WO2009022756A1

WO2009022756A1 - 虚血性疾患の診断及び治療

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Publication number: WO2009022756A1
Application number: PCT/JP2008/065052
Authority: WO
Inventors: Hideaki Wakita; Koichi Igarashi; Kazunori Oie
Original assignee: Japan As Represented By President Of National Center For Geriatrics And Gerontology; Katayama Chemical Industries Co Ltd
Current assignee: Japan As Represented By President Of National Center For Geriatrics And Gerontology; Katayama Chemical Industries Co Ltd
Priority date: 2007-08-13
Filing date: 2008-08-13
Publication date: 2009-02-19
Anticipated expiration: 2010-02-13

Abstract

本発明は、リポソームと、シアリルルイスＸ（ＳＬＸ）またはＳＬＸ基とを含む、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態を処置または予防するための医薬組成物を提供する。本発明はまた、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態を診断するための診断用組成物を提供する。この診断用組成物は、Ａ）リポソームと、Ｂ）シアリルルイスＸ（ＳＬＸ）またはＳＬＸ基と、Ｃ）標識物質とを含む。本発明はまた、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態を処置または予防するための方法を提供する。本発明はまた、中枢神経系の虚血部位を検出するための方法を提供する。本発明はまた、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態を処置、予防、検出または診断するための医薬の製造におけるＳＬＸの使用を提供する。本発明はまた、細胞内に目的の物質を送達するための送達媒体を提供する。

Description

明細書

虚血性疾患の診断及び治療技術分野

本発明は、脳梗塞をはじめとする中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態、特に、虚血性脳疾患、虚血性脳障害または脳虚血状態の処置予防、検出または診断の技術に関する。本発明は、特に、シリアルルイス X ( S L X) または S L X基を含む組成物を用いて、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態を処置、予防、検出または診断することに関する。背景技術

中枢神経系の虚血性疾患は、動脈の閉塞や狭窄などにより中枢神経系の組織への血流が阻害され、脳などに障害が起こる疾患の総称であり、非常に重篤な疾患である。虚血により中枢神経系の組織が損傷を受けると、その個体は運動性障害を含めた様々な機能障害を引き起こす。これまで虚血後の運動障害を効果的に回復させるための治療剤は実用化されていない。

非特許文献 1および 2 (Science 1999； 285 (3) : 595-599および Cerebrovasc Dis. 2002； 13 (3)： 198 - 203) は、月においてグリコシル化された S L Xまたはカルボキシル化された S L Xを使用することを記載している。しかし、非特許文献 1および 2は、リボソームと、 S L Xまたは S L X基とを含む組成物が、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態において充分に効果があることは実証されておらず、ましてや運動障害等の機能回復に対して効果があるという記載はない。また、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態に指向性を有するリポソームは記載されていない。非特許文献 3 (Cardiovasc Res. 1995 Dec 30 (6) : 965-74) は、心臓虚血および再灌流傷害において S L Xリポソームが心臓保護効果を有し得ることを記載している。し力し、非特許文献 3は、リボソームと、 S L Xまたは S L X基とを含む組成物が、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態において充分に効果があることは実証されておらず、ましてや運動障害等の機能回復に対して効果があるという記載はない。また、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態に指向性を有するリポソームは記載されていない。

特許文献:！〜 3 (特開 2003-226638号、米国特許出願公開第 2003/0143267号明細書、欧州特許出願公開第 1447081号明細書）は、 S L Xをリンカ一タンパク質を介してリボソームに結合させたリボソームを開発したこと、そのリボソームが脳への指向性を有することを記載している。しかし、特許文献 1〜 3は、リポソームと、 S L Xまたは S L X基とを含む組成物が、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態において充分に効果があることは実証されておらず、ましてや運動障害等の機能回復に対して効果があるという記載はない。また、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態に指向性を有するリボソームは記載されていない。

特許文献 4および 5 (国際公開公報第 2005/011633号パンフレツトおよび国際公開公報第 2007/018272号パンフレット）は、 S L Xをリンカ一タンパク質を介してリポソームに結合させたリポソームが炎症部位への指向性を有することを記載している。しかし、特許文献 4および 5は、リボソームと、 S L Xまたは S L X基とを含む組成物が、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態において充分に効果があることは実証されておらず、ましてや運動障害等の機能回復に対して効果があるという記載はない。また、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態に指向性を有するリポソームは記載されていない。

非特許文献 4 (Barbar P. A. et al. Ann Neurol 2004, 56 : 116-120) は、 G d — D T P A— s L e x Aを用いた MR I画像が記載されている。非特許文献 4には、虚血の発症後 2 4時間での MR I画像が撮像されているだけである。非特許文献 4には、リボソームを用いることは記載されていない。非特許文献 4の方法では、高濃度の造影剤を患部に送達させ、感度の高い画像診断をすることはできないと考えられる。非特許文献 4は、リボソームと、 S L Xまたは S L X基とを含む組成物が、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態において充分に効果があることは実証されておらず、ましてや運動障害等の機能回復に对して効果があるという記載はない。また、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態に指向性を有するリポソームは記載されていない。発明の開示

発明が解決しようとする課題

本発明の課題は、虚血性脳疾患、虚血性脳障害または脳虚血状態を処置、検出または診断するのに有用な組成物を提供することにある。課題を解決するための手段

上記の課題を解決するために、本発明者等は鋭意研究の結果、リボソームと、シァリルルイス X ( S L X) または S L X基とを含む組成物が、虚血性脳疾患、虚血性脳障害または脳虚血状態において予想外に治療効果を上げることを見いだし、本発明を完成させるに至ったものである。

上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する。

(項目 1 )

親水性化されたリボソームと、シァリルルイス X ( S L X ) または S L X基とを含む、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態を処置または予防するための医薬組成物。

(項目 2 )

歩行障害または姿勢保持障害を回復させるための、上記項目に記載の医薬組成物。 (項目 3)

前記親水性化がトリス（ヒドロキシメチル）メチルァミノ基による、上記項目に記載の医薬組成物。

(項目 4)

前記リボソームを構成する脂質の一部が、親水性化合物架橋基一 W—トリス（ヒドロキシメチル）メチルァミノ基と NH— C (=0) 結合しており、ここで、該 Wは、 C (=0) — NH結合である、上記項目に記載の医薬組成物。

(項目 5)

前記リボソームと前記 S LX基とが、ヒト血清アルブミン基を介して結合している、上記項目に記載の医薬組成物。

(項目 6)

前記リボソームを構成する脂質の一部は、ヒト血清アルブミン基一 A—リンカ一タンパク質架橋基一 X— S LX基と CH₂— NH結合しており、ここで、該 Aは、 NH-C ( = 0) 結合であり、該 Xは、 C (=0) 一 NH結合である、上記項目に記載の医薬組成物。

(項目 7)

前記リボソームの表面に前記 S LX基が存在する、上記項目に記載の医薬組成物。

(項目 8)

前記中枢神経系が、脳である、上記項目に記載の医薬組成物。

(項目 9)

中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態を診断するための診断用組成物であって、以下：

A) 親水性化されたリボソームと、

B) シァリルルイス X (S LX) または SLX基と、

C) 標識物質

とを含む、診断用組成物。 (項目 10)

磁気共鳴画像法において使用するための、上記項目に記載の診断用組成物。

(項目 1 1)

前記親水性化がトリス（ヒドロキシメチル）メチルァミノ基による、上記項目に記載の診断用組成物。

(項目 12)

前記リボソームを構成する脂質の一部が、親水性化合物架橋基一 W—トリス（ヒドロキシメチル）メチルァミノ基と NH— C (=0) 結合しており、ここで、該 Wは、 C (=0) — NH結合である、上記項目に記載の診断用組成物。

(項目 13)

前記リボソームと前記 S LX基とが、ヒト血清アルブミン基を介して結合している、上記項目に記載の診断用組成物。

(項目 14)

前記リボソームを構成する脂質の一部は、ヒト血清アルブミン基—A—リンカ一タンパク質架橋基一 X— S LX基と CH₂— NH結合しており、ここで、該 Aは、 NH— C (=0) 結合であり、該 Xは、 C ( = 0) — NH結合である、上記項目に記載の診断用組成物。

(項目 15)

前記リボソームの表面に前記 S LX基が存在する、上記項目に記載の診断用組成物。

(項目 16)

前記中枢神経系が、脳である、上記項目に記載の診断用組成物。

(項目 1 7)

分子ィメージングにより脳虚血を診断するための上記項目に記載の診断用組成物であって、

前記標識物質が、該分子イメージングによって検出可能である物質である、診断用組成物。

(項目 18)

前記標識物質が、蛍光物質である、上記項目に記載の診断用組成物。

(項目 19)

中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態を処置または予防するための方法であって、該方法は、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態を処置または予防する必要のある患者に、上記項目に記載の有効量の医薬組成物を投与する工程を包含する、方法。

(項目 20)

中枢神経系の虚血部位を検出するための方法であって、該方法は、

中枢神経系の虚血部位を検出する必要のある患者に、上記項目に記載の有効量の診断用組成物を投与する工程；および

該患者において、該診断用組成物に含まれる標識物質を磁気共鳴画像法により測定し、該標識物質の存在は、該患者に中枢神経系の虚血部位があることを示す工程

を包含する、方法。

(項目 21)

中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態を処置、予防、検出または診断するための医薬の製造における、 S LXまたは S LX基含有化合物の使用。

(項目 22 )

細胞内に目的の物質を送達するための送達媒体であって、

A) 親水性化されたリボソームと、

B) シァリルルイス X (S LX) または S LX基と、

C) 目的物質

とを含む、送達媒体。 (項目 23)

前記細胞が、 Eセレクチンを発現している細胞である、上記項目に記載の送達媒体。

(項目 24)

前記目的物質が、蛍光物質、蛍光タンパク質、発光酵素、タンパク質、錯体、コロイド、難水溶性薬物、水溶性薬物および核酸からなる群より選択される、上記項目に記載の送達媒体。

(項目 25 )

前記目的物質が、 3， 8—ジァミノ— 5—ェチルー 6—フエユルフェナントリジ二ゥムブロミド（ェチジゥムブロマイド）、 2，一（4—エトキシフエニル） ― 5— (4—メチル一 1ーピペラジニル）一2， 5 ' —ビ 1H— （へキスト 333

42) 、 2 ' 一 (4ーヒドロキシフエニル）一5— (4—メチルー 1—ピペラジニル）一 2， 5， —ビ一 1 H—ベンゾィミダゾール，三塩酸塩（へキスト 332

58) 、 P I、 3， 6—ビス（ジメチルァミノ）アタリジン塩酸塩（プロピジゥムィオダイド）、 4' ， 6—ジアミジノー 2—フエニルインドール，二塩酸塩

(DAP I ) 、 3， 6—ビス（ジメチルァミノ）ァクリジン塩酸塩（ァクリジンオレンジ、 AO) 、 5— （N—スクシンィミジルォキシカルボニル）一 3' , 6，一 0， 0，ージァセチルフルォレセイン（CFSE) 、 6— (N—スクシンィミジルォキシカノレボニル） — 3，， 6，一 0， O' —ジァセチルフルォレセィン（CFSE) 、フルォレセインジアセテート（FDA) 、 3' ， 6' —ジ（O —ァセチル）一 4，， 5 ' 一ビス [N， N—ビス（カルボキシメチル）アミノメチル] フルォレセィン，テトラァセトキシメチルエステル (C a 1 c e i n— A M) 、 7—イソブチルォキシカルボニルォキシ一 3 H—フエニキサジン一 3—ォン（Cy t oRe d) 、 3，一 O—ァセチルー 2，， 7 ' 一ビス（カルボキシェチル）一 4一カルボキシフルォレセイン，ジァセトキシメチルエステル（BCE

CF— AM) および 3' —O—ァセチル一 2 ' , 7，一ビス（カルボキシェチノレ）一 5—カノレボキシフノレォレセイン，ジァセトキシメチノレエステノレ (BCEC F-AM) からなる群より選択される、上記項目に記載の送達媒体。

(項目 A1)

親水性化されたリボソームと、シァリルルイス X (SLX) または S LX基とを含む、虚血性脳疾患、虚血性脳障害または脳虚血状態を処置または予防するための医薬組成物。

(項目 A2)

運動性障害を回復させるための、上記項目に記載の医薬組成物。

(項目 A3)

(項目 A 4)

前記リボソームを構成する脂質の一部が、親水性化合物架橋基一 W—トリス（ヒドロキシメチル）メチルァミノ基と NH— C ( = 0) 結合しており、ここで、該 Wは、 C ( = O) — NH結合である、上記項目に記載の医薬組成物。

(項目 A 5)

(項目 A 6)

前記リボソームを構成する脂質の一部は、ヒト血清アルブミン基一 A—リンカ一タンパク質架橋基一 X— S LX基と CH₂— NH結合しており、ここで、該 Aは、 NH-C ( = 0) 結合であり、該 Xは、 C ( = 0) — NH結合である、上記項目に記載の医薬組成物。

(項目 A 7 )

前記リボソームの表面に前記 S LX基が存在する、上記項目に記載の医薬組成物。 (項目 A8)

虚血性脳疾患、虚血性脳障害または脳虚血状態を診断するための診断用組成物であって、以下：

A) 親水性化されたリボソームと、

B) シァリルルイス X (S LX) または SLX基と、

C) 標識物質

とを含む、診断用組成物。

(項目 A 9)

(項目 A 10)

(項目 Al 1)

前記リボソームを構成する脂質の一部が、親水性化合物架橋基一 W—トリス（ヒドロキシメチル）メチルァミノ基と NH— C (=0) 結合しており、ここで、該 Wは、 C (=0) 一 NH結合である、上記項目に記載の診断用組成物。

(項目 A1 2)

(項目 A 1 3)

前記リボソームを構成する脂質の一部は、ヒト血清アルブミン基一 A—リンカ一タンパク質架橋基一 X— S LX基と CH₂— NH結合しており、ここで、該 Aは、

NH-C (=0) 結合であり、該 Xは、 C ( = 0) — NH結合である、上記項目に記載の診断用組成物。

(項目 A 14 )

(項目 A 1 5 )

磁気共鳴画像法により脳虚血を診断するための上記項目に記載の診断用組成物であって、前記標識物質が、核磁気共鳴画像法によって検出可能である物質である、診断用組成物。

(項目 A 1 6 )

前記標識物質が、常磁性の金属である、上記項目に記載の診断用組成物。

(項目 A 1 7 )

虚血性脳疾患、虚血性脳障害または脳虚血状態を処置または予防するための方法であって、該方法は、虚血性脳疾患、虚血性脳障害または脳虚血状態を処置または予防する必要のある患者に、上記項目に記載の有効量の医薬組成物を投与する工程を包含する、方法。

(項目 A 1 8 )

脳虚血部位を検出するための方法であって、該方法は、

脳虚血部位を検出する必要のある患者に、上記項目に記載の有効量の診断用組成物を投与する工程；および

該患者において、該診断用組成物に含まれる標識物質を磁気共鳴画像法により測定し、該標識物質の存在は、該患者に脳虚血部位があることを示す工程を包含する、方法。

(項目 A 1 9 )

虚血性脳疾患、虚血性脳障害または脳虚血状態を処置、予防、検出または診断するための医薬の製造における、 S L Xまたは S L X基含有化合物の使用。

本発明によって、シァリルルイス X ( S L X) または S L X基を含む組成物が、それ自体で中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態を効果的に治療できることが初めて見出された。本発明の組成物は、標識物質などを含めることにより、診断薬としても利用可能である。このような組成物は、本発明によって初めて提供されるものである。図面の簡単な説明

図 1は、糖鎖（シァリルルイス X) 修飾リボソームの調製についての模式図を不す (Hirai M et al. Biochemical and Biophysical Research し ommunications

353(2007)553— 558を参照のこと。：）。 HSA、 B S 3、 T r i s、 DT S S Pおよび S LXは、それぞれ以下の略号である。 HSA ; ヒト血清アルブミン、 B S 3 ；ビス（スノレホスクシンィミジル）スべレート基、 T r i s ；トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン基、 DT S S P ； 3， 3 ' —ジチオピス（スルホスクシンィミジルプロピオネート）、 S LX ；シァリルルイス X基。

図 2は、リボソームのタンパク質量を測定するための検量線の一例を示す。 X 軸は、タンパク質スタンダードの濃度（/z gZ50 /z l) であり、 Y軸は、 54 0 nmの吸光度である。

図 3は、リボソームの脂質量を測定するための検量線の一例を示す。 X軸は、コレステロールスタンダードの濃度（μ g/2 0 /X 1 ) であり、 Y軸は、 5 5 0 nmの吸光度である。

図 4は、 S LX修飾リボソームの粒子径分布（強度によるサイズ分布）の一例を示す。 X軸は、リボソームのサイズ（d. nm) を示し、 Y軸は、強度（％) を示す。

図 5 Aは、ナイロン栓子法での右中大脳動脈を 2時間閉塞した後 3時間再開通させたラットにおいて、閉塞側（脳虚血部位）の脳血管で E—セレクチンが産生されていることを示す。上段 A：虚血中心部、 B :虚血周辺部、 C ：非閉塞側、バーは 2 mmを示す。下段上段の A〜C領域についての拡大図である。バーは、 5 0 μ mを示す。

図 5 Bは、ナイロン栓子法での右中大脳動脈を 2 4時間閉塞し再開通させることなく安楽死させたラットにおいて、閉塞側（脳虚血部位）の脳血管で E—セレクチンが産生されていることを示す。 A：閉塞側、 B ：非閉塞側、バーは、 5 0 μ mを示す。

図 6— 1は、右中大脳動脈 2時間閉塞後、 3時間再開通させたのち C y 3内包リボソームを投与し、 1 0分後に脳を取り出したラットの C y 3内包リボソームの分布を示す。 Aは、 S LXで修飾したリボソームが、閉塞側（脳虚血部位）の脳血管および血管周囲に集積したことを示す。非閉塞側でも少量の集積を認めた。左側：閉塞側、右側：非閉塞側。上段： C y 3、中段：血管内皮細胞のマーカーである von Will ebrand factor (VWF)、下段：重ね合わせ。 Bは、糖鎖の結合していないリボソームには、虚血部位への集積性がないことを示す。上段： C y 3、中段：血管内皮細胞のマーカーである von Willebrand factor (VWF)、下段：重ね合わせ。バーは、 5 0 Ai mを示す。 Cは、 S LX修飾糖鎖リボソームを投与したラットにおける C y 3内包リボソームの分布を示す。中央および右側は、右中大脳動脈 2時間閉塞後、 3時間再開通させたのち C y 3内包リボソームを投与し、 1時間後（中央）または 24時間後（右側）に脳を取り出したラットの C y 3内包リボソームの分布である。左側は、コントロールであり、 s h a m手術をした後に、中央および右側のものと同じタイミングで C y 3内包リボソームを投与し、 1 0分後に脳を取り出したラット（s h a m手術群）の C y 3内包リボソームの分布である。 s h a m手術群では C y 3内包リボソームの集積は認めなかった。一方、右中大脳動脈 2時間閉塞後、 3時間再開通させたラットでは 1時間後（中央）、 24時間後（右側）ともに C y 3内包リボソームの集積を認めた。バーは、 2 5 μ mを示す。

図 6— 2は、右中大脳動脈 2時間閉塞後、 3時間再開通の C y 3内包リポソ一ムの分布を示す。上段： S LX修飾リボソーム投与群、左：閉塞側、右：非閉塞側。下段：糖鎖なし投与群、左：閉塞側、右：非閉塞側。上段は、 S LXで修飾したリボソームが、閉塞側（脳虚血部位）に集積したことを示す写真である。非閉塞側でも少量の集積を認めた。下段は、糖鎖の結合していないリボソームには、虚血部位への集積性がないことを示す写真である。バーは、 5 0 /Z mを示す。図 6— 3の上段は、 S L Xで修飾したリボソームが、閉塞側（脳虚血部位）の脳血管および血管周囲に集積したことを示す。右中大脳動脈 2時間閉塞後、 3時間再開通させたのち、 S L Xで修飾した C y 3内包リボソームを注射し 1 0分後に脳を取り出したラットの結果である。右側：透過光、中央：自家蛍光、左側： C y 3、バーは、 5 0 μ πιを示す。図 6— 3の下段は、 S L X以外の糖鎖で修飾した糖鎖修飾リボソーム（c l一 6マンノビオース（K 3 ) で修飾した C y 3標識リボソーム）には、虚血部位への集積性がないことを示す。右中大脳動脈 2時間閉塞後、 3時間再開通させたのち、 K 3で修飾した C y 3内包リボソームを注射し 1時間後に脳を取り出したラッ卜の結果である。右側：透過光、中央：自家蛍光、左側： C y 3、バーは、 5 0 μ mを示す。 A：非閉塞側、 B ：閉塞側図 6— 4は、右中大脳動脈 2時間閉塞後、再開通直後に C y 3内包リボソームを投与し 4 8時間後に脳を取り出したラットの C y 3内包リボソームの分布を示す図である。 Aは、 S L Xで修飾したリボソームが、閉塞側（脳虚血部位）の脳血管および血管周囲に集積したことを示す。非閉塞側でも少量の集積を認めた。左側：非梗塞側、右側：虚血側。上段： C y 3、中段：血管内皮細胞のマーカーである von Willebrand factor (VWF)、下段：重ね合わせ。 Bは、糖鎖の結合していないリボソームには、虚血部位への集積性がないことを示す。左側：非梗塞側、右側：虚血側。上段： C y 3、中段：血管内皮細胞のマーカーである von Willebrand factor (VWF)、下段：重ね合わせ。バーは、 5 0 μ mを示す。

図 6— 5は、右中大脳動脈 2時間閉塞後、 C y 3内包リボソームを投与し、 4 8時間後のリボソーム分布を示す。上段は、糖鎖なし C y 3内包リボソームを投与した群であり、下段は、 S L X修飾 C y 3内包リボソームを投与した群である。それぞれ、左は虚血側を観察した図であり、右は非梗塞側を観察した図である。バーは、 3 0 0 μ mを示す。図 7は、抗 E—セレクチン抗体結合の阻害を示す。 SLX (K 1) で修飾した Cy 3標識リボソーム（左側）； ct l一 6マンノビオース（K3) で修飾した C y 3標識リボソーム（中央）、および糖鎖なし Cy 3標識リボソーム（右側）を投与した虚血ラッ卜の脳を、抗 E—セレクチン阻止抗体で免疫組織ィヒ学染色した結果を示す。 K 3で修飾した Cy 3標識リボソームおよび糖鎖なしリボソームでは抗 E—セレクチン抗体で染色される（結合され得る）血管を認めるが、 S LX で修飾したリボソームでは認めない。上段のバーは、 2 mmを示す。下段は、上段の囲み部分の拡大図であり、バーは、 300 μ mを示す。

図 8は、 E—セレクチンが、血管内皮細胞と白血球の接着に関わっていることを模式的に示す図である。

図 9は、再開通から 24時間後の SLX修飾リボソームの脳虚血治療効果（臨床スコア）を示すグラフである。 X軸の左側は、 S LX修飾リボソームを投与したラット（n = 5) 群であり、右側は、コントロールとして用いた結合糖鎖のないリボソームを投与したラット（n = 5) 群である。縦軸は、臨床スコアを示す。 S LX修飾リボソームを投与したラットは、コントロールとして用いた結合糖鎖のないリボソームを投与したラットに加えて有意に運動麻痺が軽かった。

図 10は、 S LX修飾リボソームの脳虚血治療効果（梗塞サイズ）を示す。左側は S L X修飾リポソームの投与群であり、右側は糖鎖なしリポソームの投与群である。脳梗塞の大きさを比較すると、 SLX修飾リボソームを投与したラットでは、結合糖鎖のないリボソームに比較して、有意に脳梗塞が縮小した。

図 1 1は、再開通から 24時間後の S LX修飾リボソームの脳虚血治療効果 (梗塞サイズ）を示すグラフである。 X軸の左側は、 SLX修飾リボソームを投与したラット（n = 5) 群であり、右側は、コントロールとして用いた結合糖鎖のないリボソームを投与したラット（n = 5) 群である。縦軸は、梗塞サイズ (mm3) を示す。脳梗塞の大きさを比較すると、 S L X修飾リボソームを投与したラットでは、結合糖鎖のないリボソームに比較して、有意に脳梗塞が縮小した。

図 12は、右中大脳動脈 2時間閉塞後、再開通直後に Cy 3内包リボソームを投与し、投与から 24時間後の虚血ラッ卜の脳における抗 E—セレクチン抗体結合の阻害と顆粒球の浸潤阻害を確認した図である。上段は糖鎖なしリボソーム投与群であり、下段を S LX修飾リボソーム投与群である。左側は E—セレクチンの発現を示す（バーは 200 μ πιを示す。）。右側は顆粒球の存在を示す（バーは、 100 /zmを示す。）。 S LX修飾リボソームを投与した虚血ラットの脳では抗 E—セレクチン阻止抗体で免疫組織化学染色すると、染色される血管は認められなかった。この結果より、 S LX修飾リボソームが E—セレクチンに結合したことにより、抗 E—セレクチン抗体が血管上のセレクチンに結合することができなかったと考えられた。また、 S LX修飾リボソームが E—セレクチンに結合したことにより顆粒球の脳実質への浸潤が阻止されたと考えられた。

図 13は、右中大脳動脈 2時間閉塞後の生体のイメージングを示す。 S LXで修飾したリボソームでは閉塞側での蛍光物質の集積による虚血部位の検出を認めるが、結合糖鎖のないリボソームでは虚血部位の検出を認めない。上段： S LX 修飾リボソーム投与群（左から投与前、 10分後、 60分後、 120分後、 24 時間後、 48時間後のインビボイメージング、最右端は 48時間後のェキソビボイメージング（A :非閉塞側、 B ：閉塞側）、下段：糖鎖なしリボソーム投与群 (左から投与前、 10分後、 60分後、 120分後、 24時間後、 48時間後のインビボイメージング、最右端は 48時間後のェキソビボイメージング）。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナノレ力 S レヽことを示す。卓位【ま、 photon count, photon /second

(ph/s) ： 1秒間にカウントされる蛍光シグナル photon数）を表す。

図 14は、ェチジゥムブロマイドを内包した S LX修飾リボソームの粒子径分布（強度によるサイズ分布）を一例である。 X軸は、リボソームのサイズ（d. nm) を示し、 Y軸は、強度（％) を示す。

図 15は、 COS 7細胞での Ε—セレクチンの発現を確認した図である。左欄は、 Eセレクチン強制発現プラスミドをトランスフエクシヨンした COS 7細胞である。右欄は、トランスフエクシヨンしていない COS 7細胞である。上段は、明視野で細胞を観察した写真（100倍率）である。下段は、 F I TCについて、 460〜490 nmの励起光をあて、 520 n mの蛍光を観察した写真（100 倍率）である。緑色が F I TCの蛍光である。トランスフエクシヨンした COS 7細胞で蛍光が強く見られ、 E—セレクチンが強く発現していることがわかる。図 16は、 E—セレクチンを強制的に発現させた細胞への S LX修飾リポソ一ムの取り込みを示す図である。左欄は、 S LX修飾リボソームを投与した細胞を示す。右欄は、ェチジゥムブ口マイドを単独で投与した細胞を示す。上段は、明視野で細胞を観察した写真で（400倍率）ある。下段は、ェチジゥムブ口マイドの染色体へのインター力レーションについて、 330〜385 nmの励起光をあて、 420 nmの蛍光を観察した写真（400倍率）である。 SLX修飾リポソームを投与した細胞では核が染色されていることが確認でき、内包しているェチジゥムブロマイドが核まで到達し、染色体とインター力レーシヨンしていることが観察された。この結果より、内包物であるェチジゥムブロマイドがリポソ一ムより解離し、化合物単体で機能していることがわかる。青色は、ェチジゥムブ口マイドと染色体とのインターカレーシヨンによる蛍光である。

図 1 7上段は、糖鎖で修飾していない空のリボソームの粒子径分布（強度によるサイズ分布）の一例を示す。図 1 7下段は、 S LXで修飾した空のリボソーム粒子径分布の一例を示す。 X軸は、リボソームのサイズ（d. nm) を示し、 Y 軸は、強度（％) を示す。

図 18は、図 12に提示した顆粒球の浸潤抑制効果について、染色標本の 1切片あたりの虚血側大脳半球実質内に浸潤した顆粒球数を目視にて計測し、ダラフ化したものである。 SLXリボソーム群で有意に実質内浸潤顆粒球数が減少した。 X軸の左側は、 S L X修飾リボソームを投与したラット（n = 5 ) 群であり、右側は、コントロールとして用いた結合糖鎖のないリボソームを投与したラット ( n = 5 ) 群である。縦軸は、 1切片あたりの顆粒球数を示す。配列表フリーテキスト

配列番号 1 ：ヒト E—セレクチンの c D N Aの部分配列である。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「a」、「a n j 、「t h e」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当上記分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。

以下に本明細書において特に使用される用語の定義を適宜説明する。

本明細書において「虚血」とは、当該分野において通常用いられるものと同様の意味で使用され、主に動脈の狭窄または中断による、血液供給の器質的障害により引き起こされる局所性貧血をいう。虚血としては、例えば、中枢神経系虚血 (例えば、脳虚血、脊髄虚血）などが挙げられる。

本明細書において「中枢神経系の虚血」とは、中枢神経系への血液供給が低下または遮断されることにより引き起こされる局所性貧血をいう。

本明細書において「中枢神経系の虚血性疾患」とは、虚血を伴って生じる任意の中枢神経系の疾患をいう。虚血性中枢神経系疾患としては、脳梗塞、一過性脳虚血発作、脊髄梗塞などが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において「中枢神経系の虚血性障害」とは、虚血によって中枢神経系に生じた障害をいう。虚血性中枢神経系障害としては、意識障害、運動性障害、言語障害、感覚障害、失調、記憶障害、嚥下障害、視野障害などが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において「中枢神経系の虚血状態」とは、中枢神経系に虚血が起こつている状態をいう。中枢神経系虚血状態としては、一過性脳虚血発作において観察される虚血状態、脳梗塞、脊髄梗塞などが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において「脳虚血」とは、脳への血液供給が低下または遮断されることにより引き起こされる局所性貧血をいう。

本明細書において「虚血性脳疾患」とは、虚血を伴って生じる任意の脳疾患をレ、う。虚血性脳疾患としては、脳梗塞、一過性脳虚血発作が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において「虚血性脳障害」とは、虚血によって脳に生じた障害をいう。虚血性脳障害としては、一過性脳虚血発作、運動性障害、言語障害、感覚障害、失調、記憶障害が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において「脳虚血状態」とは、脳に虚血が起こっている状態をいう。脳虚血状態としては、一過性脳虚血発作において観察される虚血状態、脳梗塞が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において「中枢神経系」とは、当該分野において慣用される最も広義の意味と同様に用いられ、神経系の中で、全神経の統合、支配などの中枢的役割を果たす部分をいい、脳および脊髄をいう。

本明細書において「脳」とは、当該分野において慣用される最も広義の意味と同様に用いられ、神経細胞が集合し、神経活動の中枢をなす部分をいう。脳は、脳脊髄のうち頭蓋の中にある部分であり、脊髄の前方に連なり、前脳、中脳、菱脳に区分され、終脳（大脳）、間脳、中脳、小脳、橋、延髄に分化している。中枢神経系の虚血性疾患を「予防」するとは、中枢神経系の虚血性疾患が発生する前に、何らかの手段により、その虚血性疾患を生じさせないかまたは少なくとも遅延させることをいう。

中枢神経系の虚血性疾患を「処置」するとは、中枢神経系の虚血性疾患がいつたん生じた後に、何らかの手段により、その疾患状態を処置し、治癒、改善、悪化防止などをさせることをいう。

中枢神経系の虚血性障害を「予防」するとは、中枢神経系の虚血性障害が発生する前に、何らかの手段により、その虚血性障害を生じさせないかまたは少なくとも遅延させること、あるいは虚血自体が生じたとしてもそれが原因の障害が生じないような状態にすることをいう。

中枢神経系の虚血性障害を「処置」するとは、中枢神経系の虚血性障害がいつたん生じた後に、何らかの手段により、その障害を処置し、治癒、改善、悪化防止などをさせることをいう。

中枢神経系の虚血状態を「予防」するとは、中枢神経系に虚血が発生する条件になる前に、何らかの手段を講じることによって、仮にそのような条件が生じたとしても中枢神経系の虚血状態にならないようにするかまたは少なくとも遅延させることをいう。

中枢神経系の虚血状態を「処置」するとは、中枢神経系に虚血が起こっている状態を処置し、治癒、改善、悪化防止などをさせることをいう。

虚血性脳疾患を「予防」するとは、虚血性脳疾患が発生する前に、何らかの手段により、その虚血性脳疾患を生じさせないかまたは少なくとも遅延させることをレヽラ。

虚血性脳疾患を「処置」するとは、虚血性脳疾患がいったん生じた後に、何らかの手段により、その疾患状態を処置し、治癒、改善、悪化防止などをさせることをいう。

虚血性脳障害を「予防」するとは、虚血性脳障害が発生する前に、何らかの手段により、その虚血性脳障害を生じさせないかまたは少なくとも遅延させること、あるいは虚血自体が生じたとしてもそれが原因の障害が生じないような状態にすることをいう。

虚血性脳障害を「処置」するとは、虚血性脳障害がいったん生じた後に、何らかの手段により、その障害を処置し、治癒、改善、悪化防止などをさせることをいう。

脳虚血状態を「予防」するとは、脳に虚血が発生する条件になる前に、何らかの手段を講じることによって、仮にそのような条件が生じたとしても脳虚血状態にならないようにするかまたは少なくとも遅延させることをいう。

脳虚血状態を「処置」するとは、脳に虚血が起こっている状態を処置し、治癒、改善、悪化防止などをさせることをいう。

本明細書において「運動性障害」とは、筋肉の随意運動力が喪失した状態をいう。運動性障害としては、歩行障害、姿勢保持障害、麻痺、筋力低下、巧緻運動障害などが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において「歩行障害」とは、歩行をする能力が喪失した状態をいう。本明細書において「姿勢保持障害」とは、姿勢を保持する能力が喪失した状態をレヽう。

本明細書において「糖鎖」とは、単位糖（単糖および/またはその誘導体）が

1つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が 2つ以上連なる場合は、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、 N—ァセチノレグノレコサミン、 N—ァセチルガラクトサミン、シアル酸ならびにそれらの複合体および誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオダリカン、グリコサミノダリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。したがって、本明細書では、糖鎖は、「多糖（ポリサッカリド）」、「糖質」、「炭水化物」と互換可能に使用され得る。また、特に言及しない場合、本明細書において「糖鎖」は、糖鎖および糖鎖含有物質の両方を包含することがある。代表的には、約 2 0種類の単糖（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、 N—ァセチノレグノレコサミン、 N 一ァセチルガラタトサミン、シアル酸ならびにそれらの複合体および誘導体など）が鎖状につながった物質で、生体の細胞内外のタンパク質または脂質に付いている。単糖の配列によって機能が異なり、通常は複雑に枝分かれしていて、人体には数百種類以上の多様な構造の糖鎖があると予想されており、さらに、人体において有用な構造は数万種類以上あると考えられている。細胞間での分子 ·細胞認識機能などタンパク質や脂質が生体内で果たす高次機能に関係していると見られているが、そのメカニズムは未解明の部分が多い。核酸、タンパク質に次ぐ第 3の生命鎖として現在のライフサイエンスで注目されている。とりわけ、細胞認識におけるリガンド（情報分子）としての糖鎖の機能が期待され、その高機能材料開発への応用が研究されている。

本明細書において「糖鎖基」とは、糖鎖が別の基と結合したときに付される名称である。糖鎖基は場合に応じて一価または二価のものを指す。例えば、糖鎖基としては、シァリルルイス X基、 N—ァセチルラクトサミン基、 a l _ 6マンノビオース基が挙げられる。

本明細書において「糖」または「単糖」とは、少なくとも 1つの水酸基および少なくとも 1つのアルデヒド基またはケトン基を含む、ポリヒドロキシアルデヒドまたはポリヒドロキシケトンをいい、糖鎖の基本単位を構成する。本明細書において、糖はまた、炭水化物ともいい、両者は互換的に用いられる。本明細書において、特に言及するときは、糖鎖は、 1つ以上糖が連なった鎖または配列をいレ、、糖または単糖とレ、うときは、糖鎖を構成する 1つの単位をいう。ここで、 η = 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9および 1 0であるものを、それぞれジオース、トリオース、テトロース、ペントース、へキソース、ヘプトース、オタトース、ノノースおよびデコースという。一般に鎖式多価アルコールのアルデヒドまたはケトンに相当するもので、前者をアルドース，後者をケトースという。本発明では、いずれの形式のものでも使用され得る。

本発明において糖を記載するために使用する命名法および略称は、通常の命名法に従う。

例えば、 j3— D—ガラクトース

β-O -Galactose

は、 G a l

N—ァセチルー α— D—ガラクトサ

は、 G a l N A c ； α— D マンノース a-D-Mannose

は、 Ma n ；

β D グノレコ β-D-Glucose

は、 G 1 c ；

N_ァセチルー β—D ダルコサミン

N-Acetyl-p-D-qlucosamme

は、 G 1 c NA c ； α—L—フコース α-L-Fucose

は、 ί¹ u c

α— N—ァセチルノイラミン酸 -Ν-Acetyl neuraminic acid

は、 N e u 5 A cにより表す。環状の 2つのァノマーは、 αおよび ]3により表す。表示上の理由により、 aまたは bと表すことがある。従って、本明細書において、 αと a、と bは、ァノマー表記については交換可能に使用される。

本明細書において、ガラクトースとは、任意の異性体を指すが、代表的には i3 一 D—ガラクトースであり、特に言及しないときには、 i3— D—ガラクトースを指すものとして使用される。

本明細書において、ァセチルガラタトサミンとは、任意の異性体を指すが、代表的には N—ァセチルー α— D—ガラクトサミンであり、特に言及しないときには、 Ν—ァセチルー α—D—ガラクトサミンを指すものとして使用される。

本明細書において、マンノースとは、任意の異性体を指すが、代表的には α— D—マンノースであり、特に言及しないときには、 α— D—マンノースを指すものとして使用される。

本明細書において、グルコースとは、任意の異性体を指すが、代表的には] 3 _ D—グルコースであり、特に言及しないときには、）3—D—グルコースを指すものとして使用される。

本明細書において、ァセチルダルコサミンとは、任意の異性体を指すが、代表的には N—ァセチルー 3— D—ダルコサミンであり、特に言及しないときには、 N—ァセチル一 β _ D—ダルコサミンを指すものとして使用される。

本明細書において、フコースとは、任意の異性体を指すが、代表的には α— L ーフコースであり、特に言及しないときには、 α— L—フコースを指すものとして使用される。

本明細書において、ァセチルノイラミン酸とは、任意の異性体を指すが、代表的には c — N—ァセチルノイラミン酸であり、特に言及しないときには α _ Ν _ ァセチルノイラミン酸を指すものとして使用される。

本明細書において、糖の表示記号、呼称、略称（G 1 cなど）などは、単糖を表すときと、糖鎖中で使用されるときとは、異なることに留意する。糖鎖中、単位糖は、結合先の別の単位糖との間に脱水縮合があるので、相方から水素または水酸基を除いた形で存在することになる。従って、これらの糖の略号は、単糖を表すときに使用されるときは、すべての水酸基が存在するが、糖鎖中で使用されるときは、水酸基が結合先の糖の水酸基と脱水縮合されて酸素のみが残存した状態を示していることが理解される。

糖が、アルブミンと共有結合されるときには、糖の還元末端がァミノ化され、そのアミン基を介してアルブミンなどの他の成分に結合することができるが、その場合は還元末端の水酸基がァミン基に置換されたものを指すことに留意する。単糖は一般に、グリコシド結合により結合されて二糖および多糖を形成する。環の平面に関する結合の向きは、 αおよび i3により示す。 2つの炭素の間の結合を形成する特定の炭素原子も記載する。

本明細書において糖鎖は、

により表される。従って、例えば、ガラクトースの C— 1とグルコースの C一 4 との間の i3グリコシド結合は、 Ga 1 3 1， 4G 1 cにより表される。従って、例えば、シァリルルイス X (S LX) は、 Ne u 5Ac a 2， 3 G a 1 i3 1 , 4

(F u c α 1 , 3) G l cNAcと表される。 N—ァセチルラクトサミン（G 4 GN) は、 Ga l ]3 1， 4G l c NAcと表される。 α ΐ— 6マンノビオース

(Α 6) は、 Ma η α 1， 6Ma nと表される。

糖鎖の分岐は、括弧により表し、結合する単位糖のすぐ左に配置して表記する。例えば、単糖ァノマ一結合様式 ( )単糖と表され、括弧の中は、単糖ァノマ一 ί*α 様と表記される。従って、例えば、ガラクトースの C— 1とグルコースの C一 4との間が ]3グリコシド結合し、さらにこのグルコースの C— 3がフコースの C— 1 と αグリコシド結合している場合、 Ga l ]3 1， 4 (F u c α 1 , 3) G l cと表される。単糖は、（潜在）カルボニル原子団になるだけ小さい番号を付けることを基本にして表される。有機化学命名法の一般基準では（潜在）カルボニル原子団より優位な原子団が分子中に導入されたときでも、通常上記の番号付けで表される。

本明細書において使用される糖鎖としては、例えば、シァリルルイス X、 N— ァセチルラクトサミン、 α 1— 6マンノビオースならびにそれらの 2つ以上の組み合わせからなる群より選択される糖鎖が挙げられるが、これらに限定されなレ、。 2つ以上の組み合わせが使用可能な理由としては、理論に束縛されないが、上記糖鎖の各々が目的の送達部位の組織または細胞に局在するレクチンに対して特異性を有しており、混在してもその特異性を発揮すると考えられるからである。

(リボソーム）

本明細書において「リボソーム」とは、通常、膜状に集合した脂質層および内部の水層から構成される閉鎖小胞を意味する。代表的に使用されるリン脂質のほか、コレステロール、糖脂質などを組み込ませることも可能である。リボソームは内部に水を含んだ閉鎖小胞であるため、水溶性の薬剤などを小胞內に保持させることも可能である。したがって、このようなリボソームによって、細胞膜を通過しえない薬物または遺伝子などを細胞内に送達するのに使われる。また、生体適合性も良いので DD S用のナノ粒子性キヤリァ材料としての期待が大きい。本発明において、リボソームは、修飾基を付するために、エステル結合を付与する官能基を有する構成単位（例えば、糖脂質、ガンダリオシド、ホスファチジルグリセロールなど）またはペプチド結合を付与する官能基を有する構成単位（例えば、ホスファチジルエタノールァミン）を有し得る。

リポソームの調製は、当該分野において公知の任意の手法により製造することができる。例えば、その中でもコール酸透析法による方法が挙げられる。コール酸透析法では、 a) 脂質と界面活性剤の混合ミセルの調製、および b) 混合ミセルの透析により製造を実施する。次に本発明において使用される糖鎖リボソームにおいて好ましい実施形態では、リンカ一としてタンパク質を使用することが好ましく、タンパク質に糖鎖が結合した糖タンパク質のリボソームへのカツプリングは、以下の 2段階反応によって行うことができる。 a) リボソーム膜上のガンダリオシド部分の過ヨウ素酸酸化、および b) 還元的ァミノ化反応による酸ィ匕リポソームへの糖タンパク質の力ップリングである。このような手法によって望ましい糖鎖を含む糖タンパク質をリボソームに結合することができ、所望の糖鎖を有する多種多様な糖タンパク質 · リボソームコンジュゲートを得ることができる。リポソームの純度や安定性を見るために粒子径サイズ分布を調べることが非常に重要である。その方法として、ゲル濾過クロマト法（GPC) 、走査型電顕（S EM) 、動的光散乱法（DLS) などを使うことができる。例えば、ジパルミトイノレホスファチジコリン、コレステロ一ノレ、ガンダリオシド、ジセチ ^ホスフエート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミンおよびコール酸ナトリゥムが、 35 : 40 : 1 5 : 5 : 5 : 167のタイプのリボソームが実施例で記載されているが、この知見をもとに、当業者は種々の組成を有するリボソームを作製することができる。本明細書において「脂質」とは、長鎖の脂肪族炭化水素またはその誘導体をいう。「脂質」は、例えば、脂肪酸、アルコール、ァミン、ァミノアルコール、ァルデヒドなどからなる化合物の総称である。

本明細書において「単純脂質」とは、脂肪酸と各種アルコールとのエステルであり、「中性脂質」とも称される。単純脂質としては、例えば、トリァシルダリセロール、ステロールエステル、ビタミンの脂肪酸エステル等が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において「複合脂質」とは、脂肪酸とアルコールのほかに、リン酸、糖、硫酸、ァミンなど極性基をもつものをいう。複合脂質としては、例えば、グリセ口リン脂質、スフインゴリン脂質、 C一 P結合をもつ脂質、硫脂質などが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において「誘導脂質」とは、単純脂質および複合脂質の加水分解によつて生成する化合物のうち、脂溶性のものをいう。誘導脂質としては、例えば、脂肪酸、高級アルコール、脂溶性ビタミン、ステロイド等が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において「極性脂質」とは、一端に極性基、他端に疎水基を有する分子で、両親媒性をもつ脂質をいう。極性脂質は、水溶液中でミセルを形成する特徴がある。例えば、極性脂質としては、膜物質、界面活性剤などが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において「非極性脂質」とは、極性を有さない脂質をいう。

本発明において使用されるリボソームを構成する脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類、糖脂質類（ガンダリオシド類など）、ホスファチジルグリセロール類、スフインゴミエリン類、コレステロール類等が挙げられる。ホスファチジルコリン類としては、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等が挙げられる。

ホスファチジルエタノールァミン類としては、ジミリストイルホスファチジルエタノールァミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールァミン等が挙げられる。

ホスファチジン酸類としては、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトィルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸が挙げられる。長鎖ァノレキルリン酸塩類としてはジセチルホスフエ一ト等が挙げられる。

糖脂質類としては、ガラクトシルセラミド、ダルコシルセラミド、ラタトシルセラミド、ホスフナチド、グロボシド、ガンダリオシド類等が挙げられる。ガングリオシド類としては、ガングリオシド GM3 (4 (N e u Αα 2, 3) G a l β 1， 4 G 1 c β 1, 1， C e r) 、ガングリオシド GM1 (G a 1 ]3 1 , 3 G a 1 NA c β 1, 4 (N e u Αα 2, 3) G a 1 j3 1 , 4 G 1 c β 1, 1 ' C e r ) 、ガングリオシド GD 1 a (N e u Αα 2, 3 G a 1 3 1 , 3G a 1 NA c β 1 , 4 (Ne u Αα 2, 3) G a 1 i3 1 , 4 G 1 c ]3 1 , 1 ' C e r) , ガングリオシド GT l b (N e u A α 2 , 3 G a 1 β 1 , 3 G a 1 NA c β 1 , 4

(N e u A a 2 , 8 N e u A a 2 , 3) G a l j3 1， 4 G 1 c i3 1 , 1， C e r ) 等が挙げられる。

ホスファチジルグリセロール類としては、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパノレミトイノレホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール等が好ましい。

このうち、ホスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類、糖脂質類、およびコレステロール類はリボソームの安定性を上昇させる効果を有するので、構成脂質として添加するのが望ましい。本発明においてリポソームを構成する脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン類（モル比 0〜70%) ；ホスファチジルエタノールアミン類（モル比 0〜30%) ；ホスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩の 1種以上の脂質（モル比 0〜30%) ；糖脂質類、ホスファチジルグリセロール類、スフインゴミエリン類の 1種以上の脂質（モル比 0〜4 0 %) ；コレステロール類（モル比 0〜7 0 %) を含むものが挙げられる。ガングリオシド、糖脂質またはホスファチジルグリセロールを含むことが好ましい。なぜなら、アルブミンのようなリンカ一の結合が容易になるからである。

好ましい実施形態において、リボソームは、ガンダリオシド、糖脂質またはホスファチジルグリセロールを含ませてそれにべプチドなどのリンカーを結合させ、糖鎖を結合させることが可能である。

リボソームを作製するときにガンダリオシド、糖脂質またはホスファチジルグリセロールを合わせることによって、この糖脂質中に含まれる糖鎖を構成成分として含む、本発明において使用される糖鎖修飾リボソームを作製することができる。

別の好ましい実施形態では、本発明におけるリボソームは、ホスファチジルェタノールァミンを含むことが好ましい。ホスファチジルェタノールァミンを含むことによって、親水性付与基（トリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカンなど）との結合が容易になるからである。

(糖鎖修飾リボソーム）

本明細書において「糖鎖修飾リボソーム」とは、糖鎖とリボソームとを含む物質をいい、好ましくは、糖鎖が直接または間接的に結合することによって修飾されたリボソームをいう。本明細書において「S L X修飾リボソーム」とは、 S L Xで修飾されたリボソームをいう。糖鎖がリボソームに結合した形態を具体的に表すと、

構造 I X— R ¹— R ²— R ³

X ：前記リボソームに含まれる前記リンカータンパク質と C H ₂— N H結合可能な官能基 aを含む構成単位から、該官能基 aがとれた基

R ¹ ：リンカータンパク質基 R²：リンカータンパク質架橋基

R³：糖鎖

であり、 Xと R¹とは CH₂— NH結合し、 R¹と R²とはペプチド結合し、 R²と R³とはぺプチド結合している。

従って、より詳細には、構造 Iは、

X— CH₂— NH— R¹— NH— C (=0) — R²— C (=0) NH— R³ という構造式で表すことができる。

本発明において使用される糖鎖修飾リボソームは、以下の構造によ,り親水性化されている：

構造 I I Y— R⁴— R⁵

Y ：前記リボソームに含まれる親水性化合物架橋基とペプチド結合可能な官能基 bを含む構成単位から該官能基 bがとれた基

R⁴：親水性化合物架橋基

R⁵：親水性化合物基

Yと R⁴はペプチド結合し、 R⁴と R⁵はペプチド結合している。

従って、より詳細には、構造 I Iは、

Y-NH-C (=0) — R⁴— C (=0) -NH-R⁵

という構造式で表すことができる。

糖鎖修飾リボソームは、上述の構造 Iおよび構造 I Iを有し得し、必要に応じて、常磁性または蛍光性を付与され得る。

本発明において使用される糖鎖修飾リボソームでは、常磁性は、糖鎖修飾リポソームの構成要素の少なくとも 1つが常磁性を有すること、または糖鎖修飾リポソームが新たに常磁性を有する要素をさらに有することによって付与される。常磁性を有する要素としては、例えば、常磁性の金属（例えば、ガドリニウム、鉄など）、造影剤（例えば、酸化鉄粒子、ガドリニウムキレート剤、硫酸バリゥム、水溶性ョードなど）によって付与され得るが、これらに限定されない。なぜなら、磁気共鳴画像法において組成物を検出可能な状態にし得るものでありさえすればよいからである。

本発明において使用される糖鎖修飾リボソームでは、蛍光性は、糖鎖修飾リポソームの構成要素の少なくとも 1つが蛍光性を有すること、または糖鎖修飾リポソームが新たに蛍光性を有する要素をさらに有することによって付与される。蛍光性を有する要素としては、例えば、蛍光色素、蛍光タンパク質（例えば、

GFP、 CFP、 YFPなど）、発光酵素（例えば、ルシフェラーゼなど）が挙げられるが、これらに限定されない。蛍光色素としては、例えば、 c y 5. 5 (例えば、

<Cy5.5>

<cy3>

c y 5、 c y 7、 c y 3 B、 c y 3. 5、 A l e x a F l u o r (登録商標） 3 5 0 _N A 1 e x a F l u o r (登録商標） 488、 A l e x a F l u o r

(登録商標） 532、 A l e x a F l u o r (登録商標） 546、 A 1 e x a F l u o r (登録商標） 5 5 5、 A l e x a F l u o r (登録商標） 56 8、 A 1 e x a F l u o r (登録商標） 5 94、 A l e x a F l u o r (登録商標） 6 3 3、 A l e x a F l u o r (登録商標） 64 7、 A l e x a F l u o r (登録商標） 680、 A l e x a F l u o r (登録商標） 700、 A l e x a F l u o r (登録商標） 7 50、フルォレセイン一 4 ^ f ソチオシァネート（F I TC) 、ユウ口ピウム含有標識、それらの組み合わせのような蛍光色素によって付与され得る。

本明細書において「修飾結合密度」とは、糖鎖修飾リボソームを作製する際に使用される糖鎖の量であり、リポソームの脂質 1 m gあたりに結合した糖鎖の密度（mg糖鎖 Zmg脂質）として表される。糖鎖修飾リボソームの修飾結合密度は、経験的に、リボソームに結合した糖鎖の密度にほぼ比例していることから、当業者は調製するときに使用した糖鎖の量をもって、修飾結合密度を表現することができることを理解する。従って、本明細書では、特に言及しない限り、調製時に使用した量によって修飾結合密度が確定される。インビト口において、例えば、 E—セレクチンを用いて間接的に決定することができる。本発明において使用される糖鎖修飾リボソームは、リポソームに結合される糖鎖の種類と修飾結合密度を選択することにより、目的の送達部位に対する指向性を制御することができる。以下、表 1にリボソーム番号、糖鎖の構造、および修飾結合密度を示す。

(表 1 )

上記の表に記載されるような糖鎖修飾リボソームは、以下の方法によって製造され得る。具体的には、この方法は、（a) 脂質を、メタノールノクロロホルム溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程；（b) 該脂質膜を、懸濁緩衝液に懸濁し、超音波処理してリボソームを提供する工程；（c) 該リボソームをトリス（ヒドロキシァルキル）アミノアルカンにより親水性化処理する工程；（d) 該親水性化処理されたリボソームにリンカ一タンパク質を結合させて、リンカータンパク質結合リポソームを生成する工程；および（e) 該リボソームに、上記表に記載される糖鎖を結合させて糖鎖修飾リボソームを生成する工程を包含する。該（b) において、超音波処理した溶液と蛍光標識溶液とを混合することにより、リボソームに蛍光性を付与することができる。

好ましくは、この蛍光標識溶液は、 1， 1，一ビス（ε—カルボキシペンチル）一 3， 3, 3，， 3 ' —テトラメチルインドカルボシァニン一 5， 5' —ジスルホネートカリウム塩，ジ一 Ν—ヒドロキシスクシンイミドエステル（c y 5. 5) 、 1— ( E—カルボキシペンチル） — 1 ' 一ェチル—3， 3， 3，， 3， — テトラメチルインドカルボシァニン一 5， 5 ' —ジスルホネートカリウム塩一 N ーヒドロキシスクシンイミドエステル（c y 3) を含み得る。

好ましい実施形態において、本発明の S LX修飾リボソームの製造では、工程 (d) のリンカ一タンパク質は、ヒト血清アルブミンであり、工程（e) において、糖鎖は SLXであり、該 S LXとリボソームを、虚血の処置または診断に適切な条件で結合させて S LX修飾リボソームを生成する。

リボソームとリンカ一、リンカ一と糖鎖とは、二官能性架橋基（例えば、 3, 3，一ジチォビス（スルホスクシ二ミジルプロピオネート）（DTS S P) ) などを利用して結合されることが好ましい。

本明細書において「リンカ一」とは、糖鎖とリボソーム表面との結合を介在する分子である。本発明において使用される糖鎖修飾リボソームにおいて、糖鎖はリンカ一を介してリボソーム表面に結合してもよい。リンカ一は、当業者が適宜選択することができるが、生体適合性であるものが好ましく、より好ましくは、薬学的に受容可能である。本明細書において「リンカ一タンパク質」とは、リンカー分子のうち、タンパク質、ペプチド、アミノ酸のポリマーをいう。本明細書において使用されるリンカ一タンパク質としては、例えば、生体由来タンパク質、好ましくは、ヒト由来タンパク質、より好ましくは、ヒト由来血清タンパク質、さらにより好ましくは、血清アルブミンであり得る。特に、ヒト血清アルブミンを使用する場合は、各組織に対する取り込みが多いことがマウスについての実験により確かめられている。

本明細書において「リンカ一（タンパク質）基」とは、リンカ一（タンパク質）が別の基と結合したときに付される名称である。リンカ一（タンパク質）基は場合に応じて一価または二価のものを指す。例えば、哺乳動物由来タンパク質基、ヒト由来タンパク質基、ヒト血清タンパク質基、血清アルブミン基が挙げられる。リンカ一（タンパク質）基は「ヒト」由来が好ましい。ヒト投与において適合性が高いと考えられるからである。また、免疫原性がないタンパク質が好ましい。

本明細書において「架橋基」とは、橋をかけるように，鎖式高分子の分子間で化学結合を形成させる基をいう。代表的には、脂質、タンパク質、ペプチド、糖鎖などの高分子と他の分子（例えば、脂質、タンパク質、ペプチド、糖鎖）との間に作用し、分子内または分子間で、共有結合のなかったところを結ぶ共有結合を形成させる基をいう。本明細書において架橋基は、架橋を目的とする標的によつて変動し、例えば、アルデヒド類（例えば、ダルタルアルデヒド）、カルボジイミド類、イミドエステル類など挙げることができるがそれらに限定されない。アミノ基含有物質を架橋する場合、アルデヒド含有基、例えば、ダルタルアルデヒドを用いることができる。本明細書において「リンカ一タンパク質架橋基」とは、リボソームと糖鎖との間にペプチド結合を形成させる基をいう。リンカ一タンパク質架橋基は、架橋を目的とする標的によって変動し、例えば、ビススルホスクシンイミジルスべラート、ジスクシンイミジルグルタレート、ジチォビススクシンイミジルプ口ビオネート、ジスクシンイミジルスべラート、 3， 3，一ジチオピス（スルホスクシンイミジノレプロピオネート）、エチレングリコー^/ビススクシンイミジノレスクシネ一ト、エチレングリコールビススルホスクシンィミジルスクシネート等の 2価試薬などを使用することができる。本明細書において使用されるリンカータンパク質架橋基としては、例えば、 3， 3，一ジチォビス（スルホスクシンィミジルプ口ピオネート）基、ビススルホスクシンイミジルスべレート基、ジスクシンイミジルグルタレート基、ジチォビススクシンイミジルプロピオネート基、ジスクシンィミジノレスべレート基、エチレングリコーノレビススクシンィミジノレスクシネート基およびエチレンダリコールビススルホスクシンィミジルスクシネート基などが挙げられ得るが、これらに限定されない。なぜなら、両端にァミノ基と反応する反応基を持つ架橋剤でありさえすれば、リボソームと糖鎖との間にペプチド結合を形成させることが可能であるからである。従って、他の代替可能な例としては、ビス（スルホスクシンィミジル）グルテート一 d。基、ビス（スルホスクシンィミジル） 2， 2 , 4， 4一グルタレート一 d ₄基、ビス（スルホスクシンィミジノレ）スべレート基、ビス（スルホスクシンィミジル）スべレート一 d。基、ビス（スルホスクシンィミジル） 2， 2 , 7， 7—スべレート一 d ₄基、ビス

( 2— [スクシンイミドキシカノレポニノレオキシ] ェチル）スノレホン基、ジスクシンィミジルグルタレート、ジォチオピス（スクシンィミジルプロピオネート）基、ジスクシンィミジルタータレート基、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）基、スルホジスクシンィミジルタータレート基、エチレングリコーノレビス（スホースクシンイミジスクシネート）基、トリスー（スクシンィミジルァミノトリステート）基等が挙げられる。本明細書において「生体適合性」とは、毒性、免疫反応、損傷などを生じることなく生体組織または臓器と適合する性質をいう。生体適合性緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS) 、生理食塩水、トリス緩衝液、炭酸緩衝液（CBS) 、トリス（ヒドロキシメチル）メチルァミノプロパンスルホン酸緩衝液（TAPS) 、 2 - [4— (2—ヒドロキシルェチル） — 1—ピペラジニル] エタンスルホン酸（HEPES) 、その他のダット緩衝液（例えば、 2— モルホリノエタンスルホン酸，モノヒドレート（MES) 、ビス（2—ヒドロキシェチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（B i s— t r i s) 、 N ― (2—ァセトアミド）イミノニ酢酸（ADA) 、 1， 3—ビス [トリス（ヒド口キシメチル）メチルァミノ] プロパン（B i s— t r i sプロパン）、ピペラジン一 1， 4—ビス（2—エタンスルホン酸） (P I PES) 、 N— (2—ァセトアミド）一 2—アミノエタンスルホン酸（ACES) 、コラミンクロリド、 N_: N—ビス（2—ヒドロキシェチル）一 2—アミノエタンスルホン酸（BES) 、 3—モルホリノプロパンスルホン酸（MOP S) 、 N—トリス（ヒドロキシメチル）メチルー 2—アミノエタンスルホン酸（TES) 、 N— (2—ヒドロキシェチル）ピぺラジン一 N' — 3—プロパンスルホン酸（HEPPS) 、 N— [トリス（ヒドロキシメチル）メチル] グリシン（T r i c i n e) 、アミノアセトァミド（グリシンアミド）、 N， N—ビス（2—ヒドロキシェチル）グリシン（B i c i n e) 、 N—シクロへキシル一 2—アミノエタンスルホン酸（CHES) および N—シクロへキシル一 3—ァミノプロパンスルホン酸（CAPS) ) などが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリべプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、ァセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の 1または 2以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ぺプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。本明細書では、特に言及するときは、「タンパク質」は、比較的大きな分子量を有するアミノ酸のポリマーまたはその改変体を指し、「ペプチド」というときは、比較的小さな分子量を有するアミノ酸のポリマーまたはその改変体を指すことがあることが理解されるべきである。そのような分子量としては、例えば、約 3 0 k D a、好ましくは約 2 0 k D a、より好ましくは約 1 0 k D aなどを挙げることができるがそれらに限定されない。

本明細書において「生体由来タンパク質」とは、生物に由来するタンパク質をいい、どの生物（例えば、任意の種類の多細胞生物（例えば、動物（例えば、脊椎動物、無脊椎動物）、植物（例えば、単子葉植物、双子葉植物など）など））由来のタンパク質でもよい。好ましくは、脊椎動物（例えば、メクラウナギ類、ャッメゥナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）由来のタンパク質、より好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ゥサギ目など）由来のタンパク質が用いられる。さらに好ましくは、霊長類（例えば、チンパンジー、二ホンザル、ヒト）由来のタンパク質が用いられる。最も好ましくは投与を目的とする生体由来のタンパク質が用いられる。本明細書において、生体由来タンパク質が別の物質と結合した状態を示す場合、生体由来タンパク質基と称される。本明細書において「ヒト由来血清タンパク質」とは、ヒトの血液が自然に凝固したときに残る液体部分に含まれるタンパク質をいう。本明細書において、ヒト由来タンパク質が別の物質と結合した状態を示す場合、ヒト由来タンパク質基と称される。

本明細書において「血清アルブミン」とは、血清中に含まれるアルブミンをいう。本明細書において、血清アルブミンが別の物質と結合した状態を示す場合、血清アルブミン基と称される。

本明細書で使用される糖鎖修飾リボソームは、リボソーム膜またはリンカ一の少なくとも一方が親水性化合物、好ましくは、トリス（ヒドロキシアルキル）ァミノアルカンを結合させることにより親水性化されていてもよい。

本明細書において「親水性化」とは、リボソーム表面に親水性化合物を結合させることをいう。親水性化に用いる化合物としては、低分子の親水性化合物、好ましくは少なくとも 1つの O H基を有する低分子の親水性化合物、さらに好ましくは、少なくとも 2つの O H基を有する低分子の親水性化合物が挙げられる。また、さらに少なくとも 1つのアミノ基を有する低分子の親水性化合物、すなわち分子中に少なくとも 1つの O H基と少なくとも 1つのアミノ基を有する親水性化合物が挙げられる。親水性化合物は、低分子なので、糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチンによる糖鎖分子認識反応の進行を妨げることはない。また、親水性化合物には、本発明において使用される糖鎖修飾リポソ一ムにおいて、レクチン等の特定の標的を指向するために用いられるレクチンが結合し得る糖鎖は含まれない。このような親水性化合物として、例えば、トリス (ヒドロキシメチル）ァミノメタンなどを含むトリス（ヒドロキシアルキル）ァミノアルカン等のァミノアルコール類等が挙げられ、さらに具体的には、トリス (ヒドロキシメチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシェチル）アミノエタントリス（ヒドロキシプロピル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシェチル）ァミノメタン、トリス（ヒドロキシプロピル）ァミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）ァミノプロパン、トリス（ヒドロキシェチル）ァミノプロパン、トリス（ヒドロキシプロピル）ァミノプロパン等が挙げられる。

本明細書において「親水性化されたリボソーム」とは、リボソーム表面に親水性化合物を結合させることにより親水性化された状態のリボソームをいう。

親水性化されたリボソームと親水性化されていないリボソームとでは、溶液中での安定性が異なる。親水性化されていないリボソームは、安定性が悪く、沈殿を起こしたり、リボソーム同士が凝集することがある。一方、リボソームは、親水性化されることにより、安定性が改善され、沈殿を起こすこともなく、リポソーム同士が凝集することもない。

本明細書において「アルキル」とは、メタン、ェタン、プロパンのような脂肪族炭化水素（本明細書において「アルカン」という）から水素原子が一つ失われて生ずる 1価の基をいい、一般に C_nH_{2n + 1}—で表される（ここで、 nは正の整数である）。アルキルは、直鎖または分枝鎖であり得る。本明細書において「置換されたアルキル」とは、以下に規定する置換基によってアルキルの Hが置換されたアルキルをいう。これらの具体例は、 C 1〜C 2ァノレキノレ、 C 1〜C3ァノレキル、 C 1〜C4アルキル、 C 1〜C 5アルキル、 C 1〜C6アルキノレ、 C l〜 C 7アルキル、 C 1〜C8ァノレキノレ、 C 1〜C9ァノレキノレ、 C 1〜C 10ァノレキノレ、 C 1〜C 1 1アルキルまたは C 1〜C 1 2アルキル、 C 1〜C2置換されたアルキル、 C 1〜C 3置換されたアルキル、 C 1〜C 4置換されたアルキル、 C 1〜C 5置換されたアルキル、 C 1〜C 6置換されたアルキル、 C 1〜C 7置換されたアルキル、 C 1〜C 8置換されたアルキル、 C 1〜C 9置換されたアルキノレ、 C 1〜C 10置換されたアルキル、 C 1〜C 1 1置換されたアルキルまたは C 1〜C 1 2置換されたアルキルであり得る。アルカンについては、これらの具体例は、 C 1〜C 2ァゾレカン、 C 1〜C3アルカン、 C 1〜C4ァノレカン、 C 1

〜C 5アルカン、 C 1〜C 6アルカン、 C 1〜C 7アルカン、 C 1〜C8アル力ン、 C 1〜C9アルカン、 C 1〜C 10ァノレカン、 C 1〜C 1 1アルカンまたは C 1〜C 1 2アルカン、 C 1〜C 2置換されたアルカン、 C 1〜C3置換されたアルカン、 C 1〜C 4置換されたアルカン、 C 1〜C 5置換されたアルカン、 C 1〜C 6置換されたアルカン、 C 1〜C 7置換されたアルカン、 C 1〜C8置換されたアルカン、 C 1〜C 9置換されたアルカン、 C 1〜C 10置換されたアルカン、 C 1〜C 1 1置換されたアルカンまたは C：!〜 C 1 2置換されたアルカンであり得る。ここで、例えば C 1〜C 10アルキルとは、炭素原子を 1〜10個有する直鎖または分枝状のアルキルを意味し、メチル（CH₃—）、ェチル（C ₂H₅—）、 n—プロピル（CH₃CH₂CH₂—）、イソプロピル（（CH₃) ₂ CH-) 、 n—ブチル（CH₃CH₂CH₂CH₂— ) 、 n—ペンチル（CH₃CH ₂CH₂CH₂CH₂—）、 n—へキシノレ（C H ₃ C H ₂ C H₂ C H ₂ C H₂ C H ₂— ) 、 n—ヘプチル（CH₃CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂— ) 、 n—ォクチル (CH₃CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-) 、 n—ノエル（CH₃CH₂ CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-) 、 n—デシル（CH₃CH₂CH₂C H₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-) 、一 C (CH₃) ₂CH₂CH₂CH (CH₃) ₂、 -CH₂CH (CH₃) ₂などが例示される。また、例えば、 C l〜 C 10置換されたアルキルとは、 C 1〜C 10アルキルであって、そのうち 1または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。 Rとしては、 C 1〜C 6アルキルが好ましく、特に C 1〜C 6アルキルが好ましレ、。

本発明の物質または上で定義した官能基が置換基 Rによって置換されている場合、そのような置換基 Rは、単数または複数存在し、それぞれ独立して、水素、ァノレキノレ、シクロアルキル、ァノレケニル、シクロアノレケニノレ、アルキ-ノレ、ァノレコキシ、炭素環基、ヘテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、チオール、シァノ、二トロ、ァミノ、カルボキシ、ァシル、チォカルボキシ、アミド、置換されたアミド、置換されたカルボニル、置換されたチォカルボニル、置換されたスルホニルおよび置換されたスルフィエルからなる群より選択される。さらに、 OH基を有する低分子化合物にアミノ基を導入した化合物も本発明の親水性化合物として用いることができる。該化合物は限定されないが、例えば、セロビオース等のレクチンが結合しない糖鎖にアミノ基を導入した化合物が挙げられる。例えば、リボソーム膜の脂質ホスファチジルエタノールァミン上に架橋用の 2価試薬とトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンとを用いてリボソーム表面を親水性化する。親水性化合物の一般式は、下記式（1) 、式（2) 、式 (3) 等で示される。

Z - R¹ (R²OH) _n 式（1)

H₂N— R³— (R⁴OH) _n 式（2)

H₂N-R⁵ (OH) _n 式（3)

ここで、 R R³および R⁵は、から C₄₀、好ましくは Ciから C₂₀、さらに好ましくは Ciから。の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、 R²、 R⁴は存在しないかもしくは Ciから C₄。、好ましくはじ丄から C₂。、さらに好ましくは C iから C i。の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示す。 Zはリポソーム脂質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、例えば、 COOH、 NH、 NH₂、 CHO、 SH、 NHS—エステル、マレイミド、イミドエステル、活性ハロゲン、 EDC、ピリジルジスルフイド、アジドフエニル、ヒドラジド等が挙げられる。 nは自然数を示す。このような親水性化合物で親水性化を行ったリボソームの表面は、薄く親水性化合物で覆われている。但し、その親水性化合物の覆いの厚みは小さいので、リボソームに糖鎖を結合させた場合であっても、糖鎖等の反応性を抑制することはない。

本明細書において「親水性化合物基」とは、上記のような親水性化合物が他の基と結合したときの呼称である。親水性化合物基は場合に応じて一価または二価であり得る。

本明細書において「親水性化合物架橋基」とは、一端がリンカ一タンパク質とペプチド結合し、他の一端が糖鎖とペプチド結合する基であり、親水性化合物基とリボソームまたはリンカ一タンパク質との間にペプチド結合を形成させる基をレ、う。親水性化合物架橋基としては、例えば、ビス（スルホスクシンィミジル）スべレート基、ジスクシンィミジルグルタレート基、ジチオビススクシンイミジルプロピオネート基、ジスクシンイミジルスべレート基、 3， 3，一ジチォビス (スルホスクシンィミジルプロピオネート）基、エチレングリコールビススクシンィミジルスクシネート基およびエチレングリコールビススルホスクシンィミジルスクシネート基などを挙げることができる。好ましくは、親水性化合物架橋基は、ビス（スルホスクシンィミジル）スべレート基である。親水性化合物架橋基は、両端にァミノ基と反応する反応基を持ち、酸化 ·還元条件下でも開裂しない架橋剤であれば、上記以外の基でも代替可能である。例としては、ビス（スルホスクシンィミジル）グルテート一 d。基、ビス（スルホスクシンィミジル） 2， 2， 4， 4—グノレタレ一トー d ₄基、ビス（スノレホスクシンィミジル）スベレート一 d。基、ビス（スルホスクシンィミジル） 2， 2 , 7， 7—スベレートー d ₄基、ビス（2— [スクシンイミドキシカノレボニノレオキシ] ェチル）スルホン基、ジスクシンィミジルタータレート基、エチレングリコールビス（スクシンイミジ ^/スクシネート）基、エチレングリコーノレビス（スノレホースクシンイミジノレスクシネート）基、トリス一（スクシンィミジルアミノトリステート）基等が挙げられるが、これらに限定されない。

リボソームの親水性化は、従来公知の方法、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビュルアルコール、無水マレイン酸共重合体等を共有結合により結合させたリン脂質を用いてリボソームを作製する方法（特開 2 0 0 0— 3 0 2 6 8 5号 (例えば、 C N D A C含有リボソーム製剤ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン；ジパルミトイルホスファチジルグリセ口ール、ジステアロイノレホスファチジノレグリセローノレ；スフインゴミエリン；コレステロール；ポリエチレングリコール部分の分子量が約 2 0 0 0である N—モノメトキシポリエチレングリコーノレサクシ二 —ジステアロイ^/ホスファチジノレエタノールァミン（以下、 P E G 2 0 0 0— D S Ρ Εとする。）； C N D A C塩酸塩、グルコース水溶液およびトレハロース水溶液を使用し、 B a n g h a mら ( J . M o 1 . B i o l . 8、 6 6 0— 6 6 8 ( 1 9 6 4 ) 参照。）の方法により、多重層リボソームの粗分散液を得た。）と記載されている。））等の方法を採用することによつても行うことができる。このうち、トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンを用いてリポソーム表面を親水性化することが特に好ましい。本発明のトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンを用いる手法は、ポリエチレングリコールなどを用いる従来の親水性化方法と比較していくつかの点で好ましい。例えば、本発明のように糖鎖をリボソーム上に結合してその分子認識機能を標的指向性に利用するものでは、トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンは低分子量物質であるので従来のポリエチレンダリコールなどの高分子量物質を用いる方法に比べて、糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチン (糖鎖認識タンパク質）による糖鎖分子認識反応の進行を妨げないので特に好ましい。

また、本発明によるリポソ一ムは該親水化処理後においても粒子径分布や成分組成、分散特性が良好であり、長時間の保存性や生体內安定性も優れているのでリボソーム製剤化して利用するために好ましい。トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンを用いてリボソーム表面を親水性化するには、例えばジミリストイルホスファチジルエタノールァミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールァミン等の脂質を用いて、常法により得たリボソーム溶液にビススルホスクシンィミジルスべラート、ジスクシンィミジルグルタレート、ジチオビススクシンィミジルプロピオネート、ジスクシンイミジルスべラート、 3， 3 ' 一ジチォビス（スルホスクシンィミジルプロピオネート）、エチレングリコールビススクシンイミジルスクシネート、ェチレングリコールビススルホスクシンィミジルスクシネート等の 2価試薬を加えて反応させることにより、リボソーム膜上のジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン等の脂質に 2価試薬を結合させ、次いでトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンを、該 2価試薬の一方の結合手と反応させることにより、リボソーム表面にトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンを結合せしめる。トリス（ヒド口キシメチル）ァミノメタンを用いてリボソーム表面を親水性化するには、リポソーム膜面に組み込まれ、親水基にアミノ基を持つものでありさえすれば、上記以外であってもよい。

本明細書において、リボソーム、糖鎖修飾リボソームのタンパク質量は、例えば、リポソームに内包された HS A量とリポソーム表面に力ップリングした HS Aの総タンパク質量を BC A法により測定することができる。ぐ BCA法の原理 >

工程 1.

タンパク質 + ² , Cu⁺¹

タンパク質量の測定は、例えば、 Micro BCA^Th Protein Assay Reagentキット (カタログ番号 23235 BN) (P I ERCE Co. LTD) などを用いることができる。標準物質として、 2mgZm lアルブミン（BSA) を使用し得る。（1) スタンダード溶液として、標準物質（2mgZm l ：アルブミン）を P B S緩衝液で希釈し、 0、 0. 25、 0. 5、 1、 2、 3、 4、 5 μ g/50 μ ΐ溶液を調製する。（2) Cy 5. 5内包糖鎖修飾リボソームを PBS緩衝液で 20倍希釈し、検体溶液を調製する。（3) スタンダード溶液、検体溶液をそれぞれ試験管に 50 μ 1分注する。（4) 各試験管に 3 %ラウリル硫酸ナトリゥム溶液（SDS溶液）を 100 /x l添加する。（5) キットに添付された試薬 A、 B、 Cを、試薬 A：試薬 B ：試薬 C = 48 ： 2 ： 50となるように混合し、各試験管に 15 Ομ 1添加する。（6) この試験管を、 60°Cで 1時間、静置する。

(7) 室温に戻ってから、吸光度 540 nmを測定し、スタンダード溶液により検量線を作成して、リボソームのタンパク質量を測定する。検量線の一例を図 2 に示す。

糖鎖修飾リボソームのタンパク質量は、例えば、 0. 1〜1 mgノ m lの範囲であり得る。 Cy 3により標識された糖鎖修飾リボソームのタンパク質量は、例えば、 0. 24mgZm 1以上であり得る。 Cy 5. 5により標識された糖鎖修飾リボソームのタンパク質量は、例えば、 0. 45mgZm 1以上であり得る。 Cy 7により標識された糖鎖修飾リボソームのタンパク質量は、例えば、 0. 2 Omg /m 1以上であり得る。

リボソーム、糖鎖修飾リボソームの構成脂質量は、例えば、コレステロール量を定量することにより算出することができる。

ぐ脂質定量の原理 >

エステル ¾コレステロール（EC) 遊離型コレステロール (FC) BSttK

遊雌型コレステロール (FC) コレステノン過酸化水素

〔皿〕

H,C-N C=0

H₃C-C=C-NH,

4-ァミノアンチビリン _EMAE (赤紫色キノン色

Imax = 555nm 脂質の定量には、例えば、デタミナ一 TC 5 5 5キット（カタログ番号 UCC /E AN 1 2 8) (KYOWA C o . LTD) を用いることができる。標準物質として、キットに添付されている 5 OmgZm 1 コレステロールを使用する。

( 1 ) スタンダード溶液として、標準物質（5 0mgZm l ：コレステロール）を P B S緩衝液で希釈し、 0、 0. 1、 0. 2 5、 0. 5、 0. 7 5、 1、 5、 1 0 μ g,20 1溶液を調製する。（2) C y 5. 5内包糖鎖修飾リボソームを P B S緩衝液で 5倍希釈し、検体溶液を調製する。（3) スタンダード溶液、検体溶液をそれぞれ試験管に 2 0 X 1分注する。（4) 各試験管に、 T r i t o n X- 1 0 0 ( 1 0%溶液）を 1 7 μ 1添カ卩して撹拌し、その後、 3 7°C、 4 0 分間、静置する。（5) デタミナ一 TC 5 5 5キットの酵素試薬を 3 0 0 μ 1添加して撹拌し、その後、 3 7°C、 2 0分間、静置する。（6) 吸光度 5 4 0 nm を測定し、スタンダード溶液により検量線（検定線の一例を図 3を作成して、リポソームのコレステロール量を測定し、脂質量を求める。コレステロール量から脂質量を求める換算式は、例えば、以下のように表される。

脂質量 gZ50 μ 1 ) =コレステロール量 _g/ 50 /z l ) X 4. 5 1 (換算係数）

リボソーム中の脂質に対するタンパク質の割合は、例えば、上述のタンパク質定量および脂質定量の結果から導くことができる。本発明の S LX修飾リポソ一ムは、好ましくは、脂質に対するタンパク質の割合が、約 0. 1から約 0. 5である。

本発明において使用される糖鎖修飾リボソームの脂質量は、例えば、 l〜4m gZm 1の範囲であり得る。 Cy 3により標識された糖鎖修飾リボソームの脂質量は、例えば、 1. 2mgZm 1以上であり得る。 Cy 5. 5により標識された糖鎖修飾リボソームの脂質量は、例えば、 1. 4mgZm 1以上であり得る。 C y 7により標識された糖鎖修飾リボソームの脂質量は、例えば、 2. lmg/m 1以上であり得る。

リボソーム、糖鎖修飾リボソームの粒子径分布および粒子径は、例えば、リポソーム粒子を精製水で 50倍に希釈して、ゼータサイザ一ナノ（Na n— Z S ： MALVERN Co. LTD) を用いて測定することができる。本発明の SL X修飾リボソームの粒子径分布の一例を図 4に示す。本明細書において、リボソーム、糖鎖修飾リボソームは、粒度分布の最大域において、約 80 nm〜約 1 65 nmの粒子径を有することが好ましい。なぜなら、約 8011111〜約165 nmの粒子径は、マクロファージなどの免疫系細胞の認識を回避でき、そして肝臓および脾臓などの内皮細網系（RES) からの取り込みをある程度回避することができるからである。約 8011111〜約165 nmの粒子径の糖鎖修飾リボソームは、薬物を内包させ、その薬物を標的臓器、疾患部分に送達させるのに適している。本明細書において、リボソーム、糖鎖修飾リボソームは、約 5 0 n m〜約 3 0 0 n mの平均粒子径を有し、好ましくは、約 6 5 n m〜約 1 6 5 n m、より好ましくは、約 1 0 0 n mの粒子径を有する。なぜなら、リボソームの粒子径が小さすぎると、肝臓 ·脾臓の細胞内皮系に非特異的に入り、粒子径が大きすぎると、マクロファージなどの免疫系細胞に貪食されやすくなるからである。また、本発明において使用されるリボソームは、負に荷電していることが望ましい。負に荷電していることにより、生体中の負に荷電している細胞との相互作用を防ぐことができる。本発明において使用されるリボソーム表面のゼータ電位は、生理食塩水中において、 3 7 °Cで、一 5 0〜： L O mV、好ましくは一 4 0〜0 mV、さらに好ましくは一 3 0〜一 1 O m Vである。リボソーム表面のゼータ電位は、 2 5 °Cで、一 1 2 O mV〜一 3 O mVであり得るが、これらに限定されない。好ましくは、 2 5 °Cで、 —3 O mV未満である。リボソーム表面のゼータ電位は、一 1 2 O mV ( 2 5 °C) 未満であっても、 _ 3 0 m V以上であってもよい。なぜなら、リポソーム間の凝集が生じさえしなければよいからである。

(組成物）

本発明の組成物は、必要に応じて、適切な処方材料または薬学的に受容可能なキヤリァを含み得る。適切な処方材料または薬学的に受容可能なキヤリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、蛍光色素、風味料、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクルおよびまたは薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の組成物は、シァリルルイス X ( S L X) 、および必要に応じて他の有効成分を、少なくとも 1 つの生理的に受容可能なキヤリァ、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、ミセル、注射溶液、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的に使用される他の物質を補充することが可能である。本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、好ましくは、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、好ましくは、例えば、リン酸塩、クェン酸塩、または他の有機酸；ァスコルビン酸、 α—トコフエロール；低分子量ポリべプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロプリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビュルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、ァスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリン）；キレート剤（例えば、 EDTA) ；糖アルコール（例えば、マン- トールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリゥム）；ならびに Ζあるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、 Twe e n、プル口ニック（p l u r o n i c) またはポリエチレングリコール（PEG) ) などが挙げられる < 例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、 pH約 7. 0-8. 5の T r i s緩衝剤または pH約 4. 0— 5. 5の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。

以下に本発明の組成物の一般的な調製法を示す。なお、動物薬組成物、医薬部外品、水産薬組成物、食品組成物および化粧品組成物等についても公知の調製法により製造することができることに注意されたい。

本発明の組成物などは、薬学的に受容可能なキヤリアと必要に応じて配合し、例えば、注射剤、懸濁剤、溶液剤、スプレー剤等の液状製剤として非経口的に投与することができる。薬学的に受容可能なキャリアの例としては、賦形剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤、崩壊阻害剤、吸収促進剤、吸収剤、湿潤剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を用いることができる。また、本発明の組成物には、シァリルルイス X、脂質など以外の物質を配合することも可能である。非経口の投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、局所投与、皮膚投与など等が挙げられるがそれらに限定されない。全身投与されるとき、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製について、 p H、等張性、安定性などを考慮することは、当業者の技術範囲内である。

液状製剤における溶剤の好適な例としては、注射溶液、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油およびトウモロコシ油等が挙げられる。液状製剤における溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレンダリコール、プロピレングリコーノレ、 D—マンニトーノレ、安息香酸ベンジル、エタノーノレ、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノーノレアミン、炭酸ナトリウムおよびタエン酸ナトリゥム等が挙げられるがそれらに限定されない。

液状製剤における懸濁化剤の好適な例としては、例えば、ステアリルトリエタノールァミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニゥム、塩化べンゼトニゥム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤、例えば、ポリビエルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチノレセノレロースナトリウム、メチノレセノレロース、ヒドロキシメチノレセノレロース、ヒドロキシェチノレセノレロース、ヒドロキシェチノレセノレロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。

液状製剤における等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリゥム、グリセリン、 D—マンニトール等が挙げられるがそれらに限定されない。

液状製剤における緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩およびクェン酸塩等が挙げられるがそれらに限定されない。液状製剤における無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコール、塩化べンザルコニゥムおよび塩酸プロ力イン等が挙げられるがそれらに限定されない。液状製剤における防腐剤の好適な例としては、パラォキシ安息香酸エステル類、クロロブタノ一ノレ、. ペンジノレアノレコーノレ、 2—フエニノレエチノレアノレコーノレ、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。

液状製剤における抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、ァスコルビン酸、 α -トコフエロールおよびシスティン等が挙げられるがそれらに限定されない。注射剤として調製する際には、液剤および懸濁剤は殺菌され、かっ血液または他の目的のための注射部位における溶媒と等張であることが好ましい。通常、これらは、細菌保留フィルタ一等を用いるろ過、殺菌剤の配合または照射などによつて無菌化する。さらにこれらの処理後、凍結乾燥等の方法により固形物とし、使用直前に無菌水または無菌の注射用希釈剤（塩酸リドカイン水溶液、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノールまたはこれらの混合溶液等）を添加してもよレ、。さらに、本発明の組成物は、着色料、保存剤、香料、矯味矯臭剤、甘味料等、ならびに他の薬剤を含んでいてもよい。

本発明において使用される物質、組成物等の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、被験体の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の方法を被験体に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、被験体の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日一数ケ月に 1回（例えば、 1週間に 1回一 1ヶ月に 1回）の投与が挙げられる。 1週間一 1ヶ月に 1回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。投与する量は、処置されるべき部位が必要とする量を見積もることによって確定することができる。

本明細書において「分子イメージング」または「インビボイメージング」とは、生体の機能または構造を画像化するこという。本明細書において「分子イメージングによって検出可能である物質」とは、分子ィメ一ジングょり生体における標識物質の有無を調べて、該標識物質により該生体の機能または構造を画像化することができる物質をいう。これらとしては、例えば、蛍光物質、放射性物質、発色物質（例えば、 i3 g a 1 ) 、発行物質（例えば、ルシフェラーゼ）などが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において「磁気共鳴画像法（Ma g n e t i c R e s o n a n c e I ma g i n g ： MR I ) 」とは、核磁気共鳴現象を利用して生体内の内部情報を画像化する方法をいう。

本明細書において「核磁気共鳴 (n u c l e a r ma g n e t i c r e s o n a n c e ： NMR) 」とは、原子核のスピンエネルギー準位がゼーマン効果によって分離しているとき、振動磁場または電磁波との間に共鳴を起こすことをいう。

本明細書において「造影剤」とは、画像診断において組織の濃度（信号強度）を上昇あるいは低下させるために使われる薬剤をいう。上昇させるものを陽性造影剤、低下させるものを陰性造影剤という。陽性造影剤としては、例えば、ガドリニゥムキレート剤、硫酸バリウム、水溶性ョード造影剤等が挙げられるが、これらに限定されない。陰性造影剤には、超常磁性酸化鉄粒子（S P I O) 、空気、二酸化炭素等が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において「被験体」とは、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態（例えば、虚血性脳疾患、虚血性脳障害または脳虚血状態）の処置、検出または診断の対象とされる動物をいう。本発明が対象とする動物は、例えば、鳥類、哺乳動物などであってもよい。好ましくは、そのような動物は、哺乳動物

(例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ゥサギ目など）であり得る。例示的な被験体としては、例えば、ゥシ、ブタ、ゥマ、二ヮトリ、ネコ、ィヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない。さらに好ましくは、マウス、ラット、ゥサギ、ハムスター、モルモットなどの小動物が用いられ得る。

本明細書において「送達媒体」とは、目的の物質の送達を媒介する担体（ビヒクル）をいう。送達される物質が薬物であれば、「薬物送達媒体」という。薬物送達システム（D r u g D e l i v e r y S y s t em, DDS) とは、ドラッグデリバリーシステムとも呼ばれ、吸収制御型 DDS、放出制御型 DDS、標的指向型 DDSに分類することもある。理想的な DDSは、薬物を「体内の必要な部位に」、「必要な量を」、「必要な時間だけ」送り込むシステムである。ターゲティング DDS (T a r g e t i n g D D Sと書き、和訳は標的指向性 DDSである。）は、パッシブ ·ターグティング（受動的 ·標的指向性） DDS とアクティブ ·ターゲティング（能動的 ·標的指向性） DDSとに分類される。前者はキャリアー（薬物運搬体）の粒子径ゃ親水性など物理化学的性質を利用して体内挙動を制御する方法である。後者はこれらに特殊な仕組みを付け加えて積極的に標的組織への指向性を制御しょうとする方法であり、例えば、標的組織を構成する特定細胞の標的分子への特異的分子認識機能を有する抗体または糖鎖などを結合したキャリアーを利用する方法があり "ミサイルドラッグ" と呼ばれることもある。

本明細書において「薬物送達媒体」とは、所望の薬物を送達するためのビヒクノレをレヽう。

本明細書において「目的物質」とは、特に、送達媒体により細胞内に送達されることが所望される物質をいう。これとしては、例えば、蛍光物質（例えば、 c y 5 - 3、 c y o、 c y /、 c y 3 B、 c y 3. 5、 A l e x a F l u o r (登録商標） 3 50、 A l e x a F l u o r (登録商標） 488、 A 1 e x a F l u o r (登録商標） 5 3 2、 A l e x a F l u o r (登録商標） 54 6、 A 1 e x a F l u o r (登録商標） 5 5 5、 A l e x a F l u o r (登録商標） 5 6 8、 A l e x a F l u o r (登録商標） 5 94、 A l e x a F l u o r (登録商標） 633、 A l e x a F l u o r (登録商標） 647、 A l e x a F l u o r (登録商標） 680、 A l e x a F l u o r (登録商標） 7 00, A 1 e x a F l u o r (登録商標） 750、フルォレセイン一 4—イソチオシァネート（F I TC) 、ユウ口ピウム含有標識、 3， 8—ジァミノ一 5— ェチノレー 6—フェニ^/フエナントリジニゥムブロミド（ェチジゥムブロマイド）、 2 ' 一（4—エトキシフエ-ル） _5_ (4—メチノレー 1—ピペラジニル）一2， 5，ービ 1H— (へキスト 33342) 、 2' — （4—ヒドロキシフエニル）一 5 - (4ーメチルー 1—ピペラジニル）一2， 5，一ビ一 1 H—べンゾイミダゾール，三塩酸塩（へキスト 33258) 、 P I、 3， 6—ビス（ジメチルアミノ）アタリジン塩酸塩（プロビジゥムィオダイド）、 4' ， 6—ジアミジノー 2 一フエニルインドール，二塩酸塩（DAP I ) 、 3， 6—ビス（ジメチルアミノ）ァクリジン塩酸塩（アタリジンオレンジ、 AO) 、 5— (N—スクシンイミジルォキシカルボニル） —3' ， 6 ' -0, 0， —ジァセチルフルォレセイン (CF SE) 、 6— (N—スクシンィミジルォキシカルボニル）一 3，， 6 ' - O, O' ージァセチルフルォレセイン（CFSE) 、フルォレセインジァセテ一ト（FDA) 、 3' , 6 ' ージ（O—ァセチル） —4，， 5，一ビス [N， N— ビス（カルボキシメチル）アミノメチル] フルォレセイン，テトラァセトキシメチルエステル（Ca 1 c e i n— AM) 、 7—イソブチルォキシカルボ二ルォキシ— 3 H—フエ-キサジン— 3—オン（Cy t oRe d) 、 3，一 O—ァセチルー2，， 7，一ビス（カノレボキシェチノレ）一 4—カノレボキシフノレォレセイン，ジァセトキシメチルエステル（BCECF— AM) 、 3，一O—ァセチノレ一 2，， 7 ' 一ビス（カルボキシェチル）一 5—カルボキシフルォレセイン，ジァセトキシメチルエステル（BCECF— AM) など）、蛍光タンパク質（例えば、 GF P, CFP， YFPなど）、発光酵素（例えば、ルシフェラーゼなど）、タンパク質（例えば、抗体、 t ΡΑ、 β—ガラクトシダーゼ、 RNa s e、アルブミン、ボツリヌス毒素、ジフテリアトキシンなど）、錯体（例えば、 Gd錯体、 F e錯体など）、コロイド（例えば、金コロイドなど）、難水溶性薬物（例えば、シスプラチン、メチルプレドニゾロン、パクリタキセルなど）、水溶性薬物（例えば、プラバスタチン、リン酸プレドニゾロン、ファスジルなど）、核酸（例えば、プラスミド D N A、 S i R N A、 m i R N Aなど）などが挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、目的物質としては、リボソームに内包されることができ、標的とする部位に送達された場合に細胞内において物質単体として機能することができればよいからである。

本明細書において「蛍光物質」とは、当該分野において用いられる最も広義の意味として定義され、蛍光を発する性質を有する物質をいう。

本明細書において「蛍光タンパク質」とは、当該分野において用いられる最も広義の意味として定義され、蛍光を発するタンパク質をいう。

本明細書において「発光酵素」とは、当該分野において用いられる最も広義の意味として定義され、発光物質が光を放つ化学反応を触媒する作用を有する酵素の総称である。発光酵素は、ルシフェラーゼ（luciferase)とも称される。

本明細書において「錯体」とは、当該分野において用いられる最も広義の意味として定義され、配位結合または水素結合によって形成された分子性化合物の総称である。

本明細書において「コロイド」とは、当該分野において用いられる最も広義の意味として定義され、細かく分離された状態にある原子または分子の集合体である。コロイドは、膠質とも称される。

本明細書において「難水溶性薬物」とは、水に溶けないか、ほとんど溶けない性質の薬物をいう。

本明細書において「水溶性薬物」とは、水に溶ける性質の薬物をいう。

本明細書において「核酸」とは、当該分野において用いられる最も広義の意味として定義され、塩基と糖とリン酸とからなるヌクレオチドがリン酸エステル結合で連なった生体高分子である。 1つの実施形態において、目的物質は、リボソームから出て、物質単体で機能していることが確認できる物質であり得る。これらとしては、例えば、細胞内小器官等とインター力レーシヨンすることによってある波長の蛍光を発するものであったり、細胞内で加水分解されて蛍光を発するもの等が挙げられ得る。これらとしては、例えば、以下：

3， 8—ジァミノー 5—ェチルー 6—フエユルフェナントリジニゥムブロミド (ェチジゥムプロマイド）、

2 ' - (4—エトキシフエニル）一5— (4—メチルー 1ーピペラジニル）一 2: 5 ' —ビ 1H— (へキスト 33342) 、

2，一（4ーヒドロキシフエニル）一 5— (4—メチルー 1ーピペラジ-ル）一

2, 5 ' —ビ— 1 H—ベンゾィミダゾール，三塩酸塩（へキスト 33258 ) 、 P I、 3， 6—ビス（ジメチルァミノ）ァクリジン塩酸塩（プロビジゥムィオダイド）、 4，， 6—ジアミジノ一 2—フエニルインドール，二塩酸塩（DAP I) 、

3， 6—ビス（ジメチルァミノ）ァクリジン塩酸塩（アタリジンオレンジ、 A

O) 、

5 - (N—スクシンィミジルォキシカルボニル）一3，， 6，一 0, 〇，一ジァセチノレフノレォレセイン、または 6— （N—スクシンイミジノレォキシカ^/ボニ ^) — 3，， 6 ' — 0， 0， —ジァセチルフルォレセイン（CFSE) 、

フルォレセインジアセテート（FDA) 、

3 ' , 6 ' —ジ（〇一ァセチル） - 4 ' ， 5，一ビス [N， N—ビス（カルボキシメチル）アミノメチル] フルォレセイン，テトラァセトキシメチノレエステル

(C a 1 c e i n— AM) 、

7一イソブチルォキシカルボニルォキシー 3 H—フエニキサジン一 3—オン（C y t o R e d) 、

3，一O—ァセチノレ一 2，， 7，一ビス（カルボキシェチノレ）一4一カルボキシフルォレセイン，ジァセトキシメチルエステノレ、または 3，一 O—ァセチル一 2 ，， 7，一ビス（力ノレボキシエチ^^ — 5—力^/ボキシフ/レオレセイン，ジァセトキシメチルエステル（B C E C F— AM)

などであり得るが、これらに限定されない。

(好ましい実施形態の説明）

以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。

(医薬組成物）

1つの局面において、本発明は、親水性化されたリボソームと、シァリルルイス X ( S L X ) または S L X基とを含む、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態を処置または予防するための医薬組成物を提供する。理論に束縛されないが、 S L Xとリボソームとが共存すれば、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態を処置または予防するという効果を達成できることは、本明細書の記載から理解されるように、虚血に伴い血管内皮細胞に産生されるセレクチンと白血球の接着を競合的に阻害し、その結果、白血球の中枢神経系（例えば、脳実質）への浸潤や炎症惹起作用、血栓形成作用を抑制し、中枢神経系の虚血に伴う組織障害過程を抑制することが可能と考えられるからである。

1つの実施形態において、本発明の医薬組成物により処置または予防される中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態は、例えば、虚血性脳疾患、虚血性脳障害または脳虚血状態であり得るが、これらに限定されない。これらとしては、例えば、高血圧、糖尿病などが原因で、細い動脈の動脈硬化が進み血管が狭くなつたときに、低血圧や心臓障害などが起きて血流が減少し、その先の血流が滞ってしまうこと、あるいは心臓病などが原因で血管に血栓ができ、その血栓などが脳の血管を塞くことにより血流が減少すること等により生じ得る中枢神経系の疾患、障害または状態であるが、これに限定されない。これまで、心臓等での虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態を処置または予防する効果は知られていたが、中枢神経系での効果は心臓等からの結果からは予想することができなレ、。その理由は以下のとおりである：心臓は、構成細胞も心筋細胞など中枢神経系とは異なる細胞であり、血液脳関門の構造がないため血管系の構造も異なるので、心臓の虚血現象に対しての保護効果を中枢神経系の虚血でも応用可能であるとは考えにくレ、。また、逆に、いったん大脳での実験結果が示されたならば、他の中枢神経系においても同様の効果を有することを当業者は理解する。その理由は以下のとおりである：脳および脊髄は血液脳関門があるため、血管系の構造も共通しており、細胞構成（神経細胞、グリア細胞）も共通している部分が多い。機能障害もまた、神経細胞障害によるという共通点がある。また、虚血後の炎症メカニズム等も共通の現象が報告されている。

別の実施形態において、本発明の医薬組成物は、運動性障害（例えば、脳虚血性麻痺、歩行障害、姿勢保持障害など）を回復させるために使用され得る。好ましくは、この運動性障害は、歩行障害、姿勢保持障害であり得る。本発明の医薬組成物は、中枢神経系の虚血部位（例えば、脳虚血部位）に集積し、虚血部位の炎症を低減させることができる。本発明の医薬組成物は、虚血部位に集積し、炎症を低減させるだけでなく、運動障害の回復をもたらすことができる。 S L Xを含む組成物は炎症部位に関連があることは知られていたものの、運動障害の回復作用があることはまったく知られていなかった。運動障害に炎症が関与することは知られておらず、 S L Xのこの作用効果は、これまでに S L Xについて知られていた知見からは想起できない驚くべき効果であるといえる。本発明の医薬組成物が提供する効果は顕著に優れており、これまでの医学では達成されていなかつた。本発明の医薬組成物によって回復され得る運動障害としては、例えば、中枢神経系の虚血（例えば、脳虚血）に伴う半身麻痺が挙げられ得る。

本発明においては、本発明の医薬組成物につき治療効果が示されており、その結果からも中枢神経系の虚血の予防効果があることが理解される。現在の脳虚血の動物実験において、治療薬物投与では、虚血導入前に薬物投与を行うことが多い。この原因として、虚血導入後においては保護効果を発揮できないことが多いためである。脳虚血を起こす前に脳虚血増悪因子を前もって抑制する準備ができている方が効果も大きく、虚血が起こって、増悪因子が出てからでは抑制効果が小さくなることが多いからである。本発明において使用される S L X修飾リポソームについても、血中の安定性から、虚血導入前に投与しても長時間血中に存在し、血管内皮細胞にセレクチンが発現されても結合することができると考えられる。したがって、既に虚血導入後の投与でも保護効果を持つことが証明された S L X修飾リボソームが、虚血導入前に投与されているならば保護効果は同程度かさらに増大することが理解される。本発明とは全く異なる物質である抗体についてでの報告であるが、 H u a n g Jら、 s t r o k e . S t r o k e 2 0 0 0 D e c ； 3 1 ( 1 2 ) : 3 0 4 7— 3 0 5 3においても、前投与の方が効果は大きいことが報告されている。

1つの実施形態において、前記中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態は、脳における虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態であり得るが、これらに限定されない。これまで、心臓等での虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態を処置または予防する効果は知られていたが、中枢神経系での効果は心臓等からの結果からは予想することができない。その理由は以下のとおりである：心臓は、構成細胞も心筋細胞など中枢神経系とは異なる細胞であり、血液脳関門の構造がないため血管系の構造も異なるので、心臓の虚血現象に対しての保護効果を中枢神経系の虚血でも応用可能であるとは考えにくレ、。また、逆に、いったん大脳での実験結果が示されたならば、他の中枢神経系においても同様の効果を有することを当業者は理解する。その理由は以下のとおりである：脳および脊髄は血液脳関門があるため、血管系の構造も共通しており、細胞構成（神経細胞、グリア細胞）も共通している部分が多い。機能障害もまた、神経細胞障害によるという共通点がある。また、虚血後の炎症メカニズム等も共通の現象が報告されている。

1つの実施形態において、本発明の医薬組成物において使用されるリポソームは、例えば、単純脂質、複合脂質、誘導脂質、それらの組み合せ等の脂質により構成され得る。単純脂質としては、セラミド、ワックス、コレステロールエステル、レチノール脂肪酸エステル等が挙げられるが、これらに限定されない。複合脂質としては、グリセ口リン脂質、スフインゴリン脂質、スフインゴ糖脂質、グリセ口糖脂質等が挙げられるが、これらに限定されない。

このリボソームにおいて使用される脂質は、例えば、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類、糖脂質類（ガンダリオシド類など）、ホスファチジルグリセロール類、スフインゴミエリン類、コレステロール類等が挙げられるが、これらに限定されない。

ホスファチジルコリン類としては、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等が挙げられるが、これらに限定されない。

ホスファチジルエタノールアミン類としては、例えば、ジミリストイルホスファチジルエタノールァミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールァミン等が挙げられるが、これらに限定されない。

ホスファチジン酸類としては、例えば、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパノレミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸が挙げられる ifi これらに限定されない。長鎖アルキルリン酸塩類としては、例えば、ジセチルホスフェート等が挙げられるが、これらに限定されない。

糖脂質類としては、例えば、ガラクトシルセラミド、ダルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、ホスフナチド、グロボシド、ガンダリオシド類等が挙げられるが、これらに限定されない。

ガンダリオシド類としては、例えば、ガンダリオシド GM 3 (4 (Ne u Αα 2， 3) G a 1 i3 1 , 4 G 1 c β 1, l， C e r) 、ガングリオシド GM1 (G a 1 i3 1 , 3 G a 1 NA c β 1, 4 (N e u Αα 2, 3) G a l j3 1， 4 G 1 c β 1 , 1 ' C e r ) 、ガングリオシド GD 1 a (N e u Αα 2, 3 G a 1 ]3 1 , 3 G a 1 NA c β 1, 4 (N e u Αα 2, 3) G a 1 j3 1 , 4 G 1 c ]3 1 , 1 '

C e r ) 、ガングリオシド GT l b (N e u Αα 2, 3 G a 1 ]3 1 , 3 G a 1 N Ac β 1, 4 (N e u Αα 2, 8 N e u Αα 2, 3) G a 1 ]3 1 , 4 G 1 c β 1, 1， C e r) 等が挙げられるが、これらに限定されない。リボソームに S LX基を含ませる場合であれば、リボソームと S L X基とを結合させることができさえすれば、リボソームと S LX基とを固定することができるので、実施例において作られたような全ガンダリオシド抽出物を使用したものと同等またはそれ以上のリポソームと S LX基または S LXとの相乗効果を示すことが理解される。従つて、どのようなガンダリオシドであっても、リボソームに S LX基を直接または間接に固定することができる限り、本発明におけるリポソームにおいて使用することができ、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害および虚血状態（例えば、虚血性脳疾患、虚血性脳障害および脳虚血状態）に対する治療効果および予防効果を発揮すると考えられる。

ホスファチジルグリセロール類としては、例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパノレミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール等が挙げられるが、これらに限定されない。このうち、ホスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類、糖脂質類、およびコレステロール類はリボソームの安定性を上昇させる効果を有するので、構成脂質として添加するのが望ましい。

1つの実施形態において、本発明の医薬組成物において使用されるリポソームとしては、例えば、ホスファチジルコリン類（モル比 0〜70%) ；ホスファチジルエタノールアミン類（モル比 0〜30%) ；ホスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩の 1種以上の脂質（モル比 0〜30%) ；糖脂質類、ホスファチジルグリセロール類、スフインゴミエリン類の 1種以上の脂質（モル比 0〜4 0%) ；コレステロール類（モル比 0〜70%) を含むものが挙げられる。このリボソームは、ガンダリオシド、糖脂質、ホスファチジルグリセロールを含んでいてもよレ、。なぜなら、これらの脂質を含有することによって、アルブミンのようなリンカーの結合が容易になるからである。

1つの実施形態において、本発明の医薬組成物では、親水性化されたリポソ一ムの表面に前記 S LX基が存在し得る。なぜなら、 S LX基がリボソームの表面に存在することにより、 S LX基と標的との結合が容易になるからである。他の実施形態において、本発明の医薬組成物では、 SLXとリボソームを構成する脂質とが、水素結合またはイオン結合で結合されていてもよく、前記 SLX 基と前記脂質とが、共有結合で結合されていてもよい。好ましくは、前記 S LX 基と前記脂質とは、共有結合で結合されている。リボソームに S LX基を含ませる場合であれば、リボソームと SLX基とを結合させることができれば、リポソームと S LX基とを固定することができるので、実施例において作られたような全ガンダリオシド抽出物を使用したものと同等またはそれ以上のリボソームと S LX基または S LXとの相乗効果を示すことが理解される。従って、どのような結合様式であっても、リボソームに S LX基を直接または間接に固定することができる限り、本発明におけるリボソームにおいて使用することができ、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害および虚血状態（例えば、虚血性脳疾患、虚血性脳障害および脳虚血状態）に対する治療または予防効果を発揮すると考えられる。本発明において使用されるリポソームは、好ましくは、リポソーム上のガンダリオシドと血清アルブミン（例えば、 HSA) とがカップリングして、さらにこの血清アルブミンと S LX基とが架橋剤を介して結合され得る。理論に束縛されないが、血中での S LXの安定性を高め、かつ反応性を保持させた状態でありさえすれば、 S LXと脂質とは、結合せずに単に混ざっているだけの状態であってもよい。なぜなら、リボソームが親水性化されていることにより、血管内でのステルス性が保持されるので、リボソーム中の脂質と S LXとは結合していなくても、血中での S LXの安定性を高めることができるからである。

本明細書において使用されるリボソームにおいて、修飾結合密度の上限は、血流中に存在することが予期される投与形態の場合、血管内でのステルス性を保持することができる程度の密度であればよい。なぜなら、修飾結合密度が高密度すぎるとステルス性が低下するからである。修飾結合密度の上限は、 500mg糖鎖 Zmg脂質、またはそれより大きくてもよく、あるいは 10 Omg糖鎖 mg 脂質、 1 Omg糖鎖 Zmg脂質、 5 mg糖鎖 Zmg脂質、 lmg糖鎖 Zmg脂質、 0. 9 m g糖鎖 Zm g脂質、 0. 8 mg糖鎖 Zmg脂質、 0.

糖鎖 111₈ 脂質、 0. 6111 _§糖鎖/111₈脂質、 0. 5 mg糖鎖 Zmg脂質、 0. 4mg糖鎖 Zmg脂質、 0. 3111₈糖鎖ノ111₈脂質、 0. 2 mg糖鎖 Zmg脂質、 0. lm g糖鎖/ mg脂質、 0. 09mg糖鎖 Zmg脂質、 0. 08mg糖鎖 Zmg脂質、 0. 07mg糖鎖 Zmg脂質、 0. 06mg糖鎖 Zmg脂質、 0. 05 m g糖鎖

Zmg脂質、 0. 04mg糖鎖/ mg脂質、 0. 03mg糖鎖 Zmg脂質、 0. 029mg糖鎖 g脂質、 0. 028 m g糖鎖 Zm g脂質、 0. 027 m g糖鎖/ m g脂質、 0. 026 m g糖鎖ノ m g脂質、 0. 025 m g糖鎖 Zm g脂質であり得る。

修飾結合密度の下限は、標的部位に少なくとも一部が局在的に集積するようにと結合（S LXが血管内を転がる程度の弱い結合も含める）できる程度の密度であればよい。なぜなら、セレクチンと結合できなければ、白血球とセレクトンとの結合を阻害することができないからである。修飾結合密度の下限は、例えば、

0. 0001 mg糖鎖 Zmg脂質、またはそれより小さくてもよく、あるいは、 0. 005mg糖質ノ mg脂質、 0. 0025糖質/ mg脂質、 0. 002mg 糖鎖 Zmg脂質、 0. 00 lmg糖質 Zmg脂質、 0. 09mg糖質 Zmg脂質、 0. 08mg糖鎖/" mg脂質、 0. 07 m g糖質 Zni g脂質、 0. 06mg糖質ノ mg脂質、 0. 05mg糖質/ mg脂質、 0. 04!11₈糖鎖 111₈脂質、 0. 03mg糖質 Zm g脂質、 0. 029 m g糖質 Ζπι g脂質、 0. 028 m g糖質 mg脂質、 0. 027mg糖質 Zmg脂質、 0. 026 m g糖質/ m g脂質、 0. 025mg糖鎖 mg脂質であり得る。従って、本発明において使用されるリボソームとしては、上記の任意の上限と、任意の下限とを組み合わせた密度範囲（例えば、 50 Omg糖鎖 Zmg脂質〜 0. 0001 m g糖鎖 Zm g脂質）のものを使用することができる。理論に束縛されないが、本発明の医薬組成物は、ステルス性を少なくとも一定程度維持し、標的部位（例えば、炎症部位）に集積することができれば、治療または予防効果を期待されるからである。従って、上記の修飾結合密度の上限および下限の任意の組合せの範囲において、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態（例えば、虚血性脳疾患、虚血性脳障害または脳虚血状態など）を処置または予防できるという効果を達成できる。なぜなら、これらの範囲では、リボソームは血中で安定であり、 S LX基がセレクチンと結合することができるからである。

1つの実施形態において、前記親水性化は、水酸基が多く存在し、アミノ基を持つ基、例えば、トリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基（例えば、トリス（ヒドロキシメチル）メチルァミノ基、トリス（ヒドロキシメチル）ェチルアミノ基、トリス（ヒドロキシェチル）ェチルァミノ基、トリス（ヒドロキシプ口ピル）ェチルァミノ基、トリス（ヒドロキシメチル）メチルァミノ基、トリス

(ヒドロキシェチル）メチルァミノ基、トリス（ヒドロキシプロピル）メチルァミノ基、トリス（ヒドロキシメチル）プロピルアミノ基、トリス（ヒドロキシェチル）プロピルアミノ基、トリス（ヒドロキシプロピル）プロピルアミノ基など）によって付与され得る。この親水性化は、上記以外のものにより付与されてもよい。なぜなら、血管内でのステルス性をリボソームに保持させる程度の親水性度を付与できさえすればよいからである。

本明細書において「ステルス性」とは、細網内皮系組織に存在する貪食細胞に認識されにくく、マクロファージに捕獲されにくい性質をいう。「ステルス」は、戦闘機の名前にも使われるとおり、「レーダーに捕捉されない」という性質を示す用語であり、それをたとえて命名された。

1つの実施形態において、本発明の医薬組成物において使用されるリボソームを構成する脂質の一部は、親水性化合物架橋基 W—トリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基と N H—C ( = 0 ) 結合しており、ここで、該 Wは、 C (= 0) —N H結合であり得る。好ましくは、トリス（ヒドロキシアルキル）了ルキルアミノ基は、トリス（ヒドロキシメチル）メチルァミノ基であり得る。理論に束縛されないが、本発明の医薬組成物は、上記構成をとれば、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態（例えば、虚血性脳疾患、虚血性脳障害または脳虚血状態など）を治療または予防できるという効果を達成できることは、本明細書の記載から理解されるように、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ基により親水性化されたリボソームは、血中で親水性化していないものに比べて安定でステルス性も高く、それによつて、血中滞留性が向上し、血液中のリポソーム濃度が低下しにくくなり、疾患部位への集積も向上するからである。また、虚血に伴い血管内皮細胞に産生されるセレクチンと白血球の接着を競合的に阻害し、その結果、白血球の中枢神経系（例えば、脳実質）への浸潤や炎症惹起作用、血栓形成作用を抑制し、虚血に伴う組織障害過程を抑制することが可能と考えられるからである。 1つの実施形態において、本発明の医薬組成物では、前記リボソームと前記 S L X基とは、血清アルブミン基（例えば、ヒト血清アルブミン基）を介して結合していてもよい。理論に束縛されないが、本発明の医薬組成物では、血清アルブミン基を介してリボソームと S L X基とを結合させれば、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態（例えば、虚血性脳疾患、虚血性脳障害または脳虚血状態など）を治療または予防できるという効果を達成できることは、本明細書の記載から理解されるように、血中に存在する血清アルブミンをリポソーム表面に結合させることによって、リポソ一ムの血中での安定性およびステルス性を高め、血中滞留性を向上することで炎症部位への集積性も向上するからである。また、虚血に伴い血管内皮細胞に産生されるセレクチンと白血球の接着を競合的に阻害し、その結果、白血球の中枢神経系（例えば、脳実質）への浸潤や炎症惹起作用、血栓形成作用を抑制し、虚血に伴う組織障害過程を抑制することが可能と考えられるからである。

1つの実施形態において、本発明の医薬組成物では、前記リボソームを構成する脂質の一部は、血清アルブミン基ー A—リンカータンパク質架橋基— X _ S L X基と C H ₂— N H結合していてもよく、ここで、該 Aは、 N H— C ( = 0) 結合であり、該 Xは、 C (=〇） _ N H結合であり得る。血清アルブミン基は、例えば、ヒト血清アルブミン基であり得る。理論に束縛されないが、上記構成をとれば、本発明の医薬組成物が、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態（例えば、虚血性脳疾患、虚血性脳障害または脳虚血状態）を治療または予防できるという効果を達成できることは、本明細書の記載から理解されるように、血中に存在する血清アルブミンをリボソーム表面に結合させることによって、リポソ一ムの血中での安定性およびステルス性を高め、血中滞留性を向上することで疾患部位への集積性も向上するからであり、また、血清アルブミン上に架橋剤を介して糖鎖を結合させることによって、立体障害が少ない状態で S L X基をリポソーム表面に提示させることができるので、 S L X基の機能を阻害することがないからである。また、虚血に伴い血管内皮細胞に産生されるセレクチンと白血球の接着を競合的に阻害し、その結果、白血球の中枢神経系（例えば、脳実質）への浸潤や炎症惹起作用、血栓形成作用を抑制し、虚血に伴う組織障害過程を抑制することが可能と考えられるからである。

1つの好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物は、

(a) ホスファチジルコリン類（モル比 0〜70%)

(b) コレステロール類（モル比 0〜70%)

(c) 糖脂質類、ホスファチジルグリセロール類およびスフインゴミエリン類からなる群から選択される 1種以上の脂質（モル比 0〜40%)

(c，）糖脂質類の改変体、ホスファチジルグリセロール類の改変体およびスフィンゴミエリン類の改変体からなる群から選択される 1種以上の脂質改変体（モル比 0〜 40 %) 、

(d) ホスファチジン酸類、および長鎖アルキルリン酸塩からなる群から選択される 1種以上の脂質（モル比 0〜 30 %)

(e) ホスファチジルエタノールアミン類（モノレ比 0〜 30%) および

(e，）ホスファチジルエタノールアミン類改変体（モル比 0〜30%) からなるリボソームを含み得る。例えば、このリボソームは、ジパルミトイルホスファチジノレコリン、コレステロ一ノレ、ガングリオシド、ジセチノレホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリゥムを、 3 5 : 40 : 1 5 : 5 : 5 : 1 6 7の割合で含み得る。このリボソームには、さらに（f ) 負電荷の界面活性剤が含まれ得る。負電荷の成分をリボソームに含ませることにより、負電荷を帯びている細胞にリボソームが取り込まれにくくなり、その結果、血管内皮細胞等への非特異的な吸着を阻止できると考えられるからである。

このリボソームにおいて、該（c') 脂質改変体は、糖脂質類、ホスファチジルグリセロール類およびスフインゴミエリン類からなる群から選択される 1種以上の脂質が、血清アルブミン基一 A—リンカータンパク質架橋基一 X— S L X基と C H ₂— N H結合したものであり、ここで、該 Aは、 N H— C (= 0) 結合であり、該 Xは、 C (= 0) 一 NH結合であり得る。理論に束縛されないが、上記構成をとれば、本発明の医薬組成物が、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態（例えば、虚血性脳疾患、虚血性脳障害または脳虚血状態など）を治療または予防できるという効果を達成できることは、本明細書の記載から理解されるように、血中に存在する血清アルブミンをリポソーム表面に結合させることによって、リボソームの血中での安定性およびステルス性を高め、血中滞留性を向上することで疾患部位への集積性も向上するからであり、また、血清アルブミン上に架橋剤を介して糖鎖を結合させることによって、立体障害が少ない状態で S L X基をリボソーム表面に提示させることができるので、 S L X基の機能を阻害することがないからである。

このリボソームにおいて、該（e，）改変体は、ホスファチジルエタノールァミンが、親水性化合物架橋基一 W—トリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基と N H— C ( = 0) 結合したものであり、ここで、該 Wは、 C (= 0) — N H結合であり得る。ここで、該 S L X基は、該リボソームの表面に存在し得る。本発明において使用されるリボソームは、トリス（ヒドロキシメチル）メチルァミノ基により親水性化されたリボソームは、血中で親水性化していないものに比ベて安定でステルス性も高く、それによつて、血中滞留性が向上することで疾患部位への集積も向上すること、さらに、 S L X基がリボソームの表面に存在することにより、血管内皮に存在するセレクチンとの結合が容易になることから、この形態をとることが好ましい。

1つの実施形態において、本発明の医薬組成物において使用され得るリンカータンパク質架橋基としては、例えば、ビス（スルホスクシンィミジル）グルテ一ト一 d。基、ビス（スルホスクシンィミジル） 2， 2 , 4， 4一グルタレート一基、ビス（スルホスクシンィミジル）スべレート基、ビス（スルホスクシンィミジル）スベレートー d。基、ビス（スルホスクシンィミジル） 2 , 2 , 7， 7—スべレート一 d ₄基、ビス（2— [スクシンイミドキシカルボニルォキシ] ェチル）スルホン基、ジスクシンィミジルグルタレート、ジォチオピス（スクシンィミジルプロピオネート）基、ジスクシンイミジルスべレート基、ジスクシンィミジルタータレート基、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）基、スルホジスクシンィミジルタータレート基、エチレングリコールビス

(スルホースクシンィミジルスクシネート）基、トリス一（スクシンィミジル）アミノトリステート）基が挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、血清アルブミンのァミノ基と糖鎖のァミノ基とを架橋できさえすれば、どのような架橋基であってもよいからである。

1つの実施形態において、本発明の医薬組成物において使用され得る親水性化合物架橋基は、例えば、ビス（スルホスクシンィミジル）グルテ一トー d。基、ビス（スルホスクシンィミジル） 2 , 2 , 4， 4—グルタレート一 d ₄基、ビス (スノレホスクシンイミジノレ）スベレートー d。基、ビス（スノレホスクシンイミジル） 2， 2， 7， 7—スベレートー d ₄基、ビス（2— [スクシンイミドキシ力ノレボニノレオキシ] ェチノレ）スノレホン基、ジスクシンイミジノレグ^/タレート、ジスクシンイミジルスべレート、ジスクシンィミジルタータレート基、エチレングリコーノレビス（スクシンイミジノレスクシネート）基、エチレングリコールビス（スルホ一スクシンイミジルスクシネート）基、トリスー（スクシンィミジルァミノトリステート）基が挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、親水性化合物基とリボソームまたはリンカ一タンパク質との間にペプチド結合を形成させることができさえすれば、どのような架橋剤であつてもよいからである。

1つの実施形態において、本発明の医薬組成物において使用されるリボソームは、ガンダリオシドを含み得る。

1つの実施形態において、本発明の医薬組成物において使用されるリポソームは、さらに、（g ) 生体適合性緩衝液を含み得る。この（g ) 生体適合性緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS) 、生理食塩水、トリス緩衝液、炭酸緩衝液（CBS) 、トリス（ヒドロキシメチル）メチルァミノプロパンスルホン酸緩衝液 (TAPS) 、 2 - [4— (2—ヒドロキシルェチル）一 1 ーピぺラジュル] エタンスルホン酸（HEPES) 、その他のダット緩衝液（例えば、 2—モルホリノエタンスルホン酸，モノヒドレート（MES) 、ビス（2 —ヒドロキシェチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（B i s— t r i s ) 、 N— （2—ァセトアミド）ィミノ二酢酸（ADA) 、 1 , 3—ビス [トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ] プロパン（B i s— t r i sプロパン）、ピぺラジン一 1， 4一ビス（2—エタンスルホン酸）（P I PES) 、 N - (2—ァセトアミド）一 2—アミノエタンスルホン酸（ACES) 、コラミンクロリド、 N， N—ビス（2—ヒドロキシェチル）一 2—アミノエタンスルホン酸（BES) 、 3—モルホリノプロパンスルホン酸（MOP S) 、 N—トリス (ヒドロキシメチル）メチル一 2—アミノエタンスルホン酸（TES) 、 N— (2—ヒドロキシェチル）ピぺラジン一 N，一3—プロパンスルホン酸（HEP P S) 、 N— [トリス（ヒドロキシメチル）メチル] グリシン（T r i c i n e) 、アミノアセトアミド（グリシンアミド）、 N, N—ビス（2—ヒドロキシェチル）グリシン（B i c i n e) 、 N—シク口へキシルー 2—アミノエタンスルホン酸（CHES) および N—シクロへキシル一 3—ァミノプロパンスルホン酸（CAPS) ) が挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、リポソ一ムに含まれる緩衝液は、生体に害を与えないものであれば良いからである。別の実施形態において、本発明の医薬組成物は、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、直接投与、経口投与され得るが、これらに限定されない。

(診断用組成物）

他の局面において、本発明は、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態を診断するための診断用組成物を提供する。この診断用組成物は、 A) 親水性化されたリボソームと、 B ) シァリルルイス X ( S L X) または S L X基と、 C ) 標識物質とを含む。本発明の診断用組成物において使用されるリボソームは、上述の（医薬組成物）に記載される任意の形態が使用され得る。

本発明の診断用組成物は、リポソ一ムに高濃度の標識物質を含ませることにより、より多くの標識物質を標的部位に送達することができ、結果として、より感度の高い画像診断を可能とするという顕著に有利な効果を有する。

1つの実施形態において、本発明の診断用組成物は、磁気共鳴画像法において使用され得る。例えば、本発明の診断用組成物は、磁気共鳴画像法により脳虚血を診断するために使用され得る。この場合、診断用組成物は、標識物質として、例えば、常磁性の金属（例えば、ガドリニウム、鉄など）、造影剤（例えば、酸化鉄粒子、ガドリニウムキレート剤、硫酸バリウム、水溶性ョードなど）を含み得るが、これらに限定されない。なぜなら、標識物質は、磁気共鳴画像法において組成物を検出可能な状態にし得るものでありさえすればよいからである。本発明の診断用組成物は、磁気共鳴画像法において良好なコントラストを提供することができる。本発明の診断用組成物は、標識物質として、例えば、常磁性の酸化鉄粒子を用いて、当該分野において公知の任意のリボソーム作製方法（例えば、コール酸透析法）により製造することができる。

別の実施形態において、本発明の診断用組成物により診断される中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態は、例えば、虚血性脳疾患、虚血性脳障害または脳虚血状態であり得、好ましくは、脳虚血であり得るが、これに限定されない。これまで、心臓等での虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態を処置または予防する効果は知られていたが、中枢神経系での効果は心臓等からの結果からは予想することができない。その理由は以下のとおりである：心臓は、構成細胞も心筋細胞など中枢神経系とは異なる細胞であり、血液脳関門の構造がないため血管系の構造も異なるので、心臓の虚血現象に対しての保護効果を中枢神経系の虚血でも応用可能であるとは考えにくい。また、逆に、いったん大脳での実験結果が示されたならば、他の中枢神経系においても同様の効果を有することを当業者は理解する。その理由は以下のとおりである：脳および脊髄は血液脳関門があるため、血管系の構造も共通しており、細胞構成（神経細胞、グリア細胞）も共通している部分が多い。機能障害もまた、神経細胞障害によるという共通点がある。また、虚血後の炎症メカニズム等も共通の現象が報告されている。

1つの実施形態において、本発明の診断用組成物において使用される標識物質は、蛍光性、常磁性、放射 ½^、発光性、発色性を有し得るが、これらに限定されない。

例えば、蛍光 i4は、

<Cy5. 5>

<cy3>

c y 5、 c y 7、 c y 3 B、 c y 3. 5、 A l e x a F l u o r (登録商標） 3 50_N A 1 e x a F l u o r (登録商標） 488、 A l e x a F l u o r

(登録商標） 53 2、 A l e x a F l u o r (登録商標） 546、 A 1 e x a F l u o r (登録商標） 5 55、 A l e x a F l u o r (登録商標） 56 8、 A 1 e x a F l u o r (登録商標） 5 94、 A l e x a F l u o r (登録商標） 6 3 3、 A l e x a F l u o r (登録商標） 64 7、 A l e x a F l u o r (登録商標） 680、 A l e x a F l u o r (登録商標） 700、 A l e x a F l u o r (登録商標） 750、フルォレセイン— 4—イソチオシァネート（F I TC) およびユウ口ピウム含有標識ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される蛍光色素によって付与され得る。なぜなら、標識物質は、組成物を検出可能な状態にし得るものでありさえすればよいからである。

例えば、常磁性は、常磁性の金属（例えば、ガドリニウム、鉄など）、造影剤

(例えば、酸化鉄粒子、ガドリニウムキレート剤、硫酸バリウム、水溶性ョードなど）などによって付与され得るが、これらに限定されない。なぜなら、標識物質は、磁気共鳴画像法において組成物を検出可能な状態にし得るものでありさえすればよいからである。

別の実施形態において、前記中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態は、脳における虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態であり得る。

別の実施形態において、本発明の診断用組成物は、分子イメージングにより中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態（例えば、脳虚血）を診断するために使用され得る。

この分子イメージングでは、前記標識物質として、該分子イメージングによつて検出可能である物質が使用され得る。これらとしては、例えば、 c y 5. 5 (登録商標）、 c y 5 (登録商標）、 c y 7 (登録商標）、 c y 3 B (登録商標）、 c y 3. 5 (登録商標）、 A 1 e X a F l u o r (登録商標） 3 50、 A 1 e x a F l u o r (登録商標） 488、 A l e x a F l u o r (登録商標） 5 3 2、 A l e x a F l u o r (登録商標） 546、 A l e x a F l u

0 r (登録商標） 5 5 5、 A l e x a F l u o r (登録商標） 5 68、 A l e x a F l u o r (登録商標） 594、 A l e x a F l u o r (登録商標） 6 3 3、 A l e x a F l u o r (登録商標） 64 7、 A l e x a F l u o r

(登録商標） 6 80、 A l e x a F l u o r (登録商標） 700、 A 1 e x a F l u o r (登録商標） 7 50、フルォレセイン— 4一イソチオシァネート（F

1 TC) などが挙げられるが、これらに限定されない（c y 3、 c y 5. 5、 c y 5等は、 GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社から入手可能。 A l e x a F l u o r (登録商標）シリーズは、 I n V i t r o g e nから入手可能。）。なぜなら、リボソームに内包または結合させることができ、標的とする部位にリポソームが到達した場合に分子イメージングにより検出することができればよいからである。本発明において使用される標識物質は、周知文献、公知文献などに基づき、当業者が適宜選択し、調製または入手することができる。

好ましい実施形態において、前記標識物質は、蛍光物質であり得る。本発明による蛍光物質を含ませた診断用組成物を用いて蛍光ィメ一ジングを行うことにより、診断に必要な設備およびコストなどを従来よりも小さくすることができ、かつより短時間で中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態についての検査が可能となるという予想外に有利な効果が提供される。

1つの実施形態において、本発明の診断用組成物では、リボソームの表面に前記 S LX基が存在し得る。なぜなら、 S LX基がリボソームの表面に存在することにより、 S LX基と標的との結合が容易になるからである。

他の実施形態において、本発明の診断用組成物では、 S LXとリポソ一ムを構成する脂質とが、水素結合またはイオン結合で結合されていてもよく、前記 S L X基と前記脂質とが、共有結合で結合されていてもよい。好ましくは、前記 S L X基と前記脂質とは、共有結合で結合されている。リボソームに SLX基を含ませる場合であれば、リボソームと S LX基とを結合させることができれば、リポソームと S LX基とを固定することができるので、実施例において作られたような全ガンダリオシド抽出物を使用したものと同等またはそれ以上のリボソームと S LX基または S LXとの相乗効果を示すことが理解される。従って、どのような結合様式であっても、リボソームに S LX基を直接または間接に固定することができる限り、本発明におけるリボソームにおいて使用することができ、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害および虚血状態（例えば、虚血性脳疾患、虚血性脳障害および脳虚血状態）に対する診断効果を発揮すると考えられる。本発明において使用されるリボソームは、好ましくは、リボソーム上のガンダリオシドと血清アルブミン（例えば、 HSA) とがカップリングして、さらにこの血清アルブミンと S LX基とが架橋剤を介して結合され得る。理論に束縛されないが、血中での S LXの安定性を高め、かつ反応性を保持させた状態でありさえすれば、 S LXと脂質とは、結合せずに単に混ざっているだけの状態であってもよい。なぜなら、リボソームが親水性化されていることにより、血管内でのステルス性が保持されるので、リボソーム中の脂質と S LXとは結合していなくても、血中での S LXの安定性を高めることができるからである。本明細書において使用されるリボソームにおいて、修飾結合密度の上限は、血流中に存在することが予期される投与形態の場合、血管内でのステルス性を保持することができる程度の密度であればよい。なぜなら、修飾結合密度が高密度すぎるとステルス性が低下するからである。修飾結合密度の上限は、 500mg糖鎖/ mg脂質、またはそれより大きくてもよく、あるいは 10 Omg糖鎖/ mg 脂質、 1 001₈糖鎖 ₁11₈脂質、 5^₈糖鎖 1!1₈脂質、 lmg糖鎖Zmg脂質、 0. 9mg糖鎖/ mg脂質、 0. 8mg糖鎖 mg脂質、 0. 7mg糖鎖/ mg 脂質、 0. 6111₈糖鎖 111₈脂質、 0. 5111_§糖鎖 111₈脂質、 0. 4 m g糖鎖 mg脂質、 0. 3111₈糖鎖 111₈脂質、 0. 2111₈糖鎖 1118脂質、 0. lm g糖鎖/ mg脂質、 0. 09111_§糖鎖 111 _§脂質、 0. 08 m g糖鎖/ m g脂質、

0. 07!!18糖鎖ノ1118脂質、 0. 06111 _§糖鎖/₁11₈脂質、 0. 05 m g糖鎖 Zmg脂質、 0. 04mg糖鎖 mg脂質、 0. 03 m g糖鎖 g脂質、 0. 029mg糖鎖 Zmg脂質、 0. 028 m g糖鎖ノ m g脂質、 0. 027mg糖鎖/ mg脂質、 0. 026mg糖鎖 Zmg脂質、 0. 025 m g糖鎖 m g脂質であり得る。

修飾結合密度の下限は、標的部位に少なくとも一部が局在的に集積するようにと結合（S LXが血管内を転がる程度の弱い結合も含める）できる程度の密度であればよレ、。なぜなら、セレクチンと結合できなければ、白血球とセレクトンとの結合を阻害することができないからである。修飾結合密度の下限は、例えば、 0. 000 lmg糖鎖 Zmg脂質、またはそれより小さくてもよく、あるいは、

0. 005mg糖質/ mg脂質、 0. 0025糖質 Zmg脂質、 0. 002mg 糖鎖/ mg脂質、 0. 001 mg糖質 Zmg脂質、 0. 09mg糖質/mg脂質、 0. 08 m g糖鎖 m g脂質、 0. 07 m g糖質 Zm g脂質、 0. 06 m g糖質 Zmg脂質、 0. 05mg糖質/ mg脂質、 0. 04 m g糖鎖 Zm g脂質、 0. 03 m g糖質/ m g脂質、 0. 029 m g糖質 Zm g脂質、 0. 028 m g糖質

/m g脂質、 0. 027 m g糖質/ m g脂質、 0. 026 m g糖質 Zm g脂質、 0 . 0 2 5 m g糖鎖 Zm g脂質であり得る。従って、本発明において使用されるリボソームとしては、上記の任意の上限と、任意の下限とを組み合わせた密度範囲（例えば、 5 0 O m g糖鎖 Zm g脂質〜 0 . 0 0 0 1 m g糖鎖 g脂質）のものを使用することができる。理論に束縛されないが、本発明の医薬組成物は、ステルス性を少なくとも一定程度維持し、標的部位（例えば、炎症部位）に集積することができれば、診断効果を期待されるからである。従って、上記の修飾結合密度の上限および下限の任意の組合せの範囲において、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害および虚血状態（例えば、虚血性脳疾患、虚血性脳障害、脳虚血状態）を診断できるという効果を達成できる。なぜなら、これらの範囲では、リポソ一ムは血中で安定であり、 S L X基がセレクチンと結合することができるからである。

1つの実施形態において、前記親水性化は、水酸基が多く存在し、アミノ基を持つ基、例えば、トリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基（例えば、トリス（ヒドロキシメチル）メチルァミノ基、トリス（ヒドロキシメチル）ェチルアミノ基、トリス（ヒドロキシェチル）ェチルァミノ基、トリス（ヒドロキシプ口ピル）ェチルァミノ基、トリス（ヒドロキシメチル）メチルァミノ基、トリス (ヒドロキシェチル）メチルァミノ基、トリス（ヒドロキシプロピル）メチルァミノ基、トリス（ヒドロキシメチル）プロピルアミノ基、トリス（ヒドロキシェチル）プロピルアミノ基、トリス（ヒドロキシプロピル）プロピルアミノ基など）によって付与され得る。この親水性化は、上記以外のものにより付与されてもよい。なぜなら、血管内でのステルス性をリボソームに保持させる程度の親水性度を付与できさえすればよいからである。

1つの実施形態において、本発明の診断用組成物において使用されるリポソ一ムを構成する脂質の一部は、親水性化合物架橋基 W—トリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基と N H— C ( = 0) 結合しており、ここで、該 Wは、 C ( = 0) —N H結合であり得る。好ましくは、トリス（ヒドロキシアルキル）了ルキルアミノ基は、トリス（ヒドロキシメチル）メチルァミノ基であり得る。理論に束縛されないが、本発明の診断用組成物は、上記構成をとれば、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態（例えば、虚血性脳疾患、虚血性脳障害、脳虚血状態など）を診断できるという効果を達成できることは、本明細書の記載から理解されるように、トリス（ヒドロキシメチル）メチルァミノ基により親水性化されたリボソームは、血中で親水性化していないものに比べて安定でステルス性も高く、それによつて、血中滞留性が向上し、血液中のリボソーム濃度が低下しにくくなり、疾患部位への集積も向上するからである。また、虚血に伴い血管内皮細胞に産生されるセレクチンと白血球の接着を競合的に阻害し、その結果、白血球の中枢神経系（例えば、脳実質）への浸潤や炎症惹起作用、血栓形成作用を抑制し、虚血に伴う組織障害過程を抑制することが可能と考えられるからである。

1つの実施形態において、本発明の診断用組成物では、前記リボソームと前記 S L X基とは、血清アルブミン基（例えば、ヒト血清アルブミン基）を介して結合していてもよい。理論に束縛されないが、本発明の診断用組成物では、血清ァルブミン基を介してリボソームと S L X基とを結合させれば、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態（例えば、虚血性脳疾患、虚血性脳障害、脳虚血状態など）を診断できるという効果を達成できることは、本明細書の記載から理解されるように、血中に存在する血清アルブミンをリポソーム表面に結合させることによって、リボソームの血中での安定性およびステルス性を高め、血中滞留性を向上することで炎症部位への集積性も向上するからである。また、虚血に伴い血管内皮細胞に産生されるセレクチンと白血球の接着を競合的に阻害し、その結果、白血球の中枢神経系（例えば、脳実質）への浸潤や炎症惹起作用、血栓形成作用を抑制し、虚血に伴う組織障害過程を抑制することが可能と考えられるからである。 1つの実施形態において、本発明の診断用組成物では、前記リボソームを構成する脂質の一部は、血清アルブミン基一 A—リンカ一タンパク質架橋基一 X— S LX基と CH₂— NH結合していてもよく、ここで、該 Aは、 NH— C (=0) 結合であり、該 Xは、 C ( = 0) 一 NH結合であり得る。血清アルブミン基は、例えば、ヒト血清アルブミン基であり得る。理論に束縛されないが、上記構成をとれば、本発明の診断用組成物が、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態（例えば、虚血性脳疾患、虚血性脳障害、脳虚血状態など）を診断できるという効果を達成できることは、本明細書の記載から理解されるように、血中に存在する血清アルブミンをリポソーム表面に結合させることによって、リポソ一ムの血中での安定性およびステルス性を高め、血中滞留性を向上することで疾患部位への集積性も向上するからであり、また、血清アルブミン上に架橋剤を介して糖鎖を結合させることによって、立体障害が少ない状態で S LX基をリポソーム表面に提示させることができるので、 S LX基の機能を阻害することがないからである。また、虚血に伴い血管内皮細胞に産生されるセレクチンと白血球の接着を競合的に阻害し、その結果、白血球の中枢神経系（例えば、脳実質）への浸潤や炎症惹起作用、血栓形成作用を抑制し、虚血に伴う組織障害過程を抑制することが可能と考えられるからである。

1つの好ましい実施形態において、本発明の診断用組成物は、

(a) ホスファチジルコリン類（モル比 0〜70%)

(b) コレステロール類（モル比 0〜70%)

(c ' ) 糖脂質類の改変体、ホスファチジルグリセロール類の改変体およびスフィンゴミエリン類の改変体からなる群から選択される 1種以上の脂質改変体（モル比 0〜 40。）、

(d) ホスファチジン酸類、および長鎖アルキルリン酸塩からなる群から選択される 1種以上の脂質（モル比 0〜30%)

(e) ホスファチジルエタノールアミン類（モル比 0〜30%) および

(e，）ホスファチジルエタノールアミン類改変体（モル比 0〜30%) からなるリボソームを含み得る。例えば、このリボソームは、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガンダリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミンおよびコール酸ナトリゥムを、 35 : 40 : 15 : 5 : 5 : 167の割合で含み得る。このリボソームには、さらに（f ) 負電荷の界面活性剤が含まれ得る。負電荷の成分をリボソームに含ませることにより、負電荷を帯びている細胞にリボソームが取り込まれにくくなり、その結果、血管内皮細胞等への非特異的な吸着を阻止できると考えられるからである。

1つの実施形態において、このリボソームには、虚血を診断するため物質として、（h) 標識物質が内包され得る。

上記リボソームにおいて、該（c') 脂質改変体は、糖脂質類、ホスファチジルグリセ

ロール類およびスフインゴミエリン類からなる群から選択される 1種以上の脂質が、血清アルブミン基一 A—リンカータンパク質架橋基一 X— S LX基と CH₂ 一 NH結合したものであり、ここで、該 Aは、 NH— C ( = 0) 結合であり、該 Xは、 C ( = 0) — NH結合であり得る。理論に束縛されないが、上記構成をとれば、本発明の診断用組成物が、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態（例えば、虚血性脳疾患、虚血性脳障害、脳虚血状態など）を診断できるという効果を達成できることは、本明細書の記載から理解されるように、血中に存在する血清アルブミンをリボソーム表面に結合させることによって、リポソ一ムの血中での安定性およびステルス性を高め、血中滞留性を向上することで疾患部位への集積性も向上するからであり、また、血清アルブミン上に架橋剤を介して糖鎖を結合させることによって、立体障害が少ない状態で S L X基をリポソ一ム表面に提示させることができるので、 S L X基の機能を阻害することがないからである。

上記リボソームにおいて、該（e，）改変体は、ホスファチジルエタノールァミンが、親水性化合物架橋基— W— トリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基と N H— C (= 0) 結合したものであり、ここで、該 Wは、 C (= 0) 一 N H結合であり得る。ここで、該 S L X基は、該リボソームの表面に存在し得る。本発明において使用されるリボソームは、トリス（ヒドロキシメチル）メチルァミノ基により親水性化されたリボソームは、血中で親水性化していないものに比ベて安定でステルス性も高く、それによつて、血中滞留性が向上することで疾患部位への集積も向上すること、さらに、 S L X基がリボソームの表面に存在することにより、血管内皮に存在するセレクチンとの結合が容易になることから、この形態をとることが好ましい。

1つの実施形態において、本発明の診断用組成物において使用されるリンカータンパク質架橋基としては、例えば、ビス（スルホスクシンィミジル）グルテ一トー d。基、ビス（スルホスクシンィミジル） 2， 2， 4， 4—グルタレート一 d ₄基、ビス（スルホスクシンィミジル）スべレート基、ビス（スルホスクシンィミジル）スベレートー d。基、ビス（スルホスクシンィミジル） 2 , 2， 7 , 7—スべレート一 d ₄基、ビス（2— [スクシンイミドキシカルボニルォキシ] ェチル）スルホン基、ジスクシンィミジルグルタレート、ジォチオピス（スクシンィミジルプロピオネート）基、ジスクシンイミジルスべレート基、ジスクシンィミジルタータレート基、エチレングリコーノレビス（スクシンイミジルスクシネート）基、スルホジスクシンィミジルタータレート基、エチレングリコールビス

(スルホースクシンィミジルスクシネート）基、トリスー（スクシンィミジル）ァミノトリステート）基が挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、血清アルブミンのァミノ基と糖鎖のアミノ基とを架橋できさえすれば、どのような架橋基であってもよいからである。 1つの実施形態において、本発明の診断用組成物において使用される親水性化合物架橋基は、例えば、ビス（スルホスクシンィミジル）グルテ一ト— d。基、ビス（スルホスクシンィミジル） 2， 2， 4， 4—グルタレート一 d₄基、ビス (ス^/ホスクシンイミジノレ）スべレート一 d。基、ビス（スノレホスクシンイミジル） 2， 2， 7, 7—スべレート一 d₄基、ビス（2— [スクシンイミドキシ力ノレボ-ノレオキシ] ェチノレ）スノレホン基、ジスクシンイミジノレグノレタレート、ジスクシンイミジルスべレート、ジスクシンィミジルタータレート基、エチレングリコーノレビス（スクシンイミジノレスクシネート）基、エチレングリコー^/ビス（スルホースクシンィミジルスクシネート）基、トリス一（スクシンィミジルァミノトリステート）基が挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、親水性化合物基とリボソームまたはリンカ一タンパク質との間にペプチド結合を形成させることができさえすれば、どのような架橋剤であってもよいからである。

1つの実施形態において、本発明の診断用組成物において使用されるリポソ一ムは、さらに、（g) 生体適合性緩衝液を含み得る。この（g) 生体適合性緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（PB S) 、生理食塩水、トリス緩衝液、炭酸緩衝液（C B S ) 、トリス（ヒドロキシメチル）メチルァミノプロノンスルホン酸緩衝液（TAPS) 、 2— [4— (2—ヒドロキシルェチル）一 1—ピぺラジュル] エタンスルホン酸（HE PE S) 、その他のダット緩衝液 (例えば、 2—モルホリノエタンスルホン酸，モノヒドレート（MES) 、ビス (2—ヒドロキシェチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（B i s— t r i s) , N- (2—ァセトアミド）ィミノ二酢酸 (ADA) 、 1， 3—ビス [トリス（ヒドロキシメチル）メチルァミノ] プロパン（B i s— t r i sプロパン) 、ピぺラジン一 1， 4—ビス（2—エタンスルホン酸）（P I PES) 、 N— (2—ァセトアミド）一 2—アミノエタンスルホン酸（ACES) 、コラミンクロリド、 N， N—ビス（2—ヒドロキシェチル）一2—アミノエタンスルホン酸（BES) 、 3—モルホリノプロパンスルホン酸（MOP S) 、 N— トリス (ヒドロキシメチル）メチル一 2—アミノエタンスルホン酸（T E S ) 、 N— ( 2—ヒドロキシェチル）ピぺラジン一 N，一3—プロパンスルホン酸（H E P P S ) 、 N— [トリス（ヒドロキシメチル）メチル] グリシン（T r i c i n e ) 、アミノアセトアミド（グリシンアミド）、 N， N—ビス（2—ヒドロキシェチル）グリシン（B i c i n e ) 、 N—シク口へキシル一 2—アミノエタンスルホン酸（C H E S ) および N—シクロへキシルー 3—ァミノプロパンスルホン酸（C A P S ) ) が挙げちれるが、これらに限定されない。なぜなら、リポソ一ムに含まれる緩衝液は、生体に害を与えないものであれば良いからである。別の実施形態において、本発明の診断用組成物は、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、直接投与、経口投与され得るが、これらに限定されない。

(処置または予防するための方法）

別の局面において、本発明は、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態を処置または予防するための方法を提供する。本方法は、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態を処置または予防する必要のある患者に、有効量の本発明の医薬組成物を投与する工程を包含する。ここで医薬組成物は、上述の（医薬組成物）などに記載される任意の形態が使用され得る。

1つの実施形態において、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態は、虚血性脳疾患、虚血性脳障害または脳虚血状態であり得るが、これらに限定されない。これまで、心臓等での虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態を処置または予防する効果は知られていたが、中枢神経系での効果は心臓等からの結果からは予想することができない。その理由は以下のとおりである：心臓は、構成細胞も心筋細胞など中枢神経系とは異なる細胞であり、血液脳関門の構造がないため血管系の構造も異なるので、心臓の虚血現象に対しての保護効果を中枢神経系の虚血でも応用可能であるとは考えにくい。また、逆に、いったん大脳での実験結果が示されたならば、他の中枢神経系においても同様の効果を有することを当業者は理解する。その理由は以下のとおりである：脳および脊髄は血液脳関門があるため、血管系の構造も共通しており、細胞構成（神経細胞、グリア細胞）も共通している部分が多い。機能障害もまた、神経細胞障害によるという共通点がある。また、虚血後の炎症メカニズム等も共通の現象が報告されている。

(虚血部位を検出するための方法）

別の局面において、本発明は、中枢神経系の虚血部位を検出するための方法を提供する。この方法は、中枢神経系の虚血部位を検出する必要のある患者に、有効量の本発明の診断用組成物を投与する工程；および該患者において、該診断用組成物に含まれる標識物質を磁気共鳴画像法により測定し、該標識物質の存在は、該患者に中枢神経系の虚血部位があることを示す工程を包含する。ここで、診断用組成物は、上述の（診断用組成物）などに記載される任意の形態が使用され得る。

1つの実施形態において、中枢神経系の虚血部位は、脳虚血部位であり得るが、これらに限定されない。これまで、心臓等での虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態を処置または予防する効果は知られていたが、中枢神経系での効果は心臓等からの結果からは予想することができない。その理由は以下のとおりである：心臓は、構成細胞も心筋細胞など中枢神経系とは異なる細胞であり、血液脳関門の構造がないため血管系の構造も異なるので、心臓の虚血現象に対しての保護効果を中枢神経系の虚血でも応用可能であるとは考えにくレ、。また、逆に、いったん大脳での実験結果が示されたならば、他の中枢神経系においても同様の効果を有することを当業者は理解する。その理由は以下のとおりである：脳および脊髄は血液脳関門があるため、血管系の構造も共通しており、細胞構成（神経細胞、グリア細胞）も共通している部分が多い。機能障害もまた、神経細胞障害によるという共通点がある。また、虚血後の炎症メカニズム等も共通の現象が報告されている。 (使用)

さらなる局面において、本発明は、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態を処置、予防、検出または診断するための医薬の製造における、シァリルルイス X (S LX) の使用を提供する。ここで、 S LXは、 Ne u 5Ac c 2， 3 G a 1 i3 1 , 4 (F u c α 1 , 3) G l c NAcである。

1つの実施形態において、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態は、虚血性脳疾患、虚血性脳障害または脳虚血状態であり得るが、これらに限定されない。これまで、心臓等での虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態を処置または予防する効果は知られていたが、中枢神経系での効果は心臓等からの結果からは予想することができない。その理由は以下のとおりである：心臓は、構成細胞も心筋細胞など中枢神経系とは異なる細胞であり、血液脳関門の構造がないため血管系の構造も異なるので、心臓の虚血現象に対しての保護効果を中枢神経系の虚血でも応用可能であるとは考えにくレ、。また、逆に、いったん大脳での実験結果が示されたならば、他の中枢神経系においても同様の効果を有することを当業者は理解する。その理由は以下のとおりである：脳および脊髄は血液脳関門があるため、血管系の構造も共通しており、細胞構成（神経細胞、グリア細胞）も共通している部分が多い。機能障害もまた、神経細胞障害によるという共通点がある。また、虚血後の炎症メカニズム等も共通の現象が報告されている。 (細胞内に目的の物質を送達するためのキャリア）

1つの局面において、本発明は、細胞内に目的の物質を送達するためのキヤリァを提供する。このキャリアは、

A) 親水性化されたリボソームと、

B) シァリルルイス X (S LX) または S LX基と、

C) 目的物質

とを含み得る。 1つの実施形態において、前記細胞は、 Eセレクチンを発現している細胞であり得る。

1つの実施形態において、前記目的物質は、例えば、蛍光物質（例えば、 c y 5. 5、 c y 5、 c y 7、 c y ^ B e y s. 5、 A 1 e x a F l u o r ( 録商標） 3 50、 A l e x a F l u o r (登録商標） 488、 A l e x a F 1 u o r (登録商標） 5 3 2、 A l e x a F l u o r (登録商標） 546、 A 1 e x a F l u o r (登録商標） 5 5 5、 A l e x a F l u o r (登録商標） 5 68、 A l e x a F l u o r (登録商標） 5 94、 A l e x a F l u o r (登録商標） 63 3、 A l e x a F l u o r (登録商標） 64 7、 A l e x a F l u o r (登録商標） 680、 A l e x a F l u o r (登録商標） 7

00, A 1 e x a F l u o r (登録商標） 7 50、フルォレセイン一 4—ィソチオシァネート（F I TC) 、ユウ口ピウム含有標識、 3， 8—ジァミノ— 5— ェチル— 6—フエユルフェナントリジニゥムブロミド（ェチジゥムブロマイド）、 2， - (4—エトキシフエニル）一 5— (4—メチルー 1ーピペラジ-ル） - 2, 5，一ビ 1 H— (へキスト 33342) 、 2， - ( 4 ヒドロキシフエニル） -

5— (4—メチル 1—ピペラジエル）一 2， 5，一ビー 1 H ベンゾイミダゾール，三塩酸塩（へキスト 3 3 258) 、 P I、 3， 6 ビス（ジメチルアミノ）ァクリジン塩酸塩（プロビジゥムィオダイド）、 4，， 6—ジアミジノ一 2 —フエニルインドール，二塩酸塩（DAP I ) 、 3， 6—ビス（ジメチルアミノ）ァクリジン塩酸塩（ァクリジンオレンジ、 AO) 、 5— （N スクシンイミジルォキシカルボニル） — 3，， 6， -0, 0， —ジァセチルフルォレセイン (CF S E) 、 6— （N スクシンィミジルォキシカルボニル） - 3 ' , 6， - ト（FDA) 、 3，， 6 ' —ジ（O ァセチル） 4，， 5， —ビス [N， N— ビス（カルボキシメチル）アミノメチル] フルォレセイン，テトラァセトキシメチルエステノレ（C a 1 c e i n - AM) 、 7 イソブチルォキシカルボニノレオキシ— 3 H—フエ-キサジン一 3—オン（Cy t o R e d) 、 3， — O—ァセチル — 2' ， 7， _ビス（カルボキシェチル）一 4—カルボキシフルォレセイン，ジァセトキシメチルエステル（BCECF— AM) 、 3， —O—ァセチルー 2，， 7 ' —ビス（カルボキシェチル）一 5—カルボキシフルォレセイン，ジァセトキシメチルエステル（BCECF—AM) など）、蛍光タンパク質（例えば、 GF P, CFP, YF Pなど）、発光酵素（例えば、ルシフェラーゼなど）、タンパク質（例えば、抗体、 t ΡΑ、 β—ガラクトシダーゼ、 RNa s e、アルブミンボツリヌス毒素、ジフテリアトキシンなど）、錯体（例えば、 G d錯体、 F e錯体など）、コロイド（例えば、金コロイドなど）、難水溶性薬物（例えば、シスブラチン、メチルプレドニゾロン、パクリタキセルなど）、水溶性薬物（例えばプラバスタチン、リン酸プレドニゾロン、ファスジルなど）、核酸（例えば、プラスミド DNA、 S i RNA、 m i RNAなど）などが挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、目的物質としては、リボソームに内包されることができ、標的とする部位に送達された場合に細胞内において物質単体として機能することができればよいからである。

1つの実施形態において、目的物質は、リボソームから出て、物質単体で機能していることが確認できる物質であり得る。これらとしては、例えば、細胞内小器官等とインターカレーシヨンすることによってある波長の蛍光を発するものであったり、細胞内で加水分解されて蛍光を発するもの等が挙げられ得る。これらとしては、例えば、以下：

3， 8—ジアミノー 5—ェチルー 6—フエユルフェナントリジニゥムブロミド (ェチジゥムブロマイド）、

2 ' 一（4一エトキシフエニル）一 5— （4ーメチルー 1—ピペラジニル） - 2, 5 ' ービ 1 H— (へキスト 3 3 34 2) 、

2' - (4—ヒドロキシフエニル）一 5— (4—メチル一 1ーピペラジニル）一

2, 5 ' —ビ— 1 H—ベンゾィミダゾール，三塩酸塩（へキスト 3 3 2 5 8 ) 、 P I、 3， 6—ビス（ジメチルァミノ）アタリジン塩酸塩（プロビジゥムィオダイド）、 4，， 6—ジアミジノ一 2—フエニルインドール，二塩酸塩 (DAP I) 、

3， 6—ビス（ジメチルァミノ）アタリジン塩酸塩（ァクリジンオレンジ、 A O) 、

5— (N—スクシンィミジルォキシカルボ二ノレ） - 3 ' ， 6， -0, 0，一ジァセチルフルォレセイン、または 6— （N—スクシンィミジルォキシカルボ-ル） — 3，， 6 ' —0， 0，ージァセチルフルォレセイン（CFSE) 、 3，， 6，一ジ（O—ァセチル）一4，， 5，一ビス [N， N—ビス（カルボキシメチル）アミノメチル] フルォレセイン，テトラァセトキシメチルエステル (C a 1 c e i n - AM) 、

7—ィソブチルォキシカルボ-ルォキシ一 3 H—フエニキサジン一 3—オン（C y t oRe dノ、

3，一O—ァセチノレ一 2，， 7，一ビス（カノレボキシェチノレ）一4—力ノレボキシフノレォレセイン，ジァセトキシメチ^/エステノレ、または 3' — 0_ァセチ ^— 2，， 7，一ビス（カルボキシェチル） _ 5—カルボキシフルォレセイン，ジァセトキシメチルエステル（BCECF— AM)

などであり得るが、これらに限定されない。

ここで、親水性化されたリボソーム、シァリルルイス X (S LX) 、 S LX基は、上述の（医薬組成物）、（診断用組成物）などに記載される任意の形態が使用され得る。

本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。以下、実施例により、本発明の構成をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。以下において使用した試薬類は、特に言及した場合を除いて、市販されているものを使用した。実施例

(実施例 1. シァリルルイス X (S LX) で修飾した蛍光内包型リボソームの調製）

(c y 3および c y 5. 5標識ヒト血清アルブミン溶液の調製）

蛍光色素として、 3または。 5. 5を用いた。 c y 3は、 GEヘルスケァバイオサイエンス株式会社から、品番： PA13102、製品名： CY3 MONO NHS

ESTER 50MGを入手した。 c y 5. 5は、 G Eヘルスケアバイオサイエンス株式会社力ら、品番： PA15602、製品名： CY5.5 MONO NHS ESTER 50MGを入手した。ヒト血清アルブミン —トリス（ヒドロキシメチル）一 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液（pH8. 4) 溶液（l OmgZm l) 、 (2m l ) に、 c y 3/ N—トリス（ヒドロキシメチル）一 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液（pH 8. 4) 溶液（2mgZm 1 ) または c y 5. 5 ZN—トリス（ヒドロキシメチル）一 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液（ρΗ8· 4) 溶液（2mg/m 1 ) 、各 lm lを混合して、 37°Cで 3時間撹拌した。この混合溶液を、分画分子量 10， 000、 N—トリス（ヒドロキシメチル）一3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液（pH8. 4) 溶液で限外濾過し、遊離の蛍光色素を除去し、蛍光標識した標識ヒト血清アルブミン溶液を調製した。

リボソームは既報の手法（Yamazaki, N.， Kodama, M. and Gabius, H. - J. (1994) Methods Enzymol. 242, 56-65) により、改良型コール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルホスフェート、ガンダリオシド（Total Ganglioside Extract (脳、ブターアンモニゥム塩）販売元： A V a n t i、カタログ番号： 100232 (8 60053 P) ) およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ 35 : 40 : 5 : 15 : 5の割合で合計脂質量 45. 6mgになるように混合し、コール酸ナトリウム 46. 9mgを添加し、クロ口ホルム Zメタノール（1 ： 1) 溶液 3m lに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜を TAPS緩衝生理食塩液（pH8. 4) 3m lに再懸濁し、 37 °Cで 1時間攪拌した。次いで、この溶液を窒素置換し、超音波処理し、透明なミセル懸濁液 3 m 1を得た。この超音波処理したミセル懸濁液に HS A緩衝液 (pH8. 4) で 0. 2mgZl m lになるよう完全に溶解した蛍光標識 HS A溶液を撹拌しながらゆつくりと滴下して均一に混合した後、この蛍光色素入りミセル懸濁液を PM10膜（Am i c o n C o. ， USA) と TAP S緩衝生理食塩液（pH8. 4) を用いた限外濾過 (分画分子量： 10， 000) にかけ均一な蛍光色素（じ 3または： 75. 5) を内包するリボソーム粒子懸濁液各 10m 1を調製した。

得られた生理食塩懸濁液中（37°C) の蛍光色素を内包するリボソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位 ·粒子径 ·分子量測定装置（Model Nano ZS， Malvern Instruments Ltd,, UK) により測定した。その結果、 c y 3を内包したリボソームでは、粒子径は約 50 nm〜約 300 nm、ゼータ電位は一 30〜一 1 20mVであり、 c y 5. 5を内包したリボソームでは、粒子径は約 50 n m 〜約 300 nm, ゼータ電位は— 30 1 2 OmVであった。

(蛍光色素を内包するリポソーム脂質膜面上の親水性化処理）

本実施例で調製した蛍光色素（じ 3または。 5. 5) を内包するリポソ一ム溶液各 10m lを、 XM300膜（Am i c o n C o. ， USA) と炭酸緩衝液（pH 8. 5) を用いた限外濾過（分画分子量： 300， 000) にかけ溶液の pHを 8. 5にした。次に、架橋試薬ビス（スルホスクシンィミジル）スベレート（BS³; Pierce Co. , USA) l Omgを加え、室温で 2時間攪拌した。その後、さらに 7°Cで一晩攪拌してリボソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールァミンと B S ³との化学結合反応を完結した。そして、このリボソーム液を XM300膜と炭酸緩衝液 (pH 8. 5) で限外濾過（分画分子量： 300， 000) にかけた。次に、炭酸緩衝液（pH 8. 5) 1m lに溶かしたトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン 4 Omgをリボソーム液 10 m lに加えた。次いで、この溶液を、室温で 2時間攪拌後、冷蔵下で一晩攪拌し、分画分子量 300， 000で限外濾過し、遊離のトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液を N—トリス（ヒドロキシメチル）一3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液（pH8. 4) に交換し、リボソーム膜上の脂質に結合した B S ³とトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンとの化学結合反応を完結した。これにより、リボソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールァミン上にトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンの水酸基が配位して水和親水性化された。 (蛍光色素を内包するリボソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（HSA) の結合）

リボソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（HSA) の結合は、既報の手法 (Yamazaki, N. , Kodama, M. and Gabius, H. -J. (1994) MethodsEnzymol. 242, 56-65) により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は 2 段階化学反応で行った。はじめに、本実施例で得られた各 10m 1のリボソーム膜面上に存在するガンダリオシドを lm lの N—トリス（ヒドロキシメチル）一 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液（pH 8. 4) に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム 10. 8mgを加え、 7 °Cでー晚攪拌して過ヨウ素酸酸化した。 X M300膜と PB S緩衝液（pH 8. 0) で限外濾過（分画分子量： 300, 000) することにより、遊離の過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、 N—トリス

(ヒドロキシメチル）一 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液を P B S緩衝液 (pH8. 0) に交換して、酸化されたリボソーム 1 Om 1を得た。このリポソーム液に、 2 Omgのヒト血清アルブミン（HSA) ZPBS緩衝液（pH 8. 0) を加えて室温で 2時間反応させ、次に 2M N a BH₃CN/PB S緩衝液

(pH 8. 0) 100 μ 1を加えて室温で 2時間、さらに冷蔵下でー晚攪拌してリボソーム上のガンダリオシドと HS Αとのカツプリング反応で HS Aを結合した。次いで、限外濾過（分画分子量： 300， 000) し、遊離のシァノホウ素酸ナトリゥムおよびヒト血清アルブミンを除去し、この溶液の緩衝液を炭酸緩衝液（pH8. 5) に交換して、 HS A結合リボソーム液各 1 Om 1を得た。

(糖鎖の調製）

糖鎖としてシァリルルイス X (S LX) (メーカー： CALB I OCHEM、カタ口グ番号： 565950) を使用した。

糖鎖の質量を計測し、以下おいて使用するための前処理をした。

(表 2)

(蛍光色素を内包するリボソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（HSA) 上への糖鎖の結合とリンカ一タンパク質（HSA) の親水性化処理）

本実施例において調製した糖鎖 2 m gを精製水に溶解し、 0. 25 gのNH₄

^1。0₃を溶かした0. 5 m l水溶液に加え、 37 °Cで 3日間攪拌した後、 0.

45； umのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して、糖鎖のグリコシルァミン化合物 4 m gZm 1 (アミノ化糖鎖溶液）を得た。次に、本実施例で得たリボソーム液の一部分 1 Om 1に架橋試薬 3， 3 ' ジチォビス (スルホスクシンィミジルプロピオネート）（DTSSP; Pierce Co.， USA) 1 0m gを加えて室温で 2時間、続いて冷蔵下でー晚攪拌し、 XM3 0 0膜と炭酸緩衝液（p H 8. 5) で限外濾過（分画分子量： 3 0 0， 0 0 0) して、遊離の D T S S Pを除去し、 DT S S Pがリボソーム上の HS Aに結合したリボソーム 1 0m lを得た。次に、このリボソーム液に上記のグリコシルァミン化合物（アミノ化糖鎖溶液） 1 2. 5、 3 7. 5、 1 2 5、 2 5 0、 5 0 0、 1 2 5 0、 2 5 0 0 μ 1を加えて、室温で 2時間反応させ、トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン Ζ炭酸緩衝液（p H 8. 5) を添カ卩し、その後、冷蔵下で一晩攪拌し、リポソ一ム膜面結合ヒト血清アルブミン上の DT S S Ρにダリコシル化ァミン化合物の結合を行った。 XM30 0膜とHE P E S緩衝液 ( H 7. 2) で限外濾過（分画分子量： 3 0 0， 0 00) して、遊離の糖鎖およびトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンを除去した。その結果、糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリボソーム各 1 0m 1が得られた。修飾結合密度 0. 0 2 5 mg糖鎖 mg脂質で糖鎖修飾リボソームを調製した場合、 c y 3では、総脂質量 4 3. 6mg、総蛋白量 4. l mg、平均粒子径 8 5. 3 nm、 c y 5. 5 では、総脂質量 3 8. 5 mg、総蛋白量 5. 8 mg、平均粒子径 9 8. 3 nmであった。

得られた生理食塩懸濁液中（3 7°C) の蛍光色素を内包するリボソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位 ·粒子径 ·分子量測定装置（Model Nano ZS， Malvern Instruments Ltd, , UK) により測定した。その結果、上記糖鎖修飾リポソームは、 c y 3では、粒子径は約 5 0 nm〜約 3 0 0 nm、ゼータ電位は 3 0〜― 1 2 0mVであり、 c y 5. 5では、粒子径は約 5 0 n m〜約 3 0 0 n m、ゼータ電位は 3 0〜一 1 2 0 mVであった。 (調製例 1. 糖鎖の結合していない蛍光内包型リボソームの調製）

(リボソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（HSA) 上へのトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンの結合）

比較試料としての糖鎖の結合していない蛍光内包型リボソームを調製するために、実施例 1の（蛍光色素を内包するリボソーム膜面上へのヒト血清アルブミン

(HSA) の結合）で得たリボソーム液の一部分 1 Om 1に架橋試薬 3， 3 ' 一ジチォビス（スルホスクシンィミジルプロピオネート（DTSSP; Pierce Co., USA) 1 Omgを加えて室温で 2時間、続いて冷蔵下でー晚攪拌し、 XM300 膜と炭酸緩衝液（pH 8. 5) で限外濾過（分画分子量： 300， 000) して、遊離の DTS S Pを除去し、 DTS S Pがリボソーム上の HS Aに結合したリボソーム 1 Om 1を得た。次に、このリボソーム液にトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン（Wako Co.， Japan) 26. 4mgを加えて、室温で 2時間攪拌し、その後冷蔵下でー晚攪拌し、リボソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上の DTS S Pにトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンの結合を行った。 XM3 00膜と HE PES緩衝液（pH 7. 2) で限外濾過（分画分子量： 300， 000) した。この工程で既に大過剰である 26. 4mgのトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンが存在するのでリボソーム膜面結合ヒト血清アルブミン

(HS A) 上の親水性化処理も同時に完結した。 0. 45 //mのフィルターで濾過して、最終産物である親水性化処理されたトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンとヒト血清アルブミンとリボソームとが結合した比較試料としてのリポソーム（略称： TR I S) 10m l (c y 3では、総脂質量 43. 9mg、総蛋白量 3. 71118、平均粒子径87. 7 nm、 c y 5. 5では、総脂質量 37. 8 m g、総蛋白量 6. 5mg、平均粒子径 95 nm) ) が得られた。 (比較例 1. S LX以外の糖鎖で修飾した、蛍光内包型糖鎖修飾リボソームの調製）

(1. 糖鎖 N ァセチルラクトサミンで修飾した糖鎖修飾リボソーム）糖鎖として N ァセチルラクトサミン（メーカー： CALB I OCHEM、力タログ番号： 345250) を使用した。蛍光色素として c y 5. 5を用いた。実施例 1と同様の方法を使用して糖鎖修飾リポソーム 10m lを得た。修飾結合密度 0. 025m g糖鎖 Zmg脂質で糖鎖修飾リボソームを調製した場合、総脂質量 40. 7mg、総蛋白量 6. 5mg、平均粒子径 98. 4 nmであった。 (2. 糖鎖 ct 1 6マンノビオースで修飾した糖鎖修飾リボソーム）

糖鎖として α 1— 6マンノビオース（メーカー：フナコシ、カタログ番号： D L— 1220— 60) を使用した。蛍光色素として c y 3または c y 5， 5を用いた。実施例 1と同様の方法を使用して、糖鎖修飾リボソーム各 10m lを得た。修飾結合密度 0. 025 mg糖鎖 mg脂質で糖鎖修飾リボソームを調製した場合、 c y 3では、総脂質量 33. 1 m g、総蛋白量 5. 2 m g、平均粒子径 1 1 O nm、 c y 5. 5では、総脂質量 39. 5mg、総蛋白量 5. 3 m g、平均粒子径 90. 8 nmであった。

(実施例 2. S LX修飾リボソームの脳虚血に対する集積性）

10- 1 2週齢の雄性 Sprague-Dawley (SD)ラット（体重 350— 450 g) を日本エスエルシー株式会社から購入し、以下の実験に使用した。虚血の動物モデルとして、ナイロン栓子法により右中大脳動脈により灌流されている脳に虚血を誘導する手術を行った。 (1. ナイロン栓子法）

ナイロン栓子法は、以下のとおり行った。 4— 0サイズのナイロンモノフィラメント糸（株式会社夏目製作所製力タログ番号 C一 2 3 ) の先をガスライターの炎で丸くした後にシリコーン（信越シリコーン K E— 2 0 0 ) で丸くなった先をコーティングした 5 c m長の血管閉塞用器具を作成する。ラットの手術は小動物全身麻酔装置（新鋭工業株式会社製、ソフトランダ一、承認番号 1 7浦安第 4 5 8 8号）により吸入麻酔薬のィソフルラン (アポットジャパン、製品名フォーレン、日本標準商品分類番号 8 7 1 1 1 4 ) を 5 %濃度で混和した酸素 3 0 %、笑気 7 0 %の混合ガスで麻酔を導入し、 1 . 5 %ィソフルランを混和した酸素 3 0 %、笑気 7 0 %の混合ガスで麻酔を維持し実体顕微鏡（ォリンパス社製、 S Z X 1 2 ) を用いて行った。手順は、頸部（腹側）を正中切開し右総頸動脈、右外頸動脈、右内頸動脈を周りの組織から露出する。外頸動脈の後頭枝、甲状腺枝をソリッドステートマイクロ凝固器（夏目製作所製、 K N 3 0 1 B、承認番号 4 9 B第 4 7 0号）で凝固し切離する。内頸動脈の翼口蓋枝を内頸動脈からの分岐部で 6号絹糸（株式会社夏目製作所製力タログ番号 C一 2 3 ) にて結紮する。総頸動脈、内頸動脈に 5号絹糸（株式会社夏目製作所製カタログ番号 C一 2 3 ) をかけ、この糸を使い一時的に両動脈の血流を停止する。外頸動脈の遠位部を 6号絹糸（株式会社夏目製作所製カタログ番号 C一 2 3 ) で結紮した後、結紮部の近位部で外頸動脈を切断する。切断口からナイ口ンモノフィラメント糸で作製した血管閉塞用器具を血管内に挿入し、外頸動脈から内頸動脈を経て右中大脳動脈の起始部を閉塞用器具のシリコンコーティング部で閉塞することで、中大脳動脈により還流されている脳に虚血を誘導する手術である (Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Longa cZ, Weinstein PR, Carlson S, Cummins R. Stroke 1989 ; 20 : 84 - 91を参考のこと。）。 ( 2 . E—セレクチン産生の確認）

3匹のラットの右中大脳動脈を 2時間閉塞した後、栓子を取り外し、血流を再開通させた。 3時間の再開通の後、安楽殺した。さらに、ナイロン栓子法での右中大脳動脈を 24時間閉塞したラット（1匹）を別に作製した。これらのラットを用いて、脳内の E—セレクチンの発現を免疫組織化学で検討した。

抗 E—セレクチン抗体として、 R&D S y s t e m s、カタログ番号 A F 9 7 7を用いた。切片を、 0. 3%の過酸化水素（過酸化水素水（30%) 和光純薬工業株式会社力タ口グ番号 08 1— 04 2 1 5より調整）、 1 0 %のメタノール（和光純薬工業株式会社力タ口グ番号 1 3 7— 0 1 8 23より調整）を含むリン酸緩衝食塩水（P H 7. 4) に 3 0分浸漬した後、 1 5分間、 0. 3 % Triton- Xを含むリン酸緩衝食塩水で洗浄した。その後、 5%の濃度の正常ゥマ血清（Vector Laboratories, カタログ番号 S-2000) を入れた 0. 3% Triton-X

(SIGMA-ALDRICH社製、カタ口グ番号 T 9 284— 5 00ML) を含むリン酸緩衝食塩水（pH 7. 4) に 60分浸漬した。さらに、 5 // ₈/^/!111の濃度の抗£ ーセレクチン阻止抗体と 5%の濃度の正常ゥマ血清を入れた 0. 3% Triton-X を含むリン酸緩衝食塩水（pH7. 4) にて 4 °Cで 1 2時間浸漬した。 1 5分間、 0. 3% Triton-Xを含むリン酸緩衝食塩水（pH7. 4) で洗浄した。次いで、この切片を、 0. 3% Triton-Xを含むリン酸緩衝食塩水（pH 7. 4) にて 2 00倍に希釈したビォチン化抗ャギ I g G抗体（Vector Laboratories. カタ口グ番号 BA— 9 500) に、 60分間浸漬した。 0. 3% Triton- Xを含むリン酸緩衝食塩水で 1 5分間洗浄した後、 ABC k i t (Vector Laboratories, カタログ番号 PK— 6 1 00) を用いて切片を 1時間反応させた。その後、 DAB kit (Vector Laboratorie s、カタログ番号 S K— 4 1 00 ) で発色させた。

(結果）

これらのラットにおいて、虚血中心部、血管閉塞側（脳虚血部位）の脳血管で E—セレクチンが産生されていることが確認された（図 5A、 B) 。この点については 2時間の閉塞後、 3〜 4時間再開通させても同様の結果となることが既に報告されてレヽる (Zhang Rし， ChoppM, Zhang ZG, Phillips ML, Rosenbloom Cし， Cruz R， Manning A E-selectin in focal cerebral ischemia and reperfusion in the rat. J Cereb Blood Flow Metab. 1996 Nov ;16 (6) :1126—1136) 。反対側の脳においても少量の E—セレクチンが産生されていることが確認された。これは、脳虚血が反対側の脳に对しても影響したためと考えられている ( Haring HP, Berg EL, Tsurushita N, Tagaya M, MD del Zoppo GJ, E-selectin appears in nonischemic tissue during experimental focal cerebral ischemia. Stroke. 1996 ;27: 1386—1392) 。 (3. S LX修飾リボソームの脳虚血に対する集積性）

S LX修飾リボソームとして、実施例 1で調製した、結合密度が 0. 025m g糖鎖ノ mg脂質のリボソームを使用した。まず、ナイロン栓子法でラットの右中大脳動脈を 2時間閉塞した。その後、栓子を取り外し、血流を再開通させた。 3時間の再開通の後、 S LX修飾リボソーム（各 2 50 μ 1 ) を下肢の大腿静脈より注射し投与した。 S LX修飾リボソームの投与から 1 0分後、 1時間後、 2 4時間後、 48時間後にラットを安楽死させ脳を取り出した。取り出した脳を、ドライアイスで温度を下げた 2 -Metylbutene (SIGMA-ALDRICH社製力タ口グ番号 2 70342- 1 L) を用いて一 50 °Cの温度で凍結した後、一 20°Cの温度に調節したクリオスタツト（ライカ社製 CM1 850) にて 20 μ mの厚みの切片に薄切し、シランコーティングしたスライドグラス（松浪硝子工業株式会社 S 1 53 500) に貼付け標本を作製した。これらの標本について、蛍光顕微鏡（ォリンパス社製 I X 70、 MVX 1 0) を用いて脳内の Cy 3の蛍光を検討した。さらに、ラットの右中大脳動脈を 2時間閉塞した。その後、栓子を取り外し、血流を再開通させた。再開通直後、 S LX修飾リボソーム（各 1 000 ^ 1 ) を下肢の大腿静脈より注射し、 48時間後にラットを安楽死させ脳を取り出した後、上記と同様の手順で脳内の C y 3の蛍光を観察した。脳血管への集積の確認のため、血管内皮細胞のマーカーである von Willebrand factor (VWF)に対する抗体（S I GMA社製、製造番号 F 35 20) で血管を蛍光標識し、 Cy 3との共存を調べた。切片を、 0. 3%の過酸化水素（過酸化水素水（3 0%) 和光純薬工業株式会社カタログ番号 081-04215より調整）、 1 0%のメタノール（和光純薬工業株式会社カタログ番号 137 - 01823より調整）を含むリン酸緩衝食塩水（ρΗ7· 4) に 30分浸漬した後、 1 5分間、 0. 3% Triton- Xを含むリン酸緩衝食塩水で洗浄した。その後、 5%の濃度の正常ロバ血清（Chemicon社製、カタログ番号 S 3 0— 1 0 0 M L ) を入れた 0. 3 % Triton- X (SIGMA- ALDRICH社製力タ口グ番号 T⁹²84_⁵00ML) を含むリン酸緩衝食塩水（p H 7. 4 ) に 6 0分浸漬した。さらに、 5 0 0倍に希釈した von Willebrand factor (VWF)に対する抗体と 5 %の濃度の正常ロバ血清を入れた 0. 3% Triton-Xを含むリン酸緩衝食塩水（pH7. 4) にて 4 °Cで 1 2時間浸漬した。 1 5分間、 0. 3% Triton_Xを含むリン酸緩衝食塩水（pH7. 4) で洗浄した。次いで、この切片を、 0. 3% Triton-Xを含むリン酸緩衝食塩水 (p H 7. 4) にて 1 00倍に希釈した fluorescein isothiocyanate (FITC)標識抗ゥサギ I g G抗体（Jackson Immuno Research Labs, カタログ番号 7 1 1— 09 5 - 1 5 2) に、 60分間浸漬した。 0. 3% Triton-Xを含むリン酸緩衝食塩水で 1 5分間洗浄した後、蛍光顕微鏡（ォリンパス社製 1 X 70) を用いて蛍光を検討した。

(結果）

S LX修飾リボソームを投与すると、投与 10分後、 1時間後または 24時間後とも閉塞側（脳虚血部位）の脳血管および血管周囲で S L X修飾リボソームの集積が確認された（図 6— 1の A、図 6— 2の上段、図 6— 3の上段）反体側の脳血管および血管周囲でも少量の S LX修飾リボソームの集積が確認された。

S LX修飾リボソームを投与すると、投与 48時間後でも閉塞側（脳虚血部位）の脳血管および血管周囲で SLX修飾リボソームの集積が確認された（図 6 一 4の A) 。反体側の脳血管および血管周囲でも少量の S LX修飾リボソームの集積が確認された。また、閉塞側では、実質内で瀰漫性に広がる Cy 3の蛍光を認め、 S LX修飾リボソームの脳実質内での集積も確認された（図 6— 5の下段）。

(4. S LX修飾リボソームが抗 E—セレクチン抗体の結合を阻止する効果） (免疫組織化学染色）

抗 E—セレクチン阻止抗体として、 R&D S y s t ems, カタログ番号 A F 977を用いた。標本を免疫組織化学染色した。標本を、 0. 3%の過酸化水素（過酸化水素水（ 30 %) 和光純薬工業株式会社力タ口グ番号 081—042 1 5より調整）、 10 %のメタノール（和光純薬工業株式会社力タ口グ番号 13 7— 01823より調整）を含むリン酸緩衝食塩水（ p H 7. 4) に 30分浸漬した後、 1 5分間、 0. 3% Triton-Xを含むリン酸緩衝食塩水で洗浄した。その後、 5%の濃度の正常ゥマ血清（Vector Laboratories カタログ番号 S— 2

000) を入れた 0. 3% Triton - X (SIGMA - ALDRICH社製、カタログ番号 T 9 284- 500ML) を含むリン酸緩衝食塩水（pH7. 4) に 60分浸潰した。さらに、 5 μ gZm 1の濃度の抗 E—セレクチン阻止抗体と 5%の濃度の正常ゥマ血清を入れた 0. 3% Triton- Xを含むリン酸緩衝食塩水（pH7. 4) にて 4 °Cで 12時間浸漬した。 15分間、 0. 3% Triton- Xを含むリン酸緩衝食塩水（pH7. 4) で洗浄した。次いで、この標本を、 0. 3% Triton-Xを含むリン酸緩衝食塩水（pH7. 4) にて 200倍に希釈したピオチン化抗ャギ I g G抗体（Vector Laboratories, カタログ番号 B A— 9500 ) に、 60分間浸漬した。 0. 3% Triton-Xを含むリン酸緩衝食塩水で 1 5分間洗浄した後、 A B C k i t (Vector Laboratories, カタログ番号 P K— 6 100 ) を用いて標本を 1時間反応させた。その後、 DAB k i t (Vector Laboratories, 力タログ番号 SK_4100) で発色させた。 (結果）

SLX修飾リボソームを投与した虚血ラットの脳を、抗 E—セレクチン阻止抗体で免疫組織化学染色すると、染色される血管は認められなかった（図 7左）。この結果より、 S LX修飾リボソームが E—セレクチンに結合したことにより、抗 E—セレクチン抗体が血管上のセレクチンに結合することができなかったと考えられる。 (比較例 2. 糖鎖なしリボソームおよび S LX以外の糖鎖で修飾した糖鎖修飾リボソームの集積性）

(1. リボソームの集積性）

リボソームは調製例 1および比較例 1で調製したものを用いた。

c y 5. 5を内包した糖鎖の結合していないリボソーム（糖鎖なしリポソ一ム）、ならびに c y 3を内包した α 1— 6マンノビオース（Κ3) で修飾したリポソーム（Κ3修飾リボソーム）を用いること以外、実施例 2と同様の方法を使用した。

10- 1 2週齢の雄性 Sprague - Dawley (SD)ラット（体重 350— 450 g) を使用した。動物モデルとして、このラットに、実施例 2と同様の様式で、ナイロン栓子法により右中大脳動脈により灌流されている脳に虚血を誘導する手術を行った。

コントローノレとして、 s h am手術をしたラット（3匹）を用いた。 s h am 手術をしたラットには、虚血群（2時間閉塞後に 3時間再開通した）と Cy 3内包リボソームを投与した時点を合わせるために、虚血群と同じタイミングで s h a m手術の 5時間後にリボソームを投与した（ s h a m手術群）。このラットに、

C y 3を内包した S LX修飾リボソームを投与し、 10分後に安楽死させ脳を取り出した。

S h a m手術は、切断口からナイロンモノフィラメント糸で作製した血管閉塞用器具を血管内に挿入するが、右中大脳動脈の起始部間では進めないこと以外はすべて閉塞手術と同じ手順を用いて行なった。

その結果、右中大脳動脈 2時間閉塞後、 3時間再開通させたのち、糖鎖なし C y 3内包リボソームを投与し 1 0分後に脳を取り出したラットでは、糖鎖なしリポソームは、虚血部位への集積性を示さなかった（図 6— 1、 B ) 。

右中大脳動脈 2時間閉塞後、再開通させた直後、糖鎖なし C y 3内包リポソ一ムを投与し 4 8時間後に脳を取り出したラットでは、糖鎖なしリボソームは、虚血部位への集積性を示さなかった（図 6— 4の B、図 6— 5の左側上）。

また、ナイロン栓子法により右中大脳動脈により灌流されている脳に虚血を誘導する手術を行ったラットにおいて、 α ΐ— 6マンノビオース（Κ 3 ) で修飾した C y 3標識リボソーム、糖鎖の結合していないリボソームでは、 1時間後に集積は認められなかった（図 6— 3、下段）。

s h a m手術群のラットの脳においても、 S L X修飾リボソームの集積は認められなかった（図 6— 1、 C ) 。

( 2 . 各種リポソ一ムが抗 E—セレクチン抗体の結合を阻止する効果）抗 E—セレクチン阻止抗体を用いた免疫組織化学染色は、実施例 2と同様の方法を用いた。比較例 2と同様の方法により Sprague-Dawley (SD)ラットに虚血を誘導し、虚血モデルを作製した。コントロールとして、 s h a m手術をしたラットを用いた。これらのラットから脳を取り出し、標本を作製した。

K 3で修飾したリボソームを投与した虚血ラットの脳を、抗 E—セレクチン阻止抗体で免疫組織化学染色すると、血管に E—セレクチンの発現が認められた (図 7中）。糖鎖の結合していないリボソームにおいても、血管に E—セレクチンの発現が認められた（図 7右）。閉塞側（脳虚血部位）の脳血管のみならず反体側の脳血管でも E—セレクチンの発現が確認された。 s h a m手術のラットについても、 E—セレクチンが発現しているか否かを確認する。

以上の結果より、これらのリボソームには、抗 E—セレクチン抗体が E—セレクチンに結合することを阻止する効果はないと考えられる。

c y 5 . 5を内包した N—ァセチルラクトサミン（K 2 ) で修飾したリポソ一ム（K 2修飾リボソーム）についても、本実施例と同様の方法を用いて実験を行い、 E—セレクチンの発現を評価する。

(実施例 2および比較例 2のまとめ）

E—セレクチンは血管内皮細胞のみに産生されるタンパク質で、正常の血管では産生されていない。 E—セレクチンは、炎症等の刺激が加わると血管内皮細胞の血管内腔側に産生され、血管内皮細胞と白血球の接着に関わっている（図 8 ) 。従来、脳虚血部位では E—セレクチンが血管内皮細胞に産生されていることが報告されており、今回の実験結果からも確認された。今回の結果は S L X修飾リポソームが脳虚血部位の E—セレクチンが産生されている脳血管に集積していることを示すものであり、 S L X修飾リボソームは、 E—セレクチンを標的として脳虚血部位（特に血管内皮細胞）に薬剤を運ぶドラッグデリバリーシステムとして利用できると考えられる。

(実施例 3 . S L X修飾リボソームの脳虚血治療効果についてのインビボ実験）

(シァリルルイス X ( S L X) で修飾した型リボソームの調製）

リボソームは既報の手法（Yamazaki, N. , Kodama, M. and Gabius, H. - J. (1994) Methods Enzymol. 242, 56-65) により、改良型コール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルホスフェート、ガングリオシド（Total Ganglioside Extract (脳、ブターアンモニゥム塩）販売元： Avanti、カタログ番号： 100232 (860053P) ) およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ 35 ： 4 0 : 5 : 15 : 5の割合で合計脂質量 45. 6 mgになるように混合し、コール酸ナトリウム 46. 9mgを添加し、クロ口ホルムメタノール（1 : 1) 溶液 3m lに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによつて脂質膜を得た。得られた脂質膜を TAPS緩衝生理食塩液（_PH8. 4) 3 m lに再懸濁し、 37°Cで 1時間攪拌した。次いで、この溶液を窒素置換し、超音波処理し、透明なミセル懸濁液 3 m 1を得た。この超音波処理したミセル懸濁液に N—トリス（ヒドロキシメチル）一 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液 (pH8. 4) 溶液を撹拌しながらゆっくりと滴下して均一に混合した後、このミセル懸濁液を PM10膜（Am i c o n Co. , USA) と TAP S緩衝生理食塩液（pH8. 4) を用いた限外濾過（分画分子量： 10， 000) にかけ均一なリボソーム粒子懸濁液各 1 Om lを調製した。

(リポソーム脂質膜面上の親水性化処理）

本実施例で調製したリボソーム溶液各 10m 1を、 XM300膜（Am i c o n Co. , USA) と炭酸緩衝液（pH 8. 5) を用いた限外濾過（分画分子量： 300， 000) にかけ溶液の pHを 8. 5にした。次に、架橋試薬ビス

(スルホスクシンィミジル）スベレート（B S³ ; P i e r c e Co. , US A) l Omgを加え、室温で 2時間攪拌した。その後、さらに 7°Cで一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルェタノールァミンと B S ³との化学結合反応を完結した。そして、このリボソーム液を XM300膜と炭酸緩衝液（pH 8. 5) で限外濾過（分画分子量： 300， 000) にかけた。次に、炭酸緩衝液（pH 8. 5) 1m lに溶かしたトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン 4 Omgをリボソーム液 10m 1に加えた。次いで、この溶液を、室温で 2時間攪拌後、冷蔵下で一晩攪拌し、分画分子量 300， 000で限外濾過し、遊離のトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液を N—トリス（ヒドロキシメチル） _ 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液（p H8. 4) に交換し、リボソーム膜上の脂質に結合した B S³とトリス (ヒドロキシメチル）ァミノメタンとの化学結合反応を完結した。これにより、リポソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールァミン上にトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンの水酸基が配位して水和親水性化された。

(リボソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（HSA) の結合）

リボソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（HSA) の結合は、既報の手法 ( Y a m a z a k i , N. , K o d a m a , M. a n d Ga b i u s , H. ― J. (1 994) Me t h o d s En z ymo l . 242, 56— 65) により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は 2段階化学反応で行つた。はじめに、本実施例で得られた各 1 Om 1のリボソーム膜面上に存在するガングリオシドを 1 m 1の N—トリス（ヒドロキシメチル）一 3—アミノプロノンスルホン酸緩衝液（_PH 8. 4) に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム 10. 8mgを加え、 7 °Cでー晚攪拌して過ヨウ素酸酸化した。 XM300膜と PBS 緩衝液（pH 8. 0) で限外濾過（分画分子量： 300， 000) することにより、遊離の過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、 N—トリス（ヒドロキシメチル）一 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液を PB S緩衝液（pH8. 0) に交換して、酸化されたリボソーム 10m 1を得た。このリボソーム液に、 20mgのヒト血清アルブミン（HSA) ZPB S緩衝液（pH 8. 0) を加えて室温で 2 時間反応させ、次に 2M N a BH₃CNZP B S緩衝液（p H 8. 0) 10 0 μ 1を加えて室温で 2時間、さらに冷蔵下でー晚攪拌してリボソーム上のガンダリオシドと HS Αとのカップリング反応で HS Αを結合した。次いで、限外濾過（分画分子量： 300, 000) し、遊離のシァノホウ素酸ナトリウムおよびヒト血清アルブミンを除去し、この溶液の緩衝液を炭酸緩衝液（pH8. 5) に交換して、 HS A結合リボソーム液各 1 Om 1を得た。 (糖鎖の調製）

糖鎖としてシァリルルイス X (SLX) (メーカー： CALB I OCHEM、カタログ番号： 565950) を使用した。糖鎖の質量を計測し、以下おいて使用するための前処理をした。

(リボソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（HSA) 上への糖鎖の結合とリンカータンパク質（HSA) の親水性化処理）

本実施例において調製した糖鎖 2 mgを精製水に溶解し、 0. 25 gのNH₄ ^1。0₃を溶かした0. 5m l水溶液に加え、 37 °Cで 3日間攪拌した後、 0. 45 mのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して、糖鎖のグリコシルァミン化合物 4 m g Ζπι 1 (ァミノ化糖鎖溶液）を得た。次に、本実施例で得たリボソーム液の一部分 1 Om lに架橋試薬 3， 3 ' ジチォビス

(スルホスクシンィミジルプロピオネート）（DTSSP; Pierce Co. , USA) 10m gを加えて室温で 2時間、続いて冷蔵下で一晩攪拌し、 XM300膜と炭酸緩衝液（pH 8. 5) で限外濾過（分画分子量： 300， 000) して、遊離の D TS S Pを除去し、 DTS S Pがリボソーム上の HS Aに結合したリボソーム 1 0m lを得た。次に、このリボソーム液に上記のグリコシルァミン化合物（アミノ化糖鎖溶液） 1 25 μ 1を加えて、室温で 2時間反応させ、トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン Ζ炭酸緩衝液（pH 8. 5) を添加し、その後、冷蔵下でー晚攪拌し、リボソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上の DTS S Ρにダリコシル化ァミン化合物の結合を行った。 ΧΜ300膜と HE P E S緩衝液（pH 7. 2) で限外濾過（分画分子量： 300， 000) して、遊離の糖鎖およびトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンを除去した。その結果、糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリボソーム各 10 m 1が得られた。本実施例で調製した S LX修飾リボソームの修飾結合密度は、 0. 025mg糖鎖 g脂質である。

(粒子径 *ゼータ電位測定）

得られた生理食塩懸濁液中（37°C) のェチジゥムブロマイドを内包する S L

X修飾リボソームの粒子径とゼータ電位をゼータ電位 ·粒子径 ·分子量測定装置 (Model Nano ZS, Malvern Instruments Ltd. , UK) により測定した。その結果、平均粒子径は、 1 15 nmであった（図 1 7、下段）。 (脂質 ·タンパク質定量）

本実施例により得られたェチジゥムブ口マイドを内包する S LX修飾リポソ一ムの脂質量は、 0. 5% T i t o nX— 100存在下、デタミナ一 TC 555 (協和メディクス）を用いて、総コレステロール量を測定し、各脂質のモル比から総脂質量を算出した。その結果、リボソーム粒子の構成脂質量は、 2. 90m gZm lであった。

タンパク質量は、 1 % S D S存在下、 Micro BCA™ Protein Assay Kit (PIERCE)を用いて行った。標準物質として B S Aを用いた。その結果、タンパク質量は、 0. 013mgZm 1であった。タンパク質量/脂質量は、 0. 00 5であった。

(虚血モデルの作製および S LX修飾リボソームの投与）

1 0〜 1 2週齢の雄性 Sprague-Dawley (SD)ラット（日本エスエルシー株式会社、体重 350— 450 g) を各群 5匹使用した。動物モデルとして、ナイロン栓子法により右中大脳動脈により灌流されている脳に虚血を誘導する手術を行つた。右側中大脳動脈を 2時間閉塞し、その後再開通させた。再開通直後に 250 マイクロリットルの S LX修飾リボソームを大腿静脈内に投与した。再開通から 24時間後に脳虚血により生じたラッ卜の運動麻痺を、既存の評価方法 (Leker RR， Gai N, Mechoulam R， Ovadia H、 Drug- induced hypothermia reduces ischemic damage ： effects of the cannabinoid HU - 210. Stroke. 2003 Aug; 34 (8)： 2000-2006.) により、 0 (無症状）から 1 0 (最も重症の運動麻痺）までの 1 1段階のグレードで評価した。

(運動麻痺スコアの算出方法).

1. しっぽを持って持ち上げたとき麻痺側の上肢を突っ張らない。（1点）

2. 麻痺側の下肢を引っ張ると下肢を引っ込めない。（1点）

3. 体を麻痺側に倒すとそちらに傾く。（1点）

4. 歩行させると麻痺側に回転する。（1点）

5. 5 0センチメートルの円の中から 1 0秒以内に歩いて抜け出せない。（1 点）

20秒以内に抜け出せない。（2点）

60秒以内に抜け出せない。（3点）

6. 麻痺側の上肢に上方向の抵抗を加えると突っ張らない。（1点）

麻痺側の上肢に前方向の抵抗を加えると突っ張らない。（ 1点）

麻痺側の上肢に横方向の抵抗を加えると突っ張らない。（ 1点）

以上の各ボイントの合算を麻瘅スコアとした。

最も軽いのは 0点（無症状）で、最も重いのは 1 0点となる。 (結果）

S LX修飾リボソームを投与したラットは、グレード 1. 2± 0. 49であつた。（図 9) 。

また、 S LX修飾リボソームを投与した動物モデルについて、脳梗塞の大きさは、 7 1. 6 +/- 3 3. 8 2 2mm³であった（図 1 0および 1 1) 。 (比較例 3)

10〜1 2週齢の雄性 Sprague- Dawley (SD)ラット（日本エスエルシー株式会社、体重 350— 450 g) を 5匹使用した。実施例 3と同様の様式で動物モデノレを作製した。 S LX修飾リボソームのコントロールとして、下記のとおり調製した、糖鎖の結合していないリボソームを投与したこと以外、実施例 3と同様の様式で実験を行い、評価した。

(糖鎖の結合していないリボソームの調製）

比較試料としての糖鎖の結合していないリボソーム（糖鎖なしリボソーム）を調製するために、実施例 3の（リボソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（HS A) の結合）で得たリボソーム液の一部分 1 Omlに架橋試薬 3， 3，一ジチォビス（スルホスクシンィミジルプロピオネート（DTSSP; Pierce Co.， USA) 10 mgを加えて室温で 2時間、続いて冷蔵下で一晩攪拌し、 XM300膜と炭酸緩衝液（pH 8. 5) で限外濾過（分画分子量： 300， 000) して、遊離の DTS S Pを除去し、 DTS S Pがリボソーム上の HS Aに結合したリボソーム 10m lを得た。次に、このリボソーム液にトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン（Wako Co. , Japan) 26. 4 m gを加えて、室温で 2時間攪拌し、その後冷蔵下で一晩攪拌し、リボソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上の DTS S P にトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンの結合を行った。 ]\1300膜と^1 E PES緩衝液 (pH 7. 2) で限外濾過（分画分子量： 300， 000) した。この工程で既に大過剰である 26. 4mgのトリス（ヒドロキシメチル）了ミノメタンが存在するのでリボソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（HSA) 上の親水性化処理も同時に完結した。 0. 45 /xmのフィルターで濾過して、最終産物である親水性化処理されたトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンとヒト血清アルブミンとリボソームとが結合した比較試料としてのリボソーム（略称： TR I S) 10m lが得られた。 (粒子径 ·ゼータ電位測定）

得られた生理食塩懸濁液中（37°C) のリボソーム粒子の粒子径およびゼータ電位はゼータ電位 . 粒子径 · 分子量測定装置（Model Nano ZS, Malvern Instruments Ltd., UK) により測定した。その結果、平均粒子径は、 133 nm であった（図 1 7、上段）。

(脂質 ·タンパク質定量）

本実施例により得られたェチジゥムブロマイドを内包する S L X修飾リポソ一ムの脂質量は、 0. 5% TitonX- 100存在下、デタミナ一 TC 555 (協和メデイクス）を用いて、総コレステロール量を測定し、各脂質のモル比から総脂質量を算出した。その結果、リボソーム粒子の構成脂質量は、 3. O mgZmlであった。

タンパク質量は、 1 % S D S存在下、 Micro BCA™ Protein Assay Kit (PIERCE)を用いて行った。標準物質として B S Aを用いた。その結果、タンパク質量は、 0. 015mgZm 1であった。タンパク質量 Z脂質量は、 0. 005 であった。

S LX修飾リボソームのコントロールとして用いた糖鎖なしリボソームを投与したラットではグレード 4. 4+/—0. 678であった（図 9) 。

結合糖鎖のないリボソームを投与した動物モデルについて、脳梗塞の大きさを測定したところ、 1 90. 6 +/- 3 1. 5 mm³であった（図 1 0および 1

1)

(S LX修飾リボソームの E—セレクチンへの結合と白血球の脳実質への浸潤抑制）

実施例 3、比較例 3の動物脳を用いた。抗 E—セレクチン抗体として、 R&D

S y s t em s , カタログ番号 A F 9 77を用いた。抗顆粒球抗体として BD P h a r m i n g e n, カタログ番号 5 50000を用いた。切片を、 0. 3% の過酸化水素（過酸化水素水（30%) 和光純薬工業株式会社カタログ番号 08 1— 042 1 5より調整）、 1 0 %のメタノール（和光純薬工業株式会社力タ口グ番号 1 3 7— 0 1 8 23より調整）を含むリン酸緩衝食塩水（ p H 7. 4) に 30分浸漬した後、 1 5分間、 0. 3% Triton- Xを含むリン酸緩衝食塩水で洗浄した。その後、 5%の濃度の正常ゥマ血清（Vector Laboratories カタログ番号 S— 2000 ) を入れた 0. 3 % Triton- X (SIGMA- ALDRICH社製、カタ口グ番号 T 9 284— 500ML) を含むリン酸緩衝食塩水（pH7. 4) に 60 分浸漬した。さらに、 5 μ gZm 1の濃度の抗 E—セレクチン阻止抗体と 5%の濃度の正常ゥマ血清を入れた 0. 3% Triton-Xを含むリン酸緩衝食塩水（pH 7. 4) にて 4 °Cで 1 2時間浸漬した。抗顆粒球抗体は 5%の濃度の正常ゥマ血清を入れた 0. 3% Triton- Xを含むリン酸緩衝食塩水（pH7. 4) にて 1 0 0倍に希釈し、標本をその溶液で 4 °Cで 1 2時間浸漬した。その後 1 5分間、 0. 3% Triton- Xを含むリン酸緩衝食塩水（pH7. 4) で洗浄した。次いで、この切片を、抗 E—セレクチン阻止抗体の場合は 0. 3% Triton-Xを含むリン酸緩衝食塩水（pH7. 4) にて 200倍に希釈したピオチン化抗ャギ I g G抗体 (Vector Laboratories, カタログ番号 B A— 9 500 ) に、抗顆粒球抗体の場合は 0. 3% Triton- Xを含むリン酸緩衝食塩水（pH7. 4) にて 70倍に希釈したピオチン化抗マウス I g G抗体（Vector Laboratories. カタログ番号 B A— 200 1) に、 60分間浸漬した。 0. 3% Triton- Xを含むリン酸緩衝食塩水で 1 5分間洗浄した後、 AB C k i t (Vector Laboratories, カタログ番号 PK— 6 1 00) を用いて切片を 1時間反応させた。その後、 DAB k i t (Vector Laboratories, カタログ番号 S K— 4 1 00 ) で発色させた。 (結果）

S LX修飾リボソームを投与した虚血ラッ卜の脳を、抗 E—セレクチン阻止抗体で免疫組織化学染色すると、染色される血管は認められなかった。この結果より、 S LX修飾リボソームが E—セレクチンに結合したことにより、抗 E—セレクチン抗体が血管上のセレクチンに結合することができなかつたと考えられる。また、 S LX修飾リボソームが E—セレクチンに結合したことにより顆粒球の脳実質への浸潤が阻止されたと考えられる（図 12) 。

(脳実質内への浸潤顆粒球数についての定量）

図 1 2に提示した顆粒球の浸潤抑制効果について、染色標本の 1切片あたりの虚血側大脳半球実質内に浸潤した顆粒球数を目視にて計測し fこ。具体的には、実施例 3および比較例 3において調製した各 5匹のラットすべてを計測した。顕微鏡 (01 ympus社製、 BX51 )を用いて 10倍の対物レンズ下に虚血側の大脳半球につレヽて標本内の顆粒球数を目視にて計数した。その結果、 S LXリボソーム群の実質内浸潤顆粒球数は、糖鎖なしリボソーム群に比べて、約 6分の 1であった。 S L Xリボソーム群で有意に実質内浸潤顆粒球数が減少した（図 18) ことが確認された。この S LXリボソームの顆粒球浸潤抑制効果は予想外な効果といえる。また、これは、 S LXリボソームの Eセレクチンへの結合が原因と考えられる。

(まとめ）

S LX修飾リボソームと、コントロールとして用いた糖鎖なしリボソームを投与したラットでは、麻痺スコアは、統計学的に有意差を認めた（p = 0. 026 2) (図 9) 。

S LX修飾リボソーム、結合糖鎖のないリボソームを投与したラットで脳梗塞の大きさは統計学的に有意差を認めた（p = 0. 0496) (図 10および 1

1)

本実施例では S L Xリボソームを投与する前に、 2時間にわたる中大脳動脈閉塞が加えられ、脳虚血を発症させている。これにより、虚血後の動物には、左半身の麻痺（歩行障害、姿勢保持の障害など）が生じた。この麻痺を起こした動物は、結合糖鎖のないリボソームの処置では歩行障害、姿勢保持障害が持続または悪化するが、 S L Xリボソームを血管内投与または処置することにより、再開通から 2 4時間後には有意差を持って軽症化し、麻痺スコアが対照群の 1 Z 4に低下した。これは、脳梗塞の縮小化（対照群の 4 0 %に縮小）とあわせて、 S L X リポソームによる予想外な効果であると考えられる。

S L X糖鎖の結合していないリボソームを投与したラットは、歩行困難などの高度の左片麻瘅を呈した。しかし、 S L X修飾リボソームを投与したラットでは、虚血による運動麻痺は認められなかった（グレード 0 ) 力 \ 認められたとしても軽度の左上肢または左下肢の筋力低下であった（グレード 1 ) ことから、 S L X 修飾リボソームは、虚血による運動麻痺を抑制する効果を有することがわかった。また、病理解析でも著明な脳梗塞縮小効果を認めた。これらの保護効果は、虚血に伴い血管内皮細胞に産生されるセレクチンと白血球の接着を競合的に阻害し、その結果、白血球の脳実質への浸潤や炎症惹起作用、血栓形成作用を抑制し、脳虚血に伴う脳組織障害過程を抑制したためと考えられた。

本実施例の結果から、 S L X修飾リボソームは、脳虚血部位に集積し、脳虚血部位の炎症を低減させることができることがわかった。この S L X修飾リポソ一ムは、脳虚血部位に集積し、炎症を低減させるだけでなく、運動障害の回復をもたらすことができる。 S L Xを含む組成物は炎症部位に関連があることは知られていたものの、運動障害の回復作用があることはまったく知られていなかった。運動障害に炎症が関与することは知られておらず、 S L Xのこの作用効果は、これまでに S L Xについて知られていた知見からは想起できない驚くべき効果であるといえる。この効果は顕著に優れており、これまでの医学では達成されていな力 ^¾つた。

本実施例においては、本発明の S L X修飾リボソームについて治療効果が示されており、その結果からも脳虚血の予防効果があることが理解される。現在の脳虚血の動物実験において、治療薬物投与では、虚血導入前に薬物投与を行うことが多い。この原因として、虚血導入後においては保護効果を発揮できないことが多いためである。脳虚血を起こす前に脳虚血增悪因子を前もって抑制する準備ができている方が効果も大きく、虚血が起こって、增悪因子が出てからでは抑制効果が小さくなることが多いからである。本発明の S LX修飾リボソームについても、血中の安定性から、虚血導入前に投与しても長時間血中に存在し、血管内皮細胞にセレクチンが発現されても結合することができると考えられる。したがつて、既に虚血導入後の投与でも保護効果を持つことが証明された S L X修飾リポソームが、虚血導入前に投与されているならば保護効果は同程度かさらに増大することが理解される。本発明とは全く異なる物質である抗体についてでの報告である力 Hu a n g Jら、 s t r o k e. S t r o k e 2000 De c ; 31 (12) ： 3047— 3053においても、前投与の方が効果は大きいことが報告されている。

(実施例 4. S LX修飾リボソームによる脳虚血部位のイメージング）本実施例では、実施例 1において調製した S LX修飾 C y 5. 5内包リポソ一ムを用いた。 10〜 1 2週齢の雄性 Sprague- Dawley (SD)ラット（日本エスエルシー株式会社、体重350〜450₈) を使用した。動物モデルとして、ナイ口ン栓子法により右中大脳動脈により灌流されている脳に虚血を誘導する手術を行つた。右側中大脳動脈を 2時間閉塞し、その後再開通させた。再開通直後に lm 1の Cy 5. 5を内包した S LX修飾リボソームを大腿静脈内に投与した。投与後の蛍光画像を eXp l o r e O p t i x (GE He a l t h c a r e C O. , LTD) にて経時的（投与前、 10分後、 60分後、 1 20分後、 24時間後、 48時間後）に撮像した。コントロールとして、糖鎖の結合していないリポソームを投与した。各群 3匹用いた。 S LX修飾リボソームを投与したラットでは、インビボで観察しても、ェキソビボで観察しても、虚血部位が描出された。インビボでは S LX修飾リボソームを投与後 60分から閉塞側に蛍光強度の増加を認めた（図 13) 。ェキソビボの観察は、リボソーム投与の 48時間後に、 E Xp 1 o r e Op t i xでの撮影後、ラットを安楽死させ脳を取り出し、生理食塩水で洗浄した後、取り出した脳を EXp l o r e Op t i xで撮影することにより行った。その結果、 SLX修飾リボソーム（K1リボソーム）投与の個体で梗塞部位に強い蛍光シグナルが得られた。

(実施例 5. リボソームと S LXとを含む組成物の調製）

蛍光色素として、 c y 3または c y 5. 5を用いる。実施例 1と同様の方法を用いて、蛍光標識した標識ヒト血清アルブミン溶液を調製する。

この蛍光色素溶液を内包するリポソームを、既報の手法（Y a ma z a k i， N. ， K o d a ma , M. a n d Ga b i u s, H. — J. (1 994) Me t h o d s E n z y mo 1. 242, 56— 65) により、改良型コール酸透析法を用いて調製する。

生理食塩懸濁液中のリポソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位 ·粒子径 ·分子量測定装置（Mo d e l Na n o Z S, Ma l v e r n I n s t r ume n t s L t d, , UK) により測定することができる。

実施例 1と同様の方法を使用して、蛍光色素を内包するリボソーム脂質膜面上を親水性化処理し、ヒト血清アルブミン（HSA) を結合させる。

次に、得られたリボソーム液の一部分に架橋試薬を加えて攪拌し、限外濾過する。次に、このリボソーム液にトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンを加えて携拌し、限外濾過する。このリボソームに S LXを混合し、 S LXを含むリポソームを調製する。 (比較例 4. S L X以外の糖鎖を含む組成物の調製）

S LXの代わりに、 N—ァセチルラクトサミン（K2) 、 c l一 6マンノビォース（K3) を用いて、実施例 5と同様の方法により、組成物を調製する。親水性化していない S L Xリポソームを、実施例 1に記載の方法において親水性化工程を省くことにより調製する。 S LXとヒト血清アルブミン（HSA) とを含む組成物（S LX— HSA) を、 S LXと HS Αとが反応する条件で混合することにより調製する。グリコシル化 S LXを、 S LXがグリコシルイ匕する条件で反応させ調製する。力ルポキシル化 S L Xを、 S L Xがカルボキシル化する条件で反応させ調製する。

(実施例 6. S LXを含む組成物の脳虚血に対する集積性）

本実施例では、実施例 5で調製した組成物を用いること以外、実施例 2と同様の方法を用いる。実験には、 Sprague-Dawley (SD)ラット（日本エスエルシー株式会社から購入）を用いる。全ての実験について、実施例 1において調製した S LX修飾リボソーム（SLX基を含む組成物）についても同様に実験をおこなう。 (1. ナイロン栓子法）

ラットに、実施例 2と同様の方法を用いて、右中大脳動脈により灌流されている脳に虚血を誘導する手術を行う。

(2. E—セレクチン産生の確認）

ラットの右中大脳動脈を閉塞した後、栓子を取り外し、血流を再開通させる。再開通の後、安楽死させる。このラットにおける脳内（血管閉塞側（脳虚血部位）、反対側、コア等）の E—セレクチンの発現は、免疫組織化学などで検討することができる。抗 E—セレクチン抗体として、 R&D S y s t ems、カタログ番号 A F 977を用いて、実施例 2と同様の実験をおこなう。 (3. S LXを含む組成物の脳虚血に対する集積性）

本実施例では、実施例 5で調製した組成物を用いること以外、実施例 2と同様の方法を用いる。ナイロン栓子法でラットの右中大脳動脈を閉塞する。その後、栓子を取り外し、血流を再開通させる。再開通の後、 S LXを含む組成物を下肢の大腿静脈より注射し投与する。投与後、ラットを安楽死させ脳を取り出して標本を作製する。この標本について、蛍光顕微鏡（ォリンパス社製 I X 70) を用いることにより、脳内の Cy 3の蛍光を検討することができる。

実施例 2と同様の方法を用いて、脳血管への集積の確認することができる。具体的には、血管内皮細胞のマーカーである von Willebrand factor (VWF)に対する抗体（S I GMA社製、製造番号 F 3520) で血管を蛍光標識し、 Cy 3との共存を調べることが可能である。蛍光顕微鏡（ォリンパス社製 I X70) を用いて蛍光を検討することができる。

(4. S LXを含む組成物が抗 E—セレクチン抗体の結合を阻止する効果） (免疫組織化学染色）

抗 E—セレクチン阻止抗体として、 R&D S y s t ems, カタログ番号 A F 977を用い、実施例 2と同様の方法により、標本を免疫組織化学染色する。 S LXを含む組成物を投与した虚血ラットの脳を観察することができる。

(比較例 5. S L X以外の糖鎖を含む組成物の集積性）

(1. 集積性）

実施例 2と同様の方法を用いて、組成物の集積性を観察することができる。比較例 2と同様の方法により Sprague - Dawley (SD)ラットに虚血を誘導し、虚血モデルを作製する。比較例 4において調製した組成物（N—ァセチルラクトサミン (K 2) 修飾リボソームまたは α 1— 6マンノビオース（Κ3) 修飾リポソ一ム）、親水性化していない S LXリボソーム、 S LXとヒト血清アルブミン（Η S A) とを含む組成物（S LX— HSA) 、グリコシル化 SLX、カルボキシル化 S LX、 S LX単独、 N—ァセチルラクトサミン単独または α 1— 6マンノビオース単独のそれぞれを、虚血モデルまたは s h am手術をしたラットに投与する。これらのラットから脳を取り出し、標本を作製する。これらの標本について、蛍光顕微鏡（ォリンパス社製 I X 70) を用いて脳内の Cy 3の蛍光を検討することができる。

( 2. 各種組成物が抗 E—セレクチン抗体の結合を阻止する効果）

抗 E—セレクチン阻止抗体を用いた免疫組織化学染色は、実施例 2と同様の方法を用いる。比較例 2と同様の方法により Sprague-Dawley (SD)ラットに虚血を誘導し、虚血モデルを作製する。コントロールとして、 s h am手術をしたラットを用いる。

比較例 4において調製した組成物（N—ァセチルラクトサミン（K2) 修飾リポソームまたは α 1— 6マンノビオース（Κ3) 修飾リボソーム）、親水性化していない S LXリボソーム、 S LXとヒト血清アルブミン（HSA) とを含む組成物（S LX— HSA) 、グリコシル化 S LX、カルボキシル化 S LX、 S LX 単独、 N—ァセチルラクトサミン単独または α 1— 6マンノビオース単独のそれぞれを、虚血モデルまたは s h am手術をしたラットに投与する。これらのラットから脳を取り出し、常法により標本を作製する。この標本を抗 E—セレクチン阻止抗体で免疫組織化学染色し、 E—セレクチンの発現を観察することができる。コントロールとして、全ての実験において、 s h a m手術をしたラットを用いて同様の実験をおこなう。また、糖鎖なしリボソームを投与したラットについても同様に実験をおこなう。

(実施例 7. S LXを含む組成物の脳虚血治療効果についてのィンビボ実験） S LXを含む組成物は、本実施例（S LXを含む組成物の調製）において調製したものを使用する。

( S L Xを含む組成物の調製）

リボソームを、既報の手法（Yamazaki, Ν· , Kodama, M. and Gabius, H. -J. (1994) Methods Enzymol. 242, 56-65) により、改良型コール酸透析法を用いて調製する。

生理食塩懸濁液中のリボソーム粒子の粒子径およびゼータ電位は、ゼータ電位 '粒子径 ' 分子量測定装置（Model Nano ZS, Malvern Instruments Ltd, , UK) により測定することができる。

実施例 1と同様の方法を使用して、リボソーム脂質膜面上を親水性化処理し、ヒト血清アルブミン（H S A) を結合させる。

次に、得られたリボソーム液の一部分に架橋試薬を加えて攪拌し、限外濾過する。次に、このリボソーム液にトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンを加えて携拌し、限外濾過する。このリボソームに S L Xを混合し、 S L Xを含むリポソームを調製する。

(動物モデルの作製および S L Xを含む組成物の投与）

本実施例では、実施例 3と同様の方法を用いる。動物モデルとして、 Sprague- Dawley (SD)ラット（日本エスエルシー株式会社）に対して、ナイロン栓子法により右中大脳動脈により灌流されている脳に虚血を誘導する手術を行う。右側中大脳動脈を閉塞し、その後再開通させる。再開通直後に S L Xを含む組成物を大腿静脈内に投与する。実施例 3と同様の方法により、ラットを 0 (無症状）から 1 0 (最も重症の運動麻痺）までの 1 1段階のグレードで評価することができる。 (比較例 6. S L X以外の糖鎖を含む組成物の脳虚血治療効果についてのィンビボ実験）

Sprague-Dawley (SD)ラット（日本エスエルシー株式会社）を使用する。実施例 7と同様の様式で動物モデルを作製する。

(S LX以外の糖鎖を含む組成物の調製）

糖鎖として S LXの代わりに、 N—ァセチルラクトサミン（K2) または c l 一 6マンノビオース（Κ3) を用いること以外、実施例 7と同様の方法により S LX (Κ 1) 以外の糖鎖を含む組成物（Ν—ァセチルラクトサミン（Κ2) または α ΐ— 6マンノビオース（Κ3) を含む組成物）を調製する。

(動物モデルの作製および S L X以外の糖鎖を含む組成物の投与）

本比較例において調製した S LX (Κ 1) 以外の糖鎖を含む組成物（Ν—ァセチルラクトサミン（Κ2) または α 1— 6マンノビオース（Κ3) を含む組成物）、 S LXとヒト血清アルブミン（HSA) とを含む組成物（S LX— HS A) 、 S LX単独、 Ν—ァセチルラクトサミン単独または α 1— 6マンノビオース単独を投与したこと以外、実施例 7と同様の様式で実験を行い、ラットを評価することができる。 (実施例 8. MR Iによる虚血性脳疾患の診断用組成物の調製）

本実施例では、標識物質として、造影剤である酸化鉄粒子を用いること以外、実施例 1と同様の方法を用いて、酸化鉄粒子を內包するリボソームを調製する。糖鎖は S LXを用いる。

リボソームは、既報の手法（Yamazaki, N.， Kodama, M. and Gabius, H. - J. (1994) Methods Enzymol. 242, 56-65) により、改良型コール酸透析法を用いて調製する。生理食塩懸濁液中のリボソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位 ·粒子径 '分子量測定装置（Model Nano ZS, Malvern Instruments Ltd. , UK) により測定する。

実施例 1と同様の方法を使用して、酸化鉄粒子を内包するリボソーム脂質膜面上を親水性化処理し、ヒト血清アルブミン（H S A) を結合させる。

次に、得られたリボソーム液の一部分に架橋試薬を加えて攪拌し、限外濾過する。次に、このリボソーム液に糖鎖溶液を添加し、反応させ、さらにトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンを加えて攪拌し、限外濾過し、酸化鉄粒子を内包した S L X修飾リボソームを調製する。

(比較例 7 . S L X以外の糖鎖を用いた MR I診断用組成物の調製）

糖鎖として、 N—ァセチルラクトサミン（K 2 ) または c 1— 6マンノビオース（K 3 ) を用いること以外、実施例 8と同様の方法を用いて、 MR I診断用組成物を調製する。

(実施例 9 . MR Iによる虚血性脳疾患の診断）

実施例 8において調製した M R I診断用組成物を用いる。実験動物として、 Sprague-Dawley (SD)ラット（日本エスエルシー株式会社）を使用する。実施例 2と同様の方法を使用して虚血モデルを作製し、 MR I診断用組成物を投与する。

( 1 . ナイロン栓子法）

ラットに、実施例 2と同様の方法を用いて、右中大脳動脈により灌流されている脳に虚血を誘導する手術を行う。 ( 2 . E—セレクチン産生の確認）

ラットの右中大脳動脈を閉塞した後、栓子を取り外し、血流を再開通させる再開通の後、安楽殺させる。このラットにおける脳内（血管閉塞側（脳虚血部位）、反対側、コア等）の E—セレクチンの発現を免疫組織化学などで検討することができる。抗 E—セレクチン抗体として、 R & D S y s t e m s、カタ口グ番号 A F 9 7 7を用いて、実施例 2と同様の実験をおこなう。

( 3 . MR I診断用組成物の脳虚血に対する集積性）

実施例 8で調製した MR I診断用組成物を用いる。ナイロン栓子法でラットの右中大脳動脈を閉塞する。その後、栓子を取り外し、血流を再開通させる。再開通の後、 MR I診断用組成物を下肢の大腿静脈より注射し投与する。投与後、ラットを安楽死させ脳を取り出して標本を作製する。この標本について、 MR I装置を用いて脳を検索することができる。

(比較例 8 )

比較例 7において調製した MR I診断用組成物をもちいること以外、実施例 9 と同様の方法を用いる。ナイロン栓子法でラットの右中大脳動脈を閉塞する。その後、栓子を取り外し、血流を再開通させる。再開通の後、 MR I診断用を下肢の大腿静脈より注射し投与する。投与後、ラットを安楽死させ脳を取り出して標本を作製する。

コントロールとして、全ての実験において、 s h a m手術をしたラットを用いて同様の実験をおこなう。また、糖鎖なし MR I組成物を投与したラットについても同様に実験をおこなう。これらの標本について、 MR I装置を用いて脳を検索することができる。

(実施例 1 0 . 虚血性脳疾患に対する予防効果）

Sprague-Dawley (SD)ラット（日本エスエルシー株式会社）に、実施例 3、および実施例 7において調製した S L X修飾リボソーム、およびリボソームと S L Xとを含む組成物を投与する。

投与後、実施例 1と同様のナイロン栓子法により右中大脳動脈により灌流されている脳に虚血を誘導する手術を行う。右側中大脳動脈を数時間閉塞し、その後再開通させる。

(S LX基または S LXを含む組成物が抗 E—セレクチン抗体の結合を阻止する効果）

(免疫組織化学染色）

免疫組織化学染色のために、上記ラットから脳を取り出し、常法により標本を作製する。抗 E—セレクチン阻止抗体として、 R&D S y s t ems, カタ口グ番号 AF 977を用い、実施例 2と同様の方法により、標本を免疫組織化学染色し、ラットの脳組織を観察することができる。

(S LXを含む組成物の脳虚血治療効果についてのィンビボ実験）

上記ラットを、実施例 3と同様の方法により、 0 (無症状）から 10 (最も重症の運動麻痺）までの 1 1段階のグレードで評価することができる。

(脳虚血部位のィメ一ジング）

実施例 1、および実施例 5において調製した蛍光を内包させた、 S LX修飾リポソーム、およびリボソームと S LXとを含む組成物をラットに投与する。実施例 4と同様の方法を用いて、上記ラットの脳の蛍光画像を EX p 1 o r e Op t i xにて経時的に撮像する。

(比較例 9.虚血性脳疾患に対する予防効果）

本比較例では、比較例 1〜比較例 6において調製した、 S L X以外の糖鎖で修飾した蛍光内包型糖鎖修飾リボソーム、糖鎖なし蛍光内包型リボソーム、蛍光を内包していない糖鎖なしリボソーム、蛍光を内包していない S LX以外の糖鎖で修飾した糖鎖修飾リボソーム、蛍光色素を含有した S LX (K1) 以外の糖鎖を含む組成物（N—ァセチルラクトサミン（K2) または α 1— 6マンノビオース (Κ3) を含む組成物）、蛍光色素を含有していない S LX以外の糖鎖を含む組成物、 S LXとヒト血清アルブミン（HSA) とを含む組成物（S LX— HS A) 、 SLX単独、 Ν—ァセチルラクトサミン単独または α 1— 6マンノビオース単独を用いる。 Sprague- Dawley (SD)ラット（日本エスエルシー株式会社）に、上記リボソーム、組成物等をそれぞれ投与する。

(抗 E—セレクチン抗体の結合を阻止する効果）

(免疫組織化学染色）

免疫組織化学染色のために、上記ラットから脳を取り出し、常法により標本を作製する。抗 E—セレクチン阻止抗体として、 R&D S y s t ems、カタ口グ番号 AF 977を用い、実施例 2と同様の方法により、標本を免疫組織化学染色し、ラットの脳組織を観察することができる。

(脳虚血部位のィメージング）

比較例 1、および比較例 4において調製した蛍光を内包させた、 S LX修飾リポソーム、およびリボソームと S LXとを含む組成物をラットに投与する。実施例 4と同様の方法を用いて、上記ラットの脳の蛍光画像を EXp l o r e Op t i xにて経時的に撮像する。

コントロールとして、全ての実験において、 s h a m手術をしたラットを用いて同様の実験をおこなう。また、糖鎖なしリボソームを投与したラットについても同様に実験をおこなう。

(比較例 1 0. リボソーム表面に血清アルブミンが結合していないリボソームを用いた場合の効果）

(リポソーム表面に血清アルブミンが結合していない S LXリボソームの調製）

蛍光物質を内包した、リポソーム表面に血清アルブミンが結合していないリポソームは、（1) ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン（DP PE) に架橋剤を介して糖鎖を結合させる方法、または（2) ガンダリオシドのシアル酸を酸化し、カツプリングにより直接糖鎖を結合させる方法により調製することができる。

(1. DP PEに架橋剤を介して糖鎖を結合させる方法）

(蛍光標識したヒト血清アルブミン溶液の調製）

実施例 1と同様の方法により、蛍光標識したヒト血清アルブミン溶液を調製する。蛍光色素として c y 3、 c y 5. 5を用いる。

(リボソームの調製）

リボソームは既報の手法（Yamazaki, N. , Kodama, M. and Gabius, H. -J. (1994) ethods Enzymol. 242, 56-65) により、改良型コール酸透析法を用いて調製する。 (蛍光色素を内包するリポソーム脂質膜面上への糖鎖結合と親水性化処理）本比較例で調製した蛍光色素を内包するリポソーム溶液を、限外濾過にかけ溶液の p Hを調整する。次に、架橋試薬を加え、攪拌し、限外濾過にかける。

糖鎖 S L Xを精製水に溶解し、 N H ₄ H C 0 ₃を溶かした水溶液に加え、攪拌した後、濾過して、糖鎖のグリコシルァミン化合物を得る。

次いで、得られたリボソーム溶液に、調製した糖鎖を加えて、攪拌し、炭酸緩衝液に溶かしたトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンを加え、攪拌し、次いで限外濾過する。リボソーム膜の脂質上に糖鎖とトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンの水酸基を配位させ水和親水性化する。

( 2 . ガンダリオシドのシアル酸を酸化し、カップリングにより直接糖鎖を結合させる方法）

蛍光標識したヒト血清アルブミン溶液の調製方法およびリボソームの調製方法は、本比較例（1 . D P P Eに架橋剤を介して糖鎖を結合させる方法）と同様の方法を用いる。

本比較例で調製した蛍光色素を内包するリポソーム溶液を、限外濾過にかけ溶液の p Hを調製する。次に、架橋試薬を加え攪拌し、限外濾過にかける。次に、炭酸緩衝液に溶かしたトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンをリボソーム溶液に加える。次いで、この溶液を、攪拌し、限外濾過し、遊離のトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンを除去する。これにより、リボソーム膜の脂質上にトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンの水酸基を配位させて水和親水性化する。リポソーム膜の脂質ジパルミトィルフォスファチジルェタノールァミン上に糖鎖とトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンの水酸基を配位させ水和親水性化する。糖鎖 S LXを精製水に溶解し、 NH₄HC0₃を溶かした水溶液に加え、攪拌した後、濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して、糖鎖のグリコシルァミン化合物（アミノ化糖鎖溶液）を得る。

リボソーム膜面上への糖鎖の結合は、既報の手法（Yamazaki, N.， Kodama, M. and Gabius, H. -J. (1994) MethodsEnzymol. 242, 56 - 65) により、カップリング反応法を用いて行う。

(動物モデルの作製）

Sprague-Dawley (SD)ラット（日本エスエルシー株式会社）に、実施例 1と同様のナイ口ン栓子法により右中大脳動脈により灌流されている脳に虚血を誘導する手術を行う。右側中大脳動脈を数時間閉塞し、その後再開通させる。

(集積性の評価）

本比較例では、実施例 2と同様の方法を用いる。上記ラットに、比較例 10において調製した S LXリボソームを投与する。その後、ラットを安楽死させ、脳を取り出し、常法により標本を作製する。蛍光顕微鏡（ォリンパス社製 I X 7 0) を用いて脳内の Cy 3の蛍光を検討することができる。脳血管への集積の確認のため、血管内皮細胞のマーカーである von Willebrand factor (VWF)に対する抗体（S I GMA社製、製造番号 F 3520) で血管を蛍光標識し、 Cy 3との共存を調べることができる。

(抗 E—セレクチン抗体の結合を阻止する効果）

(免疫組織化学染色）

(S LXを含む組成物の脳虚血治療効果についてのインビボ実験）

(蛍光色素を内包せず、リポソーム表面に血清アルブミンが結合していない S LXリボソームの調製）

上記蛍光標識したヒト血清アルブミン溶液のかわりに N—トリス（ヒドロキシメチル）一 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液 (pH8. 4) 溶液を用いること以外、比較例 1 0の（リボソーム表面に血清アルブミンが結合していない S L Xリボソームの調製）と同様の方法により、蛍光色素を内包せず、リボソームの表面に血清アルブミンが結合していないリボソームを調製し、ラットに投与する。上記ラットを、実施例 3と同様の方法により、 0 (無症状）から 1 0 (最も重症の運動麻痺）までの 1 1段階のグレードで評価することができる。

(脳虚血部位のィメ一ジング）

上記ラットに、比較例 1 0において調製した S LXリボソームを投与する。実施例 4と同様の方法を用いて、上記ラットの脳の蛍光画像を EXp l o r e O p t i xにて経時的に撮像する。

(実施例 1 1. リボソームの細胞への取り込み確認）

(ェチジゥムブロマイド（E t B r ) を内包した S LX修飾リボソームの調製）

リボソームは既報の手法（Yamazaki, N. , Kodama, M. and Gabius, H. -J. (1994) Methods Enzymol. 242， 56-65) により、改良型コール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルホスフェート、ガングリオシド（Total Ganglioside Extract (脳、ブターアンモニゥム塩）販売元： A V a n t i、カタログ番号： 1 00 2 3 2 (8 60053 P) ) およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ 35 : 40 : 5 : 1 5 : 5の割合で合計脂質量 45. 6mgになるように混合し、コール酸ナトリウム 46. 9mgを添加し、クロ口ホルムノメタノール（1 ： 1) 溶液 3m lに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜を、 TAPS緩衝生理食塩液から Na C 1を抜いた緩衝液（pH8. 4) 3m lに再懸濁し、 37°Cで 1時間攪拌した。次いで、この溶液を窒素置換し、超音波処理し、透明なミセル懸濁液 3 m lを得た。この超音波処理したミセル懸濁液に 2m Lのェチジゥムブ口マイド（メーカー：シグマァノレドリツチジャパン、製品番号： 09— 061 7 — 1、濃度： 1 OmgZm l) 溶液を撹拌しながらゆつくりと滴下して均一に混合した後（ェチジゥムブロマイド終濃度 2mgZm 1 ) 、このェチジゥムブロマィド入りミセル懸濁液を、 PM10膜（Am i c o n 〇 0. ， 113八）と丁八 P S緩衝生理食塩液から Na C 1を抜いた緩衝液（pH8. 4) を用いた限外濾過（分画分子量： 10， 000) にかけ均一なェチジゥムブ口マイドを内包するリボソーム粒子懸濁液 10m lを調製した。

得られた生理食塩懸濁液中（37°C) のェチジゥムブロマイドを内包するリポソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位 ·粒子径 ·分子量測定装置 (Model Nano ZS， Malvern Instruments Ltd,, UK) 〖こより測定することができる。

(脂質 ·タンパク質定量方法）

本実施例により得られた S LX— L i p o— Cy 5. 5および L i p o— C y 5. 5の脂質量は、 0. 5% T i t o n X— 100存在下、デタミナ一 TC 5 55 (協和メディクス）を用いて、総コレステロール量を測定し、各脂質のモル比から総脂質量を算出することができる。

タンパク質量は、 1 % S D S存在下、 Micro BCA™ Protein Assay Kit (PIERCE)を用いて算出することができる。

(ェチジゥムプロマイドを内包するリボソーム脂質膜面上の親水性化処理）本実施例で調製したェチジゥムブ口マイドを内包するリボソーム溶液 1 Om l を、 XM300膜（Am i c o n Co. , USA) と炭酸緩衝液（pH 8. 5) を用いた限外濾過（分画分子量： 300， 000) にかけ溶液の pHを 8. 5にした。次に、架橋試薬ビス（スルホスクシンィミジル）スべレート（BS3； Pierce Co., USA) 10mgを加え、室温で 2時間攪拌した。その後、さらに 7 °Cでー晚攪拌してリボソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールァミンと B S³との化学結合反応を完結した。そして、このリボソーム液を XM300膜と炭酸緩衝液（pH8. 5) で限外濾過（分画分子量： 300， 000) にかけた。次に、炭酸緩衝液（pH8. 5) 1m lに溶かしたトリス (ヒドロキシメチル）ァミノメタン 4 Omgをリポソーム液 10 m 1に加えた。次いで、この溶液を、室温で 2時間攪拌後、冷蔵下で一晩攪拌し、分画分子量 3 00， 000で限外濾過し、遊離のトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液を N—トリス（ヒドロキシメチル） 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液（pH8. 4) に交換し、リボソーム膜上の脂質に結合した B S³とトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンとの化学結合反応を完結した。これにより、リボソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールァミン上にトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンの水酸基が配位して水和親水性化された。

(ェチジゥムブロマイドを内包するリボソーム膜面上へのヒト血清アルブミン (HS A) の結合）

リボソーム膜面上へのヒト血淸アルブミン（HSA) の結合は、既報の手法

(Yamazaki, N.， Kodama, M. and Gabius, H. -J. (1994) MethodsEnzymol. 242, 56-65) により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は 2 段階化学反応で行った。はじめに、本実施例で得られた 1 Om 1のリボソーム膜面上に存在するガングリオシドを 1 m 1の N—トリス（ヒドロキシメチル）一3 ーァミノプロパンスルホン酸緩衝液（pH8. 4) に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム 10. 8mgをカ卩え、 7 °Cでー晚攪拌して過ヨウ素酸酸化した。 XM3 00膜と？83緩衝液（pH8. 0) で限外濾過（分画分子量： 300， 00 0) することにより、遊離の過ヨウ素酸ナトリゥムを除去し、 N—トリス（ヒド口キシメチル）一 3—ァミノプロパンスルホン酸緩衝液を PBS緩衝液（pH8. 0) に交換して、酸化されたリボソーム 1 Om 1を得た。このリボソーム液に、 2 Omgのヒト血清アルブミン（HSA) /PBS緩衝液（pH8. 0) を加えて室温で 2時間反応させ、次に 2M N a BH₃CNZP B S緩衝液（p H 8. 0) 100 1を加えて室温で 2時間、さらに冷蔵下でー晚攪拌してリボソーム上のガンダリオシドと HS Αとのカツプリング反応で HS Aを結合した。次いで、限外濾過（分画分子量： 300， 000) し、遊離のシァノホウ素酸ナトリウムおよびヒト血清アルブミンを除去し、この溶液の緩衝液を炭酸緩衝液（pH8. 5) に交換して、 HS A結合リボソーム液 1 Om 1を得た。

(糖鎖の調製）

糖鎖としてシァリルルイス X (S LX) (メーカー： CALB I OCHEM、カタログ番号： 565950) を使用した。糖鎖の質量を計測し、以下おいて使用するための前処理をした。

(ェチジゥムプロマイドを内包するリボソーム膜面結合ヒト血清アルブミン (HS A) 上への糖鎖の結合とリンカ一タンパク質（HSA) の親水性化処理）本実施例において調製した糖鎖 2 m gを精製水に溶解し、 0. 25 _§の?^1"1₄ HC〇₃を溶かした 0. 5 m l水溶液に加え、 37 °Cで 3日間攪拌した後、 0. 4 5 μ πιのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して、糖鎖のグリコシルァミン化合物 4mgゾ m 1 (アミノ化糖鎖溶液）を得た。次に、本実施例で得たリボソーム液の一部分 1 Om 1に架橋試薬 3， 3，一ジチォビス

(スノレホスクシンィミジルプロピオネート）（DTSSP; Pierce Co. , USA) 1 0m gを加えて室温で 2時間、続いて冷蔵下で一晩攪拌し、 XM3 0 0膜と炭酸緩衝液（p H 8. 5) で限外濾過（分画分子量： 3 0 0， 0 0 0) して、遊離の D T S S Pを除去し、 DT S S Pがリボソーム上の HS Aに結合したリボソーム 1 0 m lを得た。次に、このリボソーム液に上記のグリコシルァミン化合物（アミノ化糖鎖溶液） 1 2 5 μ 1を加えて、室温で 2時間反応させ、トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン Ζ炭酸緩衝液 (ρ Η8. 5) を添加し、その後、冷蔵下でー晚攪拌し、リボソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上の DT S S Ρにグリコシル化ァミン化合物の結合を行った。 XM3 0 0膜とHE P E S緩衝液（ρ Η 7. 2) で限外濾過（分画分子量： 3 0 0， 0 0 0) して、遊離の糖鎖およびトリス

(ヒドロキシメチル）ァミノメタンを除去した。その結果、糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリボソーム 1 0m lが得られた。本実施例において調製したェチジゥムブ口マイドを内包した S LX修飾リボソームの修飾結合密度は、 0. 0 2 5mgmg糖鎖 Zmg脂質であった。

(ェチジゥムブロマイドの内包量の確認）

S LX修飾リボソームに内包されたェチジゥムブ口マイドの量を測定した。具体的には、 1. 5 mLエツペンチューブに、 2 1のェチジゥムブロマイド内包リポソームおよび 1 0%Tw e e n 2 0を 5 μ 1力 Dえ、さらに DNA 1 μ g/ μ 1を 5 μ 1添加し、精製水で 2 0 0 μ 1 とした。スタンダードとして、ェチジゥムブロマイド内包リボソームの代わりに、 l O O /z gZm l 5 0 μ g/m 1 4 0 μ g/m 1 , 3 0 M g/m 1、 2 0 μ g/m 1 のェチジゥムブ口マイド溶液を添加した。これらに UV 3 6 5 nmをあて、発した蛍光により測定した（蛍光：励起波長 530 nm、蛍光波長 600 nm (G励起）、 U励起で核染色が可能）。

その結果、 S LX修飾リボソームには 30 μ g/ 1のェチジゥムブ口マイドが内包されていることが確認できた。

(粒子径《ゼータ電位測定）

得られた生理食塩懸濁液中（3 7°C) のェチジゥムブロマイドを内包する S L X修飾リボソームの粒子径とゼータ電位をゼータ電位 ·粒子径 ·分子量測定装置 (Model Nano ZS, Malvern Instruments Ltd. , UK) により測定した。その結果、平均粒子径は、 1 9 1 (nm) であった（図 1 4)

(脂質 ·タンパク質定量）

本実施例により得られたェチジゥムブ口マイドを内包する S LX修飾リポソ一ムの脂質量は、 0. 5% T i t o nX— 1 00存在下、デタミナ一 TC 5 5 5 (協和メディクス）を用いて、総コレステロール量を測定し、各脂質のモル比から総脂質量を算出した。その結果、脂質量は、 2 7 2 z gノ 50 μ 1であった。タンパク質量は、 1 % S D S存在下、 Micro BCA™ Protein Assay Kit (PIERCE)を用いて行った。標準物質として B S Aを用いた。その結果、タンパク質量は、 4 // g/50 μ 1であった。タンパク質量 Ζ脂質量は、 0. 0 1 5であつた。

(トランスフエクション）

細胞は、 ATCCより COS 7細胞（カタ口グ番号： CRL— 1 6 5 1) を入手し、用いた。

試薬は F u GENE HD (R o c h e、カタログ番号： 4 70 9 70 5 ) を用いて行なった。プラスミドとして、 p cDNA3. 1 v e c t o r (製品名 p cDNA3. 1 (十）、 I n v i t r o g e n社製カタログ番号 V 790— 20) にヒト E ーセレクチンの cDNA (配列番号 1) を揷入したプラスミド（Eセレクチン強制発現プラスミド）を用いた。

トランスフエクシヨンは、以下のとおり行った。

Eセレクチン強制発現プラスミドを OPT I -MEM I (メーカー： G I BC 0、製品番号： 31 985) で 1 gZ50 /z lに希釈し、この溶液 50 μ 1に FuGENE HD Transfection Reagentを 4 μ 1添加して 30秒間ピペッティングした。この混合液 50 μ 1を 1 X 10⁵個/ゥヱル（培地 500 μ 1 ) に播いた CO S 7細胞に添加した。添加後 72時間後に以下の実験に用いた。

(COS 7細胞での Eセレクチンの発現の確認）

COS 7細胞での Eセレクチンの発現の確認は、以下のとおり行った。コントロールとして、トランスフエクションしていない COS 7細胞を用いた。

Eセレクチン強制発現プラスミドをトランスフエクシヨンした COS 7細胞に、

F I TC標識した抗 E—セレクチン抗体溶液（lmgZm l ) を 1ゥエルあたり 10 μ 1添加し 3時間培養した。 3時間後に、ウエノレを、培地、 PBSで洗浄し、 460〜490 nmの励起光をあて、 520 nmの蛍光を観察した。

蛍光顕微鏡は、 CKX41 (OLYMPUS) を用いた。

その結果、 COS 7細胞において Eセレクチンが発現されていることが確認できた（図 1 5左）。コントロールでは、 Eセレクチンの発現は確認できなかった (図 1 5右）。

(リボソームの添カロ）

トランスフエクシヨンの 72時間後に培地を交換をし、本実施例で調製したェチジゥムブロマイドを内包した S LX修飾リボソームを、 1ゥエルあたり 50 /Z 1添加した。添加した上記リボソームは脂質量で 0. 272mgであった。コントロールとして、 30 μ g m 1のェチジゥムブロマイドを用い、上記リポソームと等量の 1ゥヱルあたり 50 /X 1を添加し、 37°C、 5% C0₂の状態で細胞をィンキュベートした。

添加の 3時間後にゥエルを培地で洗い、蛍光顕微鏡で観察した。

(抗 E—セレクチン抗体の調製）

抗体はハイブリドーマ CL 3株（メーカー： ATCC、製品番号： CRL_ 2 51 5) から精製したものを用いた。

マウス Ba l bZc (雌性 6週齢）に、プリスタン 0. 5mLZマウスを投与した。ハイプリドーマを RPMI ( 10 % F B S , P c + S t) 培地で、 5%C 0₂、 37 °Cで培養した。 PB Sに細胞を懸濁して、 5 X 10⁶細胞マウスでマウスの腹腔内に投与した。約 2週間後に腹水を採取した。硫酸アンモ-ゥム沈殿し、沈殿物を PB Sに溶解させ、 PB S緩衝液で透析を行った。プロテイン G カラム（HiTrap ProteinG colum 1 mL) カラムに透析後の溶液を通した。力ラムを洗浄後、プロテイン Gに結合したモノクローナル抗体を、 0. 1Mグリシン緩衝液（pH2. 7) にて溶出し、溶出液を lMT r i s溶液（pH9. 0) で中和した。

F I TC (シグマ社、 Fluorescein isothiocynate isomer I (FITC)、製 tffi番号： F 7250) を用いて、本実施例で調製した抗 E—セレクチン抗体を標識した。

抗体標識の調製方法は、抗体（l

CB S pH9. 0に溶解） 740 μ 1に F I TC 2mgを添加し、混合して、室温、 6時間、攪拌した。その後、遠心限外濾過（膜： 30K、 b u f f e r ： PB S) し、未結合の F I TCを取り除いた。得られた F I TC標識した抗体溶液を P B S b u f f e r で終濃度タンパク質量 lmg/m 1 とした。 (E—セレクチンの発現確認）

F I TC標識した抗 E—セレクチン抗体溶液（l mgZrn l ) を 1ゥエルあたり 10 /z l添加した。 37°C、 5% C0₂の状態で細胞をインキュベートした。添加 3時間後に培地で洗い、蛍光顕微鏡で観察した。

(顕微鏡観察）

(ィンタ一力レーシヨンしたェチジゥムブ口マイドの観察）

蛍光顕微鏡は、 CKX41 (OLYMPUS) を用いた。

ェチジゥムブ口マイドの染色体へのィンタ一力レーションは 330〜385 n mの励起光をあて、 420 nmの蛍光を観察した（ 100倍または 400倍）。

F I TCについては、 460〜490 nmの励起光をあて、 520 nmの蛍光を観察した（100倍または 400倍）。

(結果）

ェチジゥムブロマイドを内包した S LX修飾リボソームでは、ェチジゥムブ口マイドが核内に移行し、染色体にインターカレーシヨンしているのが確認できた (図 16左）。

一方、ェチジゥムブ口マイドのみだと染色体とのインターカレーシヨンは確認できなかった（図 16右）。

以上より、ェチジゥムブロマイドをリボソームに内包させ、リボソームを S L

Xで修飾すると、このリボソームは細胞内へ移行すること、さらにはェチジゥムブロマイドは核にまで移行することが確認できた。

図 16において、赤色または黄色の蛍光は、染色体とインターカレーシヨンしていないェチジゥムブロマイド単独の蛍光がバックグラウンドで観察されていると考えられる。 (実施例 12. 実験中のラットの生理学的データ）

ラットの生理学的データは、以下のとおり行った。小動物全身麻酔装置（新鋭工業株式会社製、ソフトランダー、承認番号 1 7浦安第 4588号）により、吸入麻酔薬のイソフルラン（アボットジャパン、製品名フォーレン、日本標準商品分類番号 871 1 14) を 5 %濃度で混和した酸素 30 %、笑気 70 %の混合ガスでラットに麻酔を導入した。その後、 1. 5%イソフルランを混和した酸素 3 0%、笑気 70%の混合ガスで麻酔を維持して、実体顕微鏡（ォリンパス社製、 S ZX 12) を用いて、ラット左大腿動脈に力テールを揷入し、血圧測定と動脈血ガス分析を行った。

具体的手順は、以下のとおりである。ラットの左そけい部（腹側）を切開した後、左大腿動脈を周りの組織から露出させた。ポリエチレン性のカテーテル（夏目製作所製、カタログ番号 SP 45) を露出した左大腿動脈に挿入し、観血的血圧計（S t o e 1 t i n g社製、カタログ番号 501 10) に接続し、持続的に平均血圧を測定した。また、カテーテルから約 10 Ο μ 1の血液を採取し、血液分析装置（アイ ·スタツトコ一ポレーション製、 i STAT 300 F型）を用いて、動脈血の pH、動脈血中の C0₂、濃度動脈血中の 0₂濃度を、血管閉塞手術前、血管閉塞手術後、再開通後、およびリボソーム投与後に測定した。

o n o

実験前実験後再開通後投与後

SLX修飾 46.400±2.741 49.850± 1.900 46.275±4.078 50.775±3.607 糖鎖なし 46.550±3.014 50.975士 6.694 43.350±2.700 48.850±6.072 P02

SLX修飾 148.250±22.172 132.000 ± 25.534 133.250 ± 25.617 135.000 ± 7.958 耱鎖なし 151.750± 11.354 120.250 ± 23.286 134.750 ± 9.323 132.500 ±22.694

MAB P ：平均血圧

ρ Η：動脈血の ρ Η

PC02 ：動脈血中の C0₂濃度

PO 2 ：動脈血中の 0₂濃度

この結果より、 S LXでリボソームを修飾しても、投与後短時間（3 0分以内）では、生理学的データには、ほとんど影響がなく、 S LXには急性毒性がないということができる。

(実施例 1 3. 脳以外の中枢神経系における虚血性疾患、虚血性障害および虚血部位への S LX修飾リボソームの集積性および治療効果）

本実施例では、大脳以外の中枢神経系として、間脳、中脳、小脳、橋、延髄、脊髄における虚血性疾患、虚血性障害および虚血部位への S L X修飾リボソームの集積性を検討する。

間脳、中脳、小脳、橋、延髄、脊髄の虚血性疾患、虚血性障害および虚血部位【こつレヽて ίま、例え ί 、 Naidu KA et al. Anesth Analg. 2003 Sep ;97 (3) :857— 62.、 Zhou, Y. et al. , Induction of neuronal and inducible nitric oxide synthase in the motoneurons of spinal cord following transient abdominal aorta occlusion in rats, J. Surg. Res. 87 (1999) 185- 193.、 Kim H. et al. Delayed preconditioning effect of isof lurane on spinal cord ischemia in rats. Neuroscience Letters, 440(3): 211- 216などに記載されるプロトコ一ノレに従って作製することができる。

本実施例では、実施例 1と同様の方法により調製した S L X修飾蛍光内包リポソームを用いて、実施例 2と同様の方法により、 S LX修飾リボソームの集積性を確認することができる。さらに、実施例 3と同様の方法により、 S LX修飾リポソ一ムの虚血性疾患、虚血性障害および虚血部位に対する治療効果を検討することができる。以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。産業上の利用可能性

本発明のシァリルルイス Xを含む組成物は、虚血性脳疾患に特異的に集積し、その部位の炎症を抑える効果を有する。本発明の組成物はまた、単独で、虚血性脳疾患の後遺症である運動性障害などを回避することができるという有用性を提供する。本発明の組成物は、標識などを含めることにより、診断薬としても利用され得る。

Claims

請求の範囲

1. 親水性化されたリボソームと、シァリルルイス X (SLX) または S LX基とを含む、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態を処置または予防するための医薬組成物。

2. 歩行障害または姿勢保持障害を回復させるための、請求項 1に記載の医薬組成物。 3. 前記親水性化がトリス（ヒドロキシメチル）メチルァミノ基による、請求項

1に記載の医薬組成物。

4. 前記リボソームを構成する脂質の一部が、親水性化合物架橋基一 W—トリス (ヒドロキシメチル）メチルァミノ基と NH— C ( = 0) 結合しており、ここで、該 Wは、 C ( = 0) 一 NH結合である、請求項 3に記載の医薬組成物。

5. 前記リボソームと前記 S LX基とが、ヒト血清アルブミン基を介して結合している、請求項 1に記載の医薬組成物。 6. 前記リボソームを構成する脂質の一部は、ヒト血清アルブミン基一 A—リンカータンパク質架橋基一 X— S LX基と CH₂— NH結合しており、ここで、該 Aは、 NH— C ( = θ) 結合であり、該 Xは、 C ( = 0) — NH結合である、請求項 5に記載の医薬組成物。記リボソームの表面に前記 S LX基が存在する、請求項 1に記載の医薬組

8. 前記中枢神経系が、脳である、請求項 1に記載の医薬組成物。

9. 中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態を診断するための診断用組成物であって、以下：

A) 親水性化されたリボソームと、

B) シァリルルイス X (S LX) または S LX基と、

C) 標識物質

とを含む、診断用組成物。 10. 磁気共鳴画像法において使用するための、請求項 9に記載の診断用組成物。

1 1. 前記親水性化がトリス（ヒドロキシメチル）メチルァミノ基による、請求項 9に記載の診断用組成物。 1 2. 前記リボソームを構成する脂質の一部が、親水性化合物架橋基一 W—トリス（ヒドロキシメチル）メチルァミノ基と NH— C (=0) 結合しており、ここで、該 Wは、 C ( = 0) 一 NH結合である、請求項 1 1に記載の診断用組成物。

13. 前記リボソームと前記 S LX基とが、ヒト血淸アルブミン基を介して結合している、請求項 9に記載の診断用組成物。

14. 前記リボソームを構成する脂質の一部は、ヒト血清アルブミン基— A—リンカータンパク質架橋基一 X— S LX基と CH₂— NH結合しており、ここで、該 Aは、 NH— C (=0) 結合であり、該 Xは、 C ( = 0) —NH結合である、請求項 13に記載の診断用組成物。

1 5 . 前記リボソームの表面に前記 S L X基が存在する、請求項 9に記載の診断用組成物。

1 6 . 前記中枢神経系が、脳である、請求項 9に記載の診断用組成物。

1 7 . 分子イメージングにより脳虚血を診断するための請求項 9に記載の診断用組成物であって、

1 8 . 前記標識物質が、蛍光物質である、請求項 1 7に記載の診断用組成物。

1 9 . 中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態を処置または予防するための方法であって、該方法は、中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態を処置または予防する必要のある患者に、請求項 1に記載の有効量の医薬組成物を投与する工程を包含する、方法。

2 0 . 中枢神経系の虚血部位を検出するための方法であって、該方法は、中枢神経系の虚血部位を検出する必要のある患者に、請求項 9に記載の有効量の診断用組成物を投与する工程；および

を包含する、方法。

21. 中枢神経系の虚血性疾患、虚血性障害または虚血状態を処置、予防、検出または診断するための医薬の製造における、 S LXまたは S LX基含有化合物の使用。 22. 細胞内に目的の物質を送達するための送達媒体であって、

A) 親水性化されたリボソームと、

B) シァリルルイス X (SLX) または SLX基と、

C) 目的物質

とを含む、送達媒体。

23. 前記細胞が、 Eセレクチンを発現している細胞である、請求項 22に記載の送達媒体。

24. 前記目的物質が、蛍光物質、蛍光タンパク質、発光酵素、タンパク質、錯体、コロイド、難水溶性薬物、水溶性薬物および核酸からなる群より選択される、請求項 22に記載の送達媒体。

25. 前記目的物質が、 3， 8—ジアミノー 5—ェチル— 6 _フエニルフエナントリジニゥムブロミド（ェチジゥムブロマイド）、 2，一（4一エトキシフエ二ル）一5— (4—メチル一 1—ピペラジニル）一2, 5 ' —ビ 1H— (へキスト

33342) 、 2，一（4—ヒドロキシフエニル）一5— (4—メチル一 1—ピペラジニル）一 2， 5 ' 一ビー 1 H—べンゾィミダゾール，三塩酸塩（へキスト 33258) 、 P I、 3， 6—ビス（ジメチルァミノ）アタリジン塩酸塩（プロビジゥムィオダイド）、 4' ， 6—ジアミジノ一 2—フエニルインドール，二塩酸塩（DAP I) 、 3, 6—ビス（ジメチルァミノ）ァクリジン塩酸塩（アタリジンオレンジ、 A〇）、 5— (N—スクシンィミジルォキシカルボニル）一 3，， 6，一 0， 0，一ジァセチルフルォレセイン（CF SE) 、 6— (N—スクシンイミジノレォキシカノレボニノレ） - 3 ' , 6，一 0, Ο' —ジァセチノレフノレォレセィン（CFSE) 、フルォレセインジアセテート（FDA) 、 3，， 6，一ジ（Ο ーァセチル）一4' ， 5' —ビス [Ν， Ν—ビス（カルボキシメチル）アミノメチル] フルォレセイン，テトラァセトキシメチルエステノレ（C a 1 c e i η_Α Μ) 、 7—イソブチルォキシカルボニルォキシ一 3 Η—フエニキサジン一 3—ォン（Cy t oRe d) 、 3 ' —O—ァセチルー 2，， 7 ' 一ビス（カルボキシェチル） — 4—カルボキシフルォレセイン，ジァセトキシメチルエステル（BCE CF—AM) および 3，一O—ァセチル— 2，， 7， —ビス（カルボキシェチル）一 5—カルボキシフルォレセイン，ジァセトキシメチルエステル（BCEC F— AM) からなる群より選択される、請求項 22に記載の送達媒体。