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WO2010137547A1 - 中枢神経細胞の増殖及び分化に係る中核因子を含む医薬組成物 - Google Patents

中枢神経細胞の増殖及び分化に係る中核因子を含む医薬組成物 Download PDF

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WO2010137547A1
WO2010137547A1 PCT/JP2010/058722 JP2010058722W WO2010137547A1 WO 2010137547 A1 WO2010137547 A1 WO 2010137547A1 JP 2010058722 W JP2010058722 W JP 2010058722W WO 2010137547 A1 WO2010137547 A1 WO 2010137547A1
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WO
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crbn
pharmaceutical composition
cells
ubiquitin ligase
neural
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PCT/JP2010/058722
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English (en)
French (fr)
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宏 半田
安藤　秀樹
拓水 伊藤
健太郎 堀田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tokyo Institute of Technology NUC
Original Assignee
Tokyo Institute of Technology NUC
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Publication date
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Priority to JP2011516008A priority patent/JP5645816B2/ja
Priority to US13/322,195 priority patent/US20120134969A1/en
Priority to EP10780502.0A priority patent/EP2436387B1/en
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    • C12Y603/02—Acid—amino-acid ligases (peptide synthases)(6.3.2)
    • C12Y603/02019—Ubiquitin-protein ligase (6.3.2.19), i.e. ubiquitin-conjugating enzyme
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition used for the treatment of cerebral cortical diseases and the like, and a pharmaceutical composition thereof administered to a non-human animal, the proliferation of neural stem cells or neural progenitor cells of the non-human animal
  • the present invention relates to a method for inducing differentiation and a method for screening therapeutic agents for cerebral cortical diseases and the like.
  • Recent advances in neuronal research have created the possibility of regenerating brains lost due to Alzheimer's disease or trauma. In such brain regeneration, it is important to elucidate factors that induce differentiation into nerve cells.
  • Non-patent Document 1 a protein called Lhx2 induces neural stem cells or neural progenitor cells into the cortex and suppresses induction into the hippocampus.
  • the nerve cell can be regenerated and used for treatment of cerebral cortical diseases such as Alzheimer's disease.
  • the present invention has been made under the technical background as described above, and provides a new factor that induces differentiation into nerve cells.
  • CRBN Cereblon
  • Lhx2 a known cerebral cortical selector factor
  • CRBN is a protein that forms a ubiquitin ligase complex, and its amino acid sequence is also known, but it has never been known that it has a function of inducing the proliferation and differentiation of central neural stem cells or neural progenitor cells. It was.
  • the present invention has been completed based on the above findings. That is, the present invention provides the following [1] to [11].
  • a pharmaceutical composition comprising 1) CRBN, 2) a nucleic acid encoding CRBN, or 3) a stem cell or neural progenitor cell in which CRBN is expressed.
  • the pharmaceutical composition according to [1] wherein a nucleic acid encoding CRBN is inserted into a viral vector.
  • the pharmaceutical composition according to [1] further comprising a protein that forms a ubiquitin ligase complex with CRBN in addition to CRBN.
  • the pharmaceutical composition according to any one of [1] to [5] which is used for treatment of cerebral cortical diseases or surgical damage of cerebral cortex.
  • the pharmaceutical composition according to any one of [1] to [5] which is used for regeneration of cerebral cortex.
  • [8] A method of administering the pharmaceutical composition according to any one of [1] to [7] to a non-human animal, and proliferating neural stem cells or neural progenitor cells of the non-human animal.
  • [9] A method of administering the pharmaceutical composition according to any one of [1] to [7] to a non-human animal and differentiating the neural stem cells or neural progenitor cells of the non-human animal into nerve cells.
  • the method includes a step of bringing a test substance into contact with a ubiquitin ligase complex containing CRBN, and a step of measuring a ubiquitin ligase activity of the ubiquitin ligase complex and selecting a test substance having improved ubiquitin ligase activity.
  • a screening method for a therapeutic agent for a cerebral cortical disease or a surgical damage of the cerebral cortex [11] The step of culturing neural stem cells or neural progenitor cells in the presence of the test substance, and the expression level of CRBN in the neural stem cell or neural progenitor cell are measured, and the test substance having an increased CRBN expression level is selected.
  • a screening method for a therapeutic agent for a cerebral cortical disease or a surgical damage to the cerebral cortex which comprises a step.
  • the CRBN contained in the pharmaceutical composition of the present invention induces proliferation and differentiation into central nerve stem cells or neural progenitor cells. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention is useful as a therapeutic agent for cerebral cortical diseases such as Alzheimer's disease. CRBN is also useful as a target substance for the development of new therapeutic agents for cerebral cortical diseases.
  • Fluorescence micrograph of zebrafish embryo The upper left is a normal embryo, the upper right is an embryo in which the crbn gene is overexpressed, the lower left is an embryo in which the lhx2 gene is knocked down, and the lower right is an embryo in which the lhx2 gene is knocked down and the crbn gene is overexpressed.
  • Micrograph of zebrafish embryo The right shows an embryo overexpressing the crbn gene, and the left shows an untreated embryo. The shooting magnification is the same for both. Photomicrograph of zebrafish transplanted with cells overexpressing the crbn gene (fluorescently labeled with rhodamine). The top row was taken at 200x and the bottom row was taken at 100x.
  • the left column is a bright field image
  • the right column is a fluorescent image.
  • the left figure is a photograph of a normal individual, and the right figure is a photograph of a CRBN overexpressing individual.
  • the left figure is a photograph of a normal individual, and the right figure is a photograph of a CRBN overexpressing individual.
  • 1 indicates the pineal gland
  • 2 indicates the ventral posterior node
  • 3 indicates the raphe nucleus.
  • a to D show cases where cells not expressing CRBN were transplanted
  • E to H show cases where cells expressing CRBN were transplanted.
  • a and E are bright-field images
  • B and E are AlexaFluor (registered trademark) fluorescence images (showing tubulin distribution)
  • C and G are rhodamine fluorescence images (donor cell distribution).
  • D and H are fluorescence images of AlexaFluor (registered trademark) and rhodamine.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is characterized by comprising 1) CRBN, 2) a nucleic acid encoding CRBN, or 3) a stem cell or neural progenitor cell expressing CRBN.
  • CRBN is a known protein, and the base sequence of the gene (crbn gene) that encodes it is also published on the database.
  • the base sequence of the human-derived crbn gene, the base sequence of the mouse-derived crbn gene, the base sequence of the rat-derived crbn gene, and the base sequence of the zebrafish-derived crbn gene are GeneID: 51185, GeneID: 58799, It is registered with Entrez Gene with GeneID: 297498 and GeneID: 445491.
  • the CRBN or crbn gene used may be natural, but consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the natural CRBN, and is an active ubiquitin ligase complex
  • a modified CRBN capable of forming a body or a gene encoding the same may be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain CRBN, a CRBN-encoding nucleic acid, a stem cell expressing CRBN, or a neural progenitor cell as an active ingredient.
  • Preparation and use of pharmaceutical compositions containing these as active ingredients can be carried out in the same manner as known pharmaceuticals containing proteins, nucleic acids, stem cells, and progenitor cells as active ingredients.
  • the nucleic acid encoding CRBN may be either DNA or RNA.
  • the nucleic acid is preferably inserted into an appropriate vector so that it can act on neural stem cells in the brain.
  • Such vectors can include viral vectors.
  • virus vectors include adenovirus vectors, retrovirus vectors, and lentivirus vectors.
  • the stem cells that express CRBN are preferably patient-derived iPS cells because rejection can be avoided, but other stem cells such as ES cells, adult stem cells, cord blood stem cells, and the like may be used.
  • CRBN may be expressed in stem cells, but is preferably overexpressed.
  • the method of expressing or overexpressing CRBN can be performed according to, for example, the method of Ando et al. (Andokaand Okamoto, Mar Biotechnol 8 (3): 295-303.
  • the administration method of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately determined according to the type of active ingredient.
  • CRBN or a nucleic acid encoding CRBN is used as an active ingredient, it can be administered by injection or infusion into the ventricle, intradermal, intraperitoneal, vein, artery, or spinal fluid.
  • CRBN acts on neural stem cells or neural progenitor cells in the brain, it is preferable that treatment is performed so that it can pass through the cerebrovascular barrier, except when administered into the ventricle. Examples of such treatments include methods of binding to essential endogenous substances that are actively incorporated, structural modifications that avoid recognition of efflux transporters, and molecular weight reduction that includes only a minimal functional region.
  • stem cells or neural progenitor cells are used as active ingredients, they are administered directly into the ventricle.
  • the dose of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately determined according to the type of active ingredient.
  • the daily dose for adults is preferably 0.5 mg to 100 mg when CRBN is administered, and preferably 1 mg to 200 mg when CRBN-encoding nucleic acid is administered, so that CRBN is expressed.
  • stem cells or neural progenitor cells it is preferable to administer 500 to 5000 cells in an amount of about 50 ⁇ l to 500 ⁇ l.
  • the pharmaceutical composition of the present invention When the pharmaceutical composition of the present invention is administered by injection or infusion, it may contain components usually contained in injection solutions or infusion solutions.
  • Such components include liquid carriers (for example, potassium phosphate buffer, physiological saline, Ringer's solution, distilled water, polyethylene glycol, vegetable oils, ethanol, glycerin, dimethyl sulfoxide, propylene glycol, etc.), antibacterial agents And local anesthetics (eg, procaine hydrochloride, dibucaine hydrochloride, etc.), buffer solutions (eg, Tris-HCl buffer solution, Hepes buffer solution, etc.), osmotic pressure regulators (eg, glucose, sorbitol, sodium chloride, etc.) .
  • liquid carriers for example, potassium phosphate buffer, physiological saline, Ringer's solution, distilled water, polyethylene glycol, vegetable oils, ethanol, glycerin, dimethyl sulfoxide, propylene glycol, etc.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain 1) a protein that forms a ubiquitin ligase complex with CRBN in addition to CRBN, and 2) a ubiquitin ligase complex together with CRBN in addition to a nucleic acid encoding CRBN.
  • a nucleic acid encoding a protein to be formed may be included, and 3) a stem cell or a neural progenitor cell in which a protein that forms a ubiquitin ligase complex with CRBN in addition to CRBN may be included.
  • proteins that form a ubiquitin ligase complex with CRBN include DDB1 (Damaged DNA Binding protein), Cul4A (Cullin 4A), Cul4B (Cullin 4B), Roc1 (RBX1) and the like. These proteins are known proteins like CRBN, and the base sequences of the genes encoding them (ddb1 gene, cul4a gene, cul4b gene, roc1 gene) are also published on the database.
  • the base sequence of human-derived ddb1 gene, the base sequence of ddb1 gene from mouse, the base sequence of ddb1 gene from rat, and the base sequence of ddb1 gene from zebrafish are GeneID: 1642, GeneID: 13194, GeneID: 64470, and GeneID: 393599, registered in Entrez Gene, human cul4a gene base sequence, mouse cul4a gene base sequence, rat cul4a gene base sequence, and zebrafish cul4a
  • the base sequences of the genes are registered in Entrez Gene with GeneID: 8451, GeneID: 99375, GeneID: 361181, and GeneID: 394002, the base sequence of the cul4b gene derived from human, the base sequence of the cul4b gene derived from mouse,
  • the nucleotide sequence of cul4b gene derived from rat and the nucleotide sequence of cul4b gene derived from zebrafish are GeneID: 8450, GeneID: 72584
  • the ubiquitin ligase complex includes three types of proteins DDB1, CuL4A, Roc1, or DDB1, CuL4B, and Roc1.
  • the pharmaceutical composition of the present invention preferably contains (or expresses) all of these three types of proteins (or nucleic acids encoding these proteins), but may contain only a part of these. .
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used for treatment of cerebral cortex disease or surgical damage of the cerebral cortex or for regeneration of the cerebral cortex.
  • cerebral cortical diseases include Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Creutzfeldt-Jakob disease, Huntington's disease, progressive supranuclear palsy, cerebral cortex basal ganglia degeneration, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is used for humans, but may be administered to animals other than humans to induce proliferation of neural stem cells or neural progenitor cells or differentiation into neural cells of the animals.
  • the target animals are mainly vertebrates, such as mice, rats, monkeys, dogs, ferrets, hamsters, chickens, Xenopus, zebrafish, and medaka.
  • CRBN CRBN induces proliferation of neural stem cells or neural progenitor cells and differentiation into neural cells, as described in Examples.
  • genome synteny is 70-80% conserved between humans and zebrafish (NatureNReviews Genetics 8, 353-367 (May 2007)). Therefore, CRBN is expected to show the same action as that confirmed in zebrafish in other vertebrates including humans.
  • (A) a step of contacting a test substance with a ubiquitin ligase complex containing CRBN, and a step of measuring a ubiquitin ligase activity of the ubiquitin ligase complex and selecting a test substance having improved ubiquitin ligase activity. And a screening method for a therapeutic agent for a cerebral cortical disease or a surgical damage of the cerebral cortex.
  • (B) The step of culturing neural stem cells or neural progenitor cells in the presence of the test substance, and the expression level of CRBN in the neural stem cell or neural progenitor cell are measured, and the test substance with an increased CRBN expression level is selected.
  • the ubiquitin ligase activity can be measured, for example, according to the methods of Angers et al. (Nature 443, 590-593, 2006) and Groisman et al (Cell 113, 357-367, 2003).
  • whether the test substance has improved the ubiquitin ligase activity is determined by measuring the ubiquitin ligase activity of the complex containing CRBN without contacting with the test substance and comparing it with the value. Can do.
  • the substance selected by the method (A) has a function of improving the ubiquitin ligase activity of the complex containing CRBN present in neural stem cells or neural progenitor cells in vivo. Proliferation of neural stem cells or neural progenitor cells and differentiation into neural cells by CRBN are considered to be performed through the ubiquitin ligase activity of this complex. Therefore, the substance selected by the method (A) promotes proliferation and differentiation of neural stem cells or neural progenitor cells by CRBN and has therapeutic effects on cerebral cortical diseases and surgical damage of the cerebral cortex. Conceivable.
  • neural stem cells to be used ES cells, iPS cells, adult stem cells obtained by inducing neural differentiation and the like are basically used.
  • neural stem cells derived from adult mouse subventricular zone or adult rat hippocampus may be used.
  • the expression level of CRBN can be measured by a method using an antibody against CRBN, an in situ hybridization method, an RT-PCR method, a northern blot method, or the like.
  • whether or not the test substance increased the expression level of CRBN was determined by culturing neural stem cells or neural progenitor cells in the absence of the test substance, measuring the expression level of CRBN, and comparing it with the value. This can be determined.
  • the substance selected by the method (B) has a function of increasing the expression level of CRBN in neural stem cells or neural progenitor cells in vivo. Accordingly, the substance selected by the method (B) promotes proliferation and differentiation of neural stem cells or neural progenitor cells by CRBN and has a therapeutic effect on cerebral cortical diseases and surgical damage of the cerebral cortex. Conceivable.
  • AMO antisense morpholino oligonucleotide
  • the basic principle is to cultivate embryos knocked down by one of the two types of genes (A), which are suggested to be functionally related (A), up to 6 hours after fertilization (the gastrulation stage). Expression of the other gene (B) is induced in the planned forebrain region by in vivo lipofection of the method (2) above. If the knockdown effect of A is remedied 24 hours after fertilization and the knockdown effect of B is not remedied by the reverse combination of A and B, it is determined that A is positioned at the functional upper level of B.
  • Immunohistochemistry Antibody staining of zebrafish early neurons was performed by the following method. Embryos 24 to 28 hours after fertilization were fixed with 4% paraformaldehyde / phosphate buffer (pH 8.0) at 4 ° C. for 12 hours. After 4 washes for 15 minutes with phosphate buffer, 0.5% Blocking was performed at room temperature for 1 hour in 5% newborn goat serum dissolved in Triton X-100 / phosphate buffer.
  • rhodamine dextran molecular weight 10,000
  • a final concentration of 600 ng / ⁇ l of crbn RNA dissolved in zebrafish embryos at the 1-cell stage are injected under the conditions of the above method (1).
  • a donor was used.
  • 10-50 cells were aspirated with a glass microcapillary under fluorescent microscope observation and transplanted to the animal pole of the host (host) embryo at the same time.
  • the host embryos were cultured as they were for 2 days, and then the localization of differentiation of donor-derived cells expressing CRBN was observed with a fluorescence microscope.
  • As a negative control cells expressing green fluorescent protein (GFP), which has no effect on development, were also transplanted under the same conditions, and their differentiation localization was compared.
  • GFP green fluorescent protein
  • CRBN complex a binding protein
  • SIGMA M2 FLAG agarose beads
  • the purified CRBN complex is mixed with an aqueous solution containing Uba1 (E1), UbcH5b (E2), and GST-fused ubiquitin (Ub) recombinant protein, and after adding ATP, it is allowed to stand at 30-37 degrees for 2 hours. did.
  • the reaction was stopped by SDS, and polyacrylamide gel electrophoresis and immunoblotting were performed to detect and measure ubiquitin ligase activity by visualizing self-ubiquitination and ubiquitination of the binding protein.
  • This sample was reacted with an anti-glia monoclonal antibody (zrf-1 / zrf-2) or a rabbit anti-serotonin antibody at 4 ° C. overnight (12 to 18 hours).
  • an anti-glia monoclonal antibody zrf-1 / zrf-2
  • a rabbit anti-serotonin antibody at 4 ° C. overnight (12 to 18 hours).
  • PBST + 5% goat serum for 1 hour at room temperature goat anti-mouse IgG antibody (Cy-2 conjugate. Glial cell staining) or goat anti-rabbit IgG antibody (Cy-5 conjugate. Serotonin producing cell staining)
  • the secondary antibody reaction was performed. After reaction at 4 ° C. overnight (12 to 18 hours), the plate was washed with PBST for 1 hour at room temperature.
  • CRBN in living cells self-ubiquitinates in cooperation with other factors to generate ubiquitinated proteins with various molecular weights.
  • many of them are thought to be degraded by proteasomes in living cells.
  • the proteasome was inhibited by MG132, and it was considered that a large number of bands were detected because the protein produced by self-ubiquitination remained.
  • the right lane of FIG. 5 it is considered that almost no band was detected because most of the produced protein was degraded by the proteasome.
  • glial cells Fig. 6 left diagram
  • serotonin producing cells Fig. 7 left diagram
  • the present invention is useful as a therapeutic agent for cerebral cortical diseases such as Alzheimer's disease. It is also useful for developing new therapeutic agents for cerebral cortical diseases.

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Abstract

　神経幹細胞の増殖と神経細胞への分化を誘導する新たな因子を提供することを目的として、１）CRBN、２）CRBNをコードする核酸、又は３）CRBNを発現させた幹細胞若しくは神経前駆細胞を含有することを特徴とする医薬組成物、及びこの医薬組成物を非ヒト動物に投与し、その非ヒト動物の神経幹細胞又は神経前駆細胞の増殖と神経細胞への分化を誘導する方法、並びにCRBNを利用した大脳皮質疾患又は大脳皮質の外科的損傷の治療薬のスクリーニング方法を提供する。

Description

中枢神経細胞の増殖及び分化に係る中核因子を含む医薬組成物
　本発明は、大脳皮質疾患等の治療のために用いられる医薬組成物、及びその医薬組成物を非ヒト動物に投与し、その非ヒト動物の神経幹細胞又は神経前駆細胞の増殖や神経細胞への分化を誘導する方法、並びに大脳皮質疾患等の治療薬のスクリーニング方法に関する。
　近年の神経細胞に関する研究の進展によって、アルツハイマー病や外傷などによって失われた脳を再生できる可能性が生まれてきた。このような脳の再生においては、神経細胞への分化を誘導する因子の解明が重要である。
　神経細胞への分化誘導に関して、最近、Mangaleらは、Lhx2というタンパク質が神経幹細胞又は神経前駆細胞を皮質へ誘導し、海馬への誘導を抑制することを報告している（非特許文献１）。
Mangale, V. S. et al., Science, Vol.319, No.5861, 304-309, 2008
　上述のように、神経細胞への分化を誘導する因子を新たに見つけることができれば、神経細胞を再生し、アルツハイマー病などの大脳皮質疾患の治療に役立てることができる。
　本発明は、以上のような技術的背景の下になされたものであり、神経細胞への分化を誘導する新たな因子を提供することにある。
　本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、１）CRBN（cereblon）というタンパク質が幹細胞を神経幹細胞又は神経前駆細胞へ分化させ、更に神経細胞へと分化させる機能をもつこと、２）CRBNが中枢神経幹細胞又は神経前駆細胞の増殖を誘導すること、及び３）CRBNは、既知の大脳皮質セレクター因子であるLhx2の機能的下流に位置することを見出した。
　CRBNはユビキチンリガーゼ複合体を形成するタンパク質であり、アミノ酸配列も公知であるが、中枢神経幹細胞又は神経前駆細胞の増殖と神経細胞への分化を誘導する機能があることは従来全く知られていなかった。
　CRBNと脳との関係については、Higginsらの報告がある（J. J. Higgins et al., (2004) Neurology 63,1927-1931）。Higginsらは、軽度の精神遅滞を持つ家系には、crbn遺伝子の変異がみられることを報告している。しかし、この報告は、CRBNに上述したような機能がが存在することを示唆するものではない。
　本発明は、以上の知見に基づき完成されたものである。
　即ち、本発明は、以下の〔１〕～〔１１〕を提供するものである。
〔１〕１）CRBN、２）CRBNをコードする核酸、又は３）CRBNを発現させた幹細胞若しくは神経前駆細胞を含有することを特徴とする医薬組成物。
〔２〕CRBNをコードする核酸が、ウイルスベクター中に挿入されていることを特徴とする〔１〕に記載の医薬組成物。
〔３〕CRBNの他に、CRBNと共にユビキチンリガーゼ複合体を形成するタンパク質も含有することを特徴とする〔１〕に記載の医薬組成物。
〔４〕CRBNをコードする核酸の他に、CRBNと共にユビキチンリガーゼ複合体を形成するタンパク質をコードする核酸も含有することを特徴とする〔１〕又は〔２〕に記載の医薬組成物。
〔５〕CRBNの他に、CRBNと共にユビキチンリガーゼ複合体を形成するタンパク質も発現させた幹細胞若しくは神経前駆細胞を含有することを特徴とする〔１〕に記載の医薬組成物。
〔６〕大脳皮質疾患又は大脳皮質の外科的損傷の治療のために用いられることを特徴とする〔１〕乃至〔５〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔７〕大脳皮質の再生のために用いられることを特徴とする〔１〕乃至〔５〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔８〕〔１〕乃至〔７〕のいずれかに記載の医薬組成物を非ヒト動物に投与し、その非ヒト動物の神経幹細胞又は神経前駆細胞を増殖させる方法。
〔９〕〔１〕乃至〔７〕のいずれかに記載の医薬組成物を非ヒト動物に投与し、その非ヒト動物の神経幹細胞又は神経前駆細胞を神経細胞へ分化させる方法。
〔１０〕被験物質をCRBNを含むユビキチンリガーゼ複合体に接触させる工程、及び前記ユビキチンリガーゼ複合体のユビキチンリガーゼ活性を測定し、ユビキチンリガーゼ活性を向上させた被験物質を選択する工程を含むことを特徴とする大脳皮質疾患又は大脳皮質の外科的損傷の治療薬のスクリーニング方法。
〔１１〕被験物質の存在下で神経幹細胞又は神経前駆細胞を培養する工程、及び神経幹細胞又は神経前駆細胞中のCRBNの発現量を測定し、CRBNの発現量を増大させた被験物質を選択する工程を含むことを特徴とする大脳皮質疾患又は大脳皮質の外科的損傷の治療薬のスクリーニング方法。
　本発明の医薬組成物中に含まれるCRBNは、中枢神経幹細胞又は神経前駆細胞の増殖と神経細胞への分化を誘導する。従って、本発明の医薬組成物は、アルツハイマー病などの大脳皮質疾患の治療薬として有用である。また、CRBNは、大脳皮質疾患の新たな治療薬の開発のための標的物質としても有用である。
ゼブラフィッシュの胚の蛍光顕微鏡写真。左上が正常胚、右上がcrbn遺伝子を過剰発現させた胚、左下がlhx2遺伝子をノックダウンした胚、右下がlhx2遺伝子をノックダウンし、crbn遺伝子を過剰発現させた胚を示す。 ゼブラフィッシュの胚の顕微鏡写真。右がcrbn遺伝子を過剰発現させた胚を示し、左が未処理の胚を示す。撮影倍率は両者とも同じである。 crbn遺伝子を過剰発現させた細胞（ローダミンで蛍光標識）を移植したゼブラフィッシュの顕微鏡写真。上段は200倍、下段は100倍で撮影したものである。また、左列は明視野像、右列は蛍光像である。 試験管内反応系を用いたCRBN複合体(FH-CRBN complex)のユビキチンリガーゼ活性の検出のための電気泳動写真。左はユビキチンを、中央はCRBN複合体形成因子であるCul4Aを、右はCRBNのユビキチン化を、それぞれ免疫ブロッティングで検出している。Mockは、対照実験用のサンプル用いた場合を示す。 生細胞を用いたCRBN複合体のユビキチンリガーゼ活性の検出のための電気泳動写真。 グリア細胞を蛍光染色したゼブラフィッシュの頭部の拡大写真。左側が前端部である。左図が通常個体の写真であり、右図がCRBN過剰発現個体の写真である。 セロトニン産生細胞を蛍光染色したゼブラフィッシュの頭部の拡大写真。脳の背側から撮影している。上側が前端部である。左図が通常個体の写真であり、右図がCRBN過剰発現個体の写真である。図中の１は松果体を示し、２は腹側後方結節、３は縫線核を示す。 未分化細胞を脳室に移植したゼブラフィッシュの写真。Ａ～Ｄは、CRBNを発現しない細胞を移植した場合を示し、Ｅ～Ｈは、CRBNを発現する細胞を移植した場合を示す。Ａ及びＥは明視野画像であり、Ｂ及びＥはAlexaFluor（登録商標）の蛍光画像（チューブリンの分布を示す。）であり、Ｃ及びＧはローダミンの蛍光画像（ドナー細胞の分布を示す。）であり、Ｄ及びＨはAlexaFluor（登録商標）とローダミンの蛍光画像である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明の医薬組成物は、１）CRBN、２）CRBNをコードする核酸、又は３）CRBNを発現させた幹細胞若しくは神経前駆細胞を含有することを特徴とするものである。
　CRBNは既知のタンパク質であり、それをコードする遺伝子（crbn遺伝子）の塩基配列もデータベース上に公開されている。例えば、ヒト由来のcrbn遺伝子の塩基配列、マウス由来のcrbn遺伝子の塩基配列、ラット由来のcrbn遺伝子の塩基配列、及びゼブラフィッシュ由来のcrbn遺伝子の塩基配列は、それぞれGeneID:51185、GeneID:58799、GeneID:297498、及びGeneID:445491でEntrez Geneに登録されている。使用するCRBNやcrbn遺伝子は天然のものであってもよいが、天然のCRBNのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、活性を持つユビキチンリガーゼ複合体を形成できる改変型のCRBNやそれをコードする遺伝子を使用してもよい。
　本発明の医薬組成物は、CRBN、CRBNをコードする核酸、CRBNを発現させた幹細胞若しくは神経前駆細胞のいずれを有効成分としていてもよい。これらを有効成分とする医薬組成物の調製及び使用は、タンパク質、核酸、幹細胞、前駆細胞を有効成分とする既知の医薬と同様に行うことができる。
　CRBNをコードする核酸はDNA、RNAいずれであってもよい。核酸は、脳内の神経幹細胞に作用できるよう適当なベクターに挿入されていることが好ましい。このようなベクターとしては、ウイルスベクターを挙げることができる。ウイルスベクターの具体例としては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどを挙げることができる。
　CRBNを発現させる幹細胞としては、拒絶反応を回避できるため患者由来のiPS細胞が好ましいが、他の幹細胞、例えば、ES細胞、成体幹細胞、臍帯血幹細胞などでもよい。CRBNは幹細胞に発現させればよいが、過剰発現させることが好ましい。CRBNを発現又は過剰発現させる方法は、例えば、安藤らの方法（Ando and Okamoto, Mar Biotechnol 8(3):295-303. 2006）などに従って行うことができるが、他の方法、例えば、他のマイクロインジェクション法、ケージドRNA法（安藤ら、Nat Genet 28:317-325, 2001）、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、ウイルス法、ソノポレーション法、トランスポゾン法などによって行ってもよい。
　本発明の医薬組成物の投与方法は特に限定されず、有効成分の種類などに応じて適宜決めることができる。CRBNやCRBNをコードする核酸を有効成分とする場合は、脳室内、皮内、腹腔内、静脈、動脈、又は脊髄液への注射又は点滴等によって投与することができる。CRBNは脳内の神経幹細胞又は神経前駆細胞に対し作用するので、脳室内に投与する場合以外は、脳血管関門を通過できるような処理がなされることが好ましい。このような処理としては、積極的に取り込まれる必須内因性物質と結合させる、排出トランスポーターの認識を避ける構造的修飾を行なう、最低限の機能領域のみを含む低分子量化等の方法が考えられる。幹細胞又は神経前駆細胞を有効成分とする場合は、脳室内に直接投与する。
　本発明の医薬組成物の投与量は特に限定されず、有効成分の種類などに応じて適宜決めることができる。成人に対する１日当たりの投与量は、CRBNを投与する場合は0.5mg～100mg程度投与するのが好ましく、CRBNをコードする核酸を投与する場合は1mg～200mg程度投与するのが好ましく、CRBNを発現させる幹細胞又は神経前駆細胞を投与する場合は500細胞～5000細胞を50μl～500μl程度投与するのが好ましい。
　本発明の医薬組成物を注射又は点滴によって投与する場合は、注射液や点滴液に通常含まれる成分を含んでいてもよい。このような成分としては、液体担体（例えば、リン酸カリウム緩衝液、生理食塩水、リンゲル液、蒸留水、ポリエチレングリコール、植物性油脂、エタノール、グリセリン、ジメチルスルホキサイド、プロピレングリコールなど）、抗菌剤、局所麻酔剤（例えば、塩酸プロカイン、塩酸ジブカインなど）、緩衝液（例えば、トリス－塩酸緩衝液、ヘペス緩衝液など）、浸透圧調節剤（例えば、グルコース、ソルビトール、塩化ナトリウムなど）を例示できる。
　本発明の医薬組成物は、１）CRBNの他に、CRBNと共にユビキチンリガーゼ複合体を形成するタンパク質を含んでいてもよく、２）CRBNをコードする核酸の他に、CRBNと共にユビキチンリガーゼ複合体を形成するタンパク質をコードする核酸を含んでいてもよく、３）CRBNの他にCRBNと共にユビキチンリガーゼ複合体を形成するタンパク質も発現させた幹細胞又は神経前駆細胞を含んでいてもよい。CRBNと共にユビキチンリガーゼ複合体を形成するタンパク質としては、DDB1 (Damaged DNA Binding protein)、Cul4A (Cullin 4A)、Cul4B (Cullin 4B)、Roc1 (RBX1)などを例示できる。これらのタンパク質は、CRBNと同様に既知のタンパク質であり、それらをコードする遺伝子（ddb1遺伝子、cul4a遺伝子、cul4b遺伝子、roc1遺伝子）の塩基配列もデータベース上に公開されている。例えば、ヒト由来のddb1遺伝子の塩基配列、マウス由来のddb1遺伝子の塩基配列、ラット由来のddb1遺伝子の塩基配列、及びゼブラフィッシュ由来のddb1遺伝子の塩基配列は、それぞれGeneID:1642、GeneID: 13194、GeneID: 64470、及びGeneID: 393599でEntrez Geneに登録されており、ヒト由来のcul4a遺伝子の塩基配列、マウス由来のcul4a遺伝子の塩基配列、ラット由来のcul4a遺伝子の塩基配列、及びゼブラフィッシュ由来のcul4a遺伝子の塩基配列は、それぞれGeneID: 8451、GeneID: 99375、GeneID: 361181、及びGeneID: 394002でEntrez Geneに登録されており、ヒト由来のcul4b遺伝子の塩基配列、マウス由来のcul4b遺伝子の塩基配列、ラット由来のcul4b遺伝子の塩基配列、及びゼブラフィッシュ由来のcul4b遺伝子の塩基配列は、それぞれGeneID: 8450、GeneID: 72584、GeneID: 302502、及びGeneID: 560313でEntrez Geneに登録されており、ヒト由来のroc1遺伝子の塩基配列、マウス由来のroc1遺伝子の塩基配列、ラット由来のroc1遺伝子の塩基配列、及びゼブラフィッシュ由来のroc1遺伝子の塩基配列は、それぞれGeneID: 9978、GeneID: 56438、GeneID: 300084、及びGeneID:449846でEntrez Geneに登録されている。各タンパク質や遺伝子は天然のものであってもよいが、天然のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、活性を持つユビキチンリガーゼ複合体を形成できる改変型のタンパク質やそれをコードする遺伝子を使用してもよい。ユビキチンリガーゼ複合体には、CRBN以外にDDB1、CuL4A、Roc1、又はDDB1、CuL4B、Roc1の３種類のタンパク質が含まれている。本発明の医薬組成物は、これら３種類のタンパク質（又はこれらのタンパク質をコードする核酸）をすべて含んでいる（又は発現させている）ことが好ましいが、これらの一部しか含まなくてもよい。
　本発明の医薬組成物は、大脳皮質疾患又は大脳皮質の外科的損傷の治療のためや大脳皮質の再生のために用いることができる。大脳皮質疾患としては、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症などを挙げることができる。
　本発明の医薬組成物は、ヒトに用いるものであるが、ヒト以外の動物に投与し、その動物の神経幹細胞又は神経前駆細胞の増殖や神経細胞への分化を誘導してもよい。対象となる動物は、主として脊椎動物であり、例えば、マウス、ラット、サル、イヌ、フェレット、ハムスター、ニワトリ、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ、メダカなどである。
　CRBNが神経幹細胞又は神経前駆細胞の増殖及び神経細胞への分化を誘導することは、実施例に記載したように、ゼブラフィッシュでしか確認されていない。しかし、ヒトとゼブラフィッシュの間では、ゲノムシンテニーは７０～８０％保存されている（Nature Reviews Genetics 8, 353-367 (May 2007)）。従って、CRBNはヒトを含む他の脊椎動物においても、ゼブラフィッシュにおいて確認された作用と同様の作用を示すと予測される。
　CRBNが神経幹細胞又は神経前駆細胞の増殖及び神経細胞への分化を誘導することから、このタンパク質を利用して大脳皮質疾患又は大脳皮質の外科的損傷の治療薬のスクリーニングを行うことが可能である。具体的には、以下の（Ａ）及び（Ｂ）の方法を例示できる。
（Ａ）被験物質をCRBNを含むユビキチンリガーゼ複合体に接触させる工程、及び前記ユビキチンリガーゼ複合体のユビキチンリガーゼ活性を測定し、ユビキチンリガーゼ活性を向上させた被験物質を選択する工程を含むことを特徴とする大脳皮質疾患又は大脳皮質の外科的損傷の治療薬のスクリーニング方法。
（Ｂ）被験物質の存在下で神経幹細胞又は神経前駆細胞を培養する工程、及び神経幹細胞又は神経前駆細胞中のCRBNの発現量を測定し、CRBNの発現量を増大させた被験物質を選択する工程を含むことを特徴とする大脳皮質疾患又は大脳皮質の外科的損傷の治療薬のスクリーニング方法。
　（Ａ）の方法において、ユビキチンリガーゼ活性の測定は、例えば、Angersら (Nature 443, 590-593, 2006)や Groismanら（Cell 113, 357-367, 2003）の方法に従って行なうことができる。
　（Ａ）の方法において、被験物質がユビキチンリガーゼ活性を向上させたかどうかは、被験物質と接触させないでCRBNを含む複合体のユビキチンリガーゼ活性を測定し、その値と比較することにより、判定することができる。
　（Ａ）の方法によって選択される物質は、生体内の神経幹細胞又は神経前駆細胞に存在するCRBNを含む複合体のユビキチンリガーゼ活性を向上させる働きをもつ。CRBNによる神経幹細胞又は神経前駆細胞の増殖及び神経細胞への分化は、この複合体の持つユビキチンリガーゼ活性を介して行われていると考えられる。従って、（Ａ）の方法によって選択される物質は、CRBNによる神経幹細胞又は神経前駆細胞の増殖及び神経細胞への分化を促進し、大脳皮質疾患や大脳皮質の外科的損傷に対する治療効果を持つと考えられる。
　（Ｂ）の方法において、使用する神経幹細胞としては、基本的にES細胞、iPS細胞、成体幹細胞に神経分化誘導を施したもの等を用いる。または成体マウス脳室下帯由来あるいは成体ラット海馬由来の神経幹細胞などを用いてもよい。
　（Ｂ）の方法において、CRBNの発現量を測定する方法としては、CRBNに対する抗体を用いる方法、in situ hybridization法、RT-PCR法、ノーザンブロット法などによって行うことができる。
　（Ｂ）の方法において、被験物質がCRBNの発現量を増大させたかどうかは、被験物質の非存在下で神経幹細胞又は神経前駆細胞を培養し、CRBNの発現量を測定し、その値と比較することにより、判定することができる。
　（Ｂ）の方法によって選択される物質は、生体内の神経幹細胞又は神経前駆細胞のCRBNの発現量を増大させる働きをもつ。従って、（Ｂ）の方法によって選択される物質は、CRBNによる神経幹細胞又は神経前駆細胞の増殖及び神経細胞への分化を促進し、大脳皮質疾患や大脳皮質の外科的損傷に対する治療効果を持つと考えられる。
　以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。
（実験方法）
（１）ゼブラフィッシュ胚の全身での遺伝子過剰発現
　成魚は常時28.5℃で飼育し、照明オン14時間／オフ10時間の日周サイクルで継代、維持した。オスとメスの自然交配で受精卵を確保し、最初の卵割が始まる前（１細胞期）の胚に試験管内合成したCapped RNA水溶液を600 ng/μl の濃度で窒素ガス圧30 psi、30 msec（ミリ秒）間バルブ解放の条件で細胞質に注入した。lhx2遺伝子以外のすべての遺伝子（crbn遺伝子, six3.2遺伝子, crbnとE3ユビキチンリガーゼ複合体を構成する蛋白質をコードする遺伝子）の発現は全身での発現でも発生への影響が少ないのでこの方法で最初のデータを得た。
（２）ゼブラフィッシュ胚の頭部に限局した遺伝子過剰発現
　全身での発現で非特異的な胚の背側化を示すlhx2遺伝子および脳容積への影響を特異的に調べる精密な実験を行なう場合は、胚への予定頭部領域への生体内RNAリポフェクションを行なった。方法は、安藤らが開発、発表した技術(Ando and Okamoto, Efficient transfection strategy for the spatiotemporal control of gene expression in zebrafish. Mar Biotechnol 8(3):295-303. 2006)にすべて従った。
（３）ゼブラフィッシュ胚を用いた遺伝子ノックダウン
　ノックダウンしたい遺伝子のcDNA配列の翻訳開始コドン周辺に対応した25-merのアンチセンスモルフォリノオリゴヌクレオチド (AMO,Gene Tools社)水溶液（700 ng/μl, 注入条件はRNAと同じ）を１細胞期の胚に注入した。crbn遺伝子のノックダウンに用いるAMOの配列は、5’AGAGCTGTAGCTGGTTCCCCATTTC 3’、lhx2遺伝子のノックダウンの場合は、5’TCTGCAACCCAAGATTTCCGTGAGA3’である。
（４）ゼブラフィッシュを用いた遺伝子機能階層性の決定
　安藤ら（Ando et al., Lhx2 mediates the activity of Six3 in zebrafish forebrain growth. Dev Biol. 287(2):456-68. 2005）の手法に以下の過程以外はすべて従った。頭部特異的な遺伝子発現はRNAアンケージング（特開2002-315576、Ando et al., Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nat. Genet. 28, 317-325, 2001）のかわりに上記（２）の方法の生体内リポフェクション法を用いた。基本的な原理は、機能的関連が示唆される２種の遺伝子の一方(A)を上記（３）の方法でノックダウンした胚を受精後6時間（原腸胚期）まで培養し、その予定前脳領域に上記（２）の方法の生体内リポフェクションで他方の遺伝子(B)の発現を誘導する。受精後24時間期でAのノックダウン効果が救済され、AとBの逆の組み合わせではBのノックダウン効果が救済されない場合はAはBの機能的上位に位置すると決定する。
（５）免疫組織化学
　ゼブラフィッシュの初期ニューロンの抗体染色は以下の手法で行なった。受精後24-28時間の胚を4%パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液（pH 8.0）で4℃、12時間固定した。リン酸緩衝液で15分間洗浄を4回行なった後、0.5%
Triton X-100／リン酸緩衝液に溶解した5%新生ヤギ血清中で常温１時間ブロッキングを行なった。同じ溶液中に1000倍希釈した抗アセチル化チューブリンモノクローナル抗体を含む溶液で4℃、12時間、一次抗体反応を行い、同様にリン酸緩衝液で洗浄後、一次抗体反応と同じ条件でAlexa Fluoro 488 (Molecular Probes社)をコンジュゲートした抗マウス抗体で二次抗体反応を行なった。リン酸緩衝液で洗浄した胚を30%/50%/70%グリセロール（リン酸緩衝液に溶解）中で透明化し、488 nmで励起し蛍光顕微鏡で観察した。
（６）Whole-mount in situハイブリダイゼーション
　基本的にThisseらの手法（Nat. Protcol. 3 (1) 59-69, 2008）に従った。異なる点は、プローブのハイブリダイゼーション溶液のブロッカーに5 mg/mlのTorulaイーストRNAを使用した点と、抗体反応液中のブロッカーとして0.5%のBlocking reagent(Roche社)を用いた点である。プローブに用いた遺伝子のcDNA（six3.2遺伝子, emx1遺伝子, pax2.1遺伝子, foxg1遺伝子, otx2遺伝子）は、それぞれオリジナルな供与者から譲渡された。lhx2遺伝子のプローブは最初にクローン化した安藤のものを用いた。crbn遺伝子および関連遺伝子のプローブはゼブラフィッシュのESTデータベースからプライマーをデザインし、cDNAライブラリーからクローン化した。
（７）細胞移植
　１細胞期のゼブラフィッシュ胚に適宜濃度のローダミンデキストラン（分子量10,000）と最終濃度600 ng/μlのcrbn RNAを溶解したヌクレアーゼフリー水を上記（１）の方法の条件で注入しドナー（供与体）とした。ドナーが受精後3-4時間の時期に蛍光顕微鏡観察下で細胞をガラス製マイクロキャピラリーで10-50個吸引し、同時期のホスト（宿主）胚の動物極に移植した。そのままホスト胚を２日間培養した後、蛍光顕微鏡でCRBNを発現するドナー由来細胞の分化の局在性を観察した。またネガティブコントロールとして発生に影響がないとされる緑色蛍光蛋白質(GFP)を発現させた細胞も同じ条件で移植し、その分化の局在性を比較した。
（８）試験管内反応系を用いたCRBNのユビキチンリガーゼ活性の検出・計測
　基本的にGroisman らの方法に従った。まずFLAGエピトープタグを融合させたCRBNを発現する哺乳類細胞の破砕液よりM2 FLAGアガロースビーズ(SIGMA社)を用いてCRBNおよび結合タンパク質（CRBN複合体と呼ぶ）を精製した。次に精製したCRBN複合体をUba1 (E1), UbcH5b (E2),GST融合ユビキチン(Ub)組換えタンパク質の含まれた水溶液と混合し、ATPを加えた後30-37度で2時間静置した。その後SDSにより反応を停止させ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および免疫ブロッティングを行うことにより、自己ユビキチン化および結合タンパク質のユビキチン化を可視化させることでユビキチンリガーゼ活性を検出・計測した。
（９）生細胞を利用したCRBNユビキチンリガーゼ活性の検出・計測
　基本的にはOhtakeらの方法に従った。FLAGエピトープタグを融合させたCRBNを発現させた哺乳類細胞にプロテアソーム阻害剤であるMG132を投与し、静置した。その後、細胞を破砕し、その溶解液から上記と同様だがより厳格な条件でのFLAG精製を行い、CRBNを抽出し、免疫ブロッティングを行うことで、その自己ユビキチン化を検出・計測した。
（１０）グリア細胞及びセロトニン産生細胞の蛍光染色
　ゼブラフィッシュは２日齢（グリア細胞染色は、受精後５６時間のものを用い、セロトニン産生細胞染色は、受精後４９時間のものを用いた。）のものを用いた。ゼブラフィッシュを4%パラフォルムアルデヒド(PFA)で固定後、リン酸緩衝液（PBS）で洗浄し、次いで、10μg/mlのプロテアーゼKで処理し、表皮を部分消化した。消化反応後PBST(PBS+0.5%Triton X-100)で２０分間洗浄し、PFAで再固定した。これをPBSTで室温１時間洗浄し、その後PBST+5% ヤギ血清でブロッキングした。この標本を抗グリアモノクローナル抗体（zrf-1/zrf-2）またはウサギ抗セロトニン抗体で4℃、終夜（１２～１８時間）反応させた。その後、PBST+5% ヤギ血清で１時間、室温で洗浄し、ヤギ抗マウスIgG抗体(Cy-2コンジュゲート。グリア細胞染色)またはヤギ抗ウサギIgG抗体(Cy-5コンジュゲート。セロトニン産生細胞染色)に置換し二次抗体反応を行った。4℃、終夜（１２～１８時間）反応後、PBSTで室温１時間洗浄した。洗浄後30%, 50%, 70%グリセロール/PBSで置換し、全身をスライドグラス上にマウントし、プレパラートを作製した。Cy-2およびCy-5の励起波長で蛍光を観察し、グリア細胞またはセロトニン産生細胞の分布を記録した。なお、グリア細胞の観察はゼブラフィッシュの側面から、セロトニン産生細胞はそれらの正中線に沿った分布を観察するため背側から撮影した。
（１１）CRBN発現細胞の間脳室への移植
　受精直後の１細胞期胚にCRBNをコードするRNA (700 ng/μl)と2%ローダミンデキストランの混合液を注入した。受精後４時間まで培養後、吸引キャピラリーを用いて細胞を１０～２０個ほど採取し、受精後３０時間胚の間脳室へ注入し移植した。移植された魚をゼブラフィッシュ生理食塩水（E3リンガー）中で受精後３日まで飼育した後、4%パラフォルムアルデヒドで固定した。常法に従い抗アセチル化チューブリンモノクローナル抗体による一次抗体反応とAlexa Fluor（登録商標）抗マウスIgG (488 nm励起)抗体による二次抗体反応を行い、神経細胞軸索を蛍光標識して観察しながらローダミンデキストラン（543 nm励起）で標識された移植細胞の分布を調べた。
（実験結果）
（１）Lhx2とCRBNの機能階層性の決定
　lhx2遺伝子をノックダウンしたゼブラフィッシュの胚（図１左下）では、正常胚（図１左上）と比較し、脳の縮小がみられた。一方、lhx2遺伝子をノックダウンし、crbn遺伝子を過剰発現させた胚（図１右下）では、crbn遺伝子を過剰発現させた胚（図１右上）と同様に、脳の拡大がみられた。このことから、CRBNは、Lhx2の機能的下流に位置し、中枢神経幹細胞の増殖と神経細胞への分化を直接誘導していると考えられる。
（２）CRBNの過剰発現実験
　CRBNが大脳で神経幹細胞への分化を誘導することを検証するため、ゼブラフィッシュ胚を用いた前脳および中脳でのCRBNの過剰発現実験を行なった。その結果、両脳は形態を保持したまま約1.5 倍の容積に拡大した（図２右）。なおかつ脳のニューロンネットワークは形態上正常であった（図２右）。
（３）CRBNを過剰発現させた細胞の移植実験
　まず供与体（ドナー）胚にCRBNをコードするメッセンジャーRNAを蛍光物質（ローダミン）と共に注入し過剰発現させた。この胚胞を他個体に移植し、脳室内に分布したドナー由来細胞の分化を蛍光顕微鏡で観察した。その結果、移植したドナー由来細胞は、有意に魚類の終脳組織である嗅球に分化した（図３矢頭）。このことはCRBNを発現した細胞が脳室内に分配された場合、神経幹細胞に分化しRostral Migratory Stream (RMS)という細胞移動経路にのって哺乳動物では大脳皮質を発生する終脳背側部で脳組織に分化したことを示す。
（４）試験管内反応系を用いたCRBNのユビキチンリガーゼ活性の検出・計測
　Uba1（ユビキチン活性化酵素）、UbcH5b（ユビキチン転移酵素）、及びGST融合ユビキチン組換えタンパク質を含む水溶液（Ub/E1/E2）に、CRBN（FH-CRBN complex）を加えた場合には、CRBNを加えない場合には検出されないタンパク質が検出された（図４の左図、中央図、右図のレーン２）。タンパク質のユビキチン化には、ユビキチンのほか、ユビキチン活性化酵素、ユビキチン転移酵素、ユビキチンリガーゼの３種類の酵素が必要である。左図、中央図、右図のレーン１では、ユビキチンリガーゼが存在しないためユビキチン化したタンパク質が生じなかったのに対し、左図、中央図、右図のレーン２では、CRBNがユビキチンリガーゼとして働いたことにより、ユビキチン化したタンパク質が生じ、そのタンパク質が電気泳動によって検出されたと考えられる。
（５）生細胞を利用したCRBNユビキチンリガーゼ活性の検出・計測
　MG132を加えた場合には、CRBNを含むタンパク質のバンドが多数検出された（図５の右レーン）。一方、MG132を加えない場合には、CRBNを含むタンパク質のバンドはほとんど検出されなかった（図５の左レーン）。
　生細胞内のCRBNは、他の因子と協同して自己ユビキチン化を行い、様々な分子量のユビキチン化タンパク質を生じると考えられる。しかし、それらの多くは、生細胞内のプロテアソームによって分解されてしまうと考えられる。図５の左レーンでは、MG132によってプロテアソームが阻害され、自己ユビキチン化によって生じたタンパク質が残存したことにより、多数のバンドが検出されたと考えられる。一方、図５の右レーンでは、生じたタンパク質の多くが、プロテアソームによって分解されてしまったため、ほとんどバンドが検出されなかったと考えられる。
（６）グリア細胞及びセロトニン産生細胞の蛍光染色
　CRBNを過剰発現させた個体では、正常な空間的分布を保持しつつ、グリア細胞（図６左図）やセロトニン産生細胞（図７左図）が増加していた。このことは、CRBNが脳の空間的なパターンを正常に認識しつつ細胞を増殖、分化させることを意味する。
（７）CRBN発現細胞の間脳室への移植
　CRBNを発現しない細胞を移植した場合、その細胞は脳組織に分化しないのに対し（図８Ａ～Ｄ）、CRBNを発現する細胞を移植した場合、その細胞は脳組織に分化した（図８Ｅ～Ｈ）。
　本発明は、アルツハイマー病などの大脳皮質疾患の治療薬として有用である。また、大脳皮質疾患の新たな治療薬の開発にも有用である。

Claims (11)

  1. 　１）CRBN、２）CRBNをコードする核酸、又は３）CRBNを発現させた幹細胞若しくは神経前駆細胞を含有することを特徴とする医薬組成物。
  2. 　CRBNをコードする核酸が、ウイルスベクター中に挿入されていることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　CRBNの他に、CRBNと共にユビキチンリガーゼ複合体を形成するタンパク質も含有することを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
  4. 　CRBNをコードする核酸の他に、CRBNと共にユビキチンリガーゼ複合体を形成するタンパク質をコードする核酸も含有することを特徴とする請求項１又は２に記載の医薬組成物。
  5. 　CRBNの他に、CRBNと共にユビキチンリガーゼ複合体を形成するタンパク質も発現させた幹細胞若しくは神経前駆細胞を含有することを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
  6. 　大脳皮質疾患又は大脳皮質の外科的損傷の治療のために用いられることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  7. 　大脳皮質の再生のために用いられることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  8. 　請求項１乃至７のいずれか一項に記載の医薬組成物を非ヒト動物に投与し、その非ヒト動物の神経幹細胞又は神経前駆細胞を増殖させる方法。
  9. 　請求項１乃至７のいずれか一項に記載の医薬組成物を非ヒト動物に投与し、その非ヒト動物の神経幹細胞又は神経前駆細胞を神経細胞へ分化させる方法。
  10. 　被験物質をCRBNを含むユビキチンリガーゼ複合体に接触させる工程、及び前記ユビキチンリガーゼ複合体のユビキチンリガーゼ活性を測定し、ユビキチンリガーゼ活性を向上させた被験物質を選択する工程を含むことを特徴とする大脳皮質疾患又は大脳皮質の外科的損傷の治療薬のスクリーニング方法。
  11. 　被験物質の存在下で神経幹細胞又は神経前駆細胞を培養する工程、及び神経幹細胞又は神経前駆細胞中のCRBNの発現量を測定し、CRBNの発現量を増大させた被験物質を選択する工程を含むことを特徴とする大脳皮質疾患又は大脳皮質の外科的損傷の治療薬のスクリーニング方法。
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