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WO2008044692A1 - Protéine adaptée pour une commande d'orientation/immobilisation de protéine et support d'immobilisation destiné à la protéine - Google Patents

Protéine adaptée pour une commande d'orientation/immobilisation de protéine et support d'immobilisation destiné à la protéine Download PDF

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Publication number
WO2008044692A1
WO2008044692A1 PCT/JP2007/069722 JP2007069722W WO2008044692A1 WO 2008044692 A1 WO2008044692 A1 WO 2008044692A1 JP 2007069722 W JP2007069722 W JP 2007069722W WO 2008044692 A1 WO2008044692 A1 WO 2008044692A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
asp
ala
sequence
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2007/069722
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Masahiro Iwakura
Kiyonori Hirota
Hiroyuki Sota
Gou Sarara
Yukiko Aruga
Chiori Yamane
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Original Assignee
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST filed Critical National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority to US12/443,623 priority Critical patent/US20090299035A1/en
Publication of WO2008044692A1 publication Critical patent/WO2008044692A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/06—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag

Definitions

  • Proteins suitable for protein orientation control immobilization and immobilization carriers for the proteins are Proteins suitable for protein orientation control immobilization and immobilization carriers for the proteins
  • the present invention relates to an immobilized protein.
  • the present invention further relates to an immobilization carrier in which the protein is orientation-controlled and an immobilization method thereof.
  • a soluble protein as an immobilized protein by binding it to an insoluble immobilization carrier such as an agarose gel.
  • an immobilized enzyme in which an enzyme protein is bound to an immobilization carrier has been developed, and an enzyme reactor has been produced using the enzyme.
  • the quality of such immobilized proteins the properties and functions of the protein are uniform, the same properties as those of the non-immobilized soluble protein, and the functions are retained. If there is a large amount of protein, it will be as good as possible! /, As good as possible! /, Depending on the protein immobilization method! /.
  • a protein arrangement IJ that has only one functional group is designed by “amino acid substitution” of the protein. For example, modification to a sequence having only one cysteine residue in the protein, and site-specific immobilization via ss bond etc. is performed! /, ( Patent Literature 1 and Non-Patent Literature; see! -3).
  • the protein has only one carboxyl terminus.
  • the present inventors have already immobilized a carboxyl group at the carboxy terminus of a protein via a peptide (amide) bond with a carrier having a primary amine using an amide bond formation reaction via a cyanocystine residue. (See Patent Documents 2 to 5).
  • the immobilized protein binds via the main chain at one position of the carboxy terminus, so that the obtained immobilized protein is immobilized in a controlled orientation and is completely uniform. It becomes.
  • Non-Patent Document 4 By maintaining the uniformity of orientation control, it is possible to increase the reversibility of the denaturation of the immobilized protein, and to add excellent characteristics in terms of use such as enabling heat sterilization of the immobilized protein. (See Non-Patent Document 4).
  • the immobilization technique using the binding reaction via cyanocystine developed by the present inventors has excellent characteristics, but depending on the protein used, a protein for immobilization is produced. It is necessary to take individual measures depending on the characteristics of the protein, and the insoluble immobilization carrier used for immobilization contains a large amount of primary amine as a functional group. Development of technology to remove ionic interactions and the like caused by the reactivity of unreacted primary amine remaining on the immobilization carrier after the immobilization reaction remains as a problem to be solved. It was.
  • Patent Document 1 Japanese Patent No. 2517861
  • Patent Document 2 Japanese Patent No. 3788828
  • Patent Document 3 Japanese Patent No. 2990271
  • Patent Document 4 Japanese Patent No. 3047020
  • Patent Document 5 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-344396
  • Non-Patent Document 1 M Iwakura et al. (1993) J. Biochem. 114, 339-343
  • Non-Patent Document 2 S. J. Vigmond et al. (1994) Langumur, 10, 2860-2862
  • Non-Patent Document 3 M. Iwakura et al. (1995) J. Biochem. 117, 480-488
  • Non-Patent Document 4 M. Iwakura et al. (2001) Protein engineer., 14, 583-589
  • the present invention clarifies the conditions for optimizing the amino acid sequence of a protein including the amino acid sequence of a specific protein to be immobilized for use in orientation control immobilization via cyanostine,
  • the purpose is to prescribe.
  • the present inventors have intensively studied to solve the above-mentioned problems to be solved in protein immobilization.
  • the present inventors have intensively studied to make the amino acid sequence of the protein for immobilization including the amino acid sequence of the protein to be immobilized, which is to be immobilized, suitable for orientation control immobilization via cyanosistin.
  • the sequence is designed as a sequence of five parts including the part consisting of the amino acid sequence of the protein to be immobilized, that is, the sequence represented by R1-R2-R3-R4-R5, and features in each part
  • the present inventors have revealed that a gene corresponding to an immobilization protein can be prepared, and the separation and purification operation after expression in a host cell can be made common, and the immobilization reaction conditions can be made common. I made it.
  • R1 a sequence consisting of two parts represented by PQ in the sequence represented by R1-R2-R3-R4-R5, and the sequence of P part is (Ser or Ala)- (Gly) is a sequence consisting of n (n is an arbitrary integer from 1 to 10), and the sequence of the Q portion is a protein sequence having repeating units, and does not include lysine residues and cysteine residues! /
  • n is an arbitrary integer from 1 to 10
  • the sequence of the Q portion is a protein sequence having repeating units, and does not include lysine residues and cysteine residues! /
  • sequence indicates the sequence from the amino terminal side to the carboxy terminal side
  • sequence of the R1 portion is the sequence of the protein to be immobilized, and does not include lysine residues and cysteine residues.
  • the R2 portion sequence is a spacer sequence composed of amino acid residues other than lysine and cysteine residues;
  • R3 is cysteine-X (X is an amino acid residue other than lysine and cysteine). A sequence composed of two amino acids represented;
  • R4 portion sequence does not have to exist, it is a sequence that does not contain lysine residues and cysteine residues, and is a protein consisting of an amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5 A sequence characterized in that it contains acidic amino acid residues that can make the overall isoelectric point acidic; and
  • the sequence of the R5 portion is an affinity tag sequence for purifying the protein].
  • the coordination IJ of the R1 portion is the amino acid sequence of the naturally occurring protein, or all lysine residues in the amino acid sequence.
  • cysteine residues are substituted with amino acid residues other than lysine residues and cysteine residues, and do not include lysine residues and cysteine residues! /
  • a protein consisting of an amino acid sequence modified to an amino acid sequence And consisting of an amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5 of [1], wherein the amino acid sequence is a protein having a function equivalent to that of the naturally-occurring protein. protein.
  • the amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5 is characterized in that the coordination IJ of the R2 portion is a sequence consisting of:!
  • To 10 glycines A protein comprising an amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R 4-R5 of [1].
  • amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5 the number of amino acid residues in which the coordination IJ of the R4 portion is an amino acid residue of aspartic acid and / or glutamic acid 1 ⁇ :
  • the amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5 is characterized in that the arrangement IJ of the R5 portion is an amino acid sequence consisting of 4 or more histidine residues.
  • a protein comprising an amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5 of [1].
  • Tannoprotein of [1] composed of the following IJ (SEQ ID NO: 2)
  • Tannoprotein of [1] consisting of the following IJ (SEQ ID NO: 3)
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5 of any one of [1] to [9] is adsorbed by electrostatic interaction! Immobilization carrier.
  • a sulfhydryl group of the only cysteine residue present in the protein of any one of [1] to [9] is converted to a thiocyano group to form an immobilization carrier having a primary amine as a functional group.
  • a method for producing an immobilized protein characterized in that an amino acid sequence portion present on the amino terminal side of a cysteine residue in the protein is bound to the immobilization carrier by an amide bond by acting.
  • Any immobilization having a primary amine as a functional group by converting the sulfhydryl group of the only cysteine residue present in the protein of any one of [1] to [9] to a thiocyano group A protein-immobilized carrier characterized in that an amino acid sequence portion present on the amino terminal side of a cysteine residue in the protein is bound by an amide bond by acting on the carrier.
  • the protein consisting of the following IJ (SEQ ID NO: 5) is characterized in that the carboxy terminus of the protein is bound by an amide bond to an immobilization carrier having a primary amine as a functional group.
  • the present invention is characterized in that it is bound by an amide bond to an immobilization carrier having a carboxy terminal force primary amine of the protein represented by the following IJ (SEQ ID NO: 6) as a functional group.
  • an immobilization carrier on which the protein of [12] is immobilized is bound by an amide bond to an immobilization carrier having a carboxy terminal force primary amine of the protein represented by the following IJ (SEQ ID NO: 6) as a functional group.
  • a method of design comprising selecting the amino acid sequences of the Rl, R2, R3, R4 and R5 moieties to meet the following conditions:
  • R4 portion sequence does not exist, or if present, does not contain lysine residues and cysteine residues, and the amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5 It contains acidic amino acid residues that can make the isoelectric point of the whole protein acidic. Select the sequence to be selected; and
  • An affinity tag sequence for purifying the protein is selected as the sequence of the R5 portion.
  • the sequence of R1 is represented by PQ, and the sequence of P is composed of (Ser or Ala)-(Gly) n if it is present or not present Is a sequence (n is an arbitrary integer from 1 to 10), the sequence of the Q part is a sequence of a protein having a repeating unit, and a sequence in which a sequence unit not including a lysine residue and a cysteine residue is repeated
  • a protein consisting of an amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5 of [1], which is characterized by being R1-R2 Protein used to immobilize the part on the immobilization carrier.
  • the sequence of the repeating unit of the Q portion is the amino acid sequence IJ of a naturally derived protein, or all lysine residues and cysteine residues in the amino acid sequence.
  • amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5 is characterized in that the sequence of the R2 portion is a sequence consisting of; [17] A protein comprising an amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5.
  • amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5 the sequence of the R4 portion has 2 amino acid residues consisting of two types of amino acid residues, aspartic acid and glutamic acid.
  • amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5 the sequence of the R5 portion is an amino acid sequence consisting of 4 or more histidine residues
  • the repeat unit sequence of the Q moiety is an antibody.
  • the protein according to any one of [17] to [21], which has a function of specifically interacting with a molecule.
  • n is any integer from 2 to 5)
  • R2 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly
  • R3 Cys-Ala
  • R4 Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp
  • n is any number from 2 to 5
  • Gly-Gly-Gly-Gly-Gly R3 Cys-Ala
  • R4 Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp
  • n is any integer from 2 to 5
  • R2 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly
  • R3 Cys-Ala
  • an amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5 is designed, and a protein comprising the amino acid sequence is prepared and used for immobilization, whereby orientation-controlled immobilization is performed. Protein can be produced efficiently and rapidly.
  • Rl, R2, R3, R4 and R5 so as to satisfy the conditions of each part, it is possible to immobilize all proteins by controlling their orientation.
  • R5 used to purify the designed protein
  • the protein for immobilization can be purified by a common method regardless of the sequence of R1 that is the protein to be immobilized.
  • the reaction conditions for immobilization can be made common.
  • R1 is a sequence composed of two parts represented by PQ, and the P part may or may not exist. If present, the sequence is composed of (Ser or Ala) _ (Gly) n (where n is an arbitrary integer from 1 to 10), and the sequence of the Q portion is the sequence of a protein having a repeating unit. is there.
  • the protein for immobilization consisting of an amino acid sequence including the amino acid sequence of the protein to be immobilized, which is suitable for orientation control immobilization of the protein of the present invention, is a general formula R1-R2-R3.
  • the sequence represents a tractive amino acid sequence from the amino terminal side to the carboxy terminal side
  • the sequence of the R1 portion is an amino acid sequence of an arbitrary protein to be immobilized, and in this sequence Is a sequence characterized by not containing any lysine residues and cysteine residues.
  • the sequence of the R2 portion is an arbitrary spacer sequence composed of amino acid residues other than lysine and cysteine residues.
  • the R2 moiety may not be present.
  • the sequence of the R 3 portion is a sequence composed of two amino acids represented by cysteine-X (X is an amino acid residue other than lysine and cysteine).
  • the sequence of the R4 portion is an arbitrary sequence that does not contain any lysine residues and cysteine residues, and includes acidic amino acid residues that can make the isoelectric point of the entire sequence of R1-R2-R3-R4-R5 acidic. It is an arrangement characterized by this.
  • the R4 part may not be present.
  • the sequence of the R5 portion is an arbitrary affinity tag sequence that can bind to a specific compound, and is, for example, a sequence characterized by containing 4 or more histidine residues.
  • the sequence of the R1 portion is the amino acid sequence of the protein to be immobilized to be immobilized.
  • the sequence is characterized in that it does not contain any lysine residues and cysteine residues.
  • the number of amino acids in the R1 portion is not limited, and an amino acid sequence consisting of any number of amino acids can be selected according to the purpose.
  • the sequence of the R1 portion may be a partial amino acid sequence of the amino acid sequence of the protein to be immobilized, and the protein fragment having the amino acid sequence power may be a partial amino acid sequence having the same function and activity as the protein.
  • R1 is, for example, an amino acid sequence of a functional domain having a function of the protein to be immobilized.
  • the R1 portion has the intended function.
  • a cysteine residue is required only in the R3 portion for the immobilization reaction, and a primary amine is used as a functional group for the carrier, a lysine residue having a cysteine residue and a primary amine group in the side chain. The group is inappropriate as the amino acid residue that constitutes the R1 moiety.
  • R1-R2-R3-R4-R5 R1 can be a sequence composed of two parts represented by PQ.
  • the sequence of the P portion is a sequence represented by (Ser or Ala)-(Gly) n (n is an arbitrary integer from 1 to 10), and the sequence of the Q portion has repeating units.
  • This is a protein sequence, which is a sequence in which a repeating sequence unit containing lysine residues and cysteine residues is repeated. The number of repetitions is not limited, but is preferably 2-5.
  • Naturally-derived proteins are usually composed of 20 amino acid residues including lysine residues and cysteine residues. R1 partial force responsible for the desired function When lysine residues or cysteine residues are included, 18 amino acids other than lysine and cysteine are substituted for lysine and cysteine residues while retaining the functions of the original natural protein. It is necessary to replace it with one of these.
  • the present inventors have already established a method for producing a protein containing no cysteine and methionine (Patent Republication 01/000797, M.Iwakura et al. J. Biol. Chem. 281, 13234-13246 (2006), JP 2005-058059 A).
  • the amino acid sequence is converted based on the amino acid sequence of the naturally-derived protein, and the tandem sequence consisting of 18 amino acids that do not contain cysteine and lysine residues. It is possible to produce a protein that has the same quality and functions as a natural protein.
  • the outline of this method is as follows.
  • top three mutations in the function of 1 amino acid substitution mutant in each residue part are listed from the top, except for mutations substituted with cysteine or lysine. Select the top 3 combination mutants from among them, and perform the top 3 mutations in the 1 amino acid substitution mutation at other sites, except for the mutations substituted with cysteine or lysine.
  • the codons encoding lysine and cystine residues are defined as “other amino acids other than lysine and cysteine” (maximum 18 types).
  • a mutant gene substituted with a codon encoding) is prepared, and the enzyme activity of the double mutant enzyme protein obtained by expressing it is examined.
  • a protein having at least the same function as that of the original natural protein can be obtained.
  • “Function equivalent to the function of the original natural protein” means that the activity of the protein whose sequence has been modified is not qualitatively changed from that of the original natural protein, and is not significantly reduced in quantity.
  • the original natural protein is an enzyme that catalyzes a specific reaction
  • the sequence-modified protein also has an enzyme activity that catalyzes the same reaction, or the original natural protein acts as a specific antigen.
  • An antibody that binds to it means that a protein whose sequence has been modified also has activity as an antibody that can bind to the same antigen.
  • the activity of the protein whose amino acid sequence has been modified is 10% or more, preferably 50% or more, more preferably 75% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 100% or more of the activity of the original natural protein.
  • the activity is expressed by specific activity in the case of an enzyme, for example, and in the case of a protein having the ability to bind to another substance such as an antibody, the activity. expressed. These activity measurement methods can be appropriately selected depending on the protein.
  • a protein having a target function can be produced by de novo design, which is a technique of artificially designing and synthesizing a protein from an amino acid sequence. It is shown that functional proteins can be created by limiting the de novo design method to use only 18 amino acids that do not contain cysteine and lysine residues. Furthermore, it also suggests the possibility of newly designing and producing a functional protein having a specific function that can be used as the R1 portion of the present invention only by modifying the amino acid sequence of a naturally derived protein.
  • Examples of the protein of the R1 portion include proteins having enzyme activity and proteins having binding ability to antibody molecules.
  • Proteins having binding ability to antibody molecules include Staphylococcus aureus-derived protein A (described in A. rorsgren and J. Sjoquist, j. Immun ol. (1966) 97, 822-827), Streptococussp. Group C / G-derived protein G (described in European Patent Application No. 1173239774906_0 (1983)), Peptostreptococcus magnus-derived protein L (described in US Pat. No. 5,965,390 (1992)), group A Streptococcus-derived protein H (described in US Pat. No.
  • Example 1 The sequence shown in Example 1 below is the following sequence derived from the A domain of Staphylococcus protein A (SEQ ID NO: 7),
  • Example 2 The sequence shown in Example 2 below is the following sequence derived from the G1 domain of Streptococcus protein G (SEQ ID NO: 8),
  • Example 3 The sequence shown in Example 3 below is the following sequence derived from the B1 domain of protein L derived from P-signed tostreptococcus (SEQ ID NO: 9),
  • the random mutation method is usually used in many cases, and the phage display method is often used as a function selection.
  • the possibility of obtaining a modified protein having the function of a natural protein, which is a protein comprising an amino acid sequence that does not contain cysteine and lysine residues is extremely low.
  • the sequence corresponding to the R1 portion of the present invention cannot be obtained.
  • the sequence corresponding to the R1 portion of the present invention is made possible by the above method developed by the present inventors.
  • sequence of the R1 part is a two-part sequence represented by PQ
  • the sequence of the P part is a sequence represented by (Ser or Ala) _ (Gly) n (n is from 1 to Any integer up to 10), for example, Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 23).
  • sequence of the Q portion is a protein sequence having a repeating unit, does not include a lysine residue and a cysteine residue! /, A sequence in which the sequence unit is repeated, and examples thereof include the sequences described below. .
  • Example 5 described below shows the A domain of protein A derived from Staphylococcus as shown below. It is a protein that has a modified sequence derived from it, does not contain lysine residues and cysteine residues, and has a repeated sequence as a sequence of the Q portion with the sequence as a sequence unit.
  • n is any integer from 2 to 5, force, and the sequence in octopus is SEQ ID NO: 24
  • Example 6 to be described below is a modification of the sequence derived from the G1 domain of protein G derived from Streptococcus shown below, which does not include lysine residues and cysteine residues! / As a protein having a repetitive sequence as the sequence of the Q portion.
  • n is any integer from 2 to 5, force, and the sequence in the box is SEQ ID NO: 25)
  • Example 7 the sequence derived from the B-domain of protein L derived from P-strand tostreptococcus shown below was modified so as not to contain lysine residues and cysteine residues.
  • the R2 portion is an arbitrary spacer sequence composed of amino acid residues other than lysine and cysteine residues, and the sequence is immobilized together with the R1 portion on an immobilization carrier.
  • the R2 moiety is characterized by not containing any lysine and cysteine residues.
  • a protein to be immobilized having a specific function is immobilized.
  • the function of the immobilized protein may be inhibited due to steric hindrance with the immobilization carrier.
  • the R2 portion plays a role as an appropriate linker that prevents the function of the R1 portion from being hindered by binding to the immobilization carrier during immobilization.
  • the role as a linker is to maintain an appropriate distance between the protein having a specific function of the R1 portion and the immobilization carrier. Therefore, the R2 portion is required to be an arbitrary amino acid sequence having a certain length and inert. In the present invention, only a cysteine residue is required in the R3 portion for the immobilization reaction.
  • primary amine is used as a functional group for binding the immobilized carrier and the immobilized protein.
  • a lysine residue having a primary amine group in the side chain is inappropriate as an amino acid residue constituting a linker. Therefore, the amino acid residues constituting the R2 moiety must be composed of 18 amino acid residues other than cysteine and lysine residues.
  • the R2 part may not be present.
  • the above general formula is R1-R3 It can also be represented by -R4-R5.
  • the number of amino acids in the R2 moiety is not limited, but is 0, i.e. not present;! -10 amino acids, preferably 2-5 amino acids.
  • the protein consisting of the amino acid sequence represented by the above general formula R1-R2-R3-R4-R5 is characterized by having a unique cysteine residue only in the R3 sequence portion. Therefore, the SH group, which is a functional group on the side chain of this only cysteine residue, is cyanated to be changed to a cyanocystine residue, and the reaction between the cyanocystine residue and the primary amine on the immobilization carrier is changed. Accordingly, only the portion represented by R1-R2 of the amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5 can be immobilized on the immobilization support by controlling the orientation. By including the coordination IJ of the R4 part in the immobilization reaction via Cyanocystine, that is, the coordination
  • Examples of the sequence of the R3 moiety include an amino acid sequence consisting of two amino acids represented by cysteine-X (X is an amino acid other than lysine and cysteine).
  • X is not limited.
  • the R3 portion cysteine is Sheano cystine.
  • X is preferably alanine since an amide bond forming reaction via a cyanosistin residue is likely to occur when the amino acid next to cyanosistin is changed to alanine.
  • the R4 moiety is preferably a sequence containing an acidic amino acid residue that can make the isoelectric point of the entire protein consisting of the amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5 acidic. is there. here
  • an arrangement lj containing an acidic amino acid residue that can make the isoelectric point of the entire protein acidic means a sequence that contains the number and type of acidic amino acids only to make the isoelectric point of the whole protein acidic.
  • a sequence containing a large amount of aspartic acid and glutamic acid is preferable.
  • the isoelectric point of a protein depends on the type and number of amino acids constituting it.
  • aspartic acid and glutamic acid exceeding the total number of basic amino acids are required.
  • Calculation of the isoelectric point of a protein can be easily estimated by those skilled in the art.
  • a sequence containing a large amount of aspartic acid and glutamic acid should be designed so that the isoelectric point of the protein comprising the amino acid sequence of the general formula R1-R2-R3-R4-R5 is a value between 4 and 5.
  • the number of amino acids in the sequence of the R4 moiety is not limited, but is 0, i.e. absent, or;!-20, preferably;! -10, alternatively 1-20, preferably 1-10.
  • polyaspartic acid composed of 1 to 10 aspartic acids can be mentioned.
  • the R5 portion is a sequence portion used for purifying a synthesized protein having an amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5.
  • Examples of the sequence of the R5 portion include a sequence capable of binding to a specific compound, that is, an affinity tag sequence.
  • an affinity tag sequence When a protein containing the tag is purified using an antibody specific to the tag, it may be referred to as an epitope tag.
  • the affinity tag sequence includes, for example, a polyhistidine sequence composed of 2 to 12, preferably 4 or more, more preferably 4 to 7, more preferably 5 or 6 histidines.
  • the polypeptide can be purified by using nickel chelate column chromatography with nickel as a ligand.
  • HAT tags and HN tags composed of sequences containing histidine.
  • R5 tag and force S indicating examples of ligands used for affinity chromatography, but not limited thereto, any known affinity tag (epitope tag) can be used.
  • Other affinity tags include V5 tag, Xpress tag, AU1 tag, T7 tag, VSV-G tag, DDDDK tag, S tag, CruzTag09, CruzTag22, CruzTag41, Glu-Glu tag, Ha.11 tag, KT3 tag, etc. There is. [0075] R5 part tag Ligand
  • Glutathione-S-transferase GST
  • MBP Maltose binding protein
  • HA tag (YPYDVPDYA; SEQ ID NO: 19) Anti-HA antibody
  • R3, R4 and R5 yarns as an example
  • R3 Cys-Ala
  • R4 Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp ( ⁇ ⁇ IJ number 21),
  • R5 His- His- His- His- His- His- His- His (SEQ ID NO: 22)
  • the present invention provides a general formula R1-R2 for immobilizing an arbitrary protein to be immobilized on an immobilization carrier in accordance with the conditions to be satisfied by each of the above-described Rl, R2, R3, R4, and R5 portions.
  • Rl, R2, R3, R4, and R5 portions Includes a method for designing and producing a protein comprising the amino acid sequence represented by -R3-R4-R5
  • the design or creation method includes the following steps (a) to (e).
  • cysteine X is lysine or amino other than cysteine
  • R4 portion sequence does not exist, or if present, does not contain lysine residues and cysteine residues, and the amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5 Selecting a sequence characterized by containing an acidic amino acid residue capable of bringing the isoelectric point of the whole protein to the acidic side;
  • An affinity tag sequence for purifying the protein is selected as the sequence of the R5 portion.
  • the sequence of the P portion is not present or, if it is present, a sequence composed of (Ser or Ala) _ (Gly) n (n is 1 to 10). If the sequence is a protein sequence having repeating units as the sequence of the Q portion, and does not include lysine residues and cysteine residues, the sequence unit is repeated. Yo!
  • a protein having an amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5 can be chemically synthesized based on the amino acid sequence.
  • a DNA sequence encoding a protein comprising an amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5 can be prepared by chemical synthesis or the like. In addition, some of them can be produced by amplification and recombination from naturally-occurring genes using PCR.
  • a sequence necessary for initiation of transcription and a sequence necessary for initiation of translation are linked upstream of the DNA sequence encoding the amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5 thus prepared, Further, a DNA sequence with a stop codon linked downstream is prepared, incorporated into an appropriate vector DNA, transduced into the host, and expressed in the host, so that it is represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5.
  • the target protein consisting of the amino acid sequence can be prepared.
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by the above general formula R1-R2-R3-R4-R5 prepared as described above can be expressed by using the sequence of the R5 portion as described above. And purified from the cell-free extract. At this time, by using the same sequence, for example, a polyhistidine sequence, regardless of the sequence of the R1 portion, the amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5 is used as the sequence of the R5 portion. The same purification separation method can be applied to any given protein.
  • the present invention is a protein comprising an amino acid sequence represented by the general formula R2-R3-R4-R5. Therefore, a protein comprising an amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5 by linking the amino acid arrangement IJR 1 of the protein to be immobilized to the N-terminal side of the R2 portion It also includes proteins that can be made. Furthermore, the present invention provides a compound of general formula R
  • the DNA encoding the amino acid sequence represented by R4-R5 consists of the amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5 linked to any protein to be immobilized. It can be used as an amino acid sequence or a base sequence for producing a general-purpose immobilization protein for producing a protein. In this case, since the R5 portion is common, the immobilization protein can be purified by the same method regardless of the sequence of the R1 portion.
  • the immobilization protein to the carrier using the immobilization protein consisting of the amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5 of the present invention is disclosed in Japanese Patent No. 3788828, Patent This can be carried out according to the methods described in Japanese Patent No.
  • an immobilization carrier having a primary amino group represented by the general formula “NH2-Y” (Y represents an arbitrary immobilization carrier) as a functional group under weakly alkaline conditions (pH 8 to 10),
  • the R1-R2 part is immobilized on the immobilization carrier.
  • the R1-R2 moiety bound to the immobilization support is represented by Rl-R2-CO-NH-Y (wherein Y has the above meaning), and is immobilized at one position of the carboxy terminus of the R2 moiety. It is bound to the carrier.
  • R1-CO-NH-Y When the above-mentioned protein for immobilization does not contain the R2 portion, it is represented by R1-CO-NH-Y (wherein Y has the above meaning).
  • the cyanation reaction can be performed using a cyanation reagent. Examples of cyanation reagents include 2-nitro-5-thiocyanobennzoic acid (NTCB) (see Y. Degani, A.
  • a protein having an amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5 is adsorbed on an immobilization carrier, The tin residue is cyanated and the above reaction is performed, and a protein having an amino acid sequence represented by R1-R2 is immobilized on the immobilization carrier.
  • the protein and the immobilization carrier may be reacted under neutral to weakly alkaline conditions (pH 7 to 10). In weak alkaline reaction conditions, proteins are negatively charged, while immobilized carriers are positively charged and adsorb and bind to each other by electrostatic interactions.
  • the present invention also includes an immobilization carrier on which a protein having an amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5 is adsorbed.
  • a protein having an R1-R2 moiety immobilized, produced by an immobilization reaction via cyanostine using a protein comprising an amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5 of the present invention In the immobilization carrier, there are many unreacted primary amines in the immobilization carrier portion. If lysine residues or cysteine residues are present in the immobilized protein, the remaining active amine may limit the use of the immobilized protein of the present invention.
  • the protein portion immobilized by the method of the present invention does not contain any lysine residue or cysteine residue, the protein portion is immobilized without being affected by the remaining active amine.
  • the treated carrier surface can be treated with a primary ammine masking agent.
  • a primary ammine masking agent As the mask agent, acetic anhydride, maleic anhydride and the like are suitable. Any mask agent can be used. Therefore, the present invention is not limited by the type of masking agent.
  • the present invention further provides an immobilization carrier having a primary amino group obtained by the above-described method and comprising a protein comprising an amino acid sequence not containing a cysteine residue and a lysine residue via an appropriate linker sequence.
  • an immobilized protein firmly bound by an amide (peptide) bond and a carrier on which the immobilized protein is immobilized.
  • any immobilization carrier having a primary amino group can be used.
  • the “carrier” means any particulate carrier, plate-like or sheet-like substrate, etc., as long as they are insoluble and capable of immobilizing proteins. Is also included.
  • “Immobilization carrier” includes “immobilization substrate”.
  • immobilized carrier is sometimes referred to as “insolubilized carrier”.
  • Commercially available carriers with primary amino groups include amino-cellulofine (sold by Seikagaku), AF-aminotopal (sold by TOSOH), EAH-sepharose 4B and lysine-sepharose 4B (Amersham Biosciences).
  • Porous 20NH (sold by Boehringer Mannheim). It is also possible to introduce a primary amino group into a glass bead or a glass plate using a silane compound having a primary amino group (for example, 3-aminopropylmethoxysilane).
  • a silane compound having a primary amino group for example, 3-aminopropylmethoxysilane.
  • a cell mouth fine grafted with polyallylamine is known as a carrier in which a polymer compound having a primary amino group as a repeating unit is introduced into an immobilized carrier (reference paper: Ung_Jin Kim, Shigenori uga, Journal of Chromatography A, 946, 283-289 (2 002)).
  • CNBr-activated Sepharose FF, NHS-activated Sepharose FF, and chemically reactive carriers that react with primary amino groups are known, and polymer compounds that have primary amino groups such as polyallylamine as repeating units are also included in this.
  • a carrier in which the polymer compound is covalently bonded to the carrier can be produced.
  • the mixing ratio of the polymer compound having the primary amino group in the repeating unit and the activated carrier and the appropriate adjustment are changed to change the content of the primary amino group available for the immobilization reaction in the produced carrier.
  • the polymer compound can be used as long as it has a primary amino group and the other part is substantially inactive to the protein to be immobilized.
  • examples of commercially available polymer compounds include polyallylamine, poly L-lysine and the like. Therefore, the present invention is not limited by the type of the immobilized carrier.
  • dsDNA was synthesized and inserted into the BamHI-EcoRI site of pUC18vector, the sequence of the obtained clone was confirmed by single-strand analysis, base sequence information was verified, and the site where mismatch was confirmed As a result, mutations were corrected by site directed mutagenesis and the obtained plasmid DNA (approximately 1 microgram) was delivered. The target portion in the delivered plasmid was confirmed again by sequencing.
  • the DNA sequence encoding the amino acid at the substitution site is converted to the desired codon sequence, and a DNA primer having the original sequence of 24 bases on both sides and its complementary DNA primer are used, and the quick-chance method ( The method described in Stratagene's QuickChang Site-directed Mutagenesis kit).
  • E. coli strain JM109 transformed with the recombinant plasmid is cultured overnight at 35 ° C in 2 litter medium (containing 20 g sodium chloride, 20 g yeast extract, 32 g tryptone, lOOmg ampicillin sodium). did. Thereafter, the culture was centrifuged at a low speed for 20 minutes (5,000 revolutions per minute) to obtain cells having a wet weight of 3 to 5 g. Suspend this in 20 ml of 10 mM phosphate buffer (pH 7.0), crush the cells with a French press, and then centrifuge for 20 minutes at high speed (20,000 rpm) to separate the supernatant. did.
  • Streptomycin sulfate was added to the resulting supernatant to a final concentration of 2%, stirred for 20 minutes, and then centrifuged at high speed (20,000 rotations per minute) for 20 minutes to separate the supernatant. After this, ammonium sulfate treatment is performed, and the resulting supernatant is applied to a nickel chelate column (purchased from GE Healthcare Bioscience), and a washing buffer solution (5 mM imidazole, 20 mM sodium phosphate, 0.5 M chloride).
  • Biacore surface plasmon resonance biosensor Bi acore
  • a running buffer having a composition of 10 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM sodium chloride, 5 ⁇ M EDTA, 0.005% Surfactant P20 (Biacore) and degassed in advance was used.
  • the binding reaction between the immobilized recombinant protein and HI HgG was performed using running buffer and diluted to 7 concentrations in the range of 0.25 to 20 g / mL.
  • the antibody binding and dissociation phenomena were quantitatively observed by sequentially injecting the solution and then switching to the running buffer and holding the solution.
  • the liquid flow rate was 20 min / min
  • the binding observation time (antibody solution injection time) was 4 minutes
  • the dissociation observation time was 4 minutes.
  • inject 6M guanidine hydrochloride solution for 3 minutes and bind to the recombinant protein! All human IgG was dissociated, regenerated with running buffer and used for subsequent measurements.
  • Each protein is dialyzed 3 times or more against a 10 mM phosphate buffer of ⁇ 8 ⁇ 0 containing 1000 volumes of 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid (ED TA) in advance. Protein samples of various concentrations were prepared by diluting the protein sample with the same buffer used for dialysis.
  • ED TA ethylenediaminetetraacetic acid
  • the SH group of the adsorbed protein cysteine SHanation was performed by suspending the adsorbed and immobilized carrier in a 10 mM phosphate buffer of ⁇ 7.0 containing 5 mM EDTA so that the final concentration was 5 mM.
  • 2-Nitro-5-thiocianobenzoic acid (NTCB) was added and reacted at room temperature for 4 hours. Thereafter, centrifugation was performed at 1000 rpm for several seconds, the carrier was submerged, the supernatant was removed, and the suspension was suspended in 10 mM phosphate buffer at pH 7.0.
  • Cyanated adsorption-immobilized protein was centrifuged at 1000 rpm for several seconds to sink the carrier and remove the supernatant! /, And then suspended in a 10mM borate buffer containing 5mM EDTA. The solution became cloudy and the agitation reaction was carried out by gently stirring at room temperature for at least 24 hours. After that, the side reaction of the immobilization reaction is repeated by repeating the operation of centrifuging at 1000 rpm for several seconds, removing the supernatant, removing the supernatant, and suspending in 10 mM phosphate buffer with pH 8.0 containing 1M KC1. The product was removed.
  • Immobilized carrier 101 and 990 1 human IgG (2 mg) were mixed in 10 mM phosphate buffer at pH 7.0, gently stirred at room temperature for 12 hours, and then adjusted to pH 7.0 containing 2 ml of 1M KC1. Washed 5 times with 10 mM phosphate buffer. By measuring the absorbance at 280 mm, it was confirmed that the final washing solution contained no protein.
  • Example 1 Protein A derived from Staphylococcus a conversion to a sequence containing no cysteine and lysine residues based on a sequence derived from domain A and a sequence for immobilization
  • sequence derived from domain A of protein A derived from Staphylococcus is the sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • pPAA was inserted into the BamHI-EcoRI site of UC18vector with a sequence capacity shown in SEQ ID NO: 11.
  • Proteins were separated and purified from E. coli JM109 strain transformed with pPAA according to the method described above. As a result, the target protein was obtained with a yield of about 150 mg / 2L culture.
  • amino acid sequence analysis and mass number analysis of the obtained protein it was confirmed that the amino end was alanine and the mass of the obtained purified protein measured using a mass analyzer was 8,540 Dalton. Therefore, when a recombinant protein having a methionine-alanine sequence as an amino terminal sequence is expressed in Escherichia coli, the amino acid methionine residue corresponding to the start codon usually observed is processed. It was confirmed.
  • a DNA primer obtained by converting each lysine residue-encoding DNA into a CGT codon and its complementary DNA were synthesized and used as primers.
  • the lysine residue is 35th (named pPAA-RRKKG), then 49th (named pPAA-RRRKG), and 50th (named pPAA-RRRRG).
  • a plasmid expressing a mutant in which was converted to an arginine residue was prepared.
  • the final recombinant plasmid, pPAA-RRRRG, was obtained as a mating IJ in which all lysine residues in the wild-type protein fragment sequence were converted to arginine or glycine (i.e., represented by SEQ ID NO: 1). Is an expression plasmid of a protein A fragment variant.
  • E. coli transformed with the recombinant plasmid pPAA-RRRRG expresses a protein consisting of the sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the recombinant protein was cultured in E. coli, disrupted, pretreated, and nickel chelate column chromatography. By the operation, it was purified uniformly.
  • the obtained protein was immobilized using Aminocell Mouth Fine (purchased from Seikagaku Corporation) as a primary amin carrier.
  • Aminocell Mouth Fine purchased from Seikagaku Corporation
  • the measurement of the HgG binding capacity exhibited by the immobilized carrier This is shown in Example 4.
  • Example 2 Conversion of Streptococcus protein G to a sequence that does not contain cysteine and lysine residues based on the sequence derived from the G1 domain and conversion to an immobilization sequence G1 of Streptococcus protein G
  • the sequence derived from the domain is the sequence shown in SEQ ID NO: 8.
  • amino acid sequence IJ (SEQ ID NO: 12) represented by Design and synthesize the following DNA sequence (SEQ ID NO: 13) including the transcription initiation function and translation initiation function appropriate for the sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 and restriction enzyme arrangement IJ for incorporation into the vector.
  • pPG is a BamHI-EcoRI with a sequence capacity of 3 ⁇ 4UC18vector shown in SEQ ID NO: 13.
  • the protein was separated and purified according to the method described above. As a result, the target protein was obtained with a yield of about 120 mg / 2 L culture. As a result of performing amino acid sequence analysis and mass number analysis of the obtained protein, the amino acid end was alanine, and the mass number measured using a mass analyzer of the purified protein was 9,69 8 dalton. Therefore, when a recombinant protein having a sequence of methionine-alanine as an amino terminal sequence was expressed in E. coli, it was subjected to processing of the methionine residue at the amino end corresponding to the usual start codon. It was confirmed that
  • the obtained protein was immobilized using Aminocell Mouth Fine (purchased from Seikagaku Corporation) as a primary amin carrier.
  • Aminocell Mouth Fine purchased from Seikagaku Corporation
  • the measurement of the HgG binding capacity of the obtained immobilization support is shown in Example 4.
  • Example 3 P mark Conversion to a sequence containing no cysteine and lysine residues based on the sequence derived from the B1 domain of protein L derived from tostreptococcus and to an immobilization sequence
  • sequence derived from the B1 domain of protein L derived from P tostreptococcus is the sequence shown in SEQ ID NO: 9.
  • the amino acid sequence IJ (SEQ ID NO: 14) represented by Design and synthesize the following DNA sequence (SEQ ID NO: 15) including the transcription initiation function and translation initiation function appropriate for the sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, and restriction enzyme arrangement IJ for incorporation into the vector. did.
  • pPL was inserted into the BamHI-EcoRI site of UC18vector with a sequence capacity shown in SEQ ID NO: 15.
  • the protein was separated and purified according to the method described above. As a result, the target protein was obtained with a yield of about 100 mg / 2L culture. As a result of amino acid sequence analysis and mass number analysis of the obtained protein, the amino acid end was alanine, and the mass number measured using a mass analyzer of the purified protein was 8,78. Because of the 2 daltons, when a recombinant protein having a sequence of methionine-alanine as an amino terminal sequence was expressed in E. coli, processing of the methionine residue at the amino terminal corresponding to the start codon normally found It was confirmed that they were receiving
  • the obtained protein was immobilized using Aminocel Mouth Fine (purchased from Seikagaku Corporation) as a primary amin carrier.
  • Aminocel Mouth Fine purchased from Seikagaku Corporation
  • the measurement of the HgG binding capacity of the obtained immobilization support is shown in Example 4.
  • SEQ ID NO: 6 (—SEQ ID NO: 3) 3
  • Example 5 Preparation of a protein having a sequence containing no cysteine and lysine residues based on the sequence derived from domain A of protein A derived from Staphylococcus and measurement of its IgG binding activity
  • a gene encoding a sequence portion containing a cysteine and lysine residue based on the sequence derived from domain A of protein A is duplicated, and Cfr9I is newly cleaved as a restriction enzyme cleavage sequence.
  • the DNA sequence shown below (SEQ ID NO: 27), which contains one sequence (CCCGGG) and can be inserted into the vector by cutting with BHI and EcoRI, was designed and synthesized.
  • pAAD was inserted into the BamHI-EcoRI site of UC18vector with a sequence capacity shown in SEQ ID NO: 27.
  • sequence of the R1 part is represented by PQ in the amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5 having the sequence represented by SEQ ID NO: 24 repeated twice.
  • n is any integer from 2 to 5, force, and the sequence in octopus is SEQ ID NO: 24
  • R2 Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 16)
  • R3 Cys-Ala
  • R4 Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO: 21)
  • R5 His- His- His- His- His- His- His- His (SEQ ID NO: 22)
  • Recombinant plasmid with one or more DNA sequences of SEQ ID NO: 28 cleaved with Cfr9I by cleaving with Cfr9I, mixed with pAAD cleaved with Cfr9I, and ligated with T4DNA ligase This is cleaved with BamHI and EcoRI, and separated by agarose electrophoresis, so that the size is about 0.68 kilobase pairs, about 0.86 kilobase pairs, about 1.05 kilobase pairs and larger sizes.
  • Plasmids (referred to as pAA3T, pAA4Q, and pAA5P, respectively) into which DNA fragments of about 0.68 kilobase pair, about 0.86 kilobase pair, and about 1.05 kilobase pair were introduced.
  • coli JM109 strains transformed with recombinant plasmids pAA3T, pAA4Q, and pAA5P were shown to express and accumulate large amounts of proteins of about 22 kilodaltons, about 29 kilodaltons, and about 36 kilodaltons, respectively. It was.
  • the protein was separated and purified according to the method described above.
  • the amino acid end was serine, and the mass number measured using a mass analyzer of the purified protein was 22,193 daltons. Therefore, when a recombinant protein having a sequence of methionine-serine as an amino terminal sequence is expressed in E. coli, the amino acid methionine residue at the amino terminal corresponding to the start codon usually found is processed. It was confirmed.
  • the obtained protein was examined for its binding activity to HI HgG.
  • Table 5 shows the results.
  • Example 6 Preparation of a protein having a sequence not containing cysteine and lysine residues based on a sequence derived from the Gl domain of protein G derived from Streptococcus and measurement of its IgG binding activity
  • Cfr9I is newly used as a restriction enzyme cleavage sequence by duplicating the gene encoding the sequence portion.
  • a DNA sequence (SEQ ID NO: 30) shown below was designed and synthesized that contained one cleavage sequence (CCCGGG) and that could be inserted into a vector by digestion with B ⁇ HI and EcoRI.
  • pGGD was inserted into the BamHI-EcoRI site of UC18vector with a sequence capacity shown in SEQ ID NO: 30.
  • SEQ ID NO: 30 a sequence capacity shown in SEQ ID NO: 30.
  • n is any integer from 2 to 5, force, and the sequence in the box is SEQ ID NO: 25)
  • R2 Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 16)
  • R3 Cys-Ala
  • R4 Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO: 21)
  • R5 His- His- His- His- His- His- His- His (SEQ ID NO: 22)
  • Escherichia coli JM109 strains transformed with recombinant plasmids pGG3T, pGG4Q, and pGG5P expressed and accumulated a large amount of proteins of about 25 kilodaltons, about 33 kilodaltons, and about 41 kilodaltons, respectively. Rukoto has been shown.
  • the obtained protein was examined for its binding activity to HI HgG.
  • Example 7 Preparation of a protein having a sequence containing no cysteine and lysine residues based on the sequence derived from the B1 domain of protein L derived from Peptostreptococcus and measurement of its IgG binding activity
  • pLLD was inserted into the BamHI-EcoRI site of UC18vector with a sequence capacity shown in SEQ ID NO: 33.
  • R3 Cys-Ala
  • R4 Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO: 21)
  • R5 His- His- His- His- His- His- His (SEQ ID NO: 22)
  • Escherichia coli JM109 strain transformed with recombinant plasmids pLL3T, pLL4Q, and pLL5P expressed and accumulated a large amount of about 23 kilodaltons, about 30 kilodaltons, and about 37 kilodaltons, respectively. Rukoto has been shown.
  • the obtained protein was examined for its binding activity to HI HgG.
  • the protein to be immobilized is efficiently immobilized on the immobilization support in a controlled orientation. It can be used as a diagnostic protein-immobilized carrier, immobilized enzyme, etc. used in the medical field such as disease diagnosis.

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Description

明 細 書
タンパク質の配向制御固定化に適したタンパク質及び当該タンパク質の 固定化担体
技術分野
[0001] 本発明は、固定化タンパク質に関する。本発明は、さらに当該タンパク質を配向制 御した固定化担体及びその固定化方法に関する。
背景技術
[0002] 従来、可溶性のタンパク質を、例えばァガロースゲル等の不溶性の固定化担体と 結合させ、固定化タンパク質として利用することが試みられていた。例えば、酵素タン ノ^質を固定化担体に結合した固定化酵素を開発し、それを利用して酵素反応器を 作製すること等が行われていた。このような固定化タンパク質の品質としては、タンパ ク質の性質 ·機能が均一であること、固定化されていない可溶性タンパク質と同等の 性質'機能を保持していること、さらに、担体あたりの固定化タンパク質の量が多けれ ば多!/、ほど良!/、ことが望まれる力 S、それはタンパク質の固定化方法に依存して!/、る。
[0003] タンパク質固定化の方法としては、タンパク質を構成するアミノ酸の側鎖の反応性 を利用して、固定化担体と化学的に結合させることが主に行われていた。しかし、こ のような側鎖の官能基を利用する固定化反応を用いる限りにおいては、固定化反応 に使用される側鎖を複数有するタンパク質においては、固定化部位を制御すること、 複数の箇所での固定化を防ぐこと、さらに固定化されたタンパク質の均一性を保つこ とが困難である。また、これらの困難さの要因は、固定化されたタンパク質の機能低 下にもつながるものであり、改善が望まれていた。
[0004] 複数の側鎖の官能基を介した固定化による固定化されたタンパク質の不均一性を 避けるために、タンパク質のアミノ酸置換等により、官能基を唯一有するタンパク質配 歹 IJを設計 '作製することが試みられており、例えば、タンパク質中にシスティン残基を 1個しか持たない配列に改変し、 s-s結合等を介して部位特異的に固定化することが 行われて!/、る (特許文献 1及び非特許文献;!〜 3を参照）。
[0005] 一方、タンパク質のカルボキシル末端は一箇所しかないことから、末端カルボキシ ル基を介した固定化を行うことにより、部位特異的且つ配向を制御した固定化を行う ことができる。本発明者らは既に、シァノシスティン残基を介したアミド結合形成反応 を利用した、タンパク質のカルボキシ末端のカルボキシル基を、 1級ァミンを有する担 体とペプチド (アミド)結合を介して固定化する方法を開発している（特許文献 2〜5を 参照）。このことにより、固定化されたタンパク質がカルボキシ末端の一箇所で主鎖を 介して結合するため、得られる固定化されたタンパク質は配向制御された形で固定 化されており、且つ、完全に均一となる。されに、配向制御均一性が保たれることで、 固定化されたタンパク質の変性の可逆性を高めることができ、固定化タンパク質の熱 殺菌を可能にするなどの利用面で優れた特性を付加することができる（非特許文献 4 を参照)。
[0006] このように、本発明者らが開発したシァノシスティンを介した結合反応を利用した固 定化技術は優れた特性を有するが、用いるタンパク質によっては固定化に供するタ ンパク質を製造することが困難な場合や、タンパク質の特性に応じて個別の対応を取 る必要があること、また、固定化に供される不溶性の固定化担体において 1級ァミン を官能基として多量に含むことが必要であり、固定化反応後に固定化担体上に残存 する未反応の 1級ァミンの反応性等に起因するイオン相互作用等を取り除く技術を 開発することなどが、解消すべき問題として残されていた。
[0007] 特許文献 1：特許第 2517861号公報
特許文献 2：特許第 3788828号公報
特許文献 3：特許第 2990271号公報
特許文献 4：特許第 3047020号公報
特許文献 5：特開 2003-344396号公報
非特許文献 1 : M Iwakura et al.(1993) J. Biochem. 114， 339-343
非特許文献 2 : S. J. Vigmond et al.(1994) Langumur, 10， 2860-2862
非特許文献 3 : M. Iwakura et al. (1995) J. Biochem. 117， 480-488
非特許文献 4 : M. Iwakura et al. (2001) Protein engineer., 14， 583-589
発明の開示
発明が解決しょうとする課題 [0008] 本発明は、固定化しようとする特定のタンパク質のアミノ酸配列を含むタンパク質の アミノ酸配列を、シァノシスティンを介した配向制御固定化に供するために最適化す るための条件を明らかにし、規定することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは、タンパク質の固定化における上記の解消すべき問題点を解決すベ く鋭意検討を行なった。本発明者らは、固定化しようとする固定化対象タンパク質の アミノ酸配列を含む固定化用タンパク質のアミノ酸配列を、シァノシスティンを介した 配向制御固定化に適した配列とするために鋭意研究を行い、配列を固定化対象タン パク質のアミノ酸配列からなる部分を含む 5つの部分からなる酉己列、すなわち R1-R2- R3-R4-R5で表わされる配列として設計し、それぞれの部分に特徴を持たせることに より、上記の問題を解決できることを見出した。また、本発明者らは、固定化用タンパ ク質に対応する遺伝子を作製し、宿主細胞で発現させた後の分離精製操作をも共通 化できること、及び固定化反応条件も共通化できることを明らかにした。さらに、本発 明者らは上記 R1-R2-R3-R4-R5で表わされる配列中、 R1を P-Qで表わされる 2つの 部分からなる配列とし、 P部分の配列を、（Ser又は Ala)-(Gly)nよりなる配列（nは 1から 1 0までの任意の整数）とし、 Q部分の配列を、繰り返し単位を有するタンパク質の配列 であり、リジン残基及びシスティン残基を含まな!/、配列単位が繰り返された配列とす ることにより、繰り返し配列部分がそれぞれ発揮する結合能などの機能を一つのポリ ペプチド鎖に複数持たせることができ、その結果、当該機能の増強につながることを 見出し、本発明を完成させた。
[0010] すなわち、本発明の態様は以下のとおりである。
[0011] [1] 一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列
[式中、配列は、ァミノ末端側からカルボキシ末端側に向力、う配列を示し、 R1部分の 配列は、固定化対象タンパク質の配列であり、リジン残基及びシスティン残基を含ま なレヽことを特徴とする配列であり；
R2部分の配列は存在しなくてもよぐ存在する場合はリジン及びシスティン残基以 外のアミノ酸残基により構成されるスぺーサー配列であり；
R3部分の配列はシスティン—X (Xは、リジン及びシスティン以外のアミノ酸残基）で 表される 2残基のアミノ酸で構成される配列であり；
R4部分の配列は存在しなくてもよぐ存在する場合はリジン残基及びシスティン残 基を含まない配列であり、一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列からなる タンパク質全体の等電点を酸性側にし得る酸性アミノ酸残基を含むことを特徴とする 配列であり；そして
R5部分の配列はタンパク質を精製するためのァフィ二ティータグ配列である] 力、らなるタンパク質であって、 R1-R2で表される部分を固定化担体に固定化するため に用いるタンパク質。
[0012] [2] 一般式 R1-R2-R3-R4-R5のアミノ酸配列において、 R1部分の配歹 IJが、天然由 来のタンパク質のアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列中のすべてのリジン残基及び システィン残基を、リジン残基及びシスティン残基以外のアミノ酸残基に置換すること により得られる、リジン残基及びシスティン残基を含まな!/、アミノ酸配列に改変された アミノ酸配列からなるタンパク質であって、前記天然由来のタンパク質と同等の機能 を有するタンパク質のアミノ酸配列であることを特徴とする、 [1]の一般式 R1-R2-R3- R4-R5で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
[0013] [3] 一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列において、 R2部分の配歹 IJが、 ；!〜 10個のグリシンからなる配列であることを特徴とする、 [1]の一般式 R1-R2-R3-R 4-R5で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
[0014] [4] 一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列において、 R4部分の配歹 IJが、 ァスパラギン酸及び/又はグルタミン酸のアミノ酸残基からなるアミノ酸残基数 1〜； 10 個の配列であることを特徴とする、 [1]の一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるァミノ 酸配列からなるタンパク質。
[0015] [5] 一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列において、 R5部分の配歹 IJが、 4個以上のヒスチジン残基からなるアミノ酸配列であることを特徴とする、 [1]の一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
[0016] [6] 一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列において、 R1部分の配列が 抗体分子と特異的に相互作用する機能を有することを特徴とする、 [1]〜[5]のいず れかのタンパク質。 [0017] [7] 下記のアミノ酸配列（配列番号 1)からなる [1]のタンパク質。 Ala~Asp_Asn_Asn_Phe_Asn_Arg_Glu_Gln_Gln
Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
Asn_Leu_Asn_Glu_Glu_Gln_Arg_Asn_Gly_Phe
Ile- ln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser- ln
Ser- -Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg
し eu- - Asn_Glu_Ser_Gln_Ala~Pro_Gly_Gly_Gly
Gly- -Gly-Cys-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp
His- -His_His_His_His_His
[0018] [8] 下記の配歹 IJ (配列番号 2)からなる [1]のタンノぺク質
Ala- -Tyr_Arg_Leu_Ile_Leu_Asn_Gly_Arg_Thr
し eu- -Arg-Gly-Glu-Thr-Thr-Thr-Glu-Ala-Val
Asp- -Ala-Ala-Thr-Ala-Glu-Arg-Val-Phe-Arg
Gin- - l yr-Ala-Asn-Asp-Asn- ly-Val-Asp-Giy
Glu- - i>p-Thr- yr-Asp-Asp-Ala- fhr_Arg_Thr
Phe- -Thr-Val-Thr-Glu-Arg-Pro-Glu-VaHle
Asp- -Ala-Ser-Glu-Leu-Thr-Pro-Ala-Val-Thr
Gly- -Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp
Asp- -Asp-His-His-His-His-His-His
[0019] [9] 下記の配歹 IJ (配列番号 3)からなる [1]のタンノぺク質
Ala- -Thr_Ile_Arg_Ala~Asn_Leu_Ile_Tyr_Ala
Asp- - Gly_Arg_Thr_Gln_Thr_Ala_Glu_Phe_Arg
Gly- -Thr-Phe-Glu-Glu-Ala-Thr-Ala-Glu-Ala
Tyr- - Arg_Tyr_Ala~Asp_Leu_Leu_Ala~Arg_Glu
Asn- - Gly_Arg_Tyr_Thr_ v al~Asp- V al-Ala~Asp
Arg- -Gly_Tyr_Thr_Leu_Asn_Ile_Arg_Phe_Ala
Gly- -Gly-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Asp-Asp-Asp
Asp- -Asp-Asp-His-His-His-His-His-His [0020] [10] [1]〜[9]のいずれかの一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列から なるタンパク質が静電相互作用により吸着して!/、る固定化担体。
[0021] [11] [1]〜[9]のいずれかのタンパク質中に存在する唯一のシスティン残基のスルフ フィドリル基をチオシァノ基に変換し、 1級ァミンを官能基として有する固定化担体に 作用させることにより、前記タンパク質中のシスティン残基よりァミノ末端側に存在す るアミノ酸配列部分をアミド結合により前記固定化担体に結合させることを特徴とする 固定化タンパク質の作製方法。
[0022] [12] [1]〜[9]のいずれかのタンパク質中に存在する唯一のシスティン残基のスルフ フィドリル基をチオシァノ基に変換し、 1級ァミンを官能基として有する任意の固定化 担体に作用させることにより、前記タンパク質中のシスティン残基よりァミノ末端側に 存在するアミノ酸配列部分をアミド結合により結合したことを特徴とするタンパク質固 定化担体。
[0023] [13] 下記の配列（配列番号 4)力、らなるタンパク質のカルボキシ末端力 1級ァミンを 官能基として有する固定化担体にアミド結合で結合していることを特徴とする、 [12] のタンパク質を固定化した固定化担体。
A _Asp_Asn_Asn_Phe_Asn_Arg_Lrlu_Gln_Gln_
Asn_Ala~Phe_Tyr_Glu_Ile_Leu_Asn_Met_Pro_
Asn_Leu_Asn_Glu_Glu_Gln_Arg_Asn_Gly_Phe_
Ile- ln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-Ser- ln- Ser_Ala~Asn_Leu_Leu_Ser_Glu_Ala~Arg_Arg_
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Aia-Pro-Gly-Gly-Gly- Gly-Gly
[0024] [14] 下記の配歹 IJ (配列番号 5)からなるタンパク質のカルボキシ末端が、 1級ァミンを 官能基として有する固定化担体にアミド結合で結合していることを特徴とする、 [12] のタンパク質を固定化した固定化担体。
Aia~ yr_Arg_Leu_Iie_Leu_Asn_Gly_Arg_Thr_
Leu_Arg_Gly_Glu_Thr_Tnr_Thr_Glu_Aia_Vai_
Asp-Ala-Ala-Thr-Ala-Glu-Arg-Val-Phe-Arg- Gin- Tyr- Ala- Asn- Asp- Asn- Gly- Vaト Asp- Gly- Glu- Trp- Thr- Tyr- Asp- Asp- Ala- Thr- Arg- Thr- Phe-Thr-Val-Thr-Glu-Arg-Pro-Glu-Val-Ile- Asp_Ala_Ser_Glu_Leu_Thr_Pro_Ala_Val_Thr_
Gly-Gly-Gly-Gly
[0025] [15] 下記の配歹 IJ (配列番号 6)で示されるタンパク質のカルボキシ末端力 1級ァミン を官能基として有する固定化担体にアミド結合で結合していることを特徴とする、 [12] のタンパク質を固定化した固定化担体。
Ala_Thr_Ile_Arg_Ala_Asn_Leu_Ile_Tyr_Ala_
Asp_Gly_Arg_Thr_Gin_Tnr_Ala_Glu_Phe_Arg_
Gly-Thr- Phe- Glu- Glu- Ala- Thr- Ala- Glu- Ala- Tyr_Arg_Tyr_Ala_Asp_Leu_Leu_Ala_Arg_Glu_
Asn-Gly-Arg-Tyr-Tnr- v al~Asp- v al-Ala~Asp- Arg_Gly_Tyr_Thr_Leu_Asn_Ile_Arg_Phe_Ala_
Gly_Gly_Gly_Gly_Gly
[0026] [16] 固定化担体に R1-R2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を固定化する ために用いる一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質 を設計する方法であって、 Rl、 R2、 R3、 R4及び R5部分のアミノ酸配列を以下の条件 に適合するように選択することを含む方法：
(a) Rl部分の配列として、固定化対象タンパク質の配列であり、リジン残基及びシステ イン残基を含まなレヽことを特徴とする配列を選択し；
(b) R2部分の配列を存在させないか、または存在させ場合はリジン及びシスティン残 基以外のアミノ酸残基により構成されるスぺーサー配列を選択し；
(c) R3部分の配列として、システィン X (Xは、リジンもしくはシスティン以外のァミノ 酸残基）で表される 2残基のアミノ酸で構成される配列を選択し；
(d) R4部分の配列を存在させないか、または存在させる場合はリジン残基及びシステ イン残基を含まない配列であり、一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列 力もなるタンパク質全体の等電点を酸性側にし得る酸性アミノ酸残基を含むことを特 徴とする配列を選択し；そして
(e) R5部分の配列としてタンパク質を精製するためのァフィ二ティータグ配列を選択 する。
[0027] [17] R1部分の配列が P-Qで表わされ、 P部分の配列は、存在しても存在しなくても よぐ存在する場合は (Ser又は Ala)-(Gly)nよりなる配列（nは 1から 10までの任意の整 数)であり、 Q部分の配列は、繰り返し単位を有するタンパク質の配列であり、リジン残 基及びシスティン残基を含まない配列単位が繰り返された配列であることを特徴とす る配列である、 [1]の一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列からなるタン ノ ク質であって、 R1-R2で表される部分を固定化担体に固定化するために用いるタン パク質。
[0028] [18] P-Qで表わされるアミノ酸配列において、 Q部分の繰り返し単位の配列が天然 由来のタンパク質のアミノ酸配歹 IJ、又はそのアミノ酸配列中のすべてのリジン残基及 びシスティン残基を、リジン残基及びシスティン残基以外のアミノ酸残基に置換する ことにより得られる、リジン残基及びシスティン残基を含まないアミノ酸配列に改変さ れたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、前記天然由来のタンパク質と同等の 機能を有するタンパク質のアミノ酸配列であることを特徴とする、 [17]の一般式 R1- R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
[0029] [19] 一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列において、 R2部分の配列が 、；!〜 10個のグリシンからなる配列であることを特徴とする、 [17]の一般式 R1-R2-R3 -R4-R5で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
[0030] [20] 一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列において、 R4部分の配列が 、ァスパラギン酸とグルタミン酸の 2種類のアミノ酸残基からなるアミノ酸残基数 2〜； 10 個の配列であることを特徴とする、 [17]の一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるァミノ 酸配列からなるタンパク質。
[0031] [21] 一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列において、 R5部分の配列が 、 4個以上のヒスチジン残基からなるアミノ酸配列であることを特徴とする、 [17]の一 般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
[0032] [22] P-Qで表わされるアミノ酸配列において、 Q部分の繰り返し単位の配列が抗体 分子と特異的に相互作用する機能を有することを特徴とする、 [17]〜[21]のいずれ かのタンパク質。
[0033] [23] 一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列において、 R1部分の配列が P -Qで表わされ、
P = Ser-Gly-Gly-Gly-Gly
Q = (Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln- Asn_A _Phe_Tyr_Glu_Ile_Leu_Asn_Met_Pro_
Asn_Leu_Asn_Glu_Glu_Gln_Arg_Asn_Gly_Phe_
Ile_Lrln_Ser_Leu_Arg_Asp_Asp_Pro_Ser_Lrln_
Ser_Ala_Asn_Leu_Leu_Ser_Glu_Ala_Arg_Arg_
Leu- Asn-Glu- Ser- Gin- Ala- Pro- Gly)n (nは、 2から 5までの任意の整数）
R2 = Gly-Gly-Gly-Gly
R3 = Cys-Ala
R4 = Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp
R5 = His— His— His— His— His— His
であることを特徴とする、 [17]のタンパク質。
[0034] [24] 一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列において、 R1部分の配列が P -Qで表わされ、
P = 存在しない
Q = (Ala_Tyr_Arg_Leu_Ile_Leu_Asn_Gly_Arg_Thr_
Leu_Arg_Gly_Glu_Thr_Thr_Thr_Glu_Aia_Vai_
Asp-Ala-Ala- Thr- Ala- Glu-Arg-Va卜 Phe-Arg- Gin- yr-Ala-Asn-Asp-Asn- ly- v al-Asp- ly- Glu- Trp- Thr- Tyr- Asp- Asp- Ala- Thr- Arg- Thr- Phe-Thr-Val-Thr-Glu-Arg-Pro-Glu-Val-Ile-
Asp-Ala- Ser- Glu- Leu- Thr- Pro- Ala- Va卜 Thr- Pro- Gly)n(nは、 2から 5までの任意の
Gly-Gly-Gly-Gly R3 = Cys-Ala
R4 = Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp
R5 = His— His— His— His— His— His
であることを特徴とする、 [17]のタンパク質。
[0035] [25] 一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列において、 R1部分の配列が P -Qで表わされ、
P = 存在しない
Q = (Ala-Thr- Ile-Arg-Ala- Asn-Leu- Ile-Tyr- Ala
Asp_Gly_Arg_Thr_Gin_Tnr_Ala_Glu_Phe_Arg
Gly-Thr- Phe- Glu- Glu- Ala- Thr- Ala- Glu- Ala
Tyr_Arg_Tyr_Ala_Asp_Leu_Leu_Ala_Arg_Glu
Asn_Gly_Arg_Tyr_Thr_Vaト Asp_Vaト Ala_Asp
Arg_Gly_Tyr_Thr_Leu_Asn_Ile_Arg_Phe_Ala
Pro-Gly-)n (nは、 2から 5までの任意の整数）
R2 = Gly-Gly-Gly-Gly
R3 = Cys-Ala
4 = Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp
R5 = His— His— His— His— His— His
であることを特徴とする、 [17]のタンパク質。
[0036] [26] [17]〜[22]のいずれかの一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列か らなるタンパク質が静電相互作用により吸着している固定化担体。
[0037] [27] [17]〜[22]のいずれかのタンパク質中に存在する唯一のシスティン残基のス ルフフイドリル基をチオシァノ基に変換し、 1級ァミンを官能基として有する固定化担 体に作用させることにより、前記タンパク質中のシスティン残基よりァミノ末端側に存 在するアミノ酸配列部分をアミド結合により前記固定化担体に結合させることを特徴と する固定化タンパク質の作製方法。
[0038] [28] [17]〜[22]のいずれかのタンパク質中に存在する唯一のシスティン残基のス ルフフイドリル基をチオシァノ基に変換し、 1級ァミンを官能基として有する任意の固 定化担体に作用させることにより、前記タンパク質中のシスティン残基よりァミノ末端 側に存在するアミノ酸配列部分をアミド結合により結合したことを特徴とするタンパク 質を固定化した固定化担体。
[0039] なお、天然由来のタンパク質はシスティン及びリジンを含む 20種のアミノ酸残基より 構成されているため、構成するアミノ酸残基として、システィン及びリジンを全く含まな い配列が生物学的機能、例えば、タンパク質-タンパク質間特異的認識 ·結合機能、 タンパク質一核酸特異的認識 ·結合機能、触媒機能等、を保持するか否かに関して は不明であった。本発明は、システィン及びリジンを含まないように改変したタンパク 質が基の天然のタンパク質が有する機能と同等の機能を有しえることを明らかにした
〇
発明の効果
[0040] 本発明に従い一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列を設計し、該ァミノ 酸配列からなるタンパク質を作製し、固定化に用いることにより、配向制御された固定 化タンパク質を効率的且つ迅速に作製できる。 Rl、 R2、 R3、 R4及び R5を各部分の条 件を満たすように選択することにより、あらゆるタンパク質を配向制御させて固定化す ること力 S可能である。また、設計 '作製したタンパク質の精製に利用する R5として共通 の配列を利用することにより、固定化対象タンパク質である R1の配列にかかわらず、 共通の手法で固定化用タンパク質を精製することができ、また固定化の際の反応条 件をも共通化することができる。
[0041] さらに、上記 R1-R2-R3-R4-R5で表わされる配列中、 R1を P-Qで表わされる 2つの 部分からなる配列とし、 P部分は存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、 その配列を、（Ser又は Ala)_(Gly)nよりなる配列（nは 1から 10までの任意の整数）とし、 Q部分の配列を、繰り返し単位を有するタンパク質の配列である。リジン残基及びシ スティン残基を含まない配列単位が繰り返された配列とすることにより、一本のポリぺ プチド鎖に当該配列が発揮する機能が複数発揮できることになり、当該機能の増強 効果が得られる。
発明を実施するための最良の形態
[0042] 以下、本発明を詳細に説明する。 [0043] 本発明のタンパク質の配向制御固定化に適した、固定化しようとする固定化対象タ ンパク質のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなる固定化用タンパク質とは、一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質で表現されるタンパク 質のことである。該式中、配列は、ァミノ末端側からカルボキシ末端側に向力ゝぅァミノ 酸配列を示し、 R1部分の配列は、固定化対象となる任意のタンパク質のアミノ酸配列 であり、且つ、この配列中には、リジン残基及びシスティン残基を全く含まないことを 特徴とする配列である。 R2部分の配列は、リジン及びシスティン残基以外のアミノ酸 残基により構成される任意のスぺーサー配列である。 R2部分は存在しなくてもよい。 R 3部分の配列は、システィン— X (Xは、リジン及びシスティン以外のアミノ酸残基）で 表される 2残基のアミノ酸で構成される配列である。 R4部分の配列は、リジン残基及 びシスティン残基を全く含まない任意の配列で且つ R1-R2-R3-R4-R5の配列全体の 等電点を酸性側にし得る酸性アミノ酸残基を含むことを特徴とする配列である。 R4部 分は存在しなくてもよい。 R5部分の配列は、特定の化合物と結合し得る任意のァフィ 二ティータグ配列であり、例えばヒスチジン残基を 4個以上含むことを特徴とする配列 である。
[0044] 本発明の一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質に おいて、 R1部分の配列は、固定化しようとする固定化対象タンパク質のアミノ酸配列 であり、且つ、この配列中には、リジン残基及びシスティン残基を全く含まないことを 特徴とする配列である。 R1部分のアミノ酸の数は限定されず、 目的に応じていかなる 数のアミノ酸からなるアミノ酸配列をも選択することができる。 R1部分の配列は、前記 固定化対象タンパク質のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、該アミノ酸配列 力もなるタンパク質断片が前記タンパク質と同等の機能 ·活性を有する部分アミノ酸 配列であってもよい。この場合、 R1は例えば、固定化対象タンパク質の機能を有する 機能性ドメインのアミノ酸配列である。
[0045] 本発明の場合、 R1部分が目的とする機能を担っている。また、固定化反応のため に R3部分のみにシスティン残基を必要とすること、また、担体に官能基として一級アミ ンを用いることから、システィン残基及び一級アミン基を側鎖に有するリジン残基は R1 部分を構成するアミノ酸残基としては不適切である。 [0046] さらに、上記 R1-R2-R3-R4-R5で表わされる配列中、 R1を P-Qで表わされる 2つの 部分からなる配列とすることができる。この場合、 P部分の配列は、（Ser又は Ala)-(Gly) nで表わされる配列（nは 1から 10までの任意の整数）であり、 Q部分の配列は、繰り返 し単位を有するタンパク質の配列であり、リジン残基及びシスティン残基を含まなレヽ 配列単位が繰り返された配列である。繰り返し数は限定されないが、好ましくは 2〜5 である。
[0047] 天然由来のタンパク質は、通常リジン残基及びシスティン残基を含む 20種のアミノ 酸残基から構成されている。 目的とする機能を担う R1部分力 リジン残基又はシステ イン残基を含む場合、元の天然タンパク質の有する機能を保有したまま、リジン残基 及びシスティン残基をリジン及びシスティン以外の 18種のアミノ酸のいずれかに、置 換する必要がある。
[0048] 既に、本発明者らは、システィン及びメチォニンを全く含まないタンパク質を作製す る方法を確立している（特許再公表 01/000797号公報、 M.Iwakura et al. J.Biol.Chem . 281， 13234-13246(2006)、特開 2005-058059号公報）。これらの方法と同様の方法 により、天然由来のタンパク質のアミノ酸配列を基に、アミノ酸配列を転換し、システィ ン及びリジン残基を含まない 18種のアミノ酸より構成されるアミノ酸配列からなるタン ノ ク質であって、天然タンパク質と同等の機能を発揮するタンパク質を作製すること ができる。この方法の概要は以下のとおりである。
[0049] 1.天然配列中におけるすべてのシスティン残基部分及びリジン残基部分について、 それぞれ、網羅的に 1アミノ酸置換を行い、その機能を調べる。
2.各々の残基部分における 1アミノ酸置換変異体の機能をよいものから並べ上位 3 個の変異、ただし、システィン又はリジンに置換した変異は除ぐを用い、その組み合 わせ変異を行い、その中から上位 3個の組み合わせ変異体を選び、他の部位の 1ァ ミノ酸置換変異における上位 3個の変異、ただし、システィン又はリジンに置換した変 異は除ぐとの組み合わせ変異を行う。
3.この操作を、すべてのシスティン残基部分及びリジン残基部分が他のアミノ酸に置 換されるまで繰り返す。
[0050] さらに具体的には以下のようにして行なう。 [0051] 全長 m個のアミノ酸よりなる天然のタンパク質においてリジン及びシスティン残基が n個あるとする。その各々のアミノ酸配列上の位置を、 Ai(i=l〜n)とする。
[0052] 得られる変異を、 A1/MA1と表す。
[0053] その他の部位の Ai (i = 2〜n)のリジン及びシスティン残基に関して、リジン及びシス ティン残基をコードするコドンを前記「リジン及びシスティン以外の他のアミノ酸」（最 大 18種類）をコードするコドンで置換した変異遺伝子を作成し、これを発現して得られ た 2重変異体酵素タンパク質の酵素活性を調べる。
[0054] 2重変異体の活性を調べると、天然のタンパク質と同等又はそれ以上の活性を示す 変異体が見レ、だされる。 2重変異のうち活性の高!/、ものから最大 3個の 2重変異体を 選ふ。
[0055] 次に、得られた 2重変異体のそれぞれの A3のリジン及びシスティン残基をリジン及 びシスティン残基以外の他のアミノ酸 (最大 18種）に置換した 3重変異体をそれぞれ 作製し (最大、 3 X 18=54種）、その酵素活性を調べる。
[0056] 3重変異体の活性を調べると、天然のタンパク質と同等又はそれ以上の活性を示す 変異体が見出される。
[0057] 以下同様に、 4重、 · ·、 n重変異体を作製する。最後の n重変異体が、 目的のリジン 及びシスティン残基を含まな!/、タンパク質である。
[0058] この操作により、少なくとも元の天然のタンパク質が有する機能と同等の機能を有す るタンパク質が得られる。「元の天然のタンパク質が有する機能と同等の機能」とは、 配列を改変したタンパク質の活性が元の天然のタンパク質と質的に変わらず、さらに 量的にも大きく低下していないことをいう。例えば、元の天然のタンパク質が特定の反 応を触媒する酵素ならば、配列を改変したタンパク質も同じ反応を触媒する酵素活 性を有しており、あるいは元の天然のタンパク質が特定の抗原に結合する抗体なら ば、配列を改変したタンパク質も同じ抗原に結合し得る抗体としての活性を有してい ることをいう。アミノ酸配列を改変したタンパク質の活性は、元の天然タンパク質の活 性の 10%以上、好ましくは 50%以上、さらに好ましくは 75%以上、さらに好ましくは 90 %以上、特に好ましくは 100%以上である。活性は、例えば酵素の場合は、比活性で 表され、また抗体等の他の物質への結合能を有するタンパク質の場合は、結合能で 表される。これらの、活性の測定方法は、タンパク質に応じて適宜選択することができ
[0059] 後記の実施例に示すように、抗体分子に対して結合機能を有する別々の天然タン ノ ク質の部分配列を基に、システィン及びリジン残基を全く含まな!/、配列に転換した ところ、該転換部分配列は、天然タンパク質由来の前記部分配列が有する機能と同 等の機能を有することが示された。このことは、特定の機能を有する天然タンパク質 のアミノ酸配列を基にシスティン及びリジン残基を含まない 18種のアミノ酸より構成さ れるように改変したアミノ酸配列からなるタンパク質であって、天然に存在するタンパ ク質が示す機能と同等の機能を有するタンパク質が存在することを示すものであり、 本発明があらゆるタンパク質に応用できるという本発明の一般性を示している。また、 タンパク質をアミノ酸配列から人工的にデザインし、合成していく手法であるデノボデ ザイン等により、 目的機能を有するタンパク質を作製できることが予測される。デノボ デザイン手法をシスティン及びリジン残基を含まない 18種のアミノ酸だけを利用する ように限定することなどにより、機能性タンパク質を作製し得ることを示している。さら に、天然由来のタンパク質のアミノ酸配列の改変だけでなぐ本発明の R1部分として 利用し得る特定の機能を有する機能性タンパク質を新たに設計 ·作製できる可能性 をも示唆している。
[0060] R1部分のタンパク質の一例として、酵素活性を有するタンパク質や抗体分子に結 合能を有するタンパク質が挙げられる。抗体分子に結合能を有するタンパク質として は、 Staphylococcus aureus由来のプロァ ノ A(A. rorsgren and J. Sjoquist, j . immun ol. (1966) 97， 822-827·に記載)、 Streptococussp. Group C/G由来のプロテイン G (欧 州特許出願公開第 1173239774906_0号明細書（1983)に記載)、 Peptostreptococcus magnus由来のプロテイン L (米国特許第 5965390号明細書（1992)に記載）、 group A Streptococcus由来のプロテイン H (米国特許第 5180810号明細書（1993)に記載）、 H aemophilus influenzae由来のプロテイン D (米国特許第 6025484号明細書（1990)に記 載）、 Streptococcus AP4由来のプロテイン Arp (Protein Arp4) (米国特許第 5210183 号明細書（1987)に記載）、 group C Streptococcus由来の Streptococcal FcRc (米国 特許第 4900660号明細書（1985)に記載）、 group A streptococcus, Type II strain由 来のタンパク質（米国特許第 5556944号明細書（1991)に記載）、 Human Colonic Muc osal Epithelial Cell由来のタンパク質（米国特許第 6271362号明細書（1994)に記載） 、 Staphylococcus aureu， strain 8325-4由来のタンパク質（米国特許第 6548639号明 細書（1997)に記載）、 Pseudomonas maltophilia由来のタンパク質（米国特許第 52450 16号明細書（1991)に記載）等が知られている。
[0061] 後記の実施例 1に示す配列は、以下に示す、スタフイロコッカス由来のプロテイン A の Aドメイン由来の配列 （配列番号 7)、
A _Asp_Asn_Asn_Phe_Asn_Lys_Lrlu_Gln_Gin_
Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro- Asn_Leu_Asn_Glu_Glu_Gln_Arg_Asn_Gly_Phe_
ile_Gln_Ser_Leu_Lys_Asp_Asp_Pro_Ser_Gln_
¾er-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-lys-lys- Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Aia-Pro-Lys
である (もともとシスティン残基を含まない）。これを改変することにより、システィン残 基及びリジン残基を含まず、且つ、天然由来の上記アミノ酸配列からなるタンパク質 が有するィムノグロブリン G (IgG)結合活性と同等の IgG結合活性を有するタンパク質 が得られることが示された。
[0062] 後記の実施例 2に示す配列は、以下に示す、ストレプトコッカス由来のプロテイン G の G1ドメイン由来の配列 （配列番号 8)、
Thr- ryr_Lys_Leu_Ile_Leu_Asn_Giy_Lys_Thr_
Leu_Lys_Gly_Glu_Thr_Thr_Thr_Glu_Aia_Vai_
Asp-Ala- Ala- Thr- Ala- Glu-Lys-Va卜 Phe-Lys- Gin- yr-Ala-Asn-Asp-Asn- ly- v al-Asp- ly- Glu- Trp- Thr- Tyr- Asp- Asp- Ala- Thr- Lys- Thr- Phe-Thr-Val-Thr-Glu-Arg-Pro-Glu-Val-Ile- Asp_Ala_Ser_Glu_Leu_Thr_Pro_Ala_Val_Thr
である (もともとシスティン残基を含まない）。これを改変することにより、システィン残 基及びリジン残基を含まず、且つ、天然由来の上記アミノ酸配列からなるタンパク質 が有する IgG結合活性と同等の IgG結合活性を有するタンパク質が得られることが示 された。
[0063] 後記の実施例 3に示す配列は、以下に示す、 P印 tostreptococcus由来のプロテイン Lの B1ドメイン由来の配列 （配列番号 9)、
Vaト Thr_Ile_Lys_Ala_Asn_Leu_Ile_Tyr_A - Asp_Gly_Lys_Thr_Gin_Tnr_Ala_Glu_Phe_Lys_
Gly-Thr- Phe- Glu- Glu- Ala- Thr- Ala- Glu- Ala- Tyr_Arg_Tyr_Ala_Asp_Leu_Leu_Ala_Lys_Glu_
Asn_Gly_Lys_ f yr_Thr_ V aト Asp_Vaト Ala-Asp- Lys_Gly_Tyr_Thr_Leu_Asn_Ile_Lys_Phe_Ala_
である (もともとシスティン残基を含まない）。これを改変することにより、システィン残 基及びリジン残基を含まず、且つ、天然由来の上記アミノ酸配列からなるタンパク質 が有する IgG結合活性と同等の IgG結合活性を有するタンパク質が得られることが示 された。
[0064] なお、天然タンパク質のアミノ酸配列を変異させる方法として、通常は、ランダム突 然変異法が多くの場合使用され、また、機能の選択としてファージディスプレイ法が 多く使用される。し力もながら、そのような方法を用いる限り、システィン及びリジン残 基を含まなレ、アミノ酸配列からなるタンパク質であって、天然タンパク質の有する機能 を有している改変タンパク質を得る可能性は著しく低ぐ本発明の R1部分に相当する 配列を得ることはできない。本発明の R1部分に相当する配列は、本発明者らが開発 した上記の方法により可能になる。
[0065] さらに、 R1部分の配列を P-Qで表わされる 2つの部分からなる配列とした場合、 P部 分の配列は、（Ser又は Ala)_(Gly)nで表わされる配列（nは 1から 10までの任意の整数 )で示され、例えば Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (配列番号 23)が挙げられる。また、 Q部分 の配列は、繰り返し単位を有するタンパク質の配列であり、リジン残基及びシスティン 残基を含まな!/、配列単位が繰り返された配列であり、例えば以下に記載する配列が 挙げられる。
[0066] 後記の実施例 5は、以下に示す、スタフイロコッカス由来のプロテイン Aの Aドメイン 由来の配列を改変し、リジン残基及びシスティン残基を含まな!/、ようにした配列を配 列単位として繰り返し配列を Q部分の配列として有するタンパク質である。
la_Asp_Asn_Asn_Phe_Asn_Arg_Glu_Gln_Gln_
Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro-
Asn_Leu_Asn_Glu_Glu_Gln_Arg_Asn_Gly_Phe_
Ile_Lrln_Ser_Leu_Arg_Asp_Asp_Pro_Ser_Lrln_
Ser_Ala_Asn_Leu_Leu_Ser_Glu_Ala_Arg_Arg_
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro_Gly)n(nは、 2から 5までの任意の整数、力、つこ内の 配列は配列番号 24)
繰り返し配列とすることで、繰り返しを持たな!/、タンパク質が発揮する IgG結合活性 よりはるかに優れた IgG結合活性が示された。
[0067] 後記の実施例 6は、以下に示す、ストレプトコッカス由来のプロテイン Gの G1ドメイン 由来の配列を改変し、リジン残基及びシスティン残基を含まな!/、ようにした配列を配 列単位として繰り返し配列を Q部分の配列として有するタンパク質である。
(Ala_Tyr_Arg_Leu_ile_Leu_Asn_Lrly_Arg_ i，hr_
Leu_Arg_Gly_Glu_Thr_Tnr_Thr_Glu_Aia_Va卜
Asp-Ala-Ala- Thr- Ala- Glu-Arg-Va卜 Phe-Arg- Gin- yr-Ala-Asn-Asp-Asn- ly- v al-Asp- ly- Glu- Trp- Thr- Tyr- Asp- Asp- Ala- Thr- Arg- Thr- Phe-Thr-Val-Thr-Glu-Arg-Pro-Glu-Val-Ile-
Asp-Ala- Ser- Glu- Leu- Thr- Pro- Ala- Va卜 Thr- Pro- Gly)n(nは、 2から 5までの任意の 整数、力、つこ内の配列は配列番号 25)
繰り返し配列とすることで、繰り返しを持たな!/、タンパク質が発揮する IgG結合活性 よりはるかに優れた IgG結合活性が示された。
[0068] 後記の実施例 7は、以下に示す、 P印 tostreptococcus由来のプロテイン Lの B1ドメイ ン由来の配列を改変し、リジン残基及びシスティン残基を含まないようにした配列を 配列単位として繰り返し配列を Q部分の配列として有するタンパク質である。
(Ala-Thr-Ile-Arg-Ala-Asn-Leu-Ile-Tyr-Ala Asp_Gly_Arg_Thr_Gln_Thr_Ala_Glu_Phe_Arg
Gly-Thr- Phe- Glu- Glu- Ala- Thr- Ala- Glu- Ala
Tyr_Arg_Tyr_Ala_Asp_Leu_Leu_Ala_Arg_Glu
Asn_Gly_Arg_Tyr_Thr_Vaト Asp_Vaト Ala_Asp
Arg_Gly_Tyr_Thr_Leu_Asn_Ile_Arg_Phe_Ala
Pro-Gly-)n (nは、 2から 5までの任意の整数、かっこ内の配列は配列番号 26)
繰り返し配列とすることで、繰り返しを持たな!/、タンパク質が発揮する IgG結合活性 よりはるかに優れた IgG結合活性が示された。
[0069] R2部分は、リジン及びシスティン残基以外のアミノ酸残基により構成される任意のス ぺーサ一配列であり、該配列は、固定化担体に R1部分と共に固定化される。 R2部分 は、リジン残基及びシスティン残基を全く含まないことを特徴とする。一般に、タンパク 質を固定化する場合は、固有の機能を有する固定化対象であるタンパク質を固定化 する。タンパク質のみを固定化した場合、固定化担体との立体的障害等により固定 化タンパク質の機能が阻害される場合がある。本発明の場合、 R2部分は固定化に際 して固定化担体との結合により R1部分が有する機能が阻害されないようにする適切 なリンカ一としての役割を担っている。リンカ一としての役割は、 R1部分の特定の機能 を有するタンパク質と固定化担体との間に適切な距離を保つことである。従って、 R2 部分は一定の長さを有する任意のアミノ酸配列で且つイナートなことが求められる。 本発明においては、固定化反応のために R3部分のみに唯一のシスティン残基を必 要とする。また、固定化担体と固定化タンパク質を結合させる官能基として 1級ァミン を用いる。従って、 1級アミン基を側鎖に有するリジン残基はリンカ一を構成するァミノ 酸残基としては不適切である。従って、 R2部分を構成するアミノ酸残基としては、シス ティン及びリジン残基以外の 18種のアミノ酸残基から構成されることが必要である。
[0070] なお、 R1部分を固定化担体に直接結合しても、 R1部分のタンパク質が有する機能 が阻害されない場合は、 R2部分は存在しなくてもよぐこの場合上記一般式は R1-R3 -R4-R5で表すこともできる。 R2部分のアミノ酸の数は限定されないが、 0、すなわち存 在しないか、；!〜 10アミノ酸、好ましくは 2〜5アミノ酸である。 R2部分の配列として、例 えば、 1〜10個、又は 2〜5個のグリシンからなるポリグリシン等が挙げられる。後記の 実施例においては、最も単純なアミノ酸としてのグリシンの連鎖、 R2=Gly-Gly-Gly-Gl y (配列番号 16)、を用いた例を示す力 本発明はこれには限定されない。
[0071] 上記の一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、 R3 配列部分にのみ、唯一のシスティン残基を有するという特徴を有する。従って、この 唯一のシスティン残基の側鎖の官能基である SH基をシァノ化することによりシァノシ スティン残基に変化させ、該シァノシスティン残基と固定化担体上の 1級ァミンとの反 応により、上記の一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列の R1-R2で表され る部分のみを固定化担体上に配向制御して固定化させることができる。シァノシステ インを介した固定化反応において、 R4部分の配歹 IJ、すなわち、配列全体からなるタン ノ ク質の等電点が酸性となる酸性アミノ酸に富む配歹 |J、を含ませることにより、一般式
R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質全体を負に帯電させる こと力 Sできる。この結果、前記タンパク質は、まず正に帯電している 1級ァミンを有する 固定化担体と静電相互作用により速やかに吸着結合し得る。そして、その後の緩や 力、な反応であるシァノシスティンを介した結合反応を効率よく行わせることができる。 タンパク質の固定化担体への結合がこのように進行する結果、高密度固定化も可能 になる。なお、 R4部分を除いた R1-R2-R3-R5又は R1-R3-R5で表されるアミノ酸配列 力もなるタンパク質の等電点が酸性である場合は、 R4は存在しなくてもょレ、。
[0072] R3部分の配列としては、システィン- X (Xはリジン及びシスティン以外のアミノ酸）で 表される 2個のアミノ酸からなるアミノ酸配列が挙げられる。 Xは限定されない。ただし 、本発明の一般式 R1-R2-R3-R4-R5のアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いて R1 -R2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を固定化する場合、 R3部分のシスティ ンがシァノシスティン化される。この際、シァノシスティンの次のアミノ酸をァラニンに することにより、シァノシスティン残基を介したアミド結合形成反応が生じやすいので 、 Xはァラニンが好ましい。シァノシスティン化を介した結合反応の発見及びその反 応の解析に関しては、例えば Τ· Takenawa, et al. (1998) J. Biochem. 123， 1137-114 4や Υ· Ishihama et al. (1999) TetrahedronLett. 40,3415-3418に記載されている。
[0073] R4部分としては、一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列からなるタンパ ク質全体の等電点を酸性側にし得る酸性アミノ酸残基を含む配列が好適である。ここ で、「タンパク質全体の等電点を酸性側にし得る酸性アミノ酸残基を含む配歹 lj」とは、 酸性アミノ酸の種類及び数がタンパク質全体の等電点を酸性にするだけ含まれてい る配列をいう。 R4部分としては、ァスパラギン酸やグルタミン酸を多く含む配列が好適 である。タンパク質の等電点は、構成するアミノ酸の種類と数に依存する。例えば、リ ジンやアルギニンなどの塩基性アミノ酸を多く含む場合は、塩基性アミノ酸の総数を 超える数のァスパラギン酸やグルタミン酸が必要である。タンパク質の等電点の計算 は、当業者であれば容易に計算により推定できる。好ましくは、上記一般式 R1-R2- R3-R4-R5のアミノ酸配列からなるタンパク質の等電点を 4〜5の間の値になるように、 ァスパラギン酸やグルタミン酸を多く含む配列を設計すればょレ、。 R4部分の配列の アミノ酸の数は限定されないが、 0すなわち存在しないか、又は;!〜 20個、好ましくは ；!〜 10個、あるいは 1〜20個、好ましくは 1〜10個である。例えば、ァスパラギン酸 1〜1 0個からなるポリアスパラギン酸を挙げることができる。
R5部分は、合成した一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列からなるタ ンパク質を精製するために利用される配列部分である。 R5部分の配列として、特定の 化合物と結合し得る配列、すなわちァフィ二ティータグ配列が挙げられる。該タグに 特異的な抗体を用いて該タグを含むタンパク質の精製を行なう場合、ェピトープタグ という場合もある。ァフィ二ティータグ配列として例えば、 2〜12個、好ましくは 4個以 上、さらに好ましくは 4〜7個、さらに好ましくは 5個若しくは 6個のヒスチジンからなる ポリヒスチジン配列が挙げられる。この場合、ニッケルをリガンドとしたニッケルキレート カラムクロマトグラフィーを利用することにより上記ポリペプチドを精製することができる
。また、ポリヒスチジンに対する抗体をリガンドとして固定化したカラムを用いたァフィ 二ティークロマトグラフィーによっても精製することができる。その他、ヒスチジンを含む 配列からなる HATタグ、 HNタグ等も用いること力 Sできる。以下 R5部分のタグとァフィ二 ティークロマトグラフィーに用いるリガンドの例を示す力 S、これらには限定されず、公知 のァフィ二ティータグ (ェピトープタグ）ならばいずれも利用することができる。他のァフ ィニティータグとして、 V5タグ、 Xpressタグ、 AU1タグ、 T7タグ、 VSV-Gタグ、 DDDDKタ グ、 Sタグ、 CruzTag09、 CruzTag22、 CruzTag41、 Glu-Gluタグ、 Ha.11タグ、 KT3タグ 等がある。 [0075] R5部分のタグ リガンド
グルタチオン- S-トランスフェラーゼ（GST)
Figure imgf000024_0001
マルトース結合タンパク質（MBP) アミロース
HQタグ (HQHQHQ；酉己歹 IJ番号 17)
Figure imgf000024_0002
Mycタグ（EQKLISEEDL；配列番号 18) 抗 Myc仇体
HAタグ (YPYDVPDYA；配列番号 19) 抗 HA抗体
FLAGタグ (DY DDDD ；配列番号 20) 抗 FLAG抗体
[0076] 一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を用いた固 定化反応により、 R3-R4-R5の配列部分は切り取られて反応用溶液中に残ることから 、固定化反応後に適切な洗浄作業により取り除くことができる。この際、 R5部分のァフ ィニティータグを利用して除去することもできる。従って、 R3-R4-R5の配列部分の特 性は、固定化されたタンパク質の機能等には全く影響しないものであり、上記条件を 満たせはどのような配列でも可能である。
[0077] 例えば、 R3、 R4及び R5の糸且合せの例として、
R3 = Cys-Ala,
R4 = Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (酉己歹 IJ番号 21)，
R5=His- His- His- His- His- His (配列番号 22)
が挙げられるが、本発明はこれには限定されない。
[0078] 本発明は、上記の Rl、 R2、 R3、 R4及び R5の各部分が満たすべき条件に従って、任 意の固定化対象タンパク質を固定化担体に固定化するための、一般式 R1-R2-R3- R4-R5で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を設計、作製する方法をも包含する
[0079] 例えば、該設計又は作成方法は、以下の (a)〜（e)の工程を含む。
(a) Rl部分の配列として、固定化対象タンパク質の配列であり、リジン残基及びシステ イン残基を含まなレヽことを特徴とする配列を選択し；
(b) R2部分の配列を存在させないか、または存在させ場合はリジン及びシスティン残 基以外のアミノ酸残基により構成されるスぺーサー配列を選択し；
(c) R3部分の配列として、システィン X (Xは、リジンもしくはシスティン以外のァミノ 酸残基）で表される 2残基のアミノ酸で構成される配列を選択し；
(d) R4部分の配列を存在させないか、または存在させる場合はリジン残基及びシステ イン残基を含まない配列であり、一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列 力もなるタンパク質全体の等電点を酸性側にし得る酸性アミノ酸残基を含むことを特 徴とする配列を選択し；そして
(e) R5部分の配列としてタンパク質を精製するためのァフィ二ティータグ配列を選択 する。
[0080] さらに、 R1部分が P-Qで表わされる場合は、 P部分の配列を、存在させないか、また は存在させる場合は (Ser又は Ala)_(Gly)nよりなる配列（nは 1から 10までの任意の整 数)を選択し、 Q部分の配列として、繰り返し単位を有するタンパク質の配列であり、リ ジン残基及びシスティン残基を含まなレ、配列単位が繰り返された配列とすればよ!/ヽ。
[0081] 一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、そのアミ ノ酸配列に基づいて、化学合成することができる。また、一般式 R1-R2-R3-R4-R5 で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DNA配列を化学合成などによ り作製すること力できる。また、その一部は天然由来の遺伝子から PCR法を用いて増 幅分離し、組み換えることなどにより作製することができる。このようにして作製される 一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列をコードする DNA配列の上流に転 写開始に必要な配列及び翻訳開始に必要な配列を連結し、さらに下流にストップコ ドンを連結した DNA配列を作製し、これを適切なベクター DNAに組み込み、宿主に 形質導入し、宿主内で発現させることにより、一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるァ ミノ酸配列からなる目的のタンパク質を作製することができる。
[0082] このようにして作製された上記一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列か らなるタンパク質は、上記のように R5部分の配列を利用することにより、発現宿主の無 細胞抽出液から分離精製することができる。この際、 R5部分の配列として、 R1部分の 配列に関らず同じ配列、例えばポリヒスチジン配列を利用することにより、上記、一般 式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列からなる任意のタンパク質に対して共 通した精製分離方法を適用できる。
[0083] 本発明は、一般式 R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であ つて、 R2部分の N末端側に固定化しようとする固定化対象タンパク質のアミノ酸配歹 IJR 1を連結させることにより、一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列からなる タンパク質を作製することができるタンパク質をも含む。さらに、本発明は、一般式 R
2- R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列をコードする DNAであって、該 DNAの 5'末端側 に固定化しようとする固定化対象タンパク質（アミノ酸配列 R1)をコードする DNAの塩 基配列を連結させることにより、一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列を コードする DNAを作製することができる塩基配列からなる DNAをも含む。これらの一 般式 R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び一般式 R2-R
3- R4-R5で表されるアミノ酸配列をコードする DNAは、固定化しようとする任意の固定 化対象タンパク質を連結した一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列から なるタンパク質を作製するための汎用の固定化用タンパク質作製のためのアミノ酸配 列又は塩基配列として利用することができる。この場合、 R5部分は共通なので、 R1部 分の配列にかかわらず、固定化用タンパク質を同じ手法で精製することができる。 本発明の一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列からなる固定化用タン パク質を用いた、固定化対象タンパク質の担体への固定化は特許第 3788828号公報 、特許第 2990271号公報、特許第 3047020号公報及び特開 2003-344396号公報等に 記載の方法に従って行なうことができる。具体的には、本発明の一般式 R1-R2-R3- R4-R5で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の R3部分のシスティン残基をシァノ 化によりシァノシスティンとし、シァノシスティンを有するタンパク質を一般式「NH2-Y」 (Yは任意の固定化担体を表す）で示される 1級アミノ基を官能基として有する固定化 担体と弱アルカリ条件下 (pH8〜10)で反応させることにより、 R1-R2部分が固定化担 体に固定化される。固定化担体に R1-R2部分が結合したものは、 Rl-R2-CO-NH-Y( 式中、 Yは上記の意味を有する。）で表され、 R2部分のカルボキシ末端一箇所で固定 化担体に結合している。なお、前記の固定化用タンパク質が R2部分を含まない場合 は、 R1-CO-NH-Y (式中、 Yは上記の意味を有する。）で表される。シァノ化反応は、 シァノ化試薬を用いて行うことができる。シァノ化試薬としては、 2-ニトロ- 5-チオシァ ノ女息杳酸 (2_nitro_5_thiocyanobennzoic acid (NTCB)) (Y.Degani, A.Ptchornik, Bio chemistry, 13,1-11 (1974)参照）又は、 1—シァノ _4_ジメチルァミノピリジニゥムテトラ フノレオ口硼酸 (1— cyano— 4dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate(CDAP))等を用 いること力 Sでさる。
[0085] また、特開 2003-344396号公報に記載の方法においては、一般式 R1-R2-R3-R4- R5で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を固定化担体に吸着させた後に、シス ティン残基をシァノ化し、上記の反応を行なわせ、固定化担体に R1-R2で表されるァ ミノ酸配列からなるタンパク質を固定化担体に固定化する。タンパク質を固定化担体 に吸着させるには、中性から弱アルカリ条件下 (pH7〜10)で、タンパク質と固定化担 体を反応させればよい。弱アルカリ反応条件化において、タンパク質は負に帯電し、 一方、固定化担体は正に帯電し、静電相互作用により互いに吸着結合する。本発明 は、一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を吸着させ た固定化担体をも包含する。本発明の一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸 配列からなるタンパク質を用いて、シァノシスティンを介した固定化反応により作製さ れる、 R1-R2部分を固定化したタンパク質固定化担体においては、固定化担体部分 に未反応の一級ァミンが多数存在する。固定化されたタンパク質にリジン残基又はシ スティン残基が存在する場合、残存の活性ァミンが本発明の固定化タンパク質の利 用を制限することがあり得る。し力もながら、本発明の方法により固定化されたタンパ ク質部分は、全くリジン残基及びシスティン残基を含まないことから、タンパク質部分 が残存した活性ァミンの影響を受けることなぐタンパク質を固定化した担体表面を 1 級ァミンのマスク剤で処理することができる。マスク剤としては、無水酢酸、無水マレイ ン酸等が好適である力 どのようなマスク剤であれ利用できる。従って、マスク剤の種 類によって本発明は限定されない。
[0086] 本発明は、さらに、上記方法で得られた、システィン残基及びリジン残基を含まない アミノ酸配列よりなるタンパク質を適当なリンカ一配列を介して、 1級アミノ基を有する 固定化担体とアミド (ペプチド）結合で強固に結合した固定化タンパク質及び固定化 タンパク質が固定化された担体を提供する。
[0087] 本発明に用いられる、 1級アミノ基を有する固定化担体としては、 1級アミノ基を有す る固定化担体であれば何でも用いることができる。本発明で「担体」とは、粒子状の担 体、板状やシート状の基板等タンパク質を固定化し得る不溶性のものならば、いずれ も含まれる。「固定化担体」は、「固定化基板」を含む。また、「固定化担体」を「不溶化 担体」ということもある。 1級アミノ基を有する市販の担体としては、アミノーセルロファ イン（生化学工業で販売）、 AF-アミノトョパール（TOSOHで販売）、 EAH-セファロー ス 4B及びリジン-セファロース 4B (アマシャムバイオサイエンスで販売）、ポラス 20NH ( ベーリンガーマンノヽィムで販売）などがある。また、 1級アミノ基を有するシラン化合物 (例えば、 3—ァミノプロピルメトキシシランなど）を用いてガラスビーズもしくはガラス平 板などに 1級アミノ基を導入し、利用することも可能である。
[0088] さらに、 1級アミノ基を繰り返し単位に有するポリマー化合物を固定化担体に導入す ることにより、担体単位体積当たりの 1級ァミノ基の含量を増大させることが可能であ る（特開 2004-345956号公報参照）。
[0089] 例えば、 1級アミノ基を繰り返し単位に有するポリマー化合物を固定化担体に導入 した担体としては、ポリアリルアミンをグラフトしたセル口ファインが知られている（参考 論文： Ung_Jin Kim, Shigenori uga, Journal of Chromatography A, 946, 283-289 (2 002)参照）。また、 CNBr活性化セファロース FF、 NHS活性化セファロース FF、化学的 に 1級ァミノ基と反応性を有する担体が知られており、これにポリアリルァミンなどの 1 級アミノ基を繰り返し単位に有するポリマー化合物を作用させることにより、ポリマー 化合物が担体に共有結合により結合した担体を作製できる。その際、 1級アミノ基を 繰り返し単位に有するポリマー化合物と活性化担体との混合比と適度に調製すること により、作製される担体における、固定化反応に利用できる 1級ァミノ基の含量を変 ィ匕させること力 Sでさる。
[0090] 一方、ポリマー化合物としては、 1級アミノ基を有し、それ以外の部分が、固定化さ れるタンパク質に実質的に不活性なものであれば用いることができる。市販のポリマ 一化合物としては、ポリアリルァミン、ポリ L—リジン等が利用可能である。従って、固 定化担体の種類により、本発明は限定されない。
実施例
[0091] 以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例により限定され ない。
[0092] 以下の実施例においては、下記の実験方法が共通的に用いられている。 [0093] [遺伝子合成]
実施例に記載されている遺伝子の合成は、特に記述している場合を除き、合成遺 伝子受託製造業者にて合成を行った。示した塩基配列にもとづき、 dsDNAを合成し p UC18vectorの BamHI-EcoRI siteへの揷入、取得されたクローンについて片鎖解析に よる配列を確認、塩基配列情報の照合、ミスマッチが確認された部位につ!/、ては Site directed mutagenesis等の手法により変異修正を実施、得られた取得したプラスミド D NA (約 1マイクログラム）が納入された。納入されたプラスミド中の目的部分に関して は、再度シーケンシングにより配列確認を行った。
[0094] [1アミノ酸置換変異体作製]
アミノ酸置換は、置換部位のアミノ酸をコードする DNA配列を目的のコドン配列に転 換して両方に 24塩基ずつ元の配列を持つ DNAプライマーとその相補 DNAプライマー を用レヽて、クイックチャンシ法 (Stratagene社の QuickChang Site-directed Mutagenesis kitに記載されている方法）に従って行った。
[0095] [タンパク質精製]
組換えプラスミドを形質転換した大腸菌 JM109株を、 2リツターの培地（20gの塩化ナ トリウム、 20gの酵母エキス、 32gのトリプトン、 lOOmgのアンピシリンナトリウムを含んで いる）で、 35°Cで一晩培養した。その後、培養液を 20分間低速遠心（毎分 5,000回転） することにより、湿重量 3〜5gの菌体を得た。これを、 20mlの 10mMのリン酸緩衝液（p H7.0)に懸濁し、フレンチプレス装置により菌体を破砕した後、 20分間高速遠心（毎 分 20,000回転)することにより、上清を分離した。得られた上清にストレプトマイシン硫 酸を最終濃度が 2%になるように加え 20分間撹拌後、 20分間高速遠心（毎分 20,000 回転)することにより、上清を分離した。この後、硫酸アンモニゥム処理を行い、得られ た上清をニッケルキレートカラム（GEヘルスケアバイオサイエンス社より購入）にァプ ライし、洗浄用緩衝液（5mMイミダゾール、 20mMリン酸ナトリウム、 0.5M塩化ナトリウム 、 pH7.4)を 200ml以上用いて、カラムを十分洗浄し、洗浄後、溶出用緩衝液 (0.5Mィ ミダゾール、 20mMリン酸ナトリウム、 0.5M塩化ナトリウム、 ρΗ7·4)を 20mlアプライするこ とにより、 目的のタンパク質を溶出した。その後、このタンパク質溶液力もイミダゾール を除去するため、 5リツターの 10mMリン酸緩衝液（ρΗ7·0)に対して透析を行った。透 析膜には MWCO3500 (Spectrum Laboratories社より購入）を用いた。透析後、遠心真 空乾燥機を用いて目的のタンパク質を乾燥させた。
[0096] [ヒト抗体 IgG分子との結合特性解析]
目的タンパク質の結合特性解析には、表面プラズモン共鳴バイオセンサーである Bi acore (ビアコア社）を用い、ビアコア社の提供するプロトコールに従って解析を行った
〇
[0097] ランニング緩衝液は、 10mM HEPES(pH7.4)、 150mM塩化ナトリウム、 5 μ M EDTA、 0.005% Surfactant P20 (ビアコア社）の組成のものを用い、あらかじめ脱気したものを 用いた。
[0098] センサーチップとしては、 SensorChip NTA (ビアコア社）を用いた。センサーチップ をランニング緩衝液にて十分平衡化した後、 5mM塩化ニッケル溶液を注入すること により、ニッケルイオンの配位を完成させた。その後、センサーチップを、組み換えタ ンパク質溶液 (ランニング緩衝液中、濃度 100 g/mL)を注入することにより、組み換 えタンパク質の固定化を行った。
[0099] 固定化組換えタンパク質とヒ HgGとの結合反応は、ランニング緩衝液を用いて 0.25 〜20 g/mLの範囲で 7種類の濃度になるように希釈 ·調製したヒ HgG (シグマ アル ドリツチ社)溶液を逐次注入し、引き続きランニング緩衝液に切り替えて送液を保持す ることにより、抗体の結合'解離現象を定量的に観測した。なお、送液流量は 20 し/ min、結合観測時間 (抗体溶液注入時間）は 4分間、解離観測時間は 4分間とした。 各濃度の抗体溶液を注入し、結合 ·解離現象を観測した後には、引き続き 6M塩酸グ ァニジン溶液を 3分間注入し、固定化されて!/、る組換えタンパク質に結合して!/、るヒト IgGをすベて解離させ、ランニング緩衝液で再生し、その後の測定に使用した。
[0100] 観測された表面プラズモン共鳴によるセンサー表面の質量変化の経時変化は、 Bia coreにより定義される単位 RUにより測定し、結合速度定数 (kass)、解離速度定数 (kdis )及び解離定数 (Kd=kass/kdis)を求めた。
[0101] [組換えタンパク質の固定化]
それぞれのタンパク質を、あらかじめ 1000倍量の 5mMのエチレンジァミン 4酢酸 (ED TA)を含む ρΗ8·0の 10mMリン酸緩衝液に対して 3回以上透析を行い、透析済みのタ ンパク質サンプルを透析に用いたのと同じ緩衝液で希釈することにより、各種濃度の タンパク質サンプルを調製した。
[0102] このようにして調製した固定化用タンパク質をァミノセル口ファイン（ァミン含有量 20
a moles NH2/ml)と混合し、 2時間以上室温で穏やかに攪拌させた。
[0103] 吸着したタンパク質のシスティンの SH基のシァノ化は、吸着固定化した担体を、 5m Mの EDTAを含む ρΗ7·0の 10mMリン酸緩衝液に懸濁し、最終濃度が 5mMになるよう に 2-ニトロ- 5-チオシァノ安息香酸 (NTCB)を加え、室温で 4時間反応させることにより 行った。その後、 1000回転で数秒間遠心して担体を沈め上澄み液を取り除き、 pH7.0 の 10mMリン酸緩衝液に懸濁する、という操作を 5回繰り返すことにより NTCB等を除 去した。
[0104] シァノ化処理した吸着固定化タンパク質を、 1000回転で数秒間遠心して担体を沈 め上澄み液を取り除!/、た後、 5mMの EDTAを含む ρΗ9·5の 10mM硼酸緩衝液に懸濁 し、 24時間以上室温で穏やかに攪拌させることにより、固定化反応を行った。その後 、 1000回転で数秒間遠心して担体を沈め上澄み液を取り除き、 1M KC1を含む pH8.0 の 10mMリン酸緩衝液に懸濁する、という操作を 5回繰り返すことで、固定化反応の副 反応生成物を除去した。
[0105] 固定化担体上の未反応の 1級ァミンは、無水酢酸によるァセチル化の処理を行つ た。固定化されたタンパク質中には、リジン残基が含まれないため、ァセチル化の処 理により、ァミノ末端のァセチル化以外の修飾は起こらない。また、一般にァミノ末端 は結合活性にほとんど寄与しないことから、この操作による固定化されたリガンドタン ノ ク質の機能低下は無視できるものと考えられる。
[0106] [固定化担体の IgG結合容量の測定]
固定化担体 10 1と 990 1のヒト IgG (2mg)とを pH7.0の 10mMリン酸緩衝液中で混合 し、 12時間室温で穏やかに攪拌した後、 2mlの 1M KC1を含む pH7.0の 10mMリン酸緩 衝液で 5回洗浄した。 280匪の吸光度を測定することにより、最後の洗浄液にタンパ ク質が含まれなレ、ことを確認した。
[0107] 担体からの、ィムノグロブリン Gの遊離は、洗浄後遠心分離により集めた固定化担 体に、 0.1M酢酸溶液 lmlを加えることにより行った。溶液中に遊離されたヒ HgGの量 を、 280nmの吸光度を測定し、その吸光度係数（Ε2801%=14·0)を用いて、遊離された ヒ HgG量を測定し、これを用いた担体の量で割ることにより IgG結合容量 (mg/ml担体） を求めた。
[0108] 〔実施例 1〕スタフイロコッカス由来のプロテイン Aのドメイン A由来の配列を基にしたシ スティン及びリジン残基を含まない配列への転換と固定化用配列への転換
スタフイロコッカス由来のプロテイン Aのドメイン A由来の配列は、配列番号 7に示さ れる配列である。
[0109] この配列番号 7に示されるアミノ酸配列を基に、
Met-Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Lys-Glu-Gln-Gln-
Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro-
Asn_Leu_Asn_Glu_Glu_Gln_Arg_Asn_Gly_Phe_
ile_Gln_Ser_Leu_Lys_Asp_Asp_Pro_Ser_Gln_
¾er-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-lys-lys-
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Aia-Pro-Gly-Gly-Gly- ly-Gly― Cys_Ala_Asp_Asp_Asp_Asp_Asp_His_
His_His_His_His_His
で示されるアミノ酸配歹 IJ (配列番号 10)をコードする配列に適切な転写開始機能及び 翻訳開始機能及びベクターに組み込むための制限酵素配列を含む形で下記の DN A配列 (配列番号 11)を設計し、合成した。
GGATCCTTGA CAATATCTTA ACTATCTGTT ATAATATATT GACCAGGTTA ACTAACTAAG CAGCAAAAGG AGGAACGACT ATGGCTGATA ACAATTTCAA CAAAGAACAA CAAAATGCTT TCTATGAAAT CTTGAATATG CCTAACTTAA ACGAAGAACA ACGCAATGGT TTCATCCAAA GCTTAAAAGA TGACCCAAG C CAAAGTGCTA ACCTATTGTC AGAAGCTAAA AAGTTAAATG AATCTCAAG C ACCGAAAGGT GGCGGTGGCT GCGCTGATGA CGATGACGAT GACCATCA TC ACCACCATCA TTAAGAATTC C
pPAAは、配列番号 11に示す配列力 ¾UC18vectorの BamHI-EcoRI siteへ揷入され たものである。 [0110] pPAAを形質転換した大腸菌 JM109株から、上記記載した方法に従って、タンパク 質を分離精製した。その結果、約 150mg/2L培養の収量で目的のタンパク質が得ら れた。得られたタンパク質のァミノ末端配列及び質量数分析を行った結果、アミノ末 端がァラニンであり、また得られた精製タンパク質の質量分析器を用いて測定した質 量数が 8,540ダルトンであったことから、ァミノ末端配列として、メチォニン-ァラニンな る配列を有する配列の組換えタンパク質を大腸菌で発現した場合に、通常見られる 開始コドンに対応するァミノ末端のメチォニン残基のプロセッシングを受けていること が確かめられた。
[0111] 次に、配列番号 7中の各々リジン残基、ァミノ末端から 7番目、 35番目、 49番目、 50 番目、及び 58番目に関して、まず、 58番目をグリシンに置換した変異体を作製した。 アミノ酸置換は、 58番目のリジンをコードする DNA配列である AAAを GTTに転換して 両方に 24塩基ずつ元の配列を持つ DNAプライマーとその相補 DNAプライマーを用 レヽて、クイックテヤンン法 (Stratagene社の QuickChang Site-directed Mutagenesis kit に記載に記載されている方法）にしたがって、 pPAAを铸型として、変異操作を行い、 目的の変異を有するプラスミドを分離した (PPAA-K58Gと名づけた)。
[0112] さらに、 pPAA-K58Gを铸型として 7番目に対応するアミノ酸置換については、リジン 残基をコードする DNAをそれぞれ CGTコドンに転換した DNAプライマーとその相補 D NAを合成し、それをプライマーとして用いて、それぞれクイックチャンジ法により変異 体を作製し、 目的の変異を有するプラスミドを作製した (pPAA-RKKKGと名づけた)。 これを铸型として、 35番目（pPAA-RRKKGと名付けた）、次いでは 49番目（pPAA-RRR KGと名づけた)、さらに 50番目 (pPAA-RRRRGと名付けた)というようにして、リジン残基 をアルギニン残基に転換した変異体を発現するプラスミドを作製した。最終的に得ら れた組換えプラスミド pPAA-RRRRGは、野生型由来のプロテイン断片配列中のすべ てのリジン残基がアルギニンもしくはグリシンに転換された配歹 IJ (即ち、配列番号 1で 示される配列)からなる、プロテイン A断片変異体の発現プラスミドである。
[0113] 組換えプラスミド pPAA-RRRRGで形質転換された大腸菌は、配列番号 1で示される 配列からなるタンパク質を発現する。その組換えタンパク質は、上記の方法と同様に して、大腸菌の培養、菌体破砕、前処理、ニッケルキレートカラムクロマトグラフィーの 操作により、均一に精製された。
[0114] さらに、組換えプラスミド pPAA-RRRRGを铸型として、 7番目、 35番目、 49番目、及 び 58番目に 1アミノ酸置換をそれぞれ行い、各種変異体を作製し、そのタンパク質を 作製した。
[0115] 得られた各種タンパク質について、ビアコアを用いて、ヒ HgGとの結合活性を調べ た。
[0116] 結果を、表 1に示す。
[0117] 野生型以外は、すべて、プロテイン Aの Aドメイン由来の配列にシスティン及びリジ ンを含まない配列である。このように、使用するアミノ酸残基の種類に制限を加えても 、ヒ HgGとの結合活性を保有していることが明らかになった。
[0118] また、リジン残基の多くをアルギニンに変えた場合、結合特性に大きな変化が認め られないことが明ら力、となった。
[0119]
[表 1]
作製した各種タンパク質の IgG結合パラメ一タのまとめ
Figure imgf000035_0001
得られたタンパク質を、ァミノセル口ファイン（生化学工業より購入）を 1級ァミン担体 として用いて固定化した。得られた固定化担体が示すヒ HgG結合容量の測定は、実 施例 4に示している。
[0121] 〔実施例 2〕ストレプトコッカス由来のプロテイン Gの G1ドメイン由来の配列を基にした システィン及びリジン残基を含まない配列への転換と固定化用配列への転換 ストレプトコッカス由来のプロテイン Gの G1ドメイン由来の配列は、配列番号 8に示さ れる配列である。
[0122] 上記実施例において、すべてのリジン残基をアルギニン残基に置換しても元の機 能を保持されることが示された。従って、この配列番号 8に示されるアミノ酸配列を基 に、リジン残基をアルギニン残基に置換すると共に、開始コドン、スぺーサー配列、固 定化反応のためのシスティン-ァラニン配歹 IJ、さらに、ポリアスパラギン酸配列とポリヒ スチジン配列を付加した下記の配列
Met_Ala_Tyr_Arg_Leu_Ile_Leu_Asn_Gly_Arg_Tnr
Leu_Arg_Gly_Glu_Thr_Tnr_Thr_Glu_Aia_Val
Asp-Ala-Ala- Thr- Ala- Glu-Arg-Va卜 Phe-Arg
Gin- yr-Ala-Asn-Asp-Asn- ly- v al-Asp- ly
Glu- Trp- Thr- Tyr- Asp- Asp- Ala- Thr- Arg- Thr
Phe-Thr-Val-Thr-Glu-Arg-Pro-Glu-Val-Ile
Asp_Ala_Ser_Glu_Leu_Thr_Pro_Ala_Val_Thr
Gly-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp
Asp-Asp-His-His-His-His-His-His
で示されるアミノ酸配歹 IJ (配列番号 12)を設計した。配列番号 12のアミノ酸配列をコー ドする配列に適切な転写開始機能及び翻訳開始機能及びベクターに組み込むため の制限酵素配歹 IJを含む形で下記の DNA配列 (配列番号 13)を設計し、合成した。 pPGは、配列番号 13に示す配列力 ¾UC18vectorの BamHI-EcoRI
siteへ揷入されたものである。
[0123] pPGを形質転換した大腸菌 JM109株から、上記の方法に従って、タンパク質を分離 精製した。その結果、約 120mg/2L培養の収量で目的のタンパク質が得られた。得ら れたタンパク質のァミノ末端配列及び質量数分析を行った結果、ァミノ末端がァラニ ンであり、また得られた精製タンパク質の質量分析器を用いて測定した質量数が 9,69 8ダルトンであったことから、ァミノ末端配列として、メチォニン -ァラニンなる配列を有 する配列の組換えタンパク質を大腸菌で発現した場合に、通常見られる開始コドンに 対応するァミノ末端のメチォニン残基のプロセッシングを受けていることが確かめられ た。
[0124] 得られたタンパク質について、ビアコアを用いて、ヒ HgGとの結合活性を調べた。
[0125] 結果を、表 2に示す。この表には、参考のために、プロテイン A変異体タンパク質の 値を比較のために示して!/、る。
[0126] 表 2に示されるように、強いヒ HgG結合活性を示した。
[0127] [表 2]
作製したタンパク質の IgG結合パラメ一タのまとめ
Figure imgf000037_0001
[0128] 得られたタンパク質を、ァミノセル口ファイン (生化学工業より購入）を 1級ァミン担体 として用いて固定化した。得られた固定化担体が示すヒ HgG結合容量の測定は、実 施例 4に示している。
[0129] 〔実施例 3〕P印 tostreptococcus由来のプロテイン Lの B 1ドメイン由来の配列を基にし たシスティン及びリジン残基を含まない配列への転換と固定化用配列への転換
P印 tostreptococcus由来のプロテイン Lの B1ドメイン由来の配列は、配列番号 9に示 される配列である。
[0130] 上記実施例において、すべてのリジン残基をアルギニン残基に置換しても元の機 能を保持されることが示された。従って、この配列番号 9に示されるアミノ酸配列を基 に、リジン残基をアルギニン残基に置換すると共に、開始コドン、スぺーサー配列、固 定化反応のためのシスティン-ァラニン配歹 |J、さらに、ポリアスパラギン酸配列とポリヒ スチジン配列を付加した下記の配列
Met-Ala-Thr-Ile-Arg-Ala-Asn-Leu-Ile-Tyr-Ala
Asp_Gly_Arg_Thr_Gln_Thr_Aia_Glu_Pne_Arg
Gly-Thr- Phe- Glu- Glu- Ala- Thr- Ala- Glu- Ala
Tyr_Arg_Tyr_Ala_Asp_Leu_Leu_Ala_Arg_Glu
Asn-Gly-Arg-Tyr- i r_Vaト Asp_Vaト Ala_Asp
Arg_Gly_Tyr_Thr_Leu_Asn_Ile_Arg_Phe_Ala
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Asp-Asp-Asp
Asp-Asp-Asp-His-His-His-His-His-His
で示されるアミノ酸配歹 IJ (配列番号 14)を設計した。配列番号 12のアミノ酸配列をコー ドする配列に適切な転写開始機能及び翻訳開始機能及びベクターに組み込むため の制限酵素配歹 IJを含む形で下記の DNA配列 (配列番号 15)を設計し、合成した。
Figure imgf000038_0001
ACCACCATCATTAAGAATTC
pPLは、配列番号 15に示す配列力 ¾UC18vectorの BamHI-EcoRI siteへ揷入された ものである。
pPLを形質転換した大腸菌 JM109株から、上記の方法に従って、タンパク質を分離 精製した。その結果、約 100mg/2L培養の収量で目的のタンパク質が得られた。得ら れたタンパク質のァミノ末端配列及び質量数分析を行った結果、ァミノ末端がァラニ ンであり、また得られた精製タンパク質の質量分析器を用いて測定した質量数が 8,78 2ダルトンであったことから、ァミノ末端配列として、メチォニン -ァラニンなる配列を有 する配列の組換えタンパク質を大腸菌で発現した場合に、通常見られる開始コドンに 対応するァミノ末端のメチォニン残基のプロセッシングを受けていることが確かめられ た。
[0132] 得られたタンパク質について、ビアコアを用いて、ヒ HgGとの結合活性を調べた。
[0133] 結果を、表 3に示す。この表には、参考のために、プロテイン A変異体タンパク質の 値を比較のために示して!/、る。
[0134] 表 3に示されるように、強いヒ HgG結合活性を示した。
[0135] [表 3]
作製したタンパク質の IgG結合パラメータのまとめ
Figure imgf000039_0001
[0136] 得られたタンパク質を、ァミノセル口ファイン (生化学工業より購入）を 1級ァミン担体 として用いて固定化した。得られた固定化担体が示すヒ HgG結合容量の測定は、実 施例 4に示している。
[0137] 〔実施例 4〕
上記実施例で得られた、配列番号 1、 2及び 3で示されるアミノ酸配列のタンパク質（ それぞれ、約 6mg)を用いて、シァノシスティンを介した結合反応により、 1mlのアミノセ ルロファインに固定化した。この反応により、各々配列番号 4、 5及び 6で示される配 列がカルボキシ末端でァミノセル口ファイン上の 1級ァミノ基とアミド結合で配向制御 固定化された固定化担体が作製された。作製した固定化担体 (10 ΐ)を用いて、ヒ Hg Gに対する結合容量を測定したところ、表 4に示す結果が得られた。このように、配向 制御固定化してもヒ HgGに対する結合能を示すことが確かめられた。
[0138] [表 4] 固定化担体 （タンパク質のァミノ酸配列） ヒ ト TgG結合量 （mg/ml担体）
配列番号 4 ( 配列番号 1 ) 12
配列番号 5 ( 配列番号 2 ) 10
配列番号 6 (—配列番号 3 ) 3 〔実施例 5〕スタフイロコッカス由来のプロテイン Aのドメイン A由来の配列を基にしたシ スティン及びリジン残基を含まない配列を繰り返し有するタンパク質の作製及びその I gG結合活性の測定
繰り返し配列を導入するために、プロテイン Aのドメイン A由来の配列を基にしたシス ティン及びリジン残基を含まなレ 配列部分をコードする遺伝子を重複させ、新たに制 限酵素切断配列として Cfr9I切断配列（CCCGGG)を一箇所含み、全体を B HIと Ec oRI切断によりベクターに揷入できる以下に示す DNA配列（配列番号 27)を設計合成 した。
Figure imgf000040_0001
(配列番号 27)
pAADは、配列番号 27に示す配列力 ¾UC18vectorの BamHI-EcoRI siteへ揷入され たものである。 pAADを大腸菌で発現させることにより、配列番号 24に示す配列が 2 回繰り返した配列を有する一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列において R1部分の配列が P-Qで表わされ、
P = Ser- Gly-Gly-Gly-Gly (配列番号 23)
Q = (Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln- Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro- Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Pne- Ile- ln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-¾er- ln- Ser_Ala_Asn_Leu_Leu_Ser_Glu_Ala_Arg_Arg_
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly)n (nは、 2から 5までの任意の整数、力、つこ内の 配列は配列番号 24)
R2 = Gly-Gly-Gly-Gly (配列番号 16)
R3 = Cys-Ala
R4 = Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (配列番号 21)
R5 = His- His- His- His- His- His (配列番号 22)
であって、 n=2であらわされるタンパク質が発現された。次いで、上記の方法に従って 、タンパク質を分離精製した。得られたタンパク質のァミノ末端配列及び質量数分析 を行った結果、ァミノ末端がセリンであり、また得られた精製タンパク質の質量分析器 を用いて測定した質量数が 15,545ダルトンであることから、ァミノ末端配列として、メチ ォニン-セリンなる配列を有する配列の組換えタンパク質を大腸菌で発現した場合に 、通常見られる開始コドンに対応するァミノ末端のメチォニン残基のプロセッシングを 受けていることが確かめられた。
[0141] 更に、 nが 3以上である繰り返し配列を導入するために、両端に Cfr9I切断配列（CC CGGG)を有する以下の DNA配列を合成した（配列番号 28)
Figure imgf000041_0001
GTTTAAATGAATCTCAAGCCCCGGG (酉己歹 IJ番号 28)
[0142] これを、 Cfr9Iで切断した後、 Cfr9Iで切断した pAADと混ぜ合わせ、 T4DNAリガーゼ で結合することにより、 Cfr9Iで切断した配列番号 28の DNA配列力 1個または複数 個結合した組換えプラスミドを作製し、これを、 BamHIと EcoRIで切断し、ァガロース電 気泳動で分離することにより、約 0.68キロ塩基対、約 0.86キロ塩基対、約 1.05キロ塩 基対及びそれ以上の大きさのいくつか大きさの DNA断片を得ることができた、その各 々の DNA断片を、ゲルから分離し、これを pUC18ベクターの BamHI-EcoRI部位に導 入し、組換えプラスミドを分離した。約 0.68キロ塩基対、約 0.86キロ塩基対、及び約 1. 05キロ塩基対の DNA断片を導入したプラスミド（各々、 pAA3T，pAA4Q，pAA5Pと称し た）は、配列番号 28に相当する部分力 S、それぞれ、 1個、 2個、及び 3個結合されて おり、その結果、上記 Qの配列において、 n=3、 4及び 5に相当するアミノ酸配列をコ ードすることが明ら力、となった。また、組換えプラスミド pAA3T，pAA4Q，pAA5Pを形質 転換した大腸菌 JM109株は、それぞれ、約 22キロダルトン、約 29キロダルトン、約 36キ 口ダルトンのタンパク質を大量に発現蓄積していることが示された。
pAA3Tの BamHI-EcoRI部位の部分の塩基配列を調べたところ、以下の DNA配列で あることが明らかとなった。
Figure imgf000042_0001
CATTAAGAATTC (酉己歹 IJ番号 29)
pAA3Tを形質転換した大腸菌 JM109株を用いて、上記の方法に従って、タンパク質 を分離精製した。得られたタンパク質のァミノ末端配列及び質量数分析を行った結 果、ァミノ末端がセリンであり、また得られた精製タンパク質の質量分析器を用いて測 定した質量数が 22， 193ダルトンであることから、ァミノ末端配列として、メチォニン-セリ ンなる配列を有する配列の組換えタンパク質を大腸菌で発現した場合に、通常見ら れる開始コドンに対応するァミノ末端のメチォニン残基のプロセッシングを受けている ことが確かめられた。 [0145] 得られたタンパク質について、ビアコアを用いて、ヒ HgGとの結合活性を調べた。
[0146] 結果を、表 5に示す。この表には、参考のために、 n=lで示される変異体タンパク質 の値を比較のために示している。繰り返し配列を取ることにより、 IgGとの結合力 Kdの 値がより小さくなり、結合力が増すことが明らかになった (表 5)。
[0147] [表 5]
プラスミ ド名 繰り返し単位の数 k assDrV']xio- 5 koff [s-'],io» KdtWxio'"
pPAA-RRRRG n= l 1. 84 11. 7 6. 34 pAAD n=2 5. 75 18. 3 3. 18 pAA3T n=3 7. 86 13. 3 1. 69
[0148] 〔実施例 6〕ストレプトコッカス由来のプロテイン Gの Glドメイン由来の配列を基にした システィン及びリジン残基を含まない配列を繰り返し有するタンパク質の作製及びそ の IgG結合活性の測定
繰り返し配列を導入するために、プロテイン Gの G1ドメイン由来の配列を基にしたシ スティン及びリジン残基を含まな!/、配列部分をコードする遺伝子を重複させ、新たに 制限酵素切断配列として Cfr9I切断配列（CCCGGG)を一箇所含み、全体を B匪 HIと EcoRI切断によりベクターに揷入できる以下に示す DNA配列（配列番号 30)を設計合 成した。
Figure imgf000043_0001
AGAATTC (配列番号 30)
[0149] pGGDは、配列番号 30に示す配列力 ¾UC18vectorの BamHI-EcoRI siteへ揷入され たものである。 pGGDを大腸菌で発現させることにより、配列番号 25に示す配列が 2 回繰り返した配列を有する一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列において 、 R1部分の配列が P-Qで表わされ、
P = 存在しない
Q = (Ala_Tyr_Arg_Leu_Ile_Leu_Asn_Giy_Arg_Thr_
Leu_Arg_Gly_Glu_Thr_Tnr_Thr_Glu_Aia_Va卜
Asp-Ala-Ala- Thr- Ala- Glu-Arg-Va卜 Phe-Arg- Gin- yr-Ala-Asn-Asp-Asn- ly- v al-Asp- ly- Glu- Trp- Thr- Tyr- Asp- Asp- Ala- Thr- Arg- Thr- Phe-Thr-Val-Thr-Glu-Arg-Pro-Glu-Val-Ile-
Asp-Ala- Ser- Glu- Leu- Thr- Pro- Ala- Va卜 Thr- Pro- Gly)n(nは、 2から 5までの任意の 整数、力、つこ内の配列は配列番号 25)
R2 = Gly-Gly-Gly-Gly (配列番号 16)
R3 = Cys-Ala
R4 = Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (配列番号 21)
R5 = His- His- His- His- His- His (配列番号 22)
であって、 n=2であらわされるタンパク質が発現された。次いで、上記の方法に従って 、タンパク質を分離精製した。得られたタンパク質のァミノ末端配列及び質量数分析 を行った結果、ァミノ末端がァラニンであり、また得られた精製タンパク質の質量分析 器を用いて測定した質量数が 17,616ダルトンであることから、ァミノ末端配列として、メ チォニン-ァラニンなる配列を有する配列の組換えタンパク質を大腸菌で発現した場 合に、通常見られる開始コドンに対応するァミノ末端のメチォニン残基のプロセッシン グを受けていることが確かめられた。
[0150] 更に、 nが 3以上の繰り返し配列を導入するために、両端に Cfr9I切断配歹 IJ (CCCGG G)を有する以下の DNA配列を合成した（配列番号 31) TGCTGTTACTCCCGGG (酉己歹 lj番号 31)
[0151] これを、 Cfr9Iで切断した後、 Cfr9Iで切断した pAADと混ぜ合わせ、 T4DNAリガーゼ で結合することにより、 Cfr9Iで切断した配列番号 28の DNA配列力 1個または複数個 結合した組換えプラスミドを作製し、これを、 BamHIと EcoRIで切断し、ァガロース電気 泳動で分離することにより、約 0.79キロ塩基対、約 1.0キロ塩基対、約 1.2キロ塩基対 及びそれ以上の大きさのいくつか大きさの DNA断片を得ることができた、その各々の DNA断片を、ゲルから分離し、これを pUC18ベクターの BamHI-EcoRI部位に導入し、 組換えプラスミドを分離した。約 0.79キロ塩基対、約 1.0キロ塩基対、及び約 1.2キロ塩 基対の DNA断片を導入したプラスミド（各々、 pGG3T，pGG4Q，pGG5Pと称した）は、配 列番号 31に相当する部分が、それぞれ、 1個、 2個及び 3個結合されており、その結 果、上記 Qの配列において、 n=3、 4及び 5に相当するアミノ酸配列をコードすることが 明らかとなった。また、組換えプラスミド pGG3T，pGG4Q，pGG5Pを形質転換した大腸 菌 JM109株は、それぞれ、約 25キロダルトン、約 33キロダルトン、約 41キロダルトンのタ ンパク質を大量に発現蓄積して!/、ることが示された。
[0152] pGG3Tの BamHI-EcoRI部位の部分の塩基配列を調べたところ、以下の DNA配列で あることが明らかとなった。
CACCATCATTAAGAATTC (配列番号 32)
[0153] pGG3Tを形質転換した大腸菌 JM109株を用いて、上記の方法に従って、タンパク 質を分離精製した。得られたタンパク質のァミノ末端配列及び質量数分析を行った 結果、ァミノ末端がァラニンであり、また得られた精製タンパク質の質量分析器を用い て測定した質量数が 25,534ダルトンであることから、ァミノ末端配列として、メチォニン -ァラニンなる配列を有する配列の組換えタンパク質を大腸菌で発現した場合に、通 常見られる開始コドンに対応するァミノ末端のメチォニン残基のプロセッシングを受け ていることが確かめられた。
[0154] 得られたタンパク質について、ビアコアを用いて、ヒ HgGとの結合活性を調べた。
[0155] 結果を、表 6に示す。この表には、参考のために、 n=lで示される変異体タンパク質 の値を比較のために示している。繰り返し配列を取ることにより、 IgGとの結合力 Kdの 値がより小さくなり、結合力が増すことが明らかになった (表 6)。
[0156] [表 6]
プラスミ ド名 繰り返し単位の数 k ass[lTV']xlO- s koff -'Juo" Kd[M]xio'»
pPG n= 1 4. 01 15. 4 3. 84
pGGD n=2 8. 64 10. 0 1. 15
pGG3T n=3 11. 2 7. 63 0. 68
[0157] 〔実施例 7〕 Peptostreptococcus由来のプロテイン Lの B 1ドメイン由来の配列を基にし たシスティン及びリジン残基を含まない配列を繰り返し有するタンパク質の作製及び その IgG結合活性の測定
繰り返し配列を導入するために、プロテイン Lのドメイン B1由来の配列を基にしたシ スティン及びリジン残基を含まな!/、配列部分をコードする遺伝子を重複させ、新たに 制限酵素切断配列として Cfr9I切断配列（CCCGGG)を一箇所含み、全体を B匪 HIと EcoRI切断によりベクターに揷入できる以下に示す DNA配列（配列番号 33)を設計合 成した。
Figure imgf000047_0001
(配列番号 33)
pLLDは、配列番号 33に示す配列力 ¾UC18vectorの BamHI-EcoRI siteへ揷入され たものである。 pLLDを大腸菌で発現させることにより、配列番号 26に示す配列が 2回 繰り返した配列を有する一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列において、 R1部分の配列が P-Qで表わされ、
P = 存在しない
Q = (Ala-Thr- Ile-Arg-Ala- Asn-Leu- Ile-Tyr- Ala
Asp_Gly_Arg_Thr_Gin_Tnr_Ala_Glu_Phe_Arg
Gly-Thr- Phe- Glu- Glu- Ala- Thr- Ala- Glu- Ala
Tyr_Arg_Tyr_Ala_Asp_Leu_Leu_Ala_Arg_Glu
Asn_Gly_Arg_Tyr_Thr_Vaト Asp_Vaト Ala_Asp
Arg_Gly_Tyr_Thr_Leu_Asn_Ile_Arg_Phe_Ala
Pro-Gly-)n (nは、 2から 5までの任意の整数、かっこ内の配列は配列番号 26) R2 = Gly-Gly-Gly-Gly (配列番号 16)
R3 = Cys-Ala
R4 = Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (配列番号 21) R5 = His- His- His- His- His- His (配列番号 22)
であって、 n=2であらわされるタンパク質が発現された。次いで、上記の方法に従って 、タンパク質を分離精製した。得られたタンパク質のァミノ末端配列及び質量数分析 を行った結果、ァミノ末端がァラニンであり、また得られた精製タンパク質の質量分析 器を用いて測定した質量数が 15,779ダルトンであることから、ァミノ末端配列として、メ チォニン-ァラニンなる配列を有する配列の組換えタンパク質を大腸菌で発現した場 合に、通常見られる開始コドンに対応するァミノ末端のメチォニン残基のプロセッシン グを受けていることが確かめられた。
[0159] 更に、 nが 3以上の繰り返し配列を導入するために、両端に Cfr9I切断配列（CCCGG G)を有する以下の DNA配列（配列番号 34)を合成した。
Figure imgf000048_0001
[0160] これを、 Cfr9Iで切断した後、 Cfr9Iで切断した pAADと混ぜ合わせ、 T4DNAリガーゼ で結合することにより、 Cfr9Iで切断した配列番号 34の DNA配列力 1個または複数 個結合した組換えプラスミドを作製し、これを、 BamHIと EcoRIで切断し、ァガロース電 気泳動で分離することにより、約 0.70キロ塩基対、約 0.89キロ塩基対、約 1.1キロ塩基 対及びそれ以上の大きさのいくつか大きさの DNA断片を得ることができた、その各々 の DNA断片を、ゲルから分離し、これを pUC18ベクターの BamHI-EcoRI部位に導入 し、組換えプラスミドを分離した。約 0.70キロ塩基対、約 0.89キロ塩基対、及び約 1.1キ 口塩基対の DNA断片を導入したプラスミド (各々、 pLL3T，pLL4Q，pLL5Pと称した）は、 配列番号 34に相当する部分が、それぞれ、 1個、 2個及び 3個結合されており、その 結果、上記 Qの配列において、 n=3、 4及び 5に相当するアミノ酸配列をコードすること が明らかとなった。また、組換えプラスミド pLL3T，pLL4Q，pLL5Pを形質転換した大腸 菌 JM109株は、それぞれ、約 23キロダルトン、約 30キロダルトン、約 37キロダルトンのタ ンパク質を大量に発現蓄積して!/、ることが示された。
[0161] pLL3Tの BamHI-EcoRI部位の部分の塩基配列を調べたところ、以下の DNA配列で あることが明らかとなった。
Figure imgf000049_0001
[0162] pLL3Tを形質転換した大腸菌 JM109株を用いて、上記の方法に従って、タンパク質 を分離精製した。得られたタンパク質のァミノ末端配列及び質量数分析を行った結 果、ァミノ末端がァラニンであり、また得られた精製タンパク質の質量分析器を用いて 測定した質量数が 22,751ダルトンであることから、ァミノ末端配列として、メチォニン- ァラニンなる配列を有する配列の組換えタンパク質を大腸菌で発現した場合に、通 常見られる開始コドンに対応するァミノ末端のメチォニン残基のプロセッシングを受け ていることが確かめられた。
[0163] 得られたタンパク質について、ビアコアを用いて、ヒ HgGとの結合活性を調べた。
[0164] 結果を、表 7に示す。この表には、参考のために、 n=lで示される変異体タンパク質 の値を比較のために示している。繰り返し配列を取ることにより、 IgGとの結合力 Kdの 値がより小さくなり、結合力が増すことが明らかになった。繰り返し配列を取ることによ り、 IgGとの結合力 Kdの値がより小さくなり、結合力が増すことが明らかになった (表 7) [0165] [表 7]
プラスミ ド名 繰り返し単位の数 kassDTs koff[s χιひ d ]xio10 pPL n=l 1.5】 31.2 20.6
pLLD n-2 2.46 26.4 13.4
pLL3T n=3 3.01 23.7 7.88 産業上の利用可能性
[0166] 本発明の一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表される配列を利用して、固定化対象のタ ンパク質を固定化担体に配向を制御した状態で効率的に固定化することができ、疾 患の診断等の医学の分野で用いる診断用タンパク質固定化担体、固定化酵素等と して用いること力 Sでさる。
配列表フリーテキスト
[0167] 配列番号;!〜 6、 10—23, 27—35 合成

Claims

請求の範囲
[1] 一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列
[式中、配列は、ァミノ末端側からカルボキシ末端側に向力、う配列を示し、
R1部分の配列は、固定化対象タンパク質の配列であり、リジン残基及びシスティン 残基を含まな!/、ことを特徴とする配列であり；
R2部分の配列は存在しなくてもよぐ存在する場合はリジン及びシスティン残基以 外のアミノ酸残基により構成されるスぺーサー配列であり；
R3部分の配列はシスティン—X (Xは、リジン及びシスティン以外のアミノ酸残基）で 表される 2残基のアミノ酸で構成される配列であり；
R4部分の配列は存在しなくてもよぐ存在する場合はリジン残基及びシスティン残 基を含まない配列であり、一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列からなる タンパク質全体の等電点を酸性側にし得る酸性アミノ酸残基を含むことを特徴とする 配列であり；そして
R5部分の配列はタンパク質を精製するためのァフィ二ティータグ配列である] 力、らなるタンパク質であって、 R1-R2で表される部分をそのカルボキシ末端の 1箇所で 、 1級アミノ基を官能基として有する固定化担体に固定化するために用いるタンパク 質。
[2] 一般式 R1-R2-R3-R4-R5のアミノ酸配列において、 R1部分の配列力 S、天然由来 のタンパク質のアミノ酸配歹 IJ、又はそのアミノ酸配列中のすべてのリジン残基及びシ スティン残基を、リジン残基及びシスティン残基以外のアミノ酸残基に置換することに より得られる、リジン残基及びシスティン残基を含まな!/、アミノ酸配列に改変されたァ ミノ酸配列からなるタンパク質であって、前記天然由来のタンパク質と同等の機能を 有するタンパク質のアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項 1に記載のタンパク 質。
[3] 一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列において、 R2部分の配列力 1 〜10個のグリシンからなる配列であることを特徴とする、請求項 1に記載のタンパク質
〇
[4] 一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列において、 R4部分の配列力 S、ァ スパラギン酸及び/又はグルタミン酸のアミノ酸残基からなるアミノ酸残基数 1〜10個 の配列であることを特徴とする、請求項 1に記載のタンパク質。
一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列において、 R5部分の配歹 IJが、 4 個以上のヒスチジン残基からなるアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項 1に記 載のタンパク質。
一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列において、 R1部分の配列が抗 体分子と特異的に相互作用する機能を有することを特徴とする、請求項;!〜 5のいず れカ、 1項に記載のタンパク質。
下記のアミノ酸配歹 IJ (配列番号 1)からなる請求項 1記載のタンパク質。
Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg- lu-Gln- ln
Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Pne
Ile- ln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pro-^er- ln
Ser_Aia~Asn_Leu_Leu_Ser_Glu_Ala~Arg_Arg
Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pro-Gly-Giy-Gly
Gly_Lrly_し ys_Ala_Asp_Asp_Asp_Asp_Asp_Asp
His-His-His-His-His-His
下記の配列 (配列番号 2)からなる請求項 1記載のタンパク質。
Ala- ryr_Arg_Leu_Ile_Leu_Asn_Gly_Arg_Thr
Leu_Arg_Gly_Glu_Thr_Thr_Thr_Glu_Ala_Val
Asp-Ala-Ala-Thr-Ala-Glu-Arg-Val-Phe-Arg
Gin- fyr- Am- Asn- Asp- Asn- Lrly- Vai- Asp- Gly
Glu- Trp- Thr- Tyr- Asp- Asp- Ala- Thr- Arg- Thr
Phe-Thr-Val-Thr-Glu-Arg-Pro-Glu-VaHle
Asp-Ala-Ser-Glu-Leu-Thr-Pro-Ala-Val-Thr
Gly-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp
Asp-Asp-His-His-His-His-His-His
下記の配列 (配列番号 3)からなる請求項 1記載のタンパク質。 Ala_Thr_Ile_Arg_Ala_Asn_Leu_Ile_Tyr_Ala
Asp_Gly_Arg_Thr_Gln_Thr_Ala_Glu_Phe_Arg
Gly-Thr- Phe- Glu- Glu- Ala- Thr- Ala- Glu- Ala
Tyr_Arg_Tyr_Ala_Asp_Leu_Leu_Ala_Arg_Glu
Asn_Gly_Arg_Tyr_Thr_Vaト Asp_Vaト Ala_Asp
Arg_Gly_Tyr_Thr_Leu_Asn_Ile_Arg_Phe_Ala
Gly_Gly_Gly_Gly_Gly_Cys_Ala_Asp_Asp_Asp
Asp-Asp-Asp-His-His-His-His-His-His
[10] 一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列において、 Rl部分の配列が P-Q で表わされ、
P部分の配列は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は (Ser又は Ala)-(Gly) nよりなる配列（nは 1から 10までの任意の整数）であり、 Q部分の配列は、繰り返し単 位を有するタンパク質の配列であり、リジン残基及びシスティン残基を含まな!/、配列 単位が繰り返された配列であることを特徴とする配列である、請求項 1記載のタンパク 質。
[11] P-Qで表わされるアミノ酸配列において、 Q部分の繰り返し単位の配列が天然由来 のタンパク質のアミノ酸配歹 lj、又はそのアミノ酸配列中のすべてのリジン残基及びシ スティン残基を、リジン残基及びシスティン残基以外のアミノ酸残基に置換することに より得られる、リジン残基及びシスティン残基を含まな!/、アミノ酸配列に改変されたァ ミノ酸配列からなるタンパク質であって、前記天然由来のタンパク質と同等の機能を 有するタンパク質のアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項 10に記載のタンパク 質。
[12] 一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列において、 R2部分の配列力 1 〜10個のグリシンからなる配列であることを特徴とする、請求項 10に記載のタンパク 質。
[13] 一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列において、 R4部分の配列力 S、ァ スパラギン酸及び/又はグルタミン酸のアミノ酸残基からなるアミノ酸残基数 1〜10 個の配列であることを特徴とする、請求項 10に記載のタンパク質。 [14] 一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列において、 R5部分の配歹 IJが、 4 個以上のヒスチジン残基からなるアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項 10に 記載のタンパク質。
[15] 一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列において、 R1部分の配列が P-Q で表わされる場合に、 Q部分の繰り返し単位の配列が抗体分子と特異的に相互作用 する機能を有することを特徴とする、請求項 10〜； 14のいずれか 1項に記載のタンパ ク質。
[16] 一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列において、 R1部分の配列が P-Q で表わされ、
P = Ser-Gly-Gly-Gly-Gly
Q = (Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln-
Asn_Ala_Phe_Tyr_Glu_Ile_Leu_Asn_Met_Pro_
Asn_Leu_Asn_Glu_Glu_Gln_Arg_Asn_Gly_Phe_
Ile_Lrln_Ser_Leu_Arg_Asp_Asp_Pro_Ser_Lrln_
Ser_Ala_Asn_Leu_Leu_Ser_Glu_Ala_Arg_Arg_
Leu- Asn-Glu- Ser- Gin- Ala- Pro- Gly)n (nは、 2から 5までの任意の整数）
R2 = Gly-Gly-Gly-Gly
R3 = Cys-Ala
4 = Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp
R5 = His— His— His— His— His— His
であることを特徴とする、請求項 10に記載のタンパク質。
[17] 一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列において、 R1部分の配列が P-Q で表わされ、
P = 存在しない
Q = (Ala_Tyr_Arg_Leu_Ile_Leu_Asn_Giy_Arg_Thr_
Leu_Arg_Gly_Glu_Thr_Tnr_Thr_Glu_Aia_Va卜
Asp-Ala-Ala- Thr- Ala- Glu-Arg-Va卜 Phe-Arg- Gin- yr-Ala-Asn-Asp-Asn- ly- v al-Asp- ly- Glu- Trp- Thr- Tyr- Asp- Asp- Ala- Thr- Arg- Thr-
Phe-Thr-Val-Thr-Glu-Arg-Pro-Glu-Val-Ile-
Asp_Ala_Ser_Glu_Leu_Thr_Pro_Ala_Val_Thr_Pro_Gly)n
(nは、 2から 5までの任意の整数）
R2 = Gly-Gly-Gly-Gly
R3 = Cys-Ala
R4 = Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp
R5 = His— His— His— His— His— His
であることを特徴とする、請求項 10に記載のタンパク質。
一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列において、 R1部分の配列が P-Q で表わされ、
P = 存在しない
Q = (Ala-Thr- Ile-Arg-Ala- Asn-Leu- Ile-Tyr- Ala
Asp_Gly_Arg_Thr_Gln_Thr_Aia_Glu_Pne_Arg
Gly-Thr- Phe- Glu- Glu- Ala- Thr- Ala- Glu- Ala
Tyr_Arg_Tyr_Ala_Asp_Leu_Leu_Ala_Arg_Glu
Asn_Gly_Arg_Tyr_Thr_Vaト Asp_Vaト Ala_Asp
Arg_Gly_Tyr_Thr_Leu_Asn_Ile_Arg_Phe_Ala
Pro-Gly_)n(nは、 2から 5までの任意の整数）
R2 = Gly-Gly-Gly-Gly
R3 = Cys-Ala
R4 = Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp
R5 = His— His— His— His— His— His
であることを特徴とする、請求項 10に記載のタンパク質。
請求項 1に記載のタンパク質を用いて、当該タンパク質の R1-R2で表される部分が 、そのカルボキシ末端の 1箇所で、 1級アミノ基を官能基として有する固定化担体に結 合している固定化タンパク質の作製方法であって、
一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列中の R3に唯一存在するシスティ ン残基のスルフフイドリル基をチオシァノ基に変換し、 1級アミノ基を官能基として有す る固定化担体に作用させることにより、前記タンパク質中のシスティン残基よりァミノ 末端側に存在するアミノ酸配列部分である R1-R2のカルボキシ末端を、アミド結合に より前記固定化担体に結合させることを特徴とする固定化タンパク質の作製方法。
[20] 一般式 R1-R2で表されるアミノ酸配列 [式中、 R1及び R2は、請求項 1に記載の一 般式中の R1及び R2と同様の意味を有する。 ]からなるタンパク質が固定化担体に結 合した固定化タンパク質であって、前記タンパク質が R1-R2のカルボキシ末端の 1箇 所で、 1級アミノ基を官能基として有する固定化担体にアミド結合されていることを特 徴とする固定化タンパク質。
[21] 請求項 1に記載のタンパク質を用いて作製された、当該タンパク質の R1-R2で表さ れる部分が、そのカルボキシ末端の 1箇所で、 1級アミノ基を官能基として有する固定 化担体に結合している固定化タンパク質であって、
一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列中の R3に唯一存在するシスティ ン残基のスルフフイドリル基をチオシァノ基に変換し、 1級アミノ基を官能基として有す る固定化担体に作用させることにより、前記タンパク質中のシスティン残基よりァミノ 末端側に存在するアミノ酸配列部分である R1-R2のカルボキシ末端を、アミド結合に より前記固定化担体に結合させたものであることを特徴とする、請求項 20に記載の 固定化タンパク質。
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