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WO2010010096A2 - Procédé de production de plantes haploïdes, haploïdes doublées et/ou dihaploïdes, par gynogenèse - Google Patents

Procédé de production de plantes haploïdes, haploïdes doublées et/ou dihaploïdes, par gynogenèse Download PDF

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WO2010010096A2
WO2010010096A2 PCT/EP2009/059376 EP2009059376W WO2010010096A2 WO 2010010096 A2 WO2010010096 A2 WO 2010010096A2 EP 2009059376 W EP2009059376 W EP 2009059376W WO 2010010096 A2 WO2010010096 A2 WO 2010010096A2
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WO
WIPO (PCT)
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plants
haploid
plant
homozygous
embryos
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/EP2009/059376
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English (en)
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WO2010010096A3 (fr
Inventor
Muriel Archipiano
Danièle HOSEMANS
Eric Lionneton
Agnès Vermeulen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Clause SA
Original Assignee
Clause SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to ES201190006A priority patent/ES2403155B1/es
Priority to MX2011000828A priority patent/MX2011000828A/es
Publication of WO2010010096A2 publication Critical patent/WO2010010096A2/fr
Publication of WO2010010096A3 publication Critical patent/WO2010010096A3/fr
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Ceased legal-status Critical Current

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    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/02—Methods or apparatus for hybridisation; Artificial pollination ; Fertility
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
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    • A01H1/06—Processes for producing mutations, e.g. treatment with chemicals or with radiation
    • A01H1/08—Methods for producing changes in chromosome number
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits

Definitions

  • the field of the invention is that of selection or plant improvement, namely the production of plants both in the form of embryos and in any other stage, in particular from the seedling to the adult plant.
  • the selection or plant improvement according to the present invention means obtaining a homozygous or substantially homozygous haploid or diploid plant having stable offspring as to its phenotypic and / or genotypic characteristics.
  • the present invention relates to a new process for producing plants (eg embryos, seedlings, adult plants), Haploids (H), doubled Haploids (HD) and / or DiHaploid (DH), homozygous or essentially homozygous, this method being of the type of those of the gynogenesis technique advantageously associated with irradiation of pollen.
  • the plants concerned are for example zucchini.
  • hybrid plants Fl allowing in particular to bring together in the hybrid plant Fl the dominant characters of his parents, was quickly extended from corn to other species such as tomatoes, peppers, aubergines.
  • obtaining F1 hybrids also makes it possible to improve the plant's homeostasis capacities (stability of the plant and the expression of its characters in different environments), and the possibility of cumulating genes of interest.
  • the creation of F1 hybrid plants involves the creation of relatively homozygous parent lines. Once crossed, these parental lines allow obtaining the F1 hybrid. As long as the genetic purity of the parental lines is maintained, the F 1 hybrids can be obtained repeatedly.
  • the breeder is traditionally closer to the level of homozygosity sought by self fertilizing the most promising plants over several generations, selecting those that have the desired traits, gradually homogenizing the genome of plants from one generation to another.
  • the new zucchini plants developed by the breeders are either self-pollinated cultivars or F1 hybrids. In both cases, the search for homogeneity of the cultivar and / or parental lines of the F1 hybrid is one of the aims of the breeding program.
  • chromosome number reduction in order to initiate the sexual cycle of plants, a process of chromosome number reduction (meiosis) is necessary to give rise to gametic cells having a haploid number of chromosomes (n).
  • sexual reproduction involves double fertilization.
  • the pollen grain produces two gametic nuclei (n) male or reproductive nuclei.
  • a male nucleus fuses with an egg (n) to form a zygote (2n) that produces the embryo by restoring the number of somatic chromosomes (2n).
  • Another male nucleus (n) unites with the polar nuclei of the embryonic haploid sac to form a triploid cell (3n).
  • zygote formation does not occur, but cell divisions of the ovum are initiated, resulting in a haploid embryo capable of giving birth to a seedling whose haploid genome is entirely of maternal origin (Sarkar and Coe, Genetics, 1966, vol 54, 453-464).
  • Haploid plants exist in small numbers in nature and are sterile.
  • the discovery in the early 1920s of viable haploid plants and the possibility of doubling their chromosome stock has led to much research. Indeed, these haploid plants are interesting not only in the field of genetics but also for the improvement of plants because, after the chromosomal doubling (spontaneous or not), the genetic information is identical on the two chromosomes of each pair. In this way, genetic information is fixed and doubled haploids speed up the selection process.
  • haploidization The two main techniques for producing embryos and haploid plants (haploidization) by in vitro gametophyte culture are androgenesis and gynogenesis.
  • In androgenesis immature male gametophytes are cultured on a synthetic medium to obtain haploid embryos, which then develop into whole plants. The results vary with the genotype, but also with the protocols used.
  • gynogenesis mature female gametophytes (ovaries or ovules) are cultured.
  • haploid plants The majority of plants induced by these techniques are haploid plants, but other plants with varying levels of ploidy can be obtained. While aneuploids or tetraploids may have only minor interests in plant breeding programs, spontaneous diploids (DH haploid) are in great demand because of the spontaneous doubling of their chromosome stock during early phases of in vitro culture. makes them fertile. These homozygous plants are directly usable by the breeders, which represents a huge advantage on several levels (time, space, cost ).
  • Haploid plants which are obtained by these various techniques and have not spontaneously doubled their chromosomal stock, must then undergo an additional step to make them diploid (2n) or doubled Haploids (HD).
  • This can be done with various chemicals such as colchicine (an alkaloid that doubles a stock of chromosomes).
  • HD-doubled haploids as well as DH-doubled haploid are homozygous individuals that can be used directly as homogeneous cultivars (population varieties) or as parental lines of hybrid varieties.
  • these plants HD and DH carry, in doubled form, the genetic information of a single set (n) of chromosomes, that of the female gamete from which they originally came.
  • the authors obtain their best yield, ie 4.3 embryos per 100 cultivated ova, when the ovaries are removed one day before flowering. However, they encounter difficulties in obtaining normally growing plants. The origin of the plants is analyzed at a later stage of self - pollination of fertile diploid plants and a phenotypic examination of the offspring.
  • This technique of gynogenesis with pollen irradiation is used especially in the melon (Cucumis melo) (Sauton, Cinquantenaire of the Culture in vitro, 24-25 October 1989) where the majority of the genotypes is capable of producing embryos and / or plants haploids or dihaploids.
  • This multifactorial variability constitutes a first significant disadvantage of the known methods of gynogenesis, with or without irradiation of the pollen.
  • a second disadvantage of said methods relates to the analyzes of the state of ploidy and the state of homozygosity of the plants obtained (embryos / seedlings / adult plants).
  • the plants can be haploid or doubled haploid, but they can have various levels of ploidy, in particular be haploid-diploid chimeras, tetraploids or aneuploids (Dumas de Vaux and Chambonnet in 1986).
  • irradiation of pollen can lead to fertilization of the ovum by pollen grain DNA, mainly by DNA fragments.
  • Haploid chimeric plants when recombination between ovum DNA and fragments of irradiated pollen grain DNA is followed by loss of DNA overabundant in subsequent cell divisions) or ploidy varied, including being heterozygous for certain genes when they carry one or more supernumerary chromosomes.
  • Haploid chimeric plants are interesting because they have only one copy of the genetic information (even if a tiny part of the genome comes from the male gamete) and a doubling of their chromosomal stock, similar to haploids, produces homozygous or essentially homozygous plants.
  • Diploid heterozygous plants resulting from "classical” fertilization may also be produced, for example, in the case of insufficient irradiation.
  • haploids H chimeric or not
  • the identification of haploids H (chimeric or not) and of the different diploids can be done by cytological analysis, in particular by counting chromosomes in preparations of plant root cells passed under an optical microscope. Cytological analysis is difficult to implement in a breeding program where speed and precision are needed. This does not, however, solve the problem of identifying haploids compared to non-haploid chimeras resulting from pseudo-fertilization.
  • diploid plants 2n The selection of diploid plants 2n is done until now by phenotypic analysis of the progeny of the regenerated plant; self-pollination of a homozygous plant should give stable homogenous offspring through successive generations of self-fertilization. If it is not, and segregation of characters is observed, it is because the regenerated plant was not homozygous, but heterozygous. Thus, the identification of DH haploid has been able until now only by the morphological selection and / or the use of recessive markers (for example, liguleless, glossy ...) present in the genome of the female parent.
  • recessive markers for example, liguleless, glossy
  • these recessive markers has the disadvantage of requiring, prior to the induction of gynogenesis, their introduction into the genome of the line intended to be used as a female parent, if it does not already have them.
  • Staining markers may be used in the selection of haploid or doubled haploid embryos and plants (Chase and Nanda, Maize Gen Coop, 1965, News letter, 39, 59-60, Coe and Sarkar, J of Heredity, 1964, vol 55 , 231-233).
  • the expression of these markers is influenced by the genotype of the female parent or even by the general process of maturation of the embryo and this may lead to an incorrect assessment of the origin of the individuals obtained.
  • the pheno analysis typical of the offspring is long, since it is necessary to wait for the flowering, to obtain the seeds and to observe the progeny of each seed to check its homogeneity.
  • one of the objectives of the present invention is to provide a high performance method for improving the production of haploid plants H, doubled HD haploid and / or DH doubled haploid, by gynogenesis induced by an irradiated male gametophyte (for example irradiated pollen).
  • Another object of the present invention is to provide a new improved plant selection or improvement method, that is to say to obtain a homozygous or substantially homozygous plant, haploid or diploid having a stable progeny as to its characteristics. phenotypic and / or genotypic, or in other words, a plant for which stabilization of the genome is acquired with a reduced number of generations (eg one or two).
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing haploid, doubled haploid and / or dihaploid plants, by gynogenesis induced with irradiation of male gametophytes (pollen), overcoming the drawbacks of the prior art and satisfying at least one of the following specifications: - Optimization of the irradiation dose;
  • the level of growth of the embryos collected for their cultivation among others, (multifactorial variability); - Generalization of the process to a maximum of species and genera, in particular to the majority of zucchini Cucurbita pepo;
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing haploid plants (which then give doubled haploid plants) and / or dihaploid plants, by gynogenesis induced by irradiated pollen, said method making it possible to reduce time as well as space of culture necessary for the creation and the varietal selection, this thanks to a stage of selection of the haploid plants, and / or doubled haploid, among all the plants with various ploids produced.
  • Another objective of the present invention is to provide a process which, upstream of a process for producing haploid and / or dihaploid plants by gynogenesis with irradiation of the reproductive material of the male parent, to determine the appropriate irradiation dose to increase the production yields of said plants as a function of multiple factors given and preferably chosen from the plant species, the genotypes of the male parent and the female parent, the climatic and physiological conditions of these plants, the time of harvesting the fruits, the growth conditions of immature embryos collected for cultivation.
  • Another object of the invention is to provide at least one of the following objects: - Marker (s) molecular (s);
  • Descendants of plants Seeds of plants; usable in or obtained by a process for producing haploid, doubled and / or diplohaploid haploid plants, by gynogenesis induced by irradiated pollen, this method being of the type referred to in the above objectives.
  • Another object of the invention is to provide a high-performance method for analyzing the origin of plants, in particular plants produced by a process for producing haploid plants (which then give doubled haploid plants) and / or dihaploids, by gynogenesis. induced by irradiated pollen, this process being of the type referred to in the above objectives, and making it possible to determine whether the plants contain genetic material of the male parent.
  • Another object of the invention is to provide a high-performance method for identifying plants, in particular plants produced by a process for producing haploid plants (which then give doubled haploid plants) and / or dihaploids, by pollen-induced gynogenesis. irradiated, this method being of the type referred to in the above objectives and making it possible to determine whether the plants are homozygous or heterozygous.
  • HD and DH being homozygous or essentially homozygous, this method being of the type belonging to the technique of gynogenesis induced by irradiated pollen, characterized in that it comprises: a step of irradiation of the reproductive material of the male parent at a dose between 160 and 190 Gamma Ray, preferably between 165 and 185 Gamma Ray (Gy),
  • H, or DH, or H and DH, haploid plants by use of a molecular marker, or a step of irradiation of the reproductive parent plant material of the male parent at a dose of between 160 and 190 Gamma Ray, preferably between 165 and 185 Gamma Ray (Gy) and a step of selecting haploid plants H, or DH, or H and
  • the method according to the present invention opens a new way of obtaining plants (lato sensu) haploid H, doubled haploid HD and / or DH doubling.
  • This new approach brings improvements in terms of: broadening the spectrum of plants concerned by this technique of gynogenesis with irradiation of male gametophytes (pollen); reduction of the multifactorial variability peculiar to this technique until then; analysis of the ploidy state of the plants produced; - identification of the origin of the plants obtained; reduction of time as well as space of culture necessary for the creation and the varietal selection.
  • This process has also proven quite suitable for zucchini plants.
  • the invention is directed to a process for producing H, haploid doubled HD and / or DH doubled haploid plants, the HD and DH being homozygous or substantially homozygous by irradiation-induced gynogenesis of the reproductive material of the male parent, characterized in that it comprises a preliminary step of determining the appropriate irradiation dose (s) to increase the yields for obtaining said plants as a function of given multiple factors and chosen from preferably from the plant species, the genotypes of the male parent and the female parent, the climatic and physiological conditions, the time of harvest of the fruits, the level of growth of the embryos collected for their cultivation.
  • s irradiation dose
  • the invention also relates to a process for the production of haploid plants H, haploid doubled HD and / or DH DH, HD and DH being homozygous or substantially homozygous, by gynogenesis induced by irradiated pollen, characterized in that it comprises the use of a molecular marker to identify plants free from genetic material of the male parent whose pollen has been irradiated or which have an insufficient quantity to cause, in the progeny of said plants, a disjunction of a phenotypic and / or genotypic character as well as to determine their state of homozygosity.
  • the invention relates to a molecular marker that can be used in the process according to the invention, this marker being, for example, selected from microsatellite markers (SSR), defined by the pairs of nucleotide sequence primer SEQ ID No. 1 to 16, preferably SEQ ID NO: 3 to 14.
  • SSR microsatellite markers
  • the invention relates to haploid embryos H, HD and / or DH of plants, as intermediate products of the process according to the invention.
  • the invention relates to the progeny of the plants obtained by the process according to the invention.
  • the invention relates to the seeds of the plants obtained by the process according to the invention.
  • genotype we mean the whole of the genetic material carried by an individual and which constitutes his hereditary heritage. A genotype does or does not correspond to a phenotypic trait, whether recessive or dominant.
  • phenotype refers to the set of apparent morphological or functional characteristics of an individual, which correspond both to the expressed part of the genotype and to phenomena determined by the external environment.
  • Plant means a plant at any stage of development whatsoever, including: embryo, or any other seedling stage or adult plant.
  • male or male parent is a plant used as a pollen donor in a cross.
  • female plant or female parent is meant a plant used as a pollen recipient, or egg donor in a cross.
  • Male reproductive material means the male flower or any part comprising male haploid gamete cells, namely stamen, male gametophytes or pollen grains.
  • pollen means the male reproductive material used.
  • Female reproductive material means the female flower or any part comprising female haploid gametic cells, ovaries, ova, female gametophytes (embryo sac) or female reproductive cells (oospheres).
  • autogamous means a plant whose mode of reproduction is autogamy and whose seeds are derived from the fertilization of the two gametes from the same individual.
  • - Pollination is the intake of a grain of pollen from the stamen (male organ) on the female organs. Pollination gives rise to fertilization or even pseudo-fertilization when the maize material used is irradiated.
  • pseudo-fertilization we mean the induced formation of an embryo without prior fusion of a male and female gamete.
  • the technique of pollen irradiation-induced gynogenesis allows the formation of an embryo by pseudo-fertilization.
  • Pseudo-fertilization can also be a partial fertilization when DNA fragments of the male gamete merge with the female gamete.
  • self-fertilization we mean the pollination of an individual by his own pollen, the resulting individuals being said to be self-fertilized.
  • hybrid plant we mean a plant resulting from the cross between two genetically different parents.
  • hybrid F1 a plant of the first generation of a cross between two genetically distinct homozygous parents, for example two distinct varieties, we can speak of hybrid F1.
  • heterosis or hybrid vigor we mean the phenomenon according to which a F1 hybrid is significantly superior to the best of its parents in terms of one or more characters, particularly with regard to vigor.
  • chromosomal stock is meant the number of chromosomes contained in the nucleus of the cell, or the amount of DNA.
  • allele is meant according to the present invention the various versions of a given DNA sequence located at a given locus (location on a chromosome) chromosome.
  • homozygote we mean a cell or an individual that has two identical alleles of the same gene on a specific locus of the same pair of chromosomes, and this for the characteristic provided by this gene.
  • essentially homozygous is meant the plants according to the invention, since the identity of the two alleles is verified for example for at least 80%, preferably 85%, especially 90% and more particularly 95%, alleles tested. or since after self-fertilization there is no segregation of characters in the offspring.
  • essentially homozygous plants are considered as homozygous plants.
  • diploids is meant a qualifier applicable to cells or plants or plant parts comprising such cells, which have, in their nucleus, a batch of similar two-to-two chromosomes said homologous. Diploid cells are usually the result of the fertilization of two haploid gametes.
  • haploids we mean a qualifier applicable to cells or plants or parts of plants comprising such cells, the chromosomes contained in their nucleus are each in one copy (n).
  • - Chimeras means a qualifier for cells or plants or parts of plants comprising such cells, which comprise an additional DNA fragment from irradiated pollen or one of whose chromosomes has been recombined with the irradiated pollen DNA.
  • These cells can be haploid H, DH haploid (when there is doubly spontaneous chromosome stock) or varied ploidy.
  • a plant is a varied ploidy chimera (including chromosomes or supernumerary chromosome fragments), it is heterozygous for some alleles
  • doubled haploid is meant a qualifier applicable to cells or plants or parts of plants comprising such cells, whose chromosomal stock has been artificially propagated, mostly by chemical treatment and mainly by the colchicine.
  • DH - Dihaploids
  • Hybrid female parent means a hybrid plant used as pollen receiving plant in a cross.
  • Zucchini means a plant of the genus Cucurbita. Zucchini is actually a set of cultivars of the species Cucurbita pepo and the subspecies Cucurbita pepo ssp. pepo.
  • Dose means the radiation dose absorbed by the target, namely in particular the reproductive plant material of the male parent.
  • Molecular marker means a specific fragment of a DNA sequence that can be identified within the genome of an individual and that can be used in particular to locate a gene of interest, to verify whether an individual has inherited a gene feature parent or differentiate two individuals. It may or may not be a coding sequence. The marker may be dominant, co-dominant.
  • the detection of the molecular marker, or its non-detection makes it possible to select the individuals presenting the gene of interest or the particular characteristic, or on the contrary, not to select the individuals that do not have the gene of interest or the particular characteristic .
  • the molecular markers make it possible to quickly test the plants or seedlings under development and to retain those which possess the desired characteristics.
  • AFLP amplification fragment length polymorphisms
  • SCAR characterization of amplification products
  • SSR microsatellites, simple sequence repeats
  • RFLP polymorphisms length of restriction fragments
  • microsatellite marker or microsatellite or SSR sequence is meant a DNA sequence formed by a continuous repetition of units composed of 1 to 4 nucleotides. These microsatellite sequences are present on the whole genome, most frequently at the level of the introns of the genes but also at the level of exons.
  • the microsatellite polymorphism can be used as a genetic marker to identify an individual or a population, for example plants.
  • the stable and homogeneous transmission of selected traits is an essential prerequisite. Also, it is essential to know reliably the genotype and phenotype of the plants produced.
  • stable parental lines are required.
  • the plants are generally self-fertilized repeatedly, the plants not having the desired characteristics being eliminated at each generation. New techniques have allowed the development of plants from gametes (n) alone. Thus, androgenesis and gynogenesis have been developed. The use of gynogenesis with irradiated pollen is known to generate plants.
  • this technique has certain limits and mainly the cases of pseudo-fertilization by pollen, even when it has been fragmented by radiation, preferably X or gamma rays. Indeed, it is possible that the pollen is not sufficiently degraded and that a DNA fragment of the irradiated pollen "pseudo-fertile" the female gametophyte whereas in this technique, it must simply induce the development of a haploid embryo without modifying the genome. This embryo, and therefore the plant derived from this embryo, should ideally not contain a genome of the male parent that has been used to pollinate the reproductive material of the female parent.
  • the offspring produced by irradiated pollen-induced gynogenesis can be of different natures, including: haploid plants (with n chromosomes), doubled haploid plants (with 2n identical n + n chromosomes), chimeras containing n chromosomes of the female parent and fragmented pieces of DNA of the male parent recombined or not with the DNA of the female parent , either in haploid form, or having a varied ploidy, or being dihaploid, having undergone a spontaneous doubling of their chromosomal stock, diploid plants resulting from a fertilization of diploid plants having the same genome as the parent plant (2n).
  • the method of gynogenesis induced with irradiation of the pollen comprises the following successive steps: a) Implement reproductive material of the male parent, preferably a flower, b) Irradiate said parent plant reproductive material at a dose of between 160 and 190 gamma ray, preferably between 165 and 185 gamma ray (Gy) and most preferably between 170 and 180 gy, c) pollinating the reproductive plant material of the female parent with said reproductive plant material of the irradiated male parent, d) Harvesting the fruits from which the embryos are harvested, e) Extracting the seeds from the said fruits, f) Extracting the embryos from the seeds, g) Cultivating the embryos on an appropriate medium up to obtaining a plant, preferably a seedling.
  • the irradiation step of the male reproductive material may be repeated several times, preferably two or three times, so that the genetic material is well degraded.
  • the irradiation dose of the most preferred male reproductive material is around 175 Gy.
  • the method further comprises, after step g) described above, a step h) of selecting the haploid plants H and / or DH by cytometry of flow, or by use of molecular marker (s), or by flow cytometry and use of molecular marker (s).
  • This step h) of selection of haploid plants H and / or DH comprises:
  • step h) of selection the order of the use of the specific molecular markers contained in the genetic material of the male parent and those contained in the genetic material of the female parent does not matter. I and II are not necessarily carried out in a precise order and may be concomitant (I and II at the same time) or successive (I then II or II and then I). In addition, the selection step h) can be repeated several times. This can be interesting when using several specific molecular markers, to make successive selections increasingly fine with fewer and fewer individuals to test. Finally, when step h) consists of selecting haploid plants H and / or DH by flow cytometry and use of molecular marker (s), flow cytometry may precede the use of molecular marker (s). (s), the use of molecular marker (s) may precede flow cytometry, and the use of molecular marker (s) may be concomitant with flow cytometry.
  • the parent plants are chosen from the genus Cucurbita, family cucurbitaceae, preferably from the species Cucurbita pepo, and more preferably still, from the subspecies Cucurbita pepo ssp. pepo.
  • hybrid plants and hybrid plants F1 are used as the female plant.
  • gametes of a hybrid plant or hybrid plant F1 chromosome flats homologous chromosomes in the first division allow genetic recombination and thus give a large genetic variability gametes products.
  • the haploid plants H, (giving the doubled haploids HD) and the DH doubling plants derived from these gametes and obtained by the method according to the present invention, are genetically different from each other, thus giving the breeder greater choice.
  • the male and female plant material is chosen according to the desired characteristics.
  • the male reproductive plant material harvested and used mainly consists of flowers of a selected male plant but may also be stamens or gametophytes or directly male gametes or pollen grains.
  • the flowers for example are advantageously harvested on the male mother plant at the time of anthesis.
  • One or two male flowers being generally used for the fertilization of each female flower.
  • the male plants selected according to the invention can be for example those whose genotypes are in the group comprising: JIB, JEDIDA, ESKEND ARENI. These male plants are particularly interesting because they are good polinizers, namely they emit good amounts of pollen.
  • the time of harvest of the male parent's reproductive plant material, preferably flowers, may be important. This moment is chosen according to the development of the plant whose flowers come from the season ... Thus, it is better to harvest them during anthesis and to fertilize the female flowers before their opening.
  • the irradiation stage b) of the male parent's reproductive plant material ie male gametophytes, such as pollen, is important in the success of the H plant production process (giving HD doubled haploids). and / or DH plants.
  • the rays used are preferably gamma rays, but X-rays can also be used.
  • the irradiation is carried out using known and appropriate means such as gamma rays for example for a period of time sufficient for the reproductive material of the male parent to receive the prescribed dose on closed jars, preferably containing ten to five. twelve male flowers per jar.
  • the irradiation time is preferably between 20 minutes and one and a half hours.
  • the selected conditions of irradiation make it possible to obtain very satisfactory results, namely after pollination with the male reproductive plant material, a sufficient production of fruits, which contain a sufficient number of embryos which lead to plants. most of which possess the desired characteristics. Indeed, the majority of embryos and therefore plants produced by the method according to the invention are H and / or DH, haploids giving doubled haploids.
  • step c) of the process according to the invention it may be advantageous to germinate a few irradiated pollen grains in a suitable medium, for example in a medium called MP 15 (15% sucrose solution). , 100 mg / LH 3 BO 3 and 700 mg / L CaCl 2 , 2H 2 O), in order to verify that the irradiated pollen is still able to germinate. After a given germination time, for example from 15 to 60 min, the pollen grains are then observed with a magnifying glass in order to estimate the percentages of seed grains and broken grains.
  • a suitable medium for example in a medium called MP 15 (15% sucrose solution).
  • the reproductive material of the female parent used will have a genotype chosen according to the plant to be created.
  • the female plants retained according to the invention can be for example those whose genotypes are in the genotype group comprising VNOO1, VG06, VN002, Odessa, VG 14, Tosca and VE 547 can also be used.
  • Step c) of the process according to the invention essentially consists of the pollination of the reproductive material of the female parent with the reproductive material of the male parent.
  • Pollination of the reproductive plant material of the female parent can be done in a variety of ways.
  • the preferred techniques will be pollination by the "flower-in-flower” technique where the entire surface of the stigmas (end of the pistils) is covered with the reproductive material of the male parent but also the pollination with the brush.
  • a flower or reproductive material of the female parent is “fertilized” by a flower or reproductive material of the male parent.
  • brush a brush is used to transport the pollen grains from the male parent's reproductive material to one or more flowers or reproductive material of the female parent.
  • the days following pollination the fruit formation (fruit set) is observed and flowers not forming fruit are eliminated.
  • the length of time after which the fruits are harvested depends on the family, genus and species concerned.
  • the fruits whose maturity is suitable for the extraction of embryos are harvested.
  • the morphology of the fruit and its appearance makes it possible to evaluate the opportune moment to pick the fruit.
  • the fruits are harvested then preferably washed with water possibly with a detergent (eg Marseille soap), rinsed, dried and possibly cleaned again with alcohol.
  • a detergent eg Marseille soap
  • Step e) The fruits are then opened to extract the seeds, preferably in sterile conditions, for example under laminar flow.
  • the seeds are then opened to extract the embryos.
  • the extracted embryos are cultured on a suitable medium, of the type described in the following examples, with S2P medium being preferred (see Table 8).
  • Embryos for example, are grown in the dark, one to two nights, at 20-25 ° C, and then they are placed in bright light for about 10 hours to 20 hours, eg about 16 hours at the same temperature.
  • Embryos can be harvested at various stages of embryonic development and certain stages can influence the yield of the process according to the invention. Indeed, the embryos can be harvested at the embryonic stage globular, heart, torpedo or cotylédonnaire.
  • the embryos can be transplanted regularly, preferably every other day or so, to the same medium or to a different culture medium adapted to their stage of development, in particular as soon as the young leaves and small roots appear.
  • the seedlings are well developed, they are advantageously transplanted to another suitable culture medium, the composition of which is eg that given in the examples which follow (see Tables 8 and 9).
  • a step of selection of the H and / or DH haploid plants produced according to the method is carried out: h 1) by flow cytometry and / or h 2) using a molecular marker.
  • This selection h1 and / or h2 is advantageously carried out when the plant resulting from gynogenesis has some leaves, a sample of the plant, preferably of leaf, being taken and analyzed following this selection step h) of the process.
  • These selections hl) and / or 1x2) which can be implemented, simultaneously or not, in any order, or even intermittently, allow in particular to determine the ploidy level of the plants produced.
  • haploid H plants having n chromosomes
  • HD doubled haploids
  • flow cytometry makes it possible to make a reliable distinction between 2n plants and n plants, but it is not possible by this technique to differentiate DH doubling plants (identical 2n). , homozygotes) and diploid 2n heterozygous plants resulting from a lack of gametic reduction or fertilization by the pollen grain. During this selection, plants 2 n and plants n will be preserved.
  • the 2n plants will be further analyzed with molecular markers (step h2 below) to make a finer selection on homozygous or essentially homozygous 2n dihaploid plants and heterozygous diploid 2n plants.
  • haploid plants (chimerical or not) will be conserved for analysis also using molecular markers and then to obtain doubled haploids homozygous or essentially homozygous after doubling the chromosomal stock.
  • Selection h2) by the use of a molecular marker offers, in turn, this possibility of discrimination between the different types of plants 2n exposed above. This saves time, space and cost very important. In addition, this selection method also offers a greater analytical finesse since it also makes it possible to determine whether the haploid H or DH doubling plants contain or not the genome of the male parent, and this in a reliable and fast manner. Thus, the method of selection by the use of a molecular marker makes it possible to determine the state of homozygosity of the plant in question but also its level of ploidy.
  • the selection h2) by the use of a molecular marker is preferably a step h2) for selecting plants H and / or DH comprising:
  • a specific molecular marker of the given allele (s) contained in the genetic material of the irradiated male parent to select from the plants obtained at the end of step g) plants which are free of genetic material of the irradiated male parent or which have an insufficient quantity to cause in the offspring of said selected plants, a disjunction of a phenotypic and / or genotypic character;
  • a specific molecular marker of the given allele (s) contained in the genetic material of the hybrid female parent this marker (s) making it possible to determine the homozygous / heterozygous state, optionally the level of ploidy, plants to be selected, that is to say the plants obtained at the end of step g), this marker (s) being used to select the homozygous plants or essentially homozygous, in particular the DH plants, being clearly specified that at least one marker used for each analysis may be a single marker, in a single analysis, in particular in the context of a codominant marker making it possible to immediately discriminate between several forms allelic of the same genetic marker.
  • a specific molecular marker of at least two alleles is used.
  • This molecular marker specific for allele (s) of the genetic material of the irradiated male parent and / or one, preferably two, given alleles contained in the genetic material of the hybrid female parent is preferentially a SSR microsatellite marker.
  • SSR microsatellite marker serves, on the one hand, to identify the plants which have a part of male genetic material in their genome and, on the other hand, to differentiate the plants homozygotes of heterozygous plants.
  • the more molecular markers are used the more the level of homozygosity is defined. It is possible that at a given locus, the plant appears homozygous with the molecular markers used but is not homozygous (or essentially homozygous) on all of its genes.
  • molecular markers preferably at least 3, especially 5 and more particularly 6 to reliably select DH plants.
  • the said markers are selected according to the genomes of the parents used in gynogenesis. These molecular markers make it possible to differentiate between the homozygous H and / or DH doubling haploid plants that are derived from female gametes and the diploid (2n) heterozygous plants resulting from a gametic non-reduction, resulting from fertilization, or recombinant partial fertilization with irradiated pollen.
  • the markers are advantageously chosen so as to identify different alleles between the female plants giving the female gametes and the male plants giving the pollen which is irradiated.
  • a plant resulting from partial fertilization has the alleles from the two parent plants (male and female) whereas a haploid H or DH diploid only has alleles from the female mother plant. Plants resulting from gynogenesis induced by irradiated pollen and having in their genome alleles of the male parent thus testifying to "fertilization" are therefore discarded.
  • a particular case concerns haploid chimeras since the latter have alleles from the female and male plants, but each allele is present in only one copy.
  • This molecular marker (s) can also be used to sort and discard diploid plants derived from unreduced gametes and identical to the parent plant, because they are heterozygous for given and determined alleles of the material.
  • female used mother plant
  • the molecular marker (s) is (are) chosen so as to identify alleles that are in the heterozygous state in female plants and therefore also in plants derived from unresolved gametes but which are found either in the homozygous state for doubled haploid plants or in a single copy in haploid plants.
  • To schematize if the female plant carries alleles A and B, all regenerated plants bearing the combination of AB alleles are considered to be from an unreduced gamete. Again, only plants with only the A allele or plants with only the B allele are selected.
  • the microsatellite or SSR markers are used to determine, in the plants obtained and tested, both the presence of the genome of the male parent and the homozygous / heterozygous state. They can also be used to determine the ploidy level of the plants obtained and tested.
  • the molecular marker (s) used (s) for the implementation of the method according to the invention is (are) a marker (s) ( s) microsatellite (s).
  • a marker (s) ( s) microsatellite (s) is defined by a given nucleotide sequence of a given size, amplified by PCR through a specific pair of primers (a sense primer and an antisense primer).
  • the molecular marker (s) that can be used in the present invention are the following eight markers CMAGN73, CMBR153, CMBR22, CMMP73, CUCNITRA, FAD2, PATL1, TJ3.
  • each of these markers is defined by a pair of nucleotide primers of given sequences (see SEQ ID No. 1 to 16 below). It is obvious that for this step h), it is conceivable to use molecular markers (microsatellites or not) other than these eight markers mentioned above.
  • the markers defined by the primer pairs SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 4 will be used; SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 6; SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 0 ; SEQ ID N 0: 11 and SEQ ID No. 12 and / or SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14.
  • sequences SEQ ID No. 1 to 16 are particularly interesting for the implementation of the method according to the invention.
  • the invention also targets a molecular marker that can be used in the method according to the invention, of the microsatellite (SSR) type, and advantageously chosen from the group of microsatellite markers defined by the pairs of primers. of attached nucleotide sequences
  • the invention preferably relates to a molecular marker that can be used in the process according to the invention, of the microsatellite type, and advantageously chosen from the microsatellite group defined by the pairs of nucleotide sequence primer attachments
  • SEQ ID N 0 3 to 14 To increase the reliability of the selection, it is preferable to use a combination of two molecular markers according to the invention, namely preferably microsatellite markers. Even more preferably according to the invention, use is made of a combination of three microsatellite molecular markers, particularly of four microsatellite molecular markers, and most preferably a combination of five microsatellite markers is chosen. It can obviously be used more than five molecular markers if necessary. For these combinations of microsatellite markers used, the sequences of the primer pairs defining the marker (s) are chosen from the sequences SEQ ID Nos. 1 to 16, preferably SEQ ID Nos. 3 to 14.
  • microsatellite markers of SEQ ID No. 1 to 16 that can be used are in particular those of the family Cucurbitaceae, preferably of the genus Cucurbita and more preferably of the species cucurbita pepo.
  • the microsatellite molecular marker (s) (SSR) of the zucchini according to the invention is (are) chosen according to the genotypes of plants for gynogenesis induced by irradiated pollen.
  • This microsatellite molecular marker is (are) defined by its nucleotide sequence, which will be detected by chain reaction amplification (PCR) using primers. specific whose sequences SEQ ID 1 to 16 are detailed below in the examples. These primers may be cloned polynucleotide fragments or chemically synthesized oligonucleotides. The markers of sequences SEQ ID Nos. 3 to 14 will preferably be used.
  • Step i) ⁇ humomorphic depression .
  • the plants selected and / or obtained at the end of step h are the haploid plants H, and DH dihaploids.
  • H plants give doubled DH plants when the doubling of the chromosomal stock is spontaneous or doubled haploid HD when the doubling of the chromosomal stock is done by chemical or physical treatment, preferably using colchicine.
  • the method according to the invention therefore preferably comprises a step i) of doubling the chromosomal stock of haploid plants H, the step of doubling the stock of chromosomes being preferably carried out using colchicine.
  • HD plants already 2n have been grown in greenhouses while the haploid plants H are preferably "colchicinated” in vitro then transplanted onto appropriate medium, then rooted and taken out of the earth under glass.
  • This technique of doubling the chromosome stock using colchicine advantageously comprises the following successive steps: 1- Isolate the main apex of the plant as well as the axillary buds if they exist,
  • the present invention extends beyond the production of H, HD and DH plants by gynogenesis induced by irradiated pollen. It proposes a new method of optimizing this production of plants.
  • This method overcomes the problem of multifactorial variability and generalizes gynogenesis with pollen irradiation to many plant species.
  • This method is based on a preliminary step of determining the appropriate dose (s) of irradiation (s) to increase the yields of plants, taking into account multiple factors such as the plant species, male and female parent genotypes, climatic and physiological conditions, timing of fruit harvesting, level of growth of embryos collected for culture.
  • This preliminary step essentially consists in implementing, for each irradiation dose tested, a step h ') of selecting the plants H and / or DH, h') being similar to h) as defined above, to establish then the yields in corresponding plants and ultimately determine the dose or doses with the best yields.
  • other results such as: the percentage of fruits obtained, the percentage of seeds obtained, the percentage of embryos and plants H, HD and DH, can also be apprehended in this preliminary step for one dose. given irradiation.
  • the present invention relates to a process for producing haploid H, haploid doubled HD and / or DH doubled haploid plants, the HD and DH being homozygous or substantially homozygous, by gynogenesis with irradiation of the male parent reproductive material, characterized in that it comprises a preliminary step of determining the appropriate dose (s) of irradiation (s) to increase the yields of said plants according to given multiple factors and preferably chosen from the plant species, the genotypes of the parent male and female parent, climatic conditions and physiological, the time of fruit harvest, the level of growth of embryos collected for cultivation; the level of development of the embryos placed in culture, this preliminary stage consisting in: i) testing, for a given factor, different doses of irradiation on the reproductive material of the male parent, ii) to be used, for each dose of irradiation tested, a step h ') for selecting plants H and / or DH, said step h' comprising:
  • a molecular marker specific for an allele preferably two specific alleles specific to the genetic material of the hybrid female parent used in gynogenesis, this marker making it possible to determine the homozygous / heterozygous state, possibly the level of ploidy, plants to be selected, that is to say plants obtained at the end of gynogenesis, this marker being used to select homozygous or essentially homozygous plants, in particular DH plants; (iii) to count, for each irradiation dose tested, haploid H plants, or
  • step h comprises the use of markers and the order of use of the specific molecular marker (s) of the allele (s) of the male genetic material and that (those) specific (s) of allele (s) of the female material does not matter.
  • I and II are not necessarily carried out in a precise order and may be concomitant (I and II together) or successive (I then II or II and I).
  • the invention also relates to the plants H and DH themselves produced by the method as defined above, knowing that the term "plant” encompasses here, all stages of development: embryos, seedling, adult plant.
  • this relates to the haploid embryos H and dihaploid DH obtained, as intermediates, by the method according to the invention as defined above and the plants regenerated from said embryos.
  • the invention also relates to the HD plants and seedlings obtained by the process as defined above with the colchicination step i).
  • the invention also relates to the offspring as well as the seeds and seeds derived from the plants obtained by the process as defined above.
  • the present application also relates to the progeny of the plants obtained by the method as defined above, said progeny being obtained by crossing said plants (HD or DH) between them or by crossing between a plant HD or DH obtained by the method as defined above and a plant derived from a line or resulting from repeated self-fertilization.
  • the invention also relates to the plant seeds obtained by the process as defined above or from the embryos as defined above, as well as from plants derived from the offspring as defined above.
  • the experiments are carried out in a greenhouse whose night temperature is 15 ° C. and 25 ° C. day.
  • the plants are conducted in a soil bag (2 plants per bag for females and 3 plants per bag for males), trellised and irrigated drip.
  • the greenhouse is shaded, ventilated and the regulation of pests is done by integrated biological protection.
  • the plant biological material used is as follows: Female plants: 2 genotypes.
  • VN001 66 Plants
  • VG06 66 plants Male plants: 1 genotype
  • JIB 90 plants The plants are labeled with a number and the name of their genotype.
  • Stage a The day before the irradiation (or ionization), all the male and female plants are controlled and only the flowers that will be used for the pollination are preserved. The number of male flowers at the correct stage (the tip of the corolla begins to turn yellow) is counted to know approximately the number of pollinations that will be made for each dose of irradiation. The same is true for the female flowers at the right stage (the tip of the corolla begins to turn yellow). Witnesses are prepared:
  • the male flowers are collected very early in the morning (5:30 to 6:00).
  • the pollen is germinated in a drop of 45 ⁇ L of medium at 15% sucrose, 100 mg / L of H 3 BO 3 and 700 mg / L of CaCl 2 , 2H 2 O.
  • the drops are deposited on an EPOXY slide and left for 45 minutes in a petri dish whose atmosphere is saturated with water, at 26 ° C.
  • the reproductive material of the male parent is used for pollination.
  • a female flower or reproductive material of the female parent is fertilized by a male flower or reproductive material of the male parent.
  • Step d) The fruits will be harvested 4 to 5 weeks after pollination and labeled according to their genotype, treatment of male flowers or type of control.
  • the fruits are harvested, preferably in the morning.
  • Step e Each fruit is washed with water and Marseille soap, rinsed and dried.
  • the seeds are recovered with a spoon, freed from the flesh with a pincer and a scalpel and counted.
  • the seeds are stirred all night.
  • the round jar Under laminar flow, the round jar is emptied into a sterile high jar through a sterile funnel and then rinsed with sterile water.
  • the seeds are opened one by one under the binocular magnifying glass using a pliers and a scalpel.
  • the instruments are sterilized regularly to avoid any risk of contamination.
  • the embryo is deposited on a SIC culture medium, the composition of which is detailed in Tables 8 and 9 below, in Petri dishes 60x15, 4 embryos per box of
  • the embryos are cultured on the culture medium by the PPM (plant preservative mixture) marketed by Kalys®.
  • Petri dishes are monitored regularly. Embryos are transplanted if there is contamination by a bacterium or a fungus.
  • Embryos are transplanted every 15 days in petri dishes on fresh medium until they are sufficiently developed. As soon as the young leaves and small roots appear, the embryos are transferred to medium in S3P tubes (see composition in Tables 8 and 9).
  • Step h1) A sample of each plant is taken and the ploidy level is analyzed by flow cytometry according to the protocols developed by de Laat et al. in Theo. Appl. Genet, 1984, 67: 463-467 and in Plant Breeding, 1987, 99: 303-307. Plants with indeterminate, abnormal ploidy are discarded and plants with n chromosomes are distinguished from plants with 2n chromosomes.
  • the SSR marker (s) is (are) chosen from among the SSRs defined by the primer pairs of sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 16 below.
  • the marker FAD2 is defined by the pairs of primers SEQ ID No. 11 and SEQ ID No. 12.
  • the PCR reaction is carried out in a reaction volume of 5 .mu.l consisting of half of 5 .mu.l of diluted DNA, 0.85.
  • PCR reaction consists of several amplification cycles described as follows: 1 step of 5 minutes at 94 ° C., 10 cycles at 94 ° C. for 15 seconds then 57 degrees for 15 seconds and finally 72 ° C. for 30 seconds, then 30 cycles at 94 ° C. for 15 seconds then 52 degrees for 15 seconds and finally 72 0 C for 30 seconds, a final elongation performed at 72 0 C for 7 minutes.
  • SSR microsatellite molecular markers
  • CMAGN73 marker defined by the following pair of nucleotide sequence primers:
  • CMBR1 marker 53 defined by the following pair of nucleotide sequence primers:
  • CMBR22 marker defined by the following pair of nucleotide sequence primers:
  • CCAAAACGACCAAATGTTCC 3 ' (SEQ ID NO: 5) is the forward primer and 3' ATACAGACACGCCTTCCACC 5 '(SEQ ID NO: 6) or the antisense primer.
  • CMMP73 marker defined by the following pair of nucleotide sequence primers:
  • Marker CUCNITRA defined by the pair of the following nucleotide sequence primers: 5 'CAAACCATAACTTCCAAGG 3' (SEQ ID NO: 9) is the forward primer and 3 'GGAGATCGACGAATTTGA 5' (SEQ ID N 0 10) or the primer anti -meaning.
  • Marker FAD2 defined by the following pair of nucleotide sequence primers: 5 'CACGAGCAGAGAGATAATAAA 3' (SEO ID N 0 1 1) is the meaning primer and
  • PATL1 marker defined by the following pair of nucleotide sequence primer pairs: 5 'TACTCCGCCCTCTCTCTC 3' (SEQ ID NO : 13), that is, the sense primer and
  • Marker TJ3 defined by the following pair of nucleotide sequence primer pairs: 5 'TGGGCCTACGCTACAAACTT 3' (SEQ ID NO : 15), that is, the sense primer and
  • the plant is fertilized between the male plant material and the female plant material or if it has not undergone gametic reduction, it is removed after analysis with SSR molecular markers but if it is a dihaploid plant, it is preserved.
  • Step i) Doubling the chromosomal stock (colchicine treatment): 1- Isolate the main apex and the axillary buds if there are any (cuttings),
  • VN001 Fruit number VN001 to
  • the table shows that the 200 Gy dose used for pollen irradiation is too high to obtain, with the VG06 and VNOO1 genotypes, developing embryos.
  • the dose of 175 Gy is better adapted because it allows to produce not only more fruits with the two female genotypes tested (VG06 and VNOO1) but also more embryos developing (24 for VG06 and 4 for VNOOl).
  • VN001 hybrid plants used as a female in the gynogenesis method of plant production with maternal parent reproductive irradiation have a 171 base pair allele for the FAD2 marker whereas the JIB plants used as a male plant have a 169 allele. base pairs for that same marker.
  • the allele of the CMAGN73 marker is 128 base pairs for VN001, while it is 132 for JIB and the Cucnitra marker allele is 160 base pairs for VNOO1, whereas it is 165 for JIB.
  • Table 3 shows the molecular analysis of plants derived from VN001 according to the method of the present invention and indicates, for each plant tested, the presence or absence of genetic material of the male parent.
  • This table 3 shows that the FAD2, CMAGN73 and CUCNITRA markers make it possible to identify the plants having the male genome.
  • FAD2 the primers (SEQ ID NO : 1 and 12 defined above) specific for the molecular marker FAD2
  • the analysis of this PCR reveals for the plants 1, 3 and 4 the presence of the allele of 169 pairs of specific bases of JIB male reproductive material. Plants 1, 3 and 4 therefore have a male genome in their genome.
  • VN001 hybrid plants used as a female in the male parent reproductive material gynogenesis method of irradiation have a 130 base pair allele and a 138 base pair allele for the TJ3 marker.
  • the alleles of the CMBRl 53 marker are 166 and 182 base pairs for VN001, and those of PLAT1 are 195 and 204 base pairs.
  • Table 4 shows the molecular analysis of the plants derived from VNOO1 according to the method of the present invention and indicates, for each plant tested, the presence of one or more alleles of each marker.
  • Hybrid VG06 plants used as a female in the plant production process by gynogenesis with maternal parent reproductive irradiation have a 171 base pair allele for the FAD2 marker whereas the JIB plants used as a male plant have a 169 allele. base pairs for that same marker.
  • the 1 * allele of the Cucnitra marker is 160 for VN001, while it is 165 for JIB and the CMAGN73 marker allele is 128 base pairs for VG06, while it is 132 for JIB.
  • Table 5 shows the molecular analysis of plants derived from VG06 according to the method of the present invention and indicates, for each plant tested, the presence or absence of genetic material of the male parent.
  • Hybrid VG06 plants used as a female in the maternal parent reproductive material gynogenesis method of irradiation have a 130 base pair allele and a 138 base pair allele for the TJ3 marker.
  • the alleles of the CMBR1 marker 53 are 166 and 182 base pairs for VG06, and those of PLAT1 are 195 and 204 base pairs.
  • Table 6 shows the molecular analysis of plants derived from VG06 according to the method of the present invention and indicates, for each plant tested, the presence of one or more alleles of each marker.
  • Table 6 shows that with markers TJ3, CMBR1 53 and PALT1, only plants 4 and 6 are homozygous, the other plants appearing heterozygous with these molecular markers.
  • compositions of Table 9 - Medium TZ4 without sucrose or agar:
  • Macro element CP in mg -1
  • Micro element CP in mg -1
  • Macro element MS in mg. L ⁇ ⁇

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Abstract

L'invention concerne un procédé de production de plantes haploïdes H, haploïdes doublées HD et/ou dihaploïdes DH, les HD et DH étant homozygotes ou essentiellement homozygotes, ce procédé étant du type de ceux relevant de la technique de gynogenèse induite par du pollen irradié. Ce procédé comprend une étape d'irradiation du matériel reproducteur du parent mâle à une dose comprise entre 160 et 190 Gamma Ray et/ou une étape de sélection des plantes haploïdes H et/ou DH par utilisation de marqueur(s) moléculaire(s). L'invention concerne également un procédé de production de plantes haploïdes, haploïdes doublées et/ou dihaploïdes homozygotes comprenant une étape de détermination de la (ou des) dose(s) d'irradiation adéquate(s) pour augmenter les rendements desdites plantes en fonction de facteurs multiples donnés comme l'espèce végétale, les génotypes du parent mâle et du parent femelle, les conditions climatiques et physiologiques, le moment de la récolte des fruits, le niveau de croissance des embryons recueillis en vue de leur culture, le niveau de développement des embryons mis en culture. Par ailleurs, l'invention concerne le(s) marqueur(s) moléculaire(s) utilisé(s) dans l'étape de sélection ainsi que les embryons haploïdes, les embryons dihaploïdes obtenus par le procédé de l'invention, la descendance et les semences des plantes obtenues par le procédé de l'invention.

Description

PROCEDE DE PRODUCTION DE PLANTES HAPLOÏDES, HAPLOÏDES DOUBLEES ET/OU DIHAPLOÏDES, PAR GYNOGENESE
Le domaine de l'invention est celui de la sélection ou l'amélioration végétale, à savoir la production de plantes aussi bien sous forme d'embryons que dans tout autre stade, notamment de la plantule à la plante adulte.
Plus précisément, la sélection ou l'amélioration végétale selon la présente invention signifie l'obtention d'une plante haploïde ou diploïde homozygote ou essentiellement homozygote ayant une descendance stable quant à ses caractères phénotypiques et/ou génotypiques. En d'autres termes, on aboutit pour une telle plante à une fixation de son génome avec un nombre réduit de générations (par exemple une ou deux). Plus précisément encore, la présente invention se rapporte à un nouveau procédé de production de plantes (e.g. embryons, plantules, plantes adultes), Haploïdes (H), Haploïdes Doublées (HD) et/ou DiHaploïde (DH), homozygotes ou essentiellement homozygotes, ce procédé étant du type de ceux relevant de la technique de gynogenèse avantageusement associée à une irradiation du pollen. Les plantes concernées sont par exemple les courgettes.
Les systèmes de création variétale, à savoir la création de nouvelles plantes adaptées aux besoins spécifiques des agriculteurs et producteurs, se sont accélérés depuis le début du 20ème siècle. L'un des changements les plus radicaux fut la mise au point des hybrides, aussi commercialement appelés hybrides Fl, initialement dans le maïs, et l'utilisation du phénomène d'hétérosis qui correspond à l'augmentation des capacités ou de la vigueur d'un hybride pour de nombreux caractères (vigueur, rendement, résistance aux maladies et à la verse, précocité) sur la moyenne des deux parents ou sur le meilleur des deux parents. Un autre changement concerne l'utilisation des techniques de culture in vitro des plantes basées sur leur totipotence.
La création de plantes hybrides Fl, permettant notamment de réunir dans la plante hybride Fl les caractères dominants de ses parents, fut rapidement étendue du maïs à d'autres espèces comme la tomate, les poivrons, les aubergines. En effet, outre la vigueur hybride présente chez certaines espèces, l'obtention d'hybrides Fl permet aussi une amélioration des capacités d'homéostasie de la plante (stabilité de la plante et de l'expression de ses caractères dans différents environnements), et la possibilité de cumuler des gènes d'intérêts. Toutefois, la création de plantes hybrides Fl implique la création de lignées parentales relativement homozygotes. Une fois croisées, ces lignées parentales permettent l'obtention de l'hybride Fl. Tant que la pureté génétique des lignées parentales est maintenue, les hybrides F 1 peuvent être obtenus de manière répétée.
Cette recherche d'homozygotie des lignées parentales n'est pas uniquement développée pour l'obtention des plantes hybrides Fl. Similairement, lors du développement de nouvelles plantes commercialisées sous forme de variétés population (laitue, haricot, mâche, etc.), la création de cultivars (ou variétés) relativement homozygotes est devenue un impératif. Les exigences d'homogénéités du produit pour les agriculteurs et pour la commercialisation (critères d'homogénéité et de stabilité des nouveaux cultivars inscrits au catalogue), ainsi que la mécanisation et la précision croissante des techniques de culture et de production entraînent un besoin de plantes de plus en plus homogènes dans l'expression de leurs caractères.
Le sélectionneur se rapproche traditionnellement du niveau d'homozygotie recherchée en auto fécondant les plantes les plus prometteuses sur plusieurs générations, sélectionnant celles qui présentent les caractères recherchés, homogénéisant progressivement ainsi le génome des plantes d'une génération à l'autre.
Les nouvelles plantes de courgettes développées par les sélectionneurs sont soit des cultivars autogames, soit des hybrides Fl . Dans les deux cas, la recherche d'homogénéité du cultivar et/ou des lignées parentales de l'hybride Fl est l'un des buts du programme de sélection.
Il est à rappeler que, pour initier le cycle sexuel des plantes, un processus de réduction du nombre des chromosomes (méïose) est nécessaire pour donner naissance à des cellules gamétiques ayant un nombre haploïde de chromosomes (n). Dans les plantes à fleurs, la reproduction sexuée implique une double fécondation. Le grain de pollen produit deux noyaux gamétiques (n) mâles ou noyaux reproducteurs. Un noyau mâle fusionne avec un ovule (n) pour former un zygote (2n) qui produit l'embryon en restaurant le nombre de chromosomes somatiques (2n). Un autre noyau mâle (n) s'unit avec les noyaux polaires du sac embryonnaire haploïdes, pour former une cellule triploïde (3n). Dans certains cas, la formation du zygote ne se produit pas, mais des divisions cellulaires de l'ovule sont toutefois initiées, aboutissant à un embryon haploïde capable de donner naissance à une plantule dont le génome haploïde est entièrement d'origine maternelle (Sarkar and Coe, Genetics, 1966, vol 54, 453-464). Les plantes haploïdes existent en faible nombre dans la nature et sont stériles. La découverte, au début des années 1920, des plantes haploïdes viables et de la possibilité de doubler leur stock chromosomique a suscité de nombreuses recherches. En effet, ces plantes haploïdes sont intéressantes non seulement dans le domaine de la génétique mais également pour l'amélioration des plantes car, après le doublement chromosomique (spontané ou non), les informations génétiques sont identiques sur les deux chromosomes de chaque paire. De cette façon, l'information génétique est fixée et les haploïdes doublés permettent d'accélérer les processus de sélection.
En 1964, Guha et Maheshwari (Guha and Maheshwari, Nature, 1964, 204, 497) découvrent que des plantes peuvent être régénérées à partir de cellules haploïdes lors de la culture de grains de pollen.
Dès lors, de nombreuses recherches ont été lancées sur la production de plantes haploïdes de diverses espèces, en utilisant des techniques de cultures in vitro de gamétophytes. Les deux principales techniques de production d'embryons et de plantes haploïdes (haploïdisation) par culture in vitro de gamétophytes sont l'androgenèse et la gynogenèse. Dans l'androgenèse, des gamétophytes mâles immatures sont mis en culture sur un milieu synthétique afin d'obtenir des embryons haploïdes qui, ensuite, se développent en plantes entières. Les résultats varient avec le génotype, mais aussi avec les protocoles utilisés. Dans la gynogenèse, ce sont les gamétophytes femelles matures (ovaires ou ovules) qui sont mis en culture.
Les deux techniques peuvent être utilisées sur la même espèce, sachant que l'une d'elles est plus avantageuse pour certaines espèces, tandis que l'autre technique est plus adaptée à d'autres espèces.
Certains auteurs citent aussi la production d'embryons et de plantes haploïdes par l'utilisation d'agents chimiques ou physiques. Le principe de cette technique est de provoquer le développement de l'ovule non fécondé sur la plante {in situ). Si des tentatives par chocs thermiques, rayons X ou des substances chimiques n'ont abouti qu'à de piètres résultats, l'utilisation de pollen irradié a donné, dans certaines espèces comme le melon, des résultats non directement applicables à d'autres espèces.
La majorité des plantes induites par ces techniques sont des plantes haploïdes, mais d'autres plantes avec des niveaux de ploïdies variables peuvent être obtenues. Si les aneuploïdes ou les tétraploïdes peuvent ne présenter que des intérêts mineurs dans des programmes d'amélioration des plantes, les diploïdes spontanés (dihaploïdes DH) sont eux très recherchés puisque le doublement spontané de leur stock chromosomique durant les premières phases de la culture in vitro les rend fertiles. Ces plantes homozygotes sont directement utilisables par les sélectionneurs, ce qui représente un énorme avantage à plusieurs niveaux (temps, espace, coût...).
Les plantes Haploïdes (H), qui sont obtenues par ces diverses techniques et qui n'ont pas spontanément doublé leur stock chromosomique, doivent ensuite subir une étape supplémentaire pour les rendre diploïdes (2n) ou Haploïdes Doublés (HD). Ceci peut se faire au moyen de divers produits chimiques tels que la colchicine (alcaloïde qui permet de doublement d'un stock de chromosomes). Les haploïdes doublés HD ainsi que les dihaploïdes DH (résultats d'une diploïdisation spontanée), sont des individus homozygotes, utilisables notamment directement comme cultivars homogènes (variétés populations) ou comme lignées parentales de variétés hybrides. En effet, ces plantes HD et DH portent, sous forme doublée, l'information génétique d'un seul jeu (n) de chromosomes, celui du gamète femelle dont ils sont originellement issus.
Ainsi, ces techniques de création de plantes in vitro permettent non seulement de gagner du temps mais aussi d'aboutir à une meilleure homogénéité génétique : le génome est stabilisé (homozygote) en une seule génération au lieu d'approcher l'homozygotie génomique à la suite de multiples générations d'autofécondation. Elles permettent aussi d'améliorer le programme de sélection puisqu'elles mettent en exergue les caractéristiques récessives de la plante ainsi créée. L'utilisation des haploïdes doublés HD et des dihaploïdes DH est donc un outil très intéressant. Son usage s'est répandu pour certaines espèces : l'androgenèse est utilisée chez les plantes du genre Brassica (Keller et al, in K.Giles, S. Sen (eds.), Plant CeIl Culture in Crop Improvment, 1984, 169-183. Plénum Pub. Corp., New York), la gynogenèse pour le concombre (brevet européen EP 0374755) et la betterave sucrière (Hosemans and Bossoutrot, Z. Pflanzenzuecht, 1983, 91, 74-77), le pollen irradié chez le melon (Sauton et Dumas de Vaulx, Agronomie 7, 1987, 7 (2), 141- 148).
En conséquence, des plantes pour le développement desquelles des techniques d'haploïdisation in vitro ont été utilisées, sont aujourd'hui disponibles commercialement dans diverses espèces et inscrites au catalogue officiel.
Toutefois, malgré ces quelques variétés commerciales, les rendements des différents procédés d'haploïdisation restent encore trop dépendants de multiples facteurs inconnus ou imparfaitement maitrisés (génotype, culture des plantes mères, conditions de réalisation de l'haploïdisation, etc.) et parfois encore trop faibles, dans de nombreuses espèces, pour être intégrés de manière routinière dans les procédés de sélection actuels. En ce qui concerne les courgettes Cucurbita pepo, seuls quelques résultats fragmentaires sont connus à ce jour et aucun n'indique comment produire suffisamment d'embryons haploïdes H (donnant ensuite les haploïdes doublés HD), ou d'embryons dihaploïdes DH pour alimenter un programme d'amélioration végétale.
La première mention de la culture in vitro d'ovules non fécondés de Cucurbita pepo est rapportée par Dumas de Vaux et Chambonnet en 1986 (Dumas and Chambonnet, Genetic Manipulation in Plant Breeding, 1986, 285). Les ovules sont extraits des ovaires un ou deux jours avant la floraison ou le matin même. Dans les deux premiers cas, les fleurs ne sont pas pollinisées, dans le troisième, elles sont pollinisées mais non fécondées. Les ovules sont placés en boites de Pétri sur un milieu contenant des macro et des micronutriments, ainsi que des vitamines, de l'acide 2,4 dichlorophénoxyacétique (2,4 D) et de la kinétine. Les auteurs obtiennent leur meilleur rendement, soit 4,3 embryons pour 100 ovules cultivés, lorsque les ovaires sont prélevés un jour avant la floraison. Toutefois, ils rencontrent des difficultés pour obtenir des plantes se développant normalement. L'origine des plantes est analysée lors d'une étape ultérieure d' autopollinisation des plantes diploïdes fertiles et d'un examen phénotypique de la descendance.
Plus récemment s'agissant toujours des courgettes Cucurbita pepo, Shalaby (Shalaby, Scientia Horticulturae, 2007, 1 15, 1-6) a analysé l'influence du génotype, de la position des fleurs femelles sur la tige, de la température et de la concentration de saccharose lors de la gynogenèse. Les plantes haploïdes régénérées sont traitées à la colchicine afin d'obtenir des haploïdes doublés. Les auteurs concluent que le génotype utilisé influe grandement sur les possibilités d'utiliser cette technique de manière routinière. Le génotype Yellow Bik ne produit ainsi aucun embryon par gynogenèse alors qu'il répond à l'androgenèse.
La conclusion de cet article quant à l'influence du génotype indique clairement que les techniques d'androgenèse et de gynogenèse ne sont pas aujourd'hui satisfaisantes pour être utilisées de manière étendue et routinière dans un programme d'amélioration de la courgette Cucurbita pepo.
Il a été proposé d'irradier le pollen dans un procédé de gynogenèse induite pour l'obtention de plantes haploïdes H, et/ou de plantes dihaploïdes DH, les plantes haploïdes H donnant ensuite des plantes haploïdes doublés HD. L'irradiation du grain de pollen lui fait perdre son pouvoir fécondant (l'ADN des gamètes est endommagé par les radiations) mais il conserve son pouvoir germinatif, pouvant ainsi induire la division de l'oosphère et son développement en embryon. Cette technique de gynogenèse avec irradiation du pollen est utilisée notamment chez le melon (Cucumis melo) (Sauton, Cinquantenaire de la Culture in vitro, 24-25 octobre 1989) où la majeure partie des génotypes est capable de produire des embryons et/ou plantes haploïdes ou dihaploïdes.
Dans la technique de gynogenèse mise en œuvre pour la courgette Cucurbita pepo et rapportée par Kurtar et al. (Kurtar et al, Euphytica, 2002, 127, 335-344), on a également recours à l'irradiation du pollen. Kurtar et al. ont étudié l'influence de la dose d'irradiation et des génotypes sur l'obtention des embryons haploïdes. Ces auteurs obtiennent des embryons et des plantes haploïdes sans avoir pu optimiser la dose d'irradiation et en ayant fait le constat selon lequel la production des embryons est fortement influencée par le niveau d'irradiation, par le développement des embryons mis en culture et par les génotypes. Ainsi, contrairement à ce qui se passe pour le melon, les conditions techniques de production d'embryons haploïdes de courgettes Cucurbita pepo, sont, jusqu'à présent, non généralisables.
Cette variabilité multifactorielle constitue un premier inconvénient notable des procédés connus de gynogenèse, avec ou sans irradiation du pollen.
Un second inconvénient desdits procédés est relatif aux analyses de l'état de ploïdie et de l'état d'homozygotie des plantes obtenues (embryons/plantules/plantes adultes). En effet, les plantes peuvent être haploïdes ou dihaploïdes, mais elles peuvent avoir des niveaux de ploïdie variés, notamment être des chimères haploïdes-diploïdes, des tétraploïdes ou des aneuploïdes (Dumas de Vaux et Chambonnet en 1986). De manière contradictoire au principe de gynogenèse, l'irradiation du pollen peut donner lieu à des fécondations de l'ovule par l'ADN du grain de pollen, principalement par des fragments d'ADN. Ceci peut provenir du fait que les radiations n'ont pas dégradé suffisamment l'ADN pour empêcher la fécondation partielle, de laquelle résulte la formation d'un embryon chimérique (sans vouloir être limités par la théorie, les présents inventeurs pensent à des recombinaisons entre l'ADN de l'ovule et des fragments de l'ADN du grain de pollen). Lorsque les radiations dégradent suffisamment l'ADN, le grain de pollen devrait perdre son pouvoir fécondant et ne conserver que son pouvoir germinatif. On a toutefois constaté que dans certains cas, lors de l'extension du tube pollinique, des fragments d'ADN mâle peuvent se retrouver au contact de l'ovule et, lors d'une pseudo- fécondation, se recombiner avec l'ADN femelle, donnant ainsi des plantes chimériques haploïdes (lorsque la recombinaison entre l'ADN de l'ovule et les fragments de l'ADN du grain de pollen irradié est suivie de la perte de l'ADN surabondant lors des divisions cellulaires suivantes) ou à ploïdie variée, pouvant notamment être hétérozygotes pour certains gènes lorsqu'elles portent un ou plusieurs chromosomes surnuméraires. Les plantes chimériques haploïdes sont intéressantes puisqu'elles ne possèdent qu'une seule copie de l'information génétique (même si une infime partie du génome provient du gamète mâle) et qu'un doublement de leur stock chromosomique, similairement aux haploïdes, produit des plantes homozygotes ou essentiellement homozygotes.
Des plantes hétérozygotes diploïdes issues d'une fécondation « classique » peuvent aussi être produites, dans le cas, par exemple, d'une insuffisance d'irradiation.
De plus, chez les cucurbitacées, on a constaté que certaines plantes obtenues par ces différents procédés de culture in vitro peuvent être diploïdes mais hétérozygotes car elles ne subissent pas de réduction gamétique lors de la formation des gamètes femelle (Veilleux, Plant Breeding Reviews, 1985, 3, 253-288). Elles portent ainsi l'intégralité de l'information génétique de la plante d'origine et ne présentent donc pas les caractéristiques intéressantes recherchées et propres aux plantes haploïdes, HD et/ou DH.
Les méthodes connues pour déterminer les niveaux de ploïdie permettent de différencier les plantes haploïdes n des plantes diploïdes 2n. Cependant, les méthodes actuelles pour déterminer de façon plus fine le niveau de ploïdie (chimérisme, chromosomes ou fragments de chromosomes manquants ou surnuméraires) restent encore très coûteuses en matériel et en temps. Ainsi, une méthode simple, rapide et économique serait nécessaire pour faire une distinction entre les plantes haploïdes et les plantes chimériques issues d'une pseudo-fécondation. De plus, actuellement, aucune possibilité satisfaisante n'existe pour différencier les plantes 2n diploïdes hétérozygotes issues d'une fécondation, les plantes 2n diploïdes hétérozygotes issues de la non réduction gamétique et les plantes diploïdes 2n dihaploïdes DH homozygotes issues d'un doublement spontané.
L'identification des haploïdes H (chimères ou non) et des différents diploïdes peut se faire par analyse cytologique, notamment par comptage des chromosomes dans des préparations de cellules de racine de plantes passées au microscope optique. L'analyse cytologique est difficile à mettre en œuvre dans un programme de création variétale où la rapidité et la précision sont nécessaires. Cela ne résout toutefois pas le problème de l'identification des haploïdes par rapport aux chimères non haploïdes issues d'une pseudo-fécondation.
La sélection des plantes diploïdes 2n se fait jusqu'à présent par analyse phénotypique de la descendance de la plante régénérée ; rautopollinisation d'une plante homozygote doit donner une descendance homogène stable à travers les générations d'autofécondation successives. Si elle ne l'est pas et que l'on observe une ségrégation de caractères, c'est que la plante régénérée n'était pas homozygote, mais hétérozygote. Ainsi, l'identification des dihaploïdes DH a pu se faire jusqu'à présent uniquement par la sélection morpho logique et/ou l'utilisation de marqueurs récessifs (par exemple, liguleless, glossy...) présents dans le génome du parent femelle. L'utilisation de ces marqueurs récessifs présente l'inconvénient de nécessiter, préalablement à l'induction de la gynogenèse, leur introduction dans le génome de la lignée destinée à être utilisée comme parent femelle, si elle ne les possède pas déjà. Des marqueurs de coloration peuvent être utilisés dans la sélection des embryons et plantes haploïdes ou dihaploïdes (Chase and Nanda, Maize Gen Coop, 1965, News letter, 39, 59-60 ; Coe and Sarkar, J of Heredity, 1964, vol. 55, 231- 233). Toutefois, l'expression de ces marqueurs est influencée par le génotype du parent femelle ou même par le processus général de maturation de l'embryon et ceci peut entraîner une évaluation incorrecte de l'origine des individus obtenus. L'analyse phéno typique de la descendance est longue, puisqu'il faut attendre la floraison, obtenir les graines et observer la descendance de chaque graine afin de vérifier son homogénéité.
Les causes du manque de résultats satisfaisants dans ces différentes méthodes connues d'haploïdisation se situent, en partie, dans les limites actuelles des techniques de culture in vitro, à savoir la grande spécificité génotypique de réponse à la culture in vitro, les faibles pourcentages de différenciation pour donner naissance à des embryons, la perte importante de ces embryons quand on veut les conduire vers une organogénèse complète.
Il n'existe donc pas, à ce jour, de technique satisfaisante pour produire, de manière reproductible, suffisamment de plantes (e.g. embryons/plantules/plantes adultes) haploïdes H, haploïdes doublés HD et/ou dihaploïdes DH, afin d'alimenter un programme de sélection, notamment de courgettes. Cucurbita et particulièrement Cucurbita pepo fait en effet partie de ces espèces où l'effort déployé est très important pour surmonter ces différents problèmes.
Dans ce contexte, l'un des objectifs de la présente invention est de fournir un procédé performant permettant d'améliorer la production de plantes haploïdes H, haploïdes doublées HD et/ou dihaploïdes DH, par gynogenèse induite par un gamétophyte mâle irradié (par exemple du pollen irradié).
Un autre objectif de la présente invention est de fournir un nouveau procédé perfectionné de sélection ou d'amélioration végétale, c'est-à-dire d'obtention de plante, haploïde ou diploïde homozygote ou essentiellement homozygote ayant une descendance stable quant à ses caractères phénotypiques et/ou génotypiques, ou en d'autres termes, une plante pour laquelle une stabilisation du génome est acquise avec un nombre réduit de générations (par exemple une ou deux). Un autre objectif de la présente invention est de fournir un procédé de production de plantes haploïdes, haploïdes doublées et/ou dihaploïdes, par gynogenèse induite avec irradiation des gamétophytes mâles (pollen), remédiant aux inconvénients de l'art antérieur et satisfaisant à au moins l'une des spécifications suivantes : - Optimisation de la dose d'irradiation ;
Pouvoir au moins en partie s'affranchir de l'influence du niveau de développement des embryons mis en culture et/ou des génotypes et/ou des conditions climatiques et/ou du moment de la récolte des fruits, du niveau de croissance des embryons recueillis en vue de leur culture, entre autres, (variabilité multifactorielle) ; - Généralisation du procédé à un maximum d'espèces et de genres, en particulier à la majorité des courgettes Cucurbita pepo ;
Permettre une analyse efficace et certaine de l'état de ploïdie et de l'origine des plantes produites ;
Permettre une bonne identification des plantes obtenues.
Un autre objectif de la présente invention est de fournir un procédé de production de plantes haploïdes (donnant ensuite des plantes haploïdes doublées) et/ou dihaploïdes, par gynogenèse induite par du pollen irradié, ledit procédé permettant de réduire le temps ainsi que l'espace de culture nécessaire à la création et la sélection variétale, ceci grâce à une étape de sélection des plantes haploïdes, et/ou dihaploïdes, parmi l'ensemble des plantes à ploïdies variées produites.
Un autre objectif de la présente invention est de fournir un procédé permettant, en amont d'un procédé de production de plantes haploïdes et/ou dihaploïdes par gynogenèse avec irradiation du matériel reproducteur du parent mâle, de déterminer la dose d'irradiation adéquate pour augmenter les rendements de production desdites plantes en fonction de facteurs multiples donnés et choisis de préférence parmi l'espèce végétale, les génotypes du parent mâle et du parent femelle, les conditions climatiques et physiologiques de ces plantes, le moment de la récolte des fruits, les conditions de croissance des embryons immatures recueillis en vue de leur culture.
Un autre objectif de l'invention est de fournir au moins l'un des objets suivants : - Marqueur(s) moléculaire(s) ;
Embryons ; - Plantes régénérées à partir des embryons ;
Descendance des plantes ; Semences de plantes ; utilisables dans ou obtenus par un procédé de production de plantes haploïdes, haploïdes doublées et/ou diplohaploïdes, par gynogenèse induite par du pollen irradié, ce procédé étant du type de celui visé dans les objectifs ci-dessus.
Un autre objectif de l'invention est de fournir un procédé performant d'analyse de l'origine de plantes, notamment de plantes produites par un procédé de production de plantes haploïdes (donnant ensuite des plantes haploïdes doublées) et/ou dihaploïdes, par gynogenèse induite par du pollen irradié, ce procédé étant du type de celui visé dans les objectifs ci-dessus, et permettant de déterminer si les plantes contiennent du matériel génétique du parent mâle.
Un autre objectif de l'invention est de fournir un procédé performant d'identification de plantes, notamment de plantes produites par un procédé de production de plantes haploïdes (donnant ensuite des plantes haploïdes doublées) et/ou dihaploïdes, par gynogenèse induite par du pollen irradié, ce procédé étant du type de celui visé dans les objectifs ci-dessus et permettant de déterminer si les plantes sont homozygotes ou hétérozygotes.
Au moins l'un des objectifs ci-dessus, parmi d'autres, est atteint par la présente invention qui concerne, tout d'abord, un nouveau procédé de production de plantes haploïdes H, haploïdes doublées HD et/ou dihaploïdes DH, les HD et DH étant homozygotes ou essentiellement homozygotes, ce procédé étant du type de ceux relevant de la technique de gynogenèse induite par du pollen irradié, caractérisé en ce qu'il comprend : une étape d'irradiation du matériel reproducteur du parent mâle à une dose comprise entre 160 et 190 Gamma Ray, de préférence entre 165 et 185 Gamma Ray (Gy),
- ou une étape de sélection des plantes haploïdes H, ou DH, ou H et DH par utilisation d'un marqueur moléculaire, ou une étape d'irradiation du matériel végétal reproducteur du parent mâle à une dose comprise entre 160 et 190 Gamma Ray, de préférence entre 165 et 185 Gamma Ray (Gy) et une étape de sélection des plantes haploïdes H, ou DH, ou H et
DH par utilisation d'un marqueur moléculaire.
Il est à noter que dans la présente demande, classiquement l'article indéfini "un" doit être considéré comme un pluriel générique (signification de "au moins un" ou encore "un ou plusieurs"), sauf lorsque le contexte montre le contraire ( 1 ou "un seul"). Ainsi, par exemple, lorsque l'on dit ci-dessus que l'on ajoute une étape d'irradiation, il s'agit de l'ajout d'une ou plusieurs étapes d'irradiations. Il en va de même pour l'étape de sélection des plantes qui peut être faite par plusieurs étapes de sélections, pour l'utilisation d'un ou plusieurs marqueurs moléculaires.
Le procédé selon la présente invention ouvre une nouvelle voie d'obtention de plantes {lato sensu) haploïdes H, haploïdes doublées HD et/ou dihaploïdes DH. Cette nouvelle voie apporte des améliorations en termes : d'élargissement du spectre des végétaux concernés par cette technique de gynogenèse avec irradiation des gamétophytes mâles (pollen) ; de réduction de la variabilité multifactorielle propre à cette technique jusqu'alors ; d'analyse de l'état de ploïdie des plantes produites ; - d'identification de l'origine des plantes obtenues ; de réduction de temps ainsi que d'espace de culture nécessaire à la création et la sélection variétale. Ce procédé s'est par ailleurs avéré tout à fait approprié pour les plantes de courgettes.
Compte tenu de la variabilité factorielle de la gynogenèse induite par irradiation du pollen, toutes les avancées en termes d'optimisation sont les bienvenues. Ainsi, selon un autre de ses aspects, l'invention vise un procédé de production de plantes haploïdes H, haploïdes doublées HD et/ou dihaploïdes DH, les HD et DH étant homozygotes ou essentiellement homozygotes, par gynogenèse induite par irradiation du matériel reproducteur du parent mâle, caractérisé en ce qu'il comprend une étape préalable de détermination de la (ou des) dose(s) d'irradiation adéquate(s) pour augmenter les rendements d'obtention desdites plantes en fonction de facteurs multiples donnés et choisis de préférence parmi l'espèce végétale, les génotypes du parent mâle et du parent femelle, les conditions climatiques et physiologiques, le moment de la récolte des fruits, le niveau de croissance des embryons recueillis en vue de leur culture.
L'invention vise également un procédé de production de plantes haploïdes H, haploïdes doublées HD et/ou dihaploïdes DH, les HD et DH étant homozygotes ou essentiellement homozygotes, par gynogenèse induite par du pollen irradié, caractérisé en ce qu'il comprend l'utilisation d'un marqueur moléculaire pour identifier les plantes exemptes de matériel génétique du parent mâle dont le pollen a été irradié ou qui en possèdent une quantité insuffisante pour provoquer, dans la descendance desdites plantes, une disjonction d'un caractère phénotypique et/ou génotypique ainsi que pour déterminer leur état d'homozygotie.
Selon encore un autre de ses aspects, l'invention se rapporte à un marqueur moléculaire susceptible d'être utilisé dans le procédé selon l'invention, ce marqueur étant, par exemple, choisi parmi les marqueurs microsatellites (SSR), définis par les couples d'amorces de séquences nucléotidiques annexées SEQ ID N° 1 à 16, de préférence SEQ ID N°3 à 14.
Selon encore un autre de ses aspects, l'invention se rapporte à des embryons haploïdes H, HD et/ou DH de plantes, en tant que produits intermédiaires du procédé selon l'invention.
Selon encore un autre de ses aspects, l'invention concerne la descendance des plantes obtenues par le procédé selon l'invention.
Selon encore un autre de ses aspects, l'invention concerne les semences des plantes obtenues par le procédé selon l'invention.
Afin de mieux comprendre l'invention, il convient tout d'abord de rappeler ou de donner quelques définitions, qui doivent toutes être considérées comme des exemples non limitatifs.
- Par génotype, on entend l'ensemble du matériel génétique porté par un individu et qui constitue son patrimoine héréditaire. Un caractère génotypique correspond ou non à un caractère phénotypique, qu'il soit récessif ou dominant.
- Le terme phénotype désigne l'ensemble des caractères morphologiques ou fonctionnels apparents d'un individu, qui correspondent à la fois à la partie exprimée du génotype et à des phénomènes déterminés par le milieu extérieur.
- Par plante, on entend un végétal à quelque stade de développement que ce soit, notamment : embryon, ou tout autre stade plantule ou de la plante adulte.
- Par plante mâle ou parent mâle on entend une plante utilisée comme donneur de pollen dans un croisement.
- Par plante femelle ou parent femelle on entend une plante utilisée comme receveur de pollen, ou donneur d'ovule dans un croisement.
- Par matériel reproducteur mâle, on entend la fleur mâle ou toute partie comportant les cellules gamétiques haploïdes mâles, à savoir l'étamine, les gamétophytes mâles ou grains de pollen.
Par simplification, dans la présente demande, par pollen on entend désigner le matériel reproducteur mâle utilisé.
- Par matériel reproducteur femelle, on entend la fleur femelle ou toute partie comportant les cellules gamétiques haploïdes femelles, les ovaires, les ovules, les gamétophytes femelles (sac embryonnaire) ou les cellules reproductrices femelles (oosphères).
- Par autogame, on entend une plante dont le mode de reproduction est l'autogamie et dont les graines sont issues de la fécondation des deux gamètes issus du même individu. - Par pollinisation, on entend l'apport d'un grain de pollen depuis l'étamine (organe mâle) sur les organes femelles. La pollinisation donne lieu à une fécondation, voire à une pseudofécondation lorsque le matériel maie utilisé est irradié.
- Par fécondation, on entend la fusion entre un gamète mâle et un gamète femelle donnant naissance à un embryon.
- Par pseudo-fécondation, on entend la formation induite d'embryon sans fusion au préalable d'un gamète mâle et femelle. Dans le cadre de la présente invention, la technique de gynogenèse induite par irradiation du pollen permet la formation d'un embryon par pseudo-fécondation. La pseudo fécondation peut aussi être une fécondation partielle, lorsque des fragments d'ADN du gamète maie fusionnent avec le gamète femelle.
- Par autofécondation, on entend la pollinisation d'un individu par son propre pollen, les individus qui en résultent étant dits autofécondés.
- Par plante hybride, on entend une plante issue du croisement entre deux parents génétiquement différents. Pour une plante de la première génération d'un croisement entre deux parents homozygotes génétiquement distincts, par exemple deux variétés distinctes, on pourra parler d'hybride Fl .
- Par hétérosis ou vigueur hybride, on entend le phénomène selon lequel un hybride Fl est significativement supérieur au meilleur de ses parents quant à un ou plusieurs caractères, notamment pour ce qui concerne la vigueur. - Par stock chromosomique, on entend le nombre de chromosomes contenus dans le noyau de la cellule, ou la quantité d'ADN.
- Par allèle, on entend selon la présente invention les diverses versions d'une séquence d'ADN donnée située à un locus (emplacement sur un chromosome) chromosomique donné. - Par homozygote, on entend une cellule ou un individu qui possède deux allèles identiques d'un même gène sur un locus déterminé de la même paire de chromosome, et ce pour la caractéristique apportée par ce gène.
- Par essentiellement homozygote, on entend les plantes selon l'invention, dès lors que l'identité des deux allèles est vérifiée par exemple pour au moins 80%, de préférence 85%, notamment 90% et plus particulièrement 95%, des allèles testés ou dès lors qu'après une autofécondation, il n'y a pas de ségrégation des caractères dans la descendance. Par extension, dans la présente demande, les plantes essentiellement homozygotes sont considérées comme des plantes homozygotes.
- Par diploïdes, on entend un qualificatif applicable à des cellules ou à des plantes ou des parties de plantes comprenant de telles cellules, lesquelles présentent, dans leur noyau, un lot de chromosomes deux à deux semblables dits homologues. Les cellules diploïdes sont habituellement le résultat de la fécondation de deux gamètes haploïdes. - Par haploïdes, on entend un qualificatif applicable à des cellules ou à des plantes ou des parties de plantes comprenant de telles cellules, dont les chromosomes contenus dans leur noyau ne sont chacun qu'en un seul exemplaire (n).
- Par chimères on entend un qualificatif applicable à des cellules ou à des plantes ou des parties de plantes comprenant de telles cellules, qui comprennent un fragment d'ADN additionnel provenant du pollen irradié ou dont l'un des chromosomes a subi une recombinaison avec de l'ADN du pollen irradié. Ces cellules peuvent être haploïdes H, dihaploïdes DH (lorsqu'il y a doublement spontané du stock chromosomique) ou à ploïdie variée. Lorsqu'une plante est une chimère à ploïdie variée (comprenant notamment des chromosomes ou des fragments de chromosomes surnuméraires), elle est hétérozygote pour certains allèles
Lorsqu'une plante est issue d'une recombinaison avec un fragment d'ADN du pollen mâle irradié, elle est intéressante dans deux cas : 1) Si elle ne possède qu'une seule copie de chacun des chromosomes, elle est considérée comme haploïde et pourra donc subir un doublement chromosomique ultérieur pour devenir une plante haploïde doublée (2n) homozygote.
2) Si elle a subi un doublement chromosomique spontané, elle est dihaploïde (2n) homozygote. - Par haploïde doublé (HD), on entend un qualificatif applicable à des cellules ou à des plantes ou des parties de plantes comprenant de telles cellules, dont le stock chromosomique a été multiplié artificiellement, la plupart du temps par traitement chimique et principalement par la colchicine.
- Par dihaploïdes (DH), on entend un qualificatif applicable à des cellules ou à des plantes ou des parties de plantes comprenant de telles cellules, ces cellules étant au départ haploïdes et ayant vu leur stock chromosomique doublé spontanément. Ce doublement du stock chromosomique permet d'obtenir une cellule, plante ou partie de plante à 2n entièrement homozygote.
- Par parent femelle hybride, on entend une plante hybride utilisée comme plante receveuse de pollen dans un croisement.
- Par courgette, on entend une plante du genre Cucurbita. La courgette est en réalité un ensemble de cultivars de l'espèce Cucurbita pepo et de la sous-espèce Cucurbita pepo ssp. pepo.
- Par dose, on entend la dose d'irradiation absorbée par la cible, à savoir notamment le matériel végétal reproducteur du parent mâle.
- Par marqueur moléculaire, on entend un fragment spécifique d'une séquence d'ADN pouvant être identifiée au sein du génome d'un individu et pouvant être notamment utilisée pour localiser un gène d'intérêt, vérifier si un individu a hérité d'une caractéristique particulière d'un parent ou différencier deux individus. Il peut s'agir ou non d'une séquence codante. Le marqueur peut être dominant, co-dominant. La détection du marqueur moléculaire, ou sa non-détection, permet de sélectionner les individus présentant le gène d'intérêt ou la caractéristique particulière, ou au contraire, de ne pas sélectionner les individus ne présentant pas le gène d'intérêt ou la caractéristique particulière. Dans la présente invention, les marqueurs moléculaires permettent de tester rapidement les plantes ou plantules en cours de développement et de retenir celles qui possèdent les caractéristiques recherchées. Des marqueurs moléculaires de différentes natures sont connus de l'homme du métier : AFLP (polymorphismes de longueur des fragments d'amplification), SCAR (caractérisation de produits d'amplification), SSR (microsatellites, répétitions de séquences simples), RFLP (polymorphismes de longueur des fragments de restriction), etc.
- Par marqueur microsatellite ou séquence microsatellite ou encore SSR, on entend une séquence d'ADN formée par une répétition continue de motifs composés de 1 à 4 nucléotides. Ces séquences microsatellites sont présentes sur l'ensemble du génome, le plus fréquemment au niveau des introns des gènes mais également au niveau d'exons. Le polymorphisme des microsatellites peut être utilisé comme marqueur génétique afin d'identifier un individu ou une population, par exemple des plantes.
Lors de la création et la sélection de variétés végétales, la transmission de façon stable et homogène des caractères choisis est un pré-requis indispensable. Aussi, il est fondamental de pouvoir connaître de façon fiable le génotype et le phénotype des plantes produites. Pour maintenir un hybride, de préférence un hybride Fl, il faut des lignées parentes stables. Pour obtenir des plantes fixées, les plantes sont généralement autofécondées de manière répétée, les plantes ne présentant pas les caractéristiques recherchées étant éliminées à chaque génération. De nouvelles techniques ont permis le développement de plantes à partir des gamètes (n) seuls. Ainsi, ont été développées l'androgenèse et la gynogcnèse. L'utilisation de la gynogenèse avec du pollen irradié est connue pour générer des plantes. Cependant, comme exposé ci-dessus, cette technique présente certaines limites et principalement les cas de pseudo-fécondations par le pollen, même lorsque celui-ci a été fragmenté par les rayonnements, de préférence des rayons X ou gamma. En effet, il se peut que le pollen ne soit pas assez dégradé et qu'un fragment d'ADN du pollen irradié «pseudo-féconde» le gamétophyte femelle alors que dans cette technique, il doit simplement induire le développement d'un embryon haploïde sans en modifier le génome. Cet embryon, et par conséquent la plante issue de cet embryon, ne doit donc idéalement pas contenir de génome du parent mâle ayant servi à la pollinisation du matériel reproducteur du parent femelle. Mais il se trouve que la descendance produite par gynogenèse induite par du pollen irradié peut être de différentes natures, notamment : des plantes haploïdes (à n chromosomes), des plantes dihaploïdes (à 2n chromosomes identiques n+n), des chimères contenant n chromosomes du parent femelle et des morceaux d'ADN fragmentés du parent mâle recombinés ou non avec l'ADN du parent femelle, soit sous forme haploïde, soit ayant une ploïdie variée, soit étant dihaploïdes, ayant subit un doublement spontané de leur stock chromosomique, des plantes diploïdes issues d'une fécondation des plantes diploïdes ayant le même génome que la plante mère (2n).
Dans les processus de création variétale, il est nécessaire de ne conserver que les plantes haploïdes H (y compris les chimères haploïdes), pouvant ensuite donner par doublement du stock chromosomique les haploïdes doublés HD, et les plantes dihaploïdes DH pour être certain de leur homozygotie.
Après de longues recherches, les inventeurs ont perfectionné ce tri en proposant une gamme judicieusement sélectionnée de doses d'irradiation des gamétophytes mâles, qui permet d'orienter la gynogenèse vers une population d'individus souhaités (H, DH) exempte ou quasi-exempte d'individus non souhaités.
Le fait d'associer ou de substituer le choix de cette gamme de doses à un processus de sélection par utilisation de marqueurs moléculaires et/ou de cytométrie de flux va dans le même sens.
Selon un mode préféré de mise en œuvre de l'invention, le procédé concerné de gynogenèse induite avec irradiation du pollen, comprend les étapes successives suivantes : a) Mettre en œuvre du matériel reproducteur du parent mâle, de préférence une fleur, b) Irradier ledit matériel végétal reproducteur du parent mâle à une dose comprise entre 160 et 190 Gamma Ray, de préférence entre 165 et 185 Gamma Ray (Gy) et tout particulièrement entre 170 et 180 Gy, c) Polliniser le matériel végétal reproducteur du parent femelle avec ledit matériel végétal reproducteur du parent mâle irradié, d) Récolter les fruits dont les graines portent les embryons, e) Extraire les graines desdits fruits, f) Extraire les embryons desdites graines, g) Mettre en culture les embryons sur un milieu approprié jusqu'à l'obtention d'une plante, de préférence une plantule.
L'étape d'irradiation du matériel reproducteur mâle peut être répétée plusieurs fois, de préférence deux ou trois fois, afin que le matériel génétique soit bien dégradé. La dose d'irradiation du matériel reproducteur mâle tout particulièrement préférée est autour de 175 Gy. Dans un mode tout particulièrement préféré de mise en œuvre de l'invention, le procédé comporte en outre, après l'étape g) décrite ci-dessus, une étape h) consistant à sélectionner les plantes haploïdes H et/ou DH par cytométrie de flux, ou par utilisation de marqueur(s) moléculaire(s), ou par cytométrie de flux et utilisation de marqueur(s) moléculaire(s). Cette étape h) de sélection des plantes haploïdes H et/ou DH comporte :
-I- l'utilisation de marqueur(s) moléculaire(s) spécifique(s) d'allèle(s) donné(s) contenu(s) dans le matériel génétique du parent mâle irradié pour sélectionner parmi les plantes obtenues à l'issue de l'étape g), les plantes qui sont exemptes de matériel génétique du parent mâle irradié ou qui en possèdent une quantité insuffisante pour provoquer dans la descendance desdites plantes, une disjonction d'un ou plusieurs caractère phénotypique et/ou génotypique ;
-II- l'utilisation de marqueur(s) moléculaire(s) spécifïque(s) d'allèle(s) donné(s) contenu(s) dans le matériel génétique du parent femelle hybride, ce(s) marqueur(s) permettant de déterminer l'état homozygote/hétérozygote des plantes à sélectionner c'est-à- dire les plantes obtenues à l'issue de l'étape g), ce(s) marqueur étant utilisé(s) pour sélectionner les plantes homozygotes et essentiellement homozygotes, en particulier les plantes DH.
Il est bien évident que lors de l'étape h) de sélection, l'ordre de l'utilisation des marqueurs moléculaires spécifiques donnés contenus dans le matériel génétique du parent mâle et de ceux contenus dans le matériel génétique du parent femelle importe peu. I et II ne sont pas nécessairement réalisées dans un ordre précis et peuvent être concomitantes (I et II en même temps) ou successives (I puis II ou II puis I). De plus, l'étape de sélection h) peut être répétée plusieurs fois. Ceci peut être intéressant lorsque l'on utilise plusieurs marqueurs moléculaires spécifiques, pour effectuer des sélections successives de plus en plus fines avec de moins en moins d'individus à tester. Enfin, lorsque l'étape h) consiste à sélectionner les plantes haploïdes H et/ou DH par cytométrie de flux et utilisation de marqueur(s) moléculaire(s), la cytométrie de flux peut précéder l'utilisation de marqueur(s) moléculaire(s), l'utilisation de marqueur(s) moléculaire(s) peut précéder la cytométrie de flux, et l'utilisation de marqueur(s) moléculaire(s) peut être concomitante avec la cytométrie de flux.
De préférence, les plantes parents sont choisies dans le genre Cucurbita, famille des cucurbitacées, de préférence dans l'espèce Cucurbita pepo, et, plus préférentiel lement encore, dans la sous-espèce Cucurbita pepo ssp. pepo.
Selon une caractéristique remarquable de l'invention, on met en œuvre comme plante femelle des plantes hybrides et des plantes hybrides Fl. En effet, lors de la production des gamètes d'une plante hybride ou d'une plante hybride Fl, les appartements chromosomiques des chromosomes homologues lors de la première division permettent des recombinaisons génétiques et donnent donc une grande variabilité génétique des gamètes produits. Les plantes haploïdes H, (donnant les haploïdes doublées HD) et les plantes dihaploïdes DH issues de ces gamètes et obtenues par le procédé selon la présente invention, sont génétiquement différentes les unes des autres, donnant ainsi un choix accru au sélectionneur.
Etape.a) Pour faire un bref rappel du cycle de vie de plantes à fleurs, telle que les courgettes, une fleur pollinisée ou autopollinisée va produire des fruits contenant eux-mêmes des graines, lesquelles contiennent des embryons, qui vont se développer en plantules pour aboutir à des plantes. Le matériel végétal mâle et femelle est choisi en fonction des caractéristiques recherchées. Le matériel végétal reproducteur mâle récolté et mis en œuvre comprend principalement des fleurs d'une plante mâle choisie mais il peut s'agir également des étamines ou des gamétophytes ou directement des gamètes mâles ou grains de pollen. Les fleurs par exemple sont avantageusement récoltées sur la plante mère mâle au moment de l'anthèse. Une ou deux fleurs mâles étant généralement utilisées pour la fécondation de chaque fleur femelle. Pour les plantes préférées selon l'invention, à savoir celles du genre Cucurbita, les plantes mâles retenues selon l'invention peuvent être par exemple celles dont les génotypes sont dans le groupe comprenant : JIB, JEDIDA, ESKEND ARENI. Ces plantes mâles sont particulièrement intéressantes car ce sont de bons polinisateurs, à savoir qu'elles émettent de bonnes quantités de pollen. Le moment de la récolte du matériel végétal reproducteur du parent mâle, de préférence des fleurs, peut avoir une importance. Ce moment est choisi en fonction du développement de la plante dont les fleurs proviennent, de la saison... Ainsi, il est préférable de les récolter lors de l'anthèse et de féconder les fleurs femelles avant leur ouverture.
Etape.b)
L'étape d'irradiation b) du matériel végétal reproducteur du parent mâle, c'est-à-dire des gamétophytes mâles, comme le pollen, est importante dans la réussite du procédé de production des plantes H (donnant des haploïdes doublés HD) et/ou des plantes DH. Les rayons utilisés sont de préférence les rayons gamma, mais on peut également utiliser les rayons X.
L'irradiation est réalisée à l'aide de moyens connus et appropriés tel que des rayons gamma par exemple pendant une durée suffisante pour que le matériel végétal reproducteur du parent mâle reçoive la dose prescrite sur des bocaux fermés contenant de préférence dix à douze fleurs mâles par bocal. Par exemple, pour JIB, la durée d'irradiation est de préférence entre 20 minutes et une heure et demie.
Les conditions choisies d'irradiation (tous paramètres confondus) permettent d'obtenir des résultats très satisfaisants, à savoir après pollinisation avec le matériel végétal reproducteur mâle, une production suffisante de fruits, lesquels contiennent un nombre suffisant d'embryons qui conduisent à des plantes dont la majorité possède les caractéristiques recherchées. En effet, la majorité des embryons et donc des plantes produites par le procédé selon l'invention sont H et/ou DH, les haploïdes donnant des haploïdes doublés.
Etape.ç)
Avant d'effectuer l'étape c) du procédé selon l'invention, il peut être avantageux de faire germer quelques grains de pollen irradiés, dans un milieu approprié, comme par exemple dans un milieu nommé MP 15 (solution à 15 % de sucrose, 100 mg/L H3BO3 et 700 mg/L CaCl2, 2H2O), ceci afin de vérifier que le pollen irradié est encore capable de germer. Après un temps de germination donné, par exemple de 15 à 60 min, les grains de pollen sont ensuite observés à la loupe afin d'estimer les pourcentages de grains germes et de grains éclatés.
Le matériel reproducteur du parent femelle utilisé aura un génotype choisi en fonction de la plante à créer. Pour les plantes préférées selon l'invention, à savoir celles du genre Cucurbita, les plantes femelles retenues selon l'invention peuvent être par exemple celles dont les génotypes sont dans le groupe de génotypes comprenant VNOOl, VG06, VN002, Odessa, VG 14, Tosca et VE 547 peuvent également être utilisés. L'étape c) du procédé selon l'invention consiste essentiellement en la pollinisation du matériel reproducteur du parent femelle avec le matériel reproducteur du parent mâle.
Dans cette technique de gynogenèse, des plantes entières peuvent être régénérées à partir des gamétophytes femelles (ovaires ou ovules) contenus dans le matériel végétal reproducteur du parent femelle. La pollinisation consiste avantageusement à mettre en contact les gamètes mâles et les gamètes femelles, mais étant donné que les gamètes mâles sont irradiés, il ne peut y avoir de réelle fécondation des gamètes femelles mais juste un allongement du tube pollinique et, par induction de l'oosphère, le développement d'un embryon.
La pollinisation du matériel végétal reproducteur du parent femelle peut se faire de diverses manières. Les techniques préférées seront la pollinisation par la technique « fleur à fleur » où l'ensemble de la superficie des stigmates (extrémité des pistils) est recouverte du matériel reproducteur du parent mâle mais également la pollinisation au pinceau. Dans la technique « fleur à fleur », une fleur ou le matériel reproducteur du parent femelle est « fécondé(e) » par une fleur ou le matériel reproducteur du parent mâle. Dans la technique dite du « pinceau », un pinceau est utilisé pour effectuer le transport des grains de pollen du matériel reproducteur du parent mâle vers un ou plusieurs fleurs ou matériel reproducteur du parent femelle.
Etape d)
Avantageusement, les jours suivant la pollinisation, la bonne formation du fruit (nouaison) est observée et les fleurs ne formant pas de fruit sont éliminées. Après la pollinisation, la durée après laquelle les fruits sont récoltés dépend de la famille, du genre et de l'espèce concernée. De préférence, on récolte les fruits dont la maturité convient pour l'extraction des embryons.
La morphologie du fruit et son aspect extérieur permet d'évaluer le moment opportun pour cueillir le fruit.
Par exemple, environ 4 à 5 semaines (durée variable selon le genre et l'espèce) après la pollinisation, les fruits sont récoltés puis de préférence lavés à l'eau éventuellement avec un détergent (e.g. savon de Marseille), rincés, séchés et éventuellement nettoyés à nouveau à l'alcool.
Etape e) Les fruits sont alors ouverts pour extraire les graines, de préférence en conditions stériles, par exemple sous flux laminaire.
Etape.!)
Les graines sont ensuite ouvertes pour en extraire les embryons.
Etape.g)
Les embryons extraits sont mis en culture sur un milieu adapté, de type de ceux décrits dans les exemples qui suivent, le milieu S2P étant préféré (cf. tableau 8).
Les embryons, par exemple, sont cultivés à l'obscurité, une à deux nuits, à 20-250C, puis ils sont placés en pleine lumière pendant 10 heures à 20 heures environ, e.g. 16 heures environ à la même température.
Les embryons peuvent être récoltés à divers stades de développement embryonnaire et certains stades peuvent influencer le rendement du procédé selon l'invention. En effet, les embryons peuvent être récoltés au stade embryonnaire globulaire, cœur, torpille ou cotylédonnaire.
Les embryons peuvent être repiqués régulièrement, de préférence tous les 15 jours environ, sur le même milieu ou sur un milieu de culture différent adapté à leur stade de développement, en particulier dès l'apparition des jeunes feuilles et de petites racines. Lorsque les plantules sont bien développées, elles sont avantageusement repiquées sur un autre milieu de culture approprié, dont la composition est e.g. celle donnée dans les exemples qui suivent (cf. tableaux 8 et 9).
Etape h)
Dans une variante préférée du procédé selon l'invention, on réalise une étape de sélection des plantes haploïdes H et/ou DH produites selon le procédé : hl) par cytométrie de flux et/ou, h2) par utilisation d'un marqueur moléculaire. Cette sélection hl et/ou h2 est avantageusement réalisée lorsque la plante issue de la gynogenèse présente quelques feuilles, un échantillon de la plante, de préférence de feuille, étant prélevé et analysé suivant cette étape de sélection h) du procédé. Ces sélections hl) et/ou 1x2) qui peuvent être mises en œuvre, simultanément ou non, dans n'importe quel ordre, voire par intermittence, permettent notamment de déterminer le niveau de ploïdie des plantes produites. Une discrimination entre les plantes ayant 2n chromosomes et les plantes à n chromosomes est possible par ces techniques. Ainsi, les plantes ayant n chromosomes (haploïdes H) sont conservées pour être par la suite soumises à une étape de doublement de leur stock chromosomique, de préférence à la colchicine, produisant ainsi des haploïdes doublés (HD). Les plantes haploïdes H sont stériles, en revanche les plantes haploïdes doublées HD et les dihaploïdes DH ne le sont pas et sont particulièrement intéressantes pour les sélectionneurs.
Dans le cas de la sélection hl) par cytométrie de flux, la cytométrie de flux permet de faire une distinction fiable entre les plantes 2n et les plantes n mais il n'est pas possible par cette technique de différencier les plantes dihaploïdes DH (2n identiques, homozygotes) et les plantes diploïdes 2n hétérozygotes issues d'un défaut de réduction gamétique ou d'une fécondation par le grain de pollen. Lors de cette sélection, seront conservées les plantes 2 n ainsi que les plantes n.
Les plantes 2n seront analysées ultérieurement avec des marqueurs moléculaires (étape h2 ci-dessous) afin de faire une sélection plus fine sur entre les plantes 2n dihaploïdes homozygotes ou essentiellement homozygotes et les plantes 2n diploïdes hétérozygotes.
Les plantes n haploïdes (chimères ou non) seront conservées en vue d'être analysées également à l'aide de marqueurs moléculaires puis en vue d'obtenir des haploïdes doublées homozygotes ou essentiellement homozygotes après doublement du stock chromosomique.
La sélection par cytométrie de flux permet de classer les plantes en deux groupes : haploïdes n et diploïdes 2n. Comme méthodes alternatives ou complémentaires à la cytométrie de flux, on peut citer le dénombrement chromosomique réalisé sur des pointes racinaires ou le comptage du nombre de chloroplastes dans les cellules de garde des stomates réalisés au microscope optique.
La sélection h2) par l'utilisation d'un marqueur moléculaire offre quant à elle, cette possibilité de discrimination entre les différents types de plantes 2n exposés ci-dessus. Cela permet un gain de temps, d'espace et de coût très important. De plus, cette méthode de sélection offre aussi une plus grande finesse d'analyse puisqu'elle permet également de déterminer si les plantes haploïdes H ou dihaploïdes DH contiennent ou non du génome du parent mâle, et ce de façon fiable et rapide. Ainsi, la méthode de sélection par l'utilisation d'un marqueur moléculaire permet de déterminer l'état d'homozygotie de la plante en question mais aussi son niveau de ploïdie. La sélection h2) par l'utilisation d'un marqueur moléculaire est de préférence une étape h2) de sélection des plantes H et/ou DH comportant :
-I- l'utilisation d'un marqueur moléculaire spécifique d'allèle(s) donné(s) contenu(s) dans le matériel génétique du parent mâle irradié pour sélectionner parmi les plantes obtenues à l'issue de l'étape g) les plantes qui sont exemptes de matériel génétique du parent mâle irradié ou qui en possèdent une quantité insuffisante pour provoquer dans la descendance desdites plantes sélectionnées, une disjonction d'un caractère phénotypique et/ou génotypique ;
-II- l'utilisation d'un marqueur moléculaire spécifique d' allèle(s) donné(s) contenu(s) dans le matériel génétique du parent femelle hybride, ce(s) marqueurs permettant de déterminer l'état homozygote/hétérozygote, éventuellement le niveau de ploïdie, des plantes à sélectionner c'est-à-dire les plantes obtenues à l'issue de l'étape g), ce(s) marqueur(s) étant utilisé(s) pour sélectionner les plantes homozygotes ou essentiellement homozygotes, en particulier les plantes DH, étant bien précisé que au moins un marqueur utilisé pour chaque analyse peut être un marqueur unique, lors d'une analyse unique, notamment dans le cadre d'un marqueur codominant permettant de discriminer immédiatement entre plusieurs formes alléliques d'un même marqueur génétique. De préférence, on utilise un marqueur moléculaire spécifique d'au moins deux allèles.
Ce marqueur moléculaire spécifique d'allèle(s) du matériel génétique du parent mâle irradié et/ou d'un, de préférence deux, allèles donnés contenus dans le matériel génétique du parent femelle hybride est préférentiellement un marqueur microsatellite SSR. Ces différents marqueurs servent donc, d'une part, à identifier les plantes qui ont une partie de matériel génétique mâle dans leur génome et, d'autre part, à différencier les plantes homozygotes des plantes hétérozygotes. Plus on utilise de marqueurs moléculaires, plus le niveau d'homozygotie est défini. Il se peut qu'à un locus donné, la plante apparaisse homozygote avec les marqueurs moléculaires utilisés mais qu'elle ne soit pas homozygote (ou essentiellement homozygote) sur l'ensemble de ses gènes. Il est donc préférable d'utiliser plusieurs marqueurs moléculaires (de préférence au moins 3, particulièrement 5 et plus particulièrement 6) pour sélectionner avec fiabilité les plantes DH. Lesdits marqueurs sont sélectionnés en fonction des génomes des parents utilisés dans la gynogenèse. Ces marqueurs moléculaires permettent de faire la différence entre les plantes haploïdes H et/ou dihaploïdes DH homozygotes qui sont issues des gamètes femelles et les plantes diploïdes (2n) hétérozygotes issues d'une non réduction gamétique, issues d'une fécondation, ou recombinées issues d'une fécondation partielle avec le pollen irradié. Les marqueurs sont avantageusement choisis de manière à identifier des allèles différents entre les plantes femelles donnant les gamètes femelles et les plantes mâles donnant le pollen qui est irradié. Ainsi, une plante issue d'une fécondation partielle possède les allèles provenant des deux plantes parentales (mâle et femelle) alors qu'une plante haploïde H ou dihaploïde DH n'a que les allèles provenant de la plante mère femelle. Les plantes issues de la gynogenèse induite par le pollen irradié et ayant dans leur génome des allèles du parent mâle témoignant ainsi d'une "fécondation" sont donc écartées. Un cas particulier concerne les chimères haploïdes puisque ces dernières ont des allèles provenant de la plante femelle et de la plante mâle, mais chaque allèle n'étant présent que sous une seule copie.
Pour schématiser, si la plante femelle porte les allèles A et B et que la plante mâle porte les allèles C, toutes les plantes régénérées portant un allèle C sont considérées comme issues d'une fécondation et sont donc écartées. Seules sont retenues les plantes présentant uniquement l'allèle A ou les plantes présentant uniquement l'allèle B. Les plantes présentant l'allèle A peuvent être des plantes AA lorsqu'elles sont dihaploïdes et A lorsqu'elles sont haploïdes, les plantes présentant l'allèle B peuvent être des plantes BB lorsqu'elles sont dihaploïdes et B lorsqu'elles sont haploïdes. Dans le cas particulier des chimères haploïdes, leur identification sera rendue possible par l'utilisation de plusieurs marqueurs.
Ce(s) marqueur(s) moléculaire(s) peut(peuvent) également servir à trier et à écarter les plantes diploïdes issues de gamètes non réduits et identiques à la plante mère, car elles sont hétérozygotes pour des allèles donnés et déterminés du matériel femelle utilisé (plante mère). Dans ce cas, le(s) marqueur(s) moléculaire(s) est(sont) choisi(s) de manière à identifier des allèles qui se trouvent à l'état hétérozygote chez les plantes femelles et donc aussi chez les plantes issues de gamètes non réduits mais qui se retrouvent soit à l'état homozygote pour des plantes dihaploïdes, soit en une seule copie chez les plantes haploïdes. Pour schématiser, si la plante femelle porte les allèles A et B, toutes les plantes régénérées portant la combinaison d'allèles AB sont considérées comme issues d'un gamète non réduit. Là encore, seules sont retenues les plantes présentant uniquement l'allèle A ou les plantes présentant uniquement l'allèle B.
Les marqueurs. :
Selon une forme préférée de l'invention, les marqueurs microsatellites ou SSR sont utilisés pour déterminer, dans les plantes obtenues et testées, à la fois la présence du génome du parent mâle et l'état homozygote/hétérozygote. Ils peuvent également être utilisés pour déterminer le niveau de ploïdie des plantes obtenues et testées.
Selon une forme particulière et remarquable de l'invention, le(s) marqueur(s) moléculaire(s) utilisé(s), pour la mise en œuvre du procédé selon l'invention, est(sont) un(des) marqueur(s) microsatellite(s). Chacun de ces marqueurs moléculaires microsatellites est défini par une séquence nucléotidique donnée d'une taille donnée, amplifiée par PCR grâce à une paire d'amorces spécifiques (une amorce sens et une amorce anti-sens). Pour l'étape de sélection h), le ou les marqueurs moléculaires qui peuvent être utilisés dans la présente invention sont les huit marqueurs suivants CMAGN73, CMBR153, CMBR22, CMMP73, CUCNITRA, FAD2, PATLl, TJ3. Chacun de ces marqueurs est définis par un couple d'amorces nucléotidiques de séquences données (cf. ci-dessous SEQ ID N° 1 à 16). Il est bien évident que pour cette étape h), il est envisageable d'utiliser des marqueurs moléculaires (microsatellites ou non) autres que ces huit marqueurs cités ci-dessus. De préférence, on utilisera les marqueurs définis par les couples d'amorces SEQ ID N°3 et SEQ ID N°4 ; SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6 ; SEQ ID N°7 et SEQ ID N°8 ; SEQ ID N°9 et SEQ ID N0IO ; SEQ ID N011 et SEQ ID N°12 et/ou SEQ ID N°13 et SEQ ID N°14.
Les séquences SEQ ID N° 1 à 16 sont particulièrement intéressantes pour la mise en œuvre du procédé selon l'invention. Aussi, l'invention vise-t-elle également un marqueur moléculaire susceptible d'être utilisé dans le procédé selon l'invention, du type microsatellite (SSR), et avantageusement choisi dans le groupe des marqueurs microsatellites définis par les couples d'amorces de séquence nucléotidiques annexées
SEQ ID N0 l à 16.
L'invention vise de préférence un marqueur moléculaire susceptible d'être utilisé dans le procédé selon l'invention, du type microsatellite, et avantageusement choisi dans le groupe microsatellites définis par les couples d'amorces de séquence nucléotidiques annexées
SEQ ID N0 3 à 14. Pour accroître la fiabilité de la sélection, il est préférable d'utiliser une combinaison de deux marqueurs moléculaires selon l'invention, à savoir de préférence les marqueurs microsatellites. De manière encore plus préférée selon l'invention, on utilise une combinaison de trois marqueurs moléculaires microsatellites, particulièrement de quatre marqueurs moléculaires microsatellites, et tout particulièrement on choisit une combinaison de cinq marqueurs microsatellites. Il peut bien évidemment être utilisé plus de cinq marqueurs moléculaires si besoin. Pour ces combinaisons de marqueurs microsatellites utilisés, les séquences des couples d'amorces définissant le(s) marqueur(s) sont choisies parmi les séquences SEQ ID N°l à 16, de préférence SEQ ID N°3 à 14.
Les marqueurs microsatellites de séquence SEQ ID N°l à 16 utilisables sont notamment spécifiques de la famille des Cucurbitacées, de préférence du genre Cucurbita et plus préférentiellement encore de l'espèce cucurbita pepo.
Le(s) marqueur(s) moléculaire(s) microsatellite(s) (SSR) des courgettes selon l'invention est(sont) choisi(s) en fonction des génotypes de plantes pour la gynogenèse induite par du pollen irradié.
Ce(s) marqueur(s) moléculaire(s) microsatellite(s) est(sont) défini(s) par sa(leur) séquence nucléotidique qui sera détectée par amplification par réaction en chaine (PCR) à l'aide d'amorces spécifiques dont les séquences SEQ ID 1 à 16 sont détaillées ci-dessous dans les exemples. Ces amorces peuvent être des fragments de polynucléotides clones ou des oligonucléotides synthétisés chimiquement. On utilisera de préférence les marqueurs de séquences SEQ ID N°3 à 14.
Etape i) φubjement çhrompsomiqu.e Les plantes sélectionnées et/ou obtenues à l'issue de l'étape h, sont les plantes haploïdes H, et dihaploïdes DH. Les plantes H donnent des plantes dihaploïdes DH lorsque le doublement du stock chromosomique est spontané ou haploïdes doublées HD lorsque le doublement du stock chromosomique se fait par traitement chimique ou physique, de préférence à l'aide de colchicine. Le procédé selon l'invention comporte donc de préférence une étape i) de doublement du stock chromosomique des plantes haploïdes H, l'étape de doublement du stock de chromosomes étant réalisée de préférence à l'aide de la colchicine.
Les plantes HD déjà 2n sont sorties en terre sous serre tandis que les plantes haploïdes H sont de préférence "colchicinées" in vitro puis repiquées sur milieu approprié, puis enracinées et sorties en terre sous serre.
Cette technique de doublement du stock de chromosomes à l'aide de la colchicine, comprend avantageusement les étapes successives suivantes : 1- Isoler l'apex principal de la plante ainsi que les bourgeons axillaires s'il en existe,
2- Préparer une solution de colchicine puis la stériliser,
3- Mettre les boutures dans des petites boites de pétri stériles,
4- Verser une quantité suffisante de colchicine pour les recouvrir puis fermer les boites de Pétri,
5- Laisser tremper pendant plusieurs heures,
6- Sortir les boutures et les rincer dans des pots d'eau stérile,
7- Après les avoir légèrement séchées sur papier stérile, repiquer toutes les boutures sur leur milieu d'origine, 8- Repiquer des bourgeons se développant sur le milieu d'origine,
9- Lorsque les boutures sont racinées, les sortir in vivo sur un support comprenant une solution nutritive.
Comme expliqué ci-avant, la présente invention s'étend au-delà de la production de plantes H, HD et DH, par gynogenèse induite par du pollen irradié. Elle propose en effet une nouvelle méthode d'optimisation de cette production de plantes. Cette méthode permet de surmonter le problème de la variabilité multifactorielle et de généraliser la gynogenèse avec irradiation du pollen à de nombreuses espèces végétales. Cette méthode repose sur une étape préalable de détermination de la (ou des) dose(s) d'irradiation adéquate(s) pour augmenter les rendements d'obtention des plantes, en tenant compte de multiples facteurs tels que l'espèce végétale, les génotypes du parent mâle et du parent femelle, les conditions climatiques et physiologiques, le moment de la récolte des fruits, le niveau de croissance des embryons recueillis en vue de leur culture. Cette étape préalable consiste essentiellement à mettre en œuvre, pour chaque dose d'irradiation testée, une étape h') de sélection des plantes H et/ou DH, h') étant semblable à h) telle que définie ci-dessus, pour établir ensuite les rendements en plantes correspondants et in fine déterminer la ou les doses offrant les meilleurs rendements. Outre les rendements en plantes, on peut aussi appréhender dans cette étape préalable d'autres résultats tels que : le pourcentage de fruits obtenus, le pourcentage de graines obtenues, le pourcentage d'embryons et de plantes H, HD et DH, pour une dose d'irradiation donnée.
Ainsi la présente invention porte sur un procédé de production de plantes haploïdes H, haploïdes doublées HD et/ou dihaploïdes DH, les HD et DH étant homozygotes ou essentiellement homozygotes, par gynogenèse avec irradiation du matériel reproducteur du parent mâle, caractérisé en ce qu'il comprend une étape préalable de détermination de la (ou des) dose(s) d'irradiation adéquate(s) pour augmenter les rendements desdites plantes en fonction de facteurs multiples donnés et choisis de préférence parmi l'espèce végétale, les génotypes du parent mâle et du parent femelle, les conditions climatiques et physiologiques, le moment de la récolte des fruits, le niveau de croissance des embryons recueillis en vue de leur culture ; le niveau de développement des embryons mis en culture, cette étape préalable consistant : i) à tester, pour un facteur donné, différentes doses d'irradiation sur le matériel végétal reproducteur du parent mâle, ii) à mettre en œuvre, pour chaque dose d'irradiation testée, une étape h') de sélection des plantes H et/ou DH, ladite cette étape h' comportant :
-I- l'utilisation d'un marqueur moléculaire spécifique d'allèle(s) du matériel génétique du parent mâle irradié pour sélectionner parmi les plantes obtenues à l'issue de la gynogenèse induite par du pollen irradié, les plantes qui sont exemptes de matériel végétal du parent mâle irradié ou qui en possèdent une quantité insuffisante pour provoquer, dans la descendance desdites plantes, une disjonction d'un caractère phénotypique et/ou géno typique ;
-II- l'utilisation d'un marqueur moléculaire spécifique d'un allèle, de préférence deux allèles donnés spécifiques du matériel génétique du parent femelle hybride mis en œuvre dans la gynogenèse, ce marqueur permettant de déterminer l'état homozygote/hétérozygote, éventuellement le niveau de ploïdie, des plantes à sélectionner c'est-à-dire des plantes obtenues à l'issue de la gynogenèse, ce marqueur étant utilisé pour sélectionner les plantes homozygotes ou essentiellement homozygotes, en particulier les plantes DH ; iii) à dénombrer, pour chaque dose d'irradiation testée, des plantes haploïdes H, ou
DH, ou H et DH obtenues ; iv) à calculer, pour chaque dose d'irradiation testée et à partir des numérations issues de (iii), le rendement en plantes haploïdes H, ou DH, ou H et DH obtenues ; v) à comparer les numérations issues de (iii) et/ou les rendements issus de (iv) pour en déduire la (ou les) dose(s) d'irradiation adéquate(s).
Comme évoqué précédemment, l'étape h' comporte l'utilisation de marqueurs et l'ordre d'utilisation du ou des marqueurs moléculaires spécifique(s) d'allèle(s) du matériel génétique mâle et celui(ceux) spécifique(s) d'allèle(s) du matériel femelle importe peu. I et II ne sont pas nécessairement réalisées dans un ordre précis et peuvent être concomitantes (I et II ensembles) ou successives (I puis II ou II puis I).
L'invention porte également sur les plantes H et DH elles-mêmes produites par le procédé tel que défini ci-dessus, sachant que le terme "plante" englobe ici, tous ses stades de développement : embryons, plantule, plante adulte. En particulier, cela vise les embryons haploïdes H et dihaploïdes DH obtenus, en tant que produits intermédiaires, par le procédé selon l'invention tel que défini ci-dessus et les plantes régénérées à partir desdits embryons. L'invention porte également sur les plantes et plantules HD obtenues par le procédé tel que défini ci-dessus avec l'étape i) de colchicination.
Par ailleurs, l'invention concerne également la descendance ainsi que les semences et les graines provenant des plantes obtenues par le procédé tel que défini ci-dessus. En effet, la présente demande concerne également la descendance des plantes obtenues par le procédé tel que défini ci-dessus, ladite descendance étant obtenue par croisement desdites plantes (HD ou DH) entre elles ou par croisement entre une plante HD ou DH obtenue par le procédé tel que défini ci-dessus et une plante issue d'une lignée ou issue d' autofécondations répétées.
Enfin, l'invention porte également sur les semences de plantes obtenues par le procédé tel que défini précédemment ou à partir des embryons tels que définis ci-dessus, ainsi qu'à partir de plantes issues de la descendance telle que définie ci-dessus.
Les conditions préférentielles de mises en œuvre des procédés décrits ci-dessus s'appliquent également aux autres objets de l'invention ci-dessus, notamment au procédé d'optimisation de production de plantes par détermination de la dose d'irradiation adéquate, aux embryons et à la descendance des plantes obtenues par les procédés ainsi que leur mise en œuvre.
Les exemples qui suivent illustrent la présente demande.
EXEMPLES
I- Le procédé de fabrication de plantes haploïdes H et/ou dihaploïdes DH par gynogenèse induite par du pollen irradié selon F invention
Les expérimentations sont réalisées en serre dont la température de nuit est de 150C et de jour 250C.
Les plantes sont conduites en sac de terreau (2 plantes par sac pour les femelles et 3 plantes par sac pour les mâles), palissées et irriguées au goutte à goutte. La serre est ombrée, ventilée et la régulation des ravageurs se fait par protection biologique intégrée. Le matériel biologique végétal utilisé se constitue comme suit : Plantes femelles : 2 génotypes.
VN001 : 66 Plantes
VG06 : 66 plantes Plantes mâles : 1 génotype
JIB : 90 plantes Les plantes sont étiquetées avec un numéro et le nom de leur génotype.
Etape a) La veille de l'irradiation (ou ionisation), toutes les plantes mâles et femelles sont contrôlées et seules les fleurs qui serviront pour la pollinisation sont conservées. Le nombre de fleurs mâles au bon stade (l'extrémité de la corolle commence à devenir jaune) est comptabilisé de façon à connaître à peu près le nombre de pollinisation qui sera faite pour chaque dose d'irradiation. Il en est fait de même pour les fleurs femelles au bon stade (l'extrémité de la corolle commence à devenir jaune). Des témoins sont préparés :
- Témoin voyageur (V) : les fleurs voyagent dans les mêmes conditions mais ne sont pas irradiées,
- Témoin non- voyageur non coupé (NV) : les fleurs sont cueillies juste avant la pollinisation.
Etape b)
Les fleurs mâles sont prélevées très tôt le matin (5h30 à 6h).
- Conditionnement des fleurs lors du transport et de l'irradiation 10-12 fleurs sont insérées dans chaque bocal qui sera fermé. Les bocaux fermés sont placés dans une glacière contenant un bloc réfrigérant. Sur chaque bocal, le traitement ou le type de témoin est inscrit. L'irradiation du matériel reproducteur du parent mâle se fait le matin pendant une heure. Ceci sera répété à cinq dates différentes et deux doses d'irradiation seront testées dose H 175 Gamma Ray (Gy) dose O 200 Gamma Ray (Gy)
- Estimation du pouvoir germinatif du pollen irradié
Le pollen est mis à germer dans une goutte de 45 μL de milieu à 15 % de saccharose, 100 mg/L de H3BO3 et 700 mg/L de CaCl2, 2H2O.
Les gouttes sont déposées sur lame EPOXY et laissées 45 mn en boîte de Pétri dont l'atmosphère est saturée d'eau, à 26°C.
Le pourcentage de grains germes et de grains éclatés est estimé à la loupe. Etape c)
Deux heures après l'irradiation, le matériel reproducteur du parent mâle est utilisé pour la pollinisation.
Une fleur femelle ou matériel reproducteur du parent femelle est fécondé par une fleur mâle ou matériel reproducteur du parent mâle.
Les jours suivant la pollinisation, la nouaison des fruits est vérifiée et si celle-ci ne se fait pas, le fruit est éliminé.
Etape d) Les fruits seront récoltés 4 à 5 semaines après la pollinisation et étiquetés en fonction de leur génotype, du traitement des fleurs mâles ou du type de témoin. Les fruits sont récoltés, de préférence le matin.
Etape e) Chaque fruit est lavé à l'eau et au savon de Marseille, il est rincé et séché.
Sous le flux laminaire, de l'alcool à 70° est versé sur le fruit qui est ensuite nettoyé sur toute sa surface avec un papier stérile.
A partir de cette étape, toutes les opérations se dérouleront dans des conditions stériles, sous le flux laminaire. LIne incision est réalisée tout autour du fruit puis la chair est écartée à l'aide d'un couteau.
Les graines sont récupérées à l'aide d'une cuillère, dégagées de la chair avec une pince et un scalpel puis comptabilisées.
Les graines sont mises en agitation toute la nuit.
Etape f)
Sous flux laminaire, le bocal rond est vidé dans un bocal haut stérile à travers un entonnoir stérile puis rincé avec de l'eau stérile. Les graines sont ouvertes une à une sous la loupe binoculaire à l'aide d'une pince et d'un scalpel.
Les instruments sont stérilisés régulièrement pour éviter tout risque de contamination. L'embryon est déposé sur un milieu de culture SIC, dont la composition est détaillée dans les tableaux 8 et 9 ci-dessous, dans des boîtes de Pétri 60x15, 4 embryons par boîte de
Pétri.
Les embryons obtenus après fécondation par du pollen irradié n'ont pas la même forme que les embryons normaux. Les boîtes de Pétri sont placées à l'obscurité 1 à 2 nuits en chambre à 20/250C puis elles sont mises à la lumière dans la même chambre à 20/250C pendant 16 H. Etape g)
Les embryons sont mis en culture sur le milieu de culture par le PPM (plant preservative mixture) commercialisé par la société Kalys®.
Les embryons sont repiqués sur milieu S3P (P = PPM) dont la composition figure dans les tableaux 8 et 9.
Les boîtes de Pétri sont surveillées régulièrement. Les embryons sont repiqués s'il y a une contamination par une bactérie ou un champignon.
Les embryons sont repiqués tous les 15 jours en boîte de Pétri sur milieu neuf tant qu'ils ne sont pas suffisamment développés. Dès l'apparition des jeunes feuilles et de petites racines, les embryons sont transférés sur milieu en tubes S3P (cf. composition dans les tableaux 8 et 9).
Les plantules bien développées sont ensuite repiquées en bocal sur S2P ou S4P dont les compositions figurent dans les tableaux 8 et 9.
Etape h)
Dès que le développement foliaire est suffisant, un échantillon de chaque plante est prélevé et il est analysé par cytométrie de flux ainsi qu'à l'aide des marqueurs moléculaires SSR.
Etape hl) Un échantillon de chaque plante est prélevé et le niveau de ploïdie est analysé par cytométrie de flux selon les protocoles développés par de Laat et al. dans Théo. Appl. Genêt, 1984, 67 :463-467 et dans Plant Breeding,1987, 99 : 303-307. Les plantes à ploïdies indéterminées, anormales, sont écartées et les plantes à n chromosomes sont distinguées des plantes à 2n chromosomes.
Etape h2)
Un échantillon de chaque plante est prélevé, l'ADN est extrait selon le protocole CTAB modifié de Tomas et al (1989). Le(s) marqueur(s) SSR est(sont) choisi(s) parmi les SSR définis par les couples d'amorces de séquences SEQ ID N°l à SEQ ID N°16 ci-dessous. Le marqueur FAD2 est défini par les couples d'amorces SEQ ID N° 1 1 et SEQ ID N° 12. La réaction de PCR est réalisée dans un volume réactionnel de 5 μl constitué de la moitié de 5 μl d'ADN dilué, 0.85 μl d'eau, 1 μl de tampon 1Ox, 1 μl de MgC12 (25mM), 1 μl de dNTP (2.5mM), 0.5 μl de chaque amorce (2 μM), 0.075 de queue Ml 3 (8 μM) et 0.075 de Taq Invitrogen (5U/ μl). La réaction de PCR consiste en plusieurs cycles d'amplification décrits comme suit : 1 étape de 5 minutes à 94 0C, 10 cycles à 94 0C pendant 15 secondes puis 57 degrés pendant 15 secondes et enfin 72 0C pendant 30 secondes, puis 30 cycles à 94 0C pendant 15 secondes puis 52 degrés pendant 15 secondes et enfin 72 0C pendant 30 secondes, une élongation finale réalisée à 72 0C pendant 7 minutes.
Pour réaliser l'étape de sélection h (en particulier h2), parmi les huit marqueurs moléculaires microsatellites (SSR) préférés suivants et définis par les amorces nucléotidiques SEQ ID N° 1 à 16 suivantes , les marqueurs FAD2, CMAGN73, CUCNITRA, TJ3, CMBRl 53 et PALTl ont été utilisés :
- Marqueur CMAGN73 défini par le couple d'amorces de séquence nucléotidiques suivantes :
5' ATCCAACTCGACCAAGAAAC 3' (SEQ ID N0I) soit l'amorce sens et
3' CAGCTCTACAACAACATCTC 5' (SEQ ID N°2) soit l'amorce anti-sens.
- Marqueur CMBRl 53 défini par le couple d'amorces de séquence nucléotidiques suivantes :
5' TCAAAGACAAGAAGACCAACCA 3' (SEQ ID N°3) soit l'amorce sens et
3' TGTGCTAAGAGAGAGAGAGAAGATTG 5' (SEQ ID N°4) soit l'amorce anti-sens.
- Marqueur CMBR22 défini par le couple d'amorces de séquence nucléotidiques suivantes :
5' CCAAAACGACCAAATGTTCC 3' (SEQ ID N°5) soit l'amorce sens et 3' ATACAGACACGCCTTCCACC 5' (SEQ ID N°6) soit l'amorce anti-sens.
- Marqueur CMMP73 défini par le couple d'amorces de séquence nucléotidiques suivantes :
5' GCACTTTGAGTAAGAAGCAGA 3' (SEQ ID N°7) soit l'amorce sens et
3' GCTGTGAGGTTGACTACGA 5' (SEQ ID N°8) soit l'amorce anti-sens.
- Marqueur CUCNITRA défini par le couple d'amorces de séquence nucléotidiques suivantes : 5' CAAACCATAACTTCCAAGG 3' (SEQ ID N° 9) soit l'amorce sens et 3' GGAGATCGACGAATTTGA 5' (SEO ID N0 10) soit l'amorce anti-sens. - Marqueur FAD2 défini par le couple d'amorces de séquence nucléotidiques suivantes : 5' CACGAGCAGAGAGATAATAAA 3' (SEO ID N0 1 1) soit l'amorce sens et
3' CCTGAAAGAGAGGAAGAAGAA 5' (SEQ ID N0 12) soit l'amorce anti-sens.
- Marqueur PATLl défini par le couple d'amorces de séquence nucléotidiques suivantes : 5' TACTCCGCCCTCTCTCTC 3' (SEQ ID N0 13) soit l'amorce sens et
3' CAGGTGCAGAATCTGGTAGT 5'(SEQ ID N0 14) soit l'amorce anti-sens.
- Marqueur TJ3 défini par le couple d'amorces de séquence nucléotidiques suivantes : 5' TGGGCCTACGCTACAAACTT 3' (SEQ ID N0 15) soit l'amorce sens et
3' AGCAGCACAAAAGCACTTCA 5' (SEQ ID N0 16) soit l'amorce anti-sens.
Ces amorces ont été réalisées selon les méthodes connues de l'homme du métier. Pour des marqueurs microsatellites donnés, en fonction de la taille des fragments amplifiés par PCR grâce aux amorces spécifiques (cf. tableaux 3 à 6 ci-dessous), les plantes H, ou DH, ou H et DH ont pu être sélectionnées. Ainsi, les marqueurs moléculaires utilisés permettent, entre autres, de déterminer si une plante est issue ou non d'une fécondation, si elle est homozygote ou non.
Si la plante est issue d'une fécondation entre le matériel végétal mâle et le matériel végétal femelle ou si elle n'a pas subi de réduction gamétique, elle est éliminée après analyse avec les marqueurs moléculaires SSR mais si c'est une plante dihaploïde, elle est conservée.
Les plantes n subissent un traitement à la colchicine in vitro pour doubler leur stock chromosomique (cf. étape i) ci-dessous). Ensuite elles sont repiquées, enracinées et sorties
Etape i) Le doublement du stock chromosomique (traitement à la colchicine) : 1- Isoler l'apex principal ainsi que les bourgeons axillaires s'il en existe (boutures),
2- Préparer une solution de colchicine à 5 pour 1000 (0.5 g de colchicine dans 100 ml) et la stériliser,
3- Mettre les boutures dans des petites boites de Pétri stériles (BP 35x10) ,
4- Sous poste de sécurité microbiologique, verser une quantité suffisante de colchicine pour recouvrir les boutures (6 à 8 ml) puis fermer la boite,
5- Laisser tremper 2 heures,
6- Sortir les boutures et les rincer dans des petits pots d'eau stérile, 7- Après les avoir légèrement séchées sur papier stérile, repiquer toutes les boutures en bocaux boule sur leur milieu d'origine,
8- Repiquer des bourgeons se développant sur le milieu d'origine en les numérotant de Cl (« C » pour colchicine) à CX,
9- Lorsque les boutures sont racinées et donc prêtes, les sortir in vivo sur support coco avec un arrosage de la solution nutritive.
H- Résultats des nouaisons et effectifs en fruits en fonction des génotypes (Tableau 1)
Irradiation N 0 1 2 3 4 5 Total
J-I
Jour et Heure irradiation J-I 16H J 8H J 8H J 8H 16H
Jour et Heure pollinisation J 7H J 11H30 J 7H J 12H15 J 11H30
Nombre fruits VG06
10 9 19 1 1 12 61 pollinisés
VG06 Nombre fruits VG06 à
10 9 19 1 1 12 61 général terme
% d'accrochage de
100% 100% 100% 100% 100% 100% VG06
Nombre fruits VN001
1 1 10 19 15 9 61 pollinisés
VN001 Nombre fruits VN001 à
1 1 10 16 14 8 59 général terme
% d'accrochage de
100% 100% 100% 93% 88% 97% VN001
VG06 détail VG06 175 Gy JIB 7 7 13 7 7 41
(Nombre de VG06 200 Gy JIB 3 2 4 2 3 14 fruits) Témoins X X 2 2 2 6
VN001 VN001 175 Gy JIB 7 7 12 9 6 41 détail VN001 200 Gy JIB 3 2 4 5 2 16
(Nombre de
Témoins 1 1 X X X 2 fruits)
Total 21 19 35 30 20 125 Tableau 1
On constate une très bonne nouaison générale. 127 fécondations ont permis le développement de 125 fruits soit 98% de réussite. III- Résultats obtenus en fonction des génotypes des parents et de la dose d'irradiation (ionisation) effectuée (Tableau 2)
Les doses 175 Gy et 200 Gy ont été testées sur le matériel végétal reproducteur du parent mâle JIB et les résultats de la gynogenèse avec le matériel végétal femelle (VNOOl et VG06) figurent ci-dessous.
Figure imgf000036_0001
Tableau 2
Le tableau montre que la dose 200 Gy utilisée pour l'irradiation du pollen est trop forte pour obtenir, avec les génotypes VG06 et VNOOl, des embryons qui se développent. En revanche, la dose de 175 Gy est mieux adaptée car elle permet de produire non seulement plus de fruits avec les deux génotypes femelles testés (VG06 et VNOOl) mais également plus d'embryons se développant (24 pour VG06 et 4 pour VNOOl).
IV- Sélection avec les marqueurs moléculaires
1. Analyse des plantes issues de VNOOl
A/ Analyse des plantes afin d'identifier les plantes contenant du matériel génétique du parent mâle (Tableau 3) :
Les plantes hybrides VN001 utilisées comme femelle dans le procédé de production de plantes par gynogenèse avec irradiation du matériel reproducteur du parent maie possèdent un allèle de 171 paires de base pour le marqueur FAD2 alors que les plantes JIB utilisées comme plante mâle possèdent un allèle de 169 paires de bases pour ce même marqueur. Similairement, l'allèle du marqueur CMAGN73 est de 128 paires de bases pour VN001, alors qu'il est de 132 pour JIB et l'allèle du marqueur Cucnitra est de 160 paires de bases pour VNOOl, alors qu'il est de 165 pour JIB.
Le tableau 3 montre l'analyse moléculaire des plantes issues de VN001 selon le procédé de la présente invention et indique, pour chaque plante testée, la présence ou l'absence de matériel génétique du parent mâle.
Figure imgf000037_0001
Tableau 3
Ce tableau 3 montre que les marqueurs FAD2, CMAGN73 et CUCNITRA permettent d'identifier les plantes possédant du génome mâle. Après une PCR utilisant les amorces (SEQ ID N0I l et 12 définies ci-dessus) spécifiques du marqueur moléculaire FAD2, l'analyse de cette PCR révèle pour les plantes 1, 3 et 4 la présence de l'allèle de 169 paires de bases spécifique du matériel reproducteur mâle JIB. Les plantes 1, 3 et 4 possèdent donc du génome mâle dans leur génome. Ces résultats démontrent donc que l'utilisation de marqueur(s) moléculaire(s) déterminé(s) (ici CMAGN73, CUCNITRA et particulièrement FAD2) permet de faire une analyse et une sélection efficace et certaine de l'origine des plantes produites.
B/ Analyse des plantes afin d'identifier les plantes homozygotes des plantes hétérozygotes (Tableau 4) :
Les plantes hybrides VN001 utilisées comme femelle dans le procédé de production de plantes par gynogenèse avec irradiation du matériel reproducteur du parent mâle possèdent un allèle de 130 paires de base et un allèle de 138 paires de bases pour le marqueur TJ3. Similairement, les allèles du marqueur CMBRl 53 sont de 166 et 182 paires de bases pour VN001, et ceux de PLATl sont de 195 et 204 paires de bases. Le tableau 4 montre l'analyse moléculaire des plantes issues de VNOOl selon le procédé de la présente invention et indique, pour chaque plante testée, la présence d'un ou plusieurs allèles de chaque marqueur.
Figure imgf000038_0001
Tableau 4
Ce tableau montre que les plantes 1 et 3 sont hétérozygotes. En effet grâce au marqueur TJ3, on constate la présence d'un allèle de 130 paires de bases et d'un autre allèle de 138 paires de bases. Avec les marqueurs TJ3, CMBRl 53 et PALTl, les plantes 2 et 4 apparaissent homozygotes. Ces résultats démontrent que l'utilisation de marqueur(s) moléculaire(s) déterminé(s) (ici TJ3, CMBR153, PATLl) permet de faire une analyse et une sélection efficace et certaine de l'état homozygote/hétérozygote, et éventuellement de ploïdie, des plantes produites.
2. Analyse des plantes issues de VG06
AJ Analyse des plantes afin d'identifier les plantes contenant du matériel génétique du parent mâle (Tableau 5) :
Les plantes hybrides VG06 utilisées comme femelle dans le procédé de production de plantes par gynogenèse avec irradiation du matériel reproducteur du parent maie possèdent un allèle de 171 paires de base pour le marqueur FAD2 alors que les plantes JIB utilisées comme plante mâle possèdent un allèle de 169 paires de bases pour ce même marqueur.
Similairement, 1* allèle du marqueur Cucnitra est de 160 pour VN001, alors qu'il est de 165 pour JIB et l'allèle du marqueur CMAGN73 est de 128 paires de bases pour VG06, alors qu'il est de 132 pour JIB
Le tableau 5 montre l'analyse moléculaire des plantes issues de VG06 selon le procédé de la présente invention et indique, pour chaque plante testée, la présence ou l'absence de matériel génétique du parent mâle.
Figure imgf000039_0001
Tableau 5
De la même façon que pour les analyses avec VNOOl (tableau 3), grâce aux marqueurs moléculaires FAD2, CUCNITRA, CMAGN73, ce tableau permet de définir les plantes contenant du génome mâle : les plantes 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 18 et 19. Ces résultats démontrent donc que l'utilisation de marqueur(s) moléculaire(s) déterminé(s) (ici FAD2, CUCNITRA, CMAGN73) permet de faire une analyse et une sélection efficace et certaine de l'origine des plantes produites.
B/ Analyse des plantes afin d'identifier les plantes homozygotes des plantes hétérozygotes (Tableau 6) :
Les plantes hybrides VG06 utilisées comme femelle dans le procédé de production de plantes par gynogenèse avec irradiation du matériel reproducteur du parent maie possèdent un allèle de 130 paires de base et un allèle de 138 paires de bases pour le marqueur TJ3. Similairement, les allèles du marqueur CMBRl 53 sont de 166 et 182 paires de bases pour VG06, et ceux de PLATl sont de 195 et 204 paires de bases.
Le tableau 6 montre l'analyse moléculaire des plantes issues de VG06 selon le procédé de la présente invention et indique, pour chaque plante testée, la présence d'un ou plusieurs allèles de chaque marqueur.
Figure imgf000040_0001
Tableau 6
Ce tableau 6 montre qu'avec les marqueurs TJ3, CMBRl 53 et PALTl, seules les plantes 4 et 6 sont homozygotes, les autres plantes apparaissant hétérozygotes avec ces marqueurs moléculaires. Ces résultats démontrent que l'utilisation de marqueur(s) moléculaire(s) déterminé(s) (ici TJ3, CMBR153, PATLl) permet de faire une analyse et une sélection efficace et certaine de l'état homozygote/hétérozygote, et éventuellement de ploïdie, des plantes produites. V- Tableau récapitulatif de l'effet des doses d'irradiation sur l'obtention de plantes hétérozygotes et de plantes haploïdes (Tableau 7)
Figure imgf000041_0001
Tableau 7
Les doses de 25 à 50 Gy entrainent la production de nombreuses plantes, toutes identifiées comme hétérozygotes. La dose de 175 Gy permet non seulement de diminuer le nombre de plantes produites à analyser mais aussi d'augmenter considérablement le nombre de plantes haploïdes parmi les plantes produites. Comme ceci a été largement expliqué ci- dessus, ces plantes haploïdes sont particulièrement intéressantes. Par conséquent, ce tableau démontre que la dose d'irradiation influe sur la réussite du procédé mis en ouvre dans la présente invention et que cette dose peut s'optimiser pour une meilleure production de plantes haploïdes. Ainsi, avec la dose de 175 Gy, il est possible d'améliorer la production de plantes haploïdes H et haploïdes doublées HD, par gynogenèse induite par un gamétophyte mâle irradié et d'obtenir par conséquent une stabilisation du génome des plantes produites avec un nombre réduit de générations.
VI- Milieux de culture
Figure imgf000041_0002
Tableau 8
Figure imgf000042_0001
Tableau 9
Détails des compositions du tableau 9 : - Milieu TZ4 sans sucrose ni agar :
Macro élément CP : en mg -1
KNO3 2150
NH4NO3 1238
Ca(NO3)2, 4 H2O 50
CaCl2,2H2O 313
MgSO4JH2O 412
KCl 7
Na H2PO4,H2O 38
KH2PO4 142
(NH4)2SO4 34
Fer EDTA : en mg. L "•
FeSO4JH2O 27,8
Na2EDTA 37,8
Micro Elément CP : en mg -1
MnSO45H2O 22,13
H3BO3 3,15
ZnSO4JH2O 3,62
Na2MoO4 0,188
CuSO4,5H2O 0,016
CoCl2 0,016
KI 0,695 Vitamines P : en μg. L
Méso Inositol 50,35 mg . L '
Thiamine 600 μg. L
Acide nicotinique 700
Pyridoxine 5500
Panthothénate de calcium 500
Biotine 5
- Milieu TZ2 avec sucrose :
Macro élément MS : en mg . L ~ι
KNO3 1900
NH4NO3 1650
Ca Cl2 332.02
Mg SO4, 180.54
KH2PO4 170
FeNa EDTA : 36.70
Micro Elément MS : en mg . L "1
MnSO45H2O 16.90
H3BO3 6.20
ZnSO4, 7H2O 8.60
Na2MoO4, 2H2O 0,25
CuSO4,5H2O 0,025
CoCl2, 6H2O 0,025
KI 0,83
Vitamines MOREL : en mg . L -1
Méso Inositol 100 mg . L "1
Thiamine 1
Acide nicotinique 1
Pyridoxine 1
Panthothénate de calcium 1
Biotine 0.01
Sucrose : 30 000.00 mg/1

Claims

REVENDICATIONS
1- Procédé de production de plantes haploïdes H, haploïdes doublées HD et/ou dihaploïdes DH, les HD et DH étant homozygotes ou essentiellement homozygotes, ce procédé étant du type de ceux relevant de la technique de gynogenèse induite par du pollen irradié, caractérisé en ce qu'il comprend : une étape d'irradiation du matériel reproducteur du parent mâle à une dose comprise entre 160 et 190 Gamma Ray, de préférence entre 165 et 185 Gamma Ray (Gy), ou une étape de sélection des plantes haploïdes H, ou DH, ou H et DH par utilisation de marqueur(s) moléculaire(s), ou une étape d'irradiation du matériel reproducteur du parent mâle à une dose comprise entre environ 165 et 185 Gamma Ray (Gy) et une étape de sélection des plantes haploïdes H, ou DH, ou H et DH par utilisation de marqueur(s) moléculaire(s).
2- Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes : a) Mettre en œuvre du matériel reproducteur du parent mâle, b) Irradier ledit matériel reproducteur du parent mâle à une dose comprise entre 160 et 190 Gamma Ray (Gy), de préférence entre 165 et 185 Gamma Ray, c) Polliniser le matériel reproducteur du parent femelle hybride avec ledit matériel reproducteur du parent mâle irradié, d) Récolter les fruits dont les graines portent des embryons, e) Extraire les graines desdits fruits, f) Extraire les embryons desdites graines, g) Mettre en culture les embryons sur un milieu approprié jusqu'à l'obtention d'une plante.
3- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comporte en outre, après l'étape g), une étape h) consistant à sélectionner les plantes haploïdes H, ou DH, ou H et DH par cytométrie de flux, ou par utilisation de marqueur(s) moléculaire(s), ou par cytométrie de flux et utilisation de marqueur(s) moléculaire(s). 4- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'étape h de sélection des plantes haploïdes H, ou DH, ou H et DH comporte :
-I- l'utilisation de marqueur(s) moléculaire(s) spécifique(s) d'allèle(s) donné(s) contenu(s) dans le matériel génétique du parent mâle irradié pour sélectionner parmi les plantes obtenues à l'issue de l'étape g), les plantes qui sont exemptes de matériel génétique du parent mâle irradié ou qui en possèdent une quantité insuffisante pour provoquer dans la descendance desdites plantes, une disjonction d' un caractère phéno typique et/ou génotypique ; -II- l'utilisation de marqueur(s) moléculaire(s) spécifique(s) d'allèle(s) donné(s) contenu(s) dans le matériel génétique du parent femelle hybride, ce(s) marqueur(s) permettant de déterminer l'état homozygote/hétérozygote des plantes à sélectionner c'est-à- dire les plantes obtenues à l'issue de l'étape g), ce(s) marqueur étant utilisé(s) pour sélectionner les plantes homozygotes ou essentiellement homozygotes, en particulier les plantes DH.
5- Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte en outre une étape i) de doublement du stock chromosomique des plantes haploïdes H.
6- Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'étape i) de doublement du stock de chromosomes est réalisée à l'aide de la colchicine.
7- Procédé, en particulier selon l'une des revendications précédentes, de production de plantes haploïdes H, haploïdes doublées HD et/ou dihaploïdes DH, les HD et DH étant homozygotes ou essentiellement homozygotes, par gynogenèse induite avec irradiation du matériel reproducteur du parent mâle, caractérisé en ce qu'il comprend une étape préalable de détermination de la (ou des) dose(s) d'irradiation adéquate(s) pour augmenter les rendements desdites plantes en fonction de facteurs multiples donnés et choisis de préférence parmi l'espèce végétale, les génotypes du parent mâle et du parent femelle, les conditions climatiques et physiologiques, le moment de la récolte des fruits, le niveau de croissance des embryons recueillis en vue de leur culture, le niveau de développement des embryons mis en culture, cette étape préalable consistant : i) à tester, pour un facteur donné, différentes doses d'irradiation sur le matériel végétal reproducteur du parent mâle, ii) à mettre en œuvre, pour chaque dose d'irradiation testée, une étape h') de sélection des plantes haploïdes H, ou DH, ou H et DH, ladite cette étape h' comportant :
-I- l'utilisation de marqueur(s) moléculaire(s) spécifique(s) d'allèle(s) du matériel génétique du parent mâle irradié pour sélectionner parmi les plantes obtenues à l'issue de la gynogenèse induite par du pollen irradié, les plantes qui sont exemptes de matériel végétal du parent mâle irradié ou qui en possèdent une quantité insuffisante pour provoquer, dans la descendance desdites plantes, une disjonction d'un caractère phénotypique et/ou génotypique ; -II- l'utilisation de marqueur(s) moléculaire(s) spécifique(s) d'allèle(s) donné(s) spécifique(s) du matériel génétique du parent femelle hybride mis en œuvre dans la gynogenèse, ce(s) marqueur(s) permettant de déterminer l'état homozygote/hétérozygote des plantes à sélectionner c'est-à-dire des plantes obtenues à l'issue de la gynogenèse, ce(s) marqueur(s) étant utilisé(s) pour sélectionner les plantes homozygotes ou essentiellement homozygotes, en particulier les plantes DH ; iii) à dénombrer, pour chaque dose d'irradiation testée, des plantes haploïdes H, ou
DH, ou H et DH obtenues ; iv) à calculer, pour chaque dose d'irradiation testée et à partir des numérations issues de (iii), le rendement en plantes haploïdes H, ou DH, ou H et DH obtenues ; v) à comparer les numérations issues de (iii) et/ou les rendements issus de (iv) pour en déduire la (ou les) dose(s) d'irradiation adéquate(s).
8- Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les plantes parents sont choisies dans le genre Cucurbita.
9- Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le(s) marqueur(s) moléculaire(s) utilisé(s) est(sont) un(des) marqueur(s) microsatellite(s) (SSR).
10- Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le(s) marqueur(s) moléculaire(s) utilisé(s) est(sont) choisi(s) parmi les marqueurs définis par un ou des couples d'amorces de séquences nucléotidiques SEQ ID N° 1 à 16, de préférence SEQ ID N°3 à 14. 11 - Marqueur moléculaire, caractérisé en ce qu'il est un marqueur microsatellite (SSR) choisi parmi les marqueurs définis par un ou des couples d'amorces de séquences nucléotidiques annexées SEQ ID N° 1 à 16, de préférence SEQ ID N°3 à 14.
12- Embryons haploïdes H de plantes tels qu'obtenus par le procédé tel que défini dans l'une des revendications 1 à 10.
13- Embryons dihaploïdes DH de plantes tels qu'obtenus par le procédé tel que défini dans l'une des revendications 1 à 10.
14- Descendance des plantes obtenues par le procédé tel que défini dans l'une des revendications 1 à 10.
15- Descendance des plantes obtenues par le procédé tel que défini à l'une des revendications 1 à 10, ladite descendance étant obtenue par croisement entre deux plantes (HD ou DH) issues du procédé tel que défini dans l'une des revendications 1 à 10 ou par croisement entre une plante HD ou DH issue du procédé tel que défini dans l'une des revendications 1 à 10 et une plante issue d'une lignée stable ou issue d' autofécondations répétées.
16- Semences de plantes obtenues par le procédé tel que défini dans l'une des revendications 1 à 10 ou à partir des embryons tels que définis dans l'une des revendications 12 ou 13, ainsi qu'à partir de plantes issues de la descendance telle que définie dans l'une des revendications 14 ou 15.
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