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WO2007012319A1 - Ionisierungsadditive enthaltende lc/ms-blends - Google Patents

Ionisierungsadditive enthaltende lc/ms-blends Download PDF

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WO2007012319A1
WO2007012319A1 PCT/DE2006/001304 DE2006001304W WO2007012319A1 WO 2007012319 A1 WO2007012319 A1 WO 2007012319A1 DE 2006001304 W DE2006001304 W DE 2006001304W WO 2007012319 A1 WO2007012319 A1 WO 2007012319A1
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WO
WIPO (PCT)
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acid
salt
less
solution
solution according
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/DE2006/001304
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English (en)
French (fr)
Inventor
Joachim Emmert
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sigma Aldrich Production GmbH
Original Assignee
Sigma Aldrich Production GmbH
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Filing date
Publication date
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Application filed by Sigma Aldrich Production GmbH filed Critical Sigma Aldrich Production GmbH
Priority to EP06761828A priority Critical patent/EP1913378A1/de
Priority to US11/989,246 priority patent/US20090306341A1/en
Priority to DE112006002660T priority patent/DE112006002660A5/de
Publication of WO2007012319A1 publication Critical patent/WO2007012319A1/de
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/18—Kallidins; Bradykinins; Related peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
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    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/84—Preparation of the fraction to be distributed
    • G01N2030/8429—Preparation of the fraction to be distributed adding modificating material

Definitions

  • LC / MS the coupling of liquid chromatography with mass spectrometry, has been the method of choice since the 1990s for a wide variety of issues in pharmaceutical, clinical and forensic chemistry, as well as in environmental analysis and food monitoring.
  • LC / MS has become one of the most important analysis techniques, in particular for the separation and structure elucidation of proteins.
  • electrospray ionization is the most commonly used ionization technique, in which the addition of ionization aids or ionization additives has proven itself. These ionization additives facilitate the transition of the analytes to charged particles (ions) in the gas phase, as described in LC-GC Europe, 17 (12), p. 646-649., 2004.
  • One of the most common additives in normal HPLC is the phosphoric acid and its sodium or potassium salts, since they allow an excellent pH adjustment due to the 3 buffer stages.
  • the salts of phosphoric acid are not volatile, thus do not support the ionization and deposited as a precipitate on the shield of the ionization chamber, from where they need to be partially removed again consuming.
  • Suitable ionizing additives have been found to be organic acids such as formic, acetic and propionic acids. However, then the separation takes place in the acid and almost exclusively positive ionization to form [M + H] + - ions.
  • the use of the ammonium salts of formic and acetic acid, in particular of ammonium acetate has been found to be advantageous; This allows adjustment of pH values which allow separation and ionization under mild conditions, as well as positive and negative ionization.
  • it is characterized by a good volatility, ie remain under the typical ESI ionization conditions of about 35O 0 C at atmospheric pressure hardly or no residues in the ionization chamber back.
  • alkali ions which even at low concentrations of 5-6 ppm, the absolute sensitivity significantly affect (see also LC-GC Europe, 17 (12), p 646-649, 2004).
  • These alkali ions can be introduced by not sufficiently pure starting materials or by the use of water or methanol by washing out of the glass walls in the solvent. With acetonitrile, the glass undergoes such leaching to a significantly lesser extent; it is u.a. therefore preferably used.
  • salt-like ionizing additives such as ammonium acetate-containing blends in acetonitrile have heretofore been prepared only with the addition of 5 to 10% water because ammonium salts of lower organic acids such as formic acid, acetic acid or propionic acid are not soluble in pure acetonitrile and water is co-solvent is needed. Furthermore, it is necessary to prepare these mixtures freshly shortly before use, since, below a water content of 5%, the solvent mixture comprising ammonium acetate is characterized by poor storage stability and pH stability due to escape from the solution. distinguishes ammonia. In addition, this high proportion of water increasingly results in the aforementioned undesired leaching phenomenon.
  • hydrous acetonitrile blends it is not possible with hydrous acetonitrile blends to set a gradient value of 100% acetonitrile.
  • a blend containing ammonium acetate in acetonitrile which was prepared with the addition of 10% water, only a gradient value of 0 to 90% acetonitrile can be realized.
  • the object of the invention was therefore to provide salt-containing ionization containing blends in acetonitrile available that are low in water and sodium, are characterized by good storage stability and pH stability and leave little or no residue in the ionization chamber of a mass spectrometer.
  • This object is achieved by adding an organic acid in excess to the salt-like ionizing additive, so that the base can be kept in the protonated state. Furthermore, the added organic acid also acts as a co-solvent so that the ionization additive is also soluble in the absence of water.
  • Acids useful as the acid component of the salt ionizing additive include volatile organic acids. Sufficient volatile acids have a boiling point at normal pressure below 300 ° C, more preferably below of 25O 0 C and most preferably below 200 0 C, to. Preferred examples are formic acid, acetic acid and propionic acid.
  • Suitable bases as the base component of the salt ionization additive include volatile weak bases. Sufficiently volatile bases have a boiling point at normal pressure below 300 0 C, more preferably below of 25O 0 C and most preferably below 200 0 C, to. Preferred examples - A -
  • Ie are ammonia, methylamine, ethylamine, n-propylamine, isopropylamine, dimethylamine, diethylamine, trimethylamine and triethylamine.
  • Co-solvent organic acids include volatile organic acids. Sufficient volatile acids have a boiling point at normal pressure below 300 ° C, more preferably below 250 ° C and most preferably below 200 0 C, to. Preferred examples are formic acid, acetic acid and propionic acid.
  • the ionization additive may be used in any amount up to the limit of solubility of the additive in the blend. It is preferred that the ionizing additive be present in an amount of from 0.001 to 3% (w / v), more preferably from 0.01 to 2% (w / v), and most preferably from 0.1 to 1% (w / v) , to use.
  • the co-solvent organic acid can be used in any amount. It is preferred to include the organic acid in an amount of up to 1% by volume, based on the volume of acetonitrile, more preferably 8 to 32 equivalents, based on the molar amount of the ionization additive, and most preferably 10 to 16 Equivalents, to use.
  • the water content of the LC / MS mixtures according to the invention is preferably between 0 and 5%, more preferably between 0.1% and 4%, even more preferably between 0.5% and 3%, and most preferably between 1% and 2%. , and can according to the usual methods, eg Karl Fischer titration.
  • the purity of the substances used is preferably so high that the use of the mixtures according to the invention in chromatography (HPLC) and LC / MS is possible.
  • the substances used are so pure that organic impurities, such as plasticizers, are substantially absent, ie the content of organic impurities is less than 10 ppm, more preferably less than 6 ppm, and most preferably less than 1 ppm.
  • the substances used be so pure that the content of alkali and alkaline earth ions is less than 5 ppm per ionic species, more preferably less than 2 ppm per ionic species, even more preferably less than 1 ppm per ionic species , and most preferably less than 0.2 ppm per ion species. Further, it is preferred that the total alkali content be below 0.25 ppm, more preferably below 0.2 ppm, and most preferably below 0.15 ppm.
  • the method of preparation in particular the mixing order, is not limited.
  • the resulting product can optionally be sterilized by filtration.
  • FIG. 1 shows the pH gradients of mixtures according to the invention and of comparative mixtures.
  • the pH gradients A, B, C and D consist of the following components:
  • Fig. 2 shows the MS total ion chromatogram of the separation of bradykinins (BK).
  • BK bradykinins
  • a 0.1% (w / v) ammonium acetate ionizing additive-containing LC / MS blend was prepared as follows.
  • a volume of an aqueous 10 wt .-% ammonium acetate solution (# 32301, # 34877) is introduced and one part by volume with stirring Acetic acid (# 33209) added.
  • Acetic acid (# 33209) added.
  • 98 volumes of acetonitrile (# 34697) are added to give a blend for LC / MS with an ionization additive concentration of 0.1% (w / v).
  • the mixture is sterile filtered through a 0.2 ⁇ m filter.
  • the resulting clear colorless liquid has a water content, determined by Karl Fischer titration, of less than 2.0% and a Na content of less than 2 ppm and a K, Mg and Ca content of less than 0.5 ppm on.
  • a 0.05% (w / v) ammonium acetate ionizing additive-containing LC / MS blend was prepared as follows.
  • acetonitrile # 34967
  • one part of acetic acid # 33209
  • 0.65 mol of ammonia are introduced to obtain a blend for LC / MS with an ionization additive concentration of 0.05% (w / v).
  • the resulting clear colorless liquid has a water content, determined by Karl Fischer titration, of less than 0.01% and a Na content of less than 1 ppm and a K, Mg and Ca content of less than 0.5 ppm on.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Bereitstellung eines Salzes in Acetonitril, dadurch gekennzeichnet ist, dass die Säurekomponente des Salzes eine bei weniger als 300°C bei Normaldruck siedende organische Säure ist, die Basenkomponente des Salzes eine bei weniger als 300°C bei Normaldruck siedende Base ist, eine bei weniger als 300°C bei Normaldruck siedende organische Säure in einer Menge bis zu 1 Vol.-%, bezogen auf das Volumen von Acetonitril, zugemischt ist und der Wassergehalt, bestimmbar durch Karl-Fischer-Titration, unter 5 % liegt.

Description

lonisierungsadditive enthaltende LC/MS-Blends
Die LC/MS, die Kopplung der Flüssigchromatographie mit der Massenspektro- metrie, ist seit den 90er Jahren die Methode der Wahl für vielfaltige Fragestellungen im Bereich der pharmazeutischen, klinischen und forensischen Chemie, sowie in der Umweltanalytik und im Bereich der Lebensmittelüberwachung. Gerade im Bereich der Biotechnologie und der Proteomics hat sich die LC/MS insbesondere zur Trennung und Strukturaufklärung von Proteinen zu einer der wichtigsten A- nalysetechniken entwickelt.
In der LC/MS von Proteinen und Peptiden ist die Elektrospray Ionisierung (ESI) die am häufigsten verwendete Ionisationstechnik, bei der sich der Zusatz von Ionisierungshilfen bzw. Ionisierungsadditiven bewährt hat. Diese Ionisierungsaddi- tive erleichtern den Übergang der Analyten zu geladenen Teilchen (Ionen) in der Gasphase, wie es in LC-GC Europe, 17(12), S. 646-649., 2004, beschrieben ist. Eines der gängigsten Zusätze in der normalen HPLC ist die Phosphorsäure und ihre Na- bzw. K-Salze, da sie aufgrund der 3 Pufferstufen eine ausgezeichnete Einstellung des pH-Wertes ermöglichen. Die Salze der Phosphorsäure sind jedoch nicht flüchtig, unterstützen damit die Ionisierung nicht und lagern sich als Niederschlag am Shield der Ionisationskammer ab, von wo sie teilweise aufwändig wieder entfernt werden müssen.
Als geeignete Ionisierungsadditive haben sich organische Säuren wie Ameisen-, Essig- und Propionsäure erwiesen. Allerdings findet dann die Trennung im Sauren statt und fast ausschließlich positive Ionisierung unter Bildung von [M+H]+- Ionen. Als milde Alternative hat sich die Verwendung der Ammoniumsalze von Ameisen- und Essigsäure, insbesondere von Ammoniumacetat als vorteilhaft herausgestellt; damit lassen sich pH-Werte einstellen, die eine Trennung und Ionisierung unter milden Bedingungen, sowie positive und negative Ionisierung erlauben. Zu- dem zeichnet es sich durch eine gute Flüchtigkeit aus, d.h. es bleiben unter den typischen ESI-Ionisationsbedingungen von ca. 35O0C bei Normaldruck kaum bzw. keine Rückstände in der Ionisationskammer zurück.
Eine weitere Schwierigkeit ist die Anwesenheit von Alkaliionen, die bereits in geringen Konzentrationen von 5-6 ppm die absolute Empfindlichkeit deutlich beeinträchtigen (vgl. ebenfalls LC-GC Europe, 17(12), S. 646-649, 2004). Diese Alkaliionen können durch nicht ausreichend reine Ausgangsstoffe oder bei der Verwendung von Wasser oder Methanol auch durch das Auswaschen aus den Glaswänden in das Lösungsmittel eingebracht werden. Mit Acetonitril unterliegt das Glas solch einem Auswaschen zu einem deutlich geringeren Ausmaß; es wird u.a. daher bevorzugt eingesetzt.
Daher wäre es vorteilhaft, ein Gemisch aus einem Ionisierungsadditiv und einem Lösungsmittel, ein sog. Lösungsmittel-Blend, zur Verfügung zu stellen, das keine Rückstände in der Ionisierungskammer hinterlässt und möglichst arm an Alkaliionen ist.
Jedoch werden salzartige Ionisierungsadditive, wie Ammoniumacetat, enthaltende Blends in Acetonitril bisher nur unter Zusatz von 5 bis 10 % Wasser hergestellt, da Ammoniumsalze von niederen organischen Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure oder Propionsäure, in reinem Acetonitril nicht löslich sind und Wasser als Co-Solvens benötigt wird. Weiter ist es notwendig, diese Gemische kurz vor der Verwendung frisch herzustellen, da unterhalb eines Wasseranteils von 5% sich das Ammoniumacetat enthaltende Lösungsmittelgemisch durch eine schlechte Lageriahigkeit und pH-Stabilität aufgrund aus der Lösung entweichendem Am- moniak auszeichnet. Dieser hohe Wasseranteil rührt zudem vermehrt zu dem zuvor erwähnten unerwünschten Phänomen des Auswaschens.
Weiter ist es mit wasserhaltigen Acetonitril-Blends nicht möglich, einen Gradien- tenwert von 100% Acetonitril einzustellen. So ist zum Beispiel mit einem Ammo- niumacetat enthaltenden Blend in Acetonitril, der unter Zusatz von 10 % Wasser hergestellt wurde, nur einen Gradientenwert von 0 bis 90% Acetonitril realisierbar.
Aufgabe der Erfindung war es daher, salzartige Ionisierungsadditive enthaltende Blends in Acetonitril zur Verfügung zu stellen, die wasser- und natriumarm sind, sich durch eine gute Lagerstabilität und pH-Stabilität auszeichnen und kaum bzw. keine Rückstände in der Ionisationskammer eines Massenspektrometers hinterlassen.
Diese Aufgabe wird gelöst, indem zu dem salzartigen Ionisierungsadditiv eine organische Säure im Überschuss zugesetzt wird, so dass die Base im protonierten Zustand gehalten werden kann. Weiter wirkt die zugegebene organische Säure auch als Co-Solvens, so dass das Ionisierungsadditiv auch in Abwesenheit von Wasser löslich ist.
Als Säurekomponente des salzartigen Ionisierungsadditivs geeignete Säuren umfassen flüchtige organische Säuren. Ausreichend flüchtige Säuren weisen einen Siedepunkt bei Normaldruck unterhalb von 300°C, mehr bevorzugt unterhalb von 25O0C und am meisten bevorzugt unterhalb von 2000C, auf. Bevorzugte Beispiele sind Ameisensäure, Essigsäure und Propionsäure.
Als Basenkomponente des salzartigen Ionisationsadditivs geeignete Basen umfassen flüchtige schwache Basen. Ausreichend flüchtige Basen weisen einen Siede- punkt bei Normaldruck unterhalb von 3000C, mehr bevorzugt unterhalb von 25O0C und am meisten bevorzugt unterhalb von 2000C, auf. Bevorzugte Beispie- - A -
Ie sind Ammoniak, Methylamin, Ethylamin, n-Propylamin, Isopropylamin, Di- methylamin, Diethylamin, Trimethylamin und Triethylamin.
Als Co-Solvens fungierende organische Säuren umfassen flüchtige organische Säuren. Ausreichend flüchtige Säuren weisen einen Siedepunkt bei Normaldruck unterhalb von 300°C, mehr bevorzugt unterhalb von 250°C und am meisten bevorzugt unterhalb von 2000C, auf. Bevorzugte Beispiele sind Ameisensäure, Essigsäure und Propionsäure.
Das Ionisierungsadditiv kann in beliebiger Menge bis zur Löslichkeitsgrenze des Additivs in dem Blend verwendet werden. Es ist bevorzugt, das Ionisierungsadditiv in einer Menge von 0,001 bis 3 % (g/v), mehr bevorzugt von 0,01 bis 2 % (g/v) und am meisten bevorzugt von 0,1 bis 1 % (g/v), zu verwenden.
Die als Co-Solvens fungierende organische Säure kann in beliebiger Menge verwendet werden. Es ist bevorzugt, die organische Säure in einer Menge von bis zu 1 Vol.-%, bezogen auf das Volumen an Acetonitril, mehr bevorzugt 8 bis 32 Ä- quivalente, bezogen auf die molare Menge des Ionisationsadditivs, und am meisten bevorzugt 10 bis 16 Äquivalente, zu verwenden.
Der Wassergehalt der erfindungsgemäßen LC/MS-Gemische beträgt bevorzugt zwischen 0 und 5 %, mehr bevorzugt zwischen 0,1 % und 4 %, noch mehr bevorzugt zwischen 0,5 % und 3 %, und am meisten bevorzugt zwischen 1 % und 2 %, und kann nach den üblichen Methoden, z.B. Karl-Fischer-Titration, bestimmt werden.
Die Reinheit der eingesetzten Substanzen ist vorzugsweise so hoch, dass der Einsatz der erfindungsgemäßen Gemische in der Chromatographie (HPLC) und LC/MS möglich ist. Insbesondere ist es bevorzugt, dass die eingesetzten Substan- zen so rein sind, dass organische Verunreinigungen, wie z.B. Weichmacher, im wesentlichen abwesend sind, d.h. der Gehalt an organischen Verunreinigungen beträgt weniger als 10 ppm, mehr bevorzugt weniger als 6 ppm und am meisten bevorzugt weniger als 1 ppm.
Es ist auch bevorzugt, dass die eingesetzten Substanzen so rein sind, dass der Ge- halt an Alkali- und Erdalkali-Ionen weniger als 5 ppm pro lonensorte, mehr bevorzugt weniger als 2 ppm pro Ionensorte, noch mehr bevorzugt weniger als 1 ppm pro Ionensorte, und am meisten bevorzugt weniger als 0,2 ppm pro Ionensorte, beträgt. Weiter ist es bevorzugt, dass der Gesamtalkaligehalt unter 0,25 ppm, mehr bevorzugt unter 0,2 ppm, und am meisten bevorzugt unter 0,15 ppm liegt.
Das Verfahren der Herstellung, insbesondere die Mischreihenfolge, unterliegt keinen Beschränkungen. Insbesondere ist es möglich, das Ionisierungsadditiv als Salz zuzugeben oder aber das Salz durch getrennte Zugabe des Säure und Base während der Herstellung in situ zu erzeugen. Das erhaltende Produkt kann wahl- weise sterilfiltriert werden.
Beschreibung der Zeichnungen
Die Fig. 1 zeigt die pH-Gradienten erfindungsgemäßer Mischungen und von Ver- gleichsmischungen. Die pH-Gradienten A, B, C und D bestehen aus folgenden Komponenten:
A: Wasser; 0,1 % Ammoniumacetat / reines Acetonitril
B: Wasser; 0,1 % Ammoniumacetat / Methanol; 0,1 % Ammoniumacetat C: Wasser; 0,1 % Ammoniumacetat / Acetonitril; 0,1 % Ammoniumacetat
D: reines Wasser / Acetonitril; 0,1 % Ammoniumacetat
Die Fig. 2 zeigt das MS-Gesamtionenchromatogramm der Trennung von Bradykininen (BK). Die Peaks 1 bis 5 stehen für:
1: BK 1-6 2: Lys-Ala3-BK
3: BK
4: Des-Argl-BK
5: Verunreinigung
Mit den erfindungsgemäßen LC/MS-Gemischen lassen sich pH-Gradienten von pH 3,5 bis pH 6,5 realisieren, die positive und negative Ionisierung während der chromatographischen Trennung ermöglichen. Wie anhand der Fig.l ersichtlich ist, kann ein stetig ansteigender Gradient von pH 3,5 bis pH 6,5 realisiert werden.
Die erfindungsgemäßen Lösemittelgemische für LC/MS ermöglichen die chromatographische Auftrennung von sehr ähnlichen Peptiden (Bradykinine (BK)) unter leicht sauren Bedingungen (Fig. 2, oberes Chromatogramm, Bedingungen C). Diese Auftrennung ist unter herkömmlichen neutralen bis schwach alkalischen Bedingungen wesentlich schlechter (Fig. 2, unteres Chromatogramm, Bedingungen A).
Bei dem Betrieb der ESI-Ionisationskammer mit den erfindungsgemäßen Gemischen wurde eine deutlich verringerte Ablagerung von Rückständen gefunden.
Im Anschluss werden Herstellungsbeispiele erfindungsgemäßer LC/MS-Blends aufgeführt. Die hinter den Edukten in Klammern angegebenen Nummern beziehen sich auf die Produktnummern des Fluka-Riedel-Katalogs aus dem Jahre 2005.
Herstellungsbeispiel 1
Ein 0,1 % (g/v) Ammoniumacetat als lonisierungsadditiv enthaltenden LC/MS- Blend wurde wie folgt hergestellt.
In einer Glasapparatur wird ein Volumenteil einer wässrigen 10 Gew.-% Ammo- niumacetatlösung (#32301, #34877) vorgelegt und unter Rühren ein Volumenteil Essigsäure (#33209) zugegeben. Anschließend werden 98 Volumenteile Aceto- nitril (#34697) zugegeben, um einen Blend für LC/MS mit einer Ionisierungsad- ditivkonzentration von 0,1 % (g/v) zu erhalten. Die Mischung wird durch einen 0,2 μm-Filter sterilfiltriert. Die erhaltene klare farblose Flüssigkeit weist einen Wassergehalt, bestimmt durch Karl-Fischer-Titration, von unter 2,0 % und einen Na-Gehalt von kleiner 2 ppm und einen K-, Mg- und Ca- Gehalt von jeweils kleiner 0,5 ppm auf.
Herstellungsbeispiel 2
Ein 0,05 % (g/v) Ammoniumacetat als lonisierungsadditiv enthaltenden LC/MS- Blend wurde wie folgt hergestellt.
In einer Glasapparatur werden 100 1 Acetonitril (#34967) und ein Volumenteil Essigsäure (#33209) vorgelegt und gekühlt. Anschließend werden unter Rühren 0,65 mol Ammoniak eingeleitet, um einen Blend für LC/MS mit einer Ionisierungsadditivkonzentration von 0,05 % (g/v) zu erhalten. Die erhaltene klare farblose Flüssigkeit weist einen Wassergehalt, bestimmt durch Karl-Fischer-Titration, von unter 0,01 % und einen Na-Gehalt von kleiner 1 ppm und einen K-, Mg- und Ca- Gehalt von jeweils kleiner 0,5 ppm auf.
Herstellungsbeispiele 3 bis 8
0,1 % (g/v) Ammoniumacetat als Ionisierungsadditiv enthaltendene LC/MS- Blends wurden wie in Beispiel 1 hergestellt, außer dass die Zusammensetzungen wie in der Tabelle 1 dargestellt geändert wurden und optional Wasser zugegeben wurde. Tabelle 1
Figure imgf000010_0002
Die erhaltenen Lösungen wurden auf ihren Alkaligehalt mittels ICP-OES und ICP-MS untersucht. Die in der Tabelle 2 dargestellten Ergebnisse wurden erhalten:
Tablelle 2
Figure imgf000010_0001
Es ist aus der Tabelle 2 ersichtlich, dass der Gesamtalkaligehalt der erfindungsgemäßen Beispiele unter 0,25 ppm und bevorzugt unter 0,2 ppm liegt. Die gemäß den Beispielen 3 bis 8 erhaltenen Lösungen wurden weiter für die chromatographische Auftrennung von sehr ähnlichen Peptiden (Bradykinine (BK)) wie zuvor dargestellt verwendet. Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten.
Figure imgf000011_0001
Aus der Tabelle 3 ist ersichtlich, dass die HPLC-Trennung der sehr ähnlichen Peptide bei geringen Wasser- und Alkaliionengehalten deutlich besser erfolgt.

Claims

Patentansprüche
1. Lösung eines Salzes in Acetonitril, dadurch gekennzeichnet, dass die Säurekomponente des Salzes eine bei weniger als 300°C bei Normaldruck siedende organische Säure ist, die Basenkomponente des Salzes eine bei weniger als
300°C bei Normaldruck siedende Base ist, eine bei weniger als 300°C bei Normaldruck siedende organische Säure in einer Menge bis zu 1 Vol.-%, bezogen auf das Volumen von Acetonitril, zugemischt ist und der Wassergehalt, bestimmbar durch Karl-Fischer-Titration, unter 5 % liegt.
2. Lösung eines Salzes nach Anspruch 1, wobei die Säurekomponente des Salzes unter Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure und Trifluoressigsäure gewählt ist, die Basenkomponente des Salzes unter Ammoniak, Methylamin, Ethylamin, n-Propylamin, Isopropylamin, Dimethylamin, Diethylamin, Tri- methylamin und Triethylamin gewählt ist und die bei weniger als 3000C bei
Normaldruck siedende organische Säure unter Ameisensäure, Essigsäure und Propionsäure gewählt ist.
3. Lösung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die die bei weniger als 300°C bei Normaldruck siedende organische Säure in einer Menge von 8 bis
32 Äquivalenten, bezogen auf die Mol-Menge des Salzes, zugemischt ist.
4. Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Wassergehalt unter 2 % liegt.
5. Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Salz unter Ammonium- formiat, Ammoniumacetat und Ammoniumpropionat gewählt ist.
6. Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Acetonitril HPLC- Reinheit oder LC-MS-Reinheit aufweist.
7. Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Lösung sterilfiltriert wurde.
8. Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Anteil an Alkali- und Erdalkali-Ionen unter 2 ppm pro Ionensorte liegt.
9. Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Lösung weniger als 10 ppm an organischen Verunreinigungen enthält.
10. Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Lösung das Salz in einer Menge von 0,001 bis 3 % (g/v) enthält.
11. Lösung eines Salzes, erhältlich indem die Säurekomponente eines Salzes, gewählt unter bei weniger als 300°C bei Normaldruck siedenden organischen Säuren, die Basenkomponente eines Salzes, gewählt unter bei weniger als
300°C bei Normaldruck siedenden Basen, und eine bei weniger als 300°C bei Normaldruck siedende organische Säure, verwendet in einer Menge bis zu 1 Vol.-%, bezogen auf das Volumen von Acetonitril, gemischt werden, wobei der Wassergehalt, bestimmbar durch Karl-Fischer Titration, des erhaltenen Gemisches unter 5 % liegt.
12. Lösung nach Anspruch 11, wobei die Säurekomponente und die Basenkomponente zusammen als Salz zugegeben werden.
13. Lösung nach einem der Ansprüche 11 oder 12, wobei die Säurekomponente des Salzes unter Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure und Trifluoressig- säure gewählt ist, die Basenkomponente des Salzes unter Ammoniak, Methylamin, Ethylamin, n-Propylamin, Isopropylamin, Dimethylamin, Diethyla- min, Trimethylamin und Triethylamin gewählt ist und die bei weniger als 300°C bei Normaldruck siedende organische Säure unter Ameisensäure, Essigsäure und Propionsäure gewählt ist.
14. Lösung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei die Lösung sterilfiltriert wurde.
15. Verfahren zur chromatographischen Auftrennung, charakterisiert durch die Verwendung der Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 14.
16. Verfahren zur chromatographischen Auftrennung nach Anspruch 15, wobei Peptide chromatographiert werden.
17. Verwendung der Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 in der Chromatographie.
18. Verwendung nach Anspruch 17, wobei Peptide chromatographiert werden.
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