WO2009119874A1

WO2009119874A1 - 単球から樹状細胞様分化を誘導し、抗癌免疫活性を高める癌の治療又は予防のための医薬組成物

Info

Publication number: WO2009119874A1
Application number: PCT/JP2009/056428
Authority: WO
Inventors: 公文裕巳; 那須保友; 渡部昌実; 柏倉祐司
Original assignee: Okayama University NUC
Current assignee: Okayama University NUC
Priority date: 2008-03-28
Filing date: 2009-03-24
Publication date: 2009-10-01
Anticipated expiration: 2010-09-28
Also published as: AU2009229756B2; KR20110014142A; US20120034251A1; JPWO2009119874A1; AU2009229756A1; CN102026647A; EP2275114A1; EP2275114B1; KR101661365B1; JP5447861B2; EP2275114A4; CN102026647B; US8614093B2; US20140056945A1

Abstract

樹状細胞様細胞を誘導・活性化し、癌を免疫療法により治療又は予防する組成物の提供。　以下のREICタンパク質を有効成分として含む、癌免疫活性化剤：(a)　配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；又は(b)　配列番号２に表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸を置換、欠失、または付加してなるアミノ酸配列からなり、かつ単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するタンパク質。

Description

単球から榭状細胞様分化を誘導し、抗癌免疫活性を高める癌の治療

又は予防のための医薬組成物

技術分野

本発明は、抗癌免疫活性を高める癌の治療又は予防のための医薬組成物に関する。

明田

背景技術

樹状細胞（Dendritic cell : DC) は生体内で最も強力な抗原提示細胞であり、 T 細胞に抗原を提示することにより免疫応答を誘導することが知られている。また、 DCは T細胞のみでなく B細胞、 NK細胞、 NKT細胞などとも直接作用し、免疫反応における中枢的役割を担う細胞であることが知られている。未成熟 DCは抗原刺激を受けることによって、 CD40、 CD80、 CD86などの発現上昇を伴い高い T細胞刺激能を獲得すると共に末梢リンパ組織に移行して、取り込んだ抗原に特異的な Τ細胞を活性化することによって免疫応答を誘導する。

一般に、血液前駆細胞より榭状細胞（様）の分化を誘導できると認められている物質は、文献的にも、数えるほどしか無く、そのほとんどが著名なサイトカインである。例えば、 GM-CSF と Iい 4の併用による分化誘導について多くの報告が成され、樹状細胞分化のゴールデンスタンダードとされている。その他に、単剤もしくは併用により樹状細胞を分化誘導できる物質として、 TNF- alpha、IL- 2、IL- 3、 IL-6, I 7、 IL-12 I 13、 Iい 15、 HGF (Hepatocyte growth factor) , CD40 l igand, M- CSF、 Flt3 l igand、 TGF- beta が報告されている。これらのタンパク質のうち、単剤のみでその前駆細胞から榭状（様）細胞を分化誘導できる物質としては、 IL-2、 IL-15、 HGF、 CD40 l igandが挙げられる。このうち抗癌効果が in vivoにおいて認められるのは、 IL-2のみである（非特許文献 1を参照）。

一方、細胞の不死化に関連した遺伝子として、 REIC遺伝子が知られており、がん細胞ではこの遺伝子の発現が抑制されていることが報告されている（特許文献 1及び非特許文献 2から 5を参照）。

REIC遺伝子は Dkkフアミリーのメンバーであり、そのうち Dkk- 1が Wnt受容体を介して Wntシグナル伝達を阻害することが示唆されている（非特許文献 6及ぴ 7を参照）。 Wnt遺伝子は、細胞の成長、分化、がん化などの重要な生物学的状況に多面的な役割を果たすことが報告されている（非特許文献 8を参照）。従って、 Dkk ファミリー（ヒトでは現在 4つの遺伝子が知られている）は恐らく同様に細胞の成長、分化、がん化において重要な機能を担うと考えられるが、大部分は未解明のままである。

特許文献 1 国際公開第 W001/038523号パンフレット

非特許文献 1 Zou GM. Et al . , Eur Cytokine Netw. 2002 Apr- Jun ; 13 (2) : 186-99.

非特許文献 2 Tsuj i, T. et al. , BiochemBiophys Res Commun 268, 20—4

(2000)

非特許文献 3 Tsu.i i, T. et al. , BiochemBiophys Res し ommun 289, 2oト o3

(2001)

非特許文献 4 Nozaki, I. et al. Int J Oncol 19, 117-21 (2001) ' 非特許文献 5 Kurose, K. et al. J Urol 171, 1314-8 (2004)

非特許文 6 Baf ico, A. et al. Nat Cel l Biol 3， 683—6 (2001) 非特許文献 7 Hoang, B. H. et al Cancer Res 64, 2734 - 9 (2004) 非特許文献 8 Moon, R. T. et al. Science 296, 1644—6 (2002) 発明の開示

本発明は、樹状細胞様細胞を誘導 ·活性化し、癌を免疫療法により治療又は予防することを目的とする。

上記のように、免疫学的な癌治療剤としての IL-2タンパク質は、腎細胞癌などの特殊な癌種において治療効果を有することある。しかしながら、その投与適応のある癌種及びその効果は限定的なものであることも、臨床的には周知の事実である。

本発明者らは、先に本発明者等が単離した REIC (REIC/Dkk-3) タンパク質の癌免疫治療における効果について鋭意検討を行った。その結果、本発明者等は REIC タンパク質が単球より樹状細胞様細胞を分化誘導させ、該樹状細胞様細胞が癌抗原に対する免疫反応を惹起し、癌を治療又は予防し得ることを見出し、 REICタンパク質を樹状細胞分化誘導剤、癌免疫活性化剤及び癌の治療又は予防剤として用いることに関する本発明を完成させた。本発明者らは、ほとんどすべての癌種において発現 ·分泌低下の認められる REICタンパク質は、それらの様々な癌種におレ、て癌免疫活性化作用を有する癌治療剤として使用できる可能性があること、またその治療効果についても IL - 2 と比べて優位性を持つ可能性があることを見出した。本発明者らは、 REICタンパク質自身が抗癌免疫を誘導し得ることを証明し、生体内での免疫 ·炎症現象における REICタンパク質の有用性を確認した。発癌の観点から考えると、癌化の進む組織内では REICタンパク質の濃度が低いと考えられ（多くの種類の癌細胞では、 REICタンパク質の発現、分泌が欠如、低下しているため）、その為、抗癌免疫活性が癌組織内では誘導されにくく、生体免疫が癌を見逃して（癌細胞の免疫学的寛容）、癌が増殖、悪化すると考えられる。 REIC タンパク質は、このような状況下、抗癌免疫活性化による癌化 ·発癌予防剤としても有用である。

すなわち、本発明は以下の通りである。

[ 1 ] 以下の REKタンパク質を有効成分として含む、単球からの榭状細胞様細胞分化誘導剤：

(a) 配列番号 2に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；又は

(b) 配列番号 2に表されるアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸を置換、欠失、または付加してなるアミノ酸配列からなり、かつ単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するタンパク質。

[ 2 ] 単球が末梢血単球である [ 1 ]の単球からの榭状細胞様細胞分化誘導剤。

[ 3 ] 以下の REICタンパク質を有効成分として含む、癌免疫活性化剤：

(b) 配列番号 2に表されるアミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸を置換、欠失、または付加してなるアミノ酸配列からなり、かつ単球からの榭状細胞様細胞分化誘導活性を有するタンパク質。 [ 4 ] 単球が末梢血単球である [ 3 ]の癌免疫活性化剤。

[5] [ 3 ]又は [ 4 ]に記載の癌免疫活性化剤を含む、癌免疫活性化作用を有する、癌の治療又は予防のための医薬組成物。

[6] 以下の REICDNAを有効成分として含む、単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤：

(a) 配列番号 1に表される塩基配列からなる DNA；又は

(b) 配列番号 1に表される塩基配列に相補的な塩基配列からなる DNA にストリンジェントな条件でハイブリダィズする DNAであって、単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するタンパク質をコードする DNA。

[ 7 ] 単球が末梢血単球である [ 6 ]の単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤。

[8] 以下の REIC DNAを有効成分として含む、癌免疫活性化剤：

(a) 配列番号 1に表される塩基配列からなる DNA；又は

(b) 配列番号 1に表される塩基配列に相捕的な塩基配列からなる DNA にストリンジェン卜な条件でハイブリダイズする DNAであって、単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するタンパク質をコードする DNA。

[ 9 ] 単球が末梢血単球である [ 8 ]の癌免疫活性化剤。

[10] [8]又は [9]の癌免疫活性化剤を含む、癌免疫活性化作用を有する、癌の治療又は予防のための医薬組成物。

[1 1] 以下の REICDNAを含むベクターを有効成分として含む単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤：

(a) 配列番号 1に表される塩基配列からなる DNA；又は

(b) 配列番号 1に表される塩基配列に相補的な塩基配列からなる DNA にストリンジェントな条件でハイブリダイズする DNAであって、単球からの樹状細胞若しくは榭状細胞様細胞分化誘導活性を有するタンパク質をコードする DNA。

[1 2] ベクターがアデノウィルスベクタ一である [1 1]の単球からの榭状細胞様細胞分化誘導剤。

[1 3] 単球が末梢血単球である [1 1]又は[1 2]の単球からの榭状細胞様細胞分化誘導剤。

[14] 以下の REICDNAを含むベクターを有効成分として含む癌免疫活性化剤： (a) 配列番号 1に表される塩基配列からなる DNA；又は

(b) 配列番号 1に表される塩基配列に相補的な塩基配列からなる DNA にストリンジ工ントな条件でハイブリダイズする DNAであって、単球からの榭状細胞若しくは樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するタンパク質をコードする DNA。

[1 5] 単球が末梢血単球である [ 14 ]の癌免疫活性化剤。

[1 6] ベクターがアデノウィルスベクターである [1 4]又は[1 5]の癌免疫活性化剤。

[1 7] [14]~[1 6]のいずれかの癌免疫活性化剤を含む、癌免疫活性化作用を有する、癌の治療又は予防のための医薬組成物。

[1 8] ベクターがアデノウィルスベクターである [1 7]の癌免疫活性化作用を有する、癌の治療又は予防のための医薬組成物。

[1 9] 動物から採取した単球を、 in vitroで以下の REICタンパク質の存在下で培養することを含む、 CD14陽性単球より樹状細胞様細胞を分化誘導する方法：

(a) 配列番号 2に表されるアミノ酸配列からなるタンパグ質；又は

[20] 単球が末梢血単球である [ 1 9]の方法。

[2 1] [1 9]又は [20]の方法により、 REICタンパク質により活性化された単球より分化誘導された榭状細胞様に分化した細胞。

[22] CDllc、 CD40、 CD80、 CD86、 HLA- DR、及び CD が陽性であり、 CDlaが陰性である、 [2 1]の樹状細胞様に分化した細胞。

[23] フローサイトメトリーにより細胞表面の抗原を解析した場合に、 GM- CSF 及び IL- 4を用いて単球から誘導された樹状細胞に比べて、 CD14が多く発現しており、 CDlaがほとんど発現していない [2 1]の榭状細胞様に分化した細胞。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2008-086516号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。図面の簡単な説明図 1は、精製したヒト REICタンパク質のウェスタンブロット分析の結果を示す写真である。

図 2は、ヒト REICタンパク質添加による末梢血単球からの榭状細胞様分化誘導を示す位相差顕微鏡像を示す写真である。

図 3は、ヒト REICタンパク質添加により分化誘導される樹状細胞様細胞の全細胞に占める割合を示す図である。

図 4は、ヒト REICタンパク質添加による末梢血単球（CD14陽性細胞）からの樹状細胞様分化誘導を示す写真である。

図 5は、ヒト REICタンパク質添加による末梢血単球の STAT活性化を示す写真である。

図 6 Aは、ヒト REICタンパク質添加により分化誘導された樹状細胞様細胞のフローサイトメトリ一による解析の結果を示す図である。

図 6 Bは、ヒト REICタンパク質添加により分化誘導された樹状細胞様細胞のフローサイトメトリーによる解析の結果を示す図である。

図 7は、ヒト REICタンパク質の腫瘍内投与実験のプロトコールを示す図である。図 8 Aは、ヒト REICタンパク質の腫瘍内投与による腫瘍増殖抑制効果（腫瘍体積の経時的変化）を示す図である。

図 8 Bは、ヒト REICタンパク質の腫瘍内投与による腫瘍増殖抑制効果（腫瘍重量）を示す図である。

図 8 Cは、ヒト REICタンパク質の腫瘍内投与による腫瘍増殖抑制効果（腫瘍の写真）を示す写真である。

図 9は、ヒト REICタンパク質の腫瘍内投与による抗癌免疫活性の上昇を示す図である。

図 1 0は、ヒト REICタンパク質添加による末梢血単核球からの榭状細胞様分化誘導を示す図である。

図 1 1は、ヒト REIC タンパク質添加により誘導された樹状様細胞における CD4+T細胞（リンパ球）を用いたァロ（異系同種）反応誘導活性を示す図である。発明を実施するための最良の形態以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤、癌免疫活性化剤及び癌免疫活性化作用を有する、癌の治療又は予防のための医薬組成物は、 REIC DNA又は該 DNA がコードする REICタンパク質を有効成分として含む。

REIC DNAの塩基配列は、配列番号 1に表される。また、 REIC DNAがコードする REICタンパク質のアミノ酸配列は配列番号 2に表される。

本発明の単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤、癌免疫活性化剤及び癌免疫活性化作用を有する、癌の治療又は予防のための医薬組成物に含まれる REIC DNA をコードするタンパク質は、配列番号 2に表されるアミノ酸配列又は配列番号 2 に表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、単球からの榭状細胞様細胞分化誘導活性を有するタンパク質である。ここで、実質的に同一のァミノ酸配列としては、当該アミノ酸配列に対して 1又は複数若しくは数個（1〜10 個、好ましくは 1〜5個、さらに好ましくは 1個若しくは 2個）のアミノ酸が置換、欠失及び Z又は付加されたアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と、 BLAST (Basic Local Al ignment Search Tool at the National Center for Biological Information (米国国立生物学情報センターの基本ローカルァラインメント検索ツール））等 (例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも 85%以上、好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95% 以上、特に好ましくは 97%以上の同一性を有しているものが挙げられる。

REIC DNAをコードするタンパク質は、配列番号 1又は配列番号 2の配列情報に基づいて、化学合成により得ることができる。また、遺伝子工学的手法により組換え REICタンパク質として得ることができる。さらに、 W001/038523号公報の記載に従って得ることも可能である。

本発明の単球からの榭状細胞様細胞分化誘導剤、癌免疫活性化剤及び癌免疫活性化作用を有する、癌の治療又は予防のための医薬組成物に含まれる REIC DNA は、配列番号 1に表される塩基配列に相補的な塩基配列を有する DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNA、配列番号 1に表される塩基配列と、

BLAST (Basic Local Al ignment Search Too丄 at the National Center for Biological

Information (米国国立生物学情報センターの基本ローカルァラインメント検索ッ一ル））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも 85%以上、好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上、特に好ましくは 97%以上の同一性を有している DNA、又は前記 DNA によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して 1又は複数若しくは数個 (1〜10個、好ましくは 1〜5個、さらに好ましくは 1個若しくは 2個）のアミノ酸が置換、欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DNAなどのうち、単球からの榭状細胞様細胞分化誘導活性を有するタンパクをコードするものである。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、「1 XSSC、 0. 1% SDS、 37°C」程度の条件であり、より厳しい条件としては「0. 5XSSC、 0. 1% SDS、 42°C」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「0. 2XSSC、 0. 1% SDS、 65°C」程度の条件である。さらに、本発明の単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤、癌免疫活性化剤及び癌免疫活性化作用を有する、癌の治療又は予防のための医薬組成物に含まれる REIC DNAは、配列番号 2に表されるタンパク質をコードする DNAである。

ここで、単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性とは、単球に作用して榭状細胞様細胞に分化させる活性をいう。 REICタンパク質添加により榭状細胞様細胞が分化誘導されたか否かは、形態的特徴及び表面抗原により検出することができる。すなわち、この榭状細胞様細胞の特徴としては、形態学的に樹状突起を有するということと、さらにフローサイトメトリーによる解析により、表面抗原として、樹状細胞のマーカーである CDl lc、 CD40、 CD80、 CD86、 HLA- DRが陽性であることが挙げられる。

REIC DNAは、配列番号 1の配列情報に基づいて、ヒト細胞、ヒト組織等から得ることができる。また、 W001/038523 号公報の記載に従って得ることも可能である。

さらに、本発明は REIC DNAを含むベクターをも包含する。該ベクターを被験体に導入することにより、被験体体内で REICタンパク質が発現し単球からの榭状細胞様細胞分化誘導効果、癌免疫活性化効果及び癌免疫活性化作用による癌の治療又は予防効果を発揮し得る。

遺伝子治療における目的の遺伝子（DNA)の被験体への導入は公知の方法により行うことができる。遺伝子を被験体へ導入する方法として、ウィルスベクターを用いる方法及び非ウィルスベクターを用いる方法があり、種々の方法が公知である（別冊実験医学、遺伝子治療の基礎技術、羊土社、 1996 ;別冊実験医学、遺伝子導入 &発現解析実験法、羊土社、 1997 ; 日本遺伝子治療学会編、遺伝子治療開発研究ハンドブック、ェヌ ' ティー ' エス、 1999)。

遺伝子導入のためのウィルスベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルス、レトロウィルス等のウィルスベクターを用いた方法が代表的なものである。無毒化したレトロウイルス、へノレぺスウィルス、ワクシニアウィルス、ポックスウイ/レス、ポリォゥイノレス、シンビスウイ/レス、センダイウイノレス、 SV40、免疫不全症ウィルス（HIV)等の DNAウィルス又は RNAウィルスに目的とする遺伝子を導入し、細胞に組換えウィルスを感染させることによって、細胞内に遺伝子を導入することが可能である。

本発明に係る遺伝子をウィルスを用いた遺伝子治療に使用するとき、アデノゥィルスべクタ一が好ましく用いられる。アデノウィルスベクタ一の特徴として、

( 1 ) 多くの種類の細胞に遺伝子導入ができる、（2 ) 増殖停止期の細胞に対しても効率よく遺伝子導入ができる、（3 ) 遠心により濃縮が可能であり、高タイター

(10〜l lPFU/ml以上）のウィルスが得られる、（4 ) in vivoの組織細胞への直接の遺伝子導入に適している、といった点が挙げられる。遺伝子治療用のアデノ 'ゥィルスとしては、 E1/E3 領域を欠失させた第 1世代のアデノウィルスべクター

(Miyake, S. , et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA.， 93, 1320， 1996)から、 E1/E3領域に加え、 E2 若しくは E4 領域を欠失させた第 2世代のアデノウィルスベクター

(Lieber, A. , et al.， J. Virol. , 70, 8944, 1996 ;Mizuguchi, H. &Kay, M. A.， Hum. Gene

Ther. , 10, 2013, 1999)、アデノウィルスゲノムをほぼ完全に欠失させた（GUTLESS) 第 3 世代のアデノウィルスべクター（Steinwaerder, D. S.， et al. , J. Virol. , 73, 9303, 1999)が開発されているが、本発明に係る遺伝子を導入するには、特に限定されず、いずれのアデノウィルスベクターでも使用可能である。さらに、 AAVの染色体に組み込み能を付与したアデノ -AAVハイプリッドベクター

(Recchia, A.， et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 96, 2615， 1999)や、トランスポゾンの遺伝子を用いることにより染色体に組み込む能力を有したアデノウィルスべクタ一などを利用すれば、長期的な遺伝子発現にも応用が可能である。また、ァデノウィルスファイバーの HI ループに組織特異的な移行性を示すペプチド配列を挿入することにより、アデノウィルスベクターに組織特異性を付与することも可能である（Mizuguchi, H. &Hayakawa, T.， Nippon Rinsho, 7, 1544, 2000) ₀

本発明において、 REIC DNAを含むアデノウイルスベクターを Ad - REICと呼ぶ。また、上記ウィルスを用いることなく、プラスミドベクター等の遺伝子発現べクタ一が組み込まれた組換え発現ベクターを用いて、目的遺伝子を細胞や組織に導入することができる。例えば、リポフエクシヨン法、リン酸-力ルシゥム共沈法、 DEAE-デキストラン法、微小ガラス管を用いた DNAの直接注入法などにより細胞内へ遺伝子を導入することができる。また、内包型リボソーム（internal liposome) による遺伝子導入法、静電気型リボソーム（electorostatic type l iposome)による遺伝子導入法、 HVJ -リボソーム法、改良型 HVJ-リポソーム法（HVJ- AVE リポソ一ム法）、 HVJ-E (エンベロープ）ベクタ一を用いた方法、レセプター介在性遺伝子導入法、パーティクル銃で担体（金属粒子）とともに DNA分子を細胞に移入する方法、 naked-DNA の直接導入法、種々のポリマーによる導入法等によっても、組換え発現ベクターを細胞内に取り込ませることが可能である。この場合に用いる発現べクタ一としては、生体内で目的遺伝子を発現させることのできるベクターであれば如何なる発現ベクターも用いることができるが、例えば pCAGGS (Gene 108, 193-200 (1991) ) や、 pBK- CMV、 pcDNA3、 1、 pZeoSV (インビトロゲン社、ストラタジーン社）、 pVAXlなどの発現ベクターが挙げられる。

REIC DNAを含むベクターは、適宜遺伝子を転写するためのプロモーターゃェンハンサー、ポリ Aシグナル、遺伝子が導入された細胞の標識及び/又は選別のためのマーカ一遺伝子等を含んでいてもよい。この際のプロモーターとしては、公知のプロモーターを用いることができる。

本発明の REIC DNAを含むベクターを被験体へ導入するには、遺伝子治療剤を直接体内に導入する in vivo法、及び、ヒトからある種の細胞を取り出して体外で遺伝子治療剤を該細胞に導入し、その細胞を体内に戻す ex vivo法等を用いればょレ、（日経サイエンス、 1994年 4月号、 20- 45頁；月刊薬事、 36 (1)， 23-48 (1994)；実験医学増刊、 12 (15)、 (1994)；日本遺伝子治療学会編、遺伝子治療開発研究、ンドブック、ェヌ ·ティー 'エス、 1999)。

本発明において、単球は末梢血由来単球、骨髄由来単球、脾臓細胞由来単球、臍帯血由来単球が含まれ、この中でも末梢血由来の単球が好ましい。単球は、 CD14 陽性を特徴とし、生体から単球を採取し、 REIC タンパク質で樹状細胞様細胞に誘導させる場合、 CD14の存在'を指標に FACS (Fluorescent activated cel l sorter) またはフローサイトメータ一等により採取することができる。単球の由来動物種は限定されず、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ゥサギ、ネコ、ィヌ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、ゥマ、ャギ、サル、ヒト等の哺乳動物を用いることができる。 FACS による特定の細胞集団の単離は公知の方法により行なえばよい。 FACS、フローサイトメ一ターとしては例えば FACS vantage (べクトン 'ディッキンソン社製）、 FACS Cal ibur (べクトン ·ディッキンソン社製）等を用いることができる。単球の培養は、周知のヒトリンパ系細胞の培養技術により行なうことができる。培養液としては例えば RPMI 1640や DMEMの公知の基本培地を用いればよい。これらの基本培地に適当な抗生物質や動物血清等を添加して培養すればよい。培養容器は限定されず、培養規模に応じて市販のプレート、ディッシュ、フラスコを適宜選択して用いることができる。

本発明は、 in vitroで単球を REICタンパク質の存在下で培養し、単球を榭状細胞様細胞に分化誘導させる方法を含む。該方法においては、例えば単球を 10⁴ 〜10⁷細胞/ ml の濃度で用い、 REIC タンパク質を 1〜20 μ g/ml の濃度で添加して培養すればよい。

樹状細胞は、生体内において、癌免疫、炎症などの機構に極めて重要な役割を果たしている。本発明の方法により REICタンパク質により分化誘導された樹状細胞様細胞は、 IL-4 + G -CSF で誘導される榭状細胞に形態学的に似ているが、厳密には異なる新規な樹状細胞様細胞である。 REICタンパク質により誘導される榭状細胞様細胞は、榭状の形態を有している。また、樹状細胞のマーカーである、 CDl lc、 CD40、 CD80、 CD86、 HLA-DR が陽性である。この点、本発明の新規な樹状細胞様細胞は樹状細胞として分類することができる。しかしながら、榭状細胞のマーカーである CDla は陰性であり、一般的に樹状細胞では陰性化するとされる CD14は陽性である。 REICタンパク質の刺激により CD14陽性単球から誘導される場合は、「REICタンパク質により活性化された、榭状細胞様に分化した細胞（REIC activated monocyte with dendritic cell features)」と呼ふ。

本発明は、 REICタンパク質により CD14陽性単球から誘導された榭状細胞様細胞を包含する。

REICタンパク質に誘導され得られた樹状細胞様細胞は、癌免疫療法に用いることができる。すなわち、被験体より単球を採取し、該単球を REICタンパク質と共に培養し、樹状細胞様細胞を誘導し、得られた樹状細胞様細胞を被験体に戻すことにより、樹状細胞様細胞自体を癌治療又は予防等に用いることができる。この際、 REICタンパク質により誘導された樹状細胞様細胞は、癌種非特異的に作用し、癌免疫治療効果を発揮し得るが、樹状細胞様細胞を誘導する際に癌種特異的な腫瘍抗原を添加してもよい。また、誘導した樹状細胞様細胞を特定の腫瘍抗原と共に培養してもよい。樹状細胞様細胞を癌種特異的な腫瘍抗原で刺激することにより、腫瘍特異的に癌細胞を攻撃することが可能になる。また、本発明の REICタンパク質により誘導された榭状細胞様細胞は、 CD4+T細胞を増殖させる能力を有し、被験体の抗癌免疫活性を増大させることができる。

榭状細胞様細胞は、皮内投与、皮下投与、静脈内投与又はリンパ節内投与により投与することができる。

また、 REICタンパク質は、細胞外から細胞に作用して細胞の分化を司るサイト力イン様作用を有すると考えられ、生体内において広く、免疫性、炎症性に関する機能を有すると考えられる。従って、 REICタンパク質又はそれをコードする DNA を、被験体に投与し、 in vivo での樹状細胞様細胞分化誘導剤、又は樹状細胞様細胞活性化剤として用いることができる。 REICタンパク質は被験体内で榭状細胞様細胞を誘導し、その結果、榭状細胞様細胞により被験体内で抗癌性をもつリンパ球が全身性に活性化され癌免疫作用を発揮する。従って、 REICタンパク質又はそれをコードする DNAを癌免疫活性化剤として用いることができる。さらに、 REIC タンパク質により誘導された榭状細胞様細胞は癌免疫作用を有しているので、

REICタンパク質又はそれをコードする DNAを癌の治療又は予防のための医薬組成物（癌免疫治療剤）として用いることができる。この際、 REICタンパク質又はそれをコードする DNAを単独で投与してもよく、この場合、癌種非特異的に効果を発揮する。あるいは、特定の腫瘍抗原と共に投与してもよい。この場合は、癌種特異的に効果を発揮し得る。

本発明の治療又は予防対象となる癌としては、脳 ·神経腫瘍、皮膚癌、胃癌、肺癌、肝癌、リンパ腫 · 白血病、結腸癌、瞵癌、肛門 ·直腸癌、食道癌、子宮癌、乳癌、副腎癌、腎癌、腎盂尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、尿道癌、陰茎癌、精巣癌、骨 ·骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫、中皮腫等が挙げられる。特に、乳癌、膀胱癌が好ましい。

本発明の単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤、癌免疫活性化剤及び癌免疫活性化作用を有する、癌の治療又は予防のための医薬組成物は、 REIC DNA、該 DNA を含むベクター、若しくは該 DNAがコードするタンパク質並びに薬理学的に許容され得る担体、希釈剤若しくは賦形剤を含む。

本発明の単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤、癌免疫活性化剤及び癌免疫活性化作用を有する、癌の治療又は予防のための医薬組成物は、種々の形態で投与することができ、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、あるいは注射剤、点滴剤、座薬、スプレー剤、点眼剤、経鼻投与剤、貼付剤などによる非経口投与を挙げることができる。

本発明の単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤、癌免疫活性化剤及び癌免疫活性化作用を有する、癌の治療又は予防のための医薬組成物は、局所投与することも可能であり、例えば癌部位に注射により投与することによりその効果を発揮し得る。

好ましくは、癌病変局所に 1回又は複数回、癌病変全体に本剤が行き渡るように直接注入を行う。

本発明の単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤、- 癌免疫活性化剤及び癌免疫活性化作用を有する、癌の治療又は予防のための医薬組成物は、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用してもよい。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。

その投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、数日又は数週間又は数ケ月おきに 1回あたり、 0. 001mg〜100mgを皮下注射、筋肉注射、又は静脈注射によって投与すればよレ、。

本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。

組換えヒト REICタンパク質の調製

組換えヒト REICタンパク質は以下の方法で調製した。

1. 全長ヒト REIC の遺伝子をコードするプラスミドをエレクトロポレーションにより CH0細胞に導入し、ヒト REIC安定発現クローンを確立した。トータル 10⁷ 細胞を 2mM L -グルタミン及び 8 μ Μ ピューロマイシン含有無タンパク質培地 (C5467、 Sigma)を用いて 5 %C0₂、 37°Cで 1週間穏やかにシヱーキングして培養した。 5分間、 2, 000rpmの遠心分離で CH0細胞培養を回収し、上清を集めた（1L)。

2. 40分間、 4 °C、 15000rpmで上清を遠心分離した。

3. 0. 22 /z mのフィルタ（TP99505、 TPP、 Trasadingen, スイス）を用いて上清をろ過した。

4. 上清 ( 1 L) ^ TALON Resin (#635501 Clontech Laboratories) (ベッドボジユームに対して 3mlの Resin)を添加した。

5. 4 °Cでオーバーナイトで穏やかに回転させた。

6. 4 °C、 700g、 5分間遠心分離を行い、 Resinを集めた。

7. 上清を除去した。

8. 40ralの洗浄バッファ（50mlのリン酸ナトリウム、 600mM NaCl)で TALON Resin を洗浄した。

9. 4 °C、 700g、 5分間遠心分離を行った。

10. 上清を除去した。

11. 上記 8 〜 1 0のステップを 3回繰り返した。

12. TALON Resinと 15mlの洗浄バッファを添加し、再懸濁した。 13. 3mlの TALON Resinを重力流カラムに移した。

14. カラムに 15ralの溶出バッファを添加し、 HISタグ付きタンパク質を溶出し、ヒト REICタンパク質を回収した。

15. FPLC (Fast Prtein Liquid Chromatography)に供するために、溶出液を 20mM Tris-HCU pH7. 5、 0. 1M NaClを用いて透析した。

16. FPLC (MonoQ5/50GLカラム、 GE Healthcare)を用いて、以下の条件でヒト REIC タンパク質を精製した。

バッファ

MonoQバッファ A : 20ram Tris_HCl、 pH7. 5、 0. 1M NaCl

MonoQバッファ B： 20mm Tris- HC1、 pH7. 5、 0. 5M NaCl

流速： 1ml/分

流量： 70ml

フラクションサイズ： 1ml

17. フラクションを抗ヒト REIC抗体を用いて、 SDS- PAGE及びウェスタンブロットで分析した。最終調製物は SDS- PAGEにより純度 95%を超えていることを確認した（図 1 )。

18. 適切なフラクションを回収した。

19. PBSを用いて透析し、ストック又は使用した。

20. Centriplus YM- 50 (#4423、 mi l ipore)を用いて濃縮した。

21. ブラッドフォード法により、タンパク質濃度を検定した。

22. タンパク質のストツク溶液は使用するまで- 80°Cに保存した。

ヒト単球の調製

ヒト PBMC (末梢血単球）は健康なドナーの血液から Ficoll - Paque遠心分離を用いた標準的方法で行った。細胞の回収率をトリパンブルー排除法で計測し、 99% 以上の生存率であることを確認した。単球の調製のために、 PBMCを LGM-3培地（リンパ球増殖培地- 3、血清非常有、 Lonza)に再懸濁し、プラスチックに付着した細胞（2時間、 37°C、 10cmディッシュでインキュベート）を単球として使用した。いくつかの実験では、 CD14+単球を CD14+磁気活性化セルソーティングマイク口ビーズ（MACS ; Mi ltenyiBiotec)を用いて分離した。精製した CD14+単球を LGM- 3培地に再懸濁した。フローサイトメトリーによると、純度は常に、 95%より高かった。ヒト単球の処理

PBMCは単独、又は組換えヒト REICタンパク質（10 / g/ml)若しくは GM-CSF (R&D Systems) +IL-4 (R&D Systems) (それぞれ、 2ng/ml)の存在下で培養した。細胞は位相差顕微鏡で観察した。

図 2に単独、組換えヒト REIC タンパク質又は GM- CSF+Iい 4存在下で培養した PBMCの 0、 2及び 7日目の位相差顕微鏡像を示す。単独の 0日目、 REICタンパク質存在下での培養の 7日目、 GM-CSF+IL- 4 存在下での培養の 7日目の像の四角い点線部の拡大像を右のパネルに示す。図に示すように、 PBMCを REICタンパク質の存在下で培養することにより、樹状細胞様細胞の分化が認められた。

それぞれの培養の 7日目において、樹状細胞様細胞の全細胞に占める割合を測定した。ヒト REICタンパク質添加により分化誘導される樹状細胞様細胞の全細胞に占める割合は、以下のように測定した。すなわち、 3 回の独立した実験において、それぞれの群（（-）群、ヒト REICタンパク質、 IL-4 + GM- CSF群）の樹状細胞様細胞（形態学的に大きく、かつ樹状突起が確認できる細胞）を、それぞれの添加後 7 日目に、顕微鏡下のランダムな計 5視野においてそれぞれ 100個づつの細胞を目視し、計測した。結果を図 3に示す。 PBMC単独で培養した場合の樹状細胞様細胞の割合は数％であったが、 REIC タンパク質存在下で培養した場合は約 40%、 GM- CSF+IL- 4存在下で培養した場合は約 60%であった。また、 REICタンパク質により誘導される樹状細胞様細胞は、 GM-CSF+IL - 4 により誘導される榭状細胞と形態学的に類似していた。

CD14+細胞及び CD14陰性細胞は単独、又は組換えヒト REICタンパク質（1 μ g/ral又は 10 /z g/ml)若しくは 01^-じ5?+1し-4 (それぞれ、 2ng/ml)の存在下で培養した。細胞は位相差顕微鏡で観察した。末梢血単核球は、単球とリンパ球から構成されており、これらのどちらの細胞から樹状細胞様細胞が分化誘導されたのかを明らかにするため、市販の抗 CD14抗体の付着したビーズを用いて、 CD14陽性の単球と CD14陰性のリンパ球について、それぞれヒト REICタンパク質添加による樹状細胞様分化誘導を試みた。図 4に CD14+細胞からの樹状細胞様分化誘導の結果を示す。図 4.に示すように、 CD14陽性の単球においてのみ樹状細胞様の分化誘導が観察され、図に示されるように、分化誘導された細胞の頻度は、添加した REIC タンパク質の濃度に依存して増加した。以上のことより、ヒト REICタンパク質について、末梢血単球（CD14陽性）を榭状細胞様に分化誘導する作用が明らかとなつた。また、この作用には、用量依存性が認められた。

ウェスタンブロット分析

ヒト REICタンパク質（lO ju g/ml)又は GM- CSF+IL- 4 (それぞれ 2ng/ml)で処理した後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS)で 2度洗浄し、溶解バッファ（50raM HEPES， pH7. 4, 250mM NaCl, 1 %NP— 40, ImM DTT, ImM PMSF, 5 μ g/ml aprotinin, 2m Na₃V0₄, ImM NaF及び lOmM ]3 -GP)で溶解し、タンパク質を抽出した。遠心の後に、上清中のタンパク質を各実験で等しくなるように調整し、等量の 2 X SDSサンプルバッファで希釈し、 5分間、 95°Cで加熱処理した。サンプル（10 g タンパク質）を 7. 5%の SDS- PAGEゲルに供し、 polyvinylidine f luorodide (PVDF)膜にエレクトロブロットした。ブロットは 10%脱脂乳粉、 6 % Glycine及び 0. 1%の Tween- 20 を含む TBSを用いて、室温で 1時間行った。タンパク質は 1000倍稀釈のゥサギポリクローナル抗ヒ卜 REIC 抗体 (Abarzua F. et al. , Cancer Res. 2005 Nov 1 ; 65 (21) : 9617- 22)、抗リン酸化 Statl (Try701)抗体（#9171、 Cell Signaling Technology) 、抗リン酸化 Stat3 (Try705) 抗体（#9131) 及び抗リン酸化 Stat5 (Try694)抗体（#9351)を用いて同定した。 0. 1%の Tween-20添加 TBS (T-TBS) で十分洗浄した後に、ブロットを西洋わさびペルォキシダーゼ結合 2次抗体で処理し、 T - TBSで充分洗净した後、 enhanced cehmi luminescence detection ί¾ (ECL ッ卜、 Amersham Pharmacia Biotech)を用レヽて 5§色させた。

図 5に、ヒト REICタンパク質添加により末梢血単核球の STATが活性化された結果を示す。リン酸化 STAT- 1 (Tyr)、リン酸化 STAT- 3 (Tyr)、リン酸化 STAT-5

(Tyr)の発現の上昇は、これらのタンパク質の活性化を意味し、血球の分化の際に重要であるとされている。すなわち、このウェスタンブロット法の所見は、 REIC タンパク質が細胞内 STATシグナルを介した血球分化能を有することを、強く示唆する。加えて、 REICタンパク質の STAT活性化（リン酸化）におよぼす作用パターンは、樹状細胞-ポジテイブコント口ールの IL- 4+GM- CSF添加によるものと異なつていた。このことは、フローサイトメトリ一での結果も併せて、 REICタンパク質添加により、ポジティブコントロールの榭状細胞とは異なる榭状細胞様細胞が誘導されていることを示唆する。

フローサイトメトリ一分析

細胞培養を冷 PBSの添加により、終了させ、その後 10分間氷冷しィンキュベートした。次いで、パスツールピペットにより細胞を再懸濁し、回収した。付着した細胞は、トリプシン処理により回収し、浮遊細胞と混ぜた。おおよそ 5 X 10⁵細胞を 100 μ 1の PBSで 5倍稀釈した ΡΕ結合抗体を用いて 60分間氷上でィンキュベ一トした。用いた PE結合抗体は、 CDl lc (12- 0116、 eBioscience)、 CD14 (12-0149)、 CDla (12-0019)、 CD40 (12- 0409)、 CD80 (12-0809)、 CD83 (12-0839)、 CD86 (12-0869)、 HLA-DR (12- 9956)であった。アイソタイプが同じ PE結合免疫グロブリン G (IgG) (12-4714、 12- 4732)を陰性コントロールとして用いた。インキュベーション後、細胞を 1mlの PBSで一度洗浄し、 500 μ 1の PBSに再懸濁した。その後、 FACSCal ibur フローサイトメーター（Becton Dickinson)を用いて 10⁴個の細胞を採取し、 Cel lQuest ソフトウェア（Becton Dickinson)を用いて分析した。これらの細胞の特徴的な forward scatterパターンに基づいて適当なゲートを設定し、ゲート内の細胞のみを分析した。アイソタイプが同じコントロール抗体とともにィンキュベートしたコントロール細胞よりも高い平均蛍光ィンデックス（MFI) を示した細胞を陽性とみなした。死細胞はヨウ化プロビジゥム（PI)による染色及び又は scatter特性により除去した。 PI染色により、 99%より多い細胞が生存していることカゎ力つた。

FITC標識粒子のエンドサイト一シス

細胞を回収後、細胞を 5 X 10⁶細胞/ mlの濃度で冷 PBSに再懸濁した。 50 _{μ β}の FITC結合デキストラン（DX FITC ; FD40、Sigma)をサスペンション 0. 5mlに添加し、次いで細胞を 1時間 4 °C又は 37°Cでィンキュベートした。 1mlの冷 PBSで 2回洗浄し、 FACSCaliburフローサイトメータ一で取得した 10⁴細胞を CellQuest ソフトウェアを用いた分析した。

図 6 A及び Bに、ヒト REICタンパク質添加により分化誘導された樹状細胞様細胞をフローサイトメトリ一により解析した結果を示す。

図 6 A の、囲った部分の細胞を用いて、フローサイトメトリーを行った。その囲いの根拠は、検体中の細胞の残骸を外し、かつ、ポジティブコントロールである IL-4+GM- CSF添加群において榭状細胞がきれいにモニターできるということの、 2点である。

図 6 Aの右の図において、 CDllcは、骨髄系白血球のマ一カー（リンパ球ではなレ、）である。また、 CD14 は、単球やマクロファージのマーカーである。さらに、 DX FITCは、 FITCのタグのついたデキストランを意味する。この物質は、白血球系細胞の貪食能（エンドサイト一シス）の評価によく用いられる。

従って、 REICタンパク質添加により分化誘導された細胞は骨髄系白血球由来で、 IL-4+G -CSF 添加により誘導された樹状細胞に比べ単球系細胞に近く、また、榭状細胞とほぼ同等の異物 ·抗原貪食能を持つ榭状細胞様細胞である。

また、図 6 Bにおいて、 CDlaは、樹状細胞のマーカーの一つで、非ペプチド性の抗原（脂質抗原など）の提示に関与するとされる。また、 CD40は、榭状細胞のマーカーの一つで、 CD40 1 igand (樹状細胞誘導能を単剤でも持つ）のレセプターである。 CD80は、樹状細胞のマーカーの一つで、 CD86と共に、 T リンパ球に対する抗原提示に関与するとされる。 CD83は、樹状細胞のマーカーの一つで、成熟樹状細胞のマーカーとして使われる。 CD86は、樹状細胞のマーカーの一つで、未熟樹状細胞のマーカーとして使われる。 HLA- DR は、樹状細胞のマーカーの一つで、樹状細胞の分化に従って強発現する。

従って、 REICタンパク質添加により分化誘導された細胞は、 IL- 4+GM-CSF添加により誘導された樹状細胞に類似した（同じではない）マーカー発現パターンを示す。

他の in vitro実験の結果も合わせて結論すると、 REICタンパク質添加により、末梢血 CD14陽性単球から、榭状細胞様の細胞が分化誘導される。この細胞は、形態学的に末梢血単球と異なり、また、 IL - 4+GM-CSF 添加により誘導される樹状細胞とも異なる。

図 6に示す結果は、ヒト REICタンパク質および REICタンパク質により誘導された樹状様細胞が、（IL- 4+GM- CSFによる治療や IL- 4+GM- CSFDC と同様に、）生体内における抗原貪食 ·抗原提示能をより高めることにより、抗癌免疫を活性化させることを示す。 in vivo実験による REICタンパク質の腫瘍抑制効果の検定

RM9細胞（1 X10⁶個）をマウス（C57BL6、ォス）の皮下に注入した。注入後 7、 9、 11、 13、 15、 17及び 19 日目（注入後 7日目を REICタンパク質の投与開始とする）に REICタンパク質（100 g (300 1) )又はコントロールとして PBS (300 μ ΐ) を、形成された腫瘍全体に注入した。 21 日目にマウスを犠牲にし、皮下腫瘍における治療効果を判定し、抗癌免疫活性の測定を行った。 in vivo 実験のプロトコールを図 7に示す。腫瘍のサイズは処理の後数日後に測定した。腫瘍ボリユームは、 1/2X(最小直径） ²X (最大直径）により求めた。

図 8Aに治療後の腫瘍体積の経時的変化を示す。また、図 8Bにマウスから採取した腫瘍の重量を示す。さらに、図 8Cにマウスから採取した腫瘍の写真を示す。図 8A〜8Cに示すようにヒト REICタンパク質の投与により腫瘍増殖を抑制することができた。

in vitro細胞溶解アツセィによる REICタンパク質の抗癌免疫活性上昇効果の検定

図 7に示す方法により処理したマウス又はコントロールマウス（REICタンパク質の投与開始後 14 日目）から脾細胞を採取し、該脾細胞をエフェクターとして RM9細胞（ターゲット）と共に 96ゥエル丸底プレートで培養した。エフェクター Zターゲット比（E/T比）は 100:1、 50:1、 25:1又は 12· 5:1であった。 5X10³のターゲット細胞を 1つのゥエルに添加した。上清を回収し、溶解した RM9細胞から放出された乳酸脱水素酵素を、非放射性細胞毒性ァッセィ（CytoTox96、 Promega) を用いて測定した。溶解細胞の比率は、以下の式により計算した。

(実験における放出一エフェクターの自発的放出）/ (ターゲットの最大放出一ターゲットの自発的な放出） X100 (%)

図 9にマウス脾細胞の RM9細胞に対する抗癌細胞免疫活性の解析の結果を示す。図 9に示すように、 REICタンパク質を投与した場合、エフェクター比依存的に溶解細胞の割合が上昇しており、 REICタンパク質に抗癌細胞免疫活性を上昇ざせる効果があることが判明した。

本実施例において、データは平均土 SEMで示した。 Unpaired Student t-テストを 2群の間の統計分析のために用いた。 p値が <0. 05である場合に有意差があるとした。ヒト REICタンパク質添加による末梢血単核球からの樹状細胞様分化誘導

REICタンパク質の添加群、 IL- 4単独の添加群、 GM-CSF単独の添加群、 IL-4 + GM-CSFの添加群との間で、分化誘導される樹状細胞様細胞の全細胞に占める割合 tこつレヽて]:匕較を行った。図 1 O fま縦軸（こ Percentage of cel ls with dendritic cell-like feature (形態学的に大きく、かつ突起が確認できる榭状細胞様細胞の全細胞に占める割合）を示しており、それぞれの添加後 7 日目に、顕微鏡下に目視にて、ランダムに計測した。

図 1 0に示すように、ヒト REICタンパク質を添加した群では、 IL- 4単独の添加群および GM- CSF単独の添加群に比べて、樹状細胞様細胞への分化誘導が統計学的に有意に多かった（*にて示す）。

これらのことから、図 1 0に示すような濃度においてヒト REICタンパク質がヒ卜の末梢血単球から榭状細胞様の細胞を分化誘導する能力は、サイトカインとして知られる IL- 4や GM-CSFそれぞれ単独の場合と比べて、有意に高い。すなわちヒト REICタンパク質は、 IL- 4や GM- CSFといった各サイトインと比べて、樹状細胞様細胞の分化誘導という点においての優位性、より高い有用性を持つ。 . ヒト REICタンパク質添加により誘導された樹状様細胞における CD4+T細胞（リンパ球）を用いたァロ（異系同種）反応誘導活性

REIC タンパク質により誘導された樹状様細胞の抗癌免疫機能を評価するために、 CD4+T細胞（リンパ球）を用いたァロ（同種異系）反応誘導活性の評価を行つた。 0 日目に、 CD14+単球を回収するための MicroBeads (Mi ltenyi Biotec) を用いて、末梢血単核球から CD14+単球を回収し、ヒト REICタンパク質及び IL- 4 +

GM - CSFをそれぞれ添加した。 7日目にそれぞれの細胞を回収し、 REICタンパク質により誘導された樹状様細胞及び IL-4 + GM-CSFにより誘導された樹状細胞（ポジティブコントロール用）とした。また、 7日目に、 CD4+T細胞を回収するための MicroBeads (Mi ltenyi Biotec) を用いて、樹状細胞のドナーと HLA- DRが共通していないドナーの末梢血単核球より CD4+T細胞を選択 '回収した。この CD4 + T 細胞において、蛍光を発する化学物質 CFSEを濃度 0. 05 μ Mで添加して 5分間室温で培養することにより細胞ラベリングを行い、ァ口の naive CD4+T細胞として用いた。同じく、 7日目に、 96穴丸底プレートの 1ゥエルにつき、 REICタンパク質により誘導された樹状様細胞（6. 25 X 10³個)、またはポジティブコントロールとしての IL- 4 + GM-CSFにより誘導された榭状細胞（6. 25 X 10³個）を、 CD4+T細胞 (1 X 10⁵個）と共培養した。ネガティブコントロールとして、 CFSEラベリングした CD4+T細胞のみの培養も行った。培養条件は、 37°C、 5%C0₂、 95%大気下にてインキュベーター内で 4 日間共培養した。 11 日目に、蛍光顕微鏡下のランダムな視野において、 CFSEが陽性のリンパ球の数を計測した。結果を図 1 1に示す。図 1 1は、 REIC タンパク質により誘導された榭状様細胞（REIC/Dkk_3Mo) 、共培養により、コントロール群と比べて統計学的に有意に多くの（*にて示す） CD4+T細胞を増殖させる能力があることを示している。また、その能力は、ポジティブコントロールである IL-4 + GM-CSFにより誘導された榭状細胞と統計学的に同等であることが示された。すなわち、本実施例により、ヒト REICタンパク質及び REICタンパク質により誘導された樹状様細胞が、 Iい 4+GM-CSFによる治療や IL-4+GM-CSFDC と同様に、臨床の場で抗癌免疫を高め、癌を治療するという点において、非常に有用な手段になることが示された。産業上の利用可能性

REICタンパク質は、 IL-2や従来から数多く知られている免疫活性作用を持つサィトカイン群と比べて、

( 1 ) 単剤でも抗癌免疫活性化による抗腫瘍効果を有する、

( 2 ) REIC遺伝子発現が多くの癌種において欠如 .低下しているという REICタンパク質そのものの特性により、 REICタンパク質製剤は、広い範囲の癌種に対して有効である、

( 3 ) REICタンパク質による抗癌免疫活性化により、投与した癌局所のみならず、癌転移巣の改善や予防といった作用が期待できる、並びに

( 4 ) 既存の様々な癌抗原ンパク質と本剤を同時に投与することにより、樹状 (様）細胞などの分化誘導を介して抗癌免疫を系統的に活性化させ、発癌そのものを予防することが可能となる、

とレヽぅ効果を有する。

REICタンパク質は、癌免疫療法剤として用いることができる。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲

1 . 以下の REICタンパク質を有効成分として含む、単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤：

(b) 配列番号 2に表されるァミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸を置換、欠失、または付加してなるアミノ酸配列からなり、かつ単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するタンパク質。

2 . 単球が末梢血単球である請求項 1記載の単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤。

3 . 以下の REICタンパク質を有効成分として含む、癌免疫活性化剤：

4 . 単球が末梢血単球である請求項 3記載の癌免疫活性化剤。

5 . 請求項 3又は 4に記載の癌免疫活性化剤を含む、癌免疫活性化作用を有する、癌の治療又は予防のための医薬組成物。

6 . 以下の REIC DNAを有効成分として含む、単球からの榭状細胞様細胞分化誘導剤：

(a) 配列番号 1に表される塩基配列からなる DNA；又は

(b) 配列番号 1に表される塩基配列に相補的な塩基配列からなる DNA にストリンジヱントな条件でハイブリダィズする DNAであって、単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するタンパク質をコードする DNA。

7 . 単球が末梢血単球である請求項 6記載の単球からの榭状細胞様細胞分化誘導剤。

8 . 以下の REIC DNAを有効成分として含む、癌免疫活性化剤：

(a) 配列番号 1に表される塩基配列からなる DNA；又は

(b) 配列番号 1に表される塩基配列に相補的な塩基配列からなる DNA にストリンジヱントな条件でハイブリダィズする DNAであって、単球からめ樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するタンパク質をコードする DNA。

9 . 単球が末梢血単球である請求項 8記載の癌免疫活性化剤。

1 0 . 請求項 8又は 9に記載の癌免疫活性化剤を含む、癌免疫活性化作用を有する、癌の治療又は予防のための医薬組成物。

1 1 . 以下の REIC DNAを含むベクターを有効成分として含む単球からの榭状細胞様細胞分化誘導剤：

(a) 配列番号 1に表される塩基配列からなる DNA；又は

(b) 配列番号 1に表される塩基配列に相補的な塩基配列からなる DNA にストリンジェントな条件でハイプリダイズする DNAであって、単球からの榭状細胞様細胞分化誘導活性を有するタンパク質をコードする DNA。

1 2 . ベクターがアデノウイルスベクターである請求項 1 1記載の単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤。

1 3 . 単球が末梢血単球である請求項 1 1又は 1 2記載の単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤。

1 4 . 以下の REIC DNAを含むベクターを有効成分として含む癌免疫活性化剤：

(a) 配列番号 1に表される塩基配列からなる DNA；又は

(b) 配列番号 1に表される塩基配列に相補的な塩基配列からなる DNA にストリンジ工ントな条件でハイプリダイズする DNAであって、単球からの榭状細胞様細胞分化誘導活性を有するタンパク質をコードする DNA。

1 5 . 単球が末梢血単球である請求項 1 4記載の癌免疫活性化剤。

1 6 . ベクターがアデノウィルスベクターである請求項 1 4又は 1 5記載の癌免疫活性化剤。

1 7 . 請求項 1 4〜 1 6のいずれか 1項に記載の癌免疫活性化剤を含む、癌免疫活性化作用を有する、癌の治療又は予防のための医薬組成物。

1 8 . ベクターがアデノウィルスベクターである請求項 1 7記載の癌免疫活性化作用を有する、癌の治療又は予防のための医薬組成物。

1 9 . 動物から採取した単球を、 in vitroで以下の REICタンパク質の存在下で培養することを含む、 CD14 陽性単球より榭状細胞様細胞を分化誘導する方法：

(b) 配列番号 2に表されるアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸を置換、欠失、または付加してなるアミノ酸配列からなり、かつ単球からの榭状細胞様細胞分化誘導活性を有するタンパク質。

2 0 . 単球が末梢血単球である請求項 1 9記載の方法。

2 1 . 請求項 1 9又は 2 0記載の方法により、 REICタンパク質により活性化された単球より分化誘導された樹状細胞様に分化した細胞。

2 2 . CDllc、 CD40、 CD80、 CD86、 HLA- DR、及び CD14が陽性であり、 CDlaが陰性である、請求項 2 1記載の樹状細胞様に分化した細胞。

2 3 . フローサイトメトリーにより細胞表面の抗原を解析した場合に、 GM-CSF 及び IL-4を甩いて単球から誘導された樹状細胞に比べて、 CD14が多く発現しており、 CDlaがほとんど発現していない請求項 2 1記載の樹状細胞様に分化した細胞。