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WO2007138198A2 - Procede d'extraction d'une ou de plusieurs proteines presentes dans du lait - Google Patents

Procede d'extraction d'une ou de plusieurs proteines presentes dans du lait Download PDF

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WO2007138198A2
WO2007138198A2 PCT/FR2007/000908 FR2007000908W WO2007138198A2 WO 2007138198 A2 WO2007138198 A2 WO 2007138198A2 FR 2007000908 W FR2007000908 W FR 2007000908W WO 2007138198 A2 WO2007138198 A2 WO 2007138198A2
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WO
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protein
milk
proteins
calcium
phosphate
Prior art date
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Application number
PCT/FR2007/000908
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English (en)
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WO2007138198A3 (fr
Inventor
Alain Lejars
Michel Nogre
Michel Tellier
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
LFB Biotechnologies SAS
LFB SA
Original Assignee
LFB Biotechnologies SAS
LFB SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Application filed by LFB Biotechnologies SAS, LFB SA filed Critical LFB Biotechnologies SAS
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Priority to KR1020147034304A priority patent/KR101593494B1/ko
Priority to CA2652495A priority patent/CA2652495C/fr
Priority to EP07788820A priority patent/EP2038296A2/fr
Priority to CN200780020173.8A priority patent/CN101501059B/zh
Priority to JP2009512640A priority patent/JP5279087B2/ja
Priority to AU2007266951A priority patent/AU2007266951C1/en
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Priority to IL195183A priority patent/IL195183A0/en
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    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
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    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)

Definitions

  • the present invention relates to a method for extracting one or more proteins present in milk, said proteins having an affinity for calcium ions complexed or not with said milk.
  • the term complexed or non-complexed calcium ions is the phosphocalcic salts bound to caseins to form a colloidal micellar structure of caseins, or such salts not related to caseins and mistletoe are therefore free.
  • Such ions are also the various salts and / or organic and / or inorganic calcium complexes other than those mentioned above, which are soluble in milk.
  • the proteins with an affinity for calcium ions in milk represent those naturally present therein such as lactalbumin, lactoglobulin and immunoglobulin. These proteins may also represent recombinant proteins presented in the milk of transgenic animals, for example blood coagulation factors, in particular factor VII, factor VIII and factor IX.
  • proteins are an essential part of molecules carrying biological information. This is particularly the case of a large number of hormones, growth factors, blood coagulation factors or antibodies.
  • proteins are amino acid-based polymers most often of high molecular weight can not be obtained at reasonable costs by chemical synthesis.
  • therapeutically useful proteins are usually isolated and purified from, for example, living organisms, tissues or human or human blood.
  • Bacterial systems for example E. CoIi, are widely used and effective. They allow the production of recombinant proteins at low cost. However, such systems are limited to preparation of simple, non-glycosylated proteins that do not require an elaborate folding process.
  • Fungal systems are also used for the production of secreted proteins.
  • the disadvantage of these fungal systems lies in the fact that they are at the source of post-translational modifications, consisting, for example, in a grafting of glycan units and sulphate groups, which strongly affect the pharmacokinetic properties of the proteins produced, in particular by the addition of various groups of mannose derivatives.
  • Systems using baculoviruses can produce a variety of proteins, such as vaccine proteins or growth hormone, but their application on an industrial scale is not optimized.
  • Mammalian cell culture is also used for the preparation of complex recombinant proteins, such as monoclonal antibodies.
  • Cell expression systems lead to correctly folded and modified recombinant proteins. The weak performance against the production cost is a major drawback.
  • transgenic plants to obtain proteins in large amounts.
  • These systems generate post-translational modifications specific to plants, in particular by adding to the proteins produced highly immunogenic xylose residues, thus limiting their use for therapeutic purposes.
  • transgenic animals for the production of recombinant vaccines or complex therapeutic proteins.
  • the proteins thus obtained have a glycosylation .. close to that of the human being and are correctly folded.
  • These protein complexes are not constituted as a single polypeptide chain such as the growth hormone, but are modified in various ways after the assembly of amino acids, including specific cleavages, glycosylation and 'of carboxyméthylations . In the vast majority of cases, such modifications can not be made by bacterial or yeast cells.
  • transgenic animals can combine both the levels of expression found in bacterial cell systems and the post-translational modifications achieved through cell cultures, while generating lower production costs than by the implementation of cellular expression systems.
  • milk was the subject of work leading to regard as •. a source of very satisfactory secretion of recombinant proteins.
  • the recombinant proteins, produced from milk of transgenic animals, can be easily obtained by grafting the gene coding for the protein of interest on the regulatory region of one of the milk protein synthesis genes that will direct it. specifically in the mammary gland, then its secretion into the milk.
  • patent application EP 0 527 063 which describes the production of a protein of interest in the milk of a transgenic mammal, the expression of the gene coding for the protein of interest. being controlled by a promoter of a whey protein.
  • Other patent applications or patents describe the preparation of antibodies (EP 0 741 515), collagen (WO 96/03051), human factor IX (US 6,046,380) and VlII factor / von Willebrand factor complexes (EP 0 807 170) in the milk of transgenic mammals.
  • milk is a mixture of 90% water comprising various constituents that can be grouped into three categories.
  • the first category called whey (or whey), consists of carbohydrates, soluble proteins, minerals and water-soluble vitamins.
  • the second category called lipid phase (or cream), contains fat in the form of emulsion.
  • the third category consists of approximately 80% of caseins, which form a set of precipitable proteins at a pH of 4.6 or under the action of rennet, enzymatic coagulant, in the presence of calcium.
  • the different caseins form a colloidal micellar complex, which can reach diameters
  • Such micelles are formed from subunits of caseins consisting of a hydrophilic layer rich in casein-K surrounding a hydrophobic core, the phosphocalcic salts being linked by electrostatic interaction on the hydrophilic layer. These phosphocalcic salts can also be present in the internal volume of the micelle without being bound to the casein.
  • This protein phase also contains soluble proteins, such as lactalbumin and lactoglobulins, as well as albumins and immunoglobulins from the blood.
  • the recombinant protein secreted in the milk of transgenic animals may be present in the whey or in the protein phase, or both.
  • the richness and complexity of each category of milk constituents make it all the more difficult to carry out an extraction of this protein, in particular that trapped in the casein micelles.
  • Another difficulty lies in the fact that the majority presence of this protein in one of the two phases is not predictable with certainty.
  • a recombinant protein may also have affinities for milk calcium ions that are present as either salts and / or various soluble complexes or phosphocalcic salts of casein micelles. These affinities translate into electrostatic bonds between the protein and divalent calcium cations.
  • the protein / calcium ion affinities make it possible to define the affinity constants which, depending on their value, determine the binding force.
  • most of the proteins having an affinity for calcium ions are related to phosphocalcic salts of micelles. Its extraction requires the implementation of complex steps, which poses problems of implementation and performance.
  • US Patent 4,519,945 describes a method of extracting a recombinant protein by preparing a precipitate of caseins and whey from milk, implementing acidification and heating steps, as mentioned above. This process generates a significant loss of the activity of the protein in question and a low extraction yield.
  • US Patent 6,984,772 discloses a method of purifying recombinant fibrinogen from milk of a transgenic mammal. This process comprises a step of separating the whey from the casein pellet and the protein phase by successive centrifugations. Whey is isolated
  • Patent application WO 2004/076695 describes a method for the filtration of recombinant proteins from milk of transgenic animals.
  • This method comprises a first step of clarifying the milk, that is to say a step of removing the milk components so as to obtain a solution that can be filtered through a membrane of filter whose pores have a diameter of 0.2 ⁇ m.
  • Such a step results in the elimination of casein micelles. Therefore, the implementation of this step can be prohibitive, in terms . yield, if the casein micelles are likely to contain a protein of interest trapped within their structure.
  • US Pat. No. 6,183,803 describes a process for isolating proteins naturally present in milk, such as lactalbumin, and recombinant proteins, for example human albumin or ⁇ 1-antitrypsin, from milk.
  • This method comprises an initial step of contacting the milk comprising a protein of interest with a chelating agent. This results in the destructuring of casein micelles, which leads to a clarified milk serum comprising caseins, whey proteins and the protein of interest.
  • the method then comprises a step of restructuring the casein micelles by adding to the liquid medium (clarified milk serum) insoluble divalent cation salts.
  • This process is complex and can not be applied to proteins with relatively high affinity for calcium ions.
  • the coagulation proteins and especially those known to be synthesized under the influence of vitamin K, are in this category.
  • the Applicant has set a goal to put a method for extracting, from milk, milk proteins, whether natural or not, such as recombinant factor VII, factor VIII and factor IX, having an affinity for the ionic forms of calcium in milk, simplified implementation, further leading to a satisfactory production yield, while maintaining the biological activity of the protein.
  • the invention thus relates to a process for extracting at least one protein present in milk, said protein exhibiting an affinity for the complexed or non-complexed calcium ions of said milk, comprising the following steps: a) releasing the protein by the precipitation of calcium compounds obtained by contacting the milk with a soluble salt, whose anion is chosen for its ability to form in such a medium said insoluble calcium compounds, thereby obtaining a liquid phase enriched in the protein, b ) separating the liquid phase enriched in the protein from the precipitate of calcium compounds, said liquid phase being further separated into a lipid phase and a non-lipidic aqueous phase comprising the protein, and c) recovering the non-lipidic aqueous phase comprising the protein .
  • the Applicant has surprisingly found that adding a soluble salt, whose anion is chosen for its ability to form precipitates of calcium compounds in milk, containing a protein, especially recombinant, having an affinity for complexed or non-complexed calcium ions, that is to say having sites for fixing to calcium ions, allows the precipitation of calcium compounds, whereas the protein of interest is released from these complexed ions or not and is found in solution in the liquid phase.
  • the complexed or non-complexed calcium ions represent the different salts and / or organic and / or inorganic complexes of calcium soluble in milk. These salts or complexes may be present in the internal volume of the casein micelle (see further in Figure 1).
  • These calcium ions also represent the phosphocalcic salts in interaction with the casein micelles, in particular in the form of aggregates ("clusters"). These salts are also present in the milk in the form of monocalcium phosphate and / or dicalcium phosphate, which are in equilibrium with the other ionic forms of calcium as a function of the chemical and biochemical reactions used.
  • calcium ions represent calcium / casein complexes, that is to say representing casein subunits which are associated, by electrostatic interaction, phosphocalcic salts.
  • These calcium / casein complexes also refer to casein micelles associated with phosphocalcic salts and with salts. and / or soluble organic and / or inorganic calcium complexes.
  • insoluble calcium compounds means calcium salts or complexes whose solubility in milk is less than 0.5%.
  • the proteins of interest will be mainly associated with phosphocalcic salts of casein micelles.
  • the term "protein having affinity for complexed or non-complexed calcium ions” means any protein having a sufficient number of binding sites.
  • proteins of interest having numerous sites for fixing to calcium ions for example 8 to 10 GLA domains, which are domains rich in ⁇ -carboxyglutamic acids making it possible to fix the calcium ions, at less than 70% up to 90% of the proteins of interest are trapped in and / or on casein micelles.
  • the process of the invention can be applied to protein extraction of which at least 2% up to 10%, or at least 40% up to. 60% or, in particular, at least 90% are associated with these calcium ions.
  • Such affinity of the protein for calcium ions may result from interactions of unmodified or modified protein in vivo or in vitro, for example by post-translational modifications.
  • proteins having numerous calcium binding sites complexed or not can find themselves associated with different forms of calcium found in milk.
  • the Applicant assumes that the addition of the soluble salt displaces the equilibrium of the phosphocalcic salts of the micelles, in particular the calcium / phosphate ratio, thus causing their destructuration and the precipitation of sub-aggregates. - casein units.
  • the proteins of interest associated with the phosphocalcium salts trapped in and / or on the micelles are released into the medium during this destructuration.
  • the proteins of interest are then also released or dissociated from the phosphocalcic salts, because they precipitate in the form of insoluble calcium compounds under the effect of the soluble salt used in the process of the invention.
  • the proteins of interest which can also be associated with soluble organic and / or inorganic salts or complexes of calcium would also be dissociated by the same type of reaction.
  • the soluble salt represents any salt that makes it possible to obtain the desired effect.
  • the soluble salt used in the process of the invention may be added to the milk at a concentration chosen by those skilled in the art to achieve the release of the protein from these interactions with calcium ions. As such, it is a concentration sufficient to allow the release of at least 20%, or preferably at least 30% up to 50% of the proteins of interest. Particularly advantageously, it is a concentration sufficient to allow the separation of at least 60% to 80%, or at least 90% of the proteins of interest.
  • the process of the invention can also be applied to proteins only a part of which has calcium ion binding sites.
  • the process of the invention can be applied to the extraction of proteins present in milk of which 1% of the total is associated with calcium ions.
  • the method can also be applied to proteins of which at least 2% up to 10%, or at least 40% up to 60% or, in particular, at least 90% are associated with these calcium ions.
  • the method of the invention allows the precipitation in particular aggregates of casein subunits. This precipitation is due to the destructuring of the casein micelles, as indicated above.
  • the implementation of the process of the invention destabilizes, by precipitation, the colloidal state in which the milk is.
  • the method of the invention is therefore a method for the passage of milk from a colloidal state to a liquid state, which corresponds to a direct colloid / liquid extraction.
  • the process of the invention also makes it possible to obtain the whey and the lipid phase whose coloring is lighter than that of the starting milk. Indeed, it is the caseins related to calcium ions that give their white color to milk. Once precipitated, they can no longer give this color to milk.
  • the method of the invention thus has several advantages: it is first of a very easy implementation, since it allows the separation of the proteins of interest by simplified implementation steps. In addition, it allows recovery of the proteins of interest in the non-lipidic aqueous phase with a very good yield.
  • the extraction process of the invention has a yield of at least 50%, or at least 60%, or at least 80%. In a particularly advantageous manner, the yield is at least 90%.
  • This method will also make it possible to obtain the non-lipidic aqueous phase comprising the protein of interest in a form compatible with the implementation of subsequent steps of purification thereof, in particular chromatography steps.
  • the proteins of interest are still biologically active, since the steps of the process of the invention are carried out at a pH that does not alter their biological activity.
  • the pH is advantageously basic, for example close to 8.
  • Soluble salt according to the invention means a salt whose solubility in milk is at least 0.5 part of salt per part of milk (w / w).
  • the soluble salt used in the process is a phosphate salt.
  • the salt can be in an aqueous solution that is added to the milk, or it can be added directly to the milk as a powder.
  • the phosphate salt is selected from the group consisting of sodium phosphate, lithium phosphate, potassium phosphate, rubidium phosphate and cesium phosphate, and is, in particular, sodium phosphate.
  • the soluble salt used for carrying out the process of the invention may be an oxalate of an alkali metal, especially 1 sodium or potassium oxalate, or an alkali metal carbonate, particularly the sodium or potassium carbonate, or their mixture.
  • the concentration of the soluble salt in aqueous solution is between 100 mM and 3 M, more preferably between 200 mM and 500 mM and, in particular, between 200 mM and 500 mM. mM and 300 mM.
  • the soluble salt of the invention is sodium phosphate, the concentration of which in aqueous solution is between 100 mM and 3 M, more preferably between 200 mM and 500 mM and in particular between 200 mM and 300 mM.
  • the milk in which the protein of interest to be extracted may be unsprouted raw milk or skimmed milk.
  • the advantage of applying the method of the invention to skim milk is that it contains a lower amount of lipids.
  • the process can also be applied to fresh or frozen milk.
  • Step b) enables the separation of the liquid phase in a lipid phase and a non-lipidic water phase comprising the protein is preferably carried out by centrifugation.
  • the non-lipidic aqueous phase is assimilated to whey.
  • This separation step also makes it possible to isolate the clusters of micellar subunits of caseins and the precipitate of calcium compounds.
  • the non-lipidic aqueous phase comprising the protein is separated from the lipid phase.
  • This step advantageously makes it possible to obtain a clear aqueous nonlipidic phase. .
  • the method may further comprise, after step c), a filtration step of the non-lipidic aqueous phase carried out successively on decreasing porosity filters, preferably 1 ⁇ m and then 0.45 ⁇ m.
  • a filtration step of the non-lipidic aqueous phase carried out successively on decreasing porosity filters, preferably 1 ⁇ m and then 0.45 ⁇ m.
  • These filters such as those based on glass fibers, makes it possible to reduce the content of lipids that may still be present, fat globules and phospholipids naturally present in the milk.
  • a porosity lower than 0.5 microns makes it possible to maintain the bacteriological quality of the non-lipidic aqueous phase, as well as purification supports subsequently used. (ultrafilters, chromatography column, etc.) (see below).
  • the lipid phase is preferably filtered through these filters which thus completely retain the lipid globules of the milk, and the filtrate is clear.
  • This step may be followed by a concentration / dialysis step by ultrafiltration.
  • the concentration makes it possible to reduce the volume of the non-lipidic aqueous phase with a view to its preservation.
  • the ultrafiltration membrane is chosen by those skilled in the art according to the characteristics of the protein of interest. In general, a cutoff threshold whose pore size is less than or equal to the molecular weight of the protein of interest makes it possible to concentrate the product without noticeable loss. For example, a pore size membrane at 50 kDa makes it possible to concentrate lossless FVII with a molecular weight of 50 kDa.
  • the dialysis is intended to condition the aqueous protein phase for subsequent purification steps, in particular by chromatography. It also makes it possible to eliminate low molecular size components, such as lactoses, salts, peptides, peptone proteoses and any agent that may be detrimental to the preservation of the product.
  • the dialysis buffer is a solution of 0.025M0, 050M sodium phosphate, pH 7.5-8.5.
  • the non-lipidic aqueous phase obtained after step c), or, where appropriate, obtained after the filtration and / or concentration / dialysis steps, may be frozen and stored at a temperature of -30 ° C. while waiting the implementation of subsequent steps of their purification.
  • the method of the invention thus allows the extraction and, where appropriate, the separation of one or of several proteins of interest milk calcium ions to which they are linked by electrostatic interactions.
  • the protein may be a protein naturally present in milk, and represents, for example, ⁇ -lactoglobulin, lactoferrin, ⁇ -lactalbumin, immunoglobulins or peptone proteoses, or their mixture.
  • the protein may also be a protein not naturally present in milk.
  • the milk containing the protein of interest is a transgenic milk.
  • proteins not naturally present in milk can be synthesized by non-human transgenic mammals using recombinant DNA techniques and transgenesis.
  • Such a protein is then a recombinant or transgenic protein, these two terms being considered as equivalent in the present application, synthesized by recombinant DNA techniques.
  • transgenic animal is intended to mean any non-human animal having incorporated in its genome an exogenous DNA fragment, in particular coding for a protein of interest, this animal expressing the protein encoded by the exogenous DNA, and capable of transmitting the DNA exogenous to its descendant.
  • any non-human mammal is suitable for the production of such a milk.
  • the rabbit, the ewe, the goat, the cow, the sow and the mouse can be used, this list not being limiting.
  • the secretion by the mammary glands of the protein of interest involves the control of the expression of the recombinant protein in a tissue-dependent manner.
  • Expression control is performed by means of sequences allowing expression of the protein to a particular tissue of the animal. These sequences are in particular the promoter sequences, as well as the signal peptide sequences.
  • promoters well known to those skilled in the art are the WAP (whey acidic protein) promoter, the casein promoter, the ⁇ -lactoglobulin promoter, this list not being limiting.
  • a method for producing a recombinant protein in the milk of a transgenic animal may comprise the following steps: a synthetic DNA molecule comprising a gene coding for a protein of interest, this gene being under the control of a promoter of a protein secreted naturally in milk, is integrated into an embryo of a non-human mammal. The embryo is then placed in a female mammal of the same species which gives birth to a transgenic animal. Once this subject has developed sufficiently, the lactation of the mammal is induced, then the milk collected. The milk then contains the recombinant protein of interest.
  • a plasmid containing the WAP promoter is manufactured by introducing a sequence comprising the promoter of the WAP gene, this plasmid being made in such a way as to be able to receive a foreign gene placed under the control of the WAP promoter.
  • the gene coding for a protein of interest is integrated and placed under the control of the WAP promoter.
  • the plasmid containing the promoter and the gene coding for the protein of interest are used to obtain transgenic animals, for example rabbits, by microinjection into the male pronucleus of rabbit embryos. The embryos are then transferred into the oviduct of hormonally prepared females. The presence of the transgenes is revealed by the Southern technique from the DNA extracted from the transgenic rabbits obtained.
  • the protein produced in the milk and extracted according to the process of the invention is a coagulation protein, or coagulation factor.
  • coagulation protein or coagulation factor.
  • the coagulation factor is activated during the extraction process of the invention. It can be in particular proteins - "vitamin • K-dependent", which are essential factors for the coagulation of blood.
  • the protein produced in the milk and extracted, according to the process of the invention is a protein comprising "GLA-domains", which have the capacity to fix calcium ions, or else proteins comprising "domains".
  • EGF epidermal growth factor
  • EGF helix motif • loop-helix for fixing calcium ion
  • the calcium-dependent proteins are also proteins that can be purified by the process of the invention, in particular the antibodies or the monoclonal antibodies.
  • the protein of the invention is chosen from the factor II (FII), the factor VII (FVII), the factor IX (FIX) and the factor X (FX), as well as their activated forms, the protein C, the activated protein C, protein S and protein Z, or their mixture.
  • the protein of the invention is FVII, or activated FVII (FVIIa).
  • the FVII or FVIIa can be produced according to the teaching of EP 0 527 063, the summary of which is given above.
  • a DNA fragment whose sequence is that of human FVII is then placed under the control of the WAP promoter.
  • such a DNA sequence appears under the sequence number Ib described in EP 0 200 421.
  • the FVII of the invention is activated.
  • FVIIa results, in vivo, from cleavage of the zymogen by different proteases (FIXa, FXa, FVIIa) into two chains joined by a disulfide bridge.
  • FVIIa alone has very little enzymatic activity, but complexed with its cofactor, tissue factor (FT), it triggers the coagulation process by activating FX and FIX.
  • FT tissue factor
  • FVIIa has a coagulant activity 25 to 100 times greater than that of FVII when interacting with tissue factor (FT).
  • FVII can be activated in vitro by the factors Xa, VIIa, 11a, IXa and XIIa.
  • the FVII of the invention may also be activated during its purification process.
  • the Applicant has found, surprisingly, that the protein of interest, even placed under the control of a promoter of a protein naturally produced in whey, such as the WAP promoter for example, is nonetheless likely to be associated with calcium ions. , and therefore to casein micelles.
  • the method of the invention can be used for the separation of recombinant proteins produced under the control of a whey protein promoter.
  • the method of the invention is particularly suitable for the separation of recombinant proteins produced under the control of a casein promoter.
  • the protein may also be selected from factor VIII, anti-trypsin alpha-1, anti-thrombin III, albumin, fibrinogen, insulin, myelin basic protein, proinsulin, Tissue activator of plasminogen and antibodies, or their mixture.
  • the method of the invention can also be used for the preparation of a lactic recombinant protein.
  • it may be a lactic protein synthesized by the mammary gland of an animal of another species (Simons et al., (1987), Aug 6-12;
  • lactoferrin lactoglobulin
  • lysozyme lactalbumin transgenic.
  • a non-lipidic aqueous phase of milk comprising at least one protein that can be obtained by the process of the invention.
  • the aqueous phase is hypersaline, basic, and contains soluble caseins and at least one other protein of interest.
  • hypersaline we preferentially mean a concentration of at least 7 g / l of sodium ions, or at least 18 g / l of sodium chloride, or at least 0.3 molar of sodium chloride. Preferentially, this concentration is about 8 g / l of sodium ions or about 20 g / l of sodium chloride.
  • basic is meant a pH of between 8 to 9, and preferably greater than 7.8. Soluble caseins represent at least 25% of total caseins, and preferably at least 50% of total caseins.
  • Such a phase comprises at least 50%, or advantageously at least 60% up to 80% of the total of the proteins of interest to be purified relative to the milk that has not undergone the process steps.
  • the non-lipidic aqueous phase comprises at least 90% of the total of the proteins of interest present in the milk before extraction.
  • the protein of interest present in the non-lipidic aqueous phase is factor VII (FVII) or activated factor VII (FVIIa) ' .
  • the non-aqueous lipid phase -l'invention even if it no longer contains casein micelles and insoluble calcium compounds, however, still comprises mainly impurities. Therefore, it is necessary, depending on the case, to carry out a purification of the protein in the aqueous phase.
  • the method of the invention may further comprise the subsequent steps of purification of the non-lipid aqueous phase comprising the protein 'interest, obtained after step c) or, optionally,
  • step c) is followed by a step d) of affinity chromatography, using a device conventional chromatography, advantageously carried out on a chromatographic column whose support is a hydroxyapatite gel (Ca ⁇ o (PO 4 ) 6 (OH) 2 ) or a fluoroapatite gel (Caio (PO4) 6F2).
  • a chromatographic column whose support is a hydroxyapatite gel (Ca ⁇ o (PO 4 ) 6 (OH) 2 ) or a fluoroapatite gel (Caio (PO4) 6F2).
  • the non-lipidic aqueous phase is retained by the support, the major part of the lactic proteins not retained being eliminated.
  • the chromatographic column is preferably equilibrated in aqueous buffer A based on sodium phosphate 0.025 M-0.035 M, pH 7.5-8.5.
  • the non-lipidic aqueous phase is injected onto the column, which allows the retention of the protein of interest.
  • the unbound fraction is removed by percolation of buffer A until baseline return (RLB), which ensures proper removal of undesirable compounds, such as lactic proteins.
  • the elution of the protein is carried out by a phosphate salt-based buffer, such as sodium or potassium phosphate or a mixture thereof, at a predetermined concentration, preferably representing a phosphate-based buffer B sodium 0.25M-0.35M, pH 7.5-8.5.
  • a phosphate salt-based buffer such as sodium or potassium phosphate or a mixture thereof
  • the eluted fraction is collected until the return to baseline. Thanks to this step, more than 90% of the total lactic proteins are eliminated and more than 90% of the proteins of interest are recovered. The purity of this eluted fraction is about 5% at this stage.
  • Purity is defined as the mass ratio between the protein of interest and the total proteins present in the sample, the fraction or the eluate under consideration.
  • the specific activity of the protein or proteins is increased by a factor of 10 to 25 because of the affinity of the protein of interest to the chromatographic support.
  • the eluate obtained at the end of step d) is then advantageously subjected to a tangential filtration.
  • the tangential filtration membrane is chosen by those skilled in the art according to the characteristics of the protein of interest. In general, a cutoff threshold whose pore size is twice the molecular weight of the protein of interest allows the product to be advantageously filtered.
  • a pore size membrane of 100 kDa makes it possible to filter the FVII in good yield.
  • This filtration step is to reduce the charge, in particular to proteins of higher molecular weight than the protein of interest and, in particular, to eliminate the atypical forms of the protein of interest (for example proteins polymerized form), as well as proteases likely to eventually degrade it.
  • the filtered eluate obtained is then concentrated and dialyzed.
  • a suitable system has already been described for the ultrafiltration concentration / dialysis step.
  • the method comprises at least one ion exchange chromatography step to thereby purify the protein of interest, and, in particular, two successive chromatographic steps on ion exchangers. .
  • Their implementation notably allows the elimination of residual lactic proteins.
  • the choice of the ion exchange medium and the equilibration, washing and elution buffers depend on the nature of the protein to be purified.
  • step c This or these steps can be carried out directly after step c), or possibly after the affinity chromatography and / or tangential filtration steps.
  • the second chrornatographic step is intended to limit a possible proteolytic degradation of the protein.
  • a chromatographic support of Q-Sepharose® FF gel type on which factor VII is retained is used for the first factor VII purification chromatographic step from the non-lipidic aqueous phase.
  • An aqueous elution buffer based on Tris, preferably 0.05M, and calcium chloride, preferably 0.020M-0.05M, pH 7.0-8.0, is used in order to obtain a factor VII eluate of intermediate purity, i.e., of 25% to 75% purity.
  • the FVII eluate can then be subjected to a dialysis step, as previously described, whose buffer is a 0.15M sodium chloride solution.
  • aqueous elution buffer based on Tris, preferably 0.05M, and calcium chloride, preferably 0.005M, pH 7.0-8.0, is used for the elution of a factor fraction. VII of high purity, with a purity greater than 90%.
  • the process comprises, after the two anion exchange chromatographic steps, a third anion exchange chromatographic step.
  • This step allows the formulation of the enriched composition to be protein, so as to make it suitable for medical use.
  • the eluate obtained by the second anion exchange chromatographic step is injected, after dilution, onto a column filled with Q-Sepharose® FF gel-type support on which the factor VII is retained.
  • the factor VII retained on the support is eluted with an aqueous buffer consisting of Tris, preferably 0.02 M, and sodium chloride 0.20-0.30 M, pH 6.5-7.5. Therefore, the three anion exchange gel chromatography steps further purify the protein of interest. In addition, they allow concentration and formulation of the composition of the protein of interest.
  • the protein of interest to be purified is a coagulation factor
  • at least one of the three chromatography steps on the anion exchange supports allow the activation of any or part of the coagulation factor.
  • the first chromatography allows activation of the coagulation factor.
  • the method of the invention may also comprise at least one of the following steps: formulation, virus inactivation and sterilization.
  • the method may comprise, before the affinity chromatography step, an anti-viral treatment step which is advantageously carried out solvent / detergent, in particular in the presence of a mixture of Tween® 80 (1% w / v) and TnBP (tri-n-butyl phosphate) (0.3% v / v), which makes it possible to inactivate enveloped viruses.
  • the eluate derived from the second anion exchange chromatographic step is preferably subjected to a nanofiltration step for effective removal of viruses, particularly non-enveloped viruses, such as parvovirus B19. It is possible to use ASAHI PLANOVA TM 15 filters allowing the retention of viruses having a size greater than 15 nm.
  • These raw milks are from the first lactation of five female Fl (2nd generation of founder lines).
  • Females were selected on the basis of lactic secretion rate of FVII antigen (FVII: Ag).
  • the STAGO kit (ASSERACHROM VII) made it possible to monitor the human FVII content from day 4 to day 25 (day of milking) from the first lactation. This secretion was relatively stable for these females (between 188 and 844 IU / ml of FVII), depending on the female and the day of collection).
  • the purification process used made it possible to purify, for example, 12 mg of FVII-tg from a 500 ml pool of raw milk. The overall purification yield is 22%.
  • This concentrate is pure according to SDS-PAGE electrophoresis analysis under unreduced conditions, that is to say that the disulfide bridges are preserved, and has a complete cleavage of the heavy and light chains in a reduced condition, which translates into total conversion to activated FVII (FVIIa) during the process.
  • FVII is centrifuged at 10,000 g for 1 hour at 15 ° C.
  • a surface lipid phase cream
  • a clear non-lipid aqueous phase enriched in FVII major phase
  • a white phase solid pellet precipitates of insoluble casein and calcium compounds
  • the non-lipidic aqueous phase comprising FVII is collected at the peristaltic pump until the creamy phase.
  • the creamy phase is collected separately.
  • the solid phase (precipitate) is removed.
  • the non-lipidic aqueous phase is filtered through a filter sequence (PAIl SLK7002U010ZP - 1 ⁇ m pore size glass fiber pre-filter - then SLK7002NXP - nylon 66 0.45 ⁇ m pores).
  • a filter sequence PAIl SLK7002U010ZP - 1 ⁇ m pore size glass fiber pre-filter - then SLK7002NXP - nylon 66 0.45 ⁇ m pores.
  • the filtered non-lipidic aqueous phase is then dialyzed on an ultrafiltration membrane (Millipore Biomax 50 kDa - 0.1 m 2 ) to make it compatible with the chromatography phase.
  • the molecular weight FVII of about 50 kDa does not filter through the membrane, unlike the milk salts, sugars and peptides.
  • the solution about 5,000 ml
  • the dialysis buffer is a 0.025M sodium phosphate buffer, pH 8.2.
  • This non-lipidic aqueous phase comprising FVII can be assimilated to whey enriched in FVII-tg.
  • This preparation is stored at -30 ° C. before continuing the process.
  • the overall recovery yield of FVII by this step is very satisfactory: 90% (91% phosphate extraction + 99% Dialysis / concentration).
  • the non-lipidic aqueous phase comprising FVII at the end of this step is perfectly clear and is compatible with the chromatographic steps that follow.
  • the gel is equilibrated in aqueous buffer A consisting of a mixture of 0.025 M sodium phosphate and 0.04 M sodium chloride, pH 8.0.
  • aqueous buffer A consisting of a mixture of 0.025 M sodium phosphate and 0.04 M sodium chloride, pH 8.0.
  • the entire preparation stored at -30 ° C. is thawed on a water bath at 37 ° C. until the ice cube is completely dissolved and is then injected onto the gel (linear flow rate 100 cm / h, ie 105 ml / min).
  • the non-retained fraction is removed by passing "of a buffer consisting of sodium phosphate and 0.025 M sodium chloride 0.04 M, pH 8.2, until return to baseline (RLB).
  • Elution of the fraction containing FVII-tg is via buffer B consisting of 0.25 M sodium phosphate and 0.4 M sodium chloride, pH 8.0. The eluted fraction is collected until the return to baseline.
  • This chromatography makes it possible to recover more than 90% of the FVII-tg, while eliminating more than 95% of the lactic proteins.
  • the specific activity (A.S.) is multiplied by 25. About 85,000 IU of FVII-tg of 4% purity are available at this stage.
  • the whole of the eluate of the previous step is filtered in tangential fashion on a membrane 'of 100 kDa ultrafiltration (Pall OMEGA SC 100K - 0.1 m 2).
  • FVII is filtered through the 100 kDa membrane, while proteins with a molecular weight greater than 100 kDa are not filterable.
  • the filtered fraction is then concentrated to about 500 ml and then dialyzed on the 50 kDa ultrafilter already described in Example 1.
  • the dialysis buffer is 0.15 M sodium chloride.
  • the product is stored at -30 ° C. before passing through ion exchange chromatography.
  • This step made it possible to reduce the protein load of molecular weight greater than 100 kDa and in particular proenzymes.
  • the 100 kDa membrane treatment makes it possible to retain about 50% of the proteins including the high molecular weight proteins, while filtering 95% of the FVII-tg, ie 82,000 IU of FVII-tg.
  • This treatment makes it possible to reduce the risks of proteolytic hydrolysis during the downstream stages.
  • QSFF Q-Sepharose® Fast Flow
  • a column 2.6 cm in diameter (5.3 cm 2 section) is filled with 100 ml of Q-Sepharose® FF gel (GE Healthcare).
  • the gel is equilibrated in 0.05 M Tris buffer, pH 7.5.
  • the entire fraction stored at -30 0 C is thawed in a water bath at 37 0 C until complete dissolution of the ice cube.
  • the fraction is diluted to 1 A [v / v] with the equilibration buffer before injection on the gel (flow rate 13 ml / min, ie linear flow of 150 cm / h), then the non-retained fraction is eliminated by passage of the buffer until RLB.
  • a first low FVII protein fraction is eluted at 9 ml / min (ie 100 cm / h) with a buffer of 0.05 M Tris and 0.15 M sodium chloride, pH 7.5, and is then eliminated.
  • a second protein fraction rich in FVII is eluted at 9 ml / min (ie 100 cm / h) with a buffer of 0.05 M Tris, 0.05 M sodium chloride and 0.05 M calcium chloride, pH 7.5.
  • This second fraction is dialysed on the 50 kDa ultrafilter already described in Example 1.
  • the dialysis buffer is 0.15 M sodium chloride. This fraction is stored at + 40 ° C. overnight before the 2 nd passage. in anion exchange chromatography.
  • This step makes it possible to recover 73% of the FVII (ie 60000 IU of FVII-tg), while eliminating 80% of the accompanying proteins. It also allows the activation of FVII in FVIIa.
  • a 2.5 cm diameter column (4.9 cm 2 section) is filled with 30 ml of Q-Sepharose® FF gel (GE Healthcare).
  • the gel is equilibrated in 0.05 M Tris buffer, pH 7.5.
  • a fraction containing very high purity FVII is eluted at 4.5 ml / min (ie 50 cm / h) in buffer of 0.05 M Tris, 0.05 M sodium chloride and 0.005 M calcium chloride, pH 7.5.
  • FVII-tg About 23,000 IU of FVII-tg were purified, ie 12 mg of FVII-tg. This step eliminates more than 95% of the accompanying proteins (rabbit milk proteins).
  • This eluate of greater than 90% purity, has structural and functional characteristics close to the natural molecules of human FVII. It is concentrated and formulated by the third pass in ion exchange chromatography.
  • a column 2.5 cm in diameter (4.9 cm 2 section) is filled with 10 ml of Q-Sepharose® FF gel (GE Healthcare).
  • the gel is equilibrated in 0.05 M Tris buffer, pH 7.5.
  • the purified eluted fraction of the preceding step is diluted five times with purified water for injection (PPI) before injection on the gel (flow rate 4.5 ml / min, ie linear flow of 50 cm / h).
  • PPI purified water for injection
  • the gel is washed with the equilibration buffer to remove the non-retained fraction.
  • the FVII-tg is then eluted at a flow rate of 3 ml / min (ie 36 cm / h) with the buffer of 0.02 M Tris and 0.28 M sodium chloride, pH 7.0.
  • a concentrate of FVII-tg has been prepared with purity greater than 95%.
  • the product is compatible with intravenous injection.
  • the process has a cumulative yield of 22%, which makes it possible to purify at least 20 mg of FVII per liter of milk used.
  • Table A summarizes the process steps according to a preferred embodiment of the invention, and provides the different yields, purity and specific activities obtained at each step.

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Abstract

L'invention concerne un procédé d'extraction d'au moins une protéine présente dans du lait, ladite protéine présentant une affinité pour les ions calcium complexés ou non dudit lait, comprenant les étapes suivantes consistant à : a) libérer la protéine par la précipitation de composés de calcium obtenue par mise en contact du lait avec un sel soluble, dont l'anion est choisi pour son aptitude à former dans un tel milieu lesdits composés de calcium insolubles, pour ainsi obtenir une phase liquide enrichie en la protéine, b) séparer la phase liquide enrichie en la protéine du précipité de composés de calcium, ladite phase liquide étant en outre séparée en une phase lipidique et en une phase aqueuse non lipidique comprenant la protéine, et c) récupérer la phase aqueuse non lipidique comprenant la protéine.

Description

Procédé d'extraction d'une ou de plusieurs protéines présentes dans du lait.
La présente invention se rapporte à un procédé d'extraction d'une ou plusieurs protéines présentes dans du lait, lesdites protéines présentant une affinité pour les ions calcium complexés ou non dudit lait.
Dans le cadre de l'invention, on entend par ions calcium complexés ou non soit les sels phosphocalciques liés aux caséines pour former une structure micellaire colloïdale de caséines, soit de tels sels non liés aux caséines et gui sont donc libres. De tels ions sont également les différents sels et/ou complexes organiques et/ou inorganiques, de calcium autres que ceux cités ci-dessus, solubles dans le lait. Les protéines présentant une affinité pour les ions calcium du lait représentent, celles qui y sont naturellement présentes, tels que les lactalbumines , les lactoglobulines et les immunoglobulines . Ces protéines peuvent également représenter des protéines recombinantes présentés dans le .lait d'animaux transgéniques, comme par exemples les facteurs de la coagulation sanguine, en particulier le facteur VII, le facteur VIII et le facteur IX.
La majeure partie des médicaments disponibles dans
1 le commerce correspond à des substances chimiques obtenues par synthèse. Bn •• effet, jusqu'à récemment, la
-médecine moderne a fortement compté sur les médicaments produits par voie de synthèse chimique pour le traitement ou le diagnostic des maladies.
Toutefois, les protéines représentent une partie essentielle des molécules portant une information biologique. C'est le cas notamment d'un grand nombre d'hormones, de facteurs de croissance, de facteurs sanguins de coagulation ou encore d'anticorps.
D'une manière générale, les protéines sont des polymères à base d'acides aminés le plus souvent de haut poids moléculaire ne pouvant pas être obtenues à des coûts raisonnables par synthèse chimique. De telles protéines à usage thérapeutique sont habituellement isolées et purifiées à partir, par exemple, d'organismes vivants, de tissus ou de sang humain ou
-animal. C'est le cas notamment de l'insuline extraite du pancréas de porc, des facteurs" de la coagulation, tels que le facteur VIII ou le facteur IX, extraits du plasma sanguin, ou les immunoglobulines .
Bien que les procédés de préparation des protéines ci-dessus soient largement utilisés aujourd'hui, ils présentent toutefois des inconvénients . La faible teneur de certaines protéines, telle que l ' érythropoïétine, extraite à partir de plaquettes du sang, ne permet pas de les isoler en quantités suffisantes pour satisfaire les besoins thérapeutiques sans cesse croissants. De plus, la présence de virus, de prions ou d'autres agents pathogènes dans le plasma humain nécessite d'inclure dans les procédés de fabrication de protéines plasmatiques des étapes supplémentaires d' inactivation virale et/ou d'élimination virale afin d'obtenir de tels produits utilisables à des fins thérapeutiques . Pour pallier ces inconvénients, on a recourt au génie génétique, technique également largement utilisée pour la synthèse des protéines à partir d'un gène isolé, transféré dans " une cellule, qui prend alors en charge la sécrétion de la protéine considérée. Une telle protéine, obtenue hors de son système cellulaire d'origine, est dite « recombinante ».
Selon cette technique, différents systèmes cellulaires peuvent être utilisés.
Les systèmes bactériens, par exemple E. CoIi, sont très utilisés et efficaces. Ils permettent la production de protéines recombinantes à faible coût. Cependant, de tels systèmes sont limités à la préparation de protéines simples, non glycosylées, qui ne requièrent pas de processus élaboré de repliement.
Les systèmes fongiques sont également utilisés pour la production de protéines sécrétées . L'inconvénient de ces systèmes fongiques réside dans le fait qu'ils sont à la source de modifications post- traductionnelles , consistant par exemple en un greffage de motifs glycanniqueε et de groupes sulfates, qui affectent fortement les propriétés pharmacocinétiques des protéines produites, notamment par l'addition de divers groupements de dérivés du mannose.
Les systèmes utilisant des baculovirus permettent de produire des protéines très variées, telles que les protéines vaccinales ou l'hormone de croissance, mais leur application à l'échelle industrielle n'est pas optimisée.
On utilise également la culture de cellules de mammifères pour la préparation de protéines recombiήantes complexes, telles que les anticorps monoclonaux. Les systèmes d'expression cellulaire conduisent à des protéines recombinantes correctement repliées et modifiées . Le ' faible rendement par rapport au coût de production est un inconvénient majeur.
Une variante à de tels systèmes cellulaires consiste à mettre en oeuvre des plantes transgéniques pour l'obtention de protéines en des quantités importantes . Ces systèmes engendrent toutefois des modifications post-traductionnelles spécifiques aux plantes, en particulier par addition aux protéines produites de résidus de xylose fortement immunogènes, limitant ainsi leur utilisation à des fins thérapeutiques .
Une alternative- aux systèmes cellulaires cités précédemment consiste à utiliser les animaux transgéniques pour la production de vaccins recombinants ou de protéines thérapeutiques complexes . Les protéines ainsi obtenues présentent une glycosylation .. proche de celle de l'être humain et sont correctement repliées . Ces protéines complexes ne sont pas constituées que d'une chaîne polypeptidique simple comme par exemple l'hormone de croissance, mais elles sont modifiées de diverses manières après l'assemblage des acides aminés, notamment par des clivages spécifiques, des glycosylations et' des carboxyméthylations . Dans la grande majorité des cas, de telles modifications ne peuvent pas être effectuées par des cellules bactériennes ou de levures. En revanche, les animaux transgéniques permettent de combiner à la fois les niveaux d'expression rencontrés dans les systèmes cellulaires de bactéries et les modifications post-traductionnelles obtenues par l'intermédiaire de cultures cellulaires, tout en engendrant des coûts de production plus faibles que par la mise en œuvre des systèmes d'expression cellulaires.
Parmi' les matières biologiques d'animaux transgéniques, le lait a fait l'objet de travaux ayant conduit à le considérer • comme .une source de sécrétion très satisfaisante de protéines recombinantes .
Les protéines recombinantes, produites à partir de lait d'animaux transgéniques, peuvent être obtenues aisément par greffage du gène codant pour la protéine d'intérêt sur la région régulatrice d'un des gènes de synthèse de protéines du lait qui va diriger celle-ci spécifiquement dans la glande mammaire, puis sa sécrétion dans le lait.
A titre d'exemple, on peut citer la demande de brevet EP 0 527 063 qui décrit la production d'une protéine d'intérêt dans le lait d'un mammifère transgénique, l'expression du gène codant pour .la protéine d'intérêt étant contrôlée par un promoteur d'une protéine du lactosérum. D'autres demandes de brevet ou brevets décrivent la préparation d'anticorps (EP 0 741 515) , de collagène (WO 96/03051), de facteur IX humain (US 6 046 380 et de complexes facteur VlII/facteur von Willebrand (EP 0 807 170) dans le lait de mammifères transgéniques.
Malgré les résultats satisfaisants de ces méthodes en termes d'expression des protéines, l'utilisation du lait comme source de protéines recombinantes présente des inconvénients. L'inconvénient majeur réside dans les difficultés, d'une part, de les extraire du lait avec un rendement satisfaisant et, d'autre part, de les purifier subséguemment . En effet, le lait est un mélange constitué à 90% d'eau comprenant divers constituants que l'on peut regrouper en trois catégories. La première catégorie, appelée lactosérum (ou petit lait) , est constituée de glucides, de protéines solubles, de minéraux et de vitamines hydrosolubies . La deuxième catégorie, appelée phase lipidique (ou crème) , contient des matières grasses sous forme d'émulsion. - La troisième catégorie, dénommée phase protéinique, est constituée d'environ 80% de caséines, lesquelles forment un ensemble de protéines précipitables à un pH de 4,6 ou sous l'action de la présure, coagulant enzymatique, en présence de calcium. Les différentes caséines forment un complexe micellaire colloïdal, pouvant atteindre des diamètres
'd'environ 0,5 μm, avec des sels phosphocalciques, se présentant par exemple sous la forme d'agrégats (« clusters ») de phosphate tricalcique, soit Cag(Pθ4)6- De telles micelles sont formées de sous-unités de caséines constituées d'une couche hydrophile riche en caséine-K entourant un noyau hydrophobe, les sels phosphocalciques étant liés par interaction électrostatique sur la couche hydrophile. Ces sels phosphocalciques peuvent également être présents dans le volume interne de la micelle sans être liés à la caséine. Cette phase protéinique contient également des protéines solubles, telles que les lactalbumines et les lactoglobulines, ainsi que les albumines et les immunoglobulines provenant du sang. En fonction de la nature de la protéine recombinante sécrétée dans le lait d'animaux transgéniques, celle-ci peut être présente dans le lactosérum ou dans la phase protéinique, voire dans les deux à la fois . La richesse et la complexité de chaque catégorie de constituants du • lait rendent d'autant plus difficile la mise en oeuvre d'une extraction de cette protéine, notamment celle piégée dans les micelles de caséines. Une autre difficulté réside dans le fait que la présence majoritaire de cette protéine dans l'une des deux phases n'est pas prévisible avec certitude.
Une protéine recombinante peut également présenter des affinités pour les ions calcium du lait qui sont présents sous la forme soit de sels et/ou divers complexes solubles, soit de sels phosphocalciques des micelles de caséines. Ces affinités se traduisent par des liaisons électrostatiques entre la protéine et les cations divalents du calcium. Les affinités protéine/ions calcium permettent de définir les constantes d'affinités qui, en fonction de leur valeur, déterminent la force de liaison. De façon générale, la majeure partie des protéines présentant une affinité pour les ions calcium est liée aux sels phosphocalciques des micelles. Son extraction nécessite la mise en œuvre d'étapes complexes, ce qui pose des problèmes de mise en œuvre et de rendement.
La solution classique utilisée dans l'industrie laitière pour isoler IeB ptXMM^Φ^1 "Çûrïëistant à une pasteurisation suivie d'une coagulation enzymatique ou précipitation acide (pH 4,6) ne peut s'appliquer dans ce cas, car les protéines recombinantes sont souvent dénaturées sous l'effet combiné de la température et du pH. De plus, le piégeage des protéines dans les micelles de caséines conduit à de faibles rendements d'extraction. D'autres solutions consistant à mettre en œuvre des méthodes physiques de fractionnement du lait par les techniques de filtration, de centrifugation et/ou de sédimentation ou de précipitation conduisent également à des rendements d'extraction inacceptables et à des protéines recombinantes extraites de faible pureté. Le document EP 0 264 166 décrit la sécrétion d'une protéine désirée dans du lait d'animaux génétiquement transformés. Ce document ne mentionne pas d'étapes de purification de cette protéine à partir du lait.
Le brevet US 4 519 945 décrit un procédé d'extraction d'une protéine recombinante par la préparation d'un précipité de caséines et de lactosérum à partir du lait, mettant en œuvre des étapes d'acidification et de chauffage, comme mentionné précédemment . Ce procédé engendre une perte significative de l'activité de la protéine considérée et un faible rendement d'extraction.
Le brevet US 6 984 772 divulgue un procédé de purification du fibrinogène recombinant à partir de lait d'un mammifère transgénique. Ce procédé comprend une étape de séparation du lactosérum du culot de caséines et de la phase protéinique par des centrifugations successives. Le lactosérum est isolé
• puis conservé pour la suite du procédé conduisant à une solution de fibrinogène purifiée. Toutefois, ce procédé ne peut être appliqué à la production, à rendement satisfaisant, de protéines recombinantes piégées dans et/ou sur les micelles de caséines, telles que les facteurs plasmatiques de la coagulation, par exemple le facteur VII, le facteur VIII et le facteur IX.
La -demande de brevet WO 2004/076695 décrit un procédé de filtration de protéines recombinantes à partir de lait d'animaux transgéniques. Ce procédé comprend une première étape de clarification du lait, c'est-à-dire une étape consistant à éliminer les composants du lait de façon à obtenir une solution susceptible d'être filtrable à travers une membrane de filtre dont les pores présentent un diamètre de 0,2 μm. Une telle étape aboutit à une élimination de micelles de caséines. Par conséquent, la mise en oeuvre de cette étape peut être rédhibitoire, en termes .de rendement, si les micelles de caséines sont susceptibles de contenir une protéine d'intérêt piégée au sein de leur structure.
Le brevet US 6 183 803 décrit un procédé de d'isolation de protéines naturellement présentes dans le lait, telles que les lactalbumines , et de protéines recombinantes, par exemple l'albumine humaine ou l'αl- antitrypsine, à partir de lait. Ce procédé comprend une étape initiale de mise en contact du lait comprenant une protéine d'intérêt avec un agent chélatant. Ceci engendre la déstructuration des micelles de caséines, ce qui conduit à un sérum de lait clarifié comprenant les caséines, les protéines du lactosérum et la protéine d'intérêt. Le procédé comprend ensuite une étape de restructuration des micelles de caséines par ajout au milieu liquide (sérum de lait clarifié) de sels de cations divalents insolubles . Ces micelles précipitent, ce qui' conduit à une phase liquide comprenant la protéine d'intérêt qui n'est pas piégée par les micelles, étant donné que les sels saturent les sites de liaison électrostatique des caséines. Selon ce procédé, la séparation de la protéine d'intérêt est donc effectuée au final par restructuration des micelles et leur précipitation.
Ce procédé est de mise en oeuvre complexe et ne peut être appliqué aux protéines ayant une affinité relativement élevée pour les ions calcium. Les protéines de la coagulation, et notamment celles connues comme étant synthétisées sous l'influence de la vitamine K, se trouvent dans cette catégorie. Partant d'un double constat que les procédés de séparation et de purification de certaines catégories de protéines recombinantes sécrétées dans le lait d'animaux transgéniques présentes dans le lactosérum conduisent à des rendements très faibles, et de ceux d'autres catégories de protéines qui sont piégées dans les micelles de caséines, sont de mise en œuvre complexe, la Demanderesse s'est fixée pour objectif de mettre à disposition un procédé d'extraction, à partir du lait, de protéines constitutives du lait, naturelles ou non, telles que le facteur VII, le facteur VIII et le facteur IX recombinants, présentant une affinité pour les formes ioniques du calcium du lait, de mise en œuvre simplifiée, conduisant en outre à un rendement de production satisfaisant, tout en conservant l'activité biologique de la protéine.
L'invention concerne donc un procédé d'extraction d'au moins une protéine présente dans du lait, ladite protéine présentant une affinité pour les ions calcium complexés ou non dudit lait, comprenant les étapes suivantes consistant à : a) libérer la protéine par la précipitation de composés de calcium obtenue par mise en contact du lait avec un sel soluble, dont l'anion est choisi pour son aptitude à former dans un tel milieu lesdits composés de calcium insolubles, pour ainsi obtenir une phase liquide enrichie en la protéine, b) séparer la phase liquide enrichie en la protéine du précipité de composés de calcium, ladite phase liquide étant en outre séparée en une phase lipidique et en une phase aqueuse non lipidique comprenant la protéine, et c) récupérer la phase aqueuse non lipidique comprenant la protéine .
La Demanderesse a constaté d'une manière surprenante que le fait d'ajouter un sel soluble, dont l'anion est choisi pour sa capacité à former des précipités de composés de calcium dans le lait, contenant une protéine, notamment recombinante, présentant une affinité pour les ions calcium complexés ou non, c'est-à-dire présentant des sites de fixation aux ions calcium, permet la précipitation des composés de calcium, alors que la protéine d'intérêt est libérée de ces ions complexés ou non et se retrouve en solution dans la phase liquide.
Les ions calcium complexés ou non, comme indiqué plus haut, représentent les différents sels et/ou complexes organiques et/ou inorganiques de calcium solubles dans le lait. Ces sels ou complexes peuvent être présents dans le volume interne de la micelle de caséine (voir plus loin à la Figure 1) .
Ces ions calcium représentent également les sels phosphocalciques en interaction avec les micelles de caséines, notamment sous forme d'agrégats (« clusters ») . Ces sels sont également présents dans le lait sous forme de phosphate monocalcique et/ou de phosphate dicalcique, qui sont en équilibre avec les autres formes ioniques de calcium en fonction des réactions chimiques et biochimiques mises en œuvre.
Enfin, ces ions calcium représentent des complexes calcium/caséine, c'est-à-dire représentant des sous- unités de caséine auxquelles sont associés, par interaction électrostatique, les sels phosphocalciques. Ces complexes calcium/caséine désignent aussi les micelles de caséines associées avec les sels phosphocalciques et avec les sels . et/ou complexes organiques et/ou inorganiques de calcium solubles.
On entend par composés de calcium insolubles, des sels ou complexes de calcium dont la solubilité dans le lait est inférieure à 0,5%.
Dans la majeure partie des cas, les protéines d'intérêt seront majoritairement associées aux sels phosphocalciques des micelles de caséines. On entend ainsi par protéine présentant une affinité pour les ions calcium complexés ou non, toute protéine ayant un nombre suffisant de sites de fixation aux ions calcium pour y être associée, totalement ou partiellement, ou pour être associée, totalement ou partiellement, aux sels phophocalciques des micelles de caséines . A titre d'exemple, dans le cas de protéines d'intérêt présentant de nombreux sites de fixation aux ions calcium, par exemple 8 à 10 domaines GLA, qui sont des domaines riches en acides γ-carboxyglutamiques permettant de fixer les ions calcium, au moins 70% jusqu'à 90% des protéines d'intérêt sont piégées dans et/ou sur les micelles de caséine. Pour d'autres protéines présentant de moindres sites de fixation aux ions calcium, par exemple 2 à 8 domaines GLA, au moins 30% jusqu'à 60% de celles-ci sont piégées dans et/ou sur les micelles de caséines. Enfin, même les protéines présentant très peu de sites de fixation aux ions calcium, par exemple 0 à 2 domaines GLA, sont susceptibles d'être piégées dans et/ou sur les micelles de caséine, par exemple à raison d'au moins 5% jusqu'à 20%. De telles quantités de protéines piégées .ne sont pas négligeables pour la mise en œuvre d'un procédé à l'échelle industrielle, qui implique le fait d'atteindre un rendement le plus important possible. Le reste des protéines d'intérêt, non piégées dans et/sur les micelles, présentent une affinité pour les autres formes d'ions calcium du lait citées ci-dessus.
Par conséquent, le procédé de l'invention peut s'appliquer à l'extraction de protéines dont au moins 2% jusqu'à 10%, ou au moins 40% jusqu'à. 60% ou, en particulier, au moins 90% sont associées à ces ions calcium.
Une telle affinité de la protéine pour les ions calcium peut résulter des interactions de la protéine non modifiée ou modifiée in vivo ou in vitro par exemple par des modifications post-traductionnelles .
Ainsi, les protéines présentant de nombreux sites de fixation aux ions calcium complexés ou non peuvent se retrouver associées aux différentes formes de calcium présentes dans le lait.
Sans être liée par une quelconque interprétation des mécanismes observés, la Demanderesse suppose que l'ajout du sel soluble déplace l'équilibre des sels phosphocalciques des micelles, notamment le rapport calcium/phosphate, provoquant ainsi leur déstructuration et la précipitation d'agrégats de sous- unités de caséines. Les protéines d'intérêt associées aux sels phosphocalciques piégées dans et/ou sur les micelles sont libérées dans le milieu lors de -cette déstructuration. De plus, les protéines d'intérêt sont alors également libérées ou dissociées des sels phosphocalciques , car ceux-ci précipitent sous la forme de composés de calcium insolubles sous l'effet du sel soluble utilisé dans le procédé de l'invention. De même, les protéines d'intérêt qui peuvent également être associées aux sels ou complexes organiques et/ou inorganiques de calcium solubles en seraient également dissociées, par le même type de réaction.
Un exemple d'un tel mécanisme est illustré à la Figure 1.
Dans le cadre de l'invention, le sel soluble représente tout sel permettant d'obtenir l'effet voulu. Le sel soluble utilisé dans le procédé de l'invention peut être ajouté dans le lait à une concentration choisie par l'homme du métier pour parvenir à la libération de la protéine de ces interactions avec les ions calcium. A ce titre, il s'agit d'une concentration suffisante pour permettre la libération d'au moins 20%, ou avantageusement d'au moins 30% jusqu'à 50% des protéines d'intérêt. De manière particulièrement avantageuse, il s'agit d'une concentration suffisante pour permettre la séparation d'au moins 60% jusqu'à 80%, ou d'au moins 90% des protéines d'intérêt. De plus, le procédé de l'invention peut également s'appliquer à des protéines dont une partie seulement présente des sites de fixation aux ions calcium. Par exemple, le procédé de l'invention peut s'appliquer à l'extraction de protéines présentes dans le lait dont 1% du total est associé aux ions calcium. Le procédé peut également s'appliquer à des protéines dont au moins 2% jusqu'à 10%, ou au moins 40% jusqu'à 60% ou, en particulier, au moins 90% sont associées à ces ions calcium.
Le procédé de l'invention permet la précipitation notamment des agrégats de sous-unités de caséines. Cette précipitation est due à la déstructuration des micelles de caséines, comme indiqué plus haut. La mise en œuvre du procédé de l'invention déstabilise, par la précipitation, l'état colloïdal dans lequel se trouve le lait.
Le procédé de l'invention est donc un procédé permettant le passage du lait d'un état colloïdal à un état liquide, ce qui correspond à une extraction directe colloïdes/liquides .'
Le procédé de l ' invention permet également d'obtenir le lactosérum et la phase lipidique dont la coloration est plus claire que celle du lait de départ. En effet, ce sont les caséines liées aux ions calcium qui donnent leur couleur blanche au lait. Une fois précipitées, elles ne peuvent plus conférer cette couleur au lait.
Le procédé de l'invention présente donc plusieurs avantages : il est d'abord d'une mise en œuvre très aisée, puisqu'il permet la séparation des protéines d'intérêt par des étapes de mise en œuvre simplifiée. De plus, il permet une récupération des protéines d'intérêt dans la phase aqueuse non lipidique avec un très bon rendement. Avantageusement, le procédé d'extraction de l'invention a un rendement d'au moins 50%, ou d'au moins 60%, ou bien encore d'au moins 80%. De manière particulièrement avantageuse, le rendement est d'au moins 90%.
Ce procédé va également permettre d'obtenir la phase aqueuse non lipidique comprenant la protéine d'intérêt sous une forme compatible avec la mise en œuvre d'étapes ultérieures de purification de celle-ci, notamment des étapes de chromatographie.
Enfin, les protéines d'intérêt sont encore biologiquement actives, étant donné que les étapes du procédé de l'invention sont mises en œuvre à un pH n'altérant pas leur activité biologique. Le pH est avantageusement basique, par exemple voisin de 8.
Par sel soluble selon l'invention on entend un sel dont la solubilité dans le lait est d'au moins 0,5 partie de sel par partie de lait (p/p) .
Avantageusement, le sel soluble, utilisé dans le procédé, est un sel de phosphate. Le sel peut être dans une solution aqueuse qui est ajoutée au lait, ou il peut être ajouté directement au lait sous forme de poudre.
De préférence, le sel de phosphate est choisi dans le groupe constitué par le phosphate de sodium, le phosphate de lithium, le phosphate de potassium, le phosphate de rubidium et le phosphate de césium, et est, en particulier, le phosphate de sodium.
En variante, le sel soluble utilisé pour la mise en œuvre du procédé de l ' invention peut être un oxalate d'un métal alcalin, en particulier 1 Oxalate de sodium ou de potassium, ou un carbonate d'un métal alcalin, en particulier le carbonate de sodium ou de potassium, ou leur mélange .
Avantageusement, la concentration du sel soluble en solution aqueuse, qui est ainsi préparée pour la mise en œuvre du procédé, est comprise entre 100 mM et 3 M, de façon plus préférée, entre 200 mM et 500 mM et, en particulier, entre 200 mM et 300 mM. Ainsi, selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le sel soluble de l'invention est le phosphate de sodium, dont la concentration en solution aqueuse est comprise entre 100 mM et 3 M, de façon plus préférée, entre 200 mM et 500 mM et, en particulier, entre 200 mM et 300 mM.
Le lait dans lequel se trouve la protéine d'intérêt à extraire peut être du lait brut non écrémé ou du lait écrémé. L'avantage d'appliquer le procédé de l'invention à du lait écrémé réside dans le fait qu'il contient une quantité plus faible de lipides. Le procédé peut aussi être appliqué à du lait frais ou congelé.
L'étape b) permet la séparation de la phase liquide en une phase lipidique et une phase aqueuse non lipidique' comprenant la protéine qui est de préférence effectuée par centrifugation. La phase aqueuse non lipidique est assimilée à du lactosérum. Cette étape de séparation permet également d'isoler les agrégats de sous-unités micellaires de caséines et le précipité de composés de calcium.
La phase aqueuse non lipidique comprenant la protéine est séparée de la phase lipidique.
Cette étape permet d'obtenir avantageusement une phase aqueuse non lipidique limpide. .
Le procédé peut en outre comprendre, après l'étape c) , une étape de filtration de la phase aqueuse non lipidique effectuée successivement sur des filtres de porosité décroissante, de préférence, de 1 μm puis de 0,45 μm. L'utilisation de ces filtres, tels qu'à base de fibres de verre, permet de réduire la teneur en lipides éventuellement encore présents, globules gras et de phospholipides naturellement présents dans le lait. Une porosité inférieure à 0,5 μm permet de maintenir la qualité bactériologique de la phase aqueuse non lipidique, ainsi que des supports de purification mis en œuvre postérieurement (ultrafiltres, colonne de chromatographie etc.) (voir plus loin) . La phase lipidique est, de préférence, filtrée à travers ces filtres qui retiennent ainsi complètement les globules lipidiques du lait, et le filtrat est clair.
Cette étape peut être suivie d'une étape de concentration/dialyse par ultrafiltration.
La concentration permet de réduire le volume de la phase aqueuse non lipidique en vue de sa conservation. La membrane d'ultrafiltration est choisie par l'homme du métier en fonction des caractéristiques de la protéine d'intérêt. De façon générale, un seuil de coupure dont la taille des pores est inférieure ou égale au poids moléculaire de la protéine d'intérêt permet de concentrer le produit sans perte notable. Par exemple, une membrane de taille de pores à 50 kDa permet de concentrer sans perte du FVII dont le poids moléculaire est de 50 kDa.
La dialyse est destinée à conditionner la phase aqueuse de protéines pour des étapes ultérieures éventuelles de purification, notamment par chromatographie. Elle permet également d'éliminer les composants de faible taille moléculaire, comme les lactoses, les sels, les peptides, les protéoses peptones et tout agent pouvant nuire à la conservation du produit.
De préférence, le tampon de dialyse est une solution de phosphate de sodium 0,025 M-O, 050 M, pH 7,5-8,5. La phase aqueuse non lipidique obtenue après l'étape c) , ou, le cas échéant, obtenue après les étapes de filtration et/ou de concentration/dialyse, peut être congelée et stockée à une température de - 300C dans l'attente de la mise en oeuvre d'étapes ultérieures de leur purification.
Le procédé de l'invention permet ainsi l'extraction et, le cas échéant, la séparation d'une ou de plusieurs protéines d'intérêt des ions calcium du lait auxquels elles sont liées par des interactions électrostatiques .
La protéine peut être une protéine naturellement présente dans le lait, et représente, à titre d'exemple, la β-lactoglobuline, la lactoferrine, l'α- lactalbumine, les immunoglobulines ou les protéoses peptones, ou leur mélange.
La protéine peut également être une protéine non naturellement présente dans le lait. On peut citer à titre d'exemple le facteur VII, le facteur VIII, le facteur IX, le facteur X, l'alpha-1 anti-trypsine, 1 'anti-thrombine III, l'albumine, le fibrinogène, l'insuline, la protéine basique- de la myéline, la proinsuline, l'activateur tissulaire du plasminogène et les anticorps .
Ainsi, selon une forme de mise en œuvre, préférée de l'invention, le lait contenant la -protéine d'intérêt est un .lait transgénique. En effet, les protéines non naturellement présentes, dans le lait pourront y être synthétisées par des mammifères transgéniques non-humains, grâce aux techniques de l'ADN recombinant et de la transgénèse.
Ces techniques, bien connues de l'homme du métier, permettent de synthétiser toute protéine d'intérêt dans le lait d'un animal transgénique.
Une telle protéine est alors une protéine recombinante ou transgénique, ces deux termes étant considérés comme équivalents dans la présente demande, synthétisée grâce aux techniques de l'ADN recombinant.
On entend par « animal transgénique » tout animal non- humain ayant incorporé dans son génome un fragment d'ADN exogène, notamment codant pour une protéine d'intérêt, cet animal exprimant la protéine codée par l'ADN exogène, et susceptible de transmettre l'ADN exogène à sa descendante. A ce titre, tout mammifère non-humain est adapté à la production d'un tel lait.
Avantageusement, on peut utiliser la lapine, la brebis, la chèvre, la vache, la truie et la souris, cette liste n'étant pas limitative.
La sécrétion par les glandes mammaires de la protéine d'intérêt, permettant sa sécrétion dans le lait du mammifère transgénique, implique le contrôle de l'expression de la protéine recombinante de manière tissus-dépendante.
De telles méthodes de contrôle sont bien connues de l'homme du métier. Le contrôle de l'expression est effectué grâce à des séquences permettant l'expression de la protéine vers un tissu particulier de .1 ' animal . Ces séquences sont notamment les séquences promoteur, ainsi que les séquences peptides signal.
Des exemples de promoteurs bien connus de l'homme du métier sont le promoteur WAP (whey acidic protein) , le promoteur de la caséine, le promoteur de la β- lactoglobuline, cette liste n'étant pas limitative.
Une méthode de production d'une protéine recombinante dans le lait d'un animal transgénique peut comporter les étapes suivantes : une molécule d'ADN synthétique comprenant un gène codant pour une protéine d'intérêt, ce gène étant sous le contrôle - d'un promoteur d'une protéine sécrétée naturellement dans le lait, est intégrée dans un embryon d'un mammifère non humain. L'embryon est ensuite placé dans une femelle de mammifère de la même espèce laquelle donne ainsi naissance à un animal transgénique. Une fois que ce sujet s'est suffisamment développé, la lactation du mammifère est induite, puis le lait collecté. Le lait contient alors la protéine recombinante d'intérêt.
Un exemple de procédé de préparation de protéine dans le lait d'une femelle de mammifère autre que l'être humain est donné dans le document EP 0 527 063, dont l'enseignement peut être repris pour la production de la protéine d'intérêt de l'invention.
Un plasmide contenant le promoteur WAP est fabriqué par introduction d'une séquence comportant le promoteur du gène WAP, ce plasmide étant réalisé de manière à pouvoir recevoir un gène étranger placé sous la dépendance du promoteur WAP. Le gène codant pour une protéine d'intérêt est intégré, et placé sous la dépendance du promoteur WAP. Le plasmide contenant le promoteur et le gène codant pour la protéine d'intérêt sont utilisés pour obtenir des animaux transgéniques, par exemple des lapines, par microinjection dans le pronucléus mâle d'embryons de lapins. Les embryons sont ensuite transférés dans l'oviducte de femelles hormonalement préparées. La présence des transgènes est révélée par la technique de Southern à partir de l'ADN extrait des lapereaux transgéniques obtenus . Les concentrations dans le lait des animaux sont évaluées à l'aide de tests radioimmunologiques spécifiques. Avantageusement, la protéine produite dans le lait et- extraite selon le procédé de l'invention est une protéine de la coagulation, ou facteur de coagulation. En effet, il est connu que de telles protéines présentent une forte affinité pour les ions calcium (Hibbard et al. (1980), J. Biol. Chem. 1980, Jan 25; 255 (2) : 638-645) . Selon un aspect particulier de l'invention, le facteur de la coagulation est activé pendant le procédé d'extraction de l'invention. Il peut s'agir notamment de protéines- « vitamine • K- dépendantes », qui sont des facteurs indispensables à la coagulation du sang.
Avantageusement, la protéine produite dans le lait et extraite- selon le procédé de l'invention est -, une protéine comportant des « GLA-domaines », qui ont la capacité de fixer les- ions calcium, ou encore des protéines comportant des « domaine EGF » (epidermal growth factor) ou d'autres domaines identifiés comme. ayant une capacité à fixer des ions calcium, tels que des structures dites en « main EF » (motif hélice- • boucle-hélice permettant la fixation de l'ion calcium).
Par ailleurs, les protéines calcium-dépendantes sont également des protéines susceptibles de pouvoir être purifiées par le procédé de l'invention, notamment les anticorps ou les anticorps monoclonaux.
Avantageusement, la protéine de l'invention est choisie parmi le facteur II (FII) , le facteur VII (FVII) , le facteur IX (FIX) et le facteur X (FX) , ainsi que leurs formes activées, la protéine C, la protéine C activée, la protéine S et la protéine Z, ou leur mélange .
De manière particulièrement avantageuse, .. la protéine de l'invention est le FVII, ou le FVII activé (FVIIa) .
A cet égard, le FVII ou le FVIIa peut être produit selon l'enseignement du document EP 0 527 063, et dont le résumé de la méthode est donné ci-avant. Un fragment d'ADN dont la séquence est celle du FVII humain est alors placé sous le contrôle du promoteur WAP. Par exemple, une telle séquence d'ADN figure sous le numéro de séquence Ib décrite dans le document EP 0 200 421.
Avantageusement, le FVII de l'invention est activé. Le FVIIa résulte, in vivo, du clivage du zymogène par différentes protéases (FIXa, FXa, FVIIa) en deux chaînes réunies par un pont disulfure. Le FVIIa seul a très peu d'activité enzymatique, mais complexé avec son cofacteur, le facteur tissulaire (FT) , il déclenche le processus de la coagulation en activant le FX et le FIX.
Le FVIIa présente une activité coagulante 25 à 100 fois supérieure à celle du FVII lorsqu'ils interagissent avec le facteur tissulaire (FT) . Dans un mode de réalisation de l'invention, le FVII peut être activé in vitro par les facteurs Xa, VIIa, lia, IXa et XIIa. Le FVII de l'invention peut également être activé pendant son procédé de purification.
La Demanderesse a constaté de manière surprenante que la protéine d'intérêt, même placée sous le contrôle d'un promoteur d'une protéine naturellement produite dans le lactosérum, comme le promoteur WAP par exemple, est néanmoins susceptible de se trouver associée aux ions calcium, et donc aux micelles de caséines.
Ainsi, le procédé de l'invention peut être utilisé pour la séparation de protéines recombinantes produites sous le contrôle d'un promoteur d'une protéine du lactosérum.
Par ailleurs, le procédé de l'invention est particulièrement adapté à la séparation de protéines recombinantes produites sous le contrôle d'un promoteur de caséines .
La protéine peut également être choisie parmi le facteur VIII, l' alpha-1 anti-trypsine, l 'anti-thrombine III, l'albumine, le fibrinogène, l'insuline, la protéine basique de la myéline, la proinsuline, l'activateur tissulaire du plasminogène et les anticorps, ou leur mélange.
Le procédé de l ' invention peut également être utilisé pour la préparation d'une protéine recombinante lactique. Dans ce cas, il peut s'agir d'une protéine lactique synthétisée par la glande mammaire d'un animal d'une autre espèce (Simons et al, (1987) , Aug 6-12 ;
328 (6130) :530-532) . A ce titre, on peut citer comme exemple la lactoferrine, la lactoglobuline, le lysozyme et la lactalbumine transgéniques .
Un autre objet de l'invention concerne une phase aqueuse non lipidique du lait comprenant au moins une protéine susceptible d'être obtenue par le procédé de l'invention. Avantageusement, la phase aqueuse est hypersaline, basique, et contient des caséines solubles et au moins une autre protéine d'intérêt. Par hypersaline, on entend de manière préférentielle une concentration d'au moins 7 g/1 d'ions sodium, ou au moins 18 g/1 de chlorure de sodium, ou au moins 0,3 molaire de chlorure de sodium. Préférentiellement, cette concentration est d'environ 8 g/1 d'ions sodium ou d'environ 20 g/1 de chlorure de sodium. Par basique, on entend un pH compris entre 8 à 9, et de manière préférentielle supérieur à 7,8. Les caséines solubles représentent au moins 25% des caséines totales, et de manière préférentielle au moins 50% des caséines totales.
Une telle phase comporte au moins 50%, ou avantageusement au moins de 60% jusqu'à 80% du total des protéines d'intérêt à purifier par rapport au lait n'ayant pas subi les étapes du procédé. De manière particulièrement avantageuse, la phase aqueuse non lipidique comprend au moins 90% du total des protéines d'intérêt présentes dans le lait avant extraction.
Selon une mise en œuvre préférée de l'invention, la protéine d'intérêt présente dans la phase aqueuse non lipidique est le facteur VII (FVII) ou le facteur VII activé (FVIIa)'.
•La phase aqueuse non lipidique de -l'invention, même si elle ne contient plus de micelles de caséines et de composés de calcium insolubles, comprend toutefois encore majoritairement des impuretés. Par conséquent, il est nécessaire, selon les cas, de procéder à une purification de la protéine dans la phase aqueuse.
Le procédé de l'invention peut en outre comprendre des étapes ultérieures de' purification de la phase aqueuse non lipidique comprenant la ou les protéines' d'intérêt, obtenue après l'étape c) ou, éventuellement,
' après les étapes de filtration et de concentration/dialyse mises en œuvre après cette étape c) .
Ainsi, l'étape c) est suivie d'une étape d) de chromatographie d'affinité, utilisant un dispositif chromatographique conventionnel, avantageusement mise en oeuvre sur une colonne chromatographique dont le support est un gel d'hydroxyapatite (Caχo (PO4) 6 (OH) 2) ou un gel de fluoroapatite (Caio (PO4) 6F2) • Ainsi, la protéine de la phase aqueuse non lipidique est retenue par le support, la majeure partie des protéines lactiques non retenue étant éliminée. La détection est assurée par mesure de l'absorbance à λ= 280 nm.
La colonne chromatographique est de préférence équilibrée en tampon aqueux A à base de phosphate de sodium 0,025 M-O, 035 M, pH 7,5-8,5. La phase aqueuse non lipidique est injectée sur la colonne, ce qui permet la rétention de la protéine d'intérêt. La fraction non retenue est éliminée par percolation du tampon A, jusqu'au retour à la ligne de base (RLB), ce qui assure -une bonne élimination des composés indésirables, telles que les protéines lactiques.
L'élution de la protéine est effectuée par un tampon à base d'un sel de phosphate, tel que le phosphate de sodium ou de potassium ou leur mélange, à une- concentration prédéterminée, de préférence représentant un tampon B à base de phosphate de sodium 0,25 M-0, 35 M, pH 7,5-8,5. La fraction éluée est collectée jusqu'au retour à la ligne de base. Grâce à cette étape, plus de 90% du total des protéines lactiques sont éliminés et plus de 90% des protéines d'intérêt sont récupérées. La pureté de cette fraction, éluée est d'environ 5% à cette étape.
La pureté -est définie comme étant le rapport massique entre la protéine d'intérêt et les protéines totales présentes dans l'échantillon, la fraction ou l ' éluat considéré .
Avantageusement, l'activité spécifique de la ou des protéines est accrue d'un facteur 10 à 25 du fait de l'affinité de la protéine d'intérêt au support chromatographique . L'éluat obtenu à l'issue de l'étape d) est ensuite avantageusement soumis à une filtration tangentielle.
La membrane de filtration tangentielle est choisie par l'homme du métier en fonction des caractéristiques de la protéine d'intérêt. De façon générale, un seuil de coupure dont la taille des pores est deux fois supérieure au poids moléculaire de la protéine d'intérêt permet de filtrer avantageusement le produit.
Par exemple, une membrane de tailles de pores de 100 kDa permet de filtrer le FVII avec un bon rendement.
Le but de cette étape de filtration est de réduire la charge notamment en protéines de poids moléculaire supérieur à celui de la protéine d'intérêt et, en particulier, d'éliminer les formes atypiques de la protéine d'intérêt (par exemple des protéines sous forme polymérisée) , ainsi que des protéases susceptibles, à terme, de la dégrader.
De façon très préférée, l'éluat filtré obtenu est ensuite concentré et dialyse. Un système approprié a déjà été décrit pour l'étape de concentration/dialyse par ultra-filtration.
Selon une mise en oeuvre préférée de l'invention, le procédé comprend au moins une étape de chromatographie d'échange d'ions pour ainsi purifier la protéine d'intérêt, et, en particulier, deux étapes chromatographiques successives sur des échangeurs d'ions. Leur mise en œuvre permet notamment l'élimination des protéines lactiques résiduelles.
Le choix du support échangeur d'ions et des tampons d'équilibrage, de lavage et d'élution dépendent de la nature de la protéine à purifier.
Cette ou ces étapes peuvent être effectuées directement après l'étape c) , ou, éventuellement, après les étapes de chromatographie d'affinité et/ou de filtration tangentielle.
De préférence, l'au moins une étape et les deux étapes de chromatographie sont des chromatographies d'échange d'anions. De façon très préférée, celles-ci sont mises en oeuvre avec des supports chromatographiques de type base faible. La détection des composés est assurée par mesure de l'absorbance à K= 280 nm.
La deuxième étape chrornatographique est destinée à limiter une éventuelle dégradation protéolytique de la protéine.
A titre d'exemple, on utilise, pour la première étape chromatographique de purification du facteur VII à partir de la phase aqueuse non • lipidique, un support chromatographique de type gel Q-Sepharose® FF sur lequel le facteur VII est retenu. Il est utilisé un tampon d'élution aqueux à base de Tris, de préférence 0,05 M, et de chlorure de calcium, de préférence 0,020 M-0, 05 M, pH 7,0-8,0, afin d'obtenir un éluat de facteur VII de pureté intermédiaire, c'est-à-dire d'une pureté de 25% à 75%.
L ' éluat de FVII peut ensuite être soumis à une étape de dialyse, comme décrit précédemment, dont le tampon est une solution de chlorure de sodium 0,15 M.
Pour la deuxième étape chromatographique, on utilise, par exemple pour la purification de l' éluat de facteur VII obtenu par l'étape précédente, éventuellement dilué pour permettre de nouveau son adsorption, un support chromatographique de type gel Q- Sepharose® FF sur lequel le facteur VII est retenu. On utilise un tampon d'élution aqueux à base de Tris, de préférence 0,05 M, et de chlorure de calcium, de préférence 0,005 M, pH 7,0-8,0, pour l'élution d'une fraction de facteur VII de haute pureté, soit d'une pureté supérieure à 90%.
Selon une mise en œuvre préférée de l'invention, le procédé comprend, après les deux étapes chromatographiques d'échange d'anions, une troisième étape chromatographique d'échange d'anions. Cette étape permet la formulation de la composition enrichie en la protéine, de manière à la rendre adaptée à une utilisation médicale. De façon très préférée, la troisième étape chromatographigue est effectuée en utilisant un support chromatographique de type base faible. La détection des composés est également assurée par mesure de l ' absorbance à X= 280 nm.
A titre d'exemple, l ' éluat obtenu par la deuxième étape chromatographique d'échange d'anions est injecté, après dilution, sur une colonne remplie de support de type gel Q-Sepharose® FF sur lequel le facteur VII est retenu. Le facteur VII retenu sur le support est élue par un tampon aqueux constitué de Tris, de préférence 0,02 M, et de chlorure de sodium 0,20-0,30 M, pH 6,5- 7,5. Par conséquent, les trois étapes de chromatographies sur gel échangeur d'anions permettent de purifier encore la protéine d'intérêt. De plus, elles permettent la concentration et la formulation de la composition de la protéine d'intérêt. Selon une mise en oeuvre préférée de l'invention, et lorsque la protéine d'intérêt à purifier est un facteur de la coagulation, au moins l'une des trois étapes de chromatographies sur les supports échangeurs d'anions permettent l'activâtion de tout ou partie du facteur de la coagulation. Avantageusement, la première chromatographie permet l'activation du facteur de la coagulation.
Après la récupération du dernier éluat, celui-ci peut être soumis à une filtration sur des filtres de 0,22 μm, de répartition dans des flacons et congelés à -300C et conservés à cette température.
Le procédé de l'invention peut comprendre également au moins l'une des étapes suivantes : formulation, inactivation virale et stérilisation. De façon générale, le procédé peut comprendre, avant l'étape de chromatographie d'affinité, une étape de traitement anti-viral qui est avantageusement effectuée par solvant/détergent, en particulier en présence d'un mélange de Tween® 80 (1% p/v) et de TnBP (tri-n- butylphosphate) (0,3% v/v, ) , ce qui permet d' inactiver les virus enveloppés. En outre, l'éluat issu de la deuxième étape chromatographique sur échangeur d'anions est de préférence soumis à une étape de nanofiltration pour une élimination efficace des virus, en particulier des virus non enveloppés , tels que le parvovirus B19. Il est possible d'utiliser des filtres ASAHI PLANOVA™15 permettant la rétention des virus ayant une taille supérieure à 15 nm.
D'autres aspects et avantages de l'invention seront décrits dans les exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et ne limitent pas l'étendue de l'invention.
Exemples
Les exemples ci-après illustrent l'application du procédé d'extraction et de purification de l'invention à la préparation d'un concentré de facteur VII activé
(FVIIa) à partir de laits de lapines transgéniques
(FVII-tg : FVII transgénique) .
Ces laits bruts proviennent de la première lactation de cinq femelles Fl (2eme génération des lignées fondatrices) . Les femelles ont été sélectionnées sur la base du taux de sécrétion lactique en FVII antigène (FVII:Ag) . Le kit STAGO (ASSERACHROM VII) a permis de suivre la teneur en FVII humain de J04 à J25 (J : jour de traite) à partir de la première lactation. Cette sécrétion était relativement stable pour ces femelles (entre 188 et 844 UI /ml de FVII) , selon la femelle et le jour de collecte) . Le procédé de purification retenu a permis de purifier, par exemple, 12 mg de FVII-tg à partir d'un pool de 500 ml de lait brut. Le rendement global de purification est de 22%.
Ce concentré est pur selon l'analyse par électrophorèse SDS-PAGE en condition non réduite, c'est-à-dire que les ponts disulfures sont conservés, et présente un clivage complet des chaînes lourde et légère en condition réduite, ce gui traduit la transformation totale en FVII activé (FVIIa) au cours du procédé .
Exemple 1 : extraction du FVII à partir du lait
On considère 500 ml de lait brut non écrémé qui sont dilués par 9 volumes de tampon phosphate de sodium 0,25 M, pH 8,2. Après 30 minutes d'agitation à température ambiante, la phase aqueuse enrichie en
FVII est centrifugée à 10 000g durant 1 heure à 150C
(centrifugeuse Sorvall Evolution RC - 6700 tours/min - rotor SLC-6000) . 6 pots d'environ 835 ml sont nécessaires .
Après centrifugarti'on> trois phases sont présentes : une phase lipidique en surface (crème) , une phase aqueuse non lipidique claire enrichie en FVII (phase majoritaire) et une phase blanche solide en culot (précipités de caséines non solubles et de composés de calcium) .
La phase aqueuse non lipidique comprenant le FVII est collectée à la pompe péristaltique jusqu'à la phase crémeuse. La phase crémeuse est collectée à part. La phase solide (précipité) est éliminée.
La, phase aqueuse non lipidique, comprenant toutefois encore de très faibles quantités de lipides, est filtrée sur une séquence de filtres (PaIl SLK7002U010ZP - préfiltre en fibres de verre de taille de pores de 1 μm - puis PaIl SLK7002NXP - Nylon 66 de taille de pores de 0,45 μm) . En fin de filtration, la phase lipidique est passée sur cette séquence de filtration qui retient complètement les globules lipidiques du lait, et le filtrat est clair.
La phase aqueuse non lipidique filtrée est ensuite dialysée sur membrane d'ultrafiltration (Millipore Biomax 50 kDa - 0,1 m2) pour la rendre compatible avec la phase de chromatographie. Le FVII de poids moléculaire d'environ 50 kDa ne filtre pas à travers la membrane, contrairement aux sels, sucres et peptides du lait. Dans un premier temps, la solution (environ 5 000 ml) est concentrée à 500 ml, puis une dialyse par ultrafiltration en maintenant le volume constant permet d'éliminer les électrolytes et de conditionner la matière biologique pour l ' étape de chromatographie. Le tampon de dialyse est un tampon phosphate de sodium 0,025M, pH 8,2.
On peut assimiler cette phase aqueuse non lipidique comprenant le FVII à du lactosérum enrichi en FVII-tg. Cette préparation est stockée à -3O0C avant la poursuite du procédé. Le rendement global de récupération du FVII par cette étape est très satisfaisant : 90% (91% extraction au phosphate + 99% Dialyse/concentration) .
La phase aqueuse non lipidique comprenant le FVII à l'issue de cette étape est parfaitement limpide et est compatible avec les étapes chromatographiques qui font suite.
Environ 93 000 UI de FVII-tg sont extraites à ce stade. La pureté en FVII de cette préparation est de l'ordre de 0,2%. Exemple 2 : procédé de purification du FVIIa
1. Chromatographie sur gel d'hydroxyapatite
Une colonne Amicon 90 (9 cm de diamètre - 64 cm2 de section) est remplie avec du gel BioRad Ceramic Hydroxyapatite type I (CHT-I) . La détection est assurée par mesure de l ' absorban.ce à λ= 280 nm.
Le gel est équilibré en tampon aqueux A constitué d'un mélange de phosphate de sodium 0,025 M et de chlorure de sodium 0,04 M, pH 8,0. La totalité de la préparation conservée à -300C est décongelée au bain- marie à 370C jusqu'à dissolution complète du glaçon puis est injectée sur le gel (débit linéaire 100 cm/h, soit 105 ml/min) . La fraction non-retenue est éliminée par passage '" d'un tampon constitué de phosphate de sodium 0,025 M et de chlorure de sodium 0,04 M, pH 8,2, jusqu'au retour à la ligne de base (RLB) .
L'élution de la fraction contenant le FVII-tg se fait par le tampon B constitué de phosphate de sodium 0,25 M et de chlorure de sodium 0,4 M, pH 8,0. La fraction éluée est collectée jusqu'au retour à la ligne de base.
Cette chromatographie permet de récupérer plus de 90% du FVII-tg, tout en éliminant plus de 95% des protéines lactiques. L'activité spécifique (A. S.) est multipliée par 25. Environ 85 000 UI de FVII-tg de pureté de 4% sont disponibles à ce stade.
2. Filtration tangentielle 100 kDa et concentration/dialyse 50 kDa
La totalité de l'éluat de l'étape précédente est filtrée en mode tangentiel sur une membrane' d'ultrafiltration 100 kDa (PaIl OMEGA SC 100K - 0,1 m2) . Le FVII est filtré à travers la membrane 100 kDa, alors que les protéines de poids moléculaire supérieur à 100 kDa ne sont pas filtrables.
La fraction filtrée est ensuite concentrée à environ 500 ml, puis dialysée sur l 'ultrafiltre 50 kDa déjà décrit à l'Exemple 1. Le tampon de dialyse est du chlorure de sodium 0,15 M.
A ce stade du procédé, le produit est stocké à -3O0C avant passage en chromatographie d'échange d'ions.
Cette étape a permis de réduire la charge en protéines de poids moléculaire supérieur à 100 kDa et en particulier des pro-enzymes. Le traitement membranaire 100 kDa permet de retenir environ 50% des protéines dont les protéines de haut poids moléculaire, tout en filtrant 95% du FVII-tg, soit 82 000 UI de FVII-tg.
Ce traitement permet de réduire les risques d'hydrolyse protéolytique lors des étapes avales.
3. Chromatographies sur gel Q-Sepharose® FF
Ces trois chromatographies successives sur gel échangeur d'ions Q-Sepharose® Fast Flow (QSFF) sont réalisées pour purifier le principe actif, permettre l'activation du FVII en FVII activé (FVIIa) et finalement concentrer et formuler la composition en FVII. La détection des composés est assurée par mesure de l'absorbance à λ= 280 nm.
3.1 Etape Q-Sepharose® FF 1 - élution « High Calcium »
Une colonne de 2,6 cm de diamètre (5,3 cm2 de section) est remplie de 100 ml de gel Q-Sepharose® FF (GE Healthcare) .
Le gel est équilibré en tampon Tris 0,05 M, pH 7,5. La totalité de fraction conservée à -300C est décongelée au bain-marie à 370C jusqu'à dissolution complète du glaçon. La fraction est diluée au 1A [v/v] avec le tampon d'équilibrage avant injection sur le gel (débit 13 ml/min, soit débit linéaire de 150 cm/h) , puis la fraction non retenue est éliminée par passage du tampon jusqu'au RLB.
Une première fraction protéique à faible teneur en FVII est éluée à 9 ml/min (soit 100 cm/h) par un tampon de Tris 0,05 M et de chlorure de sodium 0,15 M, pH 7,5, et est ensuite éliminée.
Une deuxième fraction protéique riche en FVII est éluée à 9 ml/min (soit 100 cm/h) par un tampon de Tris 0,05 M, de chlorure de sodium 0,05 M et de chlorure de calcium 0,05 M, pH 7,5.
Cette deuxième fraction est dialysée sur l' ultrafiltre 50 kDa déjà décrit à l'Exemple 1. Le tampon de dialyse est du chlorure de sodium 0,15 M. Cette fraction est conservée à +40C durant une nuit avant le 2eme passage en chromatographie d'échange d' anions .
Cette étape permet de récupérer 73% du FVII (soit 60000 UI de FVII-tg) , tout en éliminant 80% des protéines accompagnantes . Elle permet également l'activation du FVII en FVIIa.
3.2 Etape Q-Sepharose® FF 2 - élution « Low Calcium »
Une colonne de 2,5 cm de diamètre (4,9 cm2 de section) est remplie de 30 ml de gel Q-Sepharose® FF (GE Healthcare) .
Le gel est équilibré en tampon Tris 0,05 M, pH 7,5.
La fraction éluée précédente (deuxième fraction) , conservée à +40C, est diluée avant injection sur le gel (débit 9 ml/min, soit débit linéaire de 100 cm/h) . Après injection, le gel est lavé par le tampon d'équilibrage pour l'élimination de la fraction non retenue.
Une fraction contenant du FVII de très haute pureté est éluée à 4,5 ml/min (soit 50 cm/h) en tampon de Tris 0,05 M, de chlorure de sodium 0,05 M et de chlorure de calcium 0,005 M, pH 7 , 5.
Environ 23 000 UI de FVII-tg ont été purifiées, soit 12 mg de FVII-tg. Cette étape permet d'éliminer plus de 95% des protéines accompagnantes (protéines du lait de lapine) .
Cet éluat, de pureté supérieure à 90%, présente des caractéristiques structurales et fonctionnelles proches des molécules naturelles du FVII humain. Il est concentré et formulé par le troisième passage en chromatographie d'échanges d'ions.
3.3 Etape Q-Sepharose® FF 3 - élution « Sodium »
Une colonne de 2,5 cm de diamètre (4,9 cm2 de section) est remplie de 10 ml de gel Q-Sepharose® FF (GE Healthcare) . Le gel est équilibré en tampon Tris 0,05 M, pH 7,5.
La fraction éluée purifiée de l'étape précédente est diluée cinq fois avec de l'eau purifiée pour injection (PPI) avant injection sur le gel (débit 4,5 ml/min, soit débit linéaire de 50 cm/h) .
Après injection, le gel est lavé par le tampon d'équilibrage pour l'élimination de la fraction non retenue.
Le FVII-tg est ensuite élue à un débit de 3 ml/min (soit 36 cm/h) par le tampon de Tris 0,02 M et de chlorure de sodium 0,28 M, pH 7 , 0. Un concentré de FVII-tg a été préparé dont la pureté est supérieure à 95%. Le produit est compatible avec une injection par voie intraveineuse. Le procédé a un rendement cumulé de 22%, ce qui permet de purifier au moins 20 mg de FVII par litre de lait mis en œuvre .
Le Tableau A résume les étapes du procédé selon une mise en oeuvre préférée de l'invention, et fournit les différents rendements, la pureté et les activités spécifiques obtenus à chaque étape.
Tableau A
Figure imgf000036_0001
Rdt : Rendement

Claims

Revendications
1. Procédé d'extraction d'au moins une protéine présente dans du lait, ladite protéine présentant une affinité pour les ions calcium complexés ou non dudit lait, comprenant les étapes suivantes consistant à : a) libérer la protéine par la précipitation de composés de calcium obtenue par mise en contact du lait avec un sel soluble, dont l'anion est choisi pour son aptitude à former dans un tel milieu lesdits composés de calcium insolubles, pour ainsi obtenir une phase liquide enrichie en la protéine, b) séparer la phase liquide enrichie en la protéine du précipité de composés de calcium, ladite phase liquide étant en outre séparée en une phase lipidique et en une phase aqueuse non lipidique comprenant la protéine, et c) récupérer la phase aqueuse non lipidique comprenant la protéine.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le sel soluble est un sel de phosphate.
3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel le sel de phosphate est choisi dans le groupe constitué par le phosphate de sodium, le phosphate de lithium, le phosphate de potassium, le phosphate de rubidium et le phosphate de césium, et est, en particulier, le phosphate de sodium.
4. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le sel soluble est un oxalate d'un métal alcalin, en particulier l' oxalate de sodium ou de potassium, ou un carbonate d'un métal alcalin, en particulier le carbonate de sodium ou de potassium, ou leur mélange.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel la concentration du sel soluble en solution aqueuse est comprise entre 100 mM et 3 M, de façon plus préférée, entre 200 mM et 500 inM et, en particulier, entre 200 mM et 300 mM.
6. "Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel l'étape b) est effectuée par centrifugation.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, comprenant, après l'étape c) , une étape de filtration de la phase aqueuse non lipidique effectuée successivement sur des filtres de porosité décroissante, de préférence de 1 μm puis de 0,45 μm, suivie d'une étape de concentration/dialyse par ultrafiltration.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel la phase lipidique est filtrée à travers des filtres de porosité décroissante, de préférence de 1 μm puis de 0,45 μm.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, dans lequel la protéine est une protéine non naturellement présente dans le lait.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, dans lequel le lait est un lait de mammifère non-humain transgénique .
11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel ledit mammifère est sélectionné parmi la lapine, la brebis, la chèvre., la vache, la truie et la souris.
12. Procédé selon l'une des revendications 9 à 11, dans lequel la- protéine est une protéine de la coagulation.
13. Procédé selon la revendication 12, dans lequel la protéine est choisie parmi le facteur II, le facteur
VII, le facteur IX et le facteur X, ainsi que leurs formes activées, la protéine C, la protéine C activée, la protéine S et la protéine Z, ou leur mélange .
14. Procédé selon l'une des revendications 9 à 11, dans lequel la protéine est une protéine comportant des
GLA-domaines, des domaines EGF (epidermial growth factor) ou d'autres domaines identifiés comme ayant une capacité à fixer les ions calcium.
15. Procédé selon l'une des revendications 9 à 11, dans lequel la protéine est une protéine vitamine K- dépendante .
16. Procédé selon l'une des revendications 9 à 11, dans lequel la protéine est une protéine calcium- dépendante .
17. Procédé selon l'une des revendications 9 à 11, dans lequel la protéine est choisie parmi le facteur
VIII, l' alpha-1 anti-trypsine, l'anti-thrombine III, l'albumine, le fibrinogène, l'insuline, la protéine basique de la myéline, la proinsuline, l'activateur tissulaire du plasminogène et les anticorps, ou leur mélange.
18. Procédé selon l'une des revendications 9 à 11, dans lequel la protéine est la lactoferrine, la lactoglobuline, le lysozyme et la lactalbumine transgéniques .
19. Phase aqueuse non lipidique du lait caractérisée en ce qu'elle est hypersaline, basique et qu'elle contient des caséines solubles et au moins une autre protéine, susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une des revendications 1 à 18.
20. Procédé selon l'.une des revendications 1 à 18, dans lequel l'étape c) est suivie d'une étape d) de chromâtographie d'affinité, l'élution de la protéine étant effectuée par un tampon à base d'un sel de phosphate à une concentration prédéterminée.
21. Procédé selon la revendication 20, dans lequel la chromatographie d'affinité est mise en oeuvre sur une colonne chromatographique dont le support est un gel d'hydroxyapatite (CaI0(PO4)E(OH)2) ou un gel de
• fluoroapatite (Caio (PO4) 6F2) .
22. Procédé selon la revendication 20 ou 21, dans lequel l'éluat obtenu à l'issue de l'étape d) est ensuite soumis à une filtration tangentielle.
23. Procédé selon l'une des revendications 1 à 18, comprenant au moins une étape de chromatographie d'échange d'ions, et, en particulier deux étapes chromatographiques successives sur des échangeurs d'ions effectuées directement après .l'étape c) .
24. Procédé selon la revendication 23, dans lequel l'au moins une étape et les deux étapes de chromatographie sont des chromatographies d'échange d'anions.
25. Procédé selon la revendication 24, comprenant, après les deux étapes chromatographiques d'échange d'anions, une troisième étape chromatographique d' échange d' anions .
26. Procédé selon l'une des revendications 20 à 25, comprenant, avant l'étape de chromatographie d'affinité, une étape de traitement anti-viral qui est effectuée par solvant/détergent ..
27. Procédé selon l'une des revendications 23 à 25, dans lequel l'éluat issu de la deuxième étape chromatographique sur échangeur d'anions est soumis à une étape de nanofiltration.
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