[go: up one dir, main page]

WO2009043963A1 - Uso de la secuencia codificante del dominio carboxilo terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica como medicamento - Google Patents

Uso de la secuencia codificante del dominio carboxilo terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica como medicamento Download PDF

Info

Publication number
WO2009043963A1
WO2009043963A1 PCT/ES2008/070186 ES2008070186W WO2009043963A1 WO 2009043963 A1 WO2009043963 A1 WO 2009043963A1 ES 2008070186 W ES2008070186 W ES 2008070186W WO 2009043963 A1 WO2009043963 A1 WO 2009043963A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hctetx
mice
treatment
tetanus toxin
medicament
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/ES2008/070186
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
María MORENO IGOA
Ana Cristina Calvo Royo
Mª Jesús MUÑOZ GONZALVO
Mª PILAR ZARAGOZA FERNÁNDEZ
José AGUILERA AVILA
Rosario Ostas Pinzolas
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitat Autonoma de Barcelona UAB
Universidad de Zaragoza
Original Assignee
Universitat Autonoma de Barcelona UAB
Universidad de Zaragoza
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to EP08836703.2A priority Critical patent/EP2210611B1/en
Priority to RU2010115135/15A priority patent/RU2495676C2/ru
Priority to CN2008801173975A priority patent/CN101873865B/zh
Priority to MX2010003695A priority patent/MX2010003695A/es
Priority to ES08836703.2T priority patent/ES2463770T3/es
Priority to BRPI0817792 priority patent/BRPI0817792A2/pt
Application filed by Universitat Autonoma de Barcelona UAB, Universidad de Zaragoza filed Critical Universitat Autonoma de Barcelona UAB
Priority to CA2701521A priority patent/CA2701521C/en
Priority to JP2010527478A priority patent/JP5325224B2/ja
Publication of WO2009043963A1 publication Critical patent/WO2009043963A1/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US12/754,552 priority patent/US8945586B2/en
Priority to US14/570,976 priority patent/US20160017008A1/en
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/4886—Metalloendopeptidases (3.4.24), e.g. collagenase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10071—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/16143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/00041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/00043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/00071—Demonstrated in vivo effect

Definitions

  • the present invention relates to the use of the coding sequence of the domain of the carboxyl terminal end of the heavy chain of the tetanus toxin as a medicament, preferably in the treatment of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), as well as the polypeptide encoded by said sequence for the treatment of said disease.
  • ALS Amyotrophic Lateral Sclerosis
  • Amyotrophic Lateral Sclerosis (Lou Gehrig's or Charcot's disease) is a progressive, incurable and deadly disease that involves the degeneration of motor neurons at the medullary, bulbar and motor cortex levels. In the case of Spain, the disease has an incidence of 2 / 100,000 and a prevalence of 1 / 10,000, which indicates that approximately 40,000 Vietnamese University of Amyotrophic Lateral Sclerosis -ADELA -).
  • adenoviral vectors that express various neurotrophic factors (GDNF, CNTF, NI-4, IGF-1), which have offered encouraging results.
  • adenoviral injections have the disadvantage of having to be applied in neonatal animals due to the great immune response they cause. Therefore, although its results are encouraging, it is essential to develop new, less immunogenic vectors that enable an effective treatment of ALS. In relation to the clinical trials that have been carried out to date, those initiated in 1996 by Dr.
  • neurotrophic factors when administered systemically, they present toxicity problems when acting on other tissues. Despite all these inconveniences, the therapeutic possibilities of neurotrophic factors have not ceased to be investigated due to their promising results in the preclinical phase. Specifically, the last clinical trial that is taking place at the Medical Center in Rochester (Minnesota) is based again on the administration of a neurotrophic factor, IGF-1.
  • HcTeTx non-toxic terminal carboxyl domain of the heavy chain of tetanus toxin
  • a first aspect of the invention relates to the use of a polynucleotide comprising the coding sequence of isolated HcTeTx, its allelic variants or functional fragments thereof for the elaboration of a medicine, preferably for the treatment of ALS.
  • the HcTeTx coding sequence encompasses from the triplet coding for amino acid V (Valine) of the amino terminal end of HcTeTx to the triplet coding for amino acid D (Aspartate), preferably from amino acid V (854) to D (1315) of the sequence with access number (NCBI .: P04958).
  • the HcTeTx coding sequence is SEQ ID NO: 1 and the HcTeTx fragment is SEQ ID NO: 5.
  • this polynucleotide will be referred to as "polynucleotide of the invention”.
  • the polynucleotide of the invention can be mutated (deletion, insertion, inversion, point mutation, etc.) where said mutations do not affect its ability to act as a medicine, specifically for the treatment of ALS.
  • the maintenance of the therapeutic effect of the polynucleotide of the mutated invention can be verified by means of the reproduction of any of examples I and II. Throughout the description, these mutated polynucleotides will also be considered allelic variants.
  • the polynucleotide of the invention can also comprise promoter, terminator, silencer sequences, sequences that facilitate its integration into chromosomes or any type of organizational structure of the genetic material, etc.
  • a second aspect of the invention is related to the use of a vector comprising the polynucleotide of the invention for the preparation of a medicament, preferably for the treatment of ALS, where said vector is selected from the group comprising, without any limitation. , plasmids, phages, cosmids, phagemids, artificial yeast chromosomes (YAC), artificial bacterial chromosomes (BAC), artificial human chromosomes (HAC), viral vectors, such as adenovirus, retrovirus or any other type of DNA or RNA molecule with ability to replicate inside a cell, prokaryotic or eukaryotic.
  • this vector will be referred to as "vector of the invention”.
  • a third aspect of the invention relates to the use of a transgenic cell for the preparation of a medicament, preferably for the treatment of ALS, where said cell comprises the polynucleotide of the invention or the vector of the invention.
  • a fourth aspect of the invention refers to the use of an isolated polypeptide comprising the HcTeTx sequence, its allelic variants or its functional fragments thereof for the preparation of a medicament for the treatment of ALS.
  • the HcTeTx sequence covers from amino acid V (854) to D (1315) of the sequence with access number (NCBI .: P04958).
  • the sequence of HcTeTx is Ia
  • polypeptide of the invention SEQ ID NO: 2 and the HcTeTx fragment is Ia SEQ ID NO: 6.
  • polypeptide of the invention this polynucleotide will be referred to as "polypeptide of the invention".
  • the polypeptide of the invention is mutated (deletion, insertion, inversion, specific amino acid substitutions, etc.), although said mutations do not affect its ability to act as a medicine in the treatment of ALS.
  • the maintenance of the therapeutic effect of the mutated polypeptide of the invention can be verified by means of the reproduction of examples 1-2.
  • the polynucleotide, the vectors, the transgenic cells or polypeptide of the invention will be formulated in a pharmaceutical form suitable for administration, by the route of administration chosen.
  • said pharmaceutical composition will include the pharmaceutically acceptable carriers and excipients necessary for the preparation of the pharmaceutical form of administration chosen.
  • excipients or vehicles that can be used in the preparation of said pharmaceutical composition as well as on pharmaceutical forms of administration of active ingredients, in general, can be found in the book "Tratado de Farmacia Galenica", C. Fauli i Trillo of 1 to Edition, 1993, Luzán 5, SA of Editions.
  • Said pharmaceutical composition comprises, at least, any of the elements of the group comprising: the polynucleotide, the vectors, the transgenic cells or the polypeptide of the invention must be in a therapeutically effective amount.
  • therapeutically effective amount refers to the amount of the selected element calculated to produce the desired effect and, in general, will be determined, among other causes, by the characteristics of the polypeptide element itself and the therapeutic effect to be achieved, the characteristics of the individual to be treated, the severity of the disease suffered by said individual, etc.
  • this pharmaceutical composition will be known as "pharmaceutical composition or medicament of the invention”.
  • the pharmaceutical composition of the invention can be administered by any appropriate route of administration, for example, orally, parenterally, nasally (mucosa), etc., typically, parenterally, advantageously, by intramuscular or subcutaneous administration.
  • said pharmaceutical composition may be presented in any form of presentation suitable for administration, for example, in the form of a solid presentation (tablets, capsules, granules, etc.), liquid (solutions, suspensions, emulsions, etc.), etc. , for administration by the chosen route of administration.
  • said pharmaceutical composition is formulated in the form of an appropriate unit dosage pharmaceutical form.
  • the pharmaceutical composition may be in a pharmaceutical form for oral administration, either in solid form, preferably liquid, more preferably ready for intramuscular administration.
  • a pharmaceutical form for oral administration include tablets, capsules, granules, solutions, suspensions, etc., and may contain conventional excipients, such as binders, diluents, disintegrants, lubricants, humectants, etc., and may be prepared. by conventional methods.
  • the pharmaceutical compositions can also be adapted for parenteral administration, in the form of, for example, sterile freeze-dried solutions, suspensions or products, in the appropriate dosage form; in this case, said pharmaceutical compositions will include suitable excipients, such as buffers, surfactants, etc. In any case, the excipients will be chosen based on the pharmaceutical form of administration selected.
  • suitable excipients such as buffers, surfactants, etc.
  • the excipients will be chosen based on the pharmaceutical form of administration selected.
  • the pharmaceutical composition may comprise other polypeptides, polycycleotides, vectors, or cells that provide greater efficiency and composition.
  • polynucleotide refers to a polymeric form of nucleotides of any length, whether deoxyribonucleotides or ribonucleotides. This term refers exclusively to the primary structure of the molecule. Thus, this term includes bi- and mono-catenary DNA, as well as bi- and mono-catenary RNA.
  • isolated throughout the description when used in association with HcTeTx or its coding sequence, not only refers to these being isolated from the human body, but also not they are forming part of fusion proteins or enzymes that will exert a therapeutic function.
  • allelic variant refers throughout the description to a polypeptide substantially homologous and functionally equivalent to the C-terminal domain of the heavy chain of the tetanus toxin.
  • a peptide is "substantially homologous" to said domain when its amino acid sequence has a degree of identity with respect to the amino acid sequence of said domain of at least 60%, 70%, 85% and , more preferably, at least 95%.
  • the amino acid sequence of said domain is SEQ ID NO: 2.
  • This term also refers in the description to a polynucleotide capable of encoding a polypeptide substantially homologous and functionally equivalent to HcTeTx.
  • the polynucleotide may have a homology of at least 40%, 50%, 60%, 70%, 85% or 95% with the polynucleotide encoding HcTeTx, whose nucleotide sequence is preferably SEQ ID NO: 1.
  • FIG. 1 Amplification by PCR for the detection of the expression of HcTeTx.
  • the cDNA obtained was amplified by PCR for the HcTeTx gene.
  • Lane 5 shows the positive control (plasmid pCMV-HcTeTx) and in lane 6 the target of the reaction was charged. In the M street is the size marker of 100 bp.
  • Figure 8 Analysis of proteins involved in the apoptosis signaling pathway in the spinal cord of symptomatic SOD1 G93A mice of 110 days of age.
  • FIG. 9 Western-blot analysis of the phosphorylation of Akt and Erk1 / 2 proteins. Samples of 5 mice were analyzed per group. IDV (Intensity Density Valué). The amounts analyzed according to the western blot are shown as the ratio with respect to ⁇ -tubulin with respect to the values of wild-type mice. ( * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01; error bars indicate SEM). The bars represent the same groups that have been described in the previous legend.
  • Intramuscular treatment of mice injected with HcTeTx affects the expression of genes related to calcium homeostasis in the spinal cord of SOD1 G93A transgenic mice.
  • HcTeTx via intramuscular injection of naked DNA delays the onset of symptoms and prolongs survival in SOD1G93A mice.
  • transgenic animals that overexpress the gene for human superoxide dismutase-1 (SOD-1) with different mutations has provided animal models for the study of ALS disease. These animals have clinical and pathological characteristics of ALS patients.
  • SOD1 G93A One of the most studied and characterized models is the transgenic mouse SOD1 G93A, which presents a mutation by replacing the amino acid glycine with alanine in position 93 in the gene for the enzyme SOD-1.
  • Various therapeutic compounds have been successfully tested in this animal model. However, it has not translated into an effective therapy in human clinical trials, either due to an inadequate route of administration and / or due to the poor bioavailability of the therapeutic molecules to reach the target cells.
  • AAV adeno-associated virus
  • HcTeTx C-terminal domain of the tetanus toxin heavy chain -SEQ ID NO: 2 of 462 amino acids-
  • CMV cytomegalovirus promoter
  • Transgenic mice that overexpress human SOD1 with the G93A mutation (B6SJL-TgN [SOD1-G93A] 1 Gur) were obtained from The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Hemizigotic mutants were used in all experiments (a mutant male paired with a non-transgenic female). Transgenic mice were identified by PCR amplification of DNA extracted from the tail, as described in Gurney et al. (Gurney et al., 1994. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation. Science, 264 (5166): 1772-5). The animals were kept in the Mixed Research Unit of the University of Zaragoza. They were provided with water and food ad libitum. All experiments and care in animals were developed in accordance with the standards of the University of Zaragoza and the international guide for the use of laboratory animals.
  • SOD1 G93A transgenic mice were injected intramuscularly with 300 ⁇ g of pCMV-HcTeTx in the quadriceps muscles (two injections of 50 ⁇ g per muscle) and in the triceps muscles (a single injection of 50 ⁇ g per muscle).
  • the group of control mice was injected with the same amounts of empty plasmid.
  • the SuperScriptTM First-Strand Synthesis System (Invitrogen) kit was used, starting from 1 ⁇ g of RNA in a final volume of 20 ⁇ L. PCR reactions were carried out in a final volume of 20 ⁇ L, with 15OnM of each primer, 150 ⁇ M of dNTPs, 2mM of MgCI 2 , 1X of buffer, 0.2U Taq pol and 2 ⁇ l_ by reaction of cDNA diluted 10 times for the amplification of a fragment of the HcTeTx gene.
  • the grid test was used to determine muscle strength and the onset of ALS symptoms.
  • the animals performed this test once a week from the age of 8 weeks.
  • Each mouse was placed on a rack that serves as a cover for conventional cages.
  • the grid was then rotated 180 ° and kept at a distance of approximately 60cm from a soft surface to avoid injury.
  • the latency of each mouse was timed to fall.
  • Each of the mice had up to three attempts to hold on the inverted grid for a maximum of 18Os and the longest period of time was recorded.
  • the rotarod test was used to evaluate motor coordination, strength and balance. The animals were placed on the rotating bar of the apparatus
  • mice The end point in the life of the mice was considered when the animal placed supine cube was not able to turn on itself.
  • the ability of the pCMV-HcTeTx vector constructed to express the coding gene in the muscle cells of the SOD1 G93A transgenic mice was confirmed. Because there is no endogenous expression of the HcTeTx gene in these mice, the PCR amplification of a fragment of this gene was applied to the injected muscles for the detection of the mRNA expression of said molecule. As Figure 1 shows, no expression of the HcTeTx gene is observed in the control group injected with an empty plasmid. However, the PCR reveals the presence of the amplification of the HcTeTx gene in the muscle inoculated with the vector coding for it, indicating that the vector successfully reaches the muscle cells and that the transcription process of said gene is performed.
  • Intramuscular treatment with naked DNA encoding HcTeTx causes a delay in the onset of symptoms, improves motor activity and postpones the end point of the disease in the mouse model for ALS, which contains the G93A mutation in the human SOD1 gene.
  • the manifestation of the symptoms was recorded as the first day in which the mice could not be held in the inverted grid for three minutes.
  • the onset of symptoms was significantly reduced in approximately 8 days in the group of animals injected with HcTeTx, compared to the control group ( Figure 2. and Table 1.).
  • Figure 3 and Table 1 the maximum survival was detected in the mice of the group treated with HcTeTx, which reached an average of 136 days; 16 days more than the control group.
  • weeks 12 and 13 there is a notable decrease in the development of the activity on the rotarod of the control group, while in the group of treated animals these deficiencies are not observed until week 16 ( Figure 4).
  • Table 1 Table where the data of the manifestation of symptoms and survival are collected, both in the control group and in the treatment with HcTeTx, as well as the P value (Log Rank, Mantel-Cox).
  • HcTeTx C-terminal domain of the tetanus toxin heavy chain, SEQ ID NO: 1
  • CMV cytomegalovirus
  • Transgenic mice that overexpress human SOD1 with the G93A mutation (B6SJL-TgN [SOD1-G93A] 1 Gur) were obtained from The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Hemizigotic mutants were used in all experiments (a mutant male paired with a non-transgenic female). Transgenic mice were identified by PCR amplification of DNA extracted from the tail, as described in Gurney et al. (Gurney et al., 1994. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu 1 Zn superoxide dismutase mutation. Science, 264 (5166): 1772-5). The animals were kept in the Mixed Research Unit of the University of Zaragoza. They were provided with water and food ad libitum.
  • SOD1 G93A transgenic mice were injected intramuscularly with 300 ⁇ g pC MV-HcTeTx in the quadriceps muscles (two injections of 50 ⁇ g per muscle) and in the triceps muscles (a single injection of 50 ⁇ g per muscle). The group of control mice was injected with the same amounts of empty plasmid.
  • the spinal cords were removed after 110 days intramuscular injections of the plasmids, which were then pre - frozen and stored in liquid nitrogen at -70 0 C.
  • the tissues were frozen in liquid nitrogen and then were sprayed in a cold mortar. Half of the sample was used for RNA extraction and the other half was used for protein extraction.
  • Total spinal cord RNA was extracted according to the RNeasy® Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen) protocol.
  • the SuperScriptTM First-Strand Synthesis System (Invitrogen) kit was used, starting from 2 ⁇ g of RNA in a final volume of 20 ⁇ L.
  • HcTeTx A mechanism of action of HcTeTx is the phosphorylation of Akt (Gil et al., 2003. Biochem J. 373: 613-620), a kinase protein that is activated by several growth factors involved in blocking phosphatidylinositol-mediated pathways.
  • Akt Akt
  • kinase Densitometric quantification indicated that animals treated with HcTeTx had more than twice the levels of phosphorylated Akt in Ser473 when compared with controls of the empty vector (P ⁇ 0.05), as determined by western blot analysis using phospho antibodies -specific ( Figure 9). Equimolar protein loading was confirmed by detection with anti-tubulin antibodies.
  • HcTeTx The polypeptide used (called HcTeTx) used corresponds to the domain C-terminal of the heavy chain of the tetanus toxin and comprises the sequence of 451 amino acids (SEQ ID NO: 1) of the SEQ ID N 0 2, and has been obtained following the protocol described by Gil et al. (Gil et al., 2003. Biochem.J. 373,613-620).
  • Transgenic mice that overexpress human SOD1 with the G93A mutation (B6SJL-TgN [SOD1-G93A] 1 Gur) were obtained from The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Hemizigotic mutants were used in all experiments (a mutant male paired with a non-transgenic female). Transgenic mice were identified by PCR amplification of DNA extracted from the tail, as described in Gurney et al. (Gurney et al., 1994. Science, 264 (5166): 1772-5). The animals were kept in the Mixed Research Unit of the University of Zaragoza. They were provided with water and food ad libitum. All experiments and animal care were developed in accordance with the standards of the University of Zaragoza and the international guide for the use of laboratory animals.
  • the SOD1 G93A transgenic mice were injected intraperitoneally with 250 ⁇ l at a concentration of 0.5 ⁇ M of the polypeptide comprising the C-terminal domain of the tetanus toxin (HcTeTx). The injection was repeated weekly throughout life.
  • mice The end point in the life of the mice was considered when the supine-cubed animal was not able to turn on itself.
  • HcTeTx causes changes in the expression of calcium-related genes in the spinal cord of SOD1G93A mice.
  • NCS1 amyotrophic lateral sclerosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La presente invención se refiere al uso de la secuencia codificante del domino del extremo carboxilo terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica como medicamento, preferentemente en el tratamiento de la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA), así como el polipéptido codificado por dicha secuencia para el tratamiento de la mencionada enfermedad.

Description

USO DE LA SECUENCIA CODIFICANTE DEL DOMINIO CARBOXILO TERMINAL DE LA CADENA PESADA DE LA TOXINA TETÁNICA COMO MEDICAMENTO.
La presente invención se refiere al uso de Ia secuencia codificante del domino del extremo carboxilo terminal de Ia cadena pesada de Ia toxina tetánica como medicamento, preferentemente en el tratamiento de Ia Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA), así como el polipéptido codificado por dicha secuencia para el tratamiento de Ia mencionada enfermedad.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La Esclerosis Lateral Amiotrófica (enfermedad de Lou Gehrig's o de Charcot) es una enfermedad progresiva, incurable y mortal que cursa con Ia degeneración de motoneuronas a nivel medular, bulbar y de cortex motor. En el caso de España, Ia enfermedad presenta una incidencia de 2/100.000 y una prevalencia de 1/10.000, Io que indica que aproximadamente 40.000 españoles desarrollarán Ia enfermedad a Io largo de su vida (fuente: Asociación Española de Esclerosis Lateral Amiotrófica -ADELA-).
A pesar de ser una enfermedad declarada como tal desde hace largo tiempo, aún no se conocen con exactitud las causas que Ia originan y, aunque existen formas genéticas de Ia misma, también son conocidos casos en los que no parece tener un origen hereditario. Así, se estima que el 10% de los casos son de origen genético, las formas familiares, de los cuales un 15-20% se corresponden con mutaciones a nivel de Ia enzima Superóxido Dismutasa (SOD-1.) e incluso también se han observado mutaciones en esta enzima en formas esporádicas de Ia enfermedad (Brown. R. H. Jr. (1997). Arch. Neurol. 54(10) 1246-1250). Mutaciones en NFH, gen que codifica para Ia cadena pesada de los neurofilamentos, también han sido encontradas de forma excepcional en algún enfermo de esclerosis lateral amiotrófica. Consecuentemente, Ia investigación de Ia herencia genética de esta enfermedad presenta gran interés.
En los últimos años, Ia creación de modelos animales de Ia enfermedad ha sido una de las herramientas más relevantes en los estudios de tratamiento experimental, que han servido para aclarar algunas dudas sobre sus causas, aunque todavía éstas son desconocidas en gran medida. Ni los ratones knockout para Ia enzima SOD-1 , ni los animales transgénicos para Ia diferentes mutaciones en Ia enzima SOD-1 humana han conseguido reproducir un cuadro clínico similar a Ia enfermedad en humanos. El animal que más se aproxima al desarrollo de Ia enfermedad es un transgénico que presenta varias copias de Ia Superóxido dismutasa mutada en su posición 93, es el llamado SOD1G93A (Tu, P. H., et al. (1996.) Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 93(7): 3155-3160.) que es suministrado por The Jackson Laboratory.
A pesar de los numerosos estudios realizados tanto para conocer su causa como su mecanismo por el momento no existen tratamientos clásicos efectivos. Actualmente, se encuentran en desarrollo tres líneas de investigación basadas en Ia aplicación de antagonistas del glutamato, factores neurotróficos y antioxidantes, aunque hasta Ia fecha ninguna de ellas a desembocado en un tratamiento eficaz.
Desde hace unos años se conoce Ia capacidad de los factores neurotróficos para rescatar a Ia motoneuronas de Ia degeneración. De gran interés han resultado las experiencias de terapia génica realizadas en modelos animales, utilizando vectores adenovirales que expresan diversos factores neurotróficos (GDNF, CNTF, NI-4, IGF-1 ), que han ofrecido resultados esperanzadores. Sin embargo, las inyecciones adenovirales presentan el inconveniente de tener que aplicarse en animales neonatos debido a Ia gran respuesta inmunitaria que ocasionan. Por tanto, aunque sus resultados sean esperanzadores resulta imprescindible el desarrollo de nuevos vectores menos inmunogénicos que posibiliten un tratamiento efectivo de Ia ELA. En relación a los ensayos clínicos que han sido llevados a cabo hasta Ia fecha, los iniciados en el año 1996 por el Dr. Schuelp no obtuvieron resultados satisfactorios (http://www.wiley.co.uk/genetherapy), barajándose como las posibles causas del fracaso: Ia naturaleza del factor neurotrófico utilizado en los ensayos (CNTF) y/o su falta de accesibilidad al Sistema Nervioso Central. En 1999, el grupo del Dr. Axel Kahn comprobó en modelos animales que efectivamente Ia vía de administración de dicho factor neurotrófico resulta un factor importante para su efecto terapéutico (Haase et al. (1999) Ann. Neurol. 45(3) 296-304). Esta falta de especificidad también ha sido propuesta como causa probable del fracaso en Ia administración de BDNF en humanos de forma subcutánea.
Por otra parte, cuando los factores neurotróficos son administrados de forma sistémica presentan problemas de toxicidad al actuar sobre otros tejidos. A pesar de todos estos inconvenientes las posibilidades terapéuticas de los factores neurotróficos no han dejado de investigarse debido a sus prometedores resultados en fase preclínica. Concretamente, el último ensayo clínico que está teniendo lugar en el Medical Center in Rochester (Minnesota) se basa de nuevo en Ia administración de un factor neurotrófico, IGF-1.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los autores de Ia presente invención han descubierto que el dominio carboxilo terminal, no tóxico, de Ia cadena pesada de Ia toxina tetánica (HcTeTx), que hasta Ia fecha únicamente había sido utilizado en el tratamiento de ELA como vehículo de diversos factores neurotróficos, así como de Ia enzima SOD-1 , mediante Ia creación de proteínas de fusión, es capaz por si solo de prolongar Ia supervivencia de modelos animales de Ia enfermedad.
Así, un primer aspecto de Ia invención se relaciona con el uso de un polinucleótido que comprende Ia secuencia codificante de HcTeTx aislada, sus variantes alélicas o fragmentos funcionales de las mismas para Ia elaboración de un medicamento, preferentemente para el tratamiento de ELA. En una realización preferida de Ia invención Ia secuencia codificante de HcTeTx abarca desde el triplete codificante del aminoácido V (Valina) del extremo amino terminal de HcTeTx hasta el triplete que codifica para el aminoácido D (Aspartato), preferentemente del aminoácido V(854) a D (1315) de Ia secuencia con número de acceso (NCBI.: P04958). En una realización todavía más preferida de este aspecto de Ia invención Ia secuencia codificante de HcTeTx es Ia SEQ ID NO: 1 y el fragmento de HcTeTx es Ia SEQ ID NO:5. En adelante este polinucleótido será denominado como "polinucleótido de Ia invención".
En otra realización preferida, el polinucleótido de Ia invención puede encontrarse mutado (delección, inserción, inversión, mutación puntual, etc.) donde dichas mutaciones no afectan a su capacidad para actuar como medicamento, concretamente para el tratamiento de ELA. El mantenimiento del efecto terapéutico del polinucleótido de Ia invención mutado puede ser comprobado mediante Ia reproducción de cualquiera de los ejemplos I y II. A Io largo de Ia descripción estos polinucleótidos mutados serán considerados también como variantes alélicas.
En una realización también preferida el polinucleótido de Ia invención puede comprender además secuencias promotoras, terminadoras, silenciadoras, secuencias que faciliten su integración en cromosomas o cualquier tipo de estructura organizativa del material genético, etc.
Un segundo aspecto de Ia invención, está referido al uso de un vector que comprende al polinucleótido de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento, preferentemente para el tratamiento de ELA, donde dicho vector es seleccionado del grupo que comprende, sin ningún tipo de limitación, plásmidos, fagos, cósmidos, fagémidos, cromosomas artificiales de levaduras (YAC), cromosomas artificiales de bacterias (BAC), cromosomas humanos artificiales (HAC), vectores virales, tales como adenovirus, retrovirus o cualquier otro tipo de molécula de DNA o ARN con capacidad para replicarse en el interior de una célula, procariota o eucariota. En adelante este vector será denominado como "vector de Ia invención".
Un tercer aspecto de Ia invención está referido al uso de una célula transgénica para Ia elaboración de un medicamento, preferentemente para el tratamiento de ELA, donde dicha célula comprende al polinucleótido de Ia invención o al vector de Ia invención.
Un cuarto aspecto de Ia invención se refiere al uso de un polipéptido aislado que comprende Ia secuencia de HcTeTx, sus variantes alélicas o sus fragmentos funcionales de las mismas para Ia elaboración de un medicamento para el tratamiento de ELA. En una realización preferida de Ia invención Ia secuencia de HcTeTx abarca desde el aminoácido V(854) a D(1315) de Ia secuencia con número de acceso (NCBI.: P04958). En una realización todavía más preferida de este aspecto de Ia invención, Ia secuencia de HcTeTx es Ia
SEQ ID NO: 2 y el fragmento de HcTeTx es Ia SEQ ID NO:6. En adelante este polinucleótido será denominado como "polipéptido de Ia invención".
En otra realización preferida, el polipéptido de Ia invención está mutado (delección, inserción, inversión, sustituciones puntuales de aminoácidos, etc.), aunque dichas mutaciones no afectan a su capacidad para actuar como medicamento en el tratamiento de ELA. El mantenimiento del efecto terapéutico del polipéptido de Ia invención mutado puede ser comprobado mediante Ia reproducción de los ejemplos 1-2.
Para Ia administración del medicamento o Ia composición farmacéutica el polinucleótido, los vectores, las células transgénicas o polipéptido de Ia invención se formularán en una forma farmacéutica adecuada para su administración, por Ia vía de administración elegida. Para ello, dicha composición farmacéutica incluirá los vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables necesarios para Ia elaboración de Ia forma farmacéutica de administración elegida. Información sobre excipientes o vehículos que pueden ser utilizados en Ia elaboración de dicha composición farmacéutica, así como sobre formas farmacéuticas de administración de principios activos, en general, puede encontrarse en el libro "Tratado de Farmacia Galénica", de C. Faulí i Trillo, 1a Edición, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones.
Dicha composición farmacéutica comprende, al menos, cualquiera de los elementos del grupo que comprende: el polinucleótido, los vectores, las células transgénicas o el polipéptido de Ia invención deben encontrarse en una cantidad terapéuticamente efectiva. En el sentido utilizado en esta descripción, Ia expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a Ia cantidad del elemento seleccionado calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias del propio elemento polipéptido y el efecto terapéutico a conseguir, las características del individuo que vaya a ser tratado, Ia severidad de Ia enfermedad que padezca dicho individuo, etc. En adelante esta composición farmacéutica será conocida como "composición farmacéutica o medicamento de Ia invención".
La composición farmacéutica de Ia invención puede ser administrada por cualquier vía de administración apropiada, por ejemplo, por vía oral, parenteral, nasal (mucosa), etc., típicamente, por vía parenteral, ventajosamente, mediante su administración intramuscular o subcutánea. Asimismo, dicha composición farmacéutica puede presentarse en cualquier forma de presentación apropiada para su administración, por ejemplo, en forma de presentación sólida (comprimidos, cápsulas, granulos, etc.), líquida (soluciones, suspensiones, emulsiones, etc.), etc., para su administración por Ia vía de administración elegida. En una realización preferida, dicha composición farmacéutica se formula en forma de una forma farmacéutica de dosificación unitaria apropiada.
En una realización preferida, Ia composición farmacéutica puede estar en una forma farmacéutica de administración por vía oral, bien en forma sólida, preferentemente líquida, más preferentemente lista para su administración vía intramuscular. Ejemplos ilustrativos de formas farmacéuticas de administración por vía oral incluyen comprimidos, cápsulas, granulados, soluciones, suspensiones, etc., y pueden contener los excipientes convencionales, tales como aglutinantes, diluyentes, desintegrantes, lubrificantes, humectantes, etc., y pueden ser preparadas por métodos convencionales. En otra realización preferida, las composiciones farmacéuticas también pueden ser adaptadas para su administración parenteral, en forma de, por ejemplo, soluciones, suspensiones o productos liofilizados, estériles, en Ia forma de dosificación apropiada; en este caso, dichas composiciones farmacéuticas incluirán los excipientes adecuados, tales como tampones, tensioactivos, etc. En cualquier caso, los excipientes se elegirán en función de Ia forma farmacéutica de administración seleccionada. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de fármacos y de su preparación puede encontrarse en el libro "Tratado de Farmacia Galénica", de C. Faulí i Trillo, 10 Edición, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones, citado supra. Además, Ia composición farmacéutica puede comprender otros polipéptidos, policleótidos, vectores, o células que aporten una mayor eficacia y a Ia composición.
Definiciones:
El término "polinucleótido", tal y como se utiliza en esta memoria, se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos. Este término se refiere exclusivamente a Ia estructura primaria de Ia molécula. Así, este término incluye DNA bi- y mono-catenario, así como RNA bi- y mono-catenario.
El término "aislado" a Io largo de Ia descripción cuando se emplea en asociación con HcTeTx o su secuencia codificante, no únicamente está referido a que éstos se encuentran aislados del cuerpo humano, sino que además no se están formando parte de proteínas o enzimas de fusión que vayan a ejercer una función terapéutica.
La expresión "fragmento funcional de HcTeTx, variantes alélicas de Ia misma o las secuencias que las codifican" está referida a Io largo de Ia descripción a un péptido o un polinucleótido que comprende una porción de HcTeTx, sus variantes alélicas o sus secuencias codificantes, que mantienen su capacidad para actuar como medicamento, más concretamente para el tratamiento de
ELA, donde el mantenimiento de su capacidad terapéutica puede ser comprobado mediante Ia reproducción de los ejemplos 1-3.
El término "variante alélica" se refiere a Io largo de Ia descripción a un polipéptido sustancialmente homólogo y funcionalmente equivalente al dominio C-terminal de Ia cadena pesada de Ia toxina tetánica. Tal como aquí se utiliza, un péptido es "sustancialmente homólogo" a dicho dominio cuando su secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad respecto a Ia secuencia de aminoácidos de dicho dominio de, al menos, un 60%, 70%, 85% y, más preferentemente de, al menos, un 95%. Preferentemente Ia secuencia aminoacídica del mencionado dominio es Ia SEQ ID NO:2. Este término también está referido en Ia descripción a un polinucleótido capaz de codificar un polipéptido sustancialmente homólogo y funcionalmente equivalente a HcTeTx. De este modo, el polinucleótido podrá tener una homología de al menos un 40%, 50%, 60%, 70%, 85% ó 95% con el polinucleótido codificante de HcTeTx, cuya secuencia nucleotídica es preferentemente Ia SEQ ID NO: 1.
La expresión "funcionalmente equivalente", tal y como se emplea a Io largo de Ia descripción, significa que el polipéptido o el polipéptido mantiene su capacidad para actuar como medicamento, más concretamente para el tratamiento de ELA, donde el mantenimiento de su capacidad terapéutica puede ser comprobado mediante Ia reproducción del ejemplo I o II. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Amplificación por PCR para Ia detección de Ia expresión de HcTeTx. Diez días tras Ia inyección intramuscular del plásmido pCMV-HcTeTx (n=2, calles 1 y 2) y del plásmido vacío pCMV (n=2, calles 3 y 4) se extrajo el RNA del músculo y se procedió a Ia retrotranscripción. El cDNA obtenido se amplificó por PCR para el gen HcTeTx. La calle 5 muestra el control positivo (plásmido pCMV-HcTeTx) y en Ia calle 6 se cargó el blanco de Ia reacción. En Ia calle M se encuentra el marcador de talla de 100pb.
Figura 2. Efectos del tratamiento con DNA desnudo codificante para HcTeTx sobre el comienzo de los síntomas en ratones modelo para Ia enfermedad de ELA SOD1 G93A. La manifestación de los síntomas se retrasó significativamente en el grupo tratado con HcTeTx (n=10) con respecto al grupo control (n=10). Las probabilidades acumuladas se calcularon mediante el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier (SPSS 13.0).
Figura 3. Efectos del tratamiento con DNA desnudo codificante para HcTeTx sobre Ia supervivencia en ratones modelo para Ia enfermedad de ELA SOD1G93A. La supervivencia aumentó notablemente en el grupo tratado con HcTeTx (n=10) con respecto al grupo control (n=10). Las probabilidades acumuladas se calcularon mediante el análisis de supervivencia de Kaplan- Meier (SPSS 13.0).
Figura 4. Efectos del tratamiento con DNA desnudo codificante HcTeTx. La actividad motora se determinó mediante el rotarod a una velocidad constante de 14rpm, con un tiempo máximo de desarrollo de 18Os. Se observa una mejor actividad motora en el grupo tratado con HcTeTx (n=10) respecto al control (n=10).
Figura 5. Efecto de Ia inyección intramuscular de DNA desnudo codificante HcTeTx en ratones SOD1-G93A. La fuerza y función motora de los ratones fueron probadas por medio del test hanging-wire. Se utilizaron 10 ratones de cada grupo (n=10).
Figura 6. Efecto de Ia inyección intramuscular de DNA desnudo codificante HcTeTx en ratones SOD1-G93A. Medidas de los pesos de los ratones transgénicos tratados con HcTeTx. Se utilizaron 10 ratones de cada grupo (n=10).
Figura 7. Análisis de Ia expresión de genes implicados en Ia ruta de señalización de apoptosis en Ia médula espinal de ratones SOD1G93A sintomáticos de 110 días de edad. Representación de los valores medios de RNA mensajero de los genes Caspi , Casp3, Bax y Bcl2 en el control (blanco) y en los ratones tratados con HcTeTx (gris). Los grupos anteriores de ratones fueron comparados con ratones tipo salvaje (negro) (n=5 ratones por grupo).
Figura 8. Análisis de proteínas implicadas en Ia ruta de señalización de apoptosis en Ia médula espinal de ratones SOD1 G93A sintomáticos de 110 días de edad. Análisis western-blot de las proteínas pro-Casp3, Casp3 activa, Bax y Bcl2 en usados de médula espinal de ratones tratados con HcTeTx (rayas grises) y ratones control (rayas negras) en relación con ratones tipo salvaje (negro) (n=5 ratones por grupo).
Figura 9. Análisis western-blot de Ia fosforilación de las proteínas Akt y Erk1/2. Fueron analizadas muestras de 5 ratones por grupo. IDV (Intensity Density Valué). Las cantidades analizadas según el western-blot se muestran como el ratio respecto de β-tubulina respecto de los valores de los ratones tipo salvaje. (*P<0.05, **P<0.01 ; las barras de error indican el SEM). Las barras representan los mismos grupos que han sido descritos en Ia leyenda anterior. Figura 10. Efectos del tratamiento intraperitoneal con el polipéptido que contiene el dominio C terminal de Ia cadena pesada de Ia toxina tetánica (HcTeTx) sobre Ia supervivencia en ratones modelo para Ia enfermedad de ELA SOD1 G93A. La supervivencia aumentó notablemente en el grupo tratado con HcTeTx (n= 3, línea punteada) con respecto al grupo control (n=3, línea continua). Las probabilidades acumuladas se calcularon mediante el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier (SPSS 13.0).
Figura 11. El tratamiento intramuscular de ratones inyectados con HcTeTx afecta a Ia expresión de genes relacionados con Ia homeostasis del calcio en médula espinal de ratones transgénicos SOD1 G93A. Fueron determinados los niveles de expresión de los genes Ncs1 y Rrad en ratones transgénicos tratados con HcTeTx (gris) o con el plásmido vacío (blanco). Los cambios en los niveles de RNA mensajero en los grupos anteriores de ratones fueron comparados con los ratones tipo salvaje (negro). (*P<0.05; las barras de error indicant el SEM; n=5 ratones por grupo).
EXPOSICIÓN DETALLADA DE MODOS DE REALIZACIÓN
A continuación se ilustrará Ia invención mediante los ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto Ia eficacia de HcTeTx, así como de su secuencia codificante, para su uso como medicamento, y más preferentemente para el tratamiento de ELA.
EJEMPLO 1
La administración de HcTeTx vía inyección intramuscular de DNA desnudo retrasa el comienzo de los síntomas y prolonga Ia supervivencia en ratones SOD1G93A.
La generación de animales transgénicos que sobreexpresan el gen para Ia superóxido dismutasa-1 (SOD-1 ) humana con distintas mutaciones ha proporcionado modelos animales para el estudio de Ia enfermedad de ELA. Estos animales presentan características clínicas y patológicas propias de los enfermos de ELA. Uno de los modelos más estudiados y caracterizados es el ratón transgénico SOD1 G93A, que presenta una mutación por sustitución del aminoácido glicina por alanina en posición 93 en el gen para Ia enzima SOD-1. En este modelo animal se han probado con éxito diversos compuestos terapéuticos. Sin embargo no se ha traducido en una terapia efectiva en ensayos clínicos humanos, ya sea por una inadecuada ruta de administración y/o por Ia escasa biodisponibilidad de las moléculas terapéuticas para alcanzar las células diana. Algunas estrategias de terapia génica incluyen el uso del virus adenoasociado (AAV), que es transportado retrógradamente a motoneuronas tras inyección intramuscular. Sin embargo existe Ia posibilidad de que el uso de vectores virales pueda causar daños añadidos en los enfermos tratados. La utilización del DNA desnudo se presenta como una estrategia alternativa más segura y apropiada para hacer llegar a los enfermos un gen terapéutico específico.
Materiales y métodos
1.1 DNA desnudo codificante para HcTeTx
El gen codificante para HcTeTx (dominio C-terminal de Ia cadena pesada de Ia toxina tetánica -SEQ ID NO: 2 de 462 aminoácidos-) fue clonado en el plásmido de expresión eucariota pcDNA3.1 (Invitrogen), bajo control del promotor del citomegalovirus (CMV). Los vectores se produjeron en bacterias Escherichia coli (DH5α) químicamente competentes y se purificaron utilizando el kit GenElute maxiprep de Sigma-Aldrich.
1.2 Ratones transgénicos
Los ratones transgénicos que sobreexpresan SOD1 humana con Ia mutación G93A (B6SJL-TgN[SOD1-G93A]1 Gur) se obtuvieron de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Se utilizaron mutantes hemizigóticos en todos los experimentos (un macho muíante apareado con una hembra no transgénica). Los ratones transgénicos se identificaron por amplificación por PCR del DNA extraído de Ia cola, como se describe en Gurney et al. (Gurney et al., 1994. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation. Science, 264 (5166): 1772-5). Los animales se conservaron en Ia Unidad Mixta de Investigación de Ia Universidad de Zaragoza. Se les proporcionó agua y comida ad libitum. Todos los experimentos y cuidados en los animales fueron desarrollados de acuerdo con las normas de Ia Universidad de Zaragoza y Ia guía internacional para el uso de animales de laboratorio.
1.3 Inyección intramuscular de DNA desnudo y extracción de músculo
A Ia edad de 8 semanas se inyectaron intramuscularmente ratones transgénicos SOD1 G93A con 300 μg de pCMV-HcTeTx en los músculos cuadríceps (dos inyecciones de 50 μg por músculo) y en los músculos tríceps (una inyección única de 50 μg por músculo). El grupo de ratones control fue inyectado con las mismas cantidades de plásmido vacío. Diez días después de las inyecciones intramusculares de los plásmidos, se extrajeron los músculos inoculados que fueron precongelados en nitrógeno líquido y posteriormente almacenados a -70 0C.
1.4 Extracción de RNA, síntesis de cDNA y amplificación por PCR
Los tejidos se congelaron en nitrógeno líquido y seguidamente fueron pulverizados en un mortero frío. El RNA total de los músculos fue extraído de acuerdo con el protocolo de TRIzol Reagent (Invitrogen). Para Ia síntesis de cDNA se empleó el kit SuperScriptTM First-Strand Synthesis System (Invitrogen), partiendo de 1 μg de RNA en un volumen final de 20μL. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen final de20μL, con 15OnM de cada cebador, 150μM de dNTPs, 2mM de MgCI2, 1X de buffer, 0,2U Taq pol y 2μl_ por reacción de cDNA diluido 10 veces para Ia amplificación de un fragmento del gen HcTeTx. Todas las reacciones de PCR se realizaron en GeneAmp® Thermal Cycler 2720 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Los parámetros de ciclos termales fueron los siguientes: incubación a 94 0C durante 3min y 35 ciclos de 940C durante 3Os, 610C durante 3Os y 72 0C durante 3Os. La presencia de Ia amplificación del gen HcTeTx se observó en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. Las secuencias de los cebadores directo y reverso empleadas fueron las SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, respectivamente. La talla del amplicón corresponde a 355 pb.
1.5 Test de rotarod, prueba de Ia rejilla v supervivencia.
La prueba de Ia rejilla se utilizó para determinar Ia fuerza muscular y el comienzo de los síntomas de ELA. Los animales realizaron este test una vez por semana desde Ia edad de 8 semanas. Cada ratón fue colocado sobre una rejilla que sirve de tapa para las jaulas convencionales. La rejilla fue después girada 180° y mantenida a una distancia de aproximadamente 60cm de una superficie blanda para evitar lesiones. Se cronometró Ia latencia de cada ratón a caer. Cada uno de los ratones tuvo hasta tres tentativas para sujetarse en Ia rejilla invertida durante un máximo de 18Os y se registró el período de tiempo más largo.
El test de rotarod fue empleado para evaluar Ia coordinación motora, Ia fuerza y el equilibrio. Los animales fueron colocados sobre Ia barra giratoria del aparato
(ROTA-ROD/RS, LE8200, LSI-LETICA Scientific Insturments). Se registró el tiempo durante el cual un animal podía mantenerse en dicha barra a una velocidad constante de 14 rpm. Cada ratón tuvo tres oportunidades y se registró el período de tiempo más largo sin que los animales cayeran de Ia barra, tomando arbitrariamente un tiempo límite de 18Os.
El punto final en Ia vida de los ratones se considero cuando el animal colocado de cubito supino no fue capaz de volverse sobre si mismo.
Resultados
2.1 Detección de Ia expresión del plásmido en músculo
Inicialmente se confirmó Ia capacidad del vector pCMV-HcTeTx construido de expresar el gen codificante en las células musculares de los ratones transgénicos SOD1 G93A. Debido a que no existe expresión endógena del gen HcTeTx en estos ratones, se aplicó a los músculos inyectados Ia amplificación por PCR de un fragmento de este gen para Ia detección de Ia expresión del mRNA de dicha molécula. Como muestra Ia Figura 1., no se observa expresión del gen HcTeTx en el grupo control inyectado con plásmido vacío. Sin embargo Ia PCR revela Ia presencia de Ia amplificación del gen HcTeTx en el músculo inoculado con el vector codificante para el mismo, indicando que el vector alcanza con éxito las células musculares y que se realiza el proceso de transcripción de dicho gen.
2.2 HcTeTx retrasa Ia manifestación de los síntomas, mejora Ia capacidad motora v prolonga Ia supervivencia de los ratones transqénicos
SOD1 G93A
El tratamiento intramuscular con DNA desnudo codificante para HcTeTx produce un retraso en el comienzo de los síntomas, mejora Ia actividad motora y pospone el punto final de Ia enfermedad en el ratón modelo para ELA, que contiene Ia mutación G93A en el gen SOD1 humano. La manifestación de los síntomas se registró como el primer día en el que los ratones no pudieron mantenerse sujetos en Ia rejilla invertida durante tres minutos. El comienzo de los síntomas se redujo muy significativamente en aproximadamente 8 días en el grupo de animales inyectados con HcTeTx, con respecto al grupo control (Figura 2. y Tabla 1.). Como se observa en Ia Figura 3 y en Ia Tabla 1 , Ia máxima supervivencia se detectó en los ratones del grupo tratado con HcTeTx, que alcanzaron una media de 136 días; 16 días más que el grupo control. Entre las semanas 12 y 13 se observa un descenso notable en el desarrollo de Ia actividad sobre el rotarod del grupo control, mientras que en el grupo de animales tratados no se observan esas deficiencias hasta Ia semana 16 (Figura 4).
Control HcTeTx Valor P
(n=10) (n=10)
Comienzo de
102.4 ± 2,4 110,9 ± 2,0 0,0295 síntomas (días) Mortalidad (días) 120.5 ± 3,9 136,0 ± 3, 0,0093
Diferencia comienzo-
18,1 25,1 mortalidad (días)
Tabla 1. Tabla donde se recogen los datos de Ia manifestación de los síntomas y Ia supervivencia, tanto en el grupo control como en el tratado con HcTeTx, así como el valor P (Log Rank, Mantel-Cox).
El tratamiento también fue evaluado en ratones a partir de 8 semanas de edad mediante el test "hanging-wire" (Figura 5). A las 14 semanas de edad, los ratones SOD1G93A demostraron las primeras muestras de debilidad, mientras que el grupo de ratones tratados con HcTeTx se mostraron más resistentes entre las semanas 14-16. Además, los ratones del grupo control empezaron a perder peso a partir de 14 semanas de edad asociado a Ia enfermedad. Sin embargo, el tratamiento con HcTeTx contrarrestó significativamente Ia pérdida de peso, mostrando un peso máximo a las 15 semanas (Figura 6).
EJEMPLO 2
Inhibición de Ia apoptosis en médula espinal de ratones SOD1G93A tratados mediante inyección intramuscular de DNA desnudo codificante para HcTeTx Materiales y métodos
1.1 DNA desnudo codificante para HcTeTx
El gen codificante para HcTeTx (dominio C-terminal de Ia cadena pesada de Ia toxina tetánica, SEQ ID NO:1 ) fue clonado en el plásmido de expresión eucariota pcDNA3.1 (Invitrogen), bajo control del promotor del citomegalovirus (CMV). Los vectores se produjeron en bacterias Escherichia coli (DH5α) químicamente competentes y se purificaron utilizando el kit Genelute maxiprep de Sigma-Aldrich.
1.2 Ratones transgénicos
Los ratones transgénicos que sobreexpresan SOD1 humana con Ia mutación G93A (B6SJL-TgN[SOD1-G93A]1 Gur) se obtuvieron de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Se utilizaron mutantes hemizigóticos en todos los experimentos (un macho muíante apareado con una hembra no transgénica). Los ratones transgénicos se identificaron por amplificación por PCR del DNA extraído de Ia cola, como se describe en Gurney et al. (Gurney et al., 1994. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu1Zn superoxide dismutase mutation. Science, 264 (5166): 1772-5). Los animales se conservaron en Ia Unidad Mixta de Investigación de Ia Universidad de Zaragoza. Se les proporcionó agua y comida ad libitum. Todos los experimentos y cuidados animales fueron desarrollados de acuerdo con las normas de Ia Universidad de Zaragoza y Ia guía internacional para el uso de animales de laboratorio. Se emplearon un total de 12 animales: wild-type (n=5), ratones SOD1 G93A inyectados con pcDNA3.1 (controles, n=5) y ratones SOD1G93A tratados con HcTeTx (n=5).
1.3 Invección intramuscular de DNA desnudo y extracción de médula espinal A Ia edad de 8 semanas se inyectaron intramuscularmente ratones transgénicos SOD1 G93A con 300 μg de pC MV- HcTeTx en los músculos cuadríceps (dos inyecciones de 50 μg por músculo) y en los músculos tríceps (una inyección única de 50 μg por músculo). El grupo de ratones control fue inyectado con las mismas cantidades de plásmido vacío.
Las médulas espinales se extrajeron 110 días después de las inyecciones intramusculares de los plásmidos, que fueron precongelados en nitrógeno líquido y posteriormente almacenados a -70 0C. Los tejidos se congelaron en nitrógeno líquido y seguidamente fueron pulverizados en un mortero frío. La mitad de Ia muestra se empleó para Ia extracción de RNA y Ia otra mitad se utilizó para Ia extracción proteica.
1.4 Extracción de RNA de médula espinal v síntesis de cDNA
El RNA total de las médulas espinales fue extraído de acuerdo con el protocolo de RNeasy® Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen). Para Ia síntesis de cDNA se empleó el kit SuperScriptTM First-Strand Synthesis System (Invitrogen), partiendo de 2 μg de RNA en un volumen final de 20μL.
1.5 PCR en tiempo real
Las reacciones de PCR en tiempo real se llevaron a cabo en un volumen final delOμL, con 1X de TaqMan® Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG
(Applied Biosystems), 1 X de Ia mezcla de cebadores no marcados y sondas
TaqMan® MGB (Applied Biosystems) para cada gen a estudio y 1 μL por reacción de cDNA diluido 10 veces. Para Ia normalización se emplearon 3 genes endógenos (18s rRNA, GAPDH y β-actina). Las referencias de Ia mezcla de cebadores y sondas empleadas para amplificar cada uno de los genes a estudio fueron las siguientes: caspasa-3 (Mm00438023_m1 ), caspasa-1
(Mm00438023_m1 ), NCS-1 (Mm00490552_m1 ), Rrad (Mm00451053_m1 ), 18s rRNA (Hs99999901 ), GAPDH (4352932E) y β-actina (4352933E). Todas las reacciones de PCR se realizaron en un termociclador ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Los parámetros de ciclos termales fueron los siguientes: incubación a 950C durante 10min y 40 ciclos de 950C durante 15s y 6O0C durante 1 min. La expresión relativa de caspasa-3, caspasa-1 , NCS-1 y Rrad fue normalizada aplicando Ia media geométrica de los tres genes endógenos.
1.6 Extracción de proteína de médula espinal y análisis de Western blot
Las muestras de médula espinal de ratones wild type y ratones SOD1 G93A tratados con HcTeTx se homogeneizaron en nitrógeno líquido con el buffer de extracción de composición 15OmM NaCI, 5OmM Tris-HCI pH=7,5, 1 % desoxicolato, 0,1 % SDS, 1 % Tritón X-100, 1 mM NaOVa, 1mM PMSF, 10μg/mL leupeptina y aprotinina y 1 μg/mL pepstatina. Se centrifugó a 40C, durante 10 minutos a 3000 g. Una vez cuantificada Ia concentración de proteína del sobrenadante de cada muestra mediante el método de BCA (9643 Sigma), se cargaron 25μg de proteína en un gel al 10% de acrilamida. Se utilizaron membranas de PVDF para el proceso de transferencia, las cuales se bloquearon con solución TTBS al 5% de leche desnatada (2OmM Tris base, 0,15M NaCI, pH=7,5, 0,1 % Tween) durante una hora. Más tarde se incubaron con el anticuerpo primario toda Ia noche a 40C (anti-p-Akt (sc-7985R, Sta. Cruz)). Se utilizó GAPDH (Gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa) para normalizar Ia medida obtenida con Akt (anti-GAPDH (sc-25778, Sta. Cruz)). Tras incubar con el anticuerpo primario, las membranas se lavaron con TTBS y se incubaron con el anticuerpo secundario 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se procedió a revelar mediante quimioluminiscencia (Western Blotting Luminol Reagent, sc-2048 Sta. Cruz). Las películas se escanearon y se analizaron mediante el software AlphaEase FC (Bonsai Technologies). El análisis estadístico se llevó a cabo usando el test de ANOVA y el test de Student-Neuman-Keuls. Resultados
En este estudio se presentan los resultados de Ia aplicación de HcTeTx sobre ratones SOD1 G93A modelo para Ia enfermedad de ELA, donde existe una degeneración de las motoneuronas. El estudio transcripcional a nivel de médula espinal de estos ratones, en edad sintomática se muestra en Ia Figura 7. Comparando Ia regulación transcripcional de los genes caspasa-1 , caspasa- 3, Bax y Bcl2 implicados en apoptosis en Ia etapa sintomática tardía (110 días de edad) en Ia médula espinal de los ratones tipo salvaje y los ratones SOD1G93A. Los resultados demostraron Ia inducción significativa de los genes caspasa-1 (P<0.05), caspasa-3 (P<0.05) y Bcl2 (P<0.01 ), pero no se encontró ninguna diferencia significativa en el perfil de expresión del gen Bax (P>0.05) en ratones control SOD1 G93A cuando fueron comparados con tipo salvaje (Figura 7). En el grupo de ratones que recibieron el tratamiento con HcTeTx, los niveles de expresión de caspasa-1 y caspasa-3 se mantuvieron en el tipo salvaje y sólo fueron encontradas diferencias significativas cuando se compararon con el grupo de ratones no tratados (P<0.05 y P<0.01 , respectivamente). Sin embargo, Ia expresión de los genes Bax y Bcl2 no fue afectada por el tratamiento de HcTeTx (P>0.05) en las médulas espinales de estos ratones transgénicos (Figura 7).
Para evaluar los efectos de HcTeTx sobre los mecanismos que revierten Ia apoptosis que pueden inducir muerte celular en Ia médula espinal de los ratones de SOD1G93A, también fue realizado un estudio de proteínas. Los datos revelaron que Ia activación del gen caspasa-3 (P<0.05) disminuyó perceptiblemente en los ratones tratados con HcTeTx en relación con el grupo control, alcanzando niveles similares a los ratones tipo salvaje, mientras que los niveles de Ia proteína pro-caspasa-3 no se vieron afectados en los animales transgénicos. En contraste con los resultados obtenidos del análisis de expresión, en el western-blot se observó que las proteínas Bax y Bcl2 estaban en menor cantidad en los ratones tratados con HcTeTx (Figura 8). Un mecanismo de acción de HcTeTx es Ia fosforilación de Akt (Gil et al., 2003. Biochem J. 373:613-620), una proteína kinasa que es activada por varios factores de crecimiento implicados en el bloqueo de rutas mediadas por fosfatidilinositol 3-kinasa. La cuantificación densitométrica indicó que los animales tratados con HcTeTx tenían más de dos veces los niveles de Akt fosforilada en Ser473 cuando fueron comparados con los controles del vector vacío (P<0.05), según Io determinado por análisis western blot mediante el empleo de anticuerpos fosfo-específicos (Figura 9). La carga equimolar de proteínas fue confirmada por detección con anticuerpos anti-tubulina. La fosforilación de ERK1/2 por HcTeTx se ha divulgado previamente en neuronas corticales cultivadas (Gil et al., 2003. Biochem J. 373:613-620). Para confirmar Ia implicación de HcTeTx en Ia ruta MAP kinasa, fueron realizados análisis western blot en los extractos de Ia médula espinal de ratones tratados y no tratados de SOD1 G93A con 110 días de edad. Los resultados demostraron una activación creciente de ERK1/2 en ratones control cuando fueron comparados con el grupo tratado con HcTeTx (Figura 9), pero el nivel de expresión fue similar al de los ratones tipo salvaje.
EJEMPLO 3
Incremento de supervivencia en ratones SOD1G93A modelos para Ia esclerosis lateral amiotrófica tras Ia administración vía inyección intraperitoneal de un polipéptido que comprende el dominio C-terminal de Ia cadena pesada de Ia toxina tetánica (HcTeTx).
Materiales y Métodos
1.1 Extracción del polipéptido que comprende el dominio C-terminal de Ia cadena pesada de Ia toxina tetánica (HcTeTx)
El polipéptido utilizado (denominado HcTeTx) utilizado corresponde al dominio C-terminal de Ia cadena pesada de Ia toxina tetánica y comprende Ia secuencia de 451 aminoácidos (SEQ ID NO:1 ) de Ia SEQ ID N0 2, y ha sido obtenido siguiendo el protocolo descrito por Gil et al. (Gil et al., 2003. Biochem.J. 373,613-620).
1.2 Ratones transgénicos
Los ratones transgénicos que sobreexpresan SOD1 humana con Ia mutación G93A (B6SJL-TgN[SOD1-G93A]1 Gur) se obtuvieron de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Se utilizaron mutantes hemizigóticos en todos los experimentos (un macho muíante apareado con una hembra no transgénica). Los ratones transgénicos se identificaron por amplificación por PCR del DNA extraído de Ia cola, como se describe en Gurney et al. (Gurney et al., 1994. Science, 264 (5166): 1772-5). Los animales se conservaron en Ia Unidad Mixta de Investigación de Ia Universidad de Zaragoza. Se les proporcionó agua y comida ad libitum. Todos los experimentos y cuidados animales fueron desarrollados de acuerdo con las normas de Ia Universidad de Zaragoza y Ia guía internacional para el uso de animales de laboratorio.
1.3 Invección intraperitoneal del polipéptido en los animales.
A Ia edad de 12 semanas se inyectaron intraperitonealmente los ratones transgénicos SOD1 G93A con 250 μl a una concentración de 0.5 μM del polipéptido que comprende el dominio C terminal de Ia toxina tetánica (HcTeTx). La inyección fue repetida semanalmente durante toda Ia vida.
1.4 Medida de Ia supervivencia en los animales.
El punto final en Ia vida de los ratones se considero cuando el animal colocado de cubito supino no fue capaz de volverse sobre si mismo. Resultados
1.1.- HcTeTx prolonga Ia supervivencia de los ratones transgénicos SOD1G93A
Como se observa en Ia Figura 10 y en Ia Tabla 2, Ia máxima supervivencia se detectó en los ratones del grupo tratado con HcTeTx, gue alcanzaron una media de 135 días; 9 días más gue el grupo control.
Control HcTeTx Valor P
(n=3) (n=3)
Mortalidad 126 ± 4 135 ± 2 0,021
Tabla 2. Se muestran los datos de Ia supervivencia, tanto en el grupo control como en el tratado con HcTeTx, así como el valor P.
EJEMPLO 4
La administración de HcTeTx causa cambios en Ia expresión de genes relacionados con el calcio en Ia médula espinal de ratones SOD1G93A.
Hay evidencias de homeostasis anormal intracelular del calcio relacionada con esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Se ha demostrado gue Ia proteína neuronal NCS1 regula Ia neurosecreción de una manera calcio-dependiente (McFerran et al., 1998. J. Biol. Chem. 273: 22768-22772) y también ha sido relacionada con Ia modulación de las enzimas calcio/calmodulina dependientes implicadas en Ia transducción neuronal de Ia señal (Schaad et al., 1996. PNAS. 93: 9253- 9258). Se probó Ia expresión de NCS1 de tejidos de Ia médula espinal de ratones SOD1 G93A 50 días después del tratamiento con HcTeTx. En los experimentos de RT-PCR se encontró gue Ia expresión del gen NCS1 estaba reprimida (P<0.05) en los ratones transgénicos con sintomatología tardía respecto de los ratones tipo salvaje de Ia misma edad. Por otra parte, los ratones que recibieron el tratamiento intramuscular de HcTeTx tenían niveles más altos de NCS1 (P<0.05), acercándose a los del tipo salvaje. Con las mismas muestras, se analizaron los niveles del RNA mensajero del gen relacionado con Ras y asociado con el gen de Ia diabetes (Rrad). En este ejemplo se muestra que los niveles de Rrad fueron incrementados casi dos veces en Ia médula espinal de los ratones transgénicos control, cuando fueron comparados con ratones del tipo salvaje de edad comparable. Sin embargo, en comparación con los controles, el tratamiento con HcTeTx en ratones SOD1G93A redujo perceptiblemente Ia expresión de Rrad (P<0.05), alcanzando valores similares a los obtenidos en los ratones tipo salvaje (Figura 11 ).

Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso de un polinucleótido aislado que comprende Ia secuencia codificante del dominio carboxilo terminal de Ia subunidad pesada de Ia toxina tetánica (HcTeTx), sus variantes alélicas o fragmentos funcionales de las mismas para Ia elaboración un medicamento.
2. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el HcTeTx es codificado por Ia SEQ ID NO: 1.
3. Uso según Ia reivindicación 1 donde el fragmento de Ia secuencia codificante del dominio carboxilo terminal de Ia subunidad pesada de Ia toxina tetánica tiene Ia SEQ ID NO: 6.
4. Uso de un vector que comprende cualquiera de los polinucleótidos de las reivindicaciones anteriores para Ia elaboración de un medicamento.
5. Uso de una célula transgénica que comprende cualquiera de los polinucleótidos de las reivindicaciones 1-3 para Ia elaboración de un medicamento.
6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el medicamento es para el tratamiento de Ia esclerosis lateral amiotrófica (ELA).
7. Uso de un polipéptido aislado que comprende el dominio carboxilo terminal de Ia subunidad pesada de Ia toxina tetánica (HcTeTx), sus variantes alélicas o fragmentos funcionales de los mismos para Ia elaboración un medicamento para el tratamiento de ELA
8. Uso según Ia reivindicación anterior donde HcTeTx tiene Ia SEQ ID NO: 2.
9. Uso según Ia reivindicación 6 donde el fragmento funcional de HcTeTx tiene Ia SEQ ID NO: 5.
10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el medicamento está destinado a su administración vía oral, parenteral, intramuscular o nasal.
PCT/ES2008/070186 2007-10-05 2008-10-03 Uso de la secuencia codificante del dominio carboxilo terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica como medicamento Ceased WO2009043963A1 (es)

Priority Applications (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA2701521A CA2701521C (en) 2007-10-05 2008-10-03 Use of the sequence encoding of the carboxyl-terminal domain of the heavy chain of the tetanus toxin as a drug
RU2010115135/15A RU2495676C2 (ru) 2007-10-05 2008-10-03 Применение последовательности, кодирующей с-концевой домен тяжелой цепи токсина столбняка, в качестве лекарственного средства
CN2008801173975A CN101873865B (zh) 2007-10-05 2008-10-03 编码破伤风毒素重链羧基端结构域的序列作为药物的用途
MX2010003695A MX2010003695A (es) 2007-10-05 2008-10-03 Uso de la secuencia codificante del dominio carboxilo terminal de la cadena pesada de la toxina tetanica como medicamento.
ES08836703.2T ES2463770T3 (es) 2007-10-05 2008-10-03 Uso de la secuencia que codifica el dominio carboxilo terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica como fármaco
EP08836703.2A EP2210611B1 (en) 2007-10-05 2008-10-03 Use of the sequence encoding the carboxyl-terminal domain of the heavy chain of tetanus toxin as a drug
JP2010527478A JP5325224B2 (ja) 2007-10-05 2008-10-03 破傷風毒素の重鎖のカルボキシル末端ドメインをコードする配列の薬物としての使用
BRPI0817792 BRPI0817792A2 (pt) 2007-10-05 2008-10-03 Uso de uma sequência codificadora do domínio carbóxi-terminal da subunidade pesada da toxina tetânica como medicamento
US12/754,552 US8945586B2 (en) 2007-10-05 2010-04-05 Therapeutic use of the encoding sequence of the carboxy-terminal domain of the heavy chain of the tetanus toxin
US14/570,976 US20160017008A1 (en) 2007-10-05 2014-12-15 Therapeutic Use of the Encoding Sequence of the Carboxy-Terminal Domain of the Heavy Chain of the Tetanus Toxin

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ESP200702621 2007-10-05
ES200702621A ES2332628B1 (es) 2007-10-05 2007-10-05 Uso de la secuencia codificante del dominio carboxilo terminal de la cadena pesada de la toxina tetanica como medicamento.

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US12/754,552 Continuation-In-Part US8945586B2 (en) 2007-10-05 2010-04-05 Therapeutic use of the encoding sequence of the carboxy-terminal domain of the heavy chain of the tetanus toxin

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2009043963A1 true WO2009043963A1 (es) 2009-04-09

Family

ID=40525852

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2008/070186 Ceased WO2009043963A1 (es) 2007-10-05 2008-10-03 Uso de la secuencia codificante del dominio carboxilo terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica como medicamento

Country Status (10)

Country Link
US (2) US8945586B2 (es)
EP (1) EP2210611B1 (es)
JP (1) JP5325224B2 (es)
CN (1) CN101873865B (es)
BR (1) BRPI0817792A2 (es)
CA (1) CA2701521C (es)
ES (2) ES2332628B1 (es)
MX (1) MX2010003695A (es)
RU (1) RU2495676C2 (es)
WO (1) WO2009043963A1 (es)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104263743A (zh) * 2014-08-29 2015-01-07 中国农业大学 猪sod1基因在抗prrs病毒中的应用
US8945586B2 (en) 2007-10-05 2015-02-03 University Of Zaragoza Therapeutic use of the encoding sequence of the carboxy-terminal domain of the heavy chain of the tetanus toxin
WO2016001762A1 (en) 2014-07-02 2016-01-07 Spherium Biomed S.L. Methods of increasing muscle mass using non-toxic tetanus toxin c fragment (ttc)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0057140A2 (fr) * 1981-01-22 1982-08-04 Pasteur Institut Nouveau composé polypeptidique thiolé provenant d'un fragment de la toxine tétanique, son procédé d'obtention et ses applications
WO1999009057A2 (en) * 1997-08-14 1999-02-25 Institut Pasteur Hybrid tetanus toxoid proteins that migrate retrogradely and transynaptically into the cns
WO2005025592A2 (en) * 2003-09-16 2005-03-24 Centre National De La Recherche Scientifique In vivo modulation of neuronal transport

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2001270219A1 (en) * 2000-06-28 2002-01-08 Ira Sanders Methods for using tetanus toxin for benificial purposes in animals (mammals)
AU2003268484A1 (en) * 2002-09-06 2004-03-29 The General Hospital Corporation Delivery of therapeutics to the brain and spinal cord
ES2281278B1 (es) * 2006-01-20 2008-10-16 Universidad Autonoma De Barcelona Empleo de un polipeptido que comprende el dominio c-terminal de la cadena pesada de la toxina tetanica en el tratamiento del parkinsonismo.
WO2008094583A2 (en) * 2007-01-30 2008-08-07 The General Hospital Corporation Methods and devices for mri-based measurement of axonal transport in vivo and delivery of therapeutic substances to the cns
ES2332628B1 (es) 2007-10-05 2011-01-24 Universidad De Zaragoza Uso de la secuencia codificante del dominio carboxilo terminal de la cadena pesada de la toxina tetanica como medicamento.

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0057140A2 (fr) * 1981-01-22 1982-08-04 Pasteur Institut Nouveau composé polypeptidique thiolé provenant d'un fragment de la toxine tétanique, son procédé d'obtention et ses applications
WO1999009057A2 (en) * 1997-08-14 1999-02-25 Institut Pasteur Hybrid tetanus toxoid proteins that migrate retrogradely and transynaptically into the cns
WO2005025592A2 (en) * 2003-09-16 2005-03-24 Centre National De La Recherche Scientifique In vivo modulation of neuronal transport

Non-Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BORDET, T. ET AL.: "Neuronal targeting of cardiotrophin-1 by coupling with tetanus toxin C fragment", MOLECULAR AND CELLULAR NEUROSCIENCE, vol. 17, no. 5, 2001, pages 842 - 854, XP001206036 *
BROWN. R.H. JR., ARCH. NEUROL., vol. 54, no. 10, 1997, pages 1246 - 1250
C. FAULI; I TRILLO: "Treaty of Galenic Pharmacy", 1993, S.A. DE EDICIONES
C. FAULI; TRILLO: "Treaty of Galenic Pharmacy", 1993, S.A. DE EDICIONES
FRANCIS, J.W. ET AL.: "CuZn Superoxide Dismutase (SOD-1):Tetanus Toxin Fragment C Hybrid Protein for Targeted Delivery of SOD-1 to Neuronal Cells", THE JOURNAL OF BIOLGICAL CHEMISTRY, vol. 270, no. 25, 1995, pages 15434 - 15442, XP008132949 *
GIL ET AL., BIOCHEM J., vol. 373, 2003, pages 613 - 620
GIL ET AL., BIOCHEM.J., vol. 373, 2003, pages 613 - 620
GURNEY ET AL., SCIENCE, vol. 264, no. 5166, 1994, pages 1772 - 5
GURNEY ET AL.: "Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation", SCIENCE, vol. 264, no. 5166, 1994, pages 1772 - 5
HAASE ET AL., ANN. NEUROL., vol. 45, no. 3, 1999, pages 296 - 304
LARSEN, K.E. ET AL.: "A glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF):tetanus toxin fragment C protein conjugate improves delivery of GDNF to spinal cord motor neurons in mice", BRAIN RESEARCH, vol. 1120, no. 1, 2006, pages 1 - 12, XP025101816 *
MCFERRAN ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 273, 1998, pages 22768 - 22772
SCHAAD ET AL., PNAS, vol. 93, 1996, pages 9253 - 9258
See also references of EP2210611A4
TU, P.H. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA., vol. 93, no. 7, 1996, pages 3155 - 3160

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8945586B2 (en) 2007-10-05 2015-02-03 University Of Zaragoza Therapeutic use of the encoding sequence of the carboxy-terminal domain of the heavy chain of the tetanus toxin
WO2016001762A1 (en) 2014-07-02 2016-01-07 Spherium Biomed S.L. Methods of increasing muscle mass using non-toxic tetanus toxin c fragment (ttc)
CN104263743A (zh) * 2014-08-29 2015-01-07 中国农业大学 猪sod1基因在抗prrs病毒中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP2010540599A (ja) 2010-12-24
ES2332628A1 (es) 2010-02-09
ES2463770T3 (es) 2014-05-29
BRPI0817792A2 (pt) 2015-03-24
US8945586B2 (en) 2015-02-03
CN101873865B (zh) 2013-06-05
CN101873865A (zh) 2010-10-27
EP2210611A4 (en) 2010-12-15
RU2010115135A (ru) 2011-11-10
ES2332628B1 (es) 2011-01-24
US20160017008A1 (en) 2016-01-21
MX2010003695A (es) 2010-09-14
CA2701521A1 (en) 2009-04-09
EP2210611A1 (en) 2010-07-28
US20100261656A1 (en) 2010-10-14
RU2495676C2 (ru) 2013-10-20
JP5325224B2 (ja) 2013-10-23
EP2210611B1 (en) 2014-02-26
CA2701521C (en) 2015-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Fernandes et al. In vivo transfer of interleukin-1 receptor antagonist gene in osteoarthritic rabbit knee joints: prevention of osteoarthritis progression
ES2819866T3 (es) Polipéptido ANGPTL8 y su uso para el tratamiento de condiciones asociadas con triglicéridos elevados
ES2825999T3 (es) Un inhibidor negativo dominante del TNF-alfa para su uso en el tratamiento de trastornos neurológicos del SNC
JP6625071B2 (ja) 慢性疼痛用のナトリウムチャネルを標的とする非麻薬性ｃｒｍｐ２ペプチド
ES2699658T3 (es) Composiciones para su uso en el tratamiento de lesión neural inhibiendo la actividad de fosfatasas de la familia LAR
RU2627451C9 (ru) Противовоспалительные композиции
ES2420510T3 (es) Composiciones y métodos para el tratamiento de lesiones del SNC
ES2885245T3 (es) Proteínas de fusión TATk-CDKL5, composiciones, formulaciones y uso de estas
JP2025122021A (ja) 抗炎症剤
ES2463770T3 (es) Uso de la secuencia que codifica el dominio carboxilo terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica como fármaco
JP4607593B2 (ja) 痛み軽減薬剤
US20110053853A1 (en) Use of copolymer 1 for treatment of muscular dystrophy
ES2952834T3 (es) Lipoil-Glu-Ala para el tratamiento de daño neurodegenerativo producido por traumatismo craneoencefálico
ES2735530T3 (es) Composiciones y métodos relacionados con la argininosuccinato sintetasa
US20050043258A1 (en) Methods of treating xerostomia and xerophthalmia
ES2732669T3 (es) Tratamiento de la esclerosis múltiple
JP7338873B2 (ja) 強皮症関連血管障害を治療または改善するための組成物および方法
US20220033450A1 (en) Virally expressed inhibitors of pdz domains, such as pick1 and uses thereof
ES2980047T3 (es) Métodos para tratar el dolor neuropático
ES2395370B1 (es) Uso de un agonista del receptor obrb para el tratamiento de traumatismos del sistema nervioso central y/o del dolor neuropático.
WO2016059277A1 (es) Péptido derivado de trkb-fl y su uso como neuroprotector
ES2493391T3 (es) Uso de IL-6 en la preparación de composiciones farmacéuticas para tratar y prevenir lesiones hepáticas
EP4136219A1 (en) 28 kda gst proteins from schistosoma for the treatment of vasculitis
WO2020097150A1 (en) Treatment of traumatic brain injury
BR112018005602B1 (pt) Composição farmacêutica compreendendo um gene que codifica glutamato descarboxilase (gad) e um gene que codifica interleucina-10 (il-10) e uso dos ditos genes para aliviar ou tratar dor

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200880117397.5

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 08836703

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2701521

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010527478

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: MX/A/2010/003695

Country of ref document: MX

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1478/KOLNP/2010

Country of ref document: IN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2008836703

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010115135

Country of ref document: RU

ENP Entry into the national phase

Ref document number: PI0817792

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20100405