[go: up one dir, main page]

WO2010004176A1 - Mutations dans la proteine ns5b du vhc - Google Patents

Mutations dans la proteine ns5b du vhc Download PDF

Info

Publication number
WO2010004176A1
WO2010004176A1 PCT/FR2009/051222 FR2009051222W WO2010004176A1 WO 2010004176 A1 WO2010004176 A1 WO 2010004176A1 FR 2009051222 W FR2009051222 W FR 2009051222W WO 2010004176 A1 WO2010004176 A1 WO 2010004176A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
residue
seq
position corresponding
hcv
ns5b protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2009/051222
Other languages
English (en)
Inventor
Emmanuel Drouet
Yassine Rechoum
Florence Fouque
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite Joseph Fourier Grenoble 1
Institut Pasteur
Original Assignee
Universite Joseph Fourier Grenoble 1
Institut Pasteur
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite Joseph Fourier Grenoble 1, Institut Pasteur filed Critical Universite Joseph Fourier Grenoble 1
Priority to EP09784435A priority Critical patent/EP2291518A1/fr
Priority to JP2011515563A priority patent/JP2011525803A/ja
Priority to US12/996,521 priority patent/US20110091969A1/en
Publication of WO2010004176A1 publication Critical patent/WO2010004176A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/127—RNA-directed RNA polymerase (2.7.7.48), i.e. RNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to the identification of novel mutations present in the hepatitis C virus (HCV) NS5B protein amplified in mosquitoes of the genus Aedes.
  • HCV hepatitis C virus
  • HCV hepatitis C virus
  • HCV a member of the genus Hepacivirus
  • Flaviviridae which are enveloped single-stranded RNA viruses, among which are viruses responsible for major epidemic diseases such as Yellow Fever (YF), Dengue fever (DEN) and Dengue hemorrhagic fever (DHF), Japanese encephalitis (JE), St. Louis encephalitis (SLE) and West NiIe fever (WN), to name only the most important ones.
  • YF Yellow Fever
  • DEN Dengue fever
  • DHF Dengue hemorrhagic fever
  • JE Japanese encephalitis
  • SLE St. Louis encephalitis
  • WN West NiIe fever
  • Flaviviruses are transmitted by insect vectors, according to very different epidemiological modalities. Some diseases are typically human and never affect animals such as DEN and DHF; other infections are more zoonotic and more or less accidentally affect humans, such as JE, SLE and WN. Finally, some Flaviviruses can circulate epidemically in both human and animal populations (WN). These different epidemiological modalities nevertheless have common bases such as viral amplification in insect cells.
  • the HCV genome consists of a single-stranded RNA of about 9.6 kilobases, which encodes a precursor polyprotein of about 3000 amino acids.
  • This polyprotein consists of the viral proteins in the following order: C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B.
  • NS5B corresponds to an RNA-dependent RNA polymerase (RdRp), described for example in the document WO 96/37619.
  • RdRp RNA-dependent RNA polymerase
  • HCV hepatitis C virus
  • the viral load used comes from a serum, advantageously of human origin, for example that of a chronic HCV hepatitis carrier of genotype Ib.
  • the present invention relates to a mutated, hepatitis C virus (HCV) NS5B protein for replication.
  • HCV hepatitis C virus
  • HCV NS5B protein means the RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) encoded by the 3 'end of the coding region of the viral genome. Although susceptible to variation, this protein has been characterized as having 591 residues or amino acids. This size is especially conserved for the NS5B proteins derived from the genotype Ib or 2b viruses described in the prior art mentioned above.
  • the sequence available in the databases under the number EF507504 was chosen as a reference. It corresponds to an entire genome of genotype Ib.
  • the C-terminal region of the corresponding polyprotein contains the NS5B protein which has the sequence identified as SEQ ID NO: 1 in the context of the present application.
  • HCV NS5B protein is advantageously understood to mean a protein having at least 70% identity, advantageously 80%, even 85%, 90% or even 95% identity. with the present sequence SEQ ID NO: 1.
  • it is a functional equivalent of the sequence SEQ ID NO: 1, for which the enzymatic activity can easily be tested using the test described in the document Lohmann et al. from 1997.
  • a protein of interest according to the invention carries a mutation at at least one of the following positions: at the position corresponding to residue 262 of SEQ ID NO: 1; and / or at the position corresponding to residue 265 of SEQ ID NO: 1; and / or at the position corresponding to residue 316 of SEQ ID NO: 1.
  • the single mutant (1262) carrying an isoleucine (1262) at the position corresponding to residue 262 of SEQ ID NO: 1 is excluded.
  • the double mutant (I262 / C316) carrying an isoleucine at the position corresponding to residue 262 of SEQ ID NO: 1 and a cysteine at the position corresponding to residue 316 of SEQ ID NO: 1 is excluded.
  • the residue at the position corresponding to residue 262 of SEQ ID NO: 1 is not an amino acid chosen from the following group: valine (Val or V), leucine (Leu or L), isoleucine (Ile or I) and cysteine (Cys or C), in particular isoleucine (Ile or I). Even more preferably, the residue at the position corresponding to residue 262 of SEQ ID NO: 1 is an alanine residue (Ala or A).
  • the residue observed at the position corresponding to the residue 265 of SEQ ID NO: 1 is not a proline (Pro or P). Even more advantageously, it is a serine (Ser or S).
  • the residue at the position corresponding to residue 316 of SEQ ID NO: 1 is not an amino acid chosen from the following group: asparagine (Asn or N), cysteine (Cys or C) and histidine (His or H) , in particular cysteine (Cys or C). Even more preferably, the residue at the position corresponding to residue 316 of SEQ ID NO: 1 is an aspartic acid or aspartate residue (Asp or D).
  • residues are also found at positions 47, 50 and 101 of the sequence SEQ ID NO: 2 corresponding to residues 216 to 345 of NS5B encoded by the viral genome used for infection at day 0 (OJ), even if otherwise occasional divergences are observed.
  • position corresponding to the residue indicates that the exact numbering of amino acids may vary depending on the sequences. Thus, a corresponding position can be identified by aligning the sequences so as to obtain the highest degree of homology around the position in question.
  • the NS5B protein according to the invention carries the three mutations described above.
  • an NS5B protein according to the invention comprises the sequence SEQ ID NO: 3.
  • SEQ ID NO: 3 the sequence SEQ ID NO: 3.
  • fragments of the NS5B protein according to the invention comprising at least one point mutation at one of the three key positions identified within the scope of the present invention.
  • these are functional fragments whose RdRp activity can easily be tested using the test described in Lohmann et al. from 1997.
  • Another aspect of the invention relates to a nucleic acid sequence encoding a mutated NS5B protein as described above.
  • nucleic acid is meant both a DNA molecule and an RNA molecule.
  • the nucleic sequences presented in the context of the invention correspond to DNA but the corresponding RNA sequences are easily deduced by those skilled in the art by replacing T with U.
  • a nucleic acid sequence according to the invention may also correspond strictly to the NS5B coding part, as well as to an entire HCV genome carrying the mutations defined above.
  • the codon coding for the residue corresponding to position 262 of NS5B must code for an alanine and may therefore correspond to GCA, GCC, GCG or GCT.
  • the codon coding for the residue corresponding to position 265 of NS5B must code for a serine and may therefore correspond to TCA, TCC, TCG, TCT, AGC or AGT.
  • the codon encoding the residue corresponding to position 316 of NS5B must encode an aspartic acid and may therefore correspond to GAC or GAT.
  • sequence encoding the portion 216 to 345 of HCV NS5B at day 0 appears in the sequence SEQ ID NO: 4.
  • nucleic acid sequence according to the invention can therefore comprise the sequence SEQ ID NO: 5.
  • proteins, nucleic acid sequences and fragments thereof described in the present invention are of human origin.
  • another aspect of the invention is a vector comprising a nucleic acid sequence according to the invention.
  • this sequence is placed under the control of regulatory sequences able to ensure its expression, in particular a promoter.
  • this embodiment allows the production of a mutated NS5B protein carrying at least one, two, or even the three mutations identified above.
  • a HCV replicon is a nucleic acid molecule capable of self-replicating in cell culture and producing detectable levels of one or more viral proteins.
  • the HCV replicon expresses the HCV-derived components of the replication machine and contains cis elements required for replication in cell culture.
  • Replicons of HCV already exist, such as, for example, that described in EP 1 666 598. It is therefore possible to modify the NS5B coding sequence in this replicon at the positions and with the aid of the mutations described above. Alternatively, it is possible to replace the region of the replicon encoding NS5B by a sequence according to the invention. A chimeric replicon is then obtained. It is thus possible to increase the efficiency of already existing replicons.
  • host cells comprising vectors or replicons as defined above.
  • these cells are derived from mosquitoes, advantageously of the genus Aedes. Without wishing to be bound to any theory, it is assumed that these mutations resulting from selection in this mosquito, the combination of this host and the mutated NS5B protein according to the invention should give rise to a particularly efficient replication system.
  • Figure 1 illustrates mosquito competence for HCV replication, 21 days after contact between the mosquito and the virus. Competence depends on the genus of the mosquito: The HCV genome was detected by qRT-PCR, 21 days after incubation with the virus in mosquitoes of the genus Aedes but not in those of the genus Culex.
  • Figure 2 illustrates the evolution of the detection of the viral genome in the bodies and heads of mosquitoes.
  • the total RNA extracts were analyzed after qRT-PCR, preceded by amplification of the total transcriptome amplification ("whole transcriptome amplification" or WTA). From the 15 th day, the combination WTA-qPCR revealed the presence of the HCV genome in the head of mosquitoes.
  • Figure 3 shows the sequence alignment of the amplified NS5B region.
  • the NS5B 8228-8628 positive mosquito region was sequenced on day 21 (D21) and compared to infectious mosquitoes on day 0 (D0).
  • the sequence NS5B corresponding to the sequence EF407504 served as references.
  • the triangles show the amino acids mutated on day 21 (262 Val / Ala, 265 Pro / Ser, 316 Asn / Asp).
  • the sequence analysis focused on 2 regions of the viral genome because they are frequently sequenced and highly informative at the phylogenetic level: the 5'UTR region is a highly conserved region while the NS5B gene has been reported to be particularly affected by mutations. adaptive during the acute phase of infection (Kuntzen et al., 2007).
  • the individuals tested come from a breeding made from mosquitoes (eggs, larvae and adults) collected on the ground in the urban area of Marseille for the species Culex pipiens and in the reserve of the Tour du Valat in the Camargue for species Aedes vexans and Aedes caspius. These farms were carried out at the ENSAM premises located at the Domaine du Merle, Salon de elle. These farms are made in a classic insectarium, with breeding standards. The larvae are fed with yeast and fish feed and the adults are fed a sucrose solution. The blood meals of Culex and Aedes are composed of red blood cells washed with sheep, the purpose of the washing being to eliminate the interference of the elements of the blood. 2. Introduction of mosquitoes in the Secure Laboratory (level 2+)
  • the viral solution containing HCV virus (serum patient with chronic hepatitis 2 E 6 copies / ml) is transported by special transporter to L2 + where mosquitoes are placed.
  • the viral solution is provided by the virology laboratory of the Albert-Michallon University Hospital in Grenoble.
  • the viral solution is stored in the freezer at -80 ° C. of the L2 +.
  • the throat containing the infected blood and heated to 37 ° C is presented to females, deprived of glucose for 24 hours.
  • the throat is placed on each box and left on site about 4 hours for taking blood meals.
  • the throat with uncontaminated blood is presented to the batch of negative control females.
  • they are recovered by mouth aspirator, asleep by the chloroform vapor and sorted under a binocular loupe.
  • Females having gorged blood are put back in the cages.
  • An artificial roost is left in each metal cage for females to lay (water tank for Aedes females and wetland for Culex females). From this day on, the metal cages containing the siped females are neither opened nor manipulated until the sacrifice of the mosquitoes.
  • mosquitoes are sacrificed by placing the metal cage in the cold. The mosquitoes are then placed individually in 1.5 ml tubes, identified and returned to the freezer until the RNA extraction step before PCR. Negative witnesses, drunk on non-viremic blood are also sacrificed. The lot of mosquitoes, sacrificed on the day of OJ and put in the freezer at -80 ° C., constitute the positive controls OJ of gorging, extraction and amplification of the viral RNA.
  • the primers used as well as the probe (for qPCR) were designed for amplification of the conserved region of the 5 'non-coding end of the viral genome.
  • GCG ACC CAA CAC TCG TAC GCT-3 ') SEQ ID NO: 7
  • the probe used for qPCR is TM416 (5'-6Fam-AAC CCG CTC AAT TGG GG A-Tamra-3 ') (SEQ ID 8) located between nucleotides -137 and -119.
  • the RT-PCR was carried out under the following conditions: The retrotranscription is carried out for 30 minutes at 50 ° C., followed by a step of deactivation of the reverse transcriptase (15 minutes at 95 ° C.), then 45 cycles of PCR alternating between elongation step (1 minute at 63 ° C.) and a denaturation step (30 seconds at 90 ° C.).
  • the viral RNA was extracted according to the protocol described in point 8.
  • a) Amplification The regions to be sequenced were first amplified by qRT-PCR using the appropriate primers. For the IRES region 52-271, the primers ITS (SEQ ID NO: 7) and 2CH (SEQ ID NO: 6) described above were used. For the region 8228-8628 nucleotides of the NS5b gene, the primers IPR and 2PR described in the reference Sandres-Sauné et al. 2003.
  • Gel migration The amplification products are migrated in a 1% agarose gel with a molecular weight marker. At the end of the migration, the amplicons were revealed by BET. The band of interest was cut out and the sequences contained in the band, extracted from the gel.
  • Cloning was carried out in the vector pUC18. In order to be able to carry out the insertions, the restriction sites (corresponding to the restriction enzymes) present on the vector pUC18 and absent on the amplicons were determined: the EcoRI and HindIII sites were selected. New pairs of primers were chosen from the primers described above, to which two short sequences were added on either side, one containing the restriction site of EcoRI and the other the HindIII restriction site, so that that Tamplicon can be introduced into the open and dephosphorylated vector. d) Transformation: The cloning product was introduced into the TOP10 competent bacteria. The bacteria were then plated in petri dishes containing agar-Ampicillin LB agar.
  • a PCR was carried out directly on the bacteria: the clones having grown were transplanted by the tip of a cone of 10 ⁇ l, the tip has firstly soaked in a PCR tube containing the master mix (see composition above), and then used to inoculate the petri dish containing agar-Ampicillin LB agar. At the end of the subculture step, the PCR was started and the Petri dishes were incubated at 37 ° C overnight. f) The PCR products are migrated in a 1% agarose gel with a molecular weight marker.
  • RNA viruses A common feature of replication of RNA viruses is the appearance of adaptive mutations.
  • HCV RNA sequences extracted from mosquitoes positive at 21 days (D21) after infection were compared to samples at day 0 (OJ).
  • Two regions of the HCV genome were selected: 220 nucleotides (region 52-271) from the region 5'UTR (5 'untranslated region') and 400 nucleotides (region 8228-8628) of the non-structural protein coding part 5B (NS5B or RdRP for "RNA dependent RNA polymerase").
  • NNS5B or RdRP non-structural protein coding part 5B
  • No mutations were noted in the 220 nucleotides analyzed in the 5'UTR region.
  • 3 adaptive mutations (262V al / Ala, 265 Pro / Ser and 316 Asn / Asp) were identified among the 400 nucleotides of RdRP that correspond to the active site ( Figure 3).
  • the extrinsic cycle of HCV defined as the time required for the parasite to replicate in its host, could be estimated to be greater than 15 days at an ambient temperature of 25 ° C.
  • ingested HCV could i) pass through the mesentery tissues of the mosquito, ii) replicate itself in other tissues, particularly the salivary glands.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

La présente invention concerne une protéine NS5B du virus de l'hépatite C (VHC), performante pour la réplication, qui porte une mutation ponctuelle à l'une au moins des positions suivantes : - à la position correspondant au résidu 262 de SEQ ID NO : 1; et/ou - à la position correspondant au résidu 265 de SEQ ID NO : 1; et/ou - à la position correspondant au résidu 316 de SEQ ID NO : 1.

Description

MUTATIONS DANS LA PROTEINE NS5B DU VHC
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention concerne l'identification de nouvelles mutations présentes dans la protéine NS5B du virus de l'Hépatite C (VHC) amplifié dans des moustiques du genre Aedes.
L'identification de telles mutations, associées à une réplication efficace, offre des perspectives prometteuses notamment dans le cadre des réplicons.
ETAT ANTÉRIEUR DE LA TECHNIQUE
Le virus de l'hépatite C (VHC) a été identifié comme étant responsable de l'hépatite non A non B développée, évoluant fréquemment vers des pathologies chroniques malignes, du type cirrhose du foie ou encore carcinome hépato-cellulaire. Il est estimé qu'environ 3% de la population mondiale est infectée par le VHC, avec une augmentation des infections de 3 à 4 millions de personnes par année (Neumayr et al., 2000).
Le VHC, membre du genre Hepacivirus, appartient à la famille des Flaviviridae qui sont des virus à ARN monobrins enveloppés, parmi lesquels on rencontre les virus responsables de maladies épidémiques majeures telles que la Fièvre Jaune (YF), la Dengue (DEN) et la Dengue Hémorragique (DHF), l'Encéphalite Japonaise (JE), l'Encéphalite de Saint-Louis (SLE) et la fièvre de West NiIe (WN), pour ne citer que les plus importantes.
Une majorité de Flavivirus sont transmis par des insectes vecteurs, selon des modalités épidémio logiques très différentes. Certaines maladies sont typiquement humaines et ne touchent jamais les animaux comme la DEN et la DHF ; d'autres infections sont plutôt zoonotiques et touchent plus ou moins accidentellement l'être humain, comme la JE, la SLE et la WN. Enfin certains Flavivirus peuvent circuler de façon épidémique aussi bien dans des populations humaines qu'animales (WN). Ces modalités épidémio logiques différentes ont pourtant des bases communes telles qu'une amplification virale dans des cellules d'insectes.
Concernant le VHC, les voies de transmission aujourd'hui bien établies sont essentiellement: transmission par les produits sanguins, toxicomanie et contexte nosocomial. Toutefois, 30 à 40% des infections à VHC aujourd'hui répertoriées chez l'homme ont une origine inexpliquée, dans la mesure où aucune des conditions listées n'est réunie (Neumayr et al., 2000).
Le génome du VHC est constitué d'un ARN simple brin de 9,6 kilobases environ, qui code une polyprotéine précurseur d'environ 3000 acides aminés. Cette polyprotéine est constituée des protéines virales dans l'ordre qui suit : C-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4A- NS4B-NS5A-NS5B.
Parmi les protéines non structurales, NS5B correspond à une ARN polymérase ARN- dépendante (RdRp), décrite par exemple dans le document WO 96/37619.
La réplication efficace du VHC en culture cellulaire a été associée à des mutations adaptatives qui augmentent fortement l'efficacité de réplication, identifiées notamment dans le gène codant NS5B. Ainsi, le document WO 2005/047463 décrit 3 mutations (serine en position 24, isoleucine en position 31 et leucine en position 392) dans NS5B d'un VHC de génotype 2b, augmentant l'efficacité d'un réplicon intégrant cette séquence.
Or, dans la lutte menée contre les hépatites virales de type C, un obstacle majeur entravant le développement d'un traitement et d'un vaccin efficace est l'absence d'un système permettant la multiplication à haut niveau du virus in vitro. Il existe donc un besoin persistant de développer des systèmes, notamment des réplicons plus efficaces.
EXPOSE DE L'INVENTION
II s'avère que le Demandeur a réussi à obtenir une amplification in vivo du virus de l'hépatite C (VHC) dans des moustiques du genre Aedes.
De manière privilégiée, la charge virale utilisée provient d'un sérum, avantageusement d'origine humaine, par exemple celui d'un porteur d'hépatite chronique VHC de génotype Ib.
Après une amplification d'une durée moyenne de 21 jours, l'analyse du génome du VHC ayant été efficacement répliqué a révélé la présence de mutations dans NS5B.
Ainsi et selon un premier aspect, la présente invention a trait à une protéine NS5B du virus de l'hépatite C (VHC) mutée, performante pour la réplication.
On entend par « protéine NS5B du VHC », l'ARN polymérase ARN-dépendante (RdRp) codée par l'extrémité 3' de la région codante du génome viral. Bien que susceptible de variations, cette protéine a été caractérisée comme comportant 591 résidus ou acides aminés. Cette taille est notamment conservée pour les protéines NS5B issues des virus de génotype Ib ou 2b décrits dans l'art antérieur mentionné ci- dessus.
La séquence disponible dans les bases de données sous le numéro EF507504 a été choisie comme référence. Elle correspond à un génome entier de génotype Ib. La région C- terminale de la polyprotéine correspondante contient la protéine NS5B qui présente la séquence identifiée SEQ ID NO : 1 dans le cadre de la présente demande.
Ainsi et dans le cadre de l'invention, on entend avantageusement par « protéine NS5B du VHC », une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement 80%, voire 85%, 90%, voire même 95% d'identité avec la présente séquence SEQ ID NO : 1. Avantageusement, il s'agit d'un équivalent fonctionnel de la séquence SEQ ID NO : 1, pour lequel l'activité enzymatique peut être aisément testée à l'aide du test décrit dans le document Lohmann et al. de 1997.
Ainsi, il a été déterminé qu'une protéine d'intérêt selon l'invention portait une mutation à l'une au moins des positions suivantes : - à la position correspondant au résidu 262 de SEQ ID NO : 1 ; et/ou à la position correspondant au résidu 265 de SEQ ID NO : 1 ; et/ou à la position correspondant au résidu 316 de SEQ ID NO : 1.
Il est à noter que ces mutations présentent la particularité d'être localisées dans le site actif de cette protéine. En effet, Lohmann et al. (1997) ont mis en évidence 4 motifs d'acides aminés qui s'avèrent essentiels pour l'activité de la polymérase NS5B de VHC.
En particulier, il a été montré qu'un remplacement de l'acide aspartique (Asp ou D) à la position 220, de la glycine (GIy ou G) à la position 283 ou de l'acide aspartique (Asp ou
D) à la position 318 supprimait totalement l'activité enzymatique. On constate que les 3 résidus visés par la présente invention sont situées au sein de cette région cruciale.
En pratique, cette définition couvre :
- 3 mutants simples (262 ; 265 ; 316) ;
- 3 mutants doubles (262 + 265 ; 262 + 316 ; 265 + 316) ; - 1 mutant triple (262 + 265 + 316).
De manière avantageuse, le mutant simple (1262) portant une isoleucine (1262) à la position correspondant au résidu 262 de SEQ ID NO : 1 est exclu. De manière similaire, le mutant double (I262/C316) portant une isoleucine à la position correspondant au résidu 262 de SEQ ID NO : 1 et une cystéine à la position correspondant au résidu 316 de SEQ ID NO : 1 est exclu.
Avantageusement, le résidu à la position correspondant au résidu 262 de SEQ ID NO : 1 n'est pas un acide aminé choisi dans la groupe suivant : valine (Val ou V), leucine (Leu ou L), isoleucine (Ile ou I) et cystéine (Cys ou C), en particulier isoleucine (Ile ou I). Encore plus avantageusement, le résidu à la position correspondant au résidu 262 de SEQ ID NO : 1 est un résidu alanine (AIa ou A).
Avantageusement, le résidu observé à la position correspondant au résidu 265 de SEQ ID NO : 1 n'est pas une proline (Pro ou P). Encore plus avantageusement, il s'agit d'une serine (Ser ou S).
Avantageusement, le résidu à la position correspondant au résidu 316 de SEQ ID NO : 1 n'est pas un acide aminé choisi dans la groupe suivant : asparagine (Asn ou N), cystéine (Cys ou C) et histidine (His ou H), en particulier cystéine (Cys ou C). Encore plus avantageusement, le résidu à la position correspondant au résidu 316 de SEQ ID NO : 1 est un résidu acide aspartique ou aspartate (Asp ou D).
II apparaît que dans la séquence SEQ ID NO : 1, le résidu à la position 262 est une valine (Val ou V), celui à la position 265 est une proline (Pro ou P) et celui à la position 316 est une asparagine (Asn ou N).
Ces résidus sont également retrouvés aux positions 47, 50 et 101 de la séquence SEQ ID NO : 2 correspondant aux résidus 216 à 345 de NS5B codé par le génome viral ayant servi à l'infection au jour 0 (JO), même si par ailleurs des divergences ponctuelles sont observées.
L'expression « position correspondant au résidu » indique que la numérotation exacte des acides aminés peut varier en fonction des séquences. Ainsi, une position correspondante peut être identifiée en alignant les séquences de manière à obtenir le plus haut degré d'homologie autour de la position en question.
En effet, il est à noter que les séquences de NS5B rapportées dans la littérature présentent certes une forte homologie mais également des divergences ponctuelles.
Ainsi, dans la référence WO 96/37619, et plus précisément dans la séquence SEQ ID NO : 1 de ce document qui correspond à NS5B, les résidus aux positions 265 et 316 sont bien une proline et une asparagine, respectivement. En revanche, la position 262 correspond à une isoleucine et non à une valine, mais n'est pas une alanine comme dans la présente invention.
En ce qui concerne la référence WO 2005/047463, et plus précisément dans la séquence SEQ ID NO : 1 de ce document qui correspond à NS5B issu d'un VHC de génotype 2b, les résidus aux positions 262 et 265 sont bien une valine et une proline, respectivement. En revanche, la position 316 correspond à une cystéine et non à une asparagine, mais n'est pas un acide aspartique comme dans la présente invention.
A la connaissance du Demandeur, c'est la première fois que des mutations aux positions particulières identifiées sont rapportées.
Selon un mode de réalisation avantageux, la protéine NS5B selon l'invention porte les trois mutations décrite ci-dessus.
De fait, en comparant les régions allant des acides aminés 216 à 345 de NS5B entre le jour 0 (JO) et le jour 21 (J21), c'est à dire en comparant les séquences SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 3, seuls les trois résidus à ces trois positions divergent.
Ainsi et selon un mode de réalisation privilégiée, une protéine NS5B selon l'invention comprend la séquence SEQ ID NO : 3. En d'autres termes et en partant d'une protéine NS5B « sauvage », il est possible de remplacer les résidus aux positions 262, 265 et 316 par une alanine, une serine et un acide aspartique, respectivement, ou bien remplacer la région 216-345 par la séquence SEQ ID NO : 3.
Sont également visés des fragments de la protéine NS5B selon l'invention, lesdits fragments comportant au moins une mutation ponctuelle à l'une des trois positions clefs identifiées dans le cadre de la présente invention. Avantageusement, il s'agit de fragments fonctionnels dont l'activité RdRp peut être aisément testée à l'aide du test décrit dans le document Lohmann et al. de 1997.
Un autre aspect de l'invention concerne une séquence d'acides nucléiques codant une protéine NS5B mutée telle que décrite ci-dessus.
On entend par « acide nucléique » aussi bien une molécule d'ADN que d'ARN. Les séquences nucléiques présentées dans la cadre de l'invention correspondent à de l'ADN mais les séquences ARN correspondantes sont aisément déduites par l'homme du métier en remplaçant T par U. Par ailleurs, une séquence d'acides nucléiques selon l'invention peut aussi bien correspondre strictement à la partie codant NS5B, qu'à un génome entier de VHC portant les mutations définies ci-dessus.
Avantageusement, le codon codant le résidu correspondant à la position 262 de NS5B doit coder pour une alanine et peut donc correspondre à GCA, GCC, GCG ou GCT.
Avantageusement, le codon codant le résidu correspondant à la position 265 de NS5B doit coder pour une serine et peut donc correspondre à TCA, TCC, TCG, TCT, AGC ou AGT.
Avantageusement, le codon codant le résidu correspondant à la position 316 de NS5B doit coder pour un acide aspartique et peut donc correspondre à GAC ou GAT.
A titre d'illustration, la séquence codant la portion 216 à 345 de NS5B du VHC au jour 0 (JO) apparaît à la séquence SEQ ID NO : 4.
En comparaison, la séquence codant cette même portion au jour 21 (J21) apparaît à la séquence SEQ ID NO : 5.
Ainsi, on constate aux positions 139 à 141 de SEQ ID NO : 4 et 5 (codant le résidu à la position 47 des séquences SEQ ID NO : 2 et 3 ou à la position 262 de la séquence SEQ ID NO : 1), le codon GTC (SEQ ID NO : 4) codant une valine devient un codon GCC (SEQ ID NO : 5) codant une alanine.
De même, on constate aux positions 148 à 150 de SEQ ID NO : 4 et 5 (codant le résidu à la position 50 des séquences SEQ ID NO : 2 et 3 ou à la position 265 de la séquence SEQ ID NO : 1), le codon CCC (SEQ ID NO : 4) codant une proline devient un codon TCC (SEQ ID NO : 5) codant une serine.
Enfin, on constate aux positions 301 et 303 de SEQ ID NO : 4 et 5 (correspondant à la position 101 des séquences SEQ ID NO : 2 et 3 ou à la position 316 de la séquence SEQ ID NO : 1), le codon AAC (SEQ ID NO : 4) codant une asparagine devient un codon GAC (SEQ ID NO : 5) codant un acide aspartique.
Typiquement, une séquence d'acide nucléique selon l'invention peut donc comprendre la séquence SEQ ID NO : 5. Avantageusement, les protéines, séquences d'acides nucléiques et fragments de ceux-ci décrits dans la présente invention sont d'origine humaine.
Dans le cadre de la présente demande, il est décrit 3 mutations adaptatives susceptibles d'améliorer la réplication du VHC. Les séquences mises en évidence trouvent donc de nombreuses applications, notamment dans le cadre de vecteurs ou de réplicons.
Ainsi, un autre aspect de l'invention vise un vecteur comprenant une séquence d'acides nucléiques selon l'invention. Avantageusement, cette séquence est placée sous le contrôle de séquences régulatrices aptes à assurer son expression, notamment un promoteur. En particulier, ce mode de réalisation permet la production d'une protéine NS5B mutée portant au moins une, deux, voire les trois mutations identifiées ci-dessus.
Selon un autre aspect, c'est un réplicon qui contient une séquence selon l'invention. Un réplicon VHC est une molécule d'acides nucléiques capable de se répliquer de manière autonome en culture cellulaire et qui produit des niveaux détectables d'une ou plusieurs protéines virales. Le réplicon du VHC exprime les composants dérivés du VHC de la machine de réplication et contient des éléments cis requis pour la réplication en culture cellulaire.
Des réplicons du VHC existent déjà, tel que, par exemple, celui décrit dans le document EP 1 666 598. Il est donc possible de modifier la séquence codant NS5B dans ce réplicon aux positions et à l'aide des mutations décrites ci-dessus. Alternativement, il est possible de remplacer la région du réplicon codant NS5B par une séquence selon l'invention. On obtient alors un réplicon chimérique. Il est ainsi possible d'augmenter l'efficacité de réplicons déjà existants.
Sont aussi visées par l'invention des cellules hôtes comprenant des vecteurs ou des réplicons tels que définis précédemment. De manière privilégiée, ces cellules sont issues de moustiques, avantageusement du genre Aedes. Sans vouloir être lié à une quelconque théorie, il est supposé que ces mutations résultant d'une sélection chez ce moustique, la combinaison de cet hôte et de la protéine NS5B mutée selon l'invention devrait donner lieu à un système de réplication particulièrement efficace.
Ces systèmes de réplication in vitro offrent de nombreuses perspectives. Ainsi, ils permettent de tester la capacité d'un composé à inhiber l'activité réplicative et constituent donc des outils de criblage pour des molécules thérapeutiques contre le VHC. EXEMPLES DE REALISATION
L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation suivants, à l'appui des figures annexées. Ceux-ci ne sont cependant en aucun cas limitatifs.
La figure 1 illustre la compétence de moustiques pour la réplication du VHC, 21 jours après la mise en contact entre le moustique et le virus. La compétence dépend du genre du moustique : Le génome du VHC a été détecté par qRT-PCR, 21 jours après incubation avec le virus dans les moustiques du genre Aedes mais pas dans ceux du genre Culex.
La figure 2 illustre l'évolution de la détection du génome viral dans les corps et les têtes des moustiques. Les extraits d'ARN totaux ont été analysés après qRT-PCR, précédée par amplification du transcriptome total (« whole transcriptome amplification » ou WTA). Dès le 15eme jour, la combinaison WTA-qPCR révèle la présence du génome VHC dans la tête des moustiques.
La figure 3 représente l'alignement de séquences de la région amplifiée de NS5B. La région NS5B 8228-8628 des moustiques positifs a été séquencée au jour 21 (J21) et comparée à celle des moustiques infectieux au jour 0 (JO). La séquence NS5B correspondant à la séquence EF407504 a servi de références. Les triangles montrent les acides aminés mutés au jour 21 (262 Val/ AIa, 265 Pro/Ser, 316 Asn/Asp). L'analyse de séquence a porté sur 2 régions du génome viral car elles sont fréquemment séquencées et très informatives au niveau phylogénique : la région 5'UTR est une région hautement conservée alors que le gène NS5B a été rapporté comme étant particulièrement affecté par des mutations adaptatives pendant la phase aiguë d'infection (Kuntzen et al., 2007).
PARTIE EXPERIMENTALE
/ - Infections expérimentales
1. Elevage des espèces testées
Les individus testés proviennent d'un élevage réalisé à partir de moustiques (oeufs, larves et adultes) collectés sur le terrain dans la zone urbaine de Marseille pour l'espèce Culex pipiens et dans la réserve de la Tour du Valat en Camargue pour les espèces Aedes vexans et Aedes caspius. Ces élevages ont été réalisés dans les locaux de l'ENSAM situés au Domaine du Merle, à Salon de Provence. Ces élevages sont réalisés dans un insectarium classique, aux normes d'élevage. Les larves sont nourries avec de la levure de bière et de l'alimentation pour poisson et les adultes sont nourris avec une solution de sucrose. Les repas sanguins des Culex et Aedes sont composés de globules rouges lavés de mouton, le but du lavage étant d'éliminer l'interférence des éléments du sang. 2. Introduction des moustiques dans le Laboratoire Sécurisé (niveau 2+)
Au jour J-I, les moustiques femelles sont répartis en lots, placés dans les boites de gorgement avec un coton humide sur chaque boite et introduits dans le laboratoire sécurisé. Les moustiques sont conservés à température et humidité contrôlées (T = 25°C ± 2, RH 80% ± 10).
3. Introduction du virus VHC dans le Laboratoire L2+
Au jour JO, la solution virale contenant du virus VHC (sérum de patient porteur d'hépatite chronique à 2E6 copies/ml) est transportée par transporteur spécial jusqu'au L2+ où sont placés les moustiques. La solution virale est fournie par le Laboratoire de virologie du CHU Albert-Michallon à Grenoble. La solution virale est conservée dans le congélateur à -800C du L2+.
4. Préparation de la solution sanguine infectée Au jour JO, le mélange globules rouges lavés (sang de mouton) non- infectés et solution virale est réalisé, de manière à obtenir un titre suffisant pour infecter des moustiques (-1500 copies / moustique). De l'ATP est rajouté pour rendre le sang plus attractif et augmenter l'appétence des femelles. Chaque moustique prend entre 3 et 5 μl par repas de sang.
5. Infection des lots de femelles
Au jour JO, le gorgeoir contenant le sang infecté et chauffé à 37°C est présenté aux femelles, privées de glucose depuis 24 heures. Le gorgeoir est posé sur chaque boite et laissé sur place environ 4 heures pour la prise de repas sanguin. En parallèle, le gorgeoir avec du sang non contaminé est présenté au lot de femelles témoins négatifs. Au bout de la durée de gorgement des femelles, celles-ci sont récupérées par l'aspirateur à bouche, endormies par les vapeurs de chloroforme puis triées sous loupe binoculaire. Les femelles ayant gorgé du sang sont remises dans les cages. Un gîte artificiel est laissé dans chaque cage métallique à la disposition des femelles pour la ponte (bac d'eau pour les femelles Aedes et terre humide pour les femelles Culex). A partir de ce jour, les cages métalliques contenant les femelles gorgées ne sont ni ouvertes, ni manipulées jusqu'au sacrifice des moustiques.
6. Entretien des lots de femelles Les lots de femelles sont maintenus à une température constante d'environ 28°C et avec une humidité contrôlée d'au moins 70%. Chaque jour, les femelles sont nourries grâce à du coton imbibé d'une solution de glucose à 10 % déposé sur la cage métallique. Les gîtes de ponte sont humidifiés à travers la cage avec une pissette. 7. Traitement des femelles
Aux jours de prélèvement, les moustiques sont sacrifiés en plaçant la cage métallique au froid. Les moustiques sont ensuite placés individuellement dans des tubes de 1,5 ml, identifiés et remis au congélateur jusqu'à l'étape d'extraction d'ARN avant les PCR. Les témoins négatifs, gorgés sur sang non virémique sont aussi sacrifiés. Le lot de moustiques, sacrifié au jour JO et mis au congélateur à -800C, constitue les témoins positifs JO de gorgement, d'extraction et d'amplification de l'ARN viral.
// - Recherche d'ARN viral
8. Extraction de l'ARN pour les organes infectés
L'extraction de l'ARN viral du VHC à partir de tissus de moustiques a été réalisée sous hotte, à l'aide du kit « High Pure RNA Tissue Kit » commercialisé par Roche.
9. Amplification de l'ARN viral
Les amorces utilisées ainsi que la sonde (pour la qPCR) ont été conçues pour l'amplification de la région conservée de l'extrémité 5' non codante du génome viral. Nous avons utilisé l'amorce sens 2CH (5'-AAC TAC TGT CTT CAC GCA GAA-3') (SEQ ID NO : 6), localisée entre les nucléotides -289 et -269, et l'amorce antisens ITS (5' GCG ACC CAA CAC TAC TCG GCT-3') (SEQ ID NO : 7), localisée entre les nucléotides -70 et -90. La sonde utilisée pour la qPCR est la TM416 (5'-6Fam-AAC CCG CTC AAT GCC TGG A-Tamra-3') (SEQ ID 8) située entre les nucléotides -137 et-119.
La composition du mélange réactionnel pour la RT PCR classique et la qRT PCR est résumée dans le tableau suivant :
Figure imgf000011_0001
La RT-PCR a été réalisée dans les conditions suivantes: La rétrotranscription se déroule pendant 30 minutes à 500C, suivie par une étape de désactivation de la reverse transcriptase (15 minutes à 95°C), puis 45 cycles de PCR alternant une étape d'élongation (1 minute à 63°C) et une étape de dénaturation (30 secondes à 900C).
10. Séquençage de la région (52-271) correspondant à TIRES et de la région (8228-8628) correspondant à une partie du gène NS5b du génome viral extrait des moustiques positifs à J0 et J21 :
L'ARN viral a été extrait selon le protocole décrit au point 8.
Le séquençage a été réalisé à partir des extraits d'ARN totaux des moustiques identifiés comme contenant le génome du VHC par qRT-PCR.
Les étapes du séquençage sont dans l'ordre :
a) Amplification : Les régions à séquencer ont d'abord été amplifiées par qRT-PCR en utilisant les amorces adéquates. Pour la région 52-271 de TIRES, les amorces ITS (SEQ ID NO : 7) et 2CH (SEQ ID NO : 6) décrites plus haut ont été utilisées. Pour la région 8228-8628 nucléotides du gène NS5b, les amorces IPR et 2PR décrites dans la référence Sandres-Sauné et al. de 2003. b) Migration sur gel : Les produits d'amplification sont mis à migrer dans un gel à 1% d'agarose avec un marqueur de poids moléculaire. A la fin de la migration, les amplicons ont été révélés par du BET. La bande d'intérêt a été découpée et les séquences contenues dans la bande, extraites du gel. c) Clonage : Le clonage a été réalisé dans le vecteur pUC18. Afin de pouvoir réaliser les insertions, les sites de restriction (correspondants aux enzymes de restriction) présents sur le vecteur pUC18 et absents sur les amplicons ont été déterminés : les sites EcoRI et Hindlll ont été sélectionnés. De nouveaux couples d'amorces ont été choisis à partir des amorces décrites plus haut, auxquelles deux courtes séquences ont été rajoutées de part et d'autre, Tune contenant le site de restriction de EcoRI et l'autre le site de restriction Hindlll, afin que Tamplicon puisse être introduit dans le vecteur ouvert et déphosphorylé. d) Transformation : Le produit de clonage a été introduit dans les bactéries compétentes TOPlO. Les bactéries ont ensuite été étalées dans des boites de Pétri contenant de la gélose LB agar-Ampicilline. Enfin, elles ont été incubées pendant la nuit à 37°C. e) Contrôle qualité du clonage : Afin de vérifier que les bactéries ayant poussé contenaient l' insert, une PCR a été réalisée directement sur les bactéries : les clones ayant poussé ont été repiqués par la pointe d'un cône de lOμl, la pointe a d'abord été trempée dans un tube pour PCR contenant le master mix (voir composition plus haut), puis a servi pour inoculer la boite de pétri contenant de la gélose LB agar-Ampicilline. A la fin de l'étape de repiquage, la PCR a été lancée et les boites de Pétri ont été incubées à 37°C pendant la nuit. f) Les produits de PCR sont mis à migrer dans un gel à 1% d'agarose avec marqueur de poids moléculaire. A la fin de la migration, les amplicons ont été révélés par du BET. Les clones qui contenaient la bande ayant la bonne taille ont été amplifiés afin de produire des quantités suffisantes de plasmides pour le séquençage. g) Miniprépartaion : les plasmides ont été extraits des bactéries. h) Séquençage : le séquençage a été réalisé automatiquement par la société MWG. Les amorces universelles M 13 ont été utilisées. La lecture a été faite dans les deux sens pour plus de précision et de fiabilité.
RESULTATS
Trois expériences ont été réalisées :
(i) Expérience 1 : Des femelles de Ae. vexans ont été collectées au stade larvaire et ont été testées à un âge inférieur à 10 jours. Environ 20 moustiques ont été nourris avec une suspension contenant 106 copies du VHC par millilitre. Après 21 jours d'élevage, les moustiques ont été congelés et leur ARN extrait. Une RT-PCR ponctuelle finale a révélé des signaux positifs correspondant à la présence de génome du VHC dans 3 moustiques sur 5 (résultats non montrés).
(ii) Expérience 2 : Pour tester la spécificité génique, 36 Aedes sp. et 15 Culex pipiens ont été nourris avec une suspension contenant 8,3.105 copies du VHC par millilitre et élevés pendant 21 jours. La qRT-PCR réalisés sur les extraites de moustique correspondant au 21eme jour d'élevage a révélé la présence du génome du VHC dans 33% (2/6) des moustiques Aedes sp.. Au contraire, l'ARN du VHC n'a jamais été détecté dans les moustiques Culex sp. (Figure 1).
Une caractéristique commune à la réplication des virus à ARN est l'apparition de mutations adaptatives. Pour tester cela, les séquences d'ARN du VHC extraits de moustiques positifs à 21 jours (J21) après infection ont été comparées à des échantillons au jour 0 (JO). Deux régions du génome du VHC ont été sélectionnées : 220 nucléotides (région 52-271) de la région 5'UTR (5' untranslated région ») et 400 nucléotides (région 8228-8628) de la partie codant la protéine non structurale 5B (NS5B ou RdRP pour « RNA dépendent RNA polymerase). Aucune mutation n'a été notée dans les 220 nucléotides analysés de la région 5'UTR. En revanche, 3 mutations adaptatives (262V al/ AIa, 265 Pro/Ser et 316 Asn/Asp) ont été identifiées parmi les 400 nucléotides de RdRP qui correspondent au site actif (Figure 3).
(iii) Expérience 3 : 124 Ae. caspius et 85 Ae. vexans ont été nourris avec une suspension contenant 1,2.106 copies du VHC par millilitre et élevés pendant 15 jours. Tous les moustiques ont été disséqués pour séparer les têtes (incluant les glandes salivaires) et les corps (incluant le mésentère). La présence du VHC a été recherchée sur des échantillons au jour 0, 4, 8 et 15. Pour obtenir une plus grande sensibilité, la RT-PCR quantitative (qRT-PCR) a été précédée par une pré-amplification du transcriptome entier via la technique WTA (« Whole Transcriptome Amplification »). Dans ces conditions, l'ARN du VHC n'a été détecté que dans les têtes des moustiques correspondant au 15eme jour d'élevage (Figure 2). Le signal positif ne pouvait pas être dû au virus résiduel, puisque le génome viral était totalement absent dans les têtes des moustiques au jour initial (JO), même en combinant WTA et qPCR.
Ainsi, le cycle extrinsèque du VHC, défini comme le temps nécessaire au parasite pour se répliquer chez son hôte, a pu être estimé comme étant supérieur à 15 jours à une température ambiante de 25°C. A ce stade, on peut suggérer que le VHC ingéré pourrait i) passer par les tissus du mésentère du moustique, ii) se répliquer dans les autres tissus en particulier les glandes salivaires.
Pris ensemble avec les mutations adaptatives identifiées, ces résultats apportent les premiers éléments en faveur de la compétence de certains moustiques, en particulier Ae. caspius et Ae. vexans, pour répliquer le VHC naturel.
REFERENCES
Kuntzen, T. et al. Viral Séquence Evolution in Acute Hepatitis C Virus Infection. J Virol 81 (21), 11658-11668 (2007).
Lohman, V. et al. Biochemical properties of Hepatitis C Virus NS5B RNA-dependent RNA Polymerase and identification of amino acid séquence motifs essential for enzymatic activity J. Virol. 71(11), 8416-8428 (1997).
Neumayr, G., Propst, A., Schwaighofer, H., Judmaier, G. & Vogel, W. Lack of évidence for the heterosexual transmission of hepatitis C Q J Med. 92, 505-508 (2000).
Sandres-Sauné K. et al. Determining Hepatitis C Génotype by analyzing the séquence of the NS5B région. J Virol. Methods 109 (2), 187-93 (2003).

Claims

REVENDICATIONS
1/Protéine NS5B du virus de l'hépatite C (VHC) portant une mutation ponctuelle à au moins l'une des positions suivantes : - à la position correspondant au résidu 262 de SEQ ID NO : 1 ; et/ou à la position correspondant au résidu 265 de SEQ ID NO : 1 ; et/ou à la position correspondant au résidu 316 de SEQ ID NO : 1, à l'exception des cas où : le résidu à la position correspondant au résidu 262 de SEQ ID NO : 1 est une isoleucine ; ou le résidu à la position correspondant au résidu 262 de SEQ ID NO : 1 est une isoleucine et le résidu à la position correspondant au résidu 316 de SEQ ID NO : 1 est une cystéine.
2/ Protéine NS5B du VHC selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle porte une mutation ponctuelle à au moins l'une des positions suivantes : à la position correspondant au résidu 262 de SEQ ID NO : 1 , le résidu à la position correspondant au résidu 262 de SEQ ID NO : 1 n'étant pas une isoleucine; et/ou à la position correspondant au résidu 265 de SEQ ID NO : 1 ; et/ou - à la position correspondant au résidu 316 de SEQ ID NO : 1, le résidu à la position correspondant au résidu 316 de SEQ ID NO : 1 n'étant pas une cystéine.
3/ Protéine NS5B du VHC selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que : le résidu à la position correspondant au résidu 262 de SEQ ID NO : 1 n'est ni une valine, ni une leucine, ni une isoleucine ni une cystéine ; et/ou le résidu à la position correspondant au résidu 265 de SEQ ID NO : 1 n'est pas une proline ; et/ou le résidu à la position correspondant au résidu 316 de SEQ ID NO : 1 n'est ni une asparagine, ni une cystéine, ni une histidine.
4/ Protéine NS5B du VHC selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que : le résidu à la position correspondant au résidu 262 de SEQ ID NO : 1 est une alanine ; et/ou - le résidu à la position correspondant au résidu 265 de SEQ ID NO : 1 est une serine ; et/ou le résidu à la position correspondant au résidu 316 de SEQ ID NO : 1 est un aspartate ou acide aspartique. 5/ Protéine NS5B du VHC selon la revendication 4 caractérisée en ce qu'elle comprend : une alanine à la position correspondant au résidu 262 de SEQ ID NO : 1 ; et une serine à la position correspondant au résidu 265 de SEQ ID NO : 1 ; et - une acide aspartique à la position correspondant au résidu 316 de SEQ ID NO : 1.
6/ Protéine NS5B du VHC selon la revendication 5 caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence SEQ ID NO : 3.
11 Fragment d'une protéine NS5B du VHC comprenant au moins une mutation telle que définie à l'une des revendications 1 à 4.
8/ Séquence d'acide nucléique codant une protéine NS5B du VHC selon l'une des revendications 1 à 6 ou un fragment de celle-ci selon la revendication 7.
9/ Séquence d'acide nucléique selon la revendication 8 caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence SEQ ID NO : 5.
10/ Protéine NS5B du VHC selon l'une des revendications 1 à 6 ou fragment protéique selon la revendication 7 ou séquence d'acide nucléique selon les revendications 8 et
9, caractérisés en ce qu'ils sont d'origine humaine.
11/ Vecteur comprenant une séquence d'acide nucléique selon l'une des revendications 8 à 10.
12/ Réplicon comprenant une séquence d'acide nucléique selon l'une des revendications
8 à 10.
13/ Cellule hôte comprenant un vecteur selon la revendication 11 ou un réplicon selon la revendication 12.
14/ Cellule hôte selon la revendication 13 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule de moustique, avantageusement du genre Aedes.
PCT/FR2009/051222 2008-06-26 2009-06-25 Mutations dans la proteine ns5b du vhc Ceased WO2010004176A1 (fr)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09784435A EP2291518A1 (fr) 2008-06-26 2009-06-25 Mutations dans la proteine ns5b du vhc
JP2011515563A JP2011525803A (ja) 2008-06-26 2009-06-25 Ｈｃｖのｎｓ５ｂタンパク質における変異
US12/996,521 US20110091969A1 (en) 2008-06-26 2009-06-25 Mutations in the ns5b protein of the hcv

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0854292A FR2933094A1 (fr) 2008-06-26 2008-06-26 Mutations dans la proteine ns5b du vhc.
FR0854292 2008-06-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010004176A1 true WO2010004176A1 (fr) 2010-01-14

Family

ID=40259171

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2009/051222 Ceased WO2010004176A1 (fr) 2008-06-26 2009-06-25 Mutations dans la proteine ns5b du vhc

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20110091969A1 (fr)
EP (1) EP2291518A1 (fr)
JP (1) JP2011525803A (fr)
FR (1) FR2933094A1 (fr)
WO (1) WO2010004176A1 (fr)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1256628A2 (fr) * 2001-05-10 2002-11-13 Agouron Pharmaceuticals, Inc. ARN polymerase NS5B du virus de la hepatite C et mutants derivés de la polymerase
WO2008024763A2 (fr) * 2006-08-25 2008-02-28 Wyeth Identification et caractérisation de variants de réplicons du virus de l'hépatite c présentant une sensibilité réduite à hcv-796, et procédés correspondants

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1256628A2 (fr) * 2001-05-10 2002-11-13 Agouron Pharmaceuticals, Inc. ARN polymerase NS5B du virus de la hepatite C et mutants derivés de la polymerase
WO2008024763A2 (fr) * 2006-08-25 2008-02-28 Wyeth Identification et caractérisation de variants de réplicons du virus de l'hépatite c présentant une sensibilité réduite à hcv-796, et procédés correspondants

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE GENESEQ 30 January 2003 (2003-01-30), LOVE RA ET AL: "Protein derived from native RNA polymerase", XP002512034, Database accession no. AA026416 *
DATABASE UniProt 5 February 2008 (2008-02-05), "RNA-dependent RNA polymerase (Fragment)", XP002512033, Database accession no. Q80MG2 *
DATABASE UniProt 5 February 2008 (2008-02-05), WATANABE ET AL: "RNA-dependent RNA polymerase (Fragment)", XP002512031, Database accession no. Q80MJ0 *
DATABASE UniProt 5 February 2008 (2008-02-05), WATANABE K ET AL: "RNA-dependent RNA polymerase (Fragment)", XP002512032, Database accession no. Q80MH9 *
WATANABE KAZUMASA ET AL: "Mutations in the nonstructural region 5B of hepatitis C virus genotype 1b: Their relation to viral load, response to interferon, and the nonstructural region 5A", JOURNAL OF MEDICAL VIROLOGY, vol. 75, no. 4, April 2005 (2005-04-01), pages 504 - 512, XP002512030, ISSN: 0146-6615 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20110091969A1 (en) 2011-04-21
EP2291518A1 (fr) 2011-03-09
FR2933094A1 (fr) 2010-01-01
JP2011525803A (ja) 2011-09-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2753194C2 (ru) Оптимизированные гены и экспрессионные кассеты мини-дистрофина и их применение
EP2099483B1 (fr) Methode d'immunisation contre les 4 serotypes de la dengue
Fry et al. Functional and structural diversification of the Anguimorpha lizard venom system
EP2077857B1 (fr) Methode d'immunisation contre les 4 serotypes de la dengue
Lapraz et al. Put a tiger in your tank: the polyclad flatworm Maritigrella crozieri as a proposed model for evo-devo
Tiozzo et al. Embryonic versus blastogenetic development in the compound ascidian Botryllus schlosseri: insights from Pitx expression patterns
Paley et al. Isolation and culture of Sphaerothecum destruens from Sunbleak (Leucaspius delineatus) in the UK and pathogenicity experiments in Atlantic salmon (Salmo salar)
EP1000153B1 (fr) Peptides anti-microbiens de crustaces, denommes penaeidines
Sikes et al. Making heads from tails: development of a reversed anterior–posterior axis during budding in an acoel
JP2014513932A (ja) ワクチン
Dolz et al. Viral genotyping of infectious bursal disease viruses isolated from the 2002 acute outbreak in Spain and comparison with previous isolates
WO2010004176A1 (fr) Mutations dans la proteine ns5b du vhc
Mor et al. Picornaviruses of fish
BG98079A (bg) Инсектицидно ефективни пептиди
Takagi et al. Functional analysis of the role of eyes absent and sine oculis in the developing eye of the cricket Gryllus bimaculatus
Gasparini et al. Characterization of Ambra1 in asexual cycle of a non-vertebrate chordate, the colonial tunicate Botryllus schlosseri, and phylogenetic analysis of the protein group in Bilateria
EP2102332A2 (fr) Procédé d'amplification du vhc chez les aedes mosquitoes
White Life in extreme environments: adaptation and evolution of a soda lake cichlid; Alcolapia alcalica
Hyams Morphological, Cellular and Molecular Processes Along the Hibernation Phenomenon of the Colonial Ascidians Botrylloides leachi
Ludwig-Begall Drivers and Constraints of Murine Norovirus Recombination–An in Vitro Study of Norovirus Evolutionary Processes
Massey The Function of Pigmentation Genes in the Development and Evolution of Drosophila Mating Behavior
東京大学大学院理学系研究科生物科学専攻 Developmental studies on the avicularium differentiation in a bryozoan
Simões et al. Angiostrongylus cantonensis: morphology, genetic variability, ecology and parasite-host relationship
FR3128713A1 (fr) Agent de liaison ayant une affinité améliorée pour la prévention et le traitement des maladies liées aux sarbecovirus
Pinto Studies on Bornaviruses Infection on Companion Animals

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09784435

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12996521

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009784435

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2011515563

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01E

Ref document number: PI0914263

Country of ref document: BR

Free format text: IDENTIFIQUE O SIGNATARIO DA PETICAO NO 020100119227 DE 22/12/2010 E COMPROVE, CASO NECESSARIO, QUE TEM PODERES PARA ATUAR EM NOME DO DEPOSITANTE, UMA VEZ QUE BASEADO NO ARTIGO 216 DA LEI 9.279/1996 DE 14/05/1996 (LPI) "OS ATOS PREVISTOS NESTA LEI SERAO PRATICADOS PELAS PARTES OU POR SEUS PROCURADORES, DEVIDAMENTE QUALIFICADOS.". APRESENTE A PROCURACAO DO DEPOSITANTE "UNIVERSITE JOSEPH FOURIER", UMA VEZ QUE NAO FOI APRESENTADA. SALIENTA-SE QUE SE TAL DOCUMENTO APRESENTAR DATA POSTERIOR A ENTRADA NA FASE NACIONAL, ESTE DEVE CONTER CLAUSULA DE RATIFICACAO DE ATOS ANTERIORMENTE PRATICADOS.

ENPW Started to enter national phase and was withdrawn or failed for other reasons

Ref document number: PI0914263

Country of ref document: BR

Free format text: PEDIDO RETIRADO, UMA VEZ QUE A EXIGENCIA FORMULADA PARA QUE FOSSE REGULARIZADA A PROCURACAO NAO FOI RESPONDIDA NO PRAZO LEGAL E NAO HOUVE MANIFESTACAO DO REQUERENTE FRENTE A PUBLICACAO DO ARQUIVAMENTO DA PETICAO (11.6.1) NA RPI 2385 DE 20/09/2016.