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WO2007034977A1 - 機能性RNAが制御するターゲットmRNAの予測・同定方法及びその利用方法 - Google Patents

機能性RNAが制御するターゲットmRNAの予測・同定方法及びその利用方法 Download PDF

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WO2007034977A1
WO2007034977A1 PCT/JP2006/319097 JP2006319097W WO2007034977A1 WO 2007034977 A1 WO2007034977 A1 WO 2007034977A1 JP 2006319097 W JP2006319097 W JP 2006319097W WO 2007034977 A1 WO2007034977 A1 WO 2007034977A1
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WO
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mirna
mrna
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target mrna
sequence
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Application number
PCT/JP2006/319097
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English (en)
French (fr)
Inventor
Roberto Antonio Barrero
Takuro Tamura
Takashi Gojobori
Kazuho Ikeo
Tadashi Imanishi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BIOINFORMATICS INSTITUTE FOR GLOBAL GOOD Inc
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
BITS Co Ltd
Original Assignee
BIOINFORMATICS INSTITUTE FOR GLOBAL GOOD Inc
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
BITS Co Ltd
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Publication date
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Priority to US11/992,261 priority Critical patent/US20090137505A1/en
Publication of WO2007034977A1 publication Critical patent/WO2007034977A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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Definitions

  • Target RNA regulated by functional RNA 'Prediction method of mRNA ⁇ Identification method and its utilization method Target RNA regulated by functional RNA 'Prediction method of mRNA ⁇ Identification method and its utilization method
  • the present invention relates to the field of biomolecule control. More specifically, the present invention relates to a method for controlling gene expression using a nucleic acid molecule. ., Ming
  • Non-patent Documents 1, 2, and 3 They were found to act on specific mRNAs in the organism's development and inhibit protein synthesis and were named microRNAs (miRNAs).
  • miRNAs The structural features of miRNAs are that the precursor “several RNA” consisting of several hundred bases takes a stem loop structure (sHRNA: short hairpin RNA) containing a double-stranded RNA (dsRNA: double strand RNA) region, It also has a bulge structure that contains a base pair mismatch in the double-stranded RNA region, and miRNA carried out of the nucleus in the precursor state is processed into a single-stranded mature structure by Dicer. It is thought to selectively interact with 3'-UTR mainly in the mRNA of the protein and inhibit protein translation (Non-patent Document 4).
  • Non- Patent Document 5 One kind of miRNA is known to have a common base sequence structure in the 5 'base sequence (Non-patent Document 6), and the target base sequence is complementary to that sequence. There have been reports of attempts to search for mRNA that is the target of action (Non-patent Document 7).
  • Non-patent literature 1 Lagos-Quintana et al. 2001 Science 294, 853-868
  • Non-patent literature 2 Lau et al. 2001 Science 294, 858-862
  • Non-patent literature 3 Lee et al. 2001 Science 294, 862-864
  • Non-Patent Literature 4 Hutvagner and Zamore 2002 Curr. Opin. Gen. Dev. 12: 225- 232
  • Non-Patent Literature 5 Griffiths-Jones S. '2004 NAR 32, D109-Dill
  • Non-Patent Document 7 Lewi s et a l 2003 Cel l 115, 787-798
  • Non-Patent Document 8 Reinhart et al. 2000 'Nature 403, 901-906
  • Non-Patent Document 9 Zuker et a l 1981 Nucl Acid Res 9: 133-148
  • Non-Patent Document 1 0 "RNAi Experiments. Mouth Tocol” Experimental Medicine, separate volume p. 95-110 (2003) Disclosure of Invention
  • RNAi. and PTGS which are attracting attention as RNA as miRNA.
  • ⁇ it is believed to be the primary. that is, the gene expression control using the specification set is primarily will be directed to the artificial control points, such as interaction with non-target m RNA, May have unexpected side effects.
  • miRNAs are thought to regulate gene expression by interacting with their own mRNAs in vivo.
  • the regulation of mRNA expression by miRNA is a mechanism of gene regulation that exists in nature.
  • the first miRNA controls multiple types of mRNA, and one type of mRNA may also be controlled by multiple types of miRNA. It is thought that there is. Therefore, if miRNAs and one or more target genes (target mRNAs) can be identified or predicted, miRNAs can be used to target gene expression in living organisms. Can be operated intentionally.
  • all partial sequences in the entire target mRNA are taken as miRNAs. get 'double-stranded RNA most secure:.. by calculating the constant secondary structure that secondary structure E Nerugi one, mil ⁇ NA all subsequence search may take a stable structure in binding to mRNA Then, the target partial sequence or the peripheral region of the target partial sequence is calculated by calculating the most specific secondary structure that can be formed with the corresponding partial sequence of the mRNA and its secondary structure energy. To determine whether miRNA has a structure that can interact with miRNA.
  • the present invention predicts a 'protein-coding gene (target mRNA)', which is a target that is controlled by miRNA, which is a functional RNA molecule that can control gene expression. Or provide the same method.
  • the target mRNA predicted by the present invention can control gene expression (control of protein translation) by miRNA.
  • an expression control agent containing miRNA as an effective component for controlling the expression of a target gene, and a medicine containing the expression control agent.
  • the present invention provides a treatment for a disease associated with a protein encoded by the predicted target mRNA, and a treatment for a disease associated with the protein encoded by the predicted target mRNA. Can be used. ,
  • Figure 1 shows the secondary structure energy pattern formed by 3'-UTR and Let-7 of Li n-41.
  • Figure 2-1 shows a list of miRNAs conserved between known human and mouses.
  • Figure 2-2 ' shows a list of miRNAs conserved between known human and mouse mice.
  • Figure 2-3 shows a list of miRNAs conserved between known humans and mice.
  • Figure 2'-4 shows a list of miRNAs conserved between known humans and mice.
  • Figure 3 shows the flow chart for miRNA target niRNA search procedures.
  • Figure 4-11 shows a list of target small mRNAs predicted as miRNAs.
  • Figure 4-12 shows a list of target small mRNAs predicted as miRNAs.
  • Figure 4-3 shows a list of target mRNAs predicted to be miRNAs.
  • Figure 4-4 shows a list of target mRNAs predicted as miRNAs.
  • Figure 4-5 shows the list of target mRNAs predicted to be miRNAs.
  • Figure 4-6 shows a list of target mRNAs predicted as miRNAs.
  • Figure 4-17 shows a list of target mRNAs predicted to be miRNAs.
  • Figure 4-8 shows a list of target mRNAs predicted to be miRNAs.
  • Figure 4-19 shows a list of miRNA and predicted Dargot mRNAs.
  • Figure 4-10 shows a list of target mRNAs predicted to be miRNAs.
  • Figure 4-11 1 shows a list of target mRNAs predicted to be miRNAs.
  • Figure 4-11 2 shows a list of target mRNAs predicted to be miRNAs.
  • Figure 4-13 shows a list of target mRNAs predicted to be miRNAs.
  • Figure 4-11 4 shows a list of miRNAs and predicted target mRNAs.
  • Figure 4-15 shows a list of target mRNAs predicted to be miRNAs.
  • Figure 4-11 shows a list of target mRNAs predicted to be miRNAs.
  • Figure 5 shows the combination of miRNA, target mRNA, and protein of interest that was experimentally demonstrated.
  • Figure 6 shows the secondary structure energy in the combination of miRNA and mRNA demonstrated experimentally.
  • FIG. 7 shows the partial sequence of mRNA used in the experiment and its modified sequence.
  • Figure 8 shows the experimental result 1 Dual Luci ferase assay.
  • Figure 9 shows experimental result 2 RT-PCR and Western plot.
  • Figure 10 shows experimental result 3 (quantification of the results in Figures 9). '
  • the functional RNA molecule in the present invention includes a 1.6 to 2.5 ′ base RNA molecule having a gene expression control activity. Specifically, miRNA is included. '
  • the miRNA molecules targeted by the present invention can be naturally occurring in any animal, such as human, mouse, rat, chicken, zebrafish, nematode, and Drosophila. . In addition, for specific organisms, artificially designed miRNA molecules can also be targeted.
  • the method for predicting or identifying a gene (target, mRNA) controlled by the 'miRNA of the present invention comprises the following first step, second step, and third step.
  • the first step is to calculate the structural energy of the miRM and the target mRNA candidate and the miRNA sequence in the mRNA partial sequence, search for a partial sequence capable of stable binding, and determine the mRNA that contains such a partial sequence. This is the step of selecting miRNA sets.
  • the second step is the most stable secondary structure energy that the mRNA partial sequence or its surrounding sequence that miRNA can stably bind to in the set of mRNA and miRNA selected in the first step can be taken within the mRNA.
  • This is a step of searching for a partial structure that cannot take a stable structure inside the mRNA and selecting a pair of mRNA and miRNA in which such a partial sequence exists.
  • one miRNA controls multiple types of mRNA, and one type of mRNA may also be controlled by multiple types of miRNA.
  • '' Can be performed repeatedly by searching for partial sequences and changing the target mRNA expression until all the combinations of mRNA and miRNA satisfying the conditions are found.
  • the first step and the second step were performed for different species, and the same base sequence structure was conserved between species compared to miRNA that was conserved between species.
  • mRNA selected as the target mRNA in each species ie, the binding formed by the partial structure of miRNA and mRNA sequence This is the step of selecting a set in which the environment is preserved between species.
  • the R N A secondary structure calculation algorithm For the structural energy calculation in the first step, it is desirable to use the R N A secondary structure calculation algorithm. This is because it is known that the base sequence pair formed in the binding of miRNA to mRNA is not a perfect match, but is an ambiguous bond including a gap. This is because the required structural energy cannot be obtained. For the same reason, it is desirable that the partial sequence of the mRNA to be calculated is not the same as the miRNA length, but a region that is about 3 to 8 bases long. For example, for this partial sequence, partial fragments having a length obtained by adding 3 to 8 bases to the length of the miRNA from the end of the mRNA, preferably the 3 ′ end, can be selected sequentially.
  • RNA secondary structure calculation algorithm general RNA secondary structure calculation algorithms can be used.
  • various programs described in Non-Patent Document 9 or developed based on Non-Patent Document 9 Program ⁇ Ram ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • RNA double strands it is effective to speed up the calculation by limiting the calculation object to secondary structures that can form short RNA double strands. That is, even if hairpin loops, tetraloops, triloops, multi-branch loops, etc. can be formed, they do not satisfy the double-stranded sought-after structure between the target miRNA and mRNA, It can be removed from the calculation algorithm. For example, when calculating the binding energy, only the Watson-Crick base pair, the GU fluctuation base pair, the bulge loop, and the internal loop are considered.
  • the partial sequence capable of stable binding to be found by the search is obvious to those skilled in the art under any conditions.
  • RNA package parameters -18. OKcal ⁇ ⁇ -22. OKcal or less, and Watson- formed between 7 base poly C and 7 base poly G The value is lower than the secondary structure energy of the Click structure (double-stranded complementary structure).
  • any miRNA sequence already collected in various databases can be used.
  • gene miRNAs targeted by certain miRNAs are already mRNA candidates, and many gene sequences (cDNAs) are stored in the database.
  • CDNA sequences stored in any database such as DDBJ, EBI, and NC can be used. Particularly suitable (this is the cDNA sequence stored in RefSeq, a cDNA sequence database constructed by NCBI (National Center for Biotechnology Information). ,
  • miRNA target mRNA discovery search can reduce the calculation time by narrowing the search range of interaction sites on the target mRNA to the 3'-UTR region. It is. This is because it is considered that there is little room to code a 5 'UTR containing a cis element such as a translation initiation signal and a functional sequence for translation control.
  • extract cDNA with 3'-UTR from the collected cDNA sequences. Each extracted cDNA can be searched from the 3'-UTR start position to the end of the cDNA.
  • the reason for searching for a partial sequence that does not have a stable structure within the mRNA in the second step is based on the premise that miRNAs can act on partial sequences that cannot form a stable secondary structure within the mRNA. This is a known miRNA and mRNA pair
  • the invention is based on the discovery of the Let-7 and Lin-41 pair. Let_7 acts on 'Lin-41 and inhibits translation is an example of the earliest reported miRNA' (Non-Patent Literature)
  • the horizontal axis (101) is the position on the Lin-41 '3'-UTR sequence
  • the vertical axis (102) is
  • the secondary structure energy value can be formed with a secondary structure energy value (103) that can be formed with Let-7 as a partial arrangement on the 3'-UTR arrangement of Lin-41, and a partial arrangement can be formed within Li n-41.
  • the secondary structure energy value (104) is represented by a line graph.
  • the two locations indicated by arrows (105) are Let-7 binding sites on the 3'-UTR base sequence, and the secondary structure energy that can be formed between Let-7 and Lin-41 is very low (106 On the other hand, the secondary structure energy that can be formed inside Lin-41 is high (107). It became clear that more stable bonds were possible.
  • the partial arrangements of Let-7 and Lin-41 indicate the possibility that there is a Let-7 complex in the vicinity of the part where the secondary structure is formed inside Lin-41.
  • the second step do not take a stable structure inside the mRNA.
  • searching for a partial sequence the portion in the vicinity of the position shifted from 0 to 20 bases from the partial sequence searched in the first step.
  • searching for a V or partial sequence that does not have a stable structure within the mRNA such a structure can be searched.
  • the second step 'the most stable secondary structure energy that can be taken by the partial partitioning, rearrangement or its neighboring sequence within the mRNA is relatively high, and the secondary structure energy of miRNA and mRNA is low.
  • a partial sequence capable of stable binding to the miRNA is selected. In this case, it is also possible to facilitate the determination by making the partial sequence search criteria in the first and second steps relative to the secondary structure energy with the miRNA.
  • the secondary structure energy is calculated so that the partial sequence having a low structural energy with miRNA or its neighboring sequence forms with other partial sequences in the mRNA, and the value is stable with the miRNA.
  • the case where the partial sequence capable of binding is 5 kcal or more higher than the secondary structure energy that can be obtained in binding to miRNA can be selected.
  • the third step it is only necessary to calculate at least one species that is different from the species examined in the first or second step, using sequences stored in a known database.
  • the miRNA and mRNA pair selected in the second step in one species is compared with the corresponding miRNA and mRNA pair in another species. It can also be done by considering whether the requirements are met.
  • miRNAs of different species corresponding to miRNAs in one species are, for example, miRNA resources (including information about miRNAs conserved between organisms) that include "The miRNA Regi stry (http-' // w w.sanger.ac.uk/Sor tare / Rfam / mirna / index, shtml) '' Obtained using Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, Database Issue, D109-Dill Can do.
  • This method can also be used in combination with other identification prediction methods. Furthermore, after identification or prediction by this method, it is confirmed by actually testing whether or not the mRNA expression expected by this method is affected by introducing miRNA into the cell. You can also
  • target mRNA candidate In addition, in order to investigate whether miRNA inhibited the expression of the target mRNA candidate, multiple target mRNA candidates or their complementary strands were introduced in the cells with and without miRNA. By detecting a target mRNA candidate or a corresponding cDNA in a cell using a nucleic acid chip arranged on the surface, the influence on the expression of the target mRNA candidate can be examined.
  • the miRNA can be used to control the expression of the target gene, and the miRNA can be used as an expression control agent for the target gene. it can.
  • miRNA can be introduced directly into cells or an expression vector that produces miRNA can be prepared.
  • Target gene expression inhibitor contains miRNA or miRNA expression vector and, if necessary, other additives effective for introduction into the target organism, such as calcium phosphate, riboferin, polylysine, and other additives can do.
  • the gene recombination method usually employed by the target species can be used.
  • s iRNA The current vector method can be used.
  • As a system for expressing siRNA ' ⁇ ', RNApo 1 ymerase III can be used, and tandem type. : And stem loop type.
  • piGENE TM hU 6, piGENE TM tRNA. IGENE Therapeutics.
  • the sequence is amplified with a primer containing the fragment, the amplified fragment is cleaved with a restriction enzyme, and inserted downstream of the U6 promoter.
  • the oligonucleotide containing the sense, loop, and antisense sequences can be annealed and inserted downstream of the U 6 promoter (Non-patent Document 10).
  • Expression vectors can be introduced into cells using a cell introduction kit such as Effectin TM.
  • Preparation miRNA or siRNA expression vectors can be prepared by well-known methods, for example, electroporation, ca + polyphosphate method, no. It is introduced into cells or organisms by a single gun gun, law, etc.
  • a target site in a target mRNA when producing an artificial miRNA.
  • miRNA is targeted for the region that does not form a stable secondary structure within the mRNA, its surrounding region, or its 3 'side region on the .3'-UTR of the mRNA whose gene expression is to be controlled. It is possible to design.
  • candidate miRNAs are created by inserting an arbitrary number of mutations into RNA complementary to the target region on the mRNA, and from among these, selective and stable to the target region. By selecting miRNAs that can bind, it is possible to design artificial miRNAs.
  • FIG. 3 An example of miRNA target mRNA search in this patent will be described with reference to the flowchart (FIG. 3).
  • 19 types of known miRNA pairs Figure 2-1 to Figure 2-4 stored between human and mouse were collected from the International DNA Data Bank and papers (302).
  • a corresponding target cDN'A candidate search is carried out in each organism species (303).
  • Target cDNAs are collected from the RefSeq database (Release 6) constructed by the National Center for Biotechnology Iniormation i, USA and the Rererence Sequence Project, and the human cDNA sequences 28, 17 & types, and.
  • 26,561 mouse cDNA sequences were collected (307).
  • 25,284 types of mice with 3'-UTR and 19,287 types of mouse cDNA sequences were used as target cDNA candidates (308).
  • a miRNA stable binding partial sequence 313
  • the partial sequence length was determined by adding 3 base lengths to the base sequence length of the target miRNA.
  • the most stable secondary structure energy that the miRNA stable binding partial sequence forms with other partial sequences within mRNA ' is calculated (314), and the value is the binding of the miRNA stable binding partial sequence to miRNA'. If it is 5 kcal or more higher than the secondary structure energy that can be taken in (315), the partial sequence was designated as a binding candidate partial sequence (MRE: miRNA Responsive Element) (316). Perform the above for each human 'mice', and combine miRNAs with conserved base sequence structures between humans and mice with MREs in mRNAs with conserved base sequence structures between humans and mice.
  • MRE miRNA Responsive Element
  • each predicted MRE was directly under the lucifer coding region on the plasmid pRL-TK (Xbal 1 'copy was inserted into the / Notl site.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • Oligo DNAs (Fig. 7) with the MRE sequence mutated (mutant type) were synthesized, respectively, and downstream (Xbal / Not) of the horn clagel luciferase code region on the plasmid pRL-TK. l site).
  • Adherent HeLa S3 (SC) cells were cultured in 96-well culture dishes or 24-well culture dishes until they reached 50 to 80% confluence in DMEM medium containing 10% FBS. In a 96-well culture dish, in addition to 100 ng of each of the above recombinant plasmids, a plasmid pGL 3 expressing a certain amount of firefly luciferase for normalization purposes.
  • S3 (SC) cells were introduced.
  • HeLa S3 (SC) cells were cultured in a 12-well culture dish in the same manner as the above luciferase assembly.
  • pEGFP- C1 vector 'single (Clontech) Smal / Bcl l site for the synthesis of DNA' (5 'gggatccACCGGATAATCTAGAGCGGCCGCT 3) ⁇ beauty 5
  • the modified pEGFP-C1 vector is the pEGFP-Cl -It was named Notl. let_7a and NM-002188, and 'miR-20 and NM_021914 in the green fluorescent protein (GFP) on the plasmid pEGFP-Cl-Notl, above the Xbal / Notl site downstream of the code region, One copy of each of the two types of MRE was inserted.
  • mRNA recovered from human HeLa S3 (SC) cells was treated with Dnasel to form 2-4 ng, 4 ng, or 8 ng cocoons, and Superscript One-Step RT-PCR with Platinum Taq kit (Invitrogen) was used to amplify GFP, b-Actin, or Neomycin, respectively.
  • the primers used are as follows.
  • Neomycin primer "
  • PCR amplification was performed at 25 sidals (95 ° C 30, 60 ° C 30 seconds, and 72 ° C 1 minute). PCR products should be separated on agarose gel or polyacrylamide gel, stained with ethimubu mouth-mide or cyber green,
  • Quantitative RT-PCR results show that in the cells into which plasmid K (wt) with wild-type MRE has been introduced and for cells into which plasmid (mut) with mutant MRE has been introduced,
  • GFP is suppressed by let-7a and miR-20 in the presence of MRE. Moreover, it was confirmed that the suppression of expression works not at the transcriptional stage but at the translational stage.
  • the expression of the protein encoded by the mRNA is determined by the combination of the miRNA and the target mRNA predicted by the method of searching for the mRNA of the functional RNA in the present invention. Can be used in the technical field of genetic engineering.
  • let-7a, miR-20, and miR-30a_5p are used to produce a protein, Interleukin 13 N Cofilin 2 variant l s Platelet-derived growth factor receptor, alpha polypeptide ⁇ and Gl ia maturation. It is possible to control the expression of factor and beta.

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Abstract

　miRNAとそれらのターゲットとなる１つまたは複数のターゲット遺伝子（ターゲットmRNA）を同定または予測すること。　miRNAとそれらのターゲットとなる１つまたは複数のターゲットmRNAを予測又は同定する方法として、対象となる全mRNAにおける全ての部分配列がmiRNAと取り得る二本鎖RNAの最も安定な二次構造とその二次構造エネルギーを計算することにより、miRNAがmRNAとの結合において安定構造を取り得る全ての部分配列を探索し、次いで、対象部分配列または対象部分配列の周辺領域が、該当mRNAの部分配列と形成可能な最も安定な二次構造とその二次構造エネルギーを計算することにより、該当mRNAの対象部分配列がmiRNAと相互作用可能な構造であるかどうかを判定する。

Description

機能性 RNAが制御するタ一ゲッ ト' mRNAの予測 · 同定方法及びその利用方法
技術分野
. 本発明は、 生体分.子制御め分野に関連する。 より詳細には、 本発明は、 核酸分 子を用いて遺伝子発現制御を行うための方法に関連する。.， 明
背景技術
2 0 0. 1年, 1 0月に、,ほぼ同時に 3つのグループが、ショウジヨウバエ、線虫、 書
ヒ 卜で、 合わせて約 1 0 0種類の 2 1—2 2塩基の小さな RNAフアミ リ が存在' することを報告.した （非特許文献 1 , 2， 3 )。 それらの,小さい RNAは、 生物の'発 生において特定の mRNAに作用して、 タンパク質合成を阻害することが発見され、 Mi croRNA (miRNA) と命名された。 miRNAの構造上の特徴は、 前駆体である数 "〜 数百塩基よりなる RNAが、 2本鎖 RNA (dsRNA : double strand RNA)領域を含むス テムループ構造 (sHRNA : short hairpin RNA) を取り、 また、 二本鎖 RNA領域に おいて塩基対のミスマッチを含むバルジ構造を持つことにある。 前駆体状態で核 外に運ばれた miRNAが、 Dicerによって一本鎖の成熟構造にプロセシングされ、 特定の mRNAの主に 3 ' -UTRに選択的に相互作用.して、タンパク質翻訳を阻害する ものと考えられている （非特許文献 4 )。
現在、 miRNAは、 ヒ トを含む多ぐの生物種においてそれぞれ 2〜300種類が報告 され、 また、 幅広い生物種間で保存されていることが報告され、 データ^—ス化 されている （非特許文献 5 )。 一^の種類の miRNAにおいては、 5 ' 側の塩基配列 に共通の塩基配列構造が存在することが知られており （非特許文献 6 )、 その配列 に相補的な塩基配列をターゲッ トとして、作用対象である mRNAを探索する試みが 報告されている （非特許文献 7 )。
非特許文献 1 Lagos-Quintana et al. 2001 Science 294, 853 - 868 非特許文献 2 Lau et al. 2001 Science 294, 858-862
非特許文献 3 Lee et al. 2001 Sc ience 294, 862-864 非特許文献 4 Hutvagner and Zamore 2002 Curr. Opin. Gen. Dev. 12 : 225- 232 非特許文献 5 Griffi ths - Jones S. ' 2004 NAR 32, D109 - Di l l
非特許文献 6 Eric C. La i 2002 Nature Genet i cs 30, 363-364
非特許文献 7 Lewi s et a l 2003 Cel l 115, 787-798
非特許文献 8 Reinhart et al . 2000 ' Nature 403, 901 - 906
非特許文献 9 Zuker et a l 1981 Nucl Aci d Res 9： 133-148
非特許文献 1 0 「RNAi実験ズ.口 トコール」実験医学別冊 p. 95-110 (2003) 発明の開示
miRNAと同様に短鎖の. RNAとして注目されている、 RNAi.、 及び、 PTGS (^生体に おける本来の役割は、 生態防御システムとして機能し、 細菌感染によって混入し てくる外来 RNAを破壊することが主であると考えられている。 すなわち、 この仕 組みを用いた遺伝子発現制御は、 主に人工的な制御点を対象とすることになり、 非ターゲッ ト mRNAとの相互作用等、 予期せぬ副作用を伴う可能性がある。
一方、 miRNAは生体内において、 対象となる自らの mRNAと相互作用することに より遺伝子の発現を制御していると考えられている。 miRNAによる mRNAの発現制 御は自然界に存在する遺伝子制御の仕組みであり、 1種類め miRNAは複数種類の mRNAを制御し、 また、 1種類の mRNAも複数種類の miRNAによって制御されるこ とがあると考えられている。 そこで、 miRNA とそれらのターゲッ トどなる 1つま たは複数のターゲッ ト遺伝子 （ターゲッ ト mRNA) を伺定または予測することでき れば、 miRNAによって、 タ一ゲッ ト mRNAを対象として、 生体における遺伝子発現 を意図的に操作することが可能となる。
さらに、 miRNA分子、 及び、 ターゲッ ト mRNAの情報を基に実験的手法を適用す ることにより、 生体における対象遺伝子の役割の解明や、 疾病のための処置手法 の開発、 また、 疾病のための処置そのものが可能となる。
幾つかの研究プロジェク トにおいて、 miRNAのターゲッ ト mRNAを探索する試み が行われているが、その手法は、塩基配列パターンを元に mRNA上の候補部位を予 測し、 該当候補部位の RNA分子と miRNAの最適二次構造とその二次構造エネルギ 一を計算し、 その妥当性を検討するものであった。 しかしながら、 既知の mi RNA がターゲッ トとする mRNA との間め塩基配列の相補パターンは曖昧である とが 知られており、 大量の mRNAの持つ類似の塩基配列パター :ンによって、膨大な数の ターゲッ ト : '候補を生じてしまう欠点があった。， . .：
本発明においては、 mi RNA .とそれらのターグ'ッ トとなる 1つまたは複数のタ一 ゲッ ト mRNAを予測又は同定する方法として、 対象となる全 mRNAにおける全ての 部分配列が mi RNAと取り得る'二本鎖 RNAの.最も安 :定な二次構造とその二次構造ェ ネルギ一を計算することにより、 mil^NA.が mRNAとの結合において安定構造を取り 得る全ての部分配列 探索し、 次いで、 対象部分配列または対象部分配列の周辺 領域が、該当 mRNAの部分配列と形成可能な最も^定な二次構造とその二次構造ェ ネルギーを計算することにより、該当 mRNA 対象部分配列が mi RNAど相互作用可 能な構造であるかどうかを判定する。 さらに、 その様な miRNAと mRNAの部分配列 との関係が、 異なる生物種間 （例えばヒ トーマウス間） で保存されているこ を 確認することにより、信輝性の高い mi RNAとターゲッ ト mRNAの組み合わせを得る。 本発明は、 遺伝子発現を制御することができる機能性 RNA分子である miRNAに 対して、 当該 mi RNA分子がターゲッ トとして制御する、'タンパク質をコ一ドする 遺伝子 （ターゲッ ト mRNA) 'を予測又は同 する方法を提供する。
本発明によって予測したターゲッ ト mRNAは、 miRNAによって遺伝子発現の制御 (タンパク質翻訳の制御） をすることができる。
本発明によって、 ターゲッ ト遺伝子の発現を制御するための、 miRNA を有効成 分として含む発現制御剤、 並びに該発現制御剤を含有する医薬を提供することが 可能となる。■ .
.. また、本発明は、 予測したターゲッ ト mRNAがコ一ドするタンパク質に関連した 疾病のための処置の開発、及び、 予測したターゲッ ト mRNAがコードするタンパク 質に関連した疾病のための処置に利用することができる。 ，
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005-272918号の明細書 および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 Li n- 41の 3 ' -UTRと Let- 7の形成する二次構造エネルギーパターンを 図 2 - 1は、 既知のヒ ト、 'マウ.ス間で保存された miRNAのリストを示す。 図 2 - 2 'は、'既知のヒ ト、 マウス間で保存された miRNAの.リス トを示す。 図 2— 3は、 既知のヒ ト、 マウス間で保存され'た miRNAのリス トを示す。 図 2' - 4は、.既知のヒ ト、 マウス間で保存された miRNAのリストを示す。. 図 3は 、 miRNAのターゲッ ト niRNA探索手艄のフローチャート'を示す。
図 4一 1は、 miRNAと予測されたターゲッ小 mRNAのリス トを示す。
図 4一 2は、 miRNAと予測されたターゲッ小 mRNAのリス トを示す。
図 4— 3は、 miRNAと予測されたターゲッ ト mRNAのリス トを示す。
図 4— 4は、 miRNAと予測されたタ一ゲッ ト mRNA 'のリス トを示す。
図 4— 5は、 miRNAと予測されたターゲッ ト mRNAのリス 卜を示す。
図 4 _ 6は、 miRNAと予測されたタ一ゲッ ト mRNAの.リストを示す。
図 4一 7は、 miRNAと予測されたターゲッ ト mRNAのリス トを示す。
図 4— 8は、 miRNAと予測されたターゲッ ト mRNAのリス トを示す。
図 4一 9は、 miRNAと予測されたダーグッ ト mRNAのリス トを示す。
図 4 - 1 0は、 miRNAと予測されだターゲッ ト mRNAのリス トを示す。
図 4一 1 1は、 miRNAと予測されたターゲッ ト mRNAのリストを示す。
図 4一 1 2は、 miRNAと予測されたターゲッ ト mRNAのリストを示す。
図 4— 1 3は、 miRNAと予測されたターゲッ ト mRNAのリストを示す。
図 4一 1 4は； miRNAと予測されたターゲッ ト mRNAのリストを示す。
図 4— 1 5は、 miRNAと予測されたタ一ゲッ ト mRNAのリストを示す。
図 4一 1 6は、 miRNAと予測されたタ一ゲッ ト mRNAのリス トを示す。
図 5は 、 実験により実証した miRNA、 タ一ゲッ ト mRNA、 対象タンパク質の組み 合わせを示す。
図 6は、実験により実証した miRNAと mRNAの組み合わせにおける二次構造エネ ルギーを示す。
図 7は、 実験に用いた mRNAの部分配列とその改変配列を示す。
図 8は、 実験結果 1 Dual Luc i ferase assayを示す。
図 9は、 実験結果 2 RT-PCR及びウェスタンプロッ トを示す。 図 1 0は、 実験結果 3 (図, 9の結果の定量化) を.示す。 '
^明を実施するための最良の形態
本発明における機能性 RNA分子としては、 1 .6がら 2. 5'塩基長の RNA分子であ つて、遺伝子 現制御活性を持つものが含まれる。具体的には miRNAが含まれる。 '
.本発明が対象とする miRNA分子は、 ヒ ト、 マウス、 ラッ卜、 鶏、 ゼブラフィッ シュ、 線虫、 ショ ウジヨ ウバエ等、 、ずれの動物においても、 天然に存在するも .のを対象とできる。 また、 特定の生物を対象として、. 人工的に設計した miRNA分 子も対象とできる。
[miRNAが制御する対象遺伝子の同定]
本発明の' miRNAが制御する遺伝子 （ターゲッ ト， mRNA) の予測又は同定方法は、 次の第 1ステップ、 第 2ステップ、 及び、 第 3ステップを含んでいる。
第 1ステップは、 miRMとターゲッ ト mRNA候補の組において、 mRNAめ部分配列 における m iRNA配列との構造エネルギーを計算し、 安定 結合が可能な部分配列 を探索し、そうした部分配列が存在する mRNAと miRNAの組を選択するステヅプで ある。
第 2ステップは、第 1ステップにおいて選択された mRNAと miRNAの組において、 miRNAが安定に結合可能な mRNAの部分配列またはその周辺配列が、 mRNA内部にお いて取り得る最も安定な二次構造エネルギーを計算し、 mRNA内部におレ、て安定な 構造を取り得ない部分構造を探索し、 そうした部分配列が存在する mRNAと miRNA の組を選択するステップである。
, なお、 1種類の miRNAは複数種類の mRNAを制御し、 また、 1種類の mRNAも複 数種類の miRNA.によって制御されることがある''と考えられているの 、 第 1及び 第 2ステップは、それぞれ、条件を満たす mRNAと miRNAの組すベてを見出すまで、 部分配列を探索し、 タ一ゲッ ト mRNA候捕を変えて繰り返して行うことができる。 第 3ステップは、 異なる生物種を対象として第 1ステップおよび第 2ステップ を実施し、 生物種間で塩基配列構造が保存された miRNAに対して、 同じく生物種 間で塩基配列構造が保存された mRNA が、 それぞれの生物種においてターゲッ ト mRNAとして選択されるもの、即ち、 miRNAと mRNA配列の部分構造が形成する結合 環境が生物種間で保存されている組を選択するステップである。
第 1ステップにおける構造エネルギーの計算には、 R N A二次構造計算ァルゴ リズムを用いることが望ましい。 これは、 miRNA ,の mRNAとの結合において形成さ れる塩基配列ペアが完全一致ではなく、 ギャップを含むあいまいな結合であるこ とが知られているためであり、 .単なる相補塩基配列のエネルギー計算では求める 構造エネルギ が得られないためである。 同じ理由により、 計算対象である mRNA の部分配列は、 miRNA長と同じではなぐ、 ' 3〜8埠基程度長い領域であることが望 ましい。 例えば、 この部分配列は、 mRNAの末端、 好ましくは 3'末端から、 miRNA の長さに 3〜8塩基を加えた長さの部分断片を、順次計算対象として選択すること ができる。， また、 必要に応じ、 他の予測方法により、 探索されたターゲッ h mRNA 候補 又はターゲッ ト mRNA候補中の部分配列をステップ 1における計算対象とし て選択することもでぎる。 R N A二次構造計算アルゴリズムにおいては、 一般的 な R N A二次構造計算アルゴリズムを用いることができるが、 例えば、 非特許文 献 9記載のもの、 又は非特許文献 9をベー に開発されだ'各種プログラムやプロ グ . ラ ム .ラ' . ィ ■フ ■ ラ リ . ィ列 ： V i enna RNA package ： http : //www. tbi . univie. a at/〜ivo/RNA/), により容易に実現可能である。 更に、 計算対象を短い R N Aの二本鎖が形成可能な二次構造に限定するこどにより、 計 算を高速化することが効果的である。 即ち、 ヘアピンループ、 テトラループ、 ト リループ、 マルチブランチループ等は、 例え形成可能である場合でも、 .探索対象 である miRNAと mRNA間の二本鎖での幸定構造を満たすことはないため、計算アル ゴリズムより除去することが可能である。 例えば、 結合エネルギーの計算に、 Watson-Cl ick塩基対、 G- U揺らぎ塩基対、 バルジループ、 インタ一ナルループの みを考慮することにより高速化した計算をすればよい。
なお、 mRNAの部分配列における miRNA配列との二次構造エネルギーを計算し、 探索により見出されるべき安定な結合が可能な部分配列とは、 いかなる条件か当 業者に明らかであるが、 例えば、 上記 Vienna RNA packageのパラメ一ターを用い た場合には、 - 18. OKcal ^ ~- 22. OKcal又はそれ以下であり、 また、 7塩基のポリ C 及び 7塩基のポリ Gの間で形成される Watson-Cl ick構造（2本鎖相補構造） の二 次構造エネルギーよりも低い値を包含している。 本発明において用いる miRNAの配列は、 各種デ一タベースに既に収集されてレ、 る任意の m i RNAの配列を用いることができる。 また、 ある mi RNAが,制御の標的と する遺伝子 mRNAの候補は、 既に、 mRNAに対応する cDNAにつ.いて、, 多数の遺伝 子の配列（cDNA) がデータベースに保存されている'ことから、 D D B J、 E B I 、 N C Β 'Ι等任意のデータベースに保存されている cDNA 配列を用いることができ' る。特に好適 (こは、 NCBI (米国 Nat iona l Center for Biotechnology Informat ion, 以下 NCBI と略すことあり) の構築し いる cDNA配列データベースである RefSeq に保存されている, cDNA.配列を利用することができる。，
第 1ステ,ツプにおける miRNAのターゲッ ト mRNA候捕検索においては、ターゲッ h mRNA上の相互作用部位の探索範囲を 3 ' -UTR領域に絞ることで,、計算時間を短 縮することが可能である。 これは、 翻訳開始シグナル等のシスエレメントを.含む 5' UTR、及び、'翻訳制御のための機能性配列をコ一ドする余地が少ないと考えら.れ' るからである。 具体的には、. 収集した cDNA配列から、 3 ' - UTRをもつ cDNAを抽 出する。 そして、 抽出ざれた cDNAについて、 それぞれ、 3 ' - UTRの開始位置から cDNAの末尾までを探索対象の配列とすることができる。
第 2ステップにおいて mRNA 内部で安定構造を取ちない部分配列を探索する理 由は、 mRNA内部で安定な二次構造を形成できない部分配列においては、 miRNAが 作用しゃすいことを前提としている。 これは、既知の miRNAと mRNAのペアである
Let-7 と Lin-41の組における発見に基づぐ発明である。 Let_7が' Lin- 41に作用し て、 翻訳を阻害することは、 最も早く報告された miRNA'の例であり （非特許文献
8 )、 Let- 7は、. ύη-41の 3 ' -UTRに相互作用することが知られている。 図 1は、
RNA二次構造エネルギーパラメータとしては、 上記 Vienna RNA packageのものを' 用いて計算した結果を、 横軸（101)を Lin-41の ' 3 ' - UTR配列上の位置、 縦軸（102) を二次構造エネルギー値として、 Lin - 41の 3 ' -UTR配列上の部分配列が Let-7 と 形成可能な二次構造エネルギー値（103)と、 部分配列が Li n- 41内部で形成可能な 二次構造エネルギー値（ 104)を折れ線グラフで表したものである。 矢印（ 105)で示 した 2箇所が 3 ' -UTRの塩基配列上の Let-7結合部位であり、 Let- 7と Lin- 41の 間で形成可能な二次構造エネルギーが非常に低く （106)、 反対に Lin- 41内部で形 成可能な二次構造エネルギーが高レ、（107)ため、 Let- 7 と Lin- 41 の間で容易に、' より安定な結合 可能であることが明ちかとなつた。 Let- 7と Lin- 41の部分配列 は、 Lin-41内部で二次構造が形成されにぐい部分の近傍に Let- 7秸合部分が存在 する可能性を示している。
第 2ステップにおいて、 mRNA内部で安定構造を取らな.レ、部分配列を探索する際、 第 1ステップ.において探索された部分配列から、 0〜 2 0塩基の範囲でずらした 位置の近傍の部分配列について、 mRNA内部で安定構造を取らな V、部分配列を探索 することにより、 こう した構造が探索可能である。結局、第 2ステップでは、' mRNA 内部において部分配,歹リ又はその近傍の配列が取り得る最も安定な二次構造エネル ギ一が相対的に高く、 且つ miRNAと mRNAの二次構造エネルギーが低い前記 miRNA と安定な結合が可能な部分配列を選択する。 この場合、 また、 第, 2ステップにお ける部分配列の探索基準を、 miRNA との二次構造エネルギーとの相対値とするこ' ' とにより、 判定を容易にすることが可能である。 例えば、 miRNA との構造エネル' ギ一が低い部分配列又はその近傍配列が mRNA 内部の他の部分配列と形成する最 も安定よ二次構造エネルギーを計算し、 その値が、 前記 miRNAと安定な結合が可 能な部分配列が miRNA との結合において取り得る二次構造エネルギーより も 5kca l以上高い場合を選択できる。
第 3ステップにおいては、 公知のデータベースに保存されている配列を利用し て、 少なくとも第 1-2ステップで検討した生物種とは異なる種 1種について計算 すればよい。 また、 第 3ステップにおいては、 ある種において、 第 2ステ'夕プで 選択された miRNAと mRNAの組について、 別,の種における対応する mi RNA と mRNA の組に いて、，第 2ステップの要件を満たすかどうかを検討する.ことによって行 うこともできる。 ' ここで、 ある種における miRNAに対応する異'なる種の miRNAは、 例えば、 miRNA のリ ソース（生物間で保存された miRNAに関する情報を含む）としては、「The miRNA Regi stry (http -' //w w. sanger. ac. uk/Sor t are/Rfam/mirna/ index, shtml) 」 Nuc le i c Aci ds Research, 2004, Vol. 32, Database Issue, D109- Di l l を用い て、 得ることができる。
また、 異なる種における対応する mRNAは、 生物間で保存された mRNAのリ ソー ス で あ る 、 （1) 「 Homologene (http : // ww. ncb'i . nlm. nih. goy/entrez/query. fcgi?db=homologene)」' ( Nuc le ic Acids Research, 2001 , Vo l . 29， No. 1 137- 140 米国生物情報技術センタ^" (NCBI) の作成する'、多生物にわたる、種間で保存された遺伝子のデータベース）又は （2) 「 ■ ' The Mouse Genome Database
(http //nar. oup journals, org/cgi/content/ful l/33/suppl_l/D471)」 、 Nuc le ic Ac ids Research, 2005， Vol. 33， Database i ssue D471-D475 ネズミのデータべ ース、 ヒ トーネズ 'ミの間で保存きれ.た遺伝子のデータ） を用いて、 得ることがで さる。
また、，本方法は、 他の同定予測方法と組み合わせて使用することもできる。 更 に、 本方法で同定又は予測した後、 実際に実験により、 ' m iRNA を細胞に導入する ことにより、本方法で予想ざれた mRNAの発現が影響されているかどうか測定する ことにより、 確認することもできる。
さらに、 miRNAによりタ一ゲッ ト mRNA候補の発現が阻害されたか否かを調べる ために、 細胞内に miRNAを導入.した場合と導入しない場^について、 複数のター ゲッ ト mRNA候補又はその相補鎖を表面に配置した核酸チップを用いて、細胞内の タ―ゲッ：ト mRNA候補又は対応する cDNAを検出することにより、 ターゲッ ト mRNA 候補の発現への影響を調べることもできる。
[miRNAの使用方法]
[標的遺伝子の発現抑制剤]
miRNAにより発現が制御される標的遺伝子が同定.されれば、 当該 miRNAを用い てその標的遺伝午の発現を制御することができ、 miRNA は、 当該標的遺伝子の発 現制御剤とじて用いることができる。
例えば、 miRNAは、 そのまま細胞に導入する か、 miRNA .を生成する発現べクタ 一を調製することができる。 標的遺伝子の発現抑制剤は、 miRNA又は miRNA発現 ベクタ一、及び、必要があれば、対象生物への導入に有効な他の添加剤、例えば、 リン酸カルシウム、 リボフエリン、 ポリ リジン、 その他の添加剤を含有すること ができる。
miRNA 発現べクタ一の調製には、 通常その対象生物種により採用されている遺 伝子組み換え法を用いることができる。 一般的な動物を対象としては、 s iRNA 発 現ベクター法を用いるこ とができ る。 siRNA ,'■を発現させる系としては、' RNApo 1 yme r a s e I I Iを用いることができ、 タンデムタイフ。 :と、 ステムループタイプ がおる。 例'えば、 piGENE™hU 6、 piGENE™tRNA . ( iGENE Therapeutics). を用いる ことが'でき、 好適には、 （i)選択ざれた miRNAに対応する. s iRNAをセンス、 アンチ セ Vス'配列を,含むブラィマ一で増幅し、増幅断片を制限酵素で切断し、 U 6プロモ タの下流に挿入し、. タンデムタイプど る力 ( i i). センス、 ループ、 アンチセ ンス配列を含むオ ゴヌクレオチド ァニールし、 U 6プロ.モータの下流に挿入す .ることができる （非特許文献 1 0 )。 発現ベクターは、 Effectin™などの細胞導入 用キク ト.を用いて、 細胞に導入することができる。
調製 miRNA又は siRNA発現べクタ一は、 周知の方法で、 例えば、.エレク トロポ レ一ション、 ca+ポリ リン酸法、ノ、。一ティクルガン,法等により、 細胞又は、 生物体 に導入される。
次に、'このように特定された制御対象遺伝子の発現が実際に miRNAめ導入によ り、 '阻害されるかどうかを確認する。 制御対象遺伝子の機能が、 確認されていな い場合については、 阻害された結果の表現型の変化を確認 fる。
[標的配列に対する人工 miRNAの設計]
本発明により、人工 miRNAを作成するさいの、 タ一ゲッ ト mRNAにおけるタ一ゲ ッ ト部位（相互作用部位）の選択を行うことが可能となる。 例えば、 遺伝子発現を 制御したい mRNAの .3 ' -UTR上において、 mRNA内部で安定な二次構造を形成しな い領域、 あるいはその周辺镇域、 あるいはその 3 ' 側領域を対象として、 miRNA を設計することが可能である。 その際、 mRNA上の対象領域に相補な RNAに任意の 数の突然変異を揷入することによって、 候補 miRNA群を作成し、 その中から、 対 象領域に対して選択的、 かつ、 安定に結合可能である miRNAを選択することによ り、 人工 miRNAの設計が可能となる。
実施例 1
本特許における mi RNAのターゲッ ト mRNA探索の実施例を、 フローチャート （図 3 ) に沿って説明する。 まず、 国際 DNAデータバンク、 及び、 論文より、 ヒ ト · マウス間で保存されている既知の miRNA の組 1 19種類 （図 2— 1 ,から図 2— 4 ) を収集した（302)。 続いて、 m i RNAのタ一ゲッ ト mRNAの候補探索のため、対応するタ一ゲッ ト cDN'A の候補探索を各生物種において実施する（303)。タ一ゲッ ト cDNAは、,米国 Nat ional Center for Biotechnology Iniormation iこおり， ' Rererence Sequence Project が構築している RefSeq データベース （Release6) より収集し、 ヒ ト cDNA 配列 28,.17 &種類、 及び、. ,マウス cDNA配列 26, 561種類を収集した（307)。 その内、 3 ' - UTRを持つヒ 卜 c醒 25, 284種類、'及び、 マウス cDNA配列 19, 287種類をタ ゲ ッ ト cDNA候補（308)とした。
各生物種において.、各 miRNAについて（309)、各 mRNAの 3 ' - UTRについて（310)、 各部分配列を対象として（311) .、 miRNAと部分配列との間の二次構造エネルギ 計 算を行い（312)、 -22kca L以下の二次構造を取り得る部分配列を mi RNA安定結合部 分配列とした（313)。 ここで、 部分配列長は、，対象 miRNAの塩基配列長に 3塩基長 加えたものとした。
続いて、 miRNA安定結合部分配列が mRNA'内部の他の部分配列と形成する最も安 定な二次構造エネルギーを計算し（314 )、 その値が、 miRNA 安定結合部分配列が miRNA 'との結合において取り得る二次構造エネルギーよりも 5kcal以上高い'場合 (315)、 その部分配列を、 結合候補部分配列 (MRE : miRNA Respons ive Element) とした（316)。 以上を、 ヒ ト 'マウスについてそれぞれ実行'し、 ヒ ト 'マウス間で 塩基配列構造が保存された miRNAが、 ヒ ト · マウス間で塩基配列構造が保存され た mRNAにそれぞれ MREを持つ組み合わせを収集し（304)、 その結果、 119種類の. ヒ ト miRNAに対応する 1, 092種類のヒ トターゲッ ト遺伝子（タ一ゲッ ト mRNA) と の組み合わせ（図 4— 1から図 4一 1 6 )が得られた（305)。 ここで、 .ヒ ト 'マウス 間で塩基配列構造が保存された miRNAとしては、 miRNAのファミ リ一を対象とし、 ' また、 ヒ ト ·マウス間で塩基配列構造が保存ざれた mRNA としては、 MGI (Mouse Genome Iniormat ics： http： //www. i nformatics, jax. org/)の提供するオノレソログ 情報を対象とした。
なお、 図 4一 1力 ら図 4一 1 6において mRNA をあらわす識別子（丽_001949，
NM_020390, 删— 004496等）は、 N C B Iの RefSeqで付与されている mRNAの登録 番 号 （ ァ ク セ ッ シ ヨ ン 番 号 ） で あ り 、 http : //www. ncbi . nlm. mh. gov/entrez/query. f cgi rdb=Nuc leoti de で参照するこ とができる。
実施例 2
実施例 1:で得られた結果より、ヒ ト. miRNA .どそのダーゲッ ト mRNAの組を計 4種 類、即ち、 let7a及び NM— 002188、 miR-20及び雇— 021914、 miR-20及び NM_006206、 並びに miR-30a-5p及び匪 _004124の組を選択し （図 5 )、 実験により、 miRNAに よる各ターゲッ小 mRNAの翻訳阻害活性を調べた。'選択した 4種類の miRNAとタ一 ゲッ ト mRNAの組における、 miRNA t MRE.間の二次構造エネルギー（M- T)、 及び、 .MRE,が mRNA内部の部分配列と形成可能な最安定二次構造エネルギー（T- T)、及び、 " M-T" と" T-T" の差（Di ffVal)を図 6に示す。
(l) Dual Luc i ferase assay
」選択した 4種類の mi RNAとタ—ゲッ ト mRNAの組に対する翻訳阻害活性を簡便に 検出するために、予測された各 MREを、 プラスミ ド pRL-TK上のルシフェラー の コード領域の直下 （Xbal/Notl 部位） に 1' コピー掙入した。 MREの挿入がこれら の指標蛋白の発現に与える影響を見ることにより内在性 miRNAによるタンパク質 翻訳阻害活性を調べた。
ヒ ト HeLa S3 (SC)細胞は、 1 0 %牛胎児血清 ( F B S ) 添加ダルベッコのィー ク"ノレ改変培地 (DMEM ： Dulbecco' s modi f i ed Eagle' s Medium) で培養した。 HeLa
S3 (SC)細胞において let7a、 miR- 20、 及び miR-30a- 5p が発現していることを mirVana miRNA i solat ion ki t (Amb ion)で調整した小分子 RNA分画を用いたノー ザンブロッ ト解析で確認した。 各ターゲッ ト mRNAの MRE配列 （野生型）、 及び、
M R E配列に突然変異を加えた配列 （変異型） を持つオリゴ DNA (図 7 ) をそれ ぞれ合成し、プラスミ ド pRL-TK上のォワンクラゲルシフェラーゼコ一ド領域の下 流（Xbal/Not l 部位）に挿入した。接着した HeLa S3 (SC)細胞は 10% FBS含有 DMEM 培地で 50乃至 80 %コンフルェントになるまで、 96穴培養皿又は 24穴培養皿で 培養した。 96穴培養皿では、 上記それぞれの組換えプラスミ ド 100ngに加え、 規準化を目的として、 ホタルルシフェラーゼを一定量発現するプラスミ ド pGL 3
15ngを、 CalPhos mammal i an transf ect ion ki t (Clontechノを用レヽ" 、共 ίこヒ 卜 HeLa
S3 (SC)細胞に導入した。
20から 24時間後導入細胞のライセートを作製し、 2種類のルシフェラ一ゼ活性 を Dual Luc if erase Reporter Assay System (Promega)を用レヽて測定 'した。 ホタ .ルルシフェラーゼ活性の値でォワ クラゲルシフェラ一ゼ'活性の値を規準化し、 野生型と変異型での規準化ォワンクラゲルシフェラーゼ活性を比較した結果、 そ れぞれの MREは野生型に比べ変異型の ¾性が高かった （図8 )。 これは、 内在性の 対応する miRNAが MREと.相互作用し、ターゲッ ト mRNAにおける翻訳過程が抑制さ れたことを している。
(2) GFP reporter assay
. HeLa S3 (SC)細胞は上記ルシフェラーゼアツセィ 同様に 1 2穴培養皿で培養 した。 次に、 pEGFP- C1 ベクタ'一 (Clontech)の Smal/Bcl l 部位に合成 DNA ' (5' gggatccACCGGATAATCTAGAGCGGCCGCT3 ) 及 び 5
GATCAGCGGCCGCTCTAGATTATCCGGTGGATCCC3' ) をァニールすることにより EGFP-Cl vector (Clontech)のストップコ ドンの後に , Xbal/Notl 部位.を形成するように修: 飾し、修飾された pEGFP- C1 ベクタ一は、 pEGFP-Cl-Notl と名づけられた。 let_7a 及び NM— 002188、 並びに、 ' miR- 20及び NM_021914の組に いて、 前記プラスミ ド pEGFP- Cl-Notl上の緑色蛍光蛋白 （GFP) .コ一ド領域の下流の Xbal/Notl部位に、 上記 2 種類の MRE をそれぞれ 1 コピー挿入した。 これらを CalPhos mammal ian transfect ion ki t (Clontech)を用いてヒ ト HeLa S3 (SC)細胞に導入した。 導入か ら 24時間後、 トランスフエク トされた HeLa S3 (SC)細胞から PARIS Protein and RNA Isolat ion System (Ambion)を用いて、 プロ トコールどおりにタンパク質及び RNA を調製した。
ヒ ト HeLaS3 (SC)細胞から回収した全タンパク質を.、 1 0 %ポリアクリルアミ ドゲルで SD S電気泳動し、 P V D 膜にエレク トロブロティングにより移した。 GFPに対するポリク口ーナルゥサギ抗体（BD l i ving Colors A. V. pepti de ant i body (Clontech) ) 及び抗ァクチンゥサギ抗体で処理し、更にホースラディッシュ ぺ ルォキシダ一ゼをコンジュゲートした抗ゥサギイミュノグロブリン G抗体で処理 した。 免疫複合体のペルォキシダ一ゼ活性は、 EC L検出キッ ト （アマシャム） で 可視化し、 LAS- 1000 plus lumino- image analyzer (Fuj i Fi lm) で分析した（図 9 )。 また、ヒ ト HeLa S3 (SC)細胞から回収した全 mRNAを Dnaselで処理し 2-4ng, 4ng 又は 8 ng 铸型として、 Superscript One-Step RT-PCR with Platinum Taq ki t (Invitrogen)を用いて、 それぞれ、 GFP, b- Actin,又は Neomycinについて増幅し た。 なお、 用いたプライマーは次のとおりである。
1) Primers
la) EGFP 用プライマー：
Forward： 5， ACTACCTGAGCACCCAGTCCG
Reverse: 5' CGGACTTCTACAGCTCGTCCAT
増幅断片サイズ (Amplicon size) ： 123 bp lb) Neomycin 用プライマー"
Forward: 5' GACCGCTATCAGGACATAGCGTT
Reverse: 5' AAGAACTCGCAAGAAG.GCGATAGA
Amplicon size: 144 bp lc) ァクチン用プライマ一：
Forward: 5' GCTCACCATGGATGATGATATCGC
Reverse: 5' GACCTGGCCGTCAGGCAGCTCG
Amplicon size: 748 bp
逆転写は 55°Cで 20分間された。 PCR増幅は、 25サイダル（95°C 30 ,、 60°C 30 秒、 及び 72°C 1分), 行った。 PCR産物は、 ァガロースゲル上又はポリアクリルァ ミ ドゲル上で分離し、 ェチジゥムブ口マイ ド又はサイバーグリーンで染色し、
LAS— 1000 plus 1 urn i no- image analyzer (Fuji Filmノ で分析し/こ。
、野生型 MREを挿入したプラスミ K (wt) を導入した細胞と、 変異型 MREを挿入 したプラスミ ド（mut)を導入しだ細胞においては、定量的な RT- PCR の結果より、
GFP、 及び、 Actin をコードした mRNA、 gfp、 及び、 actinはいずれも同様に転写 されている力；、 Westernブロッ 卜の結果より、 タンパク質の発現量は、 Actinは同 等であるが、 GFPにおいては、 mutの方が明らかに高いことがわかる。 図 9の結果 を定量化すると、 let-7aと删— 002188の組においては、変異型は野生型の 3.1倍、 miR-20の NM— 021914の組においては、変異型は野生型の 8.6倍の発現量である（図
1 0)。 即ち、 GFPは、 MREの存在により let-7aと miR- 20によって発現を抑制さ れ、 しかも、，発現の抑制が転写の段階ではなく、 翻訳の段階で働いていること . 確認できた。
以上によ"り、 '本発明の手法よつて予測しだ miRNAとターゲッ ト mRNAにおいて、 タンパク質の翻訳が制御されることを確' 認し、 同時に、 タンパク質の発現が制御 能であるこ,とを示した。 これらの結果はまた、 本発明が、 上記タンパク質に関 連した疾病のための処置の開発、 及び、 疾病のための処置そのものに有用である ことを示している。 産業上の利用可能性
本発明によれば、本発明における機能性' RNAのダーグッ ト mRNA探索手法によつ て予測された miRNA とターゲッ ト mRNAの組み合わせによつて、 タ一ゲッ ト. mRNA にコードされたタンパク質の発現の制御が可能であり、 遺伝子工学の技術分野に おいて利用することができる.。
さらに本発明によれば、 let- 7a、 miR- 20、 及び、 miR- 30a_5p によって、 タン ノ ク質、 Interleukin 13N Cofilin 2 variant ls Platelet-derived growth factor receptor, alpha polypeptide^ 及び、 Gl ia maturation factor, beta の発現を 制御することが可能である。
また、本発明におけるタンパク質発現制御を利用した疾病のためめ処置の開発、 及び、 疾病のための処置が可能である。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲 Γ. 遺伝子発現制御機能を持つ 1. 6〜 2' 5塩基長の miRNA分子により発現が 制御されるター.ゲッ ド mRNAを予測又は同定する方法であつて、 ( 1 )ターゲッ ト mRNA候補中の.部分配列と miRNA配列との二次構造エネルギーを 順次計算し、 miRNA と安定な結合が可能〉よ部分配列を探索し,、 安定な結合が,可能 な部分配列が存在するダーゲッ ト mR A候補と miRNAの組を選択する第 1ステップ、 及ぴ ( 2 )第1ステップにおいて選択されたタ一ゲッ ト mRNA候補と .miRNAの組におい て、タ一ゲッ ト mRNA候補中で m i RNAが安定に結合可能な前記部分配列又はその近 傍の部分配列が mRNA 内部において取り得る.最も安定な二次構造エネルギーを計 算し、これを、タ一ゲッ ト mRNA候補中の前記安定な結合が可能な部分配列と miRNA; 配列との二次構造エネルギーと比較し、前記 mRNA内部において前記部分配列又は その近傍の部分配列が取り得る最も安定な二次構造ェネ ギ一が相対的に高い前 記部分配列又は近傍の部分配列が存在す.る mRNAと mi RNAの組を選択する第 2'ステ ップを含み、 以上のステップにより選択された組の mRNAが当該組の mi'RNA分子により発現が 制御されるターゲッ ト mRNAであると予測又は同定する方法。 2 . 遺伝子発現制御機能を持つ 1 6〜 2 5塩基長の miRNA分子により発現が 制御されるターゲッ ト mRNAを予測又は同定する方法であつて、
( 1 ) ある生物種について、 ターゲッ ト mRNA候補中の部分配列と miRNA配列との 二次構造エネルギーを順次計算し、 miRNA と安定な結合が可能な部分配列を探索 し、安定な結合が可能な部分配列が存在するタ一ゲッ ト mRNA候補と miRNAの組を 選択する第 1ステップ、 及び
( 2 )第 1ステップにおいて選択されたターゲッ ト mRNA候補と miRNAの組におい て、ターゲッ ト mRNA候補中で miRNAが安定に結合可能な前記部分配列又はその近 傍の部分配列が mRNA 内部において取り得る最も安定な二次構造エネルギーを計 算し、これを、ターゲッ ト mRNA候補中の前記安定な結合が可能な部分配列と miRNA 配列との二次構造エネルギーと比較し、前記 mRNA内部において前記部分配列又は その近傍の部分配列が取り得る最も安定な二次構造エネルギ一が相対的に い 記部分配列又は近傍の部分配列が存在する mRNAと miRNAの組を選拆する第 2ステ ップ、：
並びに.
( 3 ) '異なる.生物種を対象として第 1ステップおよび第 2ステップを実施し、 ' miRNA と mRNA 配列の部分構造が形成する結合環境が生物種間で保存されている miRNAど mRNAの組を選択するステツ； 7°とを含み、
. 以上のステップにより選択された組の mRNAが当該組の miRNA分子により発現が 制御されるターゲッ ト mRNAであると予測又は同定する方法。,
3 . . 前記第 1ステップにおいて、 mRNAの部分配列長を、 miRNAの塩基長より も 3〜8塩基長くする請求項 1又は 2記載の方法。 ：
' 4 . 部^配列をターゲッ ト mRNA候補の.3 '末端から順次、 1塩基ずつずらし て探索する請求項3記載 方法。 '
5 . 第 1ステップにおいて、 部分配列をターゲッ ト mRNA候補の 3 ' - UTR領 域から探索する、 .請求項 1〜4いずれか, 1項記載の方法。
6 . 前記第 1ステップにおいて、 結合エネルギーの計算に、 Watson- Cl i ck塩 基対、 G-U 揺らぎ塩基対、 バルジループ、 インターナルル^"プのみを考慮するこ とにより高速化した、 RNA 二次構造予測の手法を用いる請求項 1〜 5いずれか 1 項記載の方法。 .
7 . 前記第 2ステップにおいて、 mRNA F¾部において取り得る最も安定な二次 構造エネルギーを計算する近傍の部分配列を、 （1 ) のステップにおいて選択され た部分配列から 0〜 2 0塩基の範囲でずらした位置とする手法,を用いる請求項 Γ 〜 6いずれか 1 ,項記載の方法。 '
8 . miRNA分子を細胞に導入し、 ターゲッ ト mRNAの発現に対する影響を確認 するステップを更に含む、 請求項 1〜 7いずれか 1項記載の miRNA分子により発 現が制御されるタ一ゲッ ト mRNAを予測又は同定する方法。
9 . 複数のタ一ゲッ ト mRNA候補又はその相補鎖を表面に配置した核酸チップ を用いて、 ターゲッ ト mRNA候補又は対応する cDNAを検出することにより、 ター ゲッ ト mRNA候捕の発現の影響を調べることを更に含む、請求項 1〜 8いずれか 1 項記載の miRNA分子により発現が制御されるターゲッ小 mRNAを予測又は同定する •方法。
1 0. miRNA が、 配列番号 1— 2: 38のいずれか 1つの配列番号で表される miRNAである、 請求項 1 9いずれか 1項記載の miRNA分子により制御されるタ —ゲッ ト mRNAの予測又は同定方法。
• 1 1. 以下に示される X nの遺伝子の発現を制御するため、' それぞれ、 Yn で表される核酸を有効成分として含む X η遺伝子発現制御剤 （但し η = 1 2 .3又は 4)。
X 1 ： Interleukinl3 (剛— 002188)
X 2 ： Cofilin 2 variant 1 (NM_021914) .
X 3： Platelet-derived growth factor receptor, aloha polypeptide 勵— 006206) X 4 ： Glia maturation factor, beta (删— 004124)
Y 1 : (1) UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
Y 2 : (2) UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUA
Y 3 : (3) UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUA
Y 4 ： (3) UGUAAACAUCCUCGACUGGAAGC
1 2. 請求項 1 1記載の Xn遺伝子発現制御剤を有効成分として含む医薬。 (但し、 n = 1 2, 3又は 4で、 X 1は、 Interleukinl3 (刚— 002188)、 X 2は、
Cofilin 2 variant 1 (删— 021914) X 3は、 Platelet-derived growth factor receptor,; .alpha .polypeptide (NM— 00り 206) Χ·4 、 Glia maturation factor, beta (NM_004124)を表す。）
1 3. miRNA 分子を用いて、 請求項 1 1 0いずれか 1項記載の方 で発現' が制御されると予測又は同定されたターゲッ ト' mRNAの発現を制御する方法。
1 4. miRNA 分子を用いて、 請求の範囲 1 1 0いずれか 1項記載の方法で 予測又は同定されたタ一ゲッ ト遺伝子（ターゲッ ト mRNA)の発現を制御すること により、 （ヒ ト以外の） 生体機能を制御する方法。
1 5. 疾病の処置の開発のために、 （ヒ ト以外の） 生体機能を制御する請求項 1 4に記載の方法。
1 6. 疾病の処置のために （ヒ ト以外の） 生体機能を制御する、 請求項 1 4 に記載の方法。.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010523100A (ja) * 2007-04-04 2010-07-15 キングス カレッジ ロンドン マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などの調節性ＲＮＡの機能分析で使用するための核酸及びライブラリー

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2072618A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-24 Johannes Gutenberg-Universität Mainz Use of RNA for reprogramming somatic cells
US20120323498A1 (en) * 2010-02-19 2012-12-20 The Regents Of The University Of Michigan Mirfilter: efficient noise reduction method to identify mirna and target gene networks from genome-wide expression data
AU2016298376A1 (en) * 2015-07-29 2018-02-22 Orlando Health, Inc. MicroRNA biomarkers for traumatic brain injury and methods of use thereof
CN109859798B (zh) * 2019-01-21 2023-06-23 桂林电子科技大学 一种细菌中sRNA与其靶标mRNA相互作用的预测方法

Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005503827A (ja) * 2001-09-28 2005-02-10 マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ マイクロｒｎａ分子
WO2005013901A2 (en) * 2003-07-31 2005-02-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding rnas
JP2005058235A (ja) * 2003-08-11 2005-03-10 Eppendorf Array Technologies Sa マイクロアレー上でのｓｉＲＮＡの検出および定量
WO2005056797A1 (en) * 2003-12-15 2005-06-23 Kye-Seong Kim Novel mirna molecules isolated from human embryonic stem cell
US20050182005A1 (en) * 2004-02-13 2005-08-18 Tuschl Thomas H. Anti-microRNA oligonucleotide molecules
WO2005078096A2 (en) * 2004-02-09 2005-08-25 University Of Massachusetts Dual functional oligonucleotides for use in repressing mutant gene expression
WO2005098029A2 (en) * 2004-04-07 2005-10-20 Exiqon A/S Methods for quantification of micrornas and small interfering rnas
JP2005296014A (ja) * 2004-04-06 2005-10-27 Eppendorf Array Technologies Sa 細胞性転写制御の決定方法
WO2005103298A2 (en) * 2004-04-20 2005-11-03 Genaco Biomedical Products, Inc. Method for detecting ncrna
US20050266418A1 (en) * 2004-05-28 2005-12-01 Applera Corporation Methods, compositions, and kits comprising linker probes for quantifying polynucleotides
US20060003337A1 (en) * 2004-06-30 2006-01-05 John Brandis Detection of small RNAS
WO2006033928A2 (en) * 2004-09-16 2006-03-30 Applera Corporation Compositions, methods, and kits for identifying and quantitating small rna molecules
US20060185027A1 (en) * 2004-12-23 2006-08-17 David Bartel Systems and methods for identifying miRNA targets and for altering miRNA and target expression
WO2006102309A2 (en) * 2005-03-21 2006-09-28 Stratagene Methods, compositions, and kits for detection of micro rna
WO2006115570A2 (en) * 2005-02-18 2006-11-02 Applera Corporation Small nucleic acid detection probes and uses thereof

Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005503827A (ja) * 2001-09-28 2005-02-10 マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ マイクロｒｎａ分子
WO2005013901A2 (en) * 2003-07-31 2005-02-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding rnas
JP2005058235A (ja) * 2003-08-11 2005-03-10 Eppendorf Array Technologies Sa マイクロアレー上でのｓｉＲＮＡの検出および定量
WO2005056797A1 (en) * 2003-12-15 2005-06-23 Kye-Seong Kim Novel mirna molecules isolated from human embryonic stem cell
WO2005078096A2 (en) * 2004-02-09 2005-08-25 University Of Massachusetts Dual functional oligonucleotides for use in repressing mutant gene expression
US20050182005A1 (en) * 2004-02-13 2005-08-18 Tuschl Thomas H. Anti-microRNA oligonucleotide molecules
JP2005296014A (ja) * 2004-04-06 2005-10-27 Eppendorf Array Technologies Sa 細胞性転写制御の決定方法
WO2005098029A2 (en) * 2004-04-07 2005-10-20 Exiqon A/S Methods for quantification of micrornas and small interfering rnas
WO2005103298A2 (en) * 2004-04-20 2005-11-03 Genaco Biomedical Products, Inc. Method for detecting ncrna
US20050266418A1 (en) * 2004-05-28 2005-12-01 Applera Corporation Methods, compositions, and kits comprising linker probes for quantifying polynucleotides
US20060003337A1 (en) * 2004-06-30 2006-01-05 John Brandis Detection of small RNAS
WO2006033928A2 (en) * 2004-09-16 2006-03-30 Applera Corporation Compositions, methods, and kits for identifying and quantitating small rna molecules
US20060185027A1 (en) * 2004-12-23 2006-08-17 David Bartel Systems and methods for identifying miRNA targets and for altering miRNA and target expression
WO2006115570A2 (en) * 2005-02-18 2006-11-02 Applera Corporation Small nucleic acid detection probes and uses thereof
WO2006102309A2 (en) * 2005-03-21 2006-09-28 Stratagene Methods, compositions, and kits for detection of micro rna

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BURGLER C. ET AL.: "Prediction and verification of microRNA targets by MovingTargets, a highly adaptable prediction method", BMC GENOMICS, vol. 6, no. 1, 2005, pages 88, XP021002356 *
DOSTIE J. ET AL.: "Numerous microRNAs in neuronal cells containing novel microRNAs", RNA, vol. 9, 2003, pages 180 - 186, XP002354609 *
KIRIAKIDOU M. ET AL.: "A combined computational-experimental approach predicts human microRNA targets", GENES DEV., vol. 18, no. 10, 2004, pages 1165 - 1178, XP009032049 *
MUCKSTEIN U. ET AL.: "Thermodynamics of RNA-RNA binding", BIOINFORMATICS, vol. 22, no. 10, May 2006 (2006-05-01), pages 1177 - 1182, XP003010681 *
REHMSMEIER M. ET AL.: "Fast and effective prediction of microRNA/target duplexes", RNA, vol. 10, no. 10, 2004, pages 1507 - 1517, XP008044998 *
SUH M.-R. ET AL.: "Human embryonic stem cells express a unique set of microRNAs", DEV. BIOL., vol. 270, no. 2, 2004, pages 488 - 498, XP002404396 *
WATANABE Y. ET AL.: "Computational analysis of microRNA targets in Caenorhabditis elegans", GENE, vol. 365, January 2006 (2006-01-01), pages 2 - 10, XP005280941 *
ZUKER M. ET AL.: "Optimal computer folding of large RNA sequences using thermodynamics and auxiliary information", NUCLEIC ACIDS. RES., vol. 9, no. 1, 1981, pages 133 - 148, XP003010680 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010523100A (ja) * 2007-04-04 2010-07-15 キングス カレッジ ロンドン マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などの調節性ＲＮＡの機能分析で使用するための核酸及びライブラリー

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Li et al. Deep sequencing analysis of small non-coding RNAs reveals the diversity of microRNAs and piRNAs in the human epididymis
Xu et al. MicroRNA-mediated target mRNA cleavage and 3′-uridylation in human cells
Uren et al. Genomic analyses of the RNA-binding protein Hu antigen R (HuR) identify a complex network of target genes and novel characteristics of its binding sites
Slevin et al. Deep sequencing shows multiple oligouridylations are required for 3′ to 5′ degradation of histone mRNAs on polyribosomes
Li et al. Gene regulation in Giardia lambia involves a putative microRNA derived from a small nucleolar RNA
Silenzi et al. A tripartite circRNA/mRNA/miRNA interaction regulates glutamatergic signaling in the mouse brain
Zhao et al. SARS-CoV-2 RNA stabilizes host mRNAs to elicit immunopathogenesis
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Mao et al. MiR-181b targets Six2 and inhibits the proliferation of metanephric mesenchymal cells in vitro

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