[go: up one dir, main page]

WO2010092943A1 - IgG-Fcフラグメント及びその製造方法 - Google Patents

IgG-Fcフラグメント及びその製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2010092943A1
WO2010092943A1 PCT/JP2010/051858 JP2010051858W WO2010092943A1 WO 2010092943 A1 WO2010092943 A1 WO 2010092943A1 JP 2010051858 W JP2010051858 W JP 2010051858W WO 2010092943 A1 WO2010092943 A1 WO 2010092943A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
fragment
amino acid
igg
glycosylated
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2010/051858
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
康宏 梶原
一博 深江
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Otsuka Chemical Co Ltd
Original Assignee
Otsuka Chemical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Otsuka Chemical Co Ltd filed Critical Otsuka Chemical Co Ltd
Priority to EP10741220A priority Critical patent/EP2397544A4/en
Priority to JP2010550516A priority patent/JP5575670B2/ja
Priority to US13/148,839 priority patent/US20110313136A1/en
Publication of WO2010092943A1 publication Critical patent/WO2010092943A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/462—Igs containing a variable region (Fv) from one specie and a constant region (Fc) from another
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to a novel human IgG-Fc fragment and a method for producing the same.
  • An antibody is a protein having a Y-shaped basic structure.
  • the upper half of the Y-shape is a Fab region that binds to an antigen and consists of two light chains and two heavy chains.
  • the lower half of the Y shape is called the Fc region.
  • the portion close to the tip of the Fab region is a variable region that varies depending on the antibody.
  • the variable region of the heavy chain is called the VH region
  • the variable region of the light chain is called the VL region.
  • the Fab region and the Fc region other than the variable region are regions with relatively little change, and are generally called constant regions.
  • the constant region of the light chain is called the CL region
  • the constant region of the heavy chain is called the CH region.
  • the portion corresponding to the Fab region is CH1 domain
  • the portion corresponding to the Fc region is CH2 domain, CH3 domain in order from the N-terminal side. Call it.
  • the CH1 domain and the CH2 domain are linked at the hinge, and the left and right heavy chains are disulfide bonded at the hinge.
  • An antibody against a specific antigen can be obtained, for example, by immunizing a mouse with the antigen.
  • antibodies produced by mice are highly immunogenic in humans and their administration to humans is limited. In the human body, the half-life of mouse antibodies is relatively short, and there is a high possibility that sufficient effects cannot be obtained.
  • a chimeric antibody has been developed in which the constant region of a mouse antibody is replaced with the constant region of a human antibody. It is expected that the chimeric antibody can bind to the antigen with the same specificity as the mouse antibody and has low immunogenicity. For this reason, methods for producing human-type constant regions and Fc regions for use in chimeric antibodies have been studied. Particularly, among immunoglobulins classified into five types, IgG, IgA, IgM, IgD, and IgE, humans Studies are underway on IgG, which accounts for 70-75% of immunoglobulins and is the most abundant antibody in plasma. Most antibody drugs currently on the market are IgG. IgG exhibits an antigen-destroying activity called antibody-dependent cytotoxicity (ADCC), and in particular, the IgG1 and IgG3 subclasses are known to have strong activity.
  • ADCC antibody-dependent cytotoxicity
  • the Fc fragment of IgG is a homodimer composed of a covalent bond at the hinge and a non-covalent bond between CH3 domains, and N-type at Asn at residue 297 of the CH2 domain (position 69 in SEQ ID NO: 1).
  • the sugar chain is bound. According to X-ray crystal structure analysis, this sugar chain faces inward and forms hydrogen bonds at multiple locations on the protein surface of the CH2 domain. It has been suggested that this sugar chain is indispensable for the structure formation and maintenance of the Fc fragment (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • variable region of IgG first binds to a specific protein present on the target cell.
  • the Fc fragment then binds to Fc receptors on effector cells such as NK cells, thereby releasing a protein called perforin that forms a pore in the target cells from the effector cells and destroying the target cells that the IgG has captured .
  • ADCC activity has been found to involve the structure of the sugar chain bound to IgG1, and so far many studies have been conducted on glycosylated Fc fragments.
  • the gene for glycosyltransferase N-acetylglucosamine transferase (GNTIII) was introduced into CHO cells, and an anti-neuroblastoma antibody having a 2-branched sugar chain whose non-reducing end is GlcNAc was prepared from the CHO cells.
  • GNTIII glycosyltransferase N-acetylglucosamine transferase
  • the structure of the sugar chain can affect the activity of the antibody.
  • human-type IgG1 from which fucose bound to position 6 of GlcNAc on the reducing end side of the sugar chain has been removed was expressed, and that the ADCC activity of the antibody via Fc ⁇ RIII binding is 40- It was shown to be enhanced by 50 times (for example, see Non-Patent Document 4).
  • the sugar chain bound to Asn297 is sialylated, the cytotoxic activity of IgG in vivo is reduced (for example, see Non-Patent Document 5), and the anti-inflammatory activity of IgG is enhanced in animal models. (For example, refer nonpatent literature 6) etc. are also confirmed.
  • the linked sugar chain structure is a glycoform, that is, a slightly different structure.
  • sugar chains that affect the cytotoxic activity must be added as uniformly as possible.
  • IgG having a uniform sugar chain structure is required.
  • the present inventors have so far developed a method for obtaining a uniform glycosylated amino acid, and by using a solid phase synthesis method using this method, a sugar chain having an extremely uniform sugar chain structure is accurately placed at a desired position.
  • a method for synthesizing the added glycosylated peptide was found (for example, see Patent Document 1).
  • the method is not suitable for synthesizing long peptides, but by combining the method with an expression system, that is, the peptides are divided and synthesized by solid phase synthesis or expressed by an expression system. Then, a longer glycosylated peptide can be obtained by ligation by the ligation method.
  • a peptide without a sugar chain added can be obtained in a large amount and economically by expressing it with an expression system.
  • the present inventors used this method to synthesize a part of an IgG-Fc fragment to which a sugar chain was added.
  • the IgG-Fc fragment from position 293 (Glu replaced by Cys) to position 320 Lys (SEQ ID NO: 1 from position 65 to position 92) was synthesized by solid phase synthesis, and Asn at position 297 was In addition, glycosylated Asn was used.
  • Ser at positions 321 to 444 (positions 93 to 216 of SEQ ID NO: 1) on the C-terminal side was expressed by an E. coli expression system. However, the Cys321-Ser444 peptide expressed in the E.
  • coli expression system could not be stably obtained, and the peptide could not be further linked to obtain the full IgG-Fc fragment.
  • IgG-Fc fragment In order to use an IgG-Fc fragment in a chimeric antibody, it is necessary to extend the peptide part of the IgG-Fc fragment to which a uniform sugar chain has been added longer to at least the minimum length capable of binding to the Fc receptor. .
  • an object of the present invention is to provide a full length IgG-Fc fragment to which a substantially uniform sugar chain is added, and a method for producing the same.
  • the present inventors have conventionally used a step of cleaving the purification tag after expressing the target peptide as a fusion protein with the purification tag in the E. coli expression system. It was found that the target peptide can be produced very stably by adding a strong acid instead of the formic acid that has been used and adding a specific solvent such as acetonitrile. And it discovered that the glycosylated peptide longer than before could be obtained by performing ligation using the said target peptide, and came to complete this invention.
  • the present invention [1] A glycosylated IgG-Fc fragment having a sugar chain added at the same position as a natural IgG-Fc fragment, and counting from the glycosylated amino acid at the N-terminal side of the glycosylated amino acid (I) any one of amino acids 1 to 30 is replaced with Cys; (ii) any one of the non-Ser amino acids is replaced with Ser; (iii) any non-Thr amino acids in the natural type Or (iv) an IgG-Fc fragment in which any one of the non-Ala amino acids is replaced with Ala and at least one Met is replaced with an amino acid other than Met; [2] The IgG-Fc fragment is an IgG1-Fc fragment, wherein a sugar chain is added to position 69 of Asn in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and amino acids ( i) any one is replaced by Cys; (ii) any one is replaced by Ser; (iii) any one of the non-Thr amino
  • the IgG-Fc fragment according to any one of [1] to [4] above, which is a sugar chain represented by: [6] A method for producing an IgG-Fc fragment to which a substantially uniform sugar chain is added, which is a partial peptide of the IgG-Fc fragment, wherein the sugar chain is added with 3 to 50 amino acid residues.
  • a step of synthesizing a glycosylated peptide containing an amino acid by a solid phase synthesis method using substantially uniform glycosylated Asn, and a partial peptide on the N-terminal side of the glycosylated peptide in the IgG-Fc fragment And a step of expressing at least one of the partial peptides on the C-terminal side of the glycosylated peptide in the IgG-Fc fragment by an expression system and synthesizing the rest by a solid phase synthesis method, and the glycosylated peptide And linking the N-terminal partial peptide and the C-terminal partial peptide by a ligation method, and the step of expressing the partial peptide by an expression system comprises the partial peptide Is expressed as a fusion protein with a purification tag via Met, the fusion protein is purified using the purification tag, and the partial peptide and the purification tag are mixed with a strong acid and a water-misc
  • the step of synthesizing the N-terminal partial peptide includes the step of synthesizing the N-terminal partial peptide.
  • a step of synthesizing each peptide obtained by dividing the partial peptide between Thr at position 32 and Cys at position 33 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 by solid phase synthesis, and linking the synthesized peptides by ligation The method according to any one of [6] to [9] above, comprising the step of: [11]
  • the step of synthesizing the C-terminal partial peptide comprises the step of synthesizing the C-terminal partial peptide of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the glycosylated peptide is in positions 65 to 92 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, the N-terminal partial peptide is in positions 1 to 64, and the C-terminal partial peptide is 93
  • the glycosylated peptide is synthesized by solid phase synthesis by replacing Glu at position 65 with Cys, and the partial peptide on the N-terminal side is positions 1 to 32 and 33 to Dividing into 64 positions, each synthesized by solid phase synthesis method,
  • the method for producing an IgG-Fc fragment according to any one of [1] to [5] or the IgG-Fc fragment according to any one of [6] to [14] A chimeric antibody comprising the produced IgG-Fc fragment; [16] A method for designing an IgG-Fc fragment to which a uniform sugar chain is added, wherein the IgG-Fc fragment comprises a glycosylated peptide containing a glycosylated amino acid and one or more other The glycosylated peptide is N-terminal to the glycosylated amino acid, and any one of amino acids 1 to 30 counted from the glycosylated amino acid is N-terminal.
  • the amino acid adjacent to the N-terminal side of Cys, Ser, Thr or Ala on the C-terminal side of the glycosylated amino acid is defined as the C-terminal, and the glycosylated peptide is fixed using a uniform glycosylated amino acid.
  • the other peptide is expressed by an expression system or synthesized by a solid phase synthesis method, and the glycosylated peptide and the peptide are linked by a ligation method.
  • an IgG-Fc fragment to which a uniform sugar chain is added it is possible to obtain the full length of an IgG-Fc fragment to which a uniform sugar chain is added, and using this, the activity dependent on the sugar chain structure of an IgG-Fc fragment including cytotoxic activity, As a result, highly precise research on antibody activity can be performed.
  • a chimeric antibody is prepared using an IgG-Fc fragment to which a uniform sugar chain is added, an antibody of uniform quality that can be used as a pharmaceutical product without lot difference can be obtained.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a synthetic route of a human IgG1-Fc fragment according to the present invention. The amino acid sequence of human IgG1-Fc fragment and fragments AD are shown.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the structure of a plasmid vector pET-16b used to express fragment D.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a method for producing an expression vector of fragment D.
  • FIG. 5 is a calibration curve showing the relationship between Lysozyme concentration and absorbance prepared using Lysozyme to determine the concentration of fragment D.
  • FIG. The result of the gel filtration chromatography of the reaction solution which performed the ligation of the fragment C and the fragment D is shown. The results of SDS-PAGE analysis after ligation of fragment C and fragment D are shown.
  • Lane 1 represents fragment C
  • Lane 2 represents a His tag + fragment D (16 kDa)
  • Lane 3 represents a reaction solution
  • M is a molecular weight marker.
  • Lane 1 is a ligation product
  • Lane 2 is PNGaseF
  • Lane 3 is a fragment C
  • Lane 4 is a reaction solution
  • M is a molecular weight marker.
  • the result of having analyzed the reaction solution after the ligation of the fragment A + B and the fragment C + D by SDS-PAGE is shown.
  • Lane 1 represents fragment A + B
  • Lane 2 represents fragment C + D
  • Lane 3 represents a reaction solution
  • M represents a molecular weight marker.
  • the IgG-Fc fragment according to the present invention refers to a peptide consisting of CH2 and CH3 domains of IgG immunoglobulin.
  • IgG includes those derived from any mammals such as humans, monkeys, mice, dogs, cows, and horses, but when used for chimeric antibodies, those derived from humans are preferred.
  • IgG has four subclasses, IgG1 to IgG4.
  • the IgG-Fc fragment of the present invention may be any subclass, but IgG1 having strong cytotoxic activity is preferred.
  • the IgG1-Fc fragment according to the present invention has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the IgG1-Fc fragment according to the present invention is a peptide in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 as long as the effects of the present invention described below are exhibited.
  • a peptide in which one or several amino acids are conservatively substituted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, including IgG-Fc variants, for example, IgG1-Fc having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 Also includes fragment derivatives.
  • the IgG1-Fc fragment having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is substituted with Cys at position 65, compared to the natural IgG1-Fc fragment having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • Gln at position 128 is replaced with Asp
  • Met at position 130 is replaced with Leu
  • Met at position 200 is replaced with Leu.
  • amino acid is used in its broadest sense and includes not only natural amino acids but also non-natural amino acids such as amino acid variants and derivatives.
  • amino acids herein for example, naturally occurring proteogenic L-amino acids; D-amino acids; chemically modified amino acids such as amino acid variants and derivatives; norleucine, It will be understood that natural non-proteogenic amino acids such as ⁇ -alanine, ornithine; and chemically synthesized compounds having properties known in the art that are characteristic of amino acids.
  • unnatural amino acids include ⁇ -methyl amino acids (such as ⁇ -methylalanine), D-amino acids, histidine-like amino acids (2-amino-histidine, ⁇ -hydroxy-histidine, homohistidine, ⁇ -fluoromethyl-histidine and ⁇ -Methyl-histidine, etc.), amino acids with extra methylene in the side chain (“homo" amino acids) and amino acids in which the carboxylic acid functional amino acids in the side chain are replaced with sulfonic acid groups (such as cysteic acid).
  • the amino acid contained in the compound of the present invention consists only of natural amino acids. In the present specification, amino acids are described using a three-letter code in principle.
  • the number of amino acids to be substituted is not particularly limited as long as it retains IgG-Fc fragment activity, 1 to 9, preferably 1 to 5, more preferably about 1 to 3, or within 20%, preferably within 10% of the total length.
  • the amino acid to be substituted or added can be a natural amino acid, a non-natural amino acid or an amino acid analog, and is preferably a natural amino acid.
  • the “IgG-Fc variant” refers to a compound obtained by naturally or artificially modifying an IgG-Fc fragment.
  • modifications include one or more amino acids of an IgG-Fc fragment.
  • alkylation for example, acylation
  • acylation for example, acetylation
  • amidation for example, carboxylation, ester formation
  • disulfide bond formation for example, glycosylation, lipidation, phosphorylation, hydroxylation, and labeling component attachment of a residue.
  • a sugar chain is added at the same position as the natural IgG-Fc fragment.
  • the same position as the natural IgG-Fc fragment is Asn at position 69 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the IgG-Fc fragment according to the present invention includes those in which one or more sugar chains are further added at positions other than the same positions as the natural IgG-Fc fragment.
  • sugar chain refers to a compound formed by connecting one or more unit sugars (monosaccharide and / or a derivative thereof). When two or more unit sugars are connected, each unit sugar is bound by dehydration condensation by a glycosidic bond.
  • sugar chains include monosaccharides and polysaccharides (glucose, galactose, mannose, fucose, xylose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, sialic acid, and complexes thereof contained in the living body.
  • sugar chains that are decomposed or derived from complex biomolecules such as degraded polysaccharides, glycoproteins, proteoglycans, glycosaminoglycans, glycolipids, and the like, but are not limited thereto.
  • the sugar chain may be linear or branched.
  • sugar chain also includes sugar chain derivatives.
  • sugar chain derivatives include sugars having a carboxyl group (for example, the C-1 position). Oxidized to carboxylic acid to produce aldonic acid (for example, D-glucose oxidized D-gluconic acid), terminal C atom to carboxylic acid uronic acid (D-glucose oxidized D-glucuron) Acid)), amino groups or sugars having amino group derivatives (for example, acetylated amino groups) (for example, N-acetyl-D-glucosamine, N-acetyl-D-galactosamine, etc.), amino groups and carboxyl groups (Eg, N-acetylneuraminic acid (sialic acid), N-acetylmuramic acid, etc.), deoxygenated sugar (eg, 2-deoxy-D-ribone) ), Sulfated sugar including a sulfuric acid group, including but sugar chains are such phosphorylated sugar
  • a preferable sugar chain is, for example, a sugar chain that increases cytotoxic activity when added to an IgG-Fc fragment.
  • the sugar chain in the glycosylated IgG-Fc fragment of the present invention is a complex carbohydrate (glycopeptide (or glycoprotein), An N-linked sugar chain that is a sugar chain that is bound to a peptide (or protein) as a glycopeptide (or glycoprotein) in vivo, -A linked sugar chain or the like.
  • the sugar chain used in the present invention is an N-linked sugar chain.
  • Examples of the N-linked sugar chain include a high mannose type, a complex type, and a hybrid type, and a complex type is particularly preferable.
  • the sugar chain in the glycosylated IgG-Fc fragment of the present invention is preferably a sugar chain composed of 4 or more, for example, 5 or more, 7 or more, particularly 9 or more sugars. .
  • the sugar chain in the glycosylated IgG-Fc fragment is a sugar chain composed of 5 to 11, 9 to 11, or 9 sugars.
  • the sugar chain in the glycosylated IgG-Fc fragment of the present invention is a saccharide selected from the group consisting of a dicialo saccharide chain, a monosialo saccharide chain, an asia saccharide chain, a diglucnac saccharide chain and a dimannose saccharide chain.
  • a chain more preferably an asialo sugar chain.
  • Preferred sugar chains for use in the present invention include, for example, the following general formula [Wherein R 1 and R 2 are the same or different, Indicates. Ac represents an acetyl group. ] And the like.
  • preferred sugar chains include, for example, sugar chains existing as glycoproteins bound to proteins in the human body (for example, sugar chains described in “FEBS ⁇ LETTERS Vol.50, No.3, Feb. 1975”). ) And a sugar chain having the same structure (a sugar chain having the same kind of constituent sugar and a coupling mode thereof) or a sugar chain in which one or a plurality of sugars are lost from the non-reducing end thereof. 4 can be mentioned.
  • glycosylated amino acid refers to an amino acid to which a sugar chain is bound.
  • the sugar chain and the amino acid may be bonded via a linker.
  • the type of amino acid to which the sugar chain binds is not particularly limited, but is any amino acid of the IgG-Fc fragment described above, preferably Asn or Ser, more preferably Asn.
  • the type of the linker is not particularly limited.
  • C 1-10 polymethylene —CH 2 —R— (wherein R is alkyl, The group consisting of substituted alkyl, alkenyl, substituted alkenyl, alkynyl, substituted alkynyl, aryl, substituted aryl, carbocyclic group, substituted carbocyclic group, heterocyclic group and substituted heterocyclic group And a group formed by elimination of one hydrogen atom from a more selected group).
  • the glycosylated IgG-Fc fragment according to the present invention may be produced by any production method, for example, produced by a solid phase synthesis method using a glycosylated amino acid as a raw material. It may be produced by binding a sugar chain to which no amino acid is bonded to an amino acid on the peptide directly or via a linker. A sugar chain to which no amino acid is bonded can be prepared by solid phase synthesis, liquid phase synthesis, expression by an expression system, or the like. In addition, the sugar chain of an IgG-Fc fragment to which a sugar chain has been added is produced by further extending the sugar chain by adding a sugar or a sugar chain, and the solid phase synthesis method described later and expression by an expression system are combined. As long as the final structures such as those produced by the method are consistent, they are included in the glycosylated IgG-Fc fragment of the present invention.
  • the structure of the sugar chain added to the IgG-Fc fragment is substantially uniform.
  • the structure of the sugar chain is substantially uniform, when compared between the glycosylated IgG-Fc fragments, the sugar chain addition site, the type of each sugar constituting the sugar chain sugar chain, This means that the binding order and the binding mode between sugars are the same, and that the structure of sugar chains is at least 90% or higher, preferably 95% or higher, more preferably 99% or higher.
  • a glycopeptide having a uniform sugar chain has a constant quality and is particularly preferred in the fields of pharmaceutical production and assay.
  • the uniform sugar chain ratio can be measured, for example, by a method using HPLC, capillary electrophoresis, NMR, mass spectrometry or the like.
  • the production of sugar chains having a uniform sugar chain structure is described in International Publication Nos. WO02 / 04471, WO03 / 008431, WO2004 / 058984, WO2004 / 058824, WO2004 / 070046, WO2007 / 011055, etc. As incorporated herein by reference.
  • any one of the amino acids at positions 1 to 30 amino acids from the glycosylated amino acid is substituted with Cys.
  • any one of the non-Ser amino acids is replaced with Ser in the natural type;
  • any one of the non-Thr amino acids is replaced with Thr in the natural type; or
  • not Ala in the natural type Any one of the amino acids is replaced with Ala.
  • the position is preferably from 1 to 20 amino acids, more preferably from 1 to 10 amino acids from the glycosylated amino acid.
  • any one of amino acids 59 to 68 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is substituted with Cys; (ii) any one Is replaced with Ser; (iii) any one of the non-Thr amino acids (amino acids other than position 61) is replaced with Thr in the natural type; or (iv) the non-Ala amino acid (position 59) in the natural type Any one of the other amino acids is substituted with Ala, and most preferably, Glu at position 65 is substituted with Cys.
  • Peptides having Cys at the N-terminus are preferably used in the ligation method.
  • the glycosylated IgG-Fc fragment according to the present invention can be obtained, for example, by solid-phase synthesis of a glycosylated peptide containing a glycosylated amino acid and ligating it with a peptide of another part. Can do.
  • its N-terminus is preferably in the range of 1 to 30 amino acids on the N-terminal side of the glycosylated amino acid.
  • the N-terminus of the glycosylated peptide is Cys
  • substitution to Cys occurs in the region of 1 to 30 amino acids on the N-terminal side of the glycosylated amino acid after ligation (corresponding to (i)).
  • Cys can be converted to Ser or Ala after ligation as described later (corresponding to (ii) or (iv)).
  • the ligation reaction can also be preferably carried out using the N-terminus of the glycosylated peptide as a threonine derivative (1) described later, and can be converted to Thr after ligation (corresponding to (iii)).
  • substitution with Cys, Ser, Ala, Thr is performed in the N-terminal 1 amino acid to 30 amino acid region of the glycosylated amino acid as described above. Therefore, a mutant having Cys, Ser, Ala, or Thr at a position different from the natural type can be synthesized, and the resulting glycosylated IgG-Fc fragment is also encompassed in the present invention.
  • amino acids other than Met are not particularly limited, but for example, neutral amino acids are preferable, and Leu and the like that are relatively close in structure to Met are preferably used.
  • Met at positions 130 and 200 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is substituted with Leu.
  • the glycosylated IgG-Fc fragment has a predetermined three-dimensional structure.
  • the predetermined steric structure refers to, for example, having the same structure as a natural IgG-Fc fragment.
  • disulfide bonds are formed between the 33-position Cys and 93-position Cys and between the 139-position Cys and the 197-position Cys of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the IgG-Fc fragment has a predetermined three-dimensional structure can be confirmed by, for example, a disulfide mapping method, evaluation of binding to an antibody specific for a three-dimensional structure epitope, X-ray analysis, or the like.
  • the method for producing an IgG-Fc fragment to which a substantially uniform sugar chain is added according to the present invention is first a partial peptide of an IgG-Fc fragment, wherein the sugar chain is added with 3 to 50 amino acid residues.
  • the method includes a step of synthesizing a glycosylated peptide containing an amino acid by a solid phase synthesis method using substantially uniform glycosylated Asn.
  • the solid phase synthesis method can be performed according to a known method or a method analogous thereto. For example, it is described in International Publication No. WO2004 / 005330, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety.
  • a hydroxyl group of a resin having a hydroxyl group is esterified with a carboxyl group of an amino acid in which the amino group nitrogen is protected with a lipophilic protecting group.
  • a hydroxyl group of a resin having a hydroxyl group is esterified with a carboxyl group of an amino acid in which the amino group nitrogen is protected with a lipophilic protecting group.
  • At least two or more by adding a step of amidating the carboxyl group of the asparagine part of the sugar chain asparagine in which the amino group nitrogen is protected with the lipophilic protecting group of (6) and the free amino group as appropriate.
  • a glycopeptide having a sugar chain asparagine at any position of the peptide chain can be produced. Further, at this time, by using different sugar chain asparagines, glycopeptides having two or more kinds of sugar chain asparagines at arbitrary positions of the peptide chain can also be produced.
  • the resin having a hydroxyl group may be any resin (resin) having a hydroxyl group generally used in solid phase synthesis.
  • resin resin having a hydroxyl group generally used in solid phase synthesis.
  • Amino-PEGA resin manufactured by Merck
  • Wang resin manufactured by Merck
  • HMPA -PEGA resin manufactured by Merck
  • HMPB-PEGA resin is preferred.
  • amino acids all amino acids can be used.
  • natural amino acids such as serine (Ser), asparagine (Asn), valine (Val), leucine (Leu), isoleucine (Ile), alanine (Ala), tyrosine (Tyr), glycine (Gly), lysine (Lys), arginine (Arg), histidine (His), aspartic acid (Asp), glutamic acid (Glu), glutamine (Gln), threonine (Thr), cysteine (Cys), Examples include methionine (Met), phenylalanine (Phe), tryptophan (Trp), and proline (Pro).
  • the fat-soluble protective group examples include carbonate-based or amide groups such as 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) group, t-butyloxycarbonyl (Boc) group, benzyl group, allyl group, allyloxycarbonyl group, and acetyl group.
  • Protecting groups of the system can be mentioned.
  • the fat-soluble protecting group for example, when introducing the Fmoc group, 9-fluorenylmethyl-N-succinimidyl carbonate and sodium hydrogen carbonate can be added and reacted. The reaction is carried out at 0 to 50 ° C., preferably at room temperature, for about 1 to 5 hours.
  • the above-mentioned amino acid can be produced by the above-described method.
  • Commercially available products can also be used.
  • Examples include Fmoc-Glu, Fmoc-Gln, Fmoc-Thr, Fmoc-Cys, Fmoc-Met, Fmoc-Phe, Fmoc-Trp, and Fmoc-Pro.
  • dehydration condensing agents such as 1-mesitylenesulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazole (MSNT), dicyclohexylcarbodiimide (DCC), diisopropylcarbodiimide (DIPCDI), and the like can be used.
  • MSNT 1-mesitylenesulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazole
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • DIPCDI diisopropylcarbodiimide
  • the use ratio of the amino acid and the dehydration condensing agent is usually 1 to 10 parts by weight, preferably 2 to 5 parts by weight, with respect to 1 part by weight of the former.
  • the esterification reaction is preferably performed, for example, by placing a resin in a solid phase column, washing the resin with a solvent, and then adding an amino acid solution.
  • the cleaning solvent include dimethylformamide (DMF), 2-propanol, methylene chloride and the like.
  • the solvent that dissolves amino acids include dimethyl sulfoxide (DMSO), DMF, and methylene chloride.
  • the esterification reaction is carried out at 0 to 50 ° C., preferably at room temperature, for about 10 minutes to 30 hours, preferably about 15 minutes to 24 hours.
  • the elimination of the lipophilic protecting group can be carried out, for example, by treatment with a base.
  • a base include piperidine and morpholine.
  • a solvent examples include DMSO, DMF, methanol and the like.
  • amidation reaction between the free amino group and the carboxyl group of any amino acid whose amino group nitrogen is protected with a fat-soluble protecting group is preferably performed in the presence of an activator and a solvent.
  • activator examples include dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (WSC / HCl), diphenylphosphoryl azide (DPPA), carbonyldiimidazole (CDI).
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • WSC / HCl 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • DPPA diphenylphosphoryl azide
  • CDI carbonyldiimidazole
  • the activator is used in an amount of 1 to 20 equivalents, preferably 1 to 10 equivalents, more preferably 1 to 5 equivalents with respect to any amino acid in which the amino group nitrogen is protected with a fat-soluble protecting group. Is preferred.
  • the solvent examples include DMSO, DMF, methylene chloride and the like.
  • the reaction is carried out at 0 to 50 ° C., preferably at room temperature, for about 10 to 30 hours, preferably about 15 minutes to 24 hours.
  • the elimination of the lipophilic protecting group can be carried out in the same manner as described above.
  • the acid include trifluoroacetic acid (TFA) and hydrogen fluoride (HF).
  • an amidation reaction is performed with the carboxyl group of the asparagine portion of the sugar chain asparagine in which the amino group nitrogen is protected with a fat-soluble protecting group in (6) above, and then the fat-soluble protecting group in (7) is eliminated to form a free amino group.
  • a sugar chain asparagine in which the amino group nitrogen is protected by a hydroxyl group of a resin (resin) having a hydroxyl group and a lipophilic protecting group A glycopeptide having a sugar chain asparagine at the end can be produced by esterifying the carboxyl group of the asparagine moiety.
  • the substantially uniform glycosylated Asn used in the solid phase synthesis is, for example, international publication numbers WO02 / 04471, WO03 / 008431, WO2004 / 058984, WO2004 / 058824, WO2004 / 070046, WO2007. / 011055, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety.
  • the glycosylated peptide preferably has N-terminal amino acid as Cys.
  • this N-terminal By setting this N-terminal as this amino acid, it can be preferably applied to a ligation method such as the NCL method described later.
  • the Cys residue can be converted to Ala or Ser after ligation. Therefore, if the N-terminus of the glycosylated peptide is at position 39 or 59 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, the same amino acid sequence as the natural type is obtained by converting the Cys residue to Ala or Ser after ligation. It can be.
  • a method for converting a Cys residue to Ala or Ser will be described later.
  • the N-terminal amino acid of the glycosylated peptide may be a threonine derivative represented by the following formula (1) (hereinafter referred to as “threonine derivative (1)”).
  • a glycosylated peptide having a threonine derivative (1) at the N-terminus can also be preferably applied to the ligation method.
  • the threonine derivative (1) can be converted to Thr after ligation. Therefore, if the N-terminus of the glycosylated peptide is, for example, position 61 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, the threonine derivative (1) is converted to Thr after ligation, and the same amino acid sequence as the natural type is obtained. can do.
  • a method for converting the threonine derivative (1) to Thr will be described later.
  • the glycosylated peptide is synthesized by a solid phase synthesis method, it is preferably 50 amino acids or less, and more preferably 40 amino acids or less.
  • the glycosylated peptide is preferably 3 amino acids or more, more preferably 6 amino acids or more.
  • a position within 30 amino acids to 1 amino acid is preferred on the N-terminal side. The position is more preferably within 20 amino acids to 1 amino acid, and still more preferably within 10 amino acids to 1 amino acid.
  • the C-terminal of the glycosylated peptide is preferably an amino acid adjacent to the N-terminal side of Cys, Ser, Thr, or Ala closest to the C-terminal side of the glycosylated peptide.
  • the C-terminal partial peptide of the glycosylated peptide has Cys, Ser, Thr or Ala at the N-terminus. If the N-terminus of the C-terminal partial peptide is Cys, it can be directly subjected to ligation, and the amino acid sequence after ligation is the same as the natural type.
  • the N-terminus of the C-terminal partial peptide is Ser or Ala
  • the N-terminus is set to Cys, and after ligation, Cys is converted to Ser or Ala.
  • the same amino acid sequence can be obtained.
  • the N-terminus of the C-terminal partial peptide is Thr
  • the N-terminus is a threonine derivative (1), and the threonine derivative (1) is converted to Thr after ligation
  • An amino acid sequence identical to the natural type can be obtained.
  • the method for producing an IgG-Fc fragment according to the present invention includes a partial peptide (N-terminal side partial peptide) on the N-terminal side from the above-mentioned glycosylated peptide in the IgG-Fc fragment, and a C-terminal from the glycosylated peptide.
  • the method of expressing with an expression system can produce a polypeptide at lower cost and more efficiently than solid phase synthesis if an efficient expression system can be constructed. Is particularly preferably used for the production of.
  • solid phase synthesis can produce a polypeptide having an accurate amino acid sequence, and can prevent an extra sugar chain from being added by post-translational modification.
  • Those skilled in the art can appropriately determine whether the N-terminal partial peptide and the C-terminal partial peptide should be expressed by an expression system or synthesized by a solid-phase synthesis method according to their lengths and characteristics.
  • the N-terminal side partial peptide and the C-terminal side partial peptide may be further divided depending on their lengths, and each may be expressed by an expression system or synthesized by a solid phase synthesis method and then subjected to a ligation method.
  • the N-terminal is designed to be Cys, Ser, Thr or Ala, and can be preferably applied to the subsequent ligation method. Cys residues can be converted to Ser or Ala after ligation. Therefore, Ser or Ala can also be employed as the N-terminal amino acid of the partial peptide.
  • a method for converting a Cys residue into Ser is described in, for example, International Publication No. WO2009 / 17154, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety. More specifically, for example, (a) a step of converting the —SH group to an —SMe group by reacting a —SH group of a Cys residue with a methylating agent; (b) a step of producing a reaction intermediate by reacting the —SMe group obtained in step (a) with a cyanating agent; and (c) a more basic condition compared to step (b). And a step of converting the reaction intermediate obtained in step (b) into a Ser residue.
  • a method for converting a Cys residue to Ala is described in, for example, Wan et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2007, 45, 9248-9252, the disclosure of which is generally described Incorporated by reference.
  • a peptide whose N-terminus is a threonine derivative (1) can also be suitably applied to ligation.
  • This threonine derivative (1) can be converted to Thr after ligation. Therefore, Thr can also be employed as the N-terminal amino acid of the partial peptide.
  • a method for converting a Thr derivative to Thr is described, for example, in International Publication No. WO2009 / 17154, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety.
  • step (a) a step of converting the —SH group into an —SMe group by reacting the —SH group of the threonine derivative (1) residue in the peptide with a methylating agent; (b) a step of producing a reaction intermediate by reacting the —SMe group obtained in step (a) with a cyanating agent; and (c) a more basic condition compared to step (b). And a step of converting the reaction intermediate obtained in step (b) into a peptide containing a threonine residue.
  • the expression system in the present specification is an expression system using microorganisms such as bacteria or animal and plant cells as host cells.
  • a method for preparing a polypeptide chain by an expression system is well known to those skilled in the art, but typically, a step of preparing a nucleic acid molecule encoding a partial peptide to be expressed, and the prepared nucleic acid molecule in the host cell of the expression system A step of introducing, a step of culturing and growing the transformant obtained by the introduction to express a desired partial peptide, and a step of purifying the produced polypeptide chain as necessary.
  • the method for preparing a nucleic acid molecule encoding a polypeptide chain to be expressed can be any method known in the art. For example, a method of preparing a cDNA by RT-PCR or the like from mRNA of a cell expressing a target polypeptide chain and performing a nucleic acid amplification method such as PCR using this as a template and an appropriate primer can be mentioned.
  • the obtained nucleic acid molecule can be cloned and stored in various vectors. Specific vectors that are compatible with a given host are well known to those of skill in the art and many are commercially available.
  • a purification tag comprising a polypeptide having a binding property with a specific substance is expressed as a fusion protein with the target polypeptide.
  • the purification tag is not particularly limited as long as it fulfills its function, and examples thereof include a His tag, a GST tag, an S tag, a T7 tag, and the like. Furthermore, in the present invention, these tags bind to the target polypeptide. Make sure that Met is included at the end. Therefore, a nucleic acid molecule encoding a target protein is linked to a nucleic acid molecule encoding Met and a purification tag and cloned into a vector.
  • the fusion protein of the expressed purification tag and the target polypeptide can be purified by binding the purification tag to the specific substance.
  • the purification tag is bound to the target polypeptide via Met, for example, the purification tag and the target polypeptide can be cleaved by decomposing Met with CNBr.
  • Met contained in the target polypeptide is also decomposed when the purification tag is cut off, Met contained in the polypeptide expressed by the expression system may include other amino acids in advance (for example, Leu and the like, but is not limited thereto). It is preferred to design a nucleic acid molecule that encodes the protein of interest so that it is replaced with.
  • any method known in the art can be used.
  • the gene is incorporated into a viral vector, and the vector is inserted into a mesenchymal cell.
  • Direct gene transfer via calcium phosphate transfection, DEAE-dextran transfection, protoplast fusion, electroporation (electroporation), liposome fusion, polybrene transfection and cell membrane laser microporation
  • calcium phosphate transfection DEAE-dextran transfection
  • protoplast fusion protoplast fusion
  • electroporation electroporation
  • liposome fusion protoplast fusion
  • polybrene transfection and cell membrane laser microporation
  • cell membrane laser microporation There are a number of well-known techniques, including delivery. Those skilled in the art can also use any other technique in the present invention that can integrate the gene into the cell's genome and appropriately introduce it into the cell to allow expression of the gene.
  • Arbitrary microorganisms and cells such as yeast, animal cells, insect cells, plant cells and the like can be used for the preparation by the expression system, but bacteria, particularly Escherichia coli is preferred from the viewpoint of production efficiency and ease of handling.
  • an expression system in which a sugar chain is not added to a polypeptide chain for example, a bacterial expression system, is preferable because sugar chains having the same structure are bound synthetically.
  • the medium contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts and the like that can be assimilated by the organism. Any natural or synthetic medium may be used as long as the medium can efficiently be cultured.
  • the carbon source may be anything that can be assimilated by the organism, such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, organic acids such as acetic acid and propionic acid, ethanol, Alcohols such as propanol can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium salts of organic acids such as ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein Hydrolysates, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented bacterial cells and digested products thereof, and the like can be used.
  • inorganic salts that can be used include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate.
  • Culture of transformants using prokaryotes such as E. coli or eukaryotes such as yeast as hosts is usually carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration and agitation culture.
  • the culture temperature is preferably 15 to 40 ° C., and the culture time is usually 16 hours to 7 days.
  • the pH is maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • cultivating a microorganism transformed with a recombinant vector using the lac promoter cultivate a microorganism transformed with isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside or the like using a recombinant vector using the trp promoter.
  • indoleacrylic acid or the like may be added to the medium.
  • the transformant in culture expresses the polypeptide naturally or by induction, and can produce and accumulate it in the culture.
  • a method for expressing a polypeptide in addition to direct expression, secretory production, fusion protein expression, and the like can be performed.
  • Polypeptides can be produced in a host cell, secreted into the host cell, or produced on the outer membrane of the host cell. The host cell used and the structure of the polypeptide to be produced are determined. By changing, the method can be selected.
  • a polypeptide produced by a transformant into which a gene encoding a polypeptide has been introduced for example, when the polypeptide is expressed in a state of being dissolved in the cell, after completion of the culture, the cell is recovered by centrifugation, After suspending in an aqueous buffer solution, the cells are crushed with an ultrasonic crusher, French press, Manton Gaurin homogenizer, dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • an ordinary enzyme isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, diethylamino Resin such as ethyl (DEAE) -Sepharose, anion exchange chromatography using resin such as Diaion (registered trademark) HPA, cation exchange chromatography using resin such as Sepharose FF, resin such as butyl sepharose, phenyl sepharose Using methods such as hydrophobic chromatography using gel, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, and electrophoresis such as isoelectric focusing alone or in combination, A purified sample can be obtained.
  • the cell-free extract containing the target polypeptide can be subjected to a step of inactivating or removing biological substances before or after the purification step, preferably after the purification step.
  • steps include, but are not limited to, any method known to those skilled in the art, such as heat treatment, filtration, organic solvent treatment, purification using a column or the like, light treatment using a psoralen derivative, or the like.
  • the heat treatment can be performed, for example, under the temperature and time conditions of 60 to 65 ° C. and 10 to 144 hours, which are used for the treatment of fibrinogen, albumin preparation and the like.
  • the cell When the polypeptide is expressed by forming an insoluble substance in the cell, the cell is collected and then crushed and centrifuged to recover the polypeptide insoluble substance as a precipitate fraction.
  • the recovered polypeptide insolubles are solubilized with a protein denaturant. By diluting or dialyzing the solubilized solution, the polypeptide is returned to a normal three-dimensional structure, and then a purified preparation of the polypeptide can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the polypeptide or a derivative thereof can be recovered in the culture supernatant. That is, a soluble fraction is obtained by treating the culture by a method such as centrifugation, and a purified polypeptide preparation is obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. Can do.
  • the target polypeptide and the purification tag are fused and expressed via Met.
  • the fusion protein is purified by binding to a substance having an affinity for the purification tag, and then treated with CNBr or the like in the presence of a strong acid and a water-miscible solvent, whereby Met is decomposed and the target polypeptide is separated. Disconnect from purification tag.
  • the strong acid refers to an acid not containing a weak acid such as formic acid or acetic acid.
  • Formic acid may formylate the polypeptide chain, and acetic acid may acetylate the polypeptide chain, which can reduce the production rate of the target protein.
  • the strong acid includes a weaker acid than an acid generally referred to as a strong acid unless such formylation occurs.
  • preferred strong acids include, but are not limited to, trifluoroacetic acid (TFA), hydrogen fluoride, and methanesulfonic acid.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the strong acid is preferably added at a concentration of 0.1% to 50%, more preferably 1% to 20%, and even more preferably 1% to 5%.
  • the water-miscible solvent is not particularly limited as long as it is a water-miscible solvent.
  • examples thereof include acetonitrile, trifluoroethanol, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide (DMSO), and methylene chloride. Of these, acetonitrile, trifluoroethanol, and dimethylformamide are preferable.
  • the solvent is preferably added at a concentration of 1% to 70%, more preferably 20% to 60%, and still more preferably 35% to 50%.
  • the portion obtained by removing the glycosylated peptide and the partial peptide expressed by the expression system from the IgG-Fc fragment can be accurately synthesized by a solid phase synthesis method as appropriate.
  • Solid-phase synthesis can be performed according to the above-described synthesis by a solid-phase synthesis method of a sugar chain peptide except that a glycosylated amino acid is used.
  • a glycosylated peptide, a partial peptide expressed by an expression system, and a partial peptide synthesized by a solid phase synthesis method are linked by a ligation method.
  • examples of the “ligation method” in the present specification include a natural chemical ligation method (Native Chemical Ligation, NCL method) and a Kinetically Controlled Ligation method (KCL method).
  • NCL method is described in, for example, International Publication No. WO96 / 34878, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety.
  • the KCL method was reported by Kent and is an NCL method with kinetic control (Kent et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 3985-3988).
  • Ligation using the ligation method can be performed at any of peptide-peptide, peptide-glycopeptide, and glycopeptide-glycopeptide.
  • a peptide (or glycopeptide) having an ⁇ -carboxythioester moiety at the C-terminus used in the ligation method is produced using a technique known to those skilled in the art as described in International Publication WO96 / 34878. be able to.
  • a protected peptide (or glycopeptide) in which the amino acid side chain and the N-terminal amino group are protected is obtained by solid phase synthesis, and the carboxyl group on the C-terminal side is removed.
  • the condensation agent is condensed with benzylthiol using PyBOP (Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate) / DIPEA, and then the amino acid chain is removed using 95% TFA solution.
  • PyBOP Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate
  • DIPEA Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate
  • the ligation method can be carried out by using a method known to those skilled in the art as described in the pamphlet of International Publication No. WO96 / 34878 and referring to the description of Examples described later.
  • R does not inhibit the thiol exchange reaction and is not particularly limited as long as it is a group that becomes a leaving group in the nucleophilic substitution reaction to the carbonyl carbon, preferably a benzyl type such as benzyl mercaptan, It can be selected from aryl types such as thiophenol and 4- (carboxymethyl) -thiophenol, alkyl types such as 2-mercaptoethanesulfonate, 3-mercaptopropionic acid amide, and the like.
  • the N-terminal -SH group of the second peptide may optionally be protected by a protecting group, but this protecting group is deprotected at a desired time until the following ligation reaction, and- A second peptide having an SH group reacts with the first peptide.
  • the protecting group is naturally deprotected under conditions where ligation occurs, such as a disulfide group
  • the second peptide protected by the protecting group can be used in the following ligation reaction as it is.
  • the disulfide group is easily deprotected under the reaction conditions of the subsequent ligation method.
  • a solution such as a 100 mM phosphate buffer solution in the presence of a catalytic thiol such as 4-mercaptophenylacetic acid, benzyl mercaptan, and thiophenol as necessary.
  • a catalytic thiol such as 4-mercaptophenylacetic acid, benzyl mercaptan, and thiophenol as necessary.
  • the reaction is performed at a ratio of about 0.5 to 2 equivalents of the second peptide and about 5 equivalents of catalytic thiol to 1 equivalent of the first peptide.
  • the reaction is desirably carried out for about 1 to 30 hours under conditions of pH 6.5 to 7.5 and 20 to 40 ° C.
  • the progress of the reaction can be confirmed using a known method combining HPLC, MS and the like.
  • a reducing agent such as tris 2-carboxyethylphosphine hydrochloride (TCEP) is added to suppress side reactions, and if desired, purification can be performed to link the first peptide and the second peptide. it can.
  • TCEP tris 2-carboxyethylphosphine hydrochloride
  • -C O-SR (wherein R is an aryl group)
  • R is an aryl group
  • a + b can be further used in a ligation reaction with another peptide c having an SH group at the N-terminus.
  • the IgG-Fc fragment By ligating the full length of the IgG-Fc fragment and then performing a folding step, the IgG-Fc fragment can be processed to take an appropriate higher order structure.
  • Various known methods can be used for the folding step, and for example, it can be performed by dialysis in a folding buffer.
  • the folding buffer includes, for example, a compound having a guanidino group such as guanidine or a salt thereof, and may have a pH of 6.0 to 9.0. Dialysis may be performed a plurality of times, in which case the composition and pH of each dialysis buffer may be the same or different.
  • the fact that the polypeptide is folded can be confirmed by any method for analyzing the three-dimensional structure of the polypeptide. However, it is not limited to these.
  • the present invention also provides a method for producing an IgG1-Fc fragment.
  • the IgG1-Fc fragment is not only the IgG1-Fc fragment consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 as described above, but also one or several amino acids deleted in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1.
  • the N-terminus of the glycosylated peptide is preferably located at positions 39 to 68, more preferably positions 49 to 68 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. More preferably, it is 59th to 68th, for example, 65th. Further, it is preferable that the C-terminal is set to a position just before the closest 93-position Cys on the C-terminal side, that is, up to 92-position Lys. With this length, it is possible to synthesize without any problem in solid-phase synthesis, and after binding the sugar chain asparagine at position 69 in the solid-phase synthesis, only four amino acids are bound. There is little influence.
  • the glycosylated peptide can be suitably used for the ligation method by synthesizing by replacing the Glu at the 65th position with Cys.
  • the N-terminal of the glycosylated peptide can also be, for example, Ser at position 39, Ala at position 59, and Thr at position 61.
  • the N-terminus is substituted with Cys and synthesized, and after ligation, this is converted to Ser or Ala, whereby the same amino acid sequence as the natural type can be obtained.
  • the N-terminus is at position 61, the N-terminus is substituted with a threonine derivative (1), synthesized, and converted to Thr after ligation, whereby the same amino acid sequence as that of the natural type can be obtained.
  • the C-terminus of the glycosylated peptide may be in front of the nearest Ser, Ala, or Thr.
  • the N-terminal of the C-terminal partial peptide is Cys or the above-described threonine derivative (1), and converted to Ser, Ala, or Thr after ligation, whereby the same amino acid sequence as that of the natural type can be obtained.
  • the N-terminal partial peptide is from 1 to 64
  • the C-terminal partial peptide is from 93 to 216.
  • Each can be obtained by synthesis by a solid-phase synthesis method or by expression by an expression system, but may be produced separately in smaller partial peptides and linked by a ligation method.
  • N-terminus of the partial peptide to be Cys, Ser, Ala, or Thr, so that the partial peptide is synthesized with the N-terminus as Cys or threonine derivative (1) suitable for the ligation method.
  • the binding site can be converted to the same amino acid sequence as that of the natural type.
  • the N-terminal partial peptide may be further divided between the 32-position Thr and the 33-position Cys, and each may be synthesized by a solid-phase synthesis method.
  • the partial peptide at positions 33 to 64 is Cys at the N-terminus, so that it can be easily subjected to the ligation method, and the same amino acid sequence as that of the natural IgG1-Fc fragment can be used at the ligation site. it can.
  • the C-terminal partial peptide may be divided between Thr at position 138 and Cys at position 139 and / or between Ser at position 196 and Cys at position 197, and synthesized by solid phase synthesis, respectively.
  • the N terminal of each peptide can be set to Cys.
  • the full length of the C-terminal partial peptide may be expressed by an expression system. According to this method, it is possible to efficiently produce a relatively long C-terminal partial peptide in a large amount and at a low cost.
  • the Met at positions 130 and 200 contained in the C-terminal partial peptide is preferably designed to be expressed by substitution with Leu or the like so as not to be decomposed upon purification tag cleavage.
  • the chimeric antibody according to the present invention is a chimeric antibody comprising a human IgG-Fc fragment.
  • a chimeric antibody as long as it specifically binds to an antigen, it is preferable that there are as many human-type antibody portions as possible.
  • the chimeric antibody of the present invention is obtained by, for example, expressing a polypeptide moiety other than IgG-Fc as a thioester using the intein method, thereby substantially adding the glycosylated IgG-Fc fragment according to the present invention and the substantially present invention.
  • the chimeric antibody according to the present invention has a uniform amino acid sequence, sugar chain structure, sugar chain addition position, and higher-order structure and no lot difference, and is useful as a pharmaceutical or research tool.
  • the present invention also provides a method for designing a method for producing an IgG-Fc fragment to which a uniform sugar chain is added.
  • an IgG-Fc fragment is prepared by dividing a glycosylated peptide containing a glycosylated amino acid into one or more other peptides, and the glycosylated peptide is the glycosylated amino acid.
  • the glycosylated peptide is synthesized by a solid phase synthesis method using a uniform glycosylated amino acid.
  • the glycosylated peptide By synthesizing the glycosylated peptide as a relatively short glycosylated peptide containing a glycosylated amino acid, it can be suitably synthesized by a solid phase synthesis method.
  • the peptide in the case of solid phase synthesis, the peptide is synthesized in the direction from the C-terminal to the N-terminal. Therefore, the N-terminus of the glycosylated peptide is in the range of 1 to 30 positions, preferably 1 to 20 positions, more preferably 1 to 10 positions counted from the glycosylated amino acid on the N-terminal side of the glycosylated amino acid.
  • the N-terminus of the glycosylated peptide is more preferably within the range of 5 amino acids to 1 amino acid on the N-terminal side of the glycosylated amino acid.
  • the synthesized glycosylated peptide can be directly used for ligation by using Cys as the N-terminus, and even after ligation. It has the same amino acid sequence as the natural type.
  • Cys does not exist within the range of 1-30 amino acids on the N-terminal side of glycosylated amino acids such as IgG1-Fc, the N-terminal amino acid is substituted with Cys when synthesizing glycosylated peptides. What is necessary is just to synthesize. Cys can be converted to Ala or Ser after ligation.
  • the N-terminus of the glycosylated peptide is substituted with Cys and synthesized and ligated.
  • Ser or Ala the same amino acid sequence as the natural type can be obtained.
  • the N-terminus of the glycosylated peptide is replaced with a threonine derivative (1), it can be converted to Thr after ligation, so that the N-terminus of the glycosylated peptide is at position 61 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1. It is also preferable that
  • the C-terminal of the glycosylated peptide is preferably an amino acid adjacent to the N-terminal side of Cys closest to the C-terminal side of the glycosylated amino acid.
  • the N-terminus of the C-terminal partial peptide of the glycosylated peptide can be set to Cys, so that it can be easily subjected to the subsequent ligation step, and the same amino acid sequence as the natural type can be obtained at the ligation site.
  • the C-terminal of the glycosylated peptide may be an amino acid adjacent to the N-terminal side of Ser, Ala, or Thr closest to the C-terminal side of the glycosylated amino acid.
  • the N-terminal of the C-terminal partial peptide can be synthesized as Cys or a threonine derivative (1) and converted to Sel, Ala, or Thr after ligation to obtain the same amino acid sequence as that of the natural type.
  • peptides other than the glycosylated peptide are expressed by an expression system or synthesized by a solid phase synthesis method.
  • a person skilled in the art can appropriately determine whether the expression is performed by an expression system or the solid-phase synthesis method depending on the length and characteristics of the peptide. If the polypeptide is long, it is divided into two or more partial peptides at the N-terminal side of Cys, Ser, Ala or Thr contained in the polypeptide, and each partial peptide is expressed by an expression system or a solid phase. You may decide whether to synthesize
  • the peptides when other peptides are expressed by an expression system, the peptides are expressed as a fusion protein with a purification tag having affinity for a specific substance and containing Met, The peptide and the purification tag are cleaved by decomposing Met in the presence of a strong acid and a water-miscible solvent. By adding a strong acid and a water-miscible solvent, it is possible to improve the production rate of the target polypeptide without causing formylation of the target peptide. At this time, Met contained in the target peptide is changed to an amino acid other than Met and expressed. This prevents the target peptide from being decomposed when the purification tag is cut off.
  • Embodiments of the present invention may be described with reference to schematic diagrams, but in the case of schematic diagrams, they may be exaggerated for clarity of explanation.
  • terms such as first, second, etc. are used to represent various elements, it is understood that these elements should not be limited by those terms. These terms are only used to distinguish one element from another, for example, the first element is referred to as the second element, and similarly, the second element is the first element. Can be made without departing from the scope of the present invention.
  • a human IgG1-Fc fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 was synthesized.
  • Glu at position 65 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is replaced with Cys
  • Met at positions 130 and 200 is replaced with Leu.
  • Gln at position 128 is replaced with Asp.
  • FIG. 1 The outline of the synthesis is shown in FIG. 1, and the amino acid sequence of the IgG1-Fc fragment is shown in FIG.
  • SEQ ID NO: 2 Thr at position 1 from position 1 Cys to fragment A, position 33 from position Cys to position 64 Arg to fragment B, position 65 to position Lys to fragment C, position 93 to position 216 to position Ser at fragment D did.
  • Fragments A and B correspond to the N-terminal partial peptide
  • fragment C corresponds to the glycosylated peptide
  • fragment D corresponds to the C-terminal partial peptide.
  • Fragments A to C were chemically synthesized, and fragment D was prepared by the E. coli expression method.
  • fragments A and B were ligated by the KCL method to give fragment A + B
  • fragments C and D were ligated by the NCL method to give fragment C + D
  • both were ligated by the NCL method.
  • the sugar chain was bound to the 69-position Asn of SEQ ID NO: 2 by using the following asialo sugar chain-bound Asn during the solid-phase synthesis of fragment C.
  • the RP-HPLC analyzer is manufactured by Waters
  • the UV detector is Waters486 manufactured by Waters and the photodiode array detector (Waters 2996)
  • the column is Cadenza column (Imtakt Corp., 3 ⁇ m, 75 ⁇ 4.6 mm).
  • Vydac C-18 (5 ⁇ m, 4.6 ⁇ 250 mm, 10 ⁇ 250 mm) and Superdex 75 TM 10/300 GL were used.
  • Esquire3000 plus manufactured by Bruker Daltonics was used.
  • HMPB (4- (4-Hydroxymethyl-3-metoxyphenoxy-butyric acid) 2.5 equivalent (60.0 mg, 0.25 mmol), TBTU 2.5 equivalent (80.2 mg, 0.25 mmol), N-Ethylmorpholine (31.6 ⁇ l, 0.25 mmol)
  • DMF 2 ml
  • This resin was used for solid phase synthesis.
  • Introduction of the first amino acid into the solid phase is as follows. Fmoc-Thr (Bu t ) -OH 5 equivalent (198.8 mg, 0.5 mmol), MSNT 5 equivalent (148 mg, 0.5 mmol), N-methylimidazole 3.75 equivalent (29.8 ⁇ l, 0.38 mmol) in DCM (2 ml, 250 mM) ), And placed in a solid phase synthesis tube containing a resin and stirred at room temperature for 2 hours. After stirring, the resin was washed with DCM and DMF. The Fmoc group was deprotected using 20% piperidine / DMF solution (1 ml) for 20 min.
  • Lys (Boc) (234.3mg, 0.5mmol ), Thr (Bu t) (198.8mg, 0.5mmol), Lys (Boc) (234.3mg, 0.5mmol), Ala (155.7mg, 0.5mmol), Asn (Trt) (298.4mg, 0.5mmol), His (Trt) (309.9mg, 0.5mmol), Val (169.7mg, 0.5mmol), Gln (184.2mg, 0.5mmol), Val (169.7mg, 0.5mmol), Gly (148.7 mg, 0.5mmol), Asp (Bu t ) (205.8mg, 0.5mmol), Val (169.7mg, 0.5mmol), Tyr (229.8mg, 0.5mmol), Trp (Boc) (263.3mg, 0.5mmol), Asn (177.2mg, 0.5mmol), Phe (193.7mg, 0.5mmol), Lys (Boc) (234.3
  • amino acids used are as follows. Gln (5.5mg, 15 ⁇ mol), Gln (5.5mg, 15 ⁇ mol), Boc-L-thiazolidine-4-carboxylic acid (3.5mg, 0.5mmol)
  • fragment D used IgFc (PDB accession no.1L6X) whose structure was already solved and incorporated in the plasmid vector pBluescript SK (+) (11 in FIG. 4).
  • IgFc (1L6X) is Asp356 and Leu358, respectively, whereas Fragment D is a variant of a human antibody, Gln356 and Met358 (corresponding to positions 128 and 130 in SEQ ID NO: 1, respectively).
  • Asp356 and Leu358 of IL6X were left as they were, and a mutation with Met428 as Leu was added for the convenience of CNBr treatment of fragment D.
  • Fragment D was expressed by the E. coli method as a fusion protein having Met on the N-terminal side and a purified tag peptide called a His tag in which 10 Hiss were arranged.
  • the fusion protein is shown below.
  • Sample1 54.4ng / ⁇ l
  • Sample2 48.2 ng / ⁇ l
  • Sample3 40.6 ng / ⁇ l
  • Sample4 29.9 ng / ⁇ l
  • Samples other than restriction enzymes were prepared on ice using Sample 2.
  • DNA 3 ⁇ g
  • 24) 3 ⁇ l of restriction enzyme was added on ice.
  • the reaction was performed at 37 ° C. for 2 hours in a thermostatic bath.
  • Electrophoresis of 6 ⁇ l of reaction system was performed.
  • Competent Cell Competent high E.coli DH5 ⁇
  • TOYOBO code # DNA-903 ⁇ Competent Cell ⁇ SOC medium
  • the culture solution was transferred to a 15 ml centrifuge tube cooled on ice. (9) The mixture was centrifuged at 2,000 rpm (0 ° C.) for 20 minutes. (10) The supernatant was discarded, and 3 ml of cold 0.1M MgCl 2 was added and washed. (11) The mixture was centrifuged at 2,000 rpm (0 ° C.) for 20 minutes. (12) The supernatant was discarded, and 3 ml of cold 0.1M CaCl 2 was added and washed.
  • Isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside IPTG was added to the culture medium of E. coli BL21 (DE3) to induce expression. After culturing, E. coli was collected and the cell wall was crushed with ultrasonic waves, and then the E. coli crushed solution was passed through a Ni-NTA resin column to adsorb the His tag-fragment D fusion protein. Next, a washing buffer containing imidazole was flowed to elute the fusion protein. The eluted fusion protein was confirmed to be the target substance by HPLC analysis and mass spectrometry. Subsequently, when the eluate was freeze-dried, a white solid was obtained. This solid was subjected to CNBr treatment to remove the His tag from fragment D. CNBr treatment was performed in the presence of 40% acetonitrile and 2% TFA.
  • Dialysis before CNBr treatment (23) Dialysis tube (Spectra / Por (registered trademark) Membrane MW: 3,500, Flat Width .: 54mm, Diameter .: 34mm, Vol / Length .: 9.3ml / cm, Length .: 15m / 50 ft) Then, 5 L of distilled water was used as an external solution and stirred at 4 ° C. (o / n) (24) The sample in the dialysis tube was collected and lyophilized. Yield: 40mg / L culture
  • the gel was poured into a gel maker stand prepared in advance. (7) Before the gel hardened, bubbles on the gel surface were removed using a blue chip or the like. (8) When the foam was removed, the comb was inserted. (9) The gel was hardened by leaving it at room temperature for about 30 minutes.
  • Electrophoresis method (1) The electrophoresis buffer was mixed with tweezers or a blue chip, and the solution was stirred uniformly. (2) The sample to be run and the loading dye were mixed well by pipetting. (3) Sample was applied to the well. (4) A DNA ladder (marker) suitable for the purpose was applied. (5) Power was turned on, Voltage was selected, and electrophoresis was started. (6) When the electrophoresis was finished, the power was turned off, the gel tray was pinched with tweezers and placed on the Saran wrap. (7) The gel was removed from the gel tray on the Saran wrap. (8) A photograph was taken with a gel photographing device.
  • reagents (1) LB; Bacto-tryptone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, Agar 15g / 1L H 2 O (2) Petri dish containing LB; mix Bacto tryptone 10g, Yeast Extract 5g, NaCl 5g, Glucose 5g, / 1L H 2 O 100ml ampicillin was added when it was cooled, and 30ml each was plated on a petri dish.
  • the KCL method is a method in which the C-terminal thioester of fragment A is prepared as a thioester having a higher elimination ability than the thioester of fragment B, and ligated by the NCL method using the difference in reaction rate between the two fragments. By this method, it is possible to link the peptide chain while leaving the thioester at the C-terminus of fragment B.
  • Fragment A peptide thioester (2 mg, 0.56 ⁇ mol) was transferred to an Eppendorf tube and dissolved by adding 6 M GnHCl, 0.2 M phosphate buffer solution, 40 mM TCEP adjusted to pH 6.8.
  • Fragment B peptide thioester (2 mg, 0.53 ⁇ mol) previously dissolved in a buffer solution (300 ⁇ l) was added to an Eppendorf tube containing the fragment A peptide thioester, and allowed to react for 2 hours.
  • Fragment A + B was obtained by purification by HPLC. The reaction was traced using HPLC.
  • the Lysozyme solution was prepared by removing MPAA from the Ligation buffer (8M GnHCl adjusted to pH 7.5, 0.2M phosphate buffer solution, 40mM TCEP, 25mM MPAA) used for NCL of fragment C and fragment D. is there.
  • the solvent used in the gel filtration performed in the section of “13. Agarose gel electrophoresis” was a 10% formic acid aqueous solution
  • the solvent was concentrated with Ultracel Amicon (registered trademark) YM-10, % Aqueous formic acid was filtered.
  • the buffer was changed to 8 M GnHCl, 0.2 M phosphate buffer solution, 40 mM TCEP adjusted to pH 7.5.
  • the concentration of fragment D in this concentrated solution was determined to be about 1 mM.
  • (b) was a peak of fragment D of the raw material
  • (c) was a peak of fragment C of the raw material.
  • the peak of (c) was a mass number that is considered to be the following compound P or Q in which the side chain of Lys in the molecular molecule of fragment C attacked the thioester and the thioester was removed and cyclized.
  • FIG. 7 shows the results of analyzing the progress of this reaction by SDS-PAGE.
  • Lane 1 represents fragment C
  • Lane 2 represents a His tag + fragment D (16 kDa)
  • Lane 3 represents a reaction solution.
  • M is a molecular weight marker. The most polymer band of Lane3 (product (d)) was considered to be the target.
  • the fraction containing the peak (a) of gel filtration chromatography was concentrated by centrifugation, and at the same time, the solution was replaced with a 0.5 M phosphate buffer solution adjusted to pH 7.5. During this time, 10 ⁇ Glycoprotein Denaturing Buffer (SDS 2.5 mg, DTT 30.8 mg / 500 ⁇ l) and 10 ⁇ G7 Reaction Buffer (0.5 M phosphate buffer adjusted to pH 7.5) were prepared. Next, 3 ⁇ l of 10 ⁇ Glycoprotein Denaturing Buffer was added to 27 ⁇ l of the solution containing the concentrated peak (a) and heated at 110 ° C.
  • SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence of the human IgG1-Fc fragment.
  • SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of a human IgG1-Fc fragment produced by the production method according to the present invention.
  • SEQ ID NO: 3 shows the base sequence of the sense primer for IgFc cloning.
  • SEQ ID NO: 4 shows the base sequence of an antisense primer for IgFc cloning.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

　本発明は、実質的に均一な糖鎖が付加されたIgG-Fcフラグメントの全長、及びこれを製造する方法を提供することを目的とする。　本発明は、天然のIgG-Fcフラグメントと同一の位置に糖鎖が付加されており、糖鎖付加アミノ酸のN末端側で、該糖鎖付加アミノ酸から数えて1～30位のアミノ酸のいずれか1つがCysに置換され、少なくとも1つのMetがMet以外のアミノ酸に置換されている、糖鎖付加IgG-Fcフラグメント及びその製造方法を提供するものである。

Description

IgG-Fcフラグメント及びその製造方法
　本発明は、新規なヒトIgG-Fcフラグメント及びその製造方法に関する。
　近年、様々な標的分子に特異的に結合する種々の抗体医薬が開発されている。抗体は、Y字型を基本構造とするタンパク質である。Y字の上半分は、抗原に結合するFab領域であり、2本の軽鎖と2本の重鎖からなる。Y字型の下半分はFc領域と呼ばれる。
　Fab領域の先端に近い部分は、抗体によって異なる可変領域であり、重鎖の可変領域をVH領域、軽鎖の可変領域をVL領域と呼ぶ。可変領域以外のFab領域とFc領域は、比較的変化の少ない領域であり、一般に定常領域と呼ばれる。軽鎖の定常領域はCL領域、重鎖の定常領域をCH領域と呼び、CHのうちFab領域に該当する部分をCH1ドメイン、Fc領域に該当する部分をN末端側から順にCH2ドメイン、CH3ドメインと呼ぶ。CH1ドメインとCH2ドメインはヒンジ部で結合し、左右の重鎖はヒンジ部においてジスルフィド結合している。
　特定の抗原に対する抗体は、例えば当該抗原でマウスを免疫することによって得ることができる。しかしながら、マウスが産生する抗体は、ヒトにおいて免疫原性が高く、ヒトへの投与は制限される。また、ヒトの体内においては、マウス抗体の半減期が比較的短く、十分に効果を得られない可能性が高い。
　この問題を解決するものとして、マウス抗体の定常領域をヒト型抗体の定常領域で置き換えるキメラ抗体が開発されている。キメラ抗体は、マウス抗体と同一の特異性をもって抗原に結合することが可能であり、かつ、免疫原性が低いことが予想される。そのため、キメラ抗体に利用するためのヒト型の定常領域やFc領域の製造方法が研究されており、特に、IgG、IgA、IgM、IgD、IgEの5種類に分類される免疫グロブリンのうち、ヒト免疫グロブリンの70－75％を占め、血漿中に最も多い抗体であるIgGについての研究が進められている。現在販売されている抗体医薬もほとんどがIgGである。IgGは、抗体依存性細胞障害活性（ADCC）と呼ばれる抗原破壊活性を示し、特に、IgG1とIgG3のサブクラスはこの活性が強いことが知られている。
　IgGのFcフラグメントは、ヒンジ部における共有結合とCH3ドメイン同士の非共有結合で構成されるホモ二量体であり、CH2ドメインの297残基目（配列番号：１における69位）AsnにN型糖鎖が結合している。X線結晶構造解析によれば、この糖鎖は内側を向いており、CH2ドメインのタンパク表層と複数箇所で水素結合を形成している。この糖鎖はFcフラグメントの構造形成及び維持に必要不可欠であることが示唆されている（例えば、非特許文献１を参照）。
　IgGがADCCにより抗原を破壊する過程においては、まずIgGの可変領域が標的細胞上に存在する特定のタンパク質に結合する。次いで、FcフラグメントがNK細胞などのエフェクター細胞上のFc受容体と結合し、これによって標的細胞に孔を形成するパーフォリンと呼ばれるタンパク質がエフェクター細胞から放出され、IgGが捕獲した標的細胞が破壊される。
　ADCC活性の発現には、IgG1に結合した糖鎖の構造が関与していることが見出され、これまでにグリコシル化されたFcフラグメントについて多くの研究がなされている。例えば、CHO細胞に糖転移酵素N-アセチルグルコサミン転移酵素（GNTIII）の遺伝子を導入し、非還元末端がGlcNAcである2分岐糖鎖を有する抗神経芽細胞腫抗体を当該CHO細胞から調製したことが報告されている。当該研究により、糖鎖を付加することによって、神経芽細胞腫に対するADCC活性が増強されることが示された（例えば、非特許文献２を参照）。
　また、IgG1-Fcフラグメントと、FcγRIIIの複合体結晶構造解析によって、FcフラグメントとFc受容体が結合する際、FcフラグメントのAsn297に結合したN結合型糖鎖がFcフラグメントのタンパク質と相互作用し、その構造を安定化させていることが示唆されている（例えば、非特許文献１を参照）。糖鎖が結合したFcフラグメントは、糖鎖が結合していないFcフラグメントと比較して、熱力学的にも生物学的にも安定であることも示されている（例えば、非特許文献３を参照）。
　また、糖鎖の構造が、抗体の活性に影響し得ることも知られている。例えば、糖鎖の還元末端側のGlcNAcの6位に結合したフコースが除去されたヒト型IgG1を発現させたことが報告されており、当該抗体のFcγRIIIとの結合を介したADCC活性が40-50倍増強されることが示された（例えば、非特許文献４を参照）。一方、Asn297に結合した糖鎖がシアリル化されると、IgGのin vivoでの細胞障害活性が減少すること（例えば、非特許文献５を参照）、動物モデルでIgGの抗炎症活性を高めること（例えば、非特許文献６を参照）等も確認されている。
　さらに、IgG1-Fcフラグメントを酵母で発現した後、in vitroでの酵素反応によって糖鎖構造の改変を行い、糖鎖誘導体をもつIgG1-Fcフラグメントを合成した例も報告されている（例えば、非特許文献７を参照）。しかしながら、当該方法では、N結合型糖鎖のコンセンサス配列（Asn-X-Thr又はAsn-X-Ser；Xはプロリン以外のアミノ酸である。）のAsnに糖鎖が結合するため、天然のIgG1-Fcフラグメントと異なる位置に糖鎖を付加する場合、IgG1-Fcペプチドを発現させる際に当該コンセンサス配列を導入しておかなければならない。
　このように、これまでに種々の糖鎖付加IgGが製造され、その機能が研究されてきたが、CHO細胞やヒト293T細胞、酵母などの細胞培養を利用して発現させているため、Asn297に結合した糖鎖構造は、グライコフォーム、即ち少しずつ異なった構造となっている。抗体を医薬品として用いる場合には、細胞障害活性に影響を与える糖鎖はできる限り均一なものが付加されていなければならない。また、どのような糖鎖構造が細胞障害活性に関与しているかを調べるためにも、糖鎖構造が均一なIgGが必要である。
　本発明者らは、これまでに、均一な糖鎖付加アミノ酸を得る方法を開発し、これを用いた固相合成法によって、糖鎖の構造が極めて均一な糖鎖を所望の位置に正確に付加した糖鎖付加ペプチドを合成する方法を見出した（例えば、特許文献１を参照）。当該方法は、長いペプチドを合成するのには適さないが、当該方法と発現系とを組み合わせることによって、即ち、ペプチドを分割して、それぞれを固相合成により合成し、又は発現系により発現させた後、ライゲーション法によって連結することによって、より長い糖鎖付加ペプチドを得ることができる。特に、糖鎖が付加されていないペプチドは、発現系により発現させることにより、均一なペプチドを大量に、かつ経済的に得ることができる。
　本発明者らは、この方法を利用して、糖鎖が付加されたIgG-Fcフラグメントの一部を合成した。当該方法では、IgG-Fcフラグメントの293位（GluをCysに置換）から320位のLysまで（配列番号：１の65位から92位）を固相合成法により合成し、297位のAsnを付加する際に糖鎖付加Asnを用いた。一方、そのC末端側の321位のCysから444位のSer（配列番号：１の93位から216位）は大腸菌発現系により発現させた。しかしながら、大腸菌発現系で発現させたCys321-Ser444ペプチドを安定して得ることができず、ペプチドをさらに連結してIgG-Fcフラグメント全長を得ることができなかった。IgG-Fcフラグメントをキメラ抗体に用いるためには、均一な糖鎖が付加されたIgG-Fcフラグメントのペプチド部分をより長く伸ばし、少なくともFcレセプターと結合可能な最低限の長さまで伸長させる必要がある。
国際公開第WO2004/005330号パンフレット
Sondermann, P. et al. Nature Vol. 406, 2000, pp267- Umana, P. et al. Nature Biotechnology Vol. 17, 1999, pp176- Mimura, Y. et al. Molecular Immunology 37(2000)697-706 Shields, R.L. et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 277, 2002, pp26733-26740 Kaneko, Y. et al. Science Vol. 313 (2006) 670- Anthony, R.M. Science Vol. 320 (2008) 373- Wei et al. Biochemistry Vol.47 (2008) 10294-10304
　そこで、本発明は、実質的に均一な糖鎖が付加されたIgG-Fcフラグメントの全長、及びこれを製造する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、大腸菌発現系で目的とするペプチドを精製タグとの融合タンパク質として発現させた後、精製タグを切断する工程で、従来用いられていたギ酸ではなく強酸を添加し、且つ、アセトニトリル等の特定の溶剤を添加することによって、目的ペプチドを非常に安定に産生できることを見出した。そして、当該目的ペプチドを用いてライゲーションを行うことにより、従来よりも長い糖鎖付加ペプチドを得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は、
〔１〕糖鎖付加IgG-Fcフラグメントであって、天然のIgG-Fcフラグメントと同一の位置に糖鎖が付加されており、糖鎖付加アミノ酸のN末端側で、該糖鎖付加アミノ酸から数えて1～30位のアミノ酸の(i)いずれか1つがCysに置換され；(ii)天然型ではSerでないアミノ酸のいずれか1つがSerに置換され；(iii)天然型ではThrでないアミノ酸のいずれか1つがThrに置換され；又は、(iv)天然型ではAlaでないアミノ酸のいずれか1つがAlaに置換され、少なくとも1つのMetがMet以外のアミノ酸に置換されている、IgG-Fcフラグメント；
〔２〕前記IgG-Fcフラグメントが、IgG1-Fcフラグメントであって、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の69位のAsnに糖鎖が付加されており、５９位～６８位のアミノ酸の(i)いずれか1つがCysに置換されている；(ii)いずれか1つがSerに置換されている；(iii)天然型ではThrでないアミノ酸のいずれか1つがThrに置換されている；又は、(iv)天然型ではAlaでないアミノ酸のいずれか1つがAlaに置換されている、上記〔１〕に記載のIgG-Fcフラグメント；
〔３〕配列番号：１に記載のアミノ酸配列の65位のGluがCysに置換されている、上記〔２〕に記載のIgG-Fcフラグメント；
〔４〕配列番号：１に記載のアミノ酸配列の130位及び200位のMetがLeuに置換されている、上記〔２〕又は〔３〕に記載のIgG-Fcフラグメント；
〔５〕前記糖鎖が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 ［式中、R1及びR2は、同一又は異なって、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 を示す。Acは、アセチル基を示す。］
で表される糖鎖である、上記〔１〕から〔４〕のいずれか１項に記載のIgG-Fcフラグメント；
〔６〕実質的に均一な糖鎖が付加されたIgG-Fcフラグメントの製造方法であって、前記IgG-Fcフラグメントの部分ペプチドであって、アミノ酸残基が3個～50個の糖鎖付加アミノ酸を含む糖鎖付加ペプチドを、実質的に均一な糖鎖付加Asnを使用して固相合成法により合成する工程と、前記IgG-Fcフラグメントにおける前記糖鎖付加ペプチドよりN末端側の部分ペプチド、及び、前記IgG-Fcフラグメントにおける前記糖鎖付加ペプチドよりC末端側の部分ペプチド、の少なくとも1つを発現系により発現させ、残りを固相合成法により合成する工程と、前記糖鎖付加ペプチドと、前記N末端側部分ペプチドと、前記C末端側部分ペプチドとをライゲーション法により連結する工程と、を含み、前記部分ペプチドを発現系により発現させる工程は、前記部分ペプチドを、Metを介して精製タグとの融合タンパク質として発現させ、該融合タンパク質を、該精製タグを利用して精製する工程と、前記部分ペプチドと前記精製タグを、強酸と水混和性溶剤の存在下でMetを分解することにより切断する工程と、を含む方法；
〔７〕前記強酸が、トリフルオロ酢酸、フッ化水素及びメタンスルホン酸からなる群より選択される、上記〔６〕に記載の方法；
〔８〕前記糖鎖付加ペプチドのN末端アミノ酸をCys又は下記式(1）に示すトレオニン誘導体に置換して合成する、上記〔６〕又は〔７〕に記載の方法；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 〔９〕前記部分ペプチドを発現系により発現させる工程において、該部分ペプチドに含まれるMetが、Met以外のアミノ酸に置換されるように発現させる、上記〔６〕から〔８〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１０〕前記IgG-Fcフラグメントが、IgG1-Fcフラグメントであって、前記N末端側部分ペプチドを、固相合成法により合成する場合、該N末端側部分ペプチドを合成する工程は、前記N末端側部分ペプチドを配列番号：１に記載のアミノ酸配列の32位のThrと33位のCysの間で分けたそれぞれのペプチドを固相合成法によって合成する工程と、合成したペプチドをライゲーション法で連結する工程と、を含む、上記〔６〕から〔９〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１１〕前記C末端側部分ペプチドを、固相合成法により合成する場合、該C末端側部分ペプチドを合成する工程は、前記C末端側部分ペプチドを、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の138位のThrと139位のCysの間、及び／又は196位のSerと197位のCysの間で分けたそれぞれのペプチドを固相合成法によって合成する工程と、合成したペプチドをライゲーション法で連結する工程と、を含む、上記〔１０〕に記載の方法；
〔１２〕前記糖鎖付加ペプチドが配列番号：１に記載のアミノ酸配列の65位～92位であり、前記N末端側部分ペプチドが1位～64位であり、前記C末端側部分ペプチドが93位～216位であって、前記糖鎖付加ペプチドは、65位のGluをCysに置換して固相合成法で合成し、前記N末端側部分ペプチドは、1位～32位と33位～64位に分けて、それぞれ固相合成法で合成し、
　前記C末端側部分ペプチドは、130位及び200位のMetがLeuに置換されるように発現系により発現させる、上記〔１０〕又は〔１１〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１３〕前記ライゲーション法による連結工程の後、IgG-Fcフラグメントをフォールディングさせる工程をさらに含む、上記〔６〕から〔１２〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１４〕前記発現系が大腸菌発現系である、上記〔６〕から〔１３〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１５〕上記〔１〕から〔５〕のいずれか１項に記載のIgG-Fcフラグメント、又は、上記〔６〕から〔１４〕のいずれか１項に記載のIgG-Fcフラグメントの製造方法により製造されたIgG-Fcフラグメントを含むキメラ抗体；
〔１６〕均一な糖鎖が付加されたIgG-Fcフラグメントを製造する方法の設計方法であって、前記IgG-Fcフラグメントを、糖鎖付加アミノ酸を含む糖鎖付加ペプチドと、1つ以上のその他のペプチドとに分けて産生するものとし、前記糖鎖付加ペプチドは、前記糖鎖付加アミノ酸のN末端側で、該糖鎖付加アミノ酸から数えて1～30位のいずれかのアミノ酸をN末端とし、該糖鎖付加アミノ酸のC末端側の最も近いCys、Ser、Thr又はAlaのN末端側に隣接するアミノ酸をC末端とし、当該糖鎖付加ペプチドを、均一な糖鎖付加アミノ酸を用いた固相合成法によって合成するものとし、前記その他のペプチドは、発現系により発現させるか、固相合成法により合成するものとし、前記糖鎖付加ペプチドと前記ペプチドをライゲーション法によって連結するものとする、方法；
〔１７〕前記糖鎖付加ペプチドを固相合成する際、N末端のアミノ酸をCys又は下記式(1)に示すThr誘導体に置換して合成するものとする、上記〔１６〕に記載の方法；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 〔１８〕前記その他のペプチドを、当該ペプチドに含まれるCys、Ser、Thr及びAlaからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸のN末端側で2以上の部分ペプチドに分け、各部分ペプチドを、発現系により発現させるか、固相合成法により合成するものとし、
　前記糖鎖付加ペプチドと前記部分ペプチドをライゲーション法によって連結するものとする、上記〔１６〕又は〔１７〕に記載の方法；及び
〔１９〕前記その他のペプチドを発現系により発現させる場合、該ペプチドを、Metを介して精製タグとの融合タンパク質として発現させ、該精製タグを該特定の物質に結合させることにより精製するものとし、前記ペプチドと前記精製タグとを、強酸と水混和性溶剤の存在下でMetを分解することにより切断し、前記ペプチドに含まれるMetをMet以外のアミノ酸に変えて発現させる、上記〔１６〕から〔１８〕のいずれか１項に記載の方法、に関する。
　本発明によれば、均一な糖鎖が付加されたIgG-Fcフラグメントの全長を得られるので、これを用いて、細胞障害活性をはじめとするIgG-Fcフラグメントの糖鎖構造依存性の活性、ひいては抗体活性について精度の高い研究を行うことができる。また、均一な糖鎖が付加されたIgG-Fcフラグメントを用いてキメラ抗体を作製すれば、医薬品としても使用可能なロット差のない品質の揃った抗体を得ることができる。
本発明にかかるヒトIgG1-Fcフラグメントの合成ルートを示す概略図である。 ヒトIgG1-Fcフラグメントのアミノ酸配列と、フラグメントA～Dを示す。 フラグメントDを発現させるのに用いたプラスミドベクターpET-16bの構造を示す模式図である。 フラグメントDの発現ベクターの製造方法を示す概略図である。 フラグメントDの濃度を求めるためにLysozymeを用いて作成したLysozyme濃度と吸光度の関係を示す検量線である。 フラグメントCとフラグメントDのライゲーションを行った反応溶液のゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示す。 フラグメントCとフラグメントDのライゲーションを行った後、SDS-PAGEで分析した結果を示す。Lane1はフラグメントC、Lane2はHisタグ＋フラグメントD(16kDa)、Lane3は反応溶液を示す。Mは分子量マーカーである。 フラグメントCとフラグメントDのライゲーション後に得られた化合物を確認するために、PNGase F処理を行った後、SDS-PAGEで分析した結果を示す。Lane1はライゲーション生成物、Lane2はPNGaseF、Lane3はフラグメントC、Lane4は反応溶液、Mは分子量マーカーを示す。 フラグメントA+BとフラグメントC+Dのライゲーション後の反応溶液をSDS-PAGEで分析した結果を示す。Lane1はフラグメントA+B、Lane2はフラグメントC+D、Lane3は反応溶液、Mは分子量マーカーを示す。
　本発明に係るIgG-Fcフラグメントは、IgG免疫グロブリンのCH2及びCH3ドメインからなるペプチドをいう。IgGは、ヒト、サル、マウス、イヌ、ウシ、ウマなどの任意の哺乳動物に由来するものを含むが、キメラ抗体に使用する場合、ヒトに由来するものが好ましい。また、IgGには、IgG1～IgG4の4つのサブクラスがある。本発明のIgG-Fcフラグメントはいずれのサブクラスであってもよいが、強い細胞障害活性を有するIgG1が好ましい。
　本発明に係るIgG1-Fcフラグメントは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有する。また、本発明に係るIgG1-Fcフラグメントは、以下に述べる本発明の効果を奏する限り、配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；配列番号：１に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換されたペプチド；IgG-Fc改変体も含み、例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有するIgG1-Fcフラグメント誘導体も含む。
　従って、以下、IgG-Fcフラグメントの配列番号：１におけるX位という場合、配列番号：１を有する天然型IgG-FcフラグメントのX位に加え、配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；配列番号：１に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換されたペプチド；IgG-Fc改変体、における、配列番号：１のX位に相当する位置のアミノ酸も含まれる。
　なお、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有するIgG1-Fcフラグメントは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有する天然型のIgG1-Fcフラグメントと比較して、65位のGluがCysに置換され、128位のGlnがAspに置換され、130位のMetがLeuに置換され、200位のMetがLeuに置換されている。
　本明細書において、「アミノ酸」とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸のみならずアミノ酸変異体及び誘導体といったような非天然アミノ酸を含む。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本明細書におけるアミノ酸として、例えば、天然タンパク原性L-アミノ酸；D-アミノ酸；アミノ酸変異体及び誘導体などの化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β-アラニン、オルニチンなどの天然非タンパク原性アミノ酸；及びアミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられることを理解するであろう。非天然アミノ酸の例として、α-メチルアミノ酸(α-メチルアラニンなど)、D-アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸(2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン及びα-メチル-ヒスチジンなど)、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸(「ホモ」アミノ酸)及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられる。好ましい態様において、本発明の化合物に含まれるアミノ酸は、天然アミノ酸のみからなる。なお、本明細書ではアミノ酸は、原則として三文字表記を用いて記載している。
　本明細書において、「アミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された」という場合、置換等されるアミノ酸の個数は、IgG-Fcフラグメント活性を保持する限り特に限定されないが、1～9個、好ましくは1～5個、より好ましくは1～3個程度であるかあるいは全体の長さの20%以内、好ましくは10%以内である。置換又は付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸又はアミノ酸アナログであり得、好ましくは天然のアミノ酸である。
　本明細書において、「アミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換された」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数及び／又は疎水性指数が類似している置換であって、そのような置換の前後で、IgG-Fcフラグメント活性の明らかな低下又は消失を生じない置換をいう。
　本明細書において、「IgG-Fc改変体」とは、IgG-Fcフラグメントを天然又は人工的に改変した化合物であり、そのような改変としては、例えば、IgG-Fcフラグメントの1又は複数のアミノ酸残基の、アルキル化、アシル化（例えばアセチル化）、アミド化、カルボキシル化、エステル形成、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、水酸化、標識成分の結合等が挙げられる。
　本発明に係るIgG-Fcフラグメントは、天然のIgG-Fcフラグメントと同一の位置に糖鎖が付加されている。天然のIgG-Fcフラグメントと同一の位置は、例えば、IgG1-Fcフラグメントの場合、配列番号：１に記載のアミノ酸配列における69位のAsnである。
　なお、本発明に係るIgG-Fcフラグメントは、天然のIgG-Fcフラグメントと同一の位置以外の位置に、さらに1本以上の糖鎖が付加されたものも含む。
　本明細書において、「糖鎖」とは、単位糖（単糖及び／又はその誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が２つ以上連なる場合、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される単糖類及び多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、シアル酸並びにそれらの複合体及び誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解又は誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。糖鎖は直鎖型であっても分岐鎖型であってもよい。
　また、本明細書において、「糖鎖」には糖鎖の誘導体も含まれ、糖鎖の誘導体としては、例えば、糖鎖を構成する糖が、カルボキシル基を有する糖（例えば、Ｃ－１位が酸化されてカルボン酸となったアルドン酸（例えば、Ｄ－グルコースが酸化されたＤ－グルコン酸）、末端のＣ原子がカルボン酸となったウロン酸（Ｄ－グルコースが酸化されたＤ－グルクロン酸））、アミノ基又はアミノ基の誘導体（例えば、アセチル化されたアミノ基）を有する糖（例えば、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミンなど）、アミノ基及びカルボキシル基を両方とも有する糖（例えば、Ｎ－アセチルノイラミン酸（シアル酸）、Ｎ－アセチルムラミン酸など）、デオキシ化された糖（例えば、２－デオキシ－Ｄ－リボース）、硫酸基を含む硫酸化糖、リン酸基を含むリン酸化糖などである糖鎖が挙げられるがこれらに限定されない。
　本発明において、好ましい糖鎖は、例えば、IgG-Fcフラグメントに付加された場合に細胞障害活性を上昇させる糖鎖である。
　本発明の糖鎖付加IgG-Fcフラグメントが生体に投与されるという観点から、本発明の糖鎖付加IgG-Fcフラグメントにおける糖鎖は、生体内で複合糖質（糖ペプチド（又は糖タンパク質）、プロテオグリカン、糖脂質等）として存在する糖鎖であり、好ましくは、生体内で糖ペプチド（又は糖タンパク質）としてペプチド（又はタンパク質）に結合している糖鎖であるＮ－結合型糖鎖、Ｏ－結合型糖鎖等である。
　本発明で使用する糖鎖は、Ｎ結合型糖鎖である。Ｎ結合型糖鎖としては、例えば、高マンノース（ハイマンノース）型、複合（コンプレックス）型、混成（ハイブリッド）型を挙げることができ、特に好ましくは、複合型が良い。
　本発明の一態様において、本発明の糖鎖付加IgG-Fcフラグメントにおける糖鎖は、4個以上、例えば5個以上、7個以上、特に9個以上の糖からなる糖鎖であることが好ましい。
　本発明の好ましい一態様において、糖鎖付加IgG-Fcフラグメントにおける糖鎖は、5～11個、9～11個又は9個の糖からなる糖鎖である。
　本発明の好ましい一態様において、本発明の糖鎖付加IgG-Fcフラグメントにおける糖鎖は、ジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖及びジマンノース糖鎖からなる群より選択される糖鎖であり、より好ましくは、アシアロ糖鎖である。
　本発明で使用する好ましい糖鎖としては、例えば、下記一般式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 ［式中、R1及びR2は、同一又は異なって、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 を示す。Acはアセチル基を示す。］
で表される糖鎖等が挙げられる。
　本発明において、好ましい糖鎖としては、例えば、ヒト体内において、タンパク質と結合した糖タンパク質として存在する糖鎖(例えば、「FEBS LETTERS Vol.50, No.3, Feb. 1975」に記載の糖鎖)と、同一の構造を有する糖鎖（構成糖の種類及びそれらの結合様式が同一の糖鎖）又はこれの非還元末端から1又は複数の糖を失った糖鎖である、下記表１～４に記載の糖鎖を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　本明細書において「糖鎖付加アミノ酸」とは、糖鎖が結合したアミノ酸をいう。糖鎖とアミノ酸はリンカーを介して結合していてもよい。糖鎖とアミノ酸との結合部位に特に制限はないが、糖鎖の還元末端にアミノ酸が結合していることが好ましい。
　糖鎖が結合するアミノ酸の種類は特に限定されないが、上述したIgG-Fcフラグメントのいずれかのアミノ酸であり、好ましくはAsn又はSer、より好ましくはAsnである。
　糖鎖とアミノ酸がリンカーを介して結合する場合、リンカーの種類は特に限定されないが、例えば、-NH-(CO)-(CH2)a-CH2-（式中、aは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは0～4の整数を示す。）、C1-10ポリメチレン、-CH2-R-（式中、Rは、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、炭素環基、置換された炭素環基、複素環基及び置換された複素環基からなる群より選択される基から水素原子が１つ脱離して生ずる基である）等を挙げることができる。
　なお、本発明に係る糖鎖付加IgG-Fcフラグメントは、どのような製造方法によって製造されたものであってもよく、例えば、糖鎖付加アミノ酸を原料として用いた固相合成法によって製造したものであってもよいし、アミノ酸の結合していない糖鎖を、ペプチド上のアミノ酸に直接又はリンカーを介して結合させることにより製造したものであってもよい。アミノ酸の結合していない糖鎖は固相合成、液相合成、発現系による発現等によって調製することができる。また、糖鎖を付加したIgG-Fcフラグメントの糖鎖に、さらに糖又は糖鎖を付加することにより糖鎖を伸長させて製造したもの、後述する固相合成法と発現系による発現を組み合わせた方法で製造したもの等、最終的な構造が一致している限り、本発明の糖鎖付加IgG-Fcフラグメントに含まれる。
　本発明の好ましい一態様において、IgG-Fcフラグメントに付加される糖鎖の構造は、実質的に均一である。本明細書において、糖鎖の構造が実質的に均一であるとは、糖鎖付加IgG-Fcフラグメント間で比較した場合に、糖鎖付加部位、糖鎖糖鎖を構成する各糖の種類、結合順序、及び糖間の結合様式が同一であることをいい、少なくとも90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは99%以上の糖鎖の構造が均一であることを言う。糖鎖が均一である糖ペプチドは、品質が一定であり、特に医薬品の製造や、アッセイなどの分野において好ましい。均一な糖鎖の割合は、例えば、HPLC、キャピラリー電気泳動、NMR、質量分析等を用いた方法によって測定することが可能である。糖鎖構造が均一な糖鎖の製造に関しては、国際公開番号WO02/04471、WO03/008431、WO2004/058984、WO2004/058824、WO2004/070046、WO2007/011055等に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照として組み込まれる。
　本発明に係る糖鎖付加IgG-Fcフラグメントは、糖鎖付加アミノ酸のN末端側において、該糖鎖付加アミノ酸から1アミノ酸～30アミノ酸の位置にあるアミノ酸の(i)いずれか1つがCysに置換され；(ii)天然型ではSerでないアミノ酸のいずれか1つがSerに置換され；(iii)天然型ではThrでないアミノ酸のいずれか1つがThrに置換され；又は、(iv)天然型ではAlaでないアミノ酸のいずれか1つがAlaに置換されている。好ましくは、糖鎖付加アミノ酸から1アミノ酸～20アミノ酸、さらに好ましくは1アミノ酸～10アミノ酸の位置である。例えば、IgG1-Fcフラグメントの場合、好ましくは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列における59位～68位のアミノ酸の(i)いずれか1つがCysに置換されているか；(ii)いずれか1つがSerに置換されているか；(iii)天然型ではThrでないアミノ酸（61位以外のアミノ酸）のいずれか1つがThrに置換されている；又は、(iv)天然型ではAlaでないアミノ酸（59位以外のアミノ酸）のいずれか1つがAlaに置換されており、最も好ましくは65位のGluがCysに置換されている。
　CysをN末端に有するペプチドは、ライゲーション法に好ましく用いられる。本発明に係る糖鎖付加IgG-Fcフラグメントは、後述するように、例えば、糖鎖付加アミノ酸を含む糖鎖付加ペプチドを固相合成し、これを他の部分のペプチドとライゲーションすることによって得ることができる。糖鎖付加ペプチドを合成する際、そのN末端は糖鎖付加アミノ酸のN末端側1アミノ酸～30アミノ酸の範囲にあることが好ましい。そうすると、糖鎖付加ペプチドのN末端をCysとすれば、ライゲーション後、糖鎖付加アミノ酸のN末端側1アミノ酸～30アミノ酸の領域にCysへの置換が生じる((i)に対応)。
　Cysは、後述するとおり、ライゲーション後にSer又はAlaに変換可能である（(ii)又は(iv)に対応）。一方、糖鎖付加ペプチドのN末端を後述するトレオニン誘導体(1)としてもライゲーション反応を好ましく行うことができ、ライゲーション後、Thrに変換可能である（(iii)に対応）。
　後述する本発明に係る糖鎖付加IgG-Fcフラグメントの製造方法によれば、このように糖鎖付加アミノ酸のN末端側1アミノ酸～30アミノ酸の領域にCys、Ser、Ala、Thrによる置換を入れることができるので、天然型と異なる位置にCys、Ser、Ala又はThrを有する変異体も合成することができ、こうして得られる糖鎖付加IgG-Fcフラグメントも本発明に包含される。
　また、本発明に係る糖鎖付加IgG-Fcフラグメントは、少なくとも1つのMetが、Met以外のアミノ酸に置換されている。本明細書において「Met以外のアミノ酸」は特に限定されないが、例えば、中性アミノ酸が好ましく、比較的Metと構造の近いLeu等が好ましく用いられる。例えば、IgG1-Fcフラグメントの場合、配列番号：１に記載のアミノ酸配列における130位及び200位のMetがLeuに置換されていることが好ましい。
　本発明の好ましい一態様において、糖鎖付加IgG-Fcフラグメントは所定の立体構造を有する。所定の立体構造とは、例えば、天然のIgG-Fcフラグメントと同様の構造を有することをいう。IgG1-Fcフラグメントの場合は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の33位Cysと93位Cysの間、及び139位のCysと197位のCysの間にジスルフィド結合が形成されている。IgG-Fcフラグメントが、所定の立体構造を有するか否かは、たとえば、ジスルフィドマッピング法、立体構造エピトープに特異的な抗体への結合性の評価、X線解析などにより確認することができる。
（IgG-Fcフラグメントの製造方法）
　次に、本発明に係る、実質的に均一な糖鎖が付加されたIgG-Fcフラグメントの製造方法について説明する。
（糖鎖付加ペプチドの固相合成）
　本発明に係る実質的に均一な糖鎖が付加されたIgG-Fcフラグメントの製造方法は、まず、IgG-Fcフラグメントの部分ペプチドであって、アミノ酸残基が3個～50個の糖鎖付加アミノ酸を含む糖鎖付加ペプチドを、実質的に均一な糖鎖付加Asnを使用して固相合成法により合成する工程を含む。
　固相合成法は、公知の方法又はそれに準ずる方法に従って行うことができる。例えば、国際公開第WO2004/005330に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。
　具体的には、先ず、（１）水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸のカルボキシル基をエステル化反応させる。この場合アミノ酸のアミノ基窒素を脂溶性保護基で保護しているので、アミノ酸同士の自己縮合は防止され、レジンの水酸基とアミノ酸のカルボキシル基が反応してエステル化が起こる。
次に（２）上記で得られたエステルの脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
（３）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とアミド化反応させ、
（４）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
（５）上記（３）及び（４）の工程を１回以上繰り返すことにより、任意の数の任意のアミノ酸が連結した、末端にレジンを結合し、他端に遊離アミノ基を有するペプチドが得られる。
（６）次に、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギン（糖鎖付加アスパラギン）のアスパラギン部分のカルボキシル基と上記遊離アミノ基をアミド化反応させ、
（７）更に上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
（８）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とアミド化反応させ、
（９）上記（７）及び（８）の工程を１回以上繰り返し、
（１０）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させることにより、任意の数の任意のアミノ酸が連結した、末端にレジンを結合し、他端に遊離アミノ基を有し、中間に糖鎖アスパラギンを有する糖ペプチドが得られる。
（１１）そして、酸で樹脂（レジン）を切断することにより、糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドを製造することができる。
　更に、上記（６）の脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基と上記遊離アミノ基をアミド化反応させる工程を、適宜追加することにより少なくとも２以上の糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドを製造することができる。またこの時、異なる糖鎖アスパラギンを用いることにより２種以上の糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドを製造することもできる。
　また、この糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の端部に導入することもできる。
　水酸基を有する樹脂（レジン）としては、通常、固相合成で使用する水酸基を有する樹脂（レジン）であればよく、例えば、Ａｍｉｎｏ－ＰＥＧＡレジン（メルク社製）Ｗａｎｇレジン（メルク社製）、ＨＭＰＡ－ＰＥＧＡレジン（メルク社製）等を用いることができる。固相合成の後にチオエステル化するという観点からは、ＨＭＰＢ－ＰＥＧＡレジンが好ましい。
　アミノ酸としては全てのアミノ酸を用いることができ、例えば、天然アミノ酸である、セリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）を挙げることができる。
　脂溶性保護基としては、例えば９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジル基、アリル基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基等の、カーボネート系又はアミド系の保護基等を挙げることができる。脂溶性保護基を導入するには、例えばＦｍｏｃ基を導入する場合には９－フルオレニルメチル－Ｎ－スクシニミジルカーボネートと炭酸水素ナトリウムを加えて反応を行うことにより導入できる。反応は０～５０℃、好ましくは室温で、約１～５時間程度行うのが良い。
　脂溶性保護基で保護したアミノ酸としては、上記のアミノ酸を上記の方法で製造することができる。また、市販のものも使用することができる。例えば、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ－ＡＩａ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏを挙げることができる。
　エステル化触媒として、例えば１－メシチレンスルホニル－３－ニトロ－１，２，４－トリアゾール（ＭＳＮＴ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）等の公知の脱水縮合剤を用いることができる。アミノ酸と脱水縮合剤との使用割合は、前者１重量部に対して、後者が、通常１～１０重量部、好ましくは２～５重量部である。
　エステル化反応は、例えば、固相カラムにレジンを入れ、このレジンを溶剤で洗浄し、その後アミノ酸の溶液を加えることにより行うのが好ましい。洗浄用溶剤としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２－プロパノール、塩化メチレン等を挙げることができる。アミノ酸を溶解する溶媒としては、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＤＭＦ、塩化メチレン等を挙げることができる。エステル化反応は０～５０℃、好ましくは室温で、約１０分～３０時間程度、好ましくは１５分～２４時間程度行うのが良い。
　この時固相上の未反応の水酸基を無水酢酸等を用いてアセチル化してキャッピングすることも好ましい。
　脂溶性保護基の脱離は、例えば塩基で処理することにより行うことができる。塩基としては、例えばピペリジン、モルホリン等を挙げることができる。その際、溶媒の存在下行うのが好ましい。溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール等を挙げることができる。
　遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とのアミド化反応は、活性化剤及び溶媒の存在下行うのが好ましい。
　活性化剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＷＳＣ／ＨＣｌ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ジエチルシアノホスホネート（ＤＥＰＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ－トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、ヒドロキシフタルイミド（ＨＯＰｈｔ）、ペンタフルオロフェノール（Ｐｆｐ－ＯＨ）、２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスホネート（ＨＡＴＵ）、Ｏ－ベンゾトリアゾール－１－イル－１，１，３，３－テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、３，４－ジヒドロ－３－ヒドロジ－４－オキサ－１，２，３－ベンゾトリアジン（Ｄｈｂｔ）等を挙げることができる。
　活性化剤の使用量は、脂溶性の保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸に対して、１～２０当量、好ましくは１～１０当量、さらに好ましくは、１～５当量とするのが好ましい。
　溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、塩化メチレン等を挙げることができる。反応は０～５０℃、好ましくは室温で、約１０～３０時間程度、好ましくは１５分～２４時間程度行うのが良い。脂溶性保護基の脱離は、上記と同様に行うことができる。
　樹脂（レジン）からペプチド鎖を切断するには酸で処理するのが好ましい。酸としては、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、弗化水素（ＨＦ）等を挙げることができる。
　上記（６）の、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基とアミド化反応させ、（７）の、上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる工程を、適宜追加することにより、少なくとも２以上の糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドを製造することができる。
　また上記（６）の、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基とアミド化反応させ、（７）の、上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる工程を、最終工程で行うことにより、少なくとも１以上の糖鎖アスパラギンをペプチド鎖に有する糖ペプチドを製造することができる。
　また上記（６）の工程に代えて、あるいは（６）の工程に加えて、（１）水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基をエステル化反応させることにより、端部に糖鎖アスパラギンを有する糖ペプチドを製造することができる。
　このようにして、IgG-Fcフラグメントのうち、糖鎖付加ペプチドを得ることができる。
　なお、上述のとおり、上記固相合成に用いられる実質的に均一な糖鎖付加Asnは、例えば、国際公開番号WO02/04471、WO03/008431、WO2004/058984、WO2004/058824、WO2004/070046、WO2007/011055等に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。
　上記糖鎖付加ペプチドは、そのN末端アミノ酸をCysとしておくことが好ましい。N末端をこのアミノ酸としておくことにより、後述するNCL法等のライゲーション法に好ましく適用することができる。なお、Cys残基は、ライゲーション後にAla又はSerに変換することができる。従って、糖鎖付加ペプチドのN末端を配列番号：１に記載のアミノ酸配列の39位又は59位とすれば、ライゲーション後にCys残基をAla又はSerに変換することにより、天然型と同じアミノ酸配列とすることができる。Cys残基をAla又はSerに変換する方法については後述する。
　また、糖鎖付加ペプチドは、そのN末端アミノ酸を下記式(1)で表わされるトレオニン誘導体（以下、「トレオニン誘導体(1)」という。）としてもよい。N末端にトレオニン誘導体(1)を有する糖鎖付加ペプチドもライゲーション法に好ましく適用することができる。なお、トレオニン誘導体(1)は、ライゲーション後にThrに変換することができる。従って、糖鎖付加ペプチドのN末端を、例えば配列番号：１に記載のアミノ酸配列の61位とすれば、ライゲーション後にトレオニン誘導体(1)をThrに変換することにより、天然型と同じアミノ酸配列とすることができる。トレオニン誘導体(1)をThrに変換する方法については後述する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　また、糖鎖付加ペプチドは、固相合成法により合成することから、５０アミノ酸以下であることが好ましく、４０アミノ酸以下であることがさらに好ましい。また、糖鎖付加ペプチドは、３アミノ酸以上であることが好ましく、６アミノ酸以上であることがさらに好ましい。
　また、固相合成法で合成する際、糖鎖付加アミノ酸を結合させた後は、あまり多くのアミノ酸を結合させることが望ましくないことから、糖鎖付加ペプチドのN末端は、糖鎖付加アミノ酸のN末端側で３０アミノ酸～１アミノ酸以内の位置であることが好ましい。より好ましくは２０アミノ酸～１アミノ酸以内、さらに好ましくは１０アミノ酸～１アミノ酸以内の位置である。
　また、上記糖鎖付加ペプチドのC末端は、当該糖鎖付加ペプチドのC末端側の最も近いCys、Ser、Thr又はAlaのN末端側に隣接するアミノ酸とすることが好ましい。これにより、糖鎖付加ペプチドのC末端側部分ペプチドは、N末端にCys、Ser、Thr又はAlaを有することになる。C末端側部分ペプチドは、そのN末端がCysであれば、そのままライゲーションに供することができ、ライゲーション後のアミノ酸配列は天然型と同一となる。C末端側部分ペプチドのN末端がSer又はAlaの場合は、C末端側部分ペプチドを製造する際、そのN末端をCysとし、ライゲーション後、CysをSer又はAlaに変換することによって、天然型と同一のアミノ酸配列を得ることができる。C末端側部分ペプチドのN末端がThrの場合は、C末端側部分ペプチドを製造する際、そのN末端をトレオニン誘導体(1)とし、ライゲーション後にトレオニン誘導体(1)をThrに変換することによって、天然型と同一のアミノ酸配列を得ることができる。
　また、本発明に係るIgG-Fcフラグメントの製造方法は、IgG-Fcフラグメントにおける上述した糖鎖付加ペプチドよりN末端側の部分ペプチド（N末端側部分ペプチド）、及び、糖鎖付加ペプチドよりC末端側の部分ペプチド（C末端側部分ペプチド）の、少なくとも一方を発現系により発現させ、残りを固相合成法により合成する工程を含む。
　発現系により発現させる方法は、その効率的な発現システムを構築することができれば固相合成法よりも安価に効率よくポリペプチドを産生させることができるので、糖鎖を含まない比較的長い部分ペプチドの産生に特に好適に用いられる。一方、固相合成は、正確なアミノ酸配列を有するポリペプチドを産生することができ、また翻訳後修飾によって、余分な糖鎖が付加されたりするのを防ぐことができる。当業者は、N末端側部分ペプチド及びC末端側部分ペプチドを、それぞれの長さや特徴に従って、発現系により発現させるべきか、固相合成法により合成すべきか、適宜判断することができる。
　なお、N末端側部分ペプチド及びC末端側部分ペプチドは、その長さによってはさらに分割し、それぞれを発現系により発現させるか、固相合成法によって合成した後、ライゲーション法に供してもよい。さらに分割する際、そのN末端がCys、Ser、Thr又はAlaとなるように設計して分割することにより、続くライゲーション法に好ましく適用することができる。Cys残基は、ライゲーション後にSer又はAlaに変換することが可能である。従って、Ser又はAlaも部分ペプチドのN末端アミノ酸として採用することができる。
　なお、Cys残基をSerに変換する方法は、例えば、国際公開第WO2009/17154号パンフレットに記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。より具体的には、例えば、　(a)Cys残基の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程；
　(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより、反応中間体を生成する工程；及び
　(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、Ser残基に変換する工程、を含む方法が挙げられる。
　また、Cys残基をAlaに変換する方法は、例えばWan et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2007, 45, 9248-9252に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。
　また、N末端がトレオニン誘導体(1)であるペプチドも、ライゲーションに好適に適用することができる。
　このトレオニン誘導体(1)は、ライゲーション後にThrに変換することが可能である。従って、Thrも部分ペプチドのN末端アミノ酸として採用することができる。Thr誘導体をThrに変換する方法は、例えば、国際公開第WO2009/17154号パンフレットに記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。より具体的には、例えば、
　(a)ペプチド中のトレオニン誘導体(1)残基の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程；
　(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより、反応中間体を生成する工程；及び
　(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、トレオニン残基を含むペプチドに変換する工程、を含む方法が挙げられる。
（発現系による発現）
　本明細書における発現系は、細菌等の微生物や動植物の細胞を宿主細胞として用いる発現系である。発現系によるポリペプチド鎖の調製方法は当業者によく知られているが、典型的には、発現させる部分ペプチドをコードする核酸分子を調製する工程、調製した核酸分子を発現系の宿主細胞に導入する工程、導入により得た形質転換体を培養して増殖させ、所望の部分ペプチドを発現させる工程、および必要に応じて産生されたポリペプチド鎖を精製する工程を含む。
　発現させるポリペプチド鎖をコードする核酸分子の調製方法は、当該技術分野で既知の任意の手法を用いることができる。例えば、目的のポリペプチド鎖を発現する細胞のmRNAなどからRT-PCRなどによりcDNAを作製し、これを鋳型に適切なプライマーでPCRなどの核酸増幅法を行う方法が挙げられる。得られた核酸分子は、種々のベクターにクローニングして保存することができる。所定の宿主に適合する具体的なベクターは当業者によく知られており、その多くは市販されている。
　なお、本発明においては、発現したポリペプチドの回収を容易にするために、特定の物質と結合性を有するポリペプチドからなる精製タグを、目的ポリペプチドとの融合タンパク質として発現させる。精製タグは、その機能を果たす限り特に限定されないが、例えば、Hisタグ、GSTタグ、Sタグ、T7タグなどを挙げることができ、さらに、本発明では、これらのタグの目的ポリペプチドと結合する末端にMetが含まれるようにする。そのため、目的タンパク質をコードする核酸分子に、Met及び精製タグをコードする核酸分子を連結して、ベクターにクローニングする。
　発現された精製タグと目的ポリペプチドとの融合タンパク質は、精製タグを上記特定の物質に結合させることで精製することができる。ここで、精製タグがMetを介して目的ポリペプチドに結合していれば、例えば、CNBrでMetを分解することにより、精製タグと目的ポリペプチドを切断することが可能である。
　この切断工程を行う場合、強酸とアセトニトリル等の水混和性溶剤を添加することが好ましく、これにより目的ポリペプチドの産生率を向上させることが可能である。なお、精製タグを切り離す際、目的ポリペプチドに含まれるMetも分解されるので、発現系により発現させるポリペプチドに含まれるMetは、あらかじめ他のアミノ酸（例えばLeu等が挙げられるがこれに限定されない。）に置換されるように、目的タンパク質をコードする核酸分子を設計することが好ましい。
　調製した核酸分子を発現系の微生物や宿主細胞に導入する方法は、当該技術分野で既知の任意の手法を用いることができ、例えば、該遺伝子をウイルスベクターに組み込み、該ベクターを間葉系細胞に感染させて導入する方法や、リン酸カルシウムトランスフェクション法、DEAE-デキストラントランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔（エレクトロポレーション）、リポソーム融合、ポリブレンによるトランスフェクションおよび細胞膜のレーザー微穿孔による遺伝子の直接的な送達を包含する、周知の多数の技法が挙げられる。当業者はまた、前記遺伝子を細胞のゲノムに組み込み、当該遺伝子の発現を可能にするように細胞内に適切に導入することのできる上記以外のいかなる技術をも本発明に用いることができる。
　発現系による調製には任意の微生物や、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等の細胞を用いることができるが、産生効率や取扱いの容易性から細菌、特に大腸菌が好ましい。本発明の製造方法の一態様においては、同一構造の糖鎖を合成的に結合させるため、ポリペプチド鎖に糖鎖が付加されない発現系、例えば、細菌発現系が好ましい。
　大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フルクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆かすおよび大豆かす加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等を用いることができる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
　大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主とする形質転換体の培養は、通常振とう培養または深部通気撹拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は15～40℃がよく、培養時間は、通常16時間～7日間である。培養中のpHは3.0～9.0に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。たとえば、lacプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、インドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
　培養している形質転換体は、自然にまたは誘導によりポリペプチドを発現し、培養物中に生成蓄積することができる。ポリペプチドの発現方法としては、直接発現以外に、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。ポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞該に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるポリペプチドの構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
　ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造されたポリペプチドは、例えばポリペプチドが、細胞内に溶解した状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)-セファロース、ダイヤイオン（登録商標）HPA等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、セファロースFF等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独であるいは組み合わせて用い、ポリペプチドの精製標品を得ることができる。
　目的のポリペプチドを含む上記無細胞抽出液は、上記精製工程の前または後、好ましくは精製工程後に、生物由来物を不活性化または除去する工程に供することができる。かかる工程は、限定することなく、熱処理、ろ過、有機溶剤処理、カラム等を用いた精製、ソラレン誘導体等を用いた光処理、オゾン処理など、当業者に既知の任意の手法を含む。熱処理は、例えば、フィブリノゲン、アルブミン製剤等の処理に用いられている、60～65℃、10～144時間の温度・時間条件で行うことができる。
　ポリペプチドが、細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてポリペプチドの不溶体を回収する。回収したポリペプチドの不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈又は透析することにより、該ポリペプチドを正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法により該ポリペプチドの精製標品を得ることができる。
　ポリペプチドが細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチドあるいはその誘導体を回収することができる。すなわち、該培養物を遠心分離等の方法により処理することによって可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、ポリペプチドの精製標品を得ることができる。
　上述の通り、本発明の方法では、目的ポリペプチドと精製タグがMetを介して融合して発現される。この融合タンパク質を、精製タグが親和性を有する物質に結合させることで精製した後、強酸と水混和性溶剤の存在下で、CNBr等で処理することによって、Metが分解され、目的ポリペプチドを精製タグから切り離す。
　本明細書において、強酸とは、ギ酸、酢酸などの弱酸を含まない酸をいう。ギ酸はポリペプチド鎖をホルミル化し、酢酸はポリペプチド鎖をアセチル化する場合があり、目的タンパク質の産生率を低下させ得る。本発明において、強酸は、このようなホルミル化を生じない限り、一般に強酸と称される酸よりも弱い酸も含む。好ましい強酸としては、例えば、トリフルオロ酢酸（TFA）、フッ化水素、メタンスルホン酸を挙げることができるがこれらに限定されない。
　強酸は、0.1％～50％の濃度で加えることが好ましく、より好ましくは1％～20％、さらに好ましくは1％～5％である。
　また本発明において水混和性溶剤は、水混和性を有する溶剤である限り特に限定されないが、例えば、アセトニトリル、トリフルオロエタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド（DMSO）、塩化メチレン等を挙げることができ、中でも、アセトニトリル、トリフルオロエタノール、ジメチルホルムアミドが好ましい。
　溶剤は、1％～70％の濃度で加えることが好ましく、より好ましくは20％～60％、さらに好ましくは、35％～50％である。
　このように、強酸と水混和性溶剤の存在下で切断することにより、目的ポリペプチドのホルミル化等を生じさせることなく、目的ポリペプチドの産生率を上昇させることが可能である。
　本発明に係る製造方法において、IgG-Fcフラグメントから、糖鎖付加ペプチド及び発現系により発現させる部分ペプチドを除いた部分は、適宜固相合成法によって正確に合成することができる。固相合成は、糖鎖付加アミノ酸を使用することを除き、上述した糖鎖ペプチドの固相合成法による合成に従って行うことができる。
（ライゲーション法による連結工程）
　次に、本発明に係るIgG-Fcフラグメントの製造方法では、糖鎖付加ペプチドと、発現系により発現させた部分ペプチドと、固相合成法により合成した部分ペプチドと、をライゲーション法により連結する。
　なお、本明細書における「ライゲーション法」としては、例えば、天然型化学的ライゲーション法(Native Chemical Ligation、NCL法)や、Kinetically Controlled Ligation法（KCL法）が挙げられる。NCL法は、例えば国際公開WO96/34878号パンフレットに記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。また、KCL法は、Kentが報告したもので、反応速度論的制御をしたNCL法である（Kent et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 3985-3988）。
　ライゲーション法を用いた連結は、ペプチド-ペプチド間、ペプチド-糖ペプチド間、糖ペプチド-糖ペプチド間の、いずれにおいても行うことができる。
　ライゲーション法に用いる、C末端にα-カルボキシチオエステル部分を有するようにしたペプチド(又は糖ペプチド)は、国際公開WO96/34878号パンフレットに記載のように、当業者に公知の手法を用いて製造することができる。
　例えば、後述の実施例に記載のように、固相合成法によって、アミノ酸側鎖とN末端のアミノ基が保護された保護ペプチド(又は糖ペプチド)を得て、このC末端側のカルボキシル基を、液相中において縮合剤にPyBOP(Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate)/DIPEAを用いてベンジルチオールと縮合させ、その後、95%TFA溶液を用いてアミノ酸の鎖を脱保護することで、C末端にα-カルボキシチオエステル部分を有するようにしたペプチド(又は糖ペプチド)を得ることができる。
　ライゲーション法は、国際公開WO96/34878号パンフレットに記載のような当業者に公知の手法を用いて、また、後述の実施例の記載を参照して実施することができる。例えば、C末端に-C(=O)-SRにより表されるα-カルボキシチオエステル部分を有するようにした第1のペプチドと、N末端に-SH基を有するアミノ酸残基を有する第2のペプチドとを国際公開WO96/34878号パンフレットを参照して用意する。なお、第1のペプチドにおいて、Rはチオール交換反応を阻害せず、カルボニル炭素への求核置換反応において脱離基となる基であれば特に限定されないが、好ましくはベンジルメルカプタン等のベンジル型、チオフェノール、4-(カルボキシメチル)-チオフェノール等のアリール型、2-メルカプトエタンスルホン酸塩、3-メルカプトプロピオン酸アミド等のアルキル型等から選択することができる。また、第2のペプチドのN末端の-SH基は、所望により保護基により保護されていてもよいが、この保護基は以下のライゲーション反応までの所望の時点で脱保護し、N末端に-SH基を有する第2のペプチドが、第1のペプチドと反応する。例えばジスルフィド基等、ライゲーションが起こる条件において自然に脱保護される保護基であれば、保護基により保護した第2のペプチドをそのまま以下のライゲーション反応に用いることもできる。ジスルフィド基は、その後のライゲーション法の反応条件下で容易に脱保護される。
　これらの2つのペプチドを、必要に応じ、4-メルカプトフェニル酢酸、ベンジルメルカプタン、チオフェノール等の触媒チオールの存在下、100mMリン酸緩衝溶液等の溶液中で混合する。好ましくは、第1のペプチド1当量に対し第2のペプチドを0.5～2当量及び触媒チオールを5当量程度の割合で反応を行う。反応はpH6.5～7.5程度、20～40℃程度の条件下、約1～30時間程度行うのが望ましい。反応の進行は、HPLC、MS等を組み合わせた公知の手法を用いて確認することができる。
　これに、トリス2-カルボキシエチルホスフィン塩酸塩(TCEP)のような還元剤を加えて副反応を抑制し、所望により精製することで、第1のペプチドと第2のペプチドとを連結することができる。
　なお、C末端にカルボキシチオエステル部分(-C=O-SR)を有するようにしたペプチドにおいて、R基の異なるペプチドが存在する場合、ライゲーション反応の順序を操作することが可能であり(Protein Science (2007), 16:2056-2064等参照)、複数回のライゲーションを行う場合にはこれを考慮することができる。例えば、Rとしてアリール基、ベンジル基及びアルキル基が存在する場合には、一般に、この順に、連結反応が進行するため、C末端に-C=O-SR(式中、Rは、アリール基である)を有するペプチドaと、C末端に-C=O-SR(式中、Rは、ベンジル基である)を有しN末端にSH基を有するペプチドbとの間でライゲーション反応を行う場合には、ペプチドaのC末端とペプチドbのN末端との間でまずライゲーションが起こり、得られたC末端に-C=O-SR(式中、Rは、ベンジル基である)を有するペプチドa+bを、更にN末端にSH基を有する別のペプチドcとのライゲーション反応に用いることができる。
（フォールディング工程）
　ライゲーション法によって、IgG-Fcフラグメントの全長を連結した後、フォールディング工程を行うことによって、IgG-Fcフラグメントが適切な高次構造をとるように処理することができる。
　フォールディング工程は、種々の公知の方法を用いることができるが、たとえば、フォールディングバッファー中での透析によって行うことができる。フォールディングバッファーは、たとえば、グアニジン等のグアニジノ基を有する化合物又はその塩を含み、pHは6.0～9.0であってもよい。透析は、複数回行ってもよく、その場合各透析処理のバッファーの組成やpHは同一であっても異なっていてもよい。
　ポリペプチドがフォールディングしたことは、ポリペプチドの立体構造を解析する任意の方法で確認することができ、例えば、ジスルフィドマッピング法、立体構造エピトープに特異的な抗体への結合性の評価、X線解析などが挙げられるがこれらに限定されない。
（IgG1-Fcフラグメントの場合）
　本発明は又、IgG1-Fcフラグメントの製造方法を提供する。ここで、IgG1-Fcフラグメントは、上述のとおり配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるIgG1-Fcフラグメントのほか、配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；配列番号：１に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換されたペプチド；IgG-Fc改変体も含む。
　IgG1-Fcフラグメントを製造する場合、糖鎖付加ペプチドのN末端は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の39位～68位とすることが好ましく、より好ましくは49位～68位であり、さらに好ましくは59位～68位であり、例えば65位とすることができる。また、C末端は、C末端側の最も近い93位Cysの手前まで、即ち92位Lysまでとすることが好ましい。この長さであれば、固相合成で問題なく合成することが可能であり、固相合成において69位の糖鎖アスパラギンを結合させた後は4つのアミノ酸を結合させるのみなので、糖鎖への影響も少ない。
　糖鎖付加ペプチドのN末端を65位とする場合、65位のGluをCysに置換して合成すれば、糖鎖付加ペプチドをライゲーション法に好適に供することができる。
　また、糖鎖付加ペプチドのN末端は、例えば、39位のSer、59位のAla、61位のThrとすることもできる。N末端が39位又は59位の場合、当該N末端をCysに置換して合成し、ライゲーション後にこれをSer又はAlaに変換することによって、天然型と同じアミノ酸配列を得ることができる。N末端が61位の場合は、当該N末端をトレオニン誘導体(1)に置換して合成し、ライゲーション後にこれをThrに変換することによって、天然型と同じアミノ酸配列を得ることができる。
　なお、糖鎖付加ペプチドのC末端は、最も近いSer、Ala又はThrの手前としてもよい。これにより、C末端側部分ペプチドのN末端をCys又は上述のトレオニン誘導体(1)とし、ライゲーション後にそれぞれSer、Ala又はThrに変換することによって、天然型と同じアミノ酸配列を得ることができる。
　糖鎖付加ペプチドを65位～92位とする場合、N末端側部分ペプチドは、1位～64位、C末端側部分ペプチドは93位～216位となる。それぞれ固相合成法による合成、又は、発現系による発現によって得ることができるが、より小さい部分ペプチドに分けてそれぞれ製造し、ライゲーション法によって連結してもよい。より小さい部分ペプチドに分ける場合、Cys、Ser、Ala又はThrのN末端側で分けることが好ましい。これにより、部分ペプチドのN末端をCys、Ser、Ala又はThrとすることができるので、N末端をライゲーション法に適したCys又はトレオニン誘導体(1)として部分ペプチドを合成し、Cysの場合はそのまま、Ser、Ala又はThrの場合は変換して、結合部位を天然型と同一のアミノ酸配列にすることができる。
　中でも、変換の必要性がないことからCysが好ましい。例えば、N末端側部分ペプチドを32位Thrと33位Cysの間でさらに分割し、それぞれを固相合成法により合成してもよい。このように分割すれば、33位～64位の部分ペプチドもN末端がCysとなるので、ライゲーション法に供しやすく、ライゲーション部位においても天然型のIgG1-Fcフラグメントと同一のアミノ酸配列とすることができる。同様に、C末端側部分ペプチドも、138位Thrと139位Cysの間、及び／又は196位Serと197位Cysの間で分割し、それぞれ固相合成法により合成してもよい。これにより、各ペプチドのN末端をCysとすることができる。
　また、C末端側部分ペプチドは、発現系により全長を発現させてもよい。この方法によれば、比較的長いC末端側部分ペプチドを大量かつ安価に効率よく産生することが可能である。この場合、C末端側部分ペプチドに含まれる130位及び200位のMetは、精製タグ切断の際に分解されないよう、Leu等に置換して発現されるように設計することが好ましい。
（キメラ抗体）
　本発明に係るキメラ抗体は、ヒトIgG-Fcフラグメントを含むキメラ抗体である。キメラ抗体においては、抗原に対して特異的に結合する限り、できるだけヒト型抗体部分が多いほうが好ましい。
　本発明のキメラ抗体は、例えば、IgG-Fc以外のポリペプチド部分をインテイン法を用いてチオエステルとして発現させることにより、本発明に係る糖鎖付加IgG-Fcフラグメント、及び本発明に係る実質的に均一な糖鎖が付加されたIgG-Fcフラグメントの製造方法により製造された糖鎖付加IgG-Fcフラグメントと、ライゲーション法により連結することにより得ることができる。特に、IgG-Fcフラグメントは、そのN末端がCysであるので、ライゲーション法に好ましく供することができる。
　本発明に係るキメラ抗体は、アミノ酸配列、糖鎖構造、糖鎖付加位置及び高次構造が均一でロット差がなく、医薬品やリサーチツールとして有用である。
（IgG-Fcフラグメントを製造する方法の設計方法）
　本発明は、均一な糖鎖が付加されたIgG-Fcフラグメントを製造する方法を設計する方法も提供する。
　当該設計方法は、IgG-Fcフラグメントを、糖鎖付加アミノ酸を含む糖鎖付加ペプチドと、1つ以上のその他のペプチドとに分けて作製するものとし、糖鎖付加ペプチドは、前記糖鎖付加アミノ酸のN末端側で、糖鎖付加アミノ酸から数えて1～30位のいずれかのアミノ酸をN末端とし、該糖鎖付加アミノ酸のC末端側の最も近いCys、Ser、Thr又はAlaのN末端側に隣接するアミノ酸をC末端とし、糖鎖付加ペプチドを、均一な糖鎖付加アミノ酸を用いた固相合成法によって合成するものとする。
　糖鎖付加ペプチドを、糖鎖付加アミノ酸を含む比較的短い糖鎖付加ペプチドとして合成することによって、固相合成法により好適に合成することが可能となる。ここで、固相合成の場合、ペプチドはC末端からN末端の方向に合成されていく。従って、糖鎖付加ペプチドのN末端を、糖鎖付加アミノ酸のN末端側で、糖鎖付加アミノ酸から数えて1～30位、好ましくは1～20位、より好ましくは1～10位の範囲とすることにより、糖鎖付加アミノ酸を結合させた後に結合させるアミノ酸数を限定することができ、合成による糖鎖への影響を抑えることができる。糖鎖付加ペプチドのN末端は、糖鎖付加アミノ酸のN末端側5アミノ酸～1アミノ酸の範囲内とすることが、さらに好ましい。
　糖鎖付加アミノ酸のN末端側1～30アミノ酸の範囲内にCysが存在する場合は、CysをN末端とすることで、合成した糖鎖付加ペプチドをそのままライゲーションに供することができ、ライゲーション後も天然型と同一のアミノ酸配列となる。IgG1-Fcのように糖鎖付加アミノ酸のN末端側1～30アミノ酸の範囲内にCysが存在しない場合には、糖鎖付加ペプチドを合成する際にN末端とするアミノ酸をCysに置換して合成すればよい。
　また、Cysは、ライゲーション後にAla又はSerに変換することができる。従って、糖鎖付加ペプチドのN末端に配列番号：１に記載のアミノ酸配列における39位や、59位を採用すれば、糖鎖付加ペプチドのN末端をCysに置換して合成し、ライゲーションした後でSer又はAlaに変換することにより、天然型と同一のアミノ酸配列を得ることができる。
　また、糖鎖付加ペプチドのN末端をトレオニン誘導体(1)に置換しておけば、ライゲーション後にThrに変換できるので、糖鎖付加ペプチドのN末端は配列番号：１に記載のアミノ酸配列における61位とすることも好ましい。
　また、糖鎖付加ペプチドのC末端は、糖鎖付加アミノ酸のC末端側の最も近いCysのN末端側に隣接するアミノ酸とすることが好ましい。こうすることにより、糖鎖付加ペプチドのC末端側部分ペプチドのN末端をCysとすることができるので、続くライゲーション工程に供しやすく、ライゲーション部位において天然型と同一のアミノ酸配列を得ることができる。
　また、糖鎖付加ペプチドのC末端は、糖鎖付加アミノ酸のC末端側の最も近いSer、Ala又はThrのN末端側に隣接するアミノ酸としてもよい。この場合、C末端側部分ペプチドのN末端をCys又はトレオニン誘導体(1)として合成し、ライゲーション後に、Sel、Ala又はThrに変換することにより、天然型と同一のアミノ酸配列を得ることができる。
　また、本発明に係る設計方法では、糖鎖付加ペプチド以外のペプチドは、発現系により発現させるか、固相合成法により合成するものとする。
　当業者は、そのペプチドの長さや特徴により、発現系により発現させるか、固相合成法により合成するか適宜決定することができる。また、ポリペプチドが長い場合は、そのポリペプチドに含まれるCys、Ser、Ala又はThrのN末端側で2以上の部分ペプチドに分割し、各部分ペプチドを、発現系により発現させるか、固相合成法により合成するか決定してもよい。これにより、各部分ペプチドをライゲーション法によって連結しやすくなり、且つ、ライゲーション後のアミノ酸配列を天然型と同一のアミノ酸配列を得ることができる。
　本発明に係る設計方法では、その他のペプチドを発現系により発現させる場合、該ペプチドを、特定の物質に親和性を有しMetを含む精製タグとの融合タンパク質として発現させ、該精製タグを該特定の物質に結合させることにより精製するものとし、該ペプチドと精製タグとを、強酸と水混和性溶剤の存在下でMetを分解することにより切断する。
　強酸と水混和性溶剤とを添加することによって、目的ペプチドのホルミル化等を生じることなく、目的ポリペプチドの産生率を向上させることが可能である。
　この際、目的ペプチドに含まれるMetをMet以外のアミノ酸に変えて発現させる。これにより精製タグを切り離すときに目的ペプチドが分解されるのを防ぐことができる。
　なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
　また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
　異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
　本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、模式図である場合、説明を明確にするために、誇張されて表現されている場合がある。
　第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、 例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
　以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
　本発明に係る糖鎖付加IgG-Fcフラグメントとして、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるヒトIgG1-Fcフラグメントを合成した。このヒトIgG1-Fcフラグメントは、ペプチド鎖において、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の65位のGluがCysに、130位及び200位のMetがLeuに置換されている。また、128位のGlnがAspに置換されている。
　合成の概要を図１に、IgG1-Fcフラグメントのアミノ酸配列を図２に示す。配列番号：２における1位Cysから32位のThrをフラグメントA、33位Cysから64位ArgをフラグメントB、65位Cysから92位LysをフラグメントC、93位Cysから216位SerをフラグメントDとした。フラグメントA及びBがN末端側部分ペプチド、フラグメントCが糖鎖付加ペプチド、フラグメントDがC末端側部分ペプチドに該当する。フラグメントA～Cは化学的に合成し、フラグメントDは大腸菌発現法により調製した。
　次いで、フラグメントAとBをKCL法によって連結してフラグメントA+Bとし、フラグメントCとDをNCL法により連結してフラグメントC+Dとした後、両者をNCL法によって連結した。
　また、糖鎖は、フラグメントCの固相合成の際、以下に示すアシアロ糖鎖結合Asnを用いることによって、配列番号：２の69位Asnに結合させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　以下に、実験の手順を詳細に説明する。
　なお、RP-HPLC分析装置はWaters社製のものを、UV検出器はWaters製のWaters486と photodiode array detector (Waters 2996) を、カラムはCadenza column (Imtakt Corp., 3 μm, 75 × 4.6 mm), Vydac C-18 (5μm, 4.6 × 250 mm, 10 × 250 mm) およびSuperdex 75TM 10/300 GL を使用した。ESI mass測定器はBruker Daltonics社製のEsquire3000 plusを用いた。
<Fmoc法による固相合成法を用いたペプチドチオエステル体の合成>
1-1.フラグメントA保護ペプチド1の合成
　ペプチドの伸張は一般的なFmoc法による固相合成法を用いた。まず、固相合成用チューブにAmino PEGA resin (2g, 100μmol) を入れ、DCM(Dichloromethane)、DMF(N,N-Dimethylformamide)で十分に洗浄した後、DMFでよく膨潤して用いた。HMPB(4-(4-Hydroxymethyl-3-metoxyphenoxy-butyric acid) 2.5等量 (60.0mg, 0.25mmol）、TBTU 2.5等量 (80.2mg, 0.25mmol) 、N-Ethylmorpholine (31.6μl, 0.25mmol）をDMF (2ml) に溶解させ、樹脂の入ったチューブに入れ、室温で2時間撹拌した。樹脂をDMF、DCMで十分に洗浄し、HMPB-PEGA resinを得た。
　この樹脂を固相合成に用いた。固相への最初のアミノ酸の導入は以下の通りである。
　Fmoc-Thr(But)-OH 5等量 (198.8mg, 0.5mmol) 、MSNT 5等量 (148mg, 0.5mmol) 、N-methylimidazole 3.75等量 (29.8μl, 0.38mmol) をDCM (2ml, 250mM) に溶解させ、樹脂の入った固相合成用チューブに入れ、室温で2時間撹拌した。撹拌後、樹脂をDCMとDMFを用いて洗浄した。Fmoc基を20分20％ piperidine/DMF溶液 (1ml) を用いて脱保護した。DMFで洗浄後、Kaiser Testにより反応を確認し、次のアミノ酸と縮合させた。その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
　Fmoc-Val-COOH 5等量 (169.7mg, 0.5mmol) 、HOBt(N-Hydroxybenzotriazole)・H2O 5等量 (67.6mg, 0.5mmol)、DIPCDI 5等量 (77μl, 0.5mmol) をDMF溶媒250mM (2ml) に混ぜて15分間活性化させた後、樹脂の入ったチューブに入れ、室温で１時間撹拌した。撹拌後、樹脂をDCM、DMFを用いて洗浄した。その後はじめのアミノ酸と同様の方法でFmoc基を脱保護した。
　このようにして、32残基目までの縮合と脱保護を行った。用いたアミノ酸は以下の通りである。
　Glu(But) (212.8mg, 0.5mmol) , Pro (168.7mg, 0.5mmol) , Thr(But) (198.8mg, 0.5mmol) , Arg(Pbf) (324.4mg, 0.5mmol) , Ser(But) (191.8mg, 0.5mmol) , Ile (176.7mg, 0.5mmol) , Met (185.8mg, 0.5mmol) , Leu (176.7mg, 0.5mmol) , Thr(But) (198.8mg, 0.5mmol) , Asp(But) (205.8mg, 0.5mmol) , Lys(Boc) (234.3mg, 0.5mmol) , Pro (168.7mg, 0.5mmol) , Lys(Boc) (234.3mg, 0.5mmol) , Pro (168.7mg, 0.5mmol) , Pro (168.7mg, 0.5mmol) , Phe (193.7mg, 0.5mmol) , Leu (176.7mg, 0.5mmol) , Phe (193.7mg, 0.5mmol) , Val (169.7mg, 0.5mmol) , Ser(But) (191.8mg, 0.5mmol) , Pro (168.7mg, 0.5mmol) , Gly (148.7mg, 0.5mmol) , Gly (148.7mg, 0.5mmol) , Leu (176.7mg, 0.5mmol) , Leu (176.7mg, 0.5mmol) , Glu(But) (212.8mg, 0.5mmol) , Pro (168.7mg, 0.5mmol) , Ala (155.7mg, 0.5mmol) , Pro (168.7mg, 0.5mmol) , Boc-L-thiazolidine-4-carboxylic acid (116.6mg, 0.5mmol)
　次に、縮合が終了したペプチド50μmol分の樹脂をDMF、DCMでよく洗浄し、この樹脂にAcOH：TFE＝1：1の溶液7mlを加えて24時間撹拌し、樹脂から保護ペプチドを切り出した。ヘキサンを入れたナスフラスコを用意し、そこに保護ペプチドが溶解している液を滴下し、樹脂をMeOHで洗った。これを室温で減圧濃縮し、酢酸とベンゼンで共沸した。HPLCで精製することで目的物である側鎖の保護されたペプチド1を得た。
1-2.フラグメントAペプチドチオエステル体3の合成
　保護ペプチド1 (50μmol) とMS4A (10mg) 、チオフェノール (153μl, 1.5mmol) をDMF溶媒中 (6.75ml) Ar気流下-20℃で1時間半攪拌した後、PyBOP (130mg, 0.25mmol) 、DIPEA (42.5μl, 0.25mmol) を加え3時間攪拌した。その後、氷上にて反応溶液にジエチルエーテルを加え化合物を沈殿させた。ろ過した後に沈殿物を回収し、DTTを含んだ95％TFA水溶液を加えて室温で2時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮し、HPLCで精製することで目的物であるペプチドチオエステル体3を得た。
HPLC分析：Cadenza CD-18 (3 μm, 4.6 × 75 mm) 展開溶媒A：0.1%TFA水溶液　B：0.1%TFA　アセトニトリル：水＝90：10　グラジエントA：B=95：5→25：75　15分　流速1.0ml/min
HPLC精製：Vydac C-18 (5μm, 10 × 250 mm) グラジエントA：B=70：30→30：70 30分　流速4.0ml/min
ESI-MS：m/z calcd for C165H257N37O43S3 : [M+2H]2+ 1772.6 , [M+3H]3+ 1182.1 , [M+4H]4+ 886.8 , found 1772.5 , 1182.0 , 886.8
　上述したフラグメントA保護ペプチド1～フラグメントAペプチドチオエステル体3の合成スキームを以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
2-1.フラグメントB保護ペプチド4の合成
　フラグメントAと同様に、樹脂はHMPB-PEGA resin (0.1mmol) を用い、アミノ酸の縮合はFmoc法を用いて行った。Fmoc-Arg(Pbf)-OH (324.4mg, 0.5mmol)、MSNT(1-(Mesitylene-2-sulfonyl)-3-nitro-1H1,2,4-triazole) 5等量 (148mg, 0.5mmol) 、N-methylimidazole 3.75等量 (29.8μl, 0.38mmol) をDCM (2ml, 250mM) に溶解させ、樹脂の入った固相合成用チューブに入れ、室温で2時間撹拌した。撹拌後、樹脂をDCMとDMFを用いて洗浄した。Fmoc基を20分20％ piperidine/DMF溶液 (1ml) を用いて脱保護した。DMFで洗浄後、Kaiser Testにより反応を確認し、次のアミノ酸と縮合させた。その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
　Fmoc-Pro-COOH 5等量 (168.7mg, 0.5mmol) 、HOBt・H2O 5等量 (67.6mg, 0.5mmol)、DIPCDI 5等量 (77μl, 0.5mmol) をDMF溶媒250mM (2ml) に混ぜて15分間活性化させた後、樹脂の入ったチューブに入れ、室温で1時間撹拌した。撹拌後、樹脂をDCM、DMFを用いて洗浄した。その後はじめのアミノ酸と同様の方法でFmoc基を脱保護した。
　このようにして、32残基目までの縮合と脱保護を行った。用いたアミノ酸は以下の通りである。
Lys(Boc) (234.3mg, 0.5mmol) , Thr(But) (198.8mg, 0.5mmol) , Lys(Boc) (234.3mg, 0.5mmol) , Ala (155.7mg, 0.5mmol) , Asn(Trt) (298.4mg, 0.5mmol) , His(Trt) (309.9mg, 0.5mmol) , Val (169.7mg, 0.5mmol) , Gln (184.2mg, 0.5mmol) , Val (169.7mg, 0.5mmol) , Gly (148.7mg, 0.5mmol) , Asp(But) (205.8mg, 0.5mmol) , Val (169.7mg, 0.5mmol) , Tyr (229.8mg, 0.5mmol) , Trp(Boc) (263.3mg, 0.5mmol) , Asn (177.2mg, 0.5mmol) , Phe (193.7mg, 0.5mmol) , Lys(Boc) (234.3mg, 0.5mmol) , Val (169.7mg, 0.5mmol) , Gln (184.2mg, 0.5mmol) , Pro (168.7mg, 0.5mmol) , Asp(But) (205.8mg, 0.5mmol) , Glu(But) (212.8mg, 0.5mmol) , His(Trt) (309.9mg, 0.5mmol) , Ser(But) (191.8mg, 0.5mmol) , Val (169.7mg, 0.5mmol) , Asp(But) (205.8mg, 0.5mmol) , Val (169.7mg, 0.5mmol) , Val (169.7mg, 0.5mmol) , Val (169.7mg, 0.5mmol) , Cys(Trt) (292.9mg, 0.5mmol)
　ここで、32残基目CysのFmoc基を脱保護した後、樹脂に対して10等量 (1mmol) のDi-tert-butyl dicarbonateをDMF溶媒5mlに混ぜ2時間撹拌し、Cysのアミノ基をBoc保護した。なお、Fmocの脱保護後Kaiser Test(+)により遊離のアミノ基を確認し、Boc化はKaiser Test(-)により反応終了とした。
　次に、縮合が終了したペプチド50μmol分の樹脂をDMF、DCMでよく洗浄し、この樹脂にAcOH：TFE＝1：1の溶液7mlを加えて24時間撹拌し、樹脂から保護ペプチドを切り出した。ヘキサンを入れたナスフラスコを用意し、そこに保護ペプチドが溶解している液を滴下し、樹脂をMeOHで洗った。これを室温で減圧濃縮し、酢酸をベンゼンで共沸した。HPLCで精製することで目的物である側鎖の保護されたペプチド4を得た。
2-2.フラグメントBペプチドチオエステル体6の合成
　保護ペプチド４ (50μmol) とMS4A (10mg) 、1-Propanethiol (136μl, 1.5mmol) をDMF溶媒中 (6.75ml) Ar気流下-20℃で1時間半攪拌した後、PyBOP (Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium)(130mg, 0.25mmol) 、DIPEA (42.5μl, 0.25mmol) を加え3時間攪拌した。その後、氷上にて反応溶液にジエチルエーテルを加え化合物を沈殿させた。ろ過した後に沈殿物を回収し、95％TFA水溶液を加えて室温で2時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮し、HPLCで精製することで目的物であるペプチドチオエステル体6を得た。
HPLC分析：Cadenza CD-18 (3 μm, 4.6 × 75 mm) 展開溶媒A：0.1%TFA水溶液　B：0.1%TFA　アセトニトリル：水＝90：10　グラジエントA：B=95：5→25：75　15分　流速1.0ml/min
HPLC精製：Vydac C-18 (5μm, 10 × 250 mm) グラジエントA：B=75：25→55：45 30分　流速4.0ml/min
ESI-MS：m/z calcd for C168H259N47O47S2: [M+2H]2+ 1877.6, [M+3H]3+ 1252.1, [M+4H]4+ 939.3, [M+5H]5+ 751.6, found 1878.3, 1252.6, 939.8, 752.0
　上述したフラグメントB保護ペプチド4～フラグメントBペプチドチオエステル体6の合成スキームを以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
3-1.アシアロ糖鎖7を有するフラグメントC保護糖ペプチド8の合成
　フラグメントAおよびフラグメントBと同様に、樹脂はHMPB-PEGA resin (0.1mmol) を用い、アミノ酸の縮合はFmoc法を用いて行った。Fmoc-Lys(Boc)-OH (234mg, 0.5mmol)、MSNT 5等量 (148mg, 0.5mmol) 、N-methylimidazole 3.75等量 (29.8μl, 0.38mmol) をDCM (2ml, 250mM) に溶解させ、樹脂の入った固相合成用チューブに入れ、室温で2時間撹拌した。撹拌後、樹脂をDCMとDMFを用いて洗浄した。Fmoc基を20分20％ piperidine/DMF溶液 (1ml) を用いて脱保護した。DMFで洗浄後、Kaiser Testにより反応を確認し、次のアミノ酸と縮合させた。その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
　Fmoc-Tyr(But)-OH 5等量 (229.8mg, 0.5mmol) 、HOBt・H2O 5等量 (67.6mg, 0.5mmol)、DIPCDI 5等量 (77μl, 0.5mmol) をDMF溶媒250mM (2ml) に混ぜて15分間活性化させた後、樹脂の入ったチューブに入れ、室温で1時間撹拌した。撹拌後、樹脂をDCM、DMFを用いて洗浄した。その後はじめのアミノ酸と同様の方法でFmoc基を脱保護した。
　このようにして、23残基目までの縮合と脱保護を行った。用いたアミノ酸は以下の通りである。
Glu(But) (212.8mg, 0.5mmol) , Lys(Boc) (234.3mg, 0.5mmol) , Gly (148.7mg, 0.5mmol) , Asp(But) (205.8mg, 0.5mmol) , Leu (176.7mg, 0.5mmol) , Trp(Boc) (263.3mg, 0.5mmol) , Asn (177.2mg, 0.5mmol) , Gln (184.2mg, 0.5mmol) , His(Trt) (309.9mg, 0.5mmol) , Leu (176.7mg, 0.5mmol) , Val (169.7mg, 0.5mmol) , Thr(But) (198.8mg, 0.5mmol) , Leu (176.7mg, 0.5mmol) , Val (169.7mg, 0.5mmol) , Ser(But) (191.8mg, 0.5mmol) , Val (169.7mg, 0.5mmol) , Val (169.7mg, 0.5mmol) , Arg(Pbf) (324.4mg, 0.5mmol) , Tyr (229.8mg, 0.5mmol) , Thr(But) (198.8mg, 0.5mmol) , Ser(But) (191.8mg, 0.5mmol) 
　次に、この23残基のペプチド3μmol分の樹脂をエッペンチューブに移し、アシアロ糖鎖Asnを縮合した。アシアロ糖鎖Asn 2等量 (12mg, 6μmol) とDEPBT(3-(diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-one)3等量 (3mg, 9μmol) をDMF：DMSO=4：1溶液 (201μl, 30mM) に溶解させ、樹脂の入ったエッペンチューブに入れた。その後、DIPEA(N,N’-Diisopropylethyamine)2等量 (1.02μl, 6μmol) を加え、室温で22時間撹拌した。樹脂を固相合成用チューブに移し、DMFで洗浄した後に、20％ piperidine/DMF溶液を用いてこれまでと同様の方法によりFmoc基を脱保護した。Fmoc-アシアロ糖鎖7の構造を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　このアシアロ糖鎖ペプチドにさらに順次アミノ酸を縮合した。Fmoc-Tyr(But)-OH 5等量 (6.9mg, 15μmol) とHOBt 5等量 (2.0mg, 15μmol) 、DIPCI(N,N’-Diisopropylcarbodiimide) 5等量 (2.3μl, 15μmol) をDMF (375μl, 40mM) に溶解させ15分間活性化させた後、樹脂の入った固相合成用チューブに入れ、室温で1時間撹拌した。撹拌後、樹脂をDCM、DMFを用いて洗浄した。その後はじめのアミノ酸と同様の方法でFmoc基を脱保護した。
　このようにして、28残基目までの縮合と脱保護を行った。用いたアミノ酸は以下の通りである。
Gln (5.5mg, 15μmol), Gln (5.5mg, 15μmol), Boc-L-thiazolidine-4-carboxylic acid (3.5mg, 0.5mmol)
　次に、縮合が終了した糖ペプチド3μmol分の樹脂をDMF、DCMでよく洗浄し、この樹脂にAcOH：TFE＝1：1の溶液3mlを加えて22時間撹拌し、樹脂から保護糖ペプチドを切り出した。ヘキサンを入れたナスフラスコを用意し、そこに保護ペプチドが溶解している液を滴下し、樹脂をMeOHで洗った。これを室温で減圧濃縮し、酢酸とベンゼンで共沸した。HPLCで精製することで目的物である側鎖の保護された糖ペプチド8を得た。
3-2.フラグメントC糖ペプチドチオエステル体10の合成
　上記のようにして合成したフラグメントC保護糖ペプチド8 (3μmol) を真空ラインにより十分に乾燥させた。これをAr気流下DMF (7.4 mM, 405μl) に溶解させ、更にMS4A (10mg) 、ベンジルメルカプタン30等量 (10.7μl ,90μmol)　を加え、-20℃で1時間半撹拌した。つづいてPyBOP　5等量 (7.8mg, 15μmol) 、DIPEA　5等量 (2.5μl, 15μmol) を加え、アルゴン気流下5時間半反応させてチオエステル化を行った。反応終了後、氷上にてジエチルエーテルを加えて化合物を沈殿させ、ろ過した後に沈殿物をDMFで回収した。減圧濃縮して得られた固形物9に対し、95％TFA水溶液を加えて2時間撹拌した。減圧濃縮後、HPLCを用いて純度を確認し、質量分析により目的である糖ペプチドチオエステル体10を確認した。
HPLC分析：Cadenza CD-18 (3 μm, 4.6 × 75 mm) 展開溶媒A：0.1%TFA水溶液　B：0.1%TFA　アセトニトリル：水＝90：10　グラジエントA：B=95：5→25：75　15分　流速1.0ml/min
HPLC精製：Vydac C-18 (5μm, 10 × 250 mm) グラジエントA：B=70：30→40：60 30分　流速4.0ml/min
ESI-MS： m/z calcd for C221H339N45O89S2: [M+3H]3+ 1706.1, [M+4H]4+ 1279.9, found 1705.8, 1279.6 
　上述したフラグメントC保護ペプチド8～フラグメントCペプチドチオエステル体10の合成スキームを以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
<大腸菌発現法を用いたペプチドフラグメントの合成>
　大腸菌発現法によるフラグメントDの調製及び精製は、基本的に、Macmillanら（Macmillan　et al., J. Am. Chem. Soc., 2004, 126, 9530-9531）の方法に従って行った。
　フラグメントDはHisタグ（精製タグ）との融合タンパク質として発現させたので、発現ベクターとしては、予めHisタグを発現する配列を有するpET-16ｂ（図４の14）を使用した。pET-16bの模式図を図３に示す。発現ベクターの設計の概略を、図４示す。
　一方、フラグメントDをコードするDNAは、既に構造が解かれ、プラスミドベクターpBluescript SK(+)（図４の11）に組み込まれているIgFc(PDB accession no.1L6X)を使用した。IgFc (1L6X) はそれぞれAsp356、Leu358であるのに対し、フラグメントDはヒト型抗体のバリアントであり、それぞれGln356、Met358（それぞれ、配列番号：１における128位と130位に相当）である。しかしながら、IL6XのAsp356及びLeu358はそのままにし、さらに、フラグメントDのCNBr処理の都合上、Met428をLeuとするmutationを加えた。結果として、フラグメントDのMet358（配列番号：１における130位に相当）とMet428（配列番号：１における200位に相当）をLeuに変換するmutationを導入したことになる。mutationの導入にはinverse PCR法を用いた。結果として得られるアミノ酸配列を、配列番号：２に示す。
　また、フラグメントDは、そのN末端側にMetを有し、さらにHisが10個列なったHisタグと呼ばれる精製タグペプチドが付加した融合タンパク質として大腸菌現法により発現させた。融合タンパク質を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
1.遺伝子へのMutationの導入
　上述のとおり、IgFcにMetをLeuに変えるための2ヶ所のmutationを導入した。
1-1.試薬
(1)QuikChange　II Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE, Cat# 200523-5)
10xReaction Buffer
DpnI 10U/μl
dNTP mix
PfuUltra DNA polymerase 2.5U/μl
XL1-Blue supercompitent cells
(2)1M MgCl2 (per 10 ml)
　15 ml FALCON チューブに塩化マグネシウム六水和物 (Wako, Cat# 135－00165) を2.03 g量り取って、10 mlのMilliQに溶解し、フィルター滅菌を行なった。
(3)1M MgSO4 (per 10 ml)　
　15 mlFALCON チューブに硫酸マグネシウム七水和物 (Wako, Cat# 131-00405)を2.46 g量り取って、10 mlのMilliQに溶解し、フィルター滅菌を行なった。　　　　
(4)20% (w/v) grucose
(5)NZY+ Broth (per 100 ml)
　NZ amine Type A (Wako, Cat# 541-00241) 1.0 g、yeast extract (DIFCO, Lot#　3346143)0.5 g、NaCl (Wako, Cat# 191-01665) 0.5 gにMilliQを加え、100 mlにメスアップした後、5N NaOH (Wako) により pHを7.5に調製。オートクレーブを行なった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
 　使用前に、フィルター滅菌を行なった1M MgCl2(12.5 μl/ml)、1M MgSO4(12.5 μl/ml)、20% (w/v) glucose (20 μl/ml)を加えた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
 (6)Agarose,HT (AMRESCO,Cat#:9012-36-8)
(7)DNAマーカー：
・1kb DNA ladder (BIONEER, Cat# D-1040)
・100bp DNA ladder (BIONEER, Cat# D1030)
・25/100bp Mixed DNA ladder (BIONEER, Cat# D1020)
(8)IPTG (Wako, Cat# 095-02531)
　－30℃Freezerに保管されていた100mM IPTG
(9)X-gal (Wako, Cat# 023-07851)
　－30℃Freezerに保管されていた12% X-gal
(10)Transformation試薬
　「8.IgG Fc（Cys321-Ser444）/pET-16bのTransformation」を参照
・LB plate
・2×YT
(11)Plasmid調製試薬
　「5.カラム法による大腸菌からのpET-16b調製、制限酵素処理」を参照
1-2.機器と消耗品
(1)Thermal Cycler (GeneAmp PCR System2700, Applied Biosystems, Part#:4322620)
(2)振とう培養機 (THOMAS, AT24S)
(3)Incubator (SANYO MIR-262)
(4)サブマリン型電気泳動槽Mupid-α (株式会社アドバンス)
(5)PCR用200μlチューブ (ABgene, Cat#:AB-0337)
(6)14mlポリプロピレンラウンドチューブ (FALCON, Cat# 352059)
(7)100 mm Petri dish (FALCON, Cat#:351001)
(8)シリンジフィルター (MILLIPORE, Cat# SLGV 025 LS)
1-3.実験の手順
<Primerの作製>
(1)Mutationを挿入したい部分を特定し、その前後にそれぞれ15bp程度のtemplateと同配列に相補的なPrimerを設計した。
(2)Forward Primer（配列番号：３）, Reverse Primer（配列番号：４）をそれぞれ100 ng/μlに調製した。
(3)Templateを5 μg /μlに調製した。
(4)QuikChange　II Site-Directed Mutagenesis Kitのdata sheetを元に以下の条件でPCRを行なった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
 (5)PCR終了後、5μlを泳動してバンドを確認した。
(6)PCR産物に1μlのDpn Iを加え、37℃、1hrで反応させた。
(7)泳動し、バンドパターンの変化を確認した。
(8)FALCON 2059tubeを氷上で冷やしておき、Dpn I処理したPCR産物を1μl分注した。
(9)氷上で溶解した50 μlのXL-1 Blueを分取し、タッピングにより混合した。
(10)氷上で30分静置した。
(11)待ち時間の間にNZY brothに1M MgCl2、1M Mg SO4、20％(w/v) glucoseを加えて42℃に温めておいた。
(12)42℃の温浴で45秒間静置した。
(13)氷上で2分静置した。
(14)(11)で温めておいたNZY Brothを500 μl加えた。
(15)37℃で1時間振とうした。
(16)待ち時間の間に、LBプレートに10 μlの100mM IPTG、100 μlの12％ X-galを塗り、インキュベータ内で乾かしておいた。
(17)1hrの振とうが終了したsampleを250μlで2枚Platingした。
(18)37℃、16hr 静置培養した。
(19)2.5 mlの2×YTにコロニーピックした。
(20)37℃、16時間 振とう培養した。
(21)Mini prepを行ない、Plasmidを抽出した (「5.カラム法による大腸菌からのpET-16b調製、制限酵素処理」を参照)。
　制限酵素によるmappingを行なった(「7.pET-16bへのcDNAの挿入」参照)。
(22)Sequenceを行った。
2.PCRによるcDNA fragmentの調製
2-1.試薬
(1)Primer mix:sense primerとanti-sense primerを各々4μMになるように混合したもの
(2)PCR反応液
Ex Taq DNA polymerase (5 U/μl ,TAKARA, cat#RR001B) 
10×Ex Taq buffer (TAKARA, cat#RR001B)
2.5 mM dNTP Mix (TAKARA, cat#RR001B)
(3)1%アガロースゲル
(4)TAE
(5)Loding buffer (TAKARA)
(6)EtBr (Nippon Gene,cat#315-90051)
2-2.機器
(1)0.2 ml Thermo-Tube (ABgene, cat#AB-0337)
(2)Thermal cycler
・Mastercycler gradient (eppendorf No.5331 01088)
・2720 Thermal Cycler(Applied Biosystems,partNo.4359659,serialNo.272S4101291)
(3)サブマリン型電気泳動槽 (Mupid-2plusADVANCE)
(4)トランスイルミネーター (ATTA,No.270022)
(5)ImageMaster VDS:Pharmacia Biotech
2-3.実験手順
(1)氷上でDNA polymerase以外のPCR反応液を調製した。
　　　template (188ng/μl) 5.3μl
　　　10×buffer 5μl
　　　Primer Mix (50μM) 2μl
　　　dNTPs 4μl
　　　water 33.4
　　　total 50μl
(2)PCR反応液をPCR用0.2 mlチューブに50μlずつ分注した。
(3)DNA polymerase (Ex Tag) 0.3μlを加えた。
(4)0.2 mlチューブをThermal Cyclerにセットし、プログラム(注)をスタートさせた。
　　　(注)プログラム：372bp
　　　　1.熱変性　　　　94℃、1：00
　　　　2.熱変性　　　　94℃、0：45
　　　　3.アニーリング　55℃、0：45
　　　　4.伸長反応　　　72℃、0：30
　　　　5.最終伸長反応　72℃、10：00
　　　　2～4を35サイクル行った。
(5)PCR反応終了後、1％アガロースゲル電気泳動によりPCR産物の増幅を確認した。
Sample：PCR産物 1μl
　　　　滅菌MQ　4μl
　　　　6×Loading dye 1μl
3.PCR産物のフィルター精製
3-1.試薬
(1)エタノール
(2)アガロースゲル
(3)Membrane wash solution
(4)滅MilliQ
3-2.機器
(1)1.5mlチューブ
(2)SV Minicolumn
(3)遠心分離機
(4)ブロックインキュベーター
(5)Nano Drop(スペクトロフォトメーター)
3-3.実験手順
(1)PCR溶液150μlに対して等量のMembrane wash solutionを加えた。
(2)カラムに全量をアプライし、1分間静置した後、13,000rpmで1分間遠心した。
(3)廃液を捨て、カラムにMembrane wash bufferを500μl加え、13,000rpmで5分間遠心した。
(4)カラムを1.5mlチューブに移し、70℃の滅MilliQを50μl加え、13,000rpmで1分間遠心した。
(5)Nano DropにてOD260を測定した。
4.PCR産物の制限酵素処理
　5’側と3’側に、設計時に付加された調整分の3merを切除するため、制限酵素NdeIとBamHIによる処理を行った。これにより、フラグメントDをコードする372bpの5’側にNdeIサイトの6mer、3’側にBamHIの6merが付加されたDNAを得ることができる。処理後、電気泳動により目的物が得られたことを確認した。
4-1.試薬
(1)Nde I (2)BamH I
(3)10×H
(4)water
4-2.機器
(1)恒温槽
(2)サブマリン型電気泳動槽 (Mupid-2plusADVANCE)
(3)トランスイルミネーター (ATTA,No.270022)
(4)ImageMaster VDS:Pharmacia Biotech
4-3.実験手順
(1)氷上で制限酵素以外を調製した。
　　DNA (1μg) 3.74μl
　　10×H　 2.5μl
　　water 16.76μl
(2)氷上で制限酵素を1μlずつ加えた。
(3)恒温槽で37℃、2時間反応させた。
(4)反応系1μlの電気泳動を行った。
5.カラム法による大腸菌からのpET-16b調製、制限酵素処理（図４の１４～１６）
　プラスミドベクターpET-16ｂをもつ大腸菌BL21(DE3)の細胞壁をドデシル硫酸ナトリウム（SDS）で破壊し、プラスミドベクターを抽出した後、NdeIとBamHIによる制限酵素処理を行った。処理後、電気泳動により目的物が得られたことを確認した。
5-1.試薬
(1)Wizard（登録商標）Plus SV Minipreps DNA Purification System; Promega, Cat# A1492X
・Wizard（登録商標） Plus SV Cell Resuspension Solution; Part# A711N, ( RNase A混合済)
・Wizard（登録商標） Plus SV Cell Lysis Solution; Part# A712N
・Alkaline Phosphatase Solution; Part# A144B
・Wizard（登録商標） Plus SV Neutralization Solution; Part# A148C
・Wizard（登録商標） Plus SV Column Wash Solution;Part# A131C (使用する都度、溶液：100%EtOH=10：17で調製する。)
・Wizard（登録商標） SV Mini columns; Part# A129B
・Collection Tubes ( 2 ml ); Part# A130B
・Nuclease-Free Water; Part# P119C
(2)Ethanol ( 99.5 ) ; C2H5OH ( 46.07 ) , Wako, Cat# 057-00456
5-2.機器
(1)High Speed Micro Centrifuge; HITACHI, himac CF.15R, No.090464
(2)1.5ml エッペンチューブ
(3)Nano Drop (スペクトロフォトメーター)
5-3.実験手順
(1)目的のplasmid DNAを保有する大腸菌の培養液1.5 mlをマイクロチューブに分取した。
(2)15,000rpm, 室温にて30秒遠心した。
(3)上清を完全に除去した。
(4)250 μl のResuspension bufferを加え、まずはピペッティング、次いでボルテックスで大腸菌を懸濁した。
(5)250 μl のAlkaline Lysis bufferを添加し、4～6回穏やかに転倒混和した。
(6)氷上にて5分間静置した。(時間厳守)
(7)Lysis buffer添加後1分で10 μl のAlkaline protease Solutionを添加し、4回穏やかに転倒混和した。
(8)Lysis buffer添加後5分で350 μl のNeutralization bufferを添加し、5回転倒混和した。
(9)13,000rpm, 室温にて10分遠心し、目的のplasmid DNAを上清に得た。
(10)10分の遠心の間に必要量のColumn Wash Solutionを調製した。( 1 ml / sample )
(11)カラムをcollection tubeに設置した。
(12)上清をカラムにapplyし1分静置した。
(13)13,000 rpm,室温にて1分遠心した。
(14)collection tubeの廃液を捨て、750 μlのColumn Wash Solutionをカラムに添加した。
(15)13,000 rpm,室温にて1分遠心した。
(16)collection tubeの廃液を捨て、250 μlの Column Wash Solutionをカラムに添加した。
(17)13,000 rpm,室温にて2分遠心した。
(18)カラムを新しい1.5 mlマイクロチューブに移した。
(19)100 μlのNuclease-Free Waterをカラムに添加した。
(20)1min室温で静置した。
(21)13,000 rpm,室温にて1分遠心し、DNAを溶出させた。
(22)ナノドロップによって、得られたDNA溶液濃度、purityの測定を行った。
Sample1:54.4ng/μl, Sample2:48.2 ng/μl , Sample3:40.6 ng/μl , Sample4:29.9 ng/μl
(23)Sample2を用いて、氷上で制限酵素以外を調製した。
　　　DNA (3μg) 62.2μl
　　　10×H　 8μl
　　　water 3.8μl
(24)氷上で制限酵素を3μlずつ加えた。
(25)恒温槽で37℃、2時間反応させた。
(26)反応系6μlの電気泳動を行った。
6.PCR産物、pET-16bのゲル精製
　DNA挿入断片（図４の13）と、発現ベクター（図４の16）を、それぞれ電気泳動後のゲルから切り取って回収することにより、精製した。切り取ったゲルを加熱し、アガロースを遠心分離で取り除いた後、電気泳動を行ったところ、発現ベクター及びDNA挿入断片のバンドが確認された。
6-1.試薬
(1)Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega,cat#A9282)
・Membrane binding Solution (Part#A9303)
・Wash buffer: Membrane wash Solution (Promega, cat#A9282) をEtOH (Wako, cat#057-00456) で6倍希釈
・Wizard SV mini columns (Promega,part#A129B)
・Collection Tubes (Promega,part#A130B)
(2)1％アガロースゲル
(3)EtBr Solution (Nippon Gene,cat#315-90051)
(4)10×Loding buffer (TAKARA)
6-2.機器
(1)サブマリン型電気泳動槽 (Mupid-2plus,ADVANCE)
(2)トランスイルミネーター (ATTO,No.270022)
(3)電子天秤 (Development Production Testing, Mettler Toledo,AG64,No.26210132-6)
(4)ヒートブロック (Dry Thermo Unit,TAITEC,DTU-1B,No.8032267)
(5)メス (FEATHER,SURGIAL,No.11,14)
(6)マイクロ遠心機 (HITACHI, himac CF 15R) 
(7)遠心エバポレーター
6-3.実験手順
(1)制限酵素処理したcDNA fragmentの溶液、pET-16bの溶液それぞれ9 μlに対して、10×Loding bufferを1μl加え、アプライし、泳動を行った。
(2)1.5 mlチューブの重さを測定した。
(3)電気泳動終了後、ゲルをサランラップに載せた。
(4)トランスイルミネーター上にゲルを載せ、UVを点けた。
(5)目的のPCR産物、pET-16bのバンドにメスで印をつけた。
(6)ゲルを実験台の上に移し、そこでゲルを切り出した。
(7)切り出した後、トランスイルミネーター上で正確に切り出せているかを確認した。
(8)ゲル断片を1.5 mlチューブに入れ、重さを測定した。
(9)ゲル断片と等量のBinding bufferを加え、65℃、15 分間温めた。この時、2～3分毎にタッピングをして混ぜた。
(10)カラムに全量をアプライし、1 分間静置した。
(11)静置後、13000 rpm、1 分間遠心した。
(12)廃液を捨て、カラムにWash buffer (Wash：EtOH=1：5) を700 μl加え、13000 rpm、1 分間遠心した。
(13)廃液を捨て、カラムにWash bufferを500 μl を加え、13000 rpm、5 分間遠心した。
(14)1.5 mlチューブにカラムを移し、そのカラムに70℃に温めた滅MiliQを50 μl加え、5 分間静置した。
(15)13000 rpm、1 分間遠心した。
(16)反応系が15μlになるまで遠心エバポレーターで濃縮した。
(17)濃縮した反応系1μlを電気泳動し、ゲル精製の確認を行った。
7.pET-16bへのcDNAの挿入（図４の18）
　DNA挿入断片を発現ベクターに挿入した。
7-1.試薬
(1)10×Loding buffer (TAKARA)
(2)1 kbp DNA Ladder (BioNEER, 130ng/ μl, cat#D-1040)
(3)100 bp DNA Ladder (Bioneer, 135ng/ μl , cat# D-1030)
(4)AGAROSE (AMRESCO, cat#9012-36-6)
(5)EtBr Solution (Nippon Gene, cat#315-90051)
(6)Phenol / Chloroform / Isoamyl alcohol (25:24:1) (Nippon Gene, cat#311-90151)
(7)Chloroform (CH3Cl(119.38),Wako,cat#038-02606 )
(8)3M Sodium Acetate pH5.2(Nippon Gene,cat# 316-90081)
(9)Ethanol (99.5) (C2H5OH(46.05),Wako,cat#057-00456 )
(10)Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega,cat#A9282) Ligation high (TOYOBO, cat# LGK-101)
(11)Competent Cell (Competent high E.coli DH5α,TOYOBO, cat# DNA-901)
(12)2×YTLBプレートBacto Trypton (BD,cat#211705)
(13)Bacto Yeast Extract (BD,cat#212750)
(14)Sodium Chloride (NaCl (58.44),Wako,cat#191-01665)
(15)Bacto Agar (BD,cat#214010)
(16)Ampicillin (Wako,cat#010-10371)
(17)rTaq DNA polymerase (5 U/μl ,TOYOBO, cat#TAP-201)
(18)10×rTaq buffer (TOYOBO, cat#TAP-201)
(19)2 mM dNTP Mix (TOYOBO, cat#TAP-201)
(20)MgCl2 (TOYOBO, cat#TAP-201)
(21)SV Mini 1000preps+SV Gel&PCR 500preps (Promega,cat#A1492X)
(22)Glycerol (Wako, cat#075-00616)
(23)High Purity Plasmid Midiprep System (MARLIGEN,cat#11451-010)
(24)Isopropyl Alcohol (Wako,cat#166-04836)
7-2.機器
(1)温浴 (Iuchi,型式TR-1,No.1807043)
(2)Program Temp Control System (ASTEC, 型式PC-700,No.PN7921205)
(3)サブマリン型電気泳動槽 (Mupid-2plusADVANCE)
(4)トランスイルミネーター (ATTO,No.270022)
(5)Image Master VDS ( Pharmacia Biotech)
(6)Thermal cycler 
(7)電子天秤 (Development Production Testing, Mettler Toledo,AG64,No.26210132-6)
(8)ヒートブロック (Dry Thermo Unit,TAITEC,DTU-1B,No.8032267)
(9)ND-1000スペクトロフォトメーター (Nano Drop Technologies,Inc)
(10)メス (FEATHER,SURGIAL,No.11,14)
(11)マイクロ遠心機 (HITACHI, himac CF 15R)
(12)Electronic balance (AND,No.5031522)
(13)温浴 (TAITEC,No.91071110)
(14)Petri Dish 100×15mm Style (FALCON,Lot# 3209832)
(15)14 ml polypropylene Round-Bottom tube (FALCON,Lot# 4017517)
(16)Thermostatic Shaking Incubator (THOMAS,No.007280)
(17)Centrifuge (SAKUMA,No.30025)
(18)Automatic High Speed Refrigerated Centrifuge;HITACHI,SCR20B,No.38677
(19)Cell strainer 40μm;FALCONS　Gel and PCR Clean-Up System
7-3.実験手順
7-3-1.制限酵素反応 (その１)
(1)氷上で、1.5 mlチューブに下記の反応系を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
 (2)37℃、1時間制限酵素反応を行った。
(3)制限酵素反応終了後、1 μlをサンプリングし、電気泳動でバンドを確認した。
7-3-2.フェノール・クロロホルム処理
(4)制限酵素反応液に150 μlのTEを加えた。
(5)フェノール・クロロホルムを200 μl加え、30 秒間激しく振った。
(6)15000 rpm、3 分間遠心し、上清を新しいチューブに分取した。
(7)フェノール・クロロホルムを200 μl加え、30 秒間激しく振った。
(8)15000 rpm、3 分間遠心し、上清を新しいチューブに分取した。
(9)クロロホルムを200 μl加え、30 秒間激しく振った。
(10)15000 rpm、3 分間遠心し、上清を新しいチューブに分取した。
(11)上清の1/ 10量の3MSodium acetateと2.5倍量のEtOHを加え、－30℃、10 分間静置した。
(12)15000 rpm、10 分間遠心した。
(13)上清を取り除き、70%EtOHを1 ml加えた。
(14)15000 rpm、10 分間遠心した。
(15)上清を除去し、デシケーターを用いて3 分間静置した。
(16)20 μlのTEを加え、溶解させた。
7-3-3.制限酵素反応（その2）
(17)氷上で下記の反応系を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
 (18)タッピングで混ぜ、37℃、1 時間反応させた。
(19)4.4 μlの10×Loding bufferを加え、アガロースゲルにアプライし、電気泳動を行った。
7-3-4.ゲルからの切り出し・精製
(20)アガロースゲルからの切り出しは、上記「PCR産物、pET-16bのゲル精製」と同様にして行った。
7-3-5.Ligation反応
(21)0.5 mlチューブにインサート：ベクターのmol比が3：1となるように2つの溶液を加えた。
(22)2つの溶液と等量のLigation Highを加えた。
8.IgG Fc (Cys321-Ser444) / pET-16bのTransformation
　DNA挿入断片が発現ベクターに正しく挿入されたかどうかを確認するため、発現ベクターを大腸菌BL21(DE3)に取り込ませて培養した。
8-1.細胞/ plasmid
(1)Competent Cell (Competent high E.coli DH5α) ; TOYOBO, code# DNA-903
・Competent Cell
・SOC medium
(2)Plasmid DNA
8-2.試薬
(1)LB-amp plate
(2)Ethanol (99.5) ; C2H5OH (46.05), Wako, Cat# 057-00456
8-3.機器
(1)14 ml polypropylene Round-Bottom tube; FALCON, Cat# 352059
(2)温浴 (42℃)
(3)コンラージ棒
(4)Thermostatic Shaking Incubator; THOMAS, No.007280
8-4.実験の手順
(1)温浴を42℃に温め始めた。
(2)ディープフリーザーに保存してあるCompetent CellとSOC mediumを氷上で溶かした。
(3)氷上で冷やした14 mlポリプロピレンラウンドチューブに0.1 pg～10 ngのplasmid DNAを分注した。
(4)10～50 μlのCompetent Cellを14 mlチューブに加えた。
(5)氷上にて20分間静置した。
(6)42℃の温浴に45秒間浸したのち、氷上に戻し2分間冷却した。
(7)90～450μlのSOC medium を加え、37℃, 140 rpmで1時間振蘯した。
(8)振蘯中にLB-amp plateを37℃インキュベーターで温め、10分ほどベンチで乾燥させた。
(9)選択培地plateに2～3つの濃度で大腸菌培養液を塗布した。
(10)Plateを逆さにして、37℃のインキュベーターで一晩培養した。
(11)翌日コロニー数をカウントし、いくつかの単一コロニーを拾い、2×YT培地1.5 mlで振蘯培養した。
9.アルカリMiniprep
　次の制限酵素マッピングに供するため、培養した大腸菌をSDS処理して発現ベクターを抽出した。
9-1.試薬
(1)RNase
(2)Solution (I，II，III)
(3)フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25：24：1)
(4)3M NaOAc
(5)100％エタノール
(6)70％エタノール
(7)滅MilliQ
9-2.機器
(1)1.5mlエッペンチューブ
(2)遠心分離機
(3)デシケーター
(4)エッペンシェイカー
9-3.実験手順
(1)o/nでインキュベートした培養液を1.5mlエッペンチューブに移した。
(2)15,000rpmで30秒、4℃で遠心した。
(3)上清（sup）を除去した。
(4)RNase4μlをSolution I(Sol I：RNase=1.7：3.4) に加えた。
(5)氷上で4)を100μl 、3)の沈殿物 (pellet) に加えた。
(6)Solution II(5×NaOH：20％SDS：MilliQ=0.136：0.17：3.094) を200μl加え、穏やかに転倒混和した。その後5分間氷上に静置した。
(7)Solution III (5M KoAc：AcOH：MilliQ=60：11.5：28.5) を150μl加え、穏やかに転倒混和した。その後5分間氷上に静置した。
(8)15,000rpmで10分、4℃で遠心した。この間にエッペンを用意し、エッペン1本あたり450μlのフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール (25：24：1) 液を採った。
(9)(8)で用意したエッペンにsupを加え、30秒間shakeした。
(10)15,000rpmで3分、4℃で遠心した。
(11)supを新しいエッペンに採り、3M NaOAcを40μlずつ加えた。
(12)100％エタノールを1mlずつ加え、穏やかに転倒混和した。その後-30℃で10分間静置した。
(13)15,000rpmで10分、4℃で遠心した。
(14)70％エタノールを700μlずつ加え、ボルテックスした。
(15)15,000rpmで10分、4℃で遠心した。
(16)supを除去し、3分間デシケーターで乾燥させた。
(17)滅MilliQを100μl加え、3分間エッペンシェイカーにかけた。
10.IgG Fc (Cys321-Ser444) / pET-16bの酵素処理
　大腸菌から抽出した発現ベクターに対して2種類の制限酵素を用いて制限酵素マッピングを行った。制限酵素処理後に電気泳動を行い、DNA挿入断片が発現ベクターに正しく挿入されていることが確認された。
10-1.試薬
(1)Nde I
(2)BamH I
(3)EcoR V
(4)10×H
(5)water
10-2.機器
上記「PCR産物の制限酵素処理」と同様
10-3.実験手順
(1)氷上で制限酵素以外を調製した。
　　　DNA 　2μl
　　　10×H　 1μl
　　　water 　6.5μl (EcoR Vの場合は6.75μl)
(2)氷上で制限酵素を0.25μlずつ加えた。
(3)恒温槽で37℃、45分間反応させた。
(4)反応系1μlの電気泳動を行った。
11.BL21(DE3)に対するIgG Fc (Cys321-Ser444) / pET-16bのTransformation
　発現ベクターを大腸菌BL21(DE3)に取り込ませ、HisタグとフラグメントDの融合タンパク質を発現させた。
11-1.コンピテントセルの作成
実験手順
(1)フラクションにLB培地を3mlずつ採った。
(2)o/nで培養していた大腸菌のフラクションをVORTEXした。
(3)培地の入ったフラクションに、培養していた大腸菌を30μlずつ植え継ぎ、37℃　160min-1　でインキュベートした。(o/n)
(4)フラクションにLB培地を5mlずつ採った。
(5)o/nで培養していた大腸菌のフラクションをVORTEXした。
(6)培地の入ったフラクションに、培養していた大腸菌を50μlずつ植え継ぎ、OD550が0.4になるまで37℃　160min-1　でインキュベートした。
この間に15mlの遠心チューブを冷やした。
(7)1時間20分後OD測定　OD550＝0.349
(8)氷上で冷しておいた15mlの遠心チューブに培養液を移した。
(9)2,000rpm (0℃) 、20分間遠心した。
(10)上清を捨て、coldの0.1M MgCl2を3ml加えてwashした。
(11)2,000rpm (0℃) 、20分間遠心した。
(12)上清を捨て、coldの0.1M CaCl2を3ml加えてwashした。
(13)20分間氷上保存した。
(14)2,000rpm (0℃) 、20分間遠心した。
(15)上清を捨て、coldの0.1M CaCl2を0.5ml加えてVORTEXした。
　　2057チューブを冷やしておいた。
11-2.Transformation
(1)2057チューブにコンピテントセルを移した。
(2)プラスミドDNA 溶液1μlをコンピテントセルが入ったチューブに静かに移し、氷上で1時間保存した。
(1)42℃で3分間恒温槽に浸けた。
(2)サンプルを速やかに氷上に移し、1分間放置した。
(3)サンプルに5mlのLB培地を加え、37℃で45分間shakeした。
(4)3,000rpm (r,t) 、10分間遠心した。
(5)上清を除去し、pelletにLB培地を1ml加えてVORTEXした。
(6)各々のサンプルを100μl (＊1)と900μlに分けた。
(7)900μlのサンプルを7,000rpm (r,t) で4分間遠心した。
(8)デカントで上清を除去し、pelletにLB培地を100μl加えてVORTEXした。(＊2)
(9)(＊1) と (＊2) を各々100μl platingした。
(10)37℃で一晩培養した。
12.タンパク誘導・精製
　大腸菌BL21(DE3)の培地にIsopropyl-β-D-thiogalactopyranoside（IPTG）を添加して発現を誘導した。培養後、大腸菌を集菌し、超音波で細胞壁を破砕した後、Ni-NTA樹脂カラムに大腸菌破砕液を流してHisタグ-フラグメントD融合タンパク質を吸着させた。次に、イミダゾールを含む洗浄用緩衝液を流して融合タンパク質を溶出した。溶出した融合タンパク質は、HPLC分析と質量分析により、目的とする物質であることを確認した。
　続いて、溶出物を凍結乾燥したところ、白色の固形物が得られた。この固形物に対してCNBr処理を行い、フラグメントDからHisタグを除去した。CNBr処理は、40％アセトニトリル及び2％TFA存在下で行った。
12-1.実験手順 (500ml培養)
(1)　LB-amp培地を5mlずつフラクションに採った。
(2)　菌の生えたプレートから1コロニーをpick upした。
(3) pick upした菌をLB-ampに良く懸濁した。
(4) 37℃　160min-1　でインキュベートした。(o/n)
(5)　2×YT-amp 500mlに4)のculture液を加え、OD600が0.6に達するまで37℃　160min-1　でインキュベートした。
(6)　4時間後 OD600＝0.963
(7)　培地を室温に戻し、5mlの100mM IPTGを加え (最終濃度1mM) 、16℃でインキュベートした。
(8)　24時間後、誘導を止めて培養液を50ml遠沈管に移し、3,500rpm (r,t) で10分間遠心した。
(9)　上清を除去し、PBS(-)を加えて懸濁させ、50ml遠沈管に分けた。
(10) 3,500rpm (r,t) で10分間遠心した。
(11) supを除去し、-20℃で保存した。
(12) 37℃の恒温槽でサンプルを解凍した後、50mlのLysis Buffer (100mM NaH2PO4, 10mM Tris・HCl, 8M urea, 5mM Imidazole, pH8.0) を加え、超音波をかけた。
(13) 超音波による破砕後、サンプルをシェイカーにかけた。この間に、Ni-NTA resin 1.5mlをLysis Bufferで平衡化した。
(14) Ni-NTA resinカラムにサンプルをloadし、10回吸着させた。
(15) Wash Buffer (100mM NaH2PO4, 10mM Tris・HCl, 8M urea, 50mM Imidazole, pH8.0) で樹脂を十分洗った。CBBGテスト (5μlのwash液に対して800μlのCBBを加え、OD595を測定) により、洗浄の程度を測定した。
(16) Elution Buffer (100mM NaH2PO4, 10mM Tris・HCl, 8M urea, 400mM Imidazole, pH8.0) で溶出させた。この際、上記同様CBBGテストを行い、回収するフラクションを決めた。
12-2-1.確認電気泳動
(17) フラクション中の溶出液10μlに、アセトン：MeOH=1：1液を300μl加えた。(stand on ice for 0.5h )
(18) 13,000rpm (4℃)で10分間遠心した。
(19) 上清を除去し、デシケーターで乾燥させた。
(20) 1×Sample Bufferを25μlずつ加え、95℃で5分間ボイルした。
(21) SDS-PAGEを行った。
12-2-2.HPLCおよび質量分析による確認
(22) 溶出液100μl に対して10mM DTTを100μl加え、37℃の恒温槽に30分間浸けた。
Cadenza CD-18 (3 μm, 4.6 × 75 mm), 展開溶媒A：0.1％TFA水溶液　B：0.1％TFA　CH3CN：H2O＝90：10 , グラジエントA：B=95：5→25：75 15分 , 流速1.0ml/min
ESI-MS：m/z calcd for C724H1110N212O216S5: [M+23H]23+  714.2, [M+22H]22+  746.6, [M+21H]21+  782.1, [M+20H]20+  821.2, [M+19H]19+  864.4, [M+18H]18+  912.3, [M+17H]17+  965.9, [M+16H]16+  1026.3, [M+15H]15+  1094.6, [M+14H]14+  1172.7, [M+13H]13+  1262.9, found 714.4, 746.8, 782.3, 821.4, 864.5, 912.6, 966.2, 1026.4, 1094.7, 1172.8, 1263.0
12-2-3.CNBr処理前の透析
(23) 溶出液を透析チューブ (Spectra/Por（登録商標） Membrane MW:3,500, Flat Width.:54mm, Diameter.:34mm, Vol/Length.:9.3ml/cm, Length.:15m/50 ft) に移し、5Lの蒸留水を外液とし, 4℃の下で撹拌した。(o/n)
(24) 透析チューブ内のサンプルを回収し、凍結乾燥した。
　　収率:40mg/L culture
12-2-4.CNBr処理
(25) 24)で得た白色の固形物10mgを40％CH3CN水溶液, 2％TFA水溶液5mlに溶かし、Ar気流/遮光下で0.1mgのCNBrを加え静置した。
(26) 減圧濃縮し、Buffer (100mM NaCl, 50mM Tris・HCl, 6M urea, 1mM DTT, pH8.0) を100μ加え、37℃の恒温槽に１時間浸けた。
(27) HPLCで脱塩した後、ゲルろ過クロマトグラフィーで目的であるフラグメントDを精製した。
Gel filtration on Superdex 75TM 10/300 GL. The column (10×300mm) was equilibrated and operated as follows: 10% (v/v) formic acid, flow rate of 0.4 mL min-1.
ESI-MS：m/z calcd for C619H966N166O191S3: [M+18H]18+  772.4, [M+17H]17+  817.8, [M+16H]16+  868.9, [M+15H]15+  926.7, [M+14H]14+  992.8, [M+13H]13+  1069.1, [M+12H]12+  1158.1, [M+11H]11+  1263.3, [M+10H]10+  1389.6, [M+9H]9+  1543.9, [M+8H]8+  1736.7, [M+7H]7+  1984.7, found 772.7, 821.3, 869.0, 927.0, 993.1, 1069.4, 1158.4, 1263.7, 1389.8, 1544.2, 1737.2, 1985.0
13.アガロースゲル電気泳動
　反応系を減圧濃縮、脱塩処理し、ゲルろ過クロマトグラフィーにより精製し、目的とするフラグメントDを得た。ODSカラムによる分析、質量分析及びSDS-PAGEにより、フラグメントDであることを確認した。
13-1.試薬
(1)　50×TAE (Tris-Acetate-EDTA)
　トリス塩基 (Wako) 、酢酸 (Wako Cat#:017-00256) 、0.5M EDTA (pH=8.0) を下記に従ってはかり取り、MilliQで1 Lにメスアップした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
 (2)　1×TAE
　50×TAE (2M トリス塩基, 1M CH3COOH, 50 mM EDTA) をMilliQで50倍希釈した。
(3)0.5 g/ml EtBr (Ethidium bromide)
　　　10 g/ml EtBr (Wako, Code#315-90051;-4℃で保存)を1×TAEで20倍希釈した。
(4)Agarose,HT (AMRESCO,　Cas#　9012-36-8)
(5)1kb DNA ladder (BIONEER, Cat#　d-1040)
(6)100bp DNA ladder (BIONEER, Cat#　D1030)
13-2.機器と消耗品
(1) サブマリン型電気泳動槽Mupid-α (株式会社アドバンス)
(2) ゲルメーカースタンド (株式会社アドバンス)
(3) ゲルトレイ (株式会社アドバンス)
(4) コーム (株式会社アドバンス)
(5) ゲル撮影装置 (Pharmacia)
13-3.実験手順
13-3-1.アガロースゲルの作製 (ゲルメーカースタンド1枚分の作製法を記す。)
(1)三角フラスコに1.2 gのアガロースをはかり取り、MilliQ 117.6 mlを加えた。
(2)三角フラスコの口にサランラップをまき、電子レンジで温め、アガロースを溶解した。
(3)室温に放置し、60℃程度まで下がるのを待った。
(4)ゲルを冷ましている間に、ゲルメーカースタンド、ゲルトレイの用意を済ませておいた。
(5)ゲルが60℃程度になったところで、50×TAE 2.4 ml、10 mg / ml EtBr 6 μlを添加し、混合した。
(6)あらかじめ用意しておいたゲルメーカースタンドにゲルを注ぎ込んだ。
(7)ゲルが固まらないうちに、ゲル表面の泡をブルーチップなどを用いて除去した。
(8)泡を取り終わったところで、コームを差し込んだ。
(9)約30分程度室温に放置し、ゲルを固まらせた。
13-3-2.泳動バッファーの調製　(350ml分の作成法を記す。)
(1)500 mlメスシリンダーに7 mlの50×TAEをはかり取った。
(2)MilliQで350 mlにメスアップした。
(3)メスシリンダーの口をパラフィルムで覆い、インバートにより混合した。
(4)泳動槽に注ぎ込んだ。
(5)10 mg/ml EtBrを17.5 μl添加した。
(6)ブルーチップやピンセットを用いて泳動バッファーを均一に撹拌した。
13-3-3.泳動方法
(1)泳動バッファーをピンセットやブルーチップで混合し、液を均一に撹拌した。
(2)泳動するSampleとLoading dyeをピペッティングによりよく混合した。
(3)Sampleをウェルにアプライした。
(4)目的にあったDNA ladder (マーカー) をアプライした。
(5)電源を入れ、Voltageを選択し、泳動を開始した。
(6)泳動が終わったら電源を切り、ピンセットでゲルトレイをつまんで、サランラップの上にのせた。
(7)サランラップ上でゲルをゲルトレイからはずした。
(8)ゲル撮影装置で写真を撮影した。
14.その他試薬類
(1)LB；Bacto-tryptone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, Agar 15g/ 1L H2O
(2)LBが入ったシャーレ；Bacto tryptone 10g、Yeast Extract 5g、NaCl 5g、Glucose 5g、/ 1L H2Oを混ぜ、1.5％Agar 15g/Lを加え、20分オートクレーブにかけ、50-60℃に冷えたところで100mgのアンピシリンを加え、30mlずつシャーレにプレーティングしたもの。
(3)LB-amp；LB：10％アンピシリン＝1000:1
(4)アルカリSDS溶液；0.2N NaOH、1％SDS
(5)4％ポリアクリルアミドゲル；30％アクリル溶液1.995 ml、10×TBE(注1) 1.5ml、10％APS(注2) 75μl、TEMED 10μl / H2O 15ml 
注1　10×TBE；Trisma base 108g、Broic acid 55g、0.25M EDTA 80ml / 1L H2O
注2　10％APS；ammmonium persulfater 0.1g / H2O 1ml
(6)　2×YT；Bacto-trypton 16g、Bacto Yeast Extract 10g、NaCl 5g、アンピシリン100mg、aH2O 1L
(7)2×YT-amp；2×YT：10％アンピシリン＝1000:1
(8)1×SB；0.5M Tris-HCl (pH6.8) 1ml、10％SDS 2ml、βメルカプトエタノール 0.6ml、グリセロール 1ml、H2O 5.4ml、1％BTB　液が紺色になるまで数滴加える。
(9)12.5％アクリルアミドゲル；
※Upper gell；aH2O 5ml、Lower gell Buffer 3.75ml、30％アクリルアミド　6.25ml、10％APS 75μl、TEMED 10μl
※Lower gell；aH2O 3ml、Upper gell Buffer 1.25ml、30％アクリルアミド0.75ml、10％APS 17.5μl、TEMED 5μl
(10)1×SDS-PAGE buffer；Tris(hydroxymethyl)aminometane 1.51g、Glycine 7.2g、Sodium ULauryl Sulfate (SDS) 500mg / aH2O 500ml
(11)脱色液；MeOH 25％、AcOH 10％、H2O 65％
<フラグメントAとフラグメントBのKinetically Controlled Ligation>
　KCL法は、フラグメントAのC末端のチオエステルをフラグメントBのチオエステルよりも脱離能が高いチオエステルとして用意し、2つのフラグメントの反応速度の違いを利用してNCL法によって連結する方法である。この方法によって、フラグメントBのC末端にはチオエステルを残したままペプチド鎖を連結することが可能となる。
　フラグメントAペプチドチオエステル体(2mg, 0.56μmol) をエッペンチューブに移し、pH6.8に調節した6M GnHCl, 0.2M リン酸緩衝溶液, 40mM TCEPを加えて溶かした。あらかじめ緩衝溶液 (300μl) に溶かしてあったフラグメントBペプチドチオエステル体(2mg, 0.53μmol)をフラグメントAペプチドチオエステル体の入ったエッペンチューブに加え、2時間反応させた。HPLCにより精製することでフラグメントA+Bを得た。なお反応の追跡はHPLCを用いて行った。
HPLC：Cadenza CD-18 ( 3 μm, 4.6 × 75 mm) 展開溶媒A：0.1%TFA水溶液　B：0.1%TFA　アセトニトリル：水＝90：10　グラジエントA：B=95：5→25：75　15分　流速1.0ml/min
HPLC精製：Vydac C-18 (5μm, 4.6 × 250 mm) グラジエントA：B=70：30→40：60 20分　流速1.0ml/min
ESI-MS：m/z calcd for C327H510N84O90S4: [M+4H]4+ 1797.6, [M+5H]5+ 1438.3, [M+6H]6+ 1198.7, [M+7H]7+ 1027.6, [M+8H]8+ 899.2, [M+9H]9+ 799.5, found 1797.6, 1438.3, 1198.7, 1027.7, 899.5, 799.6
<糖ペプチドフラグメントCとフラグメントDのNative Chemical Ligation>
　はじめに、Ligationバッファー内でのフラグメントDの濃度の目安を調べるため、モデルタンパクとしてLysozyme (MW:14,000) を用いた検量線の作成を行った。Lyzozymeの濃度が10μl, 5μl, 2.5μlのときの吸光度を280nmで測定し、それぞれの濃度を3回ずつ測定し、測定値を平均したものをその濃度における吸光度とした。その結果を下表及び図５にその結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
　なお、Lysozymeを溶かした溶液は、フラグメントCとフラグメントDのNCLに用いるLigationバッファー (pH7.5に調節した8M GnHCl, 0.2M リン酸緩衝溶液, 40mM TCEP, 25mM MPAA) からMPAAを除いたバッファーである。
　次に、「13.アガロースゲル電気泳動」の項目で行ったゲルろ過で用いた溶媒は10％formic acid水溶液であったため、当該溶媒をUltracel Amicon（登録商標）YM-10で濃縮すると同時に、10％formic acid水溶液をろ過した。つづいて、pH7.5に調節した8M GnHCl, 0.2M リン酸緩衝溶液, 40mM TCEP へとバッファー交換した。全体量が500μlほどになったところで280nmでの吸光度を測定した。その結果、測定値は0.14であった。この結果と図５の検量線から、濃縮したこの溶液中のフラグメントDの濃度は、約1mMと求められた。
　フラグメントDの濃度を上げるため遠心による濃縮操作を続け、溶液量が125μlほどになったところで回収した。フラグメントDが溶けたこの溶液15μlを、Ligationバッファー (pH7.5に調節した8M GnHCl, 0.2M リン酸緩衝溶液, 40mM TCEP, 25mM MPAA) に溶かしたフラグメントCが入ったシリコナイズドチューブに加え、室温で反応させた。反応溶液中のフラグメントCとフラグメントDの最終濃度は、フラグメントCが2mM、フラグメントDが1mMである。15時間後、反応溶液に最終濃度が50mMとなるようにDTTを加え、37℃で30分間還元した。その後ゲルろ過クロマトグラフィーを行った。ゲルろ過クロマトグラフィーは、Superdex 75TM 10/300 GLを用い、10％(v/v)のギ酸を流速0.4ｍL/minで送液してカラムを平衡化し操作を行った。結果を図６に示す。図６の各ピークを分取し、質量分析を行った。
　その結果、(b)は原料のフラグメントDのピークであり、(c)は原料のフラグメントCのピークであることが確認された。なお、(c)のピークは、フラグメントCの分子分子内のLysの側鎖がチオエステルに攻撃をし、チオエステルが取れて環化した以下の化合物P又はQと考えられる質量数であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　ピーク(a)には、原料であるフラグメントDとは異なる質量数の生成物をわずかな強度で確認したが、質量分析では、目的物であるフラグメントC+Dであるとは確認できなかった。
　この反応の経過をSDS-PAGEで分析した結果を図７に示す。Lane1はフラグメントC、Lane2はHisタグ＋フラグメントD(16kDa)、Lane3は反応溶液を示す。Mは分子量マーカーである。Lane3の最も高分子のバンド（生成物(d)）が目的物であるものと考えられた。質量分析でピークが確認できなかったのは、ペプチド鎖が多様な3次元構造を形成した混合物となり、それら各化合物の溶液中の濃度が低いため、ESIマスにおけるイオン強度が低くなったことが原因と考えられる。
　ここで、フラグメントCとフラグメントDがNCL法で正確に連結されたとすると、生成物の質量数は約19kDaとなるところ、電気泳動によるピークは25kDa付近であった。これはペプチド鎖に糖鎖が付加されていることによる現象と考えられるが、より確実に目的物の生成を確認するため、PNGase Fによる酵素処理を行った。目的物にN型糖鎖が結合している場合、PNGase Fで処理すると、糖鎖が結合しているAsnの位置で糖鎖とペプチドの結合が特異的に切断される。従って、これを電気泳動で確認すると、糖鎖の分子量だけ小さくなったペプチドのバンドが確認できると予想される。
　具体的には、ゲルろ過クロマトグラフィーのピーク(a)を含むフラクションを遠心濃縮すると同時に、溶液をpH7.5に調節した0.5M リン酸緩衝溶液に置換した。この間に、10×Glycoprotein Denaturing Buffer (SDS 2.5mg, DTT 30.8mg / 500μl) と10×G7 Reaction Buffer (pH7.5に調節した0.5M リン酸緩衝溶液) を調製した。次に、濃縮したピーク(a)を含む溶液27μlに対して3μlの10×Glycoprotein Denaturing Bufferを加え、110℃で加熱した。25分間加熱した後、3.3μlの10×G7 Reaction Bufferと3.3μlの10％NP-40及び5μlのPNGase Fを加え、37℃で2時間加熱した。これと同様にしてPNGaseを加えない反応をcontrol実験として行った。SDS-PAGEで確認した。
　結果を図８に示す。Lane1はライゲーション生成物、Lane2はPNGaseF、Lane3はフラグメントC、Lane4は反応溶液、Mは分子量マーカーを示す。Lane4に、生成物(d)よりも分子量の小さな位置に新たな生成物(e)が確認された。糖鎖加水分解が特異的におこる酵素を用いた処理によってバンドの位置が変化したことから、生成物(d)にはN型糖鎖が結合していたことが示唆された。
　以上の結果より、フラグメントC及びDは、NCL法により連結でき、生成物(d)は目的物であるフラグメントC+Dであるものと判断された。
<IgG1-Fcフラグメントの全合成を目指した、フラグメントA＋BとフラグメントC＋DのNative Chemical Ligation>
　図６の(a)で示したピークを分取し、生成物(d)のN末端のチアゾリンをシステインへと変換した。生成物(d)をゲルろ過カラムを用いて精製したときの溶出溶液は10％formic acid溶液であるため、まず、Ultracel Amicon（登録商標）YM-10を用いてフラクション内の10％formic acid溶液をpH7.5に調節した6M GnHCl, 0.2M リン酸緩衝溶液 へと遠心ろ過で交換した。つづいてこの系中に0.2Mメトキシアミン塩酸塩をpH4.0になるまで加えた。室温で5時間半撹拌したところで、6M GnHCl, 0.2M リン酸緩衝溶液, 0.5M NaOH を反応溶液がpH7.0を示すまで注意深く加え、反応溶液を先ほどと同様にしてUltracel Amicon（登録商標）YM-10でを用いて遠心ろ過しながら濃縮した。反応溶液量がおよそ20μlほどになったところで、pH7.0に調節した6M GnHCl, 0.2M リン酸緩衝溶液, 80mM TCEP, 0.1M MPAA 20μlを用意し、これにフラグメントA＋Bを溶解させ、メトキシアミンで処理したフラグメントC＋D溶液に加えた。原料となる2つのペプチドが溶液に溶けたことでNCLを開始した。そして、反応開始から15時間後、SDS-PAGEによってこのLigation反応の経過を調べた。
　結果を図９に示す。Lane 1（フラグメントA+B）及びLane 2（フラグメントC+D）で見られるバンド以外に、生成物(f)が確認され、目的物であるIgG1-Fcフラグメントであるものと認められた。フラグメントA+BとフラグメントC+DがNCL法により連結されると、分子量は約25kDaである。生成物fのバンドは35kDa付近に見られたが、糖鎖付加のために起こる現象と考えられる。
配列番号１は、ヒトIgG1-Fcフラグメントのアミノ酸配列を示す。
　配列番号２は、本発明に係る製造方法で製造されるヒトIgG1-Fcフラグメントのアミノ酸配列を示す。
　配列番号３は、IgFcクローニングのためのセンスプライマーの塩基配列を示す。
　配列番号４は、IgFcクローニングのためのアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。

Claims (19)

  1. 　糖鎖付加IgG-Fcフラグメントであって、
    　天然のIgG-Fcフラグメントと同一の位置に糖鎖が付加されており、糖鎖付加アミノ酸のN末端側で、該糖鎖付加アミノ酸から数えて1～30位のアミノ酸の(i)いずれか1つがCysに置換され；(ii)天然型ではSerでないアミノ酸のいずれか1つがSerに置換され；(iii)天然型ではThrでないアミノ酸のいずれか1つがThrに置換され；又は、(iv)天然型ではAlaでないアミノ酸のいずれか1つがAlaに置換され、
    　少なくとも1つのMetがMet以外のアミノ酸に置換されている、IgG-Fcフラグメント。
  2. 　前記IgG-Fcフラグメントが、IgG1-Fcフラグメントであって、
    　配列番号：１に記載のアミノ酸配列の69位のAsnに糖鎖が付加されており、５９位～６８位のアミノ酸の(i)いずれか1つがCysに置換されている；(ii)いずれか1つがSerに置換されている；(iii)天然型ではThrでないアミノ酸のいずれか1つがThrに置換されている；又は、(iv)天然型ではAlaでないアミノ酸のいずれか1つがAlaに置換されている、請求項１に記載のIgG-Fcフラグメント。
  3. 　配列番号：１に記載のアミノ酸配列の65位のGluがCysに置換されている、請求項２に記載のIgG-Fcフラグメント。
  4. 　配列番号：１に記載のアミノ酸配列の130位及び200位のMetがLeuに置換されている、請求項２又は３に記載のIgG-Fcフラグメント。
  5. 　前記糖鎖が、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、R1及びR2は、同一又は異なって、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     を示す。Acは、アセチル基を示す。］
    で表される糖鎖である、請求項１から４のいずれか１項に記載のIgG-Fcフラグメント。
  6. 　実質的に均一な糖鎖が付加されたIgG-Fcフラグメントの製造方法であって、
    　前記IgG-Fcフラグメントの部分ペプチドであって、アミノ酸残基が3個～50個の糖鎖付加アミノ酸を含む糖鎖付加ペプチドを、実質的に均一な糖鎖付加Asnを使用して固相合成法により合成する工程と、
    　前記IgG-Fcフラグメントにおける前記糖鎖付加ペプチドよりN末端側の部分ペプチド、及び、前記IgG-Fcフラグメントにおける前記糖鎖付加ペプチドよりC末端側の部分ペプチド、の少なくとも1つを発現系により発現させ、残りを固相合成法により合成する工程と、
    　前記糖鎖付加ペプチドと、前記N末端側部分ペプチドと、前記C末端側部分ペプチドとをライゲーション法により連結する工程と、を含み、
    　前記部分ペプチドを発現系により発現させる工程は、
    　前記部分ペプチドを、Metを介して精製タグとの融合タンパク質として発現させ、該融合タンパク質を、該精製タグを利用して精製する工程と、
    　前記部分ペプチドと前記精製タグを、強酸と水混和性溶剤の存在下でMetを分解することにより切断する工程と、を含む方法。
  7. 　前記強酸が、トリフルオロ酢酸、フッ化水素及びメタンスルホン酸からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記糖鎖付加ペプチドのN末端アミノ酸をCys又は下記式(1）に示すトレオニン誘導体に置換して合成する、請求項６又は７に記載の方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  9. 　前記部分ペプチドを発現系により発現させる工程において、該部分ペプチドに含まれるMetが、Met以外のアミノ酸に置換されるように発現させる、請求項６から８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　前記IgG-Fcフラグメントが、IgG1-Fcフラグメントであって、
    　前記N末端側部分ペプチドを、固相合成法により合成する場合、該N末端側部分ペプチドを合成する工程は、
    　前記N末端側部分ペプチドを配列番号：１に記載のアミノ酸配列の32位のThrと33位のCysの間で分けたそれぞれのペプチドを固相合成法によって合成する工程と、
    　合成したペプチドをライゲーション法で連結する工程と、を含む、請求項６から９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　前記C末端側部分ペプチドを、固相合成法により合成する場合、該C末端側部分ペプチドを合成する工程は、
    　前記C末端側部分ペプチドを、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の138位のThrと139位のCysの間、及び／又は196位のSerと197位のCysの間で分けたそれぞれのペプチドを固相合成法によって合成する工程と、
    　合成したペプチドをライゲーション法で連結する工程と、を含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記糖鎖付加ペプチドが配列番号：１に記載のアミノ酸配列の65位～92位であり、前記N末端側部分ペプチドが1位～64位であり、前記C末端側部分ペプチドが93位～216位であって、
    　前記糖鎖付加ペプチドは、65位のGluをCysに置換して固相合成法で合成し、
    　前記N末端側部分ペプチドは、1位～32位と33位～64位に分けて、それぞれ固相合成法で合成し、
    　前記C末端側部分ペプチドは、130位及び200位のMetがLeuに置換されるように発現系により発現させる、請求項１０又は１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　前記ライゲーション法による連結工程の後、IgG-Fcフラグメントをフォールディングさせる工程をさらに含む、請求項６から１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　前記発現系が大腸菌発現系である、請求項６から１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　請求項１から５のいずれか１項に記載のIgG-Fcフラグメント、又は、請求項６から１４のいずれか１項に記載のIgG-Fcフラグメントの製造方法により製造されたIgG-Fcフラグメントを含むキメラ抗体。
  16. 　均一な糖鎖が付加されたIgG-Fcフラグメントを製造する方法の設計方法であって、
    　前記IgG-Fcフラグメントを、糖鎖付加アミノ酸を含む糖鎖付加ペプチドと、1つ以上のその他のペプチドとに分けて産生するものとし、
    　前記糖鎖付加ペプチドは、前記糖鎖付加アミノ酸のN末端側で、該糖鎖付加アミノ酸から数えて1～30位のいずれかのアミノ酸をN末端とし、該糖鎖付加アミノ酸のC末端側の最も近いCys、Ser、Thr又はAlaのN末端側に隣接するアミノ酸をC末端とし、
    　当該糖鎖付加ペプチドを、均一な糖鎖付加アミノ酸を用いた固相合成法によって合成するものとし、
    　前記その他のペプチドは、発現系により発現させるか、固相合成法により合成するものとし、
    　前記糖鎖付加ペプチドと前記ペプチドをライゲーション法によって連結するものとする、方法。
  17. 　前記糖鎖付加ペプチドを固相合成する際、N末端のアミノ酸をCys又は下記式(1)に示すThr誘導体に置換して合成するものとする、請求項１６に記載の方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
  18. 　前記その他のペプチドを、当該ペプチドに含まれるCys、Ser、Thr及びAlaからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸のN末端側で2以上の部分ペプチドに分け、各部分ペプチドを、発現系により発現させるか、固相合成法により合成するものとし、
    　前記糖鎖付加ペプチドと前記部分ペプチドをライゲーション法によって連結するものとする、請求項１６又は１７に記載の方法。
  19. 　前記その他のペプチドを発現系により発現させる場合、該ペプチドを、Metを介して精製タグとの融合タンパク質として発現させ、該精製タグを該特定の物質に結合させることにより精製するものとし、
    　前記ペプチドと前記精製タグとを、強酸と水混和性溶剤の存在下でMetを分解することにより切断し、
    　前記ペプチドに含まれるMetをMet以外のアミノ酸に変えて発現させる、請求項１６から１８のいずれか１項に記載の方法。
PCT/JP2010/051858 2009-02-10 2010-02-09 IgG-Fcフラグメント及びその製造方法 Ceased WO2010092943A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10741220A EP2397544A4 (en) 2009-02-10 2010-02-09 IGG FRAGMENT Fc AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME
JP2010550516A JP5575670B2 (ja) 2009-02-10 2010-02-09 ＩｇＧ−Ｆｃフラグメント及びその製造方法
US13/148,839 US20110313136A1 (en) 2009-02-10 2010-02-09 IgG-Fc FRAGMENT AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009029180 2009-02-10
JP2009-029180 2009-02-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010092943A1 true WO2010092943A1 (ja) 2010-08-19

Family

ID=42561785

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2010/051858 Ceased WO2010092943A1 (ja) 2009-02-10 2010-02-09 IgG-Fcフラグメント及びその製造方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20110313136A1 (ja)
EP (1) EP2397544A4 (ja)
JP (1) JP5575670B2 (ja)
TW (1) TW201031749A (ja)
WO (1) WO2010092943A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013047372A1 (ja) * 2011-09-26 2013-04-04 株式会社糖鎖工学研究所 Ｎｃｌ法に適した、ポリペプチド断片の効率的な製造方法
JP2015501654A (ja) * 2011-12-13 2015-01-19 ノルディック ナノベクター アーエス 治療用キメラ型抗ｃｄ３７抗体ｈｈ１
US12103947B2 (en) 2018-11-30 2024-10-01 Glytech, Inc. Methods for producing peptide thioester and peptide

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996034878A1 (en) 1995-05-04 1996-11-07 The Scripps Research Institute Synthesis of proteins by native chemical ligation
WO2002004471A1 (fr) 2000-07-07 2002-01-17 Seikagaku Corporation Fractions oligosaccharidiques d'acide hyaluronique et medicament les contenant
WO2003008431A1 (en) 2001-06-19 2003-01-30 Otsuka Chemical Co.,Ltd. Process for producing sugar chain asparagine derivative
WO2004005330A1 (ja) 2002-07-05 2004-01-15 Otsuka Chemical Co., Ltd. 糖鎖アスパラギンを有する糖ペプチドの製造法及び該糖ペプチド
WO2004058984A1 (ja) 2002-12-24 2004-07-15 Otsuka Chemical Co., Ltd. 糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギンおよび糖鎖ならびにそれらの製造法
WO2004058824A1 (ja) 2002-12-26 2004-07-15 Otsuka Chemical Co., Ltd. ３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体、該糖鎖アスパラギン、該糖鎖およびそれらの製造方法
WO2004070046A1 (ja) 2003-02-04 2004-08-19 Otsuka Chemical Co., Ltd. 糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法
JP2005512597A (ja) * 2001-12-21 2005-05-12 ビオテクノール ソシエダッド アノニマ 異種遺伝子発現のための発現ベクター及びプロモーター
WO2007011055A1 (ja) 2005-07-19 2007-01-25 Otsuka Chemical Co., Ltd. 糖鎖誘導体の製造方法、構造解析方法、及び糖鎖誘導体
WO2009017154A1 (ja) 2007-07-31 2009-02-05 Otsuka Chemical Co., Ltd. ペプチドの製造方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7960512B2 (en) * 2003-01-09 2011-06-14 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
ES2646119T3 (es) * 2008-08-19 2017-12-12 Glytech, Inc. Método de producción de glicoproteína y método de selección
EP2455396A4 (en) * 2009-07-16 2013-05-01 Otsuka Chemical Co Ltd EXTRACELLULAR AILIM DOMAIN PLACED WITH SUGAR CHAINS AND METHOD OF MANUFACTURING THE SAME

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996034878A1 (en) 1995-05-04 1996-11-07 The Scripps Research Institute Synthesis of proteins by native chemical ligation
WO2002004471A1 (fr) 2000-07-07 2002-01-17 Seikagaku Corporation Fractions oligosaccharidiques d'acide hyaluronique et medicament les contenant
WO2003008431A1 (en) 2001-06-19 2003-01-30 Otsuka Chemical Co.,Ltd. Process for producing sugar chain asparagine derivative
JP2005512597A (ja) * 2001-12-21 2005-05-12 ビオテクノール ソシエダッド アノニマ 異種遺伝子発現のための発現ベクター及びプロモーター
WO2004005330A1 (ja) 2002-07-05 2004-01-15 Otsuka Chemical Co., Ltd. 糖鎖アスパラギンを有する糖ペプチドの製造法及び該糖ペプチド
WO2004058984A1 (ja) 2002-12-24 2004-07-15 Otsuka Chemical Co., Ltd. 糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギンおよび糖鎖ならびにそれらの製造法
WO2004058824A1 (ja) 2002-12-26 2004-07-15 Otsuka Chemical Co., Ltd. ３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体、該糖鎖アスパラギン、該糖鎖およびそれらの製造方法
WO2004070046A1 (ja) 2003-02-04 2004-08-19 Otsuka Chemical Co., Ltd. 糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法
WO2007011055A1 (ja) 2005-07-19 2007-01-25 Otsuka Chemical Co., Ltd. 糖鎖誘導体の製造方法、構造解析方法、及び糖鎖誘導体
WO2009017154A1 (ja) 2007-07-31 2009-02-05 Otsuka Chemical Co., Ltd. ペプチドの製造方法

Non-Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANTHONY, R.M., SCIENCE, vol. 320, 2008, pages 373
FEBS LETTERS, vol. 50, no. 3, February 1975 (1975-02-01)
KANEKO, Y. ET AL., SCIENCE, vol. 313, 2006, pages 670
KENT ET AL., ANGEW. CHEM. INT. ED., vol. 45, 2006, pages 3985 - 3988
MACMILLAN ET AL., J. AM. CHEM. SOC., vol. 126, 2004, pages 9530 - 9531
MIMURA, Y. ET AL., MOLECULAR IMMUNOLOGY, vol. 37, 2000, pages 697 - 706
NAOMI MASUNO ET AL.: "Hito IgG-Fc Fragment no Gosei Kenkyu", NIPPON TOSA GAKKAI NENKAI YOSHISHU, vol. 27TH, 2007, pages 153, XP008162051 *
PROTEIN SCIENCE, vol. 16, 2007, pages 2056 - 2064
See also references of EP2397544A4 *
SHIELDS, R.L. ET AL., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 277, 2002, pages 26733 - 26740
SONDERMANN, P. ET AL., NATURE, vol. 406, 2000, pages 267
UMANA, P. ET AL., NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 17, 1999, pages 176
WAN ET AL., ANGEW. CHEM. INT. ED., vol. 45, 2007, pages 9248 - 9252
WAN Q. ET AL.: "Free-radical-based, specific desulfurization of cysteine: a powerful advance in the synthesis of polypeptides and glycopolypeptides.", ANGEW. CHEM. INT. ED. ENGL., vol. 46, no. 48, 2007, pages 9248 - 9252, XP008155212 *
WEI ET AL., BIOCHEMISTRY, vol. 47, 2008, pages 10294 - 10304
ZHANG X. ET AL.: "Characterization of unstable intermediates and oxidized products formed during cyanogen bromide cleavage of peptides and proteins by electrospray mass spectrometry.", ANAL. CHEM., vol. 68, no. 19, 1996, pages 3422 - 3430, XP008155417 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013047372A1 (ja) * 2011-09-26 2013-04-04 株式会社糖鎖工学研究所 Ｎｃｌ法に適した、ポリペプチド断片の効率的な製造方法
JPWO2013047372A1 (ja) * 2011-09-26 2015-03-26 株式会社糖鎖工学研究所 Ｎｃｌ法に適した、ポリペプチド断片の効率的な製造方法
JP2015501654A (ja) * 2011-12-13 2015-01-19 ノルディック ナノベクター アーエス 治療用キメラ型抗ｃｄ３７抗体ｈｈ１
US12103947B2 (en) 2018-11-30 2024-10-01 Glytech, Inc. Methods for producing peptide thioester and peptide

Also Published As

Publication number Publication date
TW201031749A (en) 2010-09-01
US20110313136A1 (en) 2011-12-22
JPWO2010092943A1 (ja) 2012-08-16
EP2397544A1 (en) 2011-12-21
EP2397544A4 (en) 2012-11-21
JP5575670B2 (ja) 2014-08-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101796064B (zh) 肽的制备方法
Alexander et al. Characterization and modelling of the hydrophobic domain of a sunflower oleosin
Siman et al. Chemical and semisynthesis of posttranslationally modified proteins
AU2005216126A1 (en) Binding peptidomimetics and uses of the same
KR101920947B1 (ko) 시알릴 당쇄를 갖는 당펩티드의 제조방법, 당해 제조방법에 사용하는 시알릴 당쇄 부가 아미노산 유도체 및 당해 당펩티드
JP2025521803A (ja) 固定化エンドグリコシダーゼ融合タンパク質及びその使用
JP5575670B2 (ja) ＩｇＧ−Ｆｃフラグメント及びその製造方法
Richardson et al. Exploring neoglycoprotein assembly through native chemical ligation using neoglycopeptide thioesters prepared via N→ S acyl transfer
WO2008143944A2 (en) Methods of glycosylation and bioconjugation
JP5530358B2 (ja) 糖タンパク質の製造方法及びスクリーニング方法
EP2455396A1 (en) Sugar chain-added ailim extracellular domain and method for producing same
IL285930B1 (en) Recombinant ccn domain proteins and fusion proteins
JP6153470B2 (ja) 糖鎖付加ポリペプチドおよび当該ポリペプチドを含む医薬組成物
WO2022245259A1 (ru) Способ промышленной очистки ромиплостима
Wojnar et al. Neoglycoprotein Synthesis Using the Copper‐Catalyzed Azide–Alkyne Click Reaction and Native Chemical Ligation
RU2804622C2 (ru) Способ промышленной очистки ромиплостима
AU2003261710B2 (en) Human calcium transporter 1 gene, screening method of calcium absorption regulating factor, and calcium absorption regulating factor
Pedone et al. DESIGNANDCHARACTERIZA TION OF MOLECULAR SCAFFOLDS
Premdjee Semi-synthesis of glycoproteins

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10741220

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2010550516

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13148839

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010741220

Country of ref document: EP