[go: up one dir, main page]

WO2010021344A1 - 新規核酸誘導体およびそれを用いたヌクレアーゼ耐性核酸の調製方法 - Google Patents

新規核酸誘導体およびそれを用いたヌクレアーゼ耐性核酸の調製方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2010021344A1
WO2010021344A1 PCT/JP2009/064522 JP2009064522W WO2010021344A1 WO 2010021344 A1 WO2010021344 A1 WO 2010021344A1 JP 2009064522 W JP2009064522 W JP 2009064522W WO 2010021344 A1 WO2010021344 A1 WO 2010021344A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
carbon atoms
substituents selected
branch
ring
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2009/064522
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
正靖 ▲桑▼原
聡 小比賀
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Japan Science and Technology Agency
Original Assignee
Japan Science and Technology Agency
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan Science and Technology Agency filed Critical Japan Science and Technology Agency
Priority to JP2010525700A priority Critical patent/JP5357883B2/ja
Publication of WO2010021344A1 publication Critical patent/WO2010021344A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/067—Pyrimidine radicals with ribosyl as the saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H23/00—Compounds containing boron, silicon or a metal, e.g. chelates or vitamin B12

Definitions

  • the present invention relates to a novel nucleic acid derivative and a method for preparing a nuclease resistant nucleic acid using the same. More specifically, the present invention relates to a method for imparting nuclease resistance to an existing functional nucleic acid later.
  • nucleic acid molecules are used in various fields such as molecular biology and chemical biology, and their application to pharmaceuticals and diagnostics is being actively studied.
  • nuclease nucleolytic enzyme
  • resistance must be considered. Therefore, even for a nucleic acid molecule for which a clinical trial to sufficiently perform its function in vitro has been obtained, it is necessary to redesign the molecule and impart resistance to the nucleic acid molecule.
  • nuclease resistance is improved by introducing cross-linked nucleotides into functional nucleic acids (antisense, aptamer, etc.).
  • a locked nucleic acid LNA
  • an oligonucleotide having this LNA has improved resistance to nuclease compared to a natural oligonucleotide, and therefore It has been suggested that the stability in the body may be improved (Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Documents 2 to 4 various cross-linked nucleic acids (Bridged Nucleic Acid) that can confer nuclease resistance have been designed and synthesized.
  • the primer containing a triphosphate analog of such a bridging nucleotide has been studied for its influence on DNA polymerase, and it has been reported that modification of the sugar moiety has a large effect on the polymerase reaction (non-patented). Reference 5).
  • LNA which is a bridged nucleotide
  • TdT terminal deoxynucleotide transferase
  • An object of the present invention is to provide a method for easily imparting excellent nuclease resistance to an existing functional nucleic acid later, and to provide a novel nucleic acid derivative for use therein.
  • TdT terminal deoxynucleotide transferase
  • DNA deoxyribonucleotide
  • the present invention provides a method for preparing a nuclease resistant nucleic acid, the method comprising: Mixing and incubating a nucleic acid comprising at least three bases, a terminal deoxynucleotide transferase, and a 2 ′, 4′-bridged nucleoside triphosphate, and
  • the 2 ′, 4′-bridged nucleoside triphosphate is represented by the following formula I, formula II or formula III:
  • Base represents a purin-9-yl group or a 2-oxo-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group which may have one or more arbitrary substituents selected from the following ⁇ group
  • the ⁇ group includes a hydroxyl group, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, a linear alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms, an amino group, and a carbon number.
  • R is selected from a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, an alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, and the ⁇ group.
  • An aryl group having 3 to 12 carbon atoms which may contain a hetero atom, or a carbon which may contain a hetero atom which may have one or more arbitrary substituents selected from the ⁇ group Represents an aralkyl group having an aryl moiety of 3 to 12;
  • R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, and a C 2 to 7 group that may form a branch or a ring.
  • the Base is a 6-aminopurin-9-yl group, a 2,6-diaminopurin-9-yl group, a 2-amino-6-chloro group.
  • R is a hydrogen atom, a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, a phenyl group, or a benzyl group.
  • n 1
  • the Base is a 2,4-dihydroxy-5-methylpyrimidin-1-yl group.
  • either one of R 1 and R 2 is a hydrogen atom.
  • either one of R 1 and R 2 is a phenyl group.
  • the present invention also provides a kit for the preparation of a nuclease resistant nucleic acid comprising a terminal deoxynucleotide transferase and a 2 ′, 4′-bridged nucleoside triphosphate,
  • the 2 ′, 4′-bridged nucleoside triphosphate is represented by the following formula I, formula II or formula III:
  • Base represents a purin-9-yl group or a 2-oxo-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group which may have one or more arbitrary substituents selected from the following ⁇ group
  • the ⁇ group includes a hydroxyl group, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, a linear alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms, an amino group, and a carbon number.
  • R is selected from a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, an alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, and the ⁇ group.
  • An aryl group having 3 to 12 carbon atoms which may contain a hetero atom, or a carbon which may contain a hetero atom which may have one or more arbitrary substituents selected from the ⁇ group Represents an aralkyl group having an aryl moiety of 3 to 12;
  • R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, and a C 2 to 7 group that may form a branch or a ring.
  • the present invention also provides a 2 ', 4'-bridged nucleoside triphosphate represented by the following formula III:
  • Base represents a purin-9-yl group or a 2-oxo-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group which may have one or more arbitrary substituents selected from the following ⁇ group
  • the ⁇ group includes a hydroxyl group, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, a linear alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms, an amino group, and a carbon number.
  • R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, and a C 2 to 7 group that may form a branch or a ring.
  • R 1 and R 2 are not simultaneously hydrogen atoms;
  • N is an integer from 1 to 5).
  • the present invention also provides a 2 ', 4'-bridged nucleotide represented by the following formula I', formula II 'or formula III':
  • Base represents a purin-9-yl group or a 2-oxo-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group which may have one or more arbitrary substituents selected from the following ⁇ group
  • the ⁇ group includes a hydroxyl group, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, a linear alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms, an amino group, and a carbon number.
  • R is selected from a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, an alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, and the ⁇ group.
  • An aryl group having 3 to 12 carbon atoms which may contain a hetero atom, or a carbon which may contain a hetero atom which may have one or more arbitrary substituents selected from the ⁇ group Represents an aralkyl group having an aryl moiety of 3 to 12;
  • R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, and a C 2 to 7 group that may form a branch or a ring.
  • N is an integer from 1 to 5
  • the present invention further provides a novel nuclease-resistant nucleic acid prepared by any of the methods described above.
  • high nuclease resistance can be imparted not only to an existing nucleic acid but also to a DNA strand of unknown sequence or a DNA strand having a long base length exceeding 100 residues very easily. Is possible. Therefore, it is useful in the field of medicines and diagnostics, in the field of genomic research, particularly in the preparation of reagents for genomic research.
  • Residual rate of single-stranded DNA (ODN1 # K, ODN1 # L, ODN1 # M, and ODN1 # Q) with a bridged nucleotide added to the 3 ′ end and an untreated single strand (ODN1) by nuclease treatment It is a graph which shows a time-dependent change.
  • Thrombin-binding aptamers (TBA1 # K, TBA1 # L, TBA1 # M, and TBA1 # Q) in which a bridging nucleotide is added to the 3 ′ end and the residual ratio of untreated thrombin-binding aptamers (TBA1) by nuclease treatment It is a graph which shows a time-dependent change.
  • Reaction solution in which thrombin was incubated with thrombin-binding aptamer (TBA1 # K, TBA1 # L, TBA1 # M, and TBA1 # Q) to which a bridging nucleotide was added at the 3 ′ end and untreated thrombin-binding aptamer (TBA1) Is an electrogram by capillary electrophoresis.
  • linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms refers to any linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, specifically, a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, An n-butyl group, an n-pentyl group, or an n-hexyl group.
  • linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms includes an alkoxy group having an arbitrary linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. Examples thereof include a methyloxy group, an ethyloxy group, and an n-propyloxy group.
  • linear alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms includes an alkylthio group having an arbitrary linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. Examples thereof include a methylthio group, an ethylthio group, and an n-propylthio group.
  • a linear alkylamino group having 1 to 6 carbon atoms includes an alkylamino group having one or two alkylamino groups having any linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. To do. Examples thereof include a methylamino group, a dimethylamino group, an ethylamino group, a methylethylamino group, and a diethylamino group.
  • an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring means any linear alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, any branch having 3 to 7 carbon atoms. It includes a chain alkyl group and any cyclic alkyl group having 3 to 7 carbon atoms.
  • arbitrary linear alkyl groups having 1 to 7 carbon atoms include methyl group, ethyl group, n-propyl group, n-butyl group, n-pentyl group, n-hexyl group, and n-heptyl group.
  • Examples of the branched alkyl group having 3 to 7 carbon atoms include isopropyl group, isobutyl group, tert-butyl group, isopentyl group and the like, and optional cyclic alkyl group having 3 to 7 carbon atoms include A cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, etc. are mentioned.
  • an alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms which may form a branch or a ring means any straight chain alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms, any branch having 3 to 7 carbon atoms. It includes a chain alkenyl group and any cyclic alkenyl group having 3 to 7 carbon atoms.
  • the arbitrary branched chain alkenyl group having 3 to 7 carbon atoms there are isopropenyl group, 1-methyl-1-propenyl group, 1-methyl -2-propenyl group, 2-methyl-1-propenyl group, 2-methyl-2-propenyl group, 1-methyl-2-butenyl group, etc.
  • any cyclic alkenyl group having 3 to 7 carbon atoms Includes a cyclobutenyl group, a cyclopentenyl group, a cyclohexenyl group, and the like.
  • aryl group having 3 to 12 carbon atoms that may contain a hetero atom refers to any aromatic hydrocarbon having 6 to 12 carbon atoms and a ring structure that is composed of only hydrocarbons. Any heteroaromatic compound having 3 to 12 carbon atoms including an atom (nitrogen atom, oxygen atom, or sulfur atom) is included. Examples of the aromatic hydrocarbon having 6 to 12 carbon atoms composed of only hydrocarbons include a phenyl group, a naphthyl group, an indenyl group, an azulenyl group, and the like, and a 3 to 12 carbon atom having a hetero atom in the ring structure.
  • Arbitrary heteroaromatic compounds include pyridyl group, pyrrolyl group, quinolyl group, indolyl group, imidazolyl group, furyl group, thienyl group and the like.
  • aralkyl group having an aryl moiety having 3 to 12 carbon atoms which may contain a hetero atom examples include a benzyl group, a phenethyl group, a naphthylmethyl group, a 3-phenylpropyl group, -Phenylpropyl, 4-phenylbutyl, 2-phenylbutyl, pyridylmethyl, indolylmethyl, furylmethyl, thienylmethyl, pyrrolylmethyl, 2-pyridylethyl, 1-pyridylethyl, 3 -Thienylpropyl group and the like.
  • C2-C10 alkylene group or alkenylene group examples include methylene group, ethylene group, propylene group, pentenylene group, hexenylene group, vinylene group, propenylene group, butadienylene group and the like. It is done.
  • the method for preparing a nuclease-resistant nucleic acid of the present invention includes a step of mixing and incubating a nucleic acid consisting of at least three bases, a terminal deoxynucleotide transferase, and a 2 ', 4'-bridged nucleoside triphosphate.
  • the nucleic acid to which nuclease resistance is imparted may be either deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA).
  • the base length of the nucleic acid is not particularly limited as long as it is at least three base lengths.
  • the nucleic acid may be derived from any of nucleic acids isolated from natural products, recombinantly expressed nucleic acids, chemically synthesized nucleic acids, and enzymatically synthesized nucleic acids.
  • the nucleic acid may contain artificially modified bases and modified bases (such as methylation). Further, a labeling substance such as a fluorescent substance may be bound.
  • nucleic acids that can be suitable targets include various functional nucleic acids such as antisense DNA molecules, antigene DNA molecules, DNA aptamers, DNAzymes, and siRNA.
  • a nuclease refers to a nuclease that hydrolyzes a phosphodiester bond between a sugar of DNA or RNA and a phosphate to form nucleotides.
  • Nucleases are ubiquitous in vivo or in cells, so that when exogenous nucleic acid enters in vivo or in cells, it can be degraded by this enzyme.
  • nuclease resistance is imparted to the nucleic acid in order to prevent such degradation by nuclease.
  • nucleases examples include DNA-specific deoxyribonucleases, RNA-specific ribonucleases, and nucleases that act on both DNA and RNA. Also included are nucleases that act on single-stranded DNA, double-stranded DNA, single-stranded RNA, and DNA-RNA hybrids. In the present invention, resistance is preferably imparted to the exonuclease that degrades from the outside of the nucleic acid sequence, that is, from the 5 ′ end or 3 ′ end of the nucleic acid, more preferably to the exonuclease that degrades from the 3 ′ end. obtain.
  • the terminal deoxynucleotide transferase (TdT) used in the method of the present invention links a nucleotide having deoxyribose to the 3′-OH end of double-stranded and single-stranded DNA without depending on the template (addition). It is an enzyme that catalyzes the reaction.
  • TdT can also use a radiolabeled nucleotide or a nucleotide labeled with a hapten such as digoxigenin or biotin as a substrate.
  • the origin of TdT used in the present invention is not particularly limited, and commercially available TdT can be used.
  • TdT is typically 120 ⁇ L of reaction (120 mM potassium cacodylate, 1 mM CoCl 2 , 1 mM dTTP, 0.1 OD d (pT) 6 , and d (pT) 6 as a primer, and This is expressed as the amount of activity for incorporating 1 nmol of dAMP into the acid precipitate when reacted at 37 ° C. for 30 minutes in 6.25 pmol [ 3 H] -dTTP).
  • the 2 ', 4'-bridged nucleoside triphosphate used in the method of the present invention is represented by the following formula I, formula II or formula III:
  • Base represents a purin-9-yl group or a 2-oxo-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group which may have one or more arbitrary substituents selected from the following ⁇ group
  • the ⁇ group includes a hydroxyl group, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, a linear alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms, an amino group, and a carbon number.
  • R is selected from a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, an alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, and the ⁇ group.
  • An aryl group having 3 to 12 carbon atoms which may contain a hetero atom, or a carbon which may contain a hetero atom which may have one or more arbitrary substituents selected from the ⁇ group Represents an aralkyl group having an aryl moiety of 3 to 12;
  • R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, and a C 2 to 7 group that may form a branch or a ring.
  • Base is a purine base (ie, purin-9-yl group) or pyrimidine base (ie, 2-oxo-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group).
  • bases are a hydroxyl group, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, a linear alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms, an amino group, and 1 to carbon atoms. It may have one or more arbitrary substituents selected from the ⁇ group consisting of 6 linear alkylamino groups and halogen atoms.
  • the base include a 6-aminopurin-9-yl group (adenylyl group), a 2,6-diaminopurin-9-yl group, and 2-amino-6-chloropurin-9-yl.
  • 2-amino-6-fluoropurin-9-yl group 2-amino-6-bromopurin-9-yl group, 2-amino-6-hydroxypurin-9-yl group (guaninyl group)
  • Base is the following structural formula in that it can be a more suitable substrate for TdT:
  • 2,4-dihydroxy-5-methylpyrimidin-1-yl group (thyminyl group), 2-oxo-4-amino-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group (cytosynyl group), A 6-aminopurin-9-yl group (adenylyl group) and a 2-amino-6-hydroxypurin-9-yl group (guaninyl group) are preferable, and in particular, 2,4-dihydroxy-5-methylpyrimidine- A 1-yl group (thyminyl group) is preferred.
  • R is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms which may form a branch or a ring, an alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms which may form a branch or a ring, an acyl group optionally having one or more optional substituents selected from the ⁇ group, a sulfonyl group having an optional substituent selected from the ⁇ group, and an optional substituent selected from the ⁇ group
  • R is a hydrogen atom, a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, a phenyl group, or a benzyl group, and more preferably, R is a hydrogen atom or a methyl group.
  • R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, and a carbon that may form a branch or a ring.
  • n is an integer of 1 to 5, preferably 1 or 2, and more preferably 1.
  • m is an integer of 1 to 5, preferably 1 or 2, and more preferably 1.
  • Base is a thyminyl group
  • R is a hydrogen atom
  • R 1 and R Structural formulas (wherein LTP, MTP, and QTP, respectively) are shown below when 2 is a hydrogen atom and a phenyl group, and m and n are both 1, respectively.
  • Such 2 ′, 4′-bridged nucleoside triphosphates can be converted from any nucleoside (natural or non-bridged) to 2 ′, 4′-bridged by the method described in Non-Patent Documents 1 to 4 or 6.
  • a nucleoside can be prepared and further prepared by triphosphorylation according to the method described in Non-Patent Document 5.
  • a commercially available 2 ', 4'-bridged nucleoside may be used.
  • a nucleic acid consisting of at least three bases, terminal deoxynucleotide transferase (TdT), and 2 ′, 4′-bridged nucleoside triphosphate are mixed and incubated, whereby a nuclease resistant nucleic acid is obtained.
  • TdT terminal deoxynucleotide transferase
  • 2 ′, 4′-bridged nucleoside triphosphate are mixed and incubated, whereby a nuclease resistant nucleic acid is obtained.
  • the amount of 2 ′, 4′-bridged nucleoside triphosphate with respect to the nucleic acid to be imparted with resistance is not particularly limited, but it is excessive in order to efficiently and reliably add to the 3 ′ end of the nucleic acid. It is preferable that Further, the amount of TdT used is not particularly limited, and can be appropriately set according to the amount of nucleic acid.
  • the composition of the reaction solution is not particularly limited as long as the activity of TdT is exhibited. When using commercially available TdT, it is preferable to use the buffer solution attached to TdT.
  • the incubation conditions are not particularly limited as long as they are conditions that are usually suitable for exerting the activity of TdT, and are appropriately set according to the TdT used.
  • the incubation temperature can be 30 ° C. to 40 ° C., preferably 37 ° C.
  • the incubation time is also appropriately set according to the amount of TdT, the amount of nucleic acid and 2 ', 4'-crosslinked nucleoside triphosphate.
  • any easily-obtained TdT and 2 ′, 4′-bridged nucleoside triphosphates are incubated under the conditions commonly used by those skilled in the art to achieve any desired
  • a 2 ′, 4′-bridged nucleotide can be added to the 3 ′ end of the nucleic acid.
  • 2 ', 4'-crosslinked nucleoside triphosphate and TdT may be provided in the form of a kit.
  • a kit may also contain a buffer solution, instructions for use, etc. suitable for performing the above incubation.
  • nucleic acid to which these 2 ', 4'-bridged nucleotides are added is a novel nucleic acid to which resistance against nucleases has been imparted. Therefore, the desired nucleic acid function can be exhibited more effectively in vivo where nuclease is present.
  • KTP was prepared according to the description of Non-Patent Document 5.
  • 5-methyl-2′-O, 4′-C-methyleneuridine (nucleoside 1: synthesized according to Non-Patent Document 6) (100 mg, 0.370 mmol) and N, N, N ′, N′-tetramethyl- 1,8-Naphthalenediamine (Proton® Sponge®: 119 mg; 0.555 mmol; 1.5 eq) was placed in the flask and dried overnight under vacuum.
  • Trimethyl phosphoric acid (2.6 mL) was then placed in the flask under an argon atmosphere and the mixture was cooled to 0 ° C.
  • the residue was purified using a Sephadex® DEAE A-25 column with a linear gradient of 0.05 to 1.0 M triethylammonium bicarbonate buffer (pH 8). Corresponding fractions were combined and evaporated under reduced pressure. To remove excess pyrophosphate, the residue was purified by reverse phase MPLC with a linear gradient from 0% (v / v) to 20% (v / v) acetonitrile in 10 mM triethylammonium acetate buffer, pH 7. .
  • LTP was prepared according to the description of Non-Patent Document 5. Except that 5-methyl-2′-O, 4′-C- (methyleneoxymethylene) uridine (nucleoside 2: synthesized according to Non-Patent Document 2) (106 mg, 0.353 mmol) was used in place of nucleoside 1, A cross-linked nucleoside triphosphate LTP was obtained by the same procedure as in Reference Preparation Example 1 (18.7 ⁇ mol: yield 5.3%).
  • MTP was prepared according to the description in Non-Patent Document 5.
  • triethylamine hydrogen trifluoride (313 ⁇ L; 1.91 mmol; 5 equivalents) was added to a THF solution (4.1 mL) of nucleoside 3 (synthesized according to Non-Patent Document 4) (201 mg; 0.381 mmol) with stirring. .
  • the reaction mixture was stirred at room temperature for 3 hours. After evaporation, the residue was purified by reverse phase column chromatography (0% (v / v) to 5% (v / v) aqueous acetonitrile).
  • the residue containing nucleoside 4 was dissolved in methanol and crystallized to give nucleoside 4 in quantitative yield (108 mg; 0.379 mmol).
  • nucleoside 4 (57.8 mg, 0.203 mmol) was used instead of nucleoside 1 (3.19 ⁇ mol). : Yield 1.6%).
  • Example 1 Addition reaction of bridged nucleotide to DNA 3 'end by terminal deoxynucleotide transferase (TdT)) 26mer single-stranded DNA (ggcgttgagtgagtgaatgagtgagt: SEQ ID NO: 1) (ODN1; 0.4 ⁇ M) (purchased from Nippon Bioservice Co., Ltd.), terminal deoxynucleotide transferase (TdT; 0.125, 0.150 or 0.175 unit / ⁇ L) (purchased from Takara Bio Inc.), buffer solution (1 ⁇ ) attached to this enzyme and 200 ⁇ M of the crosslinked nucleoside triphosphate obtained in Preparation Examples 1 to 3 above 20 ⁇ L of each reaction solution containing (KTP, LTP or MTP) was prepared and incubated at 37 ° C.
  • TdT terminal deoxynucleotide transferase
  • DNA having a slightly higher molecular weight that is, DNA to which a cross-linked nucleotide is added can be obtained. I understood it. It was also found that this added DNA was generated in a dose-dependent manner with the enzyme TdT.
  • nucleoside 6 was synthesized from nucleoside 5.
  • Zinc chloride 114 mg; 0.838 mmol
  • an anhydrous benzaldehyde solution 3.7 mL
  • saturated aqueous sodium hydrogen carbonate was added, and the mixture was extracted with ethyl acetate.
  • the organic layer was washed with water and saturated brine, and dried over anhydrous sodium sulfate.
  • nucleoside 7 (338 mg: 78% yield) as a white foam. Obtained as material.
  • tetrabutylammonium fluoride (1.0 M in tetrahydrofuran; 0.0712 ml; 0.0712 mmol) was added to a tetrahydrofuran solution (0.9 mL) of nucleotide 7 (22.0 mg; 0.0356 mmol), and the mixture was cooled with ice. Stir for 1 hour. After the solvent was distilled off, the residue was purified by silica gel chromatography (ethyl acetate) to obtain nucleoside 8 (12.9 mg: yield 96%) as a white solid.
  • nucleoside 8 106 mg; 0.282 mmol
  • nucleoside 1 6.580 ⁇ mol: Yield 2.3%
  • Example 2 Evaluation of nuclease resistance of single-stranded DNA having a bridged nucleotide added to the 3 'end
  • Single-stranded DNA added with cross-linked nucleotides KTP, LTP, MTP, and QTP at the 3 ′ end in the same procedure as in Example 1 (referred to as ODN1 # K, ODN1 # L, ODN1 # M, and ODN1 # Q, respectively)
  • ODN1 # K, ODN1 # L, ODN1 # M, and ODN1 # Q respectively
  • ODN1 # K aqueous solution containing any one single-stranded DNA
  • 2 ⁇ L of an aqueous solution containing snake venom phosphodiesterase I 25 ⁇ unit / ⁇ L
  • a reaction solution (5 ⁇ L) was prepared by mixing 1 ⁇ L of a reaction buffer solution (250 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl 2 , pH 8.0), incubated at 37 ° C
  • a dye solution (0.1% (v / v) bromophenol blue) and a 7M urea solution (3 mM EDTA) were added to the removed reaction solution, and then heat-denatured at 94 ° C., and 20% (w / v).
  • Electrophoresis was performed using a polyacrylamide denaturing gel (denaturing PAGE; 300 V, 49 ° C., 130 minutes). After electrophoresis, the gel was visualized by laser irradiation (488 nm) using a molecular imager (manufactured by BioRad). From the band intensity in the obtained gel photograph (FIG. 2), the ratio (%) of unreacted single-stranded DNA was calculated and plotted against the reaction time (FIG. 3).
  • Example 3 Evaluation of nuclease resistance of thrombin-binding DNA aptamer having a bridging nucleotide added to the 3 'end
  • TBA Thrombin Binding Aptamer, purchased from Sigma-Aldrich
  • the thrombin-binding DNA aptamer (agtccgtggtagggcaggttggggtgact: SEQ ID NO: 2) used was labeled with carboxyfluorescein at the 5 ′ end.
  • TBA1 # K, TBA1 # L, TBA1 # M, and TBA1 # Q thrombin-binding DNA aptamers
  • TBA1 # Q unmodified thrombin-binding DNA aptamers
  • a 5 ⁇ concentration reaction buffer 250 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl 2 , 2.5% (w / v) Tween 20, pH 8.0
  • a reaction solution 5 ⁇ L was prepared, incubated at 37 ° C., 10 minutes after starting the reaction, 20 minutes after, 30 After 60 minutes and 120 minutes, the reaction solution was taken out.
  • a dye solution (0.1% (v / v) bromophenol blue) and a 7M urea solution (9 mM EDTA) were added to the removed reaction solution, and then heat-denatured at 94 ° C., and 20% (w / v).
  • Electrophoresis was performed using a polyacrylamide denaturing gel (denaturing PAGE; 300 V, 49 ° C., 130 minutes). After electrophoresis, the gel was visualized by laser irradiation (488 nm) using a molecular imager (BioRad). The ratio (%) of unreacted single-stranded DNA was calculated from the band intensity in the obtained gel photograph and plotted against the reaction time. The results are shown in FIG.
  • DNAs treated with cross-linked nucleotides LTP, MTP, and QTP and TdT are all untreated TBA1 and TBA # K.
  • the residual rate was higher than that of the exonuclease (snake venom phosphodiesterase I).
  • the residual rate of DNAs (TBA1 # M and TBA1 # Q) in which bridged nucleotides were added to the 3 'end using MTP and QTP was high.
  • Example 4 Evaluation of the stability in serum of a thrombin-binding DNA aptamer having a bridged nucleotide added to the 3 'end
  • Thrombin-binding DNA aptamers (TBA1 # K, TBA1 # L, TBA1 # M, and TBA1 # Q) and a non-modified thrombin-binding DNA aptamer with a bridged nucleotide added to the 3 ′ end prepared in the same manner as in Example 3 above 0.5 ⁇ L of an aqueous solution (4 ⁇ M) containing any one DNA aptamer of (TBA1), 4 ⁇ L of serum (human male type AB plasma: Sigma-Aldrich), and a 10 ⁇ concentration reaction buffer (500 mM) (5 ⁇ L) prepared by mixing 0.5 ⁇ L of Tris-HCl, 100 mM MgCl 2 , pH 8.0) and incubating at 37 ° C., 10 minutes, 20 minutes, and 30 minutes after the start
  • reaction solution was taken out.
  • a dye solution (0.1% (v / v) bromophenol blue) and a 7M urea solution (3 mM EDTA) were added to the taken out reaction solution, and then heat-denatured at 94 ° C. to obtain 20% (w / v).
  • Electrophoresis was performed using a polyacrylamide denaturing gel (denaturing PAGE; 300 V, 49 ° C., 130 minutes). After electrophoresis, the gel was visualized by laser irradiation (488 nm) using a molecular imager (BioRad). The ratio (%) of unreacted single-stranded DNA was calculated from the band intensity in the obtained gel photograph and plotted against the reaction time. The results are shown in FIG.
  • Example 5 Evaluation of binding affinity of thrombin-binding DNA aptamer with a bridging nucleotide added to the 3 ′ end to thrombin
  • Thrombin-binding DNA aptamers (TBA1 # K, TBA1 # L, TBA1 # M, and TBA1 # Q) with a bridged nucleotide added to the 3 ′ end and the unmodified thrombin-binding DNA aptamer prepared in the same manner as in Example 3 above
  • the electrophoresis conditions were as follows.
  • a BECKMAN COULTER, P / ACE TM MDQ apparatus was used for capillary electrophoresis.
  • the cartridge temperature was set at 25 ° C and the sample storage at 15 ° C.
  • Detection was performed with a fluorescence detector, and the excitation wavelength was set to 488 nm and the monitor wavelength was set to 520 nm.
  • the capillary used was a capillary having an inner diameter of 75 ⁇ m (manufactured by BECKMAN COULTER) adjusted to a length of 30.2 cm (the length to the window was 20 cm).
  • As the running buffer 0.4% (w / v) borate buffer (0.3% (w / v) sodium borate, pH 8.35: manufactured by BECKMAN COULTER) was used.
  • the peak with a migration time of around 2 minutes was a complex of each TBA and thrombin, and the peak with a migration time of around 3 minutes was a free form of each TBA.
  • TBA1 # M a third peak appeared between the complex and the free form (around 2.6 minutes). This is because the free TBA1 # M dissociated from thrombin during the migration was complex. This is thought to be due to some higher order structure due to the interaction with the body. Therefore, this peak was regarded as a complex.
  • the dissociation constant Kd was calculated from the electrogram by the following equation as described in M.V. Berezovski et al., Nature Protocols, 2006, Vol. 1, No. 3, page 1362. The calculated Kd is shown in Table 1 below.
  • the enzymatic addition of cross-linked nucleotides to various functional nucleic acids facilitates the nuclease resistance of those nucleic acid molecules. It is possible to improve it. Therefore, it is useful for genome technologies (antisense method, antigene method, RNAi, decoy method, gene homologous recombination, ribozyme, DNA enzyme, etc.) targeting RNA, single-stranded DNA, and double-stranded DNA as molecular targets. . Therefore, it can be used for the development and preparation of genomic research reagents such as basic biochemical research tools, pharmaceuticals, diagnostics, and analytical reagents as common base materials for nucleic acid drug development and diagnostic systems.
  • genomic research reagents such as basic biochemical research tools, pharmaceuticals, diagnostics, and analytical reagents as common base materials for nucleic acid drug development and diagnostic systems.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　本発明のヌクレアーゼ耐性核酸の調製方法は、少なくとも３つの塩基からなる核酸と、末端デオキシヌクレオチド転移酵素と、２’，４’－架橋型ヌクレオシド三リン酸とを混合してインキュベートする工程を含む。本発明の方法に用いられる２’，４’－架橋型ヌクレオシド三リン酸としては、例えば、５－メチル－２’－Ｏ，４’－Ｃ－（メチレンオキシメチレン）ウリジン－５’－三リン酸、５－メチル－２’－Ｏ，４’－Ｃ－（アミノメチレン）ウリジン－５’－三リン酸、および５－メチル－２’－Ｏ，４’－Ｃ－（ベンジルオキシメチレン）ウリジン－５’－三リン酸が挙げられる。本発明の方法によれば、既存の機能性核酸に対して、後から簡単に優れたヌクレアーゼ耐性を付与することができる。

Description

新規核酸誘導体およびそれを用いたヌクレアーゼ耐性核酸の調製方法
　本発明は、新規核酸誘導体およびそれを用いたヌクレアーゼ耐性核酸の調製方法に関する。より詳細には、既存の機能性核酸に対して、後からヌクレアーゼ耐性を付与するための方法に関する。
　核酸分子は、分子生物学や化学生物学などの種々の分野で使用され、医薬・診断薬への応用も盛んに検討されている。核酸分子をインビボで使用する場合、ヌクレアーゼ（核酸分解酵素）耐性を考慮しなくてはならない。そのため、インビトロで機能を十分に果たすという治験が得られた核酸分子であっても、改めて分子設計を行って、その核酸分子に耐性を付与しなければならない。
　これまでの研究で、架橋型ヌクレオチドを機能性核酸（アンチセンス、アプタマーなど）に導入することによって、ヌクレアーゼ耐性が向上することが知られている。例えば、二環系の糖部分を有するロックト核酸（Locked Nucleic Acid：ＬＮＡ）が化学合成され、このＬＮＡを有するオリゴヌクレオチドは、天然型のオリゴヌクレオチドよりもヌクレアーゼへの耐性が向上しており、したがって体内での安定性が改善される可能性が示唆されている（非特許文献１）。さらに、ヌクレアーゼ耐性を付与することが可能な架橋型核酸（Bridged Nucleic Acid）が、種々設計および合成されている（非特許文献２～４）。また、このような架橋型ヌクレオチドの三リン酸アナログを含むプライマーについて、ＤＮＡポリメラーゼに対する影響が検討されており、糖部分の改変が、ポリメラーゼ反応に大きく影響を及ぼすことが報告されている（非特許文献５）。
　しかし、これらの架橋型ヌクレオチドおよびそのアナログを核酸（オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）中に付与または導入するためには、いずれも化学合成により（例えば、自動化ＤＮＡ合成機を用いて）作成する必要がある。そのため、配列未知のＤＮＡ鎖や１００残基を超える長い塩基長のＤＮＡ鎖について、従来法でヌクレアーゼ耐性を付与することは、非常に手間がかかる。
　上記架橋型ヌクレオチドであるＬＮＡについては、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）によって認識され、ＤＮＡオリゴヌクレオチドに組込まれること、およびそれによってＤＮＡオリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性が付与されることが知られている（特許文献１）。
特表２００２－５２１３１０号公報
C. Wahlestedtら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2000年，97巻，10号，5633-5638頁 Y. Hariら、Bioorg. Med. Chem.，2006年，14巻，1029-1038頁 K. Miyashitaら、Chem. Commun.，2007年，3765-3767頁 S.M.A. Rahmanら、J. Am. Chem. Soc.，2008年，130巻，14号，4886-4896頁 M. Kuwaharaら、Nucleic Acids Res.，2008年，36巻，13号，4257-4265頁 S. Obikaら、Bioorg. Med. Chem.，2001年，9巻，1001-1011頁 S. K. Singhら、Chem. Commun.，1998年，455-456頁 R. D. Youssefyehら、J. Org. Chem.；1979年，44巻，1301-1309頁 K. Morihiroら、ChemBioChem，2009年，10巻，1784-1788頁
　本発明は、既存の機能性核酸に対して、後から簡単に優れたヌクレアーゼ耐性を付与する方法を提供すること、ならびにそれに用いるための新規な核酸誘導体を提供することを目的とする。
　本発明者らは、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）および２’，４’－架橋型ヌクレオシド三リン酸を用いることにより、一本鎖のデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）の３’末端に架橋型ヌクレオチドを効率よく付加できること、ならびにこのようにして生成した３’末端修飾ＤＮＡが非常に高いヌクレアーゼ耐性を示すことを見いだし、本発明を完成した。
　本発明は、ヌクレアーゼ耐性核酸の調製方法を提供し、該方法は、
　少なくとも３つの塩基からなる核酸と、末端デオキシヌクレオチド転移酵素と、２’，４’－架橋型ヌクレオシド三リン酸とを混合してインキュベートする工程を含み、
　該２’，４’－架橋型ヌクレオシド三リン酸が、以下の式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
（式中、
　Ｂａｓｅは、以下のα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
　Ｒは、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表し；
　Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルキニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表すか、あるいはＲ１およびＲ２は一緒になって、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい炭素数２から１０のアルキレン基またはアルケニレン基を表し、ただし、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子ではなく；
　ｍは、１から５の整数であり；そして
　ｎは、１から５の整数である）
で表される構造を有する。
　１つの実施態様では、上記式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩにおいて、上記Ｂａｓｅは、６－アミノプリン－９－イル基、２，６－ジアミノプリン－９－イル基、２－アミノ－６－クロロプリン－９－イル基、２－アミノ－６－フルオロプリン－９－イル基、２－アミノ－６－ブロモプリン－９－イル基、２－アミノ－６－ヒドロキシプリン－９－イル基、６－アミノ－２－メトキシプリン－９－イル基、６－アミノ－２－クロロプリン－９－イル基、６－アミノ－２－フルオロプリン－９－イル基、２，６－ジメトキシプリン－９－イル基、２，６－ジクロロプリン－９－イル基、６－メルカプトプリン－９－イル基、２－オキソ－４－アミノ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、４－アミノ－２－オキソ－５－フルオロ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、４－アミノ－２－オキソ－５－クロロ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－メトキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－メルカプト－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２，４－ジヒドロキシピリミジン－１－イル基、２，４－ジヒドロキシ－５－メチルピリミジン－１－イル基、または４－アミノ－５－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基である。
　１つの実施態様では、上記式ＩＩにおいて、上記Ｒは、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基である。
　１つの実施態様では、上記式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩにおいて、上記ｍは１であり、そして上記ｎも１である。
　１つの実施態様では、上記式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩにおいて、上記Ｂａｓｅは、２，４－ジヒドロキシ－５－メチルピリミジン－１－イル基である。
　１つの実施態様では、上記式ＩＩＩにおいて、上記Ｒ１およびＲ２のいずれか一方は、水素原子である。
　１つの実施態様では、上記式ＩＩＩにおいて、上記Ｒ１およびＲ２のいずれか一方は、フェニル基である。
　本発明はまた、末端デオキシヌクレオチド転移酵素、および２’，４’－架橋型ヌクレオシド三リン酸を含む、ヌクレアーゼ耐性核酸の調製用キットを提供し、
　ここで、該２’，４’－架橋型ヌクレオシド三リン酸は、以下の式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
（式中、
　Ｂａｓｅは、以下のα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
　Ｒは、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表し；
　Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルキニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表すか、あるいはＲ１およびＲ２は一緒になって、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい炭素数２から１０のアルキレン基またはアルケニレン基を表し、ただし、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子ではなく；
　ｍは、１から５の整数であり；そして
　ｎは、１から５の整数である）
で表される構造を有する。
　本発明はまた、以下の式ＩＩＩで表される２’，４’－架橋型ヌクレオシド三リン酸を提供する：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
（式中、
　Ｂａｓｅは、以下のα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
　Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルキニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表すか、あるいはＲ１およびＲ２は一緒になって、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい炭素数２から１０のアルキレン基またはアルケニレン基を表し、ただし、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子ではなく；
そして
　ｎは、１から５の整数である）。
　本発明はまた、以下の式Ｉ’、式ＩＩ’または式ＩＩＩ’で表される２’，４’－架橋型ヌクレオチド：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
（式中、
　Ｂａｓｅは、以下のα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
　Ｒは、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表し；
　Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルキニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表すか、あるいはＲ１およびＲ２は一緒になって、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい炭素数２から１０のアルキレン基またはアルケニレン基を表し、ただし、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子ではなく；
そして
　ｎは、１から５の整数である）
を３’末端に有する、ヌクレアーゼ耐性核酸を提供する。
　本発明はさらに、上記のいずれかの方法により調製された、新規なヌクレアーゼ耐性核酸を提供する。
　本発明によれば、既存の核酸に対してだけでなく、配列未知のＤＮＡ鎖や１００残基を超える長い塩基長のＤＮＡ鎖に対しても、非常に簡便に高いヌクレアーゼ耐性を付与することが可能である。したがって、医薬および診断薬の分野、ゲノム研究の分野、特にゲノム研究用試薬の調製に有用である。
架橋型ヌクレオシド三リン酸（ＫＴＰ、ＬＴＰまたはＭＴＰ）とＴｄＴとのインキュベートにより得られた一本鎖ＤＮＡおよび未処理の一本鎖（ＯＤＮ１）の電気泳動写真である。 架橋型ヌクレオチドが３’末端に付加された一本鎖ＤＮＡ（ＯＤＮ１＃Ｋ、ＯＤＮ１＃Ｌ、ＯＤＮ１＃Ｍ、およびＯＤＮ１＃Ｑ）および未処理の一本鎖（ＯＤＮ１）の、ヌクレアーゼ処理による反応液の電気泳動写真である。 架橋型ヌクレオチドが３’末端に付加された一本鎖ＤＮＡ（ＯＤＮ１＃Ｋ、ＯＤＮ１＃Ｌ、ＯＤＮ１＃Ｍ、およびＯＤＮ１＃Ｑ）および未処理の一本鎖（ＯＤＮ１）の、ヌクレアーゼ処理による残存率の経時変化を示すグラフである。 架橋型ヌクレオチドが３’末端に付加されたトロンビン結合アプタマー（ＴＢＡ１＃Ｋ、ＴＢＡ１＃Ｌ、ＴＢＡ１＃Ｍ、およびＴＢＡ１＃Ｑ）および未処理のトロンビン結合アプタマー（ＴＢＡ１）の、ヌクレアーゼ処理による残存率の経時変化を示すグラフである。 架橋型ヌクレオチドが３’末端に付加されたトロンビン結合アプタマー（ＴＢＡ１＃Ｋ、ＴＢＡ１＃Ｌ、ＴＢＡ１＃Ｍ、およびＴＢＡ１＃Ｑ）および未処理のトロンビン結合アプタマー（ＴＢＡ１）の、血清中での残存率の経時変化を示すグラフである。 架橋型ヌクレオチドが３’末端に付加されたトロンビン結合アプタマー（ＴＢＡ１＃Ｋ、ＴＢＡ１＃Ｌ、ＴＢＡ１＃Ｍ、およびＴＢＡ１＃Ｑ）および未処理のトロンビン結合アプタマー（ＴＢＡ１）とトロンビンとをインキュベートした反応液についてのキャピラリー電気泳動によるエレクトログラムである。
　まず、本明細書中で用いられる用語を定義する。
　本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキル基」は、炭素数１～６の任意の直鎖アルキル基をいい、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、またはｎ－ヘキシル基をいう。
　本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルコキシ基」は、炭素数１～６の任意の直鎖アルキル基を有するアルコキシ基を包含する。例えば、メチルオキシ基、エチルオキシ基、ｎ－プロピルオキシ基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基」は、炭素数１～６の任意の直鎖アルキル基を有するアルキルチオ基を包含する。例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ－プロピルチオ基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基」は、炭素数１～６の任意の直鎖アルキル基を有するアルキルアミノ基を１つまたは２つ有するアルキルアミノ基を包含する。例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、メチルエチルアミノ基、ジエチルアミノ基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基」は、炭素数１～７の任意の直鎖アルキル基、炭素数３～７の任意の分岐鎖アルキル基、および炭素数３～７の任意の環状アルキル基を包含する。例えば、炭素数１～７の任意の直鎖アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、およびｎ－ヘプチル基が挙げられ、炭素数３～７の任意の分岐鎖アルキル基としては、イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、イソペンチル基などが挙げられ、そして炭素数３～７の任意の環状アルキル基としては、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基」は、炭素数２～７の任意の直鎖アルケニル基、炭素数３～７の任意の分岐鎖アルケニル基、および炭素数３～７の任意の環状アルケニル基を包含する。例えば、炭素数２～７の任意の直鎖アルケニル基としては、エテニル基、１－プロペニル基、２－プロペニル基、１－ブテニル基、２－ブテニル基、１－ペンテニル基、２－ペンテニル基、３－ペンテニル基、４－ペンテニル基、１－ヘキセニル基などが挙げられ、炭素数３～７の任意の分岐鎖アルケニル基としては、イソプロペニル基、１－メチル－１－プロペニル基、１－メチル－２－プロペニル基、２－メチル－１－プロペニル基、２－メチル－２－プロペニル基、１－メチル－２－ブテニル基などが挙げられ、そして炭素数３～７の任意の環状アルケニル基としては、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基」は、炭化水素のみで構成された炭素数６～１２の任意の芳香族炭化水素および環構造にヘテロ原子（窒素原子、酸素原子、または硫黄原子）を含む炭素数３～１２の任意の複素芳香族化合物を包含する。炭化水素のみで構成された炭素数６～１２の芳香族炭化水素としては、フェニル基、ナフチル基、インデニル基、アズレニル基などが挙げられ、そして環構造にヘテロ原子を含む炭素数３～１２の任意の複素芳香族化合物としては、ピリジル基、ピロリル基、キノリル基、インドリル基、イミダゾリル基、フリル基、チエニル基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基」の例としては、ベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基、３－フェニルプロピル基、２－フェニルプロピル基、４－フェニルブチル基、２－フェニルブチル基、ピリジルメチル基、インドリルメチル基、フリルメチル基、チエニルメチル基、ピロリルメチル基、２－ピリジルエチル基、１－ピリジルエチル基、３－チエニルプロピル基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「炭素数２から１０のアルキレン基またはアルケニレン基」の例としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ペンテニレン基、ヘキセニレン基、ビニレン基、プロペニレン基、ブタジエニレン基などが挙げられる。
　以下、本発明について詳述する。
　本発明のヌクレアーゼ耐性核酸の調製方法は、少なくとも３つの塩基からなる核酸と、末端デオキシヌクレオチド転移酵素と、２’，４’－架橋型ヌクレオシド三リン酸とを混合してインキュベートする工程を含む。
　本発明において、ヌクレアーゼ耐性を付与する対象となる核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）のいずれであってもよい。核酸の塩基長は、少なくとも３つの塩基長であれば、特に限定されない。核酸は、天然物から単離した核酸、組換え発現させた核酸、化学的に合成した核酸、酵素的に合成した核酸のいずれの由来であってもよい。また、核酸中に、人工的に改変された塩基および修飾塩基（メチル化など）を含んでいてもよい。また、蛍光物質などの標識物質が結合されていてもよい。本発明においては、好適な対象となり得る核酸としては、アンチセンスＤＮＡ分子、アンチジーンＤＮＡ分子、ＤＮＡアプタマー、ＤＮＡザイム、ｓｉＲＮＡなどの種々の機能性核酸が挙げられる。
　本発明においてヌクレアーゼとは、ＤＮＡまたはＲＮＡの糖とリン酸の間のホスホジエステル結合を加水分解してヌクレオチドとする核酸分解酵素をいう。ヌクレアーゼは、生体内または細胞中に遍在するため、外因性の核酸が生体内または細胞中に入ると、この酵素によって分解され得る。本発明においては、このようなヌクレアーゼによる分解を防止するために、核酸にヌクレアーゼ耐性を付与する。
　ヌクレアーゼとしては、ＤＮＡ特異的なデオキシリボヌクレアーゼ、ＲＮＡ特異的なリボヌクレアーゼ、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡのいずれにも作用するヌクレアーゼが挙げられる。また、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、ならびにＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドのいずれに作用するヌクレアーゼも挙げられる。本発明においては、好ましくは、核酸配列の外側から、すなわち、核酸の５’末端または３’末端から分解するエキソヌクレアーゼ、より好ましくは３’末端から分解するエキソヌクレアーゼに対して、耐性が付与され得る。
　本発明の方法に用いられる末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）は、鋳型に依存せずに、二本鎖および一本鎖ＤＮＡの３’－ＯＨ末端へ、デオキシリボースを有するヌクレオチドを連結させる（付加する）反応を触媒する酵素である。ＴｄＴは、放射性標識ヌクレオチドやジゴキシゲニンやビオチンのようなハプテンで標識されたヌクレオチドも基質として利用し得る。本発明において用いるＴｄＴの由来は、特に限定されず、市販のＴｄＴを用い得る。
　ＴｄＴの１ユニットは、通常、ｄ（ｐＴ）６をプライマーとして用いて、１２０μＬの反応液（１２０ｍＭのカコジル酸カリウム、１ｍＭのＣｏＣｌ２、１ｍＭのｄＴＴＰ、０．１ＯＤのｄ（ｐＴ）６、および６．２５ｐｍｏｌの［３Ｈ］－ｄＴＴＰ）中、３７℃にて３０分間の反応させた場合に、１ｎｍｏｌのｄＡＭＰを酸沈殿産物に取り込む活性量として表される。
　本発明の方法で用いられる２’，４’－架橋型ヌクレオシド三リン酸は、以下の式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
（式中、
　Ｂａｓｅは、以下のα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
　Ｒは、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表し；
　Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルキニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表すか、あるいはＲ１およびＲ２は一緒になって、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい炭素数２から１０のアルキレン基またはアルケニレン基を表し、ただし、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子ではなく；
　ｍは、１から５の整数であり；そして
　ｎは、１から５の整数である）
で表される構造を有する。
　上記式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩにおいて、Ｂａｓｅは、プリン塩基（すなわち、プリン－９－イル基）またはピリミジン塩基（すなわち、２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基）である。これらの塩基は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群より選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。
　上記の塩基（Ｂａｓｅ）の具体例としては、６－アミノプリン－９－イル基（アデニニル基）、２，６－ジアミノプリン－９－イル基、２－アミノ－６－クロロプリン－９－イル基、２－アミノ－６－フルオロプリン－９－イル基、２－アミノ－６－ブロモプリン－９－イル基、２－アミノ－６－ヒドロキシプリン－９－イル基（グアニニル基）、６－アミノ－２－メトキシプリン－９－イル基、６－アミノ－２－クロロプリン－９－イル基、６－アミノ－２－フルオロプリン－９－イル基、２，６－ジメトキシプリン－９－イル基、２，６－ジクロロプリン－９－イル基、６－メルカプトプリン－９－イル基、２－オキソ－４－アミノ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基（シトシニル基）、４－アミノ－２－オキソ－５－フルオロ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、４－アミノ－２－オキソ－５－クロロ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－メトキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－メルカプト－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２，４－ジヒドロキシピリミジン－１－イル基（ウラシリル基）、２，４－ジヒドロキシ－５－メチルピリミジン－１－イル基（チミニル基）、および４－アミノ－５－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基が挙げられる。
　中でも、Ｂａｓｅは、ＴｄＴのより好適な基質となり得る点で、以下の構造式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
でそれぞれ表される、２，４－ジヒドロキシ－５－メチルピリミジン－１－イル基（チミニル基）、２－オキソ－４－アミノ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基（シトシニル基）、６－アミノプリン－９－イル基（アデニニル基）、および２－アミノ－６－ヒドロキシプリン－９－イル基（グアニニル基）が好適であり、特に、２，４－ジヒドロキシ－５－メチルピリミジン－１－イル基（チミニル基）が好適である。
　上記式ＩＩにおいて、Ｒは、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基である。より好適には、Ｒは、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基であり、さらに好適には、Ｒは、水素原子またはメチル基である。
　上記式ＩＩＩにおいて、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルキニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表すか、あるいはＲ１およびＲ２は一緒になって、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい炭素数２から１０のアルキレン基またはアルケニレン基を表し、ただし、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子ではない。より好適には、上記Ｒ１およびＲ２のいずれか一方は、水素原子であり、他方は、フェニル基である。
　上記式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩにおいて、ｎは、１から５の整数であり、好ましくは１または２であり、より好ましくは１である。
　上記式Ｉにおいて、ｍは、１から５の整数であり、好ましくは１または２であり、より好ましくは１である。
　上記式Ｉ、式ＩＩおよび式ＩＩＩで表される２’，４’－架橋型ヌクレオシド三リン酸の代表的な例として、Ｂａｓｅがチミニル基であり、Ｒが水素原子であり、Ｒ１およびＲ２がそれぞれ水素原子およびフェニル基であり、そしてｍおよびｎがいずれも１である場合のそれぞれの構造式（それぞれＬＴＰ、ＭＴＰ、ＱＴＰと称する）を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　このような２’，４’－架橋型ヌクレオシド三リン酸は、非特許文献１～４または６に記載の方法によって任意のヌクレオシド（天然型あるいは非架橋型）から２’，４’－架橋型ヌクレオシドを調製し、さらに非特許文献５に記載の方法に従って三リン酸化することによって調製することができる。２’，４’－架橋型ヌクレオシドは、市販のものを用いてもよい。
　本発明の方法では、少なくとも３つの塩基からなる核酸と、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）と、２’，４’－架橋型ヌクレオシド三リン酸とを混合してインキュベートする工程により、ヌクレアーゼ耐性核酸を調製することができる。
　このインキュベートする工程において、耐性を付与すべき核酸に対する、２’，４’－架橋型ヌクレオシド三リン酸の量は特に限定されないが、効率よく確実に核酸の３’末端に付加するために過剰量であることが好ましい。また、ＴｄＴの使用量も特に限定されず、核酸の量に応じて適宜設定され得る。反応液の組成も、ＴｄＴの活性が発揮されれば特に限定されない。市販のＴｄＴを用いる場合は、ＴｄＴに添付されているバッファー溶液を用いることが好ましい。
　また、インキュベート条件も、通常ＴｄＴの活性を発揮させるに適する条件であれば、特に限定されず、用いるＴｄＴに応じて適宜設定される。例えば、インキュベート温度は、３０℃～４０℃、好適には３７℃であり得る。インキュベート時間も、ＴｄＴの量、核酸および２’，４’－架橋型ヌクレオシド三リン酸の量に応じて適宜設定される。
　このようにして、入手の容易なＴｄＴと、２’，４’－架橋型ヌクレオシド三リン酸とを用いて、当業者が一般的に用いる条件下でインキュベートするという極めて簡単な操作により、任意の核酸の３’末端に２’，４’－架橋型ヌクレオチドを付加することができる。
　また、ヌクレアーゼ耐性核酸の調製のために、２’，４’－架橋型ヌクレオシド三リン酸とＴｄＴとは、キットの形態で提供されてもよい。このようなキットには、上記のインキュベートを行うために適切なバッファー溶液、使用指示書なども含まれ得る。
　上記方法により得られる生成物は、以下の式Ｉ’、式ＩＩ’または式ＩＩＩ’
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
を３’末端に有する核酸である。
　これらの２’，４’－架橋型ヌクレオチドが付加した核酸は、ヌクレアーゼに対する耐性が付与された新規な核酸である。したがって、ヌクレアーゼが存在するインビボにおいて、所望の核酸の機能をより効果的に発揮させることができる。
　(参考調製例１：５－メチル－２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレンウリジン－５’－三リン酸（ＫＴＰ）の調製)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　非特許文献５の記載に従ってＫＴＰを調製した。まず、５－メチル－２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレンウリジン（ヌクレオシド１：非特許文献６に従って合成）（１００ｍｇ，０．３７０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－１，８－ナフタレンジアミン（Proton Sponge（登録商標）：１１９ｍｇ；０．５５５ｍｍｏｌ；１．５当量）をフラスコに入れ、真空下で一晩乾燥させた。次いで、トリメチルリン酸（２．６ｍＬ）をアルゴン雰囲気下でフラスコに入れ、混合物を０℃まで冷却した。次いで、オキシ塩化リン（４２μＬ；０．４４４ｍｍｏｌ；１．２当量）を滴下し、反応混合物を０℃にて攪拌した。４５分後、ｎ－トリブチルアミン（３２８μＬ；１．３７ｍｍｏｌ；３．７当量）およびｎ－ピロリン酸ｎ－トリブチルアミン（０．５ＭのＤＭＦ溶液を３．７ｍＬ；１．８５ｍｍｏｌ；５当量）を０℃にて添加し、反応混合物を室温まで温め、さらに１時間攪拌した後、炭酸水素トリエチルアンモニウム（１．０Ｍ水溶液）で反応をクエンチした。溶媒を真空下で除去し、そして残渣を水に溶解した。この残渣を、０．０５～１．０Ｍの炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ８）の直線グラジエントでＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）ＤＥＡＥ　Ａ－２５カラムを用いて精製した。対応する画分を合わせ、減圧下でエバポレートした。過剰のピロリン酸を除去するために、残渣を、１０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ７）中０％(v/v)～２０％(v/v)アセトニトリルの直線グラジエントでの逆相ＭＰＬＣにより精製した。さらなる精製を、５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液中０％(v/v)～４．９％(v/v)アセトニトリルの直線グラジエントでの逆相ＨＰＬＣ（φ２０×２５０ｍｍ）で行い、架橋型ヌクレオシド三リン酸ＫＴＰを得た（２４．８μｍｏｌ：収率６．７％）。
　得られたＫＴＰのスペクトルデータは、以下のとおりであった：1H NMR (500 MHz, D2O)δ7.55 (s, 1H), 5.48 (s, 1H), 4.36-4.12 (m, 4H), 3.95-3.75 (m, 2H), 1.75 (s, 3H)；31P NMR (500 MHz, D2O)δ-10.35 (d), -11.17 (d), -22.81 (t)；ESI-MS（ネガティブイオンモード）m/z，実測値＝508.8，計算値 [(M-H)-]＝508.98。
　(調製例１：５－メチル－２’－Ｏ，４’－Ｃ－（メチレンオキシメチレン）ウリジン－５’－三リン酸（ＬＴＰ）の調製)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　非特許文献５の記載に従ってＬＴＰを調製した。ヌクレオシド１の代わりに５－メチル－２’－Ｏ，４’－Ｃ－（メチレンオキシメチレン）ウリジン（ヌクレオシド２：非特許文献２に従って合成）（１０６ｍｇ，０．３５３ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は、上記参考調製例１と同様の手順で、架橋型ヌクレオシド三リン酸ＬＴＰを得た（１８．７μｍｏｌ：収率５．３％）。
　得られたＬＴＰのスペクトルデータは、以下のとおりであった：1H NMR (500 MHz, D2O)δ7.67 (s, 1H), 5.84 (s, 1H), 5.06-4.99 (m, 2H), 4.49-4.48 (m, 1H), 4.30-4.23 (m, 1H), 4.30-4.23 (m, 1H), 4.13-3.97 (m, 2H), 3.73-3.65 (m, 2H), 1.75 (s, 3H)；31P NMR (500 MHz, D2O)δ-12.42 (d), -14.44 (d), -25.39 (t)；ESI-MS（ネガティブイオンモード）m/z，実測値＝538.8，計算値[(M-H)-]＝538.99。
　(調製例２：５－メチル－２’－Ｏ，４’－Ｃ－（アミノメチレン）ウリジン－５’－三リン酸（ＭＴＰ）の調製)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　非特許文献５の記載に従ってＭＴＰを調製した。まず、トリエチルアミン三フッ化水素（３１３μＬ；１．９１ｍｍｏｌ；５当量）を、ヌクレオシド３（非特許文献４に従って合成）（２０１ｍｇ；０．３８１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（４．１ｍＬ）に攪拌しながら加えた。反応混合物を、室温で３時間攪拌した。エバポレーション後、残渣を、逆相カラムクロマトグラフィー（０％(v/v)～５％(v/v)のアセトニトリル水溶液）により精製した。ヌクレオシド４を含む残渣を、メタノールに溶解し、結晶化して、ヌクレオシド４を定量的収率で得た（１０８ｍｇ；０．３７９ｍｍｏｌ）。
　得られたヌクレオシド４のスペクトルデータは、以下のとおりであった：1H NMR (300MHz, CD3OD)δ8.13 (d, J = 1 Hz, 1H), 6.24 (s, 1H), 4.23 (d, J = 3 Hz, 1H), 4.16 (d, J = 3 Hz, 1H), 3.71 (q, J = 13 Hz, 2H), 3.55 (d, J = 12 Hz, 1H), 2.51 (d, J = 13 Hz, 1H), 1.87 (d, J = 1 Hz, 3H)；ESI-MS（ポジティブイオンモード）m/z，実測値＝308.1，計算値[(M+Na)+]＝308.1。
　次いで、ヌクレオシド１の代わりにヌクレオシド４（５７．８ｍｇ，０．２０３ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は、上記参考調製例１と同様の手順で、架橋型ヌクレオシド三リン酸ＭＴＰを得た（３．１９μｍｏｌ：収率１．６％）。
　得られたＭＴＰのスペクトルデータは、以下のとおりであった：1H NMR (500 MHz, D2O)δ7.75 (s, 1H), 6.06 (s, 1H), 4.36-4.33 (m, 1H), 4.14-3.95 (m, 3H), 3.50 (d, J = 13 Hz, 1H), 2.71 (d, J = 14 Hz, 1H), 1.75 (s, 3H); 31P NMR (500 MHz, D2O)δ-13.51 (d), -14.46 (d), -25.90 (t)；ESI-MS（ネガティブイオンモード）m/z，実測値＝523.9，計算値[(M-H)-]＝524.0。
　（実施例１：末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）による架橋型ヌクレオチドのＤＮＡ３’末端への付加反応）
　５’末端を蛍光標識化した２６ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡ（ggcgttgagtgagtgaatgagtgagt：配列番号１）（ＯＤＮ１；０．４μＭ）（株式会社日本バイオサービスより購入）、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ；０．１２５、０．１５０、または０．１７５ユニット／μＬ）（タカラバイオ株式会社より購入）、この酵素に添付のバッファー溶液（１×）および２００μＭの上記調製例１～３で得た架橋型ヌクレオシド三リン酸（ＫＴＰ、ＬＴＰまたはＭＴＰ）を含む２０μＬの反応液をそれぞれ調製し、３７℃で６０分間インキュベートした。反応終了後、反応液に０．４μＬの色素液（０．１％(v/v)ブロモフェノールブルー）および２．４μＬの７Ｍの尿素溶液（３ｍＭのＥＤＴＡ）を加えた後、９４℃で熱変性させ、２０％(w/v)ポリアクリルアミド変性ゲルを用いて電気泳動を行った（変性ＰＡＧＥ；３００Ｖ、４９℃、１５０分）。泳動後、モレキュラー・イメージャー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてレーザー照射（４８８ｎｍ）し、ゲルを可視化した。得られたゲルの写真を図１に示す。
　図１からわかるように、一本鎖ＤＮＡ（ＯＤＮ１）を架橋型ヌクレオシド三リン酸とＴｄＴとで処理することにより、分子量がわずかに大きなＤＮＡ、すなわち、架橋型ヌクレオチドが付加されたＤＮＡが得られることがわかった。また、この付加されたＤＮＡは、酵素ＴｄＴの用量依存的に生じることもわかった。
　（調製例３：５－メチル－２’－Ｏ，４’－Ｃ－（ベンジルオキシメチレン）ウリジン－５’－三リン酸（ＱＴＰ）の調製）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　非特許文献７～９に従って、ヌクレオシド５からヌクレオシド６を合成した。窒素気流下、得られたヌクレオシド６（３７０ｍｇ；０．６９８ｍｍｏｌ）の無水ベンズアルデヒド溶液（３．７ｍＬ）に塩化亜鉛（１１４ｍｇ；０．８３８ｍｍｏｌ）を加え、室温で１４時間攪拌した。氷冷下、飽和重曹水を加えて酢酸エチルで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝３：１(v/v)）により精製し、ヌクレオシド７（３３８ｍｇ：収率７８％）を白色泡状物質として得た。
　得られたヌクレオシド７の物性データは、以下のとおりであった：融点：103～105℃；[α]D 26 －7.5 (c 1.00, CHCl3)；IR νmax (KBr)：1271, 1464, 1693, 2868, 2946, 3035, 3176 cm-1；1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ1.08-1.12 (28H, m), 1.92 (3H, d, J = 1 Hz), 3.70 (1H, d, J = 13 Hz), 3.76 (1H, d, J = 13 Hz), 3.93 (1H, d, J = 12 Hz), 4.05 (1H, d, J = 13 Hz), 4.43 (1H, d, J = 6 Hz), 4.71 (1H, d, J = 6 Hz), 6.22 (1H, s), 6.24 (1H, s), 7.36-7.64 (6H, m), 8.02 (1H, brs)；13C NMR (67.8 MHz, CDCl3): δ12.4, 12.6, 12.6, 12.7, 13.4, 16.9, 17.1, 17.2, 17.2, 17.3, 17.4, 60.2, 68.8, 70.6, 79.0, 88.9, 92.7, 103.9, 110.1, 126.1, 128.3, 128.9, 135.5, 139.1, 149.7, 163.9；MS (FAB): m/z 619 (M+H)+；HRMS (FAB)：計算値 C30H47N2O8Si2[(M+H)+]＝619.2871, 実測値＝619.2908。
　次いで、ヌクレオチド７（２２．０ｍｇ；０．０３５６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（０．９ｍＬ）に、テトラブチルアンモニウムフルオリド（テトラヒドロフラン中１．０Ｍ；０．０７１２ｍｌ；０．０７１２ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下で１時間攪拌した。溶媒留去後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル）により精製し、ヌクレオシド８（１２．９ｍｇ：収率９６％）を白色固体として得た。
　得られたヌクレオシド８の物性データは、以下のとおりであった：融点：122～125℃；[α]D 24 ＋17.9 (c 1.00, メタノール)；IR νmax (KBr)：1273, 1470, 1694, 3348 cm-1；1H NMR (270 MHz, CD3OD)：δ1.87 (3H, d, J = 1 Hz), 3.69 (1H, d, J = 12 Hz), 3.77 (1H, d, J = 12 Hz), 3.78 (1H, d, J = 13 Hz), 3.97 (1H, d, J = 13 Hz), 4.30 (1H, d, J = 6 Hz), 4.59 (1H, d, J = 6 Hz), 6.26 (1H, s), 6.32 (1H, s), 7.31-7.50 (5H, m), 7.95 (1H, d, J = 1 Hz)；13C NMR (67.8 MHz, CD3OD)：δ12.6, 60.9, 69.3, 71.6, 81.2, 90.5, 93.2, 104.7, 110.8, 127.3, 129.1, 129.6, 137.8, 141.4, 152.2, 166.5；MS (FAB): m/z 377 (M+H)+；HRMS (FAB)：計算値 C18H21N2O7[(M+H)+]＝377.1349, 実測値＝377.1366。
　次に、ヌクレオシド１の代わりにヌクレオシド８（１０６ｍｇ；０．２８２ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は、上記参考調製例１と同様の手順で、架橋型ヌクレオシド三リン酸ＱＴＰを得た（６．５８０μｍｏｌ：収率２．３％）。
　得られたＱＴＰのスペクトルデータは、以下のとおりであった：31P NMR (500MHz，D2O)，-10.56(d), -11.369(d), -22.94(t)；ESI-MS（ネガティブイオンモード）m/z, 実測値＝615.1，計算値[(M-H)-]＝615.03。
　（実施例２：架橋型ヌクレオチドが３’末端に付加された一本鎖ＤＮＡのヌクレアーゼ耐性の評価）
　上記実施例１と同様の手順で架橋型ヌクレオチドＫＴＰ、ＬＴＰ、ＭＴＰ、およびＱＴＰをそれぞれ３’末端に付加した一本鎖ＤＮＡ（それぞれＯＤＮ１＃Ｋ、ＯＤＮ１＃Ｌ、ＯＤＮ１＃ＭおよびＯＤＮ１＃Ｑという）および未処理の一本鎖（ＯＤＮ１）のうち、いずれか１つの一本鎖ＤＮＡを含む水溶液（１μＭ）を２μＬと、蛇毒ホスホジエステラーゼＩを含む水溶液（２５μユニット／μＬ）を２μＬと、５×濃度の反応緩衝液（２５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０）を１μＬとを混ぜ合わせた反応液（５μＬ）を調製し、３７℃でインキュベートし、反応開始１０分後、２０分後、３０分後、６０分後、および１２０分後に反応液をそれぞれ取り出した。取り出した反応液に色素液（０．１％(v/v) ブロモフェノールブルー）および７Ｍの尿素溶液（３ｍＭのＥＤＴＡ）を加えた後、９４℃で熱変性させ、２０％(w/v)ポリアクリルアミド変性ゲルを用いて電気泳動を行った（変性ＰＡＧＥ；３００Ｖ、４９℃、１３０分）。泳動後、モレキュラー・イメージャー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてレーザー照射（４８８ｎｍ）し、ゲルを可視化した。得られたゲル写真（図２）におけるバンド強度より、未反応の一本鎖ＤＮＡの割合（％）を算出し、反応時間に対してプロットした（図３）。
　図２および３から明らかなように、架橋型ヌクレオチドＬＴＰ、ＭＴＰ、およびＱＴＰが付加したＤＮＡ（それぞれＯＤＮ１＃Ｌ、ＯＤＮ１＃ＭおよびＯＤＮ１＃Ｑ）はいずれも、未処理のＯＤＮ１およびＯＤＮ１＃Ｋ（特許文献１に記載のヌクレオチド）よりも残存率が高く、エキソヌクレアーゼ（蛇毒ホスホジエステラーゼＩ）によって分解されにくかった。このように、ＤＮＡを架橋型ヌクレオチドとＴｄＴとで処理することによって、簡単に高いヌクレアーゼ耐性を付与することができることがわかった。
　（実施例３：架橋型ヌクレオチドが３’末端に付加されたトロンビン結合ＤＮＡアプタマーのヌクレアーゼ耐性の評価）
　上記実施例１と同様の手順で、トロンビン結合ＤＮＡアプタマー（ＴＢＡ：Thrombin Binding Aptamer、シグマ－アルドリッチ社より購入）に、架橋型ヌクレオチドＫＴＰ、ＬＴＰ、ＭＴＰ、およびＱＴＰをそれぞれ３’末端に付加した（それぞれＴＢＡ１＃Ｋ、ＴＢＡ１＃Ｌ、ＴＢＡ１＃Ｍ、およびＴＢＡ１＃Ｑという）。なお、用いたトロンビン結合ＤＮＡアプタマー（agtccgtggtagggcaggttggggtgact：配列番号２）は、５’末端がカルボキシフルオレセインで標識化されている。
　これらの架橋型ヌクレオチドが３’末端に付加されたトロンビン結合ＤＮＡアプタマー（それぞれＴＢＡ１＃Ｋ、ＴＢＡ１＃Ｌ、ＴＢＡ１＃ＭおよびＴＢＡ１＃Ｑという）および未修飾のトロンビン結合ＤＮＡアプタマー（ＴＢＡ１）のうち、いずれか１つのＤＮＡアプタマーを含む水溶液（１μＭ）を２μＬと、蛇毒ホスホジエステラーゼＩを含む水溶液（２５μユニット／μＬ）を２μＬと、５×濃度の反応緩衝液（２５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ２、２．５％(w/v）のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）を１μＬとを混ぜ合わせた反応液（５μＬ）を調製し、３７℃でインキュベートし、反応開始１０分後、２０分後、３０分後、６０分後および１２０分後に反応液をそれぞれ取り出した。取り出した反応液に色素液（０．１％(v/v)ブロモフェノールブルー）および７Ｍの尿素溶液（９ｍＭのＥＤＴＡ）を加えた後、９４℃で熱変性させ、２０％(w/v)ポリアクリルアミド変性ゲルを用いて電気泳動を行った（変性ＰＡＧＥ；３００Ｖ、４９℃、１３０分）。泳動後、モレキュラー・イメージャー（BioRad社製）を用いてレーザー照射（４８８ｎｍ）し、ゲルを可視化した。得られたゲル写真におけるバンド強度より未反応の一本鎖ＤＮＡの割合（％）を算出し、反応時間に対してプロットした。結果を図４に示す。
　図４から明らかなように、架橋型ヌクレオチドＬＴＰ、ＭＴＰ、およびＱＴＰとＴｄＴとで処理したＤＮＡ（それぞれＴＢＡ１＃Ｌ、ＴＢＡ１＃ＭおよびＴＢＡ１＃Ｑ）はいずれも、未処理のＴＢＡ１およびＴＢＡ＃Ｋよりも残存率が高く、エキソヌクレアーゼ（蛇毒ホスホジエステラーゼＩ）によって分解されにくかった。特に、ＭＴＰおよびＱＴＰを用いて３’末端に架橋型ヌクレオチドを付加したＤＮＡ（ＴＢＡ１＃ＭおよびＴＢＡ１＃Ｑ）の残存率が高かった。
　（実施例４：架橋型ヌクレオチドが３’末端に付加されたトロンビン結合ＤＮＡアプタマーの血清中における安定性の評価）
　上記実施例３と同様に調製した架橋型ヌクレオチドが３’末端に付加されたトロンビン結合ＤＮＡアプタマー（ＴＢＡ１＃Ｋ、ＴＢＡ１＃Ｌ、ＴＢＡ１＃Ｍ、およびＴＢＡ１＃Ｑ）および未修飾のトロンビン結合ＤＮＡアプタマー（ＴＢＡ１）のうちのいずれか１つのＤＮＡアプタマーを含む水溶液（４μＭ）を０．５μＬと、血清（ヒト男性ＡＢ型血漿：シグマ－アルドリッチ社）を４μＬと、１０×濃度の反応緩衝液（５００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０）を０．５μＬとを混ぜ合わせた反応液（５μＬ）を調製し、３７℃でインキュベートし、反応開始１０分後、２０分後、３０分後、６０分後、１２０分後、２４０分後、および４８０分後に反応液をそれぞれ取り出した。取り出した反応液に色素液（０．１％(v/v)ブロモフェノールブルー）および７Ｍの尿素溶液（３ｍＭのＥＤＴＡ）を加えた後、９４℃で熱変性させ、２０％(w/v)ポリアクリルアミド変性ゲルを用いて電気泳動を行った（変性ＰＡＧＥ；３００Ｖ、４９℃、１３０分）。泳動後、モレキュラー・イメージャー（BioRad社製）を用いてレーザー照射（４８８ｎｍ）し、ゲルを可視化した。得られたゲル写真におけるバンド強度より未反応の一本鎖ＤＮＡの割合（％）を算出し、反応時間に対してプロットした。結果を図５に示す。
　図５から明らかなように、種々のヌクレアーゼが存在している血清中においても、架橋型ヌクレオチドＬＴＰ、ＭＴＰ、およびＱＴＰとＴｄＴとで処理したＤＮＡ（それぞれＴＢＡ１＃Ｌ、ＴＢＡ１＃ＭおよびＴＢＡ１＃Ｑ）はいずれも、未処理のＴＢＡ１およびＴＢＡ＃Ｋよりも残存率が高く、ヌクレアーゼ耐性を示した。
　（実施例５：架橋型ヌクレオチドが３’末端に付加されたトロンビン結合ＤＮＡアプタマーのトロンビンに対する結合親和性の評価）
　上記実施例３と同様に調製した架橋型ヌクレオチドが３’末端に付加されたトロンビン結合ＤＮＡアプタマー（ＴＢＡ１＃Ｋ、ＴＢＡ１＃Ｌ、ＴＢＡ１＃Ｍ、およびＴＢＡ１＃Ｑ）および未修飾のトロンビン結合ＤＮＡアプタマー（ＴＢＡ１）のうちのいずれか１つのＤＮＡアプタマー（１０ｎＭ）、ヒト血漿由来トロンビン（４０ｎＭ：SIGMA社）およびインキュベーションバッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）を含む反応液を調製し、３７℃で３０分間インキュベートした。
　インキュベート後の反応液を、それぞれキャピラリー電気泳動にかけた。電気泳動の条件は、以下のとおりであった。キャピラリー電気泳動には、BECKMAN COULTER, P/ACETM MDQ装置を用いた。カートリッジの温度を２５℃、そしてサンプルストレージを１５℃に設定した。検出は蛍光検出器で行い、励起波長を４８８ｎｍおよびモニター波長を５２０ｎｍに設定した。キャピラリーは、内径７５μｍ（BECKMAN COULTER社製）のキャピラリーを長さ３０．２ｃｍ（ウィンドウまでの長さは２０ｃｍ）に調整して用いた。ランニングバッファーは、０．４％(w/v)ホウ酸バッファー（０．３％(w/v)ホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．３５：BECKMAN COULTER社製）を用いた。
　まず、キャピラリー内をランニングバッファーで置換（２０ｐｓｉ、２分）した後、サンプルをインジェクト（０．５ｐｓｉ、３．９秒、３０．５ｎＬ）し、１２ｋＶで４分間泳動した。各トロンビン結合ＤＮＡアプタマーについて得られたエレクトログラムを図６に示す。
　図６に示すエレクトログラムにおいて、移動時間が２分付近のピークは、各ＴＢＡとトロンビンとの複合体であり、移動時間が３分付近のピークは、各ＴＢＡの遊離体であった。なお、ＴＢＡ１＃Ｍについてのみ、複合体と遊離体との間（２．６分付近）に第３のピークが出現したが、これは、泳動中にトロンビンから解離した遊離のＴＢＡ１＃Ｍが複合体との相互作用により何らかの高次構造をとっているためと考えられる。したがって、このピークについては、複合体とみなした。
　エレクトログラムから解離定数Ｋｄを、M.V. Berezovskiら、Nature Protocols，2006年，1巻，3号，1362頁に記載のように、以下の式により算出した。また、算出したＫｄを以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000035
　式中、
[Ｔ]tot：総トロンビン濃度
[ＤＮＡ]tot：総ＴＢＡ濃度
Ａ１：遊離のＴＢＡのピーク面積
Ａ２：複合体から解離したＴＢＡのピーク面積
Ａ３：複合体のピーク面積。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
　表１からわかるように、架橋型ヌクレオチドが３’末端に付加されていないＴＢＡ１におけるＫｄ値と、架橋型ヌクレオチドが３’末端に付加したＴＢＡにおけるＫｄ値との間に大きな差はなく、ほぼ同等であることがわかった。したがって、３’末端に架橋型ヌク
レオチドが付加されても、アプタマーの機能にはほとんど影響がないことがわかった。
　本発明によれば、アンチセンスＤＮＡ分子、アンチジーンＤＮＡ分子、ＤＮＡアプタマー、ＤＮＡザイム、ｓｉＲＮＡなどの種々の機能性核酸への架橋型ヌクレオチドの酵素的付加によって、それらの核酸分子のヌクレアーゼ耐性を簡便に向上させることが可能である。そのため、ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、および二本鎖ＤＮＡを分子標的としたゲノムテクノロジー（アンチセンス法、アンチジーン法、ＲＮＡｉ、デコイ法、遺伝子相同組換え、リボザイム、ＤＮＡ酵素など）に有用である。したがって、核酸医薬品開発や診断システムなどの共通基盤材料として、基礎生物化学の研究用ツール、医薬品、診断薬、分析試薬などのゲノム研究試薬の開発・調製に利用され得る。

Claims (11)

  1. 　ヌクレアーゼ耐性核酸の調製方法であって、
    　少なくとも３つの塩基からなる核酸と、末端デオキシヌクレオチド転移酵素と、２’，４’－架橋型ヌクレオシド三リン酸とを混合してインキュベートする工程を含み、
    　該２’，４’－架橋型ヌクレオシド三リン酸が、以下の式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式中、
    　Ｂａｓｅは、以下のα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
    　Ｒは、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表し；
    　Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルキニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表すか、あるいはＲ１およびＲ２は一緒になって、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい炭素数２から１０のアルキレン基またはアルケニレン基を表し、ただし、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子ではなく；
    　ｍは、１から５の整数であり；そして
    　ｎは、１から５の整数である）
    で表される構造を有する、方法。
  2. 　前記式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩにおいて、前記Ｂａｓｅが、６－アミノプリン－９－イル基、２，６－ジアミノプリン－９－イル基、２－アミノ－６－クロロプリン－９－イル基、２－アミノ－６－フルオロプリン－９－イル基、２－アミノ－６－ブロモプリン－９－イル基、２－アミノ－６－ヒドロキシプリン－９－イル基、６－アミノ－２－メトキシプリン－９－イル基、６－アミノ－２－クロロプリン－９－イル基、６－アミノ－２－フルオロプリン－９－イル基、２，６－ジメトキシプリン－９－イル基、２，６－ジクロロプリン－９－イル基、６－メルカプトプリン－９－イル基、２－オキソ－４－アミノ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、４－アミノ－２－オキソ－５－フルオロ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、４－アミノ－２－オキソ－５－クロロ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－メトキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－メルカプト－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２，４－ジヒドロキシピリミジン－１－イル基、２，４－ジヒドロキシ－５－メチルピリミジン－１－イル基、または４－アミノ－５－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記式ＩＩにおいて、前記Ｒが、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩにおいて、前記ｍが１であり、そして前記ｎが１である、請求項１から３のいずれかの項に記載の方法。
  5. 　前記式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩにおいて、前記Ｂａｓｅが、２，４－ジヒドロキシ－５－メチルピリミジン－１－イル基である、請求項１から４のいずれかの項に記載の方法。
  6. 　前記式ＩＩＩにおいて、前記Ｒ１およびＲ２のいずれか一方が、水素原子である、請求項１から５のいずれかの項に記載の方法。
  7. 　前記式ＩＩＩにおいて、前記Ｒ１およびＲ２のいずれか一方が、フェニル基である、請求項１から６のいずれかの項に記載の方法。
  8. 　末端デオキシヌクレオチド転移酵素、および２’，４’－架橋型ヌクレオシド三リン酸を含む、ヌクレアーゼ耐性核酸の調製用キットであって、
    　該２’，４’－架橋型ヌクレオシド三リン酸が、以下の式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     （式中、
    　Ｂａｓｅは、以下のα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
    　Ｒは、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表し；
    　Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルキニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表すか、あるいはＲ１およびＲ２は一緒になって、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい炭素数２から１０のアルキレン基またはアルケニレン基を表し、ただし、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子ではなく；
    　ｍは、１から５の整数であり；そして
    　ｎは、１から５の整数である）
    で表される構造を有する、キット。
  9. 　以下の式ＩＩＩで表される２’，４’－架橋型ヌクレオシド三リン酸：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     （式中、
    　Ｂａｓｅは、以下のα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
    　Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルキニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表すか、あるいはＲ１およびＲ２は一緒になって、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい炭素数２から１０のアルキレン基またはアルケニレン基を表し、ただし、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子ではなく；
    そして
    　ｎは、１から５の整数である）。
  10. 　以下の式Ｉ’、式ＩＩ’または式ＩＩＩ’で表される２’，４’－架橋型ヌクレオチド：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     （式中、
    　Ｂａｓｅは、以下のα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
    　Ｒは、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表し；
    　Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルキニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表すか、あるいはＲ１およびＲ２は一緒になって、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい炭素数２から１０のアルキレン基またはアルケニレン基を表し、ただし、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子ではなく；
    そして
    　ｎは、１から５の整数である）
    を３’末端に有する、ヌクレアーゼ耐性核酸。
  11. 　請求項１から７のいずれかの項に記載の方法により調製された、ヌクレアーゼ耐性核酸。
PCT/JP2009/064522 2008-08-22 2009-08-19 新規核酸誘導体およびそれを用いたヌクレアーゼ耐性核酸の調製方法 Ceased WO2010021344A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010525700A JP5357883B2 (ja) 2008-08-22 2009-08-19 新規核酸誘導体およびそれを用いたヌクレアーゼ耐性核酸の調製方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008-214016 2008-08-22
JP2008214016 2008-08-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010021344A1 true WO2010021344A1 (ja) 2010-02-25

Family

ID=41707219

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2009/064522 Ceased WO2010021344A1 (ja) 2008-08-22 2009-08-19 新規核酸誘導体およびそれを用いたヌクレアーゼ耐性核酸の調製方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP5357883B2 (ja)
WO (1) WO2010021344A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010113937A1 (ja) * 2009-03-31 2010-10-07 武田薬品工業株式会社 ヌクレオシドの製造方法
EP2447273A4 (en) * 2009-06-23 2013-06-19 Takeda Pharmaceutical PROCESS FOR SYNTHETIZING NUCLEIC ACID
WO2014112463A1 (ja) * 2013-01-15 2014-07-24 国立大学法人大阪大学 スルホンアミド構造を有するヌクレオシドおよびヌクレオチド
WO2014126229A1 (ja) * 2013-02-18 2014-08-21 塩野義製薬株式会社 含窒素複素環構造を有するヌクレオシド及びヌクレオチド
JPWO2022065413A1 (ja) * 2020-09-25 2022-03-31

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002521310A (ja) * 1997-09-12 2002-07-16 エクシコン エ／エス オリゴヌクレオチド類似体

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002521310A (ja) * 1997-09-12 2002-07-16 エクシコン エ／エス オリゴヌクレオチド類似体

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KUWAHARA,M. ET AL.: "Smart conferring of nuclease resistance to DNA by 3'-end protection using 2',4'-bridged nucleoside-5'- triphosphates", BIOORG.MED.CHEM.LETT., vol. 19, no. 11, 1 June 2009 (2009-06-01), pages 2941 - 2943 *
KUWAHARA,M. ET AL.: "Systematic analysis of enzymatic DNA polymerization using oligo-DNA templates and triphosphate analogs involving 2',4'-bridged nucleosides", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 36, no. 13, 26 June 2008 (2008-06-26), pages 4257 - 4265 *
YOSHIHIKO OGIHARA ET AL.: "2',4'-Kakyogata Nucleoside no Kosoteki DNA Mattan Hyoshiki to Nuclease Taisei no Hyoka", CSJ: THE CHEMICAL SOCIETY OF JAPAN KOEN YOKOSHU, vol. 89TH, no. 2, 13 March 2009 (2009-03-13), pages 1385 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010113937A1 (ja) * 2009-03-31 2010-10-07 武田薬品工業株式会社 ヌクレオシドの製造方法
US8653254B2 (en) 2009-03-31 2014-02-18 Takeda Pharmaceutical Company Limited Process for producing nucleoside
EP2447273A4 (en) * 2009-06-23 2013-06-19 Takeda Pharmaceutical PROCESS FOR SYNTHETIZING NUCLEIC ACID
WO2014112463A1 (ja) * 2013-01-15 2014-07-24 国立大学法人大阪大学 スルホンアミド構造を有するヌクレオシドおよびヌクレオチド
JPWO2014112463A1 (ja) * 2013-01-15 2017-01-19 国立大学法人大阪大学 スルホンアミド構造を有するヌクレオシドおよびヌクレオチド
WO2014126229A1 (ja) * 2013-02-18 2014-08-21 塩野義製薬株式会社 含窒素複素環構造を有するヌクレオシド及びヌクレオチド
US9315535B2 (en) 2013-02-18 2016-04-19 Shionogi & Co., Ltd. Nucleoside and nucleotide having nitrogen-containing heterocycle structure
JPWO2014126229A1 (ja) * 2013-02-18 2017-02-02 塩野義製薬株式会社 含窒素複素環構造を有するヌクレオシド及びヌクレオチド
JPWO2022065413A1 (ja) * 2020-09-25 2022-03-31
WO2022065413A1 (ja) * 2020-09-25 2022-03-31 株式会社理研ジェネシス 新規人工核酸、その製造方法及び用途
CN116322706A (zh) * 2020-09-25 2023-06-23 株式会社理真思 新人工核酸、其制造方法和用途
JP7725490B2 (ja) 2020-09-25 2025-08-19 株式会社理研ジェネシス 新規人工核酸、その製造方法及び用途

Also Published As

Publication number Publication date
JP5357883B2 (ja) 2013-12-04
JPWO2010021344A1 (ja) 2012-01-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Abdur Rahman et al. Design, synthesis, and properties of 2 ‘, 4 ‘-BNANC: a bridged nucleic acid analogue
CA2790483C (en) Phosphoramidites for synthetic rna in the reverse direction
JP3893057B2 (ja) 新規な核酸塩基対
JP2004500330A (ja) グアニジニウム官能化オリゴマーとその製造法
US8153779B2 (en) Nucleotide with an alpha-phosphate mimetic
Sochacka et al. 2-Thiouracil deprived of thiocarbonyl function preferentially base pairs with guanine rather than adenine in RNA and DNA duplexes
JP2005015395A (ja) 新規ピリミドピリミジンヌクレオシドとその構造類縁体
JP5357883B2 (ja) 新規核酸誘導体およびそれを用いたヌクレアーゼ耐性核酸の調製方法
Varizhuk et al. Synthesis of oligonucleotides containing novel G-clamp analogue with C8-tethered group in phenoxazine ring: Implication to qPCR detection of the low-copy Kemerovo virus dsRNA
JPWO2004007713A1 (ja) 新規な非天然型塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチド及びその利用
EP3681897B1 (en) N4-modified cytidine nucleotides and their use
JP2009221168A (ja) ヌクレオシドまたはヌクレオチド誘導体、核酸誘導体、標的物質捕捉材料、標的物質を捕捉および／または放出する方法、ならびにヘミンアプタマー
US20190015439A1 (en) Dinucleotides
US12012432B2 (en) Nucleic acid complex, method for forming nucleic acid hybridization, pharmaceutical composition, nucleic acid probe, and complementary-strand nucleic acid complex
Yamada et al. Synthesis and properties of oligonucleotides modified with 2′-O-(2-carboxyethyl) nucleotides and their carbamoyl derivatives
Gouda et al. Carbazole modified oligonucleotides: synthesis, hybridization studies and fluorescence properties
Belousoff et al. Binding of HIV-1 TAR mRNA to a peptide nucleic acid oligomer and its conjugates with metal-ion-binding multidentate ligands
Zhou et al. Application of 4′-C-α-aminoethoxy-2′-O-methyl-5-propynyl-uridine for antisense therapeutics
Juneau Introduction of Modifications to the Nucleic Acid Scaffold for the Preparation of Circular Structures and Applications in Biochemistry
Carnero et al. The impact of an extended nucleobase-2′-deoxyribose linker in the biophysical and biological properties of oligonucleotides
Moriguchi et al. Novel method of the synthesis and hybridization properties of an oligonucleotide containing non-ionic diisopropylsilyl internucleotide linkage
Chakrapani Bioorthogonal reactions on DNA for regulation of transcription
Solodinin Synthesis of fluorinated nucleosides for probing DNA conformations via 19F NMR spectroscopy
Eritja Synthesis of oligodeoxynucleotides containing 6-N-([13C] methyl) adenine and 2-N-([13C] methyl) guanine
WO2023199261A1 (en) Rna molecule containing modified cap analogs at the 5 ' end, use of rna molecule in in vitro protein or peptide synthesis, rna molecule for use in medicine, and use of modified cap analogs for rna capping

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09808280

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010525700

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 09808280

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1