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WO2007105789A1 - ヌクレオシドおよびヌクレオチドの精製方法 - Google Patents

ヌクレオシドおよびヌクレオチドの精製方法 Download PDF

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WO2007105789A1
WO2007105789A1 PCT/JP2007/055192 JP2007055192W WO2007105789A1 WO 2007105789 A1 WO2007105789 A1 WO 2007105789A1 JP 2007055192 W JP2007055192 W JP 2007055192W WO 2007105789 A1 WO2007105789 A1 WO 2007105789A1
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WO
WIPO (PCT)
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nucleoside
nucleotide
column
acid
culture solution
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2007/055192
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hideki Murata
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority to JP2008505200A priority Critical patent/JPWO2007105789A1/ja
Publication of WO2007105789A1 publication Critical patent/WO2007105789A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/38—Nucleosides

Definitions

  • the present invention relates to a method for purifying nucleosides and nucleotides.
  • microorganisms can be obtained by means of centrifugation, condensation precipitation using a polymer coagulant, or ultrafiltration.
  • the culture solution from which solid components such as the above were removed was passed through anion-exchanged resin or cation-exchanged resin and cation resin to adsorb the nucleoside or nucleotide to the resin, and then the nucleoside or nucleotide was eluted.
  • anion-exchanged resin or cation-exchanged resin and cation resin to adsorb the nucleoside or nucleotide to the resin, and then the nucleoside or nucleotide was eluted.
  • the above-described method requires a pretreatment if microorganisms are removed from the culture solution before the ion exchange resin and the culture solution are brought into contact with each other.
  • Non-Patent Document 1 The Chemical Society of Japan, Separation and Purification Technology No, Book, p830-832
  • Patent Document 1 JP 2000-69991 A
  • Patent Document 2 JP 2003-219876
  • An object of the present invention is to provide a method for purifying a high-purity nucleoside or nucleotide easily and efficiently in a culture solution containing microbial cells.
  • the present invention relates to the following (1) to (5).
  • nucleoside or nucleotide-containing culture fluid power the nucleoside or nucleotide is separated and purified by passing through the top of a column packed with a particle carrier capable of adsorbing nucleotides and then passing through the eluate. And how to.
  • nucleoside is a nucleoside selected from the group consisting of inosine, xanthosine, guanosine, adenosine, uridine and cytidine.
  • Nucleotide is xanthylic acid, inosinic acid, guaric acid, adenosine monophosphate (AMP), adenosine diphosphate (ADP), adenosine triphosphate (ATP), guanosine monophosphate (GMP), guanosine Diphosphate (GDP), guanosine triphosphate (GTP), uridine monophosphate (UMP), uridine diphosphate (UDP), uridine triphosphate (UTP), cytidine monophosphate (CMP), cytidine diphosphate (1) to (3), which are nucleotides selected from the group consisting of phosphoric acid (CDP), cytidine triphosphate (CTP), nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) and flavin adenine dinucleotide (FAD).
  • AMP adenosine monophosphate
  • ADP adenosine diphosphate
  • ATP
  • nucleoside or nucleotide can be purified easily and inexpensively.
  • the culture solution containing the nucleoside or nucleotide and the microorganism cell in the present invention includes culturing a microorganism having an ability to produce nucleoside or nucleotide in a medium, and generating and accumulating the nucleoside or nucleotide in the medium.
  • the culture solution obtained in this way can be mentioned.
  • any microorganism can be used as long as it has the ability to produce nucleosides or nucleotides, and preferably a prokaryote, more preferably a bacterium.
  • Prokaryotes include Escherichia, Serratia, Batinoles, Brevibacterium, Corvne bacterium, and Microbactenum fum (Microbactenum).
  • Chromatium fluviatile Erwi nia uredovora, Enorevia carotovora, El winia ananas, Elwinia herbi Noctata (Erwi nia punctata) Norwinia terreus, Methylobacteria 'Modevlobacterium rhodesianum, Methylobacterium extorauens, Phormidium sp.
  • Prokaryotes include Escherichia, Serratia, Bacillus, Breviva Bacteria belonging to the genus Cterium, Corynebacterium, Syudomonas or Streptomyces, and more preferably the bacteria belonging to the genus Escherichia or Corynepacteria, such as the aforementioned Escherichia, Serratia, Examples include the species belonging to the genus Bacillus, Brevinocterium, Corynebacterium, Syudomonas or Streptomyces, preferably the species belonging to the genus Escherichia or Corynepacteria.
  • More preferable bacteria include Escherichia coli, Corynebacterium dartamicum, Corynebacterium terumum Ammoniagenes, Corynebaterum latatofumentumum, Corynebatarum flavum, Corynebaterium efficasis, Bacillus subtilis, Bacillus 'Mega Terium, Serratia' Manoressence, Syudomonas 'Putida, Syudomonas' Enoregi Noosa, Streptomyces sericolor and Streptomyces 'lividans, and more preferred bacteria are Escherichia coli and Corynebaterium' ammo-agenes Can give.
  • nucleosides include inosine, xanthosine, guanosine, adenosine, uridine, cytidine, and derivatives thereof
  • nucleotides include xanthylic acid, inosinic acid, guanylic acid, and adenosine.
  • AMP Monophosphate
  • ADP adenosine diphosphate
  • ATP adenosine triphosphate
  • GDP guanosine diphosphate
  • GTP guanosine triphosphate
  • UMP uridine monophosphate
  • UDP uridine diphosphate
  • UDP uridine triphosphate
  • CMP cytidine monophosphate
  • CDP cytidine diphosphate
  • CTP nicotinamide adenine dinucleotide
  • FAD flavin adenyl dinucleotide
  • a natural medium or a synthetic medium may be used as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be assimilated by the microorganism, and can efficiently culture the microorganism. Any of these may be used.
  • the carbon source As the carbon source, as long as the microorganism can assimilate, glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, organic acids such as acetic acid and propionic acid, Alcohol such as ethanol and propanol Can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonium phosphate, and others. Nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digested products thereof can be used.
  • inorganic salt monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride salt, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, etc. may be used. it can.
  • the culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is 15-40 ° C, and the culture time is usually 6 hours to 14 days. It is preferable to maintain the pH during the cultivation at 4.0 to 10.0.
  • the particle carrier used in the present invention is a microbial cell, preferably a prokaryotic cell, more preferably a bacterial cell, more preferably a bacterium belonging to the genus Escherichia or Coryne.
  • the particle carrier has a particle size of 350 ⁇ m or more, preferably 400 ⁇ m or more, more preferably 420 ⁇ m or more, further preferably 500 ⁇ m or more, and most preferably 600 ⁇ m or more. I can raise my body.
  • a particle carrier having the above-mentioned particle size a particle carrier that can be obtained by using a particle carrier having a nonuniform particle size through a sieve having an aperture of 0.35 mm, 0.40 mm, 0.42 mm, 0.50 mm, or 0.60 mm. I can give you.
  • the particle carrier used in the present invention is a particle carrier having a particle diameter of 350 ⁇ m or more.
  • the particle size is not particularly limited, but as a carrier that is easy to handle and has good nucleoside or nucleotide purification efficiency, the content of particles having a particle size of 2000 ⁇ m or more is 10% or less, preferably 1500 ⁇ m.
  • the particle content is 10% or less, more preferably 1180 ⁇ m or less.
  • a carrier having an upper particle content of 10% or less can be mentioned.
  • the particle carrier capable of adsorbing nucleosides or nucleotides used in the present invention is from a culture solution containing nucleosides or nucleotides and their analogs, contaminants such as sulfate ions, chloride ions and dyes.
  • the particle carrier is not particularly limited as long as it can selectively separate and purify nucleosides or nucleotides on the basis of the difference in the adsorptivity thereof, and preferably includes a cation exchange resin.
  • the ionic form of the ion exchange resin can be appropriately selected according to the kind of nucleoside or nucleotide to be separated and purified.
  • the particle carrier is sieved with a sieve having an opening of 0.35 mm, preferably 0.40 mm, more preferably 0.42 mm, still more preferably 0.50 mm, and most preferably 0.60 mm.
  • Examples thereof include a method of screening and collecting a particle carrier that does not pass through the sieve.
  • a commercially available product is a carrier having a particle size of 350 m or more, it can be used in the present invention without adjusting the particle size.
  • the ion exchange resin may be a gel type or a porous type.
  • the concentration of the nucleoside or nucleotide in the culture solution passing through the column packed with the particle carrier is not particularly limited, as long as the nucleoside or nucleotide is dissolved.
  • Nucleoside or nucleotide crystals are precipitated in the culture medium after completion of the culture. When the crystals are dissolved, the crystals can be dissolved by adding water, warming or adding an acid, or the culture solution from which the crystals have been separated can be passed through.
  • the pH of the culture solution passing through the column is not limited as long as the particle carrier used in the present invention can adsorb nucleosides or nucleotides, but the range is preferably 3 to 12, more preferably The range of 3.5-11 can be raised. If necessary, adjust the pH of the culture solution to within the above range using inorganic or organic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, acetic acid, malic acid, alkaline solutions such as sodium hydroxide, urea, calcium carbonate, ammonia, etc. Can be adjusted.
  • inorganic or organic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, acetic acid, malic acid, alkaline solutions such as sodium hydroxide, urea, calcium carbonate, ammonia, etc.
  • the column used in the present invention may be any column as long as it is usually used for purification of chemical substances.
  • the amount of the particle carrier used in the present invention can be appropriately set according to the concentration or pH of the nucleoside or nucleotide in the culture solution to be passed through.
  • concentration of the nucleoside or nucleotide in the culture solution is 10%.
  • the amount of the culture solution can be increased by 1 to 2 times.
  • a culture solution containing a nucleoside or nucleotide and a microbial cell is filled with a particle carrier having a particle diameter of 350 ⁇ m or more and capable of adsorbing the nucleoside or nucleotide.
  • the upper part of the column the so-called column bed upper layer force column.
  • the tower speed is preferably 0.5 to 7 m / h, more preferably 0.3 to 10 m / h. After passing the culture solution, the culture solution remaining in the column can be pushed out and washed by passing water or the like from the upper or lower part of the column as necessary.
  • the eluate is preferably continuously passed from the top of the column, and the nucleoside or nucleotide can be separated and purified by eluting the nucleoside or nucleotide.
  • the eluent used in the present invention is not particularly limited as long as it is a solution capable of eluting the nucleoside or nucleotide bound to the particle carrier.
  • the concentration is 0.1 to 6 mol.
  • An alkaline aqueous solution such as / L, more preferably 0.3 to 2 mol / L aqueous ammonia solution or sodium hydroxide solution can be used.
  • As the column speed of the eluate a linear speed of 0.3 to 10 m / h is preferred, and 0.5 to 7 m / h is more preferred. It can refine
  • the particle carrier after eluting the nucleoside or nucleotide can push out the eluate inside the column by passing an appropriate solvent such as water at the top of the column.
  • the present invention can be repeated by simply extruding the eluate in the column by passing water through the column without performing a special resin regeneration operation. Can be used in any way.
  • hydrochloric acid or the like when regenerating the particle carrier into C1 type, ammonia aqueous solution or sodium hydroxide aqueous solution when regenerating into OH type, and acetic acid or the like when regenerating into acetic acid type.
  • ATP containing 5 g / l of ATP and microorganisms belonging to the genus Corynebataterum with a wet cell weight of 7800 g.
  • ATP was adsorbed by passing through a column filled with 7 L (packing height: 3.5 m) at 15 ° C. and a linear velocity of 3.5 m / h.
  • 7 L packing height: 3.5 m
  • 10 L of water was passed from above to extrude the culture solution remaining in the column.
  • the cell removal rate was 90%.
  • the column was washed by passing water through the column, the column was eluted with a 2 mol / L aqueous sodium chloride solution to obtain 30 L of elution fraction.
  • the obtained elution fraction was adjusted to pH 7 with sodium hydroxide, concentrated to 1.5 L, and then cooled to 15 ° C to obtain a sodium inosinate crystal slurry.
  • a high purity nucleoside or nucleotide can be purified efficiently with a culture solution containing microbial cells.

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Abstract

 ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含有する培養液からヌクレオシドまたはヌクレオチドを分離、精製する方法において、ヌクレオシドまたはヌクレオチドおよび微生物の菌体を含む培養液を、粒子径が350μm以上であり、かつヌクレオシドまたはヌクレオチドを吸着する能力のある粒子担体を充填したカラムの上部から通塔した後、溶出液を通塔することにより、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを分離、精製することができる。

Description

明 細 書
ヌクレオシドおよびヌクレオチドの精製方法
技術分野
[0001] 本発明は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドの精製方法に関する。
背景技術
[0002] 発酵法によって生産されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを培養液力 分離、精製 する方法としては、遠心分離、高分子凝沈剤を用いた凝縮沈殿または限外ろ過等の 手段により、微生物の菌体等の固形成分が除去された培養液をァニオン交換榭脂、 またはカチオン交換榭脂およびァ-オン樹脂に通塔してヌクレオシドまたはヌクレオ チドを榭脂に吸着させた後、該ヌクレオシドまたはヌクレオチドを溶出する方法が知ら れている（非特許文献 1、特許文献 1および 2など)。
[0003] し力しながら、上記方法はイオン交換樹脂と培養液とを接触させる前に培養液中か ら微生物の菌体を除去すると!、う前処理が必要である。
非特許文献 1 :日本化学会編、分離精製技術ノ、ンドブック、 p830〜832
特許文献 1 :特開 2000— 69991号公報
特許文献 2：特開 2003— 219876号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明の目的は、微生物の菌体を含む培養液力 簡便かつ効率よく高純度のヌク レオシドまたはヌクレオチドを精製する方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0005] 本発明は以下の（1)〜（5)に関する。
(1)ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含有する培養液力 ヌクレオシドまたはヌクレオ チドを分離、精製する方法において、ヌクレオシドまたはヌクレオチドおよび微生物の 菌体を含む培養液を、粒子径が 350 μ m以上であり、かつヌクレオシドまたはヌクレオ チドを吸着する能力のある粒子担体を充填したカラムの上部力 通塔した後、溶出 液を通塔することにより、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを分離、精製することを特徴 とする方法。
(2)粒子担体がァ-オン交換榭脂である上記（1)の方法。
(3)カラムに通塔する培養液の pHが 3〜12であることを特徴とする上記（1)または（ 2)の方法。
(4)ヌクレオシドがイノシン、キサントシン、グアノシン、アデノシン、ゥリジンおよびシチ ジン力もなる群より選ばれるヌクレオシドである上記（1)〜（3)の!、ずれか 1つの方法
(5)ヌクレオチドがキサンチル酸、イノシン酸、グァ-ル酸、アデノシン一リン酸 (AMP )、アデノシン二リン酸 (ADP)、アデノシン三リン酸 (ATP)、グアノシン一リン酸（GM P)、グアノシン二リン酸（GDP)、グアノシン三リン酸（GTP)、ゥリジン一リン酸（UMP )、ゥリジン二リン酸（UDP)、ゥリジン三リン酸（UTP)、シチジン一リン酸（CMP)、シ チジン二リン酸（CDP)、シチジン三リン酸（CTP)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオ チド (NAD)およびフラビンアデ-ンジヌクレオチド (FAD)力もなる群より選ばれるヌ クレオチドである上記（1)〜（3)の 、ずれか 1つの方法。
発明の効果
[0006] 本発明により、容易かつ安価に高純度のヌクレオシドまたはヌクレオチドを精製する ことができる。
発明を実施するための最良の形態
[0007] 本発明におけるヌクレオシドまたはヌクレオチドおよび微生物の菌体を含む培養液 としては、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを生産する能力を有する微生物を培地で培 養し、該培地中にヌクレオシドまたはヌクレオチドを生成、蓄積させて得られる培養液 をあげることができる。
上記した微生物としては、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを生産する能力を有する 微生物であればどのようなものでもよぐ好ましくは原核生物、より好ましくは細菌をあ げることができる。原核生物としては、ェシエリヒア（Escherichia)属、セラチア（Serratia )属、バチノレス属、ブレビパクテリゥム（Brevibacterium)属、コリネパクテリゥム（Corvne bacterium) クロノくグァリゥム f禺 (Microbactenum 、ンュ' ~~ モナス (Pseudomonas )属、ァグロバタテリゥム（Agrobacterium)属、アリシクロバチルス属（Alic plobacillus) 、アナべナ（Anabena)属、アナシスティス（Anacvstis)属、ァスロバクタ一（Arthrobacte )属、ァゾトパクター（Azotobacter)属、クロマチゥム（Chromatium)属、ェルビ-ァ（& winia) J¾、メテロノくクテリウム (Methylobacterium)属、フオルミティゥム（Phormidium) 属、口ドノ クタ一 (Rhodobacter)属、ロドシユードモナス（Rhodopseudomonas)属、ロド スピリゥム (Rhodospirillum)属、セネデスムス (Scenedesmus)属、ストレプトマイセス reptomvces)属、シネコッ 7ス (Svnechoccus)属、サイモモナス (Zvmomonas) 等に 属する微生物、例えば、ェシエリヒア'コリ、バチルス ·サチリス（Bacillus subtilis)、ノ チルス'メガテリゥム (Bacillus megaterium)、バチルス ·アミロリケファシエンス (Bacillus amvloliauefaciens)、ノ チノレス ·コアギュランス (Bacillus coagulans)、ノ チノレス ·リケニ フォノレミス (Bacillus licheniformis)、バチノレス ·プミルス (Bacillus pumilus)、ブレビバタ テリゥム ·アンモニアゲネス (Brevibacterium ammoniagenes)、ブレビノ クテリゥム 'イマ リオフイノレム (Brevibacterium immariophilum)、ブレビバタテリゥム 'サッカロリティカム（ Brevipactenum saccharolvticum 、ブレヒノヽクァリウム ·フフノ ム (Brevibacterium flavu m)、ブレビパクテリゥム，ラクトフアーメンタム（Brevibacterium lactofermentum)、コリネ パクテリゥム ·グルタミカム（Corvnebacterium glutamicum)、コリネバタテリゥム'ァセト ァシドフィルム (Corvnebacterium acetoacidophilum)、ミクロバタテリゥム ·アンモニアフ イノレム ( icrobactenum ammoniaphilum 、セフチ , ·フィ 7リァ、aerratia ficana)、セフ チア ·フォンチコラ (Serratia fonticola)、セラチア ·リケファシエンス (Serratia liauefacie ns)、セラチア ·マノレセッセンス (Serratia marcescens)、シユードモナス ·エノレギノーサ ( Pseudomonas aeruginosa)、、ノュ. ~~ モ 7"ス.プチタ (Pseudomonas putida)、 ,グロノ クテリゥム ·ラジオパクター (Aerobacterium radiobacter)、ァグロバタテリゥム ·リゾジ一 ンズ (Aerobacterium rhizogenes)、 7グロノ クァリゥム 'ノレビ (Aerobacterium rubi、 /' ナベナ ·シリンドリカ (Anabaena cvlindrica)、アナべナ ·ドリ才ノレム (Anabaena doliolum )、アナべナ 'フロスアクア（Anabaena flos- aauae)、アースロバクタ^ ~ ·オーレッセンス（ Arthrobacter aurescens)、 7 ~~スロノ クタ1 ~~ ·シトレウス (Arthrobacter citreus)、 7 ~~ スロバクタ一 .グロプフォルミス (Arthrobacter globformis)、アースロバクタ一 ·ヒドロカ ーボグノレタミカス (Arthrobacter hvdrocarboglutamicus)、アースロノくクタ一 .ミソレンス
(Arthrobacter mysorens)、 ~~スロノくクタ1 ~~ · -コチアナ (Arthrobacter nicotianae)、 アースロバクタ一 .パラフイネウス (Arthrobacter paraffineus)、アースロバクタ一 ·プロト フォノレミエ (Arthrobacter protophormiae)ゝアースロノくクタ一 ·ロセオノ ラフイナス (Art hrobacter roseoparaffinus)、 7 ~~スロノくクタ1 ~~ 'スノレフレウス (Arthrooacter sullureus) 、アースロバクタ一 ·ウレァファシエンス (Arthrobacter ureafaciens)、クロマチゥム 'ブ デリ (Chromatium buderi)、クロマチゥム ·テピタム（Chromatium tepidum)、クロマチウ ム ·ビノサム (し hromatium vinosum)、クロマテゥム ·ヮ ~~ ン (Chromatium warmingn) 、クロマチウム.フルビアタティレ（Chromatium fluviatile)、ェルビ-ァ'ウレドバラ（Erwi nia uredovora)、エノレビ-ァ '力ロトノ ラ (Erwinia carotovora)、エノレビ-ァ ·ァナス (El winia ananas)、エノレビニァ ·ヘリコラ (Erwinia herbicola)、エノレビニァ ·ノ ンクタタ (Erwi nia punctata)、エノレビニァ ·テレウス（Erwinia terreus)、メチロバクテリゥム'口デシアナ ム (Methvlobacterium rhodesianum)、メチロバクテリウム .エタソトノレクエンス (Methvlob acterium extorauens)、フォノレミディゥム.エスピー (Phormidium sp.) ATCC29409、口 ドノ クタ一 ·カプスラタス (Rhodobacter capsulatus)、ロドパクター 'スフエロイデス（Rho dobacter sphaeroides )、ロトンュ' ~~ドモナス ·ブフステカ ( Rhodopseudomonas blastica) 、ロドシユードモナス-マ1 Jナ (Rhodopseudomonas marina)、ロドシユードモナス'ノ レス トリス (Rhodopseudomonas palustns)、口トスピリ「ノム.リブフム (Rhoaospirillum rubrum) 、ロドスピリゥム ·サレキシゲンス（RhodosDirillum salexieens)、ロドスピリゥム ·サリナラ ム (RhodosDirillum salinarum)、ストレプトマイセス ·アンボファシエンス (Streptomvces ambofaciens)、ストレプトマ でス'才ーレ才ファシエンス (Streptomvces aureofaciens) 、ストレプトマイセス ·ァゥレウス（Streptomvces aureus)、ストレプトマイセス 'フンジシ ディカス (Streptomvces lungicidicus)、ストレプトマイセス .グリセォクロモゲナス (Strep tomvces gnseochromogenes)、ストレプトマ でス'グリ ウス (Streptomvces gnseus)、 ストレプトマイセス ·リビダンス (Streptomvces lividans)、ストレプトマイセス 'オリボグリ セウス (Streptomvces olivognseus)、ストレフ。トマィセス ·フメ'ノス (Streptomvces rameu s)、ストレプトマイセス 'タナシェンシス (Streptomvces tanashiensis)、ストレプトマイセ ス ·ビナセウス (Streptomvces vinaceus)、ザィモモナス ·モビリス vmomonas mobilis) 等をあげることができる。
より好まし!/、原核生物としては、ェシエリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバ クテリウム属、コリネバクテリウム属、シユードモナス属またはストレブトマイセス属等に 属する細菌、さらに好ましくはェシエリヒア属またはコリネパクテリゥム属に属する細菌 をあげることができ、例えば上記したェシエリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビ ノ クテリウム属、コリネバクテリウム属、シユードモナス属またはストレブトマイセス属に 属する種、好ましくはェシエリヒア属またはコリネパクテリゥム属に属する種をあげるこ とがでさる。
[0009] より好ましい細菌としてはェシエリヒア'コリ、コリネバクテリウム'ダルタミクム、コリネバ クテリゥム 'アンモニアゲネス、コリネバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム、コリネバタティ ルム 'フラバム、コリネバタテリゥム 'エフイカシス、バチルス'サチルス、バチルス 'メガ テリゥム、セラチア'マノレセッセンス、シユードモナス'プチダ、シユードモナス'エノレギ ノーサ、ストレプトマイセス ·セリカラーおよびストレプトミセス'リビダンスをあげることが でき、さらに好ましい細菌としてはェシエリヒア'コリおよびコリネバタテリゥム 'アンモ- ァゲネスをあげることができる。
[0010] 本発明にお ヽてヌクレオシドとしては、イノシン、キサントシン、グアノシン、アデノシ ン、ゥリジン、シチジン、およびこれらの誘導体をあげることができ、ヌクレオチドとして は、キサンチル酸、イノシン酸、グァニル酸、アデノシン一リン酸 (AMP)、アデノシン 二リン酸 (ADP)、アデノシン三リン酸 (ATP)、グアノシン一リン酸（GMP)、グアノシ ンニリン酸（GDP)、グアノシン三リン酸（GTP)、ゥリジン一リン酸（UMP)、ゥリジン二 リン酸（UDP)、ゥリジン三リン酸（UTP)、シチジン一リン酸（CMP)、シチジン二リン 酸（CDP)、シチジン三リン酸（CTP)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD) 、フラビンアデ-ンジヌクレオチド (FAD)、およびこれらの誘導体をあげることができ る。
[0011] 上記した微生物を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源 および無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然 培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよぐグルコース、フラクトース 、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭 水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコー ル類等を用いることができる。
[0012] 窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、酢酸アンモ- ゥム、リン酸アンモ-ゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモ-ゥム塩、その他の含窒 素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼィ ン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物 等を用いることができる。
[0013] 無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸 マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム 等を用いることができる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度 は 15〜40°Cがよぐ培養時間は、通常 6時間〜 14日間である。培養中の pHは 4.0〜10 .0に保持することが好ま 、。
[0014] 本発明に用いる粒子担体は、該粒子担体を充填したカラム内において、その粒子 間を微生物の細胞、好ましくは原核生物の細胞、より好ましくは細菌の細胞、さらに 好ましくはェシエリヒア属またはコリネパクテリゥム属に属する細菌の細胞、特に好まし くはェシエリヒア'コリまたはコリネバタテリゥム.アンモニアゲネスの細胞が通過できる 程度の空隙ができる粒子径を有する粒子担体であればよぐその粒子径は不均一で あってもよい。
[0015] 該粒子担体としては、粒子径が 350 μ m以上、好ましくは 400 μ m以上、より好ましく は 420 μ m以上、さらに好ましくは 500 μ m以上、最も好ましくは 600 μ m以上の粒子担 体をあげることができる。前記した粒子径を有する粒子担体としては、粒子径が不均 一な粒子担体を、 目開きが 0.35mm、 0.40mm, 0.42mm, 0.50mmまたは 0.60mmの篩い にかけて取得することができる粒子担体をあげることができる。
[0016] また粒子間の空隙が大き!/、ほど微生物の細胞は粒子間を通過しやす 、ので、本発 明で用いられる粒子担体は、粒子径が 350 μ m以上の粒子担体であればその粒子径 に特に上限はないが、取扱いの容易性、およびヌクレオシドまたはヌクレオチドの精 製効率がよい担体としては、粒子径 2000 μ m以上の粒子含量が 10%以下、好ましく は粒子径 1500 μ m以上の粒子含量が 10%以下、さらに好ましくは粒子径 1180 μ m以 上の粒子含量が 10%以下の担体をあげることができる。
[0017] 本発明に用いられるヌクレオシドまたはヌクレオチドを吸着する能力がある粒子担 体は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドとそれらの類縁体、硫酸イオン、塩素イオンおよ び色素等の夾雑物とを含む培養液から、それらの吸着性の相違に基づき、ヌクレオ シドまたはヌクレオチドを選択的に分離、精製できる粒子担体であれば特に制限はな く、好ましくはァ-オン交換榭脂をあげることができる。
[0018] 上記した粒子担体としては、ァ-オン交換榭脂である、ダウ ·ケミカルズ社製のダウ エックスシリーズ（マラソン A、マラソン A2、モノスフィァー 550A、マラソン MSA、 MSA-2 、マラソン WBA、モノスフィァー 77、 1 X 2, 1 X 4, 1 X 8等）、三菱化学社製の SAシリー ズ（例えば SA10A、 SA11A、 SA20A、 SA21 A等）、ダイヤイオン PAシリーズ（例えば PA 304、 PA306、 PA308、 PA310、 PA312、 PA314、 PA316、 PA318、 PA320、 PA404、 PA40 6、 PA408、 PA410、 PA412、 PA414、 PA416、 PA418、 PA420等）、ダイヤイオン WAシリ ーズ (WA10、 WA11、 WA20、 WA21、 WA30等）、ローム 'アンド'ハース社製のアンバ 一ライトシリーズ（IRA400JCLゝ IRA402BLCL, IRA410JCLゝ IRA411CLゝ IRA458RFCL 、 IRA900JCL, IRA910CTCL, IRA910CTCL, IRA67、 IRA96SB等）、ピュロライト社製 のピュロライトシリーズ (A-100、 A-100S等)から粒子径を調整して得られる粒子担体 をあげることができる。
[0019] ァ-オン交換樹脂のイオン型は、分離、精製するヌクレオシドまたはヌクレオチドの 種類に応じて適宜選択することができる。
上記の粒子担体の粒子径の調整法としは、該粒子担体を目開きが 0.35mm、好まし くは 0.40mm、より好ましくは 0.42mm、さらに好ましくは 0.50mm、最も好ましくは 0.60mm の篩で篩い分けし、篩い目を通過しない粒子担体を採取する方法等をあげることが できる。上記粒子担体中、市販の製品が粒子径 350 m以上の粒子力もなる担体で ある場合は粒子径を調整することなぐ本発明に使用することができる。
[0020] ァ-オン交換榭脂は、ゲル型でもポーラス型でもよい。
粒子担体が充填されたカラムに通塔する培養液中のヌクレオシドまたはヌクレオチ ドの濃度は特に制限されず、ヌクレオシドまたはヌクレオチドが溶解して 、る状態であ ればよい。培養終了後の培地中にヌクレオシドまたはヌクレオチドの結晶が析出して いる場合は、該結晶を加水、加温もしくは酸を添加することにより溶解した後、または 該結晶を分離した培養液を通塔することができる。
[0021] カラムに通塔する培養液の pHは、本発明に用いられる粒子担体がヌクレオシドまた はヌクレオチドを吸着できる pHであればその範囲は限定されないが、好ましくは 3〜1 2、より好ましくは 3.5〜11の範囲をあげることができる。培養液の pHは必要に応じて、 塩酸、硫酸、酢酸、リンゴ酸等の無機または有機の酸、水酸ィ匕ナトリウム等のアルカリ 溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて上記範囲内に調整することが できる。
[0022] 本発明に用いられるカラムは、通常化学物質の精製に用いられるカラムであればど のようなものでもよい。
本発明で用いられる粒子担体の量は、通塔する培養液のヌクレオシドまたはヌクレ ォチドの濃度、または pHに応じて適宜設定することができ、例えば該培養液中のヌク レオシドまたはヌクレオチド濃度が 10%程度である場合、該培養液量の 1〜2倍量を あげることができる。
[0023] 本発明の方法では、ヌクレオシドまたはヌクレオチドおよび微生物の菌体を含む培 養液を、粒子径が 350 μ m以上であり、かつヌクレオシドまたはヌクレオチドを吸着す る能力を有する粒子担体を充填したカラムの上部、いわゆるカラムベッド上層力 通 塔する。
通塔速度としては、線速 0.3〜10m/hが好ましぐ 0.5〜7m/hがより好ましい。 培養液の通塔後、必要に応じてカラム上部または下部から水などを通塔することに よりカラム内に残留する培養液を押し出し洗浄することができる。
[0024] 溶出液はカラム上部から好ましくは連続的に通塔し、ヌクレオシドまたはヌクレオチ ドを溶出させることにより、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを分離、精製することができ る。
本発明で用いられる溶出液としては、粒子担体に結合しているヌクレオシドまたはヌ クレオチドを溶出することができる溶液であればその種類および濃度には特に制限 はないが、例えば濃度が 0.1〜6 mol/L、より好ましくは 0.3〜2 mol/Lのアンモニア水 溶液、水酸ィ匕ナトリウム溶液等のアルカリ性水溶液をあげることができる。 [0025] 溶出液の通塔速度としては、線速 0.3〜10m/hが好ましぐ 0.5〜7m/hがより好ましい 上記で分離、精製したヌクレオシドまたはヌクレオチドは、さらに脱色、濃縮および 晶析等の手段により精製することができる。
ヌクレオシドまたはヌクレオチドを溶出した後の粒子担体は、カラム上部力 水等の 適当な溶媒を通塔することによりカラム内部の溶出液を押し出すことができる。
[0026] 粒子担体としてァ-オン交換榭脂を用いた場合、水を通塔することにより、カラム内 部の溶出液を押し出すだけで、特別の榭脂再生操作を行うことなぐ繰返して本発明 の方法に使用することができる。なお、粒子担体を C1型に再生する場合は、塩酸等、 OH型に再生する場合は、アンモニア水溶液および水酸化ナトリウム水溶液等、酢酸 型に再生する場合は酢酸等を用いることが好ま U、。
[0027] 以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定される ものではない。
実施例 1
[0028] ATPの精製
ATP 5g/lおよびコリネバタテリゥム属に属する微生物を湿菌体重量で 7800gを含む 培養液 52Lを塩酸で pH3.5に調整した後、篩い分けにより粒子径 420 m未満の粒子 を除いた A-100S (ピュ口ライト社製。 C1型） 7Lを充填したカラム（充填高さ 3.5m)に 15°C 、線速 3.5m/hで通塔することにより ATPを吸着させた。次に 10Lの水を上方から通塔 することによりカラム中に残存する培養液を押し出した。この時点における菌体除去 率は 90%であった。カラム下方力も水を通塔することによりカラムを洗浄した後、 2mol /Lの塩ィ匕ナトリウム水溶液で溶出し、溶出画分 30Lを得た。
[0029] 得られた溶出画分を 2Lまで濃縮した後、塩酸で pH3に調整し、再度 1Lまで濃縮し た。 15°Cまで冷却することにより ATPニナトリウム結晶スラリーを取得した。
ノ スケット型分離機を用いて該結晶スラリー力も結晶を分離後、該結晶を水で洗浄 し、乾燥した。その結果、 100gの ATPニナトリウム塩 3水和物（収率 32%、純度 99%、 菌体の混入なし)を取得した。
実施例 2 [0030] IMPの精製
IMP 50g/l、並びにコリネバタテリゥム属に属する微生物およびェシエリヒア属に属 する微生物を湿菌体重量で 4000gを含む培養液 20Lを水酸ィ匕ナトリウムで pHl 1に調 整した後、篩 、分けにより粒子径 420 μ m未満の粒子を除 、た PA-412 (三菱化学社 製。 OH型） 10Lを充填したカラム（充填高さ 5m)に 20°C、線速 5m/hで通塔することに より IMPを吸着させた。次に 10Lの水を上方力 通塔することによりカラム中に残存す る培養液を押し出した。この時点における菌体除去率は 90%であった。カラム下方か ら水を通塔することによりカラムを洗浄した後、 0.5mol/Lの塩酸で溶出し、溶出画分 3 0Lを得た。
[0031] 得られた溶出画分を水酸ィ匕ナトリウムで pH7に調整し、 1.5Lまで濃縮後、 15°Cまで 冷却することによりイノシン酸ナトリウム塩結晶スラリーを取得した。
ノ スケット型分離機を用いて該結晶スラリー力も結晶を分離後、該結晶を水で洗浄 し、乾燥した。その結果、 700gのイノシン酸ナトリウム塩 3.5水和物結晶（収率 46%、純 度 98%、菌体の混入なし)を取得した。
比較例 1
ATPの精製
実施例 1と同様の方法で pH調整した培養液 52Lを、篩い分けによる粒子調整して
V、な 、A- 100S (ピュ口ライト社製。 C1型） 7Lを充填したカラム（充填高さ 3.5m)に実施 例 1と同様の条件で通塔した力 10L通塔したところで、カラムが閉塞した。
比較例 2
IMPの精製
実施例 2と同様の方法で pH調整した培養液 20Lを、篩い分けによる粒子調整して
V、な 、PA-412 (三菱化学社製。 OH型） 10Lを充填したカラム（充填高さ 5m)に実施例 2と同様の条件で通塔した力 5L通塔したところで、カラムが閉塞した。
産業上の利用可能性
[0032] 本発明によれば、微生物の菌体を含む培養液力 効率よく高純度のヌクレオシドま たはヌクレオチドを精製することができる。

Claims

請求の範囲
[1] ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含有する培養液力 ヌクレオシドまたはヌクレオチド を分離、精製する方法において、ヌクレオシドまたはヌクレオチドおよび微生物の菌 体を含む培養液を、粒子径が 350 μ m以上であり、かつヌクレオシドまたはヌクレオチ ドを吸着する能力がある粒子担体を充填したカラムの上部から通塔した後、溶出液を 通塔することにより、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを分離、精製することを特徴とす る方法。
[2] 粒子担体がァ-オン交換榭脂である請求項 1記載の方法。
[3] カラムに通塔する培養液の pHが 3〜12であることを特徴とする請求項 1または 2記載 の方法。
[4] ヌクレオシドがイノシン、キサントシン、グアノシン、アデノシン、ゥリジンおよびシチジ ンカ なる群より選ばれるヌクレオシドである請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の方 法。
[5] ヌクレオチドがキサンチル酸、イノシン酸、グァ-ル酸、アデノシン一リン酸 (AMP)、 アデノシン二リン酸 (ADP)、アデノシン三リン酸 (ATP)、グアノシン一リン酸（GMP) 、グアノシン二リン酸（GDP)、グアノシン三リン酸（GTP)、ゥリジン一リン酸（UMP)、 ゥリジン二リン酸（UDP)、ゥリジン三リン酸（UTP)、シチジン一リン酸（CMP)、シチ ジン二リン酸（CDP)、シチジン三リン酸（CTP)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ ド（NAD)およびフラビンアデ-ンジヌクレオチド (FAD)力 なる群より選ばれるヌク レオチドである請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の方法。
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