[go: up one dir, main page]

WO2009125646A1 - Ｔｄｐ－４３蓄積細胞モデル - Google Patents

Ｔｄｐ－４３蓄積細胞モデル Download PDF

Info

Publication number
WO2009125646A1
WO2009125646A1 PCT/JP2009/054826 JP2009054826W WO2009125646A1 WO 2009125646 A1 WO2009125646 A1 WO 2009125646A1 JP 2009054826 W JP2009054826 W JP 2009054826W WO 2009125646 A1 WO2009125646 A1 WO 2009125646A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tdp
cell
amino acid
acid sequence
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2009/054826
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
野中隆
新井哲明
秋山治彦
長谷川成人
山下万貴子
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
Original Assignee
Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research filed Critical Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
Priority to JP2010507197A priority Critical patent/JP5667872B2/ja
Priority to EP09730344.0A priority patent/EP2272955B1/en
Priority to US12/936,585 priority patent/US8715643B2/en
Publication of WO2009125646A1 publication Critical patent/WO2009125646A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US14/096,943 priority patent/US9128081B2/en
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5058—Neurological cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity

Definitions

  • the present invention relates to a transformed cell that forms an inclusion body (aggregate) derived from TAR DNA-binding protein of 43 kDa (TDP-43) in a cell (in cytoplasm or nucleus), that is, a TDP-43 accumulation cell model.
  • TDP-43 TAR DNA-binding protein of 43 kDa
  • TDP-423 TAR DNA-binding protein of 43 kDa
  • TDP-43 is a protein localized in the nucleus and is thought to be involved in transcriptional regulation (Buratti E et al., Nuclear factor TDP-43 and SR proteins promote in vitro and in vivo CFTR exon 9 skipping, EMBO J., 2001, vol. 20 (7), p. 1774-1784), the actual function is not well understood.
  • ALS which is a very incurable neurological disease
  • familiality is 5 to It is estimated to be about 10%, and the majority of others are arcuate.
  • About 20% of familial ALS is accompanied by superoxide dismutase 1 (SODl) gene abnormality (Deng HX et al., Amyotrophic lateral sclerosis ana structural derects in Cu, Zn superoxide dismutase, 1993, Science, vol. 261, p. 1047-1051; Rosen DR et al., Mutations in Cu / Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis, 1993, Nature, vol. 362, p. 59-62).
  • SODl superoxide dismutase 1
  • TDP-43 abnormalities are the primary factor in the majority of ALS development processes, and the intracellular aggregation and development are closely related. It is thought that you are doing.
  • the problem to be solved by the present invention is that the TAR DNA-binding protein of 43 kDa (TDP-43) -derived intracellular inclusions (aggregates) found in the brains of patients with neurodegenerative diseases such as FTLD and ALS It is to provide a transformed cell that forms Another object of the present invention is to provide a screening method for therapeutic agents for neurodegenerative diseases using the transformed cells and a method for assaying side effects of therapeutic agents for neurodegenerative diseases. Furthermore, another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating and / or preventing neurodegenerative diseases.
  • the present inventor has intensively studied to solve the above problems, and has worked on the construction of cultured cells that reproduce TDP-43 intracellular inclusions found in the brains of FTLD and ALS patients at the laboratory level.
  • TDP-43 In intracellular inclusions found in the patient's brain, TDP-43 accumulates in the nucleus or cytoplasm ( Figure 1).
  • TDP-43 which is originally a nuclear protein, accumulates in the cytoplasm means that TDP-43 is localized in the cell. Therefore, the present inventor identified a nuclear translocation signal of TDP-43 and produced a deletion mutant (mutant TDP-43 protein) and the like.
  • mutant TDP-43 protein a deletion mutant
  • combining the expression of mutant TDP-43 protein with the inhibition treatment of proteasome activity resulted in nuclear and cytoplasmic results.
  • the TDP-43 seal was successfully formed inside.
  • TDP-43 accumulated in the patient's brain, not only the full length of TDP-43 but also the TDP-43 fragment is recovered in a fraction insoluble in the surfactant. Attention was paid to the fusion protein of various TDP-43 fragments and green fluorescent protein (GFP). As a result, we succeeded in forming TDP-43 intracellular inclusions in cells expressing several fusion proteins. Furthermore, the present inventor searches for a compound having an effect of suppressing the inclusion body formation using cells capable of forming the above-mentioned TDP-43 cell inclusion body, and that a specific low molecular weight compound actually has the effect. I found. The present invention has been completed in this way. That is, the present invention is as follows.
  • examples of the mutant TDP-43 include those having an intracellular inclusion forming activity.
  • mutant TDP-43 examples include the following proteins (la) to (Id) or the following proteins (2a) to (2d).
  • (lc) A protein consisting of an amino acid sequence in which the 7th to 8th to the 4th and the 1st 8th to the 1st to 9th 2nd amino acids are deleted from the amino acid sequence of wild-type TDP-43
  • Amino acid sequence ( la) (lb) or (lc) a protein comprising an amino acid sequence from which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and having an intracellular inclusion-forming activity
  • a protein comprising an amino acid sequence including amino acids 1 2nd to 4 1 4th in the amino acid sequence of wild-type TDP-43
  • (2c) a protein comprising an amino acid sequence containing the 1st to 16th 1st amino acids in the amino acid sequence of wild-type TDP-43
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence (2a), (2b) or (2c), and having an intracellular inclusion-forming activity
  • mutant TDP-43 include those that do not have CFTR exon 9 skipping activity.
  • Examples of the transformed cell of the present invention include mammalian cell transformed cells, and specific examples include central nervous system cells, peripheral nervous system cells or neuroblasts.
  • examples of the cellular activity include proliferation ability, viability, and the formation rate of intracellular inclusion bodies of mutant TDP-43, the number and size of intracellular formation.
  • examples of the neurodegenerative disease include frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis, and are particularly associated with the formation of TDP-43 intracellular inclusions.
  • Diseases diseases associated with intracellular accumulation of TDP-43).
  • examples of the cell activity include neurite outgrowth ability, proliferation ability and viability.
  • examples of the neurodegenerative disease include frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis, and particularly for the formation of TDP-43 intracellular inclusions.
  • Associated diseases diseases associated with intracellular accumulation of TDP-43).
  • a pharmaceutical composition for treating and / or preventing a neurodegenerative disease comprising methylene blue and / or dimebon.
  • examples of the neurodegenerative diseases include frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis, and particularly diseases associated with the formation of intracellular inclusion bodies of TDP-43 ( Diseases associated with intracellular accumulation of TDP-43).
  • FIG. 1 shows TDP-43 intracellular inclusions found in the brain of FTLD or ALS patients.
  • the left figure is the inclusion body formed in the nucleus and the right figure is in the cytoplasm.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of wild-type TDP-43. Underlined parts of the nuclear translocation signal sequence (NLS1) and the nuclear translocation signal-like sequence (NLS2) was attached.
  • the “amino acid residue number” described in the examples all indicate the position of the amino acid residue from the N-terminus of the amino acid sequence shown in FIG. 2 (or SEQ ID NO: 2) and the amino acid sequence region. is there.
  • which base sequence encodes a predetermined amino acid sequence can be specified by referring to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 (also including the amino acid sequence).
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing a method for identifying TDP-43 nuclear translocation signal (NLS).
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of observation of cells expressing various TDP-43s using a confocal laser microscope.
  • FIG. 5 is a graph showing the effect of the presence or absence of proteasome inhibitor (MG132) treatment on various TDP-43-expressing cells. This is a stained image with a commercially available antibody (anti-TA DBP).
  • FIG. 6 is a graph showing the effect of treatment with a proteasome inhibitor (MG132) on ANLS1-expressing cells. Stained images of anti-phosphorylated TDP-43 antibody (anti-pS409 / 410) and anti-Ubiquitin antibody.
  • MG132 proteasome inhibitor
  • FIG. 7 is a graph showing the effect of treatment with a proteasome inhibitor (MG132) on ANLS2-expressing cells. Stained images of anti-phosphorylated TDP-43 antibody (anti-pS409 / 410) and anti-Ubiquitin antibody.
  • MG132 proteasome inhibitor
  • FIG. 8 is a graph showing the effect of the presence or absence of treatment with a proteasome inhibitor (MG132) on cells expressing ANLS1 & 2. This is a stained image with anti-phosphorylated TDP-43 antibody (anti-pS409 / 410) and anti-Ubiquitin antibody.
  • MG132 proteasome inhibitor
  • FIG. 9 is a schematic diagram of wild-type TDP-43 and various TDP-43 fragments fused with GFP.
  • FIG. 10 shows the results of observation of GFP and GFP-TDP-43 WT expressing cells using a confocal laser microscope. It is a fluorescence image of GFP and a staining image with anti-Ubiquitin.
  • FIG. 11 shows the results of observation of GFP-TDP 162-414-expressing cells using a confocal laser microscope. GFP fluorescence and anti-pS409 / 410 or anti-Ubiquitin stained image.
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of observation of cells expressing GFP-TDP 218-414 using a confocal laser microscope. GFP fluorescence and anti-pS409 / 410 or anti-Ubiquitin stained image.
  • FIG. 13 is a diagram showing the observation results of cells expressing GFP-TDP 274-414 and GFP-TDP 315-414 using a confocal laser microscope. GFP fluorescence and stained with anti-Ubiquitin.
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of observation of cells expressing GFP-TDP 1-161 and GFP-TDP 1-217 using a confocal laser microscope. GFP fluorescence and anti-Ubiquitin stained image.
  • FIG. 15 is a diagram showing the results of observation of cells expressing GFP-TDP 1-273 and GFP-TDP 1-314 with a confocal laser microscope. GFP fluorescence and anti-Ubiquitin stained image.
  • Fig. 16 is a schematic diagram showing the method of CFTR exon 9 skipping assembly.
  • Figure 17 shows the results of CFTR exon 9 skipping assembly.
  • Figure 18 shows the results of CFTR exon 9 skipping assembly.
  • Fig. 19 is a diagram showing the results of observation by a confocal laser microscope on the effect of low molecular weight compound (Methylene Blue) on the formation of inclusion bodies in TDP-43 cells.
  • the upper row is the result for TDP-43 deltaNLSl & 2
  • the lower three are the results for GFP-TDP 162-414.
  • FIG. 20 is a graph showing the results of quantitative measurement of the ratio of inclusion body-forming cells regarding the inhibitory effect of low molecular weight compound (methylene blue) on the formation of inclusion bodies in TDP-43 cells.
  • the graph on the left is for TDP-43 deltaNLSl & 2
  • the graph on the right is for GFP-TDP 162-414.
  • the horizontal axis of the graph is the concentration of methylene blue and dimebon
  • the vertical axis is the percentage of TDP-43 intracellular inclusion body-forming cells.
  • Fig. 21 is a diagram showing the results of observation with a confocal laser microscope on the effect of low molecular weight compound (Dimebon) on the formation of inclusion bodies in TDP-43 cells.
  • FIG. 22 is a graph showing the results of quantitative measurement of the ratio of inclusion body-forming cells with respect to the effect of suppressing the formation of inclusion bodies in TDP-43 cells by a low molecular weight compound (Dimebon).
  • the graph on the left is for TDP-43 deltaNLSl & 2
  • the graph on the right is for GFP-TDP 162-414.
  • the horizontal axis of the graph is the concentration of methylene blue and dimebon
  • the vertical axis is the percentage of TDP-43 intracellular inclusion body-forming cells.
  • Figure 23 shows TDP-43 with low molecular weight compounds (methylene blue and dimebon). It is a figure which shows the result of having quantitatively measured the ratio of the TDP-43 intracellular inclusion body formation cell about the inhibitory effect of TDP-43 intracellular inclusion body formation with respect to deltaNLSl & 2.
  • the horizontal axis of the graph is the concentration of methylene blue and dimebon, and the vertical axis is the proportion of TDP-43 intracellular inclusion body-forming cells.
  • Figure 24 shows the quantitative effect of low molecular weight compounds (methylene blue and dimebon) on the TDP-43 inclusion body formation inhibitory effect on GFP-TDP 162-414. It is a figure which shows a result.
  • the horizontal axis of the graph is the concentration of methylene blue and dimebon, and the vertical axis is the proportion of TDP-43 intracellular inclusion body-forming cells.
  • ubiquitin-positive protein inclusion bodies are formed in nerve cells.
  • neurodegenerative diseases such as frontotemporal lobar degeneration (FTLD) and muscular wife contraction 'I "ginger j cord sclerosis (amyotrophic lateral sclerosis: ALS)
  • FTLD frontotemporal lobar degeneration
  • ALS muscular wife contraction 'I "ginger j cord sclerosis (amyotrophic lateral sclerosis: ALS)
  • TDP-43 TAR DNA-binding protein of 43 kDa
  • TDP-43 is a specific nuclear protein.
  • TDP-43 is a type of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP), It is thought to be a protein that is involved in processes such as RNA splicing, alternative splicing, and transcriptional regulation by binding to RNA and other hnRNPs (Buratti E et al., Nuclear factor TDP-43 and SR proteins promote in vitro and in vivo CFTR exon 9 skipping, EMBO J., 2001, vol. 20 (7), p. 1774-1784). However, the mechanism by which TDP-43 accumulates in neurons, the accumulated TDP-43 is cytotoxic, and the mechanism by which cell death is induced was not clear at all.
  • hnRNP nuclear ribonucleoprotein
  • the present inventor considered that a TDP-43 accumulating cell model using cultured cells or the like was necessary to elucidate these points, and worked on the development of such a model system.
  • various mutants mutant TDP-43 protein
  • fusion proteins containing TDP-43 protein fragments are expressed in cells, and in some cases, proteasome inhibition treatment is performed on the cells.
  • TDP-43 inclusion bodies were formed and TDP-43 was successfully accumulated.
  • the transformed cell of the present invention is a cell into which a promoter that functions in a host cell, a mutant TDP-43 gene is introduced (hereinafter, also referred to as “mutant TDP-43 transformed cell”).
  • the transformed cell of the present invention expresses mutant TDP-43, which is a major component of intracellular (intracytoplasmic or intranuclear) inclusion bodies, and is useful as a cell model for neurodegenerative diseases such as FTLD and ALS Is something.
  • a recombinant vector in which the target protein gene is incorporated into the expression vector is constructed.
  • a gene functioning in the host cell is linked in advance to the gene to be incorporated into the expression vector.
  • selectable markers can be linked.
  • Each element necessary for gene expression such as the above promoter may be included in the target protein gene from the beginning, or may be used when originally included in the expression vector. There is no particular limitation.
  • the expression vector is not particularly limited, for example, plasmid DNA, / cteriophage DNA, retrotransposon DNA, retrovirus vector, artificial chromosome DNA, etc., and a vector suitable for the host cell to be used is appropriately selected. You can select and use.
  • the constructed recombinant vector is introduced into a host cell to obtain a transformant, and this is cultured, whereby the target protein can be expressed.
  • transformation means introducing a foreign gene into a host cell. Specifically, a plasmid DNA or the like is introduced into a host cell (transformation). And introducing a foreign gene by infecting a host cell with various viruses and phages (transduction).
  • the host cell is not particularly limited as long as it can express the target protein after the introduction of the recombinant vector.
  • human, mouse and rat can be selected.
  • animal cells derived from various mammals such as yeast cells and, in some cases, yeast cells.
  • the animal cells include human fibroblasts, CHO cells, monkey cells COS-7, Vero, mouse L cells, rat GH3, human FL cells, neuroblasts, central nervous system cells and peripheral nervous system.
  • nerve cells such as neuroblasts, central nervous system cells, and peripheral nervous system cells are particularly preferable.
  • yeast is not limited, but for example Preferred examples include Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe.
  • a method for obtaining a transformed cell that is, a method for introducing a recombinant vector into a host cell is not particularly limited, and can be appropriately selected in consideration of a combination of types of host cell and expression vector.
  • the codon type of the gene contained in the recombinant vector may be the same as or different from the codon type of the host cell actually used, and is not limited.
  • the method for producing a transformed cell outlined above can be arbitrarily applied to the production of the transformed cell of the present invention (variant TDP-43 transformed cell).
  • the variant TDP-43 which is the target protein, may be expressed stably in the host cell or may be transiently expressed.
  • stable expression in the present invention means constitutive expression based on a gene (intrachromosomal gene) integrated in the chromosome of the host cell
  • transient expression means It means non-constant expression based on a gene that is not integrated into a chromosome in a host cell (extrachromosomal gene such as plasmid).
  • the host cell is not limited, but a mammalian cell is more preferable.
  • Mammalian cells may be human or non-human cells and are not limited.
  • Preferred examples of non-human animals include mammals such as mice, rats, guinea pigs, rabbits, rabbits, pigs, dogs, cats, monkeys, sheep, horses and horses. More preferred are rodent (murine) animals such as mice, rats and guinea pigs, particularly preferably mice and rats.
  • the cell types of animal cells are not limited, Neuroblasts, central nervous system cells, peripheral nervous system cells and the like are particularly preferable.
  • a recombinant vector containing these genes is usually used.
  • a well-known expression vector stable expression vector
  • transient expression vector a vector having both functions of a stable expression vector and a transient expression vector may be used as appropriate.
  • known vectors such as pCEP4 vector and pTarget vector can be used for animal cells, and various known vectors can be used for yeast cells.
  • Transient expression vectors are for animal cells.
  • pCEP4 vector, and pTarget vector can be used, and various known vectors can be used for yeast cells.
  • those containing a promoter that functions in the host cell are appropriately selected from known ones and used so that the expression of the target protein gene in the host cell is controlled by the promoter.
  • An expression vector capable of introducing a mutant TDP-43 gene under the control of a promoter that functions in the host cell is preferred.
  • “under the control of a promoter” means that the promoter functions and the mutant TDP-43 gene can be expressed in the host cell, that is, the promoter can act on these genes. , Means connected.
  • promoters that function in central nervous system cells include, but are not limited to, for example, Thy-1 promoter (brain-specific), Neuron-Specific Enolase promoter motor (brain-specific), and ⁇ promoter.
  • Examples include promoters for central nerve cells such as (brain-specific) and prion promoter (brain-specific), and known promoters for various cells that can exist in the central nervous system such as glial cells.
  • Central god A promoter that functions in a transgene cell may have both a function as a promoter for central nervous cells and a function as a promoter for various cells that may exist in the central nervous system.
  • Promoters that function in peripheral nervous system cells are not limited and include known promoters for peripheral nerve cells and known promoters for various cells that may exist in the peripheral nervous system.
  • known promoters for peripheral nerve cells those listed above as promoters for central nerve cells can be used as well, and as known promoters for various cells that can exist in the peripheral nervous system, Known promoters for various cells that may be present in the central nervous system can be used as well.
  • the promoter that functions in peripheral nervous system cells may have both a function as a promoter for peripheral nerve cells and a function as a promoter for various cells that can exist in the peripheral nervous system.
  • examples of promoters that function in neuroblasts include known promoters such as the CMV promoter.
  • the mutant TDP-43 gene inserted into the expression vector can be prepared, for example, as follows.
  • a wild-type TDP-43 gene fragment is obtained from a human cDNA gene library by a method such as PCR, and the wild-type TDP-43 gene is screened using this gene fragment. . If necessary, the wild-type TDP-43 gene may be linked with DNA encoding an epitope tag or the like. The screened wild-type TDP-43 gene may be inserted into an appropriate plasmid vector using recombinant DNA technology. Alternatively, instead of performing the above screening, a commercially available plasmid vector in which a wild type TDP-43 gene has been inserted in advance may be used.
  • the nucleotide sequence information (SEQ ID NO: 1) of wild-type human TDP-43 gene can be easily obtained from a known database.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • Website: http://www.ncbi.nlm.nih.gov is published as “Accession Number: NM_007375” in the GenBank database provided by http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
  • the coding region (CDS) of wild-type human TDP-43 is from position 135 to position 1379. Therefore, the above coding region may be used instead of the full-length sequence shown in SEQ ID NO: 1. Possible It is.
  • mutant TDP-43 means a protein having intracellular inclusion body forming activity.
  • Cellular inclusion body formation activity refers to the activity of self, that is, mutant TDP-43 aggregates with each other as main constituents and forms inclusion bodies within the cell (in the cytoplasm or nucleus) (for example, Inclusion body formation rate, number of cells formed and size), compared to wild-type TDP-43, which is inherently aggregated and difficult to form inclusion bodies, the degree of aggregation between mutant TDP-43 is higher Any physical property that can be recognized is acceptable.
  • mutant TDP-43 referred to in the present invention preferably includes the following proteins (la) to (Id).
  • amino acids in the amino acid sequence (la), (lb) or (lc) are deleted or replaced.
  • a protein comprising an added amino acid sequence and having intracellular inclusion body formation activity
  • mutant TDP-43 referred to in the present invention
  • proteins (2a) to (2d) are preferably mentioned as specific examples.
  • amino acid sequence (2a), (2b) or (2c) In the amino acid sequence (2a), (2b) or (2c), one or several amino acids (preferably about 1 to 10 and more preferably about 1 to 5) are deleted or substituted. Or a protein comprising an added amino acid sequence and having intracellular inclusion body formation activity
  • the proteins (2a) to (2d) above contain a fragment of wild-type TDP-43, but it may be a protein consisting only of the fragment or other protein (for example, GFP It may be a fusion protein with a reporter protein), and is not limited.
  • the construction of the gene encoding the fusion protein can be easily carried out by those skilled in the art using known base sequence information and gene recombination techniques.
  • the mutant TDP-43 referred to in the present invention is a cystic fibrosis 3 ⁇ 4 EB gene (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator: CFTR) gene (SEQ ID NO: 16; GenBank succession) No .: NM-000492) Exon 9 having no skipping activity is preferred. Conventionally, the activity of skipping CFTR exon 9 has been reported as a function of wild-type TDP-43 (Buratti E et al., EMBO J., 2001 (supra)). 43. In particular, the proteins (la) to (Id) and (2a) to (2d) above do not have the skipping activity.
  • the exon 10 region is "Buratti E et al., EMBO J., 2001 (supra)" It will correspond to. Therefore, the “skip activity of exon 9” as used in the present specification is the same as the description (name) of “Buratti E et al., EMBO J., 2001 (supra)” for convenience.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 is used as a reference, it substantially means “exon 10 skipping activity”. This point should be interpreted in the same manner in all of the present specification, claims, and drawings.
  • the exon 10 is a base sequence consisting of the 1342th to 1524th bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 16.
  • the gene encoding the above mutant TDP-43 (mutant TDP-43 gene) is, for example, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) etc. and can be prepared according to the site-specific displacement induction method. Specifically, it can be prepared using a mutagenesis kit using site-directed mutagenesis by a known method such as the Kunkel method or the Gapped duplex method. For example, the kit includes QuickChange TM Site.
  • the mutant TDP-43 gene is designed with primers for amplifying the gene using DNA containing a nucleotide sequence encoding wild-type TDP-43 as a template, as described in Examples below. It can also be prepared by performing PCR under appropriate conditions.
  • the DNA polymerase used in the PCR is not limited, but is preferably a highly accurate DNA polymerase. For example, Pwo DNA polymerase (Roche Diagnostics), Pfu DNA polymerase (Promega), Platinum Pfk DNA Polymerase (Invitrogen), KOD DNA polymerase (Toyobo), KOD-plus-polymerase (Toyobo) and the like are preferable.
  • the PCR reaction conditions may be set as appropriate depending on the optimal temperature of the DNA polymerase to be used, the length and type of DNA to be synthesized, etc. For example, in the case of cycle conditions, “90-98 ° C for 5-30 seconds (heat Denaturation-dissociation) ⁇ 50 to 65 ° C for 5 to 30 seconds (annealing) ⁇ 65 to 80 ° C for 30 to 1200 seconds (synthesis and elongation).
  • hybridization is performed under stringent conditions with a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the mutant TDP-43 gene obtained as described above or the nucleotide sequence of the coding region, and A gene encoding a protein having intracellular inclusion body forming activity can also be used.
  • stringent conditions include a salt concentration of 100 to 100 in a hybridization. The conditions include 900 mM, preferably 100 to 300 mM, and a temperature of 50 to 70 ° C, preferably 55 to 65 ° C.
  • the DNA to be hybridized is at least 50% or more, preferably 70%, more preferably 80%, even more preferably 90% (eg, 95% or more) with respect to its complementary sequence. And a DNA containing a base sequence having 99% identity.
  • the transformed cell of the present invention is characterized in that it expresses mutant TDP-43.
  • Known clones such as Western blotting are used to select a clone that expresses it, and to detect and quantify the expression of the target protein. Can also be performed.
  • the transformed cell of the present invention can form an inclusion body in the cell (in the cytoplasm or in the nucleus) only by expressing the mutant TDP-43, but in some cases, the mutant TDP-43 In some cases, the inclusion body can be formed by treating a cell in which the protein is expressed with a proteasome inhibitor.
  • the proteasome inhibitor used in the present invention is not limited, but examples thereof include MG132, lactactin, IEAL, and MG115.
  • the transformed cells of the present invention are preferably those in which inclusion bodies very similar to intracellular inclusion bodies (intracytoplasmic or intranuclear) found in the brains of patients with neurodegenerative diseases such as human FTLD or ALS are formed. It is extremely useful as a cell model for developing therapeutic agents and treatment methods for neurodegenerative diseases.
  • the present invention it is also possible to provide a method for screening a therapeutic agent for a neurodegenerative disease using the transformed cell described in the above item 2, and a therapeutic agent for a neurodegenerative disease obtained by the method.
  • the screening method involves contacting a candidate substance with the transformed cell of the present invention, measuring the cellular activity of the cell, and screening a therapeutic agent for a neurodegenerative disease using the obtained measurement result as an index.
  • the neurodegenerative disease is not limited. Examples include frontotemporal lobar degeneration, amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's chorea, and prion disease, but especially TDP-43 intracellular inclusions.
  • Preferred examples include diseases associated with the formation of TDP-43 (diseases associated with intracellular accumulation of TDP-43).
  • the cell activity of the transformed cell of the present invention is not limited, and examples thereof include various activities related to the function and characteristics of the transformed cell. Known methods can be used for measuring various activities.
  • the cell activity to be measured includes, for example, neurite outgrowth ability, viability, proliferation ability, and the rate of formation of mutant TDP-43 intracellular inclusion bodies, the number and size of intracellular formations (mutation Type TDP-43 intracellular inclusion body formation activity) and the like.
  • the neurite extension ability is measured when a candidate substance is brought into contact with these transformed cells. If the result can be evaluated as having a high elongation rate (elongation rate) compared to cells not contacted with the candidate substance, the candidate substance can be selected as a therapeutic agent for neurodegenerative diseases.
  • the candidate substance when a candidate substance is brought into contact with the transformed cell of the present invention, it is evaluated that the measurement result of the growth ability has a higher growth rate (growth rate) than that of a cell not brought into contact with the candidate substance. If possible, the candidate substance can be selected as a therapeutic agent for neurodegenerative diseases. Similarly, when a candidate substance is brought into contact with the transformed cell of the present invention, if the measurement result of viability can be evaluated as having a long lifespan or a high survival rate as compared with a cell not brought into contact with the candidate substance, Candidate substances can be selected as therapeutic agents for neurodegenerative diseases.
  • the measurement result of the formation rate of intracellular inclusion bodies (based on the number of cells) containing the mutant TDP-43 as a main constituent is shown in FIG. If it can be evaluated that the formation rate is low compared to cells that are not allowed to be treated, the candidate substance can be selected as a therapeutic agent for neurodegenerative diseases. Similarly, when a candidate substance is brought into contact with the transformed cell of the present invention, the number of cells formed as a result of measuring the number of intracellular inclusions is less than the number of cells that are not brought into contact with the candidate substance. If it can be evaluated, the candidate substance can be selected as a therapeutic agent for neurodegenerative diseases.
  • the measurement result relating to the size of the intracellular inclusion body is smaller from the beginning than that of the cell not brought into contact with the candidate substance, or more than that. If it can be evaluated that it is difficult to grow, the candidate substance can be selected as a therapeutic agent for neurodegenerative diseases.
  • the present invention provides a method for screening a mutant TDP-43 inclusion body formation inhibitor using the transformed cell described in the above section 2, and a mutant TDP-43 obtained by the method.
  • An intracellular inclusion body formation inhibitor can also be provided.
  • the screening method is obtained by contacting the candidate cell with the transformed cell of the present invention and measuring the inclusion body-forming activity (substantially, the formation-inhibiting activity) in the cell. Using the measurement results as an index, screening for a mutant TDP-43 intracellular inclusion body formation inhibitor is performed. In the screening method,
  • the TDP-43 intracellular inclusion body formation activity is measured based on the formation rate of intracellular inclusion bodies, the number and size of intracellular inclusion bodies, and the like.
  • the measurement result of the formation rate of intracellular inclusion bodies (based on the number of cells) containing mutant TDP-43 as a main constituent is a cell that does not contact the candidate substance. If it can be evaluated that the formation rate is low as compared with, the candidate substance can be selected as the inclusion body formation inhibitor. Similarly, when a candidate substance is brought into contact with the transformed cell of the present invention, the number of formed intracellular inclusion bodies per cell is less than the number of cells that are not brought into contact with the candidate substance. If it can be evaluated, the candidate substance can be selected as the inclusion body formation inhibitor.
  • the measurement result relating to the size of the intracellular inclusion body is smaller from the beginning than that of the cell not brought into contact with the candidate substance, or that If it can be evaluated that it is difficult to increase, the candidate substance can be selected as the inclusion body formation inhibitor.
  • the assay method involves contacting a transformed cell of the present invention with a therapeutic agent for a neurodegenerative disease, and Cell activity is measured, and the measurement results obtained are used as an index to test the side effects of therapeutic agents for neurodegenerative diseases.
  • neurodegenerative diseases include frontotemporal lobar degeneration, amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's chorea, and prion disease.
  • diseases associated with the formation of 43 intracellular inclusions are diseases associated with the formation of 43 intracellular inclusions (diseases associated with intracellular accumulation of TDP-43).
  • the cell activity of the transformed cell of the present invention is not limited, and examples thereof include various activities related to the function and characteristics of the transformed cell. Known methods can be used for measuring various activities. In the above assay method, it is particularly preferable that the cell activity to be measured is, for example, neurite outgrowth ability, proliferation ability and viability.
  • the transformed cell of the present invention is derived from various nerve cells such as cerebral nerve cells or neuroblasts, when these cells are contacted with a therapeutic agent for a neurodegenerative disease, the neurite outgrowth ability If the measurement result can be evaluated as having an equal or higher elongation rate (elongation rate) compared to cells not contacted with the therapeutic agent, it can be determined that the therapeutic agent has no side effects.
  • elongation rate elongation rate
  • the measurement result of the proliferation ability is equal to or higher than that of a cell not contacted with the therapeutic agent. Can be determined as having no side effects.
  • the measurement result of viability is equivalent or longer lifespan or equivalent or higher than that of a cell not contacted with the therapeutic agent. If it can be evaluated that it has a survival rate, it can be determined that the therapeutic agent has no side effects. 5.
  • the pharmaceutical composition for treating and / or preventing neurodegenerative diseases of the present invention comprises a low molecular weight compound such as methylene blue and Z or dimebone as an active ingredient as described above. It is a composition. Methylene blue and dimebon are useful for neurodegenerative diseases such as frontotemporal lobar degeneration or Can effectively suppress the formation of TDP-43 intracellular inclusions for amyotrophic lateral sclerosis, especially for transvaginal degenerative diseases associated with the formation of TDP-43 intracellular inclusions. It is useful for treatment and prevention of the disease.
  • the present invention includes a method for treating and / or preventing a neurodegenerative disease, characterized by administering methylene blue and / or dimebon to a subject (a neurodegenerative disease or a patient who is likely to have it or a healthy person).
  • the present invention also includes the use of methylene blue and Z or dimebon for the manufacture of a medicament for the treatment and Z or prevention of neurodegenerative diseases, and further includes methylene blue and z or dimebon. It is also possible to provide a kit for treatment and Z or prevention of neurodegenerative diseases characterized by the above.
  • low molecular weight compounds such as exciphone, gosipetin and congoled are used as active ingredients having an inhibitory effect on the formation of intracellular inclusion bodies in TDP-43, as well as methylene blue and dimebon. can do.
  • the mixing ratio of methylene blue and dimebon as active ingredients is not particularly limited.
  • methylene blue is 0.01-30 weight. / 0 is preferable, more preferably 0.05 to 20% by weight, still more preferably 0.1 to 10% by weight, and dimebon is preferably 0.01 to 30% by weight, more preferably 0.05 to 20% by weight, Preferably 0.1 to 10% by weight.
  • only one of methylene blue and dimebon may be used (single agent treatment), or both may be used together (combination treatment), but there is no limitation.
  • the total blending ratio of these active ingredients in the pharmaceutical composition of the present invention is preferably 0.01 to 30% by weight, more preferably 0.05 to 20% by weight, still more preferably 0.1 to 10% by weight. It is.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain other components in addition to the active ingredients methylene blue and dimebon, as long as the effects of the present invention are not significantly impaired. Commonly used in drug production as described below Can be included.
  • Administration of the pharmaceutical composition of the present invention into the body can be carried out by a known method such as parenteral or oral, and it is preferably, but not limited to, parenteral.
  • the preparations used for these various uses include excipients, fillers, fillers, binders, wetting agents, disintegrants, lubricants, surfactants, Dispersants, buffers, preservatives, solubilizers, preservatives, flavoring agents, soothing agents, stabilizing agents, tonicity agents, etc. can be appropriately selected and used, and can be prepared by conventional methods. .
  • the dosage of the therapeutic and prophylactic pharmaceutical composition of the present invention is generally determined in consideration of the blending ratio of the active ingredient in the preparation, and the age, weight, type of disease / progress of the subject to be administered (patient) In consideration of the situation, administration route, number of administrations (1 day), administration period, etc., it can be set appropriately within a wide range.
  • composition of the present invention is used as a parenteral or oral preparation.
  • parenteral preparation When used as a parenteral preparation, its form is generally not limited. Examples include intravenous injection (including infusion), intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, and suppository. There may be. In the case of various injections, for example, it can be provided in the form of a unit dose ampoule or a multi-dose container, or in the form of a lyophilized powder that is re-dissolved in a solution at the time of use. In addition to the above-mentioned active ingredients, the parenteral preparation can contain various known shaping materials and additives in accordance with various forms, as long as the effects of the active ingredients are not impaired.
  • parenteral agent per day
  • the above-mentioned active ingredient is generally taken at 0.1 to 50 mg per kg of the subject (patient) body weight.
  • the amount is 0.5 to 20 mg, more preferably 1 to 10 mg.
  • the oral preparation When used as an oral preparation, its form is not limited in general. For example, it may be any of tablets, capsules, granules, powders, pills, troches, liquids for internal use, suspensions, emulsions, syrups, etc. Or a dry product that is re-dissolved when used. Good.
  • the oral preparation can contain various types of excipients and additives according to various forms within a range that does not impair the effect of the active ingredient.
  • binders for example, binders (syrup, gum arabic, gelatin, sorbitol, tragacanth, polybulurpyrrolidone, etc.), fillers (lactose, sugar, corn starch, potato starch, calcium phosphate, sorbitol, glycine, etc.), lubricant (magnesium stearate) , Tanolec, polyethylene glycol, silica, etc.), disintegrants (various starches, etc.), and wetting agents (sodium lauryl sulfate, etc.).
  • the dosage of oral preparation (per day) is generally preferably such that the above-mentioned active ingredient can be taken from 0.1 to 1 kg of body weight of the subject of application (subject; patient); LOO mg. Is 0.5 to 50 mg, more preferably 1 to 10 mg.
  • the blending ratio of the active ingredient in the oral preparation is not limited, and can be set as appropriate in consideration of the number of administrations per day.
  • the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
  • the human TDP-43 gene (SEQ ID NO: 1) is located between the Not I site and the Apa I site downstream of the CMV promoter of the pRc-CMV vector (see Buratti et al., EMBO J., 2001 (supra)).
  • pRc-CMV-TDP-43 as a saddle type, the coding region of the human TDP-43 gene was amplified by PCR. The PCR was performed using the following primer set and the following reaction solution composition and reaction conditions.
  • Sterilized water appropriate amount (approx. 36 w L)
  • pcDNA3-TDP43 WT is a saddle type, and using the QuickChange Site-directed Mutagenesis Kit (Stratagene), TDP-43 nuclear translocation signal (NLS1, amino acid residue number: 78-84, see Figure 2) Deletion vector, nuclear translocation signal similar sequence (NLS2, amino acid residues: 187-192, see Figure 2), and a plasmid vector having a nucleotide sequence encoding both of these deletion variants Were produced respectively. The names and outlines of each vector are listed below. • pcDNA3-TDP43 WT:
  • NLS1 deletion mutant (amino acid residue number: 78-84 deleted) is encoded.
  • NLS2 deletion mutant (amino acid residue number: 187-192 deleted) is encoded.
  • a plasmid vector having a base sequence encoding a fusion protein of wild type TDP-43 or a part thereof and GFP was prepared. Specifically, first, using pcDNA3-TDP43 WT as a saddle type, all or a part of the base sequence encoding wild-type TDP-43 was amplified by PCR. The PCR was performed using one of the following primer sets with the following reaction solution composition and reaction conditions. Gu primer set>
  • PCR vector was prepared from chromosomal DNA derived from healthy human subjects using the PCR method, and the nucleotide sequence of the CFTR gene (GenBank accession number: NM—000492) (SEQ ID NO: 1).
  • Sterile water Appropriate amount (about 36 / L)
  • Neuroblastoma SH-SY5Y were cultured in 37 ° C, 5% C0 2 conditions Inkyubeta one with DMEM / F12 medium containing 10% calf serum.
  • Dobekuta one (p C DNA 3 system or pEGFP-based, 1 g) was introduced into SH-SY5Y cells using FuGENE6 transflector Ekushi Yon reagent (Roche 'die ⁇ Diagnostics stick, Inc.). FuGENE6, 3 times the total amount of plasmid, was mixed with the plasmid, allowed to stand at room temperature for 15 minutes, and then mixed with the cell solution. The cells were cultured for 2-3 days and used for cell lysate preparation or immunohistochemical staining. Observation with confocal laser microscope
  • Various expression vectors (1 / x g) were mixed with SH-SY5Y cells cultured on a cover glass and added in the presence of FuGENE6. After 2 days of culture, cells were fixed or treated with a protease inhibitor. In the protease inhibitor treatment, 20 ⁇ MG132 (proteasome inhibitor) or carbobenzoxy-leucyl-leucinal (zLL: calpain inhibitor) was added to the cells at a final concentration and cultured at 37 ° C for 6 hours. Cells were then fixed in 4% paraformaldehyde solution. The fixed cells were treated with 0.2% Triton X-100, blocked with 5% bovine serum albumin solution, and reacted with the primary antibody at 37 ° C for 1 hour.
  • protease inhibitor treatment 20 ⁇ MG132 (proteasome inhibitor) or carbobenzoxy-leucyl-leucinal (zLL: calpain inhibitor) was added to the cells at a final concentration and cultured at 37
  • the primary antibodies and fluorescently labeled secondary antibodies used are as follows. • Primary antibody:
  • anti-pS409 / 410 An antibody obtained by using a peptide in which both the 409th and 410th Ser residues of TDP-43 are phosphorylated as an antigen (an antibody that specifically binds to TDP-43 aggregate), 1: 500 dilution);
  • FITC-labeled anti-rabbit IgG anti-rabbit immunoglobulin, FITC-labeled, product number: F9887, Sigma, 1: 500 dilution
  • Rhodamine-labeled anti-mouse IgG anti-mouse immunoglobulin, TRITC-labeled, product number: T2402, Sigma, 1: 500 dilution
  • the anti-pS409 / 410 antibody of the primary antibody was prepared as follows. (i) Preparation of antigen
  • the peptide serving as an antigen has a sequence in which cysteine is added to the N-terminal of amino acid residues 405-414 in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of human TDP-43, and the serine residue. Peptides whose groups are phosphorylated
  • CMDSKS P0 3 H 2 S (P0 3 H 2 ) GWGM (SEQ ID NO: 19) was synthesized by a solid phase method (Sigma dienosis or thermoquest).
  • a solid phase method Sigma dienosis or thermoquest.
  • S (P0 3 H 2 ) represents phosphorylated serine.
  • a non-phosphorylated peptide (MDSKSSGWGM (SEQ ID NO: 20); amino acid residues No. 405-414 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2) was also synthesized for use in column preparation, control, and the like.
  • the above synthetic peptide was conjugated with Thyroglobulin or KLH according to a conventional method and used as an antigen.
  • 1 ml of 1 mg / ml antigen peptide saline solution containing antigen peptide and 1 ml of Freund's complete adjuvant (Difco) were combined and emulsified by sonication.
  • Usagi New Zealand white, body weight 2.5 kg, The female's back was immunized in several powers.
  • Two weeks after the first immunization 0.5 ml of a 1 mg / ml antigen peptide physiological saline solution and 1 ml of Freund's incomplete adjuvant were combined and boosted with sonication.
  • cystic fibrosis a causative gene for cystic fibrosis
  • regulator CFTR
  • Cos7 cells seeded in 6 well plates were mixed with 0.5 pSPL3-CFTRex9 and l // g of various TPD-43 expression vectors and added in the presence of FuGENE6. After culturing for 2 days, the cells were collected, samples were prepared according to the GIBCO BRL Exon Trapping System instruction manual, and analyzed by electrophoresis using 1.3% agarose gel. Inhibition of intracellular inclusion bodies by addition of low molecular weight compounds
  • the human neuroblastoma cell line SH-SY5Y was used as the cell.
  • pEGFP-TDP 162-414 GFP-TDP 162-414
  • pcDNA3 -TDP delta LSl & 2 TDP deltaNLS l & 2 was used to search for inhibitors of the above-mentioned inclusion body formation.
  • Candidate inhibitors were examined for methylene blue and dimebone. The treatment was started by adding methylene blue to DMSO and adding it to the culture solution so that the final concentrations were 0/2 M, 0.05 and 0.1 ⁇ M. On the other hand, dimebon was dissolved in sterilized water, and treatment was started by adding it to the culture solution so that the final concentrations were 0 ⁇ , 20 ⁇ ⁇ , and 60 / ⁇ ⁇ . In addition, the concentration of methylene blue was determined in advance by examining the concentration conditions in which there was no damage to cell growth.
  • TDP is green (vector-derived GFP) and phosphorylated TDP is red.
  • TDP deltaNLSl & 2 TDP deltaNLSl & 2
  • -anti-pS409 / 410 An antibody obtained by using a peptide in which Ser at the 409th and 410th amino acid residues of TDP-43 are both phosphorylated as an antigen and specific for TDP-43 aggregates. Binding antibody (made by the present inventor), 1: 500 dilution)
  • Phosphorylated TDP is confirmed as green and ubiquitin as red.
  • the laser output green was set so that only intracellular inclusions could be detected (Figs. 19 and 21).
  • pcDNA3-TDP deltaNLSl & 2 shows the intensity of phosphorylated TDP (green) and the intensity of TO-PRO-3 (blue), which indicates the number of cells, pEGFP-TDP 162-414 (GFP- TDP 162-414) Then, the intensity of TDP (green) and the intensity of TO-PRO-3 (blue), which indicates the number of cells, were calculated using LSM5 Pascal V 4.0 software (Carl Zeiss), respectively. The ratio of the number of inclusion body forming cells (green) (Cell with aggregates (%)) was determined and represented in a graph. The results are shown in FIGS. 20 and 22 (methylene blue X is a single agent treatment of dimebon) and FIGS. 23 and 24 (a combined treatment of methylene blue and dimebon).
  • NLS NLS is generally known as a sequence consisting of several residues of basic amino acids ( Figure 3).
  • the most well-known NLS is the SV40 T antigen sequence (PKKKRKV: SEQ ID NO: 21).
  • PKKRKV SEQ ID NO: 21
  • the TLS-43 amino acid sequence Fig. 2 shows the NLS sequence.
  • a search for As a result candidate sequences were found in two potential locations (Fig. 2: NLS1 and NLS2), and NLS candidate sequences (NLS1: 78-84 residues, NLS2: 187-192 residues) were identified to identify NLS.
  • Mutants (ANLS1 and ANLS2) that were deficient were prepared and transiently expressed in wild-type SH-SY5Y cells and observed with a confocal laser microscope (Fig. 3).
  • Fig. 4 wild-type expression was observed in the nucleus, but ANLS1 expression was observed in the cytoplasm, not in the nucleus.
  • ANLS2 expression was observed in the nucleus, but it was detected as a granular structure in the nucleus, unlike the wild type. From the above, it was found that the amino acid sequence of NLS1 (Fig. 2) is a nuclear translocation signal. However, it was also found that intracellular inclusion bodies were not formed by expression of any mutant, including the wild type.
  • the aforementioned phosphorylated TDP-43 specific antibody (anti-pS409 / 410) and anti-ubiquitin
  • the antibody (anti-Ubiquitin) was stained and observed with a confocal laser microscope.
  • a confocal laser microscope As a result, in the MG132 untreated sample, a granular structure in the nucleus positive for the anti-pS409 / 410 antibody was detected, but nothing was stained with anti-Ubiquitin (Fig. 6: left). .
  • plasmids for expressing various TDP-43 fragments were prepared and introduced into SH-SY5Y cells to express the fragments.
  • pcDNA3 The C-terminal fragment of TDP-43 up to residues 162-414 (pcDNA3-TDP ⁇ 161) was introduced into Kuta and transfected into cells with FuGENE6. After incubating at 37 ° C for 2 days, the cells were collected and analyzed for anti-TARDBP antibodies, but no expression was observed (data not shown). Therefore, when a fusion protein (GFP-TDP 162-414) in which a GFP tag was fused to the N-terminal side of the 162-414 residue fragment of TDP-43 was expressed in cells, its expression was recognized (Fig. 1 1).
  • plasmids encoding proteins in which wild-type TDP-43 and various TDP-43 fragments were fused to the C-terminal side of GFP were prepared (Fig. 9), and these were expressed in SH-SY5Y cells and anti- Staining with pS409 / 410 or anti-Ubiquitin antibody and confocal laser scanning microscopy were performed.
  • FIG. 16 A simple scheme is shown in Figure 16. As described above, a region containing an intron upstream of CFTR exon 9 was cloned from a normal healthy person and inserted into a pSPL3 vector to prepare a pSPL3-CFTR ex9 vector. This was expressed in cos7 cells together with various TDP-43 mutants or GFP fusions, mRNA was prepared from the expressed cells, and PCR analysis was performed.
  • GFP-TDP 162-414, GFP-TDP 218-414, and GFP-TDP 1-161 with intracellular inclusions were observed when the GFP fusion protein and pSPL3-CFTR ex9 were co-expressed.
  • the CFTR exon 9 skipping activity was not observed in these three types (Fig. 18).
  • the expression of the wild-type TDP-43 GFP fusion (GFP-TDP-43 WT) showed CFTR exon 9 skipping activity (Figure 18).
  • TDP-43 deletion mutants and GFP fusions did not have CFTR exon 9 skipping activity, and TDP-43 did not form intracellular inclusions. It was shown to be associated with its functional decline. This result contributed greatly to elucidation of the mechanism of TDP-43 formation of intracellular inclusions, and was thought to lead to the development of FTLD and ALS mechanisms and their therapeutics. Inhibition of TDP-43 cell inclusion body formation by low molecular weight compounds
  • a transformed cell that forms an intracellular inclusion body of TAR DNA-binding protein of 43 kDa (TDP-43) found in the brain of patients with neurodegenerative diseases such as FTLD and ALS.
  • TDP-43 TAR DNA-binding protein of 43 kDa
  • mutant TDP-43 proteins and TDP-43 protein fragments that are the main constituents of such TDP-43 intracellular inclusions can be provided.
  • the TDP-43 intracellular inclusions formed in the cell model provided by the present invention have very similar properties to the inclusion bodies found in the above patient brain, not only in size, It is positive for anti-phosphorylated TDP-43 antibody and anti-ubiquitin antibody.
  • the transformed cells of the present invention can be used for screening compounds or genes that suppress TDP-43 accumulation in the nucleus or cytoplasm, and for developing new therapeutic agents for neurodegenerative diseases such as FTLD and ALS.
  • the inventors of the present invention used a compound (methylene blue or dimebon) that suppresses TDP-43 cytoplasmic accumulation (formation of TDP-43 intracellular inclusions) using the transformed cells. ) Is also found to be extremely practical. Sequence listing free text
  • Sequence number 13 Synthetic DNA Sequence number 14: Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 19 phosphorylated synthetic peptide
  • SEQ ID NO: 19 Ser represents a phosphorylated serine residue (location: 6, 7).
  • Sequence number 20 Synthetic peptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)

Abstract

　本発明は、FTLD及びALS等の神経変性疾患の患者脳に見られる、TAR DNA-binding protein of 43 kDa（TDP-43）由来の細胞内封入体を形成する形質転換細胞（細胞モデル）を提供する。本発明の形質転換細胞は、宿主細胞において機能するプロモーター、及び変異型TDP-43遺伝子が導入されたものであることを特徴とする。

Description

明 細 書
TDP-43蓄積細胞モデル 技術分野
本発明は、 細胞内 （細胞質内又は核内） に TAR DNA-binding protein of 43 kDa (TDP-43) 由来の封入体 （凝集体） を形成する形質転換細胞、 すなわち TDP-43 蓄積細胞モデルに関する。 背景技術
アルツハイマー病やパーキンソン病などの多くの神経変性疾患では、 神経細胞 内に蓄積するタンパク質性の異常構造物が患者脳に見出されており、 その異常構 造物の形成が発症と密接に関連していると考えられている。 前頭側頭葉変性症
(FTLD) や筋萎縮性側索硬化症 （ALS) 等の神経変性疾患では、 患者脳の神経 細胞内にュビキチン陽性の封入体が出現し （図 1) 、 その出現部位と神経細胞の 脱落部位に相関が認められることから、 この細胞内封入体が出現することにより 神経細胞死が引き起こされ、 最終的に発症に至ると考えられている。 本発明者ら は、 最近の研究により、 FTLD や ALS 患者脳に見られる細胞内封入体の主要構 成成分として、 TAR DNA-binding protein of 43 kDa (TDP-43) とレ、ぅ核タンパク 質 した (Arai T et al., TDP-43 is a component of ubiquitin-positive tau-negative inclusions in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006, vol. 351(3), p. 602-611; Neumann M et al., Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis, Science, 2006, vol. 314(5796), p. 130-133) 。 TDP-43は、 核に局在するタ ンパク質で、 転写制御などに関与すると考えられているが （Buratti E et al.， Nuclear factor TDP-43 and SR proteins promote in vitro and in vivo CFTR exon 9 skipping, EMBO J., 2001, vol. 20(7), p. 1774-1784) 、 実際の機能については余りよ く分かっていない。
進行が非常に早い神経難病である ALS において、 家族性の占める割合は 5〜 10%程度であり、 その他大多数は弧発性であると推定されている。 家族性 ALS のうち、 約 20%が superoxide dismutase 1 (SODl ) の遺伝子異常を伴うケースで める (Deng HX et al.， Amyotrophic lateral sclerosis ana structural derects in Cu, Zn superoxide dismutase, 1993, Science, vol. 261, p. 1047-1051; Rosen DR et al.， Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis, 1993, Nature, vol. 362, p. 59-62) 。 SODlの異常と発症との関連について 様々な報告がなされているが、 一方で、 孤発性 ALS とは神経病理像が異なって いることも指摘されている。 すなわち、 孤発性 ALS 患者脳では TDP-43 陽性の 圭す入体力 ほほ全例に認められる力 s (Geser F et al.， Evidence of multisystem disorder in whole-brain map of pathological TDP-43 in amyotrophic lateral sclerosis, 2008， Arch. Neurol., vol. 65, p. 636-641; Nishihira Y et al, Sporadic amyotrophic lateral sclerosis: two pathological patterns shown by analysis of distribution of TDP-43 -immunoreactive neuronal and glial cytoplasmic inclusions, 2008, Acta. Neuropathol., vol. 1 16， p. 169- 182) 、 SODl 変異を有する家族性 ALS患者脳に認められるュビキチン陽性封入 体は、 抗 TDP-43抗体で染色されないのである （Mackenzie IR et al, Pathological TDP-43 distinguishes sporadic amyotropnic lateral sclerosis rrom amyotrophic lateral sclerosis with SODl mutations, 2007, Ann. Neurol., vol. 61, p. 427-434; Tan CF et al, TDP-43 immunoreactivity in neuronal inclusions in familial amyotrophic lateral sclerosis with or without SODl gene mutation, 2007, Acta. Neuropathol., vol. 113, p. 535-542) 。 これらの事実は、 SODl変異を有する家族性 ALSには、 その他の家族性 ALS及 び大多数の弧発性 ALS とは異なる発症メカニズムが存在することを示している。 上述した ALS 患者における TDP-43 遺伝子変異の発見を合わせて考慮すると、 大多数の ALS の発症過程において TDP-43 の異常が一次的な要因であり、 その 細胞内凝集と発症とは密接に関連していること考えられる。
したがって、 TDP-43 タンパク質がどのような機構によって細胞内で蓄積し、 細胞障害性を発揮するのかについて、 そのメカニズムを解明すること、 すなわち TDP-43 の細胞内封入体形成の機構やこの封入体による神経変性機構を解明する ことは、 ALS 及び FTLD の発症メカニズムの解明 （病因解明） だけでなく、 こ れらの治療薬及び治療方法等の開発にも大きく貢献できると考えられる。 発明の開示
そこで、 本発明が解決しょうとする課題は、 FTLD及び ALS等の神経変性疾患 の患者脳に見られる、 TAR DNA-binding protein of 43 kDa (TDP-43) 由来の細胞 内封入体 （凝集体） を形成する形質転換細胞を提供することにある。 また、 本発 明は、 当該形質転換細胞を用いた神経変性疾患の治療薬のスクリーニング方法や、 神経変性疾患の治療薬の副作用の検定方法を提供することも目的とする。 さらに、 本発明は、 神経変性疾患の治療及び 又は予防用医薬組成物を提供することも目 的とする。
本発明者は、 上記課題を解決するべく鋭意検討を行い、 FTLD 及び ALS の患 者脳に見られる TDP-43細胞内封入体を実験室レベルで再現する培養細胞の構築 に取り組んだ。
患者脳に見られる細胞内封入体では、 TDP-43は核内又は細胞質内に蓄積する (図 1 ) 。 本来核タンパク質である TDP-43が細胞質に蓄積するということは、 TDP-43が細胞内で局在変化することを意味する。 そこで、 本発明者は、 TDP-43 の核移行シグナルの同定を行い、 その欠損変異体 （変異型 TDP-43タンパク質） などを作製した。 また、 近年神経変性疾患との関連が指摘されているプロテアソ ームにも着目し、 変異型 TDP-43タンパク質の発現とプロテアソーム活性の阻害 処理とを組み合わせることにより、 結果的に、 核内および細胞質内に TDP-43封 入体を形成させることに成功した。 また、 患者脳に蓄積する TDP-43の特徴とし て、 TDP-43全長だけでなく、 TDP-43断片も界面活性剤に不溶性の画分に回収さ れることから、 本発明者はこの断片に着目 し、 各種 TDP-43断片と Green fluorescent protein (GFP) との融合タンパク質を発現させた。 その結果、 いくつ かの融合タンパク質の発現細胞において、 TDP-43細胞内封入体を形成させるこ とに成功した。 さらに、 本発明者は、 上述の TDP-43細胞內封入体を形成し得る 細胞を用いて当該封入体形成抑制効果を有する化合物を検索し、 実際に特定の低 分子化合物が当該効果を有することを見出した。 本発明は、 このようにして完成 されたものである。 すなわち、 本発明は以下の通りである。
( 1 ) 宿主細胞において機能するプロモーター、 及び変異型 TDP-43遺伝子が導 入された形質転換細胞。
本発明の形質転換細胞において、 変異型 TDP-43としては、 例えば、 細胞内封 入体形成活性を有するものが挙げられる。
また、 変異型 TDP-43としては、 例えば、 以下の （la) 〜 （Id) のタンパク質、 又は、 以下の （2a) 〜 （2d) のタンパク質が挙げられる。
(la) 野生型 TDP-43のアミノ酸配列において第 7 8番目〜第 8 4番目のァミノ 酸が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
( lb) 野生型 TDP-43のアミノ酸配列において第 1 8 7番目〜第 1 9 2番目の アミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
(lc) 野生型 TDP-43のアミノ酸配列において第 7 8番目〜第 8 4番目及び第 1 8 7番目〜第 1 9 2番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質 (Id) アミノ酸配列 （la) 、 (lb) 又は （lc) において 1若しくは数個のアミ ノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ細胞内封入体 形成活性を有するタンパク質
(2a) 野生型 TDP-43のアミノ酸配列のうちの第 1 6 2番目〜第 4 1 4番目のァ ミノ酸を含むァミノ酸配列からなるタンパク質
(2b) 野生型 TDP-43のァミノ酸配列のうちの第 2 1 8番目〜第 4 1 4番目の アミノ酸を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
(2c) 野生型 TDP-43のアミノ酸配列のうちの第 1番目〜第 1 6 1番目のァミノ 酸を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
(2d) アミノ酸配列 （2a) 、 (2b) 又は （2c) において 1若しくは数個のアミ ノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ細胞内封入体 形成活性を有するタンパク質
さらに、 変異型 TDP-43としては、 例えば、 CFTRェキソン 9スキッピング活性 を有しないものが挙げられる。
本発明の形質転換細胞としては、 例えば、 哺乳動物細胞の形質転換細胞が挙げ られ、 具体的には、 中枢神経系細胞、 末梢神経系細胞又は神経芽細胞が挙げられ る。
( 2 ) 上記 （1 ) に記載の細胞に候補物質を接触させて当該細胞の細胞活性を測 定し、 得られる測定結果を指標として、 神経変性疾患の治療薬、 及び変異型 TDP-43の細胞内封入体形成抑制剤をスクリ一二ングする方法。
本発明のスクリーニング方法において、 細胞活性としては、 例えば、 増殖能、 生存能、 並びに変異型 TDP-43の細胞内封入体の形成率、 細胞内形成数及び大き さが挙げられる。
また、 本発明のスク リーニング方法において、 神経変性疾患としては、 例えば、 前頭側頭葉変性症及び筋萎縮性側索硬化症が挙げられ、 特に TDP-43の細胞内封 入体の形成に伴う疾患 （TDP-43の細胞内蓄積に伴う疾患） が挙げられる。
( 3 ) 上記 （1 ) に記載の細胞に神経変性疾患の治療薬を接触させて当該細胞の 細胞活性を測定し、 得られる測定結果を指標として神経変性疾患の治療薬の副作 用を検定する方法。
本発明の副作用の検定方法において、 細胞活性としては、 例えば、 神経突起伸 張能、 増殖能及び生存能が挙げられる。
また、 本発明の副作用の検定方法において、 神経変性疾患としては、 例えば、 前頭側頭葉変性症及び筋萎縮性側索硬化症が挙げられ、 特に TDP-43の細胞内封 入体の形成に伴う疾患 （TDP-43の細胞内蓄積に伴う疾患） が挙げられる。
( 4 ) メチレンブルー及び/又はディメボンを含む、 神経変性疾患の治療及び/ 又は予防用医薬組成物。
本発明の医薬組成物において、 神経変性疾患としては、 例えば、 前頭側頭葉変 性症及び筋萎縮性側索硬化症が挙げられ、 特に TDP-43の細胞内封入体の形成に 伴う疾患 （TDP-43の細胞内蓄積に伴う疾患） が挙げられる。 図面の簡単な説明
図 1は、 FTLD又は ALS患者脳に見られる TDP-43細胞内封入体を示す図である。 左図が核内、 右が細胞質内に形成された封入体である。
図 2は、 野生型 TDP-43のアミノ酸配列 （配列番号 2 ) を示す図である。 核移 行シグナル配列 （NLS1) および核移行シグナル類似配列 （NLS2) の部分に下線 を付した。 なお、 実施例中に記載の 「アミノ酸残基番号」 は、 すべてこの図 2 ( 又は配列番号 2 ) に示されるアミノ酸配列の N末端からのアミノ酸残基の位置及 びアミノ酸配列領域を示すものである。 また、 所定のアミノ酸配列をコードする 塩基配列がどれであるかは、 配列番号 1に示される塩基配列 （アミノ酸配列も併 記） を参照することで特定することができる。
図 3は、 TDP-43核移行シグナル （NLS) 同定の方法を示した模式図である。 図 4は、 各種 TDP-43を発現した細胞を共焦点レーザー顕微鏡により観察した 結果を示す図である。
図 5は、 各種 TDP-43の発現細胞に対するプロテアソーム阻害剤 （MG132) 処 理の有無の効果を示す図である。 市販の抗体 （anti-TA DBP) による染色像であ る。
図 6は、 ANLS1発現細胞に対するプロテアソーム阻害剤 （MG132) 処理の有 無の効果を示す図である。 抗リン酸化 TDP-43抗体 （anti-pS409/410) および抗ュ ビキチン抗体 （anti-Ubiquitin) による染色像である。
図 7は、 ANLS2発現細胞に対するプロテアソーム阻害剤 （MG132) 処理の有 無の効果を示す図である。 抗リン酸化 TDP-43抗体 （anti-pS409/410) および抗ュ ビキチン抗体 （anti-Ubiquitin) による染色像である。
図 8は、 ANLS1&2発現細胞に対するプロテアソーム阻害剤 （MG132) 処理の 有無の効果を示す図である。 抗リン酸化 TDP-43抗体 （anti-pS409/410) および抗 ュビキチン抗体 （anti-Ubiquitin) による染色像である。
図 9は、 GFPが融合した野生型 TDP-43および各種 TDP-43断片の模式図である。 図 1 0は、 GFPおよび GFP-TDP-43 WT発現細胞の共焦点レーザー顕微鏡によ る観察結果を示す図である。 GFPの蛍光および anti-Ubiquitinによる染色像である。 図 1 1は、 GFP-TDP 162-414発現細胞の共焦点レーザー顕微鏡による観察結果 を示す図である。 GFPの蛍光および anti-pS409/410または anti-Ubiquitinによる染色 像である。
図 1 2は、 GFP-TDP 218-414発現細胞の共焦点レーザー顕微鏡による観察結果 を示す図である。 GFPの蛍光および anti-pS409/410または anti-Ubiquitinによる染色 像である。 図 1 3は、 GFP-TDP 274-414および GFP-TDP 315-414発現細胞の共焦点レーザ 一顕微鏡による観察結果を示す図である。 GFPの蛍光および anti-Ubiquitinによる 染色像である。
図 1 4は、 GFP-TDP 1-161および GFP-TDP 1-217発現細胞の共焦点レーザー顕 微鏡による観察結果を示す図である。 GFPの蛍光および anti-Ubiquitinによる染色 像である。
図 1 5は、 GFP-TDP 1-273および GFP-TDP 1-314発現細胞の共焦点レーザー顕 微鏡による観察結果を示す図である。 GFPの蛍光および anti-Ubiquitinによる染色 像である。
図 1 6は、 CFTRェキソン 9スキッピングアツセィの方法を示す模式図である。 図 1 7は、 CFTRェキソン 9スキッピングアツセィの結果を示す図である。
図 1 8は、 CFTRェキソン 9スキッピングアツセィの結果を示す図である。
図 1 9は、 低分子化合物 （メチレンブル一） による TDP-43細胞内封入体形成 の抑制効果について、 共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を示す図である。 上 段は TDP-43 deltaNLSl&2についての結果であり、 下段の 3つは、 GFP-TDP 162- 414についての結果である。
図 2 0は、 低分子化合物 （メチレンブルー） による TDP-43細胞内封入体形成 の抑制効果について、 封入体形成細胞の割合を定量測定した結果を示す図である。 左のグラフは TDP-43 deltaNLSl&2についての結果であり、 右のグラフは、 GFP- TDP 162-414についての結果である。 グラフの横軸は、 メチレンブルー及びディ メボンの濃度であり、 縦軸は、 TDP-43細胞内封入体形成細胞の割合である。
図 2 1は、 低分子化合物 （ディメボン） による TDP-43細胞内封入体形成の抑 制効果について、 共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を示す図である。
図 2 2は、 低分子化合物 （ディメボン） による TDP-43細胞内封入体形成の抑 制効果について、 封入体形成細胞の割合を定量測定した結果を示す図である。 左 のグラフは TDP-43 deltaNLSl&2 についての結果であり、 右のグラフは、 GFP- TDP 162-414についての結果である。 グラフの横軸は、 メチレンブルー及びディ メボンの濃度であり、 縦軸は、 TDP-43細胞内封入体形成細胞の割合である。
図 2 3は、 低分子化合物 （メチレンブルー及びディメボン） による、 TDP-43 deltaNLSl&2 に対する TDP-43 細胞内封入体形成の抑制効果について、 TDP-43 細胞内封入体形成細胞の割合を定量測定した結果を示す図である。 グラフの横軸 は、 メチレンブルー及びディメボンの濃度であり、 縦軸は、 TDP-43 細胞内封入 体形成細胞の割合である。
図 2 4は、 低分子化合物 （メチレンブルー及びディメボン） による、 GFP- TDP 162-414に対する TDP-43細胞内封入体形成の抑制効果について、 TDP- 43細胞 内封入体形成細胞の割合を定量測定した結果を示す図である。 グラフの横軸は、 メチレンブルー及びディメボンの濃度であり、 縦軸は、 TDP-43細胞内封入体形 成細胞の割合である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。 本発明の範囲はこれらの説明に拘束されるこ とはなく、 以下の例示以外についても、 本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変 更し実施することができる。 なお、 本明細書は、 本願優先権主張の基礎となる特 願 2008-101899号明細書の全体を包含する。 また、 本明細書において引用された 全ての先行技術文献および公開公報、 特許公報その他の特許文献は、 参照として 本明細書に組み入れられる。
1 . 本発明の概要
アルツハイマー病などの多くの神経変性疾患では、 神経細胞内にュビキチン陽 性のタンパク質封入体が形成される。 前頭側頭葉変性症 （Frontotemporal lobar degeneration： FTLD) や、 筋妻縮' I"生彻 j索硬 ^(匕症 (amyotrophic lateral sclerosis： ALS) 等の神経変性疾患では、 これまで、 患者脳に特徴的に認められるュビキチ ン陽性封入体の主要構成成分が明らかとなっていなかつたが、 最近の研究により、 TAR DNA-binding protein of 43 kDa (TDP-43) とレ、う特定の核内タンパク質が上 記封入体の主要構成成分として同定された （Arai T et al.， TDP-43 is a component of ubiquitin-positive tau-negative inclusions in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006, vol. 351(3), p. 602-611 ; Neumann M et al., Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis, Science, 2006, vol. 314(5796), p. 130-133) 0 TDP-43 は、 不均一核内リボ核酸タンノ ク質 (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein； hnRNP) の一種であり、 核に局在し、 RNAや他の hnRNPと結合して、 RNAの安 定化ゃ選択的スプライシング、 転写調節などのプロセスに関与するタンパク質で あると考えられている （Buratti E et al., Nuclear factor TDP-43 and SR proteins promote in vitro and in vivo CFTR exon 9 skipping, EMBO J., 2001, vol. 20(7), p. 1774- 1784) 。 しかしながら、 どのようなメカニズムで TDP-43が神経細胞内で蓄積す るのか、 蓄積した TDP-43に細胞毒性はあるか、 及びどのようなメカニズムで細 胞死が誘導されるのか、 などといった点は、 全く明らかになっていなかった。 本発明者は、 これらの点の解明には、 培養細胞等を用いた TDP-43蓄積細胞モ デルが必要であると考え、 そのようなモデル系の開発に取り組んだ。 その結果、 種々の変異体 （変異型 TDP-43タンパク質） や TDP-43タンパク質の断片を含む融 合タンパク質を細胞に発現させ、 場合によってはその細胞にプロテアソーム阻害 処理を行うことにより、 細胞内に TDP-43封入体を形成させ、 TDP-43を蓄積させ ることに成功した。
このモデル系を用いることにより、 細胞内 TDP-43蓄積を抑制する薬剤や遺伝 子等のスクリーニングが可能となり、 またトランスジエニック動物の作製にも利 用できると考えられ、 FTLDや ALSの新たな治療薬及び治療方法の開発に極めて 有用なものであると考えられる。
2 . 形質転換細胞 （細胞モデル）
本発明の形質転換細胞は、 宿主細胞において機能するプロモーター、 変異型 TDP-43遺伝子が導入された細胞 （以下、 「変異型 TDP-43形質転換細胞」 と言う ことがある。 ） である。 本発明の形質転換細胞は、 細胞内 （細胞質内又は核内） 封入体の主要構成成分となる変異型 TDP-43を発現するものであり、 FTLDや ALS 等の神経変性疾患の細胞モデルとして有用なものである。
( 1 ) 形質転換細胞の作製方法の概要 通常、 所望の宿主細胞において外来の目的タンパク質 （本発明では変異型 TDP-43) を過剰発現させるためには、 まず、 目的タンパク質遺伝子を発現べク ターに組み込んだ組換えベクターを構築することが必要である。 この際、 発現べ クタ一に組込む遺伝子には、 予め、 宿主細胞において機能するプロモーターを連 結しておくことが好ましく、 そのほか、 Kozak配列、 ターミネータ一、 ェンハン サー、 スプライシングシグナル、 ポリ A付加シグナル、 及び選択マーカー等を連 結しておくこともできる。 なお、 上記プロモーター等の遺伝子発現に必要な各要 素は、 初めから目的タンパク質遺伝子に含まれていてもよいし、 もともと発現べ クタ一に含まれている場合はそれを利用してもよく、 特に限定はされない。
発現ベクターに目的タンパク質遺伝子を組込む方法としては、 例えば、 制限酵 素を用いる方法や、 トポイソメラ一ゼを用いる方法など、 公知の遺伝子組換え技 術を利用した各種方法が採用できる。 また、 発現ベクターとしては、 例えば、 プ ラスミ ド DNA、 /くクテリオファージ DNA、 レトロ トランスポゾン DNA、 レトロ ウィルスベクター、 人工染色体 DNAなど、 特に限定はされず、 使用する宿主細胞 に適したベクターを適宜選択して使用することができる。
次いで、 構築した組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を得、 これ を培養することにより、 目的タンパク質を発現させることができる。 なお、 本発 明で言う 「形質転換」 とは、 宿主細胞に外来遺伝子を導入することを意味し、 具 体的には、 宿主細胞にプラスミ ド DNA等を導入して （形質転換） 外来遺伝子を 導入すること、 及び、 宿主細胞に各種ウィルス及びファージを感染させて （形質 導入） 外来遺伝子を導入することをいずれも含む意味である。
宿主細胞としては、 組換えベクターが導入された後、 目的タンパク質を発現す ることができるものであれば、 特に限定はされず、 適宜選択することができ、 例 えば、 ヒ ト、 マウス及びラット等の各種哺乳動物由来の動物細胞や、 場合によつ ては酵母細胞などを用いることもできる。 当該動物細胞としては、 例えば、 ヒ ト 繊維芽細胞、 CHO細胞、 サル細胞 COS-7、 Vero、 マウス L細胞、 ラッ ト GH3、 ヒ ト FL細胞、 神経芽細胞、 中枢神経系細胞及び末梢神経系細胞等を用いることが でき、 本発明においては、 特に神経芽細胞、 中枢神経系細胞及び末梢神経系細胞 等の神経細胞が好ましい。 一方、 酵母としては、 限定はされないが、 例えば、 サ ッカロミセス .セレビシェ {Saccharomyces cerevisiae) 、 シゾサッカロミセス · ボンべ {Schizosaccharomyces pombe) 等が好ましく挙げられる。
形質転換細胞を得る方法、 すなわち組換えベクターを宿主細胞に導入する方法 としては、 特に限定はされず、 宿主細胞と発現ベクターとの種類の組み合わせを 考慮して、 適宜選択することができるが、 例えば、 リボフヱクシヨン法、 電気穿 孔 （エレク ト口ポレーシヨン） 法、 ヒートショ ック法、 PEG法、 リン酸カルシゥ ム法、 DEAEデキス トラン法、 並びに、 DNAウィルスや RNAウィルス等の各種ゥ ィルスを感染させる方法などが好ましく挙げられる。
得られる形質転換細胞においては、 組換えべクタ一に含まれる遺伝子のコドン 型は、 実際に用いた宿主細胞のコドン型と一致していてもよいし、 異なっていて もよく、 限定はされない。
以上に概要を述べた、 形質転換細胞の作製方法は、 本発明の形質転換細胞 （変 異型 TDP-43形質転換細胞） の作製においても任意に適用できる。 ( 2 ) 変異型 TDP-43形質転換細胞
本発明の形質転換細胞において、 目的タンパク質である変異型 TDP-43の発現 態様は、 宿主細胞において安定発現する態様であってもよいし、 一過性発現する 態様であってもよく、 特に限定はされない。 ここで、 本発明でいう 「安定発現」 とは、 宿主細胞の染色体内に組み込まれた遺伝子 （染色体内遺伝子） に基づく恒 常的な発現を意味し、 一方、 「一過性発現」 とは、 宿主細胞内の染色体に組み込 まれていない遺伝子 （プラスミ ド等の染色体外遺伝子） に基づく非恒常的な発現 を意味する。
本発明の形質転換細胞において、 宿主細胞としては、 限定はされないが、 哺乳 動物細胞がより好ましい。 哺乳動物細胞としては、 ヒ ト由来細胞であっても非ヒ ト由来細胞であってもよく、 限定はされない。 非ヒ ト動物としては、 例えば、 マ ウス、 ラッ ト、 モルモッ ト、 ゥサギ、 ラビッ ト、 ブタ、 ィヌ、 ネコ、 サル、 ヒッ ジ、 ゥシ及びゥマ等の哺乳類動物が好ましく挙げられ、 中でも、 マウス、 ラット 及びモルモッ ト等の齧歯類 （ネズミ目） 動物がより好ましく、 特に好ましくはマ ウス及びラットである。 また、 動物細胞の細胞種としては、 限定はされないが、 神経芽細胞、 中枢神経系細胞、 末梢神経系細胞等が特に好ましい。
宿主細胞に目的タンパク質遺伝子 （変異型 TDP-43遺伝子） を導入するには、 前述したように、 通常、 これら遺伝子を含む組換えベクターを用いるが、 この際、 宿主細胞内で安定発現させる場合は、 染色体 DNAと組換え可能な公知の発現べ クタ一 （安定発現ベクター） を用いることが好ましく、 一過性発現をさせる場合 は、 染色体 DNAとの組換えがなく細胞内で自立複製が可能な公知の発現べクタ 一 （一過性発現ベクター） を用いることが好ましい。 なお、 安定発現又は一過性 発現をさせる場合に用いるベクターとしては、 安定発現べクタ一と一過性発現べ クタ一との両方の機能を有するベクターを適宜用いてもよい。 安定発現ベクター は、 動物細胞用のものとして、 例えば、 pCEP4ベクター及び pTargetベクターなど の公知のベクターを用いることができ、 酵母細胞用のものとして、 公知の各種べ クタ一を用いることができる。 また、 一過性発現ベクターは、 動物細胞用のもの として、 例えば、 pcDNA3.1ベクター、 pcDNA3(+)ベクター、 pcDNA3(-)ベクター、 pEGFP-Clベクター （GFP (詳しくは EGFP)融合タンパク質発現用ベクター） 、 pCEP4ベクタ一、 及び pTargetベクターなどの公知のベクターを用いることができ、 酵母細胞用のものとして、 公知の各種ベクターを用いることができる。
なお、 上記各種発現ベクターとしては、 宿主細胞において機能するプロモータ —を含むものを公知のものから適宜選択して利用し、 当該プロモーターにより宿 主細胞における目的タンパク質遺伝子の発現制御を行うようにする。 宿主細胞に おいて機能するプロモーターの制御下にある変異型 TDP-43遺伝子を導入するこ とができる発現ベクターが好ましい。 ここで、 「プロモーターの制御下にある」 とは、 当該プロモーターが機能して変異型 TDP-43遺伝子が宿主細胞において発 現され得るように、 すなわち、 当該プロモーターがこれら遺伝子に作用可能なよ うに、 連結されたものであることを意味する。
具体的に、 中枢神経系細胞において機能するプロモーターとしては、 限定はさ れないが、 例えば、 Thy-1プロモータ一 （脳特異的） 、 Neuron-Specific Enolaseプ 口モーター （脳特異的） 及び Ταΐプロモーター （脳特異的） 及びプリオンプロモ 一ター （脳特異的） 等の中枢神経細胞用プロモーター、 並びに、 グリア細胞など 中枢神経系に存在し得る各種細胞用の公知のプロモーターが挙げられる。 中枢神 経系細胞において機能するプロモーターは、 中枢神経細胞用プロモーターとして の機能と、 中枢神経系に存在し得る各種細胞用プロモーターとしての機能とを両 方有するものであってもよい。 また、 末梢神経系細胞において機能するプロモー ターとしては、 限定はされず、 末梢神経細胞用の公知のプロモーター、 及び末梢 神経系に存在し得る各種細胞用の公知のプロモーターが挙げられる。 末梢神経細 胞用の公知のプロモーターとしては、 中枢神経細胞用プロモーターとして上記列 挙したものを同様に使用することができ、 また末梢神経系に存在し得る各種細胞 用の公知のプロモーターとしては、 中枢神経系に存在し得る各種細胞用の公知の プロモーターが同様に使用することができる。 末梢神経系細胞において機能する プロモーターは、 末梢神経細胞用プロモーターとしての機能と、 末梢神経系に存 在し得る各種細胞用プロモーターとしての機能とを両方有するものであってもよ レ、。 さらに、 神経芽細胞において機能するプロモーターとしては、 例えば、 CMVプロモーター等の公知のプロモーターが挙げられる。
発現ベクターに挿入する変異型 TDP-43遺伝子は、 例えば、 以下の通り作製す ることができる。
具体的には、 まず、 ヒ トの cDNA遺伝子ライブラリーから PCR等の方法によ り野生型 TDP-43遺伝子断片を得て、 この遺伝子断片を用いて野生型 TDP-43遺 伝子をスクリーニングする。 野生型 TDP-43遺伝子には、 必要により、 ェピトー プタグ等をコードする DNA を連結しておいてもよい。 スクリーニングした野生 型 TDP-43遺伝子は、 組換え DNA技術を用いて、 適当なプラスミ ドベクターに 挿入しておいてもよい。 あるいは、 上記スクリーニングをする代わりに、 予め野 生型 TDP-43遺伝子が挿入された市販のプラスミ ドベクターを使用してもよレ、。 野生型ヒ ト TDP-43遺伝子の塩基配列情報 （配列番号 1 ) は、 公知のデータべ ースから容易に入手することができ、 例えば、 米国生物工学情報センター （ National Center for Biotechnology Information ( NCBI ) , ウェブサイ ト ： http://www.ncbi.nlm.nih.gov) により提供される GenBankデータベースにおいて 「 ァクセッション番号： NM_007375」 として公表されている。 配列番号 1におい て、 野生型ヒ ト TDP-43のコード領域 （CDS) は第 135番目〜第 1379番目であるた め、 配列番号 1に示す全長配列の代わりに上記コード領域を使用することも可能 である。
次いで、 野生型 TDP-43遺伝子の塩基配列に変異を加えて、 変異型 TDP-43をコ 一ドする変異型 TDP-43遺伝子を得る。 ここで、 本発明でいう変異型 TDP-43とは、 細胞内封入体形成活性を有するタンパク質を意味する。 「細胞內封入体形成活性 」 とは、 自己、 すなわち変異型 TDP-43同士が主要構成成分となって互いに凝集 し、 細胞内 （細胞質内又は核内） において封入体を形成する活性 （例えば、 封入 体の形成率、 細胞内形成数及び大きさ） を意味し、 本来凝集して封入体を形成し にくい野生型 TDP-43に比べて、 変異型 TDP-43同士の凝集の程度が高いと認めら れる物性であればよい。
本発明でいう変異型 TDP-43としては、 具体的には、 以下の （la) 〜 （Id) の タンパク質が好ましく挙げられる。
( la) 野生型 TDP- 43のアミノ酸配列 （配列番号 2 ； GenBankデータベース 「ァ クセッション番号： NM_031214」 ) において第 7 8番目〜第 8 4番目のアミノ酸 が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
(lb) 野生型 TDP-43のアミノ酸配列 （配列番号 2 ) において第 1 8 7番目〜第
1 9 2番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
(lc) 野生型 TDP-43のアミノ酸配列 （配列番号 2 ) において第 7 8番目〜第 8 4番目及び第 1 8 7番目〜第 1 9 2番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列から なるタンパク質
(Id) アミノ酸配列 （la) 、 (lb) 又は （lc) において 1若しくは数個 （好ま しくは 1個〜 1 0個程度、 より好ましくは 1個〜 5個程度） のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたァミノ酸配列からなり、 かつ細胞内封入体形成活性を有 するタンパク質
また、 本発明でいう変異型 TDP-43としては、 以下の （2a) 〜 （2d) のタンパ ク質も具体例として好ましく挙げられる。
(2a) 野生型 TDP-43のアミノ酸配列 （配列番号 2 ) のうちの第 1 6 2番目〜第 4 1 4番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
(2b) 野生型 TDP-43のアミノ酸配列 （配列番号 2 ) のうちの第 2 1 8番目〜第 4 1 4番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列からなるタンパク質 (2c) 野生型 TDP-43のァミノ酸配列 （配列番号 2 ) のうちの第 1番目〜第 1 6 1番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
(2d) アミノ酸配列 （2a) 、 (2b) 又は （2c) において 1若しくは数個 （好ま しくは 1個〜 1 0個程度、 より好ましくは 1個〜 5個程度） のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ細胞内封入体形成活性を有 するタンパク質
ここで、 上記 （2a) 〜 （2d) のタンパク質は、 野生型 TDP-43の断片を含むも のであると言えるが、 当該断片のみからなるタンパク質であってもよいし、 他の タンパク質 （例えば GFP等のレポータータンパク質） との融合タンパク質であつ てもよく、 限定はされない。 なお、 当該融合タンパク質をコードする遺伝子の構 築は、 公知の塩基配列情報及び遺伝子組換え技術により当業者であれば容易に行 うことができる。
本発明でいう変異型 TDP-43は、 嚢胞性線維症の原因遺伝子である嚢胞性線維 ¾EB莫貫通調 因子 (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator： CFTR) 遺 伝子 （配列番号 1 6 ； GenBankァクセッション番号： NM— 000492) のェキソン 9 のスキッピング活性を有しないものであることが好ましい。 従来より、 野生型 TDP-43の機能として、 CFTRェキソン 9をスキップさせる活性が報告されている が (Buratti E et al., EMBO J., 2001 (前掲) ) 、 本発明でいう変異型 TDP-43、 特に 上記 （la) 〜 （Id) 及び （2a) 〜 （2d) のタンパク質は、 当該スキッピング活性 を有しないため、 TDP-43による細胞内封入体形成と、 TDP-43の機能低下との関 連性は高いものと言える。 なお、 配列番号 1 6に示される CFTR遺伝子 （ NM— 000492) の塩基配列においては、 ェキソン 1 0領域が、 "Buratti E et al., EMBO J., 2001 (前掲） " でいぅェキソン 9領域に対応するものとなる。 従って、 本願明細書でいう 「ェキソン 9のスキッピング活性」 とは、 便宜上、 "Buratti E et al., EMBO J., 2001 (前掲） " での表記 （名称） を同様に使用したものであり、 配列番号 1 6に示される塩基配列を基準にする場合は、 実質的には、 「ェキソン 1 0のスキッピング活性」 を意味することとなる。 この点については、 本願明細 書、 特許請求の範囲、 図面の記載のすべてにおいて同様に解釈されるものとする。 なお、 上記ェキソン 1 0は、 配列番号 1 6に示される塩基配列中の第 1342番目〜 第 1524番目の塩基からなる塩基配列である。
上記の変異型 TDP-43をコードする遺伝子 （変異型 TDP-43遺伝子） は、 例えば、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) 等に 記載の部位特異的変位誘発法に準じて調製することができる。 具体的には、 Kunkel法や Gapped duplex法等の公知手法により、 部位特異的突然変異誘発法を 利用した変異導入用キットを用いて調製することができ、 当該キットとしては、 例えば、 QuickChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit (ストラタジーン社製） 、 GeneTailor™ Site-Directed Mutagenesis System (インビ トロジェン社製） 、 TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-KN Mutan-Super Express Km等： タカラバイオ社製） 等が好ましく挙げられる。
また、 変異型 TDP-43遺伝子は、 後述する実施例に記載のように、 野生型 TDP- 43をコードする塩基配列を含む DNA等をテンプレートとして、 当該遺伝子を増 幅するためのプライマーを設計し、 適当な条件下で PCRを行うことにより、 調製 することもできる。 PCRに用いる DNAポリメラーゼは、 限定はされないが、 正確 性の高い DNAポリメラーゼであることが好ましく、 例えば、 Pwo DNAポリメラー ゼ （ロシュ 'ダイァグノスティックス） 、 Pfu DNAポリメラーゼ （プロメガ） 、 プラチナ Pfk DNAポリメラーゼ （ィンビトロジェン） 、 KOD DNAポリメラ一ゼ （ 東洋紡） 、 KOD-plus-ポリメラーゼ （東洋紡） 等が好ましい。 PCRの反応条件は、 用いる DNAポリメラーゼの最適温度、 合成する DNAの長さや種類等により適宜設 定すればよいが、 例えば、 サイクル条件であれば 「90〜98°Cで 5〜30秒 （熱変性 - 解離） →50〜65°Cで 5〜30秒 （アニーリング） →65〜80°Cで 30〜1200秒 （合成 .伸 長） 」 を 1サイクルとして合計 20〜200サイクル行う条件が好ましい。
さらに本発明においては、 上記のようにして得られた変異型 TDP-43遺伝子の 塩基配列またはそのコ一ド領域の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェン トな条件下でハイブリダィズし、 かつ、 細胞内封入体形成活性を有するタンパク 質をコードする遺伝子を使用することもできる。 「ストリンジエントな条件」 と しては、 例えば、 ハイブリダィゼーシヨンにおいて洗浄時の塩濃度が 100〜 900mM、 好ましくは 100〜300mMであり、 温度が 50〜70°C、 好ましくは 55〜65°C の条件が挙げられる。 ハイブリダィゼーシヨン法の詳細な手順については、 「 Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」 (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、 「Current Protocols in Molecular BiologyJ (John Wiley & Sons (1987- 1997) )等を参照することができる。 ハイブリダィズする DNAとしては、 その相 補配列に対して少なくとも 50%以上、 好ましくは 70%、 さらに好ましくは 80%、 より一層好ましくは 90% (例えば、 95%以上、 さらには 99%)の同一性を有する塩 基配列を含む DNAが挙げられる。
本発明の形質転換細胞は、 変異型 TDP-43を発現することを特徴とするが、 発 現をするクローンの選択や、 目的タンパク質の発現の検出及び定量は、 ゥエスタ ンブロット法等の公知の方法により行うこともできる。
本発明の形質転換細胞は、 変異型 TDP-43を発現することのみで、 その細胞内 (細胞質内又は核内） 封入体を形成し得るものであるが、 場合によっては、 変異 型 TDP-43を発現させた細胞をプロテアソーム阻害剤で処理することにより、 当 該封入体の形成が認められるものも含まれる。 本発明において使用されるプロテ ァソーム阻害剤としては、 限定はされないが、 例えば、 MG132、 ラクタシスチ ン、 IEAL、 MG115などが挙げられる。
本発明の形質転換細胞は、 ヒ トの FTLD又は ALS等の神経変性疾患の患者脳に 見られる細胞内 （細胞質内又は核内） 封入体に酷似した封入体が形成されたもの が好ましく、 これら神経変性疾患の治療薬や治療方法を開発するための細胞モデ ルとして極めて有用なものである。
3 . 神経変性疾患の治療薬等のスクリ一二ング方法
本発明においては、 前記 2 .項に記載した形質転換細胞を用いた神経変性疾患 の治療薬のスクリーニング方法、 並びに当該方法により得られる神経変性疾患の 治療薬を提供することもできる。 当該スクリーニング方法は、 詳しくは、 本発明 の形質転換細胞に候補物質を接触させて当該細胞の細胞活性を測定し、 得られる 測定結果を指標として神経変性疾患の治療薬をスクリーニングするというもので ある。 当該スクリーニング方法において、 神経変性疾患としては、 限定はされな レ、が、 例えば、 前頭側頭葉変性症、 筋萎縮性側索硬化症、 アルツハイマー病、 パ 一キンソン病、 ハンチントン舞踏病及びプリオン病等が挙げられるが、 特に TDP-43の細胞内封入体の形成に伴う疾患 （TDP-43の細胞内蓄積に伴う疾患） が 好ましく挙げられる。
ここで、 本発明の形質転換細胞の細胞活性としては、 限定はされず、 該形質転 換細胞の機能及び特性等に関わる種々の活性を挙げることができる。 種々の活性 の測定方法は、 公知の方法が採用できる。 上記スクリーニング方法においては、 測定対象とする細胞活性が、 例えば、 神経突起伸張能、 生存能、 増殖能、 並びに 変異型 TDP-43細胞内封入体の形成率、 細胞内形成数及び大きさ （変異型 TDP-43 細胞内封入体形成活性） 等であることが好ましい。
例えば、 本発明の形質転換細胞が、 脳神経細胞等の各種神経細胞や神経芽細胞 に由来するものであるときは、 これら形質転換細胞に候補物質を接触させた場合 に、 神経突起伸張能の測定結果が、 候補物質を接触させない細胞と比較して、 高 い伸長率 （伸長速度） を有すると評価できれば、 候補物質を神経変性疾患の治療 薬として選択することができる。
また、 本発明の形質転換細胞に候補物質を接触させた場合に、 増殖能の測定結 果が、 候補物質を接触させない細胞と比較して、 高い増殖率 （増殖速度） を有す ると評価できれば、 候補物質を神経変性疾患の治療薬として選択することができ る。 同様に、 本発明の形質転換細胞に候補物質を接触させた場合に、 生存能の測 定結果が、 候補物質を接触させない細胞と比較して、 長い寿命又は高い生存率を 有すると評価できれば、 候補物質を神経変性疾患の治療薬として選択することが できる。
さらに、 本発明の形質転換細胞に候補物質を接触させた場合に、 変異型 TDP- 43を主要構成成分とする細胞内封入体の形成率 (細胞個数基準） の測定結果が、 候補物質を接触させない細胞と比較して、 形成率が低いと評価できれば、 候補物 質を神経変性疾患の治療薬として選択することができる。 同様に、 本発明の形質 転換細胞に候補物質を接触させた場合に、 細胞あたりの上記細胞内封入体の形成 数の測定結果が、 候補物質を接触させない細胞と比較して、 個数が少ないと評価 できれば、 候補物質を神経変性疾患の治療薬として選択することができる。 また 同様に、 本発明の形質転換細胞に候補物質を接触させた場合に、 上記細胞内封入 体の大きさに関する測定結果が、 候補物質を接触させない細胞と比較して、 初め から小さいか又はそれ以上大きくなりにくいと評価できれば、 候補物質を神経変 性疾患の治療薬として選択することができる。
一方、 本発明は、 前記 2 .項に記載した形質転換細胞を用いた変異型 TDP-43細 胞内封入体形成抑制剤のスクリ一二ング方法、 並びに当該方法により得られる変 異型 TDP-43細胞内封入体形成抑制剤を提供することもできる。 当該スクリー二 ング方法は、 詳しくは、 本発明の形質転換細胞に候補物質を接触させて当該細胞 内における上記封入体形成活性 （実質的には、 当該形成の抑制活性） を測定し、 得られる測定結果を指標として変異型 TDP-43細胞内封入体形成抑制剤をスクリ 一二ングするというものである。 当該スク リーニング方法において、 変異型
TDP-43細胞内封入体形成活性は、 細胞内封入体の形成率、 細胞内形成数及び大 きさ等を基準にして測定されるものであることが好ましい。
本発明の形質転換細胞に候補物質を接触させた場合に、 変異型 TDP-43を主要 構成成分とする細胞内封入体の形成率 （細胞個数基準） の測定結果が、 候補物質 を接触させない細胞と比較して、 形成率が低いと評価できれば、 候補物質を当該 封入体形成抑制剤として選択することができる。 同様に、 本発明の形質転換細胞 に候補物質を接触させた場合に、 細胞あたりの上記細胞内封入体の形成数の測定 結果が、 候補物質を接触させない細胞と比較して、 個数が少ないと評価できれば、 候補物質を当該封入体形成抑制剤として選択することができる。 また同様に、 本 発明の形質転換細胞に候補物質を接触させた場合に、 上記細胞内封入体の大きさ に関する測定結果が、 候補物質を接触させない細胞と比較して、 初めから小さい か又はそれ以上大きくなりにくいと評価できれば、 候補物質を当該封入体形成抑 制剤として選択することができる。
4 . 副作用の検定方法
本発明においては、 前記 2 .項に記載した形質転換細胞を用いた神経変性疾患 の治療薬の副作用を検定する方法を提供することもできる。 当該検定方法は、 詳 しくは、 本発明の形質転換細胞に神経変性疾患の治療薬を接触させて当該細胞の 細胞活性を測定し、 得られる測定結果を指標として神経変性疾患の治療薬の副作 用を検定するというものである。 当該検定方法において、 神経変性疾患としては、 例えば、 前頭側頭葉変性症、 筋萎縮性側索硬化症、 アルツハイマー病、 パーキン ソン病、 ハンチントン舞踏病及びプリオン病等が挙げられるが、 特に TDP-43の 細胞内封入体の形成に伴う疾患 （TDP-43の細胞内蓄積に伴う疾患） が好ましく 挙げられる。
ここで、 本発明の形質転換細胞の細胞活性としては、 限定はされず、 該形質転 換細胞の機能及び特性等に関わる種々の活性を挙げることができる。 種々の活性 の測定方法は、 公知の方法が採用できる。 上記検定方法においては、 測定対象と する細胞活性が、 例えば、 神経突起伸張能、 増殖能及び生存能であることが、 特 に好ましい。
例えば、 本発明の形質転換細胞が、 脳神経細胞等の各種神経細胞や神経芽細胞 に由来するものであるときは、 これら細胞に神経変性疾患の治療薬を接触させた 場合に、 神経突起伸張能の測定結果が、 当該治療薬を接触させない細胞と比較し て、 同等又は高い伸長率 （伸長速度） を有すると評価できれば、 当該治療薬が副 作用を有しないと判断することができる。
また、 本発明の形質転換細胞に神経変性疾患の治療薬を接触させた場合に、 増 殖能の測定結果が、 当該治療薬を接触させない細胞と比較して、 同等又は高い増 殖率 （増殖速度） を有すると評価できれば、 当該治療薬が副作用を有しないと判 断することができる。 同様に、 本発明の形質転換細胞に神経変性疾患の治療薬を 接触させた場合に、 生存能の測定結果が、 当該治療薬を接触させない細胞と比較 して、 同等若しくは長い寿命又は同等若しくは高い生存率を有すると評価できれ ば、 当該治療薬が副作用を有しないと判断することができる。 5 . 治療用及び予防用医薬組成物
本発明の神経変性疾患の治療用及び 又は予防用医薬組成物は、 前述したよう に、 有効成分としてメチレンブルー （Methylene Blue) 及び Z又はディメボン （ Dimebone) といった低分子化合物を含むことを特徴とする医薬組成物である。 メチレンブルー及びディメボンは、 神経変性疾患、 例えば、 前頭側頭葉変性症又 は筋萎縮性側索硬化症、 特に TDP-43の細胞内封入体の形成に伴う祌経変性疾患 に対して、 TDP-43細胞内封入体の形成を効果的に抑制することができるため、 当該疾患の治療及び予防に有用なものである。
なお、 本発明は、 被験者 （神経変性疾患若しくはその恐れのある患者、 又は健 常者） にメチレンブルー及び 又はディメボンを投与することを特徴とする神経 変性疾患の治療及び 又は予防方法を含むものである。 また、 本発明は、 神経変 性疾患の治療及び Z又は予防のための薬剤の製造ためのメチレンブルー及び Z又 はディメボンの使用を含むものであり、 さらには、 メチレンブルー及び z又はデ ィメボンを含むことを特徴とする神経変性疾患の治療及び Z又は予防用キットを 提供することもできる。
本発明の医薬組成物等においては、 メチレンブルー及びディメボンと同様に、 エキシフォン、 ゴシぺチン及びコンゴレッ ド等の低分子化合物も、 TDP-43細胞 内封入体形成抑制効果を有する有効成分として、 使用することができる。
(1) 有効成分の配合割合
本発明の医薬組成物において、 有効成分であるメチレンブルー及びディメボン の配合割合は特に限定はされないが、 例えば、 神経変性疾患の治療用医薬組成物 (神経変性疾患治療薬） である場合、 メチレンブルーは、 0.01〜30重量。 /0が好 ましく、 より好ましくは 0.05〜20重量％、 さらに好ましくは 0.1〜： 10重量％であ り、 ディメボンは、 0.01〜30重量％が好ましく、 より好ましくは 0.05〜20重量 %、 さらに好ましくは 0.1〜： 10重量％である。 また、 本発明の医薬組成物におい ては、 メチレンブルー及びディメボンは、 いずれか一方のみ用いてもよいし （単 剤処理） 、 両者を併用してもよく （併用処理） 、 限定はされない。 メチレンブル 一及びディメボンの併用の場合、 本発明の医薬組成物におけるこれら有効成分の 合計配合割合は、 0.01〜30重量％が好ましく、 より好ましくは 0.05〜20重量％、 さらに好ましくは 0.1〜10重量％である。
(2) その他の成分
本発明の医薬組成物は、 有効成分であるメチレンブルー及びディメボン以外に も、 本発明の効果が著しく損なわれない範囲で、 他の構成成分を含んでいてもよ く、 限定はされず、 例えば、 後述するような薬剤製造上一般に用いられるもの等 を含むことができる。
(3) 用法、 用量
本発明の医薬組成物の体内への投与は、 例えば、 非経口または経口等の公知の 用法で行うことができ、 限定はされないが、 好ましくは非経口である。
これら各種用法に用いる製剤 （非経口剤や経口剤等） は、 薬剤製造上一般に用 いられる賦形材、 充填材、 増量剤、 結合剤、 湿潤剤、 崩壊剤、 潤滑剤、 界面活性 剤、 分散剤、 緩衝剤、 保存剤、 溶解補助剤、 防腐剤、 矯味矯臭剤、 無痛化剤、 安 定化剤、 等張化剤等を適宜選択して使用し、 常法により調製することができる。 本発明の治療用及び予防用医薬組成物の投与量は、 一般には、 製剤中の有効成 分の配合割合を考慮した上で、 投与対象 （患者） の年齢、 体重、 病気の種類 ·進 行状況や、 投与経路、 投与回数 （ 1日） 、 投与期間等を勘案し、 適宜、 広範囲 に設定することができる。
本発明の医薬組成物を、 非経口剤又は経口剤として用いる場合について、 以下 に具体的に説明する。
非経口剤として用いる場合、 一般にその形態は限定されず、 例えば、 静脈内注 射剤 （点滴を含む） 、 筋肉内注射剤、 腹腔内注射剤、 皮下注射剤、 坐剤等のいず れであってもよい。 各種注射剤の場合は、 例えば、 単位投与量アンプル又は多投 与量容器の状態や、 使用時に溶解液に再溶解させる凍結乾燥粉末の状態で提供さ れ得る。 当該非経口剤には、 前述した有効成分のほかに、 各種形態に応じ、 公知 の各種賦形材や添加剤を上記有効成分の効果が損なわれない範囲で含有すること ができる。 例えば、 各種注射剤の場合は、 水、 グリセロール、 プロピレングリコ —ルや、 ポリエチレンダリコール等の脂肪族ポリアルコール等が挙げられる。 非経口剤の投与量 （1日あたり） は、 限定はされないが、 例えば各種注射剤で あれば、 一般には、 前述した有効成分を、 適用対象 （患者） の体重 1 kgあたり 0.1〜50 mg服用できる量であることが好ましく、 より好ましくは 0.5〜20 mgで あり、 さらに好ましくは 1〜： 10 mgである。
経口剤として用いる場合、 一般にその形態は限定されず、 例えば、 錠剤、 カブ セル剤、 顆粒剤、 散剤、 丸剤、 トローチ剤、 内用水剤、 懸濁剤、 乳剤、 シロップ 剤等のいずれであってもよいし、 使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしても よい。 当該経口剤には、 前述した有効成分のほかに、 各種形態に応じ、 公知の各 種賦形材や添加剤を上記有効成分の効果が損なわれない範囲で含有することがで きる。 例えば、 結合剤 （シロップ、 アラビアゴム、 ゼラチン、 ソルビトール、 ト ラガカント、 ポリ ビュルピロリ ドン等） 、 充填材 （乳糖、 糖、 コーンスターチ、 馬鈴薯でんぷん、 リン酸カルシウム、 ソルビトール、 グリシン等） 、 潤滑剤 （ス テアリン酸マグネシウム、 タノレク、 ポリエチレングリコール、 シリカ等） 、 崩壊 剤 （各種でんぷん等） 、 および湿潤剤 （ラウリル硫酸ナトリウム等） 等が挙げら れる。
経口剤の投与量 （1日あたり） は、 一般には、 前述した有効成分を、 適用対象 (被験者；患者） の体重 1 kgあたり 0.1〜； LOO mg服用できる量であることが好ま しく、 より好ましくは 0.5〜50 mgであり、 さらに好ましくは 1〜10 mgである。 経口剤中の有効成分の配合割合は、 限定はされず、 1日あたりの投与回数等を考 慮して、 適宜設定することができる。 以下に、 実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、 本発明はこれらに 限定されるものではない。
〔実施例 1〕
( 1 ) 材料及び方法
各種プラスミ ドベクターの構築
pRc-CMVベクター （Buratti et al.， EMBO J.， 2001 (前掲） 参照） の CMVプロ モーター下流の Not Iサイ ト及び Apa Iサイ ト間にヒ ト TDP-43遺伝子 （配列番 号 1 ) が挿入されたベクター （pRc-CMV-TDP-43) を铸型として、 PCR法により、 ヒ ト TDP-43 遺伝子のコード領域を増幅した。 当該 PCR は、 下記のプライマー セットを使用し、 下記の反応液組成及び反応条件で行った。
<プライマーセット〉
Fプライマー ：
5'-CGGGATCC ATGTCTGAATATATTCGGGT-3 ' (配列番号 3 ) Rプライマー：
5，-GCTCTAGA CTACATTCCCCAGCCAGAAG-3 ' (配列番号 4 )
<反応液組成 >
铸型 DNA (pRc-CMV-TDP-43； 100 // g/ μ 1)： 1 μ L
TaqDNAポリメラーゼ： 1 unit
Fプライマー （20 M)： \ μ
Rプライマー （20 // M)： 1 / L
dNTP (2.5mM each)： 5 // L
lOxBuffer： 5 L
滅菌水： 適量（約 36 w L)
合 計：
<反応条件〉
「95°Cで 30 秒間の熱変性 ·解離 ― 50°Cで 30秒間のァニーリング→ 72°Cで 120秒間の合成 ·伸長」 を 1サイクルとするサイクル条件で、 計 30サイクル。 上記 PCRにより得られた増幅断片を、 pcDNA3 (+)ベクタ一 （インビトロジェ ン社） の MCSの BamHIサイ トおよび Xbalサイ ト間に挿入し、 pcDNA3-TDP43 WTベクターを作製した。 次いで、 pcDNA3-TDP43 WT を铸型 と し、 QuickChange Site-directed Mutagenesis Kit (ス トラテジーン社） を用いて、 TDP-43 の核移行シグナル (NLS1 , アミノ酸残基番号： 78-84, 図 2参照） の欠損変異体、 核移行シグナル 類似配列 （NLS2, アミノ酸残基番号： 187-192， 図 2参照） の欠損変異体、 およ びこれら両方の欠損変異体をコードする塩基配列を有するプラスミ ドベクターを、 それぞれ作製した。 各ベクターの名称及び概要を以下に列挙した。 • pcDNA3-TDP43 WT ：
野生型 TDP-43 (ァミノ酸残基番号： 1-414(全長)） をコード。
• pcDNA3-TDP43-A LSl ：
NLS1欠損変異体 （アミノ酸残基番号： 78-84を欠損） をコード。
· pcDNA3-TDP43-ANLS2：
NLS2欠損変異体 （アミノ酸残基番号： 187-192を欠損） をコード。
• pcDNA3-TDP43-ANLSl&2 ：
NLS1 及び NLS2 の両欠損変異体 （ァミノ酸残基番号： 74-84及びァミノ酸 残基番号： 187-192を欠損） をコード。 さらに、 野生型 TDP-43又はその一部と、 GFP との融合タンパク質をコードす る塩基配列を有するプラスミ ドベクターを作製した。 具体的には、 まず、 pcDNA3-TDP43 WTを铸型として、 PCR法により、 野生型 TDP-43をコードする 塩基配列の全部又は所望の一部を増幅した。 当該 PCR は、 下記のいずれかのプ ライマーセットを使用し、 下記の反応液組成及び反応条件で行った。 ぐプライマーセット >
•野生型 TDP-43 (アミノ酸残基番号： 1-414) をコードする塩基配列の増幅用
Fプライマー ：
5 -CCGCTCGAGCT ATGTCTGAATATATTCGGGTAACCGAA-3 ' (配列番号 5 )
Rプライマー：
5 -CGGGATCC CTACATTCCCCAGCCAGAAG-3 ' (配列番号 6 )
•TDP-43の一部 （アミノ酸残基番号： 162-414) をコードする塩基配列の増幅用 Fプライマー ：
5 -CCGCTCGAGCT ATGTCACAGCGAC AT ATGA-3 ' (配列番号 7 )
Rプライマー：
5 -CGGGATCC CTACATTCCCCAGCCAGAAG-3 ' (配歹 lj番号 6 ) • TDP-43の一部 （ァミノ酸残基番号： 218-414) をコードする塩基配列の増幅用 Fプライマー ：
5 -CCGCTCGAGCT ATGGATGTCTTCATCCCCA-3， （配列番号 8 )
Rプライマー ：
5 -CGGGATCC CTACATTCCCCAGCCAGAAG-3' (配列番号 6 )
• TDP-43の一部 （ァミノ酸残基番号： 274-414) をコードする塩基配列の増幅用 Fプライマー ：
5 '-CCGCTCGAGCT GGAAGATTTGGTGGTAATCC A-3 ' (配列番号 9 )
Rプライマー ：
5'-CGGGATCC CTACATTCCCCAGCCAGAAG-3 ' (配列番号 6 )
• TDP-43の一部 （ァミノ酸残基番号： 315-414) をコ一ドする塩基配列の増幅用 Fプライマー ：
5 '-CCGCTCGAGCT GCGTTCAGCATTAATCC AGCC AT-3 ' (配列番号 1 0 )
Rプライマー ：
5 -CGGGATCC CTACATTCCCCAGCCAGAAG-3 ' (配列番号 6 )
• TDP-43の一部 （アミノ酸残基番号： 1-161) をコードする塩基配列の増幅用
Fプライマー ：
5 -CCGCTCGAGCT ATGTCTGAATATATTCGGGTAACCGAA-3' (配列番号 1 1 )
Rプライマー ：
5'-CGGGATCC CTATACTTTCACTTGTGTTT-3 ' (酉己歹 lj番号 1 2 ) · TDP-43の一部 （ァミノ酸残基番号： 1-217) をコードする塩基配列の増幅用
Fプライマー ：
5 -CCGCTCGAGCT ATGTCTGAATATATTCGGGTAACCGAA-3 ' (配列番号 1 1 )
Rプライマー ：
5'-CGGGATCC CTACACATCCCCGTACTGAG-3 ' (配列番号 1 3 ) • TDP-43の一部 （ァミノ酸残基番号： 1-273) をコードする塩基配列の増幅用 Fプライマー ：
5 '-CCGCTCGAGCT ATGTCTGAATATATTCGGGTAACCGAA-3 ' (配列番号 1 1 )
Rプライマー ：
5 -CGGGATCC CTAACTTCTTTCT AACTGTCT ATTGCT-3 ' (酉己歹 IJ番号 1 4 )
• TDP-43の一部 （ァミノ酸残基番号： 1-314) をコードする塩基配列の増幅用
Fプライマー ：
5 -CCGCTCGAGCT ATGTCTGAATATATTCGGGTAACCGAA-3 ' (配列番号 1 1 )
Rプライマー ：
5 -CGGGATCC CTAACCAAAGTTCATCCCACCACCC AT-3 ' (配列番号 1 5 )
<反応液組成 >
铸型 DNA (pcDNA3-TDP43 WT; lOO/xg/μΙ)： Ιμ
TaqDNAポリメラーゼ： 1 unit
Fプライマー （20/ M)： 1/xL
Rプライマー （20μΜ)： l^L
dNTP (2.5mMeach)： 5μL
lOxBuffer： 5 μ\.
滅菌水： 適量（約 36 L)
合 計： 50 ぐ反応条件〉
r95°Cで 30 秒間の熱変性 ·解離 → 55°Cで 30秒間のァニーリング → 72°Cで 120秒間の合成 '伸長」 を 1サイクルとするサイクル条件で、 計 30サイクル。 上記 PCR により得られた各増幅断片を、 それぞれ pEGFP-Cl (クロンテック 社； GenBank ァクセッション番号： U55763) の MCS の BamHI サイ トおよび Xhol サイ ト間に挿入し、 GFP との融合タンパク質をコードする塩基配列を有す るプラスミ ドベクターを、 それぞれ作製した。 各ベクターの名称及び概要を以下 に列挙した。 · GFP-TDP-43 WT：
GFP と野生型 TDP-43 (アミノ酸残基番号： 1-414(全長)） との融合タンパク 質をコード。
• GFP-TDP 162-414：
GFP と TDP-43 の一部 （アミノ酸残基番号： 162-414) との融合タンパク質 をコード。
• GFP-TDP 218-414：
GFP と TDP-43 の一部 （アミノ酸残基番号： 218-414) との融合タンパク質 をコード。
• GFP-TDP 274-414：
GFP と TDP-43 の一部 （アミノ酸残基番号： 274-414) との融合タンパク質 をコード。
• GFP-TDP 315-414：
GFP と TDP-43 の一部 （アミノ酸残基番号： 315-414) との融合タンパク質 をコード。
· GFP-TDP 1-161 ：
GFP と TDP-43 の一部 （アミノ酸残基番号： 1-161) との融合タンパク質を コード。
• GFP-TDP 1-217：
GFP と TDP-43 の一部 （アミノ酸残基番号： 1-217) との融合タンパク質を コード。
• GFP-TDP 1-273：
GFP と TDP-43 の一部 （アミノ酸残基番号： 1-273) との融合タンパク質を コード。 - GFP-TDP 1-314：
GFP と TDP-43 の一部 （アミノ酸残基番号： 1-314) との融合タンパク質を コード。 TDP-43 の機能解析を行うために、 嚢胞性線維症の原因遺伝子である嚢胞性線 維征 H臭貞通調節因子 (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator： CFTR; のェキソン 9およびその前後のイントロンを含む領域をコードするプラスミ ドべ クタ一を作製した。 すなわち、 ヒ ト健常者由来の染色体 DNA より PCR 法を用 レヽて、 CFTR 遺伝子 （GenBank ァクセッション番号： NM— 000492) の塩基配列 (配列番号 1 6 ) 中のェキソン 10 ( "Buratti E et al., EMBO J., 2001 (前掲） " で いうェキソン 9に対応） の上流側 221番目の塩基から当該ェキソン 10の下流側 266番目の塩基までの計 670塩基 （配列番号 1 6に示される塩基配列中の第 1130 番目〜第 1790番目の塩基） からなる塩基配列領域を増幅した。 当該 PCRは、 下 記のプライマーセットを使用し、 下記の反応液組成及び反応条件で行った。
<プライマーセット〉
Fプライマー ：
5'-CGGAATTC ACTTGATAATGGGCAAATATC-3 ' (配列番号 1 7 )
Rプライマー ：
5'-CCCTCGAG CTCGCCATGTGCAAGATACAG-3' (配列番号 1 8 )
ぐ反応液組成 >
铸型 DNA
(ヒ ト健常者由来染色体 DNA; lOO/ig/μΙ)： lμL
TaqDNAポリメラーゼ： 1 unit
Fプライマー （20 M)： lμL
Rプライマー （20μΜ)： 1/ L
dNTP(2.5mMeach)：
lOxBuffer： 5 μ L
滅菌水： 適量（約 36/ L)
合 計： 50 μ L ぐ反応条件 >
「95°Cで 30 秒間の熱変性 .解離 → 60°Cで 30秒間のァニーリング → 72°Cで 120秒間の合成 ·伸長」 を 1サイクルとするサイクル条件で、 計 35サイクル。 上記 PCR により得られた増幅断片を、 pSPL3 ベクター （GIBCO BRL 社； GenBankァクセッション番号： U19867) の MCSの EcoRIサイ トおよび Xholサ ィ ト間に挿入して、 pSPL3-CFTRex9ベクタ一を作製した。
SH-SY5Y細胞の培養およびプラスミ ドベクターの導入
神経芽細胞 SH-SY5Y は、 10%仔牛血清を含む DMEM/F12培地を用いて 37°C、 5%C02の条件のィンキュベータ一中で培養した。
上記の各種プラスミ ドベクタ一 （pCDNA3 系又は pEGFP 系， 1 g) は、 FuGENE6 トランスフエクシヨン試薬 （ロシュ 'ダイァグノスティックス社） を 用いて SH-SY5Y細胞に導入した。 総プラスミ ド量の 3倍容量の FuGENE6をプ ラスミ ドと混合し、 15 分間室温で静置した後、 細胞液に混合した。 2〜3 日間培 養を行い、 細胞ライセー卜の調製又は免疫組織染色などに用いた。 共焦点レーザー顕微鏡による観察
カバーガラス上で培養した SH-SY5Y細胞に、 各種発現ベクター （1 /x g) を混 合して、 FuGENE6 の存在下で添加した。 2 日間の培養の後、 細胞の固定又はプ 口テアーゼ阻害剤処理を行った。 プロテアーゼ阻害剤処理では、 細胞に終濃度で 20 μ Μ MG132 (プロテアソーム阻害剤） 又は carbobenzoxy-leucyl-leucinal (zLL：カルパイン阻害剤） を添加し、 37°Cで 6時間培養を行った。 その後、 細 胞は 4%パラホルムアルデヒ ド溶液中で固定した。 固定した細胞は、 0.2% Triton X-100 で処理したのち、 5%牛血清アルブミン溶液でブロッキングして、 一次抗 体と 37°Cで 1時間反応させた。 0.05% Tween 20および 150 mM NaClを含む 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 (TBS-T) で洗浄した後、 蛍光標識した二次抗体と 37°Cで 1 時間反応させた。 TBS-Tで洗浄したのち、 細胞は TO-PRO-3 (インビトロジェン 社， 3，000倍希釈） と 37°Cで 1時間反応させて核染色を行った。 これをスライド ガラス上で封入したのち、 共焦点レーザー顕微鏡 （カールツァイス社） で解析し た。
使用した一次抗体および蛍光標識した二次抗体は、 以下の通りである。 •一次抗体：
ヽ
anti-TARDBP (ProteinTech社， 1 : 1000希釈） ；
anti-pS409/410 (TDP-43の第 409番目及び第 410番目の Ser残基が共にリン 酸化されたペプチドを抗原として得られた抗体 （TDP-43 凝集物に特異的に結合 する抗体） , 1 :500希釈） ；
anti-Ubiquitin (MAB 1510, CHEMIC0N社， 1 :500希釈）
•蛍光標識二次抗体：
FITC標識した抗ゥサギ IgG (抗ゥサギィムノグロブリン， FITC標識， 製品 番号： F9887, シグマ社， 1 : 500希釈） ；
ローダミン標識した抗マウス IgG (抗マウスィムノグロブリン， TRITC標識， 製品番号： T2402, シグマ社， 1 :500希釈） なお、 上記一次抗体の anti-pS409/410抗体は、 以下のようにして作製した (i) 抗原の調製
抗原となるぺプチドとして、 ヒ ト TDP-43のァミノ酸配列 （配列番号 2 ) にお けるアミノ酸残基番号 405-414のアミノ酸の N末端にシスティンを付加した配 列を有し、 かつセリン残基がリン酸化されているべプチド
(CMDSKS(P03H2)S(P03H2)GWGM (配列番号 1 9 ) ) を、 固相法により合成し た （シグマジエノシス、 又はサーモクエスト） 。 ここで、 当該ペプチド中、
S(P03H2)はリン酸化セリンを表す。 また、 カラム作製、 コントロール等に使用す るため、 非リン酸化ぺプチド （MDSKSSGWGM (配列番号 2 0 ) ；配列番号 2 に示されるアミノ酸配列中のアミノ酸残基番号 405-414) も合成した。
(ii) 免疫
上記合成べプチドを Thyroglobulin又は KLHと定法に従つてコンジユゲートし、 抗原として用いた。 抗原べプチドを含有する 1 mlの 1 mg/ml抗原べプチド生理 食塩水溶液と 1 mlのフロイント完全アジュバント （Difco社） を合わせ、 超音波 処理によってェマルジヨン化し、 ゥサギ （ニュージーランドホワイ ト、 体重 2.5 kg、 雌） の背中に数力所以上に分けて免疫した。 初回免疫から 2週間後に 0.5 ml の 1 mg/ml抗原べプチド生理食塩溶液と 1 mlのフロイント不完全アジュバント を合わせ、 超音波処理によりェマルジヨン化したものを追加免疫した。 免疫から 1 週間後に採血を行い、 採取した血液は室温で 1 時間静置後、 4°Cでー晚静置し、 5000 X gで 10分間遠心分離処理を行い、 抗血清を得た。
(iii) 抗体の精製
抗体を精製するため、 ホルミルセル口ファイン （生化学工業社） 又はトヨパー ル AF トレシル 650M (東ソ一社） 約 2 mlに対し、 前記非リン酸化合成べプチド 約 2 mgを反応させたカラムを作製した。 抗血清 2 mlをこのカラムにおいて 10 〜20時間循環させ、 カラムに吸着されなかった抗体を、 抗リン酸化 TDP-43抗体 (anti-pS409/410) とした。 ェキソンスキッビングアツセィ
各種の TDP-43変異体の機能を調べるために、 嚢胞性線維症の原因遺伝子であ る嚢胞性線維症 fl吴貞通調負 (]因子 ( Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator : CFTR) のェキソン 9のスキッピングアツセィを行った。 6ゥエルプレ 一トに播種した cos7細胞に、 0.5 の pSPL3-CFTRex9および l // gの各種 TPD- 43発現ベクターを混合して、 FuGENE6の存在下で添加した。 そのまま 2 日間培 養を行った後、 細胞を回収して、 GIBCO BRL社の Exon Trapping Systemの使用 説明書に従って試料を調製し、 1.3%ァガロースゲルを用いた電気泳動により解 析した。 低分子化合物の添加による細胞内封入体形成の抑制
細胞としてはヒ ト神経芽細胞株 SH-SY5Y細胞を用い、 各種 TDP-43変異体の うち強い細胞内封入体形成が認められた pEGFP-TDP 162-414 ( GFP-TDP 162- 414) および pcDNA3-TDP delta LSl&2 (TDP deltaNLS l&2) を用いて、 上記封 入体形成の阻害剤の検索を行った。
SH-SY5Y細胞への遺伝子導入は、 前述した 「SH- SY5Y細胞の培養およびプラ スミ ドベクターの導入」 に記載の方法に従い、 各種プラスミ ド を 3倍容量 のトランスフエクション試薬（FuGENE6 : 3 μ \) により細胞に導入した。
候補阻害剤による処理は、 遺伝子導入から 2時間後に開始した。 候補阻害剤と しては、 メチレンブルー （Methylene Blue) およびディメボン （Dimebone) につレヽ て検討した。 メチレンブルーは DMSOに溶解し、 終濃度が 0 /2 M、 0.05 及び 0.1 μ Μ になるように培養液に添加することにより処理を開始した。 一方、 ディ メボンは滅菌水に溶解し、 終濃度が 0 Μ、 20 μ Μおよび 60 /χ Μ になるように 培養液中に添加することにより処理を開始した。 なお、 メチレンブルーの濃度は 細胞増殖へのダメージがない濃度条件をあらかじめ検討し、 上記濃度に決定した。 一方、 ディメボンの濃度については参考文献 （ Jun Wu et aし Molecular Neurodegeneration, 2008, vol. 3, p. 15) を参考にし、 調製法 （滅菌水に懸濁） につ いては試薬提供者の指示に従った。
候補阻害剤の添加から 3日後、 前述した 「共焦点レーザー顕微鏡による観察」 に記載の方法に従い、 細胞の状態を観察した。 候補阻害剤処理から 3日後の細胞 を 4%パラホルムアルデヒ ドで固定し、 0.2% TritonX-100 にて膜透過処理を行つ た後、 5%牛血清アルブミン溶液でブロッキングし、 一次抗体と 37°Cで 1 時間反 応させた。 0.05% Tween 20および 150 mM NaClを含む 50 mM Tris-HCl, pH 7.5
(TBS-T) で洗浄した後、 蛍光標識した二次抗体と 37°Cで 1 時間反応させた。
TBS-T で洗浄した後、 細胞は TO-PRO-3 (インビトロジェン社， 3,000 倍希釈） と 37°Cで 1 時間反応させて核染色を行った。 これをスライ ドガラス上で封入し て、 共焦点レーザー顕微鏡 （Zeiss 社） で解析した。 なお、 今回使用した一次抗 体および蛍光標識した二次抗体は、 以下の通りである。 pEGFP-TDP 162-414 (GFP-TDP 162-414) に対して
一次抗体：
- anti-pS409/410 (TDP-43 の第 409 番目および第 410 番目のアミノ酸残基の Serが共にリン酸化されたペプチドを抗原として得られた抗体であって、 TDP-43 凝集物に特異的に結合する抗体 （本発明者により作製） ， 1 :500希釈）
蛍光標識二次抗体：
• Alexa-568標識した抗マウス Ig G (1:500希釈）
共焦点レーザー顕微鏡による観察像：
TDPが緑色 （ベクター由来の GFP) 、 リン酸化 TDPが赤色で確認される。 pcDNA3-TDP deltaNLSl&2 (TDP deltaNLSl&2) に対して
一次抗体：
- anti-pS409/410 (TDP-43 の第 409 番目および第 410 番目のアミノ酸残基の Serが共にリン酸化されたぺプチドを抗原として得られた抗体であって、 TDP-43 凝集物に特異的に結合する抗体 （本発明者により作製） ， 1 :500希釈）
- anti-Ubiquitin (MAB1510, CHEMICON社， 1:500希釈）
蛍光標識二次抗体：
- Fluorescein isothiocyanate (FITC) 標識した抗ゥサギ IgG (シグマ社、 1 :500 希釈)
• Alexa-568標識した抗マウス IgG (1:500希釈）
共焦点レーザ一顕微鏡による観察像：
リン酸化 TDPが緑色、 ュビキチンが赤色で確認される。 共焦点レ一ザ一顕微鏡による検鏡に際しては、 細胞内封入体のみが検出できる ようにレーザー出力 （緑） を設定した （図 19及び 21) 。
pcDNA3-TDP deltaNLSl&2 (TDP deltaNLSl&2) では、 リン酸化 TDP (緑） の 強度と細胞数を示す TO-PRO-3 (青） の強度とを、 pEGFP-TDP 162-414 (GFP- TDP 162-414) では、 TDP (緑） の強度と細胞数を示す TO-PRO-3 (青） の強度 とを、 それぞれ LSM5 Pascal V 4.0ソフトウェア （Carl Zeiss) を用いてそれぞれ算 出し、 全細胞数 （青） に対する封入体形成細胞数 （緑） の割合 （Cell with aggregates (%)) を求め、 グラフに表した。 その結果を、 図 20及び 22 (メチレン ブルー Xはディメボンの単剤処理） 、 並びに図 23及び 24 (メチレンブル一及び ディメボンの併用処理） に示した。
( 2 ) 結果及び考察
核移行シグナル (NLS) の同定
TDP-43の NLSの同定を行った。 NLSは、 一般的に、 塩基性ァミノ酸が数残基 連なった配列として知られている （図 3) 。 最もよく知られている NLS として、 SV40 の T抗原に存在する配列 （PKKKRKV：配列番号 2 1 ) が知られており、 この配列を基に TDP-43 ァミノ酸配列 （図 2) より、 NLS配列の検索を行った。 その結果、 2力所の候補配列を見いだし （図 2： NLS1および NLS2) 、 NLSを同 定するために、 NLS 候補配列 （NLS1 ： 78-84 残基， NLS2： 187-192 残基） をそ れぞれ欠損させた変異体 （ANLS1 および ANLS2) を作製し、 野生型と共に SH- SY5Y 細胞に一過性に発現させ、 共焦点レーザー顕微鏡により観察した （図 3) 。 その結果、 図 4 に示したように、 野生型の発現は核に認められたが、 ANLS1 の 発現は核ではなく、 細胞質に認められた。 また、 ANLS2 の発現は核に認められ たが、 野生型の場合とは異なり、 核内に顆粒状の構造物として検出された。 以上 のことから、 NLS1 のアミノ酸配列 （図 2) が核移行シグナルであることが分か つた。 しかしながら、 野生型を含め、 いずれの変異体を発現させても、 発現させ ただけでは細胞内封入体は形成されないことも分かった。 また、 市販の抗体 (anti-TARDBP) では、 プラスミ ドによる外来の TDP-43 だけでなく、 細胞に 元々存在する内在性 TDP-43 もよく染色されることが分かった （図 4 の none : pcDNA3 (+)ベクターそのものをトランスフエク トした場合） 。 核内封入体の出現
次に、 野生型 TDP-43 や各種欠損変異体を SH-SY5Y細胞に発現させ、 発現細 胞をプロテアソーム阻害剤である MG132 で処理し、 共焦点レーザー顕微鏡によ る観察を行った。 各種プラスミ ドを SH-SY5Y細胞にトランスフエクシヨンした 後、 37°Cで 48時間インキュベートし、 そこに 20 μ Μの MG132を添加して、 さ らに 37°Cで 6時間ィンキュベートした。 細胞を固定した後に、 市販の TDP-43ポ リク口ーナル抗体 （anti-TARDBP) で染色したところ、 図 5に示したように、 野 生型 TDP-43や NLS1欠損変異体の発現細胞では、 未添加の場合 （図 5：上） と 比較して、 特に顕著な差は見られなかったが、 NLS2 欠損変異体の発現細胞では、 MG132処理により核内に封入体が認められた。 また、 MG132 に構造が類似した カルパイン阻害剤である ZLL 処理を行ってみたが、 特に発現パターンの変化は 見られなかった （データは示さず） 。
この核内封入体が、 FTLD 又は ALS 患者脳で見られる核内封入体と同じ性質 を有するかどうかを調べる目的で、 前述のリン酸化 TDP-43 特異抗体 （anti- pS409/410) および抗ュビキチン抗体 （anti-Ubiquitin) による染色を行い、 共焦 点レーザー顕微鏡による観察を行った。 その結果、 MG132 未処理の試料におい て、 anti-pS409/410 抗体に陽性な核内の顆粒状の構造物が検出できたが、 anti- Ubiquitin では何も染色されなかった （図 6：左） 。 この結果より、 リン酸化 TDP-43特異抗体である anti-pS409/410は、 正常の細胞に存在する内在性 TDP-43 を全く検出しないことが再確認できた。 一方、 MG132 処理した試料においては (図 6：右） 、 anti-pS409/410および anti-Ubiquitinのどちらにも陽性な核内封入 体が出現し、 その直径は約 lO w m であることが確認された。 この結果より、 NLS2欠損変異体の発現細胞に MG132 処理した場合に出現する核内封入体は、 FTLD又は ALS患者脳で見られる核内封入体 （図 1 ：左） と同様に、 リン酸化お よびュビキチン化されており、 その大きさもほぼ同じであることが分かった。 細胞質封入体の出現
核移行シグナルを除去した NLS1 欠損変異体を発現させた SH-SY5Y 細胞に MG132処理を行レ、、 市販の TDP-43抗体 （anti-TARDBP) で染色を行った場合に は、 図 5 (ANLSl) に示したように、 細胞質封入体は認められなかったので、 次 〖こリン酸化 TDP-43抗体 （anti-pS409/410) での染色を行い、 共焦点レーザー顕微 鏡により観察した。 その結果、 anti-TARDBPでは MG132処理後においても細胞 質封入体は見られなかったが （図 5： ANLS1) 、 anti-pS409/410 による染色によ り、 anti-pS409/410 陽性の細胞質封入体が観察できた （図 7：右） 。 図 6 の核内 封入体と同様に、 この細胞質封入体も、 わずかではあるが anti-Ubiquitin 陽性で あった。 またこの細胞質封入体の直径は、 約 ΙΟ μ ηι であった。 また、 カルパイ ン阻害剤である zLL を同様に処理してみたが、 細胞内封入体は全く見られず、 未処理の場合と全く同様な結果であった （データは示さず） 。
さらに、 NLS1及び NLS2の両配列を除去した欠損変異体 （ANLS1&2) を発現 させた SH-SY5Y細胞に、 anti-pS409/410および anti-Ubiquitinによる免疫染色を 行い、 共焦点レーザー顕微鏡による観察を行った。 その結果、 図 8に示したよう に、 ANLS1&2発現細胞では、 MG132処理無しで、 すなわちプラスミ ドを発現さ せただけで、 細胞質に anti-pS409/410及び anti-Ubiquitin抗体に陽性な細胞質封入 体が認められた。 これらの細胞質封入体の直径は、 約 ΙΟ μ πιであった。 GFP融合タンパク質の発現
本発明者らにより、 FTLD 患者脳より、 界面活性剤に不溶性の画分を調製し、 市販のポリク口ーナル抗体 （anti-TARDBP) でィムノプロットを行うと、 20〜35 kDa付近にバンドが認められ、 これらは正常コントロール脳より調製した同じ画 分においては全く認められないことが明らかにされている （Arai T et al., Res. Commun., 2006, vol. 351(3), p. 602-611 (前掲） ； Neumann M et al., Science, 2006, vol. 314(5796), p. 130-133 (前掲) ) 。 このことは、 患者脳においては、 全長 TDP-43 だけでなく、 TDP-43 の部分断片が高度に不溶化し、 蓄積していることを示して いる。 そこで、 種々の TDP-43 断片を発現させるプラスミ ドを作製して、 SH- SY5Y細胞に導入し、 当該断片を発現させた。 まず、 常法に従い、 pcDNA3 クタ一に TDP-43の 162-414残基目までの C末端側断片を導入し （pcDNA3-TDP ΔΝ161) 、 FuGENE6 にて細胞にトランスフエク トした。 37°Cで 2 日間インキュ ベートした後、 細胞を回収して anti-TARDBP 抗体によるィムノブ口ット解析を 行ったが、 その発現は全く認められなかった （データは示さず） 。 そこで、 次に、 TDP-43の 162-414残基の断片の N末端側に GFPタグを融合させた融合体タンパ ク質 （GFP-TDP 162-414) を細胞に発現させたところ、 その発現は認められた (図 1 1) 。 したがって、 野生型 TDP-43および各種 TDP-43断片を GFPの C末 端側に融合させたタンパク質をコードするプラスミ ドを作製し （図 9) 、 これら を SH-SY5Y細胞に発現させ、 anti-pS409/410あるいは anti-Ubiquitin抗体による 染色を行い、 共焦点レーザー顕微鏡観察を行った。
その結果を図 10〜15 に示した。 まず、 GFP のみを発現させた場合 （図 10 : 左） 、 核および細胞質における典型的な GFP の発現パターンが確認できた。 次 に、 GFP- TDP WT を発現させた場合 （図 10：右） 、 その発現は核にのみ認めら れた。 したがって、 GFPタグが結合することによる人為的な影響によって、 GFP が融合した TDP-43の発現パターンが変化することは無いことが分かった。 TDP- 43 の N末端側の 161 残基を除去した GFP-TDP 162-414 を発現させた場合 （図
11) は、 anti-pS409/410および anti-Ubiquitin抗体に陽性な細胞内封入体が出現し た。 この封入体は、 GFP-TDP 218-414 を発現させた場合にも認められた （図
12) 。 しかし、 さらに N末端側を除去した GFP-TDP 274-414 あるいは 315-414 を発現させた細胞においては、 このような細胞内封入体は全く認められなかった
(図 13) 。 したがって、 GFP-TDP 162-414および GFP-TDP 218-414変異体を細 胞に発現させると、 患者脳に特徴的に認められる、 リン酸化およびュビキチン化 TDPからなる細胞内封入体に類似した異常構造物が出現することが分かった。 同様に、 C末端側を除去した変異体を作製し、 これらも細胞に一過性に発現さ せた。 その結果、 162残基目以降を除去した GFP-TDP 1-161を発現した場合にの み、 anti-pS409/410および anti-Ubiquitin陽性の顕著な細胞内封入体を観察するこ とができた。 その他の N 末端断片を発現させても、 特に細胞内封入体は認めら れなかった （図 14， 15) 。 なお、 C 末端側を除去した変異体を発現させた場合 の解析では、 それらの変異体にリン酸化部位 （409番目及び 410番目の Ser) が 存在しないため、 抗リン酸化 TDP-43抗体 （anti-pS409/410) は使用しなかった。 以上の結果より、 種々の TDP-43変異体あるいは GFPが融合した TDP-43タン パク質を細胞に発現させ、 場合によっては、 プロテアソーム阻害処理と組み合わ せることによって、 培養細胞内に、 患者脳に特徴的に見られる異常な細胞内封入 体を再現することに成功した。
CFTRェキソン 9スキッビングアツセィ
上記の細胞内封入体が出現した TDP-43 変異体あるいは GFP 融合タンパク質 1 野生型 TDP-43 と機能的に異なるかどうかを調べるために、 TDP-43 による CFTRェキソン 9スキッピングァッセィを行った。
TDP-43 の機能として、 CFTRェキソン 9 をスキップさせる活性が報告されて レヽる （Buratti E et al.， EMBO J., 2001 (前掲） ） 。 すなわち、 嚢胞性線維症の一種 である先天性両側完全精管欠損症と呼ばれる病気は、 CFTR のェキソン 9の欠失 による未成熟 CFTRの機能異常により発症することが知られている （Buratti E et al., EMBO J., 2001 (前掲） ） 。 このェキソン 9の欠失に TDP-43が関与している ことが報告されており、 CFTR のェキソン 9の上流のイントロン内に存在する特 定の塩基 （TG及び T) のリピート配列に TDP-43 が結合し、 ェキソン 9のスキ ッビングがなされる。 このような TDP-43の CFTRェキソン 9のスキッピング活 性に注目し、 この活性を指標に野生型と各種変異体を比較した。
簡単なスキームを図 16 に示した。 前述したように、 CFTRェキソン 9 の上流 のイントロンを含む領域を正常健常者よりクローニングし、 pSPL3ベクターに揷 入し、 pSPL3-CFTR ex9ベクターを作製した。 これを、 各種 TDP-43 変異体ある いは GFP融合体と共に cos7細胞に発現し、 発現細胞より mRNAを調製し、 PCR 解析を行った。
発現細胞内において、 ェキソン 9 がスキップされる場合は、 117 bp のバンド が検出され、 ェキソン 9 がスキップされない場合は、 361 bp のバンドが検出さ れることになる （図 16) 。 発現細胞の試料を PCR解析し、 ァガロースゲル電気 泳動を行った結果、 NLS1 欠損変異体、 NLS2欠損変異体、 及び NLS1&2欠損変 異体を発現させた場合は、 野生型 TDP-43 を発現させた場合とは異なり、 ェキソ ン 9 がスキップされたバンドは全く検出されなかった （図 17) 。 すなわち、 細 胞内封入体の形成が観察された 3種類の変異体には、 CFTRェキソン 9のスキッ ビング活性が存在しないことが分かった。 同様に、 GFP 融合タンパク質と pSPL3-CFTR ex9 とを共発現させた場合には、 細胞内封入体が認められた GFP- TDP 162-414、 GFP-TDP 218-414、 及び GFP-TDP 1-161の 3種類において、 CFTR ェキソン 9 スキッピング活性は認められなかった （図 18) 。 野生型 TDP-43 の GFP融合体 （GFP-TDP-43 WT) の発現では、 CFTR ェキソン 9 スキッピング活 性が認められていることから （図 18) 、 これらの結果は、 GFP を融合したこと による人為的な効果ではないことも分かった。
以上の結果より、 TDP-43の欠損変異体および GFP融合体において、 細胞内封 入体形成が認められた変異体には CFTRェキソン 9スキッピング活性がなく、 TDP-43による細胞内封入体形成は、 その機能低下と関連することが示された。 この結果は、 TDP-43の細胞内封入体形成のメカニズムの解明に大きく貢献する ものであり、 かつ FTLDや ALS発症機構ならびにそれらの治療薬の開発につなが るものと考えられた。 低分子化合物による TDP-43細胞內封入体形成の抑制
細胞内封入体形成が認められた pEGFP-TDP 162-414 (GFP-TDP 162-414) およ び pcDNA3-TDP deltaNLSl&2 (TDP deltaNLSl&2) を用いて、 封入体形成を抑制 する低分子化合物の検索を行った結果、 どちらの欠損変異体においてもメチレン ブルーでは 0.05 /ι Μ という低濃度において阻害効果が確認され、 その効果は濃 度依存的に増強した （図 19及び 20) 。 一方、 ディメボンも 20 μ Μ において阻 害効果が確認され、 その効果は濃度依存に増強した （図 21及び 22) 。 さらに、 メチレンブルー及びディメボンを併用し、 両者を同時に添加すると、 その効果は さらに増強し、 メチレンブルー 0.025 μ Μ およびディメボン 5〜10 /i M とレ、う低 濃度においても、 未処理時に比べて 70〜85%ほどの阻害効果が認められた （図 23 及び 24) 。 このことから、 メチレンブルー及びディメボンは、 神経変性疾患、 特に TDP-43 の細胞内封入体の形成に伴う神経変性疾患の治療薬の有効成分とし て有用なものであると考えられた。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 FTLDや ALS等の神経変性疾患の患者脳に見られる、 TAR DNA-binding protein of 43 kDa (TDP-43) の細胞内封入体を形成する形質転換細 胞 （細胞モデル） を提供することができる。 また、 そのような TDP-43細胞内封 入体の主要構成成分となる変異型 TDP-43タンパク質や TDP-43タンパク質断片を 提供することができる。
本発明により提供される細胞モデルで形成される TDP-43細胞内封入体は、 上 記患者脳に見られる封入体と非常によく似た性質を有しており、 大きさだけでな く、 抗リン酸化 TDP-43抗体及び抗ュビキチン抗体に陽性のものである。 本発明 の形質転換細胞は、 TDP-43の核内又は細胞質内蓄積を抑制する化合物や遺伝子 などのスクリーニング、 並びに FTLDや ALS等の神経変性疾患に対する新規治療 薬等の開発に用いることができる点で、 極めて有用なものであり、 実際に、 本発 明者により、 当該形質転換細胞を用いて TDP-43細胞質内蓄積 （TDP-43細胞内封 入体形成） を抑制する化合物 （メチレンブルーやディメボン） が見出された点で も、 極めて実用性に優れたものである。 配列表フリーテキスト
配列番号 3 ：合成 DNA
配列番号 4 ：合成 DNA
配列番号 5 ：合成 DNA
配列番号 6 ：合成 DNA
配列番号 7 ：合成 DNA
配列番号 8 ：合成 DNA
配列番号 9 ：合成 DNA
配列番号 1 0 ：合成 DNA
配列番号 1 1 ：合成 DNA
配列番号 1 2 ：合成 DNA
配列番号 1 3 ：合成 DNA 配列番号 1 4 ：合成 DNA
配列番号 1 5 ：合成 DNA
配列番号 1 7 ：合成 DNA
配列番号 1 8 ：合成 DNA
配列番号 1 9 ： リン酸化合成ぺプチド
配列番号 1 9 ： Serはリン酸化されたセリン残基を表す （存在位置： 6、 7 ) 。 配列番号 2 0 ：合成べプチド

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 宿主細胞において機能するプロモーター、 及び変異型 TDP-43遺伝子が導入 された形質転換細胞。
2 . 変異型 TDP-43が、 細胞内封入体形成活性を有するものである、 請求項 1記 載の細胞。
3 . 変異型 TDP-43が、 以下の （a) 〜 （d) のタンパク質である、 請求項 1記載 の細胞。
(a) 野生型 TDP-43のアミノ酸配列において第 7 8番目〜第 8 4番目のアミノ酸 が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 野生型 TDP-43のアミノ酸配列において第 1 8 7番目〜第 1 9 2番目のアミ ノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
(c) 野生型 TDP-43のアミノ酸配列において第 7 8番目〜第 8 4番目及び第 1 8 7番目〜第 1 9 2番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質 (d) アミノ酸配列 （a) 、 (b) 又は （c) において 1若しくは数個のアミノ酸が 欠失、 置換若しくは付加されたァミノ酸配列からなり、 かつ細胞内封入体形 成活性を有するタンパク質
4 . 変異型 TDP-43が、 以下の （a) 〜 （d) のタンパク質である、 請求項 1記載 の細胞。
(a) 野生型 TDP-43のアミノ酸配列のうちの第 1 6 2番目〜第 4 1 4番目のアミ ノ酸を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 野生型 TDP-43のアミノ酸配列のうちの第 2 1 8番目〜第 4 1 4番目のアミ ノ酸を含むァミノ酸配列からなるタンパク質
(c) 野生型 TDP-43のアミノ酸配列のうちの第 1番目〜第 1 6 1番目のアミノ酸 を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
(d) アミノ酸配列 （a) 、 (b) 又は （c) において 1若しくは数個のアミノ酸が 欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ細胞内封入体形 成活性を有するタンパク質
5 . 変異型 TDP-43が、 CFTRェキソン 9スキッピング活性を有しないものである、 請求項 3又は 4記載の細胞。
6 . 哺乳動物細胞の形質転換細胞である、 請求項 1記載の細胞。
7 . 哺乳動物細胞が、 中枢神経系細胞、 末梢神経系細胞又は神経芽細胞である、 請求項 6記載の細胞。
8 . 請求項 1〜 7のいずれか 1項に記載の細胞に候補物質を接触させて当該細胞 の細胞活性を測定し、 得られる測定結果を指標として神経変性疾患の治療薬 をスクリ一ユングする方法。
9 . 細胞活性が、 細胞活性が増殖能、 生存能、 並びに変異型 TDP-43細胞内封入 体の形成率、 細胞内形成数及び大きさからなる群より選ばれる少なくとも 1 種である、 請求項 8又は 9記載の方法。
1 0 . 神経変性疾患が、 前頭側頭葉変性症又は筋萎縮性側索硬化症である、 請求 項 8又は 9記載の方法。
1 1 . 神経変性疾患が、 TDP-43の細胞内封入体の形成に伴う疾患である、 請求 項 8〜 1 0のいずれか 1項に記載の方法。
1 2 . 請求項 1〜7のいずれか 1項に記載の細胞に候補物質を接触させて当該細 胞の細胞活性を測定し、 得られる測定結果を指標として変異型 TDP-43の細 胞内封入体形成抑制剤をスクリーニングする方法。
1 3 . 細胞活性が、 細胞活性が増殖能、 生存能、 並びに変異型 TDP-43細胞内封 入体の形成率、 細胞内形成数及び大きさからなる群より選ばれる少なくとも 1種である、 請求項 1 2記載の方法。
1 4 . 請求項 1〜 Ίのいずれか 1項に記載の細胞に神経変性疾患の治療薬を接触 させて当該細胞の細胞活性を測定し、 得られる測定結果を指標として神経変 性疾患の治療薬の副作用を検定する方法。
1 5 . 細胞活性が、 神経突起伸張能、 増殖能及び生存能からなる群より選ばれる 少なくとも 1種である、 請求項 1 4記載の方法。
1 6 . 神経変性疾患が、 前頭側頭葉変性症又は筋萎縮性側索硬化症である、 請求 項 1 4又は 1 5記載の方法。
1 7 . 神経変性疾患が、 TDP-43の細胞内封入体の形成に伴う疾患である、 請求 項 1 4〜1 6のいずれか 1項に記載の方法。
1 8 . メチレンブルー及び/又はディメボンを含む、 神経変性疾患の治療及び 又は予防用医薬組成物。
1 9 . 神経変性疾患が、 前頭側頭葉変性症又は筋萎縮性側索硬化症である、 請求 項 1 8記載の組成物。
2 0 . 神経変性疾患が、 TDP-43の細胞内封入体の形成に伴う疾患である、 請求 項 1 8又は 1 9記載の組成物。
PCT/JP2009/054826 2008-04-09 2009-03-06 Ｔｄｐ－４３蓄積細胞モデル Ceased WO2009125646A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010507197A JP5667872B2 (ja) 2008-04-09 2009-03-06 Ｔｄｐ−４３蓄積細胞モデル
EP09730344.0A EP2272955B1 (en) 2008-04-09 2009-03-06 Tdp-43-storing cell model
US12/936,585 US8715643B2 (en) 2008-04-09 2009-03-06 TDP-43-storing cell model
US14/096,943 US9128081B2 (en) 2008-04-09 2013-12-04 TDP-43-storing cell model

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008101899 2008-04-09
JP2008-101899 2008-04-09

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US12/936,585 A-371-Of-International US8715643B2 (en) 2008-04-09 2009-03-06 TDP-43-storing cell model
US14/096,943 Continuation US9128081B2 (en) 2008-04-09 2013-12-04 TDP-43-storing cell model

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2009125646A1 true WO2009125646A1 (ja) 2009-10-15

Family

ID=41161781

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2009/054826 Ceased WO2009125646A1 (ja) 2008-04-09 2009-03-06 Ｔｄｐ－４３蓄積細胞モデル

Country Status (4)

Country Link
US (2) US8715643B2 (ja)
EP (1) EP2272955B1 (ja)
JP (1) JP5667872B2 (ja)
WO (1) WO2009125646A1 (ja)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2258857A1 (en) * 2009-06-02 2010-12-08 Academia Sinica TDP-43 transgenic mouse model for frontotemporal lobar degeneration with ubiquitin-positive inclusions (FTLD-U)
JP2013162772A (ja) * 2012-02-13 2013-08-22 Shiga Univ Of Medical Science Ｔｄｐ−４３の凝集体が蓄積する疾患の発症リスクを予測する方法、診断薬及び治療薬
JP2014171425A (ja) * 2013-03-08 2014-09-22 Shiga Univ Of Medical Science Ｔｄｐ−４３の凝集体が蓄積する疾患を治療及び／又は予防するための化合物のスクリーニング方法
JPWO2013073219A1 (ja) * 2011-11-18 2015-04-02 公益財団法人東京都医学総合研究所 神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体の製造方法
WO2017170986A1 (ja) * 2016-03-31 2017-10-05 東レ株式会社 不溶化ｔｄｐ－４３蛋白質の蓄積誘導剤、神経変性疾患モデル細胞の作製方法及び神経変性疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法
JP2017197443A (ja) * 2016-04-25 2017-11-02 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター Ｔｄｐ−４３プロテイノパチー治療用組成物
JP2018117638A (ja) * 2018-04-18 2018-08-02 国立大学法人滋賀医科大学 Ｔｄｐ−４３の凝集体が蓄積する疾患を治療及び／又は予防するための化合物のスクリーニング方法

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009125646A1 (ja) * 2008-04-09 2009-10-15 財団法人東京都医学研究機構 Ｔｄｐ－４３蓄積細胞モデル
WO2012162249A1 (en) * 2011-05-20 2012-11-29 Benjamin Wolozin Identification of compounds that disperse tdp-43 inclusions
US20140120562A1 (en) * 2011-06-22 2014-05-01 Universite Laval Methods for the prognostic and/or diagnostic of neurodegenerative disease, methods to identify candidate compounds and compounds for treating neurodegenerative disease
ITRM20110582A1 (it) 2011-11-05 2013-05-06 Biotechnology Icgeb Modello cellulare per la selezione di molecole che influenzano l aggregazione di tdp-43
CA2874083C (en) 2014-12-05 2024-01-02 Universite Laval Tdp-43-binding polypeptides useful for the treatment of neurodegenerative diseases
KR101729518B1 (ko) 2015-03-03 2017-05-04 건국대학교 산학협력단 Transactive response DNA binding protein-43(TDP-43)-GAL4 초파리 돌연변이체와 TDP-43-GAL4 및 UAS-Green fluorescent protein(GFP) 초파리 이중돌연변이체, 이의 제조방법
EP4175716A4 (en) * 2020-07-06 2024-08-21 The Board Of Regents Of The University Of Texas System TDP-43 BIOSENSOR CELL LINES
JPWO2022113799A1 (ja) * 2020-11-30 2022-06-02

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11502925A (ja) * 1995-03-27 1999-03-09 エフ・ホフマン−ラ ロシュ アーゲー タウ−タウ会合の阻害
US6187785B1 (en) * 1995-10-23 2001-02-13 Selena Pharmaceuticals, Inc. Agent for treating neurodegenerative disorders
JP2008101899A (ja) 2006-09-12 2008-05-01 Bromic Pty Ltd ガスヒータ

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5688511A (en) * 1991-11-05 1997-11-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Cellular protein TDP-43 and regulation of HIV-1 gene expression
FR2777015B3 (fr) 1998-02-23 2000-09-15 Financ De Biotechnologie Procede et moyens pour l'obtention de modeles cellulaires et animaux de maladies neurodegeneratives
US20040142325A1 (en) * 2001-09-14 2004-07-22 Liat Mintz Methods and systems for annotating biomolecular sequences
WO2009125646A1 (ja) * 2008-04-09 2009-10-15 財団法人東京都医学研究機構 Ｔｄｐ－４３蓄積細胞モデル

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11502925A (ja) * 1995-03-27 1999-03-09 エフ・ホフマン−ラ ロシュ アーゲー タウ−タウ会合の阻害
US6187785B1 (en) * 1995-10-23 2001-02-13 Selena Pharmaceuticals, Inc. Agent for treating neurodegenerative disorders
JP2008101899A (ja) 2006-09-12 2008-05-01 Bromic Pty Ltd ガスヒータ

Non-Patent Citations (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Current Protocols in Molecular Biology", 1987, JOHN WILEY AND SONS
"Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
ARAI T ET AL., RES. COMMUN., vol. 351, no. 3, 2006, pages 602 - 611
ARAI T ET AL.: "TDP-43 is a component of ubiquitin-positive tau-negative inclusions in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis", BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 351, no. 3, 2006, pages 602 - 611
ARAI T. ET AL.: "TDP-43 is a component ot ubiquitin-positive tau-negative inclusions in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.", BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 351, no. 3, 2006, pages 602 - 611, XP008130902 *
BURATTI E ET AL., EMBO J., 2001
BURATTI E ET AL.: "Nuclear factor TDP-43 and SR proteins promote in vitro and in vivo CFTR exon 9 skipping", EMBO J., vol. 20, no. 7, 2001, pages 1774 - 1784
BURATTI E. ET AL.: "TDP-43 binds heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A/B through its C-terminal tail: an important region for the inhibition of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator exon 9 splicing.", J. BIOL. CHEM., vol. 280, no. 45, 2005, pages 37572 - 37584, XP008132306 *
BURATTI ET AL., EMBO J., 2001
DENG HX ET AL.: "Amyotrophic lateral sclerosis and structural defects in Cu, Zn superoxide dismutase", SCIENCE, vol. 261, 1993, pages 1047 - 1051
GESER F ET AL.: "Evidence of multisystem disorder in whole-brain map of pathological TDP-43 in amyotrophic lateral sclerosis", ARCH. NEUROL., vol. 65, 2008, pages 636 - 641
JUN WU ET AL., MOLECULAR NEURODEGENERATION, vol. 3, 2008, pages 15
MACKENZIE IR ET AL.: "Pathological TDP-43 distinguishes sporadic amyotrophic lateral sclerosis from amyotrophic lateral sclerosis with SOD mutations", ANN. NEUROL., vol. 61, 2007, pages 427 - 434
NEUMANN M ET AL., SCIENCE, vol. 314, no. 5796, 2006, pages 130 - 133
NEUMANN M ET AL.: "Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis", SCIENCE, vol. 314, no. 5796, 2006, pages 130 - 133
NEUMANN M. ET AL.: "Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.", SCIENCE, vol. 314, no. 5796, 2006, pages 130 - 133, XP002534603 *
NISHIHIRA Y ET AL.: "Sporadic amyotrophic lateral sclerosis: two pathological patterns shown by analysis of distribution of TDP-43-immunoreactive neuronal and glial cytoplasmic inclusions", ACTA. NEUROPATHOL., vol. 116, 2008, pages 169 - 182
NONAKA T. ET AL.: "Phosphorylated and ubiquitinated TDP-43 pathological inclusions in ALS and FTLD-U are recapitulated in SH-SY5Y cells.", FEBS LETT., vol. 583, no. 2, January 2009 (2009-01-01), pages 394 - 400, XP025926484 *
ROSEN DR ET AL.: "Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis", NATURE, vol. 362, 1993, pages 59 - 62
See also references of EP2272955A4
TAN CF ET AL.: "TDP-43 immunoreactivity in neuronal inclusions in familial amyotrophic lateral sclerosis with or without SOD 1 gene mutation", ACTA. NEUROPATHOL., vol. 113, 2007, pages 535 - 542

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2258857A1 (en) * 2009-06-02 2010-12-08 Academia Sinica TDP-43 transgenic mouse model for frontotemporal lobar degeneration with ubiquitin-positive inclusions (FTLD-U)
JPWO2013073219A1 (ja) * 2011-11-18 2015-04-02 公益財団法人東京都医学総合研究所 神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体の製造方法
US9624279B2 (en) 2011-11-18 2017-04-18 Tokyo Metropolitan Institute Of Medical Science Method for producing insoluble aggregate of neurodegenerative-disease-related protein
JP2013162772A (ja) * 2012-02-13 2013-08-22 Shiga Univ Of Medical Science Ｔｄｐ−４３の凝集体が蓄積する疾患の発症リスクを予測する方法、診断薬及び治療薬
JP2014171425A (ja) * 2013-03-08 2014-09-22 Shiga Univ Of Medical Science Ｔｄｐ−４３の凝集体が蓄積する疾患を治療及び／又は予防するための化合物のスクリーニング方法
WO2017170986A1 (ja) * 2016-03-31 2017-10-05 東レ株式会社 不溶化ｔｄｐ－４３蛋白質の蓄積誘導剤、神経変性疾患モデル細胞の作製方法及び神経変性疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法
JP2017197443A (ja) * 2016-04-25 2017-11-02 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター Ｔｄｐ−４３プロテイノパチー治療用組成物
JP2018117638A (ja) * 2018-04-18 2018-08-02 国立大学法人滋賀医科大学 Ｔｄｐ−４３の凝集体が蓄積する疾患を治療及び／又は予防するための化合物のスクリーニング方法

Also Published As

Publication number Publication date
US9128081B2 (en) 2015-09-08
US20140099660A1 (en) 2014-04-10
JPWO2009125646A1 (ja) 2011-08-04
US20110034447A1 (en) 2011-02-10
EP2272955B1 (en) 2015-08-26
US8715643B2 (en) 2014-05-06
JP5667872B2 (ja) 2015-02-12
EP2272955A1 (en) 2011-01-12
EP2272955A4 (en) 2011-11-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5667872B2 (ja) Ｔｄｐ−４３蓄積細胞モデル
JP6290212B2 (ja) タウオパチーの処置方法
US8394929B2 (en) Nogo receptor-mediated blockade of axonal growth
JP6446443B2 (ja) タウオパチーの処置方法
KR102854388B1 (ko) RGMa 결합 단백질 및 그 사용
SK9992002A3 (en) Nogo receptor-mediated blockade of axonal growth
JP2006524827A (ja) 組織保護サイトカイン受容体複合体、組織保護化合物を同定するアッセイおよびそれらの使用
US20190234935A1 (en) Methods for screening for modulators of gdf15-like biological activity
JP2001523099A (ja) 白血球免疫グロブリン様受容体（ｌｉｒ）と命名される免疫調節剤ファミリー
EP3072527B1 (en) Immunosuppressant
US7422906B2 (en) Apoptosis-inducing gene and utilization of the same
KR101678961B1 (ko) 뇌전증 동물모델 및 그의 제조 방법
US20230416375A1 (en) Antibody variants against wnt receptor ryk
RU2846293C1 (ru) АНТИТЕЛО К EphA4
JP5971966B2 (ja) Ｔｄｐ−４３の凝集体が蓄積する疾患の発症リスクを予測する方法、診断薬及び治療薬
WO2007108557A1 (ja) Ｉｐ３受容体結合タンパク質による細胞内標的分子の制御
JPWO2005056597A1 (ja) 免疫グロブリンＦｃ受容体タンパク質
EP4269588A1 (en) Anti-epha4 antibody
TW202525338A (zh) 細胞穿透劑及其用途
WO2007049642A1 (ja) カプサイシン受容体の活性調節剤、及びそれを用いた医薬組成物
ZA200205403B (en) Nogo receptor-mediated blockade of axonal growth.

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09730344

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12936585

Country of ref document: US

Ref document number: 2010507197

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009730344

Country of ref document: EP