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WO2007060182A1 - Utilisation de n-[2-[[3-(4-bromophenyl)-2-propenyl]amino] ethyl]-5- isoquinolinesulfonamide (h89) dans une composition pharmaceutique depigmentante - Google Patents

Utilisation de n-[2-[[3-(4-bromophenyl)-2-propenyl]amino] ethyl]-5- isoquinolinesulfonamide (h89) dans une composition pharmaceutique depigmentante Download PDF

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Publication number
WO2007060182A1
WO2007060182A1 PCT/EP2006/068772 EP2006068772W WO2007060182A1 WO 2007060182 A1 WO2007060182 A1 WO 2007060182A1 EP 2006068772 W EP2006068772 W EP 2006068772W WO 2007060182 A1 WO2007060182 A1 WO 2007060182A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tyrosinase
composition
use according
cells
activity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2006/068772
Other languages
English (en)
Inventor
Corine Bertolotto
Robert Ballotti
Flavie Luciani
Mehdi Khaled
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Galderma Research and Development SNC
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Galderma Research and Development SNC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Galderma Research and Development SNC filed Critical Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Publication of WO2007060182A1 publication Critical patent/WO2007060182A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/49—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds
    • A61K8/4906—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds with one nitrogen as the only hetero atom
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/02—Preparations for care of the skin for chemically bleaching or whitening the skin

Definitions

  • the present invention relates to a depigmenting pharmaceutical composition
  • a depigmenting pharmaceutical composition comprising N- [2 - [[3- (4-bromophenyl) -2-propenyl] amino] ethyl] -5-isoquinolinesulfonamide (H 89 ) and the use of such a composition for the preparation of a medicament for the treatment of hyperpigmentary disorders. 10
  • the present invention relates to the pharmaceutical field and more particularly to the dermatological and cosmetic fields.
  • the constitutive pigmentation of the skin results from the presence of
  • melanin 15 grains of melanin in epidermal keratinocytes.
  • Melanosomes by specialized cells originating from the neural crest, melanocytes. Melanin synthesis or melanogenesis is a complex metabolic pathway controlled mainly by Tyrosinase family enzymes: TYR (Tyrosinase), TYRP1 (Tyrosinase Related Protein 1) and DCT (Dopa-Chromium Tautomerase), which are localized in the membrane. of Tyrosinase family enzymes: TYR (Tyrosinase), TYRP1 (Tyrosinase Related Protein 1) and DCT (Dopa-Chromium Tautomerase), which are localized in the membrane. of Tyrosinase family enzymes: TYR (Tyrosinase), TYRP1 (Tyrosinase Related Protein 1) and DCT (Dopa-Chromium Tautomerase), which are localized in the membrane. of Tyrosinase family enzymes: TYR (Tyrosinase), TYRP1
  • Tyrosinase is the key enzyme in this synthetic route because it catalyzes the first two stages of melanogenesis, the hydroxylation of L-Tyrosine to DOPA and the oxidation of DOPA to DOPAquinone (Hearing, VJ, and Jimenez, M. (1987) Mammalian tyrosinase - the critical regulatory control point in melanocyte pigmentation, J. Biochem 19, 1141-1147); TYRP-1 and
  • DCT for their part, are mainly involved in the eumelanogenesis pathway (Hearing, VJ (1999) Biochemical control of melanogenesis and melanosomal organism, J. Investig.Dermatol, Symp Proc., 4, 24-28).
  • the amount and type of melanin generated determine the constitutive color of the skin.
  • This pigmentation can be modified by external factors such as solar radiation, which is the most important physiological stimulus of melanogenesis.
  • This induction of pigment synthesis by UV radiation is characterized macroscopically by a darkening of the skin or tanning. This process plays a crucial role in protecting against photoaging and against photocarcinogenesis.
  • UV radiation can act directly on melanocytes or indirectly through the release of keratinocyte factors that regulate melanogenesis (Gilchrest, BA, Park, HY, Eller, MS, and Yaar, M. (1996) Mechanisms of ultraviolet light -induced pigmentation Photochem Photobiol 63, 1-10).
  • ⁇ -MSH alpha-Melanocyte stimulating hormone
  • M1R melanocortin receptor 1 MC1 receptor melanocortin receptor 1
  • MC1 R is a transmembrane 7-domain receptor coupled to an as-G protein that activates adenylate cyclase inducing an increase in intramelanocyte cAMP and activation of protein kinase A (PKA).
  • PKA protein kinase A
  • a mutation in the gene encoding the alpha typel regulatory subunit of PKA leads to constitutive activation of PKA.
  • the phenotype described includes pigmentary disorders such as the presence of hyperpigmented macules (Kirschner, LS, Carney, JA, Pack, SD, Taymans, SE, Giatzakis, C, Cho, YS, Cho-Chung, YS, and Stratakis, CA (2000) Mutations of the gene encoding the protein kinase A type I-alpha regulatory subunit in patients with Carney complex (NaL Genet 26, 89-92).
  • Alpha-melanocyte stimulating hormone and its analog Nle4DPhe7 alpha-MSH affect morphology, tyrosinase activity and melanogenesis in cultured human melanocytes, J. CeII Sci 107 (Pt 1), 205-21 1) or melanoma cells (HiII, SE, Buffey, J., Thody, AJ, Oliver, I., Bleehen, SS, and Mac Neil, S.
  • cAMP via activation of PKA and transcription factor CREB (cAMP responsive element binding protein) stimulates transcription of MITF (Microphthalmia Associated Transcription Factor), a basic helical-loop-helix type transcription factor, whose mutation causes, in humans and the mouse, pigmentary defects (Tassabehji, M, Newton, VE, and Read, AP (1994) Waardenburg syndrome type 2 caused by mutations in the human microphthalmia (MITF) gene. Broom 8, 251-255).
  • MITF Microphthalmia Associated Transcription Factor
  • MITF by binding to the M box present in gene promoters of melanogenic enzymes stimulates the expression of TYR, TYRP1 and DCT and increases melanogenesis (Bertolotto, C., Abbe, P., Hemesath, TJ, Bill, K., Fisher, DE, Ortonne, JP, and Ballotti, R. (1998) Microphthalmia gene product as a transducer signal in cAMP-induced differentiation of melanocytes, J. Cell BI, 142, 827-835).
  • Tyrosinase has been shown to be a limiting enzyme in melanogenesis and is controlled by both transcriptional and post-translational mechanisms. It is known that variations in tyrosinase activity in different cell types can not be explained on the sole basis of the amount of enzymes present in the cell. This highlights the importance of post-translational events in this phenomenon (Buffey, JA, HiII, SE, Bleehen, SS, Thody, AJ, and Neil Mac, S. (1991) Evidence for a calcium / calmodulin involvement in density-dependent melanogenesis in murine B16 melanoma cells Pigment CeII, Res 4, 1 12-1 19, Buffey, JA, Edgecombe, M., and Mac Neil, S.
  • Biochem 166, 705 -71 1) (Tripathi, RK, Chaya Devi, C, and Ramaiah, A. (1988) pH-dependent interconversion of two forms of tyrosinase in human skin, Biochem, J. 252, 481-487), neutral for d other teams (Hearing, VJ, and Ekel, TM (1976) Mammalian tyrosinase. A comparison of tyrosine hydroxylation and melanin formation. Biochem J. 157, 549-557).
  • the Thody group demonstrates that acidic conditions in the melanosome are inhibitory of melanogenesis whereas this is increased with pH (Ancans, J., and Thody, AJ (2000) Activation of melanogenesis by vacuolar type H (+) - ATPase inhibitors in amelanotic, tyrosinase positive human and mouse melanoma cells, FEBS Lett 478, 57-60), (Ancans, J., Tobin, DJ, Hoogduijn, MJ, Smit, NP, Wakamatsu, K.
  • the protein p could be one of the actors of the regulation of the intramelanosomal pH (Ancans, J., Hoogduijn, MJ, and Thody, AJ, (2001) Melanosomal pH, pink locus protein and their roles in melanogenesis J. Invest Dermatol 17, 158-159, Brilliant, M., and Gardner, J. (2001) Melanosomal pH, pink locus protein and their roles in melanogenesis, J. Invest Dermatol, 17, 386-387, Brilliant, MH.
  • mice The mouse p (pink-eyed dilution) and human P genes, oculocutaneous albinism type 2 (OCA2), and melanosomal pH, Pigment CeII, Res 14, 86-93, Puri, N., Gardner, JM, and Brilliant , MH (2000) Aberrant pH of melanosomes in pink-eyed dilution (p) mutant melanocytes J. Invest Dermatol 1 15, 607-613).
  • OCA-2 oculocutaneous albinism
  • mice with oculocutaneous albinism type 2 Exp. Eye Res. 72, 695-710 or enter into the formation of a stabilizing complex with TYR (Lamoreux, ML, Zhou, BK, Rosemblat, S., and Orlaow, SJ (1995) The pinkeyed-dilution protein and the eumelanin / pheomelanin switch: in support of a unifying hypothesis, Pigment CeII Res 8, 263-270).
  • PKA is a key protein in the signaling pathways involved in the expression of TYR and the inventors have, surprisingly, found that only H 89 , known as a pharmacological inhibitor of PKA (Hidaka H. and Kobayashi R. (1992) Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol. 32, 377-397), had a strong depigmenting power on melanoma cells, in particular B16 mouse melanomas and human MNT1 melanomas, unlike other pharmacological inhibitors of PKA of the same family such as H9 dihydrochloride, dihydrochloride HA1077, H7, and H8 dihydrochloride which are not active (see Example 1). Indeed, the decrease in pigmentation within B16 cells obtained with the other inhibitors is accompanied by toxicity leading to cell death.
  • H 8 g has been known for many years as an inhibitor of protein kinase A, which is involved in many physiological and pathological processes such as the regulation of gene expression, lipid metabolism, learning and memory. , as well as in the processes of cancerization.
  • DAMP pH-sensitive probes
  • the present invention therefore relates to a depigmenting pharmaceutical composition
  • a depigmenting pharmaceutical composition comprising, in a pharmaceutically acceptable carrier, an effective amount of H 8 g (N- [2 - [[3- (4-bromophenyl) -2-propenyl] amino] ethyl ] -5-isoquinolinesulfonamide).
  • pharmaceutically acceptable carrier any suitable carrier to the dosage form in which the composition of the invention will be prepared. More particularly, those skilled in the art will choose the appropriate pharmaceutically acceptable carrier according to whether the composition of the invention is for oral administration or topical use.
  • an effective amount is meant an amount sufficient to obtain a depigmenting effect.
  • the depigmenting pharmaceutical compositions of the invention may also be present for the oral route in the form of tablets, capsules, dragees, syrups, suspensions, solutions, powders, granules, emulsions, microspheres or nanospheres or lipid or polymeric vesicles for controlled release.
  • the compositions may be in liquid, pasty or solid form, and more particularly in the form of ointments, creams, milks, ointments, powders, soaked swabs, syndets, wipes.
  • compositions for topical application may be in anhydrous form, in aqueous form or in the form of an emulsion.
  • the depigmenting pharmaceutical composition of the invention when it is intended for oral administration, is administered at a daily dose of between 0.001 mg / kg and 100 mg / kg of body weight, in 1 to 3 doses.
  • the pharmaceutical composition according to the invention comprises H89 at a concentration generally of between 0.001 and 10% by weight, preferably between 0.01 and 5% by weight, relative to the weight of the composition for systemic administration.
  • the depigmenting pharmaceutical composition for topical use comprises an amount of H 89 of between 0.0001% and 10% by weight of H 89 relative to the total weight of the composition, preferably between 0.001 % and 5% of the weight of said composition.
  • the depigmenting pharmaceutical composition of the invention may further comprise one or more other compound (s) having a complementary activity and / or borrowing other metabolic pathways than that of H 89 such as, for example, a sunscreen, a steroidal or non-steroidal anti-inflammatory agent, or other depigmenting agent, in particular chosen from a MC1 R modulator, a phenolic derivative, an alpha hydroxy acid, a tyrosinase inhibitor and a retinoid.
  • a sunscreen a steroidal or non-steroidal anti-inflammatory agent
  • depigmenting agent in particular chosen from a MC1 R modulator, a phenolic derivative, an alpha hydroxy acid, a tyrosinase inhibitor and a retinoid.
  • sunscreens there may be mentioned, in particular, physical sunscreens such as titanium dioxide or zinc oxide, and chemical sunscreens such as octocrylene, ethylhexyl methoxycinnamate, octyl salicylate and the like. avobenzone, oxybenzone, ecamsule or drometrizole trisiloxane or mixtures thereof.
  • depigmenting agents that may be mentioned as non-limiting examples include phenol derivatives, such as hydroquinone, hydroquinone monoethyl ether, hydroquinone monobenzyl ether or 4-hydroxyanisole; hydroxy acids such as glycolic acid; retinoids, such as adapalene, tretinoin or retinoic acid; modulators of MC1 R; tyrosinase inhibitors, such as the thioimidazole compounds described in application FR0504444, or the triazole thiol compounds described in application
  • compositions of the invention are particularly suitable for the treatment and / or prevention of hyperpigmentary disorders such as melasma, chloasma, lentigines, senile lentigo, freckles, post-inflammatory hyperpigmentations due to abrasion and / or a burn and / or scar and / or dermatitis and / or contact allergy; nevi, hyperpigmentations with genetic determinism, hyperpigmentations of metabolic or medicinal origin, melanomas or any other hyperpigmentary lesions.
  • hyperpigmentary disorders such as melasma, chloasma, lentigines, senile lentigo, freckles, post-inflammatory hyperpigmentations due to abrasion and / or a burn and / or scar and / or dermatitis and / or contact allergy; nevi, hyperpigmentations with genetic determinism, hyperpigmentations of metabolic or medicinal origin, melanomas or any other hyperpig
  • compositions according to the invention also find application in the cosmetics field, in particular in the protection against the harmful aspects of the sun, for preventing and / or for combating photoinduced or chronological aging of the skin and superficial body growths.
  • the composition may furthermore comprise any additive usually used in the cosmetic or pharmaceutical field, such as sequestering agents, antioxidants, sunscreens, preservatives, fillers, electrolytes, humectants, dyes, bases or acids.
  • any additive usually used in the cosmetic or pharmaceutical field such as sequestering agents, antioxidants, sunscreens, preservatives, fillers, electrolytes, humectants, dyes, bases or acids.
  • perfumes essential oils
  • cosmetic active ingredients moisturizers
  • vitamins essential fatty acids
  • sphingolipids soothing and protective agents for the skin
  • soothing and protective agents for the skin such as allantoin.
  • these optional additional compounds, and / or their amount such that the advantageous properties of the composition according to the invention are not, or not substantially impaired.
  • additives may be present in the composition in a proportion of 0.001 to 20% by weight relative to the total weight of the composition.
  • compositions of the invention may also be used for the preparation of a medicament for lightening the skin regardless of any prior event that has led to accidental browning of the skin.
  • compositions of the invention to be applied to the skin will be adapted to the skin area to be treated as well as the pathology to be treated or the desired aesthetic effect.
  • the desired effect is to lighten the skin over a larger or smaller area. This amounts to obtaining a reduction of the pigmentation of the skin visible to the naked eye and found after a certain duration of application of a composition of the invention.
  • the invention therefore also relates to a cosmetic process for depigmenting the skin or decreasing the production of melanin comprising the topical application to the skin depigmenting a composition as described above.
  • the B16 cells are transfected with 0.3 ⁇ g of pTyro (A) reporter plasmid, p-MITF (B) and pTYRP-1 (C). They are stimulated for 48 hours in the presence of 20 ⁇ M of FSK and 5 ⁇ M of H 8 g. The results are expressed as basal luciferase activity stimulating factor.
  • A pTyro
  • B p-MITF
  • C pTYRP-1
  • FIG. 4 HU inhibits Forskolin-stimulated DOPA Oxidase activity Assay of DOPA Oxidase activity on lysate of B16 cells (60 ⁇ g) treated for 48 hours with 20 ⁇ M Forskolin and 5 ⁇ M H 89 .
  • Electron microscopy of ultrafine B16 sections treated 48h with different effectors The hollow arrows represent stage I melanosomes, solids, stage II melanosomes, hollow triangles stage III melanosomes, solids, stage IV melanosomes.
  • Figure 7 Acidification of melanosomes under the action of H89 Confocal microscopy of B16 cells, treated 48h with the different effectors and labeled with DAMP (green), and TYRP-1, B8G3 (1: 10) (A), or Pmel17, HMB45 (1:20) (red).
  • B16F10 murine melanoma cells are distributed on 96-well plates (2500 cells / well in 100 ml of medium comprising DMEM, L-Glutamine 20OnM, 10OmM sodium pyruvate, 100X non-essential amino acids and fetal calf serum) and incubated. overnight in an incubator humidified with 7% CO2 at 37 ° C.
  • results are shown in Figure 1.
  • the blue line with diamonds corresponds to the viability of the cells and the red line with squares corresponds to the standardized melanogenesis.
  • the abscissa axis corresponds to the concentration of compounds ( ⁇ M), while the ordinate axis corresponds to the percentage relative to the basal level of the control cells (untreated) for each parameter (viability and melanogenesis ). For example, a percentage of 100% viability corresponds to the viability level of the control cells.
  • the pTyro plasmid contains a 2.2 kb fragment of the tyrosinase promoter, cloned upstream of the luciferase reporter gene in the pGL 2 B vector (Promega).
  • the plasmid pTYRPI contains a 1.2 kb fragment of the TYRP1 promoter, upstream of the luciferase reporter gene in the pGL 2 B vector.
  • the plasmid pMITF contains a 2.1 kb fragment of the MITF promoter, upstream of the luciferase reporter gene in the pGL 2 B vector.
  • Anti-Tyrosinase A Pep7, rabbit polyclonal directed against a peptide corresponding to the C-terminal part of mouse Tyrosinase.
  • Anti-Pmel-17 Pep13, polyclonal rabbit antibody directed against a peptide corresponding to the C-terminal portion of mouse Pmel-17 (Dr V. Hearing, Bethesda, USA).
  • HMB45 a rabbit monoclonal directed against a neuraminidase-sensitive oligosaccharide chain (DakoCymation®France).
  • Anti-MITF mAb monoclonal C5 directed against a fusion protein expressing the Taq-Sac fragment of human MITF cDNA (Abcam).
  • Anti-ERK1 mAb monoclonal directed against a synthetic peptide corresponding to the carboxy-terminal region of rat ERK1 (ERK1) (Santa cruz).
  • Anti-DNP polyclonal rabbit against dinitrophenol. (Molecular Porbe).
  • - Anti rabbit and anti mouse made in goats, labeled Texas Red and FITC, used at 1/1000 eme , Alexa 350 IgG mouse antibody, used at 1/100 th Molecular Probes® distributed by Invitrogen France.
  • - Anti rabbit anti-mouse made of goat coupled to peroxidase from among Dakopatts® (Glostrup, Denmark) and used at 1/3000 th.
  • PBS Phosphate Buffer Saline
  • Lysis buffer 50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 10 ⁇ M leupeptin, 1 mM AEBSF, 100 U / ml aprotinin, 10 mM NaF and 1 mM Na3VO4.
  • (c) saturation buffer 10 mM Tris HCl pH 7.4 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% Tween 20, 3% BSA, 5% gelatin.
  • Solubilization buffer 25 mM Tris pH8, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 2 mM DTT.
  • Solubilization buffer 25 mM Tris pH8, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 2 mM DTT.
  • B16F10 mouse melanoma lines are grown in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) supplemented with 7% FCS (Fetal Calf Serum) and 100 U / ml / 50 ⁇ g / ml penicillin / streptomycin.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • FCS Fetal Calf Serum
  • Human melanoma lines MNT-1 are cultured in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) supplemented with AIM-V medium (Gibco) 10%, FBS 20%, NEA (non-essential amino acids) 1%, Sodium pyruvate 1% , 100 U / ml / 50 ⁇ g / ml penicillin / streptomycin.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • AIM-V medium Gibco
  • FBS FBS
  • NEA non-essential amino acids
  • Sodium pyruvate 1% 100 U / ml / 50 ⁇ g / ml penicillin / streptomycin.
  • Both cell lines are maintained in a humidified atmosphere at 37 ° C, 5% CO 2 .
  • the B16 melanoma cells (150 ⁇ 10 3 per 35 mm diameter well) are incubated for 48 h at 37 ° C. in the presence of the different effectors and then centrifuged. The pellets are then dissolved in 100 .mu.l of 1 M NaOH at 70 9 C for 2 h to dissolve the melanins. The relative amount of melanin is evaluated by measuring the OD at 405 nm and related to the amount of protein. The results are expressed in stimulation level compared to the control condition.
  • the B16 melanomas are seeded at 200 ⁇ 10 3 cells per well of 35 mm in diameter, then stimulated in Forskolin and H 89 , at varying times.
  • the cells are then lysed in buffer (a) for 10 minutes at 4 ° C.
  • 30 .mu.g of proteins are denatured 4 minutes at 90 9 C in the recovery buffer (b).
  • the protein samples are then separated by electrophoresis on a 10% polyacrylamide gel in the presence of SDS and transferred onto a membrane of PVDF (Polyvinylidene fluoride) (Immobilon, Millipore) pre-moistened in a methanol bath.
  • the membrane is saturated for 1 hour at 25 9 C in buffer (c).
  • the primary antibody is incubated for 18 hours on the membrane at 4 ° C.
  • 3 washes of 10 minutes are carried out in the washing buffer (d).
  • the secondary antibody coupled to horseradish peroxidase (Dakopatts) is then incubated for 1 hour at 25 ° C. 3 washes are again performed, the proteins of interest are revealed by the technique ECL "Enhance Chemiluminescence", according to the protocol proposed by the manufacturer (Amersham®).
  • the B16 melanoma cells (20 ⁇ 10 3 cells per 16 mm diameter well) are transiently transfected, the transfectant used is a cationic lipid, Lipofectamine (Invitrogen).
  • the transfectant used is a cationic lipid, Lipofectamine (Invitrogen).
  • 0.3 ⁇ g of pTyro, pTYRPI or pMITF reporter plasmid and 0.05 ⁇ g of pCMV beta-gal are incubated with 2 ⁇ l of lipofectamine in 25 ⁇ l of OptiMEM (Invitrogen).
  • the mixture is deposited on the cells for 6 h, and is then replaced by DMEM 7% FCS in the presence of Forskolin (20 ⁇ M) or / and H 8 g (5 ⁇ M).
  • the cells are solubilized 48 h after transfection in a buffer (e) for the measurement of their luciferase and beta-galactosidase activity.
  • 10 .mu.l of cell extracts are placed in the presence of 50 .mu.l of luciferin and the luciferase activity is measured by a luminometer.
  • 20 .mu.l of cell extracts are incubated in 25 .mu.l of buffer containing ONPG (f) which makes it possible to measure the beta-galactosidase activity by spectrophotometry at 405 nm. For each point, the luciferase activity is corrected by the activity of beta-galactosidase.
  • the B16 are seeded at 200 ⁇ 10 3 cells per well of 35 mm diameter, incubated in the presence of Forskolin (20 ⁇ M) and H 8 g (5 ⁇ M).
  • the proteins are solubilized in the buffer (g) for 3 minutes at 4 ⁇ O, then assayed by the Bio-Rad Protein Assay technique.
  • the lysates (60 ⁇ g of proteins) are then incubated with 200 ⁇ g of L-DOPA in phosphate buffer.
  • the B16 are inoculated at 200 ⁇ 10 3 cells per 35 mm diameter well, incubated in the presence of Forskolin (20 ⁇ M) and H 8 g (5 ⁇ M) for 48 h.
  • the cells are fixed in 2% glutaraldehyde for 3 h at 4 ° C., followed by a post fixation with 2% osmic acid in water, for 1 h at 4 ° C.
  • the cells are then dehydrated in 30 °, 50 °, 75 ° and 95 ° alcohol baths for 15 minutes each and then at 100 ° overnight.
  • a substitution is carried out in the epon and the absolute alcohol in quantity 50-50 for 3 h, then in quantity 75-25, and finally in the pure epon 18 h.
  • the cells are then embedded in gelatin for 2 days at 60 ° C. Sections of 700 ⁇ are finally made followed by labeling with uranyl acetate and Pb citrate.
  • Forskolin a direct activator of adenylate cyclase, leads to the increase of intracellular cAMP, resulting in stimulation of the expression of the melanogenic enzymes Tyrosinase and TYRP1.
  • the increase in the expression of these enzymes causes an increased synthesis of melanin pigments for B16 cell pellets treated with 48 hours Forskolin (20 ⁇ M) compared to untreated cells (not shown).
  • H 8 g a PKA inhibitor, induces depigmentation of Forskolin-stimulated cell pellets (not shown).
  • a melanin assay carried out on these same cells shows that the amount of melanin in the cells treated with the
  • Forskolin is increased by a factor of 4 compared to the untreated condition
  • MNT-1 human melanoma cells
  • H 89 H 89
  • the inventors then undertook to study the effect of H 89 on the expression of melanogenic proteins Tyrosinase, TYRP-1 and Pmel-17, a melanosomal matrix protein that contributes to the regulation of melanogenesis as a structural protein (Kobayashi , T., Urabe, K., Orlow, SJ, Higashi, K., Imokawa, G., Kwon, BS, Potter, B. and Hearing, VJ (1994) The Pmel 17 / silver locus protein. its melanogenic function, J.
  • H 89 does not block the stimulation of Forskolin-induced TYRP1 and Pmel-17 expression (not shown).
  • the inventors have been interested in parallel to the expression of MITF, a transcription factor that regulates the expression of melanogenic enzymes (Hodgkinson, CA, Moore, KJ, Nakayama, A., Steingrimsson, E., Copeland, NG, Jenkins , NA, and Arnheiter, H. (1993) Mutations at the mouse microphthalmia are associated with defects in a novel basic-helix-loop-helix-zipper protein gene encoding (74, 395-404).
  • MITF appears as a doublet of 55 and 60 kDa, the band of lower electrophoretic mobility corresponds to MITF phosphorylated on serine 73 by MAPkinase ERK2 (Hemesath, TJ, Price, ER, Takemoto, C, Badalian, T., and Fisher, DE (1998) MAP kinase links the transcription factor Microphthalmia to c- Kit signaling in melanocytes, Nature 391, 298-301). In addition, inhibition by the 89 H of the Forskolin stimulation induced by the expression of MITF (not shown) is observed.
  • H 89 inhibits the DOPA oxidase activity of Tyrosinase.
  • the DOPA oxidase activity of the cells treated with Fsk and H 89 is decreased by 30 to 50% relative to Fsk and generally reflects the level of expression of Tyrosinase observed in Western Blot under the same conditions.
  • the addition of H 89 in vitro during enzymatic reactions does not affect the DOPA Oxidase activity of Tyrosinase (see D.). It can then be concluded that H 89 is not a specific inhibitor of Tyrosinase (not shown).
  • the reaction is carried out in a well (384 ⁇ Clear 96-well plate): 40 ⁇ l of substrate solution (Tyrosine-MBTH + Dopa in cofactor) - 5 ⁇ l of lysate (or Tris-HCl), and
  • Lyse buffer sodium phosphate pH 6.8 to 10mM-1% Igepal
  • Substrate solution - DOPA, 3,125mM stock solution: 3.08mg per 5ml of Tris HCI Buffer
  • test plates are incubated for 6 hours in an oven at 37 ° C.
  • the optical density (OD) is read at 520 nm.
  • Stages I and II correspond to unmelanized organelles. Stage I melanosomes have a content whose filamentary structure is still poorly defined. In contrast, stage II melanosomes are filled with a filamentous internal structure. Melanin begins to accumulate in stage III melanosomes. In stage melanosomes
  • the accumulation of pigments is such that the internal structure is no longer visible.
  • treatment with Forskolin causes an increase in stage IV melanosomes.
  • H 8 g observe melanosomes of earlier stage and the presence of vesicles in melanosomes, causing disruption of organelle structure.

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Abstract

Utilisation de N-(2-((3-(4-bromophényl)-2-propényl) amino) éthyl)-5- isoquinolinesulfonamide (H89) dans un support pharmaceutiquement acceptable pour préparer un médicament destiné à traiter les désordres hyperpigmentaires.

Description

UTILISATION DE N- (2- ( (3- (4-BROMOPHENYL) -2-PROPENYL) AMINO) ETHYL) -5- ISOQUINOLINESULFONAMIDE (H89 ) DANS UNE COMPOSITION PHARMACEUTIQUE DEPIGMENTANTE
5 La présente invention se rapporte à une composition pharmaceutique dépigmentante comprenant du N-[2-[[3-(4-bromophényl)-2-propényl]amino]éthyl]- 5-isoquinolinesulfonamide (H89) ainsi que l'utilisation d'une telle composition pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des désordres hyperpigmentaires. 10
La présente invention relève du domaine pharmaceutique et plus particulièrement des domaines dermatologique et cosmétique.
La pigmentation constitutive de la peau résulte de la présence de
15 grains de mélanine dans les kératinocytes épidermiques. Deux catégories de pigments ou mélanines existent : les phéomélanines, pigments jaune-orange riches en soufre, présents chez les sujets à peau claire, et les eumélanines, pigments marron-noir pauvres en soufre, présents chez les sujets à peau foncée. Ces pigments sont synthétisés dans des organites intracytoplasmiques, les
20 mélanosomes, par des cellules spécialisées originaires de la crête neurale, les mélanocytes. La synthèse de mélanines ou mélanogénèse est une voie métabolique complexe contrôlée principalement par les enzymes de la famille de la Tyrosinase : TYR (Tyrosinase), TYRP1 (Tyrosinase Related Protein 1 ) et DCT (Dopa-Chrome Tautomérase), qui sont localisées dans la membrane du
25 mélanosome. La Tyrosinase est l'enzyme clé de cette voie de synthèse car elle catalyse les deux premières étapes de la mélanogénèse, l'hydroxylation de la L- Tyrosine en DOPA et l'oxydation de la DOPA en DOPAquinone (Hearing, V. J., and Jimenez, M. (1987) Mammalian tyrosinase -the critical regulatory control point in melanocyte pigmentation. Int. J. Biochem. 19, 1 141 -1 147) ; TYRP-1 et
30 DCT quant à elles sont surtout impliquées dans la voie de l'eumélanogénèse (Hearing, V. J. (1999) Biochemical control of melanogenesis and melanosomal organization. J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 4, 24-28). A l'issue de cette réaction, la quantité et le type de mélanine générés déterminent la couleur constitutive de la peau. Cette pigmentation peut être modifiée par des facteurs extérieurs notamment les radiations solaires, qui représentent le stimulus physiologique le plus important de la mélanogénèse. Cette induction de la synthèse de pigments par les radiations UV est caractérisée macroscopiquement par un assombrissement de la peau ou bronzage. Ce processus joue un rôle crucial de protection contre le photovieillissement et contre la photocarcinogénèse. Les radiations UV peuvent agir directement sur les mélanocytes ou indirectement par l'intermédiaire de la libération de facteurs kératinocytaires qui régulent la mélanogénèse (Gilchrest, B. A., Park, H. Y., Eller, M. S., and Yaar, M. (1996) Mechanisms of ultraviolet light-induced pigmentation. Photochem. Photobiol. 63, 1 -10).
Parmi les agents sécrétés par le kératinocyte sous l'influence des UV, l'α-MSH (alpha-Melanocyte stimuling hormone), codée par le gène de la pro- opiomélanocortine, est l'un des activateurs les plus importants de la mélanogénèse. Les effets de l'α-MSH sont déclenchés par sa liaison au récepteur MC1 (MC1 R récepteur à la mélanocortine 1 ) , présent sur le mélanocyte. Le MC1 R est un récepteur à 7 domaines transmembranaires couplé à une protéine G de type as qui active l'adénylate cyclase induisant une augmentation de la teneur intramélanocytaire en AMPc et l'activation de la protéine kinase A (PKA). In vivo, il a été observé que des injections d'α-MSH chez des volontaires humains induisaient une stimulation de la pigmentation sans exposition au soleil (Levine, N., Sheftel, S. N., Eytan, T., Dorr, R. T., Hadley, M. E., Weinrach, J. C, Ertl, G. A., Toth, K., McGee, D. L., and Hruby, V. J. (1991 ) Induction of skin tanning by subcutaneous administration of a potent synthetic melanotropin. Jama. 266, 2730-2736). De plus, une hyperpigmentation cutanée est observée chez des patients atteints du syndrome de Mc Cune-Albright chez lesquels une activation soutenue de l'adénylate cyclase entraînant une augmentation des taux intracellulaires en AMPc a été observée. Chez les sujets atteints du syndrome de Carney, une mutation du gène codant pour la sous-unité régulatrice alpha typel de la PKA conduit à une activation constitutive de la PKA. Le phénotype décrit comprend des désordres pigmentaires tels que la présence de macules hyperpigmentées (Kirschner, L. S., Carney, J. A., Pack, S. D., Taymans, S. E., Giatzakis, C, Cho, Y. S., Cho-Chung, Y. S., and Stratakis, C. A. (2000) Mutations of the gène encoding the protein kinase A type l-alpha regulatory subunit in patients with the Carney complex. NaL Genêt. 26, 89-92).
In vitro, le traitement de mélanocytes humains normaux (Hunt, G., Todd, C, Cresswell, J. E., and Thody, A. J. (1994) Alpha-melanocyte stimulating hormone and its analogue Nle4DPhe7 alpha-MSH affect morphology, tyrosinase activity and melanogenesis in cultured human mélanocytes. J. CeII. Sci. 107 (Pt 1 ), 205-21 1 ) ou de cellules de mélanomes (HiII, S. E., Buffey, J., Thody, A. J., Oliver, I., Bleehen, S. S., and Mac Neil, S. (1989) Investigation of the régulation of pigmentation in alpha-melanocyte-stimulating hormone responsive and unresponsive cultured B16 melanoma cells. Pigment CeII. Res. 2, 161 -166) à l'α- MSH stimule la mélanogénèse. Ces effets peuvent être reproduits par un agent pharmacologique, la Forskoline, activateur direct de l'adénylate cyclase (Englaro, W., Rezzonico, R., Durand-Clément, M., Lallemand, D., Ortonne, J. P., and Ballotti, R. (1995) Mitogen-activated protein kinase pathway and AP-1 are activated during cAMP-induced melanogenesis in B-16 melanoma cells. J. Biol. Chem. 270, 24315-24320).
L'ensemble de ces données démontrent le rôle crucial de la voie AMPc / PKA dans le contrôle de la pigmentation.
Les travaux réalisés par les inventeurs ont montré que l'activation de la voie de l'AMPc / PKA, conduit à une augmentation de l'activité transcriptionnelle des gènes de la Tyrosinase (TYR), TYRP-1 et DCT provoquant une augmentation de leur expression (Bertolotto, C, Bille, K., Ortonne, J. P., and Ballotti, R. (1996) Régulation of tyrosinase gène expression by cAMP in B16 melanoma cells involves two CATGTG motifs surrounding the TATA box: implication of the microphthalmia gène product. J. CeII. Biol. 134, 747-755) (Bertolotto, C, Busca, R., Abbe, P., Bille, K., Aberdam, E., Ortonne, J. P., and Ballotti, R. (1998) Différent cis-acting éléments are involved in the régulation of TRP1 and TRP2 promoter activities by cyclic AMP: pivotai rôle of M boxes (GTCATGTGCT) and of microphthalmia. Mol. CeII. BIoI. 18, 694-702). Ainsi, l'AMPc via l'activation de la PKA et du facteur de transcription CREB (cAMP responsive élément binding protein) stimule la transcription de MITF (Microphthalmia Associated Transcription Factor), un facteur de transcription de type basique hélice-boucle-hélice, dont la mutation provoque, chez l'homme et la souris, des défauts pigmentaires (Tassabehji, M., Newton, V. E., and Read, A. P. (1994) Waardenburg syndrome type 2 caused by mutations in the human microphthalmia (MITF) gène. Nat. Genêt. 8, 251 -255). MITF en se fixant à la boîte M présente dans les promoteurs des gènes des enzymes mélanogéniques stimule l'expression de TYR, TYRP1 et DCT et augmente la mélanogénèse (Bertolotto, C, Abbe, P., Hemesath, T. J., Bill, K., Fisher, D. E., Ortonne, J. P., and Ballotti, R. (1998) Microphthalmia gène product as a signal transducer in cAMP-induced differentiation of melanocytes. J. CeII. BIoI. 142, 827-835).
Il a été montré que la Tyrosinase en tant qu'enzyme limitante de la mélanogénèse, est contrôlée par des mécanismes transcriptionnels mais également post traductionnels. Il est connu que des variations de l'activité de la Tyrosinase dans différents types cellulaires ne peuvent être expliquées sur l'unique base de la quantité d'enzymes présentes dans la cellule. Ceci met en avant l'importance d'événements post-traductionnels dans ce phénomène (Buffey, J. A., HiII, S. E., Bleehen, S. S., Thody, A. J., and Mac Neil, S. (1991 ) Evidence for a calcium/calmodulin involvement in density-dependent melanogenesis in murine B16 melanoma cells. Pigment CeII. Res. 4, 1 12-1 19, Buffey, J. A., Edgecombe, M., and Mac Neil, S. (1993) Calcium plays a complex rôle in the régulation of melanogenesis in muring B16 melanoma cells. Pigment CeII. Res. 6, 385-393, Parker, C, and Sherbet, G. V. (1993) The Ca2+ channel blocker verapamil enhances melanogenesis without altering metastatic potential in the B16 murine melanoma. Melanoma Res. 3, 347-350, Chakraborty, A. K., Funasaka, Y., Komoto, M., and Ichihashi, M. (1998) Effect of arbutin on melanogenic proteins in human melanocytes. Pigment CeII. Res. 1 1 , 206-212). Certaines études montrent que l'activité des molécules de Tyrosinase déjà présentes dans la cellule peut être augmentée, par des phosphorylations par la PKCbeta (Park, H. Y., Russakovsky, V., Ohno, S., and Gilchrest, B. A. (1993) The beta isoform of protein kinase C stimulâtes human melanogenesis by activating tyrosinase in pigment cells. J. Biol. Chem. 268, 1 1742-1 1749), ou par des glycosylations (Imokawa, G., and Mishima, Y. (1986) Importance of glycoproteins in the initiation of melanogenesis: an électron microscopic study of B-16 melanoma cells after release from inhibition of glycosylation. J. Invest. Dermatol. 87, 319-325 ; Imokawa, G., and Mishima, Y. (1982) Loss of melanogenic properties in tyrosinases induced by glucosylation inhibitors within malignant melanoma cells. Cancer Res. 42, 1994-2002). Cette glycosylation de la Tyrosinase qui se déroule dans le Réticulum Endoplasmique constitue un système de contrôle rigoureux impliquant des molécules chaperonnes qui permet de limiter l'activité des protéines qui ne sont pas glycosylées correctement (Branza-Nichita, N., Negroiu, G., Petrescu, A. J., Garman, E. F., Platt, F. M., Wormald, M. R., Dwek, R. A., and Petrescu, S. M. (2000) Mutations at critical N- glycosylation sites reduce tyrosinase activity by altering folding and quality control. J. Biol. Chem. 275, 8169-8175), et permet ensuite l'adressage des protéines correctement modifiées vers leur compartiment cible.
D'autres types de régulation peuvent encore intervenir dans le mélanosome lui-même. Les domaines catalytiques de la Tyrosinase et des autres enzymes impliquées dans la mélanogénèse étant localisés à l'intérieur du mélanosome, il a été démontré que leur activité pourrait dépendre de l'environnement intramélanosomal, et notamment du pH. Il existe encore beaucoup de controverses sur le pH nécessaire à une activité optimale de la Tyrosinase ; le pH doit être acide pour certains auteurs (Devi, C. C, Tripathi, R. K., and Ramaiah, A. (1987) pH-dependent interconvertible allosteric forms of murine melanoma tyrosinase. Physiological implications. Eur. J. Biochem. 166, 705-71 1 ), (Tripathi, R. K., Chaya Devi, C, and Ramaiah, A. (1988) pH-dependent interconversion of two forms of tyrosinase in human skin. Biochem. J. 252, 481 - 487), neutre pour d'autres équipes (Hearing, V. J., and Ekel, T. M. (1976) Mammalian tyrosinase. A comparison of tyrosine hydroxylation and melanin formation. Biochem J. 157, 549-557). Ainsi, le groupe de Thody met en évidence que des conditions acides dans le mélanosome sont inhibitrices de la mélanogénèse alors que celle-ci est augmentée avec le pH (Ancans, J., and Thody, A. J. (2000) Activation of melanogenesis by vacuolar type H(+)-ATPase inhibitors in amelanotic, tyrosinase positive human and mouse melanoma cells. FEBS Lett. 478, 57-60), (Ancans, J., Tobin, D. J., Hoogduijn, M. J., Smit, N. P., Wakamatsu, K., and Thody, A. J. (2001 ) Melanosomal pH controls rate of melanogenesis, eumelanin/phaeomelanin ratio and mélanosome maturation in melanocytes and melanoma cells. Exp. CeII. Res. 268, 26-35). De plus, certains auteurs ont rapporté une augmentation de l'activité de la Tyrosinase dans les mélanomes B16 en présence de composés tels que le NH4CI ou encore des ionophores comme la Nigericine ou la Monensine (Saeki, H., and Oikawa, A. (1983) Stimulation of tyrosinase activity of cultured melanoma cells by lysosomotropic agents. J. CeII. Physiol. 1 16, 93-97 ; Saeki, H., and Oikawa, A. (1985) Stimulation by ionophores of tyrosinase activity of mouse melanoma cells in culture. J. Invest. Dermatol. 85, 423-425). A l'inverse, d'autres équipes montrent que la tyrosinase requiert un pH acide pour une activité optimale (Mani, I., Sharma, V., Tamboli, I., and Raman, G. (2001 ) Interaction of melanin with proteins- the importance of an acidic intramelanosomal pH. Pigment CeII. Res. 14, 170-179).
La protéine p, pourrait être un des acteurs de la régulation du pH intramelanosomal (Ancans, J., Hoogduijn, M. J., and Thody, A. J., (2001 ) Melanosomal pH, pink locus protein and their rôles in melanogenesis. J. Invest. Dermatol. 1 17, 158-159 ; Brilliant, M., and Gardner, J. (2001 ) Melanosomal pH, pink locus protein and their rôles in melanogenesis. J. Invest. Dermatol. 1 17, 386- 387 ; Brilliant, M. H. (2001 ) The mouse p (pink-eyed dilution) and human P gènes, oculocutaneous albinism type 2 (OCA2), and melanosomal pH. Pigment CeII. Res. 14, 86-93 ; Puri, N., Gardner, J. M., and Brilliant, M. H. (2000) Aberrant pH of melanosomes in pink-eyed dilution (p) mutant melanocytes. J. Invest. Dermatol 1 15, 607-613). p est une protéine à 12 domaines trans-membranaires qui est mutée dans l'OCA-2 (Oculocutaneous albinism) et chez la souris pink-eyed. Les patients atteints d'OCA2 présentent, entre autre, des défauts pigmentaires au niveau des cheveux, de la peau et des iris avec une faible capacité à bronzer. Initialement, la protéine p a été proposée comme un transporteur de Tyrosine dans le mélanosome, cette fonction a ensuite été exclue (Gahl, W. A., Potterf, B., Durham-Pierre, D., Brilliant, M. H., and Hearing, V. J. (1995) Melanosomal tyrosine transport in normal and pink-eyed dilution murine melanocytes. Pigment CeII. Res. 8, 229-233). Plus récemment, des études ont suggéré un rôle de la protéine p dans le contrôle du pH melanosomal (Ancans, J., Hoogduijn, M. J., and Thody, A. J., (2001 ) Melanosomal pH, pink locus protein and their rôles in melanogenesis. J. Invest. Dermatol. 1 17, 158-159 ; Brilliant, M., and Gardner, J. (2001 ) Melanosomal pH, pink locus protein and their rôles in melanogenesis. J. Invest. Dermatol. 1 17, 386-387 ; Brilliant, M. H. (2001 ) The mouse p (pink-eyed dilution) and human P gènes, oculocutaneous albinism type 2 (OCA2), and melanosomal pH. Pigment CeII. Res. 14, 86-93 ; Puri, N., Gardner, J. M., and Brilliant, M. H. (2000) Aberrant pH of melanosomes in pink-eyed dilution (p) mutant melanocytes. J. Invest. Dermatol 1 15, 607-613).
Cependant, d'autres travaux suggèrent que la protéine p pourrait réguler l'adressage au mélanosome des protéines Tyrosinase et TYRP-1 (Manga,
P., Boissy, R. E., Pifko-Hirst, S., Zhou, B. K., and Orlow, S. J. (2001 )
Mislocalization of melanosomal proteins in melanocytes form mice with oculocutaneous albinism type 2. Exp. Eye Res. 72, 695-710) ou encore entrer en jeu dans la formation d'un complexe stabilisateur avec TYR (Lamoreux, M. L., Zhou, B. K., Rosemblat, S., and Orlaow, S. J. (1995) The pinkeyed-dilution protein and the eumelanin/pheomelanin switch: in support of a unifying hypothesis. Pigment CeII. Res. 8, 263-270).
Quoiqu'il en soit, et comme indiqué plus haut, la PKA est une protéine clé dans les voies de signalisation impliquées dans l'expression de la TYR et les inventeurs ont, de façon surprenante, mis en évidence que seul le H89, connu comme un inhibiteur pharmacologique de la PKA (Hidaka H. et Kobayashi R. (1992) Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol. 32, 377-397), avait un fort pouvoir dépigmentant sur les cellules de mélanomes, en particulier les mélanomes de souris B16 et les mélanomes humains MNT1 , contrairement aux autres inhibiteurs pharmacologiques de la PKA de la même famille comme le dihydrochlorure de H9, dihydrochlorure de HA1077, H7, et le dihydrochlorure de H8 qui eux ne sont pas actifs (voir exemple 1 ). En effet, la diminution de la pigmentation au sein des cellules B16 obtenue avec les autres inhibiteurs s'accompagne de toxicité entraînant la mort des cellules.
La demande WO 03/061768 montre que des composés dérivés d'acides aminés, en particulier la N-undécylènoyl phénylalanine, qui sont des inhibiteurs de PKA, sont efficaces pour éclaircir la peau. Mais leur structure est complètement différente de la famille des composés H, et d'autant plus du H89.
Le H8g est connu depuis plusieurs années en tant qu'inhibiteur de la protéine kinase A, laquelle intervient dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques tels que la régulation de l'expression génique, le métabolisme des lipides, l'apprentissage et la mémoire, ainsi que dans les processus de cancérisation.
Afin de comprendre les mécanismes d'action du H89, les inventeurs ont étudié les effets de cette molécule sur différents paramètres régulateurs de la mélanogénèse.
Ils ont observé que le H89 entraînait une diminution de l'expression de la Tyrosinase et de MITF ; cependant, ces effets modestes sur l'expression et l'activité de la Tyrosinase ne peuvent en aucun cas expliquer les effets dépigmentants drastiques qu'il provoque.
L'utilisation de sondes sensibles au pH (DAMP) a permis de montrer que la Forskoline provoquait une augmentation du pH des mélanosomes alors que le H89 conduit à une acidification importante qui pourrait être responsable de l'inhibition de la synthèse de mélanines. Enfin, les inventeurs ont découvert que la Forskoline augmente fortement l'expression du gène codant pour la protéine p et que l'inhibition spécifique de son expression bloque la pigmentation induite par la Forskoline. Bien que le H8g affecte peu l'expression de p induite par la Forskoline, il pourrait exercer des effets dépigmentant et acidifiant par l'intermédiaire d'une inhibition de l'activité de la protéine p.
Il existe donc une régulation physiologique du pH intramélanosomal qui joue un rôle important dans le contrôle de la mélanogénèse. Cette régulation du pH du mélanosome est une piste intéressante pour l'élaboration de nouveaux agents dépigmentants.
La présente invention a par conséquent pour objet une composition pharmaceutique dépigmentante comprenant, dans un support pharmaceutiquement acceptable, une quantité efficace de H8g (N-[2-[[3-(4- bromophényl)-2-propényl]amino]éthyl]-5-isoquinolinesulfonamide).
Par « support pharmaceutiquement acceptable », on entend tout support approprié à la forme galénique sous laquelle sera préparée la composition de l'invention. Plus particulièrement, l'homme du métier choisira le support pharmaceutiquement acceptable approprié selon que la composition de l'invention est destinée à une administration orale ou à une utilisation topique.
Par « quantité efficace », on entend une quantité suffisante pour obtenir un effet dépigmentant.
Les compositions pharmaceutiques dépigmentantes de l'invention peuvent par ailleurs se présenter pour la voie orale sous la forme de comprimés, de gélules, de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granulés, d'émulsions, de microsphères ou de nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques permettant une libération contrôlée. Pour l'application topique, les compositions peuvent se présenter sous forme liquide, pâteuse, ou solide, et plus particulièrement sous forme d'onguents, de crèmes, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés, de syndets, des lingettes, de solutions, de collyres, de gels, d'émulsions huile dans eau, d'émulsions eau dans huile,de sprays, de mousses, de suspensions, de lotions, de sticks, de shampoings, ou de bases lavantes. Elle peut également se présenter sous forme de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques ou de patchs polymériques et d'hydrogels permettant une libération contrôlée. Cette composition pour application topique peut se présenter sous forme anhydre, sous forme aqueuse ou sous la forme d'une émulsion.
La composition pharmaceutique dépigmentante de l'invention, lorsque celle-ci est destinée à une administration orale, est administrée à une dose journalière comprise entre 0,001 mg/kg à 100 mg/kg de poids corporel, en 1 à 3 prises. La composition pharmaceutique selon l'invention comprend du H89 à une concentration généralement comprise entre 0,001 et 10% en poids, de préférence entre 0,01 et 5% en poids, par rapport au poids de la composition pour l'administration par voie systémique.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, la composition pharmaceutique dépigmentante à usage topique comprend une quantité de H89 comprise entre 0.0001 % % et 10 % en poids de H89 par rapport au poids total de la composition, de préférence entre 0.001% et 5 % du poids de ladite composition.
Il est à noter que la composition pharmaceutique dépigmentante de la l'invention peut en outre comprendre un ou plusieurs autres composé(s) ayant une activité complémentaire et/ou empruntant d'autres voies métaboliques que celle du H89 tels que par exemple, un filtre solaire, un agent anti-inflammatoire stéroïdien ou non-stéroïdien, ou un autre agent dépigmentant notamment choisi parmi un modulateur de MC1 R, un dérivé phénolique, un alpha hydroxyacide, un inhibiteur de la tyrosinase et un rétinoïde.
Parmi les filtres solaires utilisables, on peut citer notamment les filtre solaires physiques tels que le dioxyde de titane ou l'oxyde de zinc, et les filtres solaires chimiques tels que l'octocrylene, l'ethylhexyl methoxycinnamate, l'octyl salicylate, l'avobenzone, l'oxybenzone, l'ecamsule ou le drometrizole trisiloxane ou leurs mélanges.
On peut citer comme autre agent dépigmentant, à titre d'exemple non limitatif : les dérivés phénoliques, tels que l'hydroquinone, le monoethyl éther d'hydroquinone, monobenzylether d'hydroquinone ou le 4-hydroxyanisol ; - les hydroxyacides tels que l'acide glycolique; les rétinoïdes, tels que l'adapalène, la trétinoïne ou l'acide rétinoïque ; les modulateurs de MC1 R ; les inhibiteurs de tyrosinase, tels que les composés thioimidazoles décrits dans la demande FR0504444, ou les composés triazoles thiols décrits dans la demande
FR0503249.
Bien évidemment, l'homme du métier sera tout à fait en mesure d'ajouter aux susdites compositions d'autres ingrédients ou excipients dermatologiquement (c'est-à-dire pharmaceutiquement et/ou cosmétiquement) acceptables et appropriés pour une utilisation conforme à celle ci-dessous décrite.
Un autre aspect de la présente invention se rapporte à l'utilisation d'une composition pharmaceutique ci-dessus décrite pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des désordres hyperpigmentaires. Les compositions de l'invention conviennent particulièrement bien au traitement et/ou à la prévention des désordres hyperpigmentaires tels que le melasma, le chloasma, les lentigines, le lentigo sénile, les taches de rousseur, les hyperpigmentations post-inflammatoires dues à une abrasion et/ou une brûlure et/ou une cicatrice et/ou une dermatose et/ou une allergie de contact; les nevi, les hyperpigmentations à déterminisme génétique, les hyperpigmentations d'origine métabolique ou médicamenteuse, les mélanomes ou toutes autres lésions hyperpigmentaires.
Les compositions selon l'invention trouvent également une application dans le domaine cosmétique, en particulier dans la protection contre les aspects néfastes du soleil, pour prévenir et/ou pour lutter contre le vieillissement photoinduit ou chronologique de la peau et des phanères.
La composition peut comprendre en outre tout additif usuellement utilisé dans le domaine cosmétique ou pharmaceutique, tel que des séquestrants, des antioxydants, des filtres solaires, des conservateurs, des charges, des électrolytes, des humectants, des colorants, de bases ou d'acides usuels, minéraux ou organiques, des parfums, des huiles essentielles, des actifs cosmétiques, des hydratants, des vitamines, des acides gras essentiels, des sphingolipides, des agents apaisants et protecteurs de la peau tels que l'allantoïne. Bien entendu l'homme du métier veillera à choisir ce ou ces éventuels composés complémentaires, et/ou leur quantité, de manière telle que les propriétés avantageuses de la composition selon l'invention ne soient pas, ou substantiellement pas, altérées.
Ces additifs peuvent être présents dans la composition à raison de 0,001 à 20 % en poids par rapport au poids total de la composition.
Les compositions pharmaceutiques de l'invention pourront également être utilisées pour la préparation d'un médicament destiné à éclaircir la peau indépendamment de tout événement préalable ayant conduit à un brunissement accidentel de la peau.
Les quantités des compositions de l'invention à appliquer sur la peau, les fréquences d'application et la durée du traitement seront adaptées à la zone de peau à traiter ainsi qu'à la pathologie à traiter ou encore de l'effet esthétique recherché. Quel que soit le but à atteindre, l'effet recherché est d'éclaircir la peau sur une zone plus ou moins étendue. Ceci revient à l'obtention d'une réduction de la pigmentation de la peau visible à l'œil nu et constaté après une certaine durée d'application d'une composition de l'invention.
L'invention a donc également pour objet un procédé cosmétique de dépigmentation de la peau ou de diminution de la production de mélanine comprenant l'application topique sur la peau à dépigmenter d'une composition telle que ci-dessus décrite.
LEGENDES DES FIGURES :
Figure 1 : évaluation de H89 et ses dérivés sur la mélanoqénèse Voir exemple 1
Figure 2 : HU inhibe la synthèse des mélanines
(A) Dosage des mélanines en cellules B16 en condition contrôle ou stimulées par 20 μM de Forskoline (FSK) et de 5 μM de H89 pendant 48 h. La quantité est évaluée par mesure de l'absorbance à 405 nm et rapportée à la quantité de protéines. Les résultats sont exprimés en facteur de stimulation par rapport aux cellules contrôle et représentent la moyenne de trois expériences indépendantes.
(B) Dosage des mélanines des mélanomes MNT-1 stimulées 48 h en présence de H89. Les résultats sont exprimés en facteur de stimulation par rapport aux cellules contrôle. Figure 3 : HU inhibe l'activité du promoteur de la Tyrosinase et de MITF
Les cellules B16 sont transfectées avec 0,3 μg de plasmide rapporteur pTyro (A), p-MITF (B) et pTYRP-1 (C). Elles sont stimulées 48 h en présence de 20 μM de FSK et de 5 μM de H8g. Les résultats sont exprimés en facteur de stimulation de l'activité luciférase basale.
Figure 4 : HU inhibe l'activité DOPA Oxydase stimulée par la Forskoline Dosage de l'activité DOPA Oxydase sur lysat de cellules B16 (60 μg) traitées 48 h à la Forskoline 20 μM et H89 5 μM.
Figure 5 : Effet du H∞ sur l'activité enzymatigue de la Tyrosinase
Figure 6 : Ultrastructure des mélanomes B16 en présence de Fsk et
Microscopie électronique de coupes ultrafines de B16 traitées 48h avec différents effecteurs. Les flèches creuses représentent les mélanosomes stade I, les pleines, les mélanosomes stade II, les triangles creux les mélanosomes stade III, les pleins, les mélanosomes stade IV.
Figure 7 : Acidification des mélanosomes sous l'action du H89 Microscopie confocale des cellules B16, traitées 48h avec les différents effecteurs et marqués au DAMP (vert), et TYRP-1 , B8G3 (1 :10) (A), ou Pmel17, HMB45 (1 :20) (rouge).
Les exemples ci-après ne sont mentionnés que pour illustrer certains aspects de la présente invention. En aucune manière ils ne peuvent être considérés comme limitant l'enseignement de la présente description.
EXEMPLES : Exemple 1 : Evaluation de H89 et ses dérivés sur la mélanoqénèse
a) Matériel et méthode : - Composés : 1 : dihydrochlorure de H89 (N-[2-(p-Bromocinnamylamino)ethyl]-5- isoquinolinesulfonamide dihydrochlorure)
2: dihydrochlorure de H9 (N-(2-aminoéthyl)-5-isoquinilinesulfonamide dihydrochlorure
3, dihydrochlorure de HA1077 (1 -(5-isoquinoline-sulfonyl)-homopiperazine dihydrochlorure)
4: dihydrochlorure de H8 (N-(2-[méthylamino]éthyl)-5-isoquinolinesulfonamide hydrochlorure)
5: H7 (1 -(5-isoquinolinesulfonyl)-2-méthylpiperazine
6: dihydrochlorure de H7 ((+/-)-1 -(5-isoquinolinesulfonyl)-2-méthylpiperazine dihydrochlorure
PTU (contrôle positif)
On répartit des cellules murines de mélanome B16F10 sur des plaques 96 puits (2500 cellules/puits dans 100 ml de milieu comprenant DMEM, L-Glutamine 20OnM, pyruvate de sodium 10OmM, acides aminés non esentiels 100X et sérum de veau fétal) et on incube toute la nuit dans un incubateur humidifié sous 7% CO2 à 37 °C.
On ajoute les composés à tester, puis les radioisotopes 2-[2-14C] thiouracile (Amersham, CFQ12674 ; SA=58 mCi/mmol) et 3H L-leucine (Amersham, TRK170, SA=60 mCi/mmol) (concentration finale 14C thiouracile= 6 mCi/ml, 3H L-leucine= 2mCi/ml), et on incube pendant 24 heures. On lave les puits 2 fois avec 200 ml de 5% TCA et 2 fois avec 300ml de 5% TCA. On ôte le liquide. On ajoute 10 ml de Solvable, puis 100 μl de Microscint40. On compte la radioactivité.
b) Résultats : Les résultats sont présentés en Figure 1 . La ligne bleue avec des losanges correspond à la viabilité des cellules et la ligne rouge avec des carrés correspond à la mélanogénèse normalisée. Ainsi, sur les figures, l'axe des abscisses correspond à la concentration en composés (μM), tandis que l'axe des ordonnées correspond au pourcentage par rapport au niveau basai des cellules témoins (non traitées) pour chaque paramètre (viabilité et mélanogénèse). Par exemple, un pourcentage de 100% de viabilité correspond au niveau de viabilité des cellules témoins.
Les plus fortes concentrations sont les suivantes; Composés 1 , 2 et 5: 100 μM
Composés 3 et 4: 50 μM (la plus grande concentration dans DMSO est 50 mM) Composé 6: 25 μM (la plus grande concentration dans DMSO est 25 mM)
Conclusion : Le composé 1 (H89) montre des effets antimélanogéniques à des doses non toxiques.
Bien que les composés 2, 3 et 5 montrent des effets inhibiteurs, ces derniers s'accompagnent de toxicité.
Exemple 2 : Matériel et Méthodes I- Matériels
A. Systèmes cellulaires
Lignées de mélanomes de souris B16F10, humains MNT-1 .
B. Plasmides
- Le plasmide pTyro contient un fragment de 2,2 kb du promoteur de la Tyrosinase, clone en amont du gène rapporteur de la luciférase dans le vecteur pGL2B (Promega).
- Le plasmide pTYRPI contient un fragment de 1 ,2 kb du promoteur TYRP1 , en amont du gène rapporteur de la luciférase dans le vecteur pGL2B. - Le plasmide pMITF contient un fragment 2,1 kb du promoteur MITF, en amont du gène rapporteur de la luciférase dans le vecteur pGL2B.
C. Anticorps
1. Anticorps primaires
- Ac anti-Tyrosinase, Pep7, polyclonal de lapin dirigé contre un peptide correspondant à la partie C terminale de la Tyrosinase de souris. - Ac anti-TYRP1, Pep1 , polyclonal de lapin dirigé contre un peptide correspondant à la partie C terminale de TYRP1 de souris (Dr V. Hearing, Bethesda, USA).
Anticorps anti-Pmel-17, Pep13, polyclonal de lapin dirigé contre un peptide correspondant à la partie C terminale de Pmel-17 de souris (Dr V. Hearing, Bethesda, USA). HMB45, monoclonal de lapin dirigé contre une chaîne oligosaccharidique sensible à la neuraminidase (DakoCymation®France).
Ac anti-MITF, monoclonal C5 dirigé contre une protéine de fusion exprimant le fragment Taq-Sac de l'ADNc de MITF humaine (Abcam).
Ac anti-ERK1, monoclonal dirigé contre un peptide synthétique correspondant à la région carboxy-terminale de ERK1 de rat (ERK1 ) (Santa cruz).
- B8G3: anticorps monoclonal de souris contre Tyrpi de souris. 5 ( Dr Parson, Brisbane, Queensland, Australia).
Anti-DNP, polyclonal de lapin contre le dinitrophenol. (Molecular Porbe).
2. Anticorps secondaires
- Anti lapin et anti souris, fait chez la chèvre, marqués Texas Red et FITC, utilisés au 1/1000eme, Anticorps de souris IgG Alexa 350, utilisé au 1/100eme Molecular Probes® distribué par Invitrogen France. - Anti lapin et anti souris, fait de chèvre, couplés à la péroxydase provenant de chez Dakopatts® (Glostrup, Danemark) et utilisés au 1/3000eme.
D. Tampons
- PBS (Phosphate Buffer Saline) : NaCI 140 mM, KCI 3 mM, NaH2PO4 6 mM, KH2PO4 1 mM, pH7
- (a) Tampon de lyse : 50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCI, 1 % Triton X-100, 10 μM leupeptine, 1 mM AEBSF, 100 U/ml aprotinine, 10 mM NaF et 1 mM Na3VO4.
- (b) Tampon de reprise : 40 mM Na2HPO4, 3 % SDS, 10 % Glycérol, 0,01 % bleu de bromophénol, 10 % _beta- mercaptoéthanol.
- (c) Tampon de saturation : 10 mM Tris HCI pH 7,4 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 0,1 % Tween 20, 3 % BSA, 5 % gélatine.
- (d) Tampon de lavage : 10 mM Tris, pH 7,6, 150 mM NaCI, 1 % Triton X-100.
- (e) Tampon de solubilisation : 25 mM Tris pH8, 1 % Triton X-100, 2 mM EDTA, 2 mM DTT. - (f) 1 ,33 mg/ml ONPG, 200 mM sodium de phosphate pH 7,3, 100 mM beta-mercaptoéthanol, 2 mM MgCI2.
- (g) Tampon Phosphate 0,1 M pH 6,8, 1 % Triton X-100.
E. Effecteurs utilisés - Activateur de l'adénylate cyclase : Forskoline (Sigma® France)
Inhibiteur de la PKA : H8g (Biochem® France)
II- Méthodes
A. Culture cellulaire
Les lignées de mélanomes de souris B16F10 sont cultivées dans du DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Médium) supplémenté avec 7 % de SVF (Sérum de Veau Fœtal) et 100 U/ml / 50 μg/ml de pénicilline / streptomycine.
Les lignées de mélanomes humains MNT-1 sont cultivées dans du DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Médium) supplémenté avec du AIM-V médium (Gibco) 10 %, FBS 20 %, NEA (acides aminés non essentiels) 1 %, Sodium pyruvate 1 %, 100 U/ml / 50 μg/ml de pénicilline / streptomycine.
Les deux lignées cellulaires sont maintenues dans une atmosphère humidifiée à 37°C, 5 % de CO2.
B. Dosage des Mélanines
Les cellules de mélanomes B16 (150.103 par puits de 35 mm de diamètre) sont incubées 48 h à 37^ en présence des différents effecteurs puis centrifugées. Les culots sont ensuite dissous dans 100 μl de NaOH 1 M à 709C pendant 2 h afin de dissoudre les mélanines. La quantité relative de mélanine est évaluée par mesure de la DO à 405 nm et rapportée à la quantité de protéine. Les résultats sont exprimés en niveau de stimulation par rapport à la condition contrôle.
Le même traitement est appliqué aux cellules de mélanomes humains, MNT-1 .
C. Western blot
Les mélanomes B16 sont ensemencés à 200.103 cellules par puits de 35 mm de diamètre, puis stimulés en Forskoline et H89, à des temps variables. Les cellules sont ensuite lysées dans le tampon (a) pendant 10 minutes à 4°C. Puis, 30 μg de protéines sont dénaturées 4 minutes à 909C dans du tampon de reprise (b).
Les échantillons protéiques sont ensuite séparés par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide 10 % en présence de SDS et transférés sur une membrane de PVDF (Polyvinylidene fluoride) (Immobilon, Millipore), préhumidifiée dans un bain de méthanol. La membrane est saturée pendant 1 heure à 259C dans le tampon (c). L'anticorps primaire est incubé 18 h sur la membrane à 4°C. Le lendemain, 3 lavages de 10 minutes sont effectués dans le tampon de lavage (d). L'anticorps secondaire couplé à la péroxydase de Raifort (Dakopatts) est ensuite incubé 1 heure à 25^. 3 lavages sont de nouveau effectués, les protéines d'intérêt sont révélées par la technique ECL « Enhance Chemiluminescence », selon le protocole proposé par le fabricant (Amersham®).
D. Transfection et dosage de l'activité luciférase
Les cellules de mélanomes B16 (20.103 cellules par puits de 16 mm de diamètre) sont transfectées de façon transitoire, le transfectant utilisé est un lipide cationique, la Lipofectamine (Invitrogen). Pour chaque point, 0,3 μg de plasmide rapporteur pTyro, pTYRPI ou pMITF ainsi que 0,05 μg de pCMV beta-gal sont incubés avec 2 μl de lipofectamine dans 25 μl d'OptiMEM (Invitrogen). Le mélange est déposé sur les cellules pendant 6 h, il est ensuite remplacé par du DMEM 7 % SVF en présence de Forskoline (20 μM) ou/et H8g (5 μM). Les cellules sont solubilisées 48 h après transfection dans un tampon (e) pour la mesure de leur activité luciférase et beta-galactosidase. 10 μl d'extraits cellulaires sont mis en présence de 50 μl de luciférine et l'activité luciférase est mesurée par un luminomètre. En parallèle 20 μl d'extraits cellulaires sont incubés dans 25 μl de tampon contentant de l'ONPG (f) qui permet de mesurer l'activité beta- galactosidase par spectrophotométrie à 405 nm. Pour chaque point, l'activité luciférase est corrigée par l'activité de la beta-galactosidase.
E. Mesure de l'activité DOPA Oxydase
Les B16 sont ensemencées à 200.103 cellules par puits de 35 mm de diamètre, incubées en présence de Forskoline (20 μM) et H8g (5 μM). Les protéines sont solubilisées dans le tampon (g) pendant 3 minutes à 4<O, puis dosées par la technique Bio-rad Protein Assay. Les lysats (60 μg de protéines) sont ensuite incubés avec 200 μg de L-DOPA dans du tampon Phosphate à
37^. Une cinétique de la réaction est réalisée par mesure de l'absorbance du produit formé à 570 nm toutes les 30 minutes. F. Immunofluorescence indirecte
Les mélanomes B16 sont ensemencés sur des lamelles en verre à
15.103 cellules par puits de 24 mm de diamètre. Les cellules sont traitées 48 h à la Forskoline (20 μM) et H89 (5 μM), puis lavées avec du milieu sans sérum et incubées 20 minutes en présence de DAMP (30 μM). La fixation est réalisée à
25 °C dans du PFA (Paraformaldéhyde) 3 %, 20 minutes, les lamelles sont ensuite lavées en PBS, incubées 10 minutes dans du NH4CI et enfin perméabilisées en
PBS 0,1 % triton 2 minutes. Les lamelles portant les cellules sont alors incubées dans l'Anti DNP, Ac secondaire de lapin marqué à la fluorescence (FITC) au 1/50eme en PBS 1 % BSA (Bovine Sérum Albumine).
Puis, le marquage avec l'anticorps primaire monoclonal (B8G3 contre
TYRP-1 au 1/10eme, HMB45 contre Pmel-17 au 1/20eme) est réalisé en PBS 1 %
BSA. 3 lavages en PBS sont ensuite effectués, puis l'anticorps secondaire au
1/1000eme couplé au Texas Red est incubé. Le marquage des cellules est visualisé à l'aide d'un microscope à épifluorescence (Axiophot Zeiss).
G. Microscopie Electronique
Les B16 sont ensemencés à 200.103 cellules par puits de 35 mm de diamètre, incubés en présence de Forskoline (20 μM) et H8g (5 μM) 48 h. Les cellules sont fixées en glutaraldéhyde 2 % pendant 3 h à 4°C, suivi d'une post fixation par l'acide osmique 2 % dans l'eau, pendant 1 h à 4°C. Les cellules subissent ensuite des déshydratations successives dans des bains d'alcool 30°, 50°, 75°, 95° durant 15 minutes chacun puis à 100° toute la nuit. Une substitution est réalisée dans l'épon et l'alcool absolu en quantité 50-50 pendant 3 h, puis en quantité 75-25, et enfin dans l'épon pur 18 h. Les cellules sont ensuite incluses dans de la gélatine durant 2 jours à 60°C. Des coupes de 700 â sont enfin réalisées suivi d'un marquage à l'acétate d'uranyle et au citrate de Pb.
Exemple 3 : Résultats
I- Etude de l'effet du H89 sur la régulation de la synthèse de pigments mélaniques A. Effet de la Forskoline et du H89 sur la pigmentation des B16 et des MNT-1
La Forskoline (Fsk), activateur direct de l'adénylate cyclase, conduit à l'augmentation de l'AMPc intracellulaire, entraînant une stimulation de l'expression des enzymes mélanogéniques Tyrosinase et TYRP1. L'augmentation de l'expression de ces enzymes provoque une synthèse accrue des pigments mélaniques pour les culots cellulaires de B16 traitées 48 h à la Forskoline (20 μM) en comparaison des cellules non traitées (non montré). De façon intéressante, le H8g, un inhibiteur de la PKA, induit une dépigmentation des culots cellulaires stimulés par la Forskoline (non montré). Un dosage de mélanine effectué sur ces mêmes cellules montre que la quantité de mélanine dans les cellules traitées à la
Forskoline est augmentée d'un facteur 4 par rapport à la condition non traitée
(Figure 2A). Le traitement au H89 provoque un blocage de la synthèse de mélanine stimulée par la Forskoline.
Les mêmes traitements sont effectués sur les cellules de mélanomes humains, MNT-1 , qui sont des cellules présentant une pigmentation basale très élevée. Comme l'indique la couleur des culots (non montré) et le dosage des mélanines de MNT-1 , cette pigmentation basale est inhibée en présence de H89 (Figure 2B).
Ces observations indiquent donc que le H89 peut inhiber la synthèse de mélanine à la fois basale et induite par la Forskoline.
B. Effet du H89 sur l'expression des protéines mélanoqéniques, Tyrosinase, TYRP1 et Pmel17, et sur le facteur de transcription MITF
Les inventeurs ont ensuite entrepris d'étudier l'effet du H89 sur l'expression des protéines mélanogéniques Tyrosinase, TYRP-1 et Pmel-17, une protéine de la matrice mélanosomale qui contribue à la régulation de la mélanogénèse comme protéine structurale (Kobayashi, T., Urabe, K., Orlow, S. J., Higashi, K., Imokawa, G., Kwon, B. S., Potterf, B. and Hearing, V. J. (1994) The Pmel 17/silver locus protein. Characterization and investigation of its melanogenic function. J. Biol. Chem. 269, 29198-29205 ; Zhou, B. K., Kobayashi, T., Donatien, P. D., Bennett, D. C, Hearing, V. J., and Orlow, S. J. (1994) Identification of a melanosomal matrix protein encoded by the murine si (silver) locus using « organelle scanning ». Proc. Natl. Acad. ScI. USA 91 , 7076-7080). Il est nécessaire de comprendre alors si le H89 agit sur la pigmentation en modifiant l'expression de ces gènes. Des expériences de Western Blot montrent que l'expression de la Tyrosinase stimulée par la Forskoline est partiellement inhibée par le H89 (30 à 50 % d'inhibition). En revanche, le H89 ne bloque pas la stimulation d'expression de TYRP1 et Pmel-17 induite par la Forskoline (non montré). Les inventeurs se sont intéressés en parallèle à l'expression de MITF, un facteur de transcription qui régule l'expression des enzymes mélanogéniques (Hodgkinson, C. A., Moore, K. J., Nakayama, A., Steingrimsson, E., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., and Arnheiter, H. (1993) Mutations at the mouse microphthalmia locus are associated with defects in a gène encoding a novel basic-helix-loop-helix-zipper protein. CeII. 74, 395-404). En Western Blot, MITF apparaît sous forme d'un doublet de 55 et 60 kDa, la bande de plus faible mobilité électrophorétique correspond à MITF phosphorylé sur la serine 73 par la MAPkinase ERK2 (Hemesath, T. J., Price, E. R., Takemoto, C, Badalian, T., and Fisher, D. E. (1998) MAP kinase links the transcription factor Microphthalmia to c- Kit signalling in melanocytes. Nature 391 , 298-301 ). De plus, une inhibition par le H89 de la stimulation induite par la Forskoline de l'expression de MITF (non montré) est observée.
Enfin, ces observations sont confirmées par l'analyse de l'activité des promoteurs Tyrosinase, TYRP1 et MITF. Après transfection transitoire avec pTYRO, pTYRPI et pMITF, les B16 sont traitées avec les différents effecteurs. Comme le montrent les Figures 3A et 3B respectivement, le H89 inhibe l'activité transcriptionnelle des promoteurs de la Tyrosinase et de MITF induite par la Forskoline. Par contre, il ne modifie pas l'activité du promoteur de TYRP1 (Figure 3C).
C. Effet du H89 sur l'activité intrinsèque de la Tyrosinase
Les inventeurs se sont ensuite attachés à déterminer l'effet du H89 sur l'activité intrinsèque de la Tyrosinase. Le résultat de la Figure 4 révèle que le H89 inhibe l'activité DOPA oxydase de la Tyrosinase. Cependant, l'activité DOPA oxydase des cellules traitées par la Fsk et le H89 est diminuée de 30 à 50 % par rapport à la Fsk et reflète globalement le niveau d'expression de la Tyrosinase observée en Western Blot dans les mêmes conditions. De plus, l'ajout du H89 in vitro pendant les réactions enzymatiques n'affecte pas l'activité DOPA Oxydase de la Tyrosinase (voir D.). On peut alors conclure que H89 n'est pas un inhibiteur spécifique de la Tyrosinase (non montré).
L'ensemble de ces résultats indique que le H89 en diminuant l'expression de MITF et de la Tyrosinase diminue l'activité tyrosinase et la synthèse de pigments. Cependant, ce processus ne peut pas expliquer à lui tout seul l'effet dépigmentant du H89 puisque le niveau d'expression de la Tyrosinase ainsi que son activité en condition Fsk + H89 restent supérieurs à celui du contrôle alors que la Fsk + H89 bloquent complètement la pigmentation.
D. Effet du H89 sur l'activité enzymatique de la Tyrosinase: test
Tyrosine Hydroxylase / DOPA Oxydase
On fait réagir dans un puits (plaque 96 puits 384 μClear) : 40μl_ de solution substrat (Tyrosine-MBTH + Dopa en cofacteur) - 5μL de lysat (ou de Tris-HCI), et
- 5μL de H89
Tampons :
- Tampon Tris HCI 50 m M, pH 7,5 en HCI. - Tampon B, pH : 6,8 15 g NaH2PO4 / 1 ,8 L d'eau MQ (ajuster le pH) +
50 ml de DMF, ajuster le volume à 2 litres. Tampon de Lyse : sodium phosphate pH 6,8 à 10mM-1 % Igepal
Solution substrat : - DOPA, solution mère à 3,125mM : 3.08mg par 5ml de Tampon Tris HCI
- MBTH (+40C), solution à 3,75mM : 161 ,775mg par 200ml de Tampon B - Tyrosine, solution à 1 ,25 mM : 6,795 mg par 30 ml de MBTH préparé ci- dessus + 1/500eme Dopa préparée ci-dessus
H89 : Première concentration finale = 100μM Dilution sérielle = 3
Lysat :
Culot cellulaire de 4OM cellules + 4ml_ de Tampon de Lyse ; sonication 10-15 secondes ; centrifugation 30min à 4000rpm à 4<O. On utilise le surnageant pur.
On incube les plaques tests pendant 6 heures dans une étuve à 37°C. On lit la densité optique (DO) à 520 nm.
Résultat et conclusion (voir Figure 5): On n'obtient aucune inhibition. H89 n'est donc pas un inhibiteur de la Tyrosinase.
Il- Rôle du mélanosome dans la régulation de la mélanogénèse A. Effet du HU sur le mélanosome
Une étude en microscopie électronique a été effectuée afin d'observer l'ultrastructure du mélanosome.
Il existe quatre stades de différenciation classiquement décrits pour les mélanosomes. Les stades I et II correspondent à des organites non mélanisés. Les mélanosomes de stade I ont un contenu dont la structure filamentaire est encore assez mal définie. Au contraire, les mélanosomes de stade II se remplissent d'une structure interne filamenteuse. La mélanine commence à s'accumuler dans les mélanosomes de stade III. Dans les mélanosomes de stade
IV, l'accumulation de pigments est telle que la structure interne n'y est plus visible.
Comme le montre la Figure 6, le traitement à la Forskoline provoque une augmentation des mélanosomes de stade IV. En présence de H8g, on peut observer des mélanosomes de stade plus précoce ainsi que la présence des vésicules dans les mélanosomes, provoquant une désorganisation de la structure des organelles.
B. Effet du H89 sur le pH du mélanosome
Les domaines catalytiques de la Tyrosinase et des autres enzymes impliquées dans la mélanogénèse étant localisés à l'intérieur du mélanosome, il a été démontré que leur activité pourrait dépendre de l'environnement intramélanosomal. Récemment il a été proposé que le pH intramélanosomal pouvait être un régulateur clé de la mélanogénèse. Les inventeurs ont donc étudié l'effet du H89 sur le pH des mélanosomes en utilisant une sonde (DAMP) qui marque les vésicules acides. Ce composé comporte des groupements aminés (primaires et tertiaires) qui se protonnent et se chargent positivement à un pH acide. Les groupements primaires lui confèrent la possibilité d'être retenu dans les organelles acides après fixation à des protéines par l'intermédiaire d'un lien aldéhydique. Le DAMP est ensuite visualisé par l'intermédiaire d'un Ac polyclonal anti-DNP couplé au FITC (vert) utilisé au 1/50eme. Les mélanosomes sont marqués en rouge par les Ac dirigés contre TYRP1 (A) ou Pmel-17 (B).
Les résultats (Figure 7) indiquent que le marquage DAMP des vésicules diminue après traitement à la Forskoline et augmente sous H89. De plus, la plupart des vésicules marquées au DAMP sont également positives pour les anticorps dirigés contre TYRP1 et Pmel17, indiquant que le DAMP marque principalement des mélanosomes. Ces résultats suggèrent que la synthèse accrue de mélanine sous l'effet de la Forskoline se fait à pH non acide dans le mélanosome. L'acidification du pH sous l'action du traitement au H89 suggère que celui-ci pourrait exercer son pouvoir dépigmentant en modifiant le pH intramélanosomal.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation de H89 pour préparer un médicament destiné à traiter les désordres hyperpigmentaires.
2. Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que les désordres hyperpigmentaires sont choisis parmi le melasma, le chloasma, les lentigines, le lentigo sénile, les taches de rousseur, les hyperpigmentations post- inflammatoires dues à une abrasion et/ou une brûlure et/ou une cicatrice et/ou une dermatose et/ou une allergie de contact; les nevi, les hyperpigmentations à déterminisme génétique, les hyperpigmentations d'origine métabolique ou médicamenteuse et les mélanomes.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la composition est administrée par voie topique.
4. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la composition est administrée par voie orale.
5. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme liquide, pâteuse, ou solide, et plus particulièrement sous forme d'onguents, de crèmes, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés, de syndets, de lingettes, de solutions, de collyres, de gels, d'émulsions huile dans eau, d'émulsions eau dans huile, de sprays, de mousses, de suspensions, de lotions, de sticks, de shampoings, ou de bases lavantes, de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques ou de patchs polymériques et d'hydrogels permettant une libération contrôlée.
6. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme comprimés, de gélules, de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granulés, d'émulsions, de microsphères ou de nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques permettant une libération contrôlée.
7. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que la quantité de H8g est comprise entre 0.0001 % et 10 % en poids par rapport au poids total de la composition, de préférence entre 0.001% et 5 % du poids de ladite composition.
8. Utilisation d'une composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 7 pour la préparation d'un médicament destiné à éclaircir la peau.
PCT/EP2006/068772 2005-11-25 2006-11-22 Utilisation de n-[2-[[3-(4-bromophenyl)-2-propenyl]amino] ethyl]-5- isoquinolinesulfonamide (h89) dans une composition pharmaceutique depigmentante Ceased WO2007060182A1 (fr)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112903657A (zh) * 2021-01-28 2021-06-04 中山大学 一种三聚氰胺和甲醛的表面增强拉曼光谱检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003061768A2 (fr) * 2002-01-25 2003-07-31 Societe D'exploitation De Produits Pour Les Industries Chimiques (Seppic) Utilisation d'un compose inactivant la proteine kinase a dans une composition contenant un milieu cosmetiquement acceptable, pour eclaircir la peau
US20040220203A1 (en) * 2003-02-10 2004-11-04 Zaijie Wang Method and composition for potentiating an opiate analgesic

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003061768A2 (fr) * 2002-01-25 2003-07-31 Societe D'exploitation De Produits Pour Les Industries Chimiques (Seppic) Utilisation d'un compose inactivant la proteine kinase a dans une composition contenant un milieu cosmetiquement acceptable, pour eclaircir la peau
US20040220203A1 (en) * 2003-02-10 2004-11-04 Zaijie Wang Method and composition for potentiating an opiate analgesic

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112903657A (zh) * 2021-01-28 2021-06-04 中山大学 一种三聚氰胺和甲醛的表面增强拉曼光谱检测方法
CN112903657B (zh) * 2021-01-28 2022-06-24 中山大学 一种三聚氰胺和甲醛的表面增强拉曼光谱检测方法

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