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WO2007074858A1 - ジペプチドの製造法 - Google Patents

ジペプチドの製造法 Download PDF

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Publication number
WO2007074858A1
WO2007074858A1 PCT/JP2006/326024 JP2006326024W WO2007074858A1 WO 2007074858 A1 WO2007074858 A1 WO 2007074858A1 JP 2006326024 W JP2006326024 W JP 2006326024W WO 2007074858 A1 WO2007074858 A1 WO 2007074858A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
dna
dipeptide
amino acid
transformant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2006/326024
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kuniki Kino
Atsushi Noguchi
Yuji Nakazawa
Makoto Yagasaki
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority to US12/097,806 priority Critical patent/US20090197303A1/en
Priority to JP2007552002A priority patent/JP5121462B2/ja
Publication of WO2007074858A1 publication Critical patent/WO2007074858A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a dipeptide.
  • enzymatic synthesis or biological synthesis is mainly used for long-chain peptides of several tens of residues or more, and chemical synthesis and enzymatic synthesis for short-chain peptides of 2 to several residues.
  • the law is mainly used.
  • Non-Patent Document 1 a method utilizing the reverse reaction of proteolytic enzyme (protease)
  • Patent Documents 1 to 3 Non-Patent Document 2
  • Methods using thermostable aminoacyl t-RNA synthetase Patent Documents 4 to 7
  • methods using non-ribosomal peptide synthetase hereinafter referred to as NRPS
  • NRPS non-ribosomal peptide synthetase
  • the method utilizing the reverse reaction of proteolytic enzyme requires the protection and deprotection of the functional group of the amino acid serving as the substrate, which makes it difficult to increase the efficiency of the peptide formation reaction and to prevent the peptide degradation reaction.
  • the method using transesterification requires esterification of the amino acid serving as the substrate, and has the following problems: efficiency improvement and yield reduction due to decomposition of the amino acid ester serving as the substrate and the produced peptide.
  • the method using thermostable aminoacyl t-RNA synthetase has the problem that it is difficult to prevent enzyme expression and by-product reactions other than the target product.
  • 4'-phosphopantetheine which is a coenzyme smaller than the enzyme molecular weight NRPS, does not require y-glutamylcysteine synthetase ( ⁇ -glutamylcysteine synthetase), D A group of peptides such as D-Ala-D-Ala ligase, D-Ala-D-Ala ligase, poly- ⁇ -glutamate synthetase Synthase is also known. Most of these enzymes have characteristics such as using D-amino acid as a substrate or catalyzing the formation of a peptide bond at the ⁇ -position carboxyl group. It cannot be used to synthesize short peptides.
  • Basilicin synthase has the activity to synthesize basilicin (L-Ala- L-anticapsin, L-Ala- L-anticapsin) and L-Ala-L-Alanin (L-Ala- L-Ala) Recently (see Non-Patent Documents 5 and 6), it was recently reported that this enzyme has various combinations of the same or different free amino acid strengths to generate various dipeptides. (See Patent Document 10 and Non-Patent Document 7).
  • nucleotide sequence of the chromosomal DNA of Bacillus licheniformis ATCC 14580 and Bacillus licheniformis DSM13 and the deduced nucleotide sequence of the gene are also known (see Non-Patent Document 8).
  • Non-Patent Document 8 not only the functions of the proteins encoded by the BL00235 gene and BU04240 gene in the gene, but also the force or inability of the BL00235 gene and BU04240 gene to encode a protein that actually has a function, is not known.
  • Patent Document 1 International Publication No. 2003/010187 Pamphlet
  • Patent Document 2 Pamphlet of International Publication No. 2003/010307
  • Patent Document 3 International Publication No. 2003/010189 Pamphlet
  • Patent Document 4 JP-A-58-146539
  • Patent Document 5 Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-209991
  • Patent Document 6 Japanese Patent Laid-Open No. 58-209992
  • Patent Document 7 Japanese Patent Application Laid-Open No. 59-106298
  • Patent Document 8 US Patent No. 5795738
  • Patent Document 9 US Patent No. 5652116
  • Patent Document 10 International Publication No. 2004/058960 Pamphlet
  • Non-Patent Document 1 J. Biol. Chem., 119, 707-720 (1937)
  • Non-Patent Document 2 J. BiotechnoL, 115, 211-220 (2005)
  • Non-Patent Document 3 Chem. Biol, 7, 373-384 (2000)
  • Non-Patent Document 4 FEBS Lett., 498, 42-45 (2001)
  • Non-Patent Document 5 J. Ind. Microbiol, 2, 201-208 (1987)
  • Non-Patent Document 6 Enzyme Microb. TechnoL, 29, 400-406 (2001)
  • Non-Patent Document 7 J. BacterioL, 187, 5195-5202 (2005)
  • An object of the present invention is to provide a protein having dipeptide synthesis activity, a DNA encoding the protein, a recombinant DNA containing the DNA, a transformant transformed with the recombinant DNA, the Method for producing protein having dipeptide synthesis activity using transformant, etc., method for producing dipeptide using protein having dipeptide synthesis activity, and culture of transformant or microorganism producing protein having dipeptide synthesis activity It is to provide a method for producing a dipeptide using the above as an enzyme source.
  • the present invention relates to the following (1) to (10).
  • a protein having an amino acid sequence ability in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having dipeptide synthesis activity [1] A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and having a dipeptide synthesis activity
  • the microorganism having the ability to produce the protein of (1) above is cultured in a medium, the protein is produced and accumulated in the culture, and the protein is collected from the culture (1) Protein production method.
  • a culture of a microorganism having the ability to produce the protein of (1) above or a processed product of the culture, or the protein of (1) above and one or more amino acids in an aqueous medium thus, a method for producing a dipeptide, wherein the dipeptide is produced and accumulated in the medium, and the medium force is collected.
  • a protein having an activity of synthesizing a dipeptide can be produced, and the dipeptide can be produced using the protein or a transformant or a microorganism having an ability to produce the protein.
  • FIG. 1 is a diagram showing the construction process of plasmid pBL00235.
  • BL00235 in the figure represents the ⁇ LQQ ⁇ gene derived from the Bacillus licheniformis ATCC14580 strain, PII represents the T7 promoter gene, and His-tag represents the histidine tag (His-tag) sequence.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 a protein having an amino acid sequence ability in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having a dipeptide synthesis activity
  • [3] a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having dipeptide synthesis activity;
  • the dipeptide synthesis activity in the present specification is an activity for forming a peptide bond between two amino acids, and preferably a peptide between the ⁇ -position carboxyl group of an amino acid and the amino group of another amino acid. It refers to the activity of forming a bond.
  • Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition, old Spring Harbor Laboratory Press (2001 ) (Hereinafter “h”, abbreviated as “Molecular Cloning 3rd Edition”), current Protocols in Molecular Biology, John Wile y & Sons (1987-1997) (hereinafter referred to as the current 'protocols'in' molecular ⁇ ⁇ ⁇ Biologics), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, but is a number that can be deleted, substituted or added by a known method such as the above-mentioned site-specific mutation method, From several tens, preferably 1 to 20, more preferably 1 to: LO, and further preferably 1 to 5.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 one or more amino acids have been deleted, substituted or appended, and one or more amino acids have been deleted, substituted or added at any position in the same sequence, exactly.
  • amino acid position at which amino acid deletion or attachment is possible examples include 1 to several amino acids on the N-terminal side and C-terminal side of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. .
  • Amino acids that are substituted or added, which may be deleted, substituted or attached at the same time, may be natural or non-natural.
  • Natural amino acids include L-alanine, L-arginine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-sip Icin, L-lysine, L-methionine, L-pheny
  • Examples include lulanin, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-parin, and L cysteine.
  • amino acids that can be substituted with each other are shown below. Amino acids contained in the same group can be substituted for each other.
  • Group A Leucine, Isoleucine, Norleucine, Norin, Norpaline, Alanine, 2-Aminobutanoic acid, Methionine, 0-Methylserine, t-Butylglycine, t-Butylalanine, Cyclohexinolealanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-amino adipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group D lysine, arginine, ornithine, 2,4-dianaminobutanoic acid, 2,3-dianaminopropio Acid
  • Group E proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • Group F serine, threonine, homoserine
  • the homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably It is desirable to have a homology of 98% or more, particularly preferably 99% or more.
  • a transformant that expresses the protein of the present invention is prepared by using a DNA recombination method. After producing the protein of the present invention using the transformant, the protein of the present invention, one or more amino acids, preferably two amino acids selected from L-amino acid and glycine power, and ATP are present in an aqueous medium, A method for analyzing whether or not dipeptides are produced and accumulated in the aqueous medium by HPLC or the like can be mentioned.
  • DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and [3] a DNA that hybridizes with a DNA having a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 under a stringent condition and encodes a protein having dipeptide synthesis activity;
  • the DNA having the specific base sequence or a part of the base sequence of the DNA has a force that is useful as a probe for Northern or Southern blot analysis, or a length that can be used as an oligonucleotide primer for PCR analysis. It may be DNA.
  • the DNA used as a probe include DNA of 100 bases or more, preferably 200 bases or more, more preferably 500 bases or more.
  • the DNA used as a primer is 17 bases or more, preferably 20 bases or more. Preferably, DNA having 25 bases or more can be mentioned.
  • the above stringent conditions include, for example, a DNA-immobilized filter and probe DNA, 50% formamide, 5 X SSC (750 mM sodium chloride, 75 mM sodium citrate), 50 mM sodium phosphate. (PH 7.6), 5 X Denhardt's solution, 10% dextrane sulfate, and g / 1 denatured salmon sperm DNA at 42 ° C, after incubation, for example about 65 ° Conditions for washing the filter in a 0.2 X SSC solution of C can be mentioned. Stringent conditions can be adjusted according to the length of the probe DNA chain and the GC content, and can be set by the method described in Molecular Cloning 3rd edition.
  • Lower stringent conditions can also be used, but stringent conditions can be changed by adjusting the formamide concentration (lower stringent concentration lowers stringency), changing salt concentration and temperature conditions It is.
  • Low stringent conditions include, for example, 6 X SSCE (20 X SSCE is 3 mol / l sodium chloride In a solution containing 0.2 mol / l sodium dihydrogen phosphate, 0.02 mol / l EDTA, pH 7.4), 0.5% SDS, 30% formamide, 100 g / 1 denatured salmon sperm DN A Then, after incubating at 37 ° C, washing with 50 ° C 1X SSC, 0.1% SDS solution can be mentioned. Further, as a lower stringent condition, a condition of washing with a solution having a high salt concentration (for example, 5 ⁇ SSC) after performing hybridization under the low stringent condition described above can be given. be able to.
  • 6 X SSCE (20 X SSCE is 3 mol / l sodium chloride
  • the various conditions described above can also be set by adding or changing a blocking reagent used to suppress the background of the hybridization experiment.
  • the addition of the blocking reagent described above may be accompanied by changes in hybridization conditions in order to adapt the conditions.
  • the DNA that can be hybridized under the stringent conditions described above is represented by SEQ ID NO: 2 when calculated based on the above parameters using, for example, the above-mentioned programs such as BLAST and FASTA.
  • Examples thereof include DNA having at least 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, further preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more homology with the base sequence.
  • the homology of the base sequence can be determined using a program such as BLAST or FASTA described above.
  • a DNA encoding a protein having dipeptide synthesis activity means that a recombinant DNA that expresses the DNA is prepared and the recombinant DNA is used as a host.
  • Culture strength obtained by culturing microorganisms obtained by introduction into cells Purify the protein, and use the purified protein as an enzyme source, the enzyme source, and one or more amino acids, preferably L-amino acids and Glycine power Two kinds of amino acids selected can be present in an aqueous medium, and whether or not dipeptides are generated and stored in the aqueous medium can be confirmed by a method of analyzing by HPLC or the like.
  • microorganisms and transformants used in the production method of the present invention are not particularly limited as long as they are microorganisms and transformants having the ability to produce the protein of the present invention, but the microorganism is preferably Bacillus (Bacillus_).
  • Microorganisms belonging to the genus preferably bees A microorganism belonging to Bacillsu licheniformis, more preferably Bacillus licheniformis ATCC14580 or Mlicheniformis DSM13, and the transformant includes a trait transformed with a DNA encoding the protein of the present invention.
  • the converter can be raised.
  • Bacillus licheniformis ATCC14580 is available from the American Type Culture Collection ⁇ Bacillus licheniformis DSM13i, a US bioresource seng ⁇ , and from the German bioresource conservation agency Deutche Sammulung von Mikroorganismeu und Zell kulturen GmbH.
  • a recombinant DNA containing the above DNA 2 is used to transform a host cell by a known method.
  • Host cells include prokaryotic cells such as bacteria, yeast, animal cells, insect cells and plant cells, preferably prokaryotic cells such as bacteria, more preferably bacteria, more preferably Escherichia You can raise things.
  • the DNA of the present invention is, for example, a microorganism belonging to the genus Bacillus (Ml), preferably a Bacillus licheniformis, using a probe that can be designed based on the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the obtained DNA is cut as it is or with an appropriate restriction enzyme and incorporated into a vector by a conventional method, and the resulting recombinant DNA is introduced into a host cell, followed by analysis of commonly used nucleotide sequences. Analysis using a nucleotide sequence analyzer such as the dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)] or Applied Biosystems 3700 DNA Analyzer (Applied Biosystems) Thus, the base sequence of the DNA can be determined.
  • the full length is determined by the Southern hybridization method for chromosomal DNA library using the partial length DNA as a probe. DNA can be obtained.
  • the target DNA can be prepared by chemical synthesis using an 8905 DNA synthesizer manufactured by Perceptive Biosystems.
  • Examples of the DNA obtained as described above include a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • pBluescriptll KS (+) (Stratagene)
  • pDIRECT [Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)]
  • pCR-Script Amp SK (+) (Stratagene)
  • PT7Blue manufactured by Novagen
  • pCR II manufactured by Invitrogen
  • pCR-TRAP manufactured by Gene Norter
  • Examples of host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia.
  • Examples of microorganisms belonging to the genus Rhihia include Escherichia coli XL1-Blue ⁇ escherichia coli XL2-Blue—Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli ATCC 12435, Escherichia ' Koli W1485, Escherichia 'Colli JM109, Escherichia coli' HB101, Escherichia 'Colli No. 49, Escherichia' Colli W3110, Escherichia 'Col. Etc.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the host cell.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Ac ad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]
  • protoplast method Japanese Patent Laid-Open No. 63-248394
  • electrovolution method [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)] and the like.
  • Examples of the transformant of the present invention obtained by the above method include Escherichia coli 'BL21 / pBL00235, which is a microorganism having a recombinant DNA containing a DNA having the sequence represented by SEQ ID NO: 2. it can.
  • a DNA fragment having an appropriate length containing a portion encoding the protein of the present invention is prepared.
  • a transformant with an improved production rate of the protein can be obtained by substituting the base in the base sequence of the protein-encoding portion so as to be an optimal codon for host expression.
  • Recombinant DNA is prepared by inserting the DNA fragment downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a transformant producing the protein of the present invention can be obtained by introducing the recombinant DNA into a host cell suitable for the expression vector.
  • any strain can be used as long as it can express the target gene, such as bacteria, yeast, animal cells, insect cells, plant cells, and the like.
  • the expression vector one that can replicate autonomously in the above host cell or can be integrated into a chromosome and contains a promoter at a position where the DNA of the present invention can be transcribed is used.
  • the recombinant DNA having the DNA of the present invention is capable of autonomous replication in prokaryotic organisms, and at the same time, a promoter, a ribozyme binding sequence, and It is preferably a recombinant DNA composed of a transcription termination sequence. Includes the genes that control the promoter!
  • Expression vectors include pBTrp2, pBTacl, pBTac2 (all manufactured by Boehringer Mannheim), pHelixl (manufactured by Roche's Diagnostats), pKK233-2 (manufactured by Amersham 'Fanore Macia' Biotech), pSE280 (Invitrogen), pGEMEX-EX (Promega), pQE-8 (Qiagen), pET-3 (Novagen), pKYPIO (JP 58-110600), p KYP200 [Agric. Biol Chem., 48, 669 (1984)], pLSAl [Agric. Biol.
  • the promoter may be V, as long as it functions in a host cell such as Escherichia coli, or anything else!
  • promoters examples include promoters, SPOl promoters, SP02 promoters, penP promoters, and the like.
  • P promoters two P promoters in series, ⁇ promoter, lacT7
  • the xylA promoter for expression in microorganisms belonging to the genus Bacillus [Appl.
  • a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is a ribosome binding sequence, and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (eg, 6 to 18 bases).
  • a transcription termination sequence is not necessarily required, but it is preferable to arrange the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • Prokaryotes include Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corvnebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, and Agronocterum. (Agrobacterium), Alicyclonacinolus (Alicvclobacillus), Anabena, Anacvstis, Arthrobacter, Azotobactei; Chromatium.
  • any method for introducing recombinant DNA any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the host cell.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)], protoplast method (JP-A-63-248394), electrovolution method [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)] and the like.
  • yeast When yeast is used as a host cell, for example, YEpl3 (ATC C37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15, etc. can be used as an expression vector.
  • any promoter that functions in yeast may be used.
  • PH05 promoter PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, gall promoter, gal 10 promoter, heat shock poly
  • the promoter include peptide promoters, MFa1 promoters, and CUP1 promoters.
  • yeast include Saccharomvces, Schizos accharomvces, Kluweromvces, Trichosphoron, Schwanniomvces, Pichia, or Pichia Yeasts belonging to the genus (C dida), etc.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into yeast.
  • the electoral position method [Methods EnzymoL, 194, 182 (1990)]
  • Examples include the plast method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)], the lithium acetate method [J. BacterioL, 153, 163 (1983)], and the like.
  • examples of expression vectors include pcDNAI, pcDM8 (commercially available from Funakoshi), pAGE107 (JP-A-3-22979), pAS3-3 (JP-A-2-227075), pCDM8 [ Nature, 329, 840 (1987)], pcDNAI / Amp (Invitrogen), pRE P4 (Invitrogen), pAGE103 [J. Biochem, 101, 1307 (1987)], pAGE210, pA Mo, pAMoA, etc. can be used.
  • Any promoter can be used as long as it functions in animal cells.
  • a promoter of the cytomegalovirus (CMV) IE (immediate early) gene an early promoter of SV40, or a metamouth.
  • CMV cytomegalovirus
  • Examples include thionein promoter, retrowinore promoter, heat shock promoter, SRa promoter and the like.
  • an enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with a promoter.
  • Animal cells include mouse 'myeloma cells, rat' myeloma cells, mouse 'hybridoma cells, human cells such as Namalwa cells or Namalva KJM-1 cells, human fetal kidney cells, human leukemia cells, Examples include African green monkey kidney cells, CHO cells that are Chinese hamster cells, and HBT5637 (Japanese Patent Laid-Open No. 63-299). As mouse myeloma cells, SP2 / 0, NSO, etc.
  • Rat 'myeloma cells as YB2 / 0 etc., human fetal kidney cells as HEK293 (ATCC CRL-1573), human leukemia cells as BALL-1, etc., Africa Examples of green monkey kidney cells include COS-l and COS-7.
  • any method for introducing recombinant DNA any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into animal cells.
  • the electopore position method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • the calcium phosphate method Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075
  • the lipofusion method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)]
  • an insect cell for example, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman and company, New York (1992), Current Protocorenoles in 'Molecular. , A Laboratory Manual, Bio / Technology, 6, 47 (1988), etc., can be used to produce proteins.
  • a recombinant gene transfer vector and a baculovirus are co-introduced into insect cells to obtain a recombinant virus in an insect cell culture supernatant, and then the recombinant virus is further infected into insect cells to produce a protein. Can be made.
  • gene transfer vectors used in the method include pVL1392, pVLl 393, pBlueBacIII (V, deviation is manufactured by Invitrogen) and the like.
  • baculovirus for example, the autographa californica nu clear polyhedrosis virus; which is a virus that infects night stealing insects can be used » That's it.
  • Insect cells include Spodoptera frugiperda ovary cells, Trichoplusiani egg yolk thin cells, and silkworm ovary-derived cultured cells.
  • Spodoptera frugibelda ovarian cells are S19, S11 (Baculovirus' Expression ', Vector'Lab' Laboratory 'Mual), etc., Trichopulcia' second ovary cells are High 5, ⁇ - ⁇ -5 ⁇ 1- Examples of cultured cells derived from silkworm ovary such as 4 (manufactured by Invitrogen) include Bombix mori N4.
  • Examples of a method for co-introducing the above recombinant gene transfer vector and the above baculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus include, for example, the calcium phosphate method (JP-A-2-227075), the lipofusion method [Proc. Natl. Acad Sci., USA, 84, 7413 (1987)].
  • expression vectors include Ti plasmids and tobacco mosaic virus vectors.
  • Any promoter can be used as long as it functions in plant cells. Examples thereof include the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, the rice actin 1 promoter, and the like.
  • plant cells include tobacco, potato, tomato, carrot, soybean, rape, alfalfa, rice, wheat, barley and the like.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into plant cells.
  • a method using Agrobacterium Japanese Patent Laid-Open No. 59-140885, specially disclosed. Examples include Kaisho 60-70080, WO94 / 00977), electo-poration method (Japanese Patent Publication 60-251887), a method using a particle gun (patent 2606856, Japanese Patent 2517813), and the like.
  • Method for producing the protein of the present invention The transformant obtained by the above method 5 is cultured in a medium, the protein of the present invention is produced and accumulated in the culture, and the protein can be produced by collecting from the culture.
  • the transformant host for producing the protein of the present invention may be any of bacteria, yeast, animal cells, insect cells, plant cells, etc., preferably bacteria, more preferably Examples include microorganisms belonging to the genus Escherichia, more preferably microorganisms belonging to Escherichia coli.
  • the protein of the present invention is expressed using yeast, animal cells, insect cells or plant cells, a protein to which a sugar or a sugar chain is added can be obtained.
  • the method of culturing the transformant in a medium can be performed according to a conventional method used for culturing host cells.
  • the medium As a medium for culturing a transformant obtained by using a prokaryote such as Escherichia coli or a yeast as a host cell, the medium contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the organism. Either a natural medium or a synthetic medium may be used as long as the medium can efficiently perform the steps.
  • the carbon source as long as the organism can assimilate, glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, acetic acid, propionic acid, etc. Organic acids, alcohols such as ethanol, propanol and the like can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium salts of organic acids such as ammonium salts, and other nitrogen-containing elements.
  • Compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells, digested products thereof, and the like can be used.
  • inorganic salt monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride salt, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, etc. may be used. it can.
  • the culture is usually carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • culture The culture time is 15 to 40 ° C, and the incubation time is usually 5 to 7 days.
  • the pH is maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • a microorganism transformed with an expression vector using a 1 ⁇ promoter a microorganism transformed with an expression vector using an im promoter and isopropyl-1- ⁇ -D-thiogalatatopyranoside is used.
  • indoleacrylic acid or the like may be added to the medium.
  • RPMI1640 medium J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)
  • Eagle (Eag) is used as a medium for culturing transformants obtained using animal cells as host cells.
  • MEM medium Science, 122, 501 (1952)]
  • DMEM medium DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)]
  • 199 medium Proc. Soc. Biol. Med., 73, 1 (1950)
  • a medium in which fetal calf serum or the like is added to these mediums can be used.
  • the culture is usually carried out for 1 to 7 days under conditions of pH 6 to 8, 25 to 40 ° C, 5% CO and the like.
  • antibiotics such as kanamycin, penicillin, streptomycin and the like may be added to the medium as needed during culture.
  • TNM-FH medium manufactured by Farmingen
  • Sf-900 II SFM medium manufactured by Life Technologies
  • ExCell400 ExCell405 [both manufactured by JRH Biosciences]
  • Grace's Insect Medium (Nature, 195, 788 (1962)] and the like
  • Cultivation is usually carried out under conditions of pH 6-7, 25-30 ° C, etc. for 1-5 days.
  • antibiotics such as gentamicin may be added to the medium as needed during the culture.
  • Transformants obtained using plant cells as host cells are cultured as cells or differentiated into plant cells and organs. can do.
  • a medium for culturing the transformant Commonly used Murashige 'and' Stag (MS) medium, White medium, or a medium supplemented with plant hormones such as auxin, cytokinin, etc. can be used.
  • Cultivation is usually carried out under conditions of pH 5-9 and 20-40 ° C for 3-60 days.
  • antibiotics such as kanamycin and hygromycin may be added to the medium as needed during the culture.
  • the method for producing the protein of the present invention includes a method for producing in the host cell, a method for secreting it outside the host cell, or a method for producing it on the outer membrane of the host cell, and the protein to be produced according to the selected method.
  • the structure of can be changed.
  • the protein of the present invention is produced in the host cell or on the outer membrane of the host cell, the method of Paulson et al. [J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)], the method of Lou et al. [Proc Natl. Acad. Sci “USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)], or Japanese Patent Application Laid-Open No. 05-336 963, WO94 / 23021, etc.
  • the protein can be actively secreted out of the host cell.
  • a protein containing the active site of the protein of the present invention is produced in a form in which a signal peptide is added in front of the protein, so that the protein is actively released outside the host cell. Can be secreted.
  • the production amount can be increased using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like.
  • an animal individual transgenic non-human animal or plant individual (transgenic plant) into which the gene has been introduced is created.
  • These proteins can be used to produce the protein of the present invention.
  • the transformant producing the protein of the present invention is an animal or plant individual, it is raised or cultivated according to a usual method to produce and accumulate the protein, and the protein is collected from the animal individual or plant individual. By doing so, the protein can be produced.
  • the protein of the present invention is produced and accumulated in the animal, and the protein is collected from the animal.
  • the protein can be produced.
  • the place where the protein in the animal is produced and accumulated include milk of the animal (JP-A 63-309192), eggs and the like.
  • Any promoter can be used as long as it functions in animals.
  • mammary cell specific promoters, ex casein promoter, 13 casein promoter, j8 lactoglobulin promoter, whey acidity A protein promoter or the like is preferably used.
  • a method for producing the protein of the present invention using an individual plant for example, a known method of a transgenic plant introduced with a DNA encoding the protein of the present invention [tissue culture, 20 (1994), tissue Culture, 21 (1995), Trends Biotechno L, 15, 45 (1997)], producing and accumulating the protein in the plant, and collecting the protein from the plant, The method of production is given.
  • the cells are collected by centrifugation after culturing, suspended in an aqueous buffer, and then subjected to an ultrasonic crusher, a French press, a menton. Crush the cells with a Gaurin homogenizer, dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • an ordinary enzyme isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation using an organic solvent, etc.
  • the solubilized solution is diluted with a solution containing no protein denaturant or diluted so that the concentration of the protein denaturant does not denature the protein, or dialyzed to form the protein into a normal three-dimensional structure.
  • a purified sample can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the protein of the present invention or a derivative such as a sugar modification product thereof is secreted extracellularly
  • the protein or its derivative such as a sugar adduct can be recovered in the culture supernatant. That is, a soluble fraction is obtained by treating the culture by a technique such as centrifugation as described above, and a purified sample is obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. Obtainable.
  • Examples of the protein thus obtained include a protein having the amino acid sequence strength represented by SEQ ID NO: 1.
  • the protein of the present invention can be produced as a fusion protein with another protein and purified using affinity chromatography using a substance having an affinity for the fused protein.
  • affinity chromatography using a substance having an affinity for the fused protein.
  • the method described in Law et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)] JP-A-5-336963, WO94 / 23021
  • the protein of the present invention can be produced as a fusion protein with protein A, and purified by affinity chromatography using immunoglobulin G.
  • the protein of the present invention is produced as a fusion protein with a Flag peptide and used for affinity chromatography [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)], and can be purified by affinity chromatography using a metal coordination resin that is produced as a fusion protein with polyhistidine and has high affinity with polyhistidine. it can. Furthermore, it can be purified by affinity chromatography using an antibody against the protein itself.
  • the protein of the present invention can be obtained by chemical synthesis methods such as Fmoc method (fluorenylmethylcarbol method) and tBoc method (tbutyloxycarbol method). Can be manufactured. Advanced ChemTech, Chemical synthesis can also be performed using peptide synthesizers such as “Kin, Elma ⁇ ”, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, PerSntive, Shimadzu Corporation.
  • amino acids used as a substrate preferably one or two amino acids are amino acids, preferably L-amino acids, Gly Any amino acid may be used in any combination as long as it is an amino acid selected from the group consisting of and
  • L amino acids examples include L-Ala- L-Gln, L-Glu ⁇ L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Pro, L-Phe ⁇ L-Trp ⁇ LM et, L- Ser, L — Thr, L— Cys, L— Asn, L— Tyr, L— Lys, L— Arg, L— His, L— Asp, L— a— ami nobutylate (L--AB), L- Azaserine, L- theanine, L-4-hydroxyproline (L-4-HYP), L-3-hydroxyproline (L-3-HYP), L-Ornitine (L-Orn), L-Citrulline (L-Cit) and L— 6— and diazo— 5— oxo— norleucine.
  • More preferred U and amino acids used in the above production method include L-Ala, L-Gln, L-Glu, Gly, L-Val, L-Leu, L-lie ⁇ L-Pro, L-Phe, L — Trp, L—Met ⁇ L—Ser, L—Thr, L—Cys, L—As n, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-Asp and j8-Ala
  • One or two amino acids, and more preferred amino acids are one selected from L-Ala and L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Thr, L-Asn, L-Leu and L-lie A combination of L-Gin and L-Met and L-Leu, a combination of L-Glu and L-Met, Gly and L-Met, L-Thr And a combination of one amino acid selected from L-Leu, a combination of L-Val and one amino acid selected from L-Met and L-Ser, L-Le
  • the protein of the present invention is added in an amount of 0.01 to 100 mg, preferably 0.1 to 10 mg per mg of amino acid used as a substrate.
  • the amino acid used as the substrate is added to the aqueous medium at the beginning or during the reaction so as to have a concentration of 0.1 to 500 g / L, preferably 0.2 to 200 g / L.
  • ATP can be used as an energy source, and ATP is preferably used at a concentration of 0.5 mmol to 10 mol / L.
  • ATP can be supplied as a powder or as a solution in an aqueous medium that produces and accumulates dipeptides.
  • ATP regeneration activity using glycolysis and polyphosphate kinase (ADP generated during dipeptide production) ATP can also be supplied by adding the activity of converting to ATP) to the aqueous medium.
  • Corvnebacterium ammoniagenes engrafted cell carbon source addition method [Biosci. Biotechnol. Biochem., 65, 644 (2001)]
  • polyphosphate kinase and polyphosphate addition method J. Biosci. Bioeng ., 91, 557 (2001)].
  • the aqueous medium used in the above production method may be an aqueous medium of any component and composition as long as it does not inhibit the dipeptide formation reaction.
  • water, phosphate, carbonate, acetic acid examples thereof include buffers such as salts, borates, citrates, and tris. It may also contain alcohols such as methanol and ethanol, esters such as ethyl acetate, ketones such as acetone, and amides such as acetateamide.
  • the dipeptide formation reaction is carried out in an aqueous medium at pH 5 to ll, preferably pH 6 to 10, 20 to 50 ° C, preferably 25 to 45 ° C, for 2 to 150 hours, preferably 6 to 120 hours. .
  • Dipeptides produced by the above method include amino acids, preferably L-amino acids, amino acids selected from G1 y and j8-Ala, more preferably L-Ala, L-Gln, L-Glu, L-Va 1, 1 eu 1 1 Ile, 1 Pro, 1 Phe 1 Trp 1 Met 1 Ser 1 Thr 1 Cys 1 Asn 1 T yr, L— Lys, L—Arg, L—His, L—Asp, L- ⁇ AB, j8—Ala, L—Azaserme, L—theanine, L—4-HYP, L-3-HYP, L-Orn, L-Cit ⁇ L-6-diazo-5-oxo-norleucine ⁇ Gly and j8-Ala force Dipeptides in which selected amino acids are linked by peptide bonds, more preferably the formula (I) [0078] [Chemical Formula 1]
  • R 1 is L—Ala
  • R 2 is an amino acid selected from L—Leu, L—Ile, L—Phe ⁇ L—Trp ⁇ L—Met ⁇ L—Thr and L-Asn.
  • R 1 is L-Gln
  • R 2 is L-Leu or L-Met
  • R 1 is L-Glu
  • R 2 is L-Met
  • R 1 is Gly
  • R 2 is an amino acid from which L-Leu, L-Met and L-Thr forces are also selected
  • R 1 is L-Val
  • R 2 is L-Met or L-Ser
  • R 1 is L—Leu
  • R 2 is an amino acid selected from L—Pro, L—Phe ⁇ L—Met ⁇ L—Ser, L—Thr, L—Cys, L—Asn ⁇ L—Tyr, L—Ala, L-Gin and Gly
  • R 1 is L-lie
  • R 2 is an amino acid selected from L-Met, L-Ser and L
  • R 1 is L—Met
  • R 2 is L—Met, L—Ser ⁇ L—Thr, L—Cys , L— Asn, L— Tyr ⁇ L-Lys, L- Arg ⁇ L- His ⁇ L- Asp ⁇ L- Ala ⁇ L- Gln, L- Glu ⁇ Gly ⁇ L- Val, L-Leu, L-Il e, L-Pro, an amino acid selected from L-Phe and L-Trp
  • R 1 is L-Ser
  • R 2 is L- Met, L- Ser, L- Thr , L- Asn, L-
  • R 1 is L-Thr
  • R 2 is an amino acid selected from L-Ala, Gly, L-Leu, L-Met and L-Ser.
  • R 1 when R 1 is L-Cys, R 2 is L-Leu or L-Met, and when R 1 is L-Asn, R 2 is L-Ala, L-Leu, L-Met and L- an amino acid selected from Ser, when R 1 is L-Tyr, R 2 is L-Leu or L-Met, when R 1 is L-Lys, R 2 is L-Met, R 1 when is the L-Arg, R 2 is L-Met, R 1 is L-His
  • R 2 when R 1 is L-Asp, R 2 is a dipeptide two amino acid represented by a is) L-M et are linked by peptide bonds, are particularly preferred properly, Formula (I) (However, when R 1 is L-Met, R 2 is an amino acid selected from L-Ala, Gly and L-Cys, and when R 1 is L-Leu, R 2 is L-Ala. And Gly force are also selected amino acids.) Dipeptides in which two amino acids represented
  • Examples of the culture of the microorganism or transformant used as the enzyme source in the production method of the present invention include a culture obtained by culturing the microorganism or transformant by the culture method described above.
  • the treated product of the culture of the microorganism or transformant includes a concentrate of the culture, a dried product of the culture, a cell obtained by centrifuging or filtering the culture,
  • an enzyme source such as a dried product, a freeze-dried product of the cell, a surfactant-treated product of the cell, a solvent-treated product of the cell, an enzyme-treated product of the cell, and an immobilized product of the cell
  • the same amino acid as in the above (1) may be used as one or more amino acids used as a substrate. it can.
  • the amount of the enzyme source varies depending on the specific activity of the enzyme source, etc., but for example, it is 5 to 1000 mg, preferably 10 to 400 mg as wet cell weight per 1 mg of amino acid used as a substrate.
  • the amino acid used as the substrate can be added to the aqueous medium in the same manner as in the above (1).
  • ATP can be present in an aqueous medium and used as an energy source.
  • ATP can be supplied as a powder or as a solution in an aqueous medium for generating and accumulating dipeptides.
  • ATP regeneration activity using a glycolytic system or polyphosphate kinase (ADP generated during dipeptide generation) ATP can also be supplied by adding the activity of converting to ATP) to the aqueous medium.
  • Corvnebacterium ammoniagenes cultivated cells and a carbon source are added [Biosci. Biotechnol. Biochem., 65, 644 (2001)], a method of adding polyphosphate kinase and polyphosphate [J. Biosci. Bioeng., 9 1, 557 (2001)] and the like.
  • the aqueous medium the medium described in (1) above can be used.
  • the culture supernatant of the culture of the microorganism or transformant used as the enzyme source can also be used as the aqueous medium.
  • the reaction conditions for the production reaction of the dipeptide can be the same conditions as in the above (1).
  • the dipeptides produced by the above method the same dipeptides as in the above (1) can be mentioned.
  • a dipeptide produced and accumulated in an aqueous medium is collected by a normal method using activated carbon, ion-exchanged resin, or the like, or an organic solvent. Extraction, crystallization, thin layer chromatography, high performance liquid chromatography and the like.
  • BL00235 gene A gene corresponding to BL00235 gene (hereinafter simply referred to as BL00235 gene) was obtained from 14580 chromosomal DNA as follows.
  • Bacillus licheniformis ATCC14580 was applied to YPGA medium [7 g / l yeast extract (Difco), 7 g / l bactopeptone (Difco), 7 g / l glucose, 1.5 g / l agar]. Then, the cells were statically cultured at 30 ° C. Inoculate 3 ml of YPG medium [7 g / l yeast extract (Difco), 7 g / l bactopeptone (Difco), 7 g / l glucose]] at 30 ° C For 24 hours. Chromosomal DNA was prepared using the cell strength Dneasy Kit (manufactured by Kagen) collected by centrifugation.
  • Primer A is 5 'of the region containing the start codon of BL00235 gene of the chromosomal DNA of Bacillus' Riquefolumis ATCC14580.
  • a base sequence containing a tel recognition sequence is added to the end.
  • Primer B is obtained by adding a base sequence containing an mHI recognition sequence to the 5 ′ end of a base sequence complementary to the DNA sequence containing the N-terminal amino acid sequence of BL002 gene.
  • PCR was performed using the above-mentioned primer A and primer B, and chromosomal DNA of Bacillus licheniformis ATCC14580 as the saddle type.
  • PCR consists of 0.1 ⁇ g of total DNA, 0.5 ⁇ mol / 1 primer, 2 units of KOD plus DNA polymerase (Toyobo), 5 ⁇ L of KOD plus DNA polymerase X 10 buffer (Toyobo) 50 ⁇ L of each reaction solution containing 200 ⁇ mol / 1 dNTP (dATP ⁇ dGTP, dCTP and dTTP), heated at 95 ° C for 135 seconds, and then at 95 ° C for 30 seconds. The process of 45 seconds at 52 ° C and 90 seconds at 68 ° C was repeated 30 times, followed by further heating at 68 ° C for 3 minutes.
  • the base sequence of the DNA was determined by a known method, and it was confirmed that the DNA had the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the Eshierihia 'coli DH5 a strain (Takara Bio Inc.) using the reaction solution, a method using calcium I on [Proc. Natl. Acad. Sci ., USA, 69, 2110 (1972)] transformed with The transformant was spread on an LB agar medium containing 50 g / ml ampicillin and then cultured at 30 ° C. overnight.
  • Escherichia coli BL21 (DE3) strain (manufactured by Novagen) was transformed with PBL00235 by a method using calcium ions, and the transformant was applied to an LB agar medium containing 50 g / ml ampicillin. The cells were cultured at 30 ° C.
  • a plasmid was extracted in accordance with known methods from the colonies of transformants have been grown, by analyzing the structure using a restriction enzyme, it was sure that PBL00235 is held 0
  • the test tube containing 3 ml of LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin was prepared by adding Escherichia coli BL21 (DE3) (Escherichia coli BL21 (DE3) / pBL00235) containing PBL00235 obtained in Example 1. Inoculated and incubated at 37 ° C for 6 hours with shaking. 100 1 of the resulting culture was inoculated into a 500 ml Erlenmeyer flask containing 100 ml of LB medium.
  • IPTG isopropyl mono- ⁇ -D-thiogalatatopyranoside
  • a protein to which a His tag is added using a HisTrap (His-tagged protein purification kit, manufactured by Amersham) from a supernatant obtained by crushing the wet cells by sonication and then centrifuging. was purified.
  • the purified His-tagged protein obtained in Example 2 was 0.5 mg / l, 50 mmol / l Tris-HCl buffer (pH 8.0), 12.5 mmol / l magnesium sulfate, 12.5 mmol / l ATP, 12.5mmol / l Table 1
  • reaction solutions consisting of various L-amino acids or Gly, which combine the amino acids in the leftmost column, were prepared and reacted at 30 ° C for 20 hours. After completion of the reaction, the progress of the reaction was confirmed by quantifying the amount of phosphoric acid liberated in the reaction solution using Detamina I L IP (manufactured by Kyowa Medix).
  • the reaction product is MALDI-TOFMS (Matrix Assisted Laser Deposition / Ionization-Time of Fngnt Mass Spectrometry;
  • the circles in Table 1 indicate that the progress of diphosphopeptide formation reaction was confirmed.
  • the dipeptides listed in Table 1 are dipeptides for which the molecular weight of the reaction product could be identified by MALDI-TOFMS.
  • the protein of the present invention has an activity to form various dipeptides by binding one or two amino acids by peptide bonds.
  • the purified His-tagged protein obtained in Example 2 is 0.5 mg / l, 50 mmol / l Tris-HC1 buffer ( ⁇ 8 ⁇ 0), 12.5 mmol / l magnesium sulfate, 12.5 mmol / l ATP, A reaction solution consisting of two types of L amino acids or Gly described in the first row and the leftmost column of Table 2 at 12.5 mmol / l was prepared and reacted at 30 ° C. for 20 hours. After completion of the reaction, the structure of the dipeptides shown in Table 2 among the reaction products was confirmed by NMR (Nuclear Magnetic Resonance) analysis, and the amount of formation was measured.

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Abstract

　本発明によれば、ジペプチド合成活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換された形質転換体、該形質転換体等を用いたジペプチド合成活性を有する蛋白質の製造法、ジペプチド合成活性を有する蛋白質を用いたジペプチドの製造法、およびジペプチド合成活性を有する蛋白質を生産する形質転換体または微生物の培養物等を酵素源に用いたジペプチドの製造法が提供される。

Description

明 細 書
ジペプチドの製造法
技術分野
[0001] 本発明は、ジペプチドの製造法に関する。
背景技術
[0002] ペプチドの大量合成法につ!ヽては、化学合成法 (液相法、固相法）、酵素的合成 法および DNA組換え法を用いた生物学的合成法が知られている。現在、数十残基 以上の長鎖のペプチドに関しては酵素的合成法あるいは生物学的合成法が主に用 いられ、 2〜数残基の短鎖のペプチドに関しては化学合成法と酵素的合成法が主に 用いられている。
化学合成法による短鎖ペプチドの合成では、官能基の保護'脱保護などの操作が 必要であり、またラセミ体も副生されることから、化学合成法は経済的、効率的な方法 とはいえない。
[0003] 酵素法による短鎖ペプチドの合成に関しては、蛋白質分解酵素（プロテアーゼ)の 逆反応を利用した方法 (非特許文献 1参照)、エステル交換酵素 (特許文献 1〜3、非 特許文献 2)を利用する方法、耐熱性アミノアシル t-RNA合成酵素を利用する方法（ 特許文献 4〜7)、非リボゾームペプチドシンセターゼ（以下、 NRPSと称す)を利用す る方法 (非特許文献 3、 4および特許文献 8、 9参照）が知られている。
[0004] しかし、蛋白質分解酵素の逆反応を利用する方法では、基質となるアミノ酸の官能 基の保護'脱保護が必要であり、ペプチド形成反応の効率化およびペプチド分解反 応の阻止が困難といった問題点がある。エステル交換酵素を利用する方法では、基 質となるアミノ酸のエステルイ匕が必要であり、効率化および基質となるアミノ酸エステ ルと生成したペプチドの分解による収率低下と 、つた問題点がある。耐熱性アミノア シル t-RNA合成酵素を利用する方法には、酵素の発現、目的産物以外の副生反応 の阻止が困難という問題点がある。 NRPSを利用する方法に関しては、酵素分子が巨 大なために DNA組換え法を用いて該酵素を発現することが困難であること、補酵素 である 4' ホスフォパンテティン（4'-phosphopantetheine)の供給が必要であり、効率 的な製造法とはいえない。
[0005] 一方、酵素分子量力NRPSより小さぐ補酵素である 4'—ホスフォパンテティン (4'-ph osphopantetheine)を必要としな 、 y—グルタミルシスティンシンセターゼ（ γ -glutam ylcysteine synthetase)、 D—ァラ -ル一 D—ァラニン（D— Ala— D— Ala)リガーゼ（D— Ala — D-Ala ligase)、ポリ一 γ—グルタミン酸シンセターゼ (poly- γ - glutamate synthetas e)等の一群のペプチドシンセターゼも知られて 、る。これらの酵素の殆どは D-ァミノ 酸を基質に用いる、または γ位のカルボキシル基でのペプチド結合の形成を触媒す る等の特徴を有するため、 L-アミノ酸のひ位カルボキシル基でペプチド結合している 短鎖ペプチドの合成に用いることはできな 、。
[0006] L-アミノ酸の ex位カルボキシル基でのペプチド結合形成を触媒し、ジペプチドを生 成する活性が知られて 、るのはバチルス属に属する微生物由来のジペプチド抗生 物質であるバシリシン合成酵素のみである。バシリシン合成酵素は、バシリシン (L-ァ ラ-ル L-アンチカプシン、 L- Ala— L- anticapsin)及び L-ァラ-ルー L-ァラニン（L- Ala- L-Ala)を合成する活性を有することが知られて 、た (非特許文献 5および 6参 照）が、最近、本酵素は多様な組み合わせの同一または異なる遊離のアミノ酸力 種 々のジペプチドを生成する活性を有することが報告された (特許文献 10、非特許文 献 7参照)。
[0007] し力しながら、上記酵素の基質特異性に起因し、生成効率が十分でな 、ジぺプチ ドもあるため、該酵素とは基質特異性が異なる新たなジペプチド合成酵素が求められ ている。
バチルス ·リケニフォルミス ATCC 14580およびバチルス ·リケニフォルミス DSM13の 染色体 DNAの塩基配列、および遺伝子の推定塩基配列とも公知である（非特許文 献 8参照）。しかしながら、該遺伝子中の BL00235遺伝子および BU04240遺伝子にコ ードされる蛋白質の機能はもちろん、 BL00235遺伝子および BU04240遺伝子が実際 に機能を有する蛋白質をコードする遺伝子である力否力も知られていない。
特許文献 1：国際公開第 2003/010187号パンフレット
特許文献 2：国際公開第 2003/010307号パンフレット
特許文献 3：国際公開第 2003/010189号パンフレット 特許文献 4：特開昭 58-146539号公報
特許文献 5：特開昭 58-209991号公報
特許文献 6：特開昭 58-209992号公報
特許文献 7：特開昭 59-106298号公報
特許文献 8：米国特許第 5795738号
特許文献 9：米国特許第 5652116号
特許文献 10：国際公開第 2004/058960号パンフレット
非特許文献 1 :J. Biol. Chem., 119, 707-720 (1937)
非特許文献 2 : J. BiotechnoL, 115, 211-220 (2005)
非特許文献 3 : Chem. Biol, 7, 373-384 (2000)
非特許文献 4 : FEBS Lett., 498, 42-45 (2001)
非特許文献 5 : J. Ind. Microbiol, 2, 201-208 (1987)
非特許文献 6 : Enzyme Microb. TechnoL, 29, 400-406 (2001)
非特許文献 7 : J. BacterioL, 187, 5195-5202 (2005)
非特許文献 8 : http：〃 gib.genes.nig.ac.jp/single/index.php?spid=Blic— DSM13— NOVO ZYMES
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明の目的は、ジペプチド合成活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードする DN A、該 DNAを含有する組換え体 DNA、該組換え体 DN Aで形質転換された形質転 換体、該形質転換体等を用いたジペプチド合成活性を有する蛋白質の製造法、ジ ペプチド合成活性を有する蛋白質を用いたジペプチドの製造法、およびジペプチド 合成活性を有する蛋白質を生産する形質転換体または微生物の培養物等を酵素源 に用いたジペプチドの製造法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明は、以下の（1)〜（10)に関する。
(1) 以下の [1]〜[3]のいずれかに記載の蛋白質。
[1]配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質 [2]配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換また は付加したアミノ酸配列力もなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
[3]配列番号 1で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
(2) 以下の [1]〜[3]のいずれかに記載の DNA。
[1]上記（1)の蛋白質をコードする DNA
[2]配列番号 2で表される塩基配列を有する DNA
[3]配列番号 2で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有する DNAとストリンジ ントな条件下でハイブリダィズし、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質をコード する DNA
(3) 上記（2)の DNAを含有する組換え体 DNA。
[0010] (4) 上記（3)の組換え体 DNAを有する形質転換体。
(5) 形質転換体が微生物を宿主として得られる形質転換体である、上記 (4)の形 質転換体。
(6) 微牛.物がェシエリヒア（Escherichia)属に属する微牛.物である、上記（5)の形 質転換体。
[0011] (7) 上記（1)の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物 中に該蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する上記（1)の蛋白 質の製造法。
(8) 上記（1)の蛋白質を生産する能力を有する微生物が上記 (4)〜（6)の 、ずれ 力 1つの形質転換体である、上記（7)の製造法。
[0012] (9) 上記（1)の蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物もしくは該培養物 の処理物、または上記（1)の蛋白質と 1種以上のアミノ酸とを水性媒体中に存在せし め、該媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体力 該ジペプチドを採取するジ ペプチドの製造法。
(10) 上記（1)の蛋白質を生産する能力を有する微生物が上記 (4)〜（6)の 、ず れか 1つの形質転換体である、上記（9)の製造法。
発明の効果 [0013] 本発明によりジペプチドを合成する活性を有する蛋白質を製造することができ、該 蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する形質転換体または微生物を用いて ジペプチドを製造することができる。
図面の簡単な説明
[0014] [図 1]プラスミド pBL00235の構築過程を示す図である。
符号の説明
[0015] 図中の BL00235はバチルス ·リケニフォルミス ATCC14580株由来の ^LQQ^遺伝子 、 PIIは T7プロモーター遺伝子、 His-tagはヒスチジンタグ (His-tag)配列を表す。 発明を実施するための最良の形態
[0016] 1.本発明の蛋白質
本発明の蛋白質としては、
[1]配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
[2]配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換また は付加したアミノ酸配列力もなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質、およ び
[3]配列番号 1で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質、
をあげることができる。
[0017] 本明細書におけるジペプチド合成活性とは、 2つのアミノ酸の間にペプチド結合を 形成する活性であり、好ましくはアミノ酸の α位のカルボキシル基と他のアミノ酸のァ ミノ基との間にペプチド結合を形成する活性をいう。
上記において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からな り、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質は、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, し old Spring Harbor Laboratory Press (2001) (以" h、モレキュ ラー.クロー-ング第 3版と略す）、 current Protocols in Molecular Biology, John Wile y & Sons (1987-1997) (以下、カレント 'プロトコ一ルズ'イン'モレキュラ^ ~ ·バイオロジ 一と略す）、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7 9, 6409(1982)、 Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、 Pro c. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用い て、例えば配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする DNAに部 位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
[0018] 欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されな 、が、上記の部位特異 的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、 1個か ら数十個、好ましくは 1〜20個、より好ましくは 1〜： LO個、さらに好ましくは 1〜5個で ある。
配列番号 1で表されるアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付 カロされたとは、同一配列中の任意の位置において、 1または複数のアミノ酸が欠失、 置換または付加されて 、てもよ 、。
[0019] アミノ酸の欠失または付カ卩が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配列番号 1で 表されるアミノ酸配列の N末端側および C末端側の 1〜数個のアミノ酸をあげることが できる。
欠失、置換または付カ卩は同時に生じてもよぐ置換または付加されるアミノ酸は天然 型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、 Lーァラニン、 L—アルギニン、 Lーァスパラギン、 Lーァスパラギン酸、 L グルタミン、 L グルタミン酸、グリシン、 L ヒスチジン、 L—イソロイシン、 L一口イシン、 L—リジン、 L メチォニン、 L—フエ二 ルァラニン、 L—プロリン、 Lーセリン、 Lースレオニン、 L—トリプトファン、 Lーチロシン 、 L—パリン、 L システィンなどがあげられる。
[0020] 以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互 に置換可能である。
A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、ノ リン、ノルパリン、ァラニン、 2-アミノブ タン酸、メチォニン、 0-メチルセリン、 t-ブチルグリシン、 t-ブチルァラニン、シクロへ キシノレァラニン
B群：ァスパラギン酸、グルタミン酸、イソァスパラギン酸、イソグルタミン酸、 2-ァミノ アジピン酸、 2-アミノスべリン酸
C群：ァスパラギン、グルタミン
D群：リジン、アルギニン、オル二チン、 2,4-ジァミノブタン酸、 2,3-ジァミノプロピオ ン酸
E群：プロリン、 3-ヒドロキシプロリン、 4-ヒドロキシプロリン
F群：セリン、スレオニン、ホモセリン
G群：フエ-ルァラニン、チロシン
また、本発明の蛋白質がジペプチド合成活性を有するためには、配列番号 1で表さ れるアミノ酸配列との相同性が 80%以上、好ましくは 90%以上、より好ましくは 95% 以上、さらに好ましくは 98%以上、特に好ましくは 99%以上の相同性を有しているこ とが望ましい。
[0021] アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、 Karlin and Altschulによるアルゴリズム BLAS T[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]や FASTA[Methods EnzymoL, 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズム BLASTに基づいて、 BLAST Nや BLASTXとよばれるプログラムが開発されている [J. Mol. Biol, 215, 403(1990)]。 BLASTに基づ 、て BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例 えば Score = 100、 wordlength= 12とする。また、 BLASTに基づいて BLASTXによって アミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えば score=50、 wordlength=3と する。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフオル トパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http：〃 WW w. ncbi.nlm.nih.gov.)。
[0022] 本発明の蛋白質が、ジペプチド合成活性を有する蛋白質であることを確認する手 段としては、例えば DNA組換え法を用いて本発明の蛋白質を発現する形質転換体 を作製し、該形質転換体を用いて本発明の蛋白質を製造した後、本発明の蛋白質、 1種以上のアミノ酸、好ましくは L-アミノ酸およびグリシン力 選ばれる 2種のアミノ酸、 および ATPを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドが生成、蓄積 する力否かを HPLC等により分析する方法をあげることができる。
2.本発明の DNA
本発明の DNAとしては、
[1]上記 1の [1]〜[3]の本発明の蛋白質をコードする DNA、
[2]配列番号 2で表される塩基配列を有する DNA、および [3]配列番号 2で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有する DNAとストリンジ ントな条件下でハイブリダィズし、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質をコード する DNA、
をあげることができる。
[0023] ここで!/、う「ノ、イブリダィズする」とは、特定の塩基配列を有する DNAまたは該 DNA の一部に DNAがハイブリダィズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を 有する DNAまたは該 DNAの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解 祈のプローブとして有用である力、または PCR解析のオリゴヌクレオチドプライマーと して使用できる長さの DNAであってもよい。プローブとして用いる DNAとしては、 10 0塩基以上、好ましくは 200塩基以上、より好ましくは 500塩基以上の DNAをあげる ことができ、プライマーとして用いる DNAとしては、 17塩基以上、好ましくは 20塩基 以上、より好ましくは 25塩基以上の DNAをあげることができる。
[0024] DNAのハイブリダィゼーシヨン実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー
'クロー-ング第 3版（2001年）、 Methods for General and Molecular Bacteriolgy, AS M Press (1994)、 Immunology methods manual, Academic press(Molecular)に記載の 他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダィゼーシヨンの条件を決定し、実 験を行うことができる。
[0025] 上記のストリンジェントな条件とは、例えば DNAを固定化したフィルターとプローブ DNAとを 50%ホルムアミド、 5 X SSC (750mMの塩化ナトリウム、 75mMのクェン酸ナト リウム）、 50mMのリン酸ナトリウム（pH7.6)、 5 Xデンハルト溶液、 10%の硫酸デキスト ラン、および g/1の変性させたサケ精子 DNAを含む溶液中で 42°Cでー晚、イン キュペートした後、例えば約 65°Cの 0.2 X SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件 をあげることができる。ストリンジェントな条件は、プローブ DNAの鎖長の長さや GC 含量に応じて調整が可能であり、モレキュラー 'クローユング第 3版等に記載の方法 により設定することができる。また、より低いストリンジェント条件を用いることもできるが 、ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整 (ホルムアミドの濃度を下げ るほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低 ストリンジヱント条件としては、例ぇば6 X SSCE (20 X SSCEは、 3mol/lの塩化ナトリウム 、 0.2mol/lのリン酸二水素ナトリウム、 0.02mol/lの EDTA、 pH7.4)、 0.5%の SDS、 30% のホルムアミド、 100 g/1の変性させたサケ精子 DN Aを含む溶液中で、 37°Cでー晚 インキュベートした後、 50°Cの 1 X SSC、 0.1%SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげ ることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジ ェント条件にぉ 、てハイブリダィゼーシヨンを行った後、高塩濃度 (例えば 5 X SSC)の 溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。
[0026] 上記した様々な条件は、ノ、イブリダィゼーシヨン実験のバックグラウンドを抑えるた めに用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。 上記したブロッキング試薬の添カ卩は、条件を適合させるために、ハイブリダィゼーショ ン条件の変更を伴ってもょ 、。
上記したストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズ可能な DNAとしては、例えば上 記した BLASTおよび FASTA等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づ ヽて計 算したときに、配列番号 2で表される塩基配列と少なくとも 80%以上、好ましくは 90% 以上、より好ましくは 95%以上、さらに好ましくは 98%以上、特に好ましくは 99%以 上の相同性を有する DNAをあげることができる。
[0027] 塩基配列の相同性は、上記した BLASTまたは FASTA等のプログラムを用いて決定 することができる。
上記した DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNA力 ジペプチド の合成活性を有する蛋白質をコードする DNAであることは、該 DNAを発現する組 換え体 DNAを作製し、該組換え体 DNAを宿主細胞に導入して得られる微生物を培 養して得られる培養物力 該蛋白質を精製し、該精製蛋白質を酵素源に用いて、該 酵素源、並びに 1種以上のアミノ酸、好ましくは L-アミノ酸およびグリシン力 選ばれ る 2種のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドが生成、蓄 積する力否かを HPLC等により分析する方法によって確認することができる。
3.本発明の製造法に用いられる微生物および形質転換体
本発明の製造法に用いられる微生物および形質転換体としては、本発明の蛋白質 を生産する能力を有する微生物および形質転換体であれば特に限定されないが、 該微生物としては、好ましくはバチルス (Bacillus_)属に属する微生物、好ましくはバチ ルス ·リケ-フオルミス (Bacillsu licheniformis)に属する微生物、より好ましくは Bacillus licheniformis ATCC14580または M licheniformis DSM13をあげることができ、該 形質転換体としては、本発明の蛋白質をコードする DNAで形質転換された形質転 換体をあげることができる。なお、 Bacillus licheniformis ATCC14580は米国の生物資 源セング ~~である American Type Culture Collection^ Bacillus licheniformis DSM13iま ドイツの生物資源保存機関である Deutche Sammulung von Mikroorganismeu und Zell kulturen GmbHから入手可能である。
[0028] 本発明の蛋白質をコードする DNAで形質転換された形質転換体としては、上記2 の DNAを含む組換え体 DNAを用い、宿主細胞を公知の方法で形質転換して得ら れる形質転換体をあげることができ、宿主細胞としては、細菌などの原核細胞、酵母 、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞、好ましくは細菌などの原核細胞、より好まし くは細菌、さらに好ましくは Escherichia属に属する微牛.物をあげるこ ができる。
4.本発明の DN Aの調製
本発明の DNAは、例えば、配列番号 2で表される塩基配列に基づき設計すること ができるプローブを用いた、バチルス (Ml )属に属する微生物、好ましくはバチ ルス ·リケ-フオルミス (Bacillsu licheniformis)に属する微生物、より好ましくは Bacillus licheniformis ATCC14580または Easfc licheniformis DSM13の染色体 DNAライブラ リーに対するサザンノ、イブリダィゼーシヨン、または配列番号 2で表される塩基配列に 基づき設計することができるプライマー DNAを用いた、微生物、好ましくは 属 に属する微生物、より好ましくは Bacillus licheniformisに属する微生物、さらに好ましく は Bacillus licheniformis ATCC 14580または^ dll licheniformis DSM13の染色体 D NAを铸型とした PCR[PCR Protocols, Academic Press (1990)]により取得することが できる。
[0029] また、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号 1で表されるアミノ酸配列 をコードする DNAの塩基配列と 80%以上、好ましくは 90%以上、より好ましくは 95 %以上、さらに好ましくは 98%以上、特に好ましくは 99%以上の相同性を有する配 列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物 の染色体 DNA、 cDNAライブラリ一等から上記した方法により本発明の DNA、また は本発明の製造法に用いられる DNAを取得することもできる。
[0030] 取得した DNAをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりべク ターに組み込み、得られた組換え体 DNAを宿主細胞に導入した後、通常用いられ る塩基配列解析方法、例えばジデォキシ法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 ( 1977)]あるいは Applied Biosystems 3700 DNA Analyzer (アプライド 'バイオシステム 社製)等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該 DNAの塩基配列を決 定することができる。
[0031] 塩基配列を決定した結果、取得された DNAが部分長であった場合は、該部分長 D NAをプローブに用いた、染色体 DNAライブラリーに対するサザンハイブリダィゼー シヨン法等により、全長 DNAを取得することができる。
更に、決定された DNAの塩基配列に基づいて、パーセプティブ'バイオシステムズ 社製 8905型 DNA合成装置等を用いて化学合成することにより目的とする DNAを調 製することちでさる。
[0032] 上記のようにして取得される DNAとして、例えば、配列番号 2で表される塩基配列 を有する DNAをあげることができる。
本発明の DNAを組み込むベクターとしては、 pBluescriptll KS(+) (ストラタジーン社 製）、 pDIRECT[Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)]、 pCR- Script Amp SK(+) (ストラ タジーン社製）、 pT7Blue (ノバジェン社製）、 pCR II (インビトロジェン社製）および pCR -TRAP (ジーンノヽンター社製)などをあげることができる。
[0033] 宿主細胞としては、ェシエリヒア属に属する微生物などをあげることができる。ェシ工 リヒア属に属する微生物としては、例えば、ェシエリヒア 'コリ（Escherichia coli) XL1- B lueゝェシエリヒア'コリ XL2— Blueゝェシエリヒア'コリ DH1、ェシエリヒア'コリ MC1000、 ェシエリヒア'コリ ATCC 12435、ェシエリヒア'コリ W1485、ェシエリヒア'コリ JM109、 ェシエリヒア'コリ HB101、ェシエリヒア'コリ No.49、ェシエリヒア'コリ W3110、ェシエリ ヒア'コリ NY49、ェシエリヒア'コリ MP347、ェシエリヒア'コリ NM522、ェシエリヒア'コリ BL21、ェシエリヒア'コリ ME8415等をあげることができる。
[0034] 組換え体 DNAの導入方法としては、上記宿主細胞へ DNAを導入する方法であれ ばいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法 [Proc. Natl. Ac ad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭 63- 248394)、エレクトロボレ ーシヨン法 [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
上記方法によって得られる本発明の形質転換体としては、例えば配列番号 2で表さ れる配列を有する DNAを含有する組換え体 DNAを保有する微生物であるェシエリ ヒア 'コリ BL21/pBL00235をあげることができる。
5.本発明の製造法に用いられる形質転換体および微生物の製造法
本発明の DNAをもとにして、必要に応じて、本発明の蛋白質をコードする部分を含 む適当な長さの DNA断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列 を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の 生産率が向上した形質転換体を取得することができる。
[0035] 該 DNA断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、 組換え体 DNAを作製する。
該組換え体 DNAを、該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することにより、本 発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等、目的とする 遺伝子を発現できるものであれば 、ずれも用いることができる。
[0036] 発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中へ の組込が可能で、本発明の DNAを転写できる位置にプロモーターを含有して 、るも のが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明の DNAを有する組換 え体 DNAは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソ一 ム結合配列、本発明の DNA、転写終結配列より構成された組換え体 DNAであるこ とが好ま ヽ。プロモーターを制御する遺伝子が含まれて!/ヽてもよ!/、。
[0037] 発現ベクターとしては、 pBTrp2、 pBTacl、 pBTac2 (いずれもベーリンガーマンハイ ム社製）、 pHelixl (ロシュ'ダイァグノステイタス社製）、 pKK233-2 (アマシャム'ファノレ マシア'バイオテク社製）、 pSE280 (インビトロジェン社製）、 pGEMEX-Ι (プロメガ社製 )、 pQE-8 (キアゲン社製）、 pET-3 (ノバジェン社製）、 pKYPIO (特開昭 58- 110600)、 p KYP200[Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)]、 pLSAl[Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1 989)]、 pGELl[Proc. Natl. Acad. Sci" USA, 82, 4306 (1985)]、 pBluescriptll SK(+)、 p Bluescript II KS (-) (ストラタジーン社製）、 pTrS30 [ェシエリヒア'コリ JM109/pTrS30(F ERM BP- 5407)より調製]、 pTrS32 [ェシエリヒア'コリ JM109/pTrS32(FERM BP- 5408) より調製]、 pPAC31 (W098/12343), pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)]、 pSTV28(宝酒造 社製)、 pUC118 (宝酒造社製）、 pPAl (特開昭 63-233798)等をあげることができる。
[0038] プロモーターとしては、エシ リヒア 'コリ等の宿主細胞中で機能するものであれば V、かなるものでもよ!/ヽ。例えば、 imプロモーター（P )、 プロモーター（P ；)、 Pプ
trp iac L 口モーター、 pプロモーター、 p プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来する
R SE
プロモーター、 SPOlプロモーター、 SP02プロモーター、 penPプロモーター等をあ げることができる。また P を 2つ直列させたプロモーター、 ^プロモーター、 lacT7プ
trp
口モーター、 let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用 いることがでさる。
[0039] さらにバチルス属に属する微生物中で発現させるための xylAプロモーター [Appl.
Microbiol. Biotechnol., 35, 594-599 (1991)]ゃコリネバクテリゥム（^001§^&£1§0121) 属に属する微生物中で発現させるための P54-6プロモーター [Appl. Microbiol. Biote chnol, 53, 674-679 (2000)]なども用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン一ダルガノ（Shine-Dalgarno)配列と開始コドンと の間を適当な距離 (例えば 6〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ま 、。
[0040] 本発明の DNAを発現ベクターに結合させた組換え体 DNAにおいては、転写終結 配列は必ずしも必要ではな 、が、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置すること が好ましい。
このような糸且換え体 DNAとしては、例えば pBL00235をあげることができる。 原核生物としては、ェシエリヒア属、セラチア（Serratia)属、バチルス属、ブレビバタ テリゥム（Brevibacterium)属、コリネパクテリゥム（Corvnebacterium)属、ミクロバタテリ ゥム属 (Microbacterium)、シユードモナス (Pseudomonas)属、ァグロノくクテリゥム (Agr obacterium)属、アリシクロノくチノレス属 (Alicvclobacillus)、アナべナ (Anabena)属、ァ ナシスティス (Anacvstis)属、ァスロバクタ一 (Arthrobacter)属、ァゾトパクター (Azoto bactei;)属、クロマチゥム（Chromatium.)属、ェルビ-ァ（Erwinia.)属、メチロバクテリウ ム (Methvlobacterium)属、フォノレミディゥム (Phormidium)属、口ドノくクタ一 (Rhodobact §1)属、ロドシユードモナス（Rhodopseudomonas)属、ロドスピリゥム（Rhodospirillum)属 、セネデスムス (Scenedesmus)属、ストレプトマイセス（Streptomvces)属、シネコッカス (Svnechoccus)属、ザィモモナス (Zvmomonas)属等に属する微生物、例えば、エシ リヒア.コリ XL1— Blueゝェシエリヒア'コリ XL2— Blueゝェシエリヒア'コリ DH1、ェシエリヒア 'コリ DH5 a、ェシエリヒア'コリ MC1000、ェシエリヒア'コリ KY3276、ェシエリヒア'コリ W1485、ェシエリヒア'コリ JM109、ェシエリヒア'コリ HB101、ェシエリヒア'コリ No.49、 ェシエリヒア'コリ W3110、ェシエリヒア'コリ NY49、ェシエリヒア'コリ MP347、ェシエリ ヒア'コリ NM522、ェシエリヒア'コリ BL21、バチルス ·サチリス（Bacillus subtilis) ATC C33712、バチルス ·メガテリゥム（Batillus megaterium)、ブレビバクテリウム.ァンモ二 ァゲネス (Brevibacterium ammoniagenes)、ブレビノ クテリゥム.イマリオフイノレム (Brevi bacterium immariophilum) ATCC14068、ブレビパクテリゥム ·サッカロリティカム（Brevi bacterium saccharolvticum) ATCC14066、ブレビパクテリゥム ·フラノくム（Brevibacteri um flavum) ATCC14067,ブレビバクテリウム*ラクトフアーメンタム（Brevibacterium lac tofermentum) ATCC13869、コリネパクテリゥム ·グルタミカム（Corvnebacterium eluta micum) ATCC13032、コリネバタテリゥム 'グルタミカム ATCC 14297、コリネバクテリウ ム ·ァセトァシドフィルム（Corvnebacterium acetoacidophilum) ATCC13870.ミクロノくク テリゥム ·アンモニアフィルム（Microbacterium ammoniaphilum) ATCC15354、セラチ ァ ·フィカリア (Serratia ficaria)、セラチア ·フォンチコラ (Serratia fonticola)、セラチア · リケファシエンス (Serratia liauefaciens)、セラチア ·マノレセッセンス (Serratia marcesce ns)、シユードモナス ·エスピー（Pseudomonas sp.) D-0110、ァグロバタテリゥム 'ラジ オノくクタ一 (Aerobacterium radiobacter)、ァグロノくクテリゥム ·リゾジーンズ (Agrobact enum rhizogenes)、 /'グロノヽク "7 "リウム ·ノレヒ (Aerobacterium rubi)、 /ナベナ.ンリン ドリ力 (Anabaena cvlindrica)、アナべナ ·ドリオルム (Anabaena doliolum)、アナべナ · フロスアクア（Anabaena flos-aauae)、アースロノくクタ一 ·オーレッセンス (Arthrobacter aurescens)、アースロノくクタ一 ·シトレウス (Arthrobacter citreus)、アースロノくクタ一 · グロプフォルミス（Arthrobacter globformis)、アースロバクタ一'ヒドロカーボグルタミ力 ス (ArthroDacter nvdrocarboglutamicus) ^ 1 ~~スロノくクタ1 ~~ ·ミソレンス (Arthrobacter mvsorens)、アースロノくクタ一 ·ニコチアナ (Arthrobacter nicotianae)、アースロノくクタ 一 ·パラフイネウス (Arthrobacter paraffineus)、アースロバクタ一 ·プロトフオルミエ (Art hrobacter protophormiae、 "7 ~~スロノ グタ1 ~~ ·ロセオノ、フスイナス (Arthrobacter rose oparaffinus)ゝアースロバクタ一'スルフレウス (Arthrobacter sullureus)ゝアースロバク ター ·ウレァファシエンス (Arthrobacter ureafaciens)、クロマチゥム ·ブデリ (Chromatiu rn buderi)、クロマチゥム ·テピダム (Chromatium tepidum)、クロマチゥム ·ビノサム（£ romatium vinosum)、クロマテゥム ·ヮ ~~ミン3 r (し hromatium warmingn 、クロマテゥム · フノレビアタティレ (Chromatium fluviatile)、エノレビニァ ·ウレドノくラ (Erwinia uredovora) 、エノレビ-ァ '力ロトノ ラ (Erwinia carotovora)、エノレビ-ァ ·ァナス (Erwinia ananas)、 エノレビニァ ·ヘリコラ (Erwinia herbicola)、エノレビニァ ·ノ ンクタタ (Erwinia punctata)、 エノレビニァ ·テレウス（Erwinia terreus)、メチロバクテリウム'口デシァナム（Methylobac terium rhodesianum)、メチロノ クテリゥム ·ェクソトノレクエンス (Methvlobacterium extor auens)、フオルミディウム.エスピー（Phormidium sp.) ATCC29409,ロドパクタ^ ~ ·力 プスラタス (Rhodobacter capsulatus)、口ドノくクタ一'スフエロイデス (Rhodobacter spha eroides)、ロトンュ1 ~~ rモナス'フフステカ (Rhodopseudomonas blastica)、口卜ンュ1 ~~ト モナス ·マリナ (Rhodopseudomonas marina)、ロドシユードモナス ·ノ レストリス (Rhodo pseuQomonas palustns 、口 スピリウム，リブフム (Rhodospinllum rubrum)、口トスピリ ゥム ·サレキシゲンス (Rhodospirillum salexieens)、ロドスピリゥム ·サリナラム (Rhodospi rillum salinarum 、ストレフ卜マイセス · Zンホファンエンス (Streptomvces ambofaciens )、ストレプトマイセス ·オーレオファシエンス (Streptomvces aureofaciens) 、ストレプト マイセス ·ァゥレウス (Streptomvces aureus)、ストレプトマイセス 'フンジシディカス（Sir eptomvces fungicidicus)、ストレプトマイセス ·グリセォクロモケナス (Streptomvces gns eochromogenes)、ストレフ。トマ^ fでス ·グリセウス (Streptomvces gnseus 、ストレフトマ イセス 'リビダンス (Streptomvces lividans)、ストレプトマイセス 'オリボグリセウス (Strept omvces olivognseus)、ストレフ。トマィセス ·フメウス (Streptomvces rameus 、ストレフ。ト マイセス ·タナシェンシス (Streptomvces tanashiensis)、ストレプトマイセス ·ビナセウス (Streptomvces vinaceus)、ザィモモナス ·モビリス、ん vmomonas mobilis)等をあけるこ とがでさる。 [0041] 組換え体 DNAの導入方法としては、上記宿主細胞へ DNAを導入する方法であれ ばいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法 [Proc. Natl. Ac ad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭 63- 248394)、エレクトロボレ ーシヨン法 [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 YEpl3 (ATC C37115)、 YEp24 (ATCC37051)、 YCp50 (ATCC37419)、 pHS19、 pHS15等を用いる ことができる。
[0042] プロモーターとしては、酵母中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく 、例えば、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモー ター、 gallプロモーター、 gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター 、 MF a 1プロモーター、 CUP 1プロモーター等のプロモーターをあげることができる。 酵母としては、サッカロマイセス（Saccharomvces)属、シゾサッカロマイセス（Schizos accharomvces)晨、クルィベロマ セス (Kluweromvces)属、トリコスホロン (Tnchospor )属、シヮ-ォマイミセス（Schwanniomvces)属、ピチア（Pichia)属、またはキャンデ イダ (C dida)属等に属する酵母をあげることができ、具体的には、サッカロマイセス' セレビシェ (Saccharomvces cerevisiae)、シンサッカロマイセス ·ポンべ (Schizosacchar omvces pombe)、クノレ ベロマイセス ·フクティス (Kluweromvces lactis 、トリコスホ口 ン ·プノレランス (Trichosporon pullulans)、シヮニ才マイセス ·ァノレビウス (Schwanniomv ces alluvius)、ピチア ·パストリス (Pichia pastoris)、キャンディダ ·ウテイリス (Candida u tilk)等をあげることができる。
[0043] 組換え体 DNAの導入方法としては、酵母に DNAを導入する方法であればいずれ も用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [Methods EnzymoL, 194, 182 ( 1990)]、スフエロプラスト法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)]、酢酸リチ ゥム法 [J. BacterioL, 153, 163 (1983)]等をあげることができる。
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 pcDNAI 、 pcDM8 (フナコシ社より市販）、 pAGE107 (特開平 3- 22979)、 pAS3- 3 (特開平 2- 227 075)、 pCDM8[Nature, 329, 840 (1987)]、 pcDNAI/Amp (インビトロジェン社製）、 pRE P4 (インビトロジェン社製）、 pAGE103[J. Biochem, 101, 1307 (1987)]、 pAGE210、 pA Mo、 pAMoA等を用いることができる。
[0044] プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることが でき、例えば、サイトメガロウィルス（CMV)の IE (immediate early)遺伝子のプロモータ 一、 SV40の初期プロモーターあるいはメタ口チォネインのプロモーター、レトロウイノレ スのプロモーター、ヒートショックプロモーター、 SR aプロモーター等をあげることがで きる。また、ヒト CMVの IE遺伝子のェンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
[0045] 動物細胞としては、マウス'ミエローマ細胞、ラット 'ミエローマ細胞、マウス'ハイブリ ドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa)細胞またはナマルバ KJM-1細胞、 ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ 'ハム スターの細胞である CHO細胞、 HBT5637 (特開昭 63-299)等をあげることができる。 マウス ·ミエローマ細胞としては、 SP2/0、 NSO等、ラット 'ミエローマ細胞としては YB2 /0等、ヒト胎児腎臓細胞としては HEK293(ATCC CRL-1573)、ヒト白血病細胞として は BALL-1等、アフリカミドリザル腎臓細胞としては COS-l、 COS-7等をあげることが できる。
[0046] 組換え体 DNAの導入方法としては、動物細胞に DNAを導入する方法であればい ずれも用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [Cytotechnology, 3, 133 ( 1990)]、リン酸カルシウム法（特開平 2-227075)、リポフエクシヨン法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)]、 Virology, 52, 456 (1973)に記載の方法等をあげること ができる。
[0047] 昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、例えば Baculovirus Expression Vector s, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and company, New York (1992)、カレント · プロトコーノレズ ·イン 'モレキュラー.ノィォロジ一、 Molecular Biology, A Laboratory Manual, Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、蛋白質を生産 することができる。
[0048] 即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウィルスを昆虫細胞に共導入して 昆虫細胞培養上清中に組換えウィルスを得た後、さらに組換えウィルスを昆虫細胞 に感染させ、蛋白質を生産させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、 pVL1392、 pVLl 393、 pBlueBacIII (V、ずれもインビトロジェン社製）等をあげることができる。
[0049] バキュロウィルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスであるアウトグ ラファ 'カリフオル-力'ヌクレア一'ポリへドロシス'ウィルス (Autographa californica nu clear polyhedrosis virus;等を用 ヽること »でさ 。
昆虫細胞としては、スポドプテラ ·フルギベルダ (Spodoptera frugiperda)の卵巣細胞 、トリコプルシア ·二 (Trichoplusiani)の卵巢細朐、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用 いることがでさる。
[0050] スポドプテラ ·フルギベルダの卵巣細胞としては S19、 S1 1 (バキュロウィルス'イクスプ レツシヨン'ベクターズァ 'ラボラトリー 'マ-ユアル)等、トリコプルシア '二の卵巣細胞 としては High 5、 ΒΤΙ-ΤΝ-5Β1-4 (インビトロジェン社製)等、カイコ卵巣由来の培養細 胞としてはボンビクス'モリ (Bombvx mori) N4等をあげることができる。
組換えウィルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクター と上記バキュロウィルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法 (特開平 2 -227075)、リポフエクシヨン法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)]等をあげ ることがでさる。
[0051] 植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 Tiプラス ミド、タバコモザイクウィルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いて もよぐ例えば、カリフラワーモザイクウィルス（CaMV)の 35Sプロモーター、ィネアクチ ン 1プロモーター等をあげることができる。
[0052] 植物細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファ ルファ、イネ、コムギ、ォォムギ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞に DNAを導入する方法であれば ヽ ずれも用いることができ、例えば、ァグロパクテリゥム (Agrobacterium)を用いる方法 ( 特開昭 59-140885、特開昭 60-70080、 WO94/00977)、エレクト口ポレーシヨン法（特 開昭 60-251887)、パーティクルガン (遺伝子銃）を用いる方法 (特許第 2606856、特 許第 2517813)等をあげることができる。
6.本発明の蛋白質の製造法 上記 5の方法で得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明の蛋白質 を生成、蓄積させ、該培養物から採取することにより、該蛋白質を製造することができ る。
[0053] 本発明の蛋白質を製造するための上記形質転換体の宿主としては、細菌、酵母、 動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等いずれであってもよいが、好ましくは細菌、より 好ましくはェシエリヒア属に属する微生物、さらに好ましくはェシエリヒア 'コリに属する 微生物をあげることができる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞を用いて本発明の蛋白質を発現させた 場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
[0054] 上記形質転換体を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の 方法に従って行うことができる。
ェシエリヒア'コリ等の原核生物あるいは酵母を宿主細胞として得られた形質転換体 を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有 し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいず れを用いてもよい。
[0055] 炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよぐグルコース、フラクトース、 スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水 化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類 等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、酢酸アンモ- ゥム、リン酸アンモ-ゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモ-ゥム塩、その他の含窒 素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼィ ン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化 物等を用いることができる。
[0056] 無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸 マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム 等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養 温度は 15〜40°Cがよぐ培養時間は、通常 5時間〜 7日間である。培養中 pHは 3.0〜9 .0に保持する。 pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシ ゥム、アンモニア等を用いて行う。
[0057] また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に 添カロしてちょい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微 生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例 えば、 1 ^プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するとき にはイソプロピル一 β—D—チォガラタトピラノシド等を、 imプロモーターを用いた発 現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地 に添カ卩してもよい。
[0058] 動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に 使用されている RPMI1640培地 [J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)]、イーグル（Eag le)の MEM培地 [Science, 122, 501 (1952)]、 DMEM培地 [Virology, 8, 396 (1959)]、 19 9培地 [Proc. Soc. Biol. Med., 73, 1 (1950)]またはこれら培地に牛胎児血清等を添カロ した培地等を用いることができる。
[0059] 培養は、通常 pH6〜8、 25〜40°C、 5%CO存在下等の条件下で 1〜7日間行う。
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また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生 物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に 使用されている TNM-FH培地 (ファーミンジェン社製)、 Sf-900 II SFM培地（ライフ'テ クノロジーズ社製）、 ExCell400、 ExCell405 [いずれも JRHバイオサイエンシーズ社製] 、 Grace's Insect Medium[Nature, 195, 788 (1962)]等を用いることができる。
[0060] 培養は、通常 pH6〜7、 25〜30°C等の条件下で 1〜5日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい 植物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞 や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、 一般に使用されているムラシゲ'アンド'スターグ (MS)培地、ホワイト (White)培地、また はこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添カ卩した培地等を用 いることがでさる。
[0061] 培養は、通常 pH5〜9、 20〜40°Cの条件下で 3〜60日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地 に添カ卩してもよい。
本発明の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外 に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、選択した方 法に応じて、生産させる蛋白質の構造を変えることができる。
[0062] 本発明の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポー ルソンらの方法 [J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)]、ロウらの方法 [Proc. Natl. Acad. Sci" USA, 86, 8227 (1989)、 Genes Develop., 4, 1288 (1990)]、または特開平 05- 336 963、 WO94/23021等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細胞外に 積極的に分泌させることができる。
[0063] すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の蛋白質の活性部位を含む蛋 白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で生産させることにより、該蛋白質を宿 主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平 2-227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝 子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
[0064] さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分ィ匕させることにより、遺伝子 が導入された動物個体 (トランスジエニック非ヒト動物)または植物個体 (トランスジェ- ック植物）を造成し、これらの個体を用いて本発明の蛋白質を製造することもできる。 本発明の蛋白質を生産する形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通 常の方法に従って、飼育または栽培し、該蛋白質を生成蓄積させ、該動物個体また は植物個体より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
[0065] 動物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば公知の方法 [A m. J. Clin. Nutr., 63, 639S (1996)、 Am. J. Clin. Nutr., 63, 627S (1996)、 Bio/Techno logy, 9, 830 (1991)]に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に本発明の蛋白質を 生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、本発明の DNAを導入したトランスジエニック非ヒト動 物を飼育し、本発明の蛋白質を該動物中に生成、蓄積させ、該動物中より該蛋白質 を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。該動物中の該蛋白質を生 成、蓄積させる場所としては、例えば、該動物のミルク (特開昭 63-309192)、卵等を あげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で機能するもの であればいずれも用いることができる力 例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターで ある exカゼインプロモーター、 13カゼインプロモーター、 j8ラクトグロブリンプロモータ 一、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
[0066] 植物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば本発明の蛋白 質をコードする DNAを導入したトランスジエニック植物を公知の方法 [組織培養， 20 ( 1994)、組織培養， 21 (1995)、 Trends BiotechnoL, 15, 45 (1997)]に準じて栽培し、該 蛋白質を該植物中に生成、蓄積させ、該植物中より該蛋白質を採取することにより、 該蛋白質を生産する方法があげられる。
[0067] 本発明の蛋白質を生産する形質転換体を用いて製造された本発明の蛋白質を単 離、精製する方法としては、通常の酵素の単離、精製法を用いることができる。
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で生産された場合には、培養終了 後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレン チプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞 抽出液を得る。
[0068] 該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精 製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジ ェチルアミノエチル（DEAE)—セファロース等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグ ラフィ一法、 Q- Sepharose FF (アマシャムバイオサイエンス社製)等のレジンを用いた 陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フエ-ルセファロース等のレ ジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、ァフィ二ティ 一クロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法 等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。 [0069] また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して生産された場合は、同様に細胞を回 収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋 白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶ィ匕する。
該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まな ヽあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質 が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構 造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
[0070] 本発明の蛋白質またはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には 、培養上清に該蛋白質またはその糖付加体等の誘導体を回収することができる。 即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性 画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精 製標品を得ることができる。
[0071] このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号 1で表されるアミノ酸配列 力 なる蛋白質をあげることができる。
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白 質に親和性をもつ物質を用いたァフィユティークロマトグラフィーを利用して精製する こともできる。例えば、ロウらの方法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、 G enes Develop., 4, 1288 (1990)]、特開平 5-336963、 WO94/23021に記載の方法に準 じて、本発明の蛋白質をプロテイン Aとの融合タンパク質として生産し、ィムノグロプリ ン Gを用いるァフィユティークロマトグラフィーにより精製することができる。
[0072] また、本発明の蛋白質を Flagペプチドとの融合蛋白質として生産し、抗 Flag抗体を 用いるァフィユティークロマトグラフィー [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989 )、 Genes Develop., 4, 1288 (1990)]や、ポリヒスチジンとの融合蛋白質として生産し、 ポリヒスチジンと高親和性を有する金属配位レジンを用いるァフィユティークロマトダラ フィ一によつて精製することもできる。更に、該蛋白質自身に対する抗体を用いたァ フィ-ティークロマトグラフィーで精製することもできる。
[0073] 上記で取得された蛋白質のアミノ酸配列情報を基に、 Fmoc法 (フルォレニルメチ ルォキシカルボ-ル法）、 tBoc法（t ブチルォキシカルボ-ル法）等の化学合成法 により、本発明の蛋白質を製造することができる。また、 Advanced ChemTech社、ノ ~"キン，エルマ■ ~"社、 Pharmacia社、 Protein Technology Instrument社、 Synthecell-Ve ga社、 PerS印 tive社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することも できる。
7.本発明のジペプチドの製造法
上記 3の微生物または形質転換体の培養物もしくは該培養物の処理物または上記 1の本発明の蛋白質と、 1種以上のアミノ酸とを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中 にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体力 該ジペプチドを採取することにより、ジぺ プチドを製造することができる。
(1)本発明の蛋白質を酵素源として用いるジペプチドの製造法
本発明の製造法において、酵素源として本発明の蛋白質を用いる場合、基質に用 いられる 1種以上のアミノ酸、好ましくは 1または 2種のアミノ酸としては、アミノ酸、好ま しくは L-アミノ酸、 Glyおよび |8—ァラニン（j8 -Ala)力もなる群より選ばれるアミノ酸で あれば、いずれのアミノ酸をいずれの組み合わせで用いてもよい。 L アミノ酸として は、例えば L- Alaゝ L-Gln, L- Gluゝ L- Val、 L-Leu, L- Ile、 L- Pro、 L- Pheゝ L- Trpゝ L-M et、 L— Ser、 L— Thr、 L— Cys、 L— Asn、 L— Tyr、 L— Lys、 L— Arg、 L— His、 L— Asp、 L— a— ami nobutylate (L- - AB)、 L- Azaserine、 L- theanine、 L- 4- hydroxyproline (L- 4- HYP) 、 L- 3- hydroxyproline (L- 3- HYP)、 L-Ornitine (L- Orn)、 L-Citrulline (L-Cit)および L— 6— diazo— 5— oxo— norleucineなどをあげることができる。
上記製造法に用いられる、より好ま U、アミノ酸としては、 L-Ala、 L-Gln、 L-Glu、 Gly 、 L— Val、 L-Leu, L— lieゝ L— Pro、 L— Phe、 L— Trp、 L— Metゝ L— Ser、 L— Thr、 L— Cys、 L— As n、 L-Tyr、 L- Lys、 L-Arg、 L- His、 L-Aspおよび j8 -Alaから選ばれる 1種または 2種の アミノ酸、さらに好ましいアミノ酸としては、 L- Alaと L- Phe、 L- Trp、 L- Met、 L- Thr、 L- Asn、 L- Leuおよび L- lieから選ばれる 1種のアミノ酸との組み合わせ、 L- Ginと L- Met および L-Leuから選ばれる 1種のアミノ酸との組み合わせ、 L-Gluと L-Metとの組み合 わせ、 Glyと L-Met、 L-Thrおよび L-Leuから選ばれる 1種のアミノ酸との組み合わせ、 L-Valと L- Metおよび L-Serから選ばれる 1種のアミノ酸との組み合わせ、 L-Leuと L-Pr o、 L- Phe、 L-Met, L-Ser, L-Thr, L- Cys、 L- Asnおよび L- Tyrから選ばれる 1種のァ ミノ酸との組み合わせ、 L-Ileと L-Metおよび L-Serから選ばれる 1種のアミノ酸との組 み合わせ、 L- Proと L- Metとの組み合わせ、 L- Pheと L- Trpおよび L- Metから選ばれる 1種のアミノ酸との組み合わせ、 L-Trpと L-Trpおよび L-Metから選ばれる 1種のアミノ 酸との組み合わせ、 L- Metと L- Met、 L- Ser、 L- Thr、 L- Cys、 L- Asn、 L- Tyr、 L- Lys、 L- Arg、 L- Hisおよび L- Aspから選ばれる 1種のアミノ酸との組み合わせ、 L- Serと L- Se r、 L-Thrおよび L-Asn力も選ばれる 1種のアミノ酸との組み合わせ、より好ましくは L- Metと L- Ala、 Glyおよび L-Cysから選ばれる 1種のアミノ酸との組み合わせ、 L- Leuと L -Alaおよび Gly力 選ばれる 1種のアミノ酸との組み合わせをあげることができる。
[0075] 上記製造法において、本発明の蛋白質は、基質として用いるアミノ酸 lmgあたり 0.01 〜100mg、好ましくは 0.1mg〜10mg添カ卩する。
上記製造法において、基質として用いるアミノ酸は、 0.1〜500g/L、好ましくは 0.2〜 200g/Lの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中に添加する。
上記製造法において、エネルギー源として ATPを用いることができ、 ATPは、 0.5m mol〜10mol/Lの濃度で用いることが好ましい。 ATPはジペプチドを生成、蓄積させ る水性媒体に粉末のまま、あるいは溶液として供給することができるが、例えば解糖 系やポリリン酸キナーゼなどを利用した ATP再生活性 (ジペプチド生成の際に生じる ADPを ATPに変換する活性)を該水性媒体に加えることで ATPを供給することもで きる。具体的には、 Corvnebacterium ammoniagenesの培着菌体 炭素源を添加する 方法 [Biosci. Biotechnol. Biochem., 65, 644(2001)]、ポリリン酸キナーゼとポリリン酸 を添加する方法 [J. Biosci. Bioeng., 91, 557(2001) ]等をあげることができる。
[0076] 上記製造法で用いられる水性媒体としては、ジペプチドの生成反応を阻害しな 、 限り、いかなる成分、組成の水性媒体であってもよぐ例えば、水、りん酸塩、炭酸塩 、酢酸塩、ほう酸塩、クェン酸塩、トリスなどの緩衝液などをあげることができる。また、 メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸ェチルなどのエステル類、アセトン などのケトン類、ァセトアミドなどのアミド類を含有して 、てもよ!/、。
[0077] ジペプチドの生成反応は水性媒体中、 pH5〜ll、好ましくは pH6〜10、 20〜50°C、 好ましくは 25〜45°Cの条件で 2〜150時間、好ましくは 6〜120時間行う。
上記方法で製造されるジペプチドとしては、アミノ酸同士、好ましくは L-アミノ酸、 G1 yおよび j8 - Alaから選ばれるアミノ酸同士、より好ましくは L- Ala、 L- Gln、 L- Glu、 L- Va 1、し一し euゝし一 Ile、し一 Pro、し一 Pheゝし一 Trpゝし一 Metゝし一 Serゝし一 Thrゝし一 Cysゝし一 Asnゝし一 T yr、 L— Lys、 L— Arg、 L— His、 L— Asp、 L- ~AB、 j8— Ala、 L— Azaserme、 L— theanine、 L— 4- HYP、 L- 3- HYP、 L- Orn、 L- Citゝ L- 6- diazo- 5- oxo- norleucineゝ Glyおよび j8 - Ala 力 選ばれるアミノ酸がペプチド結合で連結したジペプチド、さらに好ましくは、式 (I) [0078] [化 1]
R' _ R2 ( I )
[0079] (ただし、 R1が L— Alaのとき、 R2は L— Leu、 L— Ile、 L— Pheゝ L— Trpゝ L— Metゝ L— Thrおよび L-Asnから選ばれるアミノ酸であり、 R1が L-Glnのとき、 R2は L-Leuまたは L-Metであり 、 R1が L- Gluのとき、 R2は L- Metであり、 R1が Glyのとき、 R2は L- Leu、 L- Metおよび L- Thr力も選ばれるアミノ酸であり、 R1が L- Valのとき、 R2は L- Metまたは L- Serであり、 R1 が L— Leuとき、 R2は L— Pro、 L— Pheゝ L— Metゝ L— Ser、 L— Thr、 L— Cys、 L— Asnゝ L— Tyr、 L— Ala, L- Ginおよび Glyから選ばれるアミノ酸であり、 R1が L- lieのとき、 R2は L- Met、 L- S erおよび L- Alaから選ばれるアミノ酸であり、 R1が L- Proのとき、 R2は L- Metまたは L- L euであり、 R1が L- Pheのとき、 R2は L- Trp、 L-Met, L- Alaおよび L- Leuから選ばれるァ ミノ酸であり、 R1が L- Trpのとき、 R2は L- Trp、 L-Met, L- Alaおよび L- Pheから選ばれ るアミノ酸であり、 R1が L— Metのとき、 R2は L— Met、 L— Serゝ L— Thr、 L— Cys、 L— Asn、 L— Tyrゝ L-Lys, L- Argゝ L- Hisゝ L- Aspゝ L- Alaゝ L- Gln、 L- Gluゝ Glyゝ L- Val、 L-Leu, L-Il e、 L- Pro、 L- Pheおよび L- Trpから選ばれるアミノ酸であり、 R1が L- Serのとき、 R2は L- Met, L- Ser、 L- Thr、 L- Asn、 L- Val、 L- Leuおよび L- lieから選ばれるアミノ酸であり、 R1が L- Thrのとき、 R2は L- Ala、 Gly, L-Leu, L- Metおよび L- Serから選ばれるアミノ酸 であり、 R1が L- Cysのとき、 R2は L- Leuまたは L- Metであり、 R1が L- Asnのとき、 R2は L- Ala、 L-Leu, L-Metおよび L-Serから選ばれるアミノ酸であり、 R1が L-Tyrのとき、 R2は L- Leuまたは L- Metであり、 R1が L- Lysのとき、 R2は L- Metであり、 R1が L- Argのとき、 R2は L- Metであり、 R1が L- Hisのとき、 R2は L- Metであり、 R1が L- Aspのとき、 R2は L- M etである）で表される 2つのアミノ酸がペプチド結合で連結したジペプチド、特に好ま しくは、式 (I) (ただし、 R1が L- Metのとき、 R2は L- Ala、 Glyおよび L- Cysから選ばれる アミノ酸であり、 R1が L-Leuのとき、 R2は L-Alaおよび Gly力も選ばれるアミノ酸である） で表される 2つのアミノ酸がペプチド結合で連結したジペプチドをあげることができる (2)微生物または形質転換体の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源として用い るジペプチドの製造法
本発明の製造法において酵素源として用いられる微生物または形質転換体の培養 物としては、該微生物または形質転換体を上記 6の培養方法で培養して得られる培 養物をあげることができる。微生物または形質転換体の培養物の処理物としては、該 培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得ら れる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、 該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素 源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるもの、並びに該菌体 の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、および当該処理した菌体から得ら れる粗酵素抽出物などをあげることができる。
[0080] 形質転換体または微生物の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源として用いる 場合、基質に用いられる 1種以上のアミノ酸としては、上記（1)と同様のアミノ酸をあ げることができる。
該酵素源の量は、当該酵素源の比活性等により異なるが、例えば、基質として用い るアミノ酸 lmgあたり湿菌体重量として 5〜1000mg、好ましくは 10〜400mg添カ卩する。
[0081] 基質として用いるアミノ酸は、上記（1)と同じように水性媒体中に添加することができ る。上記（1)と同様、 ATPを水性媒体中に存在せしめ、エネルギー源として用いるこ とができる。 ATPはジペプチドを生成、蓄積させる水性媒体に粉末のまま、あるいは 溶液として供給することができるが、例えば解糖系やポリリン酸キナーゼなどを利用し た ATP再生活性 (ジペプチド生成の際に生じる ADPを ATPに変換する活性)を該 水性媒体に加えることで ATPを供給することもできる。具体的には、 Corvnebacterium ammoniagenesの培着菌体と炭素源を添加する方法「Biosci. Biotechnol. Biochem., 65, 644(2001)]、ポリリン酸キナーゼとポリリン酸を添カ卩する方法 [J. Biosci. Bioeng., 9 1, 557(2001) ]等をあげることができる。
[0082] 水性媒体としては、上記（1)の媒体を用いることができ、加えて酵素源に使用する 微生物または形質転換体の培養物の培養上清も水性媒体として用いることもできる。 ジペプチドの生成反応の反応条件は、上記（1)と同様の条件をあげることができる 上記方法で製造されるジペプチドとしては、上記（1)と同様のジペプチドをあげるこ とがでさる。
[0083] 上記（1)および（2)の製造法にぉ 、て、水性媒体中に生成、蓄積したジペプチドの 採取は、活性炭やイオン交換榭脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒によ る抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うこと ができる。
以下に、実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例 1
[0084] ジペプチド合成活性を有する蛋白質の発現株の造成
バチルス'リケニフォルミス ATCC 14580の染色体 DNA上に存在する配列番号 2で 表される塩基配列を有する、機能未知蛋白質をコードする 遺伝子の塩基配 列情報 (http://gib.genes.nig.ac.jp/single/index.php?spid=Blic_DSM13_NOVOZYME ¾、 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ viewer.fcgi?val=56160984&itemID=4022&vie w=gbwithparts)に基づき、バチルス'リケ-フオルミス ATCC 14580の染色体 DNAから BL00235遣伝子に相当する遣伝子（以下、単に BL00235遣伝子と ヽぅ）を以下のよう にして取得した。
[0085] まず、バチルス'リケニフォルミス ATCC14580を YPGA培地 [7g/lイーストエキス（デ ィフコ社製）、 7g/lバクトペプトン (ディフコ社製）、 7g/lグルコース、 1.5g/l寒天]に塗 布して 30°Cで一晚静置培養した。生育した菌体 1白金耳を 3mlの YPG培地 [7g/lィー ストエキス (ディフコ社製）、 7g/lバクトペプトン (ディフコ社製）、 7g/lグルコース]に植 菌し、 30°Cで 24時間振盪培養した。遠心分離により集菌した菌体力 Dneasy Kit (キ ァゲン社製)を用いて染色体 DNAを調製した。
[0086] パーセプティブ ·バイオシステムズ (Perseptive Biosystems)社製 8905型 DNA合成 機を用いて、配列番号 3および 4で表される塩基配列を有する DNA (以下、それぞ れプライマー A、プライマー Bと呼ぶ）を合成した。プライマー Aは、バチルス'リケ-フ オルミス ATCC14580の染色体 DNAの BL00235遺伝子の開始コドンを含む領域の 5' 末端に tel認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマー Bは、 BL002 遺伝子の N末端アミノ酸配列を含む DNA配列と相補的な塩基配列の 5'末端に mHI認識配列を含む塩基配列を付加したものである。
[0087] SLQQ^遺伝子断片の増幅には上記のプライマー Aおよびプライマー B、铸型とし てバチルス'リケニフォルミス ATCC14580の染色体 DNAを用いて PCRを行った。 PC Rは、 0.1 μ gの全 DNA、 0.5 μ mol/1の各プライマー、 2 unitsの KOD plus DNAポリメラ ーゼ (東洋紡社製）、 5 μ Lの KOD plus DNAポリメラーゼ用 X 10緩衝液 (東洋紡社製 )、各 200 μ mol/1の dNTP(dATPゝ dGTP、 dCTPおよび dTTP)を含む反応液 50 μ Lを 調製し、 95°Cで 135秒間加温した後、 95°Cで 30秒間、 52°Cで 45秒間、 68°Cで 90秒間 の工程を 30回繰り返し、さらに 68°Cで 3分間加温することにより行った。
[0088] 該反応液の 1/10量をァガロースゲル電気泳動し、該 PCRにより 遺伝子を 含む約 1.3kbの DNA断片が増幅していることを確認した後、残りの反応液力 GFX- PCR and Gel Band purification kit (アマシャム社製）を用いて該 DNA断片を精製し、 20 1の TEに溶解した。
該 DNAの塩基配列を公知の方法で決定し、配列番号 1で表されるアミノ酸配列を コードする配列番号 2で表される塩基配列を有する DNAであることを確認した。
[0089] 次に、上記で得られた DNA溶液 5 μ 1を用 ヽ、該 DNAを制限酵素 Nmlおよび E I HIで切断し、ァガロースゲル電気泳動により DNA断片を分離した後、 GFX-PCR and Gel Band purification kitを用いて、 遺伝子を含む約 1.3kbの DNA断片を回 収した。
0.2 μ gの発現ベクター pET- 21d(+) (ノバジェン社製）を制限酵素 および S iHI で切断後、ァガロースゲル電気泳動により DNA断片を分離し、上記と同様の方法に より約 5.4kbの DNA断片を回収した。
[0090] 上記で得られた SLQQ^遺伝子を含む約 1.3kbの DNA断片および上記で取得した 発現ベクター pET- 21d(+)の約 5.4kbの DNA断片をライゲーシヨンキット（タカラバイオ 社製)を用いて、 16°Cで 16時間反応させ連結した。
該反応液を用いてェシエリヒア'コリ DH5 a株 (タカラバイオ社製)を、カルシウムィ オンを用いる方法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]によって形質転換 し、該形質転換体を 50 g/mlのアンピシリンを含む LB寒天培地に塗布した後、 30°C で一晩培養した。
[0091] 生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制 限酵素を用いてその構造を解析することにより、 N末端に Hisタグ配列が付加された β LQQ2^遺伝子が IIプロモーター下流に連結された発現ベクターである PBL00235が 取得されて ヽることを確認した（図 1)。
PBL00235を用いてェシエリヒア'コリ BL21(DE3)株（ノバジェン社製）を、カルシウム イオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を 50 g/mlのアンピシリンを 含む LB寒天培地に塗布した後、 30°Cで一晚培養した。
[0092] 生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制 限酵素を用いてその構造を解析することにより、 PBL00235が保持されていることを確 した 0
実施例 2
[0093] ジペプチド合成活性を有する蛋白質の生産
実施例 1で得られた PBL00235を保有するェシエリヒア'コリ BL21(DE3) (ェシエリヒア 'コリ BL21(DE3)/pBL00235)を 50 μ g/mlのアンピシリンを含む 3mlの LB培地が入つ た試験管に接種し、 37°Cで 6時間振盪培養した。得られた培養液のうち 100 1を 100 mLの LB培地が入った 500ml三角フラスコに接種した。 37°Cで 3時間振盪培養した後 、終濃度が lmmol/1になるようにイソプロピル一 β— D—チォガラタトピラノシド (IPTG) を添加して、さらに 28°Cで 15時間振盪培養した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を 取得した。
[0094] 該湿菌体を超音波処理により破砕した後、遠心分離して得られる上清から、 HisTra p (Hisタグ付加蛋白質精製キット、アマシャム社製)を用いて Hisタグが付加した蛋白 質を精製した。
実施例 3
[0095] Hisタグ付カ卩蛋白質を用いたジペプチドの生産
実施例 2で得られた精製 Hisタグ付カ卩蛋白質を 0.5mg/l、 50mmol/lの Tris-HCl緩衝 液（pH8.0)、 12.5mmol/lの硫酸マグネシウム、 12.5mmol/lの ATP、 12.5mmol/lの表 1 の第 1行目と最左列のアミノ酸の組み合わせ力 なる各種 L-アミノ酸または Glyからな る反応液を調製し、 30°Cで 20時間反応を行った。反応終了後、反応液中に遊離した リン酸量をデタミナ一 L IP (協和メディックス社製)を用いて定量することにより、反応 の進行を確認した。さらに反応生成物を MALDI- TOFMS (Matrix Assisted Laser Des orption/Ionization - Time of Fngnt Mass Spectrometry;分 で確 gi!、し 7こ。
[0096] 結果を表 1に示す。
[0097] [表 1-1]
Figure imgf000032_0001
[0098] [表： 1-2]
Figure imgf000033_0001
[0099] [表： 1-3] 表 1 3
Figure imgf000034_0001
[0100] 表 1中の〇は、遊離するリン酸量力 ジペプチド生成反応の進行が確認されたこと を示す。また、表 1中に記載されているジペプチドは、 MALDI-TOFMSにより反応生 成物の分子量が同定できたジペプチドを示す。
表 1にあるとおり、本発明の蛋白質は、 1種または 2種のアミノ酸をペプチド結合で 結合させ、種々のジペプチドを生成する活性を有することがわ力 た。
実施例 4
[0101] ジペプチドの構造解析
実施例 2で得られた精製 Hisタグ付カ卩蛋白質を 0.5mg/l、 50mmol/lの Tris- HC1緩衝 液（ρΗ8·0)、 12.5mmol/lの硫酸マグネシウム、 12.5mmol/lの ATP、 12.5mmol/lの表 2 の第 1行目と最左列に記載の 2種類の L アミノ酸または Glyからなる反応液を調製し 、 30°Cで 20時間反応を行った。反応終了後、反応生成物のうち表 2に示すジぺプチ ドについては、 NMR (Nuclear Magnetic Resonance)分析によりその構造を確認すると ともにその生成量を測定した。
[0102] [表 2] 表 2
Figure imgf000035_0001
[0103] NMR解析を行った表 2に記載のジペプチドの生成量（mmol/1)をジペプチドの名称 の下に記載した。なお空欄は実験未実施であり、ジペプチドの名称の下に生成量の 記載がないものはジペプチドの構造は確認したが生成量は未測定であることを示す 産業上の利用可能性
[0104] 本発明により、種々のジペプチドを効率よく製造することができる。
配列表フリーテキスト
[0105] 配列番号 3 人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 4 人工配列の説明：合成 DNA

Claims

請求の範囲 [1] 以下の [1]〜 [3]の 、ずれかに記載の蛋白質。 [1]配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質 [2]配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換また は付加したアミノ酸配列力もなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質 [3]配列番号 1で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質 [2] 以下の [1]〜[3]のいずれかに記載の DNA。
[1]請求項 1記載の蛋白質をコードする DNA
[2]配列番号 2で表される塩基配列を有する DNA
[3]配列番号 2で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有する DNAとストリンジ ントな条件下でハイブリダィズし、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質をコード する DNA
[3] 請求項 2記載の DNAを含有する組換え体 DNA。
[4] 請求項 3記載の組換え体 DNAを有する形質転換体。
[5] 形質転換体が微生物を宿主として得られる形質転換体である、請求項 4記載の形質 転換体。
[6] 微生物がェシエリヒア (Escherichia)属に属する微生物である、請求項 5記載の形質 転換体。
[7] 請求項 1記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中 に該蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する請求項 1記載の蛋 白質の製造法。
[8] 請求項 1記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物が請求項 4〜6のいずれか 1 項に記載の形質転換体である、請求項 7記載の製造法。
[9] 請求項 1記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物もしくは該培養物の 処理物、または請求項 1記載の蛋白質と 1種以上のアミノ酸とを水性媒体中に存在せ しめ、該媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体力 該ジペプチドを採取する ジペプチドの製造法。 [10] 請求項 1記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物が請求項 4〜6のいずれ力 1 項に記載の形質転換体である、請求項 9記載の製造法。
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