WO2007010995A1

WO2007010995A1 - 生体試料中のペプチドの安定化方法

Info

Publication number: WO2007010995A1
Application number: PCT/JP2006/314416
Authority: WO
Inventors: Norihito Aoyama; Kazuhiko Sasaki; Osamu Kusada
Original assignee: Kyowa Medex Co Ltd
Current assignee: Minaris Medical Co Ltd
Priority date: 2005-07-20
Filing date: 2006-07-20
Publication date: 2007-01-25
Anticipated expiration: 2008-01-20
Also published as: AU2006270756A1; CA2614592A1; EP1921453A4; KR20080028942A; CN101228442B; JPWO2007010995A1; CN101228442A; US20090035803A1; US8173385B2; JP5357424B2; EP1921453A1

Abstract

　生体試料中のペプチドの簡便な安定化方法および安定化試薬、ペプチドを含有する生体試料の簡便な保存方法および保存用試薬、ならびに、生体試料中のペプチドの正確な測定方法および測定用試薬を提供すること。生体試料に糖類を添加することにより、生体試料中のペプチドを安定化すること、ペプチドを含有する生体試料をペプチドを安定化した状態で保存すること、生体試料中のペプチドを正確に測定することができる。本発明により、臨床検査で採取される生体試料中のペプチドを安定化することができるので、臨床検査において、生体試料中のマーカーとなるペプチドを正確に測定することができる。

Description

明細書

生体試料中のペプチドの安定化方法

技術分野

[0001] 本発明は、生体試料中のペプチドの簡便な安定化方法および安定化試薬、ぺプチドを含有する生体試料の簡便な保存方法および保存用試薬、ならびに、生体試料中のペプチドの正確な測定方法および測定用試薬に関する。

背景技術

[0002] 溶液中のペプチドの安定化法として、ペプチドをエチレンジァミン四酢酸を含む溶液中で静置し、難溶性の組成物とする方法 (特許文献 1参照）、ペプチドに血漿、 γ グロブリンやゼラチン等のタンパクを共存させる方法 (非特許文献 1参照）等が知られている。

ペプチドの凍結乾燥物の安定化法としては、ダルコン酸塩を共存させる方法（特許文献 2参照）が知られている。また、スクロース、マルトース、ラタトース等の糖類は、ぺプチドの凍結乾燥物の安定化剤として知られてレ、る (特許文献 3および 4参照）。

[0003] また、免疫測定法において、固相に固定化する抗原または抗体の安定化方法として、トレハロースゃスクロース等の糖類を共存させる方法が知られている（特許文献 5 および 6参照）。

一般に生体試料中のペプチドは、種々の要因、例えば生体試料中の蛋白質分解酵素による分解等により、不安定である。生体試料中のペプチドを安定化させる方法として、蛋白質分解酵素の阻害剤、界面活性剤あるいは防腐剤を添加する方法が知られている。例えば、生体試料中のサブスタンス Ρの安定化方法として、蛋白質分解酵素阻害剤であるジイソプロピル.フルォロホスフェート、ホスホラミドンおよびバシトラシンを共存させる方法が知られてレ、る（非特許文献 2参照）。

[0004] 生体試料中のサブスタンス Ρの測定としては、血清を酸処理した後、アセトンおよびエーテルで抽出し、さらに逆相カラムによる HPLCで精製したサブスタンス Ρを酵素免疫測定法で測定する方法が知られている (非特許文献 3参照）が、本方法は操作が非常に煩雑で、かつ、化学的処理条件が過酷なため、正確な測定値を与えるものではなかった。

[0005] 生体内のペプチドは、種々のマーカーとして重要であり、生体試料中の濃度を正確に測定する必要があるが、採取された生体試料を測定する段階で既に減少していることが多正確な測定が出来ないという問題があった。

特許文献 1 :特開平 9— 208485号公報

特許文献 2 :特開平 6— 321800号公報

特許文献 3 :特開平 5— 306235号公報

特許文献 4：特開平 5— 170664号公報

特許文献 5：特表 2002— 508843号公報

特許文献 6 :特開 2003— 215127号公報

非特許文献 1 :ェクスペリエンティア（Experientia) , (スイス）, 1963年，第 19卷，第 2 号， p. 72 - 73

非特許文献 2：バイオケミカル ·アンド 'バイオフィジカル ·リサーチ.コミュニケーションズ (Biochemical and Biophysical Researchし ommumcations) , 、米国) , 1984年, ¾ 1 25卷，第 2号， p. 728 - 733

非特許文献 3：クリニカル ·アンド ·ディアグノスティック ·ラボラトリー'ィムノロジー（Clini cal and Diagnostic Laboratory Immunology) , (米国) , 1998年,弟 5 ,弟 3 , p. 303 - 307

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0006] 本発明の目的は、生体試料中のペプチドの簡便な安定化方法および安定化試薬、ペプチドを含有する生体試料の簡便な保存方法および保存用試薬、ならびに、生体試料中のペプチドの正確な測定方法および測定用試薬を提供することにある。課題を解決するための手段

[0007] 本発明者らは生体試料中のペプチドの簡便な安定化方法を鋭意研究した結果、生体試料に糖類を添加することにより、ペプチドを安定化できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の [1]〜[22]に関する。

[ 1] ペプチドを含有する生体試料に糖類を添加することを特徴とする、生体試料中のペプチドの安定化方法。

[2] ペプチドを含有する生体試料に糖類を添加することを特徴とする、生体試料の保存方法。

[3] ペプチドを含有する生体試料に糖類を添加してなる試料を測定用試料として使用することを特徴とする、生体試料中のペプチドの測定方法。

[4] 生体試料が、全血、血清、血漿、涙液、鼻汁、唾液、尿、便、髄液、細胞、細胞組織液および細胞膜からなる群より選ばれる生体試料である [1]〜 [3]のレ、ずれかに記載の方法。

[0008] [5] 糖類力単糖類、二糖類または多糖類である [1]〜 [4]のいずれかに記載の方法。

[6] 単糖類が、六炭糖である [5]記載の方法。

[7] 六炭糖が、マンノースまたはガラクトースである [6]記載の方法。

[8] 二糖類が、還元性の二糖類である [5]記載の方法。

[9] 還元性の二糖類が、マルトースまたはラタトースである [8]記載の方法。

[10] 多糖類が、アミロース、セルロース、デキストランまたはデンプンである [5]記載の方法。

[11] ペプチドが、サブスタンス Pである [1]〜[10]のいずれかに記載の方法。

[0009] [12] 糖類を含有することを特徴とする、ペプチドを含有する生体試料中のペプチドの安定化試薬。

[13] 糖類を含有することを特徴とする、ペプチドを含有する生体試料の保存用試薬。

[14] 糖類を含有することを特徴とする、ペプチドを含有する生体試料中のペプチドの測定用試薬。

[15] 生体試料が、全血、血清、血漿、涙液、鼻汁、唾液、尿、便、髄液、細胞、糸田胞組織液および細胞膜からなる群より選ばれる生体試料である [12]〜[： 14]のレヽずれかに記載の試薬。

[0010] [16] 糖類力単糖類、二糖類または多糖類である [12]〜[： 15]のいずれかに記載の試薬。 [17] 単糖類が、六炭糖である [16]記載の試薬。

[18] 六炭糖が、マンノースまたはガラクトースである [16]記載の試薬。

[19] 二糖類が、還元性の二糖類であ [16]記載の試薬。

[20] 還元性の二糖類が、マルトースまたはラタトースである [19]記載の試薬。

[21] 多糖類が、アミロース、セルロース、デキストランまたはデンプンである [16]記載の方法。

[22] ペプチドが、サブスタンス Pである [12]〜[21]のいずれかに記載の方法。発明の効果

[0011] 本発明により、生体試料中のペプチドの簡便な安定化方法および安定化試薬、ぺプチドを含有する生体試料の簡便な保存方法および保存用試薬、ならびに、生体試料中のペプチドの正確な測定方法および測定用試薬が提供される。

発明を実施するための最良の形態

[0012] (1)ペプチド

本発明におけるペプチドは、生体内に存在するものであれば、どのようなペプチドでもよく、また C末端のカルボキシ基がアミド化しているものも含まれる。アミノ酸残基数としては、 5〜： 100個力 S好ましく、 5〜50個がより好ましぐ 10〜30個が特に好ましい。ペプチドは臨床検査の目的で測定されるペプチドが好ましぐ例えば、サブスタンス P、カルシトニン、ソマトスタチン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、成長ホルモン放出因子、エンドセリン、エンドルフィン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、副腎皮質刺激ホルモン、コルチコトロピン放出因子、バソプレツシン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、ガストリン、副甲状腺ホルモン、ナトリウム利尿ペプチド、セクレチン、インシュリン、ォステオカルシンなどがあげられ、サブスタンス Pが好ましい。

[0013] (2)生体試料

本発明における生体試料としては、例えば全血、血清、血漿、涙液、鼻汁、唾液、尿、便、髄液、細胞、細胞組織液、細胞膜などがあげられ、全血、血清、血漿、涙液、鼻汁が好ましい。

[0014] (3)糖類

本発明における糖類としては、本発明のペプチドの安定化方法を可能とする糖類であれば特に制限はないが、例えば単糖類、二糖類、多糖類等があげられる。単糖類としては、例えば五炭糖、六炭糖等があげられ、六炭糖が好ましい。五炭糖としては、例えばァラビノース、キシロース、リボース、リキソース、リブロース、キシル口ース等があげられる。六炭糖としては、例えばガラクトース、グルコース、タロース、マンノース、ソルボース、タガトース、フルクトース、プシコース等があげられ、マンノースおよびガラクトースが好ましレ、。

二糖類としては、例えば還元性の二糖類や非還元性の二糖類があげられ、還元性の二糖類が好ましい。還元性の二糖類としては、例えばマルトース、ラタトース等があげられ、非還元性の二糖類としては、例えばスクロース、トレハロース等があげられる多糖類としては、例えばアミロース、セルロース、デキストラン、デンプン等があげられ、セルロースが好ましい。

[0015] (4)生体試料中のペプチドの安定化方法、ペプチドを含有する生体試料の保存方法、および生体試料中のペプチドの測定方法

上記の糖類を生体試料に添加することにより、該生体試料中のペプチドを安定化することができる。また上記の糖類を生体試料に添加することにより該生体試料中のペプチドを安定化した状態で、該生体試料を保存することができる。さらに、生体試料に上記の糖類を添加したものを測定試料として用いることにより、該測定試料中のペプチドが安定に保たれるため、生体試料中のペプチドを正確に測定することができる。添加する糖類は、 1種類でもよいし、 2種類以上でもよい。生体試料は新鮮なものが好ましぐ生体試料の採取直後又はなるベく早く糖類を添加するのが好ましい。採取した生体試料を入れる容器にあらかじめ糖類をいれておくのがさらに好ましい。糖類は、固体のまま添加して生体試料に溶解させることもできるが、糖類の溶液を添加する方法が好ましい。

[0016] 本発明の生体試料中のペプチドの安定化方法、ペプチドを含有する生体試料の保存方法および生体試料中のペプチドの測定方法においては、生体試料に添加される糖類は、糖類添加後の該生体試料中に、ペプチドが安定に保存され得る濃度になるような量で添加される。糖類として単糖類を使用する場合には、単糖類添加後の該生体試料中の単糖類の濃度は、例えば 5〜600mg/mL、好ましくは 10〜500 mg/mLである。糖類として二糖類を使用する場合には、二糖類添加後の該生体試料中の二糖類の濃度は、例えば 5〜600mgZmL、好ましくは 10〜500mg/mLである。糖類として多糖類を使用する場合には、多糖類添加後の該生体試料中の多糖類の濃度は、例えば 0. l~50mg/mL,好ましくは:!〜 20mgZmLである。

[0017] 本発明のペプチドの測定方法において、測定試料、すなわち糖類を添加した生体試料中のペプチドの測定は、例えばペプチドに特異的に結合する抗体を用レ、た免疫学的方法により測定できる。免疫学的方法としては、例えばサンドイッチ法や競合法があげられる。免疫学的方法を利用した市販の測定用キットも使用できる。

[0018] (5)生体試料中のペプチドの安定化試薬、ペプチドを含有する生体試料の保存用試薬、および生体試料中のペプチドの測定用試薬

本発明の生体試料中のペプチドの安定化試薬、およびペプチドを含有する生体試料の保存用試薬、および生体試料中のペプチドの測定用試薬は、糖類を含有する。本発明の安定化試薬、保存用試薬、および測定用試薬は、凍結乾燥品でも液状品でもよい。また、特に、本発明の測定用試薬は、運搬や保存に適した形態として、キットの形態を取り得る。キットとしては、 2試薬系、 3試薬系等があげられる。糖類としては、例えば（3)に前述の糖類があげられる。糖類は 1種類でもよいし、 2種類以上でもよい。

[0019] 本発明の安定化試薬、保存用試薬、および測定用試薬の利用の 1つの態様としては、例えば本発明の安定化試薬、保存用試薬および測定用試薬を生体試料採取器具中にあら力じめ存在させる態様があげられる。この態様により、採取した生体試料中のペプチドを即座に安定化することができる。このような生体試料採取器具としては、例えば真空採血管等があげられる。この生体試料採取器具中に含有される本発明の測定用試薬に生体試料を添加して得られる試料は、そのまま、または、適宜、緩衝液等の水性媒体で溶解されて、あるいは、濃縮または希釈されて測定用試料として測定に供される。

[0020] 本発明の安定化試薬、保存用試薬、および測定用試薬には、必要に応じてキレート剤、防腐剤、界面活性剤、緩衝剤、蛋白質分解酵素阻害剤、塩類等が含有されていてもよレ、。キレート剤としては、エチレンジァミン四酢酸（EDTA)またはその塩、ジフエニルジチォカルバゾン（DZ)、 8_キノリノール（〇X)、 6—ドデシル一 4_ (2—チァゾリルァゾ)レゾルシノール（DTAR)などがあげられる。エチレンジァミン四酢酸の塩としては、エチレンジァミン四酢酸 · 2ナトリウム（EDTA' 2Na)などがあげられる。防腐剤としては、アジィ匕ナトリウム、硫酸ストレプトマイシン、パラォキシ安息香酸エステル類、エチレングリコールモノフエニルエーテルがあげられる。塩類としては、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどがあげられる。

[0021] 界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤などがあげられる。

[0022] 陰イオン界面活性剤としては、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウムなどの脂肪酸系陰イオン界面活性斉 lj、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムなどのアルキルべンゼン系陰イオン界面活性剤、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウムなどのアルキル硫酸エステル系陰イオン界面活性剤、アルファォレフインスルホン酸ナトリウムなどのアルファオレフイン系陰イオン界面活性剤、ァルキルスルホン酸ナトリウムなどのアルキルスルホン酸系陰イオン界面活性剤などがあげられる。

[0023] 非イオン界面活性剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソノレビタン脂肪酸エステルなどの脂肪酸系非イオン界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテルなどのアルキルエーテル系非イオン界面活性斉 lj、ポリオキシエチレンァルキルフエニルエーテルなどのアルキルフエノール系非イオン界面活性剤などがあげられる。

[0024] 両性界面活性剤としては、アルキルアミノ脂肪酸ナトリウムなどのアミノ酸系両性界面活性剤、アルキルべタインなどのべタイン系両性界面活性剤、アルキルアミンォキシドなどのアミンォキシド系両性界面活性剤などがあげられる。

陽イオン界面活性剤としては、アルキルトリメチルアンモニゥム塩、ジアルキルジメチルアンモニゥム塩などの第四級アンモニゥム塩系陽イオン界面活性剤などがあげられる。

[0025] 緩衝剤としては、乳酸緩衝剤、クェン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、ダリシン緩衝剤、 3, 3—ジメチルダルタル酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールァミン緩衝斉 1J、ジエタノールァミン緩衝斉 1J、ホウ酸緩衝剤、バルビツール緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル)ァミノメタン緩衝剤、イミダゾール一酢酸緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シユウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、リジン緩衝剤、グッド緩衝剤などがあげられる。

[0026] グッド緩衝剤としては、例えば Tris [トリス（ヒドロキシメチノレ）ァミノメタン]緩衝剤、 M ES (2 _モルホリノエタンスルホン酸）緩衝剤、 Bis-Tris [ビス（2 _ヒドロキシェチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル)メタン]緩衝斉 IJ、 ADA[N— (2—ァセトアミド)イミノニ酢酸]緩衝剤、 PIPES [ピペラジン一 N, N，一ビス（2—エタンスルホン酸）]緩衝剤、 A CES { 2— [N—（2 ァセトアミド）ァミノ]エタンスルホン酸 }緩衝剤、 MOPSO (3 モルホリノ 2—ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝斉 lj、 BES { 2—[N, N—ビス（2—ヒドロキシェチル）ァミノ]エタンスルホン酸 }緩衝剤、 MOPS (3—モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤、 TES〈2— {N— [トリス（ヒドロキシメチル)メチル]アミノ}エタンスルホン酸〉緩衝斉 !J、 HEPES [N- (2—ヒドロキシェチル）—N'—（2—スルホェチル）ピペラジン]緩衝剤、 DIPSO{ 3— [N, N ビス（2 ヒドロキシェチル）ァミノ] 2 ヒドロキシプロパンスルホン酸 }緩衝斉 |J、 TAPS〇〈2 ヒドロキシ一 3— { [N トリス（ヒドロキシメチル）メチル]アミノ}プロパンスルホン酸〉緩衝斉 lj、 POPSO [ピペラジン一 N, N '—ビス（2—ヒドロキシプロパン一 3—スルホン酸）]緩衝斉 1J、 HEPPSO [N- (2—ヒド口キシェチル） _N， - (2—ヒドロキシ一 3 _スルホプロピル）ピぺラジン]緩衝斉 lj、 EP PS [N- (2—ヒドロキシェチル） _Ν' - (3 スルホプロピル）ピぺラジン]緩衝斉 1J、トリシン [N—トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン]緩衝剤、ビシン [N, N—ビス（2— ヒドロキシェチル)グリシン]緩衝剤、 TAPS { 3_ [N—トリス（ヒドロキシメチル)メチル] ァミノプロパンスルホン酸 }緩衝剤、 CHES [2_ (N—シクロへキシルァミノ）エタンスルホン酸]緩衝剤、 CAPS〇[3_ (N—シクロへキシルァミノ） _ 2—ヒドロキシプロパンスルホン酸]緩衝剤、 CAPS [3—（N—シクロへキシルァミノ）プロパンスルホン酸] 緩衝剤などがあげられる。

[0027] 蛋白質分解酵素阻害剤としては、ァプロチュン、ガべキサート、トラネキサム酸、ジイソプロピル'フルォロホスフェート、ホスホラミド、バシトラシンなどをあげることができる。

[0028] 以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例においては、下記メーカーの器具および試薬を使用した。

EDTA- 2Naおよびァプロチュン入り真空採血管（二プロ社製）、キシロース（特級；和光純薬工業社製)、グルコース (特級；関東化学社製)、マンノース (特級;和光純薬工業社製）、ガラクトース（特級；ナカライテスタ社製）マルトース（特級；和光純薬ェ業社製)、スクロース (特級；関東化学社製）、ラ外ース (特級;ナカライテスタ社製)、トレハロース（日本食品化工業社製)、アミロース (和光純薬工業社製）、セルロース（ナカライテスタ社製)、デキストラン (特級;和光純薬工業社製)、デンプン (溶性；関東化学社製）、エチレンジァミン四酢酸 · 2ナトリウム (EDTA2Na) (同仁化学研究所社製）、ダルコン酸カリウム (特級;和光純薬工業社製）、グノレコン酸ナトリウム（特級;和光純薬工業社製)、ダルコン酸マグネシウム水和物 (和光純薬工業社製)、ホスホラミドン（SIGMA社製）、 Neutral Endopeptidase (NEP) (ERASTIN PRODUCTS社製)。

実施例 1

[0029] 単糖類添加による血漿中のサブスタンス Pの安定化

(1)測定用試料および対照試料の調製

EDTA' 2Naおよびァプロチュン入り真空採血管を用いてヒトより採血した採血後 3 時間以内の新鮮なヒト血漿を用意した。このヒト血漿 50 x Lに、 200mg/mLキシロース水溶液、 200mg/mLグルコース水溶液、 200mg/mLマンノース水溶液、 20 Omg/mLガラクトース水溶液をそれぞれ 100 /i L添加し混合し、更に 200pg/mL のサブスタンス P水溶液（50 μ L)をそれぞれの混合液に添加し、試料 A〜Dを調製した。単糖類の水溶液は精製水で調製した。ヒト血漿 50 / Lに、 200pg/mLのサブスタンス P水溶液を 50 μ L添加した試料を対照試料とした。

[0030] (2)検量線の作成および各試料中のサブスタンス Ρ濃度の測定

Substance P EIA Kit (Cayman社製）を用い、キットに付属のマニュアルに従い、以下のようにして試料 A〜Dおよび対照試料中のサブスタンス Pを 2連で測定した。本キットは、アセチルコリンエステラーゼと結合したサブスタンス P (サブスタンス P

AchEトレーサー）を競合物質とした、競合法による酵素免疫測定法キットである。本キットの測定は、試料中のサブスタンス Pおよび競合物質を固相の抗サブスタンス

P抗体と競合的に反応させ、固相の抗サブスタンス P抗体と結合した競合物質中のァセチルコリンエステラーゼをエルマン試薬の発色を吸光度測定することにより行われ

、予め作成された検量線を基に、試料中のサブスタンス P濃度を決定できる。

まず、キット中の試薬を用いて、 EIAバッファー（EIA Buffer)、洗浄バッファー（Wash Buffer)、サブスタンス!³ AchEトレーサー（Substance P AchE Tracer)、サブスタンス P抗血清（Substance P Antiserum)、エルマン試薬（Ellman's Reagent)、およびサブスタンス Pの濃度力 Sそれぞれ 500、 250、 125、 62. 5、 31. 2、 15. 6、 7. 8、 3. 9pg/ mLである、標準物質溶液（Standard) :！〜 8を調製した。ただし、エルマン試薬の調製は、下記の測定方法において、一晩のインキュベーションが終了する直前に行った。これらの測定用試薬を用いて、サブスタンス Pの濃度と以下に述べるような吸光度から求められる固相に結合した競合物質の量に関連した指標（％B/B )との間の関係

0

を表す検量線を作成した。同時に、試料 A〜Dおよび対照試料の測定を行った。

[0031] あら力じめ、室温に戻しておいた 96ゥエル ELISAプレートに、以下の（a)〜（の反応ゥエルを設定し、それぞれの反応ゥエルに記載した溶液をそれぞれ入れた。 (a) ブランク（Blank)：何も入れない、（b)全活性（Total Activity)：何も入れなレ、、（c)非特異結合（Non- Specific Binding)： EIAバッファー 100 μ L、サブスタンス P AchEトレーサー 50 μ L、（d)最大結合（Maximun Binding)： EIAバッファー 50 μ L、サブスタンス P AchEトレーサー 50 z L、サブスタンス P抗血清 50 z L、（e)標準物質溶液 1 〜8 :上記の標準物質溶液:!〜 8をそれぞれ 50 μ L、サブスタンス P AchEトレーサ一 50 x L、サブスタンス P抗血清 50 z L、（f)試料（S膽 pie)：測定用試料 (試料 A〜D または対照試料） 50 μ L、サブスタンス P AchEトレーサー 50 μ L、サブスタンス P抗血清 50 μ L。

[0032] キット付属品のプラスティックフィルムで 96ゥヱルプレートをカバーし、 4°C、 18時間インキュベートした。インキュベート後、プレートウォッシャー〔モデル 1575ィムノウォッシュ（ImmunoWash)、バイオラッド（BIO-RAD)社製〕にて 1反応ウエノレ当たり 250 μ L の洗浄バッファーで 5回洗浄した。反応ゥエル内に洗浄バッファー残液が無いことを確認した後、エルマン試薬 200 μ Lを入れ、全活性の反応ゥエルにのみ、さらにサブスタンス P AchEトレーサー 5 μ Lを入れ、遮光して、 25。Cで 2時間インキュベートした。インキュベート後、プレートリーダー（MTP— 120マイクロプレートリーダー、コロナ社製）にて、測定波長 405nmで吸光度を測定した。

[0033] 「標準物質溶液:!〜 8」のそれぞれの反応ゥエルでの各標準溶液における吸光度の平均値を B、「最大結合」の反応ゥエルの吸光度の平均値を B、「非特異結合」の反

0

応ゥエルの吸光度の平均値を NSBとしたときに、以下の式で表される値（％8/8 )

0 を標準溶液 1〜8それぞれについて計算し、サブスタンス Pの濃度と％B/Bの値を

0 プロットして検量線を作成した。

%B/B = [ (B-NSB) / (B -NSB) ] X 100

o o

各試料についても、吸光度から同様に％B/Bの値を求めた。ただし、 Bは 2連の

0

平均でなぐゥエルごとの吸光度を用いた。上記で得られた検量線から、試料の％B /Bの値に基づいて算出したサブスタンス Pの濃度を、各試料の測定値とした。

0

[0034] (3)測定用試料中のサブスタンス Pの安定化

上記の測定用試料の作製に用いた、 200pg/mLのサブスタンス P水溶液とヒト血漿それぞれを測定用試料とし、それぞれの試料中のサブスタンス Pを、 Substance P E IA Kit (Cayman社製）を用いて上記の方法で測定した。その結果、 200pg/mLのサブスタンス P水溶液中、ヒト血漿中のサブスタンス Pの濃度は、それぞれ 226. 16pg ZmL、 7. 70pg/mLと決定された。それぞれの測定値から、対照試料および試料 A〜Dのサブスタンス Pの理論値を下記式により計算した。

対照試料中のサブスタンス P濃度の理論値

= (サブスタンス P水溶液の測定値 X 50 +ヒト血漿の測定値 X 50) /100 試料 A〜D中のサブスタンス P濃度の理論値

= (サブスタンス P水溶液の測定値 X 50 +ヒト血漿の測定値 X 50) /200 各試料の理論値と測定値から、以下の式により残存率を計算し、サブスタンス Pの血漿中での安定性の指標とした。

残存率 = (サブスタンス Pの測定値の平均値/サブスタンス Pの理論値） X 100 第 1表に各試料の理論値および測定値と残存率を示した。

[0035] [表 1] 第 1表

サブスタンス P濃度（ p g / ' m L ) 残存率試料糖類

理論値測定値 1 測定値 2 平均値 ( % ) 対照 116.93 59.9 61.3 60.57 51.8

A キシロース 58.46 37.1 33.3 35.23 60.3

B グレコース 58.46 39.0 41.1 40.07 68.5

C マンノース 58.46 48.1 50.0 49.07 83.9

D ガラクトース 58.46 43.1 48.3 45.74 78.2

[0036] 200pg/mLのサブスタンス P水溶液をヒト血漿と混合しなレ、で、 4°Cで 18時間のィンキュベーシヨン時間を含む本測定条件下で測定した場合、 226. 16pg/mLの値を得たことから、該サブスタンス P水溶液中のサブスタンス Pは安定して存在することが判る。一方、対照区の試験で示される様に、サブスタンス Pの初期濃度が 116. 93 pg/mLである試料を、 4°Cで 18時間のインキュベーション時間を含む本測定条件下で測定した場合、サブスタンス P濃度が平均 60. 57pgZmLと測定されたことから、血漿と共存させたサブスタンス Pは不安定であることが判る。

[0037] 各試料のサブスタンス Pの残存率は、対照 51. 8%に対し単糖類を添カ卩したそれぞれの試料では、試料 A (キシロース添加） 60. 3%、試料 B (グルコース添加） 68. 5% 、試料 C (マンノース添加） 83. 9%、試料 D (ガラタトース添加） 78. 2%であり、血漿に単糖類を添加することにより、血漿中のサブスタンス Pが安定化されることが示された。特に、六炭糖であるグルコース、マンノース、ガラクトースを添加した試料で、対照と比較し有意に（P >0. 05)サブスタンス Pが安定化されており、六炭糖が血漿中のサブスタンス Pの安定化により有用であった。六炭糖としては、マンノースとガラクトースに、より高いサブスタンス P安定化効果が認められた。

実施例 2

[0038] 二糖類添カ卩による血漿中のサブスタンス Pの安定化

実施例 1と同様に調製したヒト血漿 50 しに、 100mg/mLマルトース水溶液、 10 Omg/mLスクロース水溶液、 100mg/mLラタトース水溶液、 lOOmgZmLトレハロース水溶液をそれぞれ 100 μ L添加し混合し、更に 200pg/mLのサブスタンス Ρ水溶液 50 x Lをそれぞれの混合液に添カ卩し、試料 E〜Hを調製した。二糖類の水溶液は精製水で調製した。ヒト血漿 50 しに、 200pgZmLのサブスタンス P水溶液を 50 μ L添加した試料を対照試料とした。

[0039] 調製直後の試料 Ε、試料 F、試料 G、試料 Hおよび対照試料のそれぞれにつレ、て、実施例 1と同様の方法により、それぞれの試料中のサブスタンス P濃度を測定し、サブスタンス Pの血漿中での安定性の指標となる残存率を求めた。結果を第 2表に示す

[0040] [表 2] サブスタンス Ρ濃度（p g / 残存率試料 ¾類

Ε マル卜ース 58.46 47.3 50.5 48.88 83.6

F スクロース 58.46 41.1 44.9 43.04 73.6

G ラタトース 58.46 51.4 43.8 47.62 81.4

Η トレハロース 58.46 40.2 43.5 41.84 71.6

[0041] 各試料のサブスタンス Pの残存率は、対照 51. 8%に対し、二糖類を添加したそれぞれの試料では、試料 E (マルトース添加） 83. 6。/。、試料 F (スクロース添加） 73. 6 %、試料 G (ラタトース添カロ） 81. 4%、試料 H (トレハロース添加） 71 . 6%であった。これらの試料では、対照試料と比較し有意に（P > 0. 05)サブスタンス Pが安定化されており、血漿に二糖類を添加することにより、血漿中のサブスタンス Pが安定化されることが示された。特に、マルトース、ラタトースが、血漿中のサブスタンス Pの安定化により有用であった。

実施例 3

[0042] 多糖類添カ卩による血漿中のサブスタンス Pの安定化

実施例 1と同様に調製したヒト血漿 50 しに、 10mg/mLアミロース水溶液、 10m gZmLセルロース水溶液、 l OmgZmLデキストラン水溶液、 10mg/mLデンプン水溶液をそれぞれ 100 μ L添加し混合し、更に 200pgZmLのサブスタンス Ρ水溶液 (50 x L)をそれぞれの混合液に添カ卩し、試料 I〜Lを調製した。多糖類の水溶液は精製水で調製した。ヒト血漿 50 しに、 200pg/mLのサブスタンス P水溶液を 50 μ L添加した試料を対照試料とした。

[0043] 調製直後の試料 I、試料 J、試料 K、試料 Lおよび対照試料のそれぞれにつレ、て、実施例 1と同様の方法により、それぞれの試料中のサブスタンス Ρを測定し、サブスタンス Ρの血漿中での安定性の指標となる残存率を求めた。結果を第 3表に示す。

[0044] [表 3] 3表

サブスタンス P濃度（p g / 残存率試料糖類

I アミロース 58.46 41.8 39.3 40.54 69.3

J セルロース 58.46 41.8 42.8 42.29 72.3

K デキストラン 58.46 39.9 43.1 41.51 71.0 しデンプン 58.46 35.0 35.5 35.27 60.3

[0045] 各試料のサブスタンス Pの残存率は、対照 51. 8%に対し、多糖類を添加したそれぞれの試料では、試料 1 (アミロース添加） 69. 3。 /。、試料 J (セルロース添加） 72. 3% 、試料 K (デキストラン添加） 71. 0%、試料 L (デンプン添加） 60. 3%であった。これらの試料では、対照と比較し有意に（P > 0. 05)サブスタンス Pが安定化されており、多糖類が血漿中のサブスタンス Pの安定化に有用であることが示された。

実施例 4

[0046] 糖類添加による血漿中のサブスタンス Pの 4°Cでの安定化

実施例 1と同様に調製したヒト血漿 50 μ Lに、精製水で調製した 400mg/mLダルコース（特級；関東化学社製）水溶液 100 μ Lを添加し混合し、 200pg/mLのサブスタンス P水溶液 50 μ Lを添加して調製した試料 Μを 3本作製した。ヒト血漿 50 μ Lに、 200pg/mLのサブスタンス Ρ水溶液を 50 /i L添加した試料も 3本作製し、対照試料とした。

[0047] それぞれの試料、ならびに試料の作製に用いたヒト血漿および 200pg/mLのサブスタンス P水溶液中のサブスタンス P濃度を実施例 1と同様の方法で測定し、サブスタンス Pの血漿中での安定性の指標となる残存率を求めた。なお、実施例 1では、 4°C でのインキュベーション時間は 18時間である力本試験では、それぞれ 16時間、 24 時間、 48時間と変更した。

インキュベーション時間が 16時間、 24時間、および 48時間の試料の調製に用いたヒト血漿中のサブスタンス P濃度は、それぞれ 15. 02pg/mL, 4. 95pg/mL、および 5. 71pgZmLと決定された。また、インキュベーション時間が 16時間、 24時間および 48時間の試料の調製に用いたサブスタンス P溶液の濃度は、それぞれ 211. lp g/mL 208. 4pg/mL、および 197. 8pg/mLと決定された。これらの測定値から、実施例 1と同様にして、試料中のサブスタンス Pの濃度の理論値を求め、理論値と測定値から残存率を計算した。結果を第 4表に示す。

[表 4] 第 4表

ダルコインキュべサブスタンス P濃度（p _g / ' m L )

試料 3¾ fe j¾

1ナ牛ースーシヨン理論値測定値 1 測定値 2 平均

対照 16時間 108.1 86.4 87.5 86.94 80.5 対照 24時間 106.7 63.6 64.0 63.78 59.8 対照 48時間 101.7 60.9 50.9 55.92 55.0

M 十 16時間 54.0 56.0 57.9 56.95 105.4

M 十 24時間 53.3 55.1 52.5 53.79 100.9

M 十 48時間 50.9 52.2 54.4 53.25 104.7

[0049] 対照試料では、試料の 4°Cでのインキュベーション時間が 16時間力ら 24時間、 48 時間と長くなるにつれ、試料中のサブスタンス Pの残存率が低下するのに対し、ダルコースを添加した試料では、インキュベーション時間が 16時間、 24時間、 48時間で全て 100%以上であり、残存率の低下はみられなかった。したがって、糖類は、 4°C における血漿中のサブスタンス Pの安定化に有用であった。

実施例 5

[0050] 糖類添カ卩による血漿中のサブスタンス Pの凍結時の安定化（その 1)

実施例 1と同様に調製したヒト血漿 50 μ Lに、精製水で調製した 400mg/mLダルコース（特級；関東化学社製）水溶液 100 μ Lを添加し混合し、 200pg/mLのサブスタンス P水溶液 50 μ Lを添加して調製した試料 Nを 3本作製し、それぞれの試料を— 80°Cで凍結した。試料 Nについて、凍結 0日後（調製直後）、 7日後、 15日後の各試料を室温にて融解後、融解された試料 N中のサブスタンス P濃度を実施例 1と同様の方法により測定し、サブスタンス Pの血漿中での安定性の指標となる残存率を求めた結果を第 5表に示す。

[表 5] 5 ¾

残存率（％)

試料

0曰 7日後 1 5日後

N グノレコース 85. 8 85. 8 86. 4

[0052] グルコースを添加した試料 Nでのサブスタンス Pの残存率は、調整直後（0日後） 85 . 8%と比較して、 7日後 85. 8%、 15日後 86. 4%であり、残存率の低下は見られなかった。したがって、糖類は、凍結時においても血漿中のサブスタンス Pの安定化に不用であった。

実施例 6

[0053] 糖類添カ卩による血漿中サブスタンス Pの凍結時の安定化（その 2)

実施例 1と同様に調製したヒト血漿 50 μ Lに 200pg/mLのサブスタンス Ρ水溶液を 50 μ L添加して調製した試料を 6本用意し、当該試料の各々に、 400mg/mLのグノレコース水溶液、 2. 5mg/mLの EDTA' 2Na水溶液、 60mg/mLのダルコン酸カリウム水溶液、 40mg/mLのダルコン酸ナトリウム水溶液、 50mgZmLのダルコン酸マグネシウム水溶液、 lOmmolZLのホスホラミドン水溶液をそれぞれ 100 μ L添加混合し、試料〇〜Sを調製した。尚、 EDTA' 2Naは特許文献 1に、各種ダルコン酸塩は特許文献 2に記載されたペプチド安定化剤である。

調製後、それぞれの試料を _ 80°Cで凍結した。凍結 0日後、 3日後、 13日後の各試料を室温にて融解後、融解された各試料中のサブスタンス P濃度を Substance P EIA Kit (Cayman社製）用い、実施例 1と同様の方法により測定し、サブスタンス Pの血漿中での安定性の指標となる残存率を求めた。結果を第 6表に示す。

[表 6] 第 6表

残存率（％)

試料 0 B 3ョ後 1 3ョ後

O グ /レコース 79. 8 78. 5 72. 3

P E D T A · 2 N a 104. 4 26. 4 32. 6

Q ダルコン酸カリウム 80. 0 31. 4 30. 1

R ダルコン酸ナトリウム 74. 3 32. 2 30. 3

S グ /レコン酸マグネシウム 82. 9 42. 6 40. 1

T ホスホラミドン 87. 6 29. 0 25. 6 第 6表から、血漿中に存在するサブスタンス Pは、凍結状態で、 EDTA' 2Na、各種ダルコン酸塩（ダルコン酸カリウム、ダルコン酸ナトリウム、ダルコン酸マグネシウム）、ホスホラミドンを添加した場合に比較して、グルコースを添加した場合に有意に安定ィ匕されており、本発明の安定化方法が血漿中に存在するサブスタンス Pの凍結状態での安定化にも有用な方法であることが判明した。

実施例 7

Neutral Endopeptidase (NEP)によるサブスタンス Pの分解に及ぼす糖類添加の影実施例 1と同様に調製したヒト血漿 150 μ L、 200pgZmLのサブスタンス P水溶液 150 x L並びに、 NEPがそれぞれ 0U/mL、 0. lU/mL、 1. OUZmLおよび 10. OU/mLの濃度である酵素液を 50 μ L添加した試料をそれぞれ調製した。

同様 (こして、ヒト血漿 150 μ L、 200pg/mLのサブスタンス P水溶 f夜 150 μ L、 400 mg/mLグルコース水溶液を 300 μ L並びに、 ΝΕΡがそれぞれ 0U/mL、 0. 1U/ mL、 1. OU/mLおよび 10. OU/mLの濃度である酵素液を 50 μ L添加した試料をそれぞれ調製した。

また、同様にして、ヒト血漿 150 x L、 200pg/mLのサブスタンス P水溶液 150 、 l OmmolZLホスホラミドン水溶液を 300 x L並びに、 NEPがそれぞれ 0U/mL、 0. lU/mL, 1. OU/mLおよび 10. OU/mLの濃度である酵素液を 50 μ L添加した試料をそれぞれ調製した。各試料中のサブスタンス P濃度を Substance P EIA Kit (Cayman社製）用レ、、実施例 1と同様の方法により測定し、サブスタンス Pの残存率を求めた。結果を第 7表に示す。

[表 7] 第 7表

残存率 (% )

|¾料 N E P濃度（； U / m D

0 0 . 1 1 . 0 1 0 . 0 サプスタンス P 100. 0 102. 2 93, . 3 84. 0 グノレコース十サブ'スタンス p 100. 0 98. 7 95, . 8 98. 3 ホスホラミドン十サブスタンス p 100. 0 103. 9 103, . 4 96. 2 第 7表から、サブスタンス Pは NEPにより分解され、分解は NEP濃度に依存的に進行するが、グルコースまたはホスホラミドンが添加された状態では、サブスタンス Pの N EPによる分解は抑制されることが判明した。

実施例 8

[0055] サブスタンス Pの安定化試薬

リン酸緩衝液 81. 5 mmol/L

塩化カリウム 0. 2 g/L

EDTA- 2Na 0. 09 g/L

アジ化ナトリウム 1. 0 g/L

グノレコース 400. 0 g/L

産業上の利用可能性

[0056] 本発明により、生体試料中のプチドの安定化方法が提供される。該安定化方法は、例えば、臨床検査で採取される生体試料中のペプチドを安定化することができるので、臨床検査において、生体試料中のマーカーとなるペプチドを正確に測定すること力 Sできる。

Claims

請求の範囲

[I] ペプチドを含有する生体試料に糖類を添加することを特徴とする、生体試料中のぺプチドの安定化方法。

[4] 生体試料が、全血、血清、血漿、涙液、鼻汁、唾液、尿、便、髄液、細胞、細胞組織液および細胞膜からなる群より選ばれる生体試料である請求項 1〜3のいずれかに記載の方法。

[5] 糖類が、単糖類、二糖類または多糖類である請求項 1〜4のいずれかに記載の方法

[6] 単糖類が、六炭糖である請求項 5記載の方法。

[7] 六炭糖が、マンノースまたはガラクトースである請求項 6記載の方法。

[8] 二糖類が、還元性の二糖類である請求項 5記載の方法。

[9] 還元性の二糖類が、マルトースまたはラタトースである請求項 8記載の方法。

[10] 多糖類が、アミロース、セルロース、デキストランまたはデンプンである請求項 5記載の方法。

[I I] ペプチドが、サブスタンス Pである請求項 1〜： 10のいずれかに記載の方法。

[12] 糖類を含有することを特徴とする、ペプチドを含有する生体試料中のペプチドの安定化試薬。

[15] 生体試料が、全血、血清、血漿、涙液、鼻汁、唾液、尿、便、髄液、細胞、細胞組織液および細胞膜からなる群より選ばれる生体試料である請求項 12〜： 14のいずれかに記載の試薬。

[16] 糖類が、単糖類、二糖類または多糖類である請求項 12〜： 15のいずれかに記載の試薬。

[17] 単糖類が、六炭糖である請求項 16記載の試薬。

[18] 六炭糖が、マンノースまたはガラクトースである請求項 16記載の試薬。

[19] 二糖類が、還元性の二糖類である請求項 16記載の試薬。

[20] 還元性の二糖類が、マルトースまたはラタトースである請求項 19記載の試薬。

[21] 多糖類が、アミロース、セルロース、デキストランまたはデンプンである請求項 16記載の方法。

[22] ペプチドが、サブスタンス Pである請求項 12〜21のいずれかに記載の方法。