[go: up one dir, main page]

WO2009106322A1 - Verfahren zur anreicherung oder analyse von dna fragmenten aus einer komplexen genomischen dna probe - Google Patents

Verfahren zur anreicherung oder analyse von dna fragmenten aus einer komplexen genomischen dna probe Download PDF

Info

Publication number
WO2009106322A1
WO2009106322A1 PCT/EP2009/001362 EP2009001362W WO2009106322A1 WO 2009106322 A1 WO2009106322 A1 WO 2009106322A1 EP 2009001362 W EP2009001362 W EP 2009001362W WO 2009106322 A1 WO2009106322 A1 WO 2009106322A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dna
genomic dna
probes
fragments
carrier
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2009/001362
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Claudia Bauer
Peter Bauer
Olaf Riess
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Original Assignee
Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eberhard Karls Universitaet Tuebingen filed Critical Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Publication of WO2009106322A1 publication Critical patent/WO2009106322A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Definitions

  • the present invention relates to a method for enriching contiguous genomic DNA fragments from complex genomic DNA to be examined, and to a method for analyzing the DNA fragments obtained by this enrichment method, and to the use of the method for studying mutations in genomic DNA, in particular mutations in genes associated with certain diseases and / or in the identification of genes associated with certain diseases.
  • a major goal of molecular diagnostic science is namely to identify with the available methods and techniques by means of a specific enrichment within the complex structure of the genomic DNA sequence sections or genes about which diseases can be diagnosed and possibly also treated specifically.
  • novel sequencing technologies high density parallel sequencing
  • complete bacterial genomes 100 Mb
  • de novo sequenced within three to five days at a time.
  • human genome, as well as the genomes of many other species exceeds the sequencing capacity of these technologies many times over, because deviations from the normal state have to be investigated independently 5 to 20 times before, for example, a pathological mutation can be detected with sufficient certainty.
  • the size of the mammalian genomes (up to 3 Gb) has the great disadvantage that careful screenings can not be performed with individual experiments.
  • PCR approaches that are used as a basis for the mutation search must first be tested, which is very time-consuming and leads to a high personnel outlay. Performing the PCR reactions also requires a great deal of time and money, since these must be carried out using comparable protocols in order to achieve reproducible and meaningful results, so that on the one hand these reactions must first be established, and on the other hand often after the establishment the reactions are required for the analysis of an individual.
  • mutation search in unknown disease genes today presents the science with great challenges.
  • the positional cloning technique was used to identify disease genes, leading to relevant medical breakthroughs. Beginning with the coupling analysis in large families with the subsequent sequencing of candidate genes, recurring circumscribed sections of the human genome are analyzed.
  • Candidate regions that is, regions where there is a likelihood of mutations that can cause disease, are usually around 500 kb to 10 Mb in size. Therefore, it would be desirable to develop a method by which to enrich and subsequently analyze DNA molecules of any patient of that particular candidate region.
  • this object is achieved by a method comprising the following steps:
  • step a) providing double-stranded DNA probes having sequences which correspond to sequences in the complex genomic DNA to be examined, b) immobilization of the double-stranded DNA probes from step a) to a carrier,
  • the present invention provides an enrichment method of smaller DNA fragments of complex genomic DNA to be examined, which is highly flexible and which allows DNA fragments of interest to be rapidly and specifically enriched, after which they can subsequently be reliably analyzed, for example by means of a in vitro amplification or direct sequencing.
  • the present invention provides a novel method of sample enrichment which can successfully and reproducibly reduce the complexity of genomic DNA.
  • DNA probes are initially provided which are immobilized on a support, for example via specific markings.
  • the DNA probes, or the source of the probes are thereby selected specifically with regard to the genome section to be examined, and a random fragment length of about 100 bp to 3000 bp, in particular of between 250 bp and 1000 bp, can be found to be advantageous to have.
  • After immobilization of the probes they are denatured, ie the double strand of the DNA probes is broken up into two single strands.
  • the genomic DNA to be examined is randomly fragmented, with fragments having a size of approximately 100 to 3000 bp, in particular from 250 to 1000 bp, having proven particularly advantageous.
  • these details of the fragment lengths are merely exemplary, which is why smaller or larger lengths can be used.
  • the genomic DNA is optionally denatured, ie broken down into single strands, this being done, for example, by heating the fragments in a buffer, preferably in a hybridization buffer, or else alkaline.
  • a buffer preferably in a hybridization buffer, or else alkaline.
  • denaturation is not always necessary since it is already present in single-stranded form. It will be apparent to those skilled in the art that, depending on the nature and form of the genomic DNA to be tested, it must or may not provide for a denaturation step.
  • the fragmentation of the genomic DNA can be carried out, for example, by means of one or more restriction enzymes, by ultrasonic sonication, by nebulization.
  • the fragmented and optionally denatured genomic DNA is then added to the immobilized on the support probe, for example.
  • an amount of 0.1-20 micrograms wherein an amount of 10 to 20 micrograms has proved to be advantageous, after which the approach is incubated for hybridization over a period of time.
  • two DNA single strands possessing complementary base sequences assemble into duplexes.
  • the hybridization conditions between probe and target ie the fragments
  • Conditions are regularly selected which are generally uniformly stable independently of the sequences specifically involved, with factors to be taken into account being the buffer, incubation time and incubation temperature.
  • a hybridization buffer which contains 5 ⁇ SSC (0.75 M NaCl, 75 mM Na citrate, pH 7 0.1% (w / v) N-lauryl sarcosine, 0.02% (W / V) SDS, 2%.
  • the reaction is then incubated, for example, for a period of 1 to 80 hours, preferably 60 hours.
  • the support may be washed, for example, over one to several, preferably three, washes with a wash buffer, thereby removing any non-hybridization-bound portions of the target DNA.
  • a wash buffer any washing buffer can be used which has no influence on the hybridized products, but with which unbound genomic DNA fragments can be washed off.
  • the complementary to the single-stranded DNA probes bound, also single-stranded DNA fragments (the “targets” or targets) of the genomic DNA are mobilized, for example.
  • alkaline lysis or by heat By “elution” is meant any method of action by which the targets are detached from the carrier - and thus from the probes immobilized on the carrier. It is understood that fragments obtained hereby may have to be neutralized in the solution for further analysis, in particular if alkaline lysis is used for the immobilization. It will be clear to the person skilled in the art which conditions he has to choose for which analysis in order to be able to carry them out. Thus, it is important in the method according to the invention that the double-stranded DNA probes have already been denatured and added to single-stranded DNA before addition of the target DNA.
  • genomic DNA or “genome” is understood to mean the entire genetic material of an organism.
  • the DNA (deoxyribonucleic acid) derived from the genetic material in the chromosome of a particular organism is the “genomic DNA”.
  • a “genomic library” or “genomic library DNA” is a collection of clones made from a set of randomly generated, overlapping DNA fragments representing the entire genome of an organism. This genomic DNA, also referred to herein as “library DNA”, is often already present in single stranded form.
  • genomic "DNA fragments” are to be understood here as meaning smaller sections of the total genome, which may have a length of about 50 to about 5000 bp, with the genome of, for example, mammals being up to 3 Gb in size can own.
  • genomic DNA not only the entire genomic DNA of an organism derived or derived from the genetic material in the chromosome of a particular organism can be understood, but also those in the form of a library or library DNA fragments representing the entire genome of an organism.
  • a genomic library For the preparation of a genomic library, the entire cellular DNA of an organism is broken down by restriction enzymes into fragments, which are then inserted and propagated in a suitable cloning vector, for example bacteriophages or cosmids. If only a part of all DNA regions found in the genome of an organism is contained in a gene library, it is called a subgenomic library.
  • probe as used herein is meant an oligonucleotide capable of binding in a base-specific manner with a complementary strand of nucleic acid.
  • oligonucleotide each nucleic acid
  • the length of the oligonucleotides is usually at least 5, 10 or 20 bases long and can be up to 50, 100, 1000 or more bases long. Oligonucleotides may also include peptide nucleic acids or analogous nucleic acids.
  • a “carrier” is to be understood as meaning any substrate to which nucleic acid probes can be attached.
  • a plurality of different probes may be coupled to the surface of the carrier at various known locations.
  • Such carriers are then also referred to as “chips” or “microarrays”.
  • the surface of the carrier or the substrate can be produced in virtually any shape or in a plurality of surfaces, so that, for example, carriers in the form of (microtiter) plates, a sheet, of fibers or glass, etc. can be used, which is suitable for attaching probes.
  • the genome or genomic DNA to be tested is not limited to humans as a source, but extends to include, but is not limited to, mammals, plants, bacteria or cells derived from any of the above. It goes without saying that it is also possible to resort to "library DNA" as starting material for genomic DNA.
  • BAC clones bacterial artificial chromosome ", artificial bacterial chromosome
  • the freely available BAC cloning collection 32k (Osoegawa et al., "A Bacterial Artificial Chromosomal Library for Sequencing the Complete Human Genome", Genome Research 2001; 11: 483-496) is useful in the 150,000 to 250,000 contiguous bases of the human genome are each contained in an artificial bacterial chromosome, which can be produced at any time highly pure by bacteria.
  • fragmentation can be divided into smaller sections by means of one or more restriction enzymes, by ultrasound, by nebulization (compressed air or nitrogen).
  • the probes in step b) are immobilized on the support via a marking.
  • a marking means any chemical, biological or physical modification of the probes which make it possible to attach the probes to the support and thus immobilize it thereon.
  • a marker is used for labeling the double-stranded DNA probes, which has a specific or unspecific affinity for the carrier.
  • the probes bind to the carrier arbitrarily - via the marker - ie it does not depend on the nature of the surface of the carrier to which the probes are to be bound .
  • the probes bind very specifically to the - possibly correspondingly processed - surface of the carrier and possibly to specific locations on the latter. It is preferred for a specific affinity of the marker if the marker is biotin-dUTP. This can then, in a preferred development of the method, be attached terminally to the probe, again being preferred if a terminal transferase is used for the label.
  • Terminal transferase is an enzyme that mediates the template-independent attachment of deoxynucleotides (2'-deoxyribonucleoside monophosphates) to the terminal 3'-OH groups of DNA molecules. Therefore, this enzyme may, for example, attach biotin-dUTP to the DNA probes.
  • the carrier has a coating with a specific affinity for the marker, wherein, when the marker is biotin-dUTP, it is preferred if the immobilization of the labeled double-stranded DNA probes in step c) via streptavidin takes place, with which the carrier is coated.
  • Streptavidin a protein isolated from a bacterium, binds biotin to its four subunits. In general, however, any modification can be used which by high-affinity interactions between the partners of a specific binding pair, such. Biotin / streptavidin or avidin, hapten / anti-hapten antibody, sugar / lectin, etc., can be mediated.
  • the method is furthermore generally preferred if the carrier is selected from the group consisting of microtiter plates, centrifugation columns, magnetic beads, paramagnetic beads. It will be understood that any substrate that can be modified and used for the purposes herein can serve as a carrier.
  • the prior art discloses a multiplicity of carrier substrates which are suitable for the present method and which are well known to the person skilled in the art.
  • step d) is carried out before or in parallel with one of the previous steps. It is understandably preferred to accelerate the process if the step of fragmenting and denaturing the genomic DNA is carried out in parallel to the fragmentation and optionally labeling and immobilization of the probes. This However, it also depends on the probes / genomic DNA material to be used, and it will be clear to the person skilled in the art which sequence should be used in each case.
  • step c) and / or the genomic DNA in step d) by heat, alkali or acid and hydrogen bonding solvents, such as. As urea, formamide, is performed. It is understood that the skilled worker can also use denaturing agents in a mixture.
  • the elution of the genomic DNA fragments is carried out by methods selected from the group consisting of heat exposure, acid or alkali treatment and the use of hydrogen bonding solvents, such as. As urea, formamide.
  • the invention further relates to a method of analyzing genomic DNA characterized by the steps of enrichment by the method of the invention and analyzing the eluted genomic DNA fragments.
  • the analysis is carried out by one or more of the methods selected from the group consisting of polymerase chain reaction, sequencing, in particular direct sequencing, and clonal amplification on glass surfaces.
  • the PCR which amplifies specific DNA fragments in vitro, is a highly sensitive technique that allows one or more specific double-stranded DNA fragments to accumulate millions of times within a very short time, even from very small amounts of heterogeneous DNA.
  • the so-called emPCR emulsion based PCR
  • the microbeads are coupled to the single-stranded DNA fragments, with the amplification reagents in emulsified in an oil-water mixture (see, for example, Margulies et al., (2005) Nature; 437: 376-380).
  • the genomic DNA obtained by enrichment can also be sequenced, for example, with so-called next-generation sequencing machines in which, instead of cloning into bacterial or viral systems for propagation of individual sequences, a direct clonal amplification of individual molecules takes place.
  • the genomic DNA is provided after the fragmentation in a further step with PCR or Sequenzieradaptern (production of the so-called library).
  • the recovered library DNA can then be amplified directly clonally (for example, microbead-coupled emPCR (Margulies et al. (2005) Nature; 437: 376-380) for the 454 method (see www.
  • the method be used to study mutations in genomic DNA, wherein in one embodiment it is preferred that the method be used to study mutations in genes associated with certain diseases, and preferred in another embodiment when the method is used to identify genes associated with certain diseases.
  • LRRK2 mutations in genes known to be associated with certain diseases or symptoms are investigated. For example, it has recently been shown that a single gene mutation is the cause of one of 25 Parkinson's cases worldwide. Leave the studies suggest that the mutation in a recently discovered gene called LRRK2 causes about five percent of inherited Parkinson's cases and about two percent of sporadic cases.
  • hitherto unknown genes can be identified with the method according to the invention, which are associated with diseases.
  • risk genes for Crohn's disease and type 2 diabetes have recently been identified.
  • the methods of the present invention provide an excellent tool to improve such analyzes, both in terms of cost and time required, and in reliability and flexibility.
  • FIG. 1 Genomic enrichment of human DNA sections complementary to chromosome 5-BAC (RPH 795P7).
  • a fragmented and biotin-labeled BAC probe (RP11795P7, chromosome 5) was used, at a concentration of 150 ng / ⁇ l. Of these, 1.0 .mu.l, 0.5 .mu.l or 1.0 .mu.l of a 1:10 dilution were used. The average length of the fragments was about ⁇ 400 bp (base pairs). Fragmentation was performed by nebulizing the BAC DNA to 200 to 800 bp fragments. This was followed by purification of the fragments over a MinElute ® column (Qiagen, Hilden, Germany). The fragments were further labeled with biotin by a terminal transferase with biotin-16-ddUTP (each Roche Diagnostics, Mannheim, Germany).
  • human genomic DNA was fragmented by nebulization to about 200 bp to 800 bp. These DNA fragments were purified by MinElute ® column and small fragments ( ⁇ 250 bp) by Ampure ® -Beads (® Agenco ⁇ rt Bioscien- ce, Beverly MA, USA) away. After elution of the DNA from the beads, the fragments were "end-poled” and phosphorylated by T4 DNA polymerase and T4 polynucleotide kinase (PNK) and dATP (New England Biolabs GmbH, Frankfurt, Germany), followed by further purification a MinElute ® column.
  • PNK T4 polynucleotide kinase
  • the fragments were used at a concentration c of 580 ng / ul to give 4.0 ul (equivalent to about 2 ug) 2.0 ul (corresponding to about 1 ug) and 1.0 ul (the length of the fragments averaged about 600 bp, pooled F # 17, and if the fragments were to be used for amplification after enrichment, for example, the "polis hed" DNA fragments specific adapter (single strand adapter or double strand adapter) ligated.
  • streptavidin-coated microtiter plates were used by Thermo Scientific (Waltham, USA, catalog number 95 029 362).
  • the biotin labeled BAC probe (150 ng, approximately 400 bp) was loaded with 50 ⁇ l binding buffer (10 mM Tris-HCl, 2M NaCl, ImM EDTA, 0.1% Tween 20, pH 7.6) into the wells of the streptavidin-coated ones Plate pipetted.
  • the wells were then sealed with adhesive film and incubated for 1 hour at room temperature in the Platten thoroughlyelthermoblock at speed 2. Subsequently, the plate was briefly centrifuged and the buffer removed; This was followed by a washing step with 0.5 M NaOH and a 10-minute incubation with 100 ⁇ l 0.5M NaOH to denature the immobilized probes.
  • hybridization buffer 5x SSC (0.75M NaCl, 75 mM NaCitrate, pH 7 0.1% (w / v) N-lauryl sarcosine, 0.02% (w / v) SDS, 2% Blocking Reagent ( 20 mg) and denatured for 5 minutes by boiling at 95 ° C.
  • 100 ⁇ l of hybridization buffer preheated to hybridization temperature were initially introduced, and the denatured DNA was pipetted in, followed by closed the wells with adhesive film.
  • the plate was incubated for about 60 hours at about 55 ° C on the thermoblock at speed 2 to achieve in the wells a temperature of about 50 0 C, at which the fragments hybridize to the probes.
  • the plate was tightly closed to prevent dehydration. Subsequently, the plate was briefly centrifuged. The wells were washed with yes 300 .mu.l PBS + 0.05% Tween 20 (and the contents of the wells mixed carefully twice with the pipette); the buffer was then removed and allowed to dry on paper for the last wash cycle in reverse.
  • the PCR detection was carried out using primers for the markers D5S818 (9791/9792) and D13S317 (9793/9794) in a multiplex reaction, the subsequent fragment analysis being carried out on the CEQ8000 (Beckman Coulter).
  • the results are shown in FIG. It can be seen that the BAC clone (chromosome 5) used for the enrichment showed the D5S818 allele "13".
  • the heterozygous human DNA used showed the D5S818 features "11” and "12” (Chromatogam D). All genomic enhancements were positive for the expected features "11” and "12” as well as for a more or less pronounced feature "13” (residues of BAC DNA in the eluate, Chromatogram AC).
  • the method according to the invention it was possible to achieve a 10,000-fold enrichment of the specific DNA sections with separation of the unspecific DNA.
  • a high enrichment efficiency offers the advantage that the enriched DNA can be used, for example, in an emulsion PCR (em-PCR) and in a subsequent GS-FLX sequencing.
  • em-PCR emulsion PCR
  • GS-FLX sequencing GS-FLX sequencing.
  • in the method according to the invention can be dispensed with a PCR as an enrichment method, thereby avoiding the often occurring in a PCR uncontrolled base changes, which would lead to a falsified result.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreichung von kleineren DNA- Fragmenten aus komplexer genomischer DNA, sowie ein Verfahren zur Analyse von genomischer DNA, wobei das Verfahren zur Anreicherung eingesetzt wird.

Description

VERFAHREN ZUR ANREICHERUNG ODER ANALYSE VON DNA FRAGMENTEN AUS EINER
KOMPLEXEN GENOMISCHEN DNA PROBE
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung zusammenhängender genomischer DNA-Fragmente aus zu untersuchender komplexer genomischer DNA, und ein Verfahren zur Analyse der mit diesem Anreicherungsverfahren gewonnenen DNA-Fragmente, sowie den Einsatz des Verfahrens zur Untersuchung von Mutationen in genomischer DNA, insbesondere von Mutationen bei Genen, die mit bestimmten Krankheiten assoziiert sind und/oder zur Identifizierung von Genen, die mit bestimmten Krankheiten assoziiert sind.
In der modernen molekularen Biologie ist die gezielte Anreicherung von spezifischen Regionen aus komplexen Genomen ein wichtiger Schritt, um nachfolgend spezifische Sequenzabschnitte analysieren und identifizieren zu können, wobei gegenwärtig insbesondere die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eingesetzt wird, die sich innerhalb der letzen Jahre als die herausragende Anreicherungsmethode erwiesen hat. Daneben sind im Stand der Technik ferner Verfahren zu schnellen und kostengünstigen Produktion dichter DNA-Microarrays bekannt, sowie Verfahren, mit welchen DNA im Hochdurchsatz parallel sequenziert werden kann. Der Einsatz von Microarrays in Kombination mit den weiteren Verfahren der Sequenzierung und PCR hat es der Wissenschaft ermöglicht, riesige Mengen von Daten zu verarbeiten und zu verstehen.
Ein großes Ziel der molekulardiagnostischen Wissenschaft ist es nämlich, mit den verfügbaren Verfahren und Techniken mittels einer spezifischer Anreicherung innerhalb der komplexen Struktur der genomischen DNA Sequenzabschnitte bzw. Gene zu identifizieren, über welche Krankheiten diagnostiziert und ggf. auch gezielt behandelt werden können.
So erlauben gegenwärtig neuartige Sequenziertechnologien (hochdichte Parallelsequenzierung) die Resequenzierung von mehreren Megabasen von individuellen Genomen. Auf diese Weise lassen sich bspw. komplette Bakteriengenome (100 Mb) auf einmal innerhalb von drei bis fünf Tagen re-sequenzieren bzw. de-novo- sequenzieren. Allerdings übersteigt das menschliche Genom, wie auch die Genome vieler anderer Spezies, die Sequenzierkapazität dieser Technologien um das Vielfache, weil gerade Abweichungen vom Normalzustand etwa 5 bis 20 Mal unabhängig untersucht werden müssen, bevor mit hinreichender Sicherheit bspw. eine krankhafte Mutation entdeckt werden kann.
Die genomische Forschung und die molekulargenetische Diagnostik bei Menschen wie auch bei vielen anderen Spezies oder Modellorganismen pflanzlicher oder tierischer Art stellt die Wissenschaft vor zwei wiederkehrende aufwändige bzw. überfordernde Herausforderungen.
So wird gegenwärtig bei der Mutationssuche in bekannten Krankheitsgenen mit der konventionellen Sanger-Sequenziermethode das Krankheitsgen bzw. die Krankheits- gene in einzelnen Exonen analysiert und dann Dutzende Einzelbefunde zu einem Gesamtergebnis zusammengefügt. Die Nachteile bei diesem Ansatz liegen darin, dass einerseits eine Vielzahl von Einzeluntersuchungen erforderlich ist, die zeitlich synchronisiert werden müssen; so erfordert bspw. eine Mutationssuche in den bekannten Brustkrebsgenen 76 Einzelanalysen von 100 bis 500 Basenpaaren. Ferner ist von Nachteil, dass der Verlust größerer genomischer Abschnitte ("exonische Deletionen") nicht bemerkt werden, da die PCR-Analytik in solchen Bereichen regelmäßig zu fälschlich unauffälligen Befunden führt ("allelic drop out"). Für die Brustkrebsgene müssten diese Mutationsformen, die immerhin 5 bis 10 % aller bekannten Mutationen darstellen, durch aufwändig etablierte Spezialuntersuchungen kontrolliert werden.
Daher besteht trotz dieser gegenwärtig verfügbaren Verfahren bei der Größe der Säugetiergenome (bis zu 3 Gb) der große Nachteil, dass mit einzelnen Experimenten keine sorgfältigen Screenings durchgeführt werden können.
Auch muss berücksichtigt werden, dass bei den konventionellen Verfahren nur exonische Abschnitte der Gene analysiert werden, weil die großen Introns Aufwand und Kosten vervielfachen. Obgleich oftmals klinisch relevante Mutationen in diesen intronischen Abschnitten seltener sind, werden diese jedoch dadurch systematisch übersehen.
Ferner müssen die PCR-Ansätze, die der Mutationssuche zugrunde gelegt werden, zunächst getestet werden, was sehr zeitaufwändig ist und zu einem hohen personellem Aufwand führt. Auch die Durchführung der PCR-Reaktionen verursacht einen hohen Kosten- und Zeitaufwand, da diese mit vergleichbaren Protokollen durchgeführt werden müssen, um reproduzierbare und aussagekräftige Ergebnisse zu erzielen, so dass einerseits diese Reaktionen erst etabliert werden müssen, und andererseits auch nach der Etablierung oft mehrere der Reaktionen für die Analyse eines Individuums erforderlich sind. Auch die Mutationssuche in unbekannten Krankheitsgenen stellt heute die Wissenschaft vor große Herausforderungen. Hierbei wurde insbesondere die positionelle Klonierungstechnik eingesetzt, mithilfe derer Krankheitsgene identifiziert werden konnten, und die dadurch zu relevanten medizinischen Durchbrüchen geführt hat. Dabei werden beginnend mit der Kopplungsanalyse in großen Familien mit der nachfolgenden Sequenzierung von Kandidatengenen immer wiederkehrend umschriebene Abschnitte des humanen Genoms analysiert.
Die Nachteile bei dieser Methode sind dabei u.a., dass selbst in großen, aufwändig vorbereiteten Studien oft Dutzende von Genen in zahlreichen Patienten jeweils exonweise durchsequenziert werden, wobei es selten gelingt, alle Abschnitte in ausgezeichneter Qualität darzustellen. Ferner sind diese Analysen seriell und damit sehr zeit- und kostenintensiv. Gleichzeitig ist dabei das Risiko, durch Fehlannotation das entscheidende Gen überhaupt nicht zu untersuchen, sehr hoch.
Kandidatenregionen, also Regionen, in denen mit einer bestimmten Wahrscheinlichkeit Mutationen vorliegen, die Krankheiten hervorrufen können, sind regelmäßig etwa 500 kb bis 10 Mb groß. Daher wäre es wünschenswert, ein Verfahren zu entwickeln, mit welchem DNA-Moleküle beliebiger Patienten dieser jeweiligen Kandidatenregion anzureichern und nachfolgend zu analysieren.
Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein robustes und flexibles Anreicherungsverfahren bereitzustellen, mit welchem relativ kleine Abschnitte eines komplexen Genoms (50 kb bis 10 Mb) angereichert werden können.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren gelöst, welches die folgenden Schritte aufweist:
a) Bereitstellen von doppelsträngigen DNA-Sonden, die Sequenzen aufweisen, welche Sequenzen in der zu untersuchenden komplexen genomischen DNA entsprechen, b) Immobilisierung der doppelsträngigen DNA-Sonden aus Schritt a) an einen Träger,
c) Denaturieren der an der Träger immobilisierten doppelsträngigen DNA- Sonden zur Herstellung von an den Träger gebundenen einzelsträngigen DNA- Sonden,
d) Fragmentieren und Denaturieren der zu untersuchenden genomischen DNA zur Herstellung von genomischen DNA-Fragmenten,
e) Inkubieren und Hybridisieren von fragmentierter und denaturierter genomischer DNA mit an den Träger immobilisierten einzelsträngigen DNA-Sonden,
f) Entfernen von nicht hybridisierter genomischer DNA, und
g) Eluieren von spezifisch an die DNA-Sonden gebundenen genomischen DNA- Fragmenten von dem Träger.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auf diese Weise vollkommen gelöst.
Mit der vorliegenden Erfindung wird ein Anreicherungsverfahren kleinerer DNA- Fragmente aus zu untersuchender komplexer genomischer DNA bereitgestellt, welches höchst flexibel ist und welches es ermöglicht, DNA-Fragmente von Interesse schnell und gezielt anzureichern, wonach diese nachfolgend zuverlässig analysiert werden können, bspw. mittels einer in vitro-Amplifikation bzw. einer direkten Sequenzierung.
Mit der vorliegenden Erfindung wird ein neues Verfahren zur Probenanreicherung bereitgestellt, mit welchem die Komplexität von genomischer DNA erfolgreich und in reproduzierbarer Weise reduziert werden kann. Dabei werden also zunächst DNA-Sonden bereitgestellt, die - bspw. über bestimmte Markierungen - an einem Träger immobilisiert werden. Die DNA-Sonden, bzw. die Quelle für die Sonden, werden dabei gezielt im Hinblick auf den zu untersuchenden Genomabschnitt ausgewählt, und können eine zufällige Fragmentlänge von ca. 100 bp bis 3000 bp, insbesondere von zwischen 250 bp und 1000 bp als vorteilhaft erwiesen haben. Nach der Immobilisierung der Sonden werden diese denaturiert, d.h. der Doppelstrang der DNA-Sonden wird in zwei Einzelstränge aufgebrochen. Parallel dazu wird die zu untersuchende genomische DNA (zufällig) fragmentiert, wobei sich Fragmente mit einer Größe von etwa 100 bis 3000 bp, insbesondere von 250 bis 1000 bp als besonders vorteilhaft herausgestellt haben. Diese Angaben zu den Fragmentlängen sind aber lediglich beispielhaft, weshalb auch kleinere oder größere Längen eingesetzt werden können. Nach der Fragmentierung wird die genomische DNA ggf. denaturiert, also in Einzelstränge zerlegt, wobei dies bspw. durch Erhitzen der Fragmente in einem Puffer, vorzugsweise in einem Hybridisierungspuffer, vorgenommen wird, oder aber alkalisch. Andererseits, insbesondere bei Verwendung von sogenannter Library-DNA ist eine Denaturierung nicht immer notwendig, da diese bereits auch in einzelsträngiger Form vorliegt. Dem Fachmann wird klar sein, dass er, je nach Art und Form der zu untersuchenden genomischen DNA, einen Denaturierungsschritt vorsehen muss oder nicht.
Die Fragmentierung der genomischen DNA kann dabei bspw. mittels eines oder mehrerer Restriktionsenzymen, durch Ultraschallbeschallung, durch Nebulisation durchgeführt werden.
Die fragmentierte und ggf. denaturierte genomische DNA wird anschließend zu den auf den Träger immobilisierten Sonden gegeben, bspw. in einer Menge von 0,1-20 μg, wobei sich eine Menge von 10 bis 20 μg als vorteilhaft erwiesen hat, wonach der Ansatz anschließend zur Hybridisierung über einen Zeitraum inkubiert wird. Bei diesem Schritt lagern sich zwei DNA-Einzelstränge, die komplementäre Basensequenzen besitzen, zu Doppelsträngen zusammen. Die Hybridisierungsbedinungen zwischen Sonde und Ziel (also die Fragmente) sollten dabei derart gewählt werden, dass die spezifische Wechselwirkung zwischen Sonde und Ziel, bzw. die Erkennungs- und Bindungsreaktion ("Hybridisierung") der beiden Moleküle sowohl ausreichend spezifisch als auch hinreichend stabil ist. Dabei werden regelmäßig Bedingungen gewählt, die allgemein gleichmäßig stabil unabhängig von den spezifisch beteiligten Sequenzen sind, wobei Puffer, Inkubationsdauer und Inkubationstemperatur zu berücksichtigende Faktoren sind.
Vorliegend wird bspw. ein Hybridisierungspuffer eingesetzt, der 5x SSC (0,75M NaCl, 75mM NaCitrat, pH 7 0,1% (w/v) N-Laurly-Sarcosin; 0,02% (W/V) SDS; 2% Blocking Reagens (Kasein-Fraktion fettfreier Trockenmilch) enthält. Die Reaktion wird dann bspw. für eine Dauer von 1 bis 80 Stunden, vorzugsweise von 60 Stunden inkubiert.
Nach der Hybridisierungsreaktion kann der Träger gewaschen werden, bspw. über ein bis mehrere, vorzugsweise drei, Waschschritte mit einem Waschpuffer, wodurch alle nicht durch Hybridisierung gebundenen Anteile der Ziel-DNA entfernt werden. Dabei kann jeder beliebige Waschpuffer eingesetzt werden, der keinen Einfluss auf die hybridisierten Produkte hat, mit dem jedoch nicht gebundene genomische DNA- Fragmente abgewaschen werden können.
Im letzten Schritt werden dann die komplementär zu den einzelsträngigen DNA- Sonden gebundenen, ebenfalls einzelsträngigen DNA-Fragmente (die "Targets" bzw. Ziele) der genomischen DNA mobilisiert, bspw. durch alkalische Lyse oder durch Hitze. Unter "Eluieren" ist dabei jede Verfahrensmaßnahme zu verstehen, mit dem die Targets vom Träger - und damit von den an den Träger immobilisierten Sonden - gelöst werden. Es versteht sich, hierdurch gewonnenen Fragmente für eine weitere Analyse ggf. noch in der Lösung neutralisiert werden müssen, insbesondere bei einem Einsatz einer alkalischen Lyse für die Immobilisierung. Dem Fachmann wird klar sein, welche Bedingungen er für welche Analyse wählen muss, um diese durchführen zu können. Wichtig ist also in dem erfindungsgemäßen Verfahren, dass die doppelsträngigen DNA-Sonden vor Zugabe der Ziel-DNA bereits denaturiert und einzelsträngig gemacht wurden.
In der vorliegenden Erfindung wird dabei unter "genomischer DNA" bzw. "Genom" das gesamte genetische Material eines Organismus verstanden. Dabei ist die DNA (Desoxyribonucleinsäure), die aus dem genetischen Material in dem Chromosom eines bestimmten Organismus abgeleitet ist, die "genomische DNA". Ferner ist unter einer "genomischen Bibliothek" oder "genomische Library-DNA" eine Sammlung von Klonen zu verstehen, die aus einem Satz von zufällig generierten, überlappenden DNA-Fragmenten, die das gesamte Genom eines Organismus repräsentieren, hergestellt wurde. Diese - vorliegend auch "Library-DNA" genannte - genomische DNA liegt oftmals auch bereits in Einzelstrangform vor. In diesem Zusammenhang sind vorliegend unter genomischen "DNA-Fragmenten" kleinere Abschnitte des Gesamtgenoms zu verstehen, die eine Länge von ca. 50 bis ca. 5000 bp aufweisen können, wobei als Vergleich das Genom von bspw. Säugetieren eine Größe von bis zu 3 Gb besitzen kann. Vorliegend kann also, wenn von "genomischer DNA" die Rede ist, nicht nur die aus dem genetischen Material in dem Chromosom eines bestimmten Organismus abgeleitete oder gewonnene gesamte genomische DNA eines Organismus zu verstehen sein, sondern eben auch die in Form einer Bibliothek oder Library vorliegenden DNA-Fragmente, die das gesamte Genom eines Organismus repräsentieren.
Zur Herstellung einer genomischen Bibliothek wird die gesamte zelluläre DNA eines Organismus durch Restriktionsenzyme in Fragmente zerlegt, die danach in einen geeigneten Klonierungsvektor, bspw. Bakteriophagen oder Cosmide, eingefügt und vermehrt werden. Wenn nur ein Teil aller im Genom eines Organismus vorkommenden DNA-Bereiche in einer Genbibliothek enthalten ist, so wird diese als subgenomi- sche Bibliothek bezeichnet.
Unter einer "Sonde" wird vorliegend ein Oligonucleotid verstanden, das in der Lage ist, in einer Basen-spezifischen Art und Weise mit einem komplementären Strang Nucleinsäure eine Bindung einzugehen. Dabei ist unter "Oligonucleotid" jede Nuc- leinsäure zu verstehen, wie bspw. DNA oder RNA, die darüber hinaus einzel- oder doppelsträngig vorliegen kann. Es versteht sich, dass Oliconucleotide natürlich vorkommend sein können, oder synthetisch sind, normalerweise werden diese jedoch mithilf e synthetischer Mittel hergestellt. Die Länge der Oligonucleotide ist gewöhnlich mindestens 5, 10 oder 20 Basen lang, und kann bis zu 50, 100, 1000 oder weitere Basen lang sein. Dabei können Oligonucleotide auch Peptidnucleinsäuren oder analoge Nucleinsäuren mit einschließen.
Unter einem "Träger" ist vorliegend jedes Substrat zu verstehen, an den Nucleinsäure- sonden angebracht werden können bzw. angebracht sind. Dabei können typischerweise eine Vielzahl von verschiedenen Sonden an die Oberfläche des Trägers an verschiedenen bekannten Stellen gekoppelt sein. Derartige Träger werden dann auch als "Chips" oder "Microarrays" bezeichnet. Die Oberfläche des Trägers bzw. des Substrats kann praktisch in jeder Form oder in einer Vielzahl von Oberflächen hergestellt sein, so dass bspw. Träger in Form von (Mikrotiter-)Platten, eines Blatts, von Fasern oder Glas, etc. eingesetzt werden können, die für eine Anheftung von Sonden geeignet ist.
Das zu untersuchende Genom bzw. die genomische DNA ist dabei nicht auf den Menschen als Quelle beschränkt, sondern erstreckt sich auf einschließlich, jedoch nicht limitierend, allgemein auf Säugetiere, ferner auf Pflanzen, Bakterien oder Zellen, die von jedem der oben Genannten abgeleitet sind. Dabei versteht sich, dass auch auf "Library-DNA" als Ausgangsmaterial für genomische DNA zurückgegriffen werden kann.
Dabei ist bei dem Verfahren in einer Ausführungsform bevorzugt, wenn die DNA- Sonden in Schritt a) durch eine Fragmentierung von größeren DNA-Abschnitten gewonnen werden, wobei ferner bevorzugt ist, wenn hierfür eine DNA eingesetzt wird, die in BAC-Klonen ("bacterial artificial chromosome", künstliches Bakterienchromosom) enthalten ist. So ist bspw. die frei erhältliche BAC-Klonsammlung 32k (Osoegawa et al., „A Bacterial Artificial Chromosome Library for Sequencing the Complete Human Genome", Genome Research 2001; 11:483-496) geeignet, bei der 150.000 bis 250.000 zusammenhängende Basen des humanen Genoms jeweils in einem künstlichen Bakterienchromosom enthalten sind, welche jederzeit hochrein durch Bakterien hergestellt werden können.
Es versteht sich jedoch, dass jede andere Quelle von Genomen geeignet ist, und das vorliegende Verfahren nicht auf den Einsatz von BACs beschränkt ist.
Auch bei dieser Ausführungsform des Verfahrens kann die Fragmentierung mittels eines oder mehrerer Restriktionsenzyme, durch Ultraschall, durch Nebulization (Druckluft oder Stickstoff) in kleinere Abschnitte aufgeteilt werden.
In einer Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist bevorzugt, wenn die Sonden in Schritt b) über eine Markierung an den Träger immobilisiert werden. Dabei wird vorliegend unter einer Markierung jede chemische, biologische oder physikalische Modifizierung der Sonden verstanden, die eine Anbindung der Sonden an den Träger und damit deren Immobilisierung daran ermöglichen.
Dabei ist bevorzugt, wenn zur Markierung der doppelsträngigen DNA-Sonden ein Marker eingesetzt wird, der eine spezifische oder unspezifische Affinität für den Träger besitzt.
Wenn der an die Sonden anzubringende Marker eine unspezifische Affinität für den Träger besitzt, dann binden die Sonden - über den Marker - beliebig an den Träger, d.h., dass es nicht auf die Beschaffenheit der Oberfläche des Trägers ankommt, an welche die Sonden gebunden werden sollen. Andererseits, bei einer spezifischen Affinität des Markers für den Träger, binden die Sonden ganz spezifisch an die - ggf. entsprechend bearbeitete - Oberfläche des Trägers und ggf. an spezifische Stellen auf dieser. Dabei ist bei einer spezifischen Affinität des Markers bevorzugt, wenn der Marker Biotin-dUTP ist. Dieser kann dann, in einer bevorzugten Weiterbildung des Verfahrens, terminal an der Sonde angebracht sein, wobei wiederum bevorzugt ist, wenn für die Markierung eine terminale Transferase eingesetzt wird. Die terminale Transferase ist ein Enzym, das die matrizenunabhängige Anheftung von Desoxynucleotiden (2'- Desoxyribonucleosidmonophosphate) an die endständigen 3'-OH-Gruppen von DNA-Molekülen vermittelt. Daher kann dieses Enzym bspw. Biotin-dUTP an die DNA-Sonden anheften.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform weist der Träger eine Beschich- tung mit einer spezifischen Affinität für den Marker auf, wobei dann, wenn der Marker Biotin-dUTP ist, bevorzugt ist, wenn die Immobilisierung der markierten doppelsträngigen DNA-Sonden in Schritt c) über Streptavidin erfolgt, mit welchem der Träger beschichtet ist. Streptavidin, ein aus einem Bakterium isoliertes Protein, bindet Biotin an seine vier Untereinheiten. Ganz allgemein kann aber jede Modifizierung eingesetzt werden, welche durch hochaffine Wechselwirkungen zwischen den Partnern eines spezifischen Bindepaares, wie z. B. Biotin/Streptavidin oder Avidin, Hapten/Anti- Hapten-Antikörper, Zucker/Lectin etc., vermittelt werden.
Bei dem Verfahren ist ferner insgesamt bevorzugt, wenn der Träger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mikrotiterplatten, Zentrifugationssäulen, magnetische Beads, paramagnetische Beads. Es versteht sich dabei, dass dabei jedes Substrat als Träger dienen kann, das für die vorliegenden Zwecke entsprechend modifiziert und eingesetzt werden kann. Im Stand der Technik ist eine Vielzahl von Trägersubstraten offenbart, die für das vorliegende Verfahren geeignet und dem Fachmann hinreichend bekannt sind.
Insbesondere ist in einer alternativen Ausführungsform bevorzugt, wenn Schritt d) vor oder parallel zu einem der vorherigen Schritte durchgeführt wird. Zur Beschleunigung des Verfahrens ist dabei verständlicherweise bevorzugt, wenn der Schritt des Fragmentierens und Denaturierens der genomischen DNA parallel zu der Fragmentierung und ggf. Markierung und Immobilisierung der Sonden durchgeführt wird. Dies hängt aber auch jeweils von den einzusetzenden Sonden/dem genomischen DNA- Material ab, und dem Fachmann wird anhand dieser klar sein, welche Reihenfolge jeweils angewandt werden sollte.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist ferner bevorzugt, wenn die Denaturierung der DNA-Sonden in Schritt c) und/oder der genomischen DNA in Schritt d) durch Hitze, Alkali oder Säure und Wasserstoffbrücken lösende Agenzien, wie z. B. Harnstoff, Formamid, durchgeführt wird. Es versteht sich, dass der Fachmann denaturierende Agenzien auch im Gemisch zur Anwendung bringen kann.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ferner vorgesehen, dass die Elution der genomischen DNA-Fragmente durch Verfahren vorgenommen wird, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend Hitzeeinwirkung, Säure- oder Alkalibehandlung und dem Einsatz aus Wasserstoffbrücken lösende Agenzien, wie z. B. Harnstoff, Formamid.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Analyse von genomischer DNA, das durch die Schritte der Anreichung durch das erfindungsgemäße Verfahren sowie des Analysierens der eluierten genomischen DNA-Fragmente gekennzeichnet ist.
Dabei ist bevorzugt, wenn das Analysieren vorgenommen wird durch eines oder mehrere der Verfahren, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Polymera- se-Ketten-Reaktion, Sequenzierung, insbesondere direkte Sequenzierung, und klonale Amplifikation auf Glasoberflächen.
Die PCR, mit der spezifische DNA-Fragmente in vitro amplifiziert werden, ist eine überaus empfindlichen Technik, mit der sich auch aus sehr geringen Mengen heterogener DNA innerhalb kurzer Zeit ein oder mehrere bestimmte doppelsträngige DNA- Fragmente millionenfach anreichern lassen. Dabei kann bspw. auch die sogenannte emPCR (emulsion based PCR) eingesetzt werden, bei der Microbeads, an die ein- zelsträngige DNA-Fragmente gekoppelt sind, mit den Amplifikationsreagenzien in einem Öl-Wasser-Gemisch emulgiert werden (siehe bspw. Margulies et al. (2005) Nature ; 437:376-380).
Die durch Anreicherung gewonnene genomische DNA kann bspw. auch mit sogenannten Next-generation Sequenzierautomaten sequenziert werden, bei welchen anstelle einer Klonierung in bakterielle oder virale Systeme zur Vermehrung einzelner Sequenzen eine unmittelbare klonale Amplifikation von Einzelmolekülen erfolgt. Dabei wird die genomische DNA bereits nach der Fragementierung in einem weiteren Schritt mit PCR- bzw. Sequenzieradaptern versehen (Herstellung der so genannten Library). Nach der Anreicherung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die gewonnene Library-DNA dann direkt klonal amplifiziert werden (zum Beispiel Microbead-gekoppelte emPCR (Margulies et al. (2005) Nature; 437:376-380) für das 454-Verfahren (siehe www.genome-sequencing.com: und Roche Applied Science/454) oder klonale Amplifikation auf einer Glasoberfläche nach dem Solexa IG Verfahren (siehe www.illumina.com)) und online in den jeweiligen Sequenzierautomaten sequenziert werden. Es versteht sich, dass auch andere Verfahren zur Ermittlung von Nukleinsäure-Sequenzen im Megabasen-Durchsatz grundsätzlich auf dieses Anreicherungsverfahren zurückgreifen können, um eine überfordernde Komplexität des Ausgangsmaterials zu reduzieren.
Insgesamt ist bevorzugt, wenn das Verfahren zur Untersuchung von Mutationen in genomischer DNA eingesetzt wird, wobei in einer Ausführungsform bevorzugt ist, wenn das Verfahren zur Untersuchung von Mutationen bei Genen eingesetzt wird, die mit bestimmten Krankheiten assoziiert sind, und es bei einer anderen Ausführungsform bevorzugt ist, wenn das Verfahren zur Identifizierung von Genen eingesetzt wird, die mit bestimmten Krankheiten assoziiert sind.
Bei diesen Einsätzen werden demnach einerseits Mutationen in Genen untersucht, von denen bekannt ist, dass sie mit bestimmten Krankheiten bzw. Symptomen assoziiert sind. So wurde bspw. in jüngerer Zeit gezeigt, dass eine einzige Genmutation die Ursache bei einem von 25 Parkinson-Fällen weltweit ist. Die Studien lassen vermuten, dass die Mutation in einem erst kürzlich entdeckten Gen namens LRRK2 etwa fünf Prozent der vererbten Parkinson-Fälle und etwa zwei Prozent der sporadischen Fälle verursacht.
Andererseits können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch bisher unbekannte Gene identifiziert werden, die mit Krankheiten assoziiert sind. So wurden kürzlich Riskiogene für Morbus Crohn und Typ-2-Diabetes identifiziert. Die erfindungsgemäßen Verfahren bieten ein hervorragendes Werkzeug, um derartige Analysen zu verbessern, sowohl hinsichtlich der Kosten und des (Zeit)-Aufwands, als auch in der Zuverlässigkeit und Flexibilität.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung soll nun anhand eines Beispiels und der beigefügten Figur dargestellt werden werden, ohne sie aber auf dieses Beispiel zu beschränken. Es zeigt:
Fig. 1 Genomische Anreicherung humaner DNA-Abschnitte, die komplementär zum Chromosom-5-BAC (RPH 795P7) sind.
Ausführungsbeispiel
Für die Durchführung des erfindungegemäßen Verfahrens wurde eine fragmentierte und biotinmarkierte BAC-Sonde (RP11795P7; Chromosom 5) eingesetzt, mit einer Konzentration von 150 ng/μl. Hiervon wurden 1,0 μl, 0,5 μl bzw. 1,0 μl einer 1:10 Verdünnung eingesetzt. Die durchschnittliche Länge der Fragmente betrug ca. < 400 bp (Basenpaare). Die Fragementierung erfolgte durch Nebulisierung der BAC-DNA auf 200 bis 800 bp Fragmente. Anschließend erfolgte eine Aufreinigung dieser Fragmente über eine MinElute® Säule (Quiagen, Hilden, Deutschland). Die Fragmente wurden ferner durch eine terminale Transferase mit Biotin- 16-ddUTP (jeweils Roche Di- agnostics, Mannheim, Deutschland) mit Biotin markiert.
Ferner wurde humane genomische DNA durch Nebulisierung auf ca. 200 bp bis 800 bp fragmentiert. Auch diese DNA-Fragmente wurden über eine MinElute® Säule gereinigt und kleine Fragmente (<250bp) durch AMPure®-Beads (Agencoυrt® Bioscien- ce, Beverly MA, USA) entfernt. Nach der Eluierung der DNA von den Beads erfolgte ein „End Polishing" der Fragmente und eine Phosphorylierung durch T4 DNA Polymerase und T4 Polynukleotidkinase (PNK) und dATP (jeweils New England Biolabs GmbH, Frankfurt, Deutschland), sowie im Anschluss eine weitere Reinigung über eine MinElute® Säule. Die Fragmente wurden mit einer Konzentration c von 580 ng/μl eingesetzt, wobei 4,0 μl (entsprach ca. 2 μg), 2,0 μl (entsprach ca. 1 μg) bzw. 1,0 μl (entsprach ca. 0,5 μg) verwendet wurden; die Länge der Fragmente betrug durchschnittlich ca. 600 bp; gepoolt F#17. Wenn die Fragmente nach der Anreicherung bspw. für eine Amplifizierung eingesetzt werden sollten, wurden an die „polis- hed" DNA-Fragmente spezifische Adapter (Einzelstrang-Adapter oder Doppelstrang- Adapter) ligiert.
Sämtliche Ansätze wurden als dreifach-Ansätze angesetzt. Eingesetzt wurden ferner Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatten von Thermo Scientific (Waltham, USA, Katalog Nummer 95 029 362). Die biotinmarkierte BAC-Sonde (150ng; ca. 400 bp) wurde mit 50 μl Bindepuffer (10 mM Tris-HCl, 2M NaCl, ImM EDTA, 0,1 % Tween 20, pH 7,6) in die Wells der Streptavidin-beschichteten Platte pipettiert. Anschließend wurden die Wells mit Klebefolie verschlossen, und 1 Stunde bei Raumtemperatur im Plattenschüttelthermoblock mit Geschwindigkeit 2 inkubiert. Anschließend wurde die Platte kurz anzentrifugiert und der Puffer abgenommen; es folgte ein Waschschritt mit 0,5 M NaOH sowie eine 10-minütige Inkubation mit 100 μl 0,5M NaOH zur Denaturierung der immobilisierten Sonden.
Nach der Inkubation wurde das NaOH abgenommen und die Wells mit jeweils 300 μl PBS und 0,05 % Tween 20 gewaschen (jeweils vorsichtig 2 mal mit der Pipette mi- sehen). Auch dieser Puffer wurde danach abgenommen und die Platte kurz umgekehrt auf Papier trockenen gelassen.
Parallel wurden 50 μl Hybridisierungspuffer (5x SSC (0,75M NaCl, 75mM NaCitrat, pH 7 0,1% (w/v) N-Laurly-Sarcosin; 0,02% (W/V) SDS; 2% Blocking Reagens (Kasein- Fraktion fettfreier Trockenmilch)) mit der fragmentierten genomischen DNA (ca. 20 μg) versetzt, und 5 Minuten durch Aufkochen bei 95°C denaturiert. Je Well wurden 100 μl auf Hybridisierungstemperatur vorgemärmter Hybridisierungspuffer vorgelegt und die denaturierte DNA hinzu pipettiert; anschließend wurden die Wells mit Klebefolie verschlossen.
Die Platte wurde ca. 60 Stunden bei ca. 55°C auf dem Thermoblock mit Geschwindigkeit 2 inkubiert, um in den Wells eine Temperatur von ca. 500C zu erzielen, bei der die Fragmente an die Sonden hybridisieren. Die Platte war dabei fest verschlossen, um eine Austrocknung zu vermeiden. Anschließend wurde die Platte kurz anzentrifugiert. Die Wells wurden mit ja 300 μl PBS + 0,05% Tween 20 gewaschen (und der Inhalt der Wells jeweils 2-mal vorsichtig mit der Pipette gemischt); der Puffer wurde dann abgenommen und beim letzten Waschgang kurz umgekehrt auf Papier trocknen gelassen.
Zur Elution der spezifisch angereicherten DNA wurden 50 μl 50 mM NaOH in die Wells pipettiert und 5 min. bei Raumtemperatur inkubiert, um die Hybridisie- rungskomplexe wieder zu dentaurieren. Danach wurde das NaOH abgenommen und die Lösung in Eppendorf-Cups mit vorgelegten 8 μl IM Tris-HCl, pH 7,0 pipettiert und neutralisiert. Aus diesem Ansatz wurden jeweils 4 μl in die Kontroll-PCR (zur Erfolgskontrolle des Verfahrens) eingesetzt.
Der PCR-Nachweis wurde mit Primern für die Marker D5S818(9791/9792) und D13S317(9793/9794) in einer Multiplex-Reaktion, die anschließende Fragmentanalyse wird auf dem CEQ8000 (Beckman Coulter) durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt. Es ist zu erkennen, dass der zur Anreicherung verwendete BAC-Klon (Chromosom 5) das D5S818 Allel "13" zeigte. Die eingesetzte, heterozygote humane DNA zeigte die D5S818-Merkmale "11" und "12" (Chroma- togram D). Alle genomischen Anreicherungen waren positiv für die erwarteten Merkmale "11" und "12" sowie für ein stärker oder schwächer ausgeprägtes Merkmal "13" (Reste von BAC-DNA im Eluat; Chromatogram A-C). Wichtig für die spezifische Anreicherung ist das Fehlen von D13S317-Allelen im Eluat (die D13S317-Allele "12" und "13" fehlen in den Amplifikationen nach Anreicherung (Chromatogram A-C). Das bedeutet, dass im Eluat nach genomischer Anreicherung nur noch humane DNA- Abschnitte komplementär zum Chromosom-5- BAC vorhanden sind.
Die oben dargestellten Beispiele zeigen, dass die genomische Anreicherung mithilf e des erfindungsgemäßen Verfahrens in drei parallelen Ansätzen erfolgreich war:
Alle genomischen Anreicherungen waren positiv für die erwarteten Merkmale "11" und "12" (siehe Fig. 1, Chromatogramm A bis D), sowie für ein stärker oder schwächer ausgeprägtes Merkmal "13", wobei Letzteres auf Reste von BAC-DNA im Eluat zurückzuführen ist; siehe Chromatogramm A bis C. Wichtig für die spezifische Anreicherung ist das Fehlen von D13S317-Allelen im Eluat (die D13S317-Allele 12 und 13 fehlen in den Amplifikationen nach Anreicherung) (Chromatogramm A bis C), was bedeutet, dass im Eluat nach genomischer Anreicherung nur noch humane DNA-Abschnitte vorhanden sind, die komplementär zum Chromosom-5-BAC sind.
Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens konnte demnach eine 10.000-fache Anreicherung der spezifischen DNA-Abschnitte unter Abtrennung der unspezifischen DNA erreicht werden. Eine hohe Anreicherungseffizienz bietet den Vorteil, dass die angereicherte DNA bspw. in eine Emulsion-PCR (em-PCR) und in eine anschließende GS-FLX-Sequenzierung eingesetzt werden kann. Vorteilhafterweise kann bei der erfindungsgemäßen Verfahren also auf eine PCR als Anreicherungsmethode verzichtet werden, wobei dadurch die bei einer PCR häufig auftretenden unkontrollierten Basenaustausche vermieden werden, was zu einem verfälschten Ergebnis führen würde.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Anreicherung und/oder Analysierung von zusammenhängenden genomischen DNA-Fragmenten aus einer zu untersuchenden komplexen genomischen DNA, mit den folgenden Schritten:
a) Bereitstellen von doppelsträngigen DNA-Sonden, die Sequenzen aufweisen, welche Sequenzen in der zu untersuchenden komplexen genomischen DNA entsprechen, b) Immobilisieren der doppelsträngigen DNA-Sonden aus Schritt a) an einen Träger, c) Denaturieren der an den Träger immobilisierten doppelsträngigen DNA-Sonden zur Herstellung von an den Träger gebundenen ein- zelsträngigen DNA-Sonden, d) Fragmentieren und Denaturieren der zu untersuchenden genomischen DNA zur Herstellung von genomischen DNA-Fragmenten, e) Inkubieren und Hybridisieren von fragmentierter und denaturierter genomischer DNA mit an den Träger immobilisierten einzelsträngigen DNA-Sonden, f) Entfernen von nicht hybridisierter genomischer DNA, und g) Elution von spezifisch an die DNA-Sonden gebundenen genomischen DNA-Frgamenten von dem Träger.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zu untersuchende genomische DNA Säugetier-DNA, insbesondere vom Menschen, ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA- Sonden in Schritt a) durch eine Fragmentierung von größeren DNA- Abschnitten gewonnen werden.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass in BAC-Klonen enthaltene DNA für die Fragmentierung eingesetzt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonden in Schritt b) über eine Markierung an den Träger immobilisiert werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass zur Markierung der doppelsträngigen DNA-Sonden ein Marker eingesetzt wird, der eine spezifische oder unspezifische Affinität für den Träger besitzt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker Biotin-dUTP ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sonden terminal mit dem Marker markiert werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass für die Markierung eine terminale Transferase eingesetzt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger eine Beschichtung mit einer spezifischen Affinität für die Markierung der DNA-Sonden aufweist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Immobilisierung der markierten doppelsträngigen DNA-Sonden in Schritt b) über Streptavidin erfolgt, mit welchem der Träger beschichtet ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der in Schritt b) verwendete Träger ausgewählt ist aus Mikrotiterplatten und Säulen.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt d) vor oder parallel zu einem der vorherigen Schritte durchgeführt wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Denaturierungen der DNA-Sonden in Schritt c) und/oder der genomischen DNA in Schritt d) durch Hitze, Säure oder Alkali und Wasserstoffbrücken lösende Agenzien durchgeführt wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Elution der genomischen DNA-Fragmente durch Hitze, Säure oder Alkali und Wasserstoffbrücken lösende Agenzien vorgenommen wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass es im Anschluss an die Anreicherungsschritte a) bis g) den weiteren Schritt h) aufweist:
h) Analysieren der angereicherten genomischen DNA-Fragmente mittels m-v/rro-Amplifikation und/oder direkte Sequenzierung.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass es zur Untersuchung von Mutationen in genomischer DNA eingesetzt wird.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass es zur Untersuchung von Mutationen bei Genen eingesetzt wird, die mit bestimmten Krankheiten assoziiert sind.
19. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass es zur Identifizierung von Genen eingesetzt wird, die mit bestimmten Krankheiten assoziiert sind.
PCT/EP2009/001362 2008-02-29 2009-02-26 Verfahren zur anreicherung oder analyse von dna fragmenten aus einer komplexen genomischen dna probe Ceased WO2009106322A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE200810013715 DE102008013715B4 (de) 2008-02-29 2008-02-29 Verfahren zur DNA-Analyse
DE102008013715.4 2008-02-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2009106322A1 true WO2009106322A1 (de) 2009-09-03

Family

ID=40612940

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2009/001362 Ceased WO2009106322A1 (de) 2008-02-29 2009-02-26 Verfahren zur anreicherung oder analyse von dna fragmenten aus einer komplexen genomischen dna probe

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE102008013715B4 (de)
WO (1) WO2009106322A1 (de)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2913660A4 (de) * 2012-10-25 2016-06-29 Olympus Corp Verfahren zum nachweis von zielpartikeln
US9488578B2 (en) 2011-08-26 2016-11-08 Olympus Corporation Single particle detection device, single particle detection method, and computer program for single particle detection, using optical analysis
US9575060B2 (en) 2012-04-18 2017-02-21 Olympus Corporation Method for detecting a target particle
US10481158B2 (en) 2015-06-01 2019-11-19 California Institute Of Technology Compositions and methods for screening T cells with antigens for specific populations
US12258613B2 (en) 2017-03-08 2025-03-25 California Institute Of Technology Pairing antigen specificity of a T cell with T cell receptor sequences

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0487104A1 (de) * 1990-11-22 1992-05-27 Sumitomo Electric Industries, Ltd Verfahren zur Immobilisierung von einzelsträngigen DNS-Terminalen
EP1184466A2 (de) * 2000-08-26 2002-03-06 Affymetrix, Inc. Anreicherung und Amplifikation von Ziel-Nukleinsäuren für Array-Analyse
EP1630237A2 (de) * 2004-08-26 2006-03-01 Agilent Technologies, Inc. Isolierung von Nukleinsäurefragmenten durch Hybridisierung an eine feste Phase
US20070141604A1 (en) * 2005-11-15 2007-06-21 Gormley Niall A Method of target enrichment

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0487104A1 (de) * 1990-11-22 1992-05-27 Sumitomo Electric Industries, Ltd Verfahren zur Immobilisierung von einzelsträngigen DNS-Terminalen
EP1184466A2 (de) * 2000-08-26 2002-03-06 Affymetrix, Inc. Anreicherung und Amplifikation von Ziel-Nukleinsäuren für Array-Analyse
EP1630237A2 (de) * 2004-08-26 2006-03-01 Agilent Technologies, Inc. Isolierung von Nukleinsäurefragmenten durch Hybridisierung an eine feste Phase
US20070141604A1 (en) * 2005-11-15 2007-06-21 Gormley Niall A Method of target enrichment

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALBERT THOMAS J ET AL: "Direct selection of human genomic loci by microarray hybridization", NATURE METHODS, NATURE PUBLISHING GROUP, GB, vol. 4, no. 11, 1 November 2007 (2007-11-01), pages 903 - 905, XP002499757, ISSN: 1548-7091, [retrieved on 20071014] *
BASHIARDES STAVROS ET AL: "Direct genomic selection", NATURE METHODS JAN 2005,, vol. 2, no. 1, 1 January 2005 (2005-01-01), pages 63 - 69, XP002525087 *
LOVETT ET AL: "Fishing for complements: finding genes by direct selection", TRENDS IN GENETICS, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS B.V. AMSTERDAM, NL, vol. 10, no. 10, 1 October 1994 (1994-10-01), pages 352 - 357, XP023477939, ISSN: 0168-9525, [retrieved on 19941001] *
OKOU DAVID T ET AL: "Microarray-based genomic selection for high-throughput resequencing", NATURE METHODS NOV 2007,, vol. 4, no. 11, 1 November 2007 (2007-11-01), pages 907 - 909, XP002524506 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9488578B2 (en) 2011-08-26 2016-11-08 Olympus Corporation Single particle detection device, single particle detection method, and computer program for single particle detection, using optical analysis
US9575060B2 (en) 2012-04-18 2017-02-21 Olympus Corporation Method for detecting a target particle
EP2913660A4 (de) * 2012-10-25 2016-06-29 Olympus Corp Verfahren zum nachweis von zielpartikeln
US10481158B2 (en) 2015-06-01 2019-11-19 California Institute Of Technology Compositions and methods for screening T cells with antigens for specific populations
US12258613B2 (en) 2017-03-08 2025-03-25 California Institute Of Technology Pairing antigen specificity of a T cell with T cell receptor sequences

Also Published As

Publication number Publication date
DE102008013715A1 (de) 2010-04-08
DE102008013715B4 (de) 2011-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69433136T2 (de) Nukleinsäure-isolierung
DE69825240T2 (de) Verfahren zur subtraktiven hybridisierung und differenziellen analyse
US6156502A (en) Arbitrary sequence oligonucleotide fingerprinting
US20120045771A1 (en) Method for analysis of nucleic acid populations
DE69711895T2 (de) Characterisierung von dna
US20070148690A1 (en) Analysis of gene expression profiles using sequential hybridization
DE112010004821T5 (de) Prozessierung amplifizierter DNA-Fragmente zur Sequenzierung
DE112013004650T5 (de) Multiplexpyrosequenzierung unter Verwendung nichtinterferierender, rauschbeendender Polynukleotididentifikationstags
DE102008013715B4 (de) Verfahren zur DNA-Analyse
DE102005034628B4 (de) Verfahren zur Untersuchung von Cytosin-Methylierungen in DNA
US20170137807A1 (en) Improved ngs workflow
EP2471955B1 (de) Organismusspezifisches hybridisierbares Nucleinsäuremolekül
DE4317414C1 (de) Mittel zur komplexen Diagnostik der Genexpression und Verfahren zur Anwendung für die medizinische Diagnostik und die Genisolierung
EP1816217B1 (de) Verfahren zum Nachweis mehrerer Zielnukleinsäuren
DE102019118332B4 (de) Verfahren und testkit zur bisulfitmodifizierung von dna
US20100204050A1 (en) Target preparation for parallel sequencing of complex genomes
KR20240085399A (ko) Dna 단편의 멀티 결합 조립 반응을 이용한 단일세포의 다중체 전장 시퀀싱 분석방법
EP1537246B1 (de) Verfahren zur Amplifikation genetischer Information mittels an mehrere Stellen im Genom bindende Primer
DE10240746A1 (de) Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen mittels spaltbarer Sondenmoleküle
US20210198807A1 (en) Methods and systems for production of dna libraries directly from a stool sample for 16s metagenomics next generation sequencing
EP2706124B1 (de) Zeitgleicher Nachweis verschiedener Micro-RNA-Biogenese-Formen
DE19821114A1 (de) Methode zur Identifizierung und Darstellung interindividueller DNA-Sequenzunterschiede
RU2585519C2 (ru) Способ селективного отбора целевых участков днк
CN106755443B (zh) 一种从多种混合dna中超灵敏检测痕量dna的方法和试剂
EP1650314A1 (de) Dynamische Bestimmung von Analyten durch Arrays auf inneren Oberflächen

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09713694

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 09713694

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1