WO2008043963A1 - Procede de coloration de cellules - Google Patents
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- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
Definitions
- the present invention relates to a method for staining cells, in particular for the blood and the marrow.
- the invention also relates to a particular fixator useful for the implementation of this method.
- a fixator useful for the implementation of this method.
- To identify and differentiate cells or parts of cells cell staining techniques associated with microscopic observation are used.
- MGG dyes are in the form of two compounds:
- May-Gr ⁇ nwald made from methylene blue / eosin powder at 0.30 g diluted in 100 g of methanol, Giemsa made from powders of Azure Blue II / Eosin 3.0 g and Azur II 0.8 g diluted in 375g of methanol with 125g of glycerin.
- the staining process consists of fixing the cells to be stained on a slide with the first solution, soaking the slide in the first diluted solution with buffered water, generally at 1/2, then dipping it in the second solution, usually diluted between 1/20 and 1/30 in buffered water, then rinsed and finally dried.
- MGG coloration known to all practitioners that make this technique MGG has become a standard and allows for comparisons.
- MGG staining has many disadvantages.
- the solvents used to dissolve the dye powders are toxic and volatile compounds.
- glycerine also causes disadvantages because it makes it more difficult rinsing the blades and can cause clogging filters during the final f iltration.
- glycerine to achieve good coloring it is important that the dye is stable and that it does not persist deposits of dyes after rinsing the blade.
- methanol has particular physical properties that allow it to fix the cells. It is hardly replaceable by existing solvents which alone do not give satisfactory results. Or 1 methanol is a toxic and volatile product which it is desirable to limit the use because it can be dangerous for the practitioner. There is therefore still a need for a non-toxic coloring process which makes it possible to obtain results comparable to those of a MGG, which is rapid and easy to use, with stable products having a high degree of rinsability.
- the fixer is made based on ethanol.
- the method according to the invention makes it possible to always obtain the same coloration for the same elements in order to be able to establish comparisons of images made from colored slides.
- the present invention also provides a fixative useful for carrying out a staining process comprising at least ethanol, formalin in a small amount, a blue dye and a red dye.
- the dyeing method according to the invention is not dangerous for the practitioner.
- it is fast, reliable, easy to use and requires only a low dye content.
- the dyeing process according to the invention therefore consists of immersing the preparation of cells to be stained in a fixative before immersing it in coloring reagents in the form of two compounds.
- the fixer comprises at least ethanol.
- the fixer is obtained by carrying out the following steps:
- a nonionic surfactant may also be added to the fixer formula to improve rinsability and prevent deposits from developing during use.
- the first solution of the fixer is obtained by dissolving methylene blue and / or azure blue and / or a blue dye belonging to the compounds of the thiazine group in dimethylsulfoxide, and the second fixer solution. is obtained by dissolving eosin and / or erythrosine in dimethylsulfoxide.
- the fixer is obtained by carrying out the following steps: - obtaining a first solution by dissolving in 120 ml of dimethylsulfoxide, the following blue dyes:
- Such a fixer is useful for carrying out the coloring process according to the invention.
- the dyeing process according to the invention then comprises dipping the preparation of cells to be stained in dye reagents formed of two compounds.
- the preparation of the first compound consists in dissolving at least one red dye, eosin and / or erythrosine, in dimethylsulfoxide and diluting this solution in a buffered solution.
- the preparation of the second compound consists in dissolving at least one blue dye, azure blue and / or methylene blue and / or a blue dye belonging to the compounds of the thiazine group, in dimethylsulfoxide and diluting this solution in a solution. buffered solution.
- the buffered solution is a buffered solution at a pH between 5.5 and 7.4 consisting of demineralized water, monopotassium phosphate and disodium phosphate.
- the buffered solution may also contain an antimicrobial agent. According to a particular embodiment:
- the first compound is prepared in the red by dissolving eosin in an amount of 31.2 ml of dimethylsulfoxide, with a dosage of between 0.100 and 0.300 g, more particularly 0.100 and 0.200 g, and then dilution in approximately 11 g of solution. buffered
- the second compound is prepared in blue by dissolving azure in an amount of 12.5 ml of dimethylsulfoxide, with a dosage of between 0.100 and 0.200 g, more particularly 0.100 and 0.150g, then dilution in about 1 L of buffered solution.
- the first compound incorporates erythrosine, it is at a rate of 0.100 to 0.250 g, more particularly at a rate of 0.150 to 0.200 g. If the second compound incorporates methylene blue, it is at a rate of 0.100 to 0.200 g, more particularly 0.100 to 0.150 g.
- the second compound includes a compound of the thiazine group, it is at a rate of 0.010 to 0.050 g, more particularly 0.015 to 0.030 g.
- these compounds are lightly loaded with dyes because of their dilution in an aqueous solution, so that they have reduced toxicity and they are very easily rinsable.
- the cell staining method comprises the following succession of steps:
- the staining method may also comprise a step after the fixation of the cells to be stained which consists of immersing the fixed preparation between 5 and 20 seconds in a buffered solution.
- the preparation is rinsed in a rinsing solution consisting of water and an antimicrobial agent.
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Abstract
L'objet de l'invention est un procédé de coloration de cellules, notamment pour le sang et Ia moelle comprenant au moins les étapes suivantes: plonger la préparation de cellules à colorer dans un fixateur; plonger la préparation fixée dans un premier composé comprenant un ou plusieurs colorant(s) rouge(s); et plonger la préparation fixée dans un second composé comprenant un ou plusieurs colorant(s) bleu(s). Le fixateur est obtenu par la mise en oeuvre des étapes suivantes: obtention d'une première solution par mise en solution d'au moins un colorant bleu dans du diméthyl suif oxyde; obtention d'une seconde solution par mise en solution d'au moins un colorant rouge dans du diméthyl suif oxyde; ajout de la seconde solution à la première solution; dilution du mélange obtenu avec de l'éthanol absolu contenant du formol.
Description
PROCEDE DE COLORATION DE CELLULES
La présente invention se rapporte à un procédé de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle.
L'invention concerne également un fixateur particulier utile pour la mise en oeuvre de ce procédé. Pour identifier et différencier des cellules ou des parties de cellules, on utilise des techniques de coloration cellulaire associées à l'observation au microscope.
Ces méthodes de coloration sont indispensables dans de nombreux domaines de la biologie, aussi bien en recherche fondamentale qu'en analyse médicale ou vétérinaire pour le cytodiagnostic. En hématologie notamment on utilise depuis de très nombreuses années la coloration connue sous le nom de MGG, May-Grϋnwald Giemsa. Les colorants MGG se présentent sous forme de deux composés :
May-Grϋnwald réalisé à partir de poudre de bleu de méthylène/éosine à 0,30g dilués dans 100g de méthanol, - Giemsa réalisé à partir de poudres de bleu Azur II/ éosine 3,0g et d'Azur II 0,8g diluées dans 375g de méthanol avec 125g de glycérine.
Le procédé de coloration consiste à fixer les cellules à colorer sur une lame avec la première solution, à tremper la lame dans la première solution diluée avec de l'eau tamponnée, généralement au 1/2, à la tremper ensuite dans la seconde solution, généralement diluée entre 1/20 et 1/30 dans de l'eau tamponnée, puis à la rincer et enfin la sécher.
On obtient alors des colorations connues de tous les praticiens qui font que cette technique MGG est devenue un standard et permet d'établir des comparaisons.
Néanmoins la coloration MGG présente de nombreux inconvénients. Tout d'abord, les solvants utilisés pour mettre en solution les poudres de colorant sont des composés toxiques et volatils.
La présence de glycérine engendre également des inconvénients car elle rend plus difficile les rinçages des lames et peut engendrer des colmatages des filtres lors de la f iltration finale. De plus, pour réaliser une bonne coloration il est important que le colorant soit stable et qu'il ne persiste pas de dépôts de colorants après rinçage de la lame.
Or, de tels dépôts peuvent apparaître avec le MGG. Ces dépôts perturbent le fonctionnement des dispositifs automatiques de reconnaissance de cellules et empêchent de distinguer les différents éléments cellulaires et de reconnaître les cellules saines des cellules malades dans le cas d'un cytodiagnostic.
Afin d'éviter ces inconvénients, on a tenté de remplacer le MGG par d'autres procédés de coloration.
Toutefois, les procédés existants ne permettent pas de conserver la reproductibilité du MGG, ni d'obtenir des résultats comparables. De plus, les procédés de l'art antérieur utilisent tous du méthanol que se soit pour réaliser les colorants en eux-mêmes ou la solution de fixation des cellules.
En effet, le méthanol présente des propriétés physiques particulières qui lui permettent de bien fixer les cellules. Il est difficilement remplaçable par les solvants existants qui seuls, ne donnent pas des résultats satisfaisants. Or1 le méthanol est un produit toxique et volatil dont il est souhaitable de limiter l'utilisation car il peut s'avérer dangereux pour le praticien.
II subsiste donc un besoin pour un procédé de coloration non toxique permettant d'obtenir des résultats comparables à ceux d'un MGG, qui soit rapide et facile d'utilisation, a^ec des produits stables, présentant une grande rinçabilité. C'est ce à quoi répond la présente invention en proposant un procédé de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle, comprenant au moins les étapes suivantes :
- plonger la préparation de cellules à colorer dans un fixateur,
- plonger la préparation fixée dans un premier composé comprenant un ou plusieurs colorant(s) rouge(s), et - plonger la préparation fixée dans un second composé comprenant un ou plusieurs colorant(s) bleu(s).
Préférentiellement, le fixateur est réalisé à base d'éthanol.
Le procédé selon l'invention permet d'obtenir toujours une même coloration pour les mêmes éléments afin de pouvoir établir des comparaisons d'images réalisées à partir de lames colorées.
La présente invention propose également un fixateur utile pour la mise en oeuvre d'un procédé de coloration comprenant au moins de l'éthanol, du formol en petite quantité, un colorant bleu et un colorant rouge.
Avantageusement le procédé de coloration selon l'invention n'est pas dangereux pour le praticien. En outre, il est rapide, fiable, facile d'utilisation et ne nécessite qu'une faible teneur en colorants.
D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description non limitative qui va suivre de l'invention.
Le procédé de coloration selon l'invention consiste donc à plonger la préparation de cellules à colorer dans un fixateur avant de la plonger dans des réactifs de coloration sous forme de deux composés.
Préférentiellement le fixateur comprend au moins de l'éthanol.
Selon un mode de réalisation préféré, le fixateur est obtenu par la mise en oeuvre des étapes suivantes :
- obtention d'une première solution par mise en solution d'au moins un colorant bleu dans du diméthylsulfoxyde, - obtention d'une seconde solution par mise en solution d'au moins un colorant rouge dans du diméthylsulfoxyde,
- ajout de la seconde solution à la première solution,
- dilution du mélange obtenu os/ec de l'éthanol absolu contenant du formol. Un tensioactif non- ionique peut également être ajouté dans la formule du fixateur pour améliorer la rinçabilité et éviter l'apparition de dépôts lors de l'utilisation.
De manière préférentielle, la première solution du fixateur est obtenue par mise en solution de bleu de méthylène et/ou de bleu azur et/ou d'un colorant bleu appartenant aux composés du groupe des thiazines dans du diméthylsulfoxyde, et la seconde solution du fixateur est obtenue par mise en solution d'éosine et/ou d'érythrosine dans du diméthylsulfoxyde.
Selon un mode de réalisation particulier, le fixateur est obtenu par la mise en oeuvre des étapes suivantes : - obtention d'une première solution par mise en solution dans 120ml de diméthylsulfoxyde, des colorants bleus suivants :
• entre 1 et 1,5g de bleu de méthylène,
• entre 1 et 1,5g de bleu azur, et
• entre 0,9 et 1,5g d'un colorant bleu appartenant aux composés du groupe des thiazines,
- obtention d'une seconde solution par mise en solution dans 120 ml de diméthylsulfoxyde, d'éosine dans une proportion comprise entre 0,1 et 0,6g,
- ajout de la seconde solution à la première solution,
- dilution du mélange obtenu jusqu'à IL avec de l'éthanol absolu contenant entre 15 et 25g de formol 37%.
Un tel fixateur est utile pour la mise en oeuvre du procédé de coloration selon l'invention.
Après l'étape de trempage dans un fixateur, le procédé de coloration selon l'invention consiste ensuite à plonger la préparation de cellules à colorer dans des réactifs colorant formé de deux composés.
La préparation du premier composé consiste à mettre en solution au moins un colorant rouge, l'éosine et/ou l'érythrosine, dans du diméthylsulfoxyde et à diluer cette solution dans une solution tamponnée.
La préparation du second composé consiste à mettre en solution au moins un colorant bleu, le bleu azur et/ou le bleu de méthylène et/ou un colorant bleu appartenant aux composés du groupe des thiazines, dans du diméthylsulfoxyde et à diluer cette solution dans une solution tamponnée.
Préférentiellement, la solution tamponnée est une solution tamponnée à pH compris entre 5,5 et 7,4 constituée d'eau déminéralisée, de phosphate monopotassique et de phosphate disodique.
La solution tamponnée peut également contenir un agent anti-microbien. Selon un mode de réalisation particulier :
- on prépare le premier composé dans le rouge par mise en solution d'éosine dans une quantité de 31,2ml de diméthylsulfoxyde, avec un dosage compris entre 0,100 et 0,300g, plus particulièrement 0,100 et 0,200g, puis dilution dans environ IL de solution tamponnée,
- on prépare le second composé dans le bleu par mise en solution de bleu azur dans une quantité de 12,5ml de diméthylsulfoxyde, avec un dosage compris entre 0,100 et 0,200g, plus
particulièrement 0,100 et 0,150g, puis dilution dans environ IL de solution tamponnée.
Si le premier composé intègre de l'érythrosine, elle l'est à raison de 0,100 à 0,250g, plus particulièrement à raison de 0,150 à 0,200g. Si le second composé intègre du bleu de méthylène, il l'est à raison de 0,100 à 0,200g, plus particulièrement 0,100 à 0,150g.
Si le second composé intègre un composé du groupe des thiazines, il l'est à raison de 0,010 à 0,050g, plus particulièrement 0,015 à 0,030g.
L'utilisation des ces deux composés pour le procédé de coloration selon l'invention permet une excellente stabilité et également une excellente dissolution car il n'y a pas de phase avec glycérine.
La dissolution de chacun des composés ne pose pas de problème car elle ne génère pas de complexes.
De plus, ces composés sont peu chargés en colorants du fait de leur dilution dans une solution aqueuse, si bien qu'ils présentent une toxicité réduite et qu'ils sont très facilement rinçables.
Selon un exemple particulier de l'invention, le procédé de coloration de cellules comprend la succession des étapes suivantes :
- plonger la préparation de cellules à colorer 600 à 1200 secondes dans le fixateur,
- plonger la préparation fixée 120 à 300 secondes dans le premier composé,
- plonger la préparation fixée 120 à 480 secondes dans le second composé, - rincer entre 10 et 30 secondes, et
- sécher à l'air.
Le procédé de coloration peut également comprendre une étape après la fixation des cellules à colorer qui consiste à plonger la préparation fixée entre 5 et 20 secondes dans une solution tamponnée.
Préférentiellement, la préparation est rincée dans une solution de rinçage constituée d'eau et d'un agent anti-microbien.
Bien entendu, l'invention n'est évidemment pas limitée au mode de réalisation représenté et décrit ci-dessus, mais en couvre au contraire toutes les variantes.
Claims
1. Procédé de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes :
- plonger la préparation de cellules à colorer dans un fixateur,
- plonger la préparation fixée dans un premier composé comprenant un ou plusieurs colorant(s) rouge(s), et
- plonger la préparation fixée dans un second composé comprenant un ou plusieurs colorant(s) bleu(s).
2. Procédé de coloration de cellules selon la revendication 1, caractérisé en ce que le fixateur comprend au moins de l'éthanol.
3. Procédé de coloration de cellules selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le fixateur est obtenu par la mise en oeuvre des étapes suivantes :
- obtention d'une première solution par mise en solution d'au moins un colorant bleu dans du diméthylsulfoxyde, - obtention d'une seconde solution par mise en solution d'au moins un colorant rouge dans du diméthylsulfoxyde,
- ajout de la seconde solution à la première solution,
- dilution du mélange obtenu asec de l'éthanol absolu contenant du formol.
4. Procédé de coloration de cellules selon la revendication 3, caractérisé en ce que le fixateur comprend également un tensioactif non ionique.
5. Procédé de coloration de cellules selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que la première solution du fixateur est obtenue par mise en solution de bleu de méthylène et/ou de bleu azur et/ou d'un colorant bleu appartenant aux composés du groupe des thiazines.
6. Procédé de coloration de cellules selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que la seconde solution du fixateur est obtenue par mise en solution d'éosine et/ou d'érythrosine.
7. Procédé de coloration de cellules selon l'une quelconque des précédentes revendications, caractérisé en ce que le premier composé est obtenu par mise en solution d'au moins un colorant rouge, l'éosine, dans du diméthylsulfoxyde et par dilution de cette solution dans une solution tamponnée.
8. Procédé de coloration de cellules selon l'une quelconque des précédentes revendications caractérisé en ce que le second composé est obtenu par mise en solution d'au moins un colorant bleu, le bleu azur, dans du diméthylsulfoxyde et par dilution de cette solution dans une solution tamponnée.
9. Procédé de coloration de cellules selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce que la solution tamponnée est un solution tamponnée à pH compris entre 5,5 et 7,4 constituée d'eau déminéralisée, de phosphate monopotassique et de phosphate disodique.
10. Procédé de coloration de cellules selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que le premier composé comprend un colorant rouge, l'érythrosine, mis en solution dans du diméthylsulfoxyde.
11. Procédé de coloration de cellules selon l'une des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que le second composé comprend un colorant bleu, le bleu de méthylène, mis en solution dans du diméthylsulfoxyde.
12. Procédé de coloration de cellules selon l'une des revendications 7 à 11, caractérisé en ce que le second composé comprend un colorant bleu appartenant aux composés du groupe des thiazines mis en solution dans du diméthylsulfoxyde.
13. Procédé de coloration de cellules selon l'une quelconque des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'il comprend la succession des étapes suivantes : - plonger la préparation de cellules à colorer 600 à 1200 secondes dans le fixateur,
- plonger la préparation fixée 120 à 300 secondes dans le premier composé, - plonger la préparation fixée 120 à 480 secondes dans le second composé,
- rincer entre 10 et 30 secondes, et
- sécher à l'air.
14. Procédé de coloration de cellules la revendication 13, caractérisé en ce que la préparation fixée est plongée dans une solution tamponnée pendant 10 secondes avant d'être plongée dans le premier composé.
15. Procédé de coloration de cellules selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce que la préparation est rincée dans une solution de rinçage constituée d'eau et d'un agent anti-microbien.
16. Fixateur utile pour la mise en oeuvre du procédé de coloration selon l'une quelconque des précédentes revendications caractérisé en ce qu'il comprend au moins de l'éthanol, du formol, un colorant bleu et un colorant rouge.
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