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WO2011046200A1 - 分化誘導因子又はその類縁体を含有する抗炎症剤 - Google Patents

分化誘導因子又はその類縁体を含有する抗炎症剤 Download PDF

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WO2011046200A1
WO2011046200A1 PCT/JP2010/068157 JP2010068157W WO2011046200A1 WO 2011046200 A1 WO2011046200 A1 WO 2011046200A1 JP 2010068157 W JP2010068157 W JP 2010068157W WO 2011046200 A1 WO2011046200 A1 WO 2011046200A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dif
mpges
compound
cells
treatment
Prior art date
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Application number
PCT/JP2010/068157
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English (en)
French (fr)
Inventor
富美 高橋
俊之 笹栗
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kyushu University NUC
Original Assignee
Kyushu University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyushu University NUC filed Critical Kyushu University NUC
Publication of WO2011046200A1 publication Critical patent/WO2011046200A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/192—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having aromatic groups, e.g. sulindac, 2-aryl-propionic acids, ethacrynic acid 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P11/06—Antiasthmatics
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P37/02—Immunomodulators
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin

Definitions

  • the present invention relates to a novel use of a differentiation-inducing factor or an analog thereof.
  • the present invention is useful in the pharmaceutical, food and cosmetic fields.
  • DIF-1 Differentiation-inducing factor
  • Dictyostelium discoideum a type of cellular slime mold, and the assembled slime mold cells form fruiting bodies. It is an active factor that induces differentiation into stalk cells.
  • DIF-1 was identified by Kay et al. In the UK (Non-Patent Document 1), and several related substances, for example, diferanisole A (differanisole A, DA) were subsequently discovered from Chaetomium (Non-patent document 1) Patent Document 2).
  • DIF-1 and DA were found to have strong activity against mammalian cells. The growth inhibitory effect of mouse erythroleukemia cells and human leukemia cells, the cell cycle arrest effect in normal vascular smooth muscle cells, and the differentiation induction effect on contractile smooth muscle have been reported.
  • Inflammation is a tissue / systemic reaction to invasion from outside and inside of a living body, such as wounds, infections, vascular disorders, tumors, and so-called “inflammatory symptoms” such as edema, erythema, pain, and fever.
  • steroidal anti-inflammatory drugs such as dexamethasone and betamethasone and nonsteroidal anti-inflammatory drugs such as aspirin and indomethacin are known.
  • Steroid anti-inflammatory drugs have a strong anti-inflammatory action, but due to their various physiological activities, causing side effects such as osteoporosis and gastric ulcer has been a problem.
  • Non-steroidal anti-inflammatory drugs exert anti-inflammatory effects by inhibiting the first enzyme, cyclooxygenase (COX), in the biosynthetic pathway of prostaglandins, which are inflammatory mediators.
  • COX cyclooxygenase
  • COX-1 type is a constitutive enzyme present in a certain amount in a living body and is involved in maintaining homeostasis of the living body.
  • COX-2 type is an inducing enzyme that is transiently expressed by stimulation with lipopolysaccharide and plays an important role in the inflammatory process. Therefore, inhibition of COX-1 type by non-steroidal anti-inflammatory drugs causes side effects such as gastrointestinal disorders and kidney disorders. In order to reduce such side effects, inhibitors specific to COX-2 type have been developed, but have been reported to cause serious side effects such as an increased incidence of cardiovascular events.
  • Prostaglandin E synthase is located downstream of COX in the so-called arachidonic acid cascade that produces various chemical mediators, and plays the most important role in prostaglandins as an inducer of inflammatory reaction. It is an enzyme responsible for the final step in the synthesis of prostaglandin E.
  • As prostaglandin E synthase cytosolic prostaglandin E synthase (cytosolic prostaglandin E synthase, cPGES) and membrane-bound prostaglandin E synthase (membrane prostaglandin E synthase, mPGES) have been reported.
  • Two types of mPGES have been reported: mPGES-1 and mPGES-2. Unlike the constant expression of cPGES and mPGES-2, mPGES-1 is an inducing enzyme, and its expression is increased by inflammatory factors, suggesting that it is involved in the progression of inflammation (Non-Patent Document 3).
  • a composition containing a differentiation-inducing factor or an analog thereof has an inflammation and / or tumor caused by an action mechanism that has not been known so far. Found to be effective for treatment. Furthermore, even when the composition is administered over a long period of time, side effects (such as gastrointestinal disorders, renal disorders, cardiovascular disorders, myelosuppression, and weight loss, which have been problematic in the use of conventional nonsteroidal anti-inflammatory drugs) ) was also kept low.
  • side effects such as gastrointestinal disorders, renal disorders, cardiovascular disorders, myelosuppression, and weight loss, which have been problematic in the use of conventional nonsteroidal anti-inflammatory drugs
  • the present invention provides the following.
  • R 1 is selected from hydroxy and —O—C 1-3 alkyl
  • R 2 is selected from hydrogen, chloro, bromo, and iodo
  • R 3 is selected from —O—C 1-3 alkyl and hydroxy
  • R 4 is selected from hydrogen, chloro, bromo and iodo
  • R 5 is selected from hydroxy, C 1-6 alkyl, and —O—C 1-3 alkyl
  • R 6 is selected from hydrogen, hydroxy, C 1-10 alkyl, and C 3-6 cycloalkyl
  • the —O—C 1-3 alkyl, C 1-6 alkyl, C 1-10 alkyl, and C 3-6 cycloalkyl are each independently selected from hydroxy, amino, methyl, and methoxy on carbon.
  • substituents or a pharmaceutical, food, or cosmetically acceptable salt thereof, and a pharmaceutical, food, or cosmetically acceptable excipient or carrier.
  • the compound represented by the formula (I) is 1- [3,5-dichloro-2,6-dihydroxy-4-methoxyphenyl] -1-hexanone, 1- [3,5-dichloro-2, 6-dihydroxy-4-methoxyphenyl] -1-pentanone, 1- [3-chloro-2,6-dihydroxy-4-methoxyphenyl] -1-hexanone, or 3,5-dichloro-2-hydroxy-4-
  • a membrane-bound prostaglandin E synthase expression inhibitor comprising the compound defined in (1).
  • composition according to (6) for administration to a subject having a disease or condition that requires treatment for a long time.
  • composition according to (7) for treatment of malignant tumor (preferably for treatment).
  • composition according to any one of (1) to (3), which is in a form suitable for oral administration.
  • a method for screening a compound using the compound represented by the formula (I) defined in (1) Culturing cells introduced with a firefly luciferase reporter vector incorporating the human mPGES-1 promoter, Treating the cells with a test compound; Measure luciferase activity after treatment, Selecting a test compound that strongly inhibits luciferase activity compared to treatment with a compound represented by formula (I) defined in (1), By selecting a test compound that strongly inhibits the activity of the mPGES-1 promoter, Cells stimulated with PMA and LPS are treated with the test compound selected above, Detecting the expression of cPGES, mPGES-2, and COX-2 proteins after treatment; Compared to the treatment with the compound represented by the formula (I) defined in (1), selecting a test compound that does not affect the expression level of cPGES, mPGES-2, and COX-2 proteins. Including, Said screening method.
  • test compound is a compound designed by the method according to (11).
  • the data is a relative value obtained by correcting the measured value of mPGES-1 with the measured value of GAPDH and taking the value of only PMA stimulation as 1.
  • the measured value is an average of three measured values.
  • FIG. 2 is a diagram showing the effect of suppressing expression of mPGES-1 mRNA by DIF-1.
  • the values in the figure are relative values obtained by correcting the measured value of mPGES-1 with the measured value of GAPDH and setting the value at 24 hours after stimulation by LPS (Time 0) to 1.
  • the measured value is an average of three measured values.
  • the relative value with 1 as the value at 0 hours of HCT-116 cells not treated with DIF-1 was shown.
  • cont DIF-1 unprocessed. In THP-1 cells after LPS stimulation, it illustrates the production of PGE 2 inhibition by DIF-1.
  • PMA only stimulation with PMA only
  • LPS 24 stimulation with LPS for 24 hours
  • LPS 48 stimulation with LPS for 48 hours, DIF-1 untreated
  • + DIF 30 ⁇ M treatment with DIF-1 (30 ⁇ M) for 24 hours.
  • A Detection of cPGES and mPGES-2 proteins by Western blot.
  • PMA only Stimulation with PMA only; Time 0: 0 hour treatment with DIF-1; Control (24 h): Culture for 24 hours without DIF-1 treatment; DIF-1 (24 h): Treatment with 24 hours with DIF-1
  • CPGES cytoplasmic prostaglandin E synthase
  • mPGES-2 membrane-bound prostaglandin E synthase-2
  • tubulin tubulin.
  • B Densitometry of the bands corresponding to cPGES, mPGES-2, and tubulin protein in (A). The data is a relative value with the measured value of cPGES (upper figure) and mPGES-2 (lower figure) corrected with the measured value of tubulin, and the measured value of PMA stimulation alone is 1.
  • the measured value is an average of three measured values. It is a figure which shows the effect on the expression of COX-2 protein by DIF-1. THP-1 cells were treated with LPS and then stimulated with DIF-1. After LPS stimulation, the expression of COX-2, mPGES-1 and GAPDH protein was analyzed by Western blot. Lanes 1 and 2: DIF-1 untreated, 0 hours. Lanes 3 and 4: DIF-1 untreated, cultured for 24 hours. Lane 5: DIF-1 treatment, culture for 24 hours.
  • PMA Phorbol-12-myristate-13-acetate
  • LPS Lipopolysaccharide (1 ⁇ g / ml, 10 ⁇ g / ml)
  • COX-2 Type 2 cyclooxygenase
  • mPGES-1 Membrane-bound prostaglandin synthase 1
  • GAPDH glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase
  • + added
  • - no added.
  • the measured value is an average of three measured values. 1hr (+): treated with DIF-1 for 1 hour; 3hr (+): treated with DIF-1 for 3 hours; 1hr (-): treated with DIF-1 untreated for 1 hour; 3hr (-): not treated with DIF-1 Processing for 3 hours. It is a figure which shows the influence of DIF-1 on the mPGES-1 promoter activity using the cervical cancer origin HeLa cell. The relative value which set the value in 0 hours of DIF-1 untreated HeLa cells to 1 was shown. ⁇ : DIF-1 unprocessed; ⁇ : DIF processing. It is a figure which shows the change of the DIF-1 density
  • composition or agent of the present invention (In the present specification, among the compositions or agents of the present invention, the “composition” may be described as an example. The same applies to the “agent” of the invention.)
  • the differentiation-inducing factor (DIF) or an analog thereof is an active ingredient.
  • DIF or an analog thereof refers to DIF-1, DIF-2, DIF-3 and DA, and compounds having structures similar to these and having similar activities.
  • One embodiment thereof is a compound represented by the formula (I).
  • the “compound represented by formula (I)” is as follows: (R 1 to R 6 are as defined above).
  • the substituent R 1 is preferably hydrogen or hydroxy, more preferably hydroxy.
  • Substituent R 2 is preferably hydrogen, chloro or bromo, more preferably hydrogen or chloro.
  • the substituent R 3 is preferably —O—C 1-3 alkyl.
  • the —O—C 1-3 alkyl is methoxy, ethoxy, or propoxy, preferably methoxy or ethoxy, and more preferably methoxy.
  • Substituent R 4 is preferably hydrogen, chloro or bromo, more preferably hydrogen or chloro.
  • the substituent R 5 is preferably any of hydroxy, C 1-6 alkyl, and —O—C 1-3 alkyl.
  • substituent R 5 is C 1-6 alkyl, it is preferably methyl, ethyl, propyl, butyl, or pentyl, more preferably ethyl, propyl, or butyl, and even more preferably pentyl.
  • substituent R 5 is —O—C 1-3 alkyl, it is preferably methoxy.
  • the substituent R 6 is preferably hydrogen, hydroxy or C 1-10 alkyl, more preferably hydroxy or C 1-10 alkyl.
  • the C 1-10 alkyl is preferably methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl or heptyl, more preferably butyl, pentyl or hexyl, particularly preferably butyl or It is pentyl.
  • DIF family compounds that fall within the definition of the above formula (I) may be collectively referred to as “DIF family”.
  • DIF-1 is also active in DA (1-position: —COOH, 6-position: —C 3 H 7 ) where the substituents at the 1-position and 6-position of the phenyl group are different.
  • DIF-3 which is different from DIF-1 in that it does not have -Cl at the 5-position of the phenyl group, has almost the same activity as DIF-1
  • DIF-1 Derivative 2-MIDIF-1 1- [3,5-Dichloro-2,4-dihydroxy-6-methoxyphenyl] -1-hexanone (-OH at the 4-position and -OCH 3 at the 6-position of the phenyl group) 6-MIDIF-3, which is a derivative of DIF-3: 1- [3-chloro-2,4-dihydroxy-6-methoxyphenyl] -1-hexanone (4 of the phenyl group) It is different from DIF-3 in that it has —OH at the position and —OCH 3 at the 6 position), and THPH: 1- [2,4,6-trihydroxyphenyl] -1-hexanone has very weak activity Indicated.
  • the hydroxyl group at the 2-position (R 1 ), the chloro group at the 3-position (R 2 ), and the methoxy group at the 4-position (R 3 ) of the phenyl group are important for activity expression. It is possible that there is. That is, among the compounds represented by the formula (I), a preferable compound is one having any one of the three substituents, and a more preferable compound is two of the three substituents. More preferable compounds are those having all the three substituents.
  • One embodiment of the “compound represented by formula (I)” in the present invention is, for example, 1- [3,5-dichloro-2,6-dihydroxy-4-methoxyphenyl] -1-hexanone (differentiation induction) Factor-1: DIF-1), 1- [3,5-dichloro-2,6-dihydroxy-4-methoxyphenyl] -1-pentanone (differentiation-inducing factor-2: DIF-2), or 1- [3 -Chloro-2,6-dihydroxy-4-methoxyphenyl] -1-hexanone (differentiation induction factor-3: DIF-3) or 3,5-dichloro-2-hydroxy-4-methoxy-6-propylbenzoic acid (Differanisole A: DA).
  • DIF-1, DIF-2, DIF-3, and DA The structural formulas of DIF-1, DIF-2, DIF-3, and DA are shown below.
  • the production method of the DIF family may be a non-biological method, a biological method, or a combination of these methods, but a production method using a non-biological method is simple.
  • Non-biological techniques include organic synthesis. Generally available compounds, reagents and instruments necessary for organic synthesis can be used. The synthesis reaction may be synthesized according to a method generally known to those skilled in the art, for example, the method described in Makr S. MASENTO et al. (Biochem. J. (1988) 256, 23-28).
  • the DIF family may also be prepared by biological techniques such as culturing microorganisms. Microorganisms suitable for the preparation of the target compound may be screened by methods known among those skilled in the art.
  • Microorganisms suitable for the preparation of the DIF family are not limited, but are preferably molds.
  • mold microorganisms include those belonging to the genus Dictyostelium (Dictyostelium) and Chaetomium.
  • Dictyostelium discoideum As one aspect, there are Dictyostelium discoideum, Dictyostelium mucoroides, Dictyostelium purpureum, Polysphondylium violaceum, and the like.
  • Microorganism culture may be performed under conditions known to those skilled in the art.
  • the DIF family thus produced may be used as it is or may be used after purification depending on the purpose of use.
  • the purification method can be performed by methods known among those skilled in the art.
  • the compounds belonging to the DIF family are very stable and can be stored for a long period of time under normal circumstances.
  • the composition of the present invention can be a pharmaceutical composition, a food composition, or a cosmetic composition.
  • composition of the present invention can be used for treatment of diseases or conditions.
  • Treatment refers to, for example, diagnosis, prevention, treatment, reduction, or prevention of progression.
  • Examples of the disease or condition targeted by the composition of the present invention include inflammation, tumor, arteriosclerosis, asthma, immune disease and the like, preferably inflammation, tumor and immune disease, more preferably inflammation. , Tumors and immune diseases, particularly preferably inflammation.
  • Inflammation refers to a tissue / systemic response to external or internal invasion to a living body such as a wound, infection, vascular disorder, or tumor. Inflammation includes acute inflammation and chronic inflammation. Acute inflammation generally refers to inflammation that progresses quickly and ends early. On the other hand, chronic inflammation generally means that inflammation lasts for a long time. Although there is no uniform temporal definition for distinguishing between acute and chronic inflammation, taking hepatitis as an example, what ends in 1 to 3 months is called acute hepatitis, which lasts over 6 months When hepatic dysfunction continues, it may be called chronic hepatitis.
  • the “disease or condition that needs to be taken for a long time” in the present invention is individually determined for each disease or condition based on the ordinary knowledge of those skilled in the art.
  • the composition of the present invention may be applied to any treatment of acute inflammation and chronic inflammation.
  • Chronic inflammation causes, but are not limited to, transition from acute inflammation; persistent intracellular infection by certain microorganisms such as tuberculosis and certain fungi; exposure to potentially toxic substances; For example, inhaled silicic acid particles (which cause a chronic inflammatory response to the lungs) and, as endogenous ones, chronically increased serum lipids (causing arteriosclerosis called atherosclerosis); It raises an immune response against it, autoimmunity;
  • Examples of chronic inflammation include rheumatoid arthritis, chronic gastritis, and chronic nephritis.
  • rheumatoid arthritis as used in the present invention is a disease in which autoimmune diseases are considered to be one of the onset factors. Chronic inflammation and joint destruction progress in the joint, resulting in impaired joint function. When severe, joint deformity occurs.
  • composition of the present invention is particularly useful in such applications because it can reduce side effects as compared with conventionally known anti-inflammatory agents.
  • Tumor as used in the present invention means a true tumor, that is, a neoplastic tumor: a tumor with abnormal growth of tumor cells derived from somatic cells.
  • True tumors include benign tumors and malignant tumors, and are preferably applied to the treatment of malignant tumors.
  • a malignant tumor is a fatal tumor that differs from normal cells in various ways in the form and arrangement of tumor cells and is metastatic and invasive.
  • malignant tumors include oral cancer, nasal cavity cancer, laryngeal cancer, pharyngeal cancer, tongue cancer, malignant lymphoma, malignant melanoma, maxillary cancer, cranial nerve malignant tumor, glioma, Meningioma, glioma, lung cancer, cervical cancer, breast cancer, breast sarcoma, thyroid cancer, thyroid papillary gland cancer, alveolar epithelial cancer, large cell undifferentiated cancer, small cell undifferentiated cancer Cancer, testicular cancer, prostate cancer, bone tumor, leukemia, multiple myeloma, esophageal cancer (squamous cell carcinoma), stomach cancer, stomach / colon leiomyosarcoma, pancreatic / gallbladder cancer, duodenal cancer, colon (Adenocarcinoma), small intestine cancer, primary liver cancer (hepatocellular carcinoma, cholangiocellular carcinoma), and hepatoblastoma, preferably cervical cancer, colon cancer, and leuk
  • composition of the present invention is effective for the treatment of inflammation and tumor, it is effective even when these symptoms or conditions occur together.
  • One aspect of treatment of a symptom or condition by the composition of the present invention is, but is not limited to, treatment, reduction, prevention, or inhibition of progression of the symptom or condition.
  • prostaglandin E synthesis inhibition refers to inhibiting PGE synthesis.
  • PGES PGE synthase
  • PGES has been reported to contain cytoplasmic PGES (cPGES) and membrane-bound PGES (mPGES). It is reported that mPGES-1 and mPGES-2 exist in mPGES.
  • mPGES-1 is implicated in the progression of inflammation because its gene expression is increased by inflammatory factors.
  • composition of the present invention suppresses the expression of mPGES-1, but does not affect the expression of cPGES and mPGES-2. Therefore, the composition of the present invention can be preferably used for treatment of inflammation, tumor and the like while reducing side effects.
  • mPGES-1 expression inhibitor specifically means inhibiting transcription of genomic DNA into mRNA.
  • DIF family suppresses the expression of mPGES-1 at the mRNA level.
  • mPGES-1 is known to be an enzyme mainly induced by inflammatory stimuli and involved in exacerbation of inflammation, and an inhibitory effect on the inflammatory reaction due to decreased expression of the enzyme can be expected. That is, the DIF family can be expected to exert an anti-inflammatory effect not via mPGES-1 activity suppression but via mPGES-1 expression suppression.
  • the “clinically effective amount” as used in the present invention refers to an amount of the composition that enables treatment of a disease or condition when the composition of the present invention is administered.
  • the composition can be administered in a clinically effective amount for the treatment of inflammation.
  • the clinically effective amount is, for example, 500 to 7500 mg / kg, preferably 50 to 750 mg / kg, more preferably 5 to 75 mg / kg per kg body weight of the mouse. When administered to humans, 1/10 to 1/100 of the above dose is considered appropriate.
  • the dose is 50 to 750 mg / kg, preferably 5 to 75 mg / kg, more preferably 0.5 to 7.5 mg / kg, particularly preferably 0.05 to 0.75 mg / kg per kg of human body weight. is there.
  • the dose may be a daily dose, or may be administered in several times, for example, twice or three times.
  • the composition can be administered in a clinically effective amount for the treatment of malignant tumors.
  • the clinically effective amount is, for example, 1000 to 15000 mg / kg, preferably 100 to 1500 mg / kg, more preferably 10 to 150 mg / kg per 1 kg body weight of the mouse.
  • 1/10 to 1/100 of the above dose is considered appropriate.
  • per 1 kg body weight of human 100 to 1500 mg / kg, preferably 10 to 150 mg / kg, more preferably 1 to 15 mg / kg, particularly preferably 0.1 to 1.5 mg / kg. is there.
  • the dose may be a daily dose, or may be administered in several times, for example, twice or three times.
  • the composition can be applied in a clinically effective amount to inhibit the synthesis of prostaglandin E.
  • the clinically effective amount is, for example, 500 to 7500 mg / kg, preferably 50 to 750 mg / kg, more preferably 5 to 75 mg / kg, per 1 kg body weight of the mouse.
  • 1/10 to 1/100 of the above dose is considered appropriate.
  • it is 50 to 750 mg / kg, preferably 5 to 75 mg / kg, more preferably 0.5 to 7.5 mg / kg, and particularly preferably 0.05 to 0.75 mg / kg per 1 kg of human body weight. is there.
  • the dose may be a daily dose, or may be administered in several times, for example, twice or three times.
  • the food to which the composition of the present invention is added can treat symptoms or conditions, it can be used as a value-added food.
  • the amount suitable for application to food can be appropriately set by those skilled in the art.
  • composition of the present invention can be applied to cosmetics.
  • the amount suitable for application to cosmetics can be appropriately set by those skilled in the art.
  • compositions in the present invention contains a differentiation-inducing factor or an analog thereof, various substances can be added, and the form is not particularly limited.
  • a composition of the invention having a form suitable for the method of administration.
  • the administration method include oral administration and parenteral administration.
  • “form suitable for oral administration” includes, for example, tablets, lozenges, hard or soft capsules, aqueous or oily suspensions, emulsions, dispersible powders or granules, syrups, or elixirs.
  • the “form suitable for parenteral administration” includes a form suitable for inhalation, a form suitable for administration by inhalation, a form suitable for injection, a form suitable for local administration, and the like, preferably suitable for injection. And suitable for topical administration.
  • Form suitable for administration by inhalation includes, for example, finely divided powder or liquid aerosol.
  • Examples of “a form suitable for administration by aeration” include finely divided powder.
  • Forms suitable for parenteral injection include, for example, sterile solutions, suspensions or emulsions for intravenous, subcutaneous, intramuscular, intravascular or infusion administration.
  • Forms suitable for topical administration include, for example, creams, ointments, gels, or aqueous or oily solutions or suspensions.
  • Examples of “a form suitable for rectal administration” include suppositories.
  • composition of the present invention can be used as a pharmaceutical composition or a food or drink (especially functional food, health food, supplement, etc.), for example, granules (including dry syrup), capsules (soft Various solid preparations such as capsules, hard capsules), tablets (including chewables), powders (powder), pills, or liquids for internal use (including liquids, suspensions, syrups), etc. It can be prepared in the form of a liquid preparation or the like, and is preferably in the form of a capsule or a tablet from the viewpoint of stability of ingredients and ease of ingestion, but is not particularly limited.
  • composition of the present invention in the form of a capsule or a tablet can be produced by using a known additive acceptable as a pharmaceutical or food, and a conventional formulation method adopted in the field of pharmaceutical or food. Can be applied.
  • a tablet can be prepared by adding and blending each component according to the formulation, crushing, granulating, drying, sizing and mixing, and tableting the resulting preparation mixture.
  • Additives for formulation are not limited, but include, for example, excipients, lubricants, binders, disintegrants, fluidizers, dispersants, wetting agents, preservatives, thickeners, pH adjustments. Agents, coloring agents, flavoring agents, surfactants, solubilizing agents and the like.
  • thickeners such as pectin, xanthan gum, and guar gum, can be mix
  • thickeners such as pectin, xanthan gum, and guar gum
  • it can also be set as a coating tablet using a coating agent, or it can also be set as a paste-form glue. Furthermore, even if it is a case where it prepares in another form, what is necessary is just to follow the conventional method.
  • composition of the present invention can be prepared by blending components such as conventionally known colorants, preservatives, fragrances, flavoring agents, and coating agents, if necessary.
  • composition of the present invention may be prepared by blending one or more additional components.
  • additional ingredients include antioxidants, hypoglycemic agents, anticholesterol agents, immunostimulants, vitamins, amino acids, peptides, proteins, minerals (iron, zinc, magnesium, iodine, etc.), fatty acids (EPA, DHA, etc.) ) Etc.
  • composition of the present invention can be used, for example, as various foods and beverages such as beverages, confectionery, breads and soups, or as additive components thereof; it can.
  • the method for producing these foods and drinks is not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired, and may follow the methods used by those skilled in the art for each application.
  • Cosmetics refers to those used for the purpose of washing the body or applying to the skin.
  • soaps, shampoos, basic cosmetics, hair styling agents and the like can be mentioned.
  • a method for designing a compound having an action of suppressing the expression of mPGES-1 using the compound represented by the above formula (I) as a lead compound.
  • a compound having an action of suppressing the expression of mPGES-1 can be obtained by using a known drug design technique using a computer or the like.
  • an effective drug can be obtained more efficiently.
  • the purpose of the drug design is to obtain a compound having a desired property by repeatedly optimizing the lead compound. Optimization of lead compounds is an optimal compound with improved solubility, pharmacological activity, toxicity, metabolic stability, maintenance of blood concentration, directionality to the lesion, etc. by chemically modifying the lead compound To get.
  • the method may include determining the strength of the prostaglandin E synthesis inhibitory activity by the test compound in comparison with the compound represented by the above formula (I).
  • any compound may be used as the test compound, but a compound obtained by a method for designing a compound using the compound represented by the above formula (I) as a lead compound can be preferably used.
  • the strength of prostaglandin E synthesis inhibitory activity is determined by, for example, the concentration of prostaglandin E released extracellularly, the protein concentration of mPGES-1, the expression level of mPGES-1 mRNA, the level of mPGES-1 Either promoter activity or a combination thereof may be used as an index, but it is preferable to use mPGES-1 mRNA expression level or mPGES-1 promoter activity as an index.
  • a firefly luciferase reporter vector incorporating a human mPGES-1 promoter is introduced.
  • the cells are treated with a predetermined concentration of the compound obtained by the method for designing a compound described above as a test compound, and cultured for a predetermined time, for example, 1, 2, 6, 24 hours.
  • the control is a cell treated with a compound represented by the above formula (I) instead of the test compound.
  • the luciferase activity in the treated cells is measured.
  • a substance having a lower luciferase activity than the control means that the promoter activity of mPGES-1 is strongly inhibited. Therefore, a test compound exhibiting such an effect is selected.
  • test compound in order to examine the effect of the test compound on enzymes other than mPGES-1, cells stimulated with PMA and LPS are treated with the test compound selected above.
  • the control is a cell treated with a compound represented by the above formula (I) instead of the test compound.
  • the expression of cPGES, mPGES-2, and COX-2 proteins in the cells is detected and quantified by Western blot and compared with a control.
  • a test compound in which the expression levels of cPGES, mPGES-2, and COX-2 proteins are substantially the same or substantially different from the control is selected.
  • mPGES-1 has attracted attention as a new target for anti-inflammatory drugs, and mPGES-1 inhibitors have already been synthesized. However, nothing has been clinically developed yet. These inhibitors are presumed to be likely to cause side effects as a result of directly inhibiting mPGES-1 and lowering PGE 2 below normal levels. This means that drug selectivity is not always better.
  • the DIF family does not directly target mPGES-1, but is expected to systematically suppress the physiological signal transduction system that leads to mPGES-1 expression induction. There is a possibility that drugs with mechanisms and few side effects can be developed. Therefore, if the composition of the present invention is clinically developed, an anti-inflammatory drug having a completely new mechanism of suppressing the expression of mPGES-1 may be developed.
  • DIF has an antitumor activity, but some existing NSAIDs have an anticancer effect particularly on colorectal cancer. However, it has not been approved for cancer because it increases the incidence of cardiovascular events. Since NSAIDs that suppress COX suppress the production of all PGs including PGI 2 that prevents thrombus, side effects such as thrombosis may occur. On the other hand, since DIF suppresses the expression of mPGES-1 located downstream of COX in the PG synthesis pathway, it is highly likely to escape cardiovascular side effects. Furthermore, unlike existing anticancer agents, DIF has no DNA damaging action or cytotoxic action, so it is highly possible to create anticancer drugs with extremely low toxicity.
  • composition of the present invention by using the composition of the present invention, there is a possibility that an innovative anticancer agent that exhibits a natural action mechanism and exerts a strong anticancer action can be developed. Moreover, since the DIF family can be administered orally, it is considered to be a great merit in terms of convenience for use as a medicine.
  • the DIF family can be used as a lead compound in the design of compounds having prostaglandin E synthesis inhibitory activity, and compounds with enhanced prostaglandin E synthesis inhibitory activity and reduced side effects It can also be used for screening.
  • Example 1 Inhibition of mPGES-1 protein expression by DIF-1 in human myeloid leukemia-derived cells
  • Human myeloid leukemia-derived (THP-1) cells (RIKEN BioResource Center) were treated with 10% fetal bovine serum ( The cells were cultured in RPMI1640 medium (SIGMA) supplemented with JSH biosciences (culture conditions: 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 ). 1 ⁇ 10 6 cells were seeded on a culture dish having a diameter of 35 mm, and differentiation of THP-1 cells was induced with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) (100 nM).
  • PMA phorbol-12-myristate-13-acetate
  • THP-1 cells were treated with DIF-1 (30 ⁇ M) for 3 hours, and then THP-1 cells were stimulated with lipopolysaccharide (LPS) (1 ⁇ g / ml or 10 ⁇ g / ml) for 24 hours.
  • LPS lipopolysaccharide
  • mPGES-1 and glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase (GAPDH) protein in LPS-stimulated THP-1 cells was analyzed by Western blot. After washing THP-1 cells with phosphate buffer solution (PBS), lyse with Remley's SDS-PAGE sample buffer, and apply 5% ⁇ g / lane of collected sample to 12% SDS-PAGE to separate the proteins in the sample. It was. The protein in the gel was transferred to a PVDF membrane for 60 minutes. The membrane after the transfer was treated with a rabbit polyclonal anti-mPGES-1 antibody (Cayman® Chemicals) and a mouse monoclonal anti-GAPDH antibody (Sigma) at 4 ° C.
  • Example 2 Inhibition of mPGES-1 protein expression by DIF-1 in THP-1 cells after LPS stimulation (2-1) Effect of DIF-1 treatment time on suppression of mPGES-1 protein expression THP-1 Cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum. 1 ⁇ 10 6 cells were seeded on a culture dish having a diameter of 35 mm, and differentiation of THP-1 cells was induced by PMA (100 nM) stimulation. After 24 hours, THP-1 cells were stimulated with LPS (10 ⁇ g / ml) for 24 hours. Thereafter, THP-1 cells were treated with DIF-1 (30 ⁇ M) for 1, 3, 6, 12, and 24 hours.
  • THP-1 cell treated as described above The expression levels of mPGES-1 and GAPDH protein in each THP-1 cell treated as described above were analyzed by Western blotting. As described in Example 1 above, THP-1 cells were recovered and samples were prepared to detect mPGES-1 and GAPDH proteins. Furthermore, the density of the band corresponding to the detected protein was measured using densitometry.
  • FIG. 2 it was shown that in the DIF-1 untreated group, the expression level of mPGES-1 protein increased with time by LPS stimulation. On the other hand, in the group treated with DIF-1, it was shown that the expression level of mPGES-1 protein was remarkably suppressed. From this result, it was shown that DIF-1 suppresses the expression of mPGES-1 protein even when added after LPS stimulation.
  • Example 3 Inhibition of expression of mPGES-1 protein in human colon cancer-derived cells
  • Human colon cancer-derived (HCT-116) cells were cultured in RPMI1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum. 5 ⁇ 10 5 HCT-116 cells were seeded in a culture dish having a diameter of 35 mm and treated with DIF-1 (30 ⁇ M) for 6 and 12 hours after 24 hours.
  • tubulin protein was detected according to the method described in Example 1 above, except that tubulin was detected using a monoclonal anti-tubulin antibody (Calbiochem) as the primary antibody.
  • Example 4 Inhibition of mPGES-1 protein expression by DIF family The conditions of Example 2 (2-1) were followed. THP-1 cells after LPS stimulation were treated with DIF-3 for 24 hours. The treatment concentrations of DIF-3 were 10, 20, and 30 ⁇ M. Expression of mPGES-1 and GAPDH protein in THP-1 cells after DIF-3 treatment was detected by Western blot. The same operation was performed for DIF-1.
  • DIF-3 suppresses the expression of mPGES-1 protein (FIG. 5).
  • the inhibitory effect was dependent on the concentration of DIF-3, and the degree of inhibition was equivalent to that of DIF-1. Therefore, the expression suppression effect of mPGES-1 protein is a property common to DIF-3 and other similar compounds having a chemical structure similar to that of DIF-1, that is, the DIF family represented by the formula (I). It is suggested that there is.
  • Example 5 Inhibition of mRNA expression of mPGES-1 in cells after LPS stimulation
  • THP-1 cells stimulated with PMA and LPS were treated with DIF-1 ( 30 ⁇ M) for 24 hours.
  • Total RNA was extracted from THP-1 cells after DIF-1 treatment using Torizol reagent (GIBCO) according to the attached instruction manual.
  • cDNA complementary DNA
  • Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits (Applied Biosystems).
  • Example 6 Effect of DIF-1 on mPGES-1 promoter activity 1 ⁇ 10 5 human colon cancer-derived HCT-116 cells were seeded on a 24-well culture plate, and after 24 hours, the human mPGES-1 promoter A firefly luciferase reporter vector (pGL3-Basic) incorporating (-35 / -1068 bp) and a Renilla luciferase reporter vector (pRL-SV40) for optimizing the introduction efficiency were introduced into HCT-116 cells. After 24 hours, DIF-1 (10 or 30 ⁇ M) was treated for 6, 12, and 24 hours. Here, HCT-116 cells not treated with DIF-1 served as controls. The luciferase activity in the HCT-116 cells after the treatment was measured using a Proluc kit Dual Luciferase Assay System.
  • luciferase activity increased with time in HCT-116 cells not treated with DIF-1.
  • luciferase activity decreased with the lapse of treatment time. This means that DIF-1 acted suppressively on the human mPGES-1 promoter to suppress the expression of luciferase mRNA and to suppress the expression of luciferase protein. It was also shown that DIF-1 exhibits a sufficient effect even at 10 ⁇ M.
  • Example 7 Inhibition of PGE 2 production by DIF-1 in THP-1 cells after stimulation with LPS 1 ⁇ 10 6 THP-1 cells were seeded in a culture dish having a diameter of 35 mm and stimulated with PMA (100 nM). By doing so, differentiation of THP-1 cells was induced. After 24 hours, THP-1 cells were stimulated with LPS (10 ⁇ g / ml). After 24 hours, THP-1 cells were treated with DIF-1 (30 ⁇ M). Here, cells not treated with DIF-1 served as controls. After 24 hours, the amount of PGE 2 produced in the culture supernatant of THP-1 cells was measured using a Cayman Chemical kit (FIG. 8).
  • Example 8 Effect of DIF-1 on expression of cPGES and mPGES-2 proteins 1 ⁇ 10 6 THP-1 cells were seeded in a culture dish having a diameter of 35 mm, and THP- was stimulated with PMA (100 nM). One cell was induced to differentiate. After 24 hours, THP-1 cells were stimulated with LPS (10 ⁇ g / ml). After 24 hours, THP-1 cells were stimulated with DIF-1 (30 ⁇ M). Here, THP-1 cells not treated with DIF-1 were used as controls. The expression of cPGES, mPGES-2, and tubulin protein in THP-1 cells after 24 hours treatment with DIF-1 was analyzed by Western blot.
  • the primary antibodies are polyclonal anti-cPGES antibody (CaymanChemicals) for detection of cPGES protein, polyclonal anti-mPGES-2 antibody (CaymanChemicals) for detection of mPGES-2 protein, and monoclonal anti-tubulin antibody for detection of tubulin protein.
  • the method described in Example 1 was followed. Furthermore, the density of the band corresponding to the detected protein was measured using densitometry.
  • cPGES and mPGES-2 proteins were not affected by DIF-1 treatment. It was also confirmed that cPGES and mPGES-2 are enzymes that are not induced by cell stimulation. From these, DIF-1 can not only effectively treat diseases such as inflammation and tumors, but also reduce side effects by acting only on mPGES-1 whose expression is induced in response to cell stimulation. It is suggested.
  • THP-1 cells were cultured in RPMI1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum. 1 ⁇ 10 6 cells were seeded on a culture dish having a diameter of 35 mm, and differentiation of THP-1 cells was induced by PMA (100 nM) stimulation. After 24 hours, THP-1 cells were stimulated with LPS (10 ⁇ g / ml) for 24 hours, and then THP-1 cells were treated with DIF-1 (30 ⁇ M) for 24 hours.
  • PMA 100 nM
  • DIF and its analogs do not affect PGES other than mPGES-1 and other enzymes involved in the arachidonic acid cascade, and thus are necessary for maintaining biological functions. This suggests that diseases such as inflammation and tumor can be effectively treated and side effects can be reduced without inhibiting the production of prostaglandins.
  • Example 10 Effect of DIF-1 on mRNA expression of mPGES-1 highly expressed in cancer cells Using cervical cancer-derived HeLa cells, DIF-1 is highly expressed in cancer cells The effect of non-inflammatory mPGES-1 on mRNA expression was examined.
  • PCR conditions 50 °C, 2 min ⁇ 95 °C, 10 min ⁇ (95 °C, 15 sec ⁇ 60 °C, 1 min ) ⁇ 45 cycles).
  • the analysis was performed with a real-time PCR apparatus ABI-7500 using TaqMan Gene Expression Assay Kit (Applied Biosystems), GAPDH primers (Hs99999905_m1, Applied Biosystems), and mPGES-1 primers (Hs01115610_m1, Applied Biosystems).
  • Example 11 Effect of DIF-1 on promoter activity of mPGES-1 highly expressed in cancer cells Using cervical cancer-derived HeLa cells, DIF-1 is highly expressed in cancer cells The effect of mPGES-1 on the promoter activity was investigated.
  • DIF-1 is not only derived from inflammation but also suppresses the expression of mPGES-1 mRNA that is specifically highly expressed in cancer cells by suppressing the promoter activity. It became clear that
  • DIF-1 DIF-1 150 mg / kg was orally administered to 10-14 week old C57BL / 6J mice, and 1, 2, 3, and 6 hours later, Blood was collected from the mice. The concentration of DIF-1 in plasma was measured by high performance liquid chromatography.
  • Plasma DIF-1 concentration after intraperitoneal administration showed a maximum value at 0.5 hours after administration, and then decreased rapidly (FIG. 13 (A)).
  • the DIF-1 concentration in plasma after oral administration showed a maximum value 1 hour after administration, and then decreased rapidly (FIG. 13 (B)). From these results, DIF-1 can be administered by either intraperitoneal administration or oral administration, and is taken up into the circulating blood very rapidly after administration. It was shown to show.
  • Example 13 Examination of antitumor effect using model mouse Examination was performed using MUTYH knockout CB57BL / 6J mice (provided by the Department of Basic Radiology, Medical Research Institute), which is a mouse model of human colon cancer. .
  • a 4-week-old MUTYH knockout mouse was allowed to drink a 0.2% potassium bromate solution until the age of 12 weeks, and a tumor was formed in the small intestine.
  • administration groups were set up and administered orally on a schedule of once a day and 5 times a week until the age of 16 weeks: (1) 0.25% methylcellulose (control); (2) Suspension of 0.25% methylcellulose and DIF-1 (10, 30, 100, 150 mg / kg); (3) Suspension of 0.25% methylcellulose and celecoxib (provided by Pfizer Inc.) (50, 150 mg / kg); (4) Suspension of 0.25% methylcellulose and dimethylcelecoxib (provided by Tomooka Laboratory, Institute for Leading Materials, Kyushu University) (50, 150 mg / kg).
  • Celecoxib is a non-steroidal anti-inflammatory agent (NSAIDs) that specifically inhibits COX-2 activity, and has been approved for use in the United States against familial adenomatotus polyposis (FAP).
  • the dimethyl celecoxib is an analog of celecoxib that has no inhibitory effect on COX-2 activity.
  • NSAIDs non-steroidal anti-inflammatory agent
  • FAP familial adenomatotus polyposis
  • DIF-1 was shown to decrease the number of tumors per individual and the average tumor diameter in a concentration-dependent manner (FIGS. 14 (A) and (B)).
  • the effect of DIF-1 (150 mg / kg) was almost comparable to that of celecoxib (150 mg / kg).
  • administration of dimethylcelecoxib, which has no COX-2 activity inhibitory action, that is, no anti-inflammatory action did not show the antitumor activity as seen with DIF-1 or celecoxib. From this result, it was confirmed that DIF-1 is effective in the treatment of tumors.
  • Example 14 Examination of side effects due to administration of DIF-1 According to the method described in Example 13, DIF-1 (10, 30, 100, 150 mg / kg), celecoxib (150 mg / kg), or dimethyl was administered to mice. Celecoxib (50, 150 mg / kg) was orally administered. After the administration was completed, blood cell count, blood glucose level and body weight change were measured. (Blood cell count was measured using an animal-specific whole blood fully automated 8-cell blood cell counter manufactured by Nihon Kohden Co., Ltd., body weight was measured using an electronic balance manufactured by Mettler, and blood glucose level was measured using a Glucose PILOT manufactured by Aventir Biotech) .

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Abstract

　新規な作用機序で、かつ副作用が低減された、炎症及び／又は腫瘍の処置に有効な医薬、食品、若しくは化粧品用組成物を提供する。臨床上有効量のDIFファミリーに包含される化合物、又は医薬、食品、若しくは化粧品として許容可能なその塩、及び医薬、食品、若しくは化粧品として許容可能な賦形剤又は担体を含む組成物を適用する。

Description

分化誘導因子又はその類縁体を含有する抗炎症剤
　本発明は、分化誘導因子又はその類縁体の新規な用途に関する。本発明は、医薬、食品、及び化粧品分野で有用である。
　分化誘導因子（Differentiation-inducing　factor、DIF）は、細胞性粘菌の一種、キイロタマホコリカビ（Dictyostelium　discoideum）が産生・分泌する低分子化合物であり、集合した粘菌細胞が子実体を形成する際、柄細胞への分化を誘導する活性因子である。英国のKayらによってDIF-1が同定され（非特許文献1）、その後、複数の類縁物質、例えば、ディフェラニソールA（differanisole　A、DA）が、ケタマカビ（Chaetomium）から発見されている（非特許文献2）。DIF-1とDAは、哺乳類細胞に対して強い活性を有することが明らかとなった。マウス赤白血病細胞及びヒト白血病細胞の増殖抑制効果、正常の血管平滑筋細胞における細胞周期の停止効果、そして収縮型平滑筋への分化誘導効果が報告されている。
　DIFによる細胞増殖抑制の機序については、2000年以来、詳細な解明が進んだ。まず、G1サイクリン（サイクリンD1、Eなど）の発現を強力に抑制することにより、pRbリン酸化を阻害することが明らかとなり、これが細胞周期停止の分子機構と考えられた。その後、サイクリンD1の発現抑制がどのような機序で起こるのかという観点から、DIFの標的分子（受容体）の探索が開始された。その結果、DIFは、GSK-3β（及びDYRK1B）の活性化を介してサイクリンD1蛋白の分解を促すとともに、Wnt/β-カテニン情報伝達系を阻害することにより、サイクリンD1遺伝子の転写活性を抑制することが明らかとなった。
　炎症は創傷、感染、血管障害、腫瘍など、生体への外部及び内部からの侵襲に対する組織・全身反応であり、浮腫、紅斑、疼痛、発熱などのいわゆる“炎症症状”を呈する。抗炎症薬に関する研究の歴史は古く、デキサメタゾンやベタメタゾン等のステロイド抗炎症薬、及びアスピリンやインドメタシン等の非ステロイド抗炎症薬が知られている。ステロイド抗炎症薬は、強力な抗炎症作用を有するが、その多様な生理活性に起因して、骨粗鬆症や胃潰瘍等の副作用を引き起こすことが問題になっている。非ステロイド抗炎症薬は、炎症メディエーターであるプロスタグランジンの生合成経路における初発酵素、シクロオキシゲナーゼ（COX）を阻害することにより抗炎症作用を発揮する。COXには、COX-1型とCOX-2型の2種のアイソフォームが存在することが知られている。COX-1型は、生体内に一定量で存在する構成酵素であり、生体の恒常性維持に関与している。一方、COX-2型は、リポ多糖などによる刺激によって一過的に発現する誘導酵素であり、炎症プロセスにおいて重要な役割を果たす。したがって、非ステロイド抗炎症薬によるCOX-1型の阻害は、胃腸障害や腎障害等の副作用を引き起こす。このような副作用の低減を目的として、COX-2型に特異的な阻害薬が開発されているが、心血管イベントの発生率上昇という重篤な副作用を引き起こすことが報告されている。
　プロスタグランジンE合成酵素は、種々のケミカルメディエーターを産生するいわゆるアラキドン酸カスケードのなかで、COXよりも下流に位置し、プロスタグランジン類のなかで炎症反応の惹起物質として最も重要な役割を担っているプロスタグランジンEの合成反応における最終段階を担う酵素である。プロスタグランジンE合成酵素としては、細胞質性プロスタグランジンE合成酵素（cytosolic prostaglandin E synthase, cPGES）と膜結合型プロスタグランジンE合成酵素（membrane prostaglandin E synthase, mPGES）が報告されている。mPGESについては、mPGES-1とmPGES-2の2種類の存在が報告されている。cPGESとmPGES-2が恒常的に発現しているのとは異なり、mPGES-1は誘導酵素であり、炎症性因子によりその発現が上昇し、炎症の進展に関与していることが示唆されている（非特許文献3）。
H．R．　Morris，　G．W．　Taylor，　M．S．　Masento，　K．A．　Jermyn，　R．R　Kay，　Nature　328　（1987）811． Oka　H，　AsahiK，　Morishima　H，　Sanada　M，　Shirotani　K，　Iimura　Y，　Y，　Sakurai　T，　Uzawa　J，　Iwadare　S，　Takahashi，　N．J．　Antibiot．　38（1985），　1100-1102． Samuelsson B, Morgenstern R, Jakobsson PJ., Membrane prostaglandin E synthase-1: a novel therapeutic target., Pharmacol Rev. 2007 Sep;59(3):207-24. Review.
　本発明者は、上記の事情に鑑み、鋭意検討を行った結果、分化誘導因子又はその類縁体を含有する組成物が、これまでに知られていない作用機序により、炎症及び／又は腫瘍の処置に有効であることを見出した。さらに、当該組成物を長期間に渡って投与しても、従来の非ステロイド抗炎症薬の使用において問題とされてきた副作用（胃腸障害、腎障害、心血管障害、骨髄抑制、及び体重減少など）が低く抑えられることも示唆された。本発明は、かかる知見に基づいて完成された。
　本発明は、以下を提供する。
　(1)式（I）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　ここで、R1は、ヒドロキシ、及び－O－C1-3アルキルより選択され； 
　R2は、水素、クロロ、ブロモ、及びヨードより選択され；
　R3は、－O－C1-3アルキル、及びヒドロキシより選択され；
　R4は、水素、クロロ、ブロモ及びヨードより選択され；
　R5は、ヒドロキシ、C1-6アルキル、及び－O－C1-3アルキルより選択され；
　R6は、水素、ヒドロキシ、C1-10アルキル、及びC3-6シクロアルキルより選択され；そして、
　前記－O－C1-3アルキル、C1-6アルキル、C1-10アルキル、及びC3-6シクロアルキルは、それぞれ独立して、炭素上でヒドロキシ、アミノ、メチル、及びメトキシから選択される1以上の置換基で置換されていてもよい；
で表される、臨床上有効量の化合物、又は医薬、食品、若しくは化粧品として許容可能なその塩、及び医薬、食品若しくは化粧品として許容可能な賦形剤又は担体を含む組成物。
　(2)式(I)において、R1がヒドロキシ、R2がクロロ、及びR3が－O－CH3である、(1)に記載の組成物。
　(3)式（I）で表される化合物が、1-［3，5-ジクロロ-2，6-ジヒドロキシ-4-メトキシフェニル］-1-ヘキサノン、1-［3，5-ジクロロ-2，6-ジヒドロキシ-4-メトキシフェニル］-1-ペンタノン、1-［3-クロロ-2，6-ジヒドロキシ-4-メトキシフェニル］-1-ヘキサノン、又は3，5-ジクロロ-2-ヒドロキシ-4-メトキシ-6-プロピル安息香酸である、(1)又は(2)に記載の組成物。
　(4)(1)に定義した化合物を含む、プロスタグランジンEの合成抑制剤。
　(5)(1)に定義した化合物を含む、膜結合型プロスタグランジンE合成酵素の発現抑制剤。
　(6)炎症の処置のための、(1)～(3)のいずれか1に記載の組成物。
　(7)長期に処置が必要な疾患又は状態を有する対象に投与するための、(6)に記載の組成物。
　(8)関節リウマチの処置のための、(7)に記載の組成物。
　(9)悪性腫瘍の処置のための(好ましくは治療のための)、(7)に記載の組成物。
　(10)経口投与に適した形態である、(1)～(3)のいずれか1に記載の組成物。
　(11)(1)で定義された式(I)で表される化合物をリード化合物とする、プロスタグランジンEの合成抑制活性を有する化合物の設計方法。
　(12)(1)で定義された式(I)で表される化合物を用いる化合物のスクリーニング方法であって、
　ヒトmPGES-1プロモーターを組み込んだホタルルシフェラーゼレポーターベクターを導入した細胞を培養し、
　当該細胞を試験化合物で処理し、
　処理後のルシフェラーゼ活性を測定し、
　(1)で定義された式(I)で表される化合物による処理と比較して、ルシフェラーゼ活性を強く阻害する試験化合物を選択する、
ことによりmPGES-1プロモーターの活性を強く阻害する試験化合物を選択し、
　PMA及びLPSで刺激した細胞を、上記で選択した試験化合物で処理し、
　処理後のcPGES、mPGES-2、及びCOX-2タンパク質の発現を検出し、
　(1)で定義された式(I)で表される化合物による処理と比較して、cPGES、mPGES-2、及びCOX-2のタンパク質の発現量に影響を与えない試験化合物を選択することを含む、
　前記スクリーニング方法。
　(13)試験化合物が(11)に記載の方法によって設計された化合物である、(12)に記載の方法。
DIF-1によるmPGES-1タンパク質の発現抑制効果を示す図である。DIF-1でTHP-1細胞を処理後、LPSで刺激した。LPS刺激後にmPGES-1及びGAPDHタンパク質の発現をウエスタンブロットで解析した。PMA：ホルボール－12－ミリステート－13－アセテート；LPS：リポ多糖（1 μg/ml、10 μg/ml）；mPGES-1：膜結合型プロスタグランジン合成酵素-1；GAPDH：グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ；＋：添加；－：無添加。 LPS刺激後のTHP-1細胞における、DIF-1によるmPGES-1タンパク質の発現抑制効果を示す図である。上段：ウエスタンブロットによるmPGES-1タンパク質の検出。＋：添加；－：無添加；C：コントロール（PMA処理のみ）。下段：デンシトメトリーによるmPGES-1タンパク質の解析。mPGES-1及びGAPDHに相当するバンドの濃さを測定した。データは、mPGES-1の測定値をGAPDHの測定値で補正し、LPSによる24時間処理後（0時間）の測定値を1とした相対値である。測定値は、三回の測定値の平均である。DIF(-)：DIF-1未処理；DIF(+):DIF-1処理；PMA only:PMA刺激のみ。 mPGES-1タンパク質の発現抑制における、DIFの処理濃度の影響を示す図である。上段：ウエスタンブロットによるmPGES-1タンパク質の検出。＋：添加；－：無添加。下段：mPGES-1に対応するバンドの濃さをデンシトメトリーで測定した。データは、mPGES-1の測定値をGAPDHの測定値で補正し、PMA刺激のみの値を1とした相対値である。測定値は、三回の測定値の平均である。 ヒト大腸がん由来細胞における、DIF-1によるmPGES-1タンパク質の発現抑制を示す図である。mPGES-1及びチューブリンタンパク質をウエスタンブロットで検出した。Time(h):DIF-1の処理時間; tubulin:チューブリン；＋：添加；－：無添加。 mPGES-1タンパク質の発現抑制における、DIFファミリーの処理濃度の影響を示す図である。DIF-3又はDIF-1で24時間処理したTHP-1細胞中のmPGES-1及びGAPDHタンパク質をウエスタンブロットで検出した。＋：添加；－：無添加。 DIF-1による、mPGES-1　mRNAの発現抑制効果を示す図である。図中の値は、mPGES-1の測定値をGAPDHの測定値で補正し、LPSによる刺激後24時間（Time 0）の値を1とする相対値である。測定値は、三回の測定値の平均である。24(+):DIF-1による24時間処理；24(-):DIF-1未処理で24時間培養。 mPGES-1プロモーター活性に及ぼすDIF-1の影響を示す図である。DIF-1未処理のHCT-116細胞の0時間における値を1とする相対値を示した。cont:DIF-1未処理。 LPS刺激後のTHP-1細胞における、DIF-1によるPGE2産生抑制を示す図である。PMA only：PMAによる刺激のみ；LPS 24：LPSによる24時間刺激；LPS 48：LPSによる48時間刺激、DIF-1未処理;+DIF 30μM:DIF-1（30μM）による24時間処理。 LPS刺激後のTHP-1細胞でのcPGES、及びmPGES-2タンパク質の発現におけるDIF-1の影響を示す図である。(A) cPGES、及びmPGES-2タンパク質のウエスタンブロットによる検出。PMA only：PMAによる刺激のみ；Time 0：DIF-1による0時間処理；Control(24 h)：DIF-1未処理で24時間培養；DIF-1(24 h)：DIF-1による24時間処理；cPGES：細胞質性プロスタグランジンE合成酵素;mPGES-2：膜結合型プロスタグランジンE合成酵素-2；tubulin：チューブリン。(B) (A)におけるcPGES、mPGES-2、及びチューブリンタンパク質に相当するバンドの濃さをデンシトメトリーで測定した。データは、cPGES（上の図）、及びmPGES-2（下の図）の測定値をチューブリンの測定値で補正し、PMA刺激のみの測定値を1とした相対値である。測定値は、三回の測定値の平均である。 DIF-1によるCOX-2タンパク質の発現への効果を示す図である。LPSでTHP-1細胞を処理後、DIF-1で刺激した。LPS刺激後にCOX-2、mPGES-1、及びGAPDHタンパク質の発現をウエスタンブロットで解析した。レーン1及び2：DIF-1未処理、0時間。レーン3及び4:DIF-1未処理、24時間培養。レーン5：DIF-1処理、24時間培養。PMA：ホルボール－12－ミリステート－13－アセテート；LPS：リポ多糖（1 μg/ml、10 μg/ml）；COX-2：2型シクロオキシゲナーゼ；mPGES-1：膜結合型プロスタグランジン合成酵素-1；GAPDH：グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ；＋：添加；－：無添加。 子宮頚がん由来HeLa細胞を用いたDIF-1による、mPGES-1　mRNAの発現抑制効果を示す図である。図中の値は、mPGES-1の測定値をGAPDHの測定値で補正し、コントロール（Time 0）の値を1とする相対値である。測定値は、三回の測定値の平均である。1hr(+):DIF-1で1時間処理；3hr(+):DIF-1で3時間処理；1hr(-):DIF-1未処理で1時間処理；3hr(-):DIF-1未処理で3時間処理。 子宮頚がん由来HeLa細胞を用いたmPGES-1プロモーター活性に及ぼすDIF-1の影響を示す図である。DIF-1未処理のHeLa細胞の0時間における値を1とする相対値を示した。○:DIF-1未処理；●：DIF処理。 DIF-1の(A)腹腔内投与、及び(B)経口投与後の、血漿中のDIF-1濃度の変化を示す図である。 DIF-1の経口投与による抗腫瘍作用を示す図である。(A)腫瘍半径、(B)腫瘍直径。12w：12週齢マウス（メチルセルロース投与前）、Cont：メチルセルロース投与、D10～150：DIF-1　10～150 mg/kg投与、cele150：セレコキシブ150 mg/kg投与、DMC50～150：ジメチルセレコキシブ50～150 mg/kg投与。
　＜有効成分＞
　構造：
　本発明の組成物又は剤（なお、本明細書では本発明の組成物又は剤のうち、「組成物」を例に説明することがあるが、その説明は、特に記載した場合を除き、本発明の「剤」にも当てはまる。）は、分化誘導因子（DIF）又はその類縁体を有効成分とする。
　「DIF又はその類縁体」とは、DIF-1、DIF-2、DIF-3及びDA、並びにこれらと構造が類似する化合物であって同様の活性を有する化合物をいう。その一態様として式（I）で表される化合物があげられる。本発明でいう、「式（I）で表される化合物」とは、以下：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 （R1～R6は、上記で定義した通りである）の構造式で表される化合物をいう。
　置換基R1は、好ましくは、水素又はヒドロキシであり、より好ましくは、ヒドロキシである。置換基R2は、好ましくは水素、クロロ、又はブロモであり、より好ましくは、水素又はクロロである。置換基R3は、－O－C1-3アルキルが好ましい。当該－O－C1-3アルキルは、メトキシ、エトキシ、又はプロポキシであり、好ましくは、メトキシ又はエトキシであり、より好ましくは、メトキシである。置換基R4は、好ましくは、水素、クロロ、又はブロモであり、より好ましくは、水素又はクロロである。置換基R5は、ヒドロキシ、C1-6アルキル、及び－O－C1-3アルキルのいずれも好ましい。置換基R5がC1-6アルキルの場合、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、又はペンチルであり、より好ましくは、エチル、プロピル、又はブチルであり、さらに好ましくは、ペンチルである。置換基R5が－O－C1-3アルキルの場合、好ましくは、メトキシである。置換基R6は、好ましくは、水素、ヒドロキシ、又はC1-10アルキルであり、より好ましくは、ヒドロキシ、又はC1-10アルキルである。当該C1-10アルキルは、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、へキシル、又はへプチルであり、より好ましくは、ブチル、ペンチル、又はへキシルであり、特に好ましくは、ブチル又はペンチルである。本明細書において、上記式（I）の定義に当てはまる化合物を総括して、「DIFファミリー」ということもある。
　本発明者らの検討により、(i)DIF-1と、フェニル基の1位及び6位の置換基が異なるDA（1位：-COOH、6位：-C3H7）にも活性があること、(ii)フェニル基の5位に-Clを有さない点でDIF-1と異なるDIF-3が、DIF-1とほぼ同等の活性を有すること、及び(iii)DIF-1の誘導体である2-MIDIF-1：　1-[3,5-ジクロロ-2,4-ジヒドロキシ-6-メトキシフェニル]-1-ヘキサノン（フェニル基の4位に-OH、６位に-OCH3を有する点でDIF-1と異なる）、DIF-3の誘導体である6-MIDIF-3：　1-[3-クロロ-2,4-ジヒドロキシ-6-メトキシフェニル]-1-ヘキサノン（フェニル基の4位に-OH、６位に-OCH3を有する点でDIF-3と異なる）、及びTHPH：　1-[2,4,6-トリヒドロキシフェニル]-1-ヘキサノンの活性が非常に弱いことが示された。これらのことから、DIFファミリーの構造においては、フェニル基の2位(R1)の水酸基、3位(R2)のクロロ基、及び4位(R3)のメトキシ基が活性発現に重要であることが考えられる。すなわち、式(I)で表される化合物のうち、好ましい化合物は、前記3つの置換基のいずれか１つを有しているものであり、より好ましい化合物は、前記3つの置換基の2つを有しているものであり、さらに好ましい化合物は、前記3つの置換基を全て有しているものである。
　本発明でいう「式（I）で表される化合物」の一態様としては、例えば、1-［3，5-ジクロロ-2，6-ジヒドロキシ-4-メトキシフェニル］-1-ヘキサノン（分化誘導因子-1：DIF-1）、1-［3，5-ジクロロ-2，6-ジヒドロキシ-4-メトキシフェニル］-1-ペンタノン（分化誘導因子-2：DIF-2）、又は1-［3-クロロ-2，6-ジヒドロキシ-4-メトキシフェニル］-1-ヘキサノン（分化誘導因子-3：DIF-3）、又は3，5-ジクロロ-2-ヒドロキシ-4-メトキシ-6-プロピル安息香酸（ディフェラニソールA (differanisole A)：DA）があげられる。DIF-1、DIF-2、DIF-3、及びDAの構造式を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　製造方法：
　DIFファミリーの製造方法は、非生物学的手法、生物学的手法、又はこれらを組み合わせた方法であってもよいが、非生物学的手法による製造方法が簡便である。非生物学的手法としては、有機合成があげられる。有機合成に必要な化合物、試薬及び器具などは、一般に入手可能なものを使用することができる。合成反応は、当業者に一般的に知られている方法、例えば、Makr S. MASENTOら（Biochem.J. (1988) 256, 23-28）に記載の方法に従って合成してもよい。また、DIFファミリーは、生物学的手法、例えば、微生物の培養により調製してもよい。目的化合物の調製に適した微生物は、当業者間で知られている方法によってスクリーニングしてもよい。DIFファミリーの調製に適した微生物は、限定されないが、好ましくは、カビ類である。カビ類の微生物としては、例えば、ディクチオステリウム属（キイロタマホコリカビ、Dictyostelium）、チャエトミウム属（Chaetomium）に属するものがあげられる。一態様として、ディクチオステリウム　ディスコイデウム（Dictyostelium　discoideum）、ディクチオステリウム　ムコロイデス（Dictyostelium　mucoroides）、ディクチオステリウム　パープリウム（Dictyostelium　purpureum）、ポリスフォンデリウム　ビオラシウム（Polysphondylium　violaceum）などがあげられる。微生物の培養は、当業者に知られた条件で行ってもよい。このように製造されたDIFファミリーは、使用目的に応じて、そのままの状態で使用してもよいし、精製して使用してもよい。精製方法は、当業者間で知られた方法で行うことができる。DIFファミリーに属する化合物の安定性は非常に高く、通常の環境下において長期間の保存が可能である。
　＜用途＞
　本発明の組成物は、医薬組成物、食品組成物、又は化粧用組成物とすることができる。
　本発明の組成物は、疾患又は状態の処置のために用いることができる。
　本発明でいう「処置」とは、例えば、診断、予防、治療、又は低減すること、又は進行を妨げることをいう。
　本発明の組成物が対象とする疾患又は状態としては、例えば、炎症、腫瘍、動脈硬化、喘息、免疫疾患などがあげられ、好ましくは炎症、腫瘍、及び免疫疾患であり、より好ましくは、炎症、腫瘍、及び免疫疾患であり、特に好ましくは、炎症である。
　本発明でいう「炎症」とは、創傷、感染、血管障害、腫瘍など生体への外部及び内部からの侵襲に対する組織・全身反応をいう。炎症には、急性炎症、及び慢性炎症がある。急性炎症とは、一般に、経過がすみやかで早期に終息する炎症いう。一方，慢性炎症とは、一般に、炎症が長期間持続することをいう。急性炎症と慢性炎症を区別するための画一的な時間的定義があるわけではないが、肝炎を例にとると、1～3ヶ月で終息するものを急性肝炎といい、6ヶ月以上に渡って肝機能異常が継続する場合を慢性肝炎という場合がある。したがって、本発明でいう「長期に服用が必要な疾患又は状態」とは、当業者の通常の知識に基づいて、疾患又は状態ごとに、個別的に判断される。本発明の組成物は、急性炎症及び慢性炎症のいずれの処置に適用してもよい。
　慢性炎症の発症の原因は、限定されないが、急性炎症からの移行；ある種の微生物、例えば結核菌やある種の真菌（カビ）による細胞内持続感染；潜在的に毒性を有する物質の暴露、例えば吸入されたケイ酸粒子（肺に慢性炎症反応を引き起こす）や、内在性のものとしては慢性的に増加した血清脂質（粥状硬化とよばれる動脈硬化を引き起こす）；自己の抗原が組織に対して免疫反応を起こす、自己免疫；などがあげられる。慢性炎症の一例としては、関節リウマチ、慢性胃炎、及び慢性腎炎などがあげられる。本発明でいう「関節リウマチ」とは、自己免疫疾患が発症の要因の一つと考えられている病気であり、関節で炎症の慢性化と関節破壊が進行し、関節の機能に障害をきたす。重症化すると、関節変形が起こる。
　したがって、慢性炎症を処置する場合には、長期間の投与に適した、副作用の弱い抗炎症剤を使用するのが好ましい。本発明の組成物は、従来から知られている抗炎症剤よりも副作用を低減できるため、このような用途において特に有用である。
　本発明でいう「腫瘍」とは、真性腫瘍、すなわち新生物性の腫瘍：体細胞に由来する腫瘍細胞の異常増殖を伴うものを意味する。真性腫瘍には、良性腫瘍と悪性腫瘍があるが、悪性腫瘍の処置に適用するのが好ましい。悪性腫瘍とは、腫瘍細胞の形態や配列が種々の点で正常細胞と異なっており、転移性・浸潤性があって致死的な腫瘍をいう。
　悪性腫瘍には、例えば、口腔がん、鼻腔がん、喉頭がん、咽頭がん、舌がん、悪性リンパ腫、悪性黒色腫(メラノーマ)、上顎がん、脳神経の悪性腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、神経膠腫、肺がん、子宮頚がん、乳がん、乳房肉腫、甲状腺がん、甲状乳頭腺がん、肺胞上皮がん、大細胞性未分化がん、小細胞性未分化がん、睾丸腫瘍、前立腺がん、骨腫瘍、白血病、多発性骨髄腫、食道がん(扁平上皮がん)、胃がん、胃・大腸平滑筋肉腫、膵・胆嚢がん、十二指腸がん、大腸がん(腺がん)、小腸がん、原発性肝がん(肝細胞がん、胆管細胞がん)、及び肝芽腫が含まれ、好ましくは、子宮頚がん、大腸がん、及び白血病である。本発明の組成物は、これら腫瘍の処置に適用してもよい。
　上記のように、本発明の組成物が炎症及び腫瘍の処置に有効であることから、これらの症状又は状態を併発している場合にも有効となる。本発明の組成物よる、症状又は状態の処置の一態様としては、症状又は状態の治療、低減、予防、又は進行の阻害であるが、これに限定されない。
　本発明の別の側面は、本発明の組成物によるプロスタグランジンE合成抑制剤を提供する。本発明でいう「プロスタグランジンE合成抑制」とは、PGEの合成を阻害することをいう。例えば、PGH1、PGH2、及びPGH3から、それぞれPGE1、PGE2、及びPGE3への反応を阻害することがあげられる。当該阻害は、例えば、PGE合成酵素（PGES）の阻害を介して行うことができる。PGESには、細胞質性PGES（cPGES）と膜結合性PGES（mPGES）が存在することが報告されている。mPGESには、mPGES-1とmPGES-2が存在することが報告されている。mPGES-1は、炎症因子によりその遺伝子発現が上昇することから、炎症の進展における関与が示唆されている。一方、cPGESとmPGES-2は、様々な組織において広く発現していることから、生体の機能の維持に関与しているのかもしれない。本発明の組成物は、mPGES-1の発現を抑制するが、cPGES及びmPGES-2の発現には影響を及ぼさない。従って、本発明の組成物は、副作用を低減しつつ、炎症や腫瘍等の処置に好ましく用いることができる。
　本発明の別の側面は、mPGES-1の発現抑制剤を提供する。本発明でいう「PGESの発現抑制」とは、ゲノムDNAからmRNAへの転写を阻害することを特に意味する。本発明者は、DIFファミリーがmPGES-1の発現をmRNAレベルで抑制することを見出した。mPGES-1は、主に炎症性の刺激により誘導され、炎症の増悪に関わる酵素であることが知られており、当該酵素の発現低下による炎症反応の抑制効果が期待できる。すなわち、DIFファミリーは、mPGES-1の活性抑制ではなく、mPGES-1の発現抑制を介して抗炎症作用を発揮することが期待できる。
　＜容量＞
　本発明でいう「臨床上有効量」とは、本発明の組成物を投与した際に、疾患又は状態の処置が可能となるような、当該組成物の量をいう。本発明の組成物の適用の一態様として、当該組成物を炎症の処置に臨床上有効な量で投与することができる。臨床上有効な量としては、例えば、マウスの体重1 kg当たり、500～7500 mg/kg、好ましくは、50～750 mg/kgであり、より好ましくは、5～75 mg/kgである。ヒトへ投与する際は、前記投与量の1/10～1/100が適切であると考えられる。例えば、ヒトの体重1 kg当たり、50～750 mg/kg、好ましくは、5～75 mg/kgであり、より好ましくは、0.5～7.5 mg/kg、特に好ましくは、0.05～0.75 mg/kgである。当該投与量は、１日当たりの投与量としてもよく、数回、例えば2回又は3回に分けて投与してもよい。
　本発明の組成物の適用の一態様として、当該組成物を悪性腫瘍の処置に臨床上有効な量で投与することができる。臨床上有効な量とは、例えば、マウスの体重1 kg当たり1000～15000 mg/kg、好ましくは、100～1500 mg/kgであり、より好ましくは、10～150 mg/kgである。ヒトへ投与する際は、前記投与量の1/10～1/100が適切であると考えられる。例えば、ヒトの体重1 kg当たり、100～1500 mg/kg、好ましくは、10～150 mg/kgであり、より好ましくは、1～15 mg/kg、特に好ましくは、0.1～1.5 mg/kgである。当該投与量は、１日当たりの投与量としてもよく、数回、例えば2回又は3回に分けて投与してもよい。
　本発明の組成物の適用の一態様として、当該組成物を臨床上有効な量で、プロスタグランジンEの合成抑制に適用することができる。当該臨床上有効な量は、例えば、マウスの体重1 kg当たり500～7500 mg/kg、好ましくは、50～750 mg/kgであり、より好ましくは、5～75 mg/kgである。ヒトへ投与する際は、前記投与量の1/10～1/100が適切であると考えられる。例えば、ヒトの体重1 kg当たり、50～750 mg/kg、好ましくは、5～75 mg/kgであり、より好ましくは、0.5～7.5 mg/kg、特に好ましくは、0.05～0.75 mg/kgである。当該投与量は、１日当たりの投与量としてもよく、数回、例えば2回又は3回に分けて投与してもよい。
　本発明の組成物が添加された食品は、症状又は状態を処置できるため、付加価値食品として利用するこができる。食品への適用に適した量は、当業者が適宜設定することができる。
　本発明の別の側面において、本発明の組成物は、化粧品に適用することができる。化粧品への適用に適した量は、当業者が適宜設定することができる。
　＜他の成分、形態、その他＞
　本発明でいう「組成物」は、分化誘導因子又はその類縁体を含有している限り、種々の物質を添加することができ、形態も特に制限されない。
　医薬：
　本発明の別の側面では、投与方法に適した形態を有する本発明の組成物を提供する。投与方法としては、例えば、経口投与及び非経口投与があげられる。本発明で「経口投与に適した形態」というときは、例えば、錠剤、ロゼンジ、硬質又は軟質カプセル、水性又は油性懸濁液、乳液、分散性粉末又は顆粒、シロップ、又はエリキシルがあげられる。また「非経口投与に適した形態」としては、吸入に適した形態、通気による投与に適した形態、注射に適した形態、及び局所投与に適した形態などがあり、好ましくは、注射に適した形態及び局所投与に適した形態である。「吸入による投与に適した形態」とは、例えば、微細に分割された粉末又は液体エアゾールがあげられる。「通気による投与に適した形態」とは、例えば、微細に分割された粉末があげられる。「非経口注射に適した形態」とは、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、血管内又は注入投与のための滅菌溶液、懸濁液或いは乳液があげられる。「局所投与に適した形態」とは、例えば、クリーム、軟膏、ゲル、或いは水性又は油性溶液若しくは懸濁液があげられる。「直腸投与に適した形態」とは、例えば、座薬があげられる。
　本発明の組成物は、医薬組成物又は飲食品（特に、機能性食品、健康食品、サプリメントなど）として継続的な摂取が行いやすいように、例えば顆粒剤（ドライシロップを含む）、カプセル剤（軟カプセル剤、硬カプセル剤）、錠剤（チュアブル剤などを含む）、散剤（粉末剤）、丸剤などの各種の固形製剤、又は内服用液剤（液剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）などの液状製剤などの形態で調製することができ、成分の安定性や摂取の簡便さの点からカプセル剤又は錠剤の形態が好ましいが、特に限定されるものではない。
　カプセル剤又は錠剤の形態の本発明の組成物は、医薬又は食品として許容される公知の添加物を用いて製造することができ、医薬又は食品の分野で採用されている通常の製剤化手法を適用することができる。例えば、錠剤は、各成分を処方に従って添加配合し、粉砕、造粒、乾燥、整粒、及び混合を行い、得られた調製混合物を打錠することによって調製することができる。
　製剤化のための添加物としては、限定はされないが、例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、流動化剤、分散剤、湿潤剤、防腐剤、粘稠剤、pH調整剤、着色剤、矯味矯臭剤、界面活性剤、溶解補助剤などがあげられる。また、液剤の形態にする場合は、ペクチン、キサンタンガム、グアガムなどの増粘剤を配合することができる。また、コーティング剤を用いてコーティング錠剤にしたり、ペースト状の膠剤とすることもできる。さらに、他の形態に調製する場合であっても、従来の方法に従えばよい。
　本発明の組成物は、必要に応じ、従来公知の着色剤、保存剤、香料、風味剤、コーティング剤などの成分を配合して調製することもできる。
　また、本発明の組成物は、1以上の追加成分を配合して調製してもよい。追加成分の例としては、抗酸化剤、血糖降下剤、抗コレステロール剤、免疫賦活剤、ビタミン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ミネラル分（鉄、亜鉛、マグネシム、ヨードなど）、脂肪酸（EPA、DHAなど）などをあげることができる。
　食品：
　さらに、本発明の組成物は、例えば、飲料、菓子類、パン類、スープ類などの各種飲食品又はその添加成分として；又はドッグフード、キャットフードなどの各種ペットフード又はその添加成分として使用することができる。これらの飲食品の製造方法は、本発明の効果を損なわないものであれば特に限定されず、各用途で当業者によって使用されている方法に従えばよい。
　化粧品：
　本発明でいう「化粧品」とは、体を洗浄したり、皮膚に塗布する目的で使用されるものをいう。例えば、石鹸、シャンプー、基礎化粧品、整髪料などがあげられる。
　＜化合物の設計方法及びスクリーニング方法＞
　本発明の別の側面では、上記式(I)で表される化合物をリード化合物として用いる、mPGES-1の発現抑制作用を有する化合物の設計方法を提供する。当該リード化合物に基づいて、コンピューター等を用いた公知のドラッグデザインの手法を用いることによって、mPGES-1の発現抑制作用を有する化合物を得ることができる。当該方法を用いることによって、有効な薬剤をより効率的に得ることができる。ドラッグデザインの目的は、リード化合物の最適化を繰り返すことによって所望の性質を有する化合物を取得することである。リード化合物の最適化とは、リード化合物を化学的に修飾することによって、溶解性、薬理活性、毒性、代謝安定性、血中濃度の維持、病巣への指向性等が改善された最適な化合物を取得することをいう。
　本発明の別の側面では、上記式(I)で表される化合物を用いるプロスタグランジンEの合成抑制活性を有する化合物をスクリーニングする方法を提供する。当該方法は、上記式(I)で表される化合物との比較において、試験化合物によるプロスタグランジンEの合成抑制活性の強さを判断することを含んでいればよい。ここで、試験化合物としては、いずれの化合物を用いてもよいが、好ましくは、上記式(I)で表される化合物をリード化合物として用いる化合物の設計方法によって得られる化合物を用いることができる。
　プロスタグランジンEの合成抑制活性の強さの判断は、例えば、細胞外へ放出されるプロスタグランジンEの濃度、mPGES-1のタンパク質濃度、mPGES-1のmRNAの発現量、mPGES-1のプロモーター活性、又はこれらの組み合わせのいずれを指標にしてもよいが、mPGES-1のmRNAの発現量、又はmPGES-1のプロモーター活性を指標にすることが好ましい。上記式(I)で表される化合物との比較において、試験化合物の処理によって、上記の指標、例えばmPGES-1のmRNAの発現量又はmPGES-1のプロモーター活性がより低い場合は、試験化合物のプロスタグランジンEの合成抑制活性が強いと判断できるので、そのような試験化合物を選択する。
　プロスタグランジンEの合成抑制活性が強いことに加えて、副作用が発症しにくい化合物を選択することは、実用面において重要である。副作用が発症しにくいことの判断は、例えば、先で選択した試験化合物がmPGES-1以外の酵素に与える影響、例えば酵素活性、タンパク質の発現量、mRNAの発現量等を、上記式(I)で表される化合物と比較することによって行うことができる。mPGES-1以外の酵素としては、例えば、cPGES、mPGES-2、COX-2、又はこれらの組み合わせを用いることができる。例えば、試験化合物によるmPGES-1以外の酵素に与える影響が、上記式(I)で表される化合物による影響とほぼ同等又は実質的な差異がない場合には、試験化合物の服用による副作用は発症しにくいと判断できるので、そのような試験化合物を選択する。
　上記のスクリーニング方法の一態様を以下に示す。培養用ディッシュ上で細胞を所定時間培養した後、ヒトmPGES-1プロモーターを組み込んだホタルルシフェラーゼレポーターベクターを導入する。試験化合物として上記に記載の化合物の設計方法によって得られる化合物の所定濃度で当該細胞を処理し、所定時間、例えば1、2、6、24時間培養する。ここで、試験化合物の代わりに上記式(I)で表される化合物で細胞を処理したものを対照とする。処理後の細胞におけるルシフェラーゼ活性を測定する。対照よりもルシフェラーゼ活性が低いものは、mPGES-1のプロモーター活性が強く阻害されていることを意味するので、そのような効果を示す試験化合物を選択する。
　さらに、当該試験化合物によるmPGES-1以外の酵素に対する影響を調べるため、PMA及びLPSで刺激した細胞を、上記で選択した試験化合物で処理する。ここで、当該試験化合物の代わりに上記式(I)で表される化合物で細胞を処理したものを対照とする。所定時間経過後、細胞中のcPGES、mPGES-2、及びCOX-2タンパク質の発現をウエスタンブロットで検出・定量し、対照と比較する。cPGES、mPGES-2、及びCOX-2のタンパク質の発現量が対照とほぼ同等又は実質的な差異がない試験化合物を選択する。
　＜発明の効果＞
　mPGES-1は、抗炎症薬の新しいターゲットとして注目されており、すでにmPGES-1阻害薬も合成されている。しかし、まだ臨床開発されたものはない。これらの阻害薬は、mPGES-1を直接阻害してPGE2を正常レベル以下に低下させる結果、副作用が現れやすくなるのではないかと推定される。このことは、医薬品の選択性は、常に高いほうがよいとは限らないことを意味する。一方、DIFファミリーはmPGES-1を直接のターゲットとするわけではなく、mPGES-1の発現誘導につながる生理的な情報伝達系を上流で系統的に抑制すると予想されるため、より生理的な作用機序を有し、副作用の少ない薬が開発できる可能性がある。したがって、本発明の組成物を臨床開発すれば、mPGES-1の発現抑制という全く新しい機序の抗炎症薬が開発できる可能性がある。
　また、DIFが抗腫瘍活性を持つことはすでに述べたが、既存NSAIDsの中にも、特に大腸がんへの抗がん作用が認められるものもある。しかしながら、心血管系イベント発症率を上昇させることなどの理由により、がんへの適応は認められていない。COXを抑制するNSAIDsは、血栓を防止するPGI2などを含む全てのPGの産生を抑制するため、血栓症などの副作用が発生するおそれがある。一方、DIFは、PG合成経路においてCOXより下流に位置するmPGES-1の発現を抑制するため、心血管系副作用を免れる可能性が高い。さらに、既存の抗がん剤とは異なり、DIFにはDNA傷害作用や細胞傷害作用がないため、きわめて毒性の低い抗がん剤を創出できる可能性が高い。すなわち、本発明の組成物の利用により、自然な作用機序で、かつ強力な抗がん作用を発揮する、画期的な抗がん剤を開発できる可能性がある。また、DIFファミリーは経口投与が可能であることから、医薬として使用するための利便性という面で大きなメリットになるものと思われる。
　さらに、DIFファミリーは、プロスタグランジンEの合成抑制活性を有する化合物の設計において、リード化合物として用いることができ、そして、プロスタグランジンEの合成抑制活性が高められ、かつ副作用が低減された化合物のスクリーニングに用いることもできる。
　本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
　［実施例1］　ヒト骨髄性白血病由来細胞における、DIF-1によるmPGES-1タンパク質の発現抑制
　ヒト骨髄性白血病由来（THP-1）細胞（理化学研究所バイオリソースセンター）を、10%ウシ胎仔血清（JSH biosciences）を加えたRPMI1640培地（SIGMA）中で培養した（培養条件：37℃、5% CO2存在下）。直径35mmの培養用ディッシュに1×106個の細胞を撒き、ホルボール-12-ミリステート-13-アセテート(PMA)（100 nM）でTHP-1細胞を分化誘導させた。24時間後、DIF-1(30μM)でTHP-1細胞を3時間処理し、その後リポ多糖（LPS）（1 μg/ml又は10 μg/ml）でTHP-1細胞を24時間刺激した。
　LPS刺激されたTHP-1細胞における、mPGES-1、及びグリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）タンパク質の発現をウエスタンブロットにより解析した。リン酸緩衝液（PBS）でTHP-1細胞を洗浄後、レムリーのSDS-PAGEサンプルバッファーにて溶解し、回収したサンプル5 μg/レーンを12%SDS-PAGEにかけ、サンプル中のタンパク質を分離させた。ゲル中のタンパク質をPVDFメンブレンに60分間転写した。転写後のメンブレンを、ウサギポリクローナル抗mPGES-1抗体(Cayman Chemicals)、及びマウスモノクローナル抗GAPDH抗体(Sigma)で、4℃で16時間処理した。さらに、それぞれの一次抗体と結合する二次抗体（HRP結合抗ウサギ抗体、HRP結合抗マウス抗体、すべてCell signaling社製）で処理した後、反応したタンパク質を検出試薬LumiGLO (Cell Signaling)を用いて検出した。
　その結果、LPSによる刺激の前に、THP-1細胞をDIF-1で処理することによって、mPGES-1タンパク質の発現が抑制された（図1）。その発現量は、LPSの刺激を受けなかったTHP-1細胞（左端のレーン）とほぼ同等であった。このことから、LPSによる刺激の前に、THP-1細胞をDIF-1で処理することによって、mPGES-1タンパク質の発現をほぼ完全に抑制できることが示された。
　［実施例2］LPS刺激後のTHP-1細胞における、DIF-1によるmPGES-1タンパク質の発現抑制
　（2-1）mPGES-1タンパク質の発現抑制におけるDIF-1の処理時間の影響
　THP-1細胞を、10％ウシ胎仔血清を加えたRPMI1640培地中で培養した。直径35 mmの培養用ディッシュに1×106個の細胞を撒き、PMA（100 nM）刺激により、THP-1細胞を分化誘導させた。24時間後、LPS（10 μg/ml）でTHP-1細胞を24時間刺激した。その後、DIF-1（30 μM）でTHP-1細胞を1、3、6、12、及び24時間処理した。
　上記のように処理した各THP-1細胞における、mPGES-1及びGAPDHタンパク質の発現量を、ウエスタンブロット法により解析した。上記実施例1に記載したように、THP-1細胞を回収してサンプルを調製し、mPGES-1及びGAPDHタンパク質を検出した。さらに、デンシトメトリーを用いて、検出されたタンパク質に相当するバンドの濃さを測定した。
　その結果（図2）、DIF-1未処理群では、LPS刺激により、mPGES-1タンパク質の発現量が時間経過に伴って上昇することが示された。これに対し、DIF-1で処理した群では、mPGES-1タンパク質の発現量が著しく抑制されることが示された。この結果から、DIF-1は、LPS刺激後に添加された場合であっても、mPGES-1タンパク質の発現を抑制することが示された。
　（2-2）mPGES-1タンパク質の発現抑制におけるDIF-1の処理濃度の影響
　DIF-1の濃度を10、20、及び30 μMにした以外は、上記（2-1）の条件に従った。
　その結果、DIF-1の濃度が高くなるにしたがってmPGES-1タンパク質の発現抑制の程度が強くなることが示された（図3）。
　[実施例3]　ヒト大腸がん由来細胞におけるmPGES-1タンパク質の発現抑制
　ヒト大腸がん由来(HCT-116)細胞を、10%ウシ胎仔血清を加えたRPMI1640培地中で培養した。直径35mmの培養用ディッシュに5×105個のHCT-116細胞を撒き、24時間後、DIF-1（30μM）で6、及び12時間処理した。
　上記のように処理したHCT-116細胞におけるmPGES-1及びチューブリンタンパク質の発現を解析した。一次抗体にモノクローナル抗チューブリン抗体（Calbiochem）を用いてチューブリンを検出した以外は、上記実施例1に記載の方法にしたがってタンパク質を検出した。
　その結果、HCT-116細胞をDIF-1で処理することによって、DIF-1未処理の細胞に比べて、mPGES-1タンパク質の発現が著しく抑制された（図4）。当該結果と、上記実施例1及び2の結果を考えると、DIF-1は、様々な細胞においてmPGES-1タンパク質の発現を抑制することが示された。
　［実施例4］　DIFファミリーによるmPGES-1タンパク質の発現抑制
　上記実施例2（2-1）の条件にしたがった。LPS刺激後のTHP-1細胞をDIF-3で24時間処理した。DIF-3の処理濃度は、10、20、及び30 μMとした。DIF-3処理後のTHP-1細胞におけるmPGES-1及びGAPDHタンパク質の発現をウエスタンブロットで検出した。DIF-1についても同様の操作を行った。
　その結果、DIF-3は、mPGES-1タンパク質の発現を抑制することが示された（図5）。その抑制効果は、DIF-3の濃度に依存的であり、その抑制の程度はDIF-1と同等であった。このことから、mPGES-1タンパク質の発現抑制効果は、DIF-1と化学構造が類似する、DIF-3及びその他の類似化合物、すなわち、式(I)で表されるDIFファミリーに共通の性質であることが示唆される。
　［実施例5］　LPS刺激後の細胞におけるmPGES-1のmRNA発現抑制
　上記実施例2（2-1）に記載の方法にしたがって、PMA及びLPS刺激されたTHP-1細胞を、DIF-1（30 μM）で24時間処理した。DIF-1処理後のTHP-1細胞から、Torizol試薬（GIBCO）を用いて添付の使用説明書にしたがってトータルRNAを抽出した。当該RNAから、High-Capacity　cDNA　Reverse　Transcription　Kits（Applied　Biosystems）を用いて相補的DNA（cDNA）を調製した。当該cDNAを用いて、GAPDH及びmPGES-1の遺伝子発現をリアルタイムPCR法によって解析した（PCRの条件： 50℃, 2 min → 95℃, 10 min → (95℃, 15 sec → 60℃, 1 min)×45 cycles）。解析は、TaqMan　Gene　Expression　Assay　Kit（Applied　Biosystems）、GAPDHのプライマー（Hs99999905＿m1、Applied　Biosystems）、及びmPGES-1のプライマー（Hs01115610＿m1、Applied　Biosystems）を用いた、リアルタイムPCR装置ABI-7500により行った。
　その結果、DIF-1の処理によって、THP-1細胞におけるmPGES-1　mRNAの発現量が、DIF-1未処理のTHP-1細胞に比べて、著しく低いことが示された（図6）。この結果から、DIF-1によるmPGES-1の抑制効果は、mRNAの転写抑制に基づくことが示された。
　[実施例6]　mPGES-1プロモーター活性に及ぼすDIF-1の影響
　24穴培養用プレートに1×105個のヒト大腸がん由来HCT-116細胞を撒き、24時間後、ヒトmPGES-1プロモーター（-35/-1068bp）を組み込んだホタルルシフェラーゼレポーターベクター（pGL3-Basic）と、導入効率の適正化のためのウミシイタケルシフェラーゼレポーターベクター(pRL-SV40)をHCT-116細胞に導入した。24時間後、DIF-1（10又は30μM）で6、12、及び24時間処理した。ここで、DIF-1未処理のHCT-116細胞を対照とした。処理後のHCT-116細胞におけるルシフェラーゼ活性をPromega社のキットDual Luciferase Assay Systemを用いて測定した。
　その結果（図7）、DIF-1未処理のHCT-116細胞においては、時間の経過に伴ってルシフェラーゼ活性が上昇した。一方、DIF-1で処理したHCT-116細胞においては、処理時間の経過に伴ってルシフェラーゼ活性が減少した。このことは、DIF-1がヒトmPGES-1プロモーターに対して抑制的に作用してルシフェラーゼのmRNAの発現を抑制し、ルシフェラーゼタンパク質の発現を抑制したことを意味する。DIF-1は、10μMでも十分に効果を発揮することも示された。
　以上の結果より、DIF-1によるmPGES-1　mRNAの発現抑制効果は、mPGES-1　mRNAのプロモーターに対する抑制的作用に基づいていることが明らかになった。
　[実施例7]　LPS刺激後のTHP-1細胞における、DIF-1によるPGE2産生抑制
　直径35mmの培養用ディッシュに1×106個のTHP-1細胞を撒き、PMA（100 nM）で刺激することにより、THP-1細胞を分化誘導させた。24時間後、LPS（10μg/ml）でTHP-1細胞を刺激した。24時間後、DIF-1（30μM）でTHP-1細胞を処理した。ここで、DIF-1で処理しない細胞を対照とした。24時間後、THP-1細胞の培養上清に含まれるPGE2の生成量をCayman Chemical社のキットを用いて測定した（図8）。
　PGE2の生成量が最も高かったのは、DIF-1未処理のTHP-1細胞であった（図8中の「LPS 48」）。一方、THP-1細胞をDIF-1で処理した場合、PGE2の生成量は、LPSによる24時間刺激後のPGE2の生成量とほぼ同等であった（図8中、「＋ DIF 30μM」、「LPS 24」）。このことから、DIF-1で処理した後は、PGE2の生成がほぼ完全に抑制されたことが示唆される。
　以上より、DIFファミリーがプロスタグランジンE類の合成抑制に有用であることが示唆される。さらに、プロスタグランジンE類は、炎症反応の惹起において大きな役割を担っていることから、DIFファミリーが炎症の処置においても有効であることが示唆される。
　［実施例8］　cPGES、及びmPGES-2タンパク質の発現におけるDIF-1の影響
　直径35mmの培養用ディッシュに1×106個のTHP-1細胞を撒き、PMA（100 nM）刺激により、THP-1細胞を分化誘導させた。24時間後、LPS（10μg/ml）でTHP-1細胞を刺激した。24時間後、DIF-1（30μM）でTHP-1細胞を刺激した。ここで、DIF-1処理をしないTHP-1細胞を対照とした。DIF-1による24時間処理後のTHP-1細胞におけるcPGES、mPGES-2、及びチューブリンタンパク質の発現をウエスタンブロットで解析した。
　一次抗体として、cPGESタンパク質の検出にポリクローナル抗cPGES抗体(CaymanChemicals)、mPGES-2タンパク質の検出にポリクローナル抗mPGES-2抗体(CaymanChemicals)、及びチューブリンタンパク質の検出にモノクローナル抗チューブリン抗体を用いる以外は、上記実施例1に記載の方法にしたがった。さらに、デンシトメトリーを用いて、検出されたタンパク質に相当するバンドの濃さを測定した。
　その結果、DIF-1で処理したTHP-1細胞におけるcPGESタンパク質の発現量は、DIF-1未処理のTHP-1細胞とほぼ同じであった（図9(B)上の図、cont、DIF-1）。mPGES-2タンパク質の発現量についても、同様の結果であった（図9(B)下の図、cont、DIF-1）。さらに、cPGES及びmPGES-2タンパク質の発現量は、LPS刺激によってもほとんど変化しなかった（図9(B)上下の図、PMA、Time 0）。
　以上のことから、cPGES及びmPGES-2タンパク質の発現は、DIF-1処理によって影響されないことが明らかとなった。そして、cPGES及びmPGES-2は、細胞刺激によって発現誘導されない酵素であることも確認された。これらのことより、DIF-1は、細胞刺激に応答して発現誘導されるmPGES-1のみに作用することにより、効果的に炎症や腫瘍等の疾患を処置できるだけでなく、副作用も低減できることが示唆される。
　［実施例９］　COX-2タンパク質の発現におけるDIF-1の影響
　THP-1細胞を、10％ウシ胎仔血清を加えたRPMI1640培地中で培養した。直径35 mmの培養用ディッシュに1×106個の細胞を撒き、PMA（100 nM）刺激により、THP-1細胞を分化誘導させた。24時間後、LPS（10 μg/ml）でTHP-1細胞を24時間刺激した後、DIF-1（30 μM）でTHP-1細胞を24時間処理した。
　上記のように処理した各THP-1細胞における、COX-2、mPGES-1、及びGAPDHタンパク質の発現量を、ウエスタンブロット法により解析した（図10）。DIF-1はCOX-2タンパク質の発現を阻害することなく、mPGES-1タンパク質の発現のみを阻害することが示された。
　これらの結果と実施例8の結果を鑑みると、DIF及びその類縁体は、mPGES-1以外のPGES、及びアラキドン酸カスケードに関わる他の酵素に影響を与えないため、生体機能の維持に必要なプロスタグランジン類の生成を阻害することなく、効果的に炎症や腫瘍等の疾患を処置し、かつ副作用を低減できることが示唆される。
　［実施例10］DIF-1ががん細胞にて高発現しているmPGES-1のmRNA発現に及ぼす影響
　子宮頚がん由来HeLa細胞を用いて、DIF-1ががん細胞にて高発現している非炎症性のmPGES-1のmRNA発現に及ぼす影響について検討した。
　HeLa細胞を、DIF-1（30 μM）で1及び3時間処理した。DIF-1で処理した後のHeLa細胞から、Torizol試薬（GIBCO）を用いて添付の使用説明書にしたがってトータルRNAを抽出した。当該RNAから、High-Capacity　cDNA　Reverse　Transcription　Kits（Applied　Biosystems）を用いて相補的DNA（cDNA）を調製した。当該cDNAを用いて、GAPDH及びmPGES-1の遺伝子発現をリアルタイムPCR法によって解析した（PCRの条件： 50℃, 2 min → 95℃, 10 min → (95℃, 15 sec → 60℃, 1 min)×45 cycles）。解析は、TaqMan　Gene　Expression　Assay　Kit（Applied　Biosystems）、GAPDHのプライマー（Hs99999905＿m1、Applied　Biosystems）、及びmPGES-1のプライマー（Hs01115610＿m1、Applied　Biosystems）を用いた、リアルタイムPCR装置ABI-7500により行った。
　その結果、DIF-1の処理によって、HeLa細胞におけるmPGES-1　mRNAの発現が速やかに阻害を受け、DIF-1未処理のHeLa細胞に比べて、発現量が著しく抑制されることが示された（図11）。この結果から、DIF-1は炎症由来のみでなくがん細胞に特異的に高発現しているmPGES-1のmRNA転写抑制をも行なうことが示された。
　［実施例11］DIF-1ががん細胞にて高発現しているmPGES-1のプロモーター活性に及ぼす影響
　子宮頚がん由来HeLa細胞を用いて、DIF-1ががん細胞にて高発現しているmPGES-1のプロモーター活性に及ぼす影響について検討した。
　24穴培養用プレートに1×105個のHeLa細胞を撒き、24時間後、ヒトmPGES-1プロモーター（-35/-1068bp）を組み込んだホタルルシフェラーゼレポーターベクター（pGL3-Basic）と、導入効率の適正化のためのウミシイタケルシフェラーゼレポーターベクター(pRL-SV40)をHeLa細胞に導入した。24時間後、DIF-1（30μM）で1、3、及び6時間処理した。ここで、DIF-1未処理のHeLa細胞を対照とした。処理後のHeLa細胞におけるルシフェラーゼ活性をPromega社のキットDual Luciferase Assay Systemを用いて測定した。
　その結果、DIF-1で処理したHeLa細胞においては、処理時間の経過に伴ってルシフェラーゼ活性が低下した（図12）。このことは、DIF-1がヒトmPGES-1プロモーターに対して抑制的に作用してルシフェラーゼのmRNAの発現を抑制し、ルシフェラーゼタンパク質の発現を抑制したことを意味する。
　これらの結果と実施例６の結果より、DIF-1は炎症由来のみでなくがん細胞に特異的に高発現しているmPGES-1　mRNAの発現抑制を、プロモーター活性を抑制することにより行なっていることが明らかになった。
　［実施例12］　DIF-1の体内動態
　DIF-1を腹腔内投与又は経口投与した後、DIF-1の血漿中の濃度変化を解析した。
　（12-1）DIF-1の腹腔内投与
　10-14週齢のC57BL/6JマウスにDIF-1（30 mg/kg）を腹腔内に投与し、0.5、1、3、及び6時間後に、3匹のマウスから血液を採血した。血液サンプルを、TSKgel ODS-80Tsを接続した高速液体クロマトグラフィー（Waters 2695）にアプライし、5％酢酸の存在下、メタノール40－95％のグラジエントによりDIF-1を溶出させ、血漿中のDIF-1濃度を測定した。
　（12-2）DIF-1の経口投与
　10-14週齢のC57BL/6JマウスにDIF-1（150 mg/kg）を経口投与し、1、2、3、及び6時間後に、3匹のマウスから血液を採血した。血漿中のDIF-1の濃度を高速液体クロマトグラフィーにより測定した。
　（12-3）結果
　腹腔内投与後の血漿中のDIF-1濃度は、投与後0．5時間で最大値を示し、その後急激に減少した（図13(A)）。一方、経口投与後の血漿中のDIF-1濃度は、投与後1時間で最大値を示し、その後急激に減少した（図13(B)）。これらの結果から、DIF-1は、腹腔内投与、経口投与のいずれの方法でも投与可能であること、そして投与後は非常に速やかに循環血中に取り込まれることから、良好な組織移行性を示すことが示された。
　［実施例13］　モデルマウスを用いた抗腫瘍効果の検討
　ヒト大腸がんの発症モデルマウスであるMUTYHノックアウトCB57BL/6Jマウス（医学研究院基礎放射線部門から提供された）を用いて検討を行った。4週齢のMUTYHノックアウトマウスに12週齢まで0．2％臭素酸カリウム溶液を飲用させ小腸に腫瘍を形成させた。その後、以下の投与グループを設定し、16週齢まで1日1回、週5回のスケジュールで経口投与した：
　　（1）0．25％メチルセルロース（コントロール）；
　　（2）0．25％メチルセルロースとDIF-1（10、30、100、150 mg/kg）の懸濁液；
　　（3）0．25％メチルセルロースとセレコキシブ（ファイザー株式会社より提供された）（50、150 mg/kg）の懸濁液；
　　（4）0．25％メチルセルロースとジメチルセレコキシブ（九州大学先導物質研究所友岡研究室より提供された）（50、150 mg/kg）の懸濁液。
　グループ（3）及び（4）は、DIF-1による抗腫瘍効果との比較のために設けた。前記セレコキシブは、COX-2活性を特異的に阻害する非ステロイド抗炎症剤（NSAIDs）であり、米国においては家族性大腸腺腫症（Familial　Adenomatotus　Polyposis:FAP）に対する使用が認められている。前記ジメチルセレコキシブは、COX-2活性の阻害作用を有さない、セレコキシブのアナログである。各グループごとに、オスとメス3匹ずつ、計6匹のマウスを用いた。投与終了後採血し、マウスを安楽死させて小腸を摘出し、4％ホルマリン溶液にて一晩固定した。固定後のサンプルを実体顕微鏡下で観察し小腸の腫瘍の数を計測するとともに、デジタル写真を撮影した。撮影したデジタル画像をコンピュター上で解析し、腫瘍直径を測定した。
　DIF-1は濃度依存的に、個体あたりの腫瘍の数及び腫瘍直径の平均を減少させることが示された（図14（A）及び（B））。DIF-1（150 mg/kg）の効果は、セレコキシブ（150 mg/kg）の効果にほぼ匹敵していた。一方、COX-2活性阻害作用をもたない、つまり抗炎症作用のないジメチルセレコキシブの投与によっては、DIF-1やセレコキシブで見られたほどの抗腫瘍活性は認められなかった。この結果より、DIF-1は腫瘍の治療において有効であることが確認された。
　［実施例14］　DIF-1投与による副作用の検討
　実施例13に記載の方法にしたがって、マウスにDIF-1（10、30、100、150 mg/kg）、セレコキシブ（150 mg/kg）又はジメチルセレコキシブ（50、150 mg/kg）を経口投与した。投与終了後、血球数、血糖値及び体重変化を測定した。（血球数は日本光電社製動物専用全血全自動・血液8項目血球係数器を用いて測定し、体重はメトラー社製電子天秤、血糖値はAventir Biotech社製Glucose PILOTを用いて測定した）。
　DIF-1はその最大濃度（150 mg/kg）を投与した群においても、コントロールと比較して白血球の減少は観察されず、骨髄抑制は発生していないこと、そして体重の減少も観察されなかった。このことから、DIF-1の投与によっては、骨髄抑制や体重減少などの副作用は起こらないことが示唆された（表1）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005

Claims (13)

  1. 　式（I）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　ここで、R1は、ヒドロキシ、及び－O－C1-3アルキルより選択され；
    　R2は、水素、クロロ、ブロモ、及びヨードより選択され；
    　R3は、－O－C1-3アルキル、及びヒドロキシより選択され；
    　R4は、水素、クロロ、ブロモ、及びヨードより選択され；
    　R5は、ヒドロキシ、C1-6アルキル、及び－O－C1-3アルキルより選択され；
    　R6は、水素、ヒドロキシ、C1-10アルキル、及びC3-6シクロアルキルより選択され；そして、
    　前記－O－C1-3アルキル、C1-6アルキル、C1-10アルキル、及びC3-6シクロアルキルは、それぞれ独立して、炭素上でヒドロキシ、アミノ、メチル、及びメトキシから選択される1以上の置換基で置換されていてもよい；
    で表される、臨床上有効量の化合物又は医薬、食品若しくは化粧品として許容可能なその塩、及び医薬、食品若しくは化粧品として許容可能な賦形剤又は担体を含む組成物。
  2. 　式(I)において、R1がヒドロキシ、R2がクロロ、及びR3が－O－CH3である、請求項１に記載の組成物。
  3. 　式（I）で表される化合物が、1-［3，5-ジクロロ-2，6-ジヒドロキシ-4-メトキシフェニル］-1-ヘキサノン、1-［3，5-ジクロロ-2，6-ジヒドロキシ-4-メトキシフェニル］-1-ペンタノン、1-［3-クロロ-2，6-ジヒドロキシ-4-メトキシフェニル］-1-ヘキサノン、又は3，5-ジクロロ-2-ヒドロキシ-4-メトキシ-6-プロピル安息香酸である、請求項1に記載の組成物。
  4. 　請求項1に定義した化合物を含む、プロスタグランジンEの合成抑制剤。
  5. 　請求項1に定義した化合物を含む、膜結合型プロスタグランジンE合成酵素の発現抑制剤。
  6. 　炎症の処置のための、請求項1～3のいずれか1項に記載の組成物。
  7. 　長期に処置が必要な疾患又は状態を有する対象に投与するための、請求項6に記載の組成物。
  8. 　関節リウマチの処置のための、請求項7に記載の組成物。
  9. 　悪性腫瘍の処置のための、請求項7に記載の組成物。
  10. 　経口投与に適した形態である、請求項1～3のいずれか1項に記載の組成物。
  11. 　請求項1で定義された式(I)で表される化合物をリード化合物とする、プロスタグランジンEの合成抑制活性を有する化合物の設計方法。
  12. 　請求項1で定義された式(I)で表される化合物を用いる化合物のスクリーニング方法であって、
    　ヒトmPGES-1プロモーターを組み込んだホタルルシフェラーゼレポーターベクターを導入した細胞を培養し、
    　当該細胞を試験化合物で処理し、
    　処理後のルシフェラーゼ活性を測定し、
    　請求項1で定義された式(I)で表される化合物による処理と比較して、ルシフェラーゼ活性を強く阻害する試験化合物を選択する、
    ことによりmPGES-1プロモーターの活性を強く阻害する試験化合物を選択し、
    　PMA及びLPSで刺激した細胞を、上記で選択した試験化合物で処理し、
    　処理後のcPGES、mPGES-2、及びCOX-2タンパク質の発現を検出し、
    　請求項１で定義された式(I)で表される化合物による処理と比較して、cPGES、mPGES-2、及びCOX-2のタンパク質の発現量に影響を与えない試験化合物を選択することを含む、
    　前記スクリーニング方法。
  13. 　試験化合物が請求項11に記載の方法によって設計された化合物である、請求項12に記載の方法。
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