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WO2007069755A1 - 人工リンパ節を用いた効率的な抗原特異的ハイブリドーマの作成法 - Google Patents

人工リンパ節を用いた効率的な抗原特異的ハイブリドーマの作成法 Download PDF

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WO2007069755A1
WO2007069755A1 PCT/JP2006/325137 JP2006325137W WO2007069755A1 WO 2007069755 A1 WO2007069755 A1 WO 2007069755A1 JP 2006325137 W JP2006325137 W JP 2006325137W WO 2007069755 A1 WO2007069755 A1 WO 2007069755A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antigen
cells
lymph node
immunodeficient
human animal
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2006/325137
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English (en)
French (fr)
Inventor
Takeshi Watanabe
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
RIKEN
Original Assignee
RIKEN
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by RIKEN filed Critical RIKEN
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Priority to JP2007550257A priority patent/JPWO2007069755A1/ja
Priority to US12/097,164 priority patent/US20090280563A1/en
Publication of WO2007069755A1 publication Critical patent/WO2007069755A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61D—VETERINARY INSTRUMENTS, IMPLEMENTS, TOOLS, OR METHODS
    • A61D7/00—Devices or methods for introducing solid, liquid, or gaseous remedies or other materials into or onto the bodies of animals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells

Definitions

  • a method for producing an antigen-specific hybridoma comprising the following steps:
  • step (d) collecting splenocytes from the immunodeficient non-human animal immunized in step (c); (e) A step of fusing the splenocytes collected in step (d) with a myeoma cell to form an antibody-producing hybridoma.
  • the site force in is lymphotoxin and / or chemokine [1] ⁇
  • lymphoid tissues include the spleen, lymph nodes, mucosa-related lymphoid tissues (tonsils, tracheal-related lymphoid tissues, intestinal-related lymphoid tissues, Peyer's patches) ( PP) and other aggregates of lymphoid cells).
  • the antigen-specific antibody-producing human lymph node used to produce the antigen-specific hybridoma of the present invention can be constructed by combining the following three elements and transplanting the animal:
  • Antibody-producing cells are cells in which B cells have differentiated to the final stage and are called plasma cells.
  • Cytokine is a generic term for proteinaceous physiologically active substances that control the growth and differentiation of various blood cells, and also refers to growth factors and growth inhibitory factors of cells including non-immune cells. Sometimes. Interleukin, colony stimulating factor, interferon, chemokine, lymphokine, tumor necrosis factor (TNF) And so on.
  • the interleukin used in the present invention is not particularly limited, and can be arbitrarily selected from IL-1 to IL-18.
  • the colony stimulating factor for example, G-CS'F, M-CSF, GM-CSF and the like can be used.
  • IFN-a for example, IFN-a, IFN- / 3, IFN- ⁇ and the like can be used.
  • chemokines include CCL21 (also referred to as SLC (secondary lymphoid tissue chemokine)), CXCU3 (also known as BLC (B lymphocyte chemoattractant)), CCL19 (ELC).
  • TNF-3 and TNF-3 can be used.
  • TNF-3 is a lymphotoxin ct.
  • LT ct is also found to be essential for the formation of lymph node (LN) and Peyer's patch (pp) organs and for the formation of normal splenic tissue structures.
  • LN lymph node
  • pp Peyer's patch
  • LT 3 lymphotoxin
  • the site force-in used in the present invention is preferably lymphotoxin and / or chemokine, more preferably LT, CCL2 K CXCL13, and node or CCL19. These repulsive ins are commercially available and can be easily obtained.
  • Stromal cells are various cells with specific functions specific to glands or organs.
  • stromal cells It is a general term for the cells that make up the microenvironment surrounding (parenchymal cells) and is also called “stromal cells”. This “stromal cell” literally supports physical cells and is thought to fulfill a supporting function in the sense that it exerts some action on the other cell through cell-cell interaction. Stromal cells are also called “supporting cells” or “stromal cells”.
  • stromal cells used in the present invention include TEL-2 stromal cells established from 2-week-old Bailee mouse thymus (Eur. J. Immunol 20: 47-53,
  • This TEL-2 cell has 10% inactivated FCS and 50 M
  • cytokines or chemokines in TEL-2 stromal cells, an expression vector containing a gene encoding them is introduced by a ribofusion method or the like, and G418 (500 mg / mg A drug-resistant cell line can be obtained by culturing in a selective medium supplemented with ml) for 10 days to 2 weeks. Expression of the transgene can be confirmed by measuring the biological activity of the cell culture supernatant. For the measurement of biological activity, for example, in the case of chemokines, a chemotaxis assay that measures the migration activity against T cells or B cells can be used.
  • a biocompatible polymer material having a three-dimensional structure skeleton can be used as the polymer biomaterial used in the present invention.
  • three-dimensional structural skeleton means “a scaffold for organizing stromal cells and lymph node-forming cells such as lymphocytes and dendritic cells in a three-dimensional manner.
  • biocompatible polymer material is composed of various polymers that are designed to minimize the reaction of the living body trying to eliminate it as a foreign substance when applied to the living body in some way. Means “material”.
  • polymeric biomaterials examples include collagen, glycosaminoglycan, polyglycolic acid, and poly-L-lactic acid.
  • non-biodegradable materials such as nylon, polyester, polyurethane, or ethylene vinyl acetate can be used alone or in appropriate combination.
  • Collagen sponge is a constituent of the living body and is preferable as a high molecular weight biomaterial in that it can suppress inflammatory reaction and immune reaction to a low level.
  • “Collagen sponge” means a porous material having a sponge structure containing collagen. For example, lyophilized insoluble collagen of a mussia tendon is made into a porous sponge. Collagen for three-dimensional tissue culture can be used in the present invention.
  • the polymeric biomaterial used in the present invention may be biodegradable or non-biodegradable, and when transplanted into a living body, the immune response due to its own antigenicity. Any material can be used as long as it does not cause an inflammatory response due to physical stimulation.
  • a porous high-molecular material can be used with a pore size suitable for the construction of an artificial lymph node ( Pore size), or the size of the entire polymer material to be transplanted.
  • Pore size a pore size suitable for the construction of an artificial lymph node
  • the pore size and size of such an implant can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • Dendritic cells are a general term for a group of cells having a dendritic morphology derived from hematopoietic stem cells, and are widely distributed not only in lymphoid organs but also in lymphoid organs. Dendritic cells play an important role in initiating an immune response as they become effective stimulators of T and B cells upon activation.
  • Dendritic cells used in the present invention can be obtained by culturing the precursor cells.
  • Dendritic cell progenitor cells originate from bone marrow, umbilical cord blood, peripheral blood-derived hematopoietic stem cells, peripheral blood-derived 'monocytic cells, and the like. Dendritic cell progenitor cells can be separated and purified as needed from the collected bone marrow fluid, umbilical cord blood, or peripheral blood suspensions.
  • ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , and TNF-s. These can be used alone or in appropriate combination.
  • RPMI-1640 medium or McCoy's medium with 5-20 ng / ml of the above cytokines, and finally activate it.
  • an activating factor such as LPS (lipopolysaccharide).
  • an expression vector containing a gene encoding any cytokine was introduced into a stromal cell and produced. After attaching the stromal cells to the polymer biomaterial, the polymer biomaterial may be transplanted into the tissue of an animal immunized with an antigen for which a monoclonal antibody is to be produced.
  • stromal cells To attach stromal cells to a high molecular weight biomaterial, either immerse the cells in a cell suspension prepared at a high concentration or use a syringe equipped with an injection needle (eg, 26 gauge). Inject into molecular biomaterial.
  • dendritic cells can be added to the polymeric biomaterial in addition to site-in-producing stromal cells. More preferably, activated dendritic cells pulsed with the same antigen used to immunize the animal (ie, the antigen for which the monoclonal antibody is to be made) can be added. .
  • the animals to be transplanted with macromolecular biomaterials to which stomatoma cells (and activated dendritic cells) are attached are human and non-human animals, and non-human animals are preferably Non-human mammals (eg, monkeys, horses, rushes, goats, hidges, pigs, dogs, cats, rabbits, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.). Of these, mice usually used for preparing high-pridors are preferred.
  • Antigens used for immunization are not limited, and examples include pathogenic microorganisms such as protozoa, fungi, bacteria, and viruses. In addition to these pathogenic microorganisms, proteins, peptides, nucleic acids, lipids, carbohydrates, etc. related to cancer or specific diseases can be used as antigens.
  • pathogenic microorganisms such as protozoa, fungi, bacteria, and viruses.
  • proteins, peptides, nucleic acids, lipids, carbohydrates, etc. related to cancer or specific diseases can be used as antigens.
  • these antigens are preferably administered to the animal together with an adjuvant (eg, alum, Freund's complete or incomplete adjuvant, etc.).
  • an adjuvant eg, alum, Freund's complete or incomplete adjuvant, etc.
  • the amount of antigen used to immunize the animals that make up the lymph nodes depends on the type of animal used, For example, in the case of adult mice, 10 ⁇ ⁇ to 1000 ⁇ g, preferably 10 to 100 ⁇ g of antigen precipitated in alum is administered intraperitoneally, depending on age, body weight, route of administration, etc. That's fine.
  • primary immunization may be repeated one or several times (eg,:! To 3 times) at intervals of 1-2 weeks to ensure antigen stimulation of immunocompetent cells (eg, B cells).
  • the antigen is preferably administered intravenously (i. V.).
  • a specific antibody-producing artificial lymph node used for producing the antigen-specific hyperprideoma of the present invention can be constructed in the animal body.
  • the specific antibody-producing human lymph node thus constructed is recovered from the living body.
  • the collected artificial lymph nodes can be stored at a low temperature of -80 ° C or lower in a culture medium supplemented with an appropriate preservative (eg, 10% DMS0), and prepared before use.
  • the collected artificial lymph nodes are reimplanted into the recipient immunodeficient animal.
  • the animal with immune deficiency is preferably the same species as the animal used to construct the human Elymph node.
  • the site of transplantation may be the same as the site of transplantation of biopolymer material including stromal cells etc. when constructing the artificial lymph node, for example, it may be transplanted under the kidney capsule.
  • Immunodeficient animals that do not have B y lymphocytes, such as' immune deficient mice.
  • SCID mice include NOD / Shi mouse, C.B-17 / IcrCrj-scid / scid, NOG mouse (N0D / Shi-scid / IL-2 ⁇ -/-mouse), etc. These SCID mice are available from CLEA Japan.
  • transplant 2 At the time of re-transplantation, it is preferable to transplant 2 to 4 artificial lymph nodes, and it is sufficient to transplant 1 to 2 under one kidney cortex.
  • the immunodeficient animal After transplanting human lymph node into an immunodeficient animal, the immunodeficient animal is immunized with the antigen used to construct the human lymph node. At this time, immunization may be performed a plurality of times. For example,
  • Immunization is performed 1 day to 2 weeks later, preferably 1 to 2 days later, and further 1 to 2 weeks later, preferably 1 week to 10 days later. Preferably immunize twice (primary and secondary immunization). In this case, intravenous administration is desirable.
  • the dose of antigen is 10 / ig to 1000 g, preferably 10 to 100 g.
  • the dose may be smaller than the dose of the first immunization. For example, the dose of 1/10 of the first dose may be administered.
  • B lymphocytes stimulated by primary immunity gather in the transplanted artificial lymph node, and then, when exposed to the same antigen used for primary immunization, cause class switching in the artificial lymph node, resulting in IgG, IgE Or induce antibody producing cells producing IgA.
  • antibody-producing cells preferably, IgG type (e.g., IgG had IgG 2, IgG 3, IgG 4) cells that produce antibodies of the.
  • immune cells are collected from the mammal and cell fusion is performed.
  • spleen cells are preferably used as immune cells.
  • Fig. 2 shows an outline of the present invention until an artificial lymph node is constructed and re-transplanted into an immunodeficient mouse to obtain immune cells.
  • the present invention also provides a method for producing a human-type specific antibody-producing hybridoma.
  • a human-type specific antibody-producing artificial lymph node used for the production of antigen-specific hybridomas can be used for, for example, human lymphocytes, human lymphocyte precursors, bone marrow cells in immunodeficient animals (eg, immunodeficient mice).
  • immunodeficient animals eg, immunodeficient mice.
  • an animal having this human immune system will try to produce a monoclonal antibody according to the method described above.
  • It can be constructed by transplanting a macromolecular biomaterial (artificial lymph node) immunized with an antigen, with stromal cells and / or dendritic cells attached, and if necessary, secondary immunization with the same antigen .
  • a macromolecular biomaterial artificial lymph node
  • a hybridoma that produces human monoclonal antibodies can be prepared by re-transplanting human-type specific antibody-producing human lymph nodes constructed in this way into immunodeficient animals.
  • This myeloma cell is known various cell lines, for example, in the case of a mouse-derived cell, P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immnol. (1979) 123, 1548-1550),
  • P3x63Ag8U. 1 (Current Topic cs in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. DH et al., Cell (1976) 8, 405-415) , SP2 / 0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), F0 (de St. Groth, SF et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21) S194 (Trowbridge, ISJ Exp. Med. (1978) 148, 313-323), R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133) and the like are preferably used.
  • Cell fusion between the immune cells and myeoma cells is known by the method of Kohler and Milstein et al. (Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46). The method can be used. Specifically, the cell fusion can be performed in a normal nutrient culture medium in the presence of a cell fusion promoter, for example. For example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) or the like is used as a fusion promoter, and an auxiliary agent such as dimethylsulfoxide can be added and used to increase the fusion efficiency. Further, the fusion may be performed by an electrofusion method using an electro-revolution.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) or the like is used as a fusion promoter, and an auxiliary agent such as dimethylsulfoxide can be added and used to increase the fusion efficiency.
  • the fusion may be performed by
  • the mixing ratio of myeloma cells and immune cells during cell fusion is not limited, but is preferably 1: 1 to 1:10.
  • As the culture solution used for the cyst fusion for example, RPMI1640 medium, MEM medium or the like may be used, and a serum supplement such as fetal calf serum (FCS) may be mixed.
  • FCS fetal calf serum
  • Cell fusion is performed by, for example, mixing the immune cells and myeloma cells in a medium,
  • the hybridoma thus obtained is selected by culturing in a normal selective culture solution, for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing with the above HAT culture solution is carried out for a sufficient time (usually several days to several weeks) to kill cells other than the desired hybridoma (non-fusion cells). Then, a normal limiting dilution method may be performed, and screening of the hybridoma that produces the target antibody and the mouth of the mouth may be performed. Screening It can be performed by known methods such as ELISA and Western blotting.
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody thus produced can be subcultured in a normal culture solution and can be stored for a long time in liquid nitrogen. is there.
  • the hybridoma is cultured according to a usual method and obtained as a culture supernatant, or the hybridoma is administered to a mammal compatible therewith.
  • the method of breeding and obtaining it as ascites is adopted.
  • the former method is suitable for obtaining high-purity antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • the present invention also includes a kit for producing an antigen-specific hybridoma.
  • the kit includes cytokinin-expressing vector and stromal cell, or stromal cell into which the cytokine-expressing vector has been introduced, a polymer biomaterial, activated dendritic cells, It may include a nodal forming mouse or an immunodeficient mouse. In addition, it may contain an antigen for producing a hyperidoma. In this case, activated dendritic cells may be pulsed in advance with the antigen.
  • the present invention will be specifically described with reference to the following examples. However, the present invention is not limited to these examples. .
  • the culture media, reagents and instruments used in the examples are as follows.
  • FCS fetal calf serum
  • Cell culture medium RPMI-1640 supplemented with 10% inactivated FCS and 50 ⁇ M 2-mercaptoethanol
  • G418 (geneticin): GIBC0
  • GM-CSF vgranulocyte-macrophage colony stimulating factor Peproi'ech
  • BSA bovine serum albumin
  • artificial lymph nodes were prepared under the kidney capsule of Balb / c mice. Specifically, it was produced by the following method.
  • TEL-2 cells As stromal cells, TEL-2 cells (Nakashima M. et al., Eur J Immunol. 1990 Jan; 20 (1): 47-53) established from the thymus of 2-week-old BALB / c mice were treated with 10% Cultured in RPMI 1640 supplemented with fetal calf serum and 50 ⁇ 2 -mercap ⁇ ethanol.
  • Mouse lymphotoxin ct (LT) or chemokine (CCL21, CCL19, and CXCL13) cDNA was cloned from mouse spleen RNA force by RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain react ion).
  • Each cDNA was inserted into the EcoRI site of pCXN 2 vector (Niwa H, et al., Gene. 1991 Dec 15; 108 (2): 193-9). It has a cutin promoter, a CMV enhancer, and a rabbit / 3 globin splicing donor.
  • the resulting expression vector is introduced into TEL-2 cells, and a stable transfectant cell line is selected for 2 weeks of G418 selection (500 After the establishment of stable transfectant cell lines, all cell lines were cultivated in a culture medium containing 200 ⁇ / 1111 G418. Fluorescent display cell sorting for LT Vessel (FACS) analysis and chemokines were confirmed by chemotaxis assay.
  • FACS Fluorescent display cell sorting for LT Vessel
  • Collagen sponges ("Collagen Sponge” # CS-35, K0KEN, Tokyo, Japan) were cut into small shapes and sizes and placed one by one in a 48 well plate well. Cytokine-producing TEL-2 stromal cells established as described above
  • the bone marrow cavity of femur and tibia of female BALB / cAnNCr j mice from 7 to 12 weeks of age was washed out with PBS using a syringe equipped with a 26 gauge needle to obtain a bone marrow cell solution.
  • This bone marrow cell solution was filtered with a nylon mesh to remove large cell masses, etc., and a cell suspension was prepared by adjusting to a concentration of 2 ⁇ 10 5 cel ls / ml with a culture solution. Although the cell suspension contains a considerable amount of erythroid cells, the cell concentration was calculated to be 2 ⁇ 10 5 cells / ml ignoring erythroid cells.
  • Collagen sponges ("Collagen Sponge” ttCS-35, KOKEN, Tokyo, Japan) were cut into small shapes and sizes and placed one by one in a 48-wall plate. Cytokine-producing TEL-2 stromal cells established as described above
  • NP-ovalbumin NP-0VA
  • Human lymphatic nodes were collected 3 weeks after transplantation. The collected artificial lymph nodes were transplanted under the kidney capsule of SCID mice ( ⁇ -17 / IcrCrj-scid / scid).
  • NP-OVA neuropeptide-derived neuropeptide
  • Serum was collected from SCID mice on the 4th to 5th day after the second immunization, and the spleen was removed.
  • the IgG anti-NP antibody concentration in the serum was measured.
  • the number of antibody-producing cells in the spleen was measured by the ELISpot method.
  • spleen cells were prepared, and a cell suspension was prepared using a cell culture medium.
  • mice pre-immunized with antigen
  • spleen cells (1 x 10 7 cells) collected from mice re-immunized twice with iv using antigen
  • Balb / c mice pre-immunized with antigen Were transplanted into SCID mice by intravenous injection, and then SCID mice that had been immunized twice with an antigen were used as controls.
  • Table 1 shows Balb / c mice that have undergone up to secondary immunization without re-transplanting human Elymph nodes, SCID mice that have undergone secondary immunization by re-implanting human Elypa nodes (the method of the present invention), artificial lymph nodes ! ! Serum anti-NP antibody concentrations in SCID mice that had been transplanted and were not immunized and in SCID mice that had undergone secondary immunization without re-implantation of artificial lymph nodes.
  • the serum of SCID mice transplanted with human Elymph nodes and immunized with antigen contains a large amount of antibodies with high affinity for the antigen (in this case, antibodies against NP6). It was. In the examples, 7 mg / ml of antigen-specific IgG class antibody was included. Usually, the amount of total immunoglobulin in the serum of mice is 1 mg / ml, so you can see how much antibody is being produced.
  • Fig. 3 shows the amount of IgG antibody in the serum of SCID mice immunized under each condition. Figure 3 shows that it is important to pre-pulse the dendritic cells with the antigen and immunize twice intravenously. Figure 3 The same effect can be obtained by intravenously administering a large amount of antigen-stimulated normal lymph nodes to SCID mice and immunizing with the antigen in the same manner. Indicates that it cannot be obtained.
  • Table 2 shows the number of IgG class anti-NP-specific antibody-producing cells in the spleen of SCID mice re-transplanted with artificial lymph nodes.
  • SCID mouse artificial lymph node transplantation 1 7 ⁇ 4 34 ⁇ 15 302 ⁇ 77 (approximately 8 X 10 4 cells), (immune)
  • SCID mice artificial lymph nodes 31, 496 ⁇ 6,774 37,744 ⁇ 6,936 2, 384 ⁇ 242 (approximately 8 X 10 4 cells),
  • spleen cells As shown in Table 2, when examining the spleen cells of SCID mice immunized by the method of the present invention (transplanted with artificial lymph nodes), more than 30,000 (about 30) in 100,000 spleen cells were examined. It can be seen that there are cells that produce (NP) antigen-specific IgG class antibodies. That is, according to the method of the present invention, an individual in which one or more of 3 to 4 lymphocytes (spleen cells) are antigen-specific antibody-producing cells can be prepared. Spleen cells: Myeloma cells (myeloma) were mixed at a ratio of 10: 1, and a number of hybridomas were produced by cell fusion using polyethylene glycol 1500 (Boehringer Mannheim) as a fusion agent. .
  • Hybridoma selection includes HAT containing 10% Fetal Calf Serum (FCS), hypoxanthine (H), aminopterin (A), and thymidine (T)
  • FCS Fetal Calf Serum
  • H hypoxanthine
  • A aminopterin
  • T thymidine
  • DMEM medium Gibco BRL
  • HT-containing DMEM Single clones were made by limiting dilution using the medium.
  • the culture was performed in a 96-well microtiter plate, and 10 4 cells were seeded in each well. Screening of hybridoma clones that produced anti-NP monoclonal antibodies was performed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). At this time, horseradish saponin peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody was used as a secondary antibody, and the absorbance of each cell after the enzyme reaction was measured using an ELISA reader.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Figure 4 shows the ELISA measurement results in each well. As shown in FIG. 4, when cell fusion with mouse myeloma cells was carried out by the method of the present invention, a hybridoma in which almost all produced an antigen-specific antibody could be obtained.
  • the human lymph node used in the method of the present invention can induce an antigen-specific immune response rapidly and in large quantities, and can efficiently supply effective antibody-producing cells.
  • an antigen-specific hyperdora can be created with a high formation rate.

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Abstract

　人工リンパ節を用いて効率よく特異的抗体産生ハイブリドーマを作成する方法の提供。　以下の工程を含む抗原特異的モノクローナル抗体を作製する方法：(a)　抗原で非ヒト動物を免疫し、免疫した非ヒト動物にサイトカインを産生するストローマ細胞を含む高分子生体材料を移植し、前記非ヒト動物に人工リンパ節を形成させる工程；(b)　工程(a)で形成された人工リンパ節を回収し、免疫不全非ヒト動物に移植する工程；(c)　工程(b)で人工リンパ節を移植した免疫不全非ヒト動物を前記工程(a)の抗原で免疫する工程；(d)　工程(c)で免疫した免疫不全非ヒト動物より脾細胞を採取する工程；ならびに(e)　工程(d)で採取した脾細胞をミエローマ細胞と融合させて抗体産生ハイブリドーマを形成させる工程。

Description

人工リンパ節を用いた効率的な抗原特異.的ハイプリ ドーマの作成法
技術分野
本発明は、 人工リンパ節を用いて抗原特異的ハイプリ ドーマを作成する方法に 関する。 . 明
背景技術
モノクローナル抗体を作製するためには、 マウス等の動物を抗原で免疫し、 抗 書
原産生形質細胞を生成させる。 次いで、 免疫動物から抗原産生形質細胞を多く含 む脾臓細胞を採取し、 該脾臓細胞とミエ b—マ細胞を融合することにより.ハイブ リ ドーマを形成させる。 さらに、 多数のハイプリ ドーマの中から目的の抗体を産 生するハイブリ ドーマをスクリーニングし、 得られたハイブリ ドーマにモノクロ ーナル抗体を産生させる ズ Kol ler G et a l .， Nature, 256, 495 ( 1975)等）。
モノクローナル抗体の作製において、 電気融合法を用いた細胞融合により細胞 融合効率を高める等、 目的の抗体を産生するハイプリ ドーマを多く得るための 種々の検討がなされてきた。 しかしながら、 動物にマウスを用いた場合、 ハイブ リ ドーマが形成してくるのは脾細胞 2〜4 X 104個に 1'個であり、一般には一頭の マウスからは 500個程度のハイプリ ドーマしか増殖してこない。 従って、 目的と する特異抗体を産生する細胞が脾細胞中に 1Ό5個以下しか存在しない場合には、 目的とするハイプリ ドーマを得ることは困難であった。 脾臓中の特異的抗体を産 生する細胞の数は、 用いる抗原の種類等で異なるが、 目的の抗体産生ハイプリ ド —マは、 一般的に増殖してきたハイプリ ドーマの数％であった。 分子量の小さい 抗原や種間で構造が比較的保存されているタンパク質等、 抗原によっては抗体が 生成されにく く、 従来のハイブリ ドーマ法でモノクローナル抗体を得るのは困難 であった。
動物の免疫にはリンパ節が深く関わっており、 リンパ節は高度に組織化された 三次元構造をとることにより、 リンパ球が抗原及び抗原提示細胞と相互作用して 抗原特異的な免疫反応を開始する場所であり、 外来微生物等外来の異種抗原に対 して生体を防御するための必須の ¾官である。 本発明者等は、 先にス トローマ細. 胞およびサイ ト力インを高分子生体材料から構成される三次元構造に組み込み、 これをマウスの腎被膜下に移植することによって、 人エリンパ節が構築できるこ と、 さらに上記組合せに骨髄由来の活性化樹状細胞を加えることにより効率よく 人エリンパ節を構築できることを報告した （特許文献 1参照）。
特許文献 1 特開 2004-2551 10号公報 発明の開示
本発明は、 人工リンパ節を用いて効率よく特異的抗体産生ハイプリ ドーマを作 成する方法を提供する。
従来の細胞融合法によるハイプリ ドー の作成法では、 必ずしも特異的抗体産 生ハイプリ ドーマの形成効率は高くなかった。 本発明者等は先に開発した人エリ ンパ節の構築方法と組合せてハイプリ ドーマを作成する方法について鋭意検討を 行った。 抗原を投与したァウスの腎被膜下で抗原でパルスした活性化樹状細胞を 用いて構築した人エリンパ節を免疫不全マウスに再移植し、 該免疫不全マウスを 抗原で免疫し、 脾細胞を採取しハイ,プリ ドーマを作成することにより、 特異的抗 体産生ハイプリ ドーマの形成率が著しく上昇することを見出し、 本発明を完成さ せるに至った。
すなわち、 本発明は以下のとおりである。
[ 1 ] 以下の工程を含む抗原特異的ハイプリ ドーマを作成する方法：
(a) 抗原で非ヒ ト動物を免疫し、免疫した非ヒ ト動物にサイ トカインを産生する ス トロ一マ細胞を含む高分子生体材料を移植し、 前記非ヒ ト動物に人工リンパ節 を形成させる工程；
(b) 工程（a)で形成された人工リンパ節を回収し、 免疫不全非ヒ ト動物に移植す る工程；
(c) 工程（b)で人工リンパ節を移植した免疫不全非ヒ ト動物を前記工程（a)の抗 原で免疫する工程；
(d) 工程（c)で免疫した免疫不全非ヒ ト動物より脾細胞を採取する工程； ならび (e) 工程（d)で採取した脾細胞をミエ口一マ細胞と融合させて抗体産生ハイブリ ドーマを形成させる工程。
[ 2 ] 高分子材料がさらに [ 1 ]の工程（a)の抗原でパルスした活性化樹状細胞を 含む [ 1 ]の方法。
[3] ス ト口一マ細胞が、 TEL-2細胞である [ 1 ]または [2]の方法。
[4] .高分子材料がコラーゲンスポンジである [ 1 ]〜[3]のいずれかの方法。
[5] サイ ト力インが、 リンホトキシンおよび/またはケモカインである [ 1 ]〜
[4]のいずれかの方法。 ...
[6] 非ヒ ト動物がマウスである [ 1 ]〜[5]のいずれかの方法。
[7] 免疫不全動物が免疫不全マウスである [ 1 ]〜[ 6]のいずれかの方法。
[8] 免疫不全マウスが SCIDマウスまた'は RAG 2遺伝子欠損マウスである [ 1 ]〜
[7]のいずれかの方法。
[9] 以下を含む、 抗原特異的なハイプリ ドーマを作成するためのキッ ト ：
J
(a) サイ トカイン発現べクタ一およびス ト口一マ細胞、またはサイ トカイン発現 ベクターが導入されたス ト口一マ細胞；
(b) 高分子生体材料； ならびに
(c) 活性化樹状細胞。
[1 0] 以下をさらに含む [9]の抗原特異的なハイプリ ドーマを作成するための キッ ト ：
(d) 人工リンパ節形成用マウス ；および
(e) 免疫不全マウス。
[1 1 ] さらに、 抗原を含み活性化樹状細胞が該抗原でパルスされている、 [9] または [1 0]の抗原特異的なハイプリ ドーマを作成するためのキッ ト。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005-357949号の明細書 および Zまたは図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 人工リンパ節構築の模式図である。 図 2は、 人工リンパ節を構築し、 免疫不全マウスに再移植して免疫細胞を得る までの本発明の方法の概要を示す図である。
図 3は、人工リンパ節の構築時および SCIDマウスの免疫時の条件を変えた場合 の、マウス血清中の特異的 IgG抗体量を示す図である。
図 4は、 得られたハイプリ ドーマの各ゥエルの培養液中の特異的抗体を測定し た結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態 - 本発明の方法において、 人工リンパ節は特開 2004-255110号公報に記載の方法 に従って作成することができる。 図 1に人エリンパ節構築の模式図を示す。
リンパ節とは、 リンパ系組織（リンパ球が非リンパ系細胞と相互作用する組織） であって、 リンパ球系の細胞の成熟や適応免疫応答に重要な役割を果たす組織器 官である。 リンパ系組織は一次リンパ組織と二次リンパ組織に分類することがで きる。 一次リンパ組織はリンパ球産生の場所であり、 骨髄と胸腺がこれに含まれ る。 また、 二次リンパ組織は、 抗原を補足するための特殊な構造をしており、 適 応免疫応答が開始される場所である。 .二次リンパ組織 （末梢リンパ組織とも呼ば れる） には、 脾臓、 リンパ節、 粘膜関連リンパ性組織 （扁桃、 気管関連リンパ性 組織、 腸管関連リンパ性組織、 パイエル板 （Peyer ' s patches) (PP)、 その他の リンパ球系細胞の凝集塊） が含まれる。
本発明の抗原特異的ハイプリ ドーマの作成に用いる抗原特異的抗体産生人エリ ンパ節は、 以下の三要素を組み合わせて、 動物に移植することにより構築され得 る ：
( a ) リンパ節の形成に重要であるス トロ一マ細胞を代替する細胞；
( b ) リンパ節の形成に重要であるサイ トカイン ；および
( c ) 生体適合性高分子材料から構成される三次元構造骨格。
本発明の抗原特異的ハイプリ ドーマの作成に用いる特異抗体産生人エリンパ節 は、 以下に挙げる、 抗原特異的な免疫反応を起こす場として必須であると考えら れるリンパ節の基本構造を備える。
[ 1 ] 明確に区別される T細胞領域と B細胞領域を有する。 正常リンパ組織と同様、 本発明の特異抗体産生人エリンパ節においても T'細胞 と B細胞の領域は明確に分かれており、 それぞれ 「T細胞領域」、 「Β細胞領域」 と呼ぶ。 特に Β細胞集団は 「濾胞 （follicle)」 とも呼ばれる。
[2] T細胞および B細胞と共に、 免疫反応において重要な役割を果たす樹状 細胞が存在する。
[3] 中心部に濾胞樹状細胞のネッ トワークを含む B細胞領域が存在する。 濾胞樹状細胞 (FDC： follicular dendritic cell) は、 「濾胞中心部に存在する 樹状の突起を持つ特殊な細胞」 を意味し、 濾胞中心部でネッ トワークを形成して いる (FDC networkという）。 FDCは、 樹状細胞 (dendritic cell) とは別の種類 の細胞である。 .
[4] 胚中心 B細胞様の PNA (peanut agglutinin) 強陽性 B細胞が存在する。 抗原刺激による抗体産生に先立って、 濾胞の中心部で B細胞の活発な增殖と形 質細胞 （抗体産生細胞） への分化が起きる。 この部位を胚中心 （GC： germinal center)と呼ぶ力 この胚中心で活発に増殖する B細胞は、胚中心 B細胞（germinal center B cell) と'称する。 胚中心 B細胞は PNAとよく結合する性質を持っため、 PNAで染色した時に PNA強陽性 （PNAhish+) となることが知られている。
[ 5] 抗体産生細胞である形質細胞が存在する。 '
抗体産生細胞は、 B細胞が最終段階まで分化した細胞であり、 これを形質細胞 と呼ぶ。
[6] リンパ節へのリンパ球の侵入門戸となる HEV様の血管構造が存在する。 . 高内皮細静脈 （HEV) は、 リンパ節、 パイエル板などの二次リンパ組織に特異的 に観察される特殊な血管構造であり、 一般的な血管とは異なり、 背の高い （壁が 分厚い） 内皮細胞を有する。 この HEVは、 ある種の接着因子ゃケモカインを発現 しており、 リンパ球が血流からこれらの二次リンパ組織に遊走して入ってくる時 の入り口となっている。
サイ トカインとは、 各種の血球細胞の増殖と分化を制御するタンパク質性の生 理活性物質の総称を意味し、 さらには、 非免疫系細胞を含む細胞の増殖因子およ び増殖抑制因子をいうこともある。 作用の特性から、 インタ一ロイキン、 コロニ 一刺激因子、 インターフェロン、 ケモカイン、 リンホカイン、腫瘍壊死因子 （TNF) などに分類ざれる。 本発明において使用されるインターロイキンは、 特に限定さ れず、 IL - 1〜IL- 18 の中から任意に選択することができる。 コロニー刺激因子と しては、 例えば、 G-CS'F、 M-CSF、 GM-CSFなどが使用され得る。 インターフェロン
(IFN) としては、 例えば、 IFN - a 、 IFN- /3 、 IFN- γなどが使用され得る。 ケモカ インとしては、 例えば、 CCL21 (SLC (secondary lymphoid t i ssue chemokine) と もいう）、 CXCU3 (BLC (B lymphocyte chemoattractant) ともレヽラ）、 CCL19 (ELC
(Epstein-Barr virus-induced molecule 1 l igand chemokine; ともレヽっノ なと が使用され得る。 TNF としては、 例えば、 TNF-ひ 、 TNF - 3などが使用され得る。 TNF- 3は、 リンホトキシン ct (LT.ひ.） ともいわれる。 LT ctは、 リンパ節 （LN) お よびパイエル板 （pp) の器官形成のために、 ならびに正常な脾臓組織構造の形成 のために必須であることが見出された最初の分子である。 リンホトキシンには、 LTひ の他に、 LT 3が存在する。 これらのリンホトキシンもまた、 本発明に使用さ れ得る。
本発明において使用されるサイ ト力インは、 好ましくは、 リンホ.トキシンおよ び またはケモカインであり、 より好ましくは、 LTひ 、 CCL2 K CXCL13 , およびノ または CCL19である。 これらのサイ 卜力インは市販されており、 容易に入手する ことが可能である。
ス トローマ細胞とは、 腺あるいは器官に特異的な固有の機能を持つ様々な細胞
(実質細胞） を取り巻く微小環境を構成する細胞の総称であり、 「支質細胞」 とも いう。 この「支質細胞」 は、文字どおり実質の細胞を物理的に支持するとともに、 細胞同士の相互作用により相手の細胞に何らかの作用を及ぼすという意味での支 持機能も果たしていると考えられている。 ス トローマ細胞はまた、 「支持細胞」 あ るいは 「間質細胞」 ともいう。
本発明において使用されるス トローマ細胞としては、 例えば、 2週齢の Bailee マウス胸腺から樹立された TEL-2ス トローマ細胞 （Eur. J. Immunol 20： 47-53,
1990) が挙げられる。 この TEL-2細胞は、 10%の非働化した FCSおよび 50 Mの
2 —メルカプトエタノ一ルを補充した RPMI- 1640培地で培養することによって、 維持および継代することができる。 例えば、 培養している細胞を、 3 日毎に、
Trypsi n-EDTA溶液で培養用ディッシュから収集し、 1/10〜1/20に希釈して継代す ることができる。
本発明に用いちれる、 サイ ト力インを産生するス トローマ細胞は、 サイ トカイ ンをコ一ドする遺伝子を含む発現べクタ一（サイ トカイン発現べクタ一ともいう） を構築し、 この発現ベクターを、 公知の遺伝子導入技術によって、 ス ト口一マ細 胞に導入することにより作製することができる。 種々のサイ トカインに関する遺 伝子情報は公知であり、 例えば、 GenBank などの公に利用可能な遺伝子データべ —スから入手可能である。
例えば、 TEL-2 ス トローマ細胞において、 上述のサイ トカインまたはケモカイ ンを産生させるには、 それらをコ ドする遺伝子を含む発現べクタ一をリボフヱ クシヨン法などにより導入し、 G418 (500 M g/ml ) を添加した選択培地で 10 日か ら 2週間培養して、 薬剤耐性細胞株を得ることができる。 導入遺伝子の発現は、 細胞培養上清の生物活性を測定して確認することができる。生物活性の測定には、 例えば、 ケモカインの場合であれば、 T細胞または B細胞に対する遊走活性を測 定する chemotax i s assayを用レ、ること力 できる。
本発明において使用さ る高分子生体材料としては、 三次元構造骨格を有する 生体適合性高分子材料が使用され得る。 本発明において 「三次元構造骨格」 とは 「ス トローマ細胞と、 リンパ球ゃ樹状細胞などのリンパ節 成細胞とを、 三次元 的に組織化させるための足場 （scaffol d) を意味する。 また、 「生体適合性高分 子材料」 とは、 「生体に何らかの方法で適用した時、 生体が異物としてそれを排除 しょうとする反応を極力低く抑えるようにされた、 様々な高分子から構成される 材料」 のことを意味する。
このような高分子生体材料としては、 例えば、 コラーゲン、 グリコサミノグリ カン、 ポリグリコール酸、 ポリ- L-乳酸などが挙げられる。 また、 ナイロン、 ポリ エステル、 ポリウレタンまたはエチレンビニルアセテートなどの非生体分解性の 材料も、 単独で、 または適宜組み合わせて用いることができる。
コラーゲンスポンジは、 生体の構成成分であり、 炎症反応や免疫反応を低く抑 えられる点で、 高分子生体材料として好ましい。 「コラーゲンスポンジ」 とは、 コ ラ一ゲンを含むスポンジ構造を有する多孔性材料を意味し、 例えば、 ゥシアキレ ス腱の不溶性コラーゲンを凍結乾燥することにより、多孔性のスポンジ状にした、 三次元組織培養用コラーゲンなどが本発明に利用可能である。 . 本発明で使用される高分子生体材料は、 それが生体分解性であっても、 非生体 性分解性であってもよく、 生体へ移植した際に、 それ自身の抗原性による免疫反 応および /または物理的刺激による炎症反応を起こしにくい素材である限り、 任 意の素材を用いることができる。 ただし、 ス トローマ細胞と免疫担当細胞が三次 元的に組織化され、 人工リンパ節として機能するためには、 例えば、 多孔性の高 分子材料であれば、 人工リンパ節の構築に適した孔径 （ポアサイズ）、 または、 移 植する高分子材料全体の大きさを選択する必要がある。 このような移植物の孔径 および大きさは、 当業者により適宜決定され得る。
樹状細胞とは、 造血幹細胞由来の樹枝状形態をとる細胞群の総称であり、 リン パ系器官のみならず、 リンパ系器官以外にも広く分布している。 樹状細胞は、 活 性化の際に、 T細胞および B細胞の有効な刺激因子となり、 免疫応答の開始に重 要な役割を果たしている。
本発明に用いる樹状細胞は、 その前駆細胞を培養することによって得ることが できる。 樹状細胞の前駆細胞は、 骨髄、 臍帯血、 末梢血由来の造血幹細胞、 末梢 血由来の'単球細胞などを起源とする。 樹状細胞の前駆細胞は、 採取した骨髄液、 臍帯血、 あるいは末梢血液などの懸濁液から必要に応じて分離精製することがで きる。
樹状細胞の前駆細胞を含む細胞群を増殖させ、 さらに成熟 Z活性化樹状細胞へ と分化誘導させるには、 適切な誘導剤を使用する。 誘導剤として、 サイ トカイン 類を選択して使用することができる。 サイ ト力インとしては、 例えば、 GM-CSF、 IL- 1、 IL_4、 IFN- α、 TNF-ひなどが挙げられ、 これらを単独で又は適宜組み合わ せて用いることができる。
例えば、 樹状細胞を成熟 活性化させるには、 5〜20ng/ml の上記サイ トカイ ンを加えた RPMI-1640培地、 あるいは McCoy ' s培地などを使用し、 最終的に活性 化させるためには、 LPS ( l ipopolysaccharide) などの活性化因子を加えて培養す ればよい。
さらに、 本発明の方法においては、 モノクローナル抗体を作製しょうとする抗 原を加えて培養することによって、 樹状細胞を抗原パルスすることが好ましい。 本発明の抗原特異的ハイプリ ドーマの作成に用いる特異抗体産生人エリンパ節 を構築するには、 任意のサイ トカインをコードする遺伝子を含む発現ベクターを ス トローマ細胞に導入して作製した、 サイ トカイン産生ス トロ一マ細胞を高分子 生体材料に付着させた後、 この高分子生体材料を、 モノクローナル抗体を作製し ようとする抗原で免疫した動物の組織に移植すればよい。 ス トローマ細胞を高分 子生体材料に付着させるには、高濃度に調製した細胞浮遊液に浸すか、あるいは、 この細胞を、 注射針 （例えば、 26ゲージ） を装着した注射器を用いて、 高分子生 体材料に注入する。 - 好ましくは、 この高分子生体材料には、 サイ ト力イン産生ス トローマ細胞の他 に、 樹状細胞が加えられ得る。 より好ましくは、 動物の免疫に用いたのと同じ抗 原 （すなわち、 モノクローナル抗体を作製しょうとする抗原） でパルスした活性 化樹状細胞が加えられ得る。 . '
ス ト口一マ細胞 （および活性化樹状細胞） を付着させた高分子生体材料の移植 の対象となる動物は、 ヒ トおよび非ヒ ト動物であり、非ヒ 卜動物は、好ましくは、 非ヒ ト哺乳動物 （例えば、.サル、 ゥマ、 ゥシ、 ャギ、 ヒッジ、 ブタ、 ィヌ、 ネコ、 ゥサギ、 モルモッ ト、 ハムスター、 ラッ ト、 マウスなど） である。 この中でも通 常ハイプリ ドーマ作成に用いられるマウスが好ましい。
これらの動物は、 高分子生体材料の移植の前に、 モノクローナル抗体を作製し ようとする抗原で免疫される。 この免疫によって、 動物の二次リンパ組織内等の 免疫担当細胞 （B細胞、 T細胞など） は抗原刺激され、 この抗原に特異的な抗体 (好ましくは、 IgG、 IgA、 および または IgM) を細胞表面等に発現する抗体産 生細胞 （B細胞） もしくは抗原特異的 T細胞を生じる。
免疫に用いられる抗原は限定されず、 例えば、 原虫、 真菌、 細菌、 ウィルスな どの病原微生物が挙げられる。 さらに、抗原としては、これらの病原微生物の他、 癌、 または特定の疾患に関係する、 タンパク質、 ペプチド、 核酸、 脂質、 糖質な ども用いられ得る。
免疫の際、 これらの抗原は、 好ましくは、 アジュバント （例えば、 alum、 フロ イン卜の完全もしくは不完全アジュバントなど） と共に動物へ投与される。
リンパ節を構築させる動物の免疫に用いる抗原の量は、 使用する動物の種類、 年齢、 体重、 投与の経路などによって異なるが、 例えば、成体マウスの場合、' alum 中に沈殿させた 10 ^ §〜1000 μ g、好ましくは、 10〜100 ^ gの抗原を腹腔内投与す ればよい。
さらに、 免疫担当細胞 （例えば、 B細胞) の抗原刺激を確実にするために、 1 〜 2週間の間隔で、 1または数回 （例えば、 ：！〜 3回）、 一次免疫を繰り返しても よい。 免疫を繰り返す場合、 抗原は、 好ましくは、 静脈 （i . v. ) 投与される。 高分子生体材料の移植から約 3週間後には、 動物の体内で本発明の抗原特異的 ハイプリ ドーマの作成に用いる特異抗体産生人工リンパ節が構築され得る。 この ようにして構築された特異抗体産生人エリンパ節を生体から回収する。 回収した 人工リンパ節は、 適切な保存剤 （例えば、 10%DMS0) を添加した培養液中で- 80°C 以下の低温にて保存して、 使用前に調製して用いることもできる。
回収した人工リンパ節をレシピエントである免疫不全動物に再移植する。 該免 疫不全動物は、人エリンパ節の構築に用いた動物と同一種であることが好ましい。 移植の部位は、 人工リンパ節の構築の際に、 ス トローマ細胞等を含む生体高分子 材料を移植する部位と同様でよく、 例えば腎臓被膜下に移植すればよレ、。
回収した人工リンパ節を再移植する免疫不全動物と しては、 機能的な！"、 B y ンパ球を持っていない免疫不全動物が挙げられ、 例え '免疫不全マウスがある。 免疫不全マウスとしては、 ヌードマウス、 SCID マウス （重症免疫不全マウス）、 RAG 2遺伝子欠損マウス等を用いることができ、 SCIDマウスとして、 NOD/Shiマウ ス、 C. B-17/IcrCrj-sci d/sci d、 NOGマウス (N0D/Shi-scid/IL-2 γ -/- mouse) 等 があり、 これらの SCIDマウスは日本クレア株式会社から入手可能である。
再移植の際、 2〜4個の人工リンパ節を移植するのが好ましく、 片側の腎臓皮 膜下に 1〜 2個ずつ移植すればよい。
免疫不全動物に人エリンパ節を移植した後、 免疫不全動物を人エリンパ節を構 築する際に用いた抗原で免疫する。 この際、免疫は複数回行ってもよい。例えば、
1 日〜 2週間後、 好ましくは 1 ~ 2日後に免疫し、 さらに 1〜 2週間後、 好まし くは 1週間から 10 日後に免疫すればよい。好ましくは 2回免疫する （一次免疫お よび二次免疫）。 この際の免疫方法は、 静脈投与が望ましい。 抗原投与量は、 マウ スの場合、 10 /i g〜1000 g、 好ましくは、 10〜100 g であり、 2回目の免疫の 投与量は 1回目の免疫の投与量より少なくてもよく、例えば、 1回目の 10分の 1 量を投与すればよい。 一次免疫によって抗原刺激された Bリンパ球は、 移植され た人工リンパ節に集まり、 その後、 一次免疫に用いたのと同じ抗原に曝露される と、 人工リンパ節においてクラススィッチを起こし、 IgG、 IgE、 または IgAを産 生する抗体産生細胞を誘導する。本発明において、抗体産生細胞は、好ましくは、 IgGタイプ （例えば、 IgGい IgG2、 IgG3、 IgG4) の抗体を産生する細胞である。 最後の免疫から数日後、 好ましくは 4〜 5 日後に、 哺乳動物から免疫細胞を採 取し、 細胞融合を行う。 この際、 免疫細胞としては、 脾細胞を用いるのが好まし い。 また、 細胞融合を行う前に、 免疫不全動物の免疫血清中に所望の抗体レベル が上昇していることを ELISA、 ウェスタンブロッテイング等により確認するのが 望ましい。
図 2に人工リンパ節を構築し、 免疫不全マウスに再移植して免疫細胞を得るま での本発明の概要を示す。
本発明はヒ ト型の特異抗体産生ハイプリ ドーマの作成方法をも提供する。 この 場合、 抗原特異的ハイプリ ドーマの作成に用いるヒ ト型の特異抗体産生人工リン パ節は、 例えば、 免疫不全動物 （例えば、 免疫不全マウス） にヒ トリンパ球、 ヒ トリンパ球前駆体、 骨髄細胞、 および または造血幹細胞などを導入して免疫不 全動物の生体内にヒ ト免疫系を構築した後、 このヒ ト免疫系を有する動物を、 上 記の方法に従って、 モノクローナル抗体を作製しょうとする抗原で免疫し、 ス ト ローマ細胞および または樹状細胞を付着させた高分子生体材料（人工リンパ節） を移植し、 そして、 必要に応じて、 同じ抗原で二次免疫することによって構築で きる。
このようにして構築したヒ ト型の特異抗体産生人エリンパ節を免疫不全動物に 再移植してヒ ト型モノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマを作成すること ができる。
免疫不全動物から採取した免疫細胞と融合する細胞として、 哺乳動物のミエ口
—マ細胞を用いる。 このミエローマ細胞は、 公知の種々の細胞株、 例えば、 マウ ス由来細胞の場合、 P3 (P3x63Ag8. 653) (J. Immnol. ( 1979) 123, 1548-1550)、
P3x63Ag8U. 1 (Current Topi cs in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7)、 NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519)、 MPC-11 (Margulies. D. H. et al. , Cell (1976) 8， 405-415)、 SP2/0 (Shulman, M. et al. , Nature (1978) 276, 269-270)、 F0 (de St. Groth, S. F. et al. , J. Immunol. Methods (1980) 35， 1-21)、 S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323)、 R210 (Galfre, G. et al. , Nature (1979) 277, 131-133) 等が好適に 使用される。
前記免疫細胞とミエ口一マ細胞との細胞融合は、 ケ一ラ一とミルスティンらの 方法 (Kohler. G. and Milstein, C. , Methods Enzymol. (1981) 73， 3 - 46) 等の 公知の方法により行うことができる。 具体的には、 前記細胞融合は、 例えば細胞 融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で行うことができる。 融合促進剤とし ては、 例えばポリエチレングリコール （PEG)、 センダイウィルス （HVJ) 等が使用 され、 融合効率を高めるためにジメチルズルホキシド等の補助剤を添加使用する こともできる。 また、 エレク トロボレ一シヨンを用いた電気融合法により融合し てもよい。
細胞融合の際のミエローマ細胞と免疫細胞の混合比率は限定されないが、 1 : 1 〜 1 : 10が好ましい。 前記紬胞融合に用いる培養液としては、 例えば、 RPMI1640 培地、 MEM培地等を用いればよく、 牛胎児血清 （FCS) 等の血清補液を混合しても よい。
細胞融合は、 例えば、 前記免疫細胞とミエローマ細胞を培地中で混合し、 予め
37°C程度に加温した PEG溶液 （例えば平均分子量 1000〜6000程度） を 30〜60%
(w/v) の濃度で添加し、 混合することにより行うことができる。 次いで、 適当な 培養液を逐次添加し、 遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブ リ ドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
このようにして得られたハイプリ ドーマは、 通常の選択培養液、 例えば HAT培 養液 （ヒポキサンチン、 アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液） で培養す ることにより選択される。 上記 HAT培養液での培養は、 目的とするハイプリ ドー マ以外の細胞 （非融合細胞） が死滅するのに十分な時間 （通常、 数日〜数週間） 行う。 次いで、 通常の限界希釈法を実施し、 目的とする抗体を産生するハイプリ ドーマのスクリ一ニングおよびク口一ユングを行えばよい。 スクリ一二ングは、 ELISA、 ウェスタンブロッティング等公知の方法で行うことができる。 このようにして作成されるモノク口一ナル抗体を産生するハイプリ ド一マは、 通常の培養液中で継代培養することが可能であり、 また、 液体窒素中で長期保存 することが可能である。
当該ハイブリ ドーマからモノクローナル抗体を取得するには、 当該ハイブリ ド —マを通常の方法に従い培養し、 その培養上清として得る方法、 あるいはハイブ リ ドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して增殖させ、 その腹水として得 る方法などが採用される。 前者の方法は、 高純度の抗体を得るのに適しており、 一方、 後者の方法は、 抗体の大量生産に適している。
本発明は、 抗原特異的ハイプリ ドーマを作成するためのキッ トをも包含する。 該キッ ドは、 サイ トカイン発現べクタ一およびス トローマ細胞、 またはサイ トカ イン発現べクタ一が導入されたス トロー 細胞、 高分子生体材料、 活性化樹状細 胞を含み、 さらに、 人エリンパ節形成用マウスや免疫不全マウスを含んでいても よい。 ざらに、 ハイプリ ドーマを作成しょうとする抗原を含んでい.てもよく、 こ の場合、 活性化樹状細胞は、 あらかじめ前記抗原でパルスされていてもよい。 本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例 によって限定されるものではなレ、。 . '
実施例において使用した培養液、 試薬および器具は以下の通りである。
RPMI-1640： GIBC0社
2—メノレカプトエタノーノレ ： Sigma社
FCS (fetal calf serum； ゥシ月台仔血清） ： Cel 1 Culture Technologies社 細胞培養液： 10%の非働化した FCSおよび 50^ Mの 2—メルカプトェタノールを 補充した RPMI-1640
Trypsin- EDTA溶液： GIBC0社
G418 (geneticin) ： GIBC0社
リ コ ンビナン 卜マ ウス GM-CSF vgranulocyte-macrophage colony stimulating factor) ： Peproi'ech社
LPS (1 ipopolysaccharide) : igma社
BSA (bovine serum albumin) ： Sigma社 培養ディッシュ、 培養プレート、 ペトリディッシュ ；全て、 FALCON社製 人工リ ンパ節の作製
特開 2004- 255110号公報に記載の方法に従って人エリンパ節（artificial lymph nodes) を Balb/cマウスの腎臓皮膜下で作製した。 具体的には以下の方法で作製 した。
ストローマ細胞として、 2週齢の BALB/cマウスの胸腺から樹立した TEL-2細胞 (Nakashima M. et al. ， Eur J Immunol . 1990 Jan ; 20 (1) : 47-53) を、 10%ゥシ 胎イ子血清および 50 μ Μ 2 —メルカプ卜エタノールを補充した RPMI 1640中で培養 した。 マウスのリ ンホ トキシン ct (LTひ ） またはケモカイン （CCL21、 CCL19およ び CXCL13 ) cDNA を 、 マ ウ ス 脾 臓 RNA 力 ら RT-PCR ( reverse transcription-polymerase cha in react ion) (こより クローニングした。 各 cDNA を、 pCXN 2ベクタ一 （Niwa H, et al. , Gene. 1991 Dec 15； 108 (2) ： 193-9) の EcoRI 部位へと挿入した。 このべクタ一は、 ニヮ トリ βァクチンプロモータ一、 CMV ェ ンハンサー、 およびゥサギ /3グロビンスプライシングドナーを有する。 得られた 発現ベクターを TEL-2細胞へと導入し、 そして安定なトランスフエクタント細胞 株を、 2週間の G418選択 （500 /i g/ml ) 後に得た。 安定なトランスフエクタン ト 細胞株を樹立させた後、全ての細胞株を 200 §/1111の G418を含む培養培地中で培 養した。導入された遺伝子の発現を、 LTひについては蛍光表示式細胞分取器（FACS) 分析およびケモカインについては走化性アツセィにより確認した。
コラーゲンスポンジ （" Col lagen Sponge" #CS- 35， K0KEN, Tokyo, Japan) を、 一定の形および大きさに小さく切り、 48 ゥェルプレートのゥエルに 1片ずつ入れ た。 上記のよ うに樹立したサイ トカイン産生 TEL- 2 ス トローマ細胞を、
Tryps in- EDTA溶液を用いて収集し、 培養液で 1回洗浄して培養液に浮遊させ、 さ らに、 PBS (phosphate buffered sal ine) , 0. 1 % BSA/PBSでそれぞれ 1回ずつ洗 浄した後、 1 mlの 1 % BSA/PBSを加えて細胞浮遊液を作製した。 この細胞浮遊液 を遠心分離に供して細胞を沈澱させてペレツ 卜の状態にし、 少量の 1 % BSA/PBS に細胞を浮遊させて、 細胞濃度の非常に濃い、 均一な細胞浮遊液を作製した。 こ の細胞浮遊液をコラーゲンスポンジの上に滴下し、 スポンジを揉むようにして細 胞をコラーゲンスポンジに吸着させた。少量の 1 % BSA/PBS溶液に細胞を浮遊さ せてコラーゲンスポンジに吸着させているので、 乾燥させないように注意した。 この細胞を吸着させたコラーゲンスポンジを入れた 48ゥエルプレートを、マウス の腎皮膜下への移植まで氷上に置いた。
, 7週齢から 12週齢の雌性 BALB/cAnNCr jマゥスの大腿骨と脛骨の骨髄腔内を、 26ゲージの注射針を装着した注射器を用いて PBSで洗い出し、骨髄細胞液を得た。 この骨髄細胞液をナイロンメ ッシュでろ過して大きな細胞塊等を除き、 培養液で 2 X 105cel l s/ml の濃度に調製して細胞浮遊液を作製した。 なお、 細胞浮遊液中 には赤血球系の細胞がかなり含まれているが、 赤血球系の細胞を無視して細胞の 濃度を 2 X 105ce l l s/ml と計算した。 この細胞浮遊液を、 it径 10cmのプラスチッ ク製ディッシュ （ペトリディッシュ） に、 1ディッシュ当たり 7 mlを移し、 リコ ンビナントマウス GM- CSFを最終濃度 5 ng/ml となるように添加した。 3 日又は 4 日毎に細胞上清を半分捨て、 5 ng/ml の GM- CSFを加えた新しい培赛液を加えた。 培養 8日目または 9日目に浮遊細胞を集め、 5 ng/mlの GM-CSFを加えた新しい培 養液で 2 X 106 cel l s/mlの細胞浮遊液を作り、 1 / g/mlの LPS (もしくは TNF- α )、 および、 抗原パルスを行う場合、 高分子生体材料の移植前にマウスに接種される 抗原と同じ抗原を加えて、細胞培養ディッシュで 17〜20時間培養し、樹状細胞を 成熟および活性化させた。 . '
コラーゲンスポンジ （" Col lagen Sponge" ttCS-35, KOKEN, Tokyo, Japan) を、 一定の形および大きさに小さく切り、 48ゥヱルプレートのゥ： ϋルに 1片ずつ入れ た。 上記のようにして樹立したサイ トカイン産生 TEL-2 ス トローマ細胞を、
Tryps i n-EDTA溶液を用いて収集し、 培養液で 1回洗浄して培養液に浮遊させ、 細 胞数を数えて氷上に置いた。 上記方法により調製した活性化樹状細胞を、 培養液 で 2回洗浄して培養液に浮遊させて細胞数を数え、 氷上に置いた。 その際、 樹状 細胞を LPSで活性化した場合は、 LPSが残らないように丁寧に洗浄した。その後、 それぞれの細胞を、 PBS (phosphate buffered sal i ne) , 0. 1 % BSA/PBSでそれぞ れ 1回ずつ洗浄した後、 1 mlの 1 % BSA/PBSを加えて細胞濃度のほぼ同じ均一な 細胞浮遊液を作製した。. これらの浮遊液を 1対 1の容量で混合し、 遠心分離によ り細胞を沈澱させてペレツ 卜の状態にし、 さらに少量の 1 % BSA/PBS を加えて、 非常に細胞濃度の濃い均一な細胞浮遊液を作製した。 この細胞浮遊液をコラーゲ ンスポンジの上に滴下し、 スポンジを揉むようにして細胞をコラーゲンスポンジ に吸着させた。 少量の 1 % BSA/PBS溶液に細胞を浮遊させてコラーゲンスポンジ に吸着させているので、 乾燥させないように注意した。 この細胞を吸着させたコ ラ、一ゲンスポンジを入れた 48ゥヱルプレートは、細胞を吸着させたコラーゲンス ポンジをマウスの腎皮膜下に移植するまで氷上に保った。
8週齢から 14週齢の雌性 BALBん AnNCrjマウス （日本チャールズリバ一社、 SPF 環境のマウス飼育室で飼育） に麻酔をし、.体表面を 70%エタノールで消毒して右 側臥位にした。 左季肋部の皮'を約 1 cm切開し、 その真下の筋層もほぼ同じ大きさ に切開した。腎周辺の脂肪組織をピンセッ 卜でつまみ、腎臓を体外に引き出した。 実体顕微鏡下で観察しながら、 先の鋭利なピンセッ トを用いて、 腎実質に傷をつ けないように注意しながら、 腎皮膜を開き、 腎皮膜と腎臓の間にコラーゲンスポ ンジを挿入した。 通常、 片方の腎臓につき 2ケ所 （腎上極、 下極付近） 移植する ため、 左右の腎臓で一匹のマウスあたり計 4つの、 ス トローマ細胞を付着させた コラーゲンスポンジを移植した。
レシピエントである BALB/cAnNCrjマウスは NP- ovalbumin (NP-0VA)を alum中に 沈殿させた抗原を腹腔内に投与することにより 4週間前に免疫しておいた。
移植 3週間後に人エリンパ節を回収した。回収した人工リンパ節を SCIDマウス ( Β-17/IcrCrj- sc i d/sc id) の腎臓皮膜下に移植した。
翌日、 SCIDマウスを NP- OVAを用いて免疫した。 この際、 NP-0VAを PBSに溶解 し、抗原 100 gを静脈内投与した。さらに 1週間後、同じ抗原で追加免疫行った。 抗原量は 1回目の 10分の 1の 10 μ gであった。
2回目の免疫後、 4〜5 日目に SCIDマウスから血清を回収するとともに、脾臓 を取り出した。回収した血清については、血清中の IgG抗 NP抗体濃度を測定した。 さらに、 脾臓中の抗体産生細胞数を ELISpot法にて測定した。 また、 脾臓細胞を 調製し、 細胞培養用培地で細胞浮遊液を調製した。 なお、 人工リンパ節の構築、 人エリンパ節の SCIDマウスへの再移植および SCIDマウスの免疫の工程において、 人工リンパ節の構築時に用いる樹状細胞の抗原によるパルスの有無および 100 gの抗原による一次免疫および 10 y gの抗原による二次免疫の有無の条件を変え て行った。 さらに、 免疫マウスとしてナイーブ Ba lb/cマウス、 ナイーブ SCIDマ ウス、 抗原でプレ免疫した Balb/cマウスをさらに抗原を用いて i. v.により'. 2回 再免疫したマウスおよび抗原でプレ免疫した Ba lb/c マウスから採取した脾細胞 ( 1 X 107細胞） を静脈注射により SCIDマウスに移植し、 その後マウスを抗原を 甩いて 2回再免疫した SCIDマウスを対照として用いた。
表 1に人エリンパ節を再移植せずに二次免疫まで行った Balb/cマウス、人エリ ンパ節を再移植して二次免疫を行った SCIDマウス （本発明の方法）、 人工リンパ 節を！！移植してその後の免疫を行わなかった SCID マウスおよび人工リンパ節を 再 植せずに二次免疫まで行った SCIDマウスの血清中抗 NP抗体濃度を示す。
表 1 . 血清中の lgG1クラスの抗 NP抗体 血清中の lgG1クラスの抗 NP抗体
( β g/ml)
Balb/c,プレ免疫
(二次免疫後） 人工リンパ節を有する SCID
(二次免疫後） 人工リンパ節を有する SCID
(無免疫）
SCID (二次免疫後)
表 1に示すように、人エリンパ節を移植され、抗原で免疫した SCIDマウスの血 清中には抗原に対して高親和性の抗体 （この場合は、 NP6 に対する抗体） が大量 に含まれていた。 実施例では 7 mg/ml の抗原特異的な IgG クラスの抗体が含まれ ていた。 通常マウスの血清中の全ィムノグロブリンの量は l mg/ml であるから如 何に大量の抗体が産生されているかがわかる。各条件で免疫した SCIDマウスの血 清中の IgG抗体量を図 3に示す。 図 3より樹状細胞をあらかじめ抗原でパルスし ておくこと、 静脈内に 2回免疫することが重要であることがわかる。 また、 図 3 は単純に SCID マウスに大量の抗原刺激した正常のリンパ節を静脈内投与じて抗 原で同様に免疫しても効果を得られないこと、 および人エリンパ節を用いないと このような効果は得られないことを示す。
表 2に、 人工リンパ節を再移植した SCIDマウスの脾臓中の IgGクラスの抗 NP 特異的抗体産生細胞の数を示す。
表 2
抗原チャレンジ後人工リンパ節を有する SCIDマウスの脾臓中の IgGクラスの
NP特異的抗体産生細胞の数 再免疫後の IgGクラスの抗 NP抗体産生細胞 (105細胞当り）
：. lgG1 (NP6) lgG1 (NP30) IgM (NP30)
SCIDマウス（人工リンパ節移植） 1 7±4 34± 15 302±77 (約 8 X 104細胞）、 (無免疫)
SCIDマウス（人工リンパ節） 31 ,496±6,774 37,744±6,936 2, 384 ±242 (約 8 X 104細胞）、
(NP-OVAを用いて 2回 i.v.により免疫）
SCIDマウス中の人工リンパ節 1 ,046 ± 126 991 ± 182 261 ± 120 (NP-OVAを用いて 2回 i.v.により免疫）
表 2に示すように、 本発明の方法により免疫された （人口リンパ節を移植され た） SCIDマウスの脾臓細胞を調べてみると、 10万個の脾臓細胞中に 3万個以上（約 30%以上） の （NP) 抗原特異的な IgGクラスの抗体を産生している細胞が存在し ていることがわかる。 すなわち、 本発明の方法により、 リンパ球 （脾臓細胞） 3 〜4個に 1個以上が抗原特異的抗体産生細胞である個体を作成することが出来る。 脾臓細胞：骨髄腫細胞 （ミエローマ） を 10 : 1で混合し、 融合剤としてポリェ チレングリコール 1500 (Boehri nger Mannhe i m社製） を用いて細胞融合させるこ とにより多数のハイプリ ド一マを作製した。 骨髄腫細胞は、 P3X63Ag8U. 1 を用い た。 ハイブリ ドーマの選択は、 10%のゥシ胎児血清 （Fetal Cal f Serum、 FCS) と ヒポキサンチン（H )、 アミノプテリン（A )、 チミジン （T ) を含有する HAT含有
DMEM培地（Gibco BRL社製）中で培養することにより行った。 さらに、 HT含有 DMEM 培地を用いて限界希釈法によりシングルクローンにした。 培養は、 96ウェルマィ クロタイタープレート中で行い、 各ゥエルに 104の細胞を播いて行った。 抗 NPモ ノクローナル抗体を產生するハイブリ ド一マクローンのスク リーニングは、 酵素 標識免疫吸着アツセィ（ELISA)により行った。 この際、西洋ヮサビペルォキシダー ゼ標識抗マウス IgG抗体を二次抗体として用い、 酵素反応後の各ゥ ルの吸光度 を ELISA リーダーを用いて測定した。
図 4に各ゥエル中の ELISA測定結果を示す。 図 4に示すように、 本発明の方法 でマウス骨髄腫細胞と細胞融合を行うと殆ど全てが抗原特異的な抗体を産生して いるハイプリ ドーマを得ることができた。 産業上の利用可能性 ·
本発明の方法で用いる人エリンパ節は： 迅速かつ大量に抗原特異的な免疫反応 を誘導し、 有効な抗体産生細胞を効率よく供給することができる。 該人工リ ンパ 節を用いてハイプリ ドーマを作成することにより、 高い形成率で抗原特異的ハイ プリ ドーマを作成することができる。 特に、 免疫原性が低い抗原に対する特異的 ハイプリ ドーマの作成等に有利である。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
1 . 以下の工程を含む抗原特異的ハイプリ ドーマを作成する方法：
(a) 抗原で非ヒ 卜動物を免疫し、免疫した非ヒ ト動物にサイ ト力インを産生する ス トローマ細胞を含む高分子生体材料を移植し、 前記非ヒ ト動物に人工リンパ節 を形成させる工程；
(b) 工程（a)で形成された人工リンパ節を回収し、工程（a)の非ヒ ト動物と同種の 免疫不全非ヒ ト動物に移植する工程； -
(c) 工程（b)で人工リンパ節を移植した免疫不全非七 卜動物を前記工程（a)の抗 原で免疫する工程；
(d) 工程（c)で免疫した免疫不全非ヒ ト動物より脾細胞を採取する工程； ならび に ノ
(e) 工程（d)で採取した脾細胞をミエ口一マ細胞と融合させて抗体産生ハイブリ ドーマを形成させる工程。
2 . 高分子材料がさらに請求項 1の工程（a)の抗原でパルスした活性化樹状細 胞を含む請求項 1記載の方法。
3 . ス トロ一マ細胞が、 TEL- 2細胞である請求項 1または 2に記載の方法。
4 . 高分子材料がコラーゲンスポンジである請求項：！〜 3のいずれか 1項に 記載の方法。
5 . サイ ト力インが、 リンホ トキシンおよび Zまたはケモカインである請求 項 1〜 4のいずれか 1項に記載の方法。
6 . 非ヒ ト動物がマウスである請求項 1 〜 5のいずれか 1項に記載の方法。
7 . 免疫不全動物が免疫不全マウスである請求項 1〜 6のいずれか 1項に記 載の方法。
8 . 免疫不全マウスが SCIDマウスまたは RAG 2遺伝子欠損マウスである請求 項 1 〜 7のいずれか 1項に記載の方法。
9 . 以下を含む、 抗原特異的なハイプリ ドーマを作成するためのキッ ト ：
(a) サイ トカイン発現べクタ一およびス トローマ細胞、またはサイ トカイン発現 ベクタ一が導入されたス トロ一マ細胞； (b) 高分子生体材料； ならびに
(c) 活性化樹状細胞。
1 0 . 以下をさらに含む請求項 9記載の抗原特異的なハイプリ ドーマを作成 するためのキッ ト ：
(d) 人工リンパ節形成用マウス ；および
(e) 免疫不全マウス。
1 1 . さらに、 抗原を含み活性化樹状細胞が該抗原でパルスされている、 請 求 9または 1 0に記載の抗原特異的なハイブリ ドーマを作成するためのキッ ト。
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