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WO2008108007A1 - 試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬 - Google Patents

試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬 Download PDF

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WO2008108007A1
WO2008108007A1 PCT/JP2007/055021 JP2007055021W WO2008108007A1 WO 2008108007 A1 WO2008108007 A1 WO 2008108007A1 JP 2007055021 W JP2007055021 W JP 2007055021W WO 2008108007 A1 WO2008108007 A1 WO 2008108007A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sample
protein
reagent
surfactant
measurement
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2007/055021
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Emiko Kaneko
Junichi Isoe
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shino Test Corp
Original Assignee
Shino Test Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shino Test Corp filed Critical Shino Test Corp
Priority to PCT/JP2007/055021 priority Critical patent/WO2008108007A1/ja
Publication of WO2008108007A1 publication Critical patent/WO2008108007A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6827—Total protein determination, e.g. albumin in urine
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour

Definitions

  • the present invention relates to a measurement method and a drug capable of measuring a protein contained in a sample * in a sample with very high sensitivity.
  • the present invention is useful in the fields of analytical chemistry, sacrifice and is therapy, and particularly useful in the field of clinical examination.
  • Serum or ⁇ protein levels are high in dehydration, reticuloendothelial disease, or chronic sensation.
  • plasma protein leakage, malnutrition or liver function ⁇ $ ⁇ is low.
  • the serum or bell protein belly changes with each morbidity or transformation, its t-rule is emphasized in the diagnosis and treatment of symptoms.
  • urinary protein appears in kidney disease, heart disease, manic, jaundice or high fever.
  • albumin which is a kind of protein, becomes the serum or bell level in the blood stool state. Serum or plasma iim is low in congenital analbuminemia, fl dry parenchymal disorder, ingestion of sputum, burns, bleeding, shock, protein-losing gastroenteritis, malabsorption syndrome or exhaustion It becomes.
  • Measuring albumin in serum or plasma is important for diagnosis and treatment of the above-mentioned diseases.
  • Urinary albumin (urinary albumin) is extremely poor in healthy subjects, and its reference reference value is less than 6.5 ⁇ 5. l mg / L (urgent urine). This urinary albumin appears in diabetic nephropathy, non-diabetic kidney disease such as itt glomerulonephritis shelf or benign nephrosclerosis, urinary sensation, high I & L £ E, or congestive heart failure To do. Measuring albumin in urine (urinary sputum albumin) is important for the diagnosis and treatment of Kamiki disease.
  • the B. iuret method which uses a reaction in which four peptide bonds in the protein bind to divalent copper ions in the alkaline solution and form a purple color, has a detection limit of 1 0 Omg / L The regular sensitivity was low.
  • the Lowry method using divalent copper ions and phenol reagent still has a detection limit of 25 mgZL, which is more sensitive than the Biuret method, but is still not sensitive to the measurement of thigh protein in the sample. It was insufficient.
  • the pyrogallol red-molybdenum complex coloring method which uses a reaction that turns amber by binding to proteins under the conditions of the strength of the pyrogallol red-molybdenum complex, has a detection limit of 2 OmgZL and Low ry although it is more sensitive than the method, it was still inadequate for measuring the thigh protein in the sample.
  • the total protein measurement method and the weaving medicine and rule determination kit have a detection limit, that is, a low sensitivity of the measurement, and the sensitivity is not good when measuring a very small amount of protein in the sample. It was enough.
  • bromcresol green binds to albumin in the presence of citrate acid and exhibits a blue color, and measures the increase in ⁇ due to this color development.
  • BCG bromcresol green
  • the BCP method is known in which promocresol purple (BCP) binds to albumin and exhibits a blue color, and the increase in translocation due to this color development is measured to determine albumin separation in the sample.
  • the BCG method and BCP method can be applied to general-purpose automatic analyzers used in many hospitals, and can be measured easily and within a short time. As described above, in the measurement of albumin which does not exert a very high strength in the sample, the measurement sensitivity was not sufficient.
  • albumin in urine urine albumin in urine
  • a more sensitive radioimmunoassay, enzyme immunoassay, immunoturbidimetric assay, or latex »S response immunoassay is used.
  • Conventional measurement methods and tJ3 ⁇ 4l3 ⁇ 4 drugs have been used (measurement sensitivity: 5 to 30 mg / L).
  • these immunoassay reagents are commonly used because the antibody that specifically binds to albumin is prepared from an animal and used as a raw material, and the cost of the assay reagent is high.
  • this antibody is prepared from an animal or the like, there may be a difference in sensitivity depending on the lot of the antibody, and it may be difficult to provide a drug of 1 ⁇ degree.
  • these immunological measurement methods and general pharmaceuticals are not capable of performing measurement with a general-purpose automatic analyzer, and can only be performed with a dedicated measuring device, take time to measure, or Some have the disadvantage that operation is tricky.
  • the present invention has a low cost for measurement, and can be applied to a general-purpose automatic analyzer used in many hospitals instead of a dedicated device, and the protein contained in the thigh in the sample can be applied. It is to provide a highly sensitive method for measuring protein in a sample and a regular reagent. Means for solving the problem
  • the present invention includes the following inventions.
  • the second reagent may add the second reagent to the mixed liquid in which the sample and the first reagent are mixed, so that the pH of the mixed liquid becomes pH 5.0 or lower.
  • the surfactant is a nonionic surfactant and / or a cationic surfactant (8) to (10) in the sample according to any one of (10) Protein measurement.
  • FIG. 1 is a graph showing an absorption curve when a surfactant is not removed or contained in a drug according to the present invention.
  • FIG. 2 shows a method for measuring a protein in a sample of the present invention and a nonsense ion boundary.
  • FIG. 6 is a graph showing an absorption curve when Triton X—100, which is a surface active agent, is included in a worm.
  • FIG. 3 is a diagram showing an absorption curve when tween 20 which is a nonionic surfactant is brought into contact with and contained in the protein measurement and drug of the present invention.
  • FIG. 4 is a graph showing an absorption curve when the method and rule drug for protein in the sample of the present invention contains zephiramine, which is a cationic surfactant, as an insect.
  • FIG. 5 is a diagram showing the relationship between the concentration of Triton X-1100, which is a nonionic 1 biosurfactant, and its effect in the measurement of protein in the sample of the present invention and in the case of a medicinal drug. .
  • FIG. 6 is a graph showing the relationship between the concentration of zephyramine, a p-easy ionic surfactant, and its effect in the method for measuring protein in the sample of the present invention and the rule glaze.
  • FIG. 7 is a graph showing the relationship between the effect and pH of a protein in a sample of the present invention.
  • FIG. 8 is a diagram showing a line in the method of measuring protein in the sample of the present invention and the rule drug.
  • the protein in the sample of the present invention is obtained by letting a sample, an anionic compound having a fluorescein skeleton and a surfactant, and an anionic compound having a fluorescein skeleton and a surface activity. It consists of measuring the degree of the liquid mixture containing the agent.
  • the sample in the present invention is not particularly limited as long as it may contain a protein.
  • a sample derived from a human or an animal a sample derived from a plant, a sample derived from a microorganism
  • examples include food, beverages, drugs, reagents, and environmental samples.
  • Samples derived from humans or animals are not particularly Mg, for example human, animal blood, serum, urine, stool, semen, spinal fluid, saliva, sweat, tears, ascites, or amniotic fluid; brain, 3 ⁇ (such as heart, kidney, or liver); fine wrinkles such as hair follicles, skin, nails, muscles, or nerves; or cells.
  • the food is not particularly limited, and examples thereof include meat, vegetables, grains, eggs, marine products, processed foods, and the like.
  • Beverages are not particularly brewed and can include, for example, juice, milk, tea, coffee, or awakening.
  • the drug is not particularly! ⁇ And can include, for example, infusion, injection, powder, or the like.
  • the sample used for the measurement needs to be liquid, if the sample is not liquid, pre-treatment such as extraction or solubilization is performed according to a known method to obtain liquid # 3 ⁇ 4. Just do it.
  • shelves or dredging may be performed as necessary.
  • the protein in the present invention is a protein contained in (or possibly contained in) a sample and is intended to be measured.
  • the total protein can be exemplified by albumin.
  • this protein is a protein that can only be leaked into a sample. Is preferred.
  • urinary albumin (urinary albumin), Bens-Johns protein, and the like as proteins that can be expressed only in f ⁇ .
  • the anion I ′ biocompound having a fluorescein skeleton is a fluorescein skeleton.
  • it is an anionic compound having, it can be used without particular limitation.
  • anionic compound having the fluorescein skeleton examples include xanthene-based pigments.
  • xanthene dye examples include Ellis Mouth Shin B, Yersin Sin, Yeosin, Phloxin, and Rose Benga! / ⁇ .
  • Mi in the mixed solution containing is preferably 0.1 or more, more preferably 0.5 M or more, and particularly preferably 0.7 M or more.
  • the reagent blank (the reagent blind tree may also become a high level), so at least the sample and the anion having the fluorescein skeleton
  • the separation in the liquid mixture containing the active compound is preferably 1,0 0 0 ⁇ or less, more preferably 10 0 ⁇ or less, and particularly preferably 50 0 ⁇ or less.
  • the surfactant in the present invention is not particularly limited as long as it is a surfactant.
  • this surfactant examples include nonionic surfactants, cationic surfactants, and sexual boundary surfactants.
  • the value obtained by the measurement (by subtracting the value of the reagent blank from the time of sample measurement) is obtained as a result of measurement of this sample, and the reagent blank (reduction of the value of the reagent blind tree) Since it becomes large, that is, a larger value can be obtained, the sensitivity of the measurement becomes high, and high sensitivity is achieved.
  • the worm with this surfactant provides the ability to measure i M protein in the sample.
  • the degree of purity obtained in the measurement of the sample is increased because the surfactant is a nonionic I ′ raw surfactant, a cation ⁇ ′ raw surfactant or This is especially true when the mixture is a mixture of a biosurfactant and a cationic surfactant.
  • the surfactant is a nonionic surfactant, a cationic I ′ raw surface active agent, or a mixture of a nonionic surfactant and a cationic surfactant. More preferably, a nonionic surfactant is particularly preferable.
  • this surfactant is that if it is too low, the effect of reversing with Kamai's surfactant cannot be obtained sufficiently, so a sample, a mixture containing an anionic compound having a fluorescein skeleton and a surfactant is included.
  • the liquid it is preferably 0.1 M or more, more preferably 20 xM or more, particularly preferably 40 or more.
  • the surfactant has a concentration in the sample, a mixed solution containing the anionic compound having the fluorescein skeleton and the surfactant, and the critical micelle concentration of the surfactant.
  • concentration is less than degree (CMC).
  • nonionic surfactants and cationic surfactants their compound names and their critical micelle concentration (CMC) are shown in Table 1, Table 2, and Table 3. .
  • CMC Critical micelle concentration
  • Dodecylamine Dodecylamine hydrochloride 14 30 Tetradecylamine hydrochloride 3.1 1 40 Hexadecylamine hydrochloride 0. 85 55 Octadecylamine hydrochloride 0.555 60 Dodecylethylenediamine acetate 5.7 25 Dodecyl Ethylene diamine lactate 4.4 4 // dodecyl ethylene diamine propionate 9.2 II tetradecyl ethylene diamine acetate 3.5 5 II tetradecylethylenediamine lactate 2.
  • Triton; X—100 Triton X-100
  • Triton X-100 which is a nonionic surfactant, [polyoxyethylene (1 0) octylphenol] (critical micellar 0.3) 5mM) and "Tween 20” [Polyxylene (20) sorbitan monolaurate] (critical micelle boat: 3.2mM; 18 ° C) and a cationic surfactant "Zephiramine” [Benzyldimethyltetradecylammonium hydrochloride; ⁇ (critical micelle: 0.37 mM) is particularly preferred.
  • the soot in the Kamami mixture is preferably less than 0.35 mM, which is a critical micelle 3 ⁇ 4, more preferably 0.15 mM or less, Particularly preferred is 0.1 ImM or less.
  • the removal of the sample, the anionic compound having a fluorescein skeleton and the surfactant may be carried out in one step or in two or more steps.
  • the sample is mixed with a mixture of an anion 1 ′ biocompound having a fluorescein skeleton and a surfactant (for example, measurement M drug).
  • a surfactant for example, measurement M drug
  • the time for the sample, the anion I ′ biocompound having a fluorescein skeleton, and the surfactant to disappear is preferably 30 seconds or more, more preferably 1 minute or more. Particularly preferred is 3 minutes or more.
  • anion I 'biocompound with fluorescein skeleton, and surfactant are worms?
  • the temperature is 60 ° C or higher, the protein may be denatured. Therefore, 0 to 50 ° C is preferable, 5 to 45 ° C is more preferable, and 15 to 40 ° C is particularly preferable. . .
  • the pH of the mixed solution containing at least the sample and the anionic compound having the fluorescein skeleton is set to pH 5.0.
  • the following is preferable.
  • the pH of the mixture of humility should be ⁇ 5.0 or less after reversion, but the ability to further increase the value of Kamiki by making this pH ⁇ 4.0 or less? It is more preferable, and it is particularly preferable to set this pH to 3.5 or less for the same reason.
  • the ⁇ of the mixed solution containing at least the sample and the anionic compound having the fluorescein skeleton is ⁇ ⁇ 5.0 or less. (More preferably ⁇ ⁇ 4.0 or less, particularly preferably pH 3.5 or less) Any method may be used as long as this is difficult.
  • the pH of the mixed solution is adjusted to pH 5.0 or less (more preferably pH 4). 0 or less, particularly preferably pH 3.5 or less).
  • the pH of the mixture is reduced to pH 5.0 or less (more preferably pH 4.0 or less, particularly preferably pH 3.5) by applying force to the mixture of selfishness.
  • the following must be of the acidic substance content, pH or addition »
  • citrate starch syrup for example, citrate starch syrup, vinegar syrup solution, salt solution, slag aqueous solution, or swelled ⁇ slag can be cited.
  • the pH of the mixed solution containing at least the sample and the anionic compound having a fluorescein skeleton is adjusted to pH 5.0 or less (more preferably In the present invention, the following may be mentioned as the order in which pH is 4.0 or less, particularly preferably pH 3.5 or less.
  • the pH of the mixture is adjusted to pH 5.0 or less (more preferably pH 4.0 or less, particularly preferably pH 3 5 or less).
  • a sample, an anionic compound having a fluorescein skeleton and a surfactant are wormed, and a mixed solution containing the sample, an anion I biocompound having a fluorescein skeleton and a surfactant is prepared.
  • This sample, absorption of a mixed solution containing an anionic compound having a fluorescein skeleton and a surfactant, is measured at 1 ⁇ m, and the absorption is measured at a wavelength at or near the absorption maximum of the mixed solution. .
  • 3 ⁇ (measured value) when measuring this sample is divided by the absorbance (measured value) when measuring the sample (standard solution, standard substance) whose concentration of the protein to be measured is known, By multiplying the key value of the protein in the standard solution, the concentration of the protein contained in the sample can be calculated.
  • intake) 1 when measuring the sample (measured value), and concentrations known samples of proteins to make a measurement (standard solution (measured value when measuring the standard substance)) makes measurements Measurements were made using saline or physiology that contained no protein at all, and the absorbance of the obtained reagent blank (reagent blind test) was subtracted.
  • each of the sample and the first reagent of the measurement reagent is dispensed into a reaction cell (reaction cuvette) with a pipette (probe) or tube, and mixed and leaked to form the first stage reaction system. -Keep under certain conditions and allow the first stage reaction to take place.
  • reaction cuvette After a certain period of time (end of first stage reaction ⁇ ), the reaction between the sample in this reaction cell (reaction cuvette) and the first reagent of the measurement drug (first stage reaction) Measure the angle value at a preset wavelength.
  • reaction cuvette dispense the second reagent of Kamiki's measurement with a pipette (pro force or a tube, mix, invert, Second stage reaction system
  • the second stage reaction is carried out under certain conditions.
  • the reagent blank (reagent blind tree) was obtained from the 3 ⁇ 4 example value obtained in S [6]. Calculate the difference in absorbance by subtracting the subtracted value.
  • the reagent for measuring protein in the sample of the present invention contains an anionic compound having a fluorescein skeleton and a surfactant.
  • sample in the present invention is as described in “2. Sample” of “[1]. Method for measuring protein in sample” above.
  • the protein in the present invention is as described in “3. Protein” in “[I]. Method for measuring protein in sample” above.
  • the anion I biocompound having a fluorescein skeleton in the present invention is described in “4. Anionic compound having a fluorescein skeleton” in the above “[1]. Method for measuring protein in sample”. As described above, the concentration described here is achieved in the mixture at the time of helminth between the protein contained in the sample and the anionic compound having a fluorescein skeleton. It is preferable to include an anionic compound that has the fluorescein skeleton in the drug.
  • the surfactant in the present invention is as described in “5. Surfactant” in “[1]. Method for measuring protein in sample” above.
  • This surfactant is such that the critical micelle of the surfactant is filled in the mixture upon reversal of the protein contained in the sample and an anionic compound having a fluorescein skeleton.
  • This surfactant is preferably contained in the measurement drug. .
  • the drug is preferably composed of two reagents or three or more reagents.
  • it is preferably composed of two reagents.
  • the measurement reagent consists of two reagents, the first reagent and the second reagent, the following can be cited as the constitution of the components contained in each of the two reagents.
  • First reagent anionic compound having fluorescein skeleton
  • surfactant Second reagent: surfactant, buffer, etc.
  • the protein measurement in the sample of the present invention comprises a combination of a first reagent that contains at least an anionic compound having a fluorescein skeleton and a second reagent that consists of an acidic solution. It is preferably added to the first reagent and Z or the second reagent.
  • the second reagent consisting of the acidic solution is added to the mixed solution in which the sample and the first reagent are mixed, so that the pH of the mixed solution becomes pH 5.0 or less. It is something that can be done.
  • the protein measurement reagent in the sample of the present invention comprises a combination of a first reagent comprising at least an anionic compound having a fluorescein skeleton and a second reagent comprising an acidic solution.
  • a first reagent comprising at least an anionic compound having a fluorescein skeleton
  • a second reagent comprising an acidic solution.
  • the following can be cited as the constitution of the components contained in each of these two reagents.
  • Other ingredients
  • a buffer an ion such as alkali metal or alkaline earth metal, or a salt containing the same; a chelating agent; sodium azide, antibiotic or Preservatives such as synthetic antibacterials; Stabilizers such as saccharides or high ⁇ compounds; Activators; Elimination of measurement hindrances contained in samples or substances related to suppression of effects; or other reagent components Can be applied as needed.
  • an ion such as alkali metal or alkaline earth metal, or a salt containing the same
  • a chelating agent sodium azide, antibiotic or Preservatives such as synthetic antibacterials
  • Stabilizers such as saccharides or high ⁇ compounds
  • Activators Elimination of measurement hindrances contained in samples or substances related to suppression of effects; or other reagent components Can be applied as needed.
  • a buffer having an ability in the pH range necessary for measurement is preferable to have a buffer having an ability in the pH range necessary for measurement as a buffer for a person.
  • buffering agents include MES, B is—Tris, B is—Tris Propon, ADA, PI PES, ACES, MOPS 0, MOPS, BES, TES, HE PES, DI PSO, TAP SO, POP SO, HEPPSO, EPPS, Trieine, Bicine, TAPS, CHES, inorganic phosphate, inorganic phosphate, boric acid, borate, glycine, glycylglycine, imidazole, or tris ( Hydroxymethyl) aminomethane [Tris] and the like.
  • MES MES
  • B Tris
  • B Tris Propon
  • ADA PI PES
  • ACES MOPS
  • MOPS MOPS
  • BES TES
  • HE PES DI PSO
  • TAP SO POP SO
  • HEPPSO HEPPSO
  • the protein measurement method in the trial of the present invention has a low cost for measurement, and can be applied not only to a dedicated device but also to a general-purpose automatic analyzer used in many hospitals. It is possible to measure the protein contained in the sample with high sensitivity and to obtain the effect.
  • the protein measuring agent in the sample of the present invention is low in cost, and can be applied not only to a dedicated device but also to a general-purpose automatic analyzer used in many hospitals, and in the sample. It has the effect of being able to measure the proteins contained in the water with high sensitivity.
  • Example 1 Measurement method of the present invention and confirmation of the effect of the surfactant in the t ⁇ law drug
  • Measurement method of the protein in the sample of the present invention and the objective Confirm the effect of the surfactant in the drug. I confirmed.
  • quenic acid (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in / i to prepare 500 mM quencher.
  • Pure water was prepared as a surfactant-free reagent containing no surfactant.
  • ⁇ Lye X—1 0 0 As a reagent, ⁇ Lye X—loo (Nacalai Tesque; fc) im-amount: 6 2 5] is dissolved in pure water to give 6.4 mM Triton X— 1 0 07 Prepared the night.
  • Tween 20 As a Tween 20 reagent, Tween 20 was dissolved in zK to prepare a 0.4 mM Tween 20 aqueous solution.
  • zephyramine As a zephyramine reagent, zephyramine is dissolved in pure water and a 4 mM zephyramine aqueous solution is used. Prepared.
  • human serum albumin [HSA] (Sigma 3) was dissolved in pure water to prepare 2. Omg / L human serum albumin aqueous solution.
  • Fig. 1 shows the absorption curve when using a protein-containing sample as a sample, and the negative absorption curve when using a protein material as a sample.
  • Second reagent (a) Surfactant inert drug, lift yourself 1 (3) Second reagent (b) Triton X-100 reagent Except for using as a second reagent, perform the operation as described in Tatsumi (1), (2) and (3), and use the protein polarizing material as the sample.
  • Figure 2 shows the self-absorption curve when using a protein-free sample.
  • the second reagent (d) in Zekai (3) in (d) is the second reagent.
  • the absorption curve when using a protein-containing sample as a sample, operating as described in (1), (2) and (3), and as a protein as a sample Figure 4 shows the self-absorption curve when using the non-containing sample.
  • triton X—100 a nonionic surfactant
  • erythrosine synthase B which is an anionic compound having a fluorescein skeleton
  • this triton X-1 100 is contained in the measuring agent and brought into contact with Ellis mouth syn-B and the sample, the triton X-1 100 is not contained in the measurement reagent.
  • the absorption pole of the absorption curve of the mixed solution [reagent blank (reagent blind tree)] when measuring a protein-free sample is markedly reduced.
  • Triton X—100 a nonionic surfactant, is included in the current IJ reagent, and is transferred to Ellis Mouth Syn B, an anionic compound having a fluorescein skeleton.
  • the value of SS) 1 ⁇ obtained by measurement (the value obtained by subtracting reagent blank ⁇ i from when measuring the sample) will be larger, and high sensitivity will be obtained. I was reprimanded.
  • the measurement reagent contains Tween 20 which is a nonionic surfactant, it is twisted 2 when the fluorescein skeleton is an anionic compound Eris Mouth Syn B and a worm.
  • Tween 20 which is a nonionic surfactant
  • the fluorescein skeleton is an anionic compound Eris Mouth Syn B and a worm.
  • the absorption pole of the absorption curve of the mixed solution when the protein material is measured and the absorption power in the vicinity are remarkably increased.
  • Tween 20 as a nonionic surfactant when included in the drug, it is transferred to Ellis Mouthsin B, an anionic compound with a full-year-old resin skeleton, and a sample. It was confirmed that the value obtained by the measurement (the value obtained by subtracting the reagent blank from the sample measurement) was larger, and high sensitivity was obtained.
  • zephyramine a cationic surfactant
  • erythrincin B an anionic compound that cleaves the fluorescein skeleton
  • zephiramine is used as a measurement M drug.
  • the absorption pole in the absorption curve of the mixed solution when measuring the protein-containing material and the absorption J in the vicinity thereof are remarkably high.
  • the value of the crane obtained by the measurement (the force at the time of measuring the sample ⁇ minus the 3 ⁇ 4 ⁇ of the reagent blank) is greater when the 3 ⁇ 4M drug contains zephyramine and is contacted. Rather than letting Zephiramine be included in the measurement drug and not causing insects In this case, it was confirmed that high measurement sensitivity was obtained.
  • Ellis Mouth Syn B (Wagaku Kogyo Neko: fc) was dissolved in pure water to prepare an aqueous solution of 102 / LLM erythrosine B.
  • Pure water was prepared as a surfactant-free reagent containing no surfactant.
  • Triton X-100 (Nacalati Skene ⁇ ) ⁇ ⁇ ⁇ 625] in ⁇ 7_ ⁇ , and then add 3 mM Triton X-100100 Prepared.
  • Triton X—100 (Nacalati Skene ⁇ ) [ ⁇ ? Amount: 625] was dissolved in pure water to prepare a 4.8 mM Triton X-100 aqueous solution.
  • Triton X-100 (Nakaraitesk 3 ⁇ 4) ⁇ ⁇ ⁇ : 625] was immersed in water to prepare a 6.4 mM Lyton X-100 aqueous solution.
  • Triton X-100 (Nacalai Tesque 3 ⁇ 4) [ ⁇ amount: 625] was dissolved in / J ⁇ to prepare an 8 mM Triton X-100 solution.
  • Triton X-100 (Nacalati Skene ⁇ ) [ ⁇ amount: 625] was dissolved in thread water to prepare a 9.6 mM Triton X-1007 solution.
  • Triton X-100 (Nacalai Tesque Co., Ltd.) KJ ⁇ ?
  • Triton X-100 (Nacalai Tesque) ⁇ amount: 625] was dissolved in pure water as a 6 mM Triton X-100 mechanical drug to prepare a 25.6 mM Triton X-100 aqueous solution.
  • human serum albumin [HSA] (Sigma 3) was dissolved in pure water to prepare 1.5 mg / L human serum albumin water night.
  • Pure water was prepared as a sample that does not contain the protein.
  • Figure 5 shows the following. .
  • the concentration of the surfactant (Triton X—100) in the mixed solution is 0.35 mM or more, which is the critical micelle contribution (CMC)?
  • CMC critical micelle contribution
  • the surfactant (Triton X—loo) in the mixed solution containing the sample, the anionic 1 ′ biocompound with fluorescein skeleton and the surfactant (Triton X—1 0 0) is Interfacial Tongue 'I Seiki U (Triton X— 1 0 0) Boundary Miserile? Is less than (CMC) It turns out that it is preferable.
  • mmen of citrate was dissolved in pure water to prepare soomM Quen Night.
  • Pure water was prepared as a surfactant-free reagent containing no surfactant.
  • Zephiramine As a 4 mM Zephiramine ornamental drug, Zephiramine was dissolved in pure water to prepare a 4 mM Zephiramine aqueous solution.
  • HSA human serum albumin
  • Pure water was prepared as a protein-free sample containing no protein.
  • Figure 6 shows the concentration when the protein-containing material was measured and the concentration when the protein-free sample was measured when each of the third reagents in (1) to (4) was used. Indicated.
  • an anionic compound that has a fluorescein skeleton, and a surfactant (Zephiramine)
  • Zephiramine a surfactant that increases
  • Both the absorption of the mixed solution and the mixed solution when measuring the protein-free sample are increased.
  • the value obtained by the measurement is the critical micelle concentration (CMC) of this surfactant (Zephiramine) At 0.37 mM or higher, the concentration is smaller than when the concentration is less than 0.37 mM.
  • CMC critical micelle concentration
  • the value is less than the critical micelle itS (CMC) of (zephylamine).
  • Example 4 (Confirmation of the relationship between the measurement method of the present invention and the effect of the regular reagent and PH) The measurement method of the protein in the sample of the present invention and the effect of the drug on the relationship with PH were perceived.
  • the following reagents were prepared.
  • Pure water was prepared as a citrate anti-oxidant containing no citrate.
  • citrate As a 125 mM aging reagent, citrate (Wagaku Industrial Co., Ltd.) was dissolved in 7j ⁇ to prepare a 125 mM citrate aqueous solution.
  • citrate As 50 OmM citrate drug, citrate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd .: h) was dissolved in Itosui, and 50 OmM citrate water was prepared.
  • human serum albumin [HSA] (Sigma 3) was dissolved in pure water to prepare a 1.5 mg / L human serum albumin aqueous solution.
  • Pure water was prepared as a protein-free sample containing no protein.
  • Figure 7 shows the Pmm when the protein-containing material was measured and the protein-free sample when each of the second reagents in (1) to (4) was used. .
  • a mixed solution in which the sample, the first reagent, the second reagent, and the third reagent are mixed that is, the sample, containing an anionic compound having a fluorescein skeleton (Ellis mouthcin B) and a surfactant (Triton X 1 100)
  • an anionic compound having a fluorescein skeleton Ellis mouthcin B
  • Triton X 1 100 Triton X 1 100
  • the concentration of the mixed liquid increases when protein-containing material is measured, and no protein is contained.
  • the absorbance of the mixed solution [reagent blank (reagent blind test)] when measured was decreased.
  • the value of 1 e3 ⁇ 43 ⁇ 4 obtained by the measurement (from the sample measurement concentration based on the concentration at the time of sample measurement)
  • the sample, and the fluorescein skeleton are combined.
  • the pH of the mixed solution containing at least this sample and the anion 1' biocomposite containing the J-resin skeleton is adjusted to pH 5.0. It is found that the pH is preferably below, more preferably pH 4.0 or lower, and particularly preferably pH 3.5 or lower.
  • Example 5 (Measurement method and rules of the present invention ⁇ Making of soot in medicine)
  • kenic acid (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in J to prepare 50 OmM Quench Night.
  • Triton X-1100 (Nacalai Tesque) C H3 ⁇ 4: 6 2 5] was dissolved in pure water to prepare a 6.4 mM Triton X-10 Oz solution.
  • human serum albumin [HSA] (Sigma) was dissolved in pure water to prepare a 0.25 mg / L human serum albumin aqueous solution.
  • human serum albumin [HSA] (Sigma 3) was dissolved in zf to prepare a 0.5 Omg / L human serum albumin aqueous solution.
  • human serum albumin [HSA] (Sigma ⁇ ) was dissolved in pure water to prepare a 0.75 mg ZL human serum albumin aqueous solution.
  • HSA human serum albumin
  • Human serum albumin [HSA] (Sigma 3) was dissolved in ⁇ as a 1.5 Omg / L protein solution to prepare a 1.5 Omg / L human serum albumin aqueous solution.
  • HSA Human serum albumin
  • Pure water was prepared as a protein-free sample containing no protein.
  • Second reagent As a second reagent, queenic acid (Wako Pharmaceutical Co., Ltd .: t) was dissolved in pure water to prepare a 50 mM quen solution.
  • Human serum albumin [HS A] (Sigmane ⁇ ) was dissolved in pure water and diluted stepwise with pure water to prepare a dilution series of human serum albumin aqueous solution.
  • 3 ⁇ 4 ⁇ is divided by M3 ⁇ 4 of the standard solution obtained in (4), and then multiplied by human serum albumin m of this standard solution, so that Asked.
  • Hitachi 7 1 7 0 Using the S-type automatic and nebula device, measure the sample of hate 2 according to the method specified in the size document of this language, and measure each human serum albumin aqueous solution sample. I asked for a spear. In addition, the measurement of each said sample performed 12 measurement.
  • Protein Assay Rapid Kit (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), a texture measuring agent for proteins in samples by the PR method, was used.
  • the sample of Kamii 2 was measured by the microplate method, and the separation of each human serum albumin sample was obtained.
  • “Sulfosalicyl (Wagaku Industrial Co., Ltd.)” was used as a reagent for measuring proteins in samples by the S S ⁇ method.
  • the detection limit and the quantification limit of the measurement reagent and the regular determination method for the protein in the sample of the present invention are far superior to those of the PR method and SSA method of the other methods. It turns out that it exceeds the detection limit and the limit of quantification.
  • the method for measuring and measuring the protein in the sample of the present invention has a measurement sensitivity superior to the immunoturbidimetric method, while the cost required for the measurement is low, and the method for measuring the protein in the urine sample. It has been proved that it is possible to accurately measure a protein such as albumin which is present only in a minute amount in a sample. .

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Abstract

本発明の課題は、測定に掛かるコストが低いものであって、専用装置ではなく多くの病院で使用されている汎用自動分析装置にも適用でき、かつ試料中に微量に含まれるタンパク質をも測定することができる高感度な試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬を提供することにある。これらの課題の解決を図った本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬は、以下の通りのものである。本発明の試料中のタンパク質の測定方法は、試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を接触させ、この試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を含む混合液の吸光度を測定することからなるものである。本発明の試料中のタンパク質の測定試薬は、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を含有するものである。

Description

試料中の夕ンパク質の測^法及 則定試薬 鎌分野
本発明は、 試料中に ί¾*に含まれるタンパク質を非常に高感度に測 ¾Tることができる 測定方法及 薬に関する。 本発明明は、 分析化学、 生 粹、 及び is療の分野におい て有用であり、 特に臨床検査分野において有用なものである。
田 背景腿
血清又は βのタンパク質體は、 脱水、 網内系疾 又は慢性感雖等において高値と なる。 また、 血漿タンパクの漏出、 栄養不良又は肝機能 Ρ$ ^において低値となる。 このように血清又は鐘のタンパク質腹は、 各觀患又は各翻態に伴って変化する ので、 その t則定は疾唐、の診断及 療において重視されている。
また、 尿中のタンパク質は、 腎疾患、 心疾患、 嫉患、 黄だん又は高熱等において出 現する。
この尿中の夕ンパク質を測 ることも、嫌己疾患の診断及 療にとつて重要である。 また、 タンパク質の一種であるアルブミンは、 血液灕宿状態において血清又は鐘中の カ犒値となる。そして、先天性無アルブミン血症、 fl干実質障害、雜摂取不足、火傷、 出血、 ショック、 タンパク漏出性胃腸炎、 吸収不良症候群又は消耗 ί'生疾患等において血清 又は血漿中の iimが低値となる。
この血清又は血漿中のアルブミンを測定することは、 前記疾患の診断及 ϋ始療にとつて 觀である。
尿中のアルブミン （尿中 アルブミン） の ま、 健常者においては極めて膽なも のであり、 その基準参考値は 6. 5 ± 5. l mg/L未満 （随時尿） である。 この尿中のアルブミンは、 糖尿病性腎症、 慢 Itt球体腎炎の潜棚若しくは良性腎硬化 症などの非糖尿病性腎疾患、尿路感離、高 I&L£E又はうつ血性心不^^において出現する。 そして、 尿中のアルブミン （尿中纖アルブミン） を測 ることは、 鎌己疾患の診断 及 合療にとつて重要である。
縣の総タンパク質の測定方法 （並びに測織薬、 測定キット） としては、 まず、 タン パク質と結合するとその色調を変える色素を担体に含浸させた試験片を用いる方法がある。 しかし、 .この試験片を用いる方法は、 検出限界が 1 0 0〜2 0 Omg/Lであり、 試料中 に¾»こ含まれるタンパク質を測定することができないものであった。また、この方法は、 試料中の他の物質や非結合態色素の影響を受けて、 測定^^が生じる場合もあった。
また、 夕ンパク質中の 4個のぺプチド結合がアル力リ溶液中で 2価の銅ィオンとキレ一 ト結合して紫色に発色する反応を利用する B. i u r e t法は、 検出限界が 1 0 Omg/L であり、 ？則定の感度は低いものであった。
そして、 やはり 2価の銅イオンとフエノール試薬を用いる L ow r y法は、 検出限界が 2 5mgZLと、 B i u r e t法よりは感度は高いが、 試料中の腿のタンパク質の測定 には、 いまだ感度は不充分なものであった。
また、 ピロガロールレツド ·モリブデン錯体力職性条件下で夕ンパク質と結合すること により籠色に変色する反応を利用するピロガロールレツド ·モリブデン錯体発色法は、 検出限界が 2 OmgZLと L ow r y法よりも感度は高いが、 やはり試料中の腿のタン パク質の測定に滅度は不充分であった。
上述したように «の総タンパク質の測定方法、 測織薬及 則定キットは、 検出限界 カ搞ぐ すなわち測定の感度が低いものであり、 試料中の微量のタンパク質の測定におい ては、 感度は不充分なものであった。
«のアルブミンの測¾ ^法及 則鐵薬としては、 ブロムクレゾールグリーン （B C G) がクェン酸酸性下でアルブミンと結合し、 青色を呈することを利用し、 この発色によ る^ の増加を測定して試料中のアルブミン菌を求める B C G法が知られていた。 また、 プロモクレゾールパープル （B C P) がアルブミンと結合し、 青色を呈すること を禾翻し、 この発色による 渡の増加を測定して試料中のアルブミン離を求める B C P法も知られていた。
この B C G法及び B C P法は、 多くの病院で されている汎用自動分析装置に適用で き、 これにより簡便かつ短時間の内に測定を行うことができる方法であるが、 尿中のアル ブミンのように、 試料中に極めて ί¾Μにし力彼しないアルブミンの測定においては、 測 定の感度は充分とは言えないものであった。
そこで、 尿中のアルブミン （尿中 ί織アルブミン） の測定には、 より高感度な放射免疫 測定法、 酵素免疫測定法、 免疫比濁法又はラテックス »S応麟の免疫学的測定法を測 定原理とする測^法及 tJ¾l¾ 薬が従来用いられてきた (測定感度： 5〜3 0mg/L)。 しかしながら、 これらの免疫学的測定試薬は共通して、 アルブミンに特異的に結合する 抗体を動物等より調製し、 それを原料とするため、 測定試薬のコストカ缟いという難点が め ,こ。
更に、 この抗体を動物等より調製するため、 抗体のロットにより感度に差が生じること があり、一 β度の測 薬の提供が灘しいということもあった。
また、 これらの免疫学的測定法及 則 ¾ 薬には、 汎用自動分 ί碟置で測定を行うこと 力 きず専用の測定装置でないと測定が行えなかったり、 測定に時間が掛かったり、 又は 測定操作が應であるという難点を有するものもあった。
〔棚午参考建 1〕 「臨床脑封是要」 （改訂第 3 2片 M) 、 第 1 7 1頁〜第 1 7 7 頁、 金原出版、 2 0 0 5年
〔非特許 文献 2〕 「臨床讀封是要」 （改訂第 3 2 、 第 4 7 3頁〜第 4 8 1 頁、 金原出版、 2 0 0 5年 発明の開示
発明が解決しようとする課題 本発明の は、 測定に掛かるコストが低いものであって、 専用装置ではなく多くの病 院で使用されている汎用自動分析装置にも適用でき、 かつ試料中に腿に含まれるタンパ ク質をも測定することができる高感度な試料中のタンパク質の測定方法及 則定試薬を提 ^することである。 課題を解夬するための手段
本発明は、 以下の発明を包含するものである。
( 1 ) 試料、フルォレセィン骨格を衬る陰イオン性化合物及び界面活性剤を擲虫させ、 この試料、 フルォレセィン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を含む混合液の 醜度を測 ¾ "ることからなる、 試料中のタンパク質の測 ¾ ^法。
( 2 ) 試料及びフル才レセィン骨格を ^る陰ィオン性化合物を させた後、 z少なく ともこの試料及びフル才レセィン骨格を: る陰ィオン性化合物を含む混合液の pHを p H 5. 0以下とすることを特徴とする嫌己（1 )に記載の試料中のタンパク質の測 法。
(3) 混合液の pHを ΡΗ 5 · 0以下とすることを、 当該混合液に酸性溶液を¾¾ る ことにより行うことを糊敷とする前記 (2) に記載の試料中のタンパク質の測定方法。
( ) 界面活性剤が、 非ィオン性界面活性剤及び/又は陽ィオン性界面活性剤であるこ とを纖とする嫌己 ( 1 ) 〜 （3) のいずれか 1つに記載の試料中のタンパク質の測 法。
( 5) 界面活性剤が、 混合液中で当該界面活性剤の臨界ミセ IS*満の であるこ とを纖とする嫌己 ( 1 ) 〜 （4) のいずれか 1つに記載の試料中のタンパク質の測 法。
(6) フルォレセィン骨格を有する陰イオン性化合物が、 エリス口シン Bであることを とする爾己 ( 1 ) 〜 （5) のいずれか 1つに記載の試料中のタンパク質の測 法。
(7) タンパク質が、 アルブミンであることを特徴とする前記 ( 1 ) 〜 (6) のいずれ か 1つに記載の試料中のタンパク質の測 ¾ ^法。 (8) フルォレセイン骨格を « "る陰イオン I'生化合物及 U ^面活性剤を含^ Tる、 試料 中のタンパク質の測定試薬。
(9) 少なくともフルォレセィン骨格を有する陰イオン性化合物を含有する溶液からな る第 1試薬と、 酸性溶液からなる第 2試薬との組み合わせよりなり、 界面活性剤が当該第 1試薬及び/又は当該第 2試薬に勵口されていることを纖とする前記 (8) に記載の試 料中の夕ンパク質の測^ t薬。
(10) . 酸性溶翻、らなる第 2試薬が、 試料及び第 1試薬を混合した混合液に当該第 2 試薬を添加することにより、 当該混合液の pHを pH5. 0以下とすることができるもの であることを特徴とする嫌己 (9) に記載の試料中のタンパク質の測 薬。
(11) 界面活性剤が、 非ィオン性界面活性剤及び/又は陽ィオン性界面活性剤である ことを纖とする嫌己 (8) 〜 （10) のいずれか 1つに記載の試料中のタンパク質の測 。
(12) 界面活性剤が、 混合液中において当該界面活性剤の臨界ミセル¾*満の ¾ となるような濃度に設定されていることを特徴とする前記 (8) 〜 （11) のいずれか 1 つに記載の試料中の夕ンパク質の測定試薬。
(13) フルォレセイン骨格を^ Τる陰イオン性化合物が、 エリス口シン Bであること を特徴とする前記 (8) 〜 （12) のいずれか 1つに記載の試料中のタンパク質の測 薬。
(14) タンパク質が、 アルブミンであることを觀とする編己 (8) 〜 （13) のい ずれか 1つに記載の試料中の夕ンパク質の測定試薬。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の試料中のタンパク質の測 法及 則^:薬において、 界面活性剤を 撤虫、 含有させないときの吸収曲線を示した図である。
図 2は、 本発明の試料中のタンパク質の測 法及 則識薬において、 非イオン ¾界 面活性剤であるトライトン X— 1 0 0を掘虫、 含有させたときの吸収曲線を示した図であ る。
図 3は、 本発明の試料中のタンパク質の測 法及 薬において、 非イオン性界 面活性剤であるツイーン 2 0を接触、 含有させたときの吸収曲線を示した図である。 図 4は、 本発明の試料中のタンパク質の測 法及 則 ¾ 薬において、 陽イオン性界 面活性剤であるゼフィラミンを翻虫、 含有させたときの吸収曲線を示した図である。 図 5は、 本発明の試料中のタンパク質の測 法及 ϋ¾Ι趨薬における、 非イオン 1生界 面活性剤であるトライトン X— 1 0 0の濃度とその効果との関係を示した図である。 図 6は、 本発明の試料中のタンパク質の測 法及 則纖薬における、 p易イオン性界 面活性剤であるゼフィラミンの濃度とその効果との関係を示した図である。
図 7は、 本発明の試料中のタンパク質の測 法及 則^:薬における、 効果と pHと の関係を示した図である。
図 8は、 本発明の試料中のタンパク質の測 法及 則 £ 薬における、 線を示し た図である。 発明を実施するための最良の形態
〔I〕 . 試料中のタンパク質の測 法
1. 本発明の試料中のタンパク質の測定方法
本発明の試料中のタンパク質の測 法は、 試料、 フルォレセイン骨格を^ rfる陰ィォ ン性化合物及び界面活性剤を纖させ、 この試料、 フルォレセイン骨格を る陰イオン 性化合物及 Ό ^面活性剤を含む混合液の 度を測^ることからなるものである。
2. 麵
本発明における試料としては、 夕ンパク質を含む可能性がある試料であれば特に限定さ れないが、 例えば、 ヒト若しくは動物に由来する試料、 植物に由来する試料、 微生物に由 来する試料、 食物、 飲料、 薬剤、 試薬、 又は環境試料等を挙げることができる。 ヒト若しくは動物に由来する試料は、 特にMgされず、 例えば、 ヒト或いは動物の、 血 液、 血清、 «\ 尿、 大便、 精液、 髄液、 唾液、 汗、 涙、 腹水、 若しくは羊水；脳、 心臓、 腎臓、 若しくは肝臓などの )3β ;毛髮、 皮膚、 爪、 筋肉、 若しくは神経などの細戠；又は 細胞等を挙げることができる。
食物は、 特に限定されず、 例えば、 食肉、 野菜、 穀物、 卵、 水産物、 又は加工食 品等を挙げることができる。
飲料は、 特に跪されず、 例えば、 ジュース、 牛乳、 茶、 コーヒー、 又は?醒等を挙げ ることができる。
薬剤は、 特に!^されず、 例えば、 輸液、 注射液、 散剤、 又は 等を挙げることが きる。
なお、 測定に用いる試料の形態は、 液体である必要があるので、 もし試料が液体でない 場合には、 抽出処理又は可溶化処理等の前処理を既知の方法に従って行い、 液#¾料とす ればよい。
また、 必要に応じて、 棚又は纖処理を行ってもよい。
3. タンパク質
本発明におけるタンパク質とは、 試料中に含まれる （又は含まれる可能性のある） タン パク質であって、 測定を行おうとするものである。
このタンパク質としては、 種々のタンパク質が文樣となり、 例えば、 総タンパク質ゃァ ルブミン等を挙げることができるが、 本発明においては、 このタンパク質が試料中に漏 にしか しない夕ンパク質である場合に好適である。
この試料中に f疆にしか雜しないタンパク質として、 例えば、 尿中のアルブミン （尿 中 ί纖アルブミン） やべンス ·ジョンズタンパク等を挙げること力 ?きる。
特に、 尿中のアルブミン （尿中 «還アルブミン） の測定に進である。
4. フルォレセイン骨格を^ τる陰イオン性化合物
本発明におけるフルォレセイン骨格を る陰イオン I'生化合物は、 フルォレセイン骨格 を有する陰イオン性の化合物であれば、 特に限定されずに用いること力 きる。
このフルォレセイン骨格を # "る陰イオン性化合物としては、 例えば、 キサンテン系色 素等を挙げることができる。
このキサンテン系色素としては、 例えば、 エリス口シン B、 ェ才シン Υ、 ェォシン Β、 フロキシン Β又はローズベンガ !/^を挙げることができる。
フルォレセィン骨格を る陰ィオン性化合物としては、 エリス口シン Βが特に好まし レ^
このフルォレセィン骨格を る陰イオン性化合物の渡は、 低すぎると測定の感度が 得られ t¾料中のタンパク質を測^ ることができないので、 少なくとも試料及びフルォ レセイン骨格を « "る陰イオン性化合物を含む混合液中の Mi で、 0. 1 以上である ことが好ましく、 0. 5 M以上であることがより好ましく、 0. 7 M以上であること が特に好ましい。
また、 このフルォレセイン骨格を衬る陰イオン性化合物の纖は、 高すぎると試薬ブ ランク （試薬盲樹 も高レ M直となつてしまうということがあるので、 少なくとも試料及び フルォレセイン骨格を る陰イオン性化合物を含む混合液中の離で、 1 , 0 0 Ο μΜ 以下であることが好ましく、 1 0 Ο Μ以下であることがより好ましく、 5 0 χΜ以下で あることが特に好ましい。
5. 界面活性剤
本発明における界面活性剤は、 界面活性剤であれば、 特に限定されずに用いることがで ぎる。
この界面活性剤としては、 非イオン性界面活性剤、 陽イオン性界面活性剤、 及び 性界 面活性剤を挙げること力 きる。
試料及びフルォレセィン骨格を^ τる陰ィオン性化合物を、界面活性剤と ί纖させると、 界面活性剤を撤虫させない場合に比べて、 測定により得られる ¾^カ搞いものとなり、 高感度化させることができる。 また、 この界面活性剤との翻虫により、 試薬ブランク （試薬盲樹 の値 m) が低 wる。
この試料の測定により得られる カ搞くなること、 及び試薬ブランク （試薬盲樹 の値 が低減することにより、 測定により得られる の値 （試料測定時の 度から試薬ブランクの を差し引いたもの） は大きなものとなり、 すなわち、 よ り大きな の値が得られることになるので、 測定の感度は高いものとなり、 高感度 化が達成される。
よって、 この界面活性剤との擻虫により、 試料中の i Mのタンパク質の測定力河能とな る。
この界面活性剤との翻虫により、試料の測定において得られる醜度が くなることは、 界面活性剤が、 非イオン I'生界面活性剤、 陽イオン ί'生界面活性剤、 又は非イオン I生界面活性 剤と陽イオン性界面活性剤の混合物である場合に顕著である。
また、 この界面活性剤との により、 試薬ブランク （試薬盲樹 の値 （醜度） が低 減することは、 界面活性剤が非イオン性界面活性剤である場合に顕著である。
よって、 本発明においては、 この界面活性剤が、 非イオン性界面活性剤、 陽イオン I'生界 面活性剤、 又は非イオン性界面活性剤と陽ィオン性界面活性剤の混合物であることがより 好ましく、 特に非イオン性界面活性剤が好ましい。
この界面活性剤の鍵は、 低すぎると鎌己の界面活性剤と翻虫させることによる効果が 充分に得られないので、 試料、 フルォレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及 面活 性剤を含む混合液中の で、 0. 1 M以上であることが好ましく、 2 0 xM以上であ ることがより好ましく、 4 0 以上であることが特に好ましい。
なお、 この界面活性剤の は、 高すぎると嫌己の界面活性剤と撤虫させることによる 効果が却って弱まることがある。
これより、 本発明において界面活性剤は、 試料、 フルォレセイン骨格を衬る陰イオン 性化合物及び界面活性剤を含む混合液中における濃度が、 当該界面活性剤の臨界ミセル濃 度 (CMC) 未満の濃度であることが好ましい。
非イオン性界面活性剤及び陽イオン性界面活性剤の具体例として、 その化合物名及びそ の臨界ミセル濃度 (CMC) 等を、 「表 1」 、 「表 2」 及び「表 3」 に示した。
〔表 1〕
Figure imgf000013_0001
(：※ POE： ポリオキシエチレン〕 〔表 2〕
Figure imgf000014_0001
！:※ POE : ポリオキシエチレン〕
〔表 3〕
陽ィォン性界面活性剤水溶液における臨界ミセル濃度 (CMC)
C M C 測定温度 化 合 物 名
(m )
ォクチルァミン塩酸塩 175 25 デシルァミン塩酸塩 48
ドデシルァミンドデシルァミン塩酸塩 14 30 テトラデシルァミン塩酸塩 3. 1 40 へキサデシルァミン塩酸塩 0. 85 55 ォクタデシルァミン塩酸塩 0. 55 60 ドデシルェチレンジアミン酢酸塩 5. 7 25 ドデシルエチレンジァミン乳酸塩 4. 4 // ドデシルエチレンジァミンプロピオン酸塩 9. 2 II テ卜ラデシルエチレンジァミン酢酸塩 3. 5 II テトラデシルェチレンジアミン乳酸塩 2. 7 II テトラデシルエチレンジァミンプロピオン酸塩 3. 4 11 へキサデシルエチレンジァミン酢酸塩 3. 4 II へキサデシルェチレンジァミンプロピオン酸塩 2. 3 II ォクチル卜リメチルアンモニゥ厶プロミド 137 II デシル卜リメチルアンモニゥムブロミド 65 II デシル卜リメチルアンモニゥ厶クロリド 65 II ドデシルトリメチルアンモニゥ厶ブロミド 16 II ドデシル卜リメチルアンモニゥ厶ク口リド 16 30 テトラデシルトリメチルアンモニゥ厶クロリド 4. 0 40 へキサデシル卜リメチルアンモニゥ厶プロミド 1. 0 60 へキサデシルトリメチルアンモニゥ厶クロリド 1. 3 30 ォクタデシルトリメチルアンモニゥ厶クロリド 0. 34 25 ドデシルピリジニゥ厶クロリド 1. 5 30 テ卜ラデシルピリジニゥ厶クロリド 3. 6 40 へキサデシルピリジニゥ厶ク口リド 0. 9 30 ォクタデシルピリジニゥ厶クロリド 0. 8 II へキシルジメチルベンジルアンモニゥ厶クロリド 43. 4
デシルジメチルベンジルアンモニゥ厶クロリド 6. 1
ドデシルジメチルベンジルアンモニゥ厶クロリド 2. 8
テ卜ラデシルジメチルベンジルアンモニゥ厶クロリド 0. 37
へキサデシルジメチルベンジルアンモニゥムクロリド 0. 044
才クタデシルジメチルベンジルアンモニゥ厶クロリド 0. 0071
ジォクチルジメチルアンモニゥ厶クロリド 26. 6
ジデシルジメチルアンモニゥ厶クロリド 2. 0
ジドデシルジメチルアンモニゥ厶クロリド 0. 18 本発明における界面活性剤としては、 非イオン性界面活性剤である 「トライトン； X— 1 0 0 (Triton X-100) 」 〔ポリ才キシエチレン （1 0) ォクチルフエ二ルェーテル〕 （臨界 ミセリレ 0. 3 5mM)及ぴ「ツイーン 2 0 (Tween20)」 〔ポリ才キシエチレン（2 0) ソルビタンモノラウリン酸エステル〕 （臨界ミセル艇： 3. 2mM ; 1 8°C) 、 並 びに陽イオン性界面活性剤である 「ゼフイラミン （¾phiramine) 」 〔ベンジルジメチルテ トラデシルアンモニゥム塩酸;^ (臨界ミセル? : 0. 3 7 mM) が特に好ましい。 例えば、 このトライトン X— 1 0 0においては、 鎌己混合液中における纖が、 臨界ミ セル ¾である 0. 3 5mM未満であることが好ましく、 0. 1 5mM以下であることが より好ましく、 0. 1 ImM以下であることが特に好ましい。
6. 試料中のタンパク質の測定
本発明における試料中のタンパク質の測定について、 以下説明を行う。
( 1 ) 試料、 フルォレセイン骨格を る陰イオン I'生化合物及 面活性剤の搠虫 試料、 フルォレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及 面活性剤を雄させること であるが、 嫌己の試料、 嫌己のフルォレセイン骨格を有する陰イオン I'生化合物、 及び編己 の界面活性剤を撤虫させることができれば、 どのような方法でもよい。
この擲虫時のフルォレセィン骨格を有する陰イオン性化合物、 及 面活性剤のそれぞ れの？ については、 嫌己の通りである。
この試料、 フルォレセィン骨格を る陰イオン性化合物及 面活性剤を撤虫させる ことは、 1段階で行ってもよぐ 又は 2段階以上の多段階により行ってもよい。
前記擲虫を 1段階で行う場合は、 試料と、 フルォレセイン骨格を有する陰イオン 1'生化合 物及び界面活性剤の混合物 （例えば測 ¾M薬） を^虫させる。
嫌己 ^[を 2段階以上の多段階で行う場合、 その順序として次のものを挙げることが ぎる。
( a) 試料とフルォレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を機させ、 次にこれに界 面活性剤を擞虫させる。 (b) 試料と界面活性剤を翻虫させ、 次にこれにフルォレセイン骨格を "る陰イオン 性化合物を擲虫させる。
( c ) フルォレセイン骨格を有する陰イオン 1'生化合物と界面活性剤を擲虫させ、 次にこ れに試料を撤虫させる。
この、 試料、 フルォレセイン骨格を有する陰イオン I'生化合物、 及び界面活性剤を纖さ せる時間であるが、 3 0秒間以上であることが好ましく、 1分間以上であることがより好 ましく、. 3分間以上であることが特に好ましい。
この、 試料、 フルォレセイン骨格を有する陰イオン I'生化合物、 及び界面活性剤を擻虫さ せる? J であるが、 特に はない。 但し、 6 0°C以上であると、 タンパク質が変性する 可能性があるので、 0〜5 0°Cが好ましく、 5〜4 5°Cがより好ましく、 1 5〜4 0°Cが 特に好ましい。 .
(2 ) pH
本発明においては、 試料、 及びフルォレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を纖さ せた後、 少なくともこの試料及びフルォレセイン骨格を # "る陰イオン性化合物を含む混 合液の pHを、 pH 5. 0以下とすることが好ましい。
廳己撤虫後に、 嫌己混合液の p Hを p H 5. 0以下とすることにより、 測定により得ら れる吸光度が更に高いものとなり、 かつ試薬ブランク （試薬盲検） の値 （吸)1^) を低減 させることができる。
この試料の測定により得られる ¾ ^力稿くなり、 力、つ試薬ブランク （試薬盲検） の値 { m が低減することにより、 測定により得られる p 1^の値 （試料測定時の 度から試薬ブランクの 渡を差し弓 Iいたもの） はより大きなものとなり、 すなわち、 よ り大きな の値が得られることになり、 高い測定の感度が得られるようになるので 好ましい。
嫌己翻虫後に、 謙己混合液の pHを ρΗ 5. 0以下とすることが好ましいのであるが、 この pHを ρΗ4. 0以下とすることにより鎌己 の値を更に大きくすること力 ? きるのでより好ましく、 同じ理由によりこの pHを pH 3. 5以下とすることが特に好ま しい。
なお、 この試料、 及びフルォレセイン骨格を； る陰イオン性化合物を撤虫させた後、 少なくともこの試料及びフルォレセィン骨格を ¾ る陰ィオン性化合物を含む混合液の ρ Ηを、 ρ Η 5. 0以下（より好ましくは ρ Η4. 0以下、 特に好ましくは pH 3. 5以下) とすることは、 これが難できれば、 どのような方法で行ってもよい。
例えば、 少なくとも試料及びフルォレセィン骨格を る陰イオン性化合物を含む混合 液に、 酸性の溶液である酸性溶液を添力 ることより、 当該混合液の pHを pH 5. 0以 下 （より好ましくは pH4. 0以下、 特に好ましくは pH 3. 5以下） とさせてもよい。 なお、 もちろん、 この酸性額夜は、 嫌己混合液に添力 ΠΤることにより、 当該混合液の p Hを pH 5. 0以下 （より好ましくは pH4. 0以下、 特に好ましくは pH 3. 5以下） とすることが、できるような、 酸性物質含有量、 pH又は添加 »のものでなければならな レ^
この酸性溶液としては、 例えば、 クェン酸水謹、 酢酉妹溶液、 塩 溶液、 纖水溶 液、 又は硫膨 κ溶麟を挙げること力 きる。
この試料、 及びフルォレセイン骨格を "る陰イオン性化合物を擻虫させた後、 少なく ともこの試料及びフルォレセイン骨格を衬る陰イオン性化合物を含む混合液の pHを、 PH 5. 0以下 （より好ましくは pH4. 0以下、 特に好ましくは pH 3. 5以下） とす ることの順序として、 本発明において次のものを挙げることができる。
(A) 試料と、 フルォレセイン骨格を^ る陰イオン附匕合物及 面活性剤の混合物
(例えば測鐵薬） を擻虫させ、 次にこれに酸性溶液を添力 る等により当該混合液の P Hを、 p H 5. 0以下（より好ましくは pH4. 0以下、 特に好ましくは pH 3. 5以下) とする。
(B) 試料とフルォレセイン骨格を有する陰イオン I'生化合物を擲虫させ、 次にこれに界 面活性剤を翻虫させ、 次にこれに酸性溶液を励 る等により当該混合液の pHを、 pH 5. 0以下 （より好ましくは pH4. 0以下、 特に好ましくは pH 3. 5以下） とする。 (C) 試料と界面活性剤を ¾ させ、 次にこれにフルォレセイン骨格を tる陰イオン 性化合物を ί纖させ、 次にこれに酸性溶液を添力 ITTる等により当該混合液の ΡΗを、 ρΗ
5. 0以下 （より好ましくは ρΗ4. 0以下、 特に好ましくは ρΗ 3. 5以下） とする。 (D) フルォレセイン骨格を有する陰イオン性化合物と界面活性剤を搠虫させ、 次にこ れに試料を撤虫させ、 次にこれに酸性溶液を勸 る等により当該混合液の ΡΗを、 ρΗ
5. 0以下 （より好ましくは ρΗ4. 0以下、 特に好ましくは ρΗ 3. 5以下） とする。 (Ε) 試料とフルォレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を ί纖させ、 次にこれに酸 性溶液を添力 ΠΤる等により当該混合液の ΡΗを、 ρ Η 5. 0以下 (より好ましくは ΡΗ4. 0以下、 特に好ましくは ρΗ 3. 5以下） とし、 次にこの当該混合液に界面活性剤を撤虫 させる。 - (F) 試料とフルォレセイン骨格を有する陰イオン ft化合物を搠虫させ、 次にこれに界 面活性剤を含む酸性溶液を添加し、 当該混合液の PHを、 pH 5. 0以下 （より好ましく は pH4. 0以下、 特に好ましくは pH 3. 5以下） とする。
(3) 醜度測定
本発明の測定方法においては、 試料、 フルォレセイン骨格を ¾ る陰イオン性化合物及 び界面活性剤を擲虫させ、 この試料、 フルォレセイン骨格を有する陰イオン I生化合物及び 界面活性剤を含む混合液の ¾ ^の測定を行い、 試料中のタンパク質の濃度を求める。 この試料、 フルォレセィン骨格を "る陰イオン性化合物及 面活性剤を含む混合液 の吸)1 έ¾の測定であるが、 当該混合液が有する吸収極大の波長又は近辺の波長において吸 の測定を行う。
そして、 この試料を測定したときの吸 3^ (測定値） を、 測定を行うタンパク質の濃度 が既知の試料 （標準液、 標準物質） を測定したときの吸光度 （測定値） で除して、 この標 準液のタンパク質の鍵の値を乗じることにより、 試料中に含まれていたタンパク質の濃 度を算出することができる。 なお、 前記の試料を測定したときの吸)1 (測定値） 、 及び測定を行うタンパク質の濃 度既知の試料 （標準液、 標準物質） を測定したときの (測定値） は、 測定を行う夕 ンパク質を全く含まなレ观水又は生理 等を試料として測定を行レ、得られた試薬ブラ ンク （試薬盲検） の吸光度を差し引いたものである。
(4) 測定操作例
汎用自動分析装置により本発明の試料中の夕ンパク質の測定方法を ¾ る際の操作の 一例を 下に示す。
〔i〕 フルォレセイン骨格を^ る陰イオン I生化合物であるエリス口シン B、 M オン性界面活性剤であるトライトン X— 1 0 0を含 るタンパク戴則 «薬の第 1試 薬と、 クェン酸水激夜からなるタンパク戴則纖薬の第 2試薬とを各々、 翻する汎用自 動分 ί斤装置装置に適合した容器に入れる。 - 〔2〕 これらの試薬が入った容器の各々を、 嫌己自動分析装置の所定の位置に置く。 〔3〕 また、 タンパク質の測定を行う試料も嫌己自動分析装置に適合した容器に入れ 所定の位置に置く。
〔4〕 使用する測定試薬、 及 則定を行おうとする試^についての測定条件 （測定パ ラメ一夕） 等を嫌己自動分析装置に入力し、 設¾^る。
〔5〕 そして、 試料の測定を開始する。
通常は、 試料と前記の測定試薬の第 1試薬のそれぞれをピペット （プローブ） 又はチュ ーブ等で反応セル （反応キュベット） に分注し、 混合、 漏させ、 第 1段階の反応系を形 成させて、 —定の条件下に保ち、 第 1段階の反応を行わせる。
〔6〕 一定時間後（第 1段階の反応の終了^)、 この反応セル（反応キュべット） 内の試 料と測^ t薬の第 1試薬との反 夜 （第 1段階の反応系） について、 予め設定した波長に おける醜度値を測定する。
〔7〕 次に、 この反応セル （反応キュベット） 内の反 J¾夜に、 鎌己の測 薬の第 2試 薬をピペット （プロ一力 又はチューブ等で分注し、 混合、 翻虫させ、 第 2段階の反応系 を形成させて、 一定の条件下に保ち、 第 2段階の反応を行わせる。
〔8〕 一定時間後（第 2段階の反応の終了衡、 この反応セル（反応キュべット） 内の試 料と測 薬の第 1試薬及び第 2試薬との反 夜 (第 2段階の反応系）について、鎌己〔6〕 の波長における吸光度値を測定する。
〔9〕 試料に替えて純水について、鎌己〔5〕〜〔8〕 の操作を行い、試薬ブランク （試 薬盲^) の 度値を測^る。
〔1 0〕 . 前記 〔8〕 で得た吸光度値より試薬ブランク （試薬盲検） の吸 値を差し引 いたものから、 嫌 S 〔6〕 で得た ¾¾ 値より試薬ブランク （試薬盲樹 の 値を差 し引いたものを減じて、 吸光度差の値を算出する。
〔1 1〕 鎌己 〔1 0) で算出した吸光度差の値と、 測定を行うタンパク質の濃度が既知 の試料 （標準液） における吸) の値 〔検量線〕 とを比較することにより、 試料中に含 まれていたタンパク質の を算出して得る。
W. 試料中のタンパク質の測定試薬
1. 本発明の試料中のタンパク質の測定試薬
本発明の試料中のタンパク質の測定試薬は、フルォレセィン骨格を^ ΓΤる陰イオン性化 合物及 面活性剤を含^ るものである。
2. 試料
本発明における試料は、 前記の 「〔1〕. 試料中のタンパク質の測定方法」 の 「2. 試 料」 において記載した通りである。
3. タンパク質
本発明におけるタンパク質は、前記の「〔 I〕.試料中のタンパク質の測定方法」の「3. タンパク質」 において記載した通りである。
4. フルォレセイン骨格を有する陰イオン I生化合物
本発明におけるフルォレセイン骨格を有する陰イオン I生化合物は、 前記の 「〔1〕. 試料 中のタンパク質の測定方法」 の 「4. フルォレセイン骨格を有する陰イオン性化合物」 に おいて記載した通りであるが、 ここで記載した濃度が、 試料に含まれていたタンパク質 と、 フルォレセィン骨格を有する陰イオン性化合物との搠虫時に当該混合液中において達 成されるように、 このフルォレセイン骨格を衬る陰イオン性化合物を測^:薬に含有さ せることが好ましい。
5 . 界面活性剤
本発明における界面活性剤は、前記の「〔1〕.試料中のタンパク質の測定方法」の「5. 界面活性剤」 において記載した通りである。
この界面活性剤は、試料に含まれていたタンパク質及びフルォレセィン骨格を る陰 イオン性化合物との翻虫時に、 当該混合液中において当該界面活性剤の臨界ミセル 満の となるような «になるよう、 この界面活性剤を測 ¾ ^薬に含有させることが好 ましい。 .
6. 測織薬の構成
( 1 ) 構成
本発明の試料中の夕ンパク質の測^:薬は、 2試薬又は 3試薬以上のネ冓成からなること が好ましい。
特に 2試薬からなることが好ましい。
前記測定試薬が第 1試薬及び第 2試薬の 2試薬からなる場合、 この 2つの試薬にそれぞ れ含まれる成分の構成として次のものを挙げること力 きる。
( a) 第 1試薬 フルォレセィン骨格を る陰イオン性化合物
第 2試薬 界面活性剤
(b) 第 1試薬 フル才レセィン骨格を有する陰イオン性化合物、 界面活性剤
2 pi 界面活性剤
( c ) 第 1試薬 界面活性剤
第 2試薬 フルォレセィン骨格を ¾ る陰イオン 1'生化合物
(d) 第 1試薬 界面活性剤 第 2試薬 フルォレセイン骨格を； る陰イオン性化合物、 界面活性剤
(e) 第 1試薬 フレオレセィン骨格を有する陰イオン性化合物、 及び界面活性剤 第 2試薬
( f ) 第 1試薬： フルォレセイン骨格を有する陰イオン性化合物、 及び界面活性剤 第 2試薬： 界面活性剤、 緩衝剤等
(2 ) 酸性溶液
本発明の試料中のタンパク質の測^ 薬は、 少なくともフルォレセイン骨格を る陰 イオン性化合物を含有する溶 なる第 1試薬と、 酸性溶液からなる第 2試薬との組み 合わせよりなり、 界面活性剤が当該第 1試薬及び Z又は当該第 2試薬に添加されているも のであることが好ましい。
なお、 前記の酸性溶¾? なる第 2試薬は、 試料及び第 1試薬を混合した混合液に当該 第 2試薬を添加することにより、 当該混合液の p Hを p H 5. 0以下とすることができる ものである。
この酸性溶 び p Hについての詳細は、 前記の 「〔1〕. 試料中のタンパク質の測定方 法」の「6.試料中のタンパク質の測定」の「（2 ) p HJにおいて記載した通りである。 なお、 本発明の試料中のタンパク質の測定試薬が、 少なくともフルォレセイン骨格を有 する陰イオン性化合物を含有する溶 らなる第 1試薬と、 酸性溶 ί¾ らなる第 2試薬と の組み合わせよりなる場合、 この 2つの試薬にそれぞれ含まれる成分の構成として次のも のを挙げることができる。
(Α) 第 1試薬 フルォレセィン骨格を有する陰イオン性化合物、 及 面活性剤 酸隱夜
(Β) 第 1試薬 フルォレセイン骨格を る陰イオン性化合物、 及 面活性剤 界面活性剤を含む酸性溶液
(C) 第 1試薬 フレ才レセィン骨格を有する隆イオン性化合物
第 2試薬 界面活性剤を含む酸性溶液 7. 他の成分
本発明の試料中のタンパク質の測 薬においては、 必要に応じて、 更に、 緩衝剤、 ァ ルカリ金属若しくはアルカリ土類金属などのイオン又はこれを含む塩；キレート剤；アジ 化ナトリウム、 抗生物質若しくは合成抗菌 などの防腐剤；糖類若しくは高^^化合物な どの安定化剤；活性化剤；試料中に含まれる測定妨割勿質の消去若しく 影響抑制に関わ る物質；又は他の試薬成分等を 要に応じて被させることができる。
そして、 嫌己の緩衝剤としては、 測定上必要な pHの範囲に鐵斷能を有する緩衝剤を存 在させること力 S好ましい。
このような緩衝剤としては、 例えば、 ME S、 B i s—T r i s、 B i s— T r i sプ ロノ ン、 ADA、 P I PES, ACES, MOPS〇、 MOPS, BES、 TES、 HE PES、 D I PSO、 TAP SO, POP SO, HEPPSO, EPPS、 Tr i e i n e、 B i c i ne、 TAPS, CHES、無機リン酸、無機リン酸塩、ホウ酸、ホウ酸塩、 グリシン、 グリシルグリシン、 イミダゾ—ル、 又はトリス （ヒドロキシメチル） アミノメ タン 〔Tr i s〕 等を挙げることができる。 発明の効果
本発明の試抖中のタンパク質の測定方法は、 測定に掛かるコストが低いものであって、 専用装置ではなく多くの病院で使用されている汎用自動分析装置にも適用でき、 力つ 斗 中に に含まれる夕ンパク質を高感度に測 ¾τることができる、 とレ 効果を ¾ るも のである。
また、 本発明の試料中のタンパク質の測 ¾ 薬は、 そのコストが低いものであって、 専 用装置ではなく多くの病院で使用されている汎用自動分析装置にも適用でき、 かつ試料中 に遣に含まれるタンパク質を高感度に測 ることができる、 という効果を有するもの である。 実施例
以下、 実施例により本発明をより具体的に詳述するが、 本発明はこの実施例の記載によ り限定されるものではない。
〔実施例 1〕 （本発明の測定方法及 t ^則 薬における界面活性剤の効果の確認） 本発明の試料中の夕ンパク質の測 法及 目』 薬における、 界面活性剤の効果を確 認した。
1. B式
( 1 ) 第 1試薬
第 1試薬として、 エリス口シン B (和光純薬工業社） を純水に溶解し、 1 0 エリ スロシン BzK?額夜を調製した。
(2 ) 第 2試薬 .
第 2試薬として、 クェン酸（和光純薬工業ネ ±) を /iに溶解し、 5 0 0mMクエン^ * 猶を調製した。
( 3) 第 3試薬
第 3試薬として、 下記の試薬を各々調製した。
(a) 界面活性剤不含試薬
界面活性剤を含まない界面活性剤不含試薬として、 純水を用意した。
(b) 卜ライトン X— 1 0 0試薬
卜ライ卜ン X— 1 0 0試薬として、 卜ライ卜ン X— l o o (ナカライテスクネ; fc) im- 量： 6 2 5〕 を,純水に溶解し、 6. 4mM トライトン X— 1 0 07 夜を調製した。
(c) ツイーン 2 0試薬
ツイ一ン 2 0試薬として、 ツイーン 2 0を zKに容解し、 0. 4mMツイーン 2 0水溶 液を調製した。
(d) ゼフイラミン試薬 .
ゼフィラミン試薬として、ゼフィラミンを純水に溶解し、 4mMゼフィラミン水溶液を 調製した。
2. 試料
(I) タンパク質含有試料
タンパク質を含むタンパク質含線料として、 ヒト血清アルブミン 〔HSA〕 （シグマ ¾) を純水に溶解し、 2. Omg/Lのヒト血清アルブミン水溶液を調製した。
(H)タンパク質不含試料
タンパク質を含まないタンパク質不含試料として、 を用意した。
3. 測定
(I) 前記 2の （I) のタンパク質含有試料の 3, 660 Lに、 前記 1の （1) の第 1試薬を 80^L、 鎌 31の （2) の第 2試薬を 160 L、 及び鎌 31の （3) の第 3 試薬の.（a) の界面活性剤不含試薬を 100. L添加し、 混合し、 混合液とした。
(2) 次に、 l己 (1) の混合液を、 計により、 波長を 400 nmから 700 nmまでスキヤンして を測定し、 編 3混合液の吸収曲線を記録した。
(3) 前記 2の （I) のタンパク質含 料に替えて前記 2の （Π) のタンパク質不含 試料を試料とする他は觸己 (1) 及び (2) の記載の通りに操作を行い、 吸収曲線を記録 した。
試料として夕ンパク質含有試料を用レ ^た場合の前記吸収曲線、 及び試料としてタンパク 質不^料を用いた場合の嫌 3吸収曲線を、 図 1に示した。
(4) 嫌 S1の（3)の第 2試薬の（a)の界面活性剤不^ t薬に替えて、 lift己 1の（3) の第 2試薬の（b)のトライトン X— 100試薬を第 2試薬とする他は、籠己（1)、 (2) 及び (3) の記載の通りに操作を行い、 試料としてタンパク質含極料を用いた場合の前 記吸収曲線、 及び試料としてタンパク質不含試料を用いた場合の觸己吸収曲線を示した図 2を得た。
(5) 鎌己 1の（ 3 )の第 2試薬の（a)の界面活性剤不^:薬に替えて、編己 1の（ 3 ) の第 2試薬の （c) のツイーン 20試薬を第 2試薬とする他は、 嫌己 (1) 、 (2) 及び (3) の記載の通りに操作を行い、 試料としてタンパク質含有試料を用いた場合の前記吸 収曲線、 及ぴ弒料として夕ンパク質不 料を用いた場合の前記吸収曲線を示した図 3を 得た。
(6) 鎌己 1の（3 )の第 2試薬の（a)の界面活性剤不^ li薬に替えて、鎌己 1の（3) の第 2試薬の （d) のゼフイラミン試薬を第 2試薬とする他は、 嫌己 ( 1 ) 、 (2) 及び (3) の記載の通りに操作を行い、 試料としてタンパク質含有試料を用いた場合の前記吸 収曲線、 .及び ¾料としてタンパク質不含試料を用いた場合の觸己吸収曲線を示した図 4を 得た。
4. 測定結果
( 1 ) 図 1及び図 2より、 以下のことが分かる。
非イオン性界面活性剤であるトライトン X— 1 0 0を測鐵薬に含有させ、 フルォレセ ィン骨格を る陰イオン性化合物であるエリス口シン B及び試料と誦させた場合には、 卜ライ卜ン X— 1 0 0を測定試薬に含有させず ¾|虫させない場合に比べて、 タンパク質含 有試料を測定したときの混合液の吸収曲線の吸収極大及び近辺の吸光度が著しく高くなつ ている。
また、 このトライトン X— 1 0 0を測趨薬に含有させ、 エリス口シン B及び試料と接 触させた場合には、 トライトン X— 1 0 0を測定試薬に含有させず ¾ させない場合に比 ベて、 タンパク質不含試料を測定したときの混合液 〔試薬ブランク （試薬盲樹 〕 の吸収 曲線の吸収極: «び近辺の が顕著に低減している。
これらのことより、 非イオン性界面活性剤であるトライトン X— 1 0 0を現 IJ定試薬に含 有させ、 フルォレセィン骨格を有する陰イオン性化合物であるエリス口シン B及ぴ試料と 翻虫させた場合には、 測定により得られる SS)1^の値 （試料測定時の から試薬ブ ランクの^ i を差し引いたもの） がより大きなものとなり、 高!^測定の感度が得られる ようになつたことが ϋかめられた。
(2 ) 図 1及び図 3より、 以下のことが分かる。 非イオン性界面活性剤であるツイーン 2 0を測定試薬に含有させ、 フルォレセイン骨格 を Wる陰イオン性化合物であるエリス口シン B及ぴ弒料と擲虫させた場合には、 ツイ一 ン 2 0を測^:薬に含有させす 虫させない場合に比べて、 タンパク質含 # 料を測定し たときの混合液の吸収曲線の吸収極^ ¾び近辺の吸^ em力著しく高くなつている。
また、 このツイーン 2 0を測定試薬に含有させ、 エリス口シン B及び試料と撤虫させた 場合には、 ツイーン 2 0を測定試薬に含有させず Ϊ翔虫させない場合に比べて、 タンパク質 不含試料を測定したときの混合液 〔試薬ブランク （試薬盲樹 〕 の吸収曲線の吸収極 汲 び近辺の が明らかに低減している。
これらのことより、 非イオン性界面活性剤であるツイーン 2 0を測^:薬に含有させ、 フル才レセィン骨格を る陰イオン性化合物であるエリス口シン B及び試料と翻虫させ た場合には、 測定により得られる の値 （試料測定時の 度から試薬ブランクの 度を差し引いたもの） がより大きなものとなり、 高レ測定の感度が得られるようにな つたことが かめられた。
(3) 図 1及び図 4より、 以下のことが分かる。
陽イオン性界面活性剤であるゼフィラミンを測定試薬に含有させ、 フルォレセィン骨格 を衬る陰イオン性化合物であるエリス口シン B及ぴ弒料と纖させた場合には、 ゼフィ ラミンを測 ¾M薬に含有させ 虫させない場合に比べて、 タンパク質含有 料を測定し たときの混合液の吸収曲線の吸収極^ ¾び近辺の吸 ¾J が著しく高くなつている。
なお、 このゼフイラミンを測定試薬に含有させ、 エリス口シン B及び試料と ¾ させた i には、 ゼフイラミンを測^薬に含有させ ¾虫させない場合に比べて、 タンパク質 不含試料を測定したときの混合液 〔試薬ブランク （試薬盲樹 〕 の吸収曲線の吸収 び近辺の吸)1^は高くなつている。
しかしながら、 この： ^でも、 測定により得られる 鶴の値 （試料測定時の 力^試薬ブランクの ¾ ^を差し引いたもの） は、 測 ¾M薬にゼフイラミンを含有させ接 触させたときの方が、 ゼフイラミンを測 ¾ 薬に含有させ 虫させない よりも、 よ り大きなものとなり、 この場合も、 高い測定の感度が得られるようになったことが かめ られた。
〔実施例 2〕 （本発明の測定方法及 則定試薬における界面活性剤の濃度と効果の関係の 確認）
本発明の試料中の夕ンパク質の測 法及 定試薬における、 界面活性剤であるトラ ィトン X— 100の濃荬と効果の関係を HI忍した。
1. 試藥
(1) 第 1試薬
第 1試薬として、 エリス口シン B (和 屯薬工業ネ: fc) を純水に溶解し、 1 02 /LLMエリ スロシン B水溶液を調製した。
(2) 第 2試薬 - 第 2試薬として、 クェン酸（和光純薬ェ難） を純水に溶解し、 50 OmMクェン 夜を調製した。
(3) 第 3試薬
第 3試薬として、 下記の試薬を各々調製した。
(a)界面活性剤不含試薬
界面活性剤を含まない界面活性剤不含試薬として、 純水を用意した。
(b) 卜ライ卜ン X— 100試薬
(A) 1. 6mM 卜ライトン X— 100含有試薬
1. 6mM トライトン X—100含有式薬として、 卜ライ卜ン X— 100 (ナカラィテ スクネ ±) [^?量： 625〕 を純水に溶解し、 1. 6mM トライ卜ン X— 100水溶液を 調製した。
(B) 3. 2mM 卜ライ卜ン X— 100含 ^lit薬
3. 2mM トライトン X— 100含有試薬として、 トライトン X— 100 (ナカラィテ スクネ ±) ΐ^ Λ 625] を ίβ7_Κに溶解し、 3. 2mM トライトン X— 1007溶夜を 調製した。
(C) 4. 8mM トライトン X— 100含 薬
4. 8mM 卜ライトン X— 100含 弒薬として、 トライトン X— 100 (ナカラィテ スクネ ±) [^？量： 625〕 を純水に溶解-し、 4. 8mM トライ卜ン X— 100水溶液を 調製した。
(D) 6. 4mM 卜ライ卜ン X— 100含有試薬
6. 4mM トライトン X— 100含有試薬として、 トライトン X— 100 (ナカラィテ スク¾) Ι^ Λ : 625〕 を屯水に?容角爭し、 6. 4mM 卜ライトン X— 100水溶液を 調製した。
(E) 8mM トライトン X— 100含^ ¾薬
8mM トライトン X— 100含有試薬として、 トライトン X— 100 (ナカライテスク ¾) [^量： 625]を /J<に溶解し、 8mM トライトン X— 100 溶液を調製した。
(F) 9. 6mM トライトン X— 100含 薬
9. 6mM トライトン X— 100含極薬として、 トライトン X— 100 (ナカラィテ スクネ ±) [^量： 625〕 を糸屯水に溶解し、 9. 6mM トライトン X— 1007溶液を 調製した。
(G) 12. 8mM 卜ライ卜ン X— 100含 ¾|¾薬
12. Sm 卜ライ卜ン X—100含有 薬として、 卜ライトン X— 100 (ナカライ テスクネ ±) {^ Λ : 625〕 を糸屯水に?容角 し、 12. 8mM 卜ライ卜ン X— 100水溶 液を調製した。
(H) 16mM トライトン X— 100含； 薬
16mM トライトン X— 100含有試薬として、 トライトン X— 100 (ナカライテス ク社） KJ^?量： 625〕 を Φ7_Κに容解し、 16mM 卜ライ卜ン X— 1007_K溜夜を調製 した。
(I) 19. 2mM トライトン X— 100含有試薬 19. 2mM 卜ライ卜ン X— 100含有試薬として、 卜ライ卜ン X— 100 (ナカライ テスクネ： h) (^量： 625〕 を純水に容 し、 19. 2mM トライトン X—10 ΟτΚ溶 液を調製した。
(J) 25. 6mM トライトン X— 100含有試薬
25. 6mM トライトン X— 100含械薬として、 トライトン X— 100 (ナカライ テスク社） ^量： 625〕 を純水に溶解し、 25. 6mM トライトン X— 100水溶 液を調製した。
(K) 32mM 卜ライトン X— 100含 薬
32mM 卜ライトン X— 100含有試薬として、 卜ライ卜ン X— 100 (ナカライテス ク社） ϊό^ ' : 625〕 を φ7_Κに容解し、 32mM トライトン X— 100水溶液を調製 した。 . -
2. 試料
(I) タンパク質含^料
タンパク質を含むタンパク質含織料として、 ヒト血清アルブミン 〔HSA〕 （シグマ ¾) を純水に溶解し、 1. 5mg/Lのヒト血清アルブミン水激夜を調製した。
(Π) タンパク質不含試料
夕ンパク質を含まない夕ンパク質不含試料として、 純水を用意した。
3. 測定
(1) 鎌己 2の （I) のタンパク質含 料の 3， 660 zLに、 鎌己 1の （1) の第 1試薬を 80 L、 編己 1の （2) の第 2試薬を 160 L、 及び編己 1の （3) の第 3 試薬の （a) の界面活性剤不含試薬を 100 添加し、 混合し、 混合液とした。
(2) 次に、 鎌己 （1) の混合液を、 ^^計により、 波長 547 nmにおける醜 度を測定した。
(3) 前記 2の （I) のタンパク質含有試料に替えて前記 2の （H) のタンパク質不含 試料を試料とする他は、 嫌己 (1) 及び (2) の記載の通りに操作を行い、 度を測定 した。
(4) 次に、 鎌 31の （3) の第 3試薬の （a) の界面活性剤不含試薬に替えて、 鎌己 1の （3) の第 3試薬の (b) トライトン X— 1 0 0試薬の （A) 1. 6mM トライトン X— 1 0 0含有試薬〜 (K) 3 2mM トライトン X— 1 0 0含観薬の計 1 1種類の第 3 試薬をそれぞれ用いる他は、 鎌己 ( 1 ) 、 ( 2) 及び ( 3) の記載の通りに操作を行い、 醜度を測定した。
( 5) 鎌己 ( 1 ) 〜 （4) における各第 3試薬を用いた場合の、 タンパク質含有試料を 測定したときの吸1^、 及びタンパク質不含試料を測定したときの吸光度を、 図 5に示し た。
4. 測 結果
この図 5より、 以下のことが分かる。 .
試料、 フルォレセイン骨格を有する陰イオン 1'生化合物 （エリス口シン B) 及 U ^面活性 斉! I (トライ卜ン X— 1 0 0) を含む?昆合液中で、 界面活' [生斉 （卜ライ卜ン X— 1 0 0) の 鍵が、 この界面活性剤（トライトン X— 1 0 0)の臨界ミセル S (CMC)である 0. 3 5mM以上においては、 ill が 0 · 3 5 mM未満のときに比べて、 タンパク質含有隱 を測定したときの混合液の 度が低減しており、 またタンパク質不含試料を測定したと きの混合液 〔試薬ブランク （試薬盲樹 〕 の吸) ¾Sが増加している。
すなわち、 前記混合液中における界面活性剤 （トライトン X— 1 0 0 ) の濃度が、 その 臨界ミセル献 （CMC) である 0. 3 5mM以上においては、 ？麒が 0. 3 5mM未満 のときに比べて、 測定により得られる ^の値 （試料測定時の ¾^から試薬ブラン クの を差し引いたもの） がより小さくなり、 測定の感度が減少し、 界面活性剤 （ト ライトン X— 1 0 0) を含有及び翻虫させることの効果が弱まっていることが分かる。 このことより、試料、フルォレセイン骨格を る陰イオン 1'生化合物及び界面活性剤（ト ライトン X— 1 0 0)を含む混合液中での界面活性剤（トライトン X— l o o)の? は、 この界面?舌' I生斉 U (トライトン X— 1 0 0) の 界ミセリレ？離 (CMC) 未満の である ことが好ましいことが分かる。
〔実施例 3〕 （本発明の測定方法及 則定試薬における界面活性剤の濃度と効果の関係の 確認）
本発明の試料中の夕ンパク質の測 法及 則 薬における、 界面活性剤であるゼフ ィラミンの と効果の関係を確認した。
1. 試薬 '
(1) 第 1試薬
第 1試薬として、 エリス口シン B (和 屯薬工業ネ ±) を純水に溶解し、 102βΜエリ スロシン Β7_Κ溶液を調製した。
(2) 第 2試薬
第 2試薬として、 クェン酸 mmn を純水に溶解し、 soomMクェン 激夜を調製した。
(3) 第 3試薬
第 3試薬として、 下記の試薬を各々調製した。
(a) 界面活性剤不含試薬
界面活性剤を含まない界面活性剤不含試薬として、 純水を用意した。
(b) ゼフイラミン試薬
(A) 4mMゼフイラミン含 薬
4mMゼフイラミン含観薬として、 ゼフイラミンを純水に溶解し、 4mMゼフイラ ミン水溶液を調製した。
(B) 8mMゼフイラミ ^観薬
8mMゼフィラミン含^薬として、 ゼフィラミンを ί?Κに ί容解し、 8mMゼフィラ ミン 7j^l夜を調製した。
(C) 15mMゼフイラミン含 薬
15mMゼフィラミン含; 薬として、 ゼフィラミンを _に溶解し、 15mMゼフ W
32 イラミン水溶液を調製した。
(D) 20mMゼフイラミン含 薬
2 OmMゼフイラミン含有試薬として、 ゼフイラミンを純水に溶解し、 20mMゼフ イラミン水溶液を調製した。
(E) 3 OmMゼフィラミン含 薬
3 OmMゼフイラミン含有試薬として、 ゼフイラミンを純水に溶解し、 3 OmMゼフ イラミン水激夜を調製した。
2. 試料
(1) タンパク質含^ flit料
タンパク質を含むタンパク質含観料として、 ヒト血清アルブミン 〔HSA〕 （シグマ ¾) を純水に溶解し、 2. OmgZLのヒ卜血清アルブミン水溶液を調製した。
(Π) タンパク質不含試料
タンパク質を含まないタンパク質不含試料として、 純水を用意した。
3. 測定
(1) 前記 2の （I) のタンパク質含有試料の 3, 660 Lに、 前記 1の （1) の第 1試薬を 80 L、 嫌 31の （2) の第 2試薬を 160 L、 及び嫌己 1の （3) の第 3 試薬の （a) の界面活性剤不^ 薬を 100 漏口し、 混合し、 混合液とした。
(2) 次に、 ffflB (1) の混合液を、 ^1 計により、 波長 547 nmにおける醜 度を測定した。
(3) 前記 2の （I) のタンパク質含織料に替えて嫌己 2の （Π) のタンパク質不含 試料を試料とする他は、 ttflB (1) 及び (2) の記載の通りに操作を行い、 度を測定 した。
(4) 次に、 嫌己 1の （3) の第 3試薬の （a) の界面活性剤不含試薬に替えて、 鎌己 1の （3) の第 3試薬の （b)ゼフイラミン試薬の （A) 4mMゼフイラミン含織薬〜 (E) 3 OmMゼフィラミ ^tM薬の計 5種類の第 3試薬をそれぞれ用いる他は、鎌己 ( 1 ) 、 （2) 及び（3) の記載の通りに操作を行い、 を測定した。
( 5) 前記 ( 1) 〜 （4) における各第 3試薬を用いた場合の、 タンパク質含 料を 測定したときの觀度、 及びタンパク質不含試料を測定したときの醜度を、 図 6に示し た。
4. 測定結果
この図 6より、 以下のことが分かる。
試料、 フルォレセイン骨格を^ Τる陰イオン性化合物 （エリス口シン Β) 及び界面活性 剤 （ゼフイラミン） を含む混合液中で、 界面活性剤 （ゼフイラミン） の が増すと、 夕 ンパク質含有試料を測定したときの混合液の 及びタンパク質不含試料を測定した ときの混合液 〔試薬ブランク （試薬盲検） 〕 の吸) ¾ はともに増カロする。
しかしながら、 測定により得られる の値 （嫌斗測定時の ¾¾¾から試薬ブラン クの を差し弓 1いたもの）、すなわち測定の感度は、 この界面活性剤（ゼフイラミン） の臨界ミセル濃度 （CMC) である 0. 3 7 mM以上においては、 濃度が 0. 3 7mM未 満のときに比べて、 より小さくなつている。
このことより、試料、フルォレセィン骨格を^ る陰ィオン性化合物及び界面活性剤 (ゼ フィラミン） を含む混合液中での界面活性剤 （ゼフイラミン） の は、 この界面活性剤
(ゼフイラミン） の臨界ミセル itS (CMC) 未満の であることがより好ましいこと が分かる。
〔実施例 4〕 （本発明の測定方法及 則定試薬における効果と P Hとの関係の確認） 本発明の試料中のタンパク質の測 法及 則 薬における効果と、 PHとの関係を 廳忍した。
上， 薬
( 1 ) 第 1試薬
第 1試薬として、エリス口シン B (和光純薬工業社） を に溶解し、 1 0 エリ スロシン B 7溶液を調製した。 (2)第 2試薬
第 2試薬として、 下記の試薬を各々調製した。
(a) クェン酸不含試薬
クェン酸を含まないクェン酸不^ ¾薬として、 純水を用意した。
(b) 125mMクェン 観薬
125mMクェン齢有試薬として、 クェン酸（和 屯薬工業 ¾) を 7j<に溶解し、 1 25mMクェン酸水溶液を調製した。
(c) 50 OmMクェン 観薬
50 OmMクエン^^ 薬として、 クェン酸（和光純薬工業ネ: h)を糸屯水に?容解し、 5 0 OmMクェン酸水 夜を調製した。
(d) 2, 50 OmMクェン齢有試薬 -
2, 50 OmMクェン酸含有 li薬として、クェン酸 (和^屯薬ェ W:)を純水に容解し、 2, 50 OmMクェン酸水溶液を調製した。
(3) 第 3試薬
第 3試薬として、 卜ライ卜ン X— 100 (ナカライテスク社） ( - : 625] を純 7 に容解し、 6. 4mM トライトン X— 100水溶液を調製した。
2. 試料
(I) タンパク質含 M料
タンパク質を含むタンパク質含観料として、 ヒト血清アルブミン 〔HSA〕 （シグマ ¾) を純水に溶解し、 1. 5 mg/Lのヒト血清アルブミン水溶液を調製した。
(Π) タンパク質不^ 料
タンパク質を含まないタンパク質不含試料として、 純水を用意した。
3. 測定
(1) tif己 2の （I) のタンパク質含； ¾料の 3， 660/iLに、 鎌己 1の （1) の第 1試薬を 80 xL、 前記 1の （2) の第 2試薬の （a) クェン酸不含試薬を 160 L、 及び鎌己 1の （3) の第 3試薬を 100 / L添加し、 混合し、 混合液とした。
(2) 次に、 嫌己 （1) の混合液を、 計により、 波長 547 nmにおける醜 度を測定した。
(3) 前記 2の （I) のタンパク質含有試料に替えて前記 2の （Π) のタンパク質不含 試料を試料とする他は、 鎌己 （1)及び （2) の記載の通りに操作を行い、 度を測定 した。
(4) 次に、 鎌己 1の （2) の第 2試薬の （a) のクェン酸不^:薬に替えて、 前記 1 の （2) の第 2試薬の （b) 125mMクエン^^有試薬〜 （d) 2, 50 OmMクェ ン酸含 l^薬の計 3種類の第 2試薬をそれぞれ用いる他は、 編己 (1)、 (2)及び (3) の記載の通りに操作を行い、 吸光度を測定した。
(5) なお、 鎌己 1の （2) の各第 2試薬を用いたときの、 試料、 第 1試薬、 第 2試薬 及び第 3試薬を混合した混合液の p Hは、 以下の通りであった。
(a) クェン酸不含試薬： pH5. 3
(b) 125mMクェン酸含観薬： pH3. 5
(c) 50 OmMクェン酸含観薬： pH2. 3
(d) 2, 50 OmMクエン^ 薬： pH2. 0
(6) 前記 (1) 〜 （4) における各第 2試薬を用いた場合の、 タンパク質含機料を 測定したときの Pmm、 及びタンパク質不含試料を測定したときの を、 図 7に示し た。
4. 測 結果
この図 7より、 以下のことが分かる。
試料、 第 1試薬、 第 2試薬及び第 3試薬を混合した混合液中、 すなわち試料、 フルォレ セイン骨格を有する陰イオン性化合物 （エリス口シン B) 及 面活性剤 （トライトン X 一 100) を含む混合液中で、 pHが 5. 3の場合は、 測定により得られる の値 (試料測定時の から試薬ブランクの を差し引いたもの)は小さいものであり、 測定の感度は高くはない。
しかしながら、 嫌己混合液中の pHが、 pH 5. 0、 pH4. 0、 pH 3. 5と下がる につれ、 タンパク質含繊料を測定したときの混合液の觀度は増加し、 かつタンパク質 不含 を測定したときの混合液〔試薬ブランク（試薬盲検）〕の吸光度は低減している。 この試料の測定により得られる ¾ ^が くなり、 かつ試薬ブランク （試薬盲検） の値 m が低 "ることにより、 測定により得られる 1 e¾¾の値 （試料測定時の喊 度から試薬ブランクの を差し引いたもの） はより大きなものとなり、 すなわち、 よ り大きな の値が得られることになり、 高レ測定の感度が得られるようになる。 よって、 本発明においては、 試料、 及びフルォレセイン骨格を #τる陰イオン I'生化合物 を接 させた後、 少なくともこの試料及びフ Jレ才レセィン骨格を る陰ィ才ン 1'生ィ匕合物 を含む混合液の pHを、 pH 5. 0以下とすることが好ましく、 pH4. 0以下とするこ とがより好ましく、 pH 3. 5以下とすることが特に好ましいことが分かる。
施例 5〕 （本発明の測定方法及 則^薬における 镍の作成）
本発明の試料中のタンパク質の測 法及 啶試薬における観線を作成した。 1. 試薬
( 1) 第 1試薬
第 1試薬として、 エリス口シン B ym imf) を純水に容解し、 Ι Ο 2 Μエリ スロシン B7JC溶:液を調製した。
(2) 第 2試薬
第 2試薬として、 クェン酸（和光純薬工業 ¾) を Jに溶解し、 5 0 OmMクェン酉脉 激夜を調製した。
(3) 第 3試薬
第 3試薬として、 トライトン X—1 0 0 (ナカライテスク社） C H¾ : 6 2 5] を純 水に溶解し、 6. 4mM トライトン X— 1 0 Oz溶液を調製した。
2. 試料 (A) 0. 25mg/L タンパク質含 料'
0. 25mg/L タンパク質含織料として、 ヒト血清アルブミン〔HSA〕 （シグマ ¾) を純水に溶解し、 0. 25 mg/Lのヒト血清アルブミン水溶液を調製した。
(B) 0. 50mg/L タンパク質含 料
0. 50mg/L タンパク質含織料として、 ヒト血清アルブミン〔HSA〕 （シグマ ¾) を zfに溶 if-し、 0. 5 Omg/Lのヒト血清アルブミン水溶液を調製した。
(C) 0. 75mg/L タンパク質含 ¾料
0. 75mg/L タンパク質含線料として、 ヒト血清アルブミン〔HSA〕 （シグマ ネ ±) を純水に溶解し、 0. 75mgZLのヒト血清アルブミン水溶液を調製した。
(D) 1. 0 Omg/L タンパク質含線料
1. .0 Omg/L タンパク質含織料として、 ヒト血清アルブミン〔HSA〕 （シグマ ネ: fc) を純水に溶解し、 1. 0 OmgZLのヒト血清アルブミン水溶液を調製した。
(E) 1. 5 Omg/L タンパク質含^ it料
1. 5 Omg/L タンパク質含 斗として、 ヒト血清アルブミン〔HSA〕 （シグマ ¾) を τΚに溶解し、 1. 5 Omg/Lのヒト血清アルブミン水溶液を調製した。
(F) 2. 0 Omg/L タンパク質含 # 料
2. 0 Omg/L タンパク質含観料として、 ヒト血清アルブミン〔HSA〕 （シグマ ネ ±) を純水に溶解し、 2. 0 OmgZLのヒト血清アルブミン水溶液を調製した。
(G) タンパク質不含試料
タンパク質を含まないタンパク質不含試料として、 純水を用意した。
3. 測定
(1) 鎌己 2の （A) の 0. 25mgZL タンパク質含 ¾t料の 3， 660 Lに、 前 記 1の （1) の第 1試薬を 80 L、 嫌己 1の （2) の第 2試薬を 160 L、 及び嫌己 1の （3) の第 3試薬を 100 L勸口し、 混合し、 混合液とした。
(2) 次に、 嫌己 （1) の混合液を、 計により、 波長 547nmにおける 度を測定した。
(3) 前記 2の （A) の 0. S SmgZL タンパク質含観料に替えて前記 2の （B) 0. S OmgZL タンパク質含繊料〜 （F) 2. 0 OmgZL タンパク質含 式料及 び （G) タンパク質不^:料をそれぞれ試料とする他は、 嫌己 （1 ) 及び （2) の記載の 通りに操作を行い、 を測定した。
(4) 前記 ( 1 ) 〜 （3) において、 各試料を測定したときの醜度と、 その試料中の タンパク質であるヒト血清アルブミンの濃度との関係を示した図である S線を図 8に示 した。
4. 測定結果
この検量镍を示した図 8より、試料中のヒト血清アルブミンの濃度が Omg/ から 1. 5mg/Lという極めて腿な範囲においても、 良好な H泉性が得られていることが分か る。
このことより、 その鮮範囲が 6. 5 ± 5. l mgZL未満 （随時尿） という極めて微 量な尿中のアルブミン （尿中繼アルブミン） についても、 本発明の試料中のタンパク質 の測^法及 則 薬であれは、 精確に測 すること力河能であることが分かる。 難例 6〕 （本発明の測定方法及 ¾M薬並びに他法の検出限界及び ¾M限界） 本発明の試料中の夕ンパク質の測 法及 則定試薬、 並びに他法の検出限界及び ¾S 限界を確かめた。
〔I〕 . 本発明の試料中のタンパク質の測定方法及 ϋ¾Ι 薬
1. 試薬
( 1 ) 第 1試薬
第 1試薬として、 エリス口シン Β (和う 屯薬工業ネ ±) 、 及びトライトン X— 1 0 0 (ナ 力ライテスク社） [^= : 6 2 5] をそれぞ 屯水に?容解し、 1 0 2 Mエリス口シン B及び 0. 3 7 3mM トライトン X— 1 0 0を含む水溶液を調製した。
(2) 第 2試薬 第 2試薬として、 クェン酸（和避薬工業ネ: t) を純水に溶解し、 5 0 0mMクェン 溶液を調製した。
2. 試料
(A) ヒト血清アルブミン 〔HS A〕 （シグマネ ±) を純水に溶解し、 これを純水で段階 的に希釈して、 ヒト血清アルブミン水溶液の希釈系列を用意した。
(B) タンパク質不^ ί料として、 純水を用意した。
(C) 標準液として、 濃度既知のヒト血清アルブミン水溶液を用意した。
3. 測定
( 1 ) 前記 2の （A) の各 m のヒト血清アルブミン水激纖料の 5 0 Lに、 編己 1 の （1 ) の第 1試薬を 1 5 0 ^ L、 及び Ml己 1の （2) の第 2試薬を 1 5 0 U恭カロし、 混合し、 混合液とした。 -
(2) 次に、 B ( 1 ) の混合液の波長 5 4 7 nmにおける ¾ ^を測定した。
(3) 次に、 嫌己 (B) のタンパク質不含試料について、 前記 （1 ) 及び（2) の記載 の通りに ί喿作を行い、 吸光度を測定した （試薬ブランク） 。
(4) 次に、 嫌己 (C) の標準液について、 嫌己 （1 ) 及び (2) の記載の通りに操作 を行い、 を測定した。
( 5) 前記 2の （A) の各濃度のヒト血清ァ Jレブミン水溶液試料のそれぞれについて、 測定により得られた ¾¾¾から、 嫌己 ( 3) で得られたタンパク質不含試料における醜 度 （試薬ブランク） を差し引いた。
次に、 この ¾ ^を、 編己 （4) で求めた標準液の M¾で除し、 次にこの標準液のヒ ト血清アルブミン m を乗ずることにより、 各ヒト血清ァフレブミン水激観料の觀を求 めた。
(6) 前記 ( 1 ) 〜 （5) の操作を計 1 2回繰り返して行い、 各ヒト血清アルブミン水 鹿^料について、 計 1 2の測定値 (翻 を求めた。
〔Π〕 . 免疫比濁法 1. 試薬
免疫比濁法による尿試料中のアルブミン （腿アルブミン） の測定試薬である 「マイク 口アルブミン— HAテスト」 （和 ^屯薬工業） を用いた。
2. 試料
前記 〔I〕 の 2の試料を使用した。
3. 測定
日立 7 1 7 0 S形自動、ネ斤装置を使用し、 当言獄薬の 寸文書等で指定された方法に従 つて、 嫌己 2の試料の測定を行い、 各ヒト血清アルブミン水溶液試料の獻を求めた。 なお、 前記の各試料の測定は 1 2重測定を行った。
〔Π〕 . P R法
1. 試薬 -
P R法による試料中のタンパク質の測織薬である 「プロテインアツセイラピッドキッ ト」 （和光純薬工業） を用いた。
2. 試料
ΙίίΗΒ C I ] の 2の試料を使用した。
3. 測定
当言獄薬の 寸 »等で指定された方法に準じ、 マイクロプレート法により、 鎌己 2の 試料の測定を行い、 各ヒト血清アルブミン水嶽夜試料の離を求めた。
なお、 前記の各試料の測定は 1 2重測定を行った。
〔ΙΠ〕 . S S A法
1. 試薬
S S Α法による試料中の夕ンパク質の測定試薬である 「スルホサリチル (和舰薬 工業） を用いた。
2. 試料
嫌己 〔I〕 の 2の試料を使用した。 3. 測定
当言纖薬の 寸: 等で指定された方法に準じ、 マイクロプレート法により、 嫌己 2の 試料の測定を行い、 各ヒト血清アルブミン水撤纖料の を求めた。 なお、 当雷纖薬は ネ «泉の範囲が狭いため、 前記試料を 2〜1 0傲屯水で希釈して測定した。
この前記の各試料の測定は 1 2重測定を行った。
〔IV〕 . 検出限界及び定量限界
鎌己 〔I〕 の本発明の試料中のタンパク質の測定方法及 則 薬、 前記 〔Π〕 の免疫 比濁法、 嫌己 〔ΠΙ〕 の P R法、 並びに嫌 S iW) の S S A法のそれぞれにおける、 各ヒト 血清アルブミン水溶液試料の 1 2重測定の測定値より標準偏差を算出し、検出限界（3 σ) 及び定量限界 （1 0。） を求めた。
これを、 表 4に示した。 -
〔表 4〕
Figure imgf000044_0001
4. 測定結果
この表 4より、 本発明の試料中のタンパク質の測定試薬及 則定方法における検出限界 及び定量限界は、他法の P R法及び S S A法め検出限界及び 限界よりもはるかに優れ、 免疫比濁法の検出限界及び定量限界にも勝るものであることが分かる。
このことよりも、 本発明の試料中のタンパク質の測 薬及 ti¾定方法は、 その測定に 掛かるコストが低いものでありながら、 免疫比濁法に勝る測定の感度を有し、 尿試料中の アルブミンのような試料中に微量にしか存在しない夕ンパク質を、 精確に測定することが できるものであることが雀かめられた。 .

Claims

請 求 の 範 囲
1. 試料、 フルォレセイン骨格を： る陰イオン性化合物及び界面活性剤を搠虫させ、 こ の試料、 フルォレセィン骨格を ¾ る陰イオン I'生化合物及び界面活性剤を含む混合液 の 度を測^ ることからなる、 試料中のタンパク質の測 ¾ ^法。
2. 試料及びフルォレセイン骨格を衬る陰イオン性化合物を纖させた後、 少なくとも この試料及びフルォレセィン骨格を^"る陰ィオン性化合物を含む混合液の P Hを p H 5. 0以下とすることを特徴とする請求の範囲第 1項記載の試料中のタンパク質の 測 法。
3. 混合液の p Hを pH 5. 0以下とすることを、 当該混合液に酸性溶液を添加すること により行うことを髓とする請求の範囲第 2項記載の試料中のタンパク質の測定方法。
4. 界面活性剤が、 非イオン性界面活性剤及び Z又は陽イオン性界面活性剤であることを 樹敷とする請求の範囲第 1項〜第 3項のレ vfれか 1項に記載の試料中の夕ンパク質の 測 法。
5. 界面活性剤が、 混合液中で当該界面活性剤の臨界ミセル ^¾*満の であることを 樹敷とする請求の範囲第 1項〜第 4項のレ れか 1項に記載の試料中の夕ンパク質の 測 去。
6. フルォレセイン骨格を有する陰イオン性化合物が、 エリス口シン Bであることを籠 とする請求の範囲第 1項〜第 5項のいずれか 1項に記載の試料中の夕ンパク質の測定 方法。
7. タンパク質が、 アルブミンであることを赚とする請求の範囲第 1項〜第 6項のいず れか 1項に記載の試料中の夕ンパク質の測定方法。
8. フルォレセイン骨格を有する陰イオン附匕合物及び界面活性剤を含有する、 試料中の タンパク質の測定試薬。
9. 少なくともフルォレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を含有する溶 ¾6らなる第 1試薬と、 酸性溶液からなる第 2試薬との組み合わせよりなり、 界面活性剤が当該第 1試薬及び Z又は当該第 2試薬に添加されていることを特徴とする請求の範囲第 8項 記載の試料中の夕ンパク質の測 ¾ 薬。
1 0. 酸性溶液からなる第 2試薬が、 試料及び第 1試薬を混合した混合液に当該第 2試薬 を添加することにより、 当該混合液の pHを pH 5. 0以下とすることができるもの であることを樹敷とする請求の範囲第 9項記載の試料中のタンパク質の測定試薬。
1 1. 界面活' I'生斉が、、 非イオン性界面活性剤及び/又は陽イオン性界面活性剤であること を纖とする請求の範囲第 8項〜第 1 0項のいずれか 1項に記載の試料中の夕ンパク 質の測趨薬。
1 2. 界面活性剤が、 混合液中において当該界面活性剤の臨界ミセル 満の鍵とな るような itに設定されていることを特徴とする請求の範囲第 8項〜第 1 1項のレ >ず れか 1項に記載の試料中の夕ンパク質の測定試薬。
1 3. フルォレセイン骨格を る陰イオン性化合物が、 エリス口シン Bであることを特 徴とする請求の範囲第 8項〜第 1 2項のいずれか 1項に記載の試料中の夕ンパク質の mm0
1 4. タンパク質が、 アルブミンであることを とする請求の範囲第 8項〜第 1 3項の いずれか 1項に記載の試料中の夕ンパク質の測趙薬。
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