume deux fois moins important de diluant (c'est-à-dire de l'eau pour préparations injectables) pour obtenir un produit injectable iso- osmolaire avec le plasma humain.
Les exemples illustrent l'invention sans en limiter la portée. Exemples :
Exemple 1 : Purification du Facteur H
1 .1 . Protocole
Ajustement du matériau de départ
On a utilisé comme matériau de départ une solution A, obtenue de la manière suivante : Du plasma décongelé a subi une cryoprécipitation. Après centrifugation, une partie du cryosurnageant a été soumise à une chromatographie sur DEAE Sephadex, qui fixe les facteurs Vitamine K-dépendants. Une fraction non retenue sur DEAE-Sephadex est mélangée avec le cryosurnageant restant pour constituer la Solution A.
Celle-ci a été ajustée à un pH de 6.0 ± 0,1 avec une solution de HCI à 0,5N. Deux lots L1 et L2 ont été préparés. Chromatographie sur colonne héparine -Sépharose FF
Les lots sont soumis à une chromatographie sur colonne BP 1 13 chargée avec 1500 mL de gel héparine-Sépharose Fast Flow (FF) (15cm x 10 cm) équilibrée dans un tampon de phosphate de sodium à 20 mM, une osmolalité de 60±5 mOsm/kg, pH 6,0±0,1. La même solution tampon a été utilisée pour laver le gel jusqu'au retour à la densité optique (DO) basale mesurée à 280nm. La charge protéique appliquée était de 560 et 720 mg de protéines/mL de gel pour les lots L1 et L2 respectivement. Une solution tampon de phosphate de sodium 20mM, chlorure de sodium 60mM, osmolalité de 165110 mOsm/kg, pH 7,4±0,1 a ensuite été injectée dans la colonne pour éluer les protéines qui étaient adsorbées faiblement sur le gel. Le gel a été ré-équilibré par l'injection de 2 à 3 volumes de solution tampon d'équilibrage ajustée à pH 6,5. Le Facteur H a ensuite été élué par l'injection d'une solution tampon contenant du phosphate de sodium 20mM, chlorure de sodium 250mM, 4,5g/L arginine-HCI, osmolalité de 550110 mOsm/kg, pH 6,5±0,1 . Un lavage final de la colonne a été réalisé en injectant une solution de chlorure de sodium 2M pour éluer les protéines qui étaient fortement adsorbées sur le gel, en particulier l'antithrombine III. Le débit linéaire était de 50cm/h pour toutes les étapes de chromatographie. La fraction de Facteur H éluée a été congelée à -80°C jusqu'à l'étape suivante.
Chromatographie sur colonne SP -Sépharose FF
La fraction contenant le Facteur H éluée à partir de la colonne héparine-Sépharose FF a été décongelée dans un bain marie régulé à 30°C et ensuite ajustée aux conditions d'équilibrage de la colonne SP-Sépharose FF par dilution dans de l'eau purifiée pour atteindre une osmolalité de 95±5 mOsm/kg, et si nécessaire ajout d'une solution d'HCI à 0,5N pour obtenir un pH de 6,5±0,1 .
La fraction ajustée a été soumise à une chromatographie sur deux colonnes K50 montées en parallèle, chacune contenant 137mL de gel SP-Sépharose FF (7cm x 5cm) et équilibrée avec une solution tampon contenant du phosphate de sodium 20mM, 4,5g/L arginine-HCI, osmolalité de 95±5 mOsm/kg, pH 6,5±0,1 . La même solution tampon a été utilisée pour laver le gel jusqu'au retour à la densité optique (DO) basale mesurée à 280nm. Une solution contenant du phosphate de sodium 20mM, chlorure de sodium 60mM, 4,5g/L arginine-HCI, osmolalité de 200±10mOsm/kg, pH 6,5±0,1 , a ensuite été injectée dans chaque colonne pour éluer les protéines qui étaient adsorbées faiblement au gel. Le Facteur H a ensuite été élué par injection d'une solution une tampon contenant du phosphate de sodium 20mM, chlorure de sodium 165mM, 4,5g/L arginine-HCI, osmolalité de 40015 mOsm/kg, pH 6,510,1.
Un lavage final de la colonne a été réalisé en injectant une solution de chlorure de sodium 2M pour éluer les protéines qui étaient fortement adsorbées sur le gel. Le débit linéaire était de 100cm/h pour toutes les étapes de chromatographie. La fraction de Facteur H éluée a été congelée à -80°C jusqu'à l'étape suivante.
Traitement par Solvant- Détergent
La fraction de Facteur H éluée de la colonne de SP-Sépharose FF a été décongelée dans un bain marie régulé à 30°C. Elle a été ensuite soumise à un traitement par Solvant- Détergent en présence de 1 % polysorbate 80 (Tween 80) (p/v) et 0,3% de tri-n-butyl phosphate (TnBP) (v/v) à 25+1 °C.
Chromatographie sur colonne Q-Sépharose FF
La fraction de Facteur H traitée par Solvant-Détergent a été ajustée aux conditions d'équilibrage pour la colonne Q-Sépharose FF par dilution avec de l'eau purifiée pour atteindre une osmolalité de 140+10 mOsm/kg, et ajout d'une solution de NaOH à 1 N pour obtenir un pH de 7,5+0,1 pour le lot L1 et en utilisant une solution HCI à 0,5M si nécessaire pour obtenir un pH de 6,5+0,1 pour le lot L2. La fraction ajustée a été soumise à une chromatographie sur une colonne K50 contenant 190mL de gel Q-Sépharose FF (9,5cm x 5cm) et équilibrée avec une solution tampon contenant du phosphate de sodium 20mM, chlorure de sodium 25mM, 4,5g/L arginine-HCI, osmolalité de 140+10 mOsm/kg, pH 7,5+0,1 pour le lot L1 , et pH de 6,5+0.1 pour le lot L2. La même solution tampon a été utilisée pour laver le gel jusqu'au retour à la densité optique (DO) basale mesurée à 280nm. Le gel a été lavé pour éliminer les protéines non adsorbées sur le gel et le TnBP et Tween 80. Une solution tampon contenant du phosphate de sodium 20mM, chlorure de sodium 55mM, 4,5g/L arginine-HCI, osmolalité de 200+10 mOsm/kg, pH 7,5+0,1 pour le lot L1 , et pH 6,5+0,1 pour le lot L2 a ensuite été injectée dans la colonne pour éluer les protéines qui étaient adsorbées faiblement au gel. Le Facteur H a ensuite été élué par injection d'une solution tampon contenant du phosphate de sodium 20mM, chlorure de sodium 165mM, 4,5g/L arginine-HCI, osmolalité de 390+10mOsm/kg, pH 7,5+0,1 pour le lot L1 , et pH 6,5+0,1 pour le lot L2. Un lavage final de la colonne a été réalisé en injectant une solution de chlorure de sodium 2M pour éluer les protéines qui étaient fortement adsorbées sur le gel. Le débit linéaire était de 150cm/h pour toutes les étapes de chromatographie. La fraction de Facteur H éluée a été congelée à -80°C jusqu'à l'étape suivante. Filtration à 20-15n m
La fraction éluée de la colonne de Q-Sépharose FF a été ajustée à un pH de 6,5±0,1 pour le lot L2, et pH 7,5±0,1 pour le lot 1 , et a ensuite été clarifiée par filtration sur un filtre avec une taille de pores de 0,1 μηι et conservée une nuit à 4°C. La fraction clarifiée a été filtrée sur une séquence de filtres PLANOVA 20N et 15N au préalable équilibrée avec une solution tampon contenant du phosphate de sodium 20mM, chlorure de sodium 165mM, 4,5g/L arginine-HCI, osmolalité de 390±10mOsm/kg, pH 7,5 pour le lot L1 , et pH 6,5 pour le lot L2. La pression de filtration à l'entrée, appliquée au filtre de 15nm était de 300±50mbar et était maintenue constante. La filtration a été réalisée à la température du laboratoire.
Concentration/Formulation
La fraction de Facteur H filtrée a été formulée et a subi une diafiltration sur un module d'ultrafiltration équipé d'une membrane avec un seuil de coupure de poids moléculaire de 100kD.
Les lots ont été formulé avec une solution tampon composée de 12g/L arginine HCI, 3g/L isoleucine, 0,6g/L glycine, 0,6g/L lysine HCI, 0,75 g/IL trisodium citrate, osmolalité 150±10mOsm/kg, pH 7,5±0,1 . La concentration protéique finale en Facteur H était de 5g/L.
Filtration 0,22μπι
Le produit concentré et formulé a été filtré sur un filtre de 0,22μηΊ Millipak 20 sous hotte à flux laminaire et conditionné.
1 .2. Tests de pureté
Des échantillons des fractions de Facteur H en cours de purification ont été prélevés à la fin de chacune des étapes indiquées à l'exemple 1 .1. Le dosage du Facteur H est réalisé classiquement par méthode immunoenzymatique (ELISA) avec des réactifs commerciaux (Diagnostica Stago). Brièvement, le Facteur H à doser est capté par un anticorps anti-Facteur H humain immobilisé sur une phase solide. Le Facteur H fixé est ensuite reconnu par un immuno-conjugué à la peroxydase. Le taux de peroxydase liée est mesuré par son activité sur le substrat ortho-phénylènediamine en présence d'eau oxygénée. L'intensité de la coloration, après arrêt de la réaction par un acide fort, est fonction de la quantité de facteur H présente initialement dans l'échantillon. Le Facteur H ainsi dosé est appelé « Facteur H antigène » ou « Ag ».
Les résultats de purification sont indiqués dans les tableaux ci-dessous.
Tableau 1A : Pureté du Facteur H pour le Lot L1
Figure imgf000018_0001
Tableau 1 B : Pureté du Facteur H pour le Lot L2
Figure imgf000018_0002
Les valeurs de pureté supérieures à 1 ,0 sont données à titre indicatif seulement. Exemple 2 : Préparation de concentrés de Facteur H, et tests de stabilité
2.1 . Matériels et méthodes :
Deux autres lots de plasma sanguin, dits « lots de faisabilité » L3 et L4, ont été soumis au procédé de purification décrit à l'exemple 1.
Les concentrés de Facteur H obtenus ont été formulés de la manière suivante.
Tableau 2 : Composition du concentré filtré (avant lyophilisation) obtenu à partir du lot L3
Figure imgf000019_0001
Une partie a été lyophilisée en flacons en verre bouchés avec des bouchons en élastomère et conservée à 40°C. Une autre partie a été stockée, sous forme liquide, à 5°C, afin d'estimer la stabilité de la formulation sous cette forme, pendant 6 mois.
Pour les analyses, la reconstitution de la partie lyophilisée a été réalisée avec un volume d'eau pour préparations injectables égal au volume initial réparti dans chaque flacon de formulation lyophilisée (n=1 ). Tableau 3 : Composition du concentré filtré (avant lyophilisation) obtenu à partir du lot L4
Figure imgf000019_0002
La composition a été lyophilisée en flacons en verre bouchés avec des bouchons en élastomère, une partie a été conservée à 40°C, l'autre partie a été conservée à 5°C. Pour les analyses, la reconstitution de la composition lyophilisée a été réalisée avec un volume d'eau pour préparations injectables égal à la moitié du volume initial réparti dans chaque flacon de formulation lyophilisée (n=2).
Les analyses suivantes ont été pratiquées:
Mesure du pH :
Son suivi permet l'observation d'une alcalinisation ou d'une acidification du produit au cours du temps. Distribution de la taille moléculaire par chromatographie par exclusion de taille à haute pression HP SEC (DTM) :
Cette analyse permet de mettre en évidence l'apparition de fragments, dimères ou polymères : reflet d'une dégradation de la protéine. La séparation est effectuée sur colonne type Superdex Tricorn 200 10/300 GL - GE Healthcare (Réf : 03441 1 1 ). La révélation est faite par lecture à une densité optique (DO) à 280 nm.
Mesure de la densité optique (DO) à 280 nm (Spectrophotomètre SHIMADZU UV 2401): Grâce aux cycles aromatiques de certains acides aminés (tryptophane, tyrosine, phénylalanine), les protéines absorbent dans l'ultraviolet. La densité optique (DO) à 280 nm, en utilisant de l'eau comme blanc, est mesurée afin de mettre en évidence une évolution de la DO. La DO est fonction de la concentration en protéines.
Analyse thermique par DSC (Differential Scanning Calorimetry ou Calorimétrie différentielle à balayage DSC, sur appareil DSC7 - TAC 7/DX, Perkin Elmer) :
La température de transition vitreuse a été déterminée par un thermoanalyseur différentiel à balayage DSC 7 (Perkin Elmer) calibré à l'aide d'indium (de température de fusion (Tm) 156,6°C) et de n-octadécane (Tm 38,2°C). Les échantillons ont subi des températures de - 50 à 138°C à la vitesse de 20°C/min. L'hélium a été utilisé pour mener les expériences à une température inférieure à la température ambiante. La température de transition vitreuse (Tg) a été prise au point médian du changement endothermique dans la chaleur spécifique apparente. Deux mesures ont été réalisées et la moyenne donne la Tg.
Mesure de taille (Nano-ZS, Malvern) :
500 microlitres de chaque échantillon issus de la lyophilisation ont été placés dans une microcuvette (Plastibrand®, Wertheim, Allemagne), qui a été transférée dans un appareil Zetasizer Nano (Malvern Instruments, Worcestershire, UK). Cet appareil fonctionne avec un laser à 633nm He-Ne à 4mM, et une technique non invasive de rétrodiffusion « Non- Invasive Backscatter » ou NIBS.
La distribution de taille des populations monomériques de la protéine par intensité et volume a été calculée à partir du logiciel Dispersion Technology Software de Malvern (version 4.00). Les indices de réfraction du matériau et du dispersant ont été définis à 1 ,33 et 1 ,45 respectivement. La température durant les mesures a été contrôlée et fixée à 20°C. L'un des paramètres de qualité pour les formulations testées est le diamètre de la population de protéines sous forme de monomères. Dosage de l'activité anti-convertase du facteur H.
Le taux calculé correspond à la quantité de facteur H qui permet de dissocier 50% de la C3 convertase préformée, on l'appelle aussi EC 50 (concentration effective pour avoir 50% de l'activité). Un échantillon de pool de plasma est passé à chaque analyse pour servir de référence. Plus le pourcentage est élevé, plus il faut de facteur H pour dissocier la même quantité de C3 convertase donc moins le facteur H est actif. Toute augmentation du taux traduit une dénaturation de la protéine.
2.2. Résultats :
Les résultats sont présentés dans les tableaux 4 et 5 suivants.
Tableau 4 : Stabilité de la formulation issue du lot L3
Figure imgf000021_0001
La formulation est stable 2 mois à 5°C sous forme liquide et 6 mois à 40°C sous forme lyophilisée. Tableau 5 : Stabilité de la formulation issue du lot L4
Figure imgf000022_0001
Sous forme lyophilisée la formulation est stable 6 mois à 40°C et 12 mois à 5°C. Exemple 3 : Tests de stabilité complémentaires de formulations concentrées lyophilisées
La faisabilité de concentrer le Facteur H a été confirmée par la suite avec un autre lot, désigné L5, de même composition que le lot L4, et diluée de la même manière au ½, ce lot étant conservé sous forme lyophilisée pendant 6 mois à 40°C.
Un autre lot a été préparé, désigné L6, comprenant la composition suivante :
Tableau 6 : Composition du concentré filtré (avant lyophilisation) obtenu à partir du lot L6
Composant Concentration
Facteur H Environ 6g/L
Arginine, HCI 12g/L
Isoleucine 3g/L
Glycine 0,6g/L
Lysine, HCI 0,6gL
Citrate Na, 2H20 0,75g/L Ce lot a été réparti et lyophilisé dans sa forme finale, à savoir 20ml de la formulation ci- dessus, dans un flacon de 30ml. La stabilité a été étudiée sur une période de 6 mois à 40°C, et confirmée. Exemple 4 : Reconstitution d'une formulation pour préparation injectable
Un lot L7 de Facteur H a été fabriqué et formulé, selon la composition suivante :
Tableau 7 : Composition du concentré filtré obtenu à partir du lot L7
Figure imgf000023_0001
Le produit est reconstitué avec un volume deux fois moins élevé que le volume de remplissage, la solution finale étant iso-osmolaire.
Ce lot a été réparti et lyophilisé dans sa forme finale, à savoir 20ml de la formulation ci- dessus, dans un flacon de 30ml. Puis la reconstitution a été réalisée par injection dans le flacon, de 10ml d'eau pour préparation injectable. La stabilité de la formulation reconstituée a été confirmée après conservation à 5°C et 25°C pendant 24h.

Claims

Revendications
Procédé d'obtention d'une composition liquide injectable de Facteur H, comprenant
a. la fourniture d'une composition solide obtenue par lyophilisation d'un volume V d'une formulation liquide comprenant du Facteur H de concentration C1 , de l'arginine ou l'un de ses sels, de concentration C2, du citrate de sodium, de concentration C3,
b. l'ajout d'un volume V/n d'eau, avec n>1 ,
par ce en quoi on obtient une composition liquide injectable contenant du Facteur H à une concentration C=C1xn.
Procédé selon la revendication 1 , dans lequel n est égal à 2.
Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le Facteur H provient de plasma humain.
Procédé selon la revendication 3, dans lequel le Facteur H a été obtenu par un procédé comprenant les étapes consistant à :
(i) obtenir une fraction de plasma sanguin contenant du Facteur H ;
(ii) soumettre la fraction obtenue à l'étape (i) à une unique chromatographie d'affinité de type héparine;
(iii) soumettre la fraction enrichie en Facteur H obtenue à l'étape (ii) à une chromatographie échangeuse de cations ;
(iv) soumettre la fraction enrichie en Facteur H obtenue à l'étape (iii) à une chromatographie échangeuse d'anions ;
et comprenant en outre au moins une étape d'inactivation virale, de préférence par l'action d'un solvant et/ou d'un détergent, et/ou au moins une étape d'élimination virale, de préférence par nanofiltration.
Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel l'arginine dans la formulation est sous forme de chlorhydrate ou de phosphate d'arginine.
Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel la formulation liquide de Facteur H avant lyophilisation comprend en outre au moins un autre acide aminé hydrophile.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel la formulation liquide de Facteur H avant lyophilisation comprend en outre au moins un acide aminé hydrophobe.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel la formulation liquide de Facteur H avant lyophilisation comprend de l'arginine, de préférence sous forme de son chlorhydrate, du citrate de sodium, de préférence sous forme dihydratée, de l'isoleucine, de la glycine, et de la lysine ou l'un de ses sels.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, dans lequel la concentration C en Facteur H dans la composition liquide injectable est comprise entre 0,5 et 50g/L, de préférence entre 1 et 30g/L, de préférence encore entre 5 et 20g/L, ou encore entre 10 et 20g/L.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, dans lequel la formulation liquide de Facteur H présente une osmolarité comprise entre 250 et 350 mOsmol/kg.
1 1 . Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, dans lequel la formulation liquide de Facteur H avant lyophilisation comprend, outre du Facteur H,
Arginine ou ses sels (de préférence le chlorhydrate) 12g/L
Isoleucine 3g/L
Glycine 0,6g/L
Lysine ou ses sels (de préférence le chlorhydrate) 0,6g/L Citrate de sodium *2H20 0,75g/L et n=2.
12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 1 1 , dans lequel la composition liquide injectable ne comprend pas de sucre.
13. Composition liquide injectable de Facteur H, comprenant, outre du Facteur H à une concentration comprise entre 0,5 et 50g/L, de préférence entre 1 et 30g/L, de préférence encore entre 5 et 20g/L, ou encore entre 10 et 20g/L,
Arginine ou ses sels (de préférence le chlorhydrate) 24g/L Isoleucine 6g/L
Glycine 1 ,2g/L
Lysine ou ses sels (de préférence le chlorhydrate) 1 ,2g/L
Citrate de sodium, de préférence sous forme dihydratée 1 ,5g/L
14. Composition solide de Facteur H obtenue par lyophilisation d'une formulation comprenant, outre du Facteur H à une concentration comprise entre 0,5 et 50g/L, de préférence entre 1 et 30g/L, de préférence encore entre 5 et 20g/L, ou encore entre 10 et 20g/L,
Arginine ou ses sels (de préférence le chlorhydrate) 12g/L
Isoleucine 3g/L
Glycine 0,6g/L
Lysine ou ses sels (de préférence le chlorhydrate) 0,6g/L Citrate de sodium, de préférence sous forme dihydratée 0,75g/L
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