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WO2010119769A1 - 慢性ストレスの評価方法 - Google Patents

慢性ストレスの評価方法 Download PDF

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WO2010119769A1
WO2010119769A1 PCT/JP2010/055828 JP2010055828W WO2010119769A1 WO 2010119769 A1 WO2010119769 A1 WO 2010119769A1 JP 2010055828 W JP2010055828 W JP 2010055828W WO 2010119769 A1 WO2010119769 A1 WO 2010119769A1
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WO
WIPO (PCT)
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chronic stress
cytokines
stress
healthy
csf
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2010/055828
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English (en)
French (fr)
Inventor
一仁 六反
智子 河合
佳子 亀崎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Katakura Industries Co Ltd
University of Tokushima NUC
Original Assignee
Katakura Industries Co Ltd
University of Tokushima NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Katakura Industries Co Ltd, University of Tokushima NUC filed Critical Katakura Industries Co Ltd
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Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/30—Psychoses; Psychiatry

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating chronic stress.
  • Stress reaction is a basic reaction to adapt to a new environment.
  • psychological and physical changes associated with stress cause exacerbations and onset of symptoms of various stress-related diseases.
  • stress responses are complex reactions involving the autonomic nervous system, endocrine function, and immune system, so it is required to conduct a multifaceted evaluation, and a method for objectively and accurately evaluating stress has not yet been established. .
  • biochemical measurement of limited in vivo factors such as stress hormones includes, for example, stress hormones such as cortisol in blood and saliva, neurotransmitters such as chromogranin A, glutathione-modified hemoglobin, monoamine, V1 protein, lactoferrin
  • stress hormones such as cortisol in blood and saliva
  • neurotransmitters such as chromogranin A, glutathione-modified hemoglobin, monoamine, V1 protein, lactoferrin
  • normal stress responses can be captured, it is insufficient to distinguish and evaluate chronic stress that can lead to stress-related diseases and normal stress.
  • the method using a DNA chip requires a relatively large amount of blood (5 ml or more), the measurement operation and the process are complicated, and the measurement time and measurement cost are obstacles to practical use for clinical diagnosis and the like. Yes. Further, since peripheral blood is used as a sample, there is a disadvantage that noninvasive sampling cannot be performed. Therefore, it is necessary to develop a simpler and quicker evaluation method, and further technical breakthrough has been demanded.
  • Patent Document 2 IL-1 ⁇ and IL-6 have been reported. There are not yet reports on the application of measurement of a plurality of blood cytokine levels to chronic stress evaluation or risk diagnosis of stress-related diseases.
  • the present invention provides a method for objectively and accurately evaluating a chronic stress state easily and in a short time without including the disadvantages of the conventional methods.
  • the present inventors have focused on immune system proteins that actually function in living body regulation in blood, have found a plurality of cytokine-related proteins capable of evaluating chronic stress, and have completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • Cytokines are basic FGF, CTACK, eotaxin, G-CSF, GM-CSF, GRO- ⁇ , HGF, ICAM-1, IFN- ⁇ 2, IFN- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-1 ⁇ , IL- 1Ra, IL-2Ra, IL-3, IL-6, IL-9, IL-12 (p40), IL-16, IL-18, IP-10, MCP-1, MCP-3, M-CSF, MIF
  • the method for evaluating chronic stress according to claim 1, selected from the group consisting of MIG, MIP-1 ⁇ , MIP-1 ⁇ , SCF, SDF-1 ⁇ , TNF- ⁇ , TRAIL, and VEGF.
  • Cytokines are CTACK, eotaxin, G-CSF, GM-CSF, GRO- ⁇ , HGF, IFN- ⁇ 2, IFN- ⁇ , IL-1Ra, IL-2Ra, IL-3, IL-9, IL- Selected from the group consisting of 12 (p40), IL-16, IL-18, IP-10, MCP-3, M-CSF, MIF, MIG, MIP-1 ⁇ , SCF, TNF- ⁇ , TRAIL and VEGF, The method for evaluating chronic stress according to claim 2, wherein the biological sample is serum.
  • Cytokines are basic FGF, G-CSF, GRO- ⁇ , HGF, IFN- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-1Ra, IL-6, IL-9, IL-12 (p40), IP-10
  • the cytokine is selected from the group consisting of G-CSF, GRO- ⁇ , IFN- ⁇ , IL-1Ra, IL-2Ra, IL-12 (p40), IL-16 and IP-10. 3.
  • cytokine is selected from the group consisting of G-CSF, IL-1Ra, and IP-10.
  • cytokine is two selected from the group consisting of G-CSF, IL-1Ra, and IP-10.
  • the cytokine is selected from the group consisting of GRO- ⁇ , HGF, ICAM-1, IFN- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-1Ra, MCP-3, MIF, MIG, SDF-1 ⁇ , TRAIL and VEGF,
  • the method for evaluating chronic stress according to claim 2 wherein the biological sample is saliva, and the method for evaluating chronic stress is a k-nearest neighbor method.
  • stress can be more objectively evaluated with higher accuracy than conventional stress assessment methods using questionnaires or single biometric indicators, and in particular, statistical analysis of the concentration patterns of a plurality of indicator cytokines in a sample.
  • the accuracy can be improved by conducting the evaluation.
  • the cost is low and the evaluation can be performed in a short time with a smaller amount of specimen.
  • FIG. 1 shows the average value and standard deviation of 62 chronic stressed persons and 169 healthy persons according to the STAI scale.
  • FIG. 2 shows the results of scoring by counting the number of cytokines that had thresholds (abnormal values) of 13 types of cytokines.
  • examples of the biological sample include peripheral blood, plasma, serum and saliva, preferably serum or saliva.
  • a cytokine is a protein secreted from a cell that transmits information to a specific cell.
  • CTACK eotaxin
  • G-CSF GM-CSF
  • GRO- ⁇ HGF
  • IFN- ⁇ 2 IFN- ⁇
  • IL-3 IL-9
  • IL-12 p40
  • IL-16 IL- 18, IL-1ra, IL-2ra
  • IP-10 MCP-3, M-CSF, MIF, MIG, MIP-1 ⁇ , SCF, TNF- ⁇ , TRAIL and VEGF.
  • any conventionally known method can be used, but preferably ELISA or antibody array.
  • chronic stress refers to a state of stress load in which sustained psychological stress load over a long period of time that is not temporary or short-term stress is not sufficiently resolved but accumulated.
  • the k-nearest neighbor method or abnormal value scoring is preferable.
  • the k-nearest neighbor method first, all the learning samples are taken, and then the response of the newly added sample is analyzed for an appropriate number (k) of neighbors to predict the added sample class.
  • This method is a kind of lazy learning in which feature vectors are examined using known responses in the vicinity of a given vector for prediction.
  • the obtained cytokine concentration data was divided by the median value of the sample group for each cytokine and then analyzed by the k-nearest neighbor method with a k value of 10.
  • GeneSpringGX which is analysis software of Agilent Technologies Inc.
  • abnormal value scoring In the abnormal value scoring, first, a significant difference in the concentration of each cytokine between the healthy subject group and the chronic stress group was analyzed by t-test, and cytokines having a risk value of 5% or less were selected. Graph pad prism (version 5.0, Graph Pad Prism Co., Ltd.) was used as analysis software for the t test. Next, for each of the healthy group and the chronic stress group, the quartile range and 95th percentile value of the selected cytokine are calculated by Excel (Microsoft), a spreadsheet software, and the 95th percentile of the chronic stress group is calculated. Concentrations that deviate from the values were defined as abnormal values. A method for determining chronic stress based on the number of cytokines that showed abnormal values among cytokines selected as markers in each specimen was defined as an abnormal value scoring determination method.
  • Healthy people Healthy people are among the first-year students, second-year students, and first-year students of Tokushima University School of Medicine who have not yet been put into the chronic stress state associated with the preparation for the doctoral state exam. It consisted of 169 persons who explained in writing and agreed to participate in the study. The 169 members consisted of 77 men and 92 women, the average age was 19.6 years old, the oldest was 33 years old, and the youngest was 18 years old. About these 169 people, the blood sample of each person was extract
  • FIG. 1 shows the average values and standard deviations of state anxiety and characteristic anxiety for 38 chronic stressed persons and 169 healthy persons scored on the STAI scale.
  • the STAI characteristic anxiety score indicating the ease of feeling anxiety of individual subjects was tested in the same manner, and no significant difference was found between healthy subjects and examinees.
  • cytokine abundance in serum or saliva was performed with a multi-cytokine assay kit using an antigen-antibody reaction (sandwich ELISA method) and a flow cytometry instrument.
  • the multi-cytokine measurement kit using the flow cytometry instrument was Bio-Rad Laboratories Bio-Plex 200 and Bio-Plex cytokine assay panel measurement kit.
  • the cytokines that were measured were 50 types of Bio-Plex cytokine assay panel measurement kits, including Human27-PlexPane1 (171-A11127) and Human23-PlexPanel (171-A11123).
  • cytokine abundance in serum or saliva was carried out according to a measurement protocol provided by Bio-Rad Laboratories. Moreover, the amount of serum used for the measurement at this time was an extremely small amount of 30 microliters per sample.
  • Data analysis selection of chronic stress marker cytokines 50 types of cytokine abundance data in 62 serum samples collected from 38 people in chronic stress state and 169 serum samples collected from 169 healthy subjects were analyzed by the k-nearest neighbor method. Twenty-five types of cytokines were selected as combinations of cytokines.
  • cytokines are useful as marker cytokines for evaluating whether or not a subject is in a chronic stress state.
  • cytokine abundance data in 11 sets of saliva samples collected from 11 people in chronic stress state and 120 sets of saliva samples collected from 120 healthy subjects by the k-nearest neighbor method. Twelve types of cytokines were selected as combinations of cytokines.
  • cytokines are also useful as marker cytokines for evaluating whether or not a subject is in a chronic stress state.
  • Random measurement numbers were assigned to 40 subjects so that they could not know whether they were chronically stressed or healthy.
  • the amount of cytokines in the serum of these 40 people was measured in the same manner as in Example 1.
  • the chronic stress state and the healthy state of 40 subjects who were randomly assigned numbers were determined using the formula for serum discrimination set by the k-nearest neighbor method from the cytokines in Table 1 of Example 1.
  • Example 2 Determination with three types of cytokines Using three types of cytokines selected from Table 1, IL-1ra, IP-10, and G-CSF, using the k-nearest neighbor method in the same manner as in Example 1. The judgment algorithm was set. Using this determination algorithm, the chronic stress state and the healthy state of 40 subjects as in Example 2 were determined. When comparing the blinded sample name with the result determined by the k-nearest neighbor method, 11 out of 14 people who were in a chronic stress state were judged as chronic stress, and the correct answer rate was 78.6%. The remaining three were undecidable and there was no wrong answer. Moreover, all the 26 healthy persons were judged as healthy, and the correct answer rate was 100%.
  • the threshold value abnormal value
  • all subjects belonging to the chronic stress group had 9 counts or more.
  • Nine or more kinds of stress index candidate proteins were found to have abnormal values.
  • non-stress healthy individuals it was found that only 9 out of 169 were as small as 8 counts (Fig. 2).
  • the threshold of the judgment score was set so that healthy subjects and chronic stress could be separated most efficiently.
  • the threshold for determining chronic stress is defined as 9 counts or more, and the chronic stress state and the healthy state of 40 subjects as in Example 2 were determined.
  • the determination threshold was set to 7 or more using the abnormal value counting method in the same manner as in Example 4. Using this threshold value, the chronic stress state and healthy state of 40 subjects as in Example 2 were determined. When comparing the blinded sample name with the result determined by the abnormal value counting method, all 14 people in the chronic stress state were determined to have chronic stress, and the correct answer rate was 100%. Moreover, all the 26 healthy persons were determined to be healthy, and the correct answer rate was 100%.
  • Example 4 4-3.3 Determination with three types of cytokines Using the three types of cytokines IL-1ra, IP-10, and G-CSF selected from Table 1, the abnormal value counting method was used in the same manner as in Example 4.
  • the determination threshold was set to 3 or more. Using this threshold value, the chronic stress state and healthy state of 40 subjects as in Example 2 were determined.
  • 12 out of 14 people who were in a chronic stress state were judged as chronic stress, and the correct answer rate was 85.7%. The remaining two were wrong answers. Moreover, all the 26 healthy persons were judged as healthy, and the correct answer rate was 100%.
  • the determination threshold using the abnormal value counting method as in Example 4 was set to 2 or more. Using this threshold value, the chronic stress state and healthy state of 40 subjects as in Example 2 were determined. When comparing the blinded sample name with the result determined by the abnormal value counting method, 12 out of 14 people who were in a chronic stress state were judged as chronic stress, and the correct answer rate was 85.7%. The remaining two were wrong answers. Moreover, all the 26 healthy persons were judged as healthy, and the correct answer rate was 100%.
  • the present invention is useful for evaluating chronic stress.

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Abstract

　本発明は、生物学的試料中のサイトカインの濃度を測定すること、及び得られた測定値を評価すること含む、慢性ストレスの評価方法に関する。

Description

慢性ストレスの評価方法
　本発明は、慢性ストレスの評価方法に関する。
　ストレスを起因とする心の疾患の増加は、毎年３万人以上の自殺者を生み出すなど深刻な社会問題となっている。慢性の社会心理学的ストレスはうつ病をはじめとする心の疾患に加え、生活習慣病を含む多くの身体疾患の発症にも深く関与しており、ストレスに起因する人的・経済的損失は日本社会の発展を妨げる大きな要因となっている。このため、慢性の社会心理学的ストレスを正しく評価することは病気を予防するためにも極めて重要である。しかしながら、社会心理学的ストレスに対する個人の反応は個人差が大きく、また、自覚的にも他覚的にもその度合いを判定することは困難であるため、客観的に評価できる方法が求められている。
　ストレス反応は新しい環境に適応するための基本的な反応である。一方、ストレスに付随する心理的・身体的変化は各種ストレス関連疾患の症状の増悪や発症の原因となる。ストレス反応には個人差があり、ストレスに対する脆弱性も、遺伝素因や養育環境に加え、個人を取り巻く社会や家庭環境に大きく左右される。また、ストレス反応は、自律神経・内分泌・免疫系が関与する複雑系の反応であるため多角的な評価を行うことが求められ、未だストレスを客観的に正確に評価する方法は確立されていない。
　従来、個人のストレスを評価する方法として、質問紙を用いてライフイベントや日常苛立ち事の調査、自己記入式の不安やうつ状態の判定、個人の性格判定調査などが用いられてきたが、膨大な時間と労力が必要である上、被験者の回答は主観に基づくものであり、医療や検診現場等で用いるには定量性や客観性、再現性に大きな問題があった。結果解析についても、それぞれの調査の問題点と限界に熟知しかつ経験を積んだ専門的な知識が必要であった。
　ストレスによる生体反応を検出して評価しようとする試みもあり、例えば心電図や血圧、脈拍を測定する方法、瞳孔対光反応を利用する方法、微弱電流刺激に対する応答を利用する方法などが提案されているが、一時的なストレス反応を検出するには有効であるものの、長期に渡る慢性的なストレス負荷状況を評価するのは不可能であった。
　さらに、ストレスホルモンなどの限られた生体内因子の生化学的測定では、例えば、血液や唾液中のコルチゾールなどのストレスホルモン、クロモグラニンＡ、グルタチオン修飾ヘモグロビン、モノアミンなどの神経伝達物質、Ｖ１タンパク質、ラクトフェリン、アミラーゼなどを、それぞれ単独で測定する方法が提案されているが、内分泌・神経・免疫が関与する複雑系のストレス反応を、精度よく評価することが困難であった。また、正常なストレス反応は捉えられるとしても、ストレス性疾患につながるような慢性なストレスと正常なストレスを区別して評価するには不十分であった。
　最近、六反らは末梢白血球に現れる生体反応を、ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）を用いて網羅的遺伝子発現解析を行い、複雑系の反応であるストレス反応を、ＤＮＡチップで客観的に精度よく評価する方法を報告している（非特許文献１）。さらに、慢性ストレスの評価（特許文献１）の評価に有用であることを示している。
　しかし、ＤＮＡチップを用いる方法は、比較的多量の血液（５ｍｌ以上）が必要であり、測定操作や工程も複雑であり、測定時間と測定コストが臨床診断等への実用化の障害となっている。また、末梢血をサンプルとするため、非侵襲的なサンプリングができないという欠点もあった。そのため、さらに簡便で迅速な評価法の開発が必要であり、さらなる技術的ブレークスルーが求められていた。
　ストレスと免疫系タンパク質の関係については、ＩＬ－１βやＩＬ－６の報告があるのみである（特許文献２）。複数の血中サイトカイン濃度の測定を慢性ストレス評価やストレス性疾患のリスク診断に応用した報告は、未だ知られていない。
特開２００７－３０６８８３号公報 特開２００１－１９４３６９号公報 Neuroscience Letters, 381(2005)57-62
　本発明は、従来の方法の欠点を含まず、慢性ストレス状態を、簡便かつ短時間に、客観的かつ高精度に評価するための方法を提供する。
　本発明者らは、血液中で実際に生体調節に機能する免疫系のタンパク質に着目し、慢性ストレスを評価可能な複数のサイトカイン関連タンパク質を見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、下記のとおりである。
　［１］生物学的試料中のサイトカインの濃度を測定することを含む、慢性ストレスの評価方法。
　［２］サイトカインが、塩基性ＦＧＦ、ＣＴＡＣＫ、エオタキシン、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＲＯ－α、ＨＧＦ、ＩＣＡＭ－１、ＩＦＮ－α２、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－２Ｒａ、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－９、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１６、ＩＬ－１８、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１、ＭＣＰ－３、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＩＦ、ＭＩＧ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＳＣＦ、ＳＤＦ－１α、ＴＮＦ－α、ＴＲＡＩＬ及びＶＥＧＦからなる群より選択される、請求項１に記載の慢性ストレスの評価方法。
　［３］サイトカインが、ＣＴＡＣＫ、エオタキシン、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＲＯ－α、ＨＧＦ、ＩＦＮ－α２、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－２Ｒａ、ＩＬ－３、ＩＬ－９、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１６、ＩＬ－１８、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－３、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＩＦ、ＭＩＧ、ＭＩＰ－１β、ＳＣＦ、ＴＮＦ－α、ＴＲＡＩＬ及びＶＥＧＦからなる群より選択され、生物学的試料が血清である、請求項２に記載の慢性ストレスの評価方法。
　［４］サイトカインが、塩基性ＦＧＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＲＯ－α、ＨＧＦ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－６、ＩＬ－９、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１及びＭＩＰ－１αからなる群より選択される、請求項３に記載の慢性ストレスの評価方法。
　［５］サイトカインが、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＲＯ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－２Ｒａ、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１６及びＩＰ－１０からなる群より選択される、請求項３に記載の慢性ストレスの評価方法。
　［６］サイトカインが、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－１Ｒａ及びＩＰ－１０からなる群より選択される、請求項３に記載の慢性ストレスの評価方法。
　［７］サイトカインが、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－１Ｒａ及びＩＰ－１０からなる群より選択される２つである、請求項３に記載の慢性ストレスの評価方法。
　［８］サイトカインが、ＧＲＯ－α、ＨＧＦ、ＩＣＡＭ－１、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１Ｒａ、ＭＣＰ－３、ＭＩＦ、ＭＩＧ、ＳＤＦ－１α、ＴＲＡＩＬ及びＶＥＧＦからなる群より選択され、生物学的試料が唾液であり、慢性ストレスの評価方法が、ｋ近傍法である、請求項２に記載の慢性ストレスの評価方法。
　本発明によれば、従来の質問紙や単一の生体指標を用いるストレス評価法と比べ、より客観的に高精度でストレスを評価でき、特に複数の指標サイトカインの検体中の濃度パターンについて統計学的に評価を行うことでその精度が向上する。さらに、ストレス性疾患の発症につながる可能性の高い慢性ストレスを正常のストレス反応や急性のストレス反応と区別して評価することが可能であり、ＤＮＡチップによる遺伝子発現解析評価法と比べてもより簡便で低コストであり、より少量の検体で短時間に評価が可能である。
図１は、ＳＴＡＩ尺度による慢性ストレス状態者６２人と健常者１６９人の平均値と標準偏差である。 図２は、１３種類のサイトカインの閾値（異常値）をとったサイトカインの数をカウントしてスコア化した結果である。
　本発明において生物学的試料とは、末梢血、血漿、血清、唾液を挙げることができ、好ましくは、血清又は唾液である。
　本発明においてサイトカインとは、細胞から分泌されるタンパク質で、特定の細胞に情報伝達をするものをいう。好ましくは、ＣＴＡＣＫ、エオタキシン、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＲＯ－α、ＨＧＦ、ＩＦＮ－α２、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－３、ＩＬ－９、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１６、ＩＬ－１８、ＩＬ－１ｒａ、ＩＬ－２ｒａ、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－３、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＩＦ、ＭＩＧ、ＭＩＰ－１β、ＳＣＦ、ＴＮＦ－α、ＴＲＡＩＬ及びＶＥＧＦである。
　本発明においてサイトカインの濃度の測定方法は、従来公知の任意の方法を用いることができるが、好ましくは、ＥＬＥＳＡまたは抗体アレイである。
　本発明において慢性ストレスとは、一時的ではない長期間にわたる持続的な心理的ストレス負荷又は短期的なストレスが十分に解消されずそれが蓄積されたストレス負荷の状態をいう。
　本発明の測定値の評価方法は、従来公知の任意の方法を用いることができるが、好ましくは、ｋ近傍法又は異常値スコアー化である。
　ｋ近傍法では、はじめに学習用サンプルを全て取り込み、次に新たに追加されるサンプルの応答を適当な数（ｋ）の近傍を分析し、追加されたサンプルのクラスを予測する。この手法は、予測のために与えられたベクトルの近傍にある既知の応答を用いて特徴ベクトルを調べる怠惰学習 (lazy learning) の一種である。
　本発明において、得られたサイトカイン濃度データは、各サイトカインごとに検体群の中央値で除算された後、ｋ値を１０としたｋ近傍法にて解析された。解析にはアジレント・テクノロジー株式会社の解析ソフトであるＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇＧＸを用いた。
　異常値スコアー化では、はじめに健常者群と慢性ストレス群における各サイトカイン濃度の有意差をｔ検定にて解析し、危険値が５％以下であったサイトカインを選定した。ｔ検定には解析ソフトとしてグラフパッドプリズム（バージョン５．０、グラフパッドプリズム社）を使用した。
　次に、健常者群と慢性ストレス群のそれぞれについて、選択されたサイトカインの四分位範囲と９５パーセンタイル値を、表計算ソフトであるエクセル（マイクロソフト社）にて算出し、慢性ストレス群の９５パーセンタイル値から外れる濃度を異常値として規定した。個々の検体において、マーカーとして選択したサイトカインのうち異常値を示したサイトカインの個数で慢性ストレスを判定する方法を異常値スコアー化判定法とした。
　以下、実施例によって本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらには限定されない。
　慢性ストレスを評価するための指標となるサイトカインのスクリーニング
１．慢性ストレス状態者
　・対象者は、徳島大学医学部医学科あるいは栄養学科学生のうち、本評価法開発のための研究に参加することについて文章により説明し同意を得た者とした。なお本研究は徳島大学病院倫理委員会の承認を得たうえで実施した。
　慢性ストレス状態者は、平成１７年度の医師国家試験受験を控えて半年以上にわたり慢性ストレス状態が続き、試験２ヶ月前と、試験を前々日に控えた６年次医学科学生２４名と、同じく平成１８年度の医師国家試験受験を前々日に控えた１４名から構成された。
　この３８名の構成は、男性が２０人、そして女性が１８人であり、平均年齢は２４．７歳であり、最高齢が３０歳、最年少が２３歳であった。
　この３８名について、試験２ヶ月前と試験前々日に、各人の血液サンプルを採取した。同時に、ＳＴＡＩ質問表への回答調査を行い、状態不安と特性不安をスコアー化してマン・ホイットニーのＵ検定にて評価したところ、状態不安のスコアーが非ストレス健常者と比較して危険値０．０１％以下の水準で有意に高かったことから、慢性的な精神的ストレス負荷群として妥当と考えられた。
２．健常者
　健常者は、まだ医師国家試験準備に伴う慢性ストレス状態に置かれていない、徳島大学医学科１年次学生、２年次学生及び栄養学科１年次学生のうち、本開発のための研究に参加することについて文章により説明し同意を得た者１６９名から構成された。
　この１６９名の構成は、男性が７７人、そして女性が９２人であり、平均年齢は１９．６歳であり、最高齢が３３歳、最年少が１８歳であった。
　この１６９名について、慢性ストレス状態者の場合と同様に、各人の血液サンプルを採取した。
　同時に、ＳＴＡＩ質問表への回答調査を行い、状態不安と特性不安をスコアー化してマン・ホイットニーのＵ検定にて評価した。
　図１に、ＳＴＡＩ尺度によりスコアー化した慢性ストレス状態者３８名と健常者１６９名について、状態不安と特性不安の平均値と標準偏差を示した。健常者と医師国家試験受験生のＳＴＡＩスコアーの値の有意差をマン・ホイットニーのＵ検定を用いて検定したところ、受験前の心理的な不安を表すＳＴＡＩ状態不安のスコアーが、健常者より受験生が有意に高い結果が認められた。
　被験者個人の不安の感じやすさを示すＳＴＡＩ特性不安のスコアーも同様に検定を行ったところ、健常者と受験者で有意な差は認められなかった。
　３．サイトカイン存在量の測定
　慢性ストレス状態者３８名と健常者１６９名から、午後４時から午後６時までの間の空腹時に医師が安静下に肘静脈より約１ｃｃ採血し、この血液サンプルからサイトカイン測定用の血清を調製した。唾液は昼食後２時間以上経過した午後４時から６時までの間に採取した。採取には唾液サンプリングキット(商品名：サリベット、Ｓａｒｓｔａｄｔ　Ｉｎｃ．，Ｒｏｍｍｅｌｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ)を用いてそのプロトコールに従って唾液吸収体を舌下で２分間浸潤させて唾液を採取した。
　これらの血清および唾液はおよそ４本ずつに分注され、サイトカイン存在量の測定に使用するまで摂氏マイナス８０度の冷凍状態で保存された。
　血清中または唾液中のサイトカイン存在量の測定は、抗原抗体反応（サンドイッチＥＬＩＳＡ法）とフローサイトメトリ機器を利用したマルチサイトカイン測定キットにより行った。
　このフローサイトメトリ機器を利用したマルチサイトカイン測定キットはＢｉｏ－Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社のＢｉｏ－Ｐｌｅｘ２００とＢｉｏ－Ｐｌｅｘサイトカインアッセイパネル測定キットを用いた。
　測定を行ったサイトカインは、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘサイトカインアッセイパネル測定キットのうち、Ｈｕｍａｎ２７－ＰｌｅｘＰａｎｅ１（１７１－Ａ１１１２７）とＨｕｍａｎ２３－ＰｌｅｘＰａｎｅｌ（１７１－Ａ１１１２３）を合わせた５０種類であった。
　血清中または唾液中のサイトカイン存在量の測定はＢｉｏ－Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から提供された測定プロトコールに従って実施した。また、このとき測定に使用した血清量は１検体につき３０マイクロリットルと、極微量であった。
　４．データ解析（慢性ストレスマーカーサイトカインの選定）
　慢性ストレス状態の３８名から採取した６２組の血清検体と、健常者１６９名から採取した１６９組の血清検体における、５０種類のサイトカイン存在量データをｋ近傍法により解析し、もっとも正答率の高くなるサイトカインの組み合わせとして２５種類のサイトカインを選定した。
　これらのサイトカインを表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　この２５種類のサイトカインは、被験者が慢性ストレス状態にあるか否かを評価するマーカーサイトカインとして有用である。
　慢性ストレス状態の１１名から採取した１１組の唾液検体と、健常者１２０名から採取した１２０組の唾液検体における、５０種類のサイトカイン存在量データをｋ近傍法により解析し、もっとも正答率の高くなるサイトカインの組み合わせとして１２種類のサイトカインを選定した。
　これらのサイトカインを表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　この１４種類のサイトカインもまた、被験者が慢性ストレス状態にあるか否かを評価するマーカーサイトカインとして有用である。
　慢性ストレス負荷被験者群を用いた血清による慢性ストレス評価方法の検証
　１．ｋ近傍法による評価
　平成１８度の医師国家試験２ヶ月前の６年次学生１４名（慢性ストレス群)、徳島大学医学科１年次６月採血群２６名（健常者群）を被験者とした。
　４０名の被験者に慢性ストレス状態者か健常者か分からないようにランダムな測定番号を付与した。この４０名の血清中サイトカイン存在量を実施例１と同様の方法で測定した。
　実施例１の表１のサイトカインからｋ近傍法により設定した血清判別用計算式を用いて、ランダムに番号を付与した４０名の被験者の慢性ストレス状態と健常状態を判定した。
　ブラインドしてあったサンプル名とｋ近傍法により判定した結果を照合すると、慢性ストレス状態とした１４名のうち１３名が慢性ストレスの判定となり、正答率は９２．９％であった。残りの１名は判定不能であり、誤答はなかった。健常者とした２６名のうち２３名が健常と判定され、正答率は８８．５％であった。残りの３名は判定不能であり、誤答はなかった。
２．評価に利用する指標蛋白質数を変動させた場合の判定結果（８種及び３種、２種の場合）
２－１．８種類のサイトカインでの判定
　表１から選ばれたＩＬ－１ｒａ、ＩＰ－１０、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－９、ＧＲＯ－α、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１６、ＩＦＮ－γの８種類のサイトカインを用いて、実施例１と同様の手法でｋ近傍法を用いて判定アルゴリズムを設定した。この判定アルゴリズムを用いて、実施例２と同じ４０名の被験者の慢性ストレス状態と健常状態を判定した。
　ブラインドしてあったサンプル名とｋ近傍法により判定した結果を照合すると、慢性ストレス状態とした１４人のうち１１人が慢性ストレスの判定となり、正答率は７８．６％となった。残る３名は判定不能であり、誤答はなかった。また２６人の健常者のうち２５人が健常と判定となり、正答率は９６．２％であった。残る１名は判定不能であり、誤答はなかった。
２－２．３種類のサイトカインでの判定
　表１から選ばれたＩＬ－１ｒａ、ＩＰ－１０、Ｇ－ＣＳＦの３種類のサイトカインを用いて、実施例１と同様の手法でｋ近傍法を用いて判定アルゴリズムを設定した。この判定アルゴリズムを用いて、実施例２と同じ４０名の被験者の慢性ストレス状態と健常状態を判定した。
　ブラインドしてあったサンプル名とｋ近傍法により判定した結果を照合すると、慢性ストレス状態とした１４人のうち１１人が慢性ストレスの判定となり、正答率は７８．６％となった。残る３名は判定不能であり、誤答はなかった。また２６人の健常者のうち全員が健常判定となり、正答率は１００％であった。
２－３－１．２種類のサイトカインでの判定
　表１から選ばれたＩＬ－１ｒａ、ＩＰ－１０の２種類のサイトカインを用いて、実施例１と同様の手法でｋ近傍法を用いて判定アルゴリズムを設定した。この判定アルゴリズムを用いて、実施例２と同じ４０名の被験者の慢性ストレス状態と健常状態を判定した。
　ブラインドしてあったサンプル名とｋ近傍法により判定した結果を照合すると、慢性ストレス状態とした１４人のうち１１人が慢性ストレスの判定となり、正答率は７８．６％となった。残る２名は判定不能であり、１名は誤答であった。また２６人の健常者のうち２５人が健常判定となり、正答率は９６．２％であった。残る１名は判定不能であり、誤答はなかった。
２－３－２．２種類のサイトカインでの判定
　表１から選ばれたＩＬ－１ｒａ、Ｇ－ＣＳＦの２種類のサイトカインを用いて、実施例１と同様の手法でｋ近傍法を用いて判定アルゴリズムを設定した。この判定アルゴリズムを用いて、実施例２と同じ４０名の被験者の慢性ストレス状態と健常状態を判定した。
　ブラインドしてあったサンプル名とｋ近傍法により判定した結果を照合すると、慢性ストレス状態とした１４人のうち１１人が慢性ストレスの判定となり、正答率は７８．６％となった。残る３名は判定不能であり、誤答はなかった。また２６人の健常者のうち全員が健常判定となり、正答率は１００％であった。
２－３－３．２種類のサイトカインでの判定
　表１から選ばれたＩＰ－１０、Ｇ－ＣＳＦの２種類のサイトカインを用いて、実施例１と同様の手法でｋ近傍法を用いて判定アルゴリズムを設定した。この判定アルゴリズムを用いて、実施例２と同じ４０名の被験者の慢性ストレス状態と健常状態を判定した。
　ブラインドしてあったサンプル名とｋ近傍法により判定した結果を照合すると、慢性ストレス状態とした１４人のうち１２人が慢性ストレスの判定となり、正答率は８５．７％となった。残る２名は判定不能であり、誤答はなかった。また２６人の健常者のうち全員が健常判定となり、正答率は１００％であった。
　慢性ストレス負荷被験者群を用いた唾液による慢性ストレス評価方法の検証
　平成１８度の医師国家試験２ヶ月前の６年次学生１１名（慢性ストレス群)を被験者とした。この１１名の血清中サイトカイン存在量を実施例１と同様の方法で測定した。
　実施例１の表２のサイトカインからｋ近傍法により設定した唾液判別用計算式を用いて、１１名の被験者の慢性ストレス状態と健常状態を判定した。
　被験者１１名のうち、９名が慢性ストレスの判定となり、正答率は８１．８％であった。残る２名は判定不能であり、誤答はなかった。
　閾値を外れる慢性ストレス指標蛋白質数のスコアー化評価方法
　５０種類の血清中サイトカイン測定値について、非ストレス健常者群と慢性ストレス群の評価をマン・ホイットニーのＵ検定で行ったところ、危険値５％以下の水準で有意差のあったサイトカインは３４種類となった。この３４種類のサイトカインの慢性ストレス群における９５パーセンタイル範囲を算出し、この９５パーセンタイルの値を閾値（異常値）としたときに非ストレス健常者と大きく異なる濃度分布をとるストレス指標候補サイトカインは１３種類であった（表３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
それぞれの検体において、この１３種類のサイトカインの閾値（異常値）をとったサイトカインの数をカウントしてスコア化したところ、慢性ストレス群に属するすべての被験者が９カウント以上になる、すなわち１３種類のストレス指標候補蛋白質のうち９種類以上が異常値をとることが分かった。それに対して非ストレス健常者では、９カウント以上であったのは１６９人中８人と少人数であることが分かった（図２）。
判定スコアの閾値は健常者と慢性ストレスがもっとも効率的に分離できるように設定した。上記（図２）の例では慢性ストレス判定の閾値を９カウント以上と規定し、実施例２と同じ４０名の被験者の慢性ストレス状態と健常状態を判定した。ブラインドしてあったサンプル名と異常値カウント法により判定した結果を照合すると、慢性ストレス状態とした１４人のうち全員が慢性ストレスの判定となり、正答率は１００％であった。また２６人の健常者のうち全員が健常と判定となり、正答率は１００％であった。
４－１．評価に利用する指標蛋白質数を変動させた場合の判定結果（２５種類、８種、３種及び２種の場合）
４－１．２５種類のサイトカインでの判定
　表１に示した２５種類のサイトカインを用いて、実施例４と同様に異常値カウント法を用いて判定閾値を２３以上と設定した。この閾値を用いて、実施例２と同じ４０名の被験者の慢性ストレス状態と健常状態を判定した。
　ブラインドしてあったサンプル名と異常値カウント法により判定した結果を照合すると、慢性ストレス状態とした１４人のうち１２人が慢性ストレスの判定となり、正答率は８５．７％となった。残る２名は誤答であった。また２６人の健常者のうち全員が健常と判定となり、正答率は１００％であった。
４－２．８種類のサイトカインでの判定
　表１から選ばれたＩＬ－１ｒａ、ＩＰ－１０、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－９、ＧＲＯ－α、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１６、ＩＦＮ－γの８種類のサイトカインを用いて、実施例４と同様に異常値カウント法を用いて判定閾値を７以上と設定した。この閾値を用いて、実施例２と同じ４０名の被験者の慢性ストレス状態と健常状態を判定した。
　ブラインドしてあったサンプル名と異常値カウント法により判定した結果を照合すると、慢性ストレス状態とした１４人のうち全員が慢性ストレスの判定となり、正答率は１００％となった。また２６人の健常者のうち全員が健常と判定となり、正答率は１００％であった。
４－３．３種類のサイトカインでの判定
　表１から選ばれたＩＬ－１ｒａ、ＩＰ－１０、Ｇ－ＣＳＦの３種類のサイトカインを用いて、実施例４と同様に異常値カウント法を用いて判定閾値を３以上と設定した。この閾値を用いて、実施例２と同じ４０名の被験者の慢性ストレス状態と健常状態を判定した。
　ブラインドしてあったサンプル名と異常値カウント法により判定した結果を照合すると、慢性ストレス状態とした１４人のうち１２人が慢性ストレスの判定となり、正答率は８５．７％となった。残る２名は誤答であった。また２６人の健常者のうち全員が健常判定となり、正答率は１００％であった。
４－４－１．２種類のサイトカインでの判定
　表１から選ばれたＩＬ－１ｒａ、ＩＰ－１０の２種類のサイトカインを用いて、実施例４と同様に異常値カウント法を用いて判定閾値を２以上と設定した。この閾値を用いて、実施例２と同じ４０名の被験者の慢性ストレス状態と健常状態を判定した。
　ブラインドしてあったサンプル名と異常値カウント法により判定した結果を照合すると、慢性ストレス状態とした１４人のうち１３人が慢性ストレスの判定となり、正答率は９２．９％となった。残る１名は誤答であった。また２６人の健常者のうちまた２６人の健常者のうち全員が健常判定となり、正答率は１００％であった。
４－４－２．２種類のサイトカインでの判定
　表１から選ばれたＩＬ－１ｒａ、Ｇ－ＣＳＦの２種類のサイトカインを用いて、実施例４と同様に異常値カウント法を用いて判定閾値を２以上と設定した。この閾値を用いて、実施例２と同じ４０名の被験者の慢性ストレス状態と健常状態を判定した。
　ブラインドしてあったサンプル名と異常値カウント法により判定した結果を照合すると、慢性ストレス状態とした１４人のうち１２人が慢性ストレスの判定となり、正答率は８５．７％となった。残る２名は誤答であった。また２６人の健常者のうち全員が健常判定となり、正答率は１００％であった。
４－４－３．２種類のサイトカインでの判定
　表１から選ばれたＩＰ－１０、Ｇ－ＣＳＦの２種類のサイトカインを用いて、実施例４と同様に異常値カウント法を用いて判定閾値を２以上と設定した。この閾値を用いて、実施例２と同じ４０名の被験者の慢性ストレス状態と健常状態を判定した。
　ブラインドしてあったサンプル名と異常値カウント法により判定した結果を照合すると、慢性ストレス状態とした１４人のうち１３人が慢性ストレスの判定となり、正答率は９２．９％となった。残る１名は誤答であった。また２６人の健常者のうち全員が健常判定となり、正答率は１００％であった。
　本発明は、慢性ストレスの評価のために有用である。

Claims (8)

  1. 　生物学的試料中のサイトカインの濃度を測定することを含む、慢性ストレスの評価方法。
  2. 　サイトカインが、塩基性ＦＧＦ、ＣＴＡＣＫ、エオタキシン、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＲＯ－α、ＨＧＦ、ＩＣＡＭ－１、ＩＦＮ－α２、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－２Ｒａ、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－９、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１６、ＩＬ－１８、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１、ＭＣＰ－３、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＩＦ、ＭＩＧ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＳＣＦ、ＳＤＦ－１α、ＴＮＦ－α、ＴＲＡＩＬ及びＶＥＧＦからなる群より選択される、請求項１に記載の慢性ストレスの評価方法。
  3. 　サイトカインが、ＣＴＡＣＫ、エオタキシン、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＲＯ－α、ＨＧＦ、ＩＦＮ－α２、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－２Ｒａ、ＩＬ－３、ＩＬ－９、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１６、ＩＬ－１８、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－３、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＩＦ、ＭＩＧ、ＭＩＰ－１β、ＳＣＦ、ＴＮＦ－α、ＴＲＡＩＬ及びＶＥＧＦからなる群より選択され、生物学的試料が血清である、請求項２に記載の慢性ストレスの評価方法。
  4. 　サイトカインが、塩基性ＦＧＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＲＯ－α、ＨＧＦ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－６、ＩＬ－９、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１及びＭＩＰ－１αからなる群より選択される、請求項３に記載の慢性ストレスの評価方法。
  5. 　サイトカインが、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＲＯ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－２Ｒａ、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１６及びＩＰ－１０からなる群より選択される、請求項３に記載の慢性ストレスの評価方法。
  6. 　サイトカインが、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－１Ｒａ及びＩＰ－１０からなる群より選択される、請求項３に記載の慢性ストレスの評価方法。
  7. 　サイトカインが、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－１Ｒａ及びＩＰ－１０からなる群より選択される２つである、請求項３に記載の慢性ストレスの評価方法。
  8. 　サイトカインが、ＧＲＯ－α、ＨＧＦ、ＩＣＡＭ－１、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１Ｒａ、ＭＣＰ－３、ＭＩＦ、ＭＩＧ、ＳＤＦ－１α、ＴＲＡＩＬ及びＶＥＧＦからなる群より選択され、生物学的試料が唾液であり、慢性ストレスの評価方法が、ｋ近傍法である、請求項２に記載の慢性ストレスの評価方法。
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